EA019968B1

EA019968B1 - Модифицированные бычьи полипептиды g-csf и их применение

Info

Publication number: EA019968B1
Application number: EA201170242A
Authority: EA
Inventors: Анна-Мария А. Хэйс Путмэн; Ник Кнудсен; Теа Норман; Алан Кодер; Вадим Крайнов; Лиллиан Скидмор; Питер К. Кеннинг
Original assignee: Амбркс, Инк.; Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2014-07-30
Also published as: JP2014064581A; ZA201101166B; BRPI0916515B1; US20100035812A1; EP2318029B1; KR101726884B1; ES2963062T3; EP2318029A2; PL2318029T3; UA118536C2; WO2010011735A3; AU2009274076C1; EA201170242A1; EP3225248A1; PA8836801A1; AR072967A1; EP2318029A4; WO2010011735A2; US10138283B2; BRPI0916515A2

Abstract

Представлены модифицированные бычьи полипептиды G-CSF и их применение.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептидам колониестимулирующего фактора бычьих гранулоцитов (ЬС-С8Р), необязательно модифицированным по меньшей мере одной не кодируемой в природе аминокислотой.

Уровень техники

Экономические потери от инфекционных заболеваний при производстве пищевых продуктов животноводства хорошо документированы. Инфекционные заболевания снижают выгоду, повышают стоимость продукции и ухудшают качество пищевых продуктов, также как влияют на производительность, здоровье и общее состояние животного. Заболевания могут снизить производство и ухудшить качество молока, что приводит к большим экономическим потерям владельцев молочных ферм и производителей говядины, в частности, если в некоторых случаях инфекционные микробные заболевания вызывают заболеваемость и смертность новорожденных, молодых (например, ремонтного поголовья) или взрослых животных. Два таких заболевания, как мастит и респираторное заболевание крупного рогатого скота (ΒΚΌ), могут оказать губительный эффект на производство мясомолочных пищевых продуктов.

Мастит определяют как воспаление молочной железы. Он может поразить любое млекопитающее, например коров, овец и коз. Мастит крупного рогатого скота представляет собой инфекцию вымени жвачных животных, таких как коровы, вызываемую, главным образом, грам-положительными и грамотрицательными бактериями, и особенно у коров с интенсивной лактацией. Бактериальная инфекция приводит к воспалению молочной железы (т.е. сосков и вымени). Животные могут стать более подверженными маститу из-за нарушенной микробицидной функции нейтрофилов во время периода до и после отела. Заболевание доставляет особенно много беспокойства и является весьма важным с экономической точки зрения, так как патоген легко переносится от одного животного к другому во время процесса дойки. Он часто развивается в течение первых нескольких недель после отела и может повторяться при каждой лактации. Некоторыми из основных патогенных микроорганизмов, вызывающих мастит крупного рогатого скота, являются 81арйу1ососси8 аитеик, 81гер1ососси8 ада1асйае, ЗГгерЮсосст иЬегЦ ЗГгерЮсосси8 бу8да1ас11ае, ЕксйепсЫа сой, ЛегоЬасГег аетодеиек, К1еЬ81е11а рпеишошае и Ркеиботоиак аетидтока; см. также Воуше Маййщ, издание С1еиу5 В1оотйе1б, ν&Ο РиЬНсайоик 1987, включенное в описание путем ссылки. Указанные микроорганизмы проникают в вымя через сосковые каналы и вызывают воспаление вырабатывающих молоко тканей, вызывая образование рубцовой ткани, которая один раз образовавшись, может вызывать постоянное снижение производства молока. Инфекция может также изменять состав, количество, вид и качество молока. Вызывающие мастит патогены делятся на две категории, а именно контагиозные (заразные) и относящиеся к окружающей среде. Контагиозные бактерии, такие как 81гер1ососси5 ада1асйае и 81арйу1ососси5 аигеик, главным образом, заселяют такие участки тканей хозяина, как молочные железы, сосковые каналы и поврежденную кожу сосков, и передаются от одной инфицированной коровы к другой в процессе дойки. Относящиеся к окружающей среде бактерии, часто МгерГососсг еи1егососс1 и колиформные организмы, обычно присутствуют в среде обитания коров, в таких источниках, как коровий навоз, почва, растительные материалы, подстилка или вода, и инфицируют при случайном оппортунистическом контакте с животным. Различие между контагиозными и относящимися к окружающей среде патогенами, хотя и не исключительное, является особенно важным, так как особенности содержания молочного поголовья важны для различных групп микроорганизмов. Во всех случаях мастит крупного рогатого скота вызывает, независимо от вызывающего его микроорганизма, способ передачи заражающего патогена внутрь железы вымени через отверстие соска и сосковый канал. Обычные источники вредных микроорганизмов включают антисанитарное состояние доильных установок, доярок, других больных маститом животных, антисанитарное состояние стойл и процессы собственных выделений животных (дефекация/мочеотделение).

Существуют различные формы или типы мастита крупного рогатого скота, характеризующиеся различной тяжестью и симптоматикой, включая следующие: (1) инфекция вымени: заражение полости вымени микроорганизмами, которые размножаются в железе и вызывают воспаление; (2) неклинический или субклинический мастит; форма мастита, при которой не происходит опухания железы или не наблюдается анормальности молока, хотя в молоке происходят изменения, которые можно определить специальными тестами. Такой тип мастита является наиболее часто встречающимся и вызывает наиболее крупные общие потери для большинства стад. Такой мастит часто называют скрытым маститом: (3) клинический мастит; это такая форма мастита, при которой наблюдаются анормальное состояние вымени и секреции молока. Легкий клинический мастит включает изменения в молоке, такие как расслаивание, образование сгустков и водянистость или необычный внешний вид. Повышение температуры и чувствительность вымени незначительны или отсутствуют, но могут присутствовать следы набухания. Тяжелый клинический мастит включает внезапное набухание инфицированной четверти вымени, которая становится горячей, твердой и чувствительной. Качество молока ухудшается, и производство молока падает. Иногда, кроме локальных проявлений в вымени, сами коровы становятся больными. Появляются признаки лихорадки, учащенный пульс, депрессия, слабость и потеря аппетита. Комбинацию таких признаков часто называют острым системным маститом, так как поражено не только вымя, но и весь организм животного; и (4) хронический мастит; такую форму мастита вызывает постоянная инфекция выме- 1 019968 ни, которая существует чаще всего в неклинической форме, но иногда может переходить в активную клиническую форму. После таких вспышек неклиническая форма обычно периодически возвращается.

(см. Сеиега11у Сштеи! Соисер!к о£ Воуше Макббк, риЬНкйеб Ьу ТНе Ναΐίοηαΐ Макббк Соиисй, 1пс., 2иб Еб.

1978, р. 5.)

Мастит продолжает вызывать значительные экономические потери в молочной промышленности. Мастит влияет на рентабельность стада разными путями, как прямо, так и косвенно, включая (1) потери производства молока; (2) большее количество отбракованных инфицированных коров; (3) снижение ценности молока; (4) выбраковку молока после обработки антибиотиками; (5) стоимость ветеринарного лечения (антибиотики и визиты ветеринара) и (6) смертность (Воуше МакШк, С1еиук В1оошйе1б, кирга, р. 33.)

Другим общим заболеванием, поражающим скотоводство, является транспортная лихорадка (респираторное заболевание крупного рогатого скота или ВВЭ). Некоторые называют ВВЭ комплексным заболеванием по двум причинам: обычно его вызывают различные патогены, как вирусы, так и бактерии, которые взаимодействуют друг с другом, вызывая резко выраженное заболевание, и так как поведение патогенов может проявляться как последовательный процесс, оно шаг за шагом приводит к болезни животных. Бактериальные патогены представляют собой одну из наиболее изученных причин острого синдрома. Такие бактериальные патогены могут заселять респираторный тракт крупного скота после поражения вирусной инфекцией и другие факторы, такие как стресс после отнятия от вымени, стресс при транспортировке, изменение питания и изменение окружающей температуры и влажности, могут предшествовать и внести свой вклад в инфицирование. Во многих случаях эти факторы добавляются к экспонированию скота патогенам во время транспортировки животных, когда они смешиваются с животными другого происхождения в грузовиках, стойлах и аукционных сараях, что приводит к большому числу заболеваний животных, доставляемых на площадки для откорма.

Были выделены и связаны с ВВЭ некоторые виды бактерий, и некоторыми из наиболее часто встречающихся являются Маиийеш1а йаешо1убса, Рак1еиге11а ши11ос1ба и/или Н1к1орЫ1ик кошт. НаеторШик котиик представляет собой вирулентный патоген, который вызывает септицемию у скота и иногда приводит к проявлениям, которые называют гемофилический котиик комплекс, одной из форм которого является респираторное заболевание; вирусы, такие как инфекционный бычий ринотрахеит (1ВВ), вирусная диарея крупного рогатого скота (ВУЭ) и респираторный синцитиальный вирус крупного рогатого скота (ВВ8У), также могут участвовать в инициировании ВВЭ комплекса, часто открывая дверь вторичной бактериальной инфекции.

Так как практически невозможно исключить указанные организмы из окружающей среды, к ВВЭ комплексу следует подходить с точки зрения профилактики указанных заболеваний, предотвращая возможность контактирования с вызывающими заболевания агентами и детектируя или обрабатывая клинические случаи, насколько возможно, быстро и эффективно. Респираторные заболевания являются основной причиной потерь от заболеваний мясного поголовья. Обычно считают, что окончательной причиной гибели в большинстве случаев транспортной лихорадки является бактериальная (обычно рак1еиге11а) пневмония. Рак1еиге11а йаето1убса, особенности типа ΙΑ, является наиболее часто встречающейся бактерией, выделенной при случаях респираторного заболевания в Северной Америке. Вакцинация против некоторых из инфекционных агентов, проводимая против транспортной лихорадки, иногда помогает, но вакцины доступны и эффективны только против нескольких из агентов, которые, как известно, участвуют в комплексе заболевания.

Лечение антибиотиками было основным компонентом стратегии борьбы с маститом и ВВЭ. В патенте США № 7182948, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте, указано, что противомикробные обработки сосков вымени содержащими йод растворами, как было показано, являются эффективными против инфекций млекопитающих и вызывающих мастит бактерий (Раикеу, IV. е! а1., (1983) 1. Палу 8сг, 66 (1), 161, 167). Указанными композициями обычно обрабатывают вымя путем его погружения или опрыскивания перед дойкой, а также после удаления доильной чашки. Для уменьшения случаев мастита созданы коммерческие растворы для сосков, содержащие различные противомикробные агенты, включая йодофоры, четвертичные соединения аммония, соединения, выделяющие хлор (например, щелочные гипохлориды), окисляющие соединения (например, перекись водорода, перациды), протонированные карбоновые кислоты (например, гептановая, октановая, нонановая, декановая, ундекановая кислоты), анионные кислоты (например, алкиларилсульфоновые кислоты), диоксид хлора (из хлорита) и бисбигуаниды, такие как хлоргексидин. Такие агенты, которые обладают различными степенями эффективности, ограничивают распространение мастита за счет уменьшения популяций патогенов на сосках. Однако существуют проблемы, связанные с использованием противомикробных агентов. Чаще всего встречаются раздражение сосков и растрескивание сосков. Для облегчения указанных проблем в такие композиции включали умягчающие добавки, такие как глицерин и ланолин. Однако даже при использовании указанных умягчительных средств кожные раздражения все еще могут возникать.

В патенте США № 6790867, который полностью включен в описании посредством ссылки, указывается, что подкожные инъекции композиций, включающих нестероидные противовоспалительные ле- 2 019968 карственные средства (Ν8ΑΙΌ), такие как флуниксин, с фторированным хлорамфениколом или антибиотиком - производным тиамфеникола, таким как флорфеникол, можно использовать для лечения ВКБ. В патентной публикации заявки США № 20070155799, которая полностью включена в описание посредством ссылки во всей своей полноте, раскрыты новые соединения феникола, которые можно использовать в качестве антибиотиков-пролекарств и в комбинации с Ν8ΑΙΌ или другими антибиотиками.

ΝΜ0 (ранее Ναΐίοηαΐ ΜηδΙίΙίδ СоипеП). некоммерческая организация, занимающаяся уменьшением случаев мастита и повышением качества молока, акцентирует внимание на важности правильной санации сосков, но также и на лечебной обработке для профилактики мастита. Экономический вред, причиняемый маститом, привел к многочисленным исследованиям по борьбе с ним. Сообщалось, что физические стрессы так же, как относящиеся к окружающей среде условия, вносят значительный вклад в маститные инфекции; см. патентную публикацию США № 20020051789, которая включена в описании посредством ссылки. Так как было документировано, что субклинический мастит непосредственно связан с плохим состоянием сосков (№уепйш8 Р., еЧ а1. (2001) 1. БаЧту 8сг, (84) 2664 2672), был предложен ряд коммерческих растворов для омывания сосков, включающих кондиционеры (№Шопа1 МазЧЧЧЧз СоипсП, 8ишшагу οί Реет-КеуЧетеб РиЫЧсаЧшпк оп ЕШсасу οί Ргешйкшд апб РозЧтбкшд ТеаЧ БЧзЧпГесЧапЧз РиЬ118Йеб 8шсе, 1980; Чапиагу 2002). Было показано, что затверделость и шероховатость кончиков сосков имеет прямое отношение к клиническому маститу (№уепйш8 Е., еЧ а1. (2001) 1. Балу 8сЧ., (84) 2664 2672). Уменьшение растрескивания и раздражения сосков так же, как сохранение эластичности сосков, являются очень важными факторами в борьбе с инфекциями молочной железы. В качестве кондиционера для сосков также использовали глицерин в растворах для омывания сосков. Однако исследования показали, что не происходит значительного уменьшения количества вызывающих мастит бактерий, таких как 81ар11у1ососси5 аигеиз, 8ЧгерЧососсиз ада1асЧЧае или СоПГогпъ, если содержание глицерина повышают с 2 до 10% в 1% йодном растворе для обработки сосков (№1бопа1 МазЧЧЧЧз Соипсб, 8иттату οί Реет-КеуЧе^еб РиЫЧсаЧюЬз оп ЕГйсасу οί Ртетйкшд апб РозЧтбкЧпд ТеаЧ БЧзшГесЧапЧз РиЫЧзйеб 8шсе, 1980; Чапиагу 2002). Таким образом, хотя такие продукты, как растворы для омывания сосков, доступны, все еще существует неудовлетворенная потребность в уменьшении случаев возникновения, рецидивов и/или снижении тяжести мастита.

В патенте США № 5849883, который полностью включен в описание посредством ссылки, раскрыт ряд антибиотиков, которые использовали для лечения мастита, включая, без ограничения, беталактамные антибиотики, такие как пенициллин (ампициллин, клоксациллин, гетациллин, нафциллин, пенициллин С, (бензил-пенициллин), прокаинпенициллин) и цефалоспорины (цефоперазон, цефуроксим, цефалоний, цефаприн, цефоксазол, цефравцетрил); аминогликозидные антибиотики (фрамицетин, неомицин, новобиоцин, стрептомицин); антибиотики макролиды (эритромицин); тетрациклины (хлортетрациклин, окситетрациклин) и полипептидные антибиотики (полимиксин В). Лечение мастита антибиотиками обычно проводят, используя интрамаммарные вливания, или коровам в период лактации, если у них диагностирован клинический мастит, или в сухостойный период (когда корову не доят) (Воуше МазЧЧЧЧз, зирта, р. 69). В тех случаях, когда присутствует тяжелое клиническое заболевание, антибиотики необходимо вводить парентерально, так как интрамаммарные вливания неэффективны из-за блокировки каналов.

Существовавшие ранее надежды на то, что антибиотики позволят полностью победить заболевание, не реализовались. Ни один из вышеперечисленных антибиотиков не оказался полностью удовлетворительным. Кроме того, было обнаружено, что было бы весьма желательно заменить лечение антибиотиками лечением неантибиотическими химиотерапевтическими лекарственными соединениями по следующим причинам: (1) антибиотики, эффективные в медицине для людей, нельзя использовать в ветеринарии, чтобы не выработать штаммовую устойчивость бактерий, проявляющихся при заболеваниях людей; (2) антибиотики следует приберечь для таких заболеваний, для которых недоступны химиотерапевтические лекарственные соединения, так как было доказано, что штаммы бактерий вырабатывают устойчивость к антибиотикам после длительного использования таких антибиотиков; и (3) 8Чарйу1ососсиз аигеик, один из вышеуказанных патогенов, уже выработал устойчивость к большинству антибиотиков, которые использовали при лечении мастита крупного рогатого скота.

Один из таких способов лечения неантибиотическим химиотерапевтическим лекарственным соединением раскрыт в патенте США № 4610993, который включен в описание посредством ссылки, в котором заявлен способ лечения животных от мастита крупного рогатого скота эффективным количеством по меньшей мере одного пиридин-Аоксиддисульфидного соединения. Другой способ тех же авторов раскрыт в патенте США № 4401666, который включен в описание посредством ссылки, где заявлен способ лечения животных от мастита крупного рогатого скота эффективным количеством по меньшей мере одной соли металла пиридин-2-тион-№оксида. Несмотря на несколько опубликованных способов, все еще остается очень важным найти рентабельные, но эффективные способы использования соединений, отличных от антибиотиков, которые смогли бы, по существу, преодолеть недостатки использованных до настоящего времени антибиотиков и при этом были бы эффективны при лечении и профилактике мастита.

Другим общим заболеванием, поражающим скотопромышленность, являются транспортные лихо- 3 019968 радки (респираторное заболевание крупного рогатого скота). Респираторные заболевания являются основной причиной потерь мясного скота. Термин транспортная лихорадка используют для описания комплекса респираторных заболеваний, наблюдаемых у животных в возрасте 6 месяцев или старше после перевозки или на площадке для откорма скота либо на пастбищах. Стрессы при отлучении от матери, кастрация, удаление рогов, голодная выдержка, чрезмерная скученность, экспонирование инфекционным агентам, изменения кормежки, транспортировка, относящиеся к окружающей среде температурные экстримы и другие причины стрессов, наряду с вирусной, бактериальной, микоплазменной и/или хламидийной инфекциями, составляют комплекс транспортной лихорадки. Перемешивание телят из различных ферм и/или в предпродажных сараях приводит к значительному экспонированию инфекционным агентам. В патенте США № 6497869, который включен в описание посредством ссылки, описаны некоторые первичные инфекционные агенты, которые могут воздействовать на скот. Смешивание популяций может быть наиболее важным провоцирующим фактором, вызывающим транспортную лихорадку, нежели стресс-факторы, хотя заболевание может проходить без перемешивания и без стресс-факторов, обычно резко ухудшающих респираторное заболевание. Попытки уменьшить стрессы при отлучении от матери, при кастрации, при удалении рогов и т.д. и при приучении скота к новому корму за несколько дней или недель до перевозки иногда бывают успешными (но могут оказаться нерентабельными) для уменьшения случаев транспортной лихорадки. Вакцинация против некоторых инфекционных агентов, принимающих участие в транспортной лихорадке, иногда помогает, но вакцины доступны и эффективны только для нескольких из агентов, которые, как известно, включены в комплекс заболевания.

Общепринято считать, что конечной причиной, вызывающей гибель в большинстве случаев транспортной лихорадки, является бактериальная (обычно Ра81еиге11а) пневмония. Ра§1еиге11а Ьаето1убса, особенно типа ΙΑ, является наиболее общей, выделенной из случаев респираторных заболеваний в Северной Америке. Попытки экспериментально воспроизвести бактериальную пневмонию у скота обычно являются безуспешными без сильного стресса и предрасполагающего повреждения респираторного тракта. Обычно принято считать, что во время стресса вирусы, микоплазмы и/или хламидии чаще всего осуществляют начальное повреждение респираторного тракта, что и провоцирует тяжелую бактериальную инфекцию и заболевание.

Вспышка типичного клинического респираторного заболевания обычно начинается в течение нескольких часов или дней по прибытии скота в загон для откорма. Недавно прибывший скот весом в интервале от 180 до 225 кг обычно дает от 10 до 80% заболеваемости и от 1 до 10% смертности или более из-за заболеваний респираторного тракта. Когда проводят анализ сыворотки скота в отношении четырехкратного увеличения антител (серологическая конверсия) и респираторный тракт и его секрецию подвергают микробиологическому выделению, можно идентифицировать мириад этиологических агентов. Можно показать, что многие животные, те, которые больны, и те, которые, по-видимому, здоровы, подверглись инфицированию одним или более из агентов (заболевание респираторного тракта, вероятно, редко связано с только одним инфекционным агентом). Хотя комплекс респираторного заболевания крупного рогатого скота распознается клинически в пункте откорма после прибытия, инфекции, вызывающие клиническое заболевание, по-видимому, начинаются в торговых помещениях, где скот вначале собирают из различных ферм; см. также Воуте ИекрйаЮгу Ощеаке, Ьоаи, Ρ.\ν. Техак Α&Μ Ипуегайу Рге55. 1984, что включено в описание посредством ссылки.

Введение соединения, которое лечит или модулирует возникновение, возврат, длительность и/или тяжесть мастита или респираторного заболевания у скота или другие инфекции у нечеловеческих животных, включая, без ограничения, крупный рогатый скот, птицу, свиней, лошадей, собак и кошек, должно пригодиться в ветеринарии. Примеры таких инфекций включают, без ограничения, неонатальную септицемию у лошадей, пиеропневмонию у свиней и пневмонии у нечеловеческих животных. Такие соединения могут сохранять или модулировать функцию нейтрофилов в организме животных.

Семейство супергенов гормона роста (ОН) (Вахаи р. 1ттиио1оду Тобау, 11: 350-354 (1991); Мой, Н.К апб СатрЬе11, Ι.Ό. Сиггеи! Ортюи ίη 81гис1ига1 Вю1оду, 5: 114-121 (1995); 811уеппотеи, О. и 1Ые, ΤΝ. (1996) 8ΙΟΝΑΕΙΝΟ ΒΥ ТНЕ НЕМАТОРО1ЕТ1С СΥТОΚINΕ ЯЕСЕРТОК.8) представляет собой набор белков с аналогичными структурными характеристиками. Каждый член этого семейства белков включает четырехспиральный узел. Хотя до сих пор не обнаружены другие члены указанного семейства, некоторые члены указанного семейства включают следующие: гормон роста, пролактин, плацентарный лактоген, эритропоэтин (ЕРО), тромбопоэтин (ТРО), интерлейкин-2 (1Ь-2), Ш-3, Ш-4, Ш-5, Ш-6, 1Ь-7, 1Ь-9, 1Ь10, Ш-11, Ш-12 (р35 субъединица), ΙΠ-13, ΙΠ-15, онкостатин М, цилиарный нейротрофический фактор, ингибирующий лейкемию фактор, альфа-интерферон, бета-интерферон, гамма-интерферон, омегаинтерферон, тау-интерферон, эпсилон-интерферон, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (О-С8Р), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-С8Р) и кардиотропин-1 (СТ-1) (семейство супергенов ОН). Члены семейства супергенов ОН обладают аналогичными вторичными и третичными структурами, несмотря на тот факт, что они вообще отличаются ограниченной идентичностью аминокислот или ДНК последовательностей. Общие структурные характеристики позволяют легко идентифицировать новые члены генного семейства. Четырехспиральный узел полипептидов описан в публикации VО 2005/074650, озаглав- 4 019968 ленной МойШей Нитап Гоит Не11са1 Випй1е Ро1урер11йек апй Тйей Икек, которая полностью включена в описание посредством ссылки.

Член супергенного семейства СН представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Г). Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Г) представляет собой один из факторов роста гликопротеинов, известных как колониестимулирующие факторы (С8Г), так как они поддерживают пролиферацию гемопоэтических клеток-предшественников. С-С8Г стимулируют пролиферацию и дифференцирование специфических клеток-предшественников костного мозга в гранулоциты. Они отличаются от других С8Г своей способностью как стимулировать образование колоний нейтрофильных гранулоцитов, так и стимулировать образование колоний нейтрофилов в полутвердом агаре и индуцировать терминальное дифференцирование мышиных миеломоноцитарных лейкемических клеток ίη νίίτο. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является эффективным стимулом для пролиферации и созревания нейтрофилов ίη νίνο (Сойеп е! а1., Ргос. Νη11. Асай. 8οί.„ 1987; 84: 2484-2488, см. также Не1йап е! а1., Уе! 1ттипо1. 1ттипора!йо1., 2001; 81:45-57). С-С8Г также способны индуцировать функциональную активацию или прайминг зрелых нейтрофилов ш νίΙΐΌ (ХУе^Ыт, ЯН., Саккоп, С.С. и ЭЛУ. Со1йе. Аппа1к оГ 1п!егпа1 Мейюте, 1989; 110:297-303). Было показано, что С-С8Г примируют человеческие гранулоциты и усиливают выделение супероксида, стимулируемое хемотактическим пептидом, Ν-формил-метионил-лейцил-фенилаланином (8. Кйадата, е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Яек. Соттип., 1987; 144: 1143-1146 и С.Р. №!йап, В1оой, 1989; 74:301-306), и активируют фагоцитоз, опосредованный человеческими нейтрофильными 1дА (\Уе1кЬаг1 Я.Н., е! а1., №!иге, 1988; 332: 647-649).

Нейтрофилы являются критическим компонентом защитного механизма хозяина против бактериальных и грибковых инфекций. С-С8Г способны индуцировать увеличение абсолютного числа циркулирующих нейтрофилов и усиление функций нейтрофилов.

Были описаны клонирование кДНК и экспрессия рекомбинантных человеческих С-С8Г (БС-С8Г), было подтверждено, что рекомбинантные БС-С8Г проявляют большинство, если не все, биологические свойства природной молекулы (8ои/а, Ь. е! а1. 8с1епсе, 232, 61-65 (1986)). Анализ последовательностей кДНК и клонов геномной ДНК позволяет дедуктивно определить аминокислотную последовательность и показывает, что указанный белок состоит из 204 аминокислот в длину с сигнальной последовательностью в 30 аминокислот. Зрелый белок состоит из 174 аминокислот в длину и не содержит потенциальных сайтов Ν-связанного гликозилирования кроме нескольких возможных сайтов О-связанного гликозилирования.

Клонирование и экспрессия кДНК, кодирующей человеческий С-С8Г, были описаны двумя группами 8. е! а1., №!ите, 319, 415-418 (1986); 8ои/а, Ь.М. е! а1., 8с1епсе, 232, 61-65 (1986)). В первой работе, посвященной С-С8Г кДНК клону, высказано предположение, что зрелый белок состоит из 177 аминокислот в длину. Авторы сообщали, что они также идентифицировали клон кДНК С-С8Г, которая кодирует белок, в котором отсутствует участок из трех аминокислот. Эта более короткая форма С-С8Г кДНК экспрессирует ожидаемую С-С8Г активность. Во втором сообщении описывается кДНК последовательность, идентичная указанной короткой форме, и нет никаких указаний на другие варианты. Так как указанные авторы подтверждают, что короткая кДНК экспрессирует С-С8Г с ожидаемым профилем биологической активности, возможно, что это и есть важная форма С-С8Г и что более длинная форма является или минорным вариантом сплайсинга, или результатом артефакта клонирования.

Ма1кито1о е! а1., т 1пГесйоп апй 1ттипйу, Уо1. 55, № 11, р. 2715 (1987) обсуждает защитное действие человеческого С-С8Г в отношении микробных инфекций у нейтропеничных мышей.

Следующие патентные публикации относятся к С-С8Г: \УО 8703689, который включен в описание посредством ссылки, раскрывает гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфические для человеческого С-С8Г, и их использование при очистке С-С8Г; в \УО 8702060, который включен в описание посредством ссылки, раскрыты полипептиды, подобные человеческому С-С8Г, и способы их получения; в патенте США № 4810643, который включен в описание посредством ссылки, раскрыты полипептиды, подобные человеческому С-С8Г, кодирующие их последовательности и способы их получения; в \УО 8604605 и \УО 8604506, которые включены в описание посредством ссылки, описан ген, кодирующий человеческий С-С8Г, и ингибиторы инфекций, содержащие человеческий С-С8Г. Выделение 11-СС8Р и продуцирование С-С8Г в клетках-хозяевах, таких как Е. со11, раскрыты, например, в патентах США №№ 4810643; 4999291; 5580755 и 6716606, которые включены в описание посредством ссылки.

С-С8Г представляет собой фармацевтически активный белок, который регулирует пролиферацию, дифференциацию и функциональную активацию нейтрофильных гранулоцитов (Ме!са1Г, е! а1. В1оой, 67:257 (1986); Уап, с! а1. В1оой, 84(3): 795-799 (1994); Вепктдет, с! а1. В1оой, 81(11): 3158-3163 (1993); ЯоЬейк, с! а1., ЕхрП Нета!о1оду, 22: 1156-1163 (1994); №Ьеп, с! а1. В1оой, 81(7): 1960-1967 (1993); Уе1!е, е! а1. ΡΝΑ8-ϋ8Α, 82: 1526-1530 (1985); 8ои/а, е! а1. 8с1епсе, 232: 61-65 (1986) и СаЬп^е, 1. 8еттатк т Нета!о1оду, 26:2 1-14 (1989)). С-С8Г очищают до гомогенности из надосадочной жидкости клеточной культуры клеточной линии карциномы мочевого пузыря человека 5637 (Уе1!е е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8ст (1985), 82:1526-30). Последовательность кДНК, кодирующая природный 11С-С8Е известна из работы 8оиха е! а1., 8с1епсе (1986), 232:61-65. Вследствие альтернативного сплайсинга в указанном втором интроне существуют две природные формы 11С-С8Е содержащие 204 или 207 аминокислот, из которых

- 5 019968 первые 30 представляют собой сигнальный пептид (Ьутрйокшек, 1ВЬ Ргекк, ОхГогб, ХУаЧипЦоп Ό.Ο. Ебйогк Ό. Ма1е и С. Вюк^ооб). Было показано, что зрелый белок имеет молекулярную массу около 19 кДа и имеет 5 цистеиновых остатков, которые могут образовывать межмолекулярные или внутримолекулярные дисульфидные мостики. Исследования связывания показали, что ЙС-С8Е связывается с нейтрофильными гранулоцитами. Слабое связывание или его отсутствие наблюдаются с эритроидами, лимфоидными эозинофильными клеточными линиями, так же, как с макрофагами.

У людей эндогенный С-С8Е детектируется в плазме крови (1опек е! а1. Ва1Шеге'8 С11шеа1 Нета!о1оду, 2:1 83-111 (1989)). 11С-С8Е продуцируется фибробластами, макрофагами, Т-клетками, трофобластами, эндотелиальными клетками и эпителиальными клетками и представляет собой продукт экспрессии одной копии гена, включающего четыре эксона и пять интронов, расположенных на хромосоме семнадцать. Транскрипция указанного локуса продуцирует тип мРНК, которая дифференциально процессируется, что приводит к двум формам ЙС-С8Е мРНК, причем одна версия кодирует белок из 177 аминокислот, а другая кодирует белок из 174 аминокислот (Ыада1а е! а1. ЕМВО 1., 5: 575-581 (1986)), и было обнаружено, что форма, содержащая 174 аминокислоты, обладает наибольшей специфической ίη У1уо биологической активностью. 11С-С8Р представляют собой виды перекрестнореакционноспособные, так что, когда человеческие С-С8Е вводят другим млекопитающим, таким как мыши, собаки или обезьяны, вырабатывается устойчивый нейтрофильный лейкоцитоз (Мооге, е! а1. ΡΝΆδ-υδΆ, 84: 7134-7138 (1987)).

С-С8Е можно получить и выделить из многих источников. Природные человеческие С-С8Е (пйСС8Е) можно выделить из надосадочных жидкостей культивируемых клеточных линий опухолей человека. Создание технологии рекомбинантных ДНК, см., например, патент США № 4810643 (8ои/а), который включен в описание посредством ссылки, обеспечил получение в промышленных количествах С-С8Е в гликозилированной форме как продукт экспрессии эукариотных клеток-хозяев и С-С8Е в негликозилированной форме как продукт экспрессии прокариотных клеток-хозяев.

Было обнаружено, что С-С8Е можно использовать для лечения таких показаний, при которых увеличение количества нейтрофилов оказывает положительное действие. С-С8Е может мобилизовывать стволовые клетки и клетки-предшественники из костного мозга и его используют для лечения пациентов, гранулоциты которых истощены в результате химиотерапии, или как подготовку к трансплантации костного мозга. Например, для больных раком пациентов С-С8Е является хорошим средством для селективной стимуляции продуцирования нейтрофилов для компенсации гематопоэтического дефицита, возникшего в результате химиотерапии или радиационной терапии. Другие показания включают лечение различных инфекционных заболеваний и родственных состояний, таких как сепсис, которые обычно вызываются за счет метаболизма бактерий. С-С8Е можно использовать отдельно или в комбинации с другими соединениями, такими как другие цитокины, для роста или размножения клеток в культуре, например для трансплантатов костного мозга.

С-С8Е рецептор (С-С8ЕВ) является членом семейства рецепторов факторов роста гемато поэтических цитокинов, которое включает некоторые другие рецепторы факторов роста, такие как рецепторы интерлейкина (1Ь)-3, -4 и -6 рецепторы, рецепторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (СМ-С8Е), рецептор эритропоэтина (ЕРО), также как рецепторы пролактина и гормона роста; см. Вахап, Ргос. №И. Асаб. δα υδΑ, 87: 6934-6938 (1990). Члены семейства рецепторов цитокинов содержат четыре консервативных цистеиновых остатка и мотив триптофан-серин-Х-триптофан-серин, расположенный непосредственно вне трансмембранного участка. Считают, что консервативные последовательности участвуют во взаимодействиях белок-белок; см., например, СЫЬа е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Век. Сотт., 184: 485-490 (1992). Рецептор 6-ί.’δΕ состоит из одной пептидной цепи с молекулярной массой около 150 кДа (№со1а, 1ттипо1. Тобау, 8 (1987), 134).

Гликозилированный 1ιΟ-ί.'δΡ сравнивают с дегликозилированным ΗΟ-ΕδΡ, полученным ίη νίΙΐΌ в результате ферментативного гидролиза нейраминидазой и эндо-а-№ацетилгалактозаминидазой, в отношении его стабильности как функции рН и температуры (Ой-еба е! а1., 1990, 1. Вю1. Сйет., 265 (20): 11432-35). Дегликозилированный ΗΟ-ΕδΡ, растворенный в концентрации 1 мкг/мо в 20 мМ фосфатном буфере, содержащем 0,2 М №1С1 и 0,01% Т\\ееп 20, быстро инактивируется в интервале значений рН от около 7 до около 8 после двух дней инкубирования при 37°С. Напротив, гликозилированный 1ιΟ-ί.'δΡ сохраняет более 80% своей активности в тех же условиях. Кроме того, оценка термостабильности обеих форм ΗΟ-ΕδΡ, определенная в биологическом анализе и в колориметрическом анализе, показывает, что дегликозилированный 1ιΟ-ί.'δΡ был менее термостабилен, чем нативная форма 1ιΟ-ί.'δΡ.

Было предпринято несколько попыток получить стабильную фармацевтически приемлемую 6-ί.'δΕ композицию. Одна из попыток повышения стабильности композиции 6-ί.'δΕ включает синтез производных белка. В патенте США № 5665863 раскрыто получение рекомбинантных химерных белков, содержащих Ο-ΕδΡ, соединенных с альбумином, которые обладают новыми фармакокинетическими свойствами. В патентах США №№ 5824784 и 5320840 описано химическое присоединение водорастворимых полимеров к белкам для повышения стабильности и обеспечения защиты против протеолитического разложения и, более конкретно, Ν-терминально модифицированные 6-ί.'δΕ молекулы, содержащие химически присоединенные полимеры, включая полиэтиленгликоль.

- 6 019968

Структуры ряда цитокинов, включая С-С8Е (Ζίη1< е! а1., ЕЕВ8 Бей, 314:435 (1992); Ζίη1< е! а1., ВюсНепиМп. 33:8453 (1994); НШ е! а1., Ргос. Ыа11. Асаб. 8οΐ. И8А, 90:5167 (1993)), СМ-С8Е (ВкбеисЬв, К., е! а1. 8с1епсе, 154: 1779-1782 (1991); ХУаИет е! а1., 1. Мо1. Вю1., 224:1075-1085 (1992)), Ш-2 (Вахт. ЕЕ. 8с1епсе, 257: 410-411 (1992); МсКау, Ό.Β. 8с1епсе, 257: 412 (1992)), Ш-4 (ВебТ1е1б е! а1., Вюсйетщ!гу, 30: 11029-11035 (1991); Ротега е! а1., 8аепсе, 256:1673-1677 (1992)) и Ш-5 (МбЬит е! а1., Уинге. 363: 172-176 (1993)), были определены с помощью дифракции рентгеновских лучей и ЯМР исследований и продемонстрировали поразительный консерватизм СН структуры, несмотря на отсутствие существенной гомологичности основной последовательности.

Альтернативный подход к повышению стабильности С-С8Е в композиции включает изменение аминокислотной последовательности белка. В патенте США № 5416195 раскрыты генетически сконструированные аналоги С-С8Е, обладающие повышенной композиционной стабильностью, где цистеиновый остаток, обычно расположенный в положении 17 цепи зрелого полипептида, остаток аспарагиновой кислоты, расположенный в положении 27, и по меньшей мере один из тандемных остатков пролина, расположенных в положениях 65 и 66, все заменены сериновым остатком. В патенте США № 5773581 раскрыты генетически сконструированные аналоги С-С8Е, которые были ковалентно конъюгированы с водорастворимым полимером.

Различные формы человеческого С-С8Е, включая их получение и очистку, которые можно использовать в способе лечения или профилактики мастита, подробно раскрыты в патенте США № 4810643, который включен в описание посредством ссылки. В патенте США № 4810643 раскрыты и заявлены новые генные сегменты, биологически функциональные рекомбинантные плазмиды и вирусные ДНК векторы и прокариотные и эукариотные клетки-хозяева, которые содержат С-С8Е ген или генетически сконструированный вариант С-С8Е гена. Клетки-хозяева экспрессируют биологически активные С-С8Е или генетически сконструированный вариант С-С8Е. В патентах США № 5849883 и \У0 89/10932 раскрыты различные исследования человеческого С-С8Е в крупном рогатом скоте. Указанные исследования проводились для оценки респираторных заболеваний (РайеитеПа йето1уйса), реакций на бактериальные заражения (К1еЬ81е11а рпеитоша) или колиформного мастита (Е. со11) у скота.

В патенте США № 5849883, который полностью включен в описание посредством ссылки, представлен полинуклеотид и полипептидная последовательность зрелого бычьего С-С8Е (ЬС-С8Е) и раскрыты способы клонирования, выделения и очистки указанного полипептида и его аналогов. Зрелый ЬСС8Е состоит из 174 аминокислот в длину (8ЕЦ ГО N0: 1) и на 82% гомологичен с 11С-С8Е. Полипептид ЬС-С8Е с начальным аминокислотным остатком метионином представлен как 8ЕЦ ГО N0: 2. Полинуклеотидная последовательность, которая кодирует 8ЕЦ ГО N0: 1, представлена как 8ЕЦ ГО N0: 3. Полинуклеотидная последовательность, которая кодирует 8ЕЦ ГО N0: 2, представлена как 8ЕЦ ГО N0: 4. Не1бап е! а1. описывают экспрессию, очистку и биологическую активность ЬС-С8Е в Уе!еттагу 1ттипо1оду апб 1ттипора1йо1оду (2001) 81:45-57.

Ковалентное присоединение гидрофильного полимера поли(этиленгликоля), сокращенно ПЭГ, представляет собой способ повышения растворимости в воде, биодоступности, увеличения времени полужизни в сыворотке, повышения времени терапевтической полужизни, модулирования иммуногенности, модулирования биологической активности или продления времени циркуляции многих биологически активных молекул, включая белки, пептиды и особенно гидрофобные молекулы. ПЭГ интенсивно используют в фармацевтических препаратах, в искусственных имплантатах и в других применениях, где важным являются биосовместимость, отсутствие токсичности и отсутствие иммуногенности. Для достижения максимума желательных свойств ПЭГ полная молекулярная масса и гидратационное состояние ПЭГ полимера или полимеров, присоединенных к биологически активной молекуле, должны быть достаточно высоки, чтобы придать выгодные характеристики, обычно связанные с присоединением РЕС полимера, такие как повышенная растворимость в воде и увеличение циркуляционного времени полужизни, при этом не оказывая вредного воздействия на биоактивность исходной молекулы.

Производные ПЭГ часто связаны с биологически активными молекулами через реакционноспособные химические функциональности, такие как лизиновый, цистеиновый и гистидиновый остатки, N конец и углеводные молекулы. Белки и другие молекулы часто имеют ограниченное число реакционноспособных сайтов, доступных для присоединения полимера. Часто сайты, которые наиболее подходят для модификации через присоединение полимера, играют значительную роль в рецепторном связывании и необходимы для сохранения биологической активности молекулы. В результате беспорядочного присоединения полимерных цепей к таким реакционноспособным сайтам биологически активной молекулы часто происходит значительное ослабление или даже полная потеря биологической активности модифицированной полимером молекулы. В. С1агк е! а1. (1996), 1. Вю1. Сйет., 271: 21969-21977. Для создания конъюгатов, обладающих достаточной молекулярной массой полимера для придания необходимых преимуществ мишеневой молекуле, применявшийся ранее подход обычно состоял в произвольном присоединении множества полимерных ветвей к молекуле, тем самым повышая риск ослабления или даже полной потери биоактивности исходной молекулы.

Реакционноспособные сайты, которые образуют локусы для присоединения производных ПЭГ к белкам, определяются структурой белков. Белки, включая ферменты, состоят из различных последова- 7 019968 тельностей альфа-аминокислот, которые имеют общую структуру Η₂Ν-ΟΗΒ-ΟΘΘΗ. Альфааминомолекула (Η₂Ν-) аминокислоты присоединяется к карбоксильной молекуле (-СООН) соседней аминокислоты с образованием амидной связи, что можно представить как -(ΝΗ-ί'ΉΡ-ίΌ),где подстрочное п может принимать значения сотен или тысяч. Фрагмент, представленный как В, может содержать реакционноспособные сайты для биологической активности белка и для присоединения производных ПЭГ.

Например, в случае аминокислоты лизин существует -ΝΗ₂ молекула в эпсилон положении, также как в альфа положении. Эпсилон -ΝΗ₂ свободен для реакции в условиях щелочных значений рН. Множество работ в области получения производных белка, содержащих ПЭГ, были направлены на создание производных ПЭГ для присоединения к эпсилон -ΝΗ2 молекуле лизиновых остатков, присутствующих в белках. Ро1уе1йу1епе 61усо1 апб Эспуабусх £от Абуапсеб РЕ6у1айоп, №к!ат Мо1еси1аг Епщпееппд Са!а1од, 2003, р. 1-17. Все указанные производные ПЭГ имеют, однако, общее ограничение, состоящее в том, что их нельзя включить селективно среди множества лизиновых остатков, расположенных на поверхности белков. Это является существенным ограничением в случае, когда лизиновый остаток важен для активности белка, существующей в сайте ферментной активности, например, или в случае, когда лизиновый остаток играет роль в опосредовании взаимодействия белка с другой биологической молекулой, как в случае сайтов рецепторного связывания.

Вторая и одинаково важная сложность существующих способов ПЭГилирования белков состоит в том, что производные ПЭГ могут претерпевать нежелательные побочные реакции с другими остатками, отличающимися от желательных. Гистидин содержит реакционноспособную имино-молекулу, представленную структурно как -Ν(Η)-, но многие химически реакционноспособные виды, которые реагируют с эпсилон -ΝΗ2, могут также реагировать с -Ν(Η)-. Аналогично, боковая цепь аминокислоты цистеина содержит свободную сульфгидрильную группу, представленную структурно как -8Η. В некоторых случаях производные ПЭГ, направленные по -ΝΗ2 группе лизина, также реагируют с цистеиновым, гистидиновым или другими остатками. Это создает сложные, гетерогенные смеси ПЭГ-производных биоактивных молекул и риск нарушения активности биоактивной молекулы, являющейся целью. Было бы желательно создать такие производные ПЭГ, которые позволили бы вводить химически функциональную группу в один сайт в белке, что обеспечило бы селективное присоединение одного или более из ПЭГ полимеров к биоактивной молекуле по специфическим сайтам на поверхности белка, которые являются одновременно хорошо известными и предсказуемыми.

Кроме лизиновых остатков, значительные попытки специалистов были направлены на создание активированных ПЭГ реагентов на другие боковые цепи аминокислот, включая цистеин, гистидин и Νконец; см., например, патент США № 6610281, который включен в описание посредством ссылки, и Ро1уе111у1епе 61усо1 апб Эег|уа1|уе5 £от Абуапсеб РЕ6у1айоп, №к1ат Мо1еси1аг Епщпееппд Са1а1од, 2003, р. 1-17. Цистеиновый остаток можно вводить сайт-селективно в структуры белков, используя сайтнаправленный мутагенез и другие методы, известные специалистам, и полученную свободную сульфгидрильную молекулу можно подвергнуть взаимодействию с производным ПЭГ, которое содержит тиолреакционноспособные функциональные группы. Такой подход, однако, сложен в том, что введение свободной сульфгидрильной группы может осложнить экспрессию, укладку (фолдинг) и стабильность полученного белка. Поэтому было бы желательно иметь средства для введения химически функциональной группы в биоактивные молекулы, которые обеспечили бы селективное присоединение одного или более из ПЭГ полимеров к белку, который одновременно оставался бы совместимым с (то есть не участвовал бы в нежелательных побочных реакциях с) сульфгидрилами и другими химически функциональными группами, обычно присутствующими в белках.

Как видно из обзора, многие из указанных производных, которые были созданы для присоединения к боковым цепям белков, особенно -ΝΗ₂ молекулы на боковой цепи аминокислоты лизина и -8Η молекулы на боковой цепи цистеина, была доказана проблематичность их синтеза и применения. Некоторые образуют нестабильные связи с белком, которые подвержены гидролизу и поэтому разрушаются, или оказываются другим образом нестабильными в водной среде, такой как кровоток. Некоторые образуют более стабильные связи, но подвергаются гидролизу прежде, чем связь образуется, что означает, что реакционноспособная группа на ПЭГ производном может быть инактивирована прежде, чем белок может быть присоединен. Некоторые являются в некоторой степени токсичными и поэтому менее подходящими для применения ш у|уо. Некоторые реагируют слишком медленно, чтобы иметь практическое значение. Некоторые приводят к потере активности белка, присоединяясь к сайтам, ответственным за активность белка. Некоторые не являются специфическими в сайтах, к которым они должны присоединиться, что также сможет привести к утрате желательной активности и к отсутствию воспроизводимости результатов. Для преодоления проблем, связанных с модифицированием белков молекулами поли(этиленгликоля), были созданы производные ПЭГ, которые были более стабильными (например, см. патент США 6602498, который включен в описание посредством ссылки) или которые селективно реагируют с тиольными молекулами на молекулах и на поверхности (например, см. патент США 6610281, который включен в описание посредством ссылки). Существует настоятельная необходимость в ПЭГ производных, которые были бы химически инертными в физиологической среде до селективной реакции с

- 8 019968 образованием стабильных химических связей.

Применение конъюгатов гидроксиалкилкрахмала и, в частности, применение гидроксиэтилкрахмала (НЕ8), ковалентно связанного с полипептидом, было раскрыто для потенциального изменения иммуногенности полипептида и/или аллергенности. ПЭГ илирование представляет собой альтернативную методику, которая обсуждалась в ряде патентных заявок, принадлежащих Етекепшк КаЫ А.В., включая патентные публикации США №№ 20050063943, 20060121073, 20010100163, 20050234230, 20050238723, 20060019877, 20070134197, 20070087961, а также патент США № 7285661, причем все они включены в описание посредством ссылки. НЕ8 представляет собой модифицированный природный полимер, который был клинически использован в качестве агента, увеличивающего объем плазмы, и ПЭГилирование представляет собой методику присоединения лекарственного вещества к НЕ8 производным для модификации характеристик лекарственного вещества, таких как фармакокинетика или растворимость в воде. Характеристики также включают пролонгирование циркуляции белка в плазме за счет повышенной стабильности молекулы и пониженного почечного клиренса, что приводит к повышению биологической активности. Кроме того, могут быть снижены иммуногенность или аллергенность. Изменяя различные параметры, такие как молекулярная масса НЕ8, можно создать широкий круг НЕ8 конъюгатов. Тем не менее, гидроксиэтилкрахмал имеет недостаток, общий с другими доступными в настоящее время полимерами: их полидисперсность. Полимерные конъюгаты представляют собой смесь молекул с молекулярно массовым распределением около среднего значения. Такой недостаток гомогенности приводит к низким уровням химической и биохимической характеризации и может предотвратить достижение фармацевтически активным компонентам сайта его действия (рецептора, фермента и т.д.). В таких случаях, чтобы лекарственное средство было активным, необходима его доставка в исходной неконъюгированной форме и таким образом расщепление полимера в метаболических реакциях требуется для его фармацевтической эффективности.

Недавно появились сообщения о совершенно новой методике в науке о белках, которая обещает преодолеть многие из ограничений, связанных с сайт-специфическими модификациями белков. Более конкретно, новые компоненты были добавлены к механизму биосинтеза белков прокариотной ЕксйейсЫа сой (Е. сой) (например, Ь. Уапд, е! а1. (2001), 8с1епсе, 292:498-500) и эукариотным 8ассйтотусе5 сегеуыае (8. сегеуыае) (например, 1. СЫп е! а1., 8с1епсе, 301: 964-7 (2003)), что сделало возможным включение не кодируемой генетически аминокислоты в белки ίη νίνο. Ряд новых аминокислот с новыми химическими, физическими или биологическими свойствами, включая метки фотосродства и фотоизомеризуемые аминокислоты, фотосшиваемые аминокислоты (см., например, СЫп, 1.У., е! а1. (2002) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 99: 11020-11024 и СЫп, ТУ., е! а1. (2002) 1. Ат. Сйет. 8ос., 124:9026-9027), кетоаминокислоты, аминокислоты, содержащие тяжелые атомы, и гликозилированные аминокислоты, были эффективно и с высокой точностью включены в белки в Е. сой и в дрожжи в ответ на амбер-кодон, ТАС, используя указанную методику; см., например, 1АУ. СЫп е! а1., (2002), 1оитпа1 о! !йе Атепсап СйетЫа1 8ос1е1у. 124:9026-9027; ТУ. СЫп, & Р.С. 8сйи1Ы, (2002), СйетВюСйет, 3(11):1135-1137; ТУ. СЫп, е! а1., (2002), РЫА8 Ипйеб 81а!е§ о! Атепса. 99: 11020-11024 и Ь. Уапд, & Р.С. 8сйи112, (2002), Сйет. Сотт., 1:1-11. Все ссылки полностью включены в описание посредством ссылки. Представленные исследования продемонстрировали, что возможно селективно и рутинно вводить химические функциональные группы, такие как кетонные группы, группы алкина и азидные молекулы, которые не встречаются в белках, которые химически инертны в отношении всех функциональных групп, присутствующих в 20 обычных, генетически кодируемых аминокислотах, и которые можно использовать для селективной и эффективной реакции с образованием стабильной ковалентной связи.

Способность включать не кодируемые генетически аминокислоты в белки позволяет вводить химические функциональные группы, которые могут предоставить альтернативы природным функциональным группам, таким как эпсилон - ЛН₂ лизина, сульфгидрил -8Н цистеина, иминогруппа гистидина и т.д. Известно, что некоторые химические функциональные группы инертны в отношении функциональных групп, присутствующих в 20 обычных, кодируемых генетически аминокислотах, но реагируют точно и эффективно с образованием стабильной связи. Азидные и ацетиленовые группы, например, как известно специалистам, претерпевают реакцию [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена в присутствии каталитического количества меди; см., например, Тогпое, е! а1., (2002) 1. βτ§. Сйет., 67:3057-3064 и ВоЧоуЬеу. е! а1. (2002) Апде\\·. Сйет., 1п!. Еб, 41:2596-2599. Путем введения азидной молекулы в структуру белка, например, можно включить функциональную группу, которая химически инертна в отношении аминов, сульфгидрилов, карбоксильных кислот, гидроксильных групп, находящихся в белках, но которая также реагирует хорошо и эффективно с ацетиленовой молекулой с образованием продукта циклоприсоединения. Важно, что в отсутствие ацетиленовой молекулы азид остается химически инертным и нереакционноспособным в присутствии других боковых цепей белков и в физиологических условиях.

Настоящее изобретение нацелено, среди прочего, на проблемы, связанные с активностью и продуцированием полипептидов ЙС-С8Е, и также нацелено на получение полипептида ЙС-С8Е с улучшенными биологическими или фармакологическими свойствами и/или повышенным терапевтическим временем полужизни.

- 9 019968

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предложены полипептиды ЬС-С8Р, включающие одну или более не кодируемых в природе аминокислот.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает одну или более из посттрансляционных модификаций. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р связан с линкером, полимером или биологически активной молекулой. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р связан с бифункциональным полимером, бифункциональным линкером или по меньшей мере одним дополнительным полипептидом ЬС-С8Р.

В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах указанный водорастворимый полимер включает молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером линкером или связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах молекула поли(этиленгликоля) является бифункциональным полимером. В некоторых вариантах бифункциональный полимер связан со вторым полипептидом. В некоторых вариантах указанный второй полипептид представляет собой полипептид ЬС-С8Р.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает по меньшей мере две аминокислоты, связанные с водорастворимым полимером, включающим молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах по меньшей мере одна аминокислота представляет собой не кодируемую в природе аминокислоту.

В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений в ЬС-С8Р: перед положением 1 (то есть на Ν-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,

38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,

68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,

121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142,

143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164,

165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (то есть на карбоксильном конце белка) и любую их комбинацию (8ЕО ГО ΝΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8Εβ ГО ΝΟ: 2 либо соответствующие аминокислоты в другом полипептиде ЬС-С8Р).

В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений ЬС-С8Р: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173 и любую из их комбинаций из 8ЕО ГО ΝΟ: 1 или соответствующих аминокислот в 8ЕО ГО ΝΟ: 2. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений в ЬС-С8Р: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166 и любую из их комбинаций (8ЕО ГО ΝΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО ΝΟ: 1). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений ЬС-С8Р: 3, 7, 62, 133, 166 и любую из их комбинаций из 8ЕО ГО ΝΟ: 1 или соответствующих аминокислот в 8ЕО ГО ΝΟ: 2. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений ЬСС8Р: 62, 133 и их комбинаций (8ЕО ГО ΝΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО ΝΟ: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в положении 62 ЬС-С8Р (8ЕО ГО ΝΟ: 1 или соответствующая аминокислота в 8ЕО ГО ΝΟ: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в положение 133 ЬС-С8Р (8ЕО ГО ΝΟ: 1 или соответствующая аминокислота в 8ЕО ГО ΝΟ: 2). В некоторых вариантах полипептид по настоящему изобретению включает одно или более из природных аминокислотных замещений, добавлений или делеций. В некоторых вариантах одна или более из неприродных аминокислот включена в лидерную или в сигнальную последовательность, которая является Ν- или С-терминальной в отношении 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2 или другой ЬС-С8Р последовательности.

В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения: перед положением 1 (то есть на Ν-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 1 11, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135,

136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,

158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (то есть на карбоксильном конце белка) и любую их комбинацию (8ЕО ГО ΝΟ: 1 или у соответствующих аминокислот в

8ЕО ГО ΝΟ: 2 либо у соответствующих аминокислот в другом полипептиде ЬС-С8Р). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173 и любую их комбинацию (8ЕО ГО ΝΟ: 1 или соответствующие

- 10 019968 аминокислоты в 8ЕО ГО N0: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166 и любую их комбинацию (8Е0 ГО N0: 1 или соответствующие аминокислоты в 8Е0 ГО N0: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3, 7, 62, 133, 166 и любую их комбинацию (8Е0 ГО N0: 1 или соответствующие аминокислоты в 8Е0 ГО N0: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 62, 133 и их комбинацию (8Е0 ГО N0: 1 или соответствующие аминокислоты в 8Е0 ГО N0: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в положении 62 связана с водорастворимым полимером (8Е0 ГО N0: 1 или соответствующей аминокислотой в 8Е0 ГО N0: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в положении 133 связана с водорастворимым полимером (8Е0 ГО N0: 1 или соответствующей аминокислотой в 8Е0 ГО N0: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в сигнальной или лидерной последовательности И- или С-терминальной относительно 8Е0 ГО N0: 1, 2 или другой ЬС-С8Е последовательности связана с водорастворимым полимером.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют сродство полипептида ЬС-С8Е к рецептору или к связываемому партнеру, включая, без ограничения, белок, полипептид, малые молекулы или нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е включает замещение, добавление или делецию, которые повышают стабильность полипептида ЬС-С8Е по сравнению со стабильностью соответствующих полипептидов ЬС-С8Е без замещения, добавления или делеции. Стабильность и/или растворимость можно измерить, используя ряд различных анализов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Такие анализы включают, без ограничения, 8Е-НРЬС и КР-НРЬС. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют иммуногенность полипептида ЬС-С8Е по сравнению с иммуногенностью соответствующих полипептидов ЬС-С8Е без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют время полужизни в сыворотке или время циркуляции полипептида ЬС-С8Е по сравнению со временем полужизни в сыворотке или со временем циркуляции соответствующих ЬС-С8Е без замещения, добавления или делеции.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е включает замещение, добавление или делецию, которые повышают водорастворимость полипептида ЬС-С8Е по сравнению с водорастворимостью соответствующих полипептидов ЬС-С8Е без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е включает замещение, добавление или делецию, которые повышают растворимость полипептида ЬС-С8Е. продуцируемого в клетке-хозяине, по сравнению с растворимостью соответствующих ЬС-С8Е без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е включает замещение, добавление или делецию, которые повышают экспрессию полипептида ЬС-С8Е в клеткехозяине или повышают синтез ίη νίίτο по сравнению с экспрессией или синтезом соответствующих ЬСС8Р без замещения, добавления или делеции. Полипептид ЬС-С8Р, включающий такое замещение, сохраняет агонистическую активность и сохраняет или повышает уровни экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает замещение, добавление или делецию, которые повышают устойчивость протеазы полипептида ЬС-С8Р по сравнению с устойчивостью протеазы соответствующих ЬС-С8Р без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют активность сигнальной трансдукции рецептора по сравнению с активностью рецептора при взаимодействии с соответствующим полипептидом ЬС-С8Р без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют его связывание с другой молекулой, такой как рецептор, по сравнению со связыванием соответствующих полипептидов ЬС-С8Р без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют гематопоэз по сравнению с гематопоэзом соответствующих полипептидов ЬС-С8Р без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют пролиферацию нейтрофилов по сравнению с пролиферацией нейтрофилов соответствующих полипептидов ЬС-С8Р без замещения, добавления или делеции. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает замещение, добавление или делецию, которые модулируют созревание нейтрофилов по сравнению с созреванием нейтрофилов соответствующих полипептидов ЬС-С8Р без замещения, добавления или делеции.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р включает замещение, добавление или делецию, которые повышают совместимость полипептида ЬС-С8Р с фармацевтическими консервантами (например, текрезолом, фенолом, бензиловым спиртом) по сравнению с совместимостью соответствующих ЬС-С8Р без замещения, добавления или делеции. Такое повышение совместимости должно обеспечить возможность получения законсервированных фармацевтических композиций, которые сохраняют физикохимические свойства и биологическую активность белка в процессе хранения.

В некоторых вариантах одну или более из сконструированных связей создают с одной или более из

- 11 019968 неприродных аминокислот. Внутримолекулярную связь можно создать различными способами, включая, без ограничения, реакцию между двумя аминокислотами в белке в подходящих условиях (одна или обе аминокислоты могут быть неприродными аминокислотами); реакцию двух аминокислот, каждая из которых может быть кодируемой в природе или не кодируемой в природе, с линкером, полимером или другой молекулой в подходящих условиях; и т.д.

В некоторых вариантах одно или более из аминокислотных замещений в полипептиде ЬС-С8Е может осуществляться одной или более из природных или неприродных аминокислот. В некоторых вариантах аминокислотные замещения в полипептиде ЬС-С8Е могут осуществляться природными или неприродными аминокислотами при условии, что по меньшей мере одно замещение происходит не кодируемой в природе аминокислотой. В некоторых вариантах одно или более из аминокислотных замещений в полипептиде ЬС-С8Е происходит одной или более из природных аминокислот и, кроме того, по меньшей мере одно замещение происходит не кодируемой в природе аминокислотой.

В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает карбонильную группу, ацетильную группу, аминооксигруппу, группу гидразина, группу гидразида, группу семикарбазида, группу азида или группу алкина.

В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает карбонильную группу. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота имеет следующую структуру:

ЯзНМ соя.

где η принимает значения 0-10; В! представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил; В₂ представляет собой Н, алкил, арил, замещенный алкил и замещенный арил; В₃ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую аминоконец; и В₄ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбоксиконец.

В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает аминооксигруппу. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает группу гидразида. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает группу гидразина. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты включает группу семикарбазида.

В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты включает группу азида. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота имеет следующую структуру:

«ощутишь щнмсок, где η принимает значения 0-10; В₁ представляет собой алкил, арил, замещенный алкил, замещенный арил или отсутствует; X представляет собой О, Ν, 8 или отсутствует; т принимает значения 0-10; В₂представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую аминоконец; и В3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбоксиконец.

В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает группу алкина. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота имеет следующую структуру:

(СН^БЦХЮНг^ССН κ₂ην сок.

где η принимает значения 0-10; В1 представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил; X представляет собой О, Ν, 8 или отсутствует; т принимает значения 0-10; В₂ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую аминоконец; и В3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или группу, модифицирующую карбоксиконец.

В некоторых вариантах полипептид представляет собой агонист, частичный агонист, антагонист, частичный антагонист или обратный агонист полипептида ЬС-С8Е. В некоторых вариантах агонист, частичный агонист, антагонист, частичный антагонист или обратный агонист полипептида ЬС-С8Е включают не кодируемую в природе аминокислоту, связанную с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах указанный водорастворимый полимер включает молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах агонист, частичный агонист, антагонист, частичный антагонист или обратный агонист полипептида ЬС-С8Е включают не кодируемую в природе аминокислоту и одну или более из посттрансляционных модификаций, линкеров, полимеров или биологически активных молекул.

В настоящем изобретении также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях с 8ЕО ГО ΝΟ: 3, 4 или нуклеиновыми кислотами, которые кодируют полипептиды 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2. В настоящем изобретении также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях с 8ЕО ГО ΝΟ: 3, 4 или полинуклеотидами, которые гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидами, которые кодируют полипептиды, представленные как 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2, где указанный полинуклеотид включает по меньшей мере один селекторный кодон. В настоящем изобретении также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который кодирует полипептиды, представленные как 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2. В настоящем изобретении также предложены выделенные нук

леиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который кодирует полипептиды, представленные как 8ЕО Ш N0: 1, 2 с одной или более из не кодируемых в природе аминокислот. Специалисты в данной области легко поймут, что множество различных полинуклеотидов может кодировать любой полипептид по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах селекторный кодон выбирают из группы, состоящей из янтарного кодона, охра-кодона, опал-кодона, уникального кодона, редкого кодона, пятиосновного кодона и четырехосновного кодона.

В настоящем изобретении также предложены способы получения полипептида ЬС-С8Р, связанного с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах указанный способ включает осуществление контактирования выделенного полипептида ЬС-С8Р, включающего не кодируемую в природе аминокислоту, с водорастворимым полимером, включающим молекулу, которая реагирует с не кодируемой в природе аминокислотой. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота, включенная в полипептид ЬС-С8Е, является реакционноспособной в отношении водорастворимого полимера, который иначе является нереакционноспособным в отношении любой из 20 обычных аминокислот. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота, включенная в полипептид ЬС-С8Е, является реакционноспособной в отношении линкера, полимера или биологически активной молекулы, которая иначе является нереакционноспособной в отношении любой из 20 обычных аминокислот.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е, объединенный с водорастворимым полимером, получают, осуществляя взаимодействие полипептида ЬС-С8Е, включающего карбонилсодержащую аминокислоту, с молекулой поли(этиленгликоля), включающей аминооксигруппу, группу гидразина, группу гидразида или группу семикарбазида. В некоторых вариантах аминооксигруппа, группа гидразина, группа гидразида или группа семикарбазида связаны с молекулой поли(этиленгликоля) через амидную связь. В некоторых вариантах аминооксигруппа, группа гидразина, гидразида или семикарбазида связаны с молекулой поли(этиленгликоля)через карбаматную связь.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е, связанный с водорастворимым полимером, получают, осуществляя взаимодействие молекулы поли(этиленгликоля), включающей карбонильную группу, с полипептидом, включающим не кодируемую в природе аминокислоту, которая содержит аминооксигруппу, группу гидразина, группу гидразида или группу семикарбазида.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е, связанный с водорастворимым полимером, получают, осуществляя взаимодействие полипептида ЬС-С8Е, включающего алкинсодержащую аминокислоту с молекулой поли(этиленгликоля), включающей азидную молекулу. В некоторых вариантах группа азида или алкина связана с молекулой поли(этиленгликоля)через амидную связь.

В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Е, связанный с водорастворимым полимером, получают, осуществляя взаимодействие полипептида ЬС-С8Е, включающего азидсодержащую аминокислоту с молекулой поли(этиленгликоля), включающей молекулу алкина. В некоторых вариантах группы азида или алкина связаны с молекулой поли(этиленгликоля)через амидную связь.

В некоторых вариантах молекулярная масса молекулы поли(этиленгликоля) составляет величину от около 0,1 до около 100 кДа. В некоторых вариантах молекулярная масса молекулы поли(этиленгликоля) составляет величину от 0,1 до 50 кДа.

В некоторых вариантах молекула поли(этиленгликоля) представляет собой разветвленный полимер.

В некоторых вариантах молекулярная масса каждой ветви разветвленного полимера поли(этиленгликоля) составляет величину от 1 до 100 кДа или от 1 до 50 кДа.

В некоторых вариантах водорастворимый полимер, связанный с полипептидом ЬС-С8Е, включает молекулу полиалкиленгликоля. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты, включенной в полипептид ЬС-С8Е, включает карбонильную группу, аминооксигруппу, группу гидразида, группу гидразина, группу семикарбазида, группу азида или группу алкина. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты, включенной в полипептид ЬС-С8Е, включает карбонильную молекулу и водорастворимый полимер включает аминоокси молекулу, молекулу гидразида, гидразина или семикарбазида. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты, включенной в полипептид ЬС-С8Е, включает молекулу алкина и водорастворимый полимер включает азидную молекулу. В некоторых вариантах остаток не кодируемой в природе аминокислоты, включенной в полипептид ЬС-С8Е, включает азидную молекулу и водорастворимый полимер включает молекулу алкина.

В настоящем изобретении также предложены композиции, включающие полипептид ЬС-С8Е, включающий не кодируемую в природе аминокислоту и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером.

В настоящем изобретении также предложены клетки, включающие полинуклеотид, кодирующий полипептид ЬС-С8Е, включающий селекторный кодон. В некоторых вариантах указанные клетки включают ортогональную РНК синтетазу и/или ортогональную тРНК для замещения не кодируемой в природе аминокислоты в полипептид ЬС-С8Р.

В настоящем изобретении также предложены способы получения полипептида ЬС-С8Р, включающего не кодируемую в природе аминокислоту. В некоторых вариантах указанные способы включают

- 13 019968 культивирование клеток, включающих полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующие полипептид ЬС-С8Е. ортогональную РНК синтетазу и/или ортогональную тРНК, в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида БС-С8Р; и выделение полипептида БС-С8Р из клеток и/или культуральной среды.

В настоящем изобретении также предложены способы увеличения терапевтического времени полужизни, времени полужизни в сыворотке или времени циркуляции полипептидов БС-С8Р. В настоящем изобретении также предложены способы модулирования иммуногенности полипептидов БС-С8Р. В некоторых вариантах указанные способы включают замещение не кодируемой в природе аминокислотой любой одной или более из аминокислот в природных полипептидах БС-С8Р и/или связывание полипептида БС-С8Р с линкером, полимером, водорастворимым полимером или биологически активной молекулой.

В настоящем изобретении также предложены способы лечения нуждающегося в таком лечении пациента эффективным количеством БС-С8Р молекул по настоящему изобретению. В некоторых вариантах указанные способы включают введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей полипептид БС-С8Р, включающий неприродную аминокислоту и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах полипептид БС-С8Р гликозилирован. В некоторых вариантах полипептид БС-С8Р не гликозилирован.

В настоящем изобретении также предложены полипептиды БС-С8Р, включающие последовательность, представленную в 8ЕЦ Ш N0: 1, 2, или любую другую полипептидную БС-С8Р последовательность, при условии, что по меньшей мере одна аминокислота в ней замещена не кодируемой в природе аминокислотой. В настоящем изобретении также предложены полипептиды БС-С8Р, включающие последовательность, представленную как 8ЕЦ Ш N0: 1, 2. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота связана с водорастворимым полимером. В некоторых вариантах указанный водорастворимый полимер включает молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает карбонильную группу, аминооксигруппу, группу гидразида, группу гидразина, группу семикарбазида, группу азида или группу алкина.

В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемый носитель и полипептид БС-С8Р, включающий последовательность, представленную в 8ЕЦ Ш N0: 1, 2, или любую другую полипептидную БС-С8Р последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота замещена не кодируемой в природе аминокислотой. В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемый носитель и С-С8Р полипептид, включающий последовательность, представленную в 8ЕЦ Ш N0: 1, 2. В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота включает сахаридную молекулу. В некоторых вариантах водорастворимый полимер связан с полипептидом через сахаридную молекулу. В некоторых вариантах линкер, полимер или биологически активная молекула связаны с полипептидом БС-С8Р через сахаридную молекулу.

В настоящем изобретении также предложен полипептид БС-С8Р, включающий водорастворимый полимер, связанный ковалентной связью с полипептидом БС-С8Р по одной аминокислоте. В некоторых вариантах водорастворимый полимер включает молекулу поли(этиленгликоля). В некоторых вариантах аминокислота, ковалентно связанная с водорастворимым полимером, является не кодируемой в природе аминокислотой, присутствующей в полипептиде.

В некоторых вариантах по настоящему изобретению полипептид БС-С8Р, включающий НЕ8, связанный ковалентной связью с полипептидом БС-С8Р, связан по одной аминокислоте. В некоторых вариантах указанная единственная аминокислота, ковалентно связанная с НЕ8, является не кодируемой в природе аминокислотой, присутствующей в полипептиде. В некоторых вариантах по настоящему изобретению полипептид БС-С8Р включает множество не кодируемых в природе аминокислот, которые могут быть связаны с множеством НЕ8 и/или ПЭГ молекул.

В настоящем изобретении предложен полипептид БС-С8Г, включающий по меньшей мере один линкер, полимер или биологически активную молекулу, где указанные линкер, полимер или биологически активная молекула присоединены к указанному полипептиду через функциональную группу не кодируемой в природе аминокислоты, рибосомально включенной в указанный полипептид. В некоторых вариантах указанный полипептид является моноПЭГилированным. В настоящем изобретении также предложен полипептид БС-С8Г, включающий линкер, полимер или биологически активную молекулу, которые присоединены к одной или более из не кодируемых в природе аминокислот, где указанные не кодируемые в природе аминокислоты рибосомально включены в полипептид в заранее выбранных сайтах.

В объем настоящего изобретения включены БС-С8Г лидерная или сигнальная последовательности, соединенные с кодирующим участком БС-С8Г, также как гетерологичная сигнальная последовательность, соединенная с кодирующим участком БС-С8Г. Выбранная гетерологичная лидерная или сигнальная последовательность должна быть последовательностью, которая распознается и процессируется, например, системой секреции клетки-хозяина для секретирования и возможного расщепления сигнальной пептидазой клетки-хозяина. Способ лечения состояния или нарушения с использованием БС-С8Г по на

- 14 019968 стоящему изобретению подразумевает применение лечения с помощью ЬС-С8Р, содержащего или не содержащего сигнального или лидерного пептида.

В настоящем изобретении предложен способ лечения и профилактики инфекции у животных. В настоящем изобретении также предложен способ лечения и профилактики мастита и транспортной лихорадки крупного рогатого скота. В настоящем изобретении также предложен способ лечения инфекций у животных без создания штамма устойчивых бактерий. Кроме того, в настоящем изобретении предложен очищенный и выделенный полипептид, имеющий часть или всю конформацию первичной структуры и одно или более из биологических свойств природного бычьего С-С8Р, и ДНК последовательности, кодирующие такие бычьи С-С8Р.

В другом варианте настоящего изобретения один или более из дополнительных колониестимулирующих факторов вводят инфицированному животному с С-С8Р. включая, без ограничения, СМ-С8Р. М-С8Р и мульти-С8Р (1Ь-3). С8Р вводят вместе или отдельно. В следующем варианте инфекции животных лечат путем введения С-С8Р с одним или более из: интерферонов, включая, без ограничения, αинтерферон, 1Ь2 и ΤΝΡ, или с традиционными антибиотиками, включая, без ограничения, пенициллин, цефалоспорины и аминогликозиды.

В другом варианте лечение ЬС-С8Р используют в целях профилактики. ЬС-С8Р можно использовать в качестве профилактической обработки для усиления защитных сил животных, которые подвержены риску заражения бактериальной, дрожжевой или грибковой инфекцией. Например, ЬС-С8Р можно использовать в качестве профилактической обработки здоровых животных, подверженных риску заражения инфекцией, включая, без ограничения, пневмонию. Термин здоровый в том смысле, как здесь использован, означает животное с нормальным иммунитетом и нормальным количеством и дифференциалом лейкоцитов. Скот лечат профилактически перед транспортировкой или другими ситуациями, которые могут ослабить скот, чтобы повысить их способность побеждать инфекции. Введение ЬС-С8Р можно осуществить в то время, когда скот обрабатывают, то есть вакцинируют, клеймят и т.д. Обработку с помощью ЬС-С8Р можно также осуществить в период сухостоя и/или непосредственно перед отелом коровы, чтобы уменьшить возможность внутриматочной инфекции после отела и мастита на ранних стадиях лактации. 8ее КеНгН е! а1., Ат. 1. Уе!. Век., 50, Νο. 2, 207 (1989); Ойтег е! а1., 1. Байу δει., 71: 25842606 (1988) и Кейтй е! а1., 1. Байу δει. 74:4399-4412 (1991) для описания функций бычьих нейтрофилов на протяжении периода отела. Обычно обработку антибиотиками не осуществляют непосредственно перед отелом из-за остатков, которые могут появиться в коровьем молоке, делая его непригодным для использования.

В другом варианте конъюгирование полипептида ЬС-С8Р, включающего одну или более из неприродных аминокислот, с другой молекулой, включая, без ограничения, ПЭГ, позволяет получить, по существу очищенный ЬС-С8Р благодаря уникальной химической реакции, используемой для конъюгирования с неприродной аминокислотой. Конъюгирование ЬС-С8Р, включающего одну или более из не кодируемых в природе аминокислот, с другой молекулой, такой как ПЭГ, можно осуществить, используя другие методики очистки, осуществляемые перед или после стадии конъюгирования, получая практически чистые ЬС-С8Р.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображена плазмида, используемая для экспрессии ЬС-С8Р;

на фиг. 2 представлены подробности, касающиеся клеточной линии хозяина, используемой для экспрессии ЬС-С8Р;

на фиг. 3 представлен 8Б8 РАСЕ анализ экспрессии полипептидов ЬС-С8Р по настоящему изобретению;

на фиг. 4 представлен 8Б8 РАСЕ анализ пиковых фракций СМ РР колонки для ЬС-С8Р перед ПЭГилированием;

на фиг. 5 представлен 8Б8-РАСЕ анализ пиковых фракций 8Р НР колонки для ПЭГилированного ЬС-С8Р-Т133рАР;

на фиг. 6 представлен 8Б8-РАСЕ анализ Ь-СС8Р до и после ПЭГилирования;

на фиг. 7а представлен трипсин/С1и-С гидролизат дикого типа ЬС-С8Р (детектирование на 214 нм); на фиг. 7Ь представлен трипсин/С1и-С гидролизат ЬС-С8Р Т133рАР (детектирование на 214 нм); на фиг. 8а представлен трипсин/С1и-С гидролизат дикого типа ЬС-С8Р (детектирование на 250 нм); на фиг. 8Ь представлен трипсин/С1и-С гидролизат ЬС-С8Р Т133рАР (детектирование на 250 нм); на фиг. 9а представлен С1и-С гидролизат дикого типа ЬС-С8Р (детектирование на 214 нм);

на фиг. 9Ь представлен С1и-С гидролизат ЬС-С8Р Т133рАР (детектирование на 214 нм); на фиг. 10а представлен С1и-С гидролизат дикого типа ЬС-С8Р (250 нм детектирование); на фиг. 10Ь представлен С1и-С гидролизат ЬС-С8Р Т133рАР (250 нм детектирование); на фиг. 11 представлен 8ЕС-ВЭЖХ анализ ПЭГилированного полипептида ЬС-С8Р; на фиг. 12 представлен 8ЕС-ВЭЖХ анализ полипептида ЬС-С8Р;

на фиг. 13 представлены необработанные ЕС50 значения, полученные в Μ-ΝΡ860 пролиферационном анализе 20К ПЭГилированных бычьих С-С8Р Т133рАР и дикого типа;

на фиг. 14 представлены кратные ЕС50 различия в Μ-ΝΡ860 пролиферационном анализе 20К ПЭ

- 15 019968

Гилированных бычьих О-С8Е Т133рАЕ относительно дикого типа;

на фиг. 15 представлены результаты эксперимента анализа бычьих нейтрофилов, окрашенных СЭ11Ь антителом;

на фиг. 16 представлены результаты введения ПЭГилированных ЬО-С8Е в отношении ΑΝΟ;

фиг. 17 - линейный график, демонстрирующий абсолютное количество нейтрофилов (среднее ± ст.откл., ошибка) у телят, обработанных или буфером для лекарственного средства, или ПЭГилированным ЬО-С8Е после одной подкожной инъекции в дозе 40 мкг/кг;

фиг. 18 - линейный график, демонстрирующий среднее дневное производство молока коровами из примера 40 мкг/кг.

фиг. 19 - столбиковая диаграмма, демонстрирующая различия в количестве соматических клеток в дни 3, 5, 7 и 10 после отела между четырьмя группами коров, включая контрольную группу, группу, обработанную неПЭГилированными Ь0-С8Е при ежедневной обработке, группу, инъецированную ПЭГилированными Ь0-С8Е в дозе 40 мкг/кг, и группу, инъецированную ПЭГ илированными Ь0-С8Е в дозе 20 мкг/кг.

Определения

Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными, раскрытыми здесь методами, протоколами, клеточными линиями, конструкциями и реагентами и, как таковые, они могут варьироваться. Следует также понимать, что используемая здесь терминология приведена только для целей описания конкретных вариантов и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, которое должно быть ограничено только прилагаемой формулой изобретения.

В описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если только в контексте нет четких указаний на обратное. Так, например, ссылки на Ь0С8Е бычьи О-С8Е, Ь0-С8Е, бычий О-С8Е полипептид или полипептид Ь0-С8Е и различные формы с дефисом или без дефиса являются ссылкой на один или более из таких белков и включают их эквиваленты, известные специалистам в данной области и т.д.

Если не определено иначе, все использованные технические и научные термины имеют те же самые значения, которые обычно подразумевают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя можно использовать любые способы, устройства и материалы аналогичные или эквивалентные раскрытым здесь в практике или тестировании настоящего изобретения, далее будут раскрыты предпочтительные методы, устройства и материалы.

Все упомянутые в описании публикации и патенты включены посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, конструкций и методологий, которые раскрыты в публикациях, которые можно использовать в связи с раскрытым настоящим изобретением. Обсуждаемые здесь публикации предложены исключительно для их раскрытия перед датой подачи рассматриваемого изобретения. Ничего из приведенного здесь не следует толковать, как допущение того, что авторы изобретения не полномочны датировать задним числом такое раскрытие на основании более раннего изобретения или по каким-либо другим причинам.

Термин по существу очищенный относится к полипептиду Ь0-С8Е, который может, по существу, или практически не содержать компонентов, которые обычно сопутствуют белку или взаимодействуют с белком, как это происходит в его природном окружении, то есть природных клеток, или клеток-хозяев в случае рекомбинантно получаемых полипептидов Ь0-С8Е. Полипептиды Ь0-С8Е, которые могут практически не содержать клеточного материала, включают препараты белка, содержащие менее чем около 30, менее чем около 25, менее чем около 20, менее чем около 15, менее чем около 10, менее чем около 5, менее чем около 4, менее чем около 3, менее чем около 2 или менее чем около 1% (в расчете на сухой вес) загрязняющего белка. Если полипептид Ь0-С8Е или его вариант рекомбинантно получен с использованием клетки-хозяина, указанный белок может присутствовать в количестве около 30, около 25, около 20, около 15, около 10, около 5, около 4, около 3, около 2 или около 1% или меньше в расчете на сухой вес клетки. Если полипептид Ь0-С8Е или его вариант рекомбинантно получен с использованием клеткихозяина, указанный белок может присутствовать в культуральной среде в концентрации около 5, около 4, около 3, около 2, около 1 г/л, около 750, около 500, около 250, около 100, около 50, около 10 или около 1 мг/л или меньше в расчете на сухой вес клетки. Так, по существу очищенный полипептид Ь0-С8Е, полученный указанными способами настоящего изобретения, может иметь степень чистоты по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 55, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 70%, особенно степень чистоты по меньшей мере около 75, 80, 85% и более конкретно степень чистоты по меньшей мере около 90, степень чистоты по меньшей мере около 95, степень чистоты по меньшей мере около 99% или больше, что определено соответствующими способами, такими как 8Ό8/ΡΑΟΕ анализ, ВР-НЬРС, 8ЕС и капиллярный электрофорез.

Термин рекомбинантная клетка-хозяин или клетка-хозяин относится к клетке, которая включает экзогенный полинуклеотид, независимо от использованного способа встраивания, например прямого захвата, трансдукции, £-скрещивания, или других способов, известных специалистам в данной области для создания рекомбинантной клетки-хозяина. Экзогенный полинуклеотид можно сохранять как неин

- 16 019968 тегрированный вектор, например плазмиду, или, альтернативно, можно интегрировать в геном хозяина.

Термин среда или среды включает любую культуральную среду, раствор, твердую, полутвердую или жесткую подложку, которая может поддерживать или содержать любую клетку-хозяина, включая бактериальные клетки-хозяева, дрожжевые клетки-хозяева, клетки-хозяева насекомых, растительные клетки-хозяева, эукариотные клетки-хозяева, клетки-хозяева млекопитающих, СНО клетки, прокариотные клетки-хозяева, Е. со11 или Ркеиботопак клетки-хозяева, и содержание клеток. Таким образом, термин может включать среду, в которой клетка-хозяин выращивалась, например среду, в которую полипептид ЬС-С8Е был секретирован, включая среду как до, так и после стадии пролиферации. Указанный термин может также включать буферы или реагенты, которые содержат лизаты клетки-хозяина, такие как в случае, когда полипептид ЬС-С8Е продуцируется внутриклеточно, и клетки-хозяева подвергаются лизису или разрушению для выделения полипептида ЬС-С8Е.

Термин восстанавливающий агент в отношении рефолдинга белка определяют как любое соединение или материал, которые сохраняют сульфгидрильные группы в восстановленном виде и восстанавливают внутри- или межмолекулярные дисульфидные связи. Подходящие восстанавливающие агенты включают, без ограничения, дитиотреитол (ΌΤΤ), 2-меркаптоэтанол, дитиоэритритол, цистеин, цистеамин (2-аминоэтантиол) и восстановленный глутатион. Специалистам в данной области легко понять, что для использования в указанных способах и композициях настоящего изобретения можно использовать широкий круг восстанавливающих агентов.

Термин окисляющий агент в отношении рефолдинга белка определяют как любое соединение или материал, которые способны удалять электрон из соединения, которое окисляют. Подходящие окисляющие агенты включают, без ограничения, окисленный глутатион, цистеин, цистамин, окисленный дитиотреитол, окисленный эритреитол и кислород. Специалистам в рассматриваемой области должно быть очевидно, что для использования в указанных способах настоящего изобретения можно использовать широкий круг окисляющих агентов.

Термин денатурирующий агент или денатурант определяют как любое соединение или материал, которые вызывают обратимое разворачивание (ипТоИтд) белка. Эффективность денатурирующего агента или денатуранта определяется как свойствами, так и концентрацией конкретного денатурирующего агента или денатуранта. Подходящие денатурирующие агенты или денатуранты могут быть хаотропными агентами (сНао1гор15), детергентами, органическими растворителями, смешивающимися с водой растворителями, фосфолипидами или комбинацией двух или более таких агентов. Подходящие хаотропные агенты включают, без ограничения, мочевину, гуанидин и тиоцианат натрия. Подходящие детергенты могут включать, без ограничения, сильные детергенты, такие как натрийдодецилсульфат, или полиоксиэтиленовые эфиры (например, детергенты Т\тееп или Тп1оп), саркозил, мягкие неионные детергенты (например, дигитонин), мягкие катионные детергенты, такие как N^2,3-(^^о1еуоxу)-пропил-N,N,Nтриметиламмоний, мягкие ионные детергенты (например, натрийхолат или натрийдеоксихолат) или цвиттерионные детергенты, включая, без ограничения, сульфобетаины (ΖνίΐΐΌτ^ηΐ), 3-(3холамидопропил)диметиламмонио-1-пропансульфат (СНАР8) и 3-(3-холамидопропил)диметиламмоний2-гидрокси-1-пропансульфонат (0ΗΑΡ8Ο). Органические смешивающиеся с водой растворители, такие как ацетонитрил, низшие спирты (особенно С₂-С₄ спирты, такие как этанол или изопропанол) или низшие алкандиолы (особенно С₂-С₄ алкандиолы, такие как этиленгликоль), можно использовать в качестве денатурантов. Фосфолипиды, которые можно использовать в настоящем изобретении, могут быть природными фосфолипидами, такими как фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол, или синтетическими производными или вариантами фосфолипидов, такими как дигексаноилфосфатидилхолин или дигептаноилфосфатидилхолин.

Термин рефолдинг описывает любой процесс, реакцию или способ, которые трансформируют полипептиды, содержащие дисульфидную связь, из неправильного складчатого или не складчатого состояния в природную или правильную складчатую конформацию относительно дисульфидных связей.

Термин кофолдинг относится специально к процессам рефолдинга, реакциям или способам, в которых используют по меньшей мере два полипептида, которые взаимодействуют друг с другом и в результате происходит трансформация развернутого полипептида или полипептида с неправильной укладкой в природный, с правильной укладкой полипептид.

Термины гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или С-С8Е включают такие полипептиды и белки, которые обладают по меньшей мере одной биологической активностью С-С8Е (такие как те, что раскрыты в патентах США №№ 6716606; 6689351; 6565841; 6162426; 5811301; 5776895; 5718893; 5580755; 5536495; 5202117; 5043156; 4999291; 4810643 и 4968618 для Ю-С8Е, которые включены в описание посредством ссылки), также как С-С8Е аналоги, С-С8Р изоформы, С-С8Р миметики, СС8Е фрагменты, гибридные С-С8Е белки, олигомеры и мультимеры гибридных белков, гомологи, варианты схем гликозилирования и мутеины, независимо от их биологической активности и, кроме того, независимо от их способа синтеза или получения, включая, без ограничения, рекомбинантные (независимо от того, получены они из кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или других форм нуклеиновой кислоты), синтетические, трансгенные и активирующие гены способы. Конкретные примеры С-С8Е вклю

- 17 019968 чают, без ограничения, ПЭГфилграстим (ΝΕυΕΑδΤΑ®), филграстим (ΝΕυΡΟΟΕΝ®), аналог С-С8Е, мутант С-С8Е, измененный гликозилированный С-С8Е и конъюгированные с ПЭГ С-С8Е аналоги. Конкретные примеры клеточных линий, модифицированных для экспрессии эндогенных человеческих СС8Е, раскрыты у Ό&ν1ίη е1 а1., 1. Ьеикос. Вю1., 41:306 (1987); в патентах США №№ 6716606; 6379661; 6004548; 5830705; 5582823; 4810643 и 6242218, которые включены в описание посредством ссылки.

Термины бычий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, бычьи С-С8Е или ЬС-С8Е включают такие полипептиды и белки, которые обладают по меньшей мере одной биологической активностью ЬС-С8Е, также как ЬС-С8Е аналоги, ЬС-С8Е изоформы, ЬС-С8Е миметики, ЬС-С8Е фрагменты, гибридные ЬС-С8Е белки, олигомеры и мультимеры гибридных белков, гомологи, варианты схем гликозилирования и мутеины, независимо от их биологической активности и, кроме того, независимо от их способа синтеза или получения, включая, без ограничения, рекомбинантные (независимо от того, получены они из кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или других форм нуклеиновой кислоты), синтетические, трансгенные и активирующие гены способы. Конкретные примеры С-С8Е включают, без ограничения, ЬС-С8Е мутанты, измененные гликозилированные С-С8Е и конъюгированные с ПЭГ С-С8Е аналоги.

Термины бычий С-С8Е (ЬС-С8Е) или полипептид ЬС-С8Е относятся к бычьему гранулоцитарному колониестимулирующему фактору или С-С8Е, как раскрыто выше, так же, как к полипептиду, который сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность природных ЬС-С8Е. Полипептиды ЬС-С8Е включают фармацевтически приемлемые соли и пролекарства, пролекарства солей, полиморфы, гидраты, сольваты, биологически активные фрагменты, биологически активные варианты и стереоизомеры природных бычьих С-С8Е, так же, как варианты агонистов, миметиков и антагонистов природных бычьих С-С8Е и их гибридных полипептидов. Примеры полипептидов ЬС-С8Е и миметиков включают те, что раскрыты в \УО 89/10932, в патентах США №№ 5849883 и 6497869, которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте. Гибриды, включающие добавленные аминокислоты у аминоконца, карбоксильного конца или с обоих концов, охватывают термин полипептид ЬС-С8Е. Примеры гибридов включают, без ограничения, например, метионил ЬС-С8Е, в котором метионин связан с Ν-концом ЬС-С8Е (такой как полипептид в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2), полученный в результате рекомбинантной экспрессии зрелой формы ЬС-С8Е, гибриды для целей очистки (включая, без ограничения, полигистидин или родственные эпитопы), гибриды с пептидами, связывающими сывороточный альбумин, и гибриды с сывороточными белками, такими как сывороточный альбумин. Природная ЬС-С8Е нуклеиновая кислота и аминокислотные последовательности для полной длины и зрелых форм известны так же, как варианты, такие как варианты отдельных аминокислот и варианты сплайсинга. Для аминокислотной последовательности зрелого ЬС-С8Е так же, как для аминокислотной последовательности метионил ЬС-С8Е, см. здесь 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 соответственно. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие 11СС8Е мутанты и мутантные 11С-С8Е полипептиды, также известны.

Бычий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или ЬС-С8Е обладает различными биологическими активностями, включая, без ограничения, связывание со своим рецептором, инициирование димеризации своего рецептора, стимулирование продуцирования нейтрофилов и стимулирование клеточной пролиферации и дифференциации. Примеры некоторых из биологических активностей гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и 11С-С8Е раскрыты выше и в патентах США №№ 6676947; 6579525; 6531121; 6521245; 6489293; 6368854; 6316254; 6268336; 6239109; 6165283; 5986047; 5830851; 5043156 и 577569, которые включены в описание посредством ссылки.

Термины бычий С-С8Е полипептид, полипептид ЬС-С8Е, бычий С-С8Е или ЬС-С8Е и написанные через дефис или без дефиса, их формы включают такие полипептиды и белки, которые обладают по меньшей мере одной биологической активностью С8Е, их ЬС-С8Е аналогов, ЬС-С8Е мутантов, измененных гликозилированных ЬС-С8Е, конъюгированных с ПЭГ ЬС-С8Е, ЬС-С8Е изоформ, ЬС-С8Е миметиков, ЬС-С8Е фрагментов, гибридных ЬС-С8Е белков, гибридных белков, олигомеров и мультимеров, гомологов, вариантов схем гликозилирования, вариантов сплайсинга и мутеинов, независимо от их биологической активности и, кроме того, независимо от указанного способа их синтеза или получения, включая, без ограничения, рекомбинантные (независимо от того, получены он из кДНК, геномной ДНК, синтетической ΌΝΑ или других форм нуклеиновой кислоты), ίη уЦго, ίη у1уо, путем микроинъекций молекул нуклеиновой кислоты, синтетически, трансгенно и активированием генов, способы. Термины бычий С-С8Е полипептид, полипептид ЬС-С8Е, бычьи С-С8Е или ЬС-С8Е охватывают полипептиды ЬС-С8Е, включающие одно или более из аминокислотных замещений, добавлений или делеций; см. патент США № 5849883, который включен в описание посредством ссылки, для аналогов бычьего С-С8Е.

Описаны замещения в большом разнообразии положений аминокислот в ЬС-С8Е. Замещения, включая, без ограничения, такие, которые модулируют фармацевтическую стабильность, повышают агонистическую активность, повышают устойчивость к протеазам, превращают полипептид в антагониста и т.д., включены в термины полипептид ЬС-С8Е, бычий С-С8Е полипептид, бычий С-С8Е или ЬСС8Е.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предложены рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие вариантные белки, векторы экспрессии, содержащие варианты нуклеиновых кислот,

- 18 019968 клетки-хозяева, включающие варианты нуклеиновых кислот и/или векторы экспрессии, и способы получения вариантов белков. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения инфекции путем введения животному варианта белка обычно вместе с фармацевтическим носителем в терапевтически эффективном количестве.

ЬО-С8Р мутанты обсуждаются в патенте США № 5849883, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте, и включают полипептиды, сконструированные с оптимизацией кодона для Е. со11 и гибридных белков, созданных с бычьими и человеческими О-С8Р последовательностями. В патенте США № 5416195, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте, раскрыты 11С-С8Е мутанты, в которых было произведено по меньшей мере одно из следующих аминокислотных замещений (нумерация аминокислот дается в соответствии со зрелым белком; поэтому, если присутствует Ν-концевой метионин, ему приписывается положение -1 или 0): Сук17 природной последовательности заменен на 8ег17 остаток, Акр27 природной последовательности заменен на 8ег27 остаток, Ьеи15 природной последовательности заменен на О1и15 остаток, Ьу§23 природной последовательности заменен на Агд23 остаток, О1у28 природной последовательности заменен на А1а28 остаток, Ьу§40 природной последовательности заменен на Агд40 остаток, Рго44 природной последовательности заменен на А1а44 остаток, Ьеи49 природной последовательности заменен на Ьу§49 остаток, О1у55 природной последовательности заменен на А1а55 остаток, Сук60 природной последовательности заменен на 8ег60 остаток, Рго111 природной последовательности заменен на О1и111 остаток, ТНг115 природной последовательности заменен на 8ег115 остаток и Туг165 природной последовательности заменен на Агд165 остаток. Многие из указанных остатков присутствуют в ЬО-С8Р последовательности, и одно или более из указанных замещений можно обнаружить в полипептиде ЬО-С8Р настоящего изобретения. Сайег е! а1. Вю1одюак (2004), 32:37 описывают мутантные 11С-С8Е, у которых отсутствуют сайты гликозилирования. Аналогичные мутации можно найти в полипептидах ЬО-С8Р настоящего изобретения.

В некоторых вариантах полипептиды ЬО-С8Р по настоящему изобретению, по существу, идентичны 8ЕО ΙΌ NО: 1, 2 или любой другой последовательности полипептида ЬО-С8Р. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды ЬО-С8Р, включая мутанты и способы экспрессии и выделения полипептидов ЬО-С8Р, хорошо известны.

Термин полипептид ЬО-С8Р также включает фармацевтически приемлемые соли и пролекарства и пролекарства солей, полиморфы, гидраты, сольваты, биологически активные фрагменты, биологически активные варианты и стереоизомеры природных ЬО-С8Р так же, как агонисты, миметики и антагонисты природных ЬО-С8Р и гибридных полипептидов. Белки слияния, включающие добавления аминокислот у аминоконца, карбоксльного конца или у обоих концов, включены в термин полипептид ЬО-С8Р. Примеры слияний включают, без ограничения, например, метионин ЬО-С8Р, в котором метионин связан с Νконцом ЬО-С8Р, полученного в результате рекомбинантной экспрессии зрелой формы ЬО-С8Р без лидерного или сигнального пептида или его части (метионин связан с Ν-концом ЬО-С8Р в результате рекомбинантной экспрессии), белки слияния, для целей очистки (включая, без ограничения, полигистидин или родственные эпитопы), белки слияния с пептидами, связывающими сывороточный альбумин, и белки слияния с сывороточными белками, такими как сывороточный альбумин. В патенте США № 5750373, который включен в описание посредством ссылки, раскрыт способ селекции новых белков, таких как гормон роста и вариантов фрагментов антител с измененными свойствами связывания в отношении их сответствующих рецепторных молекул. Указанный способ включает слияние гена, кодирующего представляющий интерес белок, с карбоксиконцевым доменом гена ΙΙΙ белка оболочки нитчатого бактериофага М13. Химерные молекулы включают ЬО-С8Р одну или более из других молекул. Химерная молекула может содержать специфические участки или фрагменты одной или обеих из ЬО-С8Р и другой молекулы (молекул). Любые такие фрагменты можно получить из белков стандартными биохимическими методами или осуществляя экспрессию полинуклеотида, кодирующего фрагмент ЬО-С8Р, или его фрагмент можно получить как белок слияния, включающий человеческий сывороточный альбумин (Н8А), Рс или его часть. Такие конструкции слияния пригодны для повышения экспрессии ЬО-С8Р или его фрагмента в эукариотной клетке-хозяине. Примеры Н8А частей включают Ν-концевой полипептид (аминокислоты 1-369, 1-419 и участки промежуточной длины, начинающиеся с аминокислоты 1), как раскрыто в патенте США № 5766883 и в публикации VО 97/24445, которые включены в описание посредством ссылки. Другие химерные полипептиды могут включать Н8А белок с ЬО-С8Р или его фрагментами, присоединенными к каждому из С-конца и Ν-конца Н8А. Другие белки слияния можно создать путем слияния ЬО-С8Р с а) Рс частью иммуноглобулина; Ь) аналогом Рс части иммуноглобулина и с) фрагментами рс части иммуноглобулина.

В различных ссылках раскрыты модификации полипептидов конъюгированием с полимером или гликозилированием. Термин полипептид ЬО-С8Р включает полипептиды, конъюгированные с полимером, таким как ПЭГ, и могут включать одно или более из дополнительных производных цистеина, лизина или других остатков. Кроме того, полипептид ЬО-С8Р может включать линкер или полимер, где аминокислота, с которой конъюгируют указанные линкер или полимер, может быть неприродной аминокислотой в соответствии с настоящим изобретением или может быть конъюгирована с кодируемой в природе аминокислотой с использованием методик, известных специалистам, таких как присоединение к ли

- 19 019968 зину или цистеину.

Имеются сообщения о модификации полипептидов полимерами. ΙΕΝβ упоминается как один из примеров полипептида, принадлежащего к суперсемейству гормонов роста. В \У0 00/23114 раскрыт гликозилированный и ПЭГилированный ΙΕΝβ. В \У0 00/23472 раскрыты ΙΕΝβ гибридные белки. В патенте США № 4904584 раскрыты полипептиды, обедненные ПЭГилированным лизином, где по меньшей мере один лизиновый остаток был удален или заменен любым другим аминокислотным остатком. В \У0 99/67291 раскрыт процесс конъюгирования белка с ПЭГ, где по меньшей мере один аминокислотный остаток в белке удаляют и осуществляют контактирование полученного белка с ПЭГ в условиях, достаточных для достижения конъюгирования с белком. В \У0 99/03887 раскрыты ПЭГилированные варианты полипептидов, принадлежащих к суперсемейству гормонов роста, где цистеиновый остаток был замещен остатком несущественной аминокислоты, расположенным в специфическом участке указанного полипептида. В \У0 00/26354 раскрыт способ получения гликозилированного полипептидного варианта с пониженной аллергенностью, который по сравнению с соответствующим исходным полипептидом включает по меньшей мере один дополнительный сайт гликозилирования. В патенте США № 5218092, который включен в описание посредством ссылки, раскрыта модификация гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (С-С8Е) и других полипептидов для введения по меньшей мере одной дополнительной углеводной цепочки по сравнению с природным полипептидом.

Термин полипептид ЬС-С8Е также включает гликозилированные ЬС-С8Е, такие как, без ограничения, полипептиды, гликозилированные по любому аминокислотному положению, Ν-связанная или Освязанная формы гликозилирования полипептида. Варианты, содержащие единственное нуклеотидное изменение, также рассматриваются как биологически активные варианты полипептида ЬС-С8Е. Варианты, содержащие одно нуклеотидное изменение, также рассматриваются как биологически активные варианты ЬС-С8Е. Кроме того, включены также варианты сплайсинга. Термин полипептид ЬС-С8Е также включает ЬС-С8Е гетеродимеры, гомодимеры, гетеромультимеры или гомомультимеры любого одного или более из ЬС-С8Е или любого другого полипептида, белка, углевода, полимера, малой молекулы, линкера, лиганда или другой активной молекулы любого типа, связанной химически или экспрессированной как гибридный белок (см. патенты США №№ 6261550; 6166183; 6204247; 6261550; 6017876, которые включены в описание посредством ссылки), также как аналоги полипептидов, содержащие, например, специфические делеции или другие модификации, но все еще сохраняя биологическую активность (патенты США №№ 6261550; 6004548; 6632426, которые включены в описание посредством ссылки).

Все ссылки на положения аминокислот в описанных здесь ЬС-С8Е основаны на положениях в 8ЕО ΙΌ N0: 1, если не указано иначе (то есть если не указывается, что сравнение основано на 8ЕО ΙΌ N0: 2 или другой ЬС-С8Е последовательности). Например, аминокислота в положении 1 8ЕО ΙΌ N0: 1 представляет собой треонин и соответствующий треонин расположен в 8ЕО ΙΌ N0: 2 у положения 2. Специалистам в данной области должно быть понятно, что положения аминокислот, соответствующие положению в 8Е0 ΙΌ N0: 1, можно легко идентифицировать в любой другой ЬС-С8Е молекуле, такой как 8Е0 ΙΌ N0: 2. Специалистам в данной области должно быть понятно, что положения аминокислот, соответствующие положению в 8Е0 ΙΌ N0: 1, 2 или в любой другой ЬС-С8Е последовательности, можно легко идентифицировать в любой другой ЬС-С8Е молекуле, такой как ЬС-С8Е гибриды, варианты, фрагменты и т.д. Например, программу выравнивания последовательностей, такую как ВБА8Т, можно использовать для выравнивания и определения конкретного положения в белке, которое соответствует положению в 8Е0 ΙΌ N0: 1, 2, или в других ЬС-С8Е последовательностях. Замещения, делеции или добавления аминокислот, раскрытые здесь со ссылкой на 8Е0 ΙΌ N0: 1, 2, или другие ЬС-С8Е последовательности относятся также к замещениям, делециям или добавлениям в соответствующие положения в ЬСС8Е гибридах, вариантах, фрагментах и т.д., раскрытых здесь или известных специалистам, и естественно включены в настоящее изобретение.

Термин полипептид ЬС-С8Е или ЬС-С8Е включает полипептиды ЬС-С8Е, включающие одно или более из аминокислотных замещений, добавлений или делеций. Полипептиды ЬС-С8Е настоящего изобретения включают модификации с одной или более из природных аминокислот вместе с одной или более из неприродных аминокислотных модификаций. Были описаны примеры замещений в широком круге положений аминокислот в природных ЬС-С8Е полипептидах, включая, без ограничения, замещения, которые модулируют фармацевтическую стабильность, которые модулируют одну или более из биологических активностей полипептида ЬС-С8Е, такие как те, без ограничения, что повышают агонистическую активность, повышают растворимость полипептида, уменьшают протеазную восприимчивость, превращают полипептид в антагониста и т.д. и включены в термин полипептид ЬС-С8Е. В некоторых вариантах ЬС-С8Е антагонист включает не кодируемую в природе аминокислоту, связанную с водорастворимым полимером, который присутствует в участке связывания рецептора ЬС-С8Е молекулы.

В некоторых вариантах полипептиды ЬС-С8Е далее включают добавление, замещение или делецию, которые модулируют биологическую активность полипептида ЬС-С8Е. В некоторых вариантах полипептиды ЬС-С8Е далее включают добавление, замещение или делецию, которые модулируют проли

- 20 019968 ферацию нейтрофилов, функцию и/или дифференциацию полипептида ЬС-С8Е. Например, добавления, замещения или делеции могут модулировать одно или более из свойств или активностей ЬС-С8Е. Например, добавления, замещения или делеции могут модулировать сродство к рецептору, модулируют время полужизни в циркуляции, модулируют терапевтическое время полужизни, модулируют стабильность полипептида, модулируют расщепление протеазами, модулируют дозу, модулируют выделение или биодоступность, облегчают очистку или улучшают или изменяют способ введения. Аналогично, полипептиды ЬС-С8Е могут включать последовательности расщепления протеазой, реакционноспособные группы, связывающие антитело домены (включая, без ограничения, ЕЬАС или поли-Ηίδ) или другие основанные на сродстве последовательности (включая, без ограничения, ЕЬАС, поли-Ηίδ, С8Т и т.д.) либо связанные молекулы (включая, без ограничения, биотин), которые улучшают детектирование (включая, без ограничения, СЕР), очистку или другие характеристики полипептида.

Термин полипептид ЬС-С8Е также включает гомодимеры, гетеродимеры, гомомультимеры и гетеромультимеры, которые связаны, включая, без ограничения, непосредственно через боковые цепи не кодируемых в природе аминокислот, с боковыми цепями или той же самой или другой не кодируемой в природе аминокислоты, с боковым цепям кодируемой в природе аминокислоты или непосредственно через линкер. Примеры линкеров включают, без ограничения, малые органические соединения, водорастворимые полимеры различной длины, такие как поли(этиленгликоль)или полидекстран, или полипептиды различной длины.

Термин не кодируемая в природе аминокислота относится к аминокислоте, которая не является одной из 20 обычных аминокислот или пирролизином либо селеноцистеином. Другими терминами, которые можно использовать синомимично с термином не кодируемая в природе аминокислота, являются термины неприродная аминокислота, ненатуральная аминокислота, не встречающаяся в природе аминокислота и различные их варианты с дефисом или без него. Термин не кодируемая в природе аминокислота также включает, без ограничения, аминокислоты, которые возникают в результате модификаций (например, пост-трансляционных модификаций) кодируемой в природе аминокислоты (включая, без ограничения, 20 обычных аминокислот или пирролизин и селеноцистеин), но сами не являются природно включенными в растущую полипептидную цепь трансляционным комплексом. Примеры таких неприродно возникших аминокислот включают, без ограничения, Ν-ацетилглюкозаминил-Ь-серин, Νацетилглюкозаминил-Ь-треонин и О-фосфотирозин.

Термин аминоконец модифицирующая группа относится к любой молекуле, которую можно присоединить к аминоконцу полипептида. Аналогично, термин карбоксиконец модифицирующая группа относится к любой молекуле, которую можно присоединить к карбоксиконцу полипептида. Модифицирующие концы группы включают, без ограничения, различные водорастворимые полимеры, пептиды или белки, такие как сывороточный альбумин или другие молекулы, которые повышают время полужизни пептидов в сыворотке.

Термины функциональная группа, активная молекула, активирующая группа, отщепляемая группа, реакционноспособный сайт, химически реакционноспособная группа и химически реакционноспособная молекула, которые используют специалисты и которые использованы здесь для обозначения различных, определяемых участков или звеньев в молекуле. Термины в некотором смысле являются синонимами в области химии и использованы здесь для указания частей молекул, которые выполняют некоторые функции или обладают некоторой активностью и являются реакционноспособными в отношении других молекул.

Термины связь или линкер использованы здесь для обозначения групп или связей, которые обычно образованы в результате химических реакций и обычно являются ковалентными связями. Термин гидролитически стабильные связи означает, что связи, по существу, стабильны в воде и не реагируют с водой при используемых значениях рН, включая, без ограничения, в физиологических условиях в течение длительного промежутка времени, возможно даже, бесконечно долго. Термины гидролитически нестабильные или разлагаемые связи означают, что такие связи разлагаются в воде или в водных растворах, включая, например, кровь. Термины ферментативно нестабильные или разлагаемые связи означают, что связь может разрушиться под действием одного или более из ферментов. Как понятно специалистам, ПЭГ и родственные полимеры могут включать разлагаемые связи в полимерном скелете или в линкерной группе между полимерным скелетом и одной или более из концевых функциональных групп полимерной молекулы. Например, сложноэфирные связи, образованные в реакции ПЭГ карбоновых кислот или активированных ПЭГ карбоновых кислот со спиртовыми группами биологически активного агента, обычно гидролизуются в физиологических условиях с выделением агента. Другие гидролитически разлагаемые связи включают, без ограничения, карбонатные связи; иминные связи, образованные в результате реакции амина и альдегида; фосфатные эфирные связи, образованные при взаимодействии спирта с фосфатной группой; гидразоновые связи, которые являются продуктом реакции гидразида и альдегида; ацетальные связи, которые являются продуктом реакции альдегида и спирта; ортоэфирные связи, которые являются продуктом реакции формиата и спирта; пептидные связи, образованные группой амина, включая, без ограничения, связи у конца полимера, такого как ПЭГ, и карбоксильную группу пептида; и олигонуклеотидные связи, образованные фосфорамидитной группой, включая, без ограничения, группы на

- 21 019968 конце полимера и 5' гидроксильную группу олигонуклеотида.

Термины биологически активная молекула или биологически активный агент означают любое вещество, которое может влиять на любые физические или биохимические свойства биологической системы, схемы функционирования молекулы или взаимодействия, связанные с организмом, включая, без ограничения, вирусы, бактерии, бактериофаги, транспозоны, прионы, насекомых, грибы, растения, животных и людей. В частности, в том смысле, как здесь использован термин, биологически активные молекулы включают, без ограничения, любые вещества, предназначенные для диагностических целей, ухода, облегчения, лечения или профилактики заболеваний у людей или других животных или для улучшения физического или ментального состояния человека или животных. Примеры биологически активных молекул включают, без ограничения, пептиды, белки, ферменты, малые молекулы лекарственных средств, вакцины, иммуногены, твердые формы лекарственных средств, мягкие формы лекарственных средств, углеводы, неорганические атомы или молекулы, красители, липиды, нуклеозиды, радионуклиды, олигонуклеотиды, токсоиды, токсины, прокариотные и эукариотные клетки, вирусы, полисахариды, нуклеиновые кислоты и их части, полученные или произведенные из вирусов бактерий, насекомых, животных или любых других клеток или клеточных типов, липосомы, микрочастицы и мицеллы. Полипептиды ЬС-С8Р можно добавлять в мицеллюлярные композиции. Классы биологически активных агентов, которые можно использовать для целей настоящего изобретения, включают, без ограничения, лекарства, пролекарства, радионуклиды, агенты для получения изображений, полимеры, антибиотики, фунгициды, противовирусные агенты, противовоспалительные агенты, противоопухолевые агенты, сердечнососудистые агенты, антидепрессанты, гормоны, факторы роста, стероидные агенты, микробно полученные токсины и т.п.

Термин бифункциональный полимер относится к полимеру, включающему две дискретные функциональные группы, которые способны специфически реагировать с другими молекулами (включая, без ограничения, боковые группы аминокислот) с образованием ковалентной или нековалентной связи. Бифункциональный линкер, содержащий одну функциональную группу, реакционноспособную в отношении группы на конкретном биологически активном компоненте, и другую группу, реакционноспособную в отношении группы на втором биологическом компоненте, можно использовать для получения конъюгата, который включает первый биологически активный компонент, бифункциональный линкер и указанный второй биологически активный компонент. Известны многие процедуры и линкерные молекулы для присоединения различных соединений к пептидам, см., например, Европейскую патентную заявку № 188256; патенты США №№ 4671958, 4659839, 4414148, 4699784; 4680338 и 4569789, которые включены в описание посредством ссылки. Термин многофункциональный полимер относится к полимеру, включающему две или более дискретные функциональные группы, которые способны специфически реагировать с другими молекулами (включая, без ограничения, боковые группы аминокислот) с образованием ковалентных и нековалентных связей. Бифункциональный полимер или полифункциональный полимер могут быть любой нужной длины или молекулярной массы, и их можно выбрать таким образом, чтобы обеспечить конкретное необходимое пространственное положение или конформацию между одной или более из молекул, связанных с ЬС-С8Р и его рецептором или с ЬС-С8Р.

Если группы заместителей обозначены их обычными химическими формулами, написанными слева направо, они одинаково включены в химически идентичные заместители, которые получаются при написании структуры справа налево, например структура -СН₂О- эквивалентна структуре -ОСН₂-.

Термин заместители включает, без ограничения, термин неинтерферирующие заместители. Неинтерферирующие заместители представляют собой такие группы, которые приводят к получению стабильных соединений. Подходящие неинтерферирующие заместители или радикалы включают, без ограничения, галоген, С₁-С₁₀ алкил, С₂-С1₀ алкенил, С₂-Сю алкинил, С₁-С₁₀ алкокси, С₁-С₁₂ аралкил, С₁С₁₂ алкарил, С₃-С1₂ циклоалкил, С₃-С1₂ циклоалкенил, фенил, замещенный фенил, толуоил, ксиленил, бифенил, С₂-С1₂ алкоксиалкил, С₂-С1₂ алкоксиарил, С₇-С1₂ арилоксиалкил, С₇-С1₂ оксиарил, С₁-С₆ алкилсульфинил С₁-С₁₀ алкилсульфонил, -(СН₂)_т-О-(С1-С1₀ алкил), где т принимает значения от 1 до 8, арил, замещенный арил, замещенный алкокси, фторалкил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, нитроалкил, -ΝΟ₂, -ΟΝ, -ЫКС(О)-(С1-С1₀ алкил), -С^НС^Сю алкил), С₂-С_!0 алкилтиоалкил, -С(О)О-(С1-С1₀ алкил), -ОН, -8Ο₂, =8, -ί,ΌΟΗ. -ΝΚ₂, карбонил, -С(О)-(С1-С_!0 алкил)-СР₃, -С(О)-СР₃, -ϋ(Ο)ΝΚ₂, -(С1-С10 арил)-8-(С6-Сю арил), -С(О)-(С1-С10 арил), -(^η-Ο-Κ^η-Ο-^алкил), где каждый т принимает значения от 1 до 8, ^(Ο)ΝΚ₂, -^8)ΝΚ₂, -8Ο₂ΝΚ₂, -ΝΕΟ(Ο)ΝΚ₂, -ΝΚ.ί.'(8)ΝΚ.₇· их соли и тому подобные. Каждый К в том смысле, как здесь использован, представляет собой Н, алкил или замещенный алкил, арил или замещенный арил, аралкил или алкарил.

Термин галоген включает фтор, хлор, йод и бром.

Термин алкил сам по себе или как часть другого заместителя означает, если не указано иначе, неразветвленную или разветвленную цепочку или циклический углеводородный радикал или их комбинации, которые могут быть полностью насыщенными, моно- или полиненасыщенными и могут включать ди- и поливалентные радикалы, с указанным числом атомов углерода (то есть С₁-С₁₀ означает от одного до десяти атомов углерода). Примеры насыщенных углеводородных радикалов включают, без ограничения, группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил,

- 22 019968 циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил, гомологи и изомеры, например н-пентил, нгексил, н-гептил, н-октил и т.п. Ненасыщенная алкильная группа содержит одну или более из двойных связей или тройных связей. Примеры ненасыщенных алкильных групп включают, без ограничения, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил и высшие гомологи и изомеры. Термин алкил, если нет других указаний, также включает такие производные алкила, более подробно определенные далее как гетероалкил. Алкильные группы, которые ограничены улеводородными группами, называют гомоалкилами.

Термин алкилен сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, полученный из алкана, представленный, но ими не ограниченный, структурами -СН₂СН₂- и -СН₂СН₂СН₂СН₂-, и далее включает такие группы, которые раскрыты далее как гетероалкилены. Обычно алкильная (или алкиленовая) группа содержит от 1 до 24 атомов углерода, причем такие группы, которые содержат 10 или меньше атомов углерода, составляют предпочтительный вариант раскрытых здесь способов и композиций. Термин низший алкил или низший алкилен означает короткоцепочечную алкильную или алкиленовую группу, обычно содержащую восемь или меньше атомов углерода.

Термины алкокси, алкиламино и алкилтио (или тиоалкокси) используют в их общепринятом значении и они относятся к алкильным группам, присоединенным к остальной части молекулы через атом кислорода, аминогруппу или атом серы соответственно.

Термин гетероалкил сам по себе или в комбинации с другим термином означает, если не указано иначе, стабильную, неразветвленную или разветвленную цепочку, или циклический углеводородный радикал, или их комбинации, состоящие из указанного числа атомов углерода и по меньшей мере одного гетероатома, выбранного из группы, состоящей из О, Ν, 81 и 8, и где атомы азота и серы могут быть необязательно окислены, и гетероатом азота может быть необязательно кватернизован. Гетероатом (гетероатомы) О, N и 8 и 81 могут находиться в любом положении внутри гетероалкильной группы или в положении, по которому указанная алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. Примеры включают, без ограничения, -СН₂-СН₂-О-СН₃, -СН₂-СН₂-Ж-СН₃, -СН₂-СН₂^(СН₃)-СН₃, -СН₂-8-СН₂СН₃, -СН2-СН2, -8(О)-СН₃, СН2-СН2-8(О)2-СН₃, -СН=СН-О-СН₃, -81(СН₃)₃, -С11_;-(Ί I \-ОС11_; и -СН=СНΝ(ί.Ή₃)-ί.Ή₃. Вплоть до двух гетероатомов могут располагаться последовательно, как, например, -СН₂-Ж-ОСН₃ и -СН₂-О-81(СН₃)₃. Аналогично, термин гетероалкилен сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, полученный из гетероалкила, как представлено, но ими не ограничено, -СН₂-СН₂-8-СН₂-СН₂- и -СН₂-8-СН₂-СН₂-Ж-СН₂-. В гетероалкиленовых группах одинаковые или различные гетероатомы также могут занимать или один или оба конца цепочки (включая, без ограничения, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино, аминооксиалкилен и т.п.) Кроме того, для алкиленовых и гетероалкиленовых связывающих групп ориентация связывающей группы по направлению, в котором записана связывающая группа, не указывается. Например, формула -С(О)₂К'- представляет собой как -С(О)₂К'-, так и -К'С(О)₂-.

Термины циклоалкил и гетероциклоалкил, сами по себе или в комбинации с другими терминами, представляют, если не указано иначе, циклический вариант алкила и гетероалкила соответственно. Таким образом, циклоалкил или гетероциклоалкил включают насыщенные, частично ненасыщенные и полностью ненасыщенные кольцевые связи. Кроме того, для гетероциклоалкила гетероатомы могут занимать положение, по которому гетероцикл присоединен к остальной части молекулы. Примеры циклоалкилов включают, без ограничения, циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и т.п. Примеры гетероциклоалкилов включают, без ограничения, 1-(1,2,5,6тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1пиперазинил, 2-пиперазинил и т.п. Кроме того, термин включает бициклические и трициклические кольцевые структуры. Аналогично, термин гетероциклоалкилен сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, полученный из гетероциклоалкила, и термин циклоалкилен, сам по себе или как часть другого заместителя, означает двухвалентный радикал, полученный из циклоалкила.

Термин водорастворимый полимеротносится к любому полимеру, который растворим в водных растворителях. Связь водорастворимых полимеров с полипептидами ЬС-С8Е может привести к изменениям, включая, без ограничения, те, которые повышают или модулируют время полужизни в сыворотке или повышают или модулируют терапевтическое время полужизни по сравнению с немодифицированной формой, модулируют иммуногенность, модулируют характеристики физической ассоциации, такие как агрегация и образование мультимеров, изменяют рецепторное связывание, изменяют связывание с одним или более из связываемых партнеров и изменяют рецепторную димеризацию или мультимеризацию. Водорастворимый полимер может или не может обладать собственной биологической активностью, и его можно использовать в качестве линкера для присоединения ЬС-С8Е к другим веществам, включая, без ограничения, один или более из полипептидов ЬС-С8Е или одну или более из биологически активных молекул. Подходящие полимеры включают, без ограничения, полиэтиленгликоль, пропиональдегид полиэтиленгликоля, моно С₁-С₁₀ алкокси или арилокси его производные (раскрыты в патенте США № 5252714, который включен в описание посредством ссылки), монометоксиполиэтиленгликоль, поливи

- 23 019968 нилпирролидон, поливиниловый спирт, полиаминокислоты, малеиновый ангидрид дивинилового эфира, №(2-гидроксипропил)метакриламид, декстран, производные декстрана, включая декстрансульфат, полипропиленгликоль, сополимер полипропиленоксид/этиленоксида, полиоксиэтилинированные полиоли, гепарин, фрагменты гепарина, полисахариды, олигосахариды, гликаны, целлюлозу и производные целлюлозы, включая, без ограничения, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу, крахмал и производные крахмала, полипептиды, полиалкиленгликоль и его его производные, сополимеры полиалкиленгликоля и его производных, поливинилэтиловые эфиры и альфа-бета-поли(2-гидроксиэтил)-ЭЬ-аспартамид и т.п. или их смеси. Примеры таких водорастворимых полимеров включают, без ограничения, полиэтиленгликоль и сывороточный альбумин. В \00 03/074087 и \00 03/074088 раскрыто конъюгирование белков или малых молекул с гидроксиалкилкрахмалом (НА8). Примеры гидроксиалкилкрахмалов включают, без ограничения, гидроксиэтилкрахмал. Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и других молекул, например, могут включать ковалентную связь между концевыми альдегидными группами НА8 и реакционноспособными группами других молекул.

Термин полиалкиленгликоль или поли(алкиленгликоль) относится к полиэтиленгликолю (поли(этиленгликолю)), полипропиленгликолю, полибутиленгликолю и их производным. Термин полиалкиленгликоль включает как линейные, так и разветвленные полимеры со средней молекулярной массой от 0,1 до 100 кДа. Другие примеры вариантов перечислены, например, в коммерческих каталогах поставщиков, таких как каталог 811еаг\\а1ег Сотротабоп'к са!а1од Ро1уе!йу1епед1усо1 апб ЭепуаЖе £от Βίοшеб1са1 АррБсабопк (2001).

Термин арил означает, если не указано иначе, полиненасыщенный, ароматический, углеводородный заместитель, который может представлять собой одно кольцо или множество колец (включая, без ограничения, от 1 до 3 колец), которые конденсированы вместе или связаны ковалентно. Термин гетероарил относится к арильным группам (или кольцам), которые содержат от одного до четырех гетероатомов, выбранных из N О и 8, где атомы азота и серы необязательно окислены, и атом (атомы) азота необязательно кватернизованы. Гетероарильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы через гетероатом. Нелимитирующие примеры арильных и гетероарильных групп включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-бифенил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил, 4имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изоксазолил, 4изоксазолил, 5-изоксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 3-хинолил и 6-хинолил. Заместители у каждого из указанных выше арильных и гетероарильных кольцевых систем выбирают из группы описанных далее приемлемых заместителей.

Для краткости термин арил, когда использован в комбинации с другими терминами (включая, без ограничения, арилокси, арилтиоокси, арилалкил), включает как арильные, так и гетероарильные кольца, как определено выше. Таким образом, термин арилалкил означет, что включены те радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (включая, без ограничения, бензил, фенэтил, пиридилметил и т.п.), включая такие алкильные группы, в которых атом углерода (включая, без ограничения, метиленовую группу) был заменен, например, на атом кислорода (включая, без ограничения, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.п.).

Каждый из вышеуказанных терминов (включая, без ограничения, алкил, гетероалкил, арил и гетероарил) означает, что включены как замещенные, так и незамещенные формы указанных радикалов. Примеры заместителей для каждого типа радикалов представлены далее.

Заместителями для алкильного и гетероалкильного радикалов (включая такие группы, которые часто называют как алкилен, алкенил, гетероалкилен, гетероалкенил, алкинил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкенил и гетероциклоалкенил) могут быть один или более из членов группы, выбранные из, без ограничения: -010, =0, =ЯЯ', =N-0^', -1МЯ'Я, -8Я', -галоген, -81Я'ЯЯ', -00(0)1!'. -С(0)Я', -С0₂Я', С0МЯ'Я, -0С(0)МЯ'Я, ^ЯС(0)Я', ^Я'-С(0)1УЯЯ, -МЯС(0)₂Я', -1МЯ-С(МЯ'ЯЯ')=МЯ, -МЯ-С(МЯ'Я)=МЯ', -8(0)!', -8(0)₂Я', -8(0)₂МЯ'Я, -МЯ80₂Я', -СN и -Ы0₂, причем количество их может меняться в интервале от нуля до (2т'+1), где т' представляет собой полное число атомов углерода в таком радикале. К.', Я, Я' и Я, каждый независимо, обозначает водород, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, включая, без ограничения, арил, замещенный 1-3 галогенами, замещенный или незамещенный алкил, алкокси- или тиоалкоксигруппы или арилалкильные группы. Если соединение настоящего изобретения включает более чем одну Я группу, например, каждую Я группу независимо выбирают как каждую Я', Я, Я' и Я группу, если присутствует более чем одна из указанных групп. Если Я' и Я присоединены к одному и тому же атому азота, тогда взятые вместе с атомом азота они могут образовывать 5-, 6- или 7-членное кольцо. Например, -ЫЯ'Я включает, без ограничения, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. На основании вышеприведенного обсуждения заместителей специалисту в данной области должно быть понятно, что термин алкил включает группы, включая атомы углерода, связанные с группами другими, чем группы водорода, такими как галогеноалкил (включая, без ограничения, -СЕ₃ и -СН₂СЕ₃) и ацил (включая, без ограничения, -С(О)СН₃, -С(0)СЕ₃, -С(О)СН₂ОСН₃ и т.п.).

- 24 019968

Аналогично заместителям, раскрытым для алкильного радикала, заместители для арильной и гетероарильной группы варьируются и их выбирают, без ограничения, из: галогена, -0В', =0, =МВ', =У0В', -ЦВ'В, -8В', -галогена, -81В'ВВ', -0С(0)В', -С(0)В', -С0₂В', -С0ПВ'В, -ОС(0)НВ'В, -ЦКС(0)К', -МК'-С(0)ЦКК', ^С(0)2К', -№- С(\В'ВВ') ХВ, -НК-С(НК'В)=НК', -8(0)В', -8(0)₂В', -8(0)_;ХВ'В, -№80^', -СN и -Ы0₂, -В', -N3, -СН(Рй)₂, фтор(С1-С₄)алкокси и фтор(С1-С₄)алкила, в количестве от нуля до числа свободных валентностей у ароматической кольцевой системы; и где В', В, В' и В независимо выбирают из водорода, алкила, гетероалкила, арила и гетероарила. Если соединение по настоящему изобретению включает более одной В группы, например, каждую из В групп независимо выбирают как каждую В', В, В' и В группу, если присутствует более одной из указанных групп.

Термин модулируют время полужизни в сыворотке означает позитивное или негативное изменение во времени циркулирующей полужизни модифицированных ЬС-С8Е по сравнению с немодифицированной формой. Время полужизни в сыворотке измеряют, отбирая образцы крови в различные моменты времени после введения ЬС-С8Е и определяя концентрацию указанной молекулы в каждом образце молекул. Зависимость концентрации сыворотки от времени позволяет рассчитать время полужизни в сыворотке. Желательно повышение времени полужизни по меньшей мере в два раза, но и меньшие значения повышения могут оказаться полезными, например, в тех случаях, когда они позволяют определить удовлетворительный режим дозирования и избежать токсического эффекта. В некоторых вариантах повышение составляет по меньшей мере трехкратное, по меньшей мере примерно пятикратное или по меньшей мере примерно десятикратное.

Термин модулируют терапевтическое время полужизни в том смысле, как здесь использован, означает позитивное или негативное изменение времени полужизни терапевтически эффективного количества ЬС-С8Е по сравнению с его немодифицированной формой. Терапевтическое время полужизни определяют, измеряя фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства молекул в различные моменты времени после введения. Желательно, чтобы повышение терапевтического времени полужизни обеспечило конкретный благоприятный дозовый режим, конкретную благоприятную полную дозу или позволило избежать вредных эффектов. В некоторых вариантах повышение терапевтического времени полураспада возникает из-за повышения эффективности, увеличения или уменьшения связывания модифицированных молекул с их мишенью, усиления или уменьшения разрушений молекул ферментами, такими как протеазы, или повышения или уменьшения других параметров или механизма действия немодифицированных молекул или повышения или уменьшения рецептор-опосредованного клиренса молекул.

Термин выделенный в применении к нуклеиновой кислоте или белку означает, что указанные нуклеиновая кислота или белок не содержат, по меньшей мере, некоторых из клеточных компонент, с которыми они ассоциированы в природном состоянии, или что указанные нуклеиновая кислота или белок были сконцентрированы до уровня, который выше, чем их концентрация при ίη у1уо или ίη νίΙΐΌ продуцировании. Это может быть в гомогенном состоянии. Выделенные вещества могут быть или в сухом либо в полусухом виде или в растворе, включая, без ограничения, водный раствор. Они могут быть компонентами фармацевтических композиций, которые включают дополнительные фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты. Чистоту и гомогенность обычно определяют, используя аналитические химические методы, такие как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Белок, который является преимущественным видом в препарате, значительно очищают. В частности, выделенный ген выделяют из открытой считывающей рамки, которая фланкирует ген и кодирует белок, другой, нежели представляющий интерес ген. Термин очищенный означает, что нуклеиновая кислота или белок проявляются только одной полосой в электрофоретическом геле. В частности, это может означать, что указанные нуклеиновая кислота или белок имеют степень чистоты по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99% или больше.

Термин нуклеиновая кислота относится к дезоксирибонуклеотидам, дезоксирибонуклеозидам, рибонуклеозидам или рибонуклеотидам и их полимерам или в одноцепочечной, или в двухцепочечной форме. Если нет конкретных ограничений, термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают аналогичными свойствами связывания, что и сравниваемая нуклеиновая кислота, и их метаболизм аналогичен метаболизму природных нуклеотидов. Если конкретно не ограничено иначе, термин также относится к аналогам олигонуклеотидов, включая РNА (пептидонуклеиновая кислота), аналогам ДНК, используемым в антисмысловой методике (фосфоротиоаты, фосфороамидаты и т.п.). Если не указано иначе, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно включает ее консервативно модифицированные варианты (включая, без ограничения, замещения вырожденного кодона) и комплементарные последовательности, также как косвенно означенную последовательность. Специфически, замещения вырожденного кодона можно осуществить, создавая последовательности, в которых третье положение одного или более из выбранных (или всех) кодонов замещено смешанным основанием и/или дезоксиинозиновыми остатками (Ва1хег е! а1., У1с1е1с Ас1б Век., 19:5081 (1991); 0Юика е! а1., 1. Вю1. Сйет., 260:2605-2608 (1985); Воккойш е! а1., Мо!. Се11. РгоЬек, 8:91-98 (1994)).

Термины полипептид, пептид и белок в настоящем описании используют взаимозаменяемо,

- 25 019968 обозначая полимер аминокислотных остатков. То есть описание, относящееся к полипептиду, равным образом применимо к описанию белка, и наоборот. Термины, применимые к природным аминокислотным полимерам, также применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или более из аминокислотных остатков представляет собой не кодируемую в природе аминокислоту. Термин включает аминокислотные цепи любой длины, включая белки полной длины, где аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями.

Термин аминокислота относится к природным и неприродным аминокислотам так же, как к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Кодируемые в природе аминокислоты представляют собой 20 обычных аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин) и пирролизин и селеноцистеин. Термин аминокислотные аналоги относится к соединениям, которые имеют ту же самую основную химическую структуру, что и природные аминокислоты, то есть содержат α-углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и Я группу, такую как, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные Я группы (такие как норлейцин) или модифицированные пептидные основные цепи, но сохраняют ту же самую основную химическую структуру, что и природные аминокислоты. Ссылки на аминокислоту включают, например, природные протеогенные Ь-аминокислоты; Ό-аминокислоты, химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; природные непротеогенные аминокислоты, такие как β-аланин, орнитин и т.д.; и химически синтезированные соединения, обладающие свойствами, которые, как известно специалистам, являются характеристиками аминокислот. Примеры неприродных аминокислот включают, без ограничения, α-метиламинокислоты (например, α-метилаланин), Ό-аминокислоты, гистидино-подобные аминокислоты (например, 2аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин и α-метилгистидин), аминокислоты, содержащие дополнительный метилен в боковой цепи (гомо аминокислоты), и аминокислоты, в которых функциональная группа карбоновой кислоты в боковой цепи заменена группой сульфоновой кислоты (например, цистеиновой кислоты). Включение неприродных аминокислот, включая синтетические неприродные аминокислоты, замещенные аминокислоты, или одну или более из Ό-аминокислот в белки настоящего изобретения может оказаться выгодным в ряде различных случаев. Пептиды, содержащие Ό-аминокислоту и т.д., проявляют повышенную стабильность ш уйго или т νί\Ό по сравнению с эквивалентами, содержащими Ь-аминокислоту. Таким образом, конструирование пептидов и т.д., включающих Ό-аминокислоты, может быть особенно полезным в тех случаях, когда желательна или необходима повышенная внутриклеточная стабильность. Более конкретно, Ό-пептиды и т.д. устойчивы в отношении эндогенных пептидов и протеаз, тем самым обеспечивая повышенную биодоступность молекул, и пролонгируют время полужизни ш νί\Ό. если такие свойства желательны. Кроме того, Ό-пептиды и т.д. не могут быть процессированы эффективно из-за ограниченного основным комплексом гистосовместимости класса II представления Т-хелперным клеткам, поэтому, по-видимому, меньше вызывают гуморальные иммунные реакции во всем организме.

Аминокислоты могут быть названы в описании или по их общеизвестным трехбуквенным символам, или по однобуквенным символам, как рекомендовано комиссией по биохимической номенклатуре ГОРАС-ГОВ. Нуклеотиды, аналогично, могут быть названы в соответствии с их общепринятыми однобуквенными кодами.

Термин консервативно модифицированные варианты применим как к аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, термин консервативно модифицированные варианты относится к таким нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности или если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность до практически идентичной последовательности. Из-за дегенерации генетического кода большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой данный белок. Например, кодоны ССА, ССС, ССС и ССи все кодирует аминокислота аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин специфицирован кодоном, указанный кодон можно изменить на любой из соответствующих кодонов, описанных без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновой кислоты являются молчащими вариантами, которые являются одними из типов консервативно модифицированных вариантов. Здесь каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалистам в данной области должно быть понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением АИС, который обычно является единственным кодоном для метионина, и ТСС, который обычно является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, присутствует в каждой описанной последовательности.

Что касается последовательностей аминокислот, специалисту в данной области должно быть по

- 26 019968 нятно, что отдельные замещения, делеции или добавления к последовательностям нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или исключают одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, представляют собой консервативно модифицированный вариант, в котором указанное изменение приводит к делеции аминокислоты, добавлению аминокислоты или замещению аминокислоты химически аналогичной аминокислотой. Таблицы консервативных замещений, содержащие списки функционально аналогичных аминокислот, известны специалистам в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты, кроме того, дополняют и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели настоящего изобретения.

Таблицы консервативных замещений, содержащие списки функционально аналогичных аминокислот, известны специалистам в данной области. Следующие восемь групп, каждая из которых содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замещения друг для друга:

1) Аланин (А), Глицин (С);

2) Аспарагиновая кислота (Б), Глутаминовая кислота (Е);

3) Аспарагин (Ν), Глутамин (О);

4) Аргинин (В), Лизин (К);

5) Изолейцин (I), Лейцин (Ь), Метионин (М), Валин (V);

6) Фенилаланин (Р), Тирозин (Υ), Триптофан (№);

7) Серин (δ), Треонин (Т) и

8) Цистеин (С), Метионин (М), (см., например, Сге1дб!оп, Рго!ешк: 8бис!игек апб Мо1еси1аг Ргорегбек (№.Н. Ргеетап & Со.; 2пб еб1боп (БесетЬег 1993).

Термины идентичны или процент идентичности в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые одинаковы. Последовательности по существу, идентичны, если процент их аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые одинаковы (то есть имеют около 60% идентичности, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90 или около 95% идентичности в указанном участке), по сравнению с и выравненные для максимального соответствия в окне сравнения или в обозначенном участке, как измерено с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей (или других алгоритмов, доступных специалистам в данной области) или вручную сравнения и визуального изучения. Указанное определение также относится к комплементу тестируемой последовательности. Идентичности могут существовать на участке, который имеет по меньшей мере около 50 аминокислот или нуклеотидов в длину, или на участке, который имеет 75-100 аминокислот или нуклеотидов в длину или, если конкретно не указано, по всей последовательности полинуклеотида или полипептида. Полинуклеотид, кодирующий полипептид настоящего изобретения, включая гомологи видов, отличающихся от людей, можно получить способом, включающим стадии скринирования библиотеки в жестких условиях гибридизации с меченым зондом, содержащим полинуклеотидную последовательность настоящего изобретения или ее фрагмент, и выделяя полной длины кДНК и геномные клоны, содержащие указанную полинуклеотидную последовательность. Такие методики гибридизации хорошо известны специалистам в данной области.

Для сравнения последовательностей обычно одну последовательность используют как референспоследовательность, с которой сравнивают последовательности. Когда используют алгоритм сравнения последовательностей, тестируемую последовательность и референс-последовательность вводят в компьютер, определяют координаты субпоследовательности, при необходимости, и задают параметры программы алгоритма последовательностей. Можно использовать параметры неудачной программы или можно задать альтернативные параметры. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей рассчитывают процент идентичности последовательности для тестируемой последовательности относительно референс-последовательности на основании параметров программы.

Термин окно сравнения в том смысле, как здесь использован, включает сравнение с сегментом любого одного из числа смежных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно от около 50 до около 200, чаще от около 100 до около 150, в котором последовательность можно сравнить с референс-последовательностью того же числа смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны специалистам в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществить, используя, включая, без ограничения, алгоритм локальной гомологичности διηίΩι апб №а!егтап (1970) Абν. Арр1. Ма!й., 2:482с, алгоритм выравнивания гомологичности №еб1етап апб №ипксй (1970) 1. Мо1. Βίο1., 48:443, поиск по методу сходства Реагкоп апб Ыртап (1988) Ргос. №1'1. Асаб. 8ст И8А, 85:2444, компьютерными реализациями указанных алгоритмов (САР, ВЕ8ТР1Т, РА8ТА и ТРА8ТА из №1ксопкт Сепебск 8об\\аге Раскаде, Сепебск Сотри!ег Сгоир, 575 8аепсе, Бг., Маббоп, №1) или выравнивая вручную и визуально инспектируя (см., например, АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг В1о1оду (1995 кирр1етеп!)).

Одним примером алгоритма, который пригоден для определения процента идентичности последо

- 27 019968 вательности и сходства последовательностей, являются алгоритмы ВБ-ΑδΤ и ВБ-ΑδΤ 2.0, которые раскрыты А1!ксйи1 е! а1. (1997) Шс. Ас1бк Век., 25:3389-3402 и А1!ксйи1 е! а1. (1990) 1. Мо1. Вю1., 215:403-410 соответственно. Программное обеспечение для осуществления В^ΑδΤ анализов общедоступно через Национальный Центр (№11юпа1 Сеп!ег Вю!есйпо1оду 1пГогтайоп), доступный на \Уог1б \У1бе \УеЬ по адресу псЬ1.п1т.шй.доу. Параметры В^ΑδΤ алгоритма V, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В^ΑδΤN программа (для нуклеотидных последовательностей) использует как параметр по умолчанию длину слова (V) 11, ожидание (Е) или 10, М=5, N=-4 и сравнение обоих цепей. Для аминокислотных последовательностей В^ΑδΤΡ программа использует как параметр по умолчанию длину слова 3, и ожидание (Е) 10, и В^ОδυМ62 матрицу замен (см. НешкоГГ апб НешкоГГ (1992) Ргос. №И. Асаб. δ^. ША 89:10915) выравнивание (В) 50, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. В^ΑδΤ алгоритм обычно используют с отключенным фильтром низкой комплексности.

В^ΑδΤ алгоритм также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Каг1т апб А1!ксйи1 (1993) Ргос. №И. Асаб. δ^. ^А, 90:5873-5787). Одним показателем сходства, который предоставляет В^ΑδΤ алгоритм, является наименьшая сумма вероятностей (Ρ(Ν)), что является показателем вероятности совместимости между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями, которая может случайно возникнуть. Например, нуклеиновую кислоту считают сходной с референс-последовательностью, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с референс-нуклеиновой кислотой составляет менее чем около 0,2, или менее чем около 0,01, или менее чем около 0,001.

Выражение селективно (или специфически) гибридизуется с относится к связыванию, дублированию или гибридизации молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, если такая последовательность присутствует в сложной смеси (включая, без ограничения, полные клеточные или библиотеку ДНК или РНК).

Выражение жесткие условия гибридизации относится к гибридизации последовательности ДНК, РНК, ΡNΑ или других имитаторов нуклеиновой кислоты либо их комбинаций в условиях низкой ионной силы и высокой температуры, что известно специалистам. Обычно в жестких условиях зонд гибридизуется со своей мишеневой субпоследовательностью в сложной смеси нуклеиновых кислот (включая, без ограничения, полные клеточные или библиотеки ДНК либо РНК), но не гибридизуется с другими последовательностями в сложной смеси. Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться в различных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах. Обширное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Т^ккеп, ЬаЬога!огу Тес11пк|иек ш В1осйет1к!гу апб Мо1еси1аг Вю1оду-НуЬпб|/а1юп \νί11ι Шс1ею РгоЬек, Оуе1У1е\\· оГ ргшс1р1ек оГ НуЬг1б1ха(1оп апб 1йе к!га!е§у оГ Шс1ею Ас1бк Апа1ук1к (1993). Обычно жесткие условия выбирают примерно на около 5-10°С ниже температуры точки плавления (Т_т) для конкретной последовательности при заданной ионной силе, рН. Т_т представляет собой температуру (при определенной ионной силе, рН и концентрации ядер), при которой 50% зондов комплементарных мишени гибридизуются с последовательностью-мишенью при равновесии (если последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Т_т 50% зондов находятся в равновесии). Жесткие условия могут быть такими, при которых концентрация соли составляет менее чем около 1,0 М ионов натрия, обычно от около 0,01 до 1,0 М концентрации ионов натрия (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, и температура равна по меньшей мере около 30°С для коротких зондов (включая, без ограничения, зонды от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°С для более длинных зондов (включая, без ограничения, зонды от 50 нуклеотидов). Жесткие условия можно также создать, добавляя дестабилизирующие агенты, такие как формамид. Доля селективной или специфической гибридизации позитивного сигнала может превышать фон, по меньшей мере двукратно, оптимально в 10 раз фоновую гибридизацию. Примеры условий жесткой гибридизации могут быть следующими: 50% формамида, 5Х 88С, и 1% δΌδ, инкубирование при 42°С или 5Х 88С, 1% δΌδ, инкубирование при 65°С, с промывкой при 0,2Х δδС и 0,1% δΌδ при 65°С. Такие промывки можно осуществлять в течение 5, 15, 30, 60, 120 или более минут.

Термин эукариот относится к организмам, принадлежащим к филогенетическому домену Еисагуа, таким как животные (включая, без ограничения, млекопитающих, насекомых, рептилий, птиц и т.д.), реснитчатые, растения (включая, без ограничения, однодольные, двудольные, водоросли и т.д.), грибы, дрожжи, жгутиковые, микроспоридии, одноклеточные организмы и т.д.

Термин неэукариот относится к неэукариотным организмам. Например, неэукариотный организм может принадлежать к ЕиЬас!епа (включая, без ограничения, ЕксйепсЫа сой, Тйегтик !йегторЫ1ик, Васйик к!еаго!йегторЫ1ик, Ркеиботопак йиогексепк, Ркеиботопак аегидтока, Ркеиботопак рийба и т.д.) филогенетическому домену или Агсйаеа (включая, без ограничения, Ме1йапососсик _)аппаксйп, Ме!йапоЬас!епит !йегтоаи!о!горЫсит, На1оЬас!епит, таким как На1оГегах уо1сапи и На1оЬас!епит креаек ΝΒΟ-Ι, Агсйаеод1оЬик Ги1д1бик, Ругососсик Гшюкик, Ругососсик йопкокйи, Аеигоругит регшх и т.д.) филогенетическому домену.

Термин субъект относится к животному, в некоторых вариантах - к млекопитающему, и в других вариантах - к человеку, который является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Животное может быть домашним животным (например, собакой, кошкой и т.п.), фермерским животным (например,

- 28 019968 коровой, овцой, свиньей, лошадью и т.п.) или лабораторным животным (например, крысой, мышью, морской свинкой и т.п.).

Термин эффективное количество относится к такому количеству вводимого полипептида, модифицированного неприродной аминокислотой, которое до некоторой степени облегчит один или более из симптомов подлежащего лечению заболевания, состояния или нарушения. Композиции, содержащие раскрытые здесь полипептиды, модифицированные неприродной аминокислотой, можно вводить для профилактики, активизации и/или терапевтического лечения.

Термины повышать или повышение означают повышение или пролонгирование эффективности или длительности необходимого эффекта. Так, что касается эффекта усиления терапевтических агентов, термин усиление относится к способности повышать или пролонгировать, или эффективность или длительность действия других терапевтических агентов на систему. Термин повышающе-эффективное количество в том смысле, как здесь использован, относится к количеству, которое адекватно усилению действия другого терапевтического агента в необходимой системе. При использовании для животного эффективное количество для такого использования будет зависеть от тяжести процесса заболевания, нарушения или состояния, предшествовавшего лечения, общего состояния здоровья животного, реакции на лекарственное средство и от суждения лечащего ветеринара.

Термин модифицированное относится к любому изменению, осуществленному для данного полипептида, такому как изменение длины полипептида, аминокислотной последовательности, химической структуры, к котрансляционной модификации или посттрансляционной модификаци полипептида. Термин модифицированная форма означает, что обсуждаемые полипептиды являются необязательно модифицированными, то есть обсуждаемые полипептиды могут быть как модифицированными, так и/или немодифицированными.

Термин посттрансляционно модифицированный относится к любой модификации природной или неприродной аминокислоты, которая происходит после того, как такая аминокислота была включена в полипептидную цепь. Термин включает только в качестве примера котрансляционные 1п νί\Ό модификации, котрансляционные 1п νίΙΐΌ модификации (такие как не содержащая клеток трансляционная система), посттрансляционные 1п νί\Ό модификации и посттрансляционные 1п νίΙΐΌ модификации.

В целях профилактики композицию, содержащую полипептид ЬС-С8Р, вводят животному, восприимчивому или каким-либо другим образом подверженному риску конкретного заболевания, нарушения или состояния. Такое количество определяют как профилактически эффективное количество. При таком использовании точные количества также зависят от общего состояния здоровья животного, веса и т.п. Среди специалистов в данной области общепринято определять такие профилактически эффективные количества рутинными экспериментами (например, доза, превышающая клинически определенные дозы).

Термин защищенный относится к присутствию защитной группы или молекулы, которые предотвращают реакцию химически реакционноспособных функциональных групп в некоторых условиях реакций. Защитная группа будет меняться в зависимости от типа защищаемой химически реакционноспособной группы. Например, если химически реакционноспособной группой является амин или гидразид, защитную группу можно выбрать из группы тетрабутилоксикарбонила (ί-Вос) и 9фторенилметоксикарбонила (Ртос). Если химически реакционноспособной группой является тиол, защитной группой может быть ортопиридилдисульфид. Если химически реакционноспособной группой является карбоновая кислота, такая как бутановая или пропионовая кислота либо гидроксильная группа, защитной группой может быть бензильная или алкильная группа, такая как метил, этил или трет-бутил. Другие известные специалистам защитные группы можно также использовать в раскрытых здесь способах и композициях, включая фотолабильные группы, такие как Жос и МеЖос. Другие известные специалистам защитные группы можно также использовать в раскрытых здесь способах и композициях.

Только в качестве примера блокирующие/защитные группы можно выбрать из

Другие защитные группы раскрыты у Сгеепе апй Уи!к, РгоЮсЙуе Сгоирк ш Огдашс 8уп!йек1к, 3гй

Ей., Йо11п \УПеу & 8опк, Ж\у Уогк, ΝΥ, 1999, что включено в описание посредством ссылки во всей своей полноте.

В терапевтических целях композицию, содержащую модифицированный неприродный аминокис

- 29 019968 лотный полипептид, вводят животному, у которого уже существует заболевание, состояние или нарушение, в количестве, которого достаточно для лечения или, по меньшей мере, частичного ослабления симптомов заболевания, нарушения или состояния. Такое количество определяют как терапевтически эффективное количество и оно зависит от тяжести и течения заболевания, нарушения или состояния, предшествующего лечения, общего состояния здоровья животного, реакции на лекарственное средство и суждения лечащего ветеринара. Среди специалистов в данной области общепринято определять такие профилактически эффективные количества рутинными экспериментами (например, доза, превышающая клинически определенные дозы).

Термин лечение используют для ссылки на профилактическое и/или терапевтическое лечение.

Представленные здесь полипептиды с не кодируемой в природе аминокислотой могут включать меченые изотопами соединения, у которых один или более из атомов заменен на атом с атомной массой или массовым числом, отличающимся от атомной массы или массового числа обычно существующих в природе. Примеры изотопов, которые могут быть включены в рассматриваемые соединения, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фтора и хлора, такие как Н, Н, С, С, N 0, 0, 8, ¹⁸Е, ³⁶С1 соответственно. Некоторые из раскрытых здесь меченных изотопами соединений, например, таких, в которые включены радиоактивные изотопы, такие как ³Н и ¹⁴С, можно использовать в лекарственных средствах и/или субстратах для анализов распределения в тканях. Кроме того, замещение изотопами, такими как дейтерий, то есть ²Н, может обеспечить некоторые терапевтические преимущества, связанные с большей метаболической стабильностью, например увеличением времени полужизни ίη νίνο или уменьшением необходимой дозы.

Все изомеры, включая, без ограничения, диастереоизомеры, энантиомеры и их смеси, рассматривают как часть раскрытых здесь композиций. В дополнительных или следующих вариантах полипептиды с не кодируемой в природе аминокислотой метаболизируются после введения в нуждающийся в этом организм с образованием метаболитов, которые затем используются для осуществления необходимого эффекта, включая необходимый терапевтический эффект. Следующими или дополнительными вариантами являются активные метаболиты полипептидов с не кодируемой в природе аминокислотой.

В некоторых ситуациях полипептиды с не кодируемой в природе аминокислотой могут существовать как таутомеры. Кроме того, раскрытые здесь полипептиды с не кодируемой в природе аминокислотой могут существовать в несольватированной, также как в сольватированной формах с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода, этанол и т.п. Сольватированные формы также рассматриваются как обсуждавшиеся здесь. Специалистам в данной области должно быть понятно, что некоторые из приведенных здесь соединений могут существовать в нескольких таутомерных формах. Все такие таутомерные формы рассматриваются как часть раскрытых здесь композиций.

Если не указано иначе, использованы известные специалистам обычные способы массспектроскопии, ЯМР, ВЭЖХ, химии белков, биохимии, методики рекомбинантных ДНК и фармакологии.

Подробное описание предпочтительного варианта изобретения

I. Введение.

В настоящем изобретении предложены молекулы Ь-СС8Е, включающие по меньшей мере одну неприродную аминокислоту. В некоторых вариантах настоящего изобретения полипептид Ь-СС8Е, содержащий по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, включает по меньшей мере одну посттрансляционную модификацию. В одном варианте по меньшей мере одна посттрансляционная модификация включает присоединение молекулы, включая, без ограничения, гидроксиалкилкрахмал (НА8), гидроксиэтилкрахмал (НЕ8), метку, краситель, полимер, водорастворимый полимер, производное полиэтиленгликоля, фотосшивающий агент, радионуклид, цитотоксическое соединение, лекарственное средство, метку сродства, метку фолосродства, реакционноспособное соединение, смолу, второй белок или полипептид или аналог полипептида, антитело или фрагмент антитела, металлохелатор, кофактор, жирную кислоту, углевод, полинуклеотид, ДНК, РНК, антисмысловой полинуклеотид, сахарид, водорастворимый дендример, циклодекстрин, ингибиторную рибонуклеиновую кислоту, биоматериал, наночастицы, спиновую метку, фторофор, металлсодержащую молекулу, радиоактивную молекулу, новую функциональную группу, группу, которая ковалентно или нековалентно взаимодействует с другими молекулами, фотозахватывающую (рйоЮсадсб) молекулу, молекулу, возбуждаемую актиничной радиацией, фотоизомеризуемую молекулу, биотин, производное биотина, аналог биотина, молекулу, содержащую тяжелый атом, химически отщепляемую группу, фотоотщепляемую группу, удлиненную боковую цепь, связанный с углеродом сахар, окислительно-восстановительно активный агент, аминотиокислоту, токсическую молекулу, изотопно меченную молекулу, биофизический зонд, фосфоресцентную группу, хемилюминесцентную группу, электронноплотную группу, магнитную группу, интеркалирующую группу, хромофор, агент энергопереноса, биологически активный агент, детектируемую метку, малую молекулу, наночастицу, которую вводят в клетку в качестве метки (ДиаШит άοί), нанотрансмиттер, радионуклеотид, радиотрансмиттер, агент захвата нейтронов или любую комбинацию вышеперечисленных или других необходимых соединений или веществ, включающих вторую реакционноспособную группу, по меньшей мере к одной неприродной аминокислоте, включающей первую реакционноспособную группу, используя химически

- 30 019968 ую методологию, которая, как известно специалистам в данной области, подходит для конкретной реакционноспособной группы. Например, первая реакционноспособная группа представляет собой алкинильную молекулу (включая, без ограничения, в неприродной аминокислоте ппропаргилоксифенилаланин, где группу пропаргила иногда называют также ацетиленовой молекулой) и вторая реакционноспособная группа представляет собой азидомолекулу, и используют химический метод [3+2] циклодоприсоединения. В другом примере первая реакционноспособная группа представляет собой азидомолекулу (включая, без ограничения, в неприродной аминокислоте п-азидо-Ь-фенилаланин) и вторая реакционноспособнная группа представляет собой алкинильную молекулу. В некоторых вариантах модифицированного Ь-СС8Е полипептида настоящего изобретения используют по меньшей мере одну неприродную аминокислоту (включая, без ограничения, неприродную аминокислоту, содержащую кетофункциональную группу), включающую по меньшей мере одну посттрансляционную модификацию, где по меньшей мере одна посттрансляционная модификация включает сахаридную молекулу. В некоторых вариантах посттрансляционные модификации осуществляются 1и у1уо в эукариотной клетке или в неэукариотной клетке. Линкер, полимер, водорастворимый полимер или другие молекулы могут присоединять молекулу к полипептиду. Молекула может быть связана непосредственно с полипептидом.

В некоторых вариантах белок включает по меньшей мере одну посттрансляционную модификацию, которая осуществляется 1и у1уо в одной клетке-хозяине, где посттрансляционная модификация обычно не осуществляется в клетке-хозяине другого типа. В некоторых вариантах белок включает по меньшей мере одну посттрансляционную модификацию, которая осуществляется ш у1уо в эукариотной клетке, где посттрансляционная модификация обычно не осуществляется в неэукариотной клетке. Примеры посттрансляционных модификаций включают, без ограничения, гликозилирование, ацетилирование, ацилирование, липид-модификацию, пальмитоилирование, добавление пальмитата, фосфорилирование, модификацию гликолипидной связи и т.п.

В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает одну или более из не кодируемых в природе аминокислот для гликозилирования, ацетилирования, ацилирования, липид-модификации, пальмитоилирования, добавления пальмитата, фосфорилирования или модификации гликолипидной связи полипептида. В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает одну или более из не кодируемых в природе аминокислот для гликозилирования полипептида. В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает одну или более из кодируемых в природе аминокислот для гликозилирования, ацетилирования, ацилирования, липид-модификации, пильмитоилирования, добавления пальмитата, фосфорилирования или модификации гликолипид-связи полипептида. В некоторых вариантах полипептид Ь-СС8Е включает одну или более из кодируемых в природе аминокислот для гликозилирования полипептида.

В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает добавления и/или замещения одной или более из не кодируемых в природе аминокислот, что увеличивает степень гликозилирования полипептида. В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает одну или более из делеций, что увеличивает степень гликозилирования полипептида. В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает одно или более из добавлений и/или замещений не кодируемой в природе аминокислоты, что увеличивает степень гликозилирования различных аминокислот в полипептиде. В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает одну или более из делеций, что увеличивает степень гликозилирования различных аминокислот в полипептиде. В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает одно или более из добавления и/или замещения не кодируемой в природе аминокислоты, что увеличивает степень гликозилирования не кодируемой в природе аминокислоты в полипептиде. В некоторых вариантах Ь-СС8Е полипептид включает одно или более из добавлений и/или замещений не кодируемой в природе аминокислоты, что увеличивает степень гликозилирования кодируемой в природе аминокислоты в полипептиде. В некоторых вариантах полипептид Ь-СС8Е включает одно или более из добавлений и/или замещений кодируемой в природе аминокислоты, что увеличивает степень гликозилирования различных аминокислот в полипептиде. В некоторых вариантах полипептид Ь-СС8Е включает одно или более из добавлений и/или замещений не кодируемой в природе аминокислоты, что увеличивает степень гликозилирования кодируемой в природе аминокислоты в полипептиде. В некоторых вариантах полипептид Ь-СС8Е включает одно или более из добавлений и/или замещений не кодируемой в природе аминокислоты, что увеличивает степень гликозилирования не кодируемой в природе аминокислоты в полипептиде.

В одном варианте посттрансляционная модификация включает присоединение олигосахарида к аспарагину через С1сNΑс-аспарагиновую связь (включая случаи без ограничения, когда олигосахарид включает (С1сNΑс-Маи)₂-Маη-С1сNΑс-С1сNΑс и т.п.). В другом варианте посттрансляционная модификация включает присоединение олигосахарида (включая, без ограничения, Са1-СаШАс, Са1-С1сNЛс и т.д.) к серину или треонину через связи СаШАс-серин, СаШАс-треонин, С1сNΑс-серин или ΟΒΝΑ^ треонин. В некоторых вариантах белок или полипептид настоящего изобретения может включать секрецию или локализацию последовательности, эпитопную метку, ЕБЛС метку, полигистидиновую метку, С8Т гибрид и/или т.п. Примеры секреторных сигнальных последовательностей включают, без ограничения, прокариотную секреторную сигнальную последовательность, эукариотную секреторную сигнальную последовательность, эукариотную секреторную сигнальную последовательность 5'оптимизированную для бактериальной экспрессии, новую секреторную сигнальную последовательность,

- 31 019968 пектатлиазную секреторную сигнальную последовательность, Οтρ А секреторную сигнальную последовательность и фаговую секреторную сигнальную последовательность. Примеры секреторных сигнальных последовательностей включают, без ограничения, 8ΤΙΙ (прокариотная), Εά С111 и М13 (фаговая), Вд12 (дрожжевая) и сигнальную последовательность Ь1а, полученную из транспозона. Любая такая последовательность может быть модифицирована до получения необходимого результата полипептидом, включая, без ограничения, замещение одной сигнальной последовательности отличающейся последовательностью, замещение лидерной последовательности отличающейся лидерной последовательностью и т.д.

Представляющий интерес белок или полипептид может содержать по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или десять либо больше неприродных аминокислот. Неприродные аминокислоты могут быть одинаковыми или различными, например в белке может быть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше различных сайтов, которые включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше различных неприродных аминокислот. В некоторых вариантах по меньшей мере одна, но меньше чем все, из конкретных аминокислот, присутствующих в природной версии белка, замещены неприродными аминокислотами.

В настоящем изобретении предложены способы и композиции на основе Ь-СС8Е, включающие по меньшей мере одну не кодируемую в природе аминокислоту. Введение по меньшей мере одной не кодируемой в природе аминокислоты в Ь-СС8Е может позволить применять химическую стратегию конъюгирования, которая включает специфические химические реакции, включая, без ограничения, реакцию с одной или более из не кодируемых в природе аминокислот, хотя и не реагирующей с обычно встречающимися 20 аминокислотами. В некоторых вариантах Ь-СС8Е, включающие не кодируемую в природе аминокислоту, связаны с водорастворимым полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), через боковую цепь не кодируемой в природе аминокислоты. В настоящем изобретении предложен высокоэффективный способ селективной модификации белков производными ПЭГ, который включает селективное включение негенетически кодируемой аминокислоты, включая, без ограничения, такие аминокислоты, которые содержат функциональные группы или заместители, не встречающиеся в 20 природно включенных аминокислотах, включая, без ограничения, кетонную, азидную или ацетиленовую молекулу, в белки в ответ на селекторный кодон и последующую модификацию полученных аминокислот соответствующими реакционноспособными производными ПЭГ. После включения аминокислотные боковые цепи можно затем модифицировать, используя химические методики, которые, как известно специалистам в данной области, пригодны для конкретной функциональной группы или заместителей, присутсвующих в не кодируемой в природе аминокислоте. Известны весьма разнообразные химические методики, которые пригодны для использования в настоящем изобретении для включения в белок водорастворимого полимера. Такие методики включают, без ограничения, реакцию [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена (см., например, Рай\\а, А. в СотргеНепмуе Ο^-ιηχ 8уп1йе818, Уо1. 4, (1991) Εά. Τ1Ό81, В.М., Регдатоп, Οχίοιά, р. 1069-1109 и Ншздеп, В. в 1,3-Э1ро1аг Сус1оайййюп Сйет18йу. (1984) Εά. Ραάνα, А., ^йеу, №\ν Уогк, р. 1-176) с, включая, без ограничения, ацетиленовыми или азидными производными соответственно.

Так как метод [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена включает реакцию циклоприсоединения, а не нуклеофильного замещения, белки можно модифицировать с чрезвычайно высокой селективностью. Реакцию можно вести при комнатной температуре в водных условиях с превосходной региоселективностью (1,4>1,5) путем добавления каталитических количеств соли Си(1) к реакционной смеси; см., например, Штое, е! а1., (2002) 1. Ογ§. СНет., 67:3057-3064, ВозкИбеу, е! а1., (2002) Апее\\\ СНет. Ιηΐ. Εά., 41:2596-2599 и νΟ 03/101972. Молекулой, которую можно добавлять к белку настоящего изобретения через [3+2] циклоприсоединение, на самом деле может быть любая молекула с подходящей функциональной группой или заместителем, включая, без ограничения, азидопроизводные или ацетиленовые производные. Такие молекулы можно добавлять к неприродной аминокислоте с ацетиленовой группой, включая, без ограничения, п-пропаргилоксифенилаланин, или с азидогруппой, включая, без ограничения, п-азидофенилаланин соответственно.

Пятичленное кольцо, которое образуется в результате [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена, не всегда является обратимым в восстанавливающей среде и является стабильным при гидролизе в течение длительного времени в водном окружении. Соответственно физические и химические характеристики широкого круга веществ можно модифицировать в жестких водных условиях активными производными ПЭГ настоящего изобретения. Еще более важно то, что так как азидные и ацетиленовые молекулы являются специфическими друг для друга (и не реагируют, например, с любой из 20 обычных генетически кодируемых аминокислот), белки можно модифицировать по одному или более из специфических сайтов с чрезвычайно высокой селективностью.

В настоящем изобретении также предложены водорастворимые и гидролитически стабильные производные производных ПЭГ и родственных гидрофильных полимеров, содержащие одну или более из ацетиленовых или азидных молекул. Производные ПЭГ полимеров, которые содержат ацетиленовые молекулы, отличаются высокой селективностью в отношении присоединения к азидным молекулам, которые были селективно введены в белки под действием селекторного кодона. Аналогично, производные ПЭГ полимеров, которые содержат азидные молекулы, отличаются высокой селективностью в отноше- 32 019968 нии присоединения к ацетиленовым молекулам, которые были селективно введены в белки под действием селекторного кодона.

Более конкретно, азидные молекулы включают, без ограничения, алкилазиды, арилазиды и производные указанных азидов. Производные алкил- и арилазидов могут содержать другие заместители до тех пор, пока сохраняется ацетилен-специфическая реакционная способность. Ацетиленовые молекулы включают алкил- и арилацетилены и производные каждого из них. Производные алкил- и арилацетиленов могут включать другие заместители до тех пор, пока сохраняется азид-специфическая реакционная способность.

В настоящем изобретении предложены конъюгаты веществ, обладающих широким разнообразием функциональных групп, заместителей или молекул, с другими веществами, включая, без ограничения, гидроксиалкилкрахмал (НА8); гидроксиэтилкрахмал (НЕ8); метки; красители; полимеры; водорастворимые полимеры; производные полиэтиленгликоля; фотосшивающие агенты; радионуклиды; цитотоксические соединения; лекарственные средства; метки сродства; фотоаффинные метки; реакционноспособные соединения; смолы; второй белок или полипептид либо аналоги полипептида; антитела или фрагменты антител; металлохелаторы; кофакторы; жирные кислоты; углеводы; полинуклеотиды; ДНК; РНК; антисмысловые полинуклеотиды; сахариды; водорастворимые дендримеры; циклодекстрины; ингибиторная рибонуклеиновая кислота; биоматериалы; наночастицы; спиновые метки; фторофоры, металлсодержащие молекулы; радиоактивные молекулы; новые функциональные группы; группы, которые ковалентно или нековалентно взаимодействуют с другими молекулами; фотозахватывающие молекулы; молекулы, возбуждаемые актиничным излучением; фотоизомеризуемые молекулы; биотин; производные биотина; аналоги биотина; молекулы, содержащие тяжелые атомы; химически отщепляемые группы; фотоотщепляемые группы; удлиненные боковые цепи; связанные с углеродом сахара; окислительновосстановительно активные агенты; аминотиоциды; токсичные молекулы; изотопно меченные молекулы; биофизические зонды; фосфоресцентные группы; хемилюминесцентные группы; электронноплотные группы; магнитные группы; интеркалирующие группы; хромофоры; агенты переноса энергии; биологически активные агенты; детектируемые метки; малые молекулы; наночастицы (с.|иап1ит бо1); нанотрансмиттеры; радионуклеотиды; радиотрансмиттеры; захватывающие нейтроны агенты; или любые комбинации вышеперечисленных, или любые другие необходимые соединения или вещества. Настоящее изобретение также включает конъюгаты веществ, содержащих азидные или ацетиленовые молекулы с производными ПЭГ полимеров, содержащими соответствующие ацетиленовые или азидные молекулы. Например, ПЭГ полимер, содержащий азидную молекулу, можно присоединить к биологически активной молекуле в таком положении в белке, которое содержит негенетически кодируемую аминокислоту, содержащую ацетиленовую функциональность. Связь, через которую ПЭГ и биологически активные молекулы присоединяются, включает, без ограничения, продукт [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена.

Специалистами установлено, что ПЭГ можно использовать для модификации поверхностей биоматериалов (см., например, патент США 6610281; Мейуаг, Я., 1. Рйагт. 8ск, 3(1): 125-136 (2000), который включен в описание посредством ссылки). Настоящее изобретение также включает биоматериалы, поверхность которых включает один или более из реакционноспособных азидных или ацетиленовых сайтов и один или более из азид- или ацетиленсодержащих полимеров настоящего изобретения, присоединенных к поверхности в результате [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена. Биоматериалы и другие вещества также можно присоединить к производным азид- или ацетилен-активированных полимеров через связь, отличающуюся от азидной или ацетиленовой связи, такую как связь, включающую молекулы карбоновой кислоты, амина, спирта или тиола, при этом оставляя азидные или ацетиленовые молекулы доступными для последующих реакций.

Настоящее изобретение включает способ синтеза азид- и ацетиленсодержащих полимеров настоящего изобретения. В случае азидсодержащего производного ПЭГ азид может быть связан непосредственно с атомом углерода полимера. Альтернативно, азидсодержащее производное ПЭГ можно получить, присоединяя связывающий агент, который содержит азидную молекулу с одного конца, к обычному активированному полимеру так, чтобы образовавшийся полимер содержал азидную молекулу на своем конце. В случае ацетиленсодержащих производных ПЭГ ацетилен может быть связан непосредственно с атомом углерода полимера. Альтернативно, ацетиленсодержащие производные ПЭГ можно получить, присоединяя связывающий агент, который содержит ацетиленовую молекулу на одном конце обычного активированного полимера, так, чтобы образовавшийся полимер имел ацетиленовую молекулу на своем конце.

Более конкретно, в случае азидсодержащих производных ПЭГ водорастворимый полимер, содержащий по меньшей мере одну активную гидроксильную молекулу, подвергают реакции для получения замещенного полимера, содержащего более реакционноспособные молекулы, такие как мезилат, трезилат, тозилат или отщепляемую группу галогена. Получение и использование производных ПЭГ, содержащих галогенангидриды сульфокислоты, атомы галогена и другие отщепляемые группы, известно специалистам в данной области. Полученный замещенный полимер затем подвергают реакции для замещения азидной молекулы на конце полимера на более реакционноспособную молекулу. Альтернативно, водорастворимый полимер, содержащий по меньшей мере одну активную нуклеофильную или электро

- 33 019968 фильную молекулу, подвергают реакции со связывающим агентом, который имеет азид на одном конце, так что образуется ковалентная связь между ПЭГ полимером и связывающим агентом, и азидная молекула располагается на конце полимера. Нуклеофильные и электрофильные молекулы, включая амины, тиолы, гидразиды, гидразины, спирты, карбоксилаты, альдегиды, кетоны, тиоэфиры и т.п., известны специалистам в данной области.

Более конкретно, в случае ацетиленсодержащих производных ПЭГ водорастворимый полимер, содержащий по меньшей мере одну активную гидроксильную молекулу, подвергают реакции для удаления галогена или другой активированной отщепляемой группы у предшественника, который содержит ацетиленовую молекулу. Альтернативно, водорастворимый полимер, содержащий по меньшей мере одну активную нуклеофильную или электрофильную молекулу, подвергают реакции со связывающим агентом, который содержит ацетилен на одном конце, так что образуется ковалентная связь между ПЭГ полимером и связывающим агентом и ацетиленовая молекула оказывается на конце полимера. Использование галогеновых молекул, активированных отщепляемых групп, нуклеофильных и электрофильных молекул в контексте органического синтеза и получения и использования производных ПЭГ хорошо изучено специалистами в данной области.

В настоящем изобретении также предложен способ селективной модификации белков для добавления других веществ к модифицированному белку, включая, без ограничения, водорастворимые полимеры, такие как ПЭГ и производные ПЭГ, содержащие азидную или ацетиленовую молекулы. Азид- и ацетиленсодержащие производные ПЭГ можно использовать для модификации свойств поверхностей и молекул, в случаях, когда важны биосовместимость, стабильность, растворимость и отсутствие иммуногенности, в то же самое время обеспечивая более селективный способ присоединения производных ПЭГ к белкам, чем ранее было известно специалистам в данной области.

II. Бычьи СС8Е.

Полипептиды ЬС-С8Е настоящего изобретения можно использовать для ослабления или профилактики инфекций у животных. Биологические активности так же, как анализы для характеризации биологических активностей бычьих и человеческих С-С8Е, известны специалистам в данной области. Анализы, которые включают оценку числа нейтрофилов и функций нейтрофилов, известны специалистам в данной области.

III. Общие методы рекомбинантных нуклеиновых кислот для использования в настоящем изобретении.

В многочисленных вариантах настоящего изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие представляющий интерес полипептид ЬС-С8Е, выделяют, клонируют и часто изменяют, используя рекомбинантные методики. Такие варианты используют, включая, без ограничения, для экспрессии белка или во время создания вариантов, производных, экспрессионных кассет или других последовательностей, полученных из полипептида ЬС-С8Е. В некоторых вариантах последовательности, кодирующие полипептиды настоящего изобретения, операбельно связаны с гетерологичным промотором. Выделение 11С-С8Е и продуцирование С-С8Е в клетках-хозяевах раскрыты, например, в патентах США №№ 4810643; 4999291; 5580755 и 6716606, которые включены в описание посредством ссылки.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид ЬС-С8Е, включающий не кодируемую в природе аминокислоту, можно синтезировать на основании аминокислотной последовательности исходного полипептида, включая, без ограничения, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО Ш ΝΟ: 1, 2, и затем, изменяя нуклеотидную последовательность таким образом, чтобы осуществить введение (т.е. встраивание или замещение) или удаление (т.е. делецию или замещение) соответствующего аминокислотного остатка (остатков). Нуклеотидную последовательность можно удобно модифицировать, используя сайт-направленный мутагенез в соответствии с обычными способами. Альтернативно, нуклеотидную последовательность можно получить, используя химический синтез, включая, без ограничения, использование олигонуклеотидного синтезатора, где олигонуклеотиды конструируют на основании аминокислотной последовательности искомого полипептида, и предпочтительно выбирая такие кодоны, которые находятся в клетке-хозяине, в которой будут продуцироваться указанные рекомбинантные полипептиды. Например, несколько мелких олигонуклеотидов, кодирующих части искомого полипептида, можно синтезировать и собрать, используя РСК, лигирование или цепную реакцию лигирования; см., например, Вагапу, е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8сЕ, 88: 189-193 (1991); патент США 6521427, которые включены в описание посредством ссылки.

В настоящем изобретении используют рутинные методики в области рекомбинантной генетики. Основные литературные источники, в которых раскрыты общие методы, использованные в настоящем изобретении, включают 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1 (3гб еб. 2001); Кпед1ег, Сепе ТгапзГег апб Ехргекыоп: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (1990) и Сиггеп! Рго!осок ш Мо1еси1аг Вю1оду (Аи8иЬе1 е! а1., ебк., 1994)).

Общие тексты, в которых описаны методики молекулярной биологии, включают Вегдег апб К1тте1, Сшбе !о Мо1еси1аг С1ошпд Тесйпгдиек, МеШобк т Еп7уто1оду, Уо1. 152, Асабетю Ргекк, Шс, 8ап П1едо, СА (Вегдег); 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬога!огу Мапиа1 (2пб Еб.), Уо1. 1-3, Со1б 8рппд ИагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд ИагЬог №\ν Уогк, 1989 (8атЬгоок) и Сиггеп! Рго!осо1§ т Мо1еси

- 34 019968

1аг В1о1оду, Р.М. АикиЬе1 е! а1., ейк., Сиггеп! Рго!осо1к, совместное предприятие Сгеепе РиЬйкйтд Аккоаа!ек, 1пс. и ίοΗπ \УПеу & 8опк, 1пс., (дополненные до 1999) (АикиЬе1). В указанных текстах раскрыт мутагенез, использование векторов, промоторов и множество других родственных материалов, относящихся к, включая, без ограничения, созданию генов или полинуклеотидов, которые включают селекторные кодоны для производства белков, которые включают неприродные аминокислоты, ортогональные тРНК, ортогональные синтетазы и их пары.

В настоящем изобретении используют различные типы мутагенеза для различных целей, включая, без ограничения, для получения новых синтетаз или тРНК, для осуществления мутаций тРНК молекул, для осуществления мутаций полинуклеотидов, кодирующих синтетазы, для создания библиотек тРНК, для создания библиотек синтетаз, для создания селекторных кодонов, для встраивания селекторных кодонов, которые кодируют неприродные аминокислоты в представляющих интерес белках или полипептидах. Они включают, без ограничения, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, гомологические рекомбинации, перестановки в ДНК или другие рекурсивные методы мутагенеза, химерические конструкции, мутагенез с использованием урацилсодержащих матриц, олигонуклеотид-направленный мутагенез, модифицированный фосфоротиоатом ДНК мутагенез, мутагенез с использованием содержащей разрывы двухцепочечной ДНК или т.п., РСТ-опосредованный мутагенез или любую из их комбинаций. Дополнительные подходящие методы включают точечное исправление ошибок спаривания, мутагенез с использованием репарационно-дефицитных штаммов-хозяев, рестрикцию-селекцию и рестрикциюочистку, мутагенез с использованием делеций, мутагенез с использованием синтеза полного гена, репарацию двухцепочечных разрывов и т.п. Мутагенез, включая, без ограничения, включающий химерические конструкции, также включен в объем настоящего изобретения. В одном варианте осуществляя мутагенез можно руководствоваться известной информацией о природных молекулах или измененных либо мутированных природных молекулах, включая, без ограничения, последовательности, сравнение последовательностей, физические свойства, вторичные, третичные или четвертичные структуры, кристаллическую структуру или т.п.

Приведенные здесь тексты и примеры раскрывают указанные процедуры. Дополнительная информация находится в следующих публикациях и ссылках, цитированных в Ыпд е! а1., Арргоасйек !о ^NΑ тШадепеак: ап оусгугс^, Апа1. Вюсйет., 254(2): 157-178 (1997); Эа1е е! а1., О11допис1еоййе-й1гес!ей гапйот ти!адепек1к иктд 1йе рйокрйого!йюа!е те11юй, Ме!йойк Мо1. Вю1., 57: 369-374 (1996); 8тйй, 1п νίίΓο ти1адепек1к, Апп. Яеν. Сепе!., 19:423-462 (1985); Во!к!ет & 8Ног11е, 8!га!ед1ек апй аррйсайопк оГ т νίίΓο ти1адепек1к, 8с1епсе, 229: 1193-1201 (1985); Сайет, 8йе-ййес!ей ти!адепек1к, Вюсйет. I., 237: 1-7 (1986); Кипке1, Тйе еГПаепсу оГ о11допис1еоййе й1гес!ей ти!адепек1к, т Шс1ею Аайк & Мо1еси1аг Вю1оду (Ескк!ет, Р. апй ЬШеу, Э.М.1. ейк., 8рппдег Уег1ад, Вегйп) (1987); Кипке1, Яар1й апй еГйаеп! кйе-креайс ти!адепеак М!йои! рйепо1урю ке1ес!юп, Ргос. №И. Асай. 8сй И8А, 82: 488-492 (1985); Кипке1 е! а1., Яар1й апй еГйаеп! кйе-креайс тн1адепек1к \\ййои1 рйепо1ур1с ке1ес!юп, Ме!йойк т Епхуток, 154, 367-382 (1987); Вакк е! а1., Ми!ап! Тгр гергеккогк νίΐΗ пе\\' ^NΑ-Ь^пй^пд кресШсйтек, 8с1епсе, 242: 240-245 (1988); 2о11ег & 8тйй, Ойдопис1ео!1йе-й1гес!ей тн1адепек1к иктд МЕ3-йепуей уесЮгк: ап еГПс1еп1 апй депега1 ргосейиге Гог 1йе ргойисйоп оГ рот! ти1а!юпк т апу ^NΑ Ггадтеп!, Жс1ею Ас1йк Яек., 10: 6487-6500 (1982); 2о11ег & 8тйй, Ойдопис1ео!1йе-й1гес!ей тн1адепек1к оГ ^NΑ Ггадтеп!к с1опей т!о М13 уесЮгк, Ме!йойк т ЕпхутоЕ 100: 468-500 (1983); 2о11ег & 8тйй, О11допис1еоййе-й1гес!ей ти!адепек1к: а к1тр1е те!йой иктд ίνο ойдопис1еоййе рптегк апй а ктд1е-кйапйей ^NΑ !етр1а!е, Ме!йойк т ЕпхутоЕ 154: 329-350 (1987); Тау1ог е! а1., Тйе ике оГ рйокрйого1йюа!е-той1йей ^NΑ т гек1г1с11оп епхуте геасйопз !о ргераге шскей ^NΑ. №с1. Ас1йк Яек., 13: 8749-8764 (1985); Тау1ог е! а1., Тйе гар1й депегайоп оГ ойдопис1еоййе-й1гес!ей тнЕИюпк а! й1дй Ггециепсу иктд рйокрйого!йюа!е-той1йей ^NΑ. Жс1. Ас1йк Яек., 13: 8765-8785 (1985); Nакатауе & Ескк!ет, 1пй1Ьйюп оГ гекйтсйоп епйопис1еаке Να I с1еауаде Ьу рйокрйого1йюа!е дгоирк апй йк аррйсайоп !о ойдопис1еоййе-й1гес!ей ти1адепек1к, Νϋθ1. Аайк Яек., 14: 9679-9698 (1986); 8ауегк е! а1., 5''-3' Ехопис1еакек т рйокрйого1йюа!е-Ьакей о11допис1еоййе-й1гес!ей ти1адепек1к, Νϋθ1. Аайк Яек., 16:791-802 (1988); 8ауегк е! а1., 8йапй кресШс с1еауаде оГ рйокрйого!йюа!е-соп!а1шпд ^NΑ Ьу геасйоп νίΐΗ гекйгсйоп епйопис1еакек т 1йе ргекепсе оГ е!й1йтт Ьгот1йе, (1988) Νϋθ1. Аайк Яек., 16: 803-814; Кгатег е! а1., Тйе даррей йир1ех ^NΑ арргоасй !о ойдопис1еоййе-й1гес!ей ти1айоп сои8!гисйоп, Νϋθ1. Аайк Яек., 12: 9441-9456 (1984); Кгатег & Ρηίζ Ойдопис1еоййе-й1гес!ей сопкйисЕоп оГ ти1айопк νίη даррей йир1ех ^NΑ, Ме!йойк т Еиζутο1., 154: 350-367 (1987); Кгатег е! а1., 1тргоуей еиζутайс т νίίτο геасйопк т !йе даррей йир1ех ^NΑ арргоасй !о ойдопис1еоййе-й1гес!ей сопкйисйоп оГ ти1айопк, Жс1. Ас1йк Яек., 16: 7207 (1988); Ρηίζ е! а1., Ойдопис1ео11йе-й1гес(ей сопкйисЕоп оГ ти!айопк: а даррей йир1ех ^NΑ ргосейиге νίΐΗουΙ еиζутайс геасйопк т νίίτο, Νϋθ1. Ас1йк Яек., 16: 6987-6999 (1988); Кгатег е! а1., ОГГегеп! Ьаке/Ьаке т1кта!сйек аге соггес!ей νίΐΗ й1ГГегеп! еГйаепаек Ьу !йе те!йу1-ййес!ей ^NΑ т1кта!сй-гера1г кук!ет оГ Е. сой, Се11, 38: 879-887 (1984); Сайет е! а1., 1трготей ойдопис1еоййе кйе-ййес!ей тШадепеак иктд М13 усс!огк, Νϋθ1. Аайк Яек., 13: 44314443 (1985); Сайет, 1трготей ойдопис1еоййе-ййес!ей ти!адепек1к иктд М13 усс!огк, Ме!йойк т Еиζутο1., 154: 382-403 (1987); Едй!ейагеайей & Неп^кοГГ. Ике оГ ойдопис1еоййек !о депега!е 1агде йе1е11опк, Νϋθ1. Ас1йк Яек., 14: 5115 (1986); Уе11к е! а1., 1тройапсе оГ йуйгодеп-Ьопй Гогтайоп т к!аЬ^1^ζ^пд !йе йапкйюп к!а!е оГ киЬййкт, Рй11. Тгапк. Я. 8ос. Ьопй. А 317: 415-423 (1986); NатЬ^а^ е! а1., То1а1 куп!йек1к апй с1ошпд оГ а депе сойтд Гог !йе пЬопис1еаке 8 рго1ст, 8с1епсе, 223: 1299-1301 (1984); 8актаг апй Кйогапа, То!а1 куп!йе- 35 019968

818 апб ехрге881оп о£ а депе £ог Не а1рйа-8иЬипй о£ Ьоуте гой ойег ведшей диашпе пнс1ео11йе-Ь|пй1пд рго1ст (йапвйист), N^1. Ас1йв Кев., 14: 6361-6372 (1988); ^е11в е1 а1., Саввейе тйадепе818: ап е£йс1ей те1Ной £ог депегайоп о£ тиШр1е тййюпв а! йейпей вйев, Сепе, 34: 315-323 (1985); СгнпйвИот е1 а1., 011допис1еоййе-ййес1ей тйадепе818 Ьу тюговсак 'вНоРдип' депе 8уйке818, №с1. Ас1йв Кев., 13: 3305-3316 (1985); Мапйеск1, 011допис1еоййе-ййейей йоиЫе-вйапй Ьгеак герай т р1авт1Й8 о£ ЕвскейсЫа сой: а теПюй £ог 8Йе-8рес1йс тйадепе818, Ргос. Асай. 8сг И8А, 83: 7177-7181 (1986); Ато1й, Рго1ет епдтеегшд £ог ипивиа1 епуйоптейв, Сштей 0ршюп т Вю1ескпо1оду, 4: 450-455 (1993); 81еЬег, е1 а1., №11иге В1о1есНпо1оду, 19: 456-460 (2001); ^.Р.С. 81еттег, АПиге, 370, 389-91 (1994) и ГА. Ьойтег, Ι. Равкап, ШсШс Ас1йв Кев., 23, 3067-8 (1995). Дополнительные подробности отнсительно многих из вышеперечисленных методов можно найти в МеПюйв ш Епхуто1оду, Уо1. 154, где также раскрыты способы, которые можно использовать для решения диагностических проблем различных способов мутагенеза.

Олигонуклеотиды, например, для использования в мутагенезе настоящего изобретения, например библиотеки мутирующих синтетаз или изменяющихся тРНК, обычно синтезируют химическим способом, используя фосфорамидитный триэфирный способ, раскрытый Веаисаде апй Сагййегв, ТеИаНейгоп Ьейв., 22(20): 1859-1862, (1981), например, используя автоматический ситезатор, как раскрыто в работе №ейкат-УапПеуайег е1 а1., №с1ею Ас1й Кев., 12: 6159-6168 (1984).

Настоящее изобретение также относится к эукариотным клеткам-хозяевам, неэукариотным клеткам-хозяевам и организмам для т у|уо встраивания неприродной аминокислоты через ортогональные тРНК/К8 пары. Клетки-хозяева генетически конструируют (включая, без ограничения, трансформированные, трансдуцированные или трансфектированные), используя полинуклеотиды настоящего изобретения или конструкции, которые включают полинуклеотиды настоящего изобретения, включая, без ограничения, вектор настоящего изобретения, который может быть, например, клонирующим вектором или экспрессионным вектором. Например, кодирующие участки для ортогональной тРНК, ортогональной тРНК синтетазы и белка, подлежащие дериватизации, операбельно связывают с элементами, контролирующими генную экспрессию, которые функциональны в представляющей интерес клетке-хозяине. Указанные векторы могут быть, например, в форме плазмиды, космиды, фага, бактерии, вируса, открытого полинуклеотида или конъюгированного полинуклеотида. Указанные векторы вводят в клетки и/или микроорганизмы стандартными способами, включая электропорацию (Еготт е1 а1., Ргос, №И. Асай. 8сг И8А, 82, 5824 (1985)), инфицирование вирусными векторами, высокоскоростную баллистическую бомбардировкую мелкими частицами, причем нуклеиновые кислоты расположены или внутри матрицы маленьких шариков или частиц либо на их поверхности (К1еш е1 а1., №11иге 327, 70-73 (1987)) и/или т.п. Методики, пригодные для переноса нуклеиновой кислоты в клетки ш νίΙΐΌ, включают использование липосом, микроинъекций, гибридизации клеток, ОЕАЕ-декстрана, способа кальцийфосфатного осаждения и т.д. Способы 1п у|уо генного переноса включают кальцийфосфатное осаждение, трансфекцию вирусными (обычно ретровирусными) векторами и липосомально опосредованную трансфекцию покрытого вирусом белка |Охаи е1 а1., Тгепйв ΐπ Вю1ескпо1оду, 11, 205-210 (1993)]. В некоторых ситуациях может оказаться желательным создать источник нуклеиновой кислоты с агентом, который нацелен на клетки-мишени, таким как антитело, специфическое для мембранного белка клеточной поверхности или клетки-мишени, лиганд для рецептора на клетке-мишени и т.д. В тех случаях, когда используют липосомы, белки, которые связываются с мембранным белком клеточной поверхности, связанным с эндоцитозом, можно использовать для нацеливания и/или облегчения захвата, например, капсидных белков или их фрагментов, тропных для конкретного типа клеток, антител к белкам, которые подверглись интернализации во время клеточного цикла, белков, которые нацелены на внутриклеточную локализацию и увеличивают период внутриклеточной полужизни.

Сконструированные клетки-хозяева можно культивировать в обычной питательной среде, модифицированной в соответствии с такими активностями, как, например, стадии скрининга, активация промоторов или выбор трансформантов. Такие клетки можно необязательно культивировать в трансгенных организмах. Другие полезные ссылки включают, без ограничения, для выделения и культивирования клеток (например, для последующего выделения нуклеиновой кислоты) ЕгевНпеу (1994) СнНшс о£ Айта1 Се11в, а Мапиа1 о£ Вавю ТесНп1цие, 111йй еййюп, ^йеу-Ывв, №\ν Уогк и цитированные там ссылки, Раупе е1 а1 (1992) Р1ай Се11 и Т188ие СиЙиге ш Ыс.|шй Системы 1оНп ^йеу & 8опв, Шс. №\ν Уогк, NΥ, СатЬогд апй РйШрв (ейв) (1995) Р1ай Се11, Т188ие апй 0гдап СиЙиге, Енпйатеп1а1 МеЛойв 8ргшдег ЬаЬ Мапиа1, 8ргтдег- Уег1ад (Вейт Не1йе1Ьегд №\ν Уогк) и АЙав и Ра1кв (ейв.) ТНе НапйЬоок о£ МююЬю1одюа1 Мей1а (1993) СКС Р1 евв, Воса Кйоп, ЕЬ.

Существуют несколько хорошо известных способов введения нуклеиновых кислот-мишеней в клетки, причем любой из них можно использовать в настоящем изобретении. Они включают гибридизацию клеток-реципиентов с бактериальными протопластами, содержащими ДНК, электропорацию, бомбардировку частицами и инфицирование вирусными векторами (обсуждаются далее) и т.д. Бактериальные клетки можно использовать для амплификации ряда плазмид, содержащих ДНК конструкции настоящего изобретения. Бактерии выращивают до логарифмической фазы, и плазмиды из бактерий можно выделить различными способами, хорошо известными специалистам (см., например, 8атЬгоок). Кроме того, коммерчески доступны наборы для выделения плазмид из бактерий, (см., например, Еа8уР1ер™,

- 36 019968

Е1ех1Ртер™, оба от Рйагтааа Вю!есй; 8!га!аС1еап™ от 8!та!адепе и О1Аргер™ от О|адеп). Выделенные и очищенные плазмиды затем используют для получения других плазмид, которые используют для трансфекции клеток или включения в родственные векторы для инфицирования организмов. Типичные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности, инициирующие транскрипцию и трансляцию, и промоторы, которые можно использовать для регулирования экспресии конкретных нуклеиновых кислот-мишеней. Указанные векторы необязательно включают генетические экспрессионные кассеты, содержащие по меньшей мере одну независимую последовательность терминации, последовательности, обеспечивающие репликацию кассеты в эукариотах или в прокариотах, или в тех и других (включая, без ограничения, шаттл-векторы) и селекционные маркеры как для прокариотных, так и для эукариотных систем. Векторы пригодны для репликации и интеграции в прокариоты, эукариоты или ив те и другие; см., С111ат & 8тйй, Сепе, 8:81 (1979); ЯоЬейк, е! а1., Ыа!иге, 328:731 (1987); 8сйпе1бег, Е., е! а1., Рго!ет Ехрг. РипГ. 6(1): 10-14 (1995); АикиЬеЬ 8атЬгоок, Вегдег (а11 кирга). Каталог бактерий и бактериофагов, которые можно использовать для клонирования, представлен, например, АТСС, например гГг Тйе АТСС Са!а1одие о! Вас!епа апб Вас!епорйаде (1992) Сйета е1 а1. (ебк), опубликованный АТСС. Дополнительные основные процедуры для секвенирования, клонирования и других аспектов молекулярной биологии и основополагающих теоретических рассмотрений также можно найти у Уа!коп е! а1. (1992) ЯесотЫпап! ОЫА 8есопб Ебйюп 8с1епййс Атепсап Воокк, ΝΥ. Кроме того, практически любую нуклеиновую кислоту (и, возможно, любую меченую нуклеиновую кислоту независимо от того, является она стандартной или нестандартной) можно купить или обычным образом заказать в любом из различных коммерческих источников, таких как М1б1апб Сегййеб Яеадеп! Сотрапу (М1б1апб, ТХ, доступном на Уог1б У1бе УеЬ на сайте тсгс.сот), Тйе Сгеа! Атепсап Сепе Сотрапу (Яатопа, СА, доступном на Уог1б У1бе УеЬ а! депсо.сот), ЕхргеккСеп 1пс. (СЫсадо, 1Ь, доступном на Уог1б У1бе УеЬ а! ехргеккдеп.сот), Орегоп Тесйпо1од1ек 1пс. (А1атеба, СА) и многих других.

Селекторные кодоны

Селекторные кодоны настоящего изобретения расширяют границы генетических кодонов белковых биосинтетических методов. Например, селекторные кодоны включают, без ограничения, уникальный трехосновной кодон, бессмысленный кодон, такой как стоп-кодон, включая, без ограничения, янтарный кодон (ИАС), охра-кодон или опал-кодон (ИСА), неприродный кодон, кодон, содержащий четыре или более оснований, редкий кодон или т.п.

Специалистам в данной области совершенно очевидно, что существует широкий круг селекторных кодонов, которые можно встраивать в нужный ген или полинуклеотид, включая, без ограничения, один или более, два или более, три или более, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более в один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере часть полипептида ЬС-С8Е.

В одном варианте указанные способы включают использование селекторного кодона, который представляет собой стоп-кодон для встраивания одной или более из неприродных аминокислот т νί\Ό. Например, получают О-тРНК, который распознает стоп-кодон, включая, без ограничения, ИАС, и аминосинтезируют, используя О-Я8 с необходимой неприродной аминокислотой. Такая О-тРНК не распознается встречающейся в природе аминоацил-тРНК синтетазой хозяина. Обычный сайт-направленный мутагенез можно использовать для встраивания стоп-кодона, включая, без ограничения, ТАС, в представляющий интерес сайт представляющего интерес полипептида; см., например, 8ауегк, 1.Я., е! а1. (1988), 5'-3' Ехопис1еакек ш рйокрйотойоа!е-Ьакеб ойдопис1еойбе бйес!еб ти1адепек1к, ШсШс Аабк Яек., 16:791-802. Если О-Я8, О-тРНК и нуклеиновую кислоту, которая кодирует представляющий интерес полипептид, комбинируют ш νί\Ό, неприродную аминокислоту включают в ответ на ИАС кодон, получая полипептид, содержащий неприродную аминокислоту в специфическом положении.

Такое встраивание неприродных аминокислот т νί\Ό можно осуществить без заметной перестройки эукариотных клеток-хозяев. Например, так как эффективность супрессии для ИАС кодона зависит от конкуренции между О-тРНК, включая, без ограничения, янтарным супрессором тРНК и эукариотным фактором освобождения (включая, без ограничения, еЯР) (который связывается со стоп-кодоном и инициирует освобождение растущего пептида из рибосомы), причем эффективность супрессии можно модулировать, включая, без ограничения, повышение уровня экспрессии О-тРНК и/или супрессорной тРНК.

Неприродные аминокислоты могут также кодироваться редкими кодонами. Например, если концентрация аргинина в ш уйго реакции синтеза белка понижена, редкий кодон аргинина, АСС, как было доказано, эффективен для встраивания А1а синтетической тРНК, ацилированной аланином; см., например, Ма е! а1., Вюсйетййу, 32:7939 (1993). В таком случае синтетическая тРНК конкурирует с неприродной тРНКА-гд, которая существует как минорный вид в ЕксйепсЫа сой. Некоторые организмы не используют все триплетные кодоны. Неопределенный кодон АСА в Мютососсик 1и!еик был использован для встраивания аминокислоты в т νίΙΐΌ транскрипционный/трансляционный экстракт; см., например, Ко\\а1 апб Ойует, Νϋθ1. Ас1б. Яек., 25:4 685 (1997). Компоненты настоящего изобретения могут быть созданы для использования таких редких кодонов т νί\Ό.

Селекторные кодоны также включают расширенные кодоны, включая, без ограничения, кодоны из четырех или более оснований, например кодоны из четырех, пяти, шести или более оснований. Примеры кодонов из четырех оснований включают, без ограничения, АССА, СИАС, ИАСА, СССИ и т.п. Приме

- 37 019968 рами кодонов, которые включают пять оснований, без ограничения, являются АССАС, ССССи, СССиС, СиАСА, СиАСи, иАССС и т.п. Признаки настоящего изобретения включают использование расширенных кодонов, основанных на супрессии со сдвигом рамки. Кодоны, включающие четыре или более оснований, могут встраивать, включая, без ограничения, одну или несколько неприродных аминокислот в один и тот же белок. Например, в присутствии мутированных О-тРНК, включая, без ограничения, специальные супрессорные тРНК со сдвигом рамки, антикодоновыми петлями, например по меньшей мере с 810 антикодоновыми петлями, кодон, содержащий четыре или более оснований, считывается как одна аминокислота. В других вариантах антикодоновые петли можно раскодировать, включая, без ограничения, по меньшей мере, кодон, содержащий четыре основания, по меньшей мере, кодон, содержащий пять оснований, по меньшей мере, кодон, содержащий шесть оснований или больше. Так как существуют 256 возможных кодонов из четырех оснований, множество неприродных аминокислот может быть кодировано в одной и той же клетке, используя кодоны с четырьмя или более основаниями; см., Апбегкоп е! а1., (2002) Ехр1ог1пд !1е Ышйк оГ Собой апб Апйсобоп 8|/е, СНетМгу апб Вю1оду, 9:237-244; Мадйегу (2001) Ехрапбтд Сепейс Собе: 8ее!с!юп оГ ЕГПс1еп1 8ирргеккогк оГ Роиг-Ьаке Собопк апб 1беп!1йса!юп оГ 8Ыйу Роиг-Ьаке Собопк \νί11ι а ЫЬгагу Арргоасй т ЕксйейсШа сой, I. Мо1. Вю1., 307: 755-769.

Например, кодоны, включающие четыре основания, были использованы для встраивания неприродных аминокислот в белки, используя ш уйго методы биосинтеза; см., например, Ма е! а1. (1993) Вюсйет1к!гу, 32:7939 и Нойкака е! а1. (1999) I. Ат. Скет. 8ос., 121:34. СССС и АССи были использованы для одновременного включения 2-нафтилаланина и NΒ^ производного лизина в стрептавидин ш уйго с помощью двух химически ацилированных супрессорных тРНК со сдвигом рамки; см., например, Нойкака е! а1. (1999) I. Ат. Сйет. 8ос., 121:12194. В ш у1уо исследовании Мооге е! а1. исследовали способность тРНК Ьей производных с NСиΑ антикодонами подавлять иΑСN кодоны (Ν могут быть и, А, С или С) и обнаружили, что квадруплет иАСА может быть раскодирован с использованием тРНК Ьей с иСиА антикодоном с эффективностью от 13 до 26% при незначительном декодировании в 0 или -1 рамке; см. Мооге е! а1. (2000) I. Мо1. Вю1., 298: 195. В одном варианте в настоящем изобретении можно использовать расширенные кодоны, основанные на редких кодонах или бессмысленных кодонах, что может снизить бессмысленное считывание и супрессию со сдвигом рамки на внешних нежелательных сайтах.

Для конкретной системы селекторный кодон может также включать один из природных кодонов из трех оснований, где эндогенная система не использует (или редко использует) природный кодон. Например, это включает систему, в которой отсутствует тРНК, которая распознает природный кодон из трех оснований, и/или систему, в которой кодон из трех оснований является редким кодоном.

Селекторные кодоны необязательно включают пары неприродных оснований. Такие пары неприродных оснований далее расширяют существующий генетический алфавит. Одна дополнительная пара оснований увеличивает количество триплетных кодонов с 64 до 125. Характеристики третьих пар оснований включают стабильное и селективное спаривание оснований, эффективное ферментативное встраивание в ДНК с высокой точностью полимеразой и эффективное продолжение расширения праймера после синтеза образующейся неприродной пары оснований. Описания неприродных пар оснований, которые можно адаптировать к способам и композициям, включают, например, перечисленные Нпао, е! а1., (2002) Ап иппа!ига1 Ьаке рай Гог тсотрогайпд ашшо ас1б апа1одиек т!о рго!ет, №11иге Вю!есйпо1оду, 20: 177-182; см. также \¥и, Υ., е! а1. (2002) I. Ат. Сйет. 8ос., 124: 14626-14630. Другие родственные публикации перечислены далее.

Для использования т у1уо неприродный нуклеозид является мембрано-проницаемым и фосфорилирован до образования соответствующего трифосфата. Кроме того, повышенная генетическая информативность стабильна и не нарушается клеточными ферментами. Предыдущие попытки Веппег и остальных извлечь преимущество из схем водородного связывания, которое отличается от схем связывания в канонических парах Уотсона-Крика, наиболее заслуживающим внимание примером которого служит пара, которая представляет собой изо-С:изо-С пару; см., например, δνίΐ/ег е! а1., (1989) I Ат. Сйет. 8ое., 1 11:8322 и РюстШ е! а1. (1990) №!иге, 343:33; Коо1 (2000) Сигг. Οр^η, Сйет. Вю1., 4:602. Указанные основания обычно до некоторой степени ошибочно спариваются с природными основаниями и не могут быть ферментативно реплицированы. Коо1 с сотрудниками продемонстрировали, что гидрофобные взаимодействия упаковки между основаниями могут заменить водородное связывание для управления образованием пар оснований; см. Коо1 (2000) Сигг. Οр^η. Сйет. Вю1., 4:602 и СисШап апб Коо1 (1998) Апде\\\ Сйет. 1п!. Еб. Епд1., 36, 2825. В попытках создать неприродную пару оснований, удовлетворяющую всем вышеперечисленным требованиям, 8с1ш11х, КотекЬетд с сотрудниками систематически синтезировали и исследовали ряд неприродных гидрофобных оснований. Было обнаружено, что Р1С8:Р1С8 (собственная) пара более стабильна, чем природные пары оснований, и может быть эффективно встроена в ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I ЕксйейсЫа сой (КР); см., например, МсМшп е! а1. (1999) Р Ат. Сйет. 8ос., 121:11585-6 и Οдаνа е! а1. (2000) I. Ат. Сйет. 8ос., 122:3274. Можно синтезировать собственную пару 3МN:3МN с помощью КР с эффективностью и селективностью, достаточными для биологических функций; см., например, Οдаνа е! а1. (2000) I. Ат. Сйет. 8ос., 122:8803. Однако оба основания действуют как терминаторы цепи для дальнейшей репликации. Недавно была создана мутантная

- 38 019968

ДНК полимераза, которую можно использовать для репликации собственной пары Р1С8. Кроме того, собственную пару 7ΑΙ можно реплицировать; см., например, Тае с1 а1. (2001) Т Ат. СЬет. 8ос., 123:7439. Также была создана новая пара металлооснований П1рю:Ру, которая образует стабильную пару после связывания с Си(11); см., Меддегк е1 а1. (2000) Т Ат. СЬет. 8ос., 122:10714. Так как расширенные кодоны и неприродные кодоны взаимно ортогональны с природными кодонами, указанные способы настоящего изобретения могут получить преимущество, используя указанное свойство для создания ортогональных тРНК для них.

Трансляционную обходную систему также можно использовать для включения неприродной аминокислоты в целевой полипептид. В трансляционной обходной системе в геном включают большую последовательность, но не транслируют в белок. Указанная последовательность содержит структуру, которая служит ключом к индуцированию перескока рибосомы через последовательность и продолжению трансляции в прямом направлении от вставки.

В некоторых вариантах представляющий интерес белок или полипептид (или их часть) в указанных способах и/или композициях настоящего изобретения кодируются нуклеиновой кислотой. Обычно нуклеиновая кислота включает по меньшей мере один селекторный кодон, по меньшей мере два селекторных кодона, по меньшей мере три селекторных кодона, по меньшей мере четыре селекторных кодона, по меньшей мере пять селекторных кодонов, по меньшей мере шесть селекторных кодонов, по меньшей мере семь селекторных кодонов, по меньшей мере восемь селекторных кодонов, по меньшей мере девять селекторных кодонов, десять или больше селекторных кодонов.

Можно осуществить мутацию генов, кодирующих представляющие интерес белки или полипептиды, используя методы, известные специалистам в данной области и раскрытые здесь, чтобы включить, например, один или более из селекторных кодонов для встраивания неприродной аминокислоты. Например, нуклеиновую кислоту для представляющего интерес белка подвергают мутации для включения одного или более из селекторных кодонов, обеспечивающих встраивание одной или более из неприродных аминокислот. Настоящее изобретение включает любой такой вариант, включая, без ограничения, мутанты, версии любого белка, например, включающего по меньшей мере одну неприродную аминокислоту. Аналогично, настоящее изобретение также включает соответствующие нуклеиновые кислоты, то есть любую нуклеиновую кислоту, содержащую один или более из селекторных кодонов, которые кодируют одну или более из неприродных аминокислот.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие представляющий интерес белок, такой как полипептид ЬС-С8Р, можно легко подвергнуть мутации для введения цистеина в любое необходимое положение полипептида. Цистеин широко используют для введения реакционноспособных молекул, водорастворимых полимеров, белков или широкого круга других молекул в представляющий интерес белок. Методы, пригодные для встраивания цистеина в нужное положение полипептида, хорошо известны специалистам в данной области, такие как те, что раскрыты в патенте США № 6608183, который включен в описание посредством ссылки, и стандартные методики мутагенеза.

IV. Не кодируемые в природе аминокислоты.

Для использования в настоящем изобретении пригоден широкий круг разнообразных не кодируемых в природе аминокислот. В полипептид ЬС-С8Р можно ввести любое количество не кодируемых в природе аминокислот. Обычно введенные не кодируемые в природе аминокислоты являются практически химически инертными в отношении 20 обычных, генетически кодируемых аминокислот (т.е. аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина). В некоторых вариантах не кодируемые в природе аминокислоты включают функциональные группы боковых цепей, которые реагируют эффективно и селективно с функциональными группами, которые не находятся в 20 обычных аминокислотах (включая, без ограничения, азидные, кетонные, альдегидные и аминооксигруппы), с образованием стабильных конъюгатов. Например, полипептид ЬС-С8Р, который включает не кодируемую в природе аминокислоту, содержащую азидную функциональную группу, можно подвергнуть взаимодействию с полимером (включая, без ограничения, поли(этиленгликоль) или, альтернативно, второй полипептид, содержащий алкиновую молекулу, с образованием стабильного конъюгата, полученного для селективной реакции азидной и алкинной функциональных групп с образованием [3+2] продукта циклоприсоединения Хьюсгена.

Общая структура альфа-аминокислоты иллюстрируется следующим образом (формула I):

η₂ν соон

Не кодируемая в природе аминокислота обычно является любой структурой, содержащей вышеуказанную формулу, где К группа представляет собой любой заместитель, отличающийся от одного, использованного в двадцати природных аминокислотах, и может оказаться подходящим для использования в настоящем изобретении. Так как не кодируемые в природе аминокислоты настоящего изобретения

- 39 019968 обычно отличаются от природных аминокислот только строением боковой цепи, не кодируемые в природе аминокислоты образуют амидные связи с другими аминокислотами, включая, без ограничения, природные или не кодируемые в природе аминокислоты, таким же образом как они образуют встречающиеся в природе полипептиды. Однако не кодируемые в природе аминокислоты содержат группы боковых цепей, которые отличают их от природных аминокислот. Например, Я необязательно включает алкил-, арил-, ацин-, кето-, азидо-, гидроксил-, гидразин, циано-, галоген-, гидразид, алкенил, алкинил, простой эфир, тиол, селено-, сульфонил-, борат, боронат, фосфо, фосфоно, фосфин, гетероцикл, енон, имин, альдегид, сложный эфир, тиокислоту, гидроксиламин, аминогруппу или т.п. либо любую их комбинацию. Другие представляющие интерес неприродные аминокислоты, которые могут быть полезны для использования в настоящем изобретении, включают, без ограничения, аминокислоты, включающие фотоактивируемый кросс-линкерный агент, спин-меченые аминокислоты, флуоресцентные аминокислоты, связывающие металл аминокислоты, металлсодержащие аминокислоты, радиоактивные аминокислоты, аминокислоты с новыми функциональными группами, аминокислоты, которые ковалентно или нековалентно взаимодействуют с другими молекулами, фотосостариваемые и/или фотоизомеризуемые аминокислоты, аминокислоты, включающие биотин или аналог биотина, гликозилированные аминокислоты, такие как сахаром замещенный серин, другие модифицированные углеводами аминокислоты, кетосодержащие аминокислоты, аминокислоты, включающие полиэтиленгликоль или полиэфир, аминокислоты, замещенные тяжелыми атомами, химически расщепляемые и/или фоторасщепляемые аминокислоты, аминокислоты с удлиненными боковыми цепями по сравнению с природными аминокислотами, включая, без ограничения, полиэфиры или углеводороды с длинной цепью, включающие более чем около 5 или более чем около 10 атомов углерода, связанные с углеродом сахарсодержащие аминокислоты, окислительно-восстановительно активные аминокислоты, аминокислоты, содержащие аминотиокислоту, и аминокислоты, включающие одну или более токсических молекул.

Примеры не кодируемых в природе аминокислот, которые могут пригодиться для использования в настоящем изобретении, и тех, которые можно использовать для реакций с водорастворимыми полимерами, включают, без ограничения, аминокислоты с карбонильной, аминоокси, гидразиновой, гидразидной, семикарбазидной, азидной и алкинной реакционноспособными группами. В некоторых вариантах не кодируемые в природе аминокислоты включают сахаридную молекулу. Примеры таких аминокислот включают Ν-ацетил-Ь-глюкозаминил-Ь-серин, Ν-ацетил-Ь-галактозаминил-Ь-серин, Ν-ацетил-Ьглюкозаминил-Ь-треонин, Ν-ацетил-Ь-глюкозаминил-Ь-аспарагин и О-маннозаминил-Ь-серин. Примеры таких аминокислот также включают примеры аминокислот, в которых встречающуюся в природе Ν- или О-связь между аминокислотой и сахаридом заменяют на ковалентную связь, которая обычно не встречается в природе, включая, без ограничения, алкен, оксим, тиоэфир, амид и т.п. Примеры таких аминокислот также включают сахариды, которые обычно не встречаются в природных белках, такие как 2-деоксиглюкоза, 2-деоксигалактоза и т.п.

Многие из представленных здесь не кодируемых в природе аминокислот являются коммерчески доступными, например, от 8|дта-А1бпс11 (8Ч. Ьошз, МО, И8А), ШмаЬюсйет (отделение ΕΜΌ ВюзсЧепсез, БагтзЧабЧ, Сегтапу) или от РерЧесй (ВигйпдЧоп, ΜΑ, И8А). Те аминокислоты, которые коммерчески недоступны, можно необязательно синтезировать, как здесь раскрыто, или используя стандартные способы, хорошо известные специалистам в данной области. Для методов органического синтеза см., например, Огдашс СйетЧзЧгу Ьу Ееззепбоп апб Ееззепбоп, (1982, 8есопб ЕбЧЧюп, ^Шагб СгапЧ Ргезз, ВозЧоп Мазз.); Абуапсеб Огдашс СйетЧзЧгу Ьу Магсй (ТЫгб ЕбЧЧюп, 1985, \УПеу и 8опз, №\ν Уогк) и Абуапсеб Огдашс СйетЧзЧгу Ьу Сагеу и 8ипбЬегд (ТЫгб ЕбЧЧюп, Райз А и В, 1990, Р1епит Ргезз, №\ν Уогк); см. также патенты США №№ 7045337 и 7083970, которые включены в описание посредством ссылки. В дополнении к неприродным аминокислотам, которые содержат новые боковые цепи, неприродные аминокислоты, которые могут быть пригодны для использования в настоящем изобретении, также необязательно включают модифицированные структуры основных цепей, включая, без ограничения, те, что проиллюстрированы структурными формулами II и III

П

Я

X

III

Н₂и СогН где Ζ обычно включает ОН, ΝΉ₂, 8Н, ΝΉ-Я' или 8-Я'; X и Υ, которые могут быть одинаковы или различны, обычно включают 8 или О; Я и Я', которые необязательно одинаковы или различны, обычно выбирают из того же списка составляющих, что и для Я группы, раскрытых выше для неприродных аминокислот формулы I, а также из водорода. Например, неприродные аминокислоты настоящего изобретения необязательно включают замещения в аминогруппе или в карбоксильной группе, что проиллюстри

- 40 019968 ровано формулами II и III. Неприродные аминокислоты такого типа включают, без ограничения, αгидроксикислоты, α-тиокислоты, α-аминтиокарбоксилаты, включая, без ограничения, аминокислоты с боковыми цепями, соответствующими цепями в обычных двадцати природных аминокислотах или с неприродными боковыми цепями. Кроме того, замещения у α-углерода необязательно включают, без ограничения, Ь, Б или α-α-дизамещенные аминокислоты, такие как Б-глутамат, Б-аланин, Б-метил-Отирозин, аминомасляную кислоту и т.п. Другие структурные альтернативы включают циклические аминокислоты, такие как аналоги пролина, также как 3, 4, 6, 7, 8 и 9-членные кольцевые аналоги пролина, β и γ аминокислоты, такие как замещенные β-аланин и γ-аминомасляная кислота.

Многие неприродные аминокислоты основаны на природных аминокислотах, таких как тирозин, глутамин, фенилаланин и т.п., и они пригодны для использования в настоящем изобретении. Аналоги тирозина включают, без ограничения, пара-замещенные тирозины, орто-замещенные тирозины и метазамещенные тирозины, где замещенный тирозин включает, включая, без ограничения, кетогруппу (включая, без ограничения, ацильную группу), группу бензоила, аминогруппу, гидразин, гидроксиамин, группу тиола, карбоксигруппу, изопропильную группу, метильную группу, С₆-С₂₀ неразветвленную цепь или разветвленный углеводород, насыщенный или ненасыщенный углеводород, О-метильную группу, полиэфирную группу, нитрогруппу, алкинильную группу или т.п. Кроме того, также рассматриваются многократно замещенные арильные кольца. Аналоги глутамина, которые могут быть полезными для использования в настоящем изобретении, включают, без ограничения, α-гидроксипроизводные, γзамещенные производные, циклические производные и амидзамещенные производные глутамина. Примеры аналогов фенилаланина, которые могут быть полезными для использования в настоящем изобретении включают, без ограничения, паразамещенные фенилаланины, ортозамещенные фенилаланины и метазамещенные фенилаланины, где заместители включают, включая, без ограничения, гидроксигруппу, метоксигруппу, метильную группу, аллильную группу, альдегидную, азидную, йодо-, бромо-, кетогруппу (включая, без ограничения, ацетильную группу), бензоил, алкинильную группу или т.п. Конкретные примеры неприродных аминокислот, которые могут быть полезны для использования в настоящем изобретении, включают, без ограничения, п-ацил-Ь-фенилаланин, О-метил-Ь-тирозин, Ь-3-(2нафтил)аланин, 3-метилфенилаланин, 0-4-аллил-Ь-тирозин, 4-пропил-Ь-тирозин, три-О-акцил-С1сNАβсерин, Ь-Бора, фторированный фенилаланин, изопропил-Ь-фенилаланин, п-Ь-фенилаланин, п-ацил-Ьфенилаланин, п-бензоил-Ь-фенилаланин, Ь-фосфосерин, фосфоносерин, фосфонотирозин, пйодофенилаланин, п-бромфенилаланин, п-амино-Ь-фенилаланин, изопропил-Ь-фенилаланин и ппропаргилоксифенилаланин и т.п. Примеры структур различных неприродных аминокислот, которые могут быть полезны для использования в настоящем изобретении, представлены, например, в №0 2002/085923, озаглавленном 'Чп νίνο тсогрога!юп о£ иппа!ига1 атто ас1бк; см. также Кпск е! а1. (2002) Ыдгрогабоп о£ а/|бек т гесотЬтап! рго!ешк £ог сйетоке1ес1|уе тоб1йса!юп Ьу !йе §!аибтдег Нда!юп, ΓΝΆ^, 99:19-24, которые включены в описание посредством ссылки для дополнительных аналогов метионина. В международной заявке № РСТ/И806/47822, озаглавленной Сотрокйюпк Соп1а1шпд, Ме!1обк ^оМпд, апб Икек о£ №п-па1ига1 Ртто Ас1бк апб Ро1урерббек, которые включены в описание посредством ссылки, раскрыто восстановительное алкилирование ароматических аминомолекул, включая, без ограничения, п-аминофенилаланин, и восстановительное аминирование.

В одном варианте предложены композиции полипептида ЬС-С8Р, включающего неприродную аминокислоту (такие как п-(пропаргилокси)фенилаланин). Предложены также различные композиции, включающие п-(пропаргилокси)фенилаланин и, включая, без ограничения, белки и/или клетки. В одном аспекте композиция, которая включает п-(пропаргилокси)фенилаланин, неприродную аминокислоту, кроме того, включает ортогональную тРНК. Неприродная аминокислота может быть связана (включая, без ограничения, ковалентно) с ортогональной тРНК, включающей, без ограничения, ковалентную связь с ортогональной тРНК через амино-ацильную связь, ковалентно связанную с 3' ОН или 2' ОН концом рибозного сахара ортогональной тРНК и т.д.

Химические молекулы через неприродные аминокислоты, которые могут быть включены в белки, предлагают разнообразные преимущества манипуляций с белками. Например, уникальная реакционная способность кетофункциональной группы позволяет селективно модифицировать белки любым количеством гидразин- или гидроксиламинсодержащих реагентов ш νί!το и ш νίνο. Содержащие тяжелые металлы неприродные аминокислоты, например, могут быть такими, которые можно использовать для фазирования результатов структурного рентгеновского анализа. Сайт-специфическое встраивание тяжелых металлов с помощью неприродных аминокислот также обеспечивает селективность и гибкость в выборе положения для тяжелых атомов. Фотореакционноспособные неприродные аминокислоты (включая, без ограничения, аминокислоты с бензофеноном и арилазидами (включая, без ограничения, фенилазид) в боковых цепях), например, позволяют эффективно ш νίνο и ш νίίτο осуществлять фотосшивание белков. Примеры фотореакционноспособных неприродных аминокислот включают, без ограничения, пазидофенилаланин и п-бензоилфенилаланин. Белок с фотореакционноспособными неприродными аминокислотами можно затем сшить при желании за счет возбуждения фотореакционноспособной группы, обеспечивающей температурный контроль. В одном примере метильная группа неприродной аминокис

- 41 019968 лоты может быть замещена изотопно меченной группой, включая, без ограничения, метильную группу в качестве зонда локальной структуры и динамики, включая, без ограничения, исследования с использованием ядерного магнитного резонанса и колебательной спектроскопии. Алкинильные или азидные функциональные группы, например, позволяют осуществить селективную модификацию белков молекулами в результате реакции [3+2] циклоприсоединения.

Неприродные аминокислоты, включенные в полипептид, у аминоконца могут состоять из К группы, которая представляет собой любой заместитель, отличающийся от заместителя, используемого в двадцати природных аминокислотах и второй реакционноспособной группе, отличающейся от №Н₂ группы, которая обычно присутствует в α-аминокислотах (см. формулу I). Аналогичные неприродные аминокислоты могут быть включены на карбоксильном конце за счет второй реакционноспособной группы, отличающейся от СООН группы, которая обычно присутствует в α-аминокислотах (см. формулу I).

Неприродные аминокислоты настоящего изобретения можно выбрать или сконструировать для придания им дополнительных характеристик, не существующих у двадцати природных аминокислот. Например, неприродную аминокислоту можно необязательно сконструировать или выбрать таким образом, чтобы модифицировать биологические характеристики белка, например белка, в который они включены. Например, следующие характеристики можно необязательно модифицировать путем включения в белок неприродной аминокислоты: токсичность, биораспределение, растворимость, стабильность, например термическую, гидролитическую, оксидативную устойчивость в отношении ферментативного разложения и т.п., простоту выделения и процессинга, структурные характеристики, спектроскопические характеристики, химические и/или фотохимические свойства, каталитическую активность, окислительно-восстановительный потенциал, время полужизни, способность реагировать с другими молекулами, например ковалентно или нековалентно, и т.п.

Структура и синтез неприродных аминокислот: карбонильные, карбонилоподобные, маскированные карбонильные, защищенные карбонильные группы и гидроксиламинные группы

В некоторых вариантах настоящего изобретения предложены ЬС-С8Р, связанные с водорастворимым полимером, например ПЭГ, оксимной связью.

Многие типы не кодируемых в природе аминокислот можно использовать для создания оксимных связей. Такие связи включают, без ограничения, не кодируемые в природе аминокислоты, содержащие карбонильную, дикарбонильную или гидроксиламиннную группу. Такие аминокислоты раскрыты в патентных публикациях США №№ 2006/0194256, 2006/0217532, 2006/0217289 и \\'0 2006/069246, озаглавленной ί,οιηροδίΐίοηδ соп1а1п1пд, тс11юб5 ίηνίΐνίη^, апб И5С5 о£ поп-па1ига1 атто асИ§ апб роКрсрибсХ, которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте. Не кодируемые в природе аминокислоты также раскрыты в патенте США № 7083970 и в патенте США № 7045337, которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах настоящего изобретения используют полипептиды ЬС-С8Г, которые замещены в одном или более из положений пара-ацетилфенилаланиновой аминокислоты. Синтез п-ацетил(+/-)-фенилаланина и м-ацетил-(+/-)-фенилаланина раскрыт у Ζйаηд, Ζ., с1 а1., Вюсйетщру, 42: 6735-6746 (2003), что включено в описание посредством ссылки. Другие карбонил- или дикарбонилсодержащие аминокислоты специалисты могут получить аналогичным способом. Кроме того, нелимитирующие примеры синтеза неприродных аминокислот, которые включены сюда, представлены на фиг. 4, 24-34 и 36-39 патента США № 7083970, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Аминокислоты с электрофильной реакционноспособной группой позволяют осуществлять разнообразные реакции для связывания молекул, используя, наряду с другими, реакции нуклеофильного присоединения. Такие электрофильные реакционноспособные группы включают карбонильную группу (включая кетогруппу и дикарбонильную группу), карбонило-подобную группу (которая обладает реакционной способностью, аналогичной реакционной способности карбонильной группы (включая кетогруппу и карбонильную группу) и структурно аналогична карбонильной группе), маскированную карбонильную группу (которую можно легко превратить в карбонильную группу (включая кетогруппу и дикарбонильную группу)) или защищенную карбонильную группу (которая обладает реакционной способностью, аналогичной способности карбонильной группы (включая кетогруппу и дикарбонильную группу) после удаления защитной группы). Такие аминокислоты включают аминокислоты структурной формулы (IV)

(IV), где А необязателен и, если присутствует, представляет собой низший алкилен, замещенный низший алкилен, низший циклоалкилен, замещенный низший циклоалкилен, низший алкенилен, замещенный низший алкенилен, алкинилен, низший гетероалкилен, замещенный гетероалкилен, низший гетероциклоалкилен, замещенный низший гетероциклоалкилен, арилен, замещенный арилен, арилен, замещенный арилен, алкарилен, замещенный алкарилен, аралкилен или замещенный аралкилен;

- 42 019968

В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -0-, -0-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(0)_к-, где к принимает значения 1, 2 или 3, -8(О)_к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С (О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -УВ')-, -ЫВ'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(0)УК')-, -СОN(В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -САУН')-, -С8УВ')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -УВ')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(В')С(О)0-, -8(О)_кЫ(В')-,

-^В'^ОМВ')-, ^В^С^ЖВ')-, -^)8(0)^^)-, ^(В')-^, -С(В')=У, С^^У^В')-, -С^'^-У, -ЦВ'Ц-УУ и -ЦВ'Ц-^В'Ц^В')-, где каждый В' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

представляет собой

В представляет собой Н, алкил, замещенный алкил или замещенный циклоалкил;

каждый В независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил или защитную группу или, если присутствует более чем одна В группа, два В необязательно образуют гетероциклоалкил;

В1 необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

В2 необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

каждый из В₃ и В₄ независимо представляет собой Н, галоген, низший алкил или замещенный низший алкил; или

В₃ и В₄ или две В₃ группы необязательно образуют циклоалкил или гетероциклоалкил; или

-А-В-1-В группы вместе образуют бициклический или трициклический циклоалкил или гетероциклоалкил, включающий по меньшей мере одну карбонильную группу, включая дикарбонильную группу, защищенную карбонильную группу, включая защищенную дикарбонильную группу или маскированную карбонильную группу, включая маскированную дикарбонильную группу; или

-1-В группы вместе образуют моноциклический или бициклический циклоалкил или гетероциклоалкил, включающий по меньшей мере одну карбонильную группу, включая дикарбонильную группу, защищенную карбонильную группу, включая защищенную дикарбонильную группу, или маскированную карбонильную группу, включая маскированную дикарбонильную группу, при условии, что, если А представляет собой фенилен и каждый В3 представляет собой Н, В присутствует; и что, если А представляет собой -(СН₂)₄- и каждый В₃ представляет собой Н, В не может быть -ЫНС(0)(СН₂СН₂)-; и что, если А и В отсутствуют и каждый В₃ представляет собой Н, В не может представлять собой метил.

Кроме того, соединения, имеющие структурные формулы (V), включают

где А необязателен и, если присутствует, представляет собой низший алкилен, замещенный низший алкилен, низший циклоалкилен, замещенный низший циклоалкилен, низший алкенилен, замещенный низший алкенилен, алкинилен, низший гетероалкилен, замещенный гетероалкилен, низший гетероциклоалкилен, замещенный низший гетероциклоалкилен, арилен, замещенный арилен, арилен, замещенный арилен, алкарилен, замещенный алкарилен, аралкилен или замещенный аралкилен;

В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -0-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(0)_к - где к принимает значения 1, 2 или 3, -8(О)к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Н(В')-, -NВ'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)№В')-, -СОN(В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -САУЯ')-, -С’8УВ')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -УВ')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(В')С(О)0-, -8(О)_кЫ(В')-, -^В'^ОМВ')-, ^В^С^ЖВ')-, -^)8(0)^^)-, ^(В')-^, -С(В')=У, С^^У^В')-, -С^'^-У, -С (В')₂-УУ и -0(^)2^(^)-^^)-, где каждый В' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

В₁ необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

- 43 019968

В₂ необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид, при условии, что, если А представляет собой фенилен, В присутствует; и что, если А представляет собой -(СН₂)₄-, В не может быть -МНС(О)(СН₂СН₂)-; и что, если А и В отсутствуют, В не может представлять собой метил.

Кроме того, включены аминокислоты, имеющие структурную формулу (У1)

где В представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -О-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(О)_к- где к представляет собой 1, 2 или 3, -8(О)_к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -^В')-, -МВ'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)^В')-, -СО^В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С8МК.')-. -С8^В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, ^(В')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, ^В')С(О)О-, -8(О)]МВ')-, -^В')С(ОМВ')-, -ВДВДЭДВ¹)-, -^В')8(О)]МВ')-, ^(В')^=, -С(В')=Ж -С(В')=^^В')-, С(В')=^^, -€(Κ^,)₂-Ν=Ν- и -С(В')Ж(В'ЖВ')-, где каждый В' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

В представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный циклоалкил;

В₂ необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

каждый В, независимо выбирают из группы, состоящей из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, -^В')₂, -С(О)_кВ', где к принимает значения 1, 2 или 3, -С(О)^В')₂, -ОВ' и -8(О)_кВ', где каждый В' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил.

Кроме того, включены следующие аминокислоты:

где такие соединения необязательно защищены по аминогруппе, по карбоксильной группе или их соли. Кроме того, любые из следующих неприродных аминокислот могут быть включены в полипептид с неприродными аминокислотами.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (VII):

где В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -О-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(О)_к-, где к принимает значения 1, 2 или 3, -8(О)_к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -^В')-, -МВ'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)^В')-, -СО^В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С8^В')-, -С8^В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, ^(В')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -^В')С(О)О-, -8(О)Щ(В'),

-^В')С(ОМВ')-, ^В')С(8ЖВ')-, -^В')8(ОЖВ')-, -Ν(Κ^,)-Ν=, -С(В')=Ж С(В')=^^В')-, -ΟΚ'=Ν-Ν=, -С (В')₂^=№ и -С(В')₂-^В')-^В')-, где каждый В' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

- 44 019968 каждый Я_а независимо выбирают из группы, состоящей из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, -Ы(Я')₂, -С(0)_кЯ', где к принимает значения 1, 2 или 3, -С(0^(Я')₂, -0Я' и -8(0)_кЯ', где каждый Я' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил; и п принимает значения от 0 до 8, при условии, что если А представляет собой -(СН₂)₄-, В не может быть -ХНС(0)(СН₂СН₂)-.

где такие соединения необязательно защищены по аминогруппе, необязательно по карбоксильной группе, или их соли. Кроме того, указанные аминокислоты и любые из следующих неприродных аминокислот могут быть включены в полипептид с неприродными аминокислотами.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (VIII):

В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -0-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(0)_к-, где к представляет собой 1, 2 или 3, -8(О)к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')-, -ЫЯ'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(0^(Я')-, -С0^Я')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С8^Я')-, -С8^Я')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')С(О)0-, -8(О)_кИ(Я')-, -Ы(Я')С(О)^Я')-, ^Я')С(8МЯ')-, -^)8(0)^(^)-, -Ы(Я')'^= -С(Я')=№, С(Я')=№^Я')-, -С(Я'^-Ы=, -С(Я')₂-Ы=№ и -С(Я')₂-Ы(Я')-Ы(Я')-, где каждый Я' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

Я| необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Я2 необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (IX):

к»

О (IX), где В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низ шего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -0-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(0)_к-, где к представляет собой 1, 2 или 3, -8(О)к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, С(8)-,

-С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')-, -ЫЯ'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(0^(Я')-, -С0^Я')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С8^Я')-, -С8^Я')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')С(О)0-, -8(О)_кИ(Я')-,

- 45 019968

-Ы(Я')С(О)^Я')-, адОДЫДО-, -^ЭДда-, -Ν(Κ')-Ν=, -ϋ(Κ^,)=Ν-, С(Я')=№^Я')-, -ϋ(Κ^,)=Ν-Ν=, -Ο(Κ')2-Ν=Ν- и -С(Я')₂-Ы(Я')-Ы(Я')-, где каждый Я' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

Я представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный циклоалкил;

Я! необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Я₂ необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

где каждый Я_а независимо выбирают из группы, состоящей из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, -Ы(Я')₂, -С(О)|.Я', где к принимает значения 1, 2 или 3, -С(О)^Я')₂, -ОЯ' и -8(О)_кЯ', где каждый Я' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил.

где такие соединения необязательно защищены по аминогруппе, необязательно защищены по карбоксильной группе, необязательно защищены по аминогруппе и карбоксильной группе, или их соли. Кроме того, указанные неприродные аминокислоты и любые из следующих неприродных аминокислот могут быть включены в полипептид с неприродными аминокислотами.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурные формулы (X):

о-^\

где В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -О-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(О)_к- где к принимает значения 1, 2 или 3, -8(О)_к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С (О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')-, -ХЯ'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)^Я')-, -СО^Я')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -ί.’8Ν(Κ.')-, -С8^Я')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(Я')С(О)О-, -8(О)_кИ(Я')-,

-Ы(Я')С(О)^Я')-, ЫСВДЭДЯ¹)-, ^(Я')8(О)]МЯ')-, -Ν(Κ>Ν=, -С(Я')=№, -С(Я')=№^Я')-, -^')=Ν-Ν=, -С(Я')₂-Ы=№ и -С(Я')₂-Ы(Я')-Ы(Я')-, где каждый Я' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

Я1 необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

каждый Я_а независимо выбирают из группы, состоящей из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, -Ы(Я')₂, -С(О)_кЯ', где к принимает значения 1, 2 или 3, -С(О)^Я')₂, -ОЯ' и -8(О)_кЯ', где каждый Я' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил и п принимает значения от 0 до 8.

Кроме монокарбонильных структур, раскрытые здесь неприродные аминокислоты могут включать такие группы, как дикарбонильная, дикарбонило-подобная, маскированная дикарбонильная и защищен

- 46 019968 ная дикарбонильная группы.

Например, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (XI):

о (XI), где А необязателен и, если присутствует, представляет собой низший алкилен, замещенный низший алкилен, низший циклоалкилен, замещенный низший циклоалкилен, низший алкенилен, замещенный низший алкенилен, алкинилен, низший гетероалкилен, замещенный гетероалкилен, низший гетероциклоалкилен, замещенный низший гетероциклоалкилен, арилен, замещенный арилен, арилен, замещенный арилен, алкарилен, замещенный алкарилен, аралкилен или замещенный аралкилен;

В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -Ο-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(Ο)|._:-, где к принимает значения 1, 2 или 3, -8(О)_к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(В')-, -ЫВ'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С^^В')-, -СΟN(В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -ί.’8Ν(Κ.')-, -С8^В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(В')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ν^Ύ^Ο-, -8(О)_кИ(В')-, -Ы(В')С(О)^В')-, ^В')С(8МВ') -, -Ν(Β')-Ν=, -ϋ(Κ')=Ν-, С(В'Ж^(В')-, -ϋ(Κ')=Ν-Ν=,

-0(Κ')2-Ν=Ν- и -С(В')₂-Ы(В')-Ы(В')-, где каждый В' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (XII):

о (XII), где В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -Ο-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(Ο)_|-, где к принимает значения 1, 2 или 3, -8 (О)_к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, Ν(Κ.')-, -ИК'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ο(Ο)Ν(Κ')-, -^^В^^иплен или замещенный алкилен)-, -ί.’8Ν(Κ.')-, -С8^В')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(В')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ν^Ύ^Ο-, -8(О)_кИ(В')-, ^В^С^МВ')-, -Ы(В')С(8)^В')-, -^В'^^ЖВ')-, -Ν(Β')-Ν=, -€(Β')=Ν-, -С(В'Ж^(В')-, -ϋ(Κ')=Ν-Ν=, -0(Κ')2-Ν=Ν- и -С(В')₂-Ы(В')-Ы(В')-, где каждый В' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

где каждый В_а независимо выбирают из группы, состоящей из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, -Ν(Κ')₂, -Ο(Ο)_ιΚ', где к принимает значения 1, 2 или 3, -Ο(Ο)Ν(Κ')2, -ΟΚ' и -8(9)^, где каждый В' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил.

- 47 019968

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (XIII):

где В необязателен и, если присутствует, представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из низшего алкилена, замещенного низшего алкилена, низшего алкенилена, замещенного низшего алкенилена, низшего гетероалкилена, замещенного низшего гетероалкилена, -Ο-, -О-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8-, -8-(алкилен или замещенный алкилен)-, -8(Ο)|.-, где к принимает значения 1, 2 или 3, -8 (О)_к(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(О)-, -С(О)-(алкилен или замещенный алкилен)-, -С(8)-, -С(8)-(алкилен или замещенный алкилен)-, Ν(Κ')-, -ХК'-(алкилен или замещенный алкилен)-, -ί’(Ο)Ν(Κ')-, -СΟN(К')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -ί’8Ν(Κ.')-, -С8N(К')-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(К')СО-(алкилен или замещенный алкилен)-, -Ы(К')С(О)О-, -8(О)_кЫ(К')-,

Ν^Ο)^¹)-, -Х(К')С(8)Х(К')-, -Ν (^ЭДде)-, -Ν(Κ')-Ν=, -С(К')=Ы-, -С(К')=Х-Х(К')-, -Ο(Κ^,)=Ν-Ν=, -0(Κ')2-Ν=Ν- и -0(Κ')2-Ν(Κ')-Ν(Κ')-, где каждый К' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил;

К представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный циклоалкил;

К1 необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, ами нокислоту, полипептид или полинуклеотид;

К2 необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

где каждый К_а независимо выбирают из группы, состоящей из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, -Ν(Κ')₂, -С^ХК', где к принимает значения 1, 2 или 3, -^Ο)Ν(Κ')₂, -ΟΚ' и - 8(ΟχΚ', где каждый К' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (XIV):

- 48 019968

Βι необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Х₁ представляет собой С, δ₁ или δ(Ό);

Ь представляет собой алкилен, замещенный алкилен, N(Β')(алкилен) или ^В')(замещенный алкилен), где В' представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный циклоалкил.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (ΧΙΥ-А):

В₁ необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, ами нокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (ΧΙΥ-В):

В1 необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, ами нокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (XV):

О о

В2 необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид; Х₁ представляет собой С, δ или δ(Ό);

- 49 019968 п принимает значения 0, 1, 2, 3, 4 или 5;

каждый В⁸ и В⁹ в каждой СВ⁸В⁹ группе независимо выбирают из группы, состоящей из Н, алкокси, алкиламина, галогена, алкила, арила, или любые В⁸ и В⁹ могут вместе образовать =0 или циклоалкил либо любые соседние В группы, взятые вместе, могут образовать циклоалкил.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (ХУ-А):

В! необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, ами нокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Х₁ представляет собой С, 8 или 8(0);

п принимает значения 0, 1, 2, 3, 4 или 5;

каждый В⁸ и В⁹ в каждой СВ⁸В⁹ группе независимо выбирают из группы, состоящей из Н, алкокси, алкиламина, галогена, алкила, арила, или любые В⁸ и В⁹ могут вместе образовать =Ο или циклоалкил либо любые соседние В группы, взятые вместе, могут образовать циклоалкил.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (ХУ-В):

Х₁ представляет собой С, 8 или 8(О);

п принимает значения 0, 1, 2, 3, 4 или 5;

каждый В⁸ и В⁹ в каждой СВ⁸В⁹ группе независимо выбирают из группы, состоящей из Н, алкокси, алкиламина, галогена, алкила, арила, или любые В⁸ и В⁹ могут вместе образовать =О или циклоалкил либо любые соседние В группы, взятые вместе, могут образовать циклоалкил.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (XVI):

о о

В₂ необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу,

- 50 019968 смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Х₁ представляет собой С, 8 или 8(О);

Ь представляет собой алкилен, замещенный алкилен, N(Я')(алкилен) или ^Я')(замещенный алкилен), где Я' представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный циклоалкил.

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (ХМ-А):

Я₁ необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Кроме того, включены следующие аминокислоты, имеющие структурную формулу (ХУ!-В):

Я₁ необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, ами нокислоту, полипептид или полинуклеотид;

Кроме того, включены аминокислоты, имеющие структуру формулы (XVII)

Из

О (XVII), где А необязателен и, если присутствует, представляет собой низший алкилен, замещенный низший алкилен, низший циклоалкилен, замещенный низший циклоалкилен, низший алкенилен, замещенный низший алкенилен, алкинилен, низший гетероалкилен, замещенный гетероалкилен, низший гетероциклоалкилен, замещенный низший гетероциклоалкилен, арилен, замещенный арилен, арилен, замещенный арилен, алкарилен, замещенный алкарилен, аралкилен или замещенный аралкилен

где (а) указывает на связывание с группой А и (Ь) указывает на связывание с соответствующими карбонильными группами, Я₃ и Я₄ независимо выбирают из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, циклоалкила или замещенного циклоалкила или Я₃ и Я₄ либо две Я₃ группы или две Я₄ группы необязательно образуют циклоалкил или гетероциклоалкил;

- 51 019968

К представляет собой Н, галоген, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный циклоалкил;

Т₃ представляет собой связь, С(К)(К), О или 8;

К₁ необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

К₂ необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид.

Кроме того, включены аминокислоты, имеющие структурную формулу (XVIII)

где

М представляет собой -С(Кз)-, <Л)

(Ь)	«1 / < —С—‘ 1 ·	(Ь) (« 8-	-с-1 (Ь)
	1 (а)	ипи	(δ)

где (а) указывает на связывание с группой А и (Ь) указывает на связывание с соответствующими карбонильными группами, К₃ и К₄ независимо выбирают из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, циклоалкила или замещенного циклоалкила или К3 и К4 либо две К3 группы или две К4 группы необязательно образуют циклоалкил или гетероциклоалкил;

К представляет собой Н, галоген, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный циклоал кил;

Т3 представляет собой связь, С(К)(К), О или 8;

К₁ необязателен и, если присутствует, представляет собой Н, аминозащитную группу, смолу, ами нокислоту, полипептид или полинуклеотид;

К₂ необязателен и, если присутствует, представляет собой ОН, сложноэфирную защитную группу, смолу, аминокислоту, полипептид или полинуклеотид;

каждый К_а независимо выбирают из группы, состоящей из Н, галогена, алкила, замещенного алкила, -Ы(К')₂, -С(0)_кК', где к представляет собой 1, 2 или 3, -С(0)фК')₂, -0К' и -8(0)_кК', где каждый К' независимо представляет собой Н, алкил или замещенный алкил.

Кроме того, включены аминокислоты, имеющие структурную формулу (XIX)

где К представляет собой Н, галоген, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный цик лоалкил и

Т3 представляет собой О или 8.

Кроме того, включены аминокислоты, имеющие структурную формулу (XX)

где К представляет собой Н, галоген, алкил, замещенный алкил, циклоалкил или замещенный цик лоалкил.

- 52 019968

Кроме того, включены аминокислоты, имеющие структурные формулы (XXI)

В некоторых вариантах полипептид, включающий неприродную аминокислоту, химически модифицирован для создания реакционноспособной карбонильной или дикарбонильной функциональной группы. Например, альдегидную функциональность, которую можно использовать для реакций конъюгирования, можно создать из функциональности, в которой имеются соседние амино и гидроксильные группы. Если биологически активная молекула представляет собой полипептид, например Νтерминальный серин или треонин (которые могут нормально присутствовать или могут быть экспонированы в результате химического или ферментативного расщепления), ее можно использовать для создания альдегидной функциональности в условиях мягкого оксидативного расщепления, используя перйодат; см., например, Саейпет е! а1., Вюсопщд. Сйет., 3: 262-268 (1992); Сеодйедап, К. & δΙίΌΐτ I., Вюсопщд. Сйет., 3:138-146 (1992); Саейпет е! а1., I. Вю1. Сйет., 269:7224-7230 (1994). Однако методы, известные специалистам, ограничены аминокислотой на Ν-конце пептида или белка.

В настоящем изобретении неприродную аминокислоту, содержащую соседние гидроксильную и аминогруппы можно включить в полипептид как маскированную альдегидную функциональность. Например, 5-гидроксилизин содержит гидроксильную группу, соседнюю с эпсилон амином. Условия реакции для создания альдегида обычно включают добавление молярного избытка метапериодата натрия в мягких условиях чтобы избежать окисления по другим сайтам. Величина рН в реакции окисления обычно составляет около 7,0. Типичная реакция включает добавление около 1,5 мол. избытка метапериодата натрия к забуференному раствору полипептида с последующим инкубированием в течение около 10 мин в темноте; см., например, патент США № 6423685.

Карбонильную или дикарбонильную функциональности можно подвергнуть взаимодействию селективно с гидроксиламинсодержащим реагентом в мягких условиях в водном растворе до образования соответствующей оксимной связи, в физиологических условиях; см., например, 1епскк, νΤ., ί. Ат. Сйет. 8ос., 81, 475-481 (1959); 8Ьао, Р и Тагп, РР., Ь Ат. Сйет. 8ос., 117:3893-3899 (1995). Кроме того, уникальная реакционная способность карбонильной или дикарбонильной групп позволяет осуществлять селективную модифицикацию в присутствии боковых цепей других аминокислот; см., например, Сотшкй, ν.ν., е! а1., I. Ат. Сйет. 8ос., 118:8150-8151 (1996); Сеодйедап, К.Р. & δΙίΌΐτ !С., Вюсопщд. Сйет., 3:138-146 (1992); Майа1, Ь.К., е! а1., δс^еηсе, 276:1125-1128 (1997).

Структура и синтез неприродных аминокислот: гидроксиламинсодержащие аминокислоты.

Предварительная патентная заявка США № 60/638418 включена в описание посредством ссылки во всей своей полноте. Так, информация, представленная в разделе V (озаглавленном №п-№1Шга1 Атто Ас1бк), в разделе В (озаглавленном 'ЪйисШге и δуη!йек^к оГ №п-№1Шга1 Атто Ас1бк: Нубгоху1атшеСоп!а1шпд Атто Ас1бк) полностью относится к указанным способам, композициям (включая формулы IXXXV), методикам и стратегиям для получения, выделения, характеризации и к применению неприродных аминокислот, полипептидов, содержащих неприродные аминокислоты, и полипептидов, содержащих модифицированные неприродные аминокислоты, раскрыты в описании до той же степени, как если бы такие раскрытия были бы здесь представлены полностью. В патентных публикациях США №№ 2006/0194256, 2006/0217532, 2006/0217289 и в VО 2006/069246, озаглавленной СотрокШопк соп!аттд, те!йобк шуоМпд, апб икек оГ поп-па!ига1 атто аабк апб ро1урерйбек, также включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Химический синтез неприродных аминокислот

Многие из неприродных аминокислот, пригодных для использования в настоящем изобретении, коммерчески доступны, например, от δίμιηη (^А) или А1бпс11 (Мй^аикее, VI, ^А). Те соединения, которые коммерчески недоступны, можно необязательно синтезировать как здесь раскрыто или как раскрыто в различных публикациях либо используя стандартные методы, хорошо известные специалистам в данной области. Для методик органического синтеза см., например, Огдашс СйетМгу Ьу Реккепбоп и Реккепбоп (1982, δесοηб Ебйюп, νί11ηΓύ Сгап! Ргекк, Вок!оп Макк.); Абуапсеб Отдатс СйетЦйу Ьу Магсй (ТЫтб Еб1йоп, 1985, \УПеу и δοηк, №\ν Уотк) и Абуапсеб Огдашс СйетЦйу Ьу Сагеу и δυ^^^ (ТЫтб Ебйюп, Райк А и В, 1990, Р1епит Ргекк, №\ν Уотк). Дополнительные публикации, в которых описывается синтез неприродных аминокислот, включают, например, VО 2002/085923, озаглавленный 1п у1уо шсотротайоп оГ иппа!ига1 Атто Ас1бк; Ма!коикак е! а1., (1995) Р Меб. Сйет., 38, 4660-4669; Кшд, Р.Е. & К1бб, Э.А.А. (1949) А №\ν δуη!йек^к оГ С1и!атше апб оГ у-Э1рерйбек оГ С1и!атю Ас1б Ггот Рй!йу1а!еб 1п!егтеб1а!ек, Р Сйет. 8ос., 3315-3319; Рпебтап, О.М. & Сйа!!еггр, В. (1959) δуηίйек^к оГ Оепуайуек оГ С1и!атше ак Мобе1 δиЬкΐ^а!ек Гог Апй-Титог Адеп!к, Р Ат. Сйет. 8ос., 81, 3750-3752; Сга1д, РС. е! а1. (1988) АЬко1и!е Сопйдигайоп оГ !йе Епапйотетк оГ 7-Сй1ого-4 [[4-(б1е!йу1атто)-1-те!йу1Ьи!у1]атто]дшпо1те (СШогодшпе), Ь Огд. Сйет., 53, 1167-1170; Ахои1ау, М., ^1топ!, М. & Ргарр1ег, Р. (1991) С1и!атше апа1одиек ак Ро!епйа1 Апйта1апа1к, Еиг. Р Меб. Сйет., 26, 201-5; Коккшеп, А.М.Р. & Варорой, Н. (1989) δуη

- 53 019968 !йек1к о£ 4-8иЬк!йи!еб Ргойпек ак СопГогта1юпа11у Сопкйатеб Атто Ас1б Апа1одие8, I. Огд. Сйет., 54, 1859-1866; Сйпкйе, В.Э. & Варорой, Η. (1985) 8уп!йек1к о£ Орйса11у Риге Р1ресо1а!ек £гот Ь-Акрагадте. Аррйсайоп !о !йе То!а1 8уп!йек1к о£ (+)-Ароутсатте !йгоидй Атто Ас1б ОесагЬопуйИюп апб Мшит йп СусНхайоп, I. Огд. Сйет., 50:1239-1246; Вайоп е! а1. (1987) 8уп!йек1к о£ №ус1 а1рйа-Атто-Ас1бк апб Эепуайуек Иктд Ваб1са1 СйетМгу: 8уп!йек1к о£ Ь- апб П-а1рйа-Атто-Аб1рю Ас1бк, Ь-а1рйа-аттор1те11с Ас1б апб Арргорпа!е ипка!ига!еб ПейуаБуек, Те!гайебгоп, 43:4297-4308 и 8иЬактдйе е! а1. (1992) ΟιιίκсщаКс ас1б апа1одиек: куп!йек1к о£ Ье!а-йе!егосусйс 2-атторгорапо1с ас1б бейуайуек апб !йе1г асйуйу а! а поуе1 с.|шкс.|иа1а1е-кепкй|/еб кйе, I. Меб. Сйет., 35:4602-7; см. также патентную публикациию США № 2004/0198637, озаглавленную Рго!ет Аггаук, которая включена в описание посредством ссылки.

А. Карбонильные реакционноспособные группы.

Аминокислоты с карбонильными реакционноспособными группами предоставляют возможность осуществления различных реакций для связывания молекул (включая, без ограничения, ПЭГ или другие водорастворимые молекулы) в реакциях, наряду с другими, нуклеофильного присоединения или альдольной конденсации.

Примеры карбонилсодержащих аминокислот можно представить следующим образом:

если п принимает значения 0-10; В₁ представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил; В₂ представляет собой Н, алкил, арил, замещенный алкил и замещенный арил; В₃ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или аминотерминальную модифицирующую группу и В₄представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или карбокситерминальную модифицирующую группу. В некоторых вариантах п=1, В₁ представляет собой фенил, В₂ представляет собой низший алкил (т.е. метил, этил или пропил) и кетонная молекула расположена в пара-положении относительно алкильной боковой цепи. В некоторых вариантах п=1, В1 представляет собой фенил, В2 представляет собой низший алкил (т.е. метил, этил или пропил) и кетонная молекула расположена в мета-положении относительно алкильной боковой цепи.

Синтез п-ацетил-(+/-)-фенилаланина и м-ацетил-(+/-)-фенилаланин раскрыт 2йапд, Ζ., е! а1., Вюсйет1к!гу, 42: 6735-6746 (2003), что включено в описание посредством ссылки. Другие карбонилсодержащие аминокислоты специалисты в данной области могут получить аналогичным способом.

В некоторых вариантах полипептид, включающий не кодируемую в природе аминокислоту, химически модифицируют для создания реакционноспособной карбонильной функционакльной группы. Например, альдегидную функциональность, которую можно использовать для реакций конъюгирования, можно создать из функциональности, имеющей соседние амино и гидроксильную группы. Если биологически активная молекула является полипептидом, например Ν-терминальным серином или треонином (которые могут как обычно присутствовать или могут быть экспонированы в результате химического или ферментативного расщепления), ее можно использовать для создания альдегидной функциональности в условиях мягкого оксидативного расщепления, используя периодат; см., например, Саейпег, е! а1., В1осоп)ид. Сйет., 3: 262-268 (1992); Сеодйедап, К. & 8!гой, I., Вюсопщд, Сйет., 3:138-146 (1992); Саейпег е! а1., I. Вю1. Сйет., 269:7224-7230 (1994). Однако известные специалистам методы ограничены аминокислотой на Ν-конце пептида или белка.

В настоящем изобретении не кодируемую в природе аминокислоту, содержащую соседние гидроксильную и аминогруппу, можно включить в полипептид как маскированную альдегидную функциональность. Например, 5-гидроксилизин содержит гидроксильную группу, соседнюю с эпсилон-амином. Условия реакции для создания альдегида обычно включают добавление молярного избытка метапериодата натрия в мягких условиях, чтобы избежать окисления по другим сайтам внутри полипептида. Величина рН в реакции окисления обычно составляет около 7,0. А типичная реакция включает добавление около 1,5 мол. избытка метапериодата натрия к забуференному раствору полипептида с последующим инкубированием в течение около 10 мин в темноте; см., например, патент США № 6423685, который включен в описание посредством ссылки.

Карбонильную функциональность можно подвергнуть взаимодействию селективно с гидразин-, гидразид-, гидроксиламин- или семикарбазидсодержащим реагентом в мягких условиях в водном растворе для образования соответствующих гидразоновой, оксимной или семикарбазоновой связей, соответственно которые стабильны в физиологических условиях; см., например, 1епскк, ν.₽., I. Ат. Сйет. 8ос., 81, 475-481 (1959); 8йао, I. и Тат, ЕР, I. Ат. Сйет. 8ос., 117:3893-3899 (1995). Кроме того, уникальная реакционная способность карбонильной группы позволяет осуществить селективную модификацию в присутствии боковых цепей других аминокислот; см., например, Согшкй, У>., е! а1., I. Ат. Сйет. 8ос., 118:8150-8151 (1996); Сеодйедап, К.Е. & 8!гой, ЕС, Вюсопщд. Сйет., 3:138-146 (1992); Майа1, Ь. К., е! а1., 8с1епсе, 276:1125-1128 (1997).

В. Гидразиновые, гидразидные или семикарбазидные реакционноспособные группы.

Не кодируемые в природе аминокислоты, содержащие нуклеофильные группы, такие как гидразин, гидразид или семикарбазид, позволяют вести реакции с различными электрофильными группами для

- 54 019968 создания конъюгатов (включая, без ограничения, с ПЭГ или с другими водорастворимыми полимерами). Примеры гидразин-, гидразид- или семикарбазидсодержащих аминокислот можно представить следующим образом:

если п принимает значения 0-10; Я! представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил или отсутствует; X представляет собой О, N или 8 или отсутствует; Я₂ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или аминотерминальную модифицирующую группу и Я₃ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или карбокситерминальную модифицирующую группу.

В некоторых вариантах п=4, Я! отсутствует и X представляет собой N. В некоторых вариантах п=2, Я₁ отсутствует и X отсутствует. В некоторых вариантах п=1, Я! представляет собой фенил, X представляет собой О и атом кислорода находится в пара-положении относительно алифатической группы на арильном кольце.

Гидразид-, гидразин- и семикарбазидсодержащие аминокислоты доступны из коммерческих источников. Например, Ь-глутамат-у-гидразид доступен от 81дта СНет1са1 (8ΐ. Ьошк, МО). Другие аминокислоты, которые недоступны коммерчески, могут получить специалисты в данной области; см., например, патент США № 6281211, который включен в описание посредством ссылки.

Полипептиды, содержащие не кодируемые в природе аминокислоты, которые содержат гидразидные, гидразиновые или семикарбазидные фугкциональности, можно подвергнуть взаимодействию эффективно и селективно с различными молекулами, которые содержат альдегидные или другие функциональные группы с аналогичной реакционной способностью; см., например, 8Нао, I. и Тагп, I., I. Ат. СНет. 8ос., 117:3893-3899 (1995). Уникальная реакционная способность гидразидных, гидразиновых и семикарбазидных функциональных групп делает их значительно более реакционноспособными в отношении альдегидов, кетонов и других электрофильных групп по сравнению с нуклеофильными группами, присутствующими в 20 обычных аминокислотах (включая, без ограничения, гидроксильные группы серина или треонина или аминогруппы лизина и №конца).

С. Аминооксисодержащие аминокислоты.

Не кодируемые в природе аминокислоты, содержащие аминоокси (также называемые гидроксиламинами) группы, позволяют проводить реакции с различными электрофильными группами с образованием конъюгатов (включая, без ограничения, ПЭГ или другие водорастворимые полимеры). Подобно гидразинам, гидразидам и семикарбазидам повышенная нуклеофильность аминооксигруппы позволяет вести реакции эффективно и селективно с различными молекулами, которые содержат альдегидные или другие функциональные группы с аналогичными химическими реакционными способностями; см., например, 8Нао, I. и Тагп, I., I. Ат. СНет 8ос., 117:3893-3899 (1995); Н. Напд и С. ВеПо/хг Асе. СНет. Яек., 34: 727736 (2001). В результате реакции с гидразиновой группой образуется соответствующий гидразон, однако в результате реакции аминооксигруппы с карбонилсодержащей группой, такой как кетон, образуется оксим.

Примеры аминокислот, содержащие аминооксигруппы, могут быть представлены следующим образом:

где п принимает значения 0-10; Я₁ представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил или отсутствует; X представляет собой О, N 8 или отсутствует; т принимает значения 010; У=С(0) или отсутствует; Я₂ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или аминотерминальную модифицирующую группу и Я3 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или карбокситерминальную модифицирующую группу. В некоторых вариантах п=1, Я₁ представляет собой фенил, X представляет собой О, т=1 и Υ присутствует. В некоторых вариантах п=2, Я₁ и X отсутствуют, т=0 и Υ отсутствует.

Аминооксисодержащие аминокислоты можно получить из легкодоступных аминокислотных предшественников (гомосерин, серин и треонин); см., например, М. Саггаксо и Я. Вго\\п, I. 0гд. СНет., 68: 8853-8858 (2003). Некоторые аминооксисодержащие аминокислоты, такие как Ь-2-амино-4(аминоокси)масляная кислота), были выделены (Яокеп!йа1, С., Ь1£е 8ск, 60: 1635-1641 (1997). Другие аминооксисодержащие аминокислоты могут получить специалисты в данной области.

Ό. Азидные и алкинные реакционноспособные группы.

Уникальная реакционная способность азидных и алкинных функциональных групп делает их чрезвычайно подходящими для селективных модификаций полипептидов и других биологические молекул. Органические азиды, особенно алифатические азиды и алкины, достаточно стабильны в условиях обычных химических реакций. В частности, как азидные, так и функциональные группы алкина инертны в отношении боковых цепей (т.е. Я групп) 20 обычных аминокислот, присутствующих в природных поли

- 55 019968 пептидах. При ближайшем рассмотрении, однако, выявляется пружинная природа азидных групп и групп алкина, и они селективно и эффективно участвуют в реакции [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена с образованием соответствующего триазола; см., например, СЫп Ь, е1 а1., 8с1епсе, 301: 964-7 (2003); №апд, р., е1 а1., I Ат. СЬет. 8ос., 125, 3192-3193 (2003); СЫп, Ь№., е1 а1., I Ат. СЬет. 8ос., 124:90269027 (2002).

Так как реакция циклоприсоединения Хьюсгена включает реакцию селективного циклоприсоединения (см., например, Райта, А., т ^МРВЕт^^ Ο^ΑΝ^ δΥΝΤΉΕδΚ, Ш. 4, (ей. Тгок!, В.М., 1991), р. 1069-1109; Ншкдеп, К. в 1,3-^IРΟ^ΑК СΥС^ΟΑ^^IΤIΟN СНЕМКТОТ, (ей. Райта, А., 1984), р. 1-176) скорее, чем реакцией нуклеофильного замещения, включение не кодируемых в природе аминокислот, содержащих азид- и алкинсодержащие боковые цепи, позволяет получать в результате полипептиды, которые селективно модифицированы по положению не кодируемой в природе аминокислоты. Реакцию циклоприсоединения с участием азид- или алкинсодержащих полипептидов ЬС-С8Р можно вести при комнатной температуре в водных условиях путем добавления Си(П) (включая, без ограничения, в виде каталитического количества ί.'ιι8Ο.·ι) в присутствии восстанавливающего агента для восстановления Си(П) до СиЦ), ш 5Йи, в каталитическом количестве; см., например, \Уапд, Ц., е1 а1., Ь Ат. СЬет. 8ос., 125, 3192-3193 (2003); Тогпое, С.№., е1 а1., I Ογ& СЬет., 67:3057-3064 (2002); Койоту, е1 а1., Апдем. СЬет. Ей., 41:2596-2599 (2002). Примеры восстанавливающих агентов включают, без ограничения, аскорбат, металлическую медь, хинин, гидрохинон, витамин К, глутатион, цистеин, Ре²⁺, Со²⁺, и под действием электрического потенциала.

В некоторых случаях, когда желательно проведение реакции [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена между азидом и алкином, полипептид ЬС-С8Р включает не кодируемую в природе аминокислоту, включающую алкиновую молекулу, а водорастворимый полимер, который следует присоединить к аминокислоте, включает азидную молекулу. Альтернативно, можно осуществить обратную реакцию (т.е. реакцию с азидной молекулой у аминокислоты и алкиновой молекулой, присутствующей на водорастворимом полимере).

Азидная функциональная группа может также селективно реагировать с водорастворимым полимером, содержащим ариловый сложный эфир, и соответствующим образом функционализированной арилфосфиновой молекулой для создания амидной связи. Арилфосфиновая группа восстанавливает азид 1п 5Йи, и образующийся амин затем эффективно реагирует с проксимальной сложноэфирной связью с образованием соответствующего амида; см., например, Е. 8ахоп апй С. ВеПоххг 8с1епсе, 287, 2007-2010 (2000). Азидсодержащая аминокислота может быть или алкилазидом (включая, без ограничения, 2амино-6-азидо-1-гексановую кислоту) или арилазидом (п-азидофенилаланин).

Примеры водорастворимых полимеров, содержащих ариловые сложные эфиры и фосфиновую молекулу, могут быть представлены следующим образом:

где X представляет собой О, Ν, 8 или отсутствует; РЬ представляет собой фенил; представляет собой водорастворимый полимер и К может представлять собой Н, алкил, арил, замещенный алкил и замещенные арильные группы. Примеры К групп включают, без ограничения -СН2, -С(СН3)3, ЮК', -ЦК'К, -8К', -галоген, -С^К', -εΘΝΕ^, ^(Ο)^', -8(Ο)₂NΚ'Κ, -ΟΝ и -ΝΟ₂. К', К, К' и К, каждый независимо, представляет собой водород, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, включая, без ограничения, арил, замещенный 1-3 галогенами, замещенный или незамещенный алкил, алкокси- или тиоалкоксигруппы или арилалкильные группы. Если соединения настоящего изобретения включают более одной К группы, например, каждую из К групп независимо выбирают как каждую К', К, К' и К группу, если присутствует более одной такой группы. Если К' и К присоединены к одному и тому же атому азота, они в комбинации с атомом азота могут образовывать 5-, 6- или 7-членное кольцо. Например, подразумевается, что -ΝΗΚ включает, без ограничения, 1пирролидинил и 4-морфолинил. Из приведенного выше обсуждения заместителей специалисту будет понятно, что термин алкил подразумевает включение групп с атомами углерода, связанными с группами, отличающимися от водорода, такими как галогеноалкил (включая, без ограничения, -СР3 и -СН2СР3) и ацил (включая, без ограничения, -С(О)СН₃, -С^СР^ -С(О)СН₂ОСН₃) и т.п.

Азидная функциональная группа также может селективно реагировать с водорастворимым полимером, содержащим тиоэфир, и соответствующим образом функционализованной арилфосфиновой молекулой для создания амидной связи. Арилфосфиновая группа восстанавливает азид 1п 5Йи, и образовавшийся амин затем эффективно реагирует с тиоэфирной связью с образованием соответствующего амида. Водорастворимые полимеры, содержащие тиоэфир и фосфиновую молекулу, можно представить следующим образом:

X

РИгРОЪСМ·'' Д Αν

О где п принимает значения 1-10; X может представлять собой О, Ν, 8 или отсутствует; РЬ представляет собой фенил и представляет собой водорастворимый полимер.

- 56 019968

Примеры алкинсодержащих аминокислот можно представить следующим образом: (СН,)„Н,Х(СН₂)„ССН

Я,ННсок₃ где η принимает значения 0-10; В1 представляет собой алкил, арил, замещенный алкил или замещенный арил или отсутствует; X представляет собой О, N 8 или отсутствует; т принимает значения 010; В2 представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или аминотерминальную модифицирующую группу, В₃ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или карбокситерминальную модифицирующую группу. В некоторых вариантах п=1, В! представляет собой фенил, X отсутствует, т=0 и ацетиленовая молекула расположена в пара-положении относительно алкильной боковой цепи. В некоторых вариантах п=1, В! представляет собой фенил, X представляет собой О, т=1 и пропаргилоксигруппа расположена в пара-положении относительно алкильной боковой цепи (т.е. О-пропаргилтирозин). В некоторых вариантах п=1, В1 и X отсутствуют и т=0 (т.е. пропаргилглицин).

Алкинсодержащие аминокислоты коммерчески доступны. Например, пропаргилглицин коммерчески доступен от Рер!есй (Виг11пд1оп, М.А.). Альтернативно, алкинсодержащие аминокислоты можно получить стандартными способами. Например, п-пропаргилоксифенилаланин можно синтезировать, например, как раскрыто у Оейегк, А., е! а1., 1. Ат. СНет. 8ос., 125: 11782-11783 (2003), и 4-алкинил-Ьфенилаланин можно синтезировать, как раскрыто у Каукег, В., е! а1., Те!гайебгоп 53(7): 2475-2484 (1997). Другие алкинсодержащие аминокислоты могут получить специалисты в данной области.

Примеры азидсодержащих аминокислот можно представить следующим образом:

сок₃ где η принимает значения 0-10; В₁ представляет собой алкил, арил, замещенный алкил, замещенный арил или отсутствует; X представляет собой О, N 8 или отсутствует; т принимает значения 0-10; В₂представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или аминотерминальную модифицирующую группу; В₃ представляет собой Н, аминокислоту, полипептид или карбокситерминальную модифицирующую группу. В некоторых вариантах п=1, В! представляет собой фенил, X отсутствует, т=0 и азидная молекула расположена в пара-положении относительно алкильной боковой цепи. В некоторых вариантах η принимает значения 0-4, В1 и X отсутствуют и т=0. В некоторых вариантах п=1, В1 представляет собой фенил, X представляет собой О, т=2 и β-азидоэтоксимолекула расположена в пара-положении относительно алкильной боковой цепи.

Азидсодержащие аминокислоты доступны из коммерческих источников. Например, 4азидофенилаланин можно получить от СНет-1трех 1п!ета!юпа1, 1пс. (\Уооб Оа1е, Ш). Что касается азидсодержащих аминокислот, которые коммерчески недоступны, то азидную группу можно получить относительно легко, используя стандартные методы, хорошо известные специалистам в данной области, включая, без ограничения, замещение соответствующей отщепляемой группы (включая, без ограничения, галогенид, мезилат, тозилат) или используя раскрытие соответствующим образом защищенного лактона; см., например, Абуапсеб 0гдашс СНет181гу Ьу Магсй (ТЫгб Ебйюп, 1985, ^11еу и 8опк, №\у Уогк).

Е. Аминотиольные реакционноспособные группы.

Уникальная реакционная способность бета-замещенных аминотиольных функциональных групп делает их крайне полезными для селективной модификации полипептидов и других биологических молекул, которые содержат альдегидные группы, через образование тиазолидина; см., например, 1. 8Нао и 1. Тагп, 1. Ат. СНет. 8ос., 1995, 117 (14) 3893-3899. В некоторых вариантах бета-замещенные аминотиольные аминокислоты можно включить в полипептиды ЬС-С8Е и затем подвергнуть реакции с водорастворимыми полимерами, включающими альдегидную функциональность. В некоторых вариантах водорастворимый полимер, лекарственный конъюгат или другие агенты можно присоединить к полипептиду ЬСС8Е, включающему бета-замещенную аминотиольную аминокислоту через образование тиазолидина.

Е. Дополнительные реакционноспособные группы.

Дополнительные реакционноспособные группы и не кодируемые в природе аминокислоты, включая, без ограничения, пара-аминофенилаланин, которые можно включить в полипептиды ЬС-С8Е настоящего изобретения, раскрыты в следующих патентных заявках, которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте: патентная публикация США № 2006/0194256, патентная публикация США № 2006/0217532, патентная публикация США № 2006/0217289, предварительная заявка на патент № 60/755338; предварительная заявка на патент № 60/755711; предварительная заявка на патент № 60/755018; международная патентная заявка № РСТ/И8 06/49397; \У0 2006/069246; предварительная заявка на патент США № 60/743041; предварительная заявка на патент № 60/743040; международная патентная заявка № РСТ/И8 06/47822; предварительная заявка на патент № 60/882819; предварительная заявка на патент № 60/882500; и предварительная заявка на патент № 60/870594. В перечисленных заявках также рассматриваются реакционноспособные группы, которые могут присутствовать у ПЭГ или у других полимеров, включая, без ограничения, группы гидроксиламина (аминоокси) для конъюгации.

Клеточный захват неприродных аминокислот.

Захват (поглощение) клеткой неприродных аминокислот является моментом, который обычно принимают во внимание, конструируя и селектируя неприродные аминокислоты, включая, без ограничения, для включения в белок. Например, высокая плотность заряда α-аминокислот предполагает, что указанные соединения, по-видимому, не способны проникать в клетки. Природные аминокислоты захватываются эукариотными клетками за счет транспортных систем на основе белков. Можно осуществить быстрый скрининг, чтобы оценить, какие именно из неприродных кислот захватываются (если захватываются) клетками; см., например, анализы токсичности, например, в патентной публикации США № 2004/0198637, озаглавленной РгоЧет Аггауз, которая включена в описание посредством ссылки; и ЬЧи, И.Я. & 8сйиЮ, Р.С. (1999) Ргодгезз Чотагб Чйе егойШоп оГ ап огдапЧзт \νί11ι ап ехрапбеб депеЧЧс собе, РNΑ8, ИпЧЧеб 8ЧаЧез, 96:4780-4785. Хотя захват легко определяется различными анализами, альтернативой созданию неприродных аминокислот, которые поддаются схемам клеточного захвата, является разработка биосинтетических схем создания аминокислоты Чп уЧуо.

Биосинтез неприродных аминокислот.

Многие биосинтетические схемы уже существуют в клетках для продуцирования аминокислот и других соединений. Хотя биосинтетические способы для конкретной аминокислоты могут не существовать в природе, включая, без ограничения, клетки, в настоящем изобретении предложены такие методы. Например, биосинтетические схемы для неприродных аминокислот необязательно создаются в клеткехозяине в результате добавления новых ферментов или модификации существующих в клетке-хозяине схем. Дополнительные новые ферменты представляют собой необязательно природные ферменты или искусственно созданные ферменты. Например, биосинтез п-аминофенилаланина (представленный в примере \¥О 2002/085923, озаглавленном Чп уЧуо 1псогрогаЧ1оп оГ иппаЧига1 атЧпо асЧбз) основан на комбинации известных ферментов из других организмов. Гены для таких ферментов можно встроить в эукариотные клетки путем трансформирования клеток плазмидой, содержащей указанные гены. Такие гены, будучи экспрессированы в клетке, обеспечивают ферментативные пути к синтезу целевого соединения. Примеры типов ферментов, которые необязательно добавляют, представлены далее в примерах. Дополнительные ферментные последовательности можно найти, например, в Банке генов. Искусственно созданные ферменты также необязательно добавляют в клетку таким же образом. Таким образом можно манипулировать клеточным механизмом и ресурсами для создания неприродных аминокислот.

Различные методы доступны для получения новых ферментов для использования в биосинтетических схемах или для эволюции уже существующих схем. Например, рекурсивную рекомбинацию, включая, без ограничения, предложенную Махудеп, Чпс. (доступна на \Уог1б ^Чбе \¥ей по адресу тахудеп.сот), необязательно используют для создания новых ферментов и схем; см., например, 8Четтег (1994), Яар1б еуо1иЧ1оп оГ а ргоЧеЧп Чп уЧЧго Ьу ΩΝΛ зйиГЙЧпд, №1Чиге 370(4):389-391 и, 8Четтег, (1994), ΩΝΛ зйиГЙЧпд Ьу гапбот ГгадтепЧаЧЧоп апб геаззетЬ1у: Ш уЧЧго гесотЫпайоп Гог то1еси1аг еуо1иЧ1оп, Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А., 91:10747-10751. Аналогично, ИезЧдпРаЧй™, созданную Сепепсог (доступно на \Уог1б ^Чбе \¥ей по адресу депепсог.сот), необязательно используют для метаболической схемы конструирования, включая, без ограничения, для конструирования схемы для создания О-метил-Ь-тирозин в клетке. Такая технология реконструкции существующих схем в организме хозяина с использованием комбинации новых генов, включая, без ограничения, те, которые идентифицированы с помощью функциональной геномики, и молекулярной эволюции и дизайна. БЧуегза СогрогаЧЧоп (доступно на \Уог1б ^УЧбе \УеЬ по адресу бЧуегза.сот) также предлагает технологию для быстрого скринирования библиотек генов и генных схем, включая, без ограничения, создание новых схем.

Обычно неприродную аминокислоту получают, используя сконструированные схемы биосинтеза настоящего изобретения в концентрации, достаточной для эффективного биосинтеза белка, включая, без ограничения, количества в клетках в природе, но не до такой степени, чтобы воздействовать на концентрации других аминокислот или исчерпания ресурсов клетки. Типичные концентрации, продуцируемые Чп уЧуо, таким образом, составляют от около 10 до около 0,05 мМ. После того как клетка трансформирована плазмидой, включающей гены, использованные для получения ферментов, необходимых для конкретной схемы, и создана неприродная аминокислота, необязательно используют Чп уЧуо селекцию для дальнейшей оптимизации продуцирования неприродной аминокислоты как для синтеза рибосомального белка, так и для клеточного роста.

Полипептиды с неприродными аминокислотами.

Встраивание неприродной аминокислоты можно осуществить для различных целей, включая, без ограничения, вспомогательные изменения в структуре и/или в функциях белка, изменения размера, кислотности, нуклеофильности, водородного связывания, гидрофобности, доступности сайтов-мишеней протеазы, нацеливания на молекулу (включая, без ограничения, структуру белка), добавления биологически активной молекулы, присоединения полимера, присоединения радионуклида, модулирование времени полужизни, модулирование тканепроницаемости (например, опухолей), модулирование активного транспорта, модулирование ткане-, клетко- или орган-специфичности или распределения, модулирования иммуногенности, модулирование протеазоустойчивости и т.д. Белки, которые включают неприрод

- 58 019968 ные аминокислоты, можно усилить или даже полностью придать им новые каталитические или биофизические свойства. Например, следующие свойства необязательно модифицируют путем включения неприродной аминокислоты в белок: токсичность, биораспределение, структурные характеристики, спектроскопические характеристики, химические и/или фотохимические свойства, каталитическую способность, время полужизни (включая, без ограничения, период сывороточной полужизни), способность реагировать с другими молекулами, включая, без ограничения, ковалентно или нековалентно и т.п. Композиции, включающие белки, которые содержат по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, можно использовать для, включая, без ограничения, новых терапевтических агентов, диагностических агентов, каталитических ферментов, промышленных ферментов, связывающих белков (включая, без ограничения, антитела), и включая, без ограничения, исследования структуры и функций белков; см., например, Боидбебу, (2000) Иппа!ига1 Атто Ас1бк РгоЬек о£ Рго!ет 8бис!иге апб Рипсбоп, Сиггеп! Ортюп ш Сбет1са1 Вю1оду, 4:645-652.

В одном аспекте настоящего изобретения композиция включает по меньшей мере один белок, включающий по меньшей мере одну, включая, без ограничения, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять или больше неприродных аминокислот. Неприродные аминокислоты могут быть одинаковыми или различными, включая, без ограничения, может быть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или больше различных сайтов в белке, который включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или больше различных неприродных аминокислот. В другом аспекте композиция включает белок, содержащий по меньшей мере одну, но меньше, чем все, конкретную аминокислоту, присутствующую в белке, замещенном неприродной аминокислотой. Для конкретного белка, содержащего более чем одну неприродную аминокислоту, неприродные аминокислоты могут быть идентичными или могут отличаться (включая, без ограничения, белок, который может включать два или больше различных типа неприродных аминокислот или может включать две одинаковые неприродные аминокислоты). Для конкретного белка с более чем двумя неприродными аминокислотами неприродные аминокислоты могут быть одинаковыми, различными или могут представлять собой множество неприродных аминокислот одного типа по меньшей мере с одной отличающейся неприродной аминокислотой.

Представляющие интерес белки или полипептиды, содержащие по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, являются отличительным признаком настоящего изобретения. Настоящее изобретение также включает полипептиды или белки, содержащие по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, полученную с использованием композиций и способов настоящего изобретения. Эксципиент (включая, без ограничения, фармацевтически приемлемый эксципиент) также может присутствовать вместе с белком.

При получении представляющих интерес белков или полипептидов, содержащих по меньшей мере одну неприродную аминокислоту в эукариотных клетках, белки или полипептиды обычно включают эукариотные посттрансляционные модификации. В некоторых вариантах белок включает по меньшей мере одну неприродную аминокислоту и по меньшей мере одну посттрансляционную модификацию, которая осуществляется 1п νίνο эукариотными клетками, причем указанная посттрансляционная модификация не осуществляется прокариотными клетками. Например, пост-трансляционные модификации включают, включая, без ограничения, синтезирование, ацилирование, липидную модификацию, пальмитоилирование, добавление пальмитата, фосфорилирование, модификацию гликолипидной связи, гликозилирование и т.п. В одном аспекте посттрансляционная модификация включает присоединение олигосахарида (включая, без ограничения, (С1сNАс-Μап)₂-Μап-С1сNАс-С1сNАс)) к аспарагину через С1сNАсаспарагиновую связь; см. табл. 1, в которой перечислены некоторые примеры Ν-связанных олигосахаридов эукариотных белков (могут присутствовать также дополнительные остатки, которые не показаны). В другом аспекте посттрансляционная модификация включает присоединение олигосахарида (включая, без ограничения, Са1-СаШАс, Са1-С1сNАс и т.д.) к серину или треонину через связи СаШАс-серин или Са1NАс-треонин или связи С1сNАс-серин или С1сNАс-треонин.

- 59 019968

Таблица 1

Примеры олигосахаридов через С1сNАс-связь

Тип	Базовая структура
Высокомолекулярная манноза	Мапа1-6ч. МапаЛ-6-ν. Мапа1-3> \ Μ3Πβ1-46ΙοΝΑοβ1-4ΘΙοΝΑοβ1-Α5Π Мапа1-3>^
Гибрид	МапоД-ЕА. £> ΜβηβΜΘΙοΝΑοβΜΟΙοΝΑοβΙ-Αδη ΟΙοΝΑοβ1-2----Магш1-3^
Комплекс	ΟΙοΝΑοβ1-2----Мапа1-6. £> Μ3ηβ1-43ΙοΝΑοβ1-4ΘΙοΝΑοβ1Άδη ΟΙοΝΑοβ1-2·---Мапа1-3^
Ксилоза	Мапа.1-6ч. £> Мапр1-4О1сЫАср1-4О1сМАср1-Азп Ху(р1-2-^

В еще одном аспекте посттрансляционная модификация включает протеолитический процессинг предшественников (включая, без ограничения, кальцитониновый предшественник, пептидный предшественник, родственный гену кальцетонина, препропаратироидный гормон, проинсулин, препроопиомеланокортин, проопиометанокортин и т.п.), сборку в белок, состоящий из многих субъединиц или макромолекулярную сборку, трансляцию в другие сайты в клетке (включая, без ограничения, в органеллы, такие как эндоплазмический ретикулум, комплекс Гольджи, ядра, лизосомы, пероксисомы, митохондрии, хлоропласты, вакуоли и т.д. или через секреторную схему). В некоторых вариантах белок включает секреторную или локализационную последовательность, эпитопную метку, БЬАС метку, полигистидиновую метку, слитых С8Т или т.п.

Одним из преимуществ неприродной аминокислоты является то, что она предоставляет дополнительные химические молекулы, которые можно использовать для добавления дополнительных молекул. Такие модификации можно осуществить ίη νίνο в эукариотных или не эукариотных клетках или ίη νίίτο. Так, в некоторых вариантах пост-трансляционная модификация происходит через неприродную аминокислоту. Например, посттрансляционная модификация может быть результатом нуклеофильноэлектрофильной реакции. Большинство реакций, которые в настоящее время используют для селективной модификации белков, включает образование ковалентной связи между нуклеофильным и электрофильным партнерами реакции, включая, без ограничения, реакцию α-галогенокетонов с боковыми цепями гистидина или цистеина. Селективность в таких случаях определяют по количеству и доступности нуклеофильных остатков в белке. С белками настоящего изобретения можно использовать другие, более селективные реакции, такие как реакция неприродной кетоаминокислоты с гидразидами или аминооксисоединениями ίη νίίτο и ίη νίνο; см., например, СотЫй, е! а1. (1996) 1. Ат. Сйет. 8ос., 118:8150-8151; Майа1, е! а1. (1997) 8с1епсе, 276:1125-1128; \\апА е! а1. (2001) 8с1епсе, 292:498-500; СЫп, е! а1. (2002) 1. Ат. Сйет. 8ос., 124:9026-9027; СЫп, е! а1. (2002) Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сй, 99:11020-11024; \\апА е! а1. (2003) Ргос. №ί1. Асаб. 8ст, 100:56-61; Ζΐιηηβ, еί а1. (2003) ВюсйетЫйу, 42:6735-6746 и СЫп, еί а1. (2003) 8с1епсе, 301:964-7, причем все они включены в описание посредством ссылки. Это позволяет селективно вводить метки практически в любой белок, используя множество переносчиков реагентов, включая флуорофоры, сшивающие агенты, производные сахаридов и цитотоксические молекулы; см. также патент США № 6927042, озаглавленный С1усорго1еЫ вупЩезЫ, который включен в описание посредством ссылки. Посттрансляционные модификации, включая, без ограничения, модификации с использованием азидоаминокислоты, можно также осуществить с помощью лигирования Стаудингера (включая, без ограничения, триарилфосфиновые реагенты); см., например, Кпск еί а1. (2002) ШсогрогаШоп оГ а/|бе5 ίηίο тесотЬтаЫ ргсЛеиъ Гог с11ето5е1ес1ке тобШсайоп Ьу !йе 8!аибшдег 11да(1оп_ РNА8, 99:19-24.

В настоящем изобретении предложен другой высокоэффективный способ селективной модификации белков, который включает генетическое встраивание неприродных аминокислот, включая, без ограничения, содержащие азидную или алкинильную молекулу, в белки в ответ на селекторный кодон. Такие боковые цепи аминокислоты можно затем модифицировать, включая, без ограничения, в [3+2] реакции циклоприсоединения Хьюсгена (см., например, Рабтеа, А. ίη Сотргейепмуе 0тдашс 8уп1йе515., νο1. 4. (1991) Еб. ТтоЩ В.М., Регдатоп, 0хГогб, р. 1069-1109 и НиЫдеп, К. ίη 1,3-Э1ро1ат Сус1оаббйюп СйетЫйу (1984) Еб. Рабтеа, А., ХУПеу, №те Уогк, р. 1-176) с использованием, включая, без ограничения, алкинилили азидопроизводных соответственно. Так как указанный способ включает скорее циклоприсоединение, а не нуклеофильное замещение, белки можно модифицировать с чрезвычайно высокой селективностью. Указанную реакцию можно вести при комнатной температуре в водных условиях с превосходной региоселективностью (1,4>1,5), добавляя к реакционной смеси каталитические количества солей СиЩ; см., например, Тогпое, е! а1., (2002) 1. 0гд. Сйет., 67:3057-3064 и ΒοδΙονΙίΑν, е! а1., (2002) Апдете. Сйет. Ση!. Еб., 41:2596-2599. Другим способом, который можно использовать, является обмен лигандов на бисмышьяксодержащем соединении с тетрацистеиновым мотивом, см., например, СпГПп, е! а1., (1998) 8Ы

- 60 019968 епсе, 281: 269-272.

Молекулами, которые можно добавлять к белку настоящего изобретения с помощью [3+2] циклоприсоединения, являются практически любые молекулы с азидными или алкинильными производными. Такие молекулы включают, без ограничения, красители, флуорофоры, сшивающие агенты, производные сахаридов, полимеры (включая, без ограничения, производные полиэтиленгликоля), фотосшивающие линкеры, цитотоксические соединения, аффинные метки, производные биотина, смолы, шарики, второй (или больше) белок или полипептид, полинуклеотид (политнуклеотиды) (включая, без ограничения, ДНК, РНК и т.д.), металлохелаторы, кофакторы, жирные кислоты, углеводы и т.п. Такие молекулы можно добавлять к неприродной аминокислоте с алкинильной группой, включая, без ограничения, ппропаргилоксифенилаланин, или с азидной группой, включая, без ограничения, п-азидофенилаланин соответственно.

V. Ш у1уо создание полипептидов ЬО-С8Р, включающих не кодируемые в природе аминокислоты.

Полипептиды ЬО-С8Р настоящего изобретения можно создать т у1уо, используя модифицированные тРНК и тРНК синтетазы для добавления к аминокислотам или для замещения аминокислотами, которые не кодированы в природных системах.

Методы создания тРНК и тРНК синтетаз, которые используют аминокислоты, которые не кодированы в природных системах, раскрыты, например, в патенте США № 7045337 и 7083970, которые включены в описание посредством ссылки. Указанные методы включают создание трансляционного механизма, который функционирует независимо от синтетазы и тРНК эндогенных в отношении трансляционной системы (и поэтому иногда называемых ортогональными). Обычно трансляционная система включает ортогональную тРНК (О-тРНК) и ортогональную аминоацил-тРНК-синтетазу (О-Я8). Обычно О-Я8 преимущественно аминоацилируют О-тРНК, содержащую по меньшей мере одну неприродную аминокислоту в трансляционной системе, и О-тРНК распознает по меньшей мере один селекторный кодон, который не распознают другие тРНК в системе. Трансляционная система, таким образом, встраивает не кодируемую в природе аминокислоту в белок, продуцируемый в системе, в ответ на кодируемый селекторный кодон, тем самым замещая аминокислоту в положении в кодированном полипептиде.

Специалистами был описан широкий круг ортогональных тРНК и аминоацил-тРНК синтетаз для включения конкретных синтетических аминокислот в полипептиды, и они обычно пригодны для использования в настоящем изобретении. Например, кето-специфические О- и РНК/аминоацил-тРНК синтетазы раскрыты у Уапд, Ь., е! а1., Ргос. №111 Асаб. 8ск И8А, 100:56-61 (2003) и 2йапд, Ζ. е! а1., Вюскет., 42 (22): 6735-6746 (2003). Примеры О-Я8, или их частей, кодированы полинуклеотидными последовательностями и включают аминокислотные последовательности, раскрытые в патентах США №№ 7045337 и 7083970, которые включены в описание посредством ссылки. Соответствующие О-тРНК молекулы для использования с О-Я8 также раскрыты в патентах США №№ 7045337 и 7083970, которые включены в описание посредством ссылки. Дополнительные примеры О-тРНК/аминоацил-тРНК синтетазных пар раскрыты в УО 2005/007870, УО 2005/007624 и УО 2005/019415.

Пример системы азидоспецифической О-тРНК/аминоацил-тРНК синтетазы раскрыт у СЫп, ГУ., е! а1., 1. Ат. С11ет. 8ос., 124:9026-9027 (2002). Примеры О-Я8 последовательности для п-азидо-Ь-Рке включают, без ограничения, нуклеотидные последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО: 14-16 и 29-32 и аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО: 46-48 и 61-64, как раскрыто в патенте США № 7083970, который включен в описание посредством ссылки. Примеры О-тРНК последовательностей, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают, без ограничения, нуклеотидные последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 1-3, как раскрыто в патенте США № 7083970, который включен в описание посредством ссылки. Другие примеры пар О-тРНК/аминоацил-тРНК-синтетаз, специфических относительно конкретной не кодируемой в природе аминокислоты, раскрыты в патенте США № 7045337, который включен в описание посредством ссылки. О-Я8 и О-тРНК, которые включают как кетосодержащие, так и азидосодержащие аминокислоты, в 8. сегеуыае раскрыты у СЫп, ЕУ., е! а1., 8с1епсе, 301:964-967 (2003).

Имеются сообщения о некоторых других ортогональных парах. Глутаминильная (см., например, Ьш, И.Я. и 8скик/, Р.О. (1999) Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А, 96:4780-4785), аспартильная (см., например, Райгпак, М., е! а1. (2000) Не1у. СЫт. Ас!а, 83:2277-2286) и тирозильная (см., например, Окпо, 8., е! а1., (1998) 1. Вюскет. (Токуо, брп.), 124:1065-1068 и Ко^а1, А.К., е! а1., (2001) Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сЕ И8А, 98:2268-2273) системы, полученные из 8. сегеуШае тРНК и синтетазы, были раскрыты для потенциального встраивания неприродных аминокислот в Е. сок. Системы, полученные из Е. со11 глутаминильной (см., например, Ко^а1, А.К., е! а1., (2001) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А, 98:2268-2273) и тирозильной (см., например, Еб^агбк, Н. и 8сЫтте1, Р. (1990) Мо1. Се11. Вю1., 10:1633-1641) синтетазы, были раскрыты для использования в 8. сегеуШае. Е. со11 тирозильная система была использована для встраивания 3-йодо-Ьтирозина 1п у1уо в клетки млекопитающих; см., 8акато!о, К., е! а1., Т2002, №с1ею Аабк Яек., 30:46924699.

Использование О-тРНК/аминоацил-тРНК синтетазы включает селекцию специфического кодона, который кодирует не кодируемую в природе аминокислоту. Хотя можно использовать любой кодон, обычно желательно выбирать такой кодон, который редко или никогда не используется в клетках, в которых экспрессируется О-тРНК/аминоацил-тРНК синтетаза. Например, примеры кодонов включают бес

- 61 019968 смысленные кодоны, такие как стоп-кодоны (амбер-кодон, охра-кодон и опал-кодон), кодоны с четырьмя или более основаниями и другие природные трехосновные кодоны, которые редко используют или вовсе не используют.

Специфический селекторный кодон (кодоны) можно встроить в соответствующие положения в последовательности, кодирующей ЬС-С8Е полинуклеотид, используя известные специалистам методы мутагенеза (включая, без ограничения, сайт-специфический мутагенез, кассетный мутагенез, рестрикционно-селекционный мутагенез и т.д.).

Методы создания компонентов белкового биосинтетического механизма, таких как О-Я8, О-тРНК и ортогональных О-тРНК/О-Я8 пар, которые можно использовать для встраивания не кодируемой в природе аминокислоты, раскрыты в Уапд, Ь., е! а1., 8с1епсе, 292: 498-500 (2001); СЫп, ТУ., е! а1., I. Ат. Сйет. 8ос., 124:9026-9027 (2002); 2йапд, Ζ. е! а1., Вюсйеткйу, 42: 6735-6746 (2003). Методы и композиции для т νί\Ό встраивания не кодируемых в природе аминокислот раскрыты в патенте США № 7045337, который включен в описание посредством ссылки. Методы селекции пар ортогональных тРНКтРНК синтетаз для использования в т νί\Ό трансляционной системе организма также раскрыты в патентах США 7045337 и 7083970, которые включены в описание посредством ссылки. В РСТ публикации № УО 04/035743, озаглавленной 8йе 8рес1йс 1псотротайоп о! Ке!о Атшо Ас1бк т Рго!етк, которая включена в описание посредством ссылки во всей своей полноте, раскрыты ортогональные Я8 и тРНК пары для встраивания кетоаминокислоты. В РСТ публикации № УО 04/094593, озаглавленной Ехрапбтд !йе Еисапойс Сепейс Собе, которая включена в описание посредством ссылки во всей своей полноте, раскрыты ортогональные Я8 и тРНК пары для встраивания не кодируемых в природе аминокислот в эукариотные клетки-хозяева.

Способы получения по меньшей мере одной рекомбинантной ортогональной аминоацил-тРНК синтетазы (О-Я8) включают (а) создание библиотеки (необязательно мутантных) Я8, полученных по меньшей мере из одной аминоацил-тРНК синтетазы (Я8) из первого организма, включая, без ограничения, прокариотные организмы, такие как Ме!йапососсик )аппаксЫ|, Ме!йапоЬас!епит !йегтоаи!о!горЫсит, На1оЬас1епит, ЕксйепсЫа со11, А. !и1д1бик, Р. Гилокик, Р. йопкокйй, А. регшх, Т.1йетторЫ1ик или т.п., или эукариотный организм; (Ь) селекцию (и/или скрининг) библиотеки Я8 (необязательно мутантных Я8) для членов, которые аминоацилируют ортогональные тРНК (О-тРНК) в присутствии не кодируемой в природе аминокислоты и природной аминокислоты, тем самым обеспечивая создание пула активных (необязательно мутантных) Я8; и/или (с) селекцию (необязательно через негативную селекцию) полученного пула по активным Я8 (включая, без ограничения, мутантные Я8), которые преимущественно аминоацилируют О-тРНК в отсутствие не кодируемой в природе аминокислоты, тем самым обеспечивая получение по меньшей мере одной рекомбинантной О-Я8; где по меньшей мере одна рекомбинантная О-Я8 преимущественно ацилирует О-тРНК не кодируемой в природе аминокислотой.

В одном варианте Я8 представляет собой неактивную Я8. Неактивную Я8 можно создать путем мутирования активной Я8. Например, неактивную Я8 можно создать в результате мутации по меньшей мере около 1, по меньшей мере около 2, по меньшей мере около 3, по меньшей мере около 4, по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 6 или по меньшей мере около 10 или более аминокислот до получения другой аминокислоты, включая, без ограничения, аланин.

Библиотеки мутантных Я8 можно создать, используя различные методики, известные специалистам, включая, без ограничения, рациональный дизайн на основе белковой трехмерной структуры Я8 или мутагенез Я8 нуклеотидов в методике хаотичного или рационального дизайна. Например, мутантные Я8 можно создать в результате сайт-специфических мутаций, случайных мутаций, создающих разнообразие рекомбинантных мутаций, химерических конструкций, рационального дизайна и другими методами, раскрытыми здесь или известными специалистам.

В одном варианте селектирование (и/или скрининг) библиотеки Я8 (необязательно мутантной Я8) в отношении активных членов, включая, без ограничения, таких, которые аминоацилируют ортогональные тРНК (О-тРНК) в присутствии не кодируемой в природе аминокислоты и природной аминокислоты, включает введение позитивного селекционного или скринингового маркера, включая, без ограничения, ген устойчивости к антибиотикам или т.п., и библиотеки (необязательно мутантных) Я8 в множество клеток, где позитивный селекционный и/или скрининговый маркер включает по меньшей мере один селекторный кодон, включая, без ограничения, амбер-, охра- или опал-кодон; культивирование множества клеток в присутствии селекционного агента; идентификацию клеток, которые выжили (или демонстрируют специфическую реакцию) в присутствии селекционного и/или скринингового агента, путем супрессии по меньшей мере одного селекторного кодона в позитивном селекторном или скрининговом маркере, тем самым обеспечивая субпопуляцию селектированных клеток, которые содержат пул активных (необязательно мутантных) Я8. Необязательно, можно изменять концентрацию селекционных и/или скрининговых агентов.

В одном аспекте позитивным селекционным маркером является ген хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) и селекторным кодоном является янтарный стоп-кодон в САТ гене. Необязательно, позитивным селекционным маркером является ген β-лактамазы и селекторным кодоном является янтарный стоп

- 62 019968 кодон в гене β-лактамазы. В другом аспекте позитивный скрининговый маркер включает флуоресцентный или люминесцентный скрининговый маркер или скрининговый маркер на основе аффинности (включая, без ограничения, маркер клеточной поверхности).

В одном варианте негативная селекция или скрининг пула в поисках активных В8 (необязательно мутантных), которые преимущественно аминоацилируют О-тРНК в отсутствие не кодируемой в природе аминокислоты, включает введение негативного селекционного или скринингового маркера с пулом активных (необязательно мутантных) В8 из позитивной селекции или скрининга во множество клеток второго организма, где негативный селекторный или скрининговый маркер включает по меньшей мере один селекторный кодон (включая, без ограничения, ген устойчивости к антибиотикам, включая, без ограничения, ген хлорамфениколацетилтранферазы ^ΑΤ)); и идентификацию клеток, которые выживают или демонстрируют специфические реакции на скрининг в первой среде, дополненной не кодируемой в природе аминокислотой и скрининговым или селекционным агентом, но не выживают или не демонстрируют специфической реакции во второй среде, не дополненной не кодируемой в природе аминокислотой и селекционным или скрининговым агентом, тем самым обеспечивая выживание клеток или срининг клеток, содержащих по меньшей мере одну рекомбинантную О-В8. Например, СΑΤ идентификационный протокол необязательно действует как позитивная селекция и/или негативный скрининг при определении соответствующих О-В8 рекомбинант. Например, пул клонов, необязательно реплицированных на ростовых планшетах, содержащих СΑΤ (который включает по меньшей мере один селекторный кодон) или с одной или более из не кодируемых в природе аминокислот или без них. Колонии, развивающиеся исключительно на планшетах, содержащих не кодируемые в природе аминокислоты, рассматривают таким образом как содержащие рекомбинантные О-В8. В одном аспекте меняют концентрацию селекционного (и/или скринингового) агента. В некоторых аспектах первый и второй организмы отличаются. Так, первый и/или второй организм необязательно включает прокариот, эукариот, млекопитающих, ЕксНепсЫа сой, грибы, дрожжи, агсйаеЬайепит, еиЬайепит, растения, насекомых, простейших и т.д. В других вариантах скрининговый маркер включает флуоресцентный или люминесцентный скрининговый маркер или маркер скрининга на основе аффинности.

В других вариантах скрининг или отбор (включая, без ограничения, негативный отбор) пула в поисках активных (необязательно мутантных) В8 включает выделение пула активных мутантных В8 со стадии позитивной селекции (Ь); введение негативного селекционного или скринингового маркера, где негативный селекционный или скрининговый маркер включает по меньшей мере один селекторный кодон (включая, без ограничения, ген токсического маркера, включая, без ограничения, ген рибонуклеазыбарназы, включающий по меньшей мере один селекторный кодон) и пул активных (необязательно мутантных) В8, во множество клеток второго организма; и идентификацию клеток, которые выживают или демонстрируют специфическую реакцию на скрининг в первой среде, не дополненной не кодируемой в природе аминокислотой, но не выживают и не демонстрируют специфической реакции на скрнинг во второй среде, дополненной не кодируемой в природе аминокислотой, тем самым обеспечивая выживание или скринирование клеток, содержащих по меньшей мере одну рекомбинантную О-В8, где по меньшей мере одна рекомбинантная О-В8 специфична для не кодируемой в природе аминокислоты. В одном аспекте по меньшей мере один селекторный кодон включает около двух или более селекторных кодонов. Такие варианты необязательно могут включать случаи, когда по меньшей мере один селекторный кодон включает два или более селекторных кодона и где первый и второй организм, включая, без ограничения, представляет собой, необязательно, включая, без ограничения, прокариот, эукариот, млекопитающих, ЕксйепсЫа сой, грибы, дрожжи, архебактерии, эубактерии, растения, насекомых, простейших и т.д.). Также некоторые аспекты включают случаи, где негативный селекционный маркер включает ген рибонуклеазы-барназы (который включает по меньшей мере один селекторный кодон). Другие аспекты включают случаи, когда скрининговый маркер необязательно включает флуоресцентный или люминесцентный скрининговый маркер или скрининговый маркер, основанный на аффинности. В представленных здесь вариантах скрининги и/или селекции необязательно включают вариации жесткости скрининга и/или селекции.

В одном варианте указанные способы продуцирования по меньшей мере одной рекомбинантной ортогональной аминоацил-тРНК синтетазы (О-В8) могут дополнительно включать (б) выделение по меньшей мере одной рекомбинантной О-В8; (е) создание второго набора О-В8 (необязательно мутантных), полученных по меньшей мере из одной рекомбинантной О-В8; и (ί) повторение стадий (Ь) и (с) до получения мутантной О-В8, которая включает способность преимущественно аминоацилировать О-тРНК. Необязательно, стадии (6)-(ί) повторяют, включая, без ограничения, по меньшей мере около двух раз. В одном аспекте второй набор мутантных О-В8, полученных по крайней мере из одной рекомбинантной ОВ8, можно создать, используя мутагенез, включая, без ограничения, случайный мутагенез, сайтспецифический мутагенез, рекомбинационный мутагенез или их комбинации.

Жесткость стадий селекции/скрининга, включая, без ограничения, стадию позитивной селекции/скрининга (Ь), стадию негативной селекции/скрининга (с) или обе стадии позитивной и негативной селекции/скрининга (Ь) и (с), в вышеописанных способах, необязательно, включает различную жесткость селекции/скрининга. В других вариантах стадия позитивной селекции/скрининга (Ь), стадия негативной

- 63 019968 селекции/скрининга (с) или обе стадии позитивной и негативной селекции/скрининга (Ь) и (с) включают использование репортера, где указанный репортер детектируют, используя сортинг флуоресцентно активированных клеток (РАС8) или где указанный репортер детектируют, используя люминесценцию. Необязательно, репортер расположен на клеточной поверхности, на фаговом дисплее или т.п. и селектирован на основании аффинности или каталитической активности, включающей не кодируемую в природе аминокислоту или ее аналог. В одном варианте мутантная синтетаза расположена на клеточной поверхности, на фаговом дисплее или т.п.

Способы получения рекомбинантных ортогональных тРНК (О-тРНК) включают (а) создание библиотеки мутантных тРНК, полученных по крайней мере из одной тРНК, включая, без ограничения, супрессорную тРНК из первого организма; (Ь) селектирование (включая, без ограничения, негативное селектирование) или скрининг библиотеки в поиске (необязательно мутантных) тРНК, которые аминоацилированы аминоацил-тРНК синтетазой (К8) из второго организма в отсутствие К8 из первого организма, тем самым обеспечивая пул тРНК (необязательно мутантных); и (с) селектирование или скрининг полученного пула тРНК (необязательно мутантных) в поисках членов, которые аминоацилированы за счет введенных ортогональных К8 (Ο-Κ8), тем самым обеспечивая по меньшей мере одну рекомбинантную Ο-тРНК; где по меньшей мере одна рекомбинантная О-тРНК распознает селекторный кодон и эффективно не распознается К8 из второго организма и преимущественно аминоацилирована Ο-Κ8. В некоторых вариантах по меньшей мере одна тРНК является супрессорной тРНК и/или включает уникальный кодон из трех природных и/или неприродных оснований или представляет собой бессмыссленный кодон, редкий кодон, неприродный кодон, кодон, включающий по меньшей мере 4 основания, амбер-кодон, охракодон или опал-стоп-кодон. В одном варианте рекомбинантные Ο-тРНК обладают повышенной ортогональностью. Должно быть очевидно, что в некоторых вариантах О-тРНК необязательно импортирована в первый организм из второго организма без необходимости модификации. В различных вариантах первый и второй организмы являются или одинаковыми либо различными и их необязательно выбирают из, включая, без ограничения, прокариот (включая, без ограничения, Ме!йапососсик _)аппаксйп, Ме!йапоЬас!епиш !йегтоаи!о!горй1сит, ЕксйепсЫа сой, На1оЬас!егшт и т.д.), эукариот, млекопитающих, грибов, дрожжей, архебактерий, эубактерий, растений, насекомых, простейших и т.д. Кроме того, рекомбинантные тРНК необязательно аминоацилированы не кодируемыми в природе аминокислотами, где не кодируемая в природе аминокислота является биосинтезированной ш у1уо или естественным путем либо в результате генетической манипуляции. Не кодируемую в природе аминокислоту необязательно добавляют к ростовой среде, по меньшей мере, для первого или второго организма.

В одном аспекте селектирование (включая, без ограничения, негативное селектирование) или скрининг библиотеки в поисках (необязательно мутантных) тРНК, которые аминоацилированы аминоацилтРНК синтетазой (стадия (Ь)) включает введение гена токсического маркера, где ген токсического маркера включает по меньшей мере один из селекторных кодонов (или ген, который вызывает продуцирование токсического или статического агента или гена, незаменимого в организме, где такой маркерный ген включает по меньшей мере один селекторный кодон), и библиотеки (необязательно мутантных) тРНК во множество клеток второго организма; и селектирование выживших клеток, где выжившие клетки содержат пул (необязательно мутантных) тРНК, включающих по меньшей мере одну ортогональную тРНК или нефункциональную тРНК. Например, выжившие клетки можно выбрать, используя анализ сравнения отношения клеточной плотности.

В другом аспекте ген токсического маркера может включать два или более селекторных кодона. В других вариантах указанных способов ген токсического маркера представляет собой ген рибонуклеазыбарназы, где ген рибонуклеазы-барназы включает по меньшей мере один амбер-кодон. Необязательно, ген рибонуклеазы-барназы может включать два или более амбер-кодона.

В одном варианте селектирование или скрининг пула (необязательно мутантных) тРНК в поисках членов, которые аминоацилированы введенными ортогональными К8 (Ο-Κ8) могут включать введение маркерного гена селекции или скрининга, где ген позитивного маркера включает ген устойчивости к лекарствам (включая, без ограничения, ген β-лактамазы, включающий по меньшей мере один из селекторных кодонов, таких как по меньшей мере один амбер-стоп-кодон) или гена, существенного для организма, или гена, который приводит к детоксификации токсического агента, наряду с Ο-Κ8, и пулом (необязательно мутантных) тРНК, во множество клеток второго организма; и идентификацию выживших или скринированных клеток, выращиваемых в присутствии селекционного или скринингового агента, включая, без ограничения, антибиотик, тем самым обеспечивая пул клеток, обладающих по меньшей мере одной рекомбинантной тРНК, где по меньшей мере одна рекомбинантная тРНК аминоацилирована Ο-Κ8 и встраивает аминокислоту в продукт трансляции, кодируемый геном позитивного маркера, в ответ по меньшей мере на один селекторный кодон. В другом варианте варьируют концентрацию агента селекции и/или скрининга.

Предложены способы создания специфической О-тРНК/О-К8 пары. Способы включают (а) создание библиотеки мутантных тРНК, полученных по крайней мере из одной тРНК из первого организма; (Ь) негативную селекцию или скрининг библиотеки в поисках (необязательно мутантных) тРНК, которые аминоацилированы аминоацил-тРНК синтетазой (К8) из второго организма в отсутствие К8 из первого

- 64 019968 организма, тем самым обеспечивая пул (необязательно мутантных) тРНК; (с) селектирование или скрининг пула (необязательно мутантных) тРНК в поисках членов, которые аминоацилированы, введенными ортогональными В8 (Ο-Κ.8), тем самым обеспечивая по меньшей мере одну рекомбинантную О-тРНК. По крайней мере одна рекомбинантная О-тРНК распознает селекторный кодон и не эффективно распознается В8 из второго организма и преимущественно аминоацилируется Ο-Ρ8. Указанный способ также включает (ά) создание библиотеки (необязательно мутантных) В8, полученных по крайней мере из одной аминоацил-тРНК синтетазы (В8) из третьего организма; (е) селектирование или скрининг библиотеки мутантных В8 из членов, которые предпочтительно аминоацилируют по меньшей мере одну рекомбинантную О-тРНК в присутствии не кодируемой в природе аминокислоты и природной аминокислоты, тем самым обеспечивая пул активных (необязательно мутантных) В8; и (ί) негативное селектирование или скрининг пула в поисках активных (необязательно мутантных) В8, которые преимущественно аминоацилируют по меньшей мере одну рекомбинантную О-тРНК в отсутствие не кодируемой в природе аминокислоты, тем самым обеспечивая по меньшей мере одну специфическую пару О-тРНКЮ-В8, где по меньшей мере одна специфическая пара О-тРНКЮ-В8 включает по меньшей мере одну рекомбинантную Ο-Κ.8, которая специфична для не кодируемой в природе аминокислоты, и по меньшей мере одну рекомбинантную О-тРНК. Включены специфические пары О-тРНКЮ-В8, полученные указанными способами. Например, специфические пары О-тРНКЮ-В8 могут включать, включая, без ограничения, пары тиΐ-РНК-Τу^-тиΐΤу^В8, такие как пара тиΐ-РНК-Τу^-88υΤу^В8, пара ти1-РНК-Ьеи-ти1ЬеиВ8, пара ти!РНК-Τй^-тиΐΤй^В8, пара ти1-РНК-С1и-ти1С1иВ8 или т.п. Кроме того, такие методы включают случаи, когда первый и третий организмы одинаковы (включая, без ограничения, МеЙипюсоссщ )зппз5сЫ1).

Способы селектирования пар ортогональных тРНК-тРНК синтетаз для использования в ίη у1уо трансляционной системе второго организма также включены в настоящее изобретение. Указанные способы включают введение маркерного гена, тРНК и аминоацил-тРНК синтетазы (В8), выделенных или полученных из первого организма, в первый набор клеток из второго организма; введение маркерного гена и тРНК в дублирующий набор клеток из второго организма и селекцию выживших клеток в первом наборе, которые не смогли выжить в наборе дубликатных клеток, или скрининг по клеткам, демонстрирующим специфическую реакцию на скрининг, которые не проявили такую реакцию в наборе дубликатных клеток, где первый набор и набор дубликатных клеток выращивают в присутствии селекцонного или скринингового агента, где выжившие или скринированные клетки включают пары ортогональных тРНКтРНК синтетаз для использования в ίη у1уо трансляционной системе второго организма. В одном варианте сравнение или селектирование либо скрининг включает ίη у1уо комплементационный анализ. Концентрации селекционного или скринингового агентов могут меняться.

Организмы настоящего изобретения включают различные организмы и различные комбинации. Например, первый и второй организмы указанных способов настоящего изобретения могут быть одинаковыми или различными. В одном варианте организмы являются необязательно прокариотными организмами, включая, без ограничения, Μеΐйаηοсοсси8 )зппз5сЫ1, Ме^^Ьа^егшт 1Негтоаи1о1горЫсит, На1оЬас1епит, Е^сНепсЫа сой, А. Γπ1βίάπ5, Р. Гштокик, Р. йопкокйй, А. регшх, Τ. ШегторЫйск или т.п. Альтернативно, организмы, необязательно, включают эукариотный организм, включая, без ограничения, растения (включая, без ограничения, сложные растения, такие как однодольные или двудольные), водоросли, простейшие, грибы (включая, без ограничения, дрожжи и т.д.), животных (включая, без ограничения, млекопитающих, насекомых, членистоногих и т.д.) или т.п. В другом варианте второй организм представляет собой прокариотный организм, включая, без ограничения, МеЙи-пюсоссщ Ме111а^Ьа^егшт 111егтози1о1гор1исит, Нз1оЬзс1епит, ЕхсНепсЫа сой, А. Γπ1βίάπ5, Нз1оЬзс1епит, Р. Гигюкик, Р. йопкокИй, А. регшх, Τ. 1йегторЫ1и8 или т.п. Альтернативно, второй организм может быть эукариотным организмом, включая, без ограничения, дрожжи, клетки животных, грибы, клетки млекопитающих или т.п. В различных вариантах первый и второй организмы отличаются.

VI. Положения неприродных аминокислот в полипептидах ЬС-С8Е.

В настоящем изобретении рассматривают встраивание одной или более из неприродных аминокислот в полипептиды ЬС-С8Е. Одну или более из неприродных аминокислот можно встроить в конкретное положение, которое не нарушает активности полипептида. Этого можно достичь, осуществляя консервативные замещения, включая, без ограничения, замещения гидрофобных аминокислот гидрофобными аминокислотами, объемных аминокислот объемными аминокислотами, гидрофильных аминокислот гидрофильными аминокислотами и/или встраивая неприродную аминокислоту в положение, которого не требуется для активности.

Можно использовать различные биохимические и структурные подходы для выбора нужных сайтов для замещения не кодируемой в природе аминокислотой в полипептиде ЬС-С8Е. Специалистам в данной области должно быть понятно, что любое положение полипептидной цепи пригодно для выбора для включения не кодируемой в природе аминокислоты и селекция может быть основана на рациональном дизайне или на случайной селекции для любой конкретно необходимой цели. Выбор необходимых сайтов может быть сделан для продуцирования ЬС-С8Е молекул, обладающих любыми желательными свойствами и активностями, включая, без ограничения, агонистическую, суперагонистическую, обратную агонистической, антагонистическую, молекул-модуляторов связывания рецепторов, модуляторов актив

- 65 019968 ности рецепторов, образования димеров или тримеров либо мультимеров, отсутствия изменения активности или свойств, сравнимых с природными молекулами, или манипулирования любыми физическими или химическими свойствами полипептида, такими как растворимость, агрегация или стабильность. Например, положения в полипептиде, требуемые для биологической активности полипептидов ЬС-С8Е, можно определить, используя анализ точечных мутаций, сканирование аланином, мутагенез насыщения и скрининг по биологической активности или методы сканирования гомологов, известные специалистам. Другие методы можно использовать для идентификации остатков для модификации полипептидов ЬСС8Е, которые включают, без ограничения, профилирование последовательности, селекцию библиотеки ротамеров, потенциалы пар остатков и рациональный дизайн, используя технологию автоматизации конструирования белков (см. патенты США 6188965; 6269312; 6403312; \У0 98/47089, которые включены в описание посредством ссылки). Остатки, которые являются критичными для биоактивности ЬСС8Е, остатки, которые связаны с фармацевтической стабильностью, эпитопы антител или остатки связывающие рецептор, можно подвергнуть мутации. В патентах США №№ 5580723; 5834250; 6013478; 6428954 и 6451561, которые включены в описание посредством ссылки, раскрыты методы систематического анализа структур и функций полипептидов, таких как ЬС-С8Е, путем идентификации активных доменов, которые влияют на активность полипептида веществом-мишенью. Исследования мутагенеза сканированием аланином С-С8Е раскрыты в Яе1бБаат-01коп РЕ. е! а1., ВюсйетШту (1996), 1и1. 16; 35(28): 9034-41, Υοипд И.С. е! а1., Рго!ет 8сЕ (1997), 1ип., 6(6):1228-36 и Ьау!оп е! а1. (1997), 1ВС, 272 (47):297352974]. Остатки, другие, чем те, которые идентифицированы, как критичные для биологической активности, мутагенезом сканирования аланином или его гомологами могут оказаться хорошими кандидатами на замещение не кодируемой в природе аминокислотой в зависимости от активности, которая желательна для полипептида. Альтернативно, сайты, идентифицированные как критичные для биологической активности, могут также быть хорошими кандидатами для замещения не кодируемой в природе аминокислотой, снова в зависимости от активности, которая желательна для полипептида. Другой альтернативой могут быть просто серийные замещения в каждом положении полипептидной цепи не кодируемой в природе аминокислотой и наблюдение за влиянием на активности полипептида. Специалисты в рассматриваемой области смогут легко понять, что любые средства, технологии или методы для выбора положения для замещения неприродной аминокислотой в любом полипептиде пригодны для использования в настоящем изобретении.

Структура и активность мутантов полипептидов ЬС-С8Е, которые содержат делеции, также можно исследовать для определения участков белка, которые, по-видимому, толерантны к замещению не кодируемой в природе аминокислотой. Аналогичным образом можно использовать протеазное расщепление и моноклональные антитела для идентификации участков ЬС-С8Е, которые ответственны за связывание его рецептора. Ьау!оп е! а1. (2001), 1ВС, 276 (39) 36779-36787 раскрывает исследования антитела с НСС8Е и его рецептором. После того как были удалены остатки, которые, по-видимому, нетолерантны к замещению не кодируемыми в природе аминокислотами, можно исследовать влияние предполагаемого замещения по каждому из оставшихся положений. Можно создать модели трехмерных кристаллических структур других членов семейства С8Е и С8Е рецепторов. Банк данных белковых структур (Рто!ет Иа!а Вапк) (РЭВ, доступный на \Уог1б \У1бе \УеЬ по адресу гскЬ.огд) представляет собой централизованную базу данных, содержащую данные о трехмерных структурах крупных молекул белков и нуклеиновых кислот. Можно создать модели для исследования вторичных и третичных структур полипептидов, если недоступны данные о трехмерных структурах. Результаты рентгеновских кристаллографических исследований и ЯМР структур 11С-С8Е доступны в банке данных белковых структур с РЭВ Ю'к: 1СИ9, 1РСЯ, 1ЯНС, 1СNС так же, как в патентах США № 5581476 и 5790421, которые включены в описание посредством ссылки. Таким образом, специалисты в данной области могут легко определить положения аминокислот, которые могут быть замещены не кодируемыми в природе аминокислотами.

В некоторых вариантах полипептиды ЬС-С8Е настоящего изобретения включают одну или более из неприродных аминокислот, расположенных в участке белка, который не разрушает структуру полипептида.

Примерами остатков встраивания не кодируемой в природе аминокислоты могут быть такие, которые исключены из потенциальных участков рецепторного связывания, они могут быть полностью или частично экспонированы растворителю, могут иметь минимальные или вовсе не иметь связывающих водородных взаимодействий с близлежащими остатками, могут быть минимально экспонированы близлежащим реакционноспособным остаткам, могут быть расположены на одной или более из экспонированных сторон, могут быть сайтом или сайтами, которые расположены рядом со вторым ЬС-С8Е, или другими молекулами или их частями, могут быть участками, которые чрезвычайно гибкие или структурно жесткие, как предсказано по данным трехмерной вторичной, третичной или четвертичной структуры ЬС-С8Е, связанного или не связанного с его рецептором, или присоединенного или неприсоединенного к другой биологически активной молекуле, или могут модулировать конформацию самого ЬС-С8Е или димера либо мультимера, включающего один или более из ЬС-С8Е, путем изменения гибкости или жесткости полной структуры при желании.

Специалисту в данной области должно быть понятно, что такие анализы ЬС-С8Е дают возможность

- 66 019968 определить, какие аминокислотные остатки экспонированы на поверхности по сравнению с аминокислотными остатками, которые находятся в глубине третичной структуры белка. Поэтому одним вариантом целей настоящего изобретения является замещение не кодируемой в природе аминокислотой аминокислоты, которая представляет собой экспонированный на поверхности остаток.

В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений в ЬС-С8Е: перед положением 1 (т.е. на №конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (т.е. на карбоксильном конце белка) и любых их комбинаций (8ЕО ΙΌ N0: 1 или соответствующих аминокислот в 8ЕО ΙΌ N0: 2 либо соответствующих аминокислот в другом полипептиде ЬС-С8Е).

В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включены в одно или более из следующих положений ЬС-С8Е: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173 и любую их комбинацию из 8ЕО ΙΌ N0: 1 или соответствующих аминокислот в 8ЕО ΙΌ N0: 2. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включены по одному или более из следующих положений ЬС-С8Е: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166 и любую их комбинацию (8Е0 ΙΌ N0: 1 или соответствующих аминокислот в 8Е0 ΙΌ N0: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в одно или более из следующих положений ЬС-С8Е: 3, 7, 62, 133, 166 и любых их комбинаций 8Е0 ΙΌ N0: 1 или соответствующие аминокислоты в 8Е0 ΙΌ N0: 2. В некоторых вариантах одну или более из не кодируемых в природе аминокислот включают по одному или более из следующих положений ЬС-С8Е: 62, 133 и их комбинаций (8Е0 ΙΌ N0: 1 или соответствующих аминокислот в 8Е0 Ш N0: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в положении 62 ЬС-С8Е (8Е0 ΙΌ N0: 1 или соответствующая аминокислота в 8Е0 ΙΌ N0: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот включена в положении 133 ЬС-С8Е (8Е0 ΙΌ N0: 1 или соответствующая аминокислота в 8Е0 ΙΌ N0: 2). В некоторых вариантах полипептид настоящего изобретения включает одно или более из замещений, добавлений или делеций природной аминокислоты. В некоторых вариантах одна или более из неприродных аминокислот встроены в лидерную или сигнальную последовательность, которая представляет собой N или С терминал в 8Е0 ΙΌ N0: 1, 2, или другой ЬС-С8Е последовательности. В некоторых вариантах одна или более не кодируемых в природе аминокислот встроены в одно или более из положений ЬС-С8Е (8Е0 ΙΌ N0: 1) и одна или более из не кодируемых в природе аминокислот или кислот не включает гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, фенилаланин, лейцин, триптофан, аланин, цистеин, аспарагины, валин, глицин, серин, глутамин, тирозин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, треонин или природные непротеогенные аминокислоты, такие как β-аланин, орнитин и т.д. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот встроены в одно или более из положений ЬС-С8Е (8Е0 ΙΌ N0: 2) и одна или более из не кодируемых в природе аминокислот или кислот не включает гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, фенилаланин, лейцин, триптофан, аланин, цистеин, аспарагины, валин, глицин, серин, глутамин, тирозин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, треонин или природных непротеогенных аминокислот, таких как β-аланин, орнитин и т.д. В некоторых вариантах аминокислота, встроенная в положении 133 8Е0 ΙΌ N0: 1 или в соответствующее положение в 8Е0 ΙΌ N0: 2, является аминокислотой, другой, нежели гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, фенилаланин, лейцин, триптофан, аланин, цистеин, аспарагины, валин, глицин, серин, глутамин, тирозин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, треонин, или природные непротеогенные аминокислоты, такие как β-аланин, орнитин и т.д.

В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот является рибосомально встроенной в одно или более из положений ЬС-С8Е (8Е0 ΙΌ N0: 1) и одна или более из не кодируемых в природе аминокислот или кислот не включает гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, фенилаланин, лейцин, триптофан, аланин, цистеин, аспарагины, валин, глицин, серин, глутамин, тирозин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, треонин, или природные непротеогенные аминокислоты, такие как β-аланин, орнитин и т.д. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот рибосомально встроена в одно или более из положений ЬС-С8Е (8Е0 ΙΌ N0: 2) и одна или более из не кодируемых в природе аминокислот или кислот не включает гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, фенилаланин, лейцин, триптофан, аланин, цистеин, аспарагины, валин, глицин, серин, глутамин, тирозин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, треонин, или природные непротеогенные аминокислоты, такие как β-аланин, орнитин и т.д. В некоторых вариантах аминокислота, рибосомально встроенная в положении 133 8Е0 ΙΌ N0: 1 или в соответствующем положении 8Е0 ΙΌ N0: 2, представляет собой аминокислоту, другую, нежели гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, фенилаланин, лейцин, трип

- 67 019968 тофан, аланин, цистеин, аспарагины, валин, глицин, серин, глутамин, тирозин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, треонин, или природные непротеогенные аминокислоты, такие как β-аланин, орнитин и т.д. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот встроена в одно или более из положений ЬС-С8Р (8ЕЦ ГО Ν0: 1), где одна или более из не кодируемых в природе аминокислот или кислот содержит (или содержат) функциональную группу или группы, которые не распознаются эндогенной Βδ. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот встроена в одно или более из положений ЬС-С8Р (8ЕЦ ГО Ν0: 2), где одна или более из не кодируемых в природе аминокислот или кислот содержит (или содержат) функциональную группу или группы, которые не распознаются эндогенной Βδ. В некоторых вариантах полипептид ЬС-С8Р настоящего изобретения содержит аминокислоту, встроенную в положении 133 δΕρ ГО Ν0: 1, или в соответствующем положении в δΕρ ГО Ν0: 2, где аминокислота содержит (или содержат) функциональную группу или группы, которые не распознаются эндогенной Βδ. В некоторых вариантах полипептид ЬС-СδР настоящего изобретения содержит пара-ацетилфенилаланин, встроенный в положении 133 δΕρ ГО Ν0: 1, или в соответствующем положении в δΕρ ГО Ν0: 2. В некоторых вариантах полипептид ЬС-СδР настоящего изобретения содержит пара-аминофенилаланин, встроенный в положении 133 δΕρ ГО Ν0: 1, или в соответствующем положении в δΕρ ГО Ν0: 2.

В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения: перед положением 1 (т.е. на Ν-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,

30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,

60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,

90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,

115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136,

137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158,

159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (т.е. на карбоксильном конце белка), и любую их комбинацию (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующих аминокислот в δΕρ ГО Ν0:

или соответствующих аминокислот в другом полипептиде ЬС-СδР).

В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173 и любые их комбинации (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующие аминокислоты в δΕρ ГО Ν0: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166 и любые их комбинации (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующие аминокислоты в δΕρ ГО Ν0: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 3, 7, 62, 133, 166 и любые их комбинации (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующие аминокислоты в δΕρ ГО Ν0: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения 62, 133 и их комбинации (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующие аминокислоты в δΕρ ГО Ν0: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в положении 62 связана с водорастворимым полимером (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующая аминокислота в δΕρ ГО Ν0: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в положении 133 связана с водорастворимым полимером (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующая аминокислота в δΕρ ГО Ν0: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в сигнальной или лидерной последовательности Ν- или Стерминальной для δΕρ ГО Ν0: 1, 2 или других ЬС-СδР последовательностей связана с водорастворимым полимером.

Исследование кристаллической структуры члена (членов) семейства ЬС-СδР или ЬС-СδР и его взаимодействия с рецептором С-СδР может указать, какие именно аминокислотные остатки имеют боковые цепи, которые полностью или частично доступны для растворителя. Боковая цепь не кодируемой в природе аминокислоты в указанных положениях может выделиться с поверхности белка и перейти в растворитель.

Широкий круг не кодируемых в природе аминокислот может быть заместителем для или может быть встроен в конкретное положение в полипептиде ЬС-СδР. Обычно конкретную не кодируемую в природе аминокислоту выбирают для встраивания на основании изучения трехмерной кристаллической структуры ЬС-СδР полипептиад или других членов семейства С-СδР с его рецептором, причем предпочтение отдается консервативным замещениям (т.е. арилсодержащим не кодируемым в природе аминокислотам, таким как п-ацетилфенилаланин или О-пропаргилтирозин, замещающим Рйе, Туг или Тгр), и используют специфические реакции для конъюгирования молекулы, которую необходимо ввести в полипептид ЬС-СδР (например, включить 4-азидофенилаланин, если необходимо осуществить [3+2] циклоприсоединение Хьюсгена с водорастворимым полимером, содержащим алкиновую молекулу, или образование амидной связи с водорастворимым полимером, который содержит ариловый сложный эфир, который, в свою очередь, включает фосфиновую молекулу).

- 68 019968

В одном варианте указанный способ дополнительно включает встраивание в белок неприродной аминокислоты, где неприродная аминокислота включает первую реакционноспособную группу; и осуществление контактирования белка с молекулой (включая, без ограничения, гидроксиалкилкрахмал (НА8), гидроксиэтилкрахмал (НЕ8), метку, краситель, полимер, водорастворимый полимер, производное полиэтиленгликоля, фотосшивающий линкер, радионуклид, цитотоксическое соединение, лекарство, метку аффинности, метку фотоаффинности, реакционноспособное соединение, смолу, второй белок или полипептид или аналог полипептида, антитело или фрагмент антитела, металлохелатор, кофактор, жирную кислоту, углевод, полинуклеотид, ДНК, РНК, антисмысловой полинуклеотид, сахарид, водорастворимый дендример, циклодекстрин, ингибиторную аминокислоту, биоматериал, наночастицы, спиновую метку, флуорофор, металлсодержащую молекулу, радиоактивную молекулу, новую функциональную группу, группу, которая ковалентно или нековалентно взаимодействует с другими молекулами, фотостареющую молекулу, молекулу, возбуждаемую актиничной радиацией, фотоизомеризуемую молекулу, биотин, производное биотина, аналог биотина, молекулу, включающую тяжелый атом, химически отщепляемую группу, фотоотщепляемую группу, удлиненную боковую цепь, сахар, связанный с углеродом, окислительно-воссановительный агент, аминотиокислоту, токсическую молекулу, изотопномеченую молекулу, биофизический зонд, фосфоресцентную группу, хемилюминесцентную группу, электроноплотную группу, магнитную группу, интеркалирующую группу, хромофор, агент переноса энергии, биологически активный агент, детектируемую метку, малую молекулу, наночастицы, нанотрансмиттер, радионуклеотид, радиотрансмиттер, агент захвата нейтрона или любую комбинацию вышеперечисленных или других необходимых соединений или веществ), которые включают вторую реакционноспособную группу. Первая реакционноспособная группа реагирует со второй реакционноспособной группой, для присоединения молекулы к неприродной аминокислоте в результате [3+2] циклоприсоединения. В одном варианте первая реакционноспособная группа представляет собой алкинильную молекулу или азидомолекулу и вторая реакционноспособная группа представляет собой азидомолекулу или алкинильную молекулу. Например, первая реакционноспособная группа представляет собой алкинильную молекулу (включая, без ограничения, в неприродной аминокислоте п-пропаргилоксифенилаланин) и вторая реакционноспособная группа представляет собой азидомолекулу. В другом примере первая реакционноспособная группа представляет собой азидомолекулу (включая, без ограничения, в неприродной аминокислоте п-азидо-Ь-фенилаланин) и вторая реакционноспособная группа представляет собой алкинильную молекулу.

В некоторых случаях замещение (замещения) не кодируемой в природе аминокислотой могут объединяться с другими добавлениями, замещениями или делециями внутри полипептида ЬС-С8Е для воздействия на другие биологические характеристики полипептида ЬС-С8Е. В некоторых случаях другие добавления, замещения или делеции могут повысить стабильность (включая, без ограничения, устойчивость к протеолитическому расщеплению) полипептида ЬС-С8Е или могут повысить аффинность полипептида ЬС-С8Е в отношении его рецептора. В некоторых случаях другие добавления, замещения или делеции могут повысить фармацевтическую стабильность полипептида ЬС-С8Е. В некоторых случаях другие добавления, замещения или делеции могут повысить биологическую активность полипептида ЬСС8Е. В некоторых случаях другие добавления, замещения или делеции могут повысить растворимость (включая, без ограничения, будучи экспрессированы в Е.со11 или другие клетки-хозяева) полипептида ЬС-С8Е. В некоторых вариантах добавления, замещения или делеции могут повысить растворимость полипептида ЬС-С8Е после экспрессии в Е. со11 или в других рекомбинантных клетках-хозяевах. В некоторых вариантах, таким образом, выбирают сайты для замещения кодируемой в природе или неприродной аминокислотой в добавлении к другим сайтам для встраивания неприродной аминокислоты, чтобы это привело к повышению растворимости полипептида после экспрессии в Е. сой или в других рекомбинантных клетках-хозяевах. В некоторых вариантах полипептиды ЬС-С8Е включают другие добавления, замещения или делеции, которые модулируют сродство к рецептору, связывание белков или ассоциированных лигандов, модулируют трансдукцию сигнала после связывания с рецептором, модулируют циркуляционное время полужизни, модулируют выделение или биодоступность, облегчают очистку или улучшают или изменяют конкретный способ введения. В некоторых вариантах полипептиды ЬС-С8Е включают добавления, замещения или делеции, которые повышают сродство варианта ЬС-С8Е к его рецептору. Аналогично, полипептиды ЬС-С8Е могут включать химические или ферментные последовательности расщепления, протеазные последовательности расщепления, реакционноспособные группы, домены, связывающие антитела (включая, без ограничения, ЕЬАС или ро1у-Н1к) или другие последовательности на основе аффинности (включая, без ограничения, ЕЬАС, поли-Н18, С8Т и т.д.) или связанные молекулы (включая, без ограничения, биотин), которые улучшают детектирование (включая, без ограничения, СЕР), очистку, транспорт через ткани или клеточные мембраны, выделение пролекарств или активацию, уменьшение размера ЬС-С8Е или другие характеристики полипептида.

В некоторых вариантах замещение не кодируемой в природе аминокислотой приводит к созданию антагониста ЬС-С8Е. В некоторых вариантах не кодируемую в природе аминокислоту замещают или добавляют в участок, участвующий в рецепторном связывании. В некоторых вариантах антагонисты ЬСС8Е включают по меньшей мере одно замещение, которое заставляет ЬС-С8Е функционировать как ан

- 69 019968 тагонист. В некоторых вариантах ЬС-С8Е антагонист включает не кодируемую в природе аминокислоту, связанную с водорастворимым полимером, который присутствует в участке рецепторного связывания молекулы ЬС-С8Е.

В некоторых вариантах замещение не кодируемой в природе аминокислотой приводит к созданию антагониста ЬС-С8Е. В некоторых вариантах антагонист ЬС-С8Е включает не кодируемую в природе аминокислоту, связанную с водорастворимым полимером, который присутствует в участке рецепторного связывания молекулы ЬС-С8Е.

В некоторых случаях 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислоты замещены одной или более из не кодируемых в природе аминокислот. В некоторых случаях полипептид ЬС-С8Е включает далее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более из замещений природной аминокислоты одной или более из не кодируемых в природе аминокислот. Например, в некоторых вариантах один или более из остатков в ЬС-С8Е замещен одной или более из не кодируемых в природе аминокислот. В некоторых случаях один или более из не кодируемых в природе остатков связан с одним или более из низкомолекулярных линейных или разветвленных ПЭГ, тем самым повышая аффинность связывания и время полужизни по сравнению с остатками, присоединенными к одному высокомолекулярному ПЭГ.

В некоторых вариантах вплоть до двух из следующих остатков ЬС-С8Е замещены одной или более из не кодируемых в природе аминокислот.

VII. Экспрессия в не эукариоты и в эукариоты.

Для достижения высоких уровней экспрессии клонированных полинуклеотидов ЬС-С8Е обычно субклонируют полинуклеотиды, кодирующие полипептид ЬС-С8Е настоящего изобретения в вектор экспрессии, который содержит сильный промотор для управления транскрипцией, терминатор транскрипции/трансляции и, если для кодирующей белок аминокислоты, сайт связывания рибосомы для инициирования трансляции. Подходящие бактериальные промоторы известны специалистам в данной области и раскрыты, например, у 8атЬгоок е! а1. и ΑикиЬе1 е! а1.

Бактериальные экспрессионные системы для экспрессии полипептидов ЬС-С8Е настоящего изобретения доступны в, включая, без ограничения, Е. сой, ВасШик кр., Ркеиботоиак йиогексеик, Ркеиботоиак аегидтока, Ркеиботоиак рибба и 8а1тоие11а (Рака е! а1., Сеие, 22:229-235 (1983); МокЬасй е! а1., №1иге, 302:543-545 (1983)). Наборы для таких экспрессионных систем коммерчески доступны. Эукариотные экспрессионные системы для клеток млекопитающих, дрожжей и насекомых, хорошо известны специалистам в данной области и также коммерчески доступны. В тех случаях, когда ортогональные тРНК и аминоацил-тРНК синтетазы (описанные выше) используют для экспрессии полипептидов ЬС-С8Е настоящего изобретения, клетки-хозяева для экспрессии выбирают на основании их способности использовать ортогональные компоненты. Примеры клеток-хозяев включают грам-положительные бактерии (включая, без ограничения, В. Ьгеу1к, В. киЬййк или 8йерютусек) и грам-отрицательные бактерии (Е. сой, Ркеиботоиак Диогексеик, Ркеиботоиак аегидтока, Ркеиботоиак риПба), а также дрожжи и другие эукариотные клетки. Клетки, включающие О-тРНК/О-В8 пары, можно использовать, как раскрыто в данном описании.

Эукариотные клетки-хозяева или не эукариотные клетки-хозяева настоящего изобретения обеспечивают способность синтеза белков, которые включают неприродные аминокислоты в больших количествах. В одном аспекте композиция необязательно включает, без ограничения, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 500 мкг, по меньшей мере 1, по меньшей мере 10, по меньшей мере 100 мг, по меньшей мере 1 г или больше белка, который включает неприродную аминокислоту, или такое количество, которое можно обеспечить, используя ш уко способы получения белка (здесь приводятся подробности получения и очистки рекомбинантных белков). В другом аспекте белок необязательно присутствует в композиции в концентрации, включая, без ограничения, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 500 мкг на 1 л, по меньшей мере 1 или по меньшей мере 10 мг белка на 1 л или больше, включая, без ограничения, в клеточном лизате, буфере, фармацевтическом буфере или в других жидких суспензиях (включая, без ограничения, в объеме, включая, без ограничения, от около 1 нл до около 100 л или больше). Получение больших количеств (включая, без ограничения, больших, чем обычно, возможно с использованием других методов, включая, без ограничения, 1и уйто трансляцию) белка в эукариотных клетках, включающих по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, составляет отличительную особенность настоящего изобретения.

Эукариотные клетки-хозяева или не эукариотные клетки-хозяева настоящего изобретения обеспечивают способность к биосинтезу белков, которые включают неприродные аминокислоты в больших полезных количествах. Например, белки, включающие неприродную аминокислоту, можно получать в концентрациях, включая, без ограничения, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250 или по меньшей мере 500, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 мг/л, 1, 5, 10 г/л или

- 70 019968 больше белка в клеточном экстракте, в клеточном лизате, в культуральной среде, в буфере и/или т.п.

Ряд векторов, пригодных для экспрессии ЬС-С8Р, коммерчески доступен. Подходящие экспрессионные векторы для эукариотных хозяев включают, без ограничения, векторы, включающие экспрессионные контрольные последовательности из 8ν40, бычьего папилломовируса, аденовируса и цитомегаловируса. Такие векторы включают рСОНА3.1(+)/Нуд ([пу|1го8еп, Саг1кЬай, СайГ., И8А) и рС'Ч-пео (8ййадепе, Ьа ЧоНа, СайГ., И8А). Можно также использовать бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Е. сой, включая рВК322, рЕТ3а и рЕТ12а, плазмиды из широкого круга хозяев, такие как КР4, фаговые ДНК, например многочисленные производные фага-лямбда, например НМ989, и другие ДНК фаги, такие как М13 и нитчатые одноцепочечные ДНК фаги. 2-мк плазмиду и ее производные, РОТ1 вектор (патент США № 4931373, который включен в описание посредством ссылки), ρΣ8Ο37 вектор, описанный в (Ο1<ке1к, Апп. №\ν Υо^к Асей. 8ск 782, 202 207, 1996) и рРК'Х А, В или С (Iпν^ί^одеп), можно использовать с дрожжевыми клетками-хозяевами. Для клеток насекомых указанные векторы включают, без ограничения, ρνΗ941, рВС311 (С'Йе е( а1., койайоп оГ (Не Воуте апй Нитап Сепек Гог Мийейап IпЬ^Ь^йпд 8иЬк(апсе апй Ехргеккюп оГ (Ье Нитап Сей Ш Ашта1 Се11к, Се11, 45, р. 685 98 (1986), рВ1иеЬас 4.5 и рМе1Ьас Цпуйгодеп, Саг1кЬай, СА).

Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид ЬС-С8Р, может включать или не включать последовательность, которая кодирует сигнальный пептид. Сигнальный пептид присутствует, если полипептид должен секретироваться из клетки, в которой он экспрессируется. Таким сигнальным пептидом может быть любая последовательность. Сигнальный пептид может быть прокариотным или эукариотным. Со1ота, М. (1992) к Iтт. Мейюйк, 152:89 104) описывает сигнальный пептид для использования в клетках млекопитающих (сигнальный пептид мышиной Ц-к легкой цепи). Другие сигнальные пептиды включают, без ограничения, сигнальный пептид α-фактора из 8. сегеуШае (патент США № 4870008, который включен в описание посредством ссылки), сигнальный пептид амилазы слюнной железы мыши (О. НадепЬисЫе е( а1., №11иге 289, 1981, р. 643-646), модифицированный сигнальный пептид карбоксипептидазы (Ь.А. νηί1κ е( а1., Се11 48, 1987, р. 887-897), ВАК1 сигнальный пептид дрожжей (νΟ 87/02670, который включен в описание посредством ссылки) и сигнальный пептид ^АР3) аспартикпротеазы 3 дрожжей (сГ. М. Еде1-Мйай е( а1., Υеакΐ 6, 1990, р. 127-137).

Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих хорошо известны специалистам в данной области. Такие клетки-хозяева могут быть клетками яичников китайского хомяка (СНО) (например, СНОК1; АТСС ССЬ-61), клетками зеленых обезьян (ΧΌ8) (например, ОД8 1 (АТСС СКЬ-1650), ТО8 7 (АТСС СКЬ-1651)); мышиными клетками (например, Ν8/Ο), клеточными линиями почек детеныша хомяка (ВНК) (например, АТСС СКЬ-1632 или АТСС ССЬ-10) и человеческими клетками (например, НЕК 293 (АТСС СКЬ-1573)), также как растительными клетками в культуре тканей. Указанные клеточные линии, также как и другие, доступны из общественных депозитариев, таких как Атепсап Туре СиЙиге Сойейюп, КоскуШе, Мй. Для достижения улучшенного гликозилирования полипептида ЬС-С8Р клеткихозяева млекопитающего можно модифицировать для экспрессии сиалилтрансферазы, например 1,6сиалилтрансферазы, например, как раскрыто в патенте США № 5047335, который включен в описание посредством ссылки.

Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают, без ограничения, кальцийфосфат-опосредованную трансфекцию, электропорацию, ОЕАЕ-декстран-опосредованную трансфекцию, липосомами опосредованную трансфекцию, вирусные векторы и методы трансфекции, раскрытые в Ь1Ге ТесЬпо1од1ек Ый, Рай1еу, ИК с использованием липофектамина 2000 и КосЬе О1адпокНск Согрогайоп Ш^а^рокк, И8А с использованием РиСЕНЕ 6. Указанные методы хорошо известны специалистам в данной области и раскрыты у АикЬе1 е( а1. (ейк.), 1996, Сиггей Рго(осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойп \νί^ν & 8опк, №\ν Υо^к. И8А. Культивирование клеток млекопитающих можно осуществить в соответствии с общепринятыми способами, например, как раскрыто в (Ашта1 Се11 Вю1ес11по1оду, Ме(Ьойк апй Рго1осо1к, Еййей Ьу №де1 •кпктк, 1999, Нитап Ргекк йю. ТоЮма, Ν.Ι, И8А и Наткоп Макк, и Кае кР., Сепега1 МеШойк оГ Се11 СиЙиге, СатЬпйде Ийуегкйу Ргекк, 1997).

I. Экспрессионные системы, культивирование и выделение.

Полипептиды ЬС-С8Р можно экспрессировать в любых подходящих экспрессионных системах, включая, например, дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих и бактерии. Далее приводится описание примеров экспрессионных систем.

Дрожжи.

Термин дрожжи включает любые различные дрожжи, способные к экспрессии гена, кодирующего полипептид ЬС-С8Р. Такие дрожжи включают, без ограничения, Аксокрогодепоик уеак(к (ЕпйотусеШек), Ваыйюкрогодепоик уеак(к и дрожжи, принадлежащие к группе Рипд1 1трегГесй (В1ак1отусе1ек). Аксокрогодепоик уеак(к подразделяются на два семейства, 8регторЙЬогасеае и 8ассЬаготусейсеае. Последнее состоит из четырех субсемейств, 8с1пхокасс11аготусо1йеае (например, рода 8сЙ7окассйаготусек), №1йкойо1йеае, Е1ротусо1йеае и 8ассйаготусо1йеае (например, родов РюЫа, К1иууеготусек и 8ассйаготусек). Ваыйюкрогодепоик дрожжи включают рода Ееисокроййшт, КЬойокропйшт, 8ропйюЬо1ик, РйоЬаыйшт, и Р11оЬак1й1е11а. Дрожжи, принадлежащие к группе Рипд1 (В1ак1отусе1ек), подразделяются на

- 71 019968 два семейства, 8рогоЬо1отусе!асеае (например, род 8рогоЬо1отусек и Ви11ега) и Сгур!ососсасеае (например, род Сапб1ба).

Особый интерес для использования в рамках настоящего изобретения представляют виды из родов Р1сЫа, К1иууеготусек, 8ассйаготусек, 8сЫ/окассйаготусек, Напкетйа, Тоги1орк1к и Сапб1ба, включая, без ограничения, Р. ракЮпк, Р. диШейтопби, 8. сегеуШае, 8. саг1кЬегдепк1к, 8. б1ак1айсик, 8. боид1аки, 8. к1иууеп, 8, погЬепк1к, 8. оу1Гогш1к, К. 1асйк, К. ГгадШк, С. а1Ысапк, С. та1!ока и Н. ро1утогрйа.

Проблема выбора подходящих дрожжей для экспрессии полипептидов ЬС-С8Р хорошо известна специалистам в данной области. При выборе дрожжей-хозяев для экспрессии подходящие хозяева могут включать те, которые, как показано, обладают, например, высокой секреционной способностью, низкой протеолитической активностью, хорошей секреционной способностью, хорошей производительностью растворимого белка и общей устойчивостью. Дрожжи обычно доступны из различных источников, включая, без ограничения, Υеак! Сепейс 8!оск Сеп!ег, Перайтеп! оГ Вюрйукюк апб Меб1са1 Рйукюк, Ьшуегкйу оГ СайГогша (Вегке1еу, СА) и Атепсап Туре Си1!иге Сойесйоп (АТСС) (Мапаккак, VΑ).

Термины дрожжи-хозяева или дрожжевые клетки-хозяева включают дрожжи, которые могут быть или были использованы как реципиенты для рекомбинантных векторов или других транспортных ДНК. Термин включает потомство оригинальных дрожжевых клеток-хозяев, в которые ввели рекомбинантные векторы или другие транспортные ДНК. Следует понимать, что потомство одной родительской клетки может необязательно быть полностью идентичным с точки зрения морфологии или генома либо комплемента полной ДНК с первоначальным родителем из-за случайной или преднамеренной мутации. Потомки родительской клетки, которые достаточно сходны с родителем, чтобы быть охарактеризованными соответствующими свойствами, такими как присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ЬС-С8Р, включены в потомство в соответствии с указанным определением.

Векторы экспрессии и трансформации, включая экстрахромосомальные репликоны или интегрирующие векторы, были созданы для трансформации во многих дрожжевых хозяевах. Например, экспрессионные векторы были созданы для 8. сегеуШае (81когкк1 е! а1., СΕNΕΤIС8 (1989), 122:19; 1!о е! а1., 1. ВАСТЕКЮЬ. (1983), 153: 163; Нтпеп е! а1., РКСС. КАТЬ. АСАЬ. 8С1. и8А (1978), 75:1929); С. а1Шсапк (Кий/ е! а1., \Ю1.. СЕЬЬ. ВЮЬ. (1986) 6:142); С. та1!ока (Кип/е е! а1., Ь ВА81С МК^ВЮ^ (1985), 25: 141); Н. ро1утогрйа (С1еекоп е! а1., Ь СЕК МIСКΟΒIΟ^. (1986), 132:3459; Коддепкатр е! а1., \Ю1.. СЕКЕТ1С8 и СЕ^М1С8 (1986), 202:302); К. ГгадШк (Пак е! а1., Ь ВАСТЕКЮЬ. (1984), 158:1165); К. 1асйк (Бе Ьоиуепсоий е! а1., Ь ВАСТЕКЮЬ. (1983), 154:737; Vаη беп Вегд е! а1., ΒЮΤΕСНNΟ^ΟСΥ (ΝΥ) (1990), 8:135); Р. диШейтопби (Кип/е е! а1., I. ВА81С МIСКΟΒЮ^. (1985), 25:141); Р. ракЮпк (патенты США №№ 5324639; 4929555 и 4837148; Сгедд е! а1., \Ю1.. СЕЬЬ. ВЮЬ. (1985), 5:3376); 8с1и/окасс11аготусек ротЬе (Веасй е! а1., NΑΤиКΕ (1982), 300:706) и Υ. йро1уйса; А. шби1апк (Ва11апсе е! а1., ВЮСНЕМ. ΒЮΡНΥ8. КЕ8. ТОММиК (1983), 112:284-89; ТйЬигп е! а1., Сепе (1983) 26:205-221 и Υе1!оη е! а1., Р1ЮС. КАТЬ. АСАЬ. 8С1. и8А (1984), 81: 1470-74); А. шдег (Ке11у и Нупек, ΕМΒΟ Ь (1985), 4:475-479); Т. геек1а (ЕР 0244234) и нитчатых грибов, таких как, например, №игокрога, РешсШшт, То1урос1абшт (\νΟ 91/00357), причем все они включены в описание посредством ссылки.

Контрольные последовательности для дрожжевых векторов хорошо известны специалистам в данной области и включают, без ограничения, промоторные участки из генов, такие как алкогольдегидрогеназа (АЭН) (ЕР 0284044); энолаза; глюкокиназа; глюкозо-6-фосфат-изомераза; глицеральдегид3-фосфат-дегидрогеназа (САР или САРЬН); гексокиназа; фосфофруктокиназа; 3-фосфоглицерат мутаза и пируваткиназа (РуК) (ЕР 0329203). Ген дрожжей РНО5, кодирующий кислую фосфатазу, также может обеспечить промоторные последовательности (М1уапойага е! а1., ΡКΟС. КАТЬ. АСАЭ. 8С1. и8А (1983), 80:1). Другие подходящие промоторные последовательности для использования с дрожжевыми хозяевами могут включать промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (Нй/етап е! а1., 1. ВЮЬ. СНЕМ. (1980), 255: 12073) и другие гликолитические ферменты, такие как пируват декарбоксилаза, триосефосфат изомераза и фосфоглюкозо изомераза (Но11апб е! а1., ΒЮСНΕМI8ΤКΥ (1978), 17:4900; Некк е! а1., I. Α^V. ΕNΖΥМΕ КЕС. (1969), 7: 149). Вводимые дрожжевые промоторы обладают дополнительным преимуществом транскрипции, контролируемой условиями роста, могут включать промоторные участки для алкогольдегидрогеназы 2; изоцитохрома С; кислой фосфатазы; металлотионеина; глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы; деструктивных ферментов, связанных с метаболизмом азота; и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для использования в дрожжевой экспрессии раскрыты еще в ЕР 0073657.

Дрожжевые энхансеры также можно использовать с дрожжевыми промоторами. Кроме того, синтетические промоторы также могут функционировать как дрожжевые промоторы. Например, расположенные в прямом направлении активирующие последовательности (иА8) дрожжевого промотора могут быть соединены с участком активации транскрипции другого дрожжевого промотора, создавая синтетический гибридный промотор. Примеры таких гибридных промоторов включают АПН регуляторную последовательность, связанную с участком активации транскрипции САР; см. патенты США №№ 4880734 и 4876197, которые включены в описание посредством ссылки. Другие примеры гибридных промоторов включают промоторы, которые состоят из регуляторных последовательностей АПН2, САЬ4, САЬ10, или РНО5 генов, объединенных с участками активации транскрипции гена гликолитического фермента, та

- 72 019968 кими как САР или РуК; см. ЕР 0164556. Кроме того, дрожжевой промотор может включать природные промоторы не дрожжевого происхождения, которые обладают способностью связывать полимеразу дрожжевой РНК и инициировать транскрипцию.

Другие контрольные элементы, которые могут включать часть экспрессионных векторов дрожжей, включают терминаторы, например, из генов САРБН или элоназы (Но11апб еЧ а1., Е ВЮЬ. СНЕМ. (1981), 256:1385). Кроме того, источник репликации из 2 μ плазмидного источника пригоден для дрожжей. Подходящим селекционным геном для использования в дрожжах является Чгр1 ген, присутствующий в дрожжевой плазмиде; см. Тзсйитрег еЧ а1., Сепе (1980), 10: 157; КЧпдзтап еЧ а1., Сепе (1979), 7: 141. Чгр1 ген обеспечивает селекционный маркер для мутантного штамма дрожжей, лишенного способности расти в триптофане. Аналогично, Ьеи2-дефицитные штаммы дрожжей (АТСС 20,622 или 38,626) дополнены известными плазмидами, содержащими Ьеи2 ген.

Методы встраивания экзогенной ДНК в дрожжи-хозяева хорошо известны специалистам в данной области и обычно включают, без ограничения, или трансформацию сферопластов либо использование интактных дрожжевых клеток-хозяев, обработанных щелочными катионами. Например, трансформацию дрожжей можно вести в соответствии со способом, раскрытым НзЧао еЧ а1., РЯОС. NΑТ^. АСАБ. 8СЕ И8А (1979), 76:3829 и Vаη 8о1Чпдеп еЧ а1. I. ВАСТ. (1977), 130:946. Однако можно использовать другие методы для встраивания ДНК в клетки, такие как ядерная инъекция, электропорация, или слияние протопластов, как раскрыто в 8АМВЯООК ЕТ АЬ., МОЬЕСиЬАК СЕО\1\С: А ЬАВ. МАМ/АЕ (2001). Дрожжевые клетки-хозяева можно затем культивировать, используя стандартные методики, хорошо известные специалистам в данной области.

Другие способы экспрессии гетерологичных белков в дрожжевых клетках-хозяевах хорошо известны специалистам в данной области; см. патентную публикацию США № 20020055169, патенты США Νθδ. 6361969; 6312923; 6,183,985; 6083723; 6017731; 5674706; 5629203; 5602034 и 5089398; пересмотренные патенты США Νϋ8. ЯЕ37343 и ЯЕ35/749; РСТ опубликованные патентные публикации АО 99/07862; АО 98/37208 и АО 98/26080; европейские патентные заявки ЕР 0946736; ЕР 0732403; ЕР 0480480; АО 90/10277; ЕР 0340986; ЕР 0329203; ЕР 0324274 и ЕР 0164556; см. также СеШззеп еЧ а1., А№ ТОМЕ VΑN ЕЕЕЕАЕХ11ОЕК (1992), 62(1-2): 79-93; Яотапоз еЧ а1., ΥеаЧз (1992) 8(6): 423-488; Соеббе1, МЕТНОБ8 ΕΝ ΕNΖΥΜО^ОСΥ (1990), 185: 3-7, которые включены в описание посредством ссылки.

Штаммы дрожжей-хозяев можно выращивать в ферментерах во время стадии амплификации, используя стандартные способы периодической ферментации с подпиткой, хорошо известные специалистам в данной области. Методы ферментации можно адаптировать с учетом различий в схемах использования углерода конкретными дрожжами-хозяевами или в типах контроля экспрессии. Например, ферментация 8ассйаготусез дрожжей-хозяев может потребовать только глюкозного питания, комплексного источника азота (например, казеинового гидролизата) и множества витаминных добавок. Напротив, метилотрофные дрожжи Р. разЧогЧз могут требовать глицерин, метанол и следовые количества минерального питания, но только простые аммонийные (азот) соли для оптимального роста и экспрессии; см., например, патент США № 5324639; ЕШой еЧ а1., I. РЯОТЕШ СНЕМ. (1990), 9:95 и ЕЧезсйко еЧ а1., ВЮТЕСН. ΒIОΕNС. (1987), 29:1113, которые включены в описание посредством ссылки.

Однако такие методы ферментации могут обладать некоторыми общими чертами независимо от используемых штаммов дрожжей-хозяев. Например, ограничивающее рост питательное вещество, обычно углерод, можно добавлять в ферментер во время фазы амплификации, чтобы обеспечить максимальный рост. Кроме того, в методах ферментации обычно используют ферментационную среду, содержащую адекватные количества углерода, азота, основных солей, фосфора и других минорных питательных веществ (витаминов, следовых количеств минералов и солей и т.д.). Примеры ферментационных сред, подходящих для использования с РЧсЫа, раскрыты в патентах США №№ 5324639 и 5231178, которые включены в описание посредством ссылки.

Клетки насекомых, инфицированные бакуловирусом.

Термины насекомое-хозяин или клетка-хозяин насекомого относятся к насекомым, которые могут быть или были использованы в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или других транспортных ДНК. Термин включает потомство исходной клетки-хозяина насекомого, которая была трансфектирована. Следует понимать, что потомство одной родительской клетки вовсе не обязательно будет полностью идентично морфологично или геномно или по полному ДНК комплементу исходной родительской клетке, из-за случайной или преднамеренной мутации. Потомство родительской клетки, которое обладает достаточным сходством с родительской клеткой, чтобы характеризоваться соответствующими свойствами, такими как присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ЬС-С8Е, включены в понятие потомство в соответствии с приведенным определением.

Способы селекции подходящих клеток насекомых для экспрессии полипептидов ЬС-С8Е хорошо известны специалистам в данной области. Некоторые виды насекомых хорошо описаны в литературе и коммерчески доступны, включая Аебез аедурб, ВотЬух топ, Бгозорбба те1аподазЧег, 8роборЧега ГгидЧрегба и ТгЧсйорЧизЧа пк При селекции клеток-хозяев для экспрессии подходящие хозяева могут включать те, которые, как показано, обладают, наряду с другими, хорошей секреционной способностью, низкой протеолитической активностью и общей устойчивостью. Обычно насекомые доступны из различных

- 73 019968 источников, включая, без ограничения, Пьес! Оепейс 8!оск Сеп!ег, Иерайтеп! о£ Вюркукюк и Меб1са1 Ркуыск, Ипуегкйу о£ СаШогша (Вегке1еу, СА) и в Атепсап Туре Си1!иге Со11ескоп (АТСС) (Мапаккак, \А).

Обычно компоненты экспрессионных систем насекомых, инфицированных бакуловирусом, включают вектор переноса, обычно бактериальную плазмиду, которая содержит как фрагмент бакуловирусного генома, так и обычный рестрикционный сайт для встраивания подлежащего экспрессии гетерологичного гена; дикого типа бакуловирус, последовательности которого гомологичны бакуловирусспецифическому фрагменту в векторе переноса (это обеспечивает гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в бакуловирусный геном); соответствующие клетки-хозяева и ростовую среду. Материалы, методы и методики, используемые при конструировании векторов, трансфектировании клеток, сборе бляшек, выращивании клеток в культуре и т.п., хорошо известны специалистам в данной области и, кроме того, доступны руководства, описывающего указанные методики.

После встраивания гетерологичного гена в вектор переноса указанный вектор и вирусный геном дикого типа трансфектируют в клетке-хозяине насекомого, где указанный вектор и вирусный геном рекомбинируют. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, и рекомбинантные бляшки идентифицируют и очищают. Материалы и методы создания экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого коммерчески доступны в наборе, например, от [пуЦгодеп Согр. (Саг1кЬаб, СА). Указанные методики обычно хорошо известны специалистам в данной области и полностью описаны в 8ИММЕЯ8 АЫО 8ΜIТН, ТЕХА8 АОЯЮТЬТиЯАЬ ЕХРЕЯЕМЕЭТ 8ТΑТIОN ВИБЬЕТШ № 1555 (1987), который включен в описание посредством ссылки; см. также ШСНАКЭ8О^ 39 МЕТНОИ8 ΙΝ МОЬЕСИЬАК ВЮЬООΥ: ВАСО.СЛИЯЕЯ ЕХРЯЕ88ЮХ РЯОТОСОБ8 (1995); Аи8ИВЕЬ ЕТ АЬ., СИНЯЕМТ РЯОТОСОБ8 ΙΝ МОЬЕСИЬАК ВIО^ООΥ 16.9-16.11 (1994); КШ6 и РО8СМ., ТНЕ ВАСИЬО^Я^ 8Υ8ТЕΜ8: А ВАВО1Я\ТО1№ ОИГОЕ (1992) и О'ΚЕI^^Υ ЕТ АЬ., В.АСВ'ВСЛИВВА ЕXРЯЕ88IОN \ТСТОВ8: А ЬАВОЯΑТОЯΥ (1992).

Действительно, продуцирование различных гетерологичных белков с использованием экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого хорошо известно специалистам в данной области; см., например, патенты США №№ 6368825; 6342216;,338846; 6261805; 6245528, 6225060; 6183987; 6168932; 6126944; 6096304; 6013433; 5965393; 5939285; 5891676; 5871986; 5861279; 5858,368; 5843733; 5762939; 5753220; 560827; 5583023; 5571709; 5516657; 5290686; УО 02/06305; УО 01/90390; УО 01/27301; УО

01/05956; УО 00/55345; УО 00/20032; УО 99/51721; УО 99/45130; УО 99/31257; УО 99/10515; УО

99/09193; УО 97/26332; УО 96/29400; УО 96/25496; УО 96/06161; УО 95/20672; УО 93/03173; УО

92/16619; УО 92/02628; УО 92/01801; УО 90/14428; УО 90/10078; УО 90/02566; УО 90/02186; УО

90/01556; УО 89/01038; УО 89/01037; УО 88/07082, которые включены в описание посредством ссылки.

Векторы, которые можно использовать в экспрессионных системах бакуловирус/клетка насекомого, известны специалистам и включают, например, векторы экспрессии и переноса насекомых, полученные из бакуловируса Аи!одгаркаса1йогшса, вируса ядерного полиэдроза (ΑсХРV), который является хелпернезависимым вектором вирусной экспрессии. Вирусные экспрессионные векторы, полученные из такой системы, обычно используют сильный промотор вирусного гена полиэдрина для управления экспрессией гетерологичных генов; см. О'ЯеШу е! а1., В.АСВ'ВСЛИВВХ ЕXРЯЕ88IОN \ЕСТОЯ8: А ^ΑВОЯΑТОЯΥ ΜΑNυΑ^ (1992).

Прежде чем встраивать чужеродный ген в бакуловирусный геном, вышеописанные компоненты, включающие промотор, лидер (при желании), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность окончания транскрипции, обычно собирают в промежуточную конструкцию перемещения (вектор переноса). Промежуточные конструкции перемещения часто сохраняют в репликоне, таком как дополнительный хромосомальный элемент (например, плазмиды), способный стабильно сохраняться в хозяине, таком как бактерия. Такой репликон имеет репликационную систему, что позволяет ему сохраняться в подходящем хозяине для клонирования и амплификации. Более конкретно, плазмида может содержать сигнал полиаденилирования полиэдрина (МШег, ΑNХ. ЯЕ\. МГСЯОВЮЬ. (1988), 42: 177) и прокариотный ген устойчивости к ампициллину (амп) и источник репликации для селекции и размножения в Е. со11.

Одним обычно используемым вектором переноса для введения чужеродных генов в ΑсХРV является рАс373. Было сконструировано множество других векторов, хорошо известных специалистам в данной области, включая, например, р\Ь985, который изменяет стартовый кодон полиэдрина с АТО на АТТ и который встраивает ВатН сайт клонирования 32 пар оснований в прямом направлении от АТТ; см. Ьискоте апб 8иттегк, VIЯО^ООΥ, 170:31 (1989). Другие коммерчески доступные векторы включают, например, РВ1иеВас4.5N5-Н^к; рВ1иеВасН1к2; рМе1Вас; рВ1иеВас4.5 (Iην^!^одеη Согр., Саг1кЬаб, СА).

После встраивания гетерологичного гена вектор переноса и дикого типа бакуловирусный геном совместно трансфектируют в клетку-хозяина. Методы введения гетерологичной ДНК в нужный сайт в бакуловирусный вирус хорошо известны специалистам в данной области; см. 8ЬММЕЯ8 апб 8ΜIТН, ТЕХА8 АОЯЮТЬТИЯАЬ ЕХРЕШМЕЭТ 8ТΑТIОN ВИБЬЕТШ № 1555 (1987); 8тйк е! а1., МОЬ. СЕЬЬ. ВЮЬ. (1983), 3:2156; Ьискоте апб 8иттегк, VIЯО^ООΥ (1989) 170:31. Например, встраивание можно осуществить в ген, такой как ген полиэдрина, с помощью двойной кроссовер рекомбинации; встраивание

- 74 019968 можно также осуществить в сайт рестрикционного фермента, сконструированного в целевом бакуловирусном гене; см. М111ег е! а1., ВIОЕ88АΥ8 (1989), 11(4): 91.

Трансфекцию можно осуществить, используя электропорацию; см. ТЯОТТЕЯ апб УООБ, 39 МЕТНОБ8 ΙΝ МОЬЕСиЬЛЯ ВЮВОСУ (1995); Мапп и Ктд, I. СЕК У1ЯОВ. (1989), 70: 3501. Альтернативно, липосомы можно использовать для трансфектирования клеток насекомых рекомбинантным вектором экспрессии и бакуловирусом; см., например, ЫеЬтап е! а1., ВЮТЕСНМриЕЗ (1999), 26(1): 36; Сгауек е! а1., ВIОСНЕМI8ТЯΥ (1998), 37:6050; №1пига е! а1., I. ВЮЬ. СНЕМ. (1998), 273(22): 13570; 8сйт1б! е! а1., РЯОТЕЕЫ ЕНРКЕ88ЮУ апб РЕР1Е1СЛУ1ОУ (1998), 12: 323; 81йег! е! а1., УЛТЕВЕ СЕУЕТ1С8 (1998), 18: 45; Т1ЬКВУ8 ЕТ ЛЬ., СЕЬЬ ВЮВОСУ: А ВЛВОЯЛТОЯУ НЛУВВООК 145-154 (1998); Са1 е! а1., РЯОТЕЕЫ ЕНРЯЕ881ОУ апб РИШИСАТЮУ (1997), 10: 263; Бо1рЫп е! а1., УАТИЯЕ СЕУЕТ1С8 (1997), 17: 491; Кок! е! а1., Сепе (1997), 190: 139; 1акоЬккоп е! а1., I. ВЮЬ. СНЕМ. (1996), 271: 22203; ЯоМек е! а1., I. ВЮЬ. СНЕМ. (1996), 271(37): 22376; Яе\еге\ е! а1., I. ВЮЬ. СНЕМ. (1996), 271(39): 23607-10; 8!ап1еу е! а1., I. ВЮЬ. СНЕМ. (1995), 270: 4121; 81кк е! а1., I. У1ЯОВ. (1994), 68(2): 766 и Репд е! а1., ВЮТЕСНШриЕЗ (1993), 14(2): 274. Коммерчески доступные липосомы включают, например, Се11!ес!т® и Ыро!есйп® (1пуЦгодеп, Согр., Саг1кЬаб, СА). Кроме того, можно использовать трансфекцию с использованием кальцийфосфата; см. ТЯОТТЕЯ апб УООБ, 39 МЕТНОБ8 ΙΝ МОЬЕСиЬЛЯ ВЮВОСУ (1995); Кй!к, УАЯ (1990), 18(19): 5667 и Мапп апб Ктд, I. СЕК У1ЯОВ. (1989), 70: 3501.

Бакуловирусные экспрессионные векторы обычно содержат бакуловирусный промотор. Бакуловирусный промотор представляет собой любую ДНК последовательность, способную связывать бакуловирусную РНК полимеразу и инициировать в прямом направлении (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурный ген) в мРНК. Промотор должен содержать участок инициирования транскрипции, который обычно расположен проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Такой участок инициирования транскрипции обычно включает сайт связывания РНК полимеразы и сайт инициирования транскрипции. Бакуловирусный промотор может также содержать второй домен, называемый энхансером, который, если присутствует, обычно расположен вдали от структурного гена. Кроме того, экспрессия может быть как регулируемой, так и конститутивной.

Структурные гены, которые в большом количестве транскрибируются в последней части цикла инфицирования, представляют собой особенно полезные промоторные последовательности. Примеры включают последовательности, полученные из гена, кодирующего вирусный белок полигедрона (ЕЯ1Е8ЕК ЕТ АЬ., Тйе Яеди1а!юп о! Васи1оу|гик депе Ехргеккюп ш ТНЕ МОЬЕСиЬЛЯ ВIО^ОСΥ ОЕ ВАСИЬОУ1ЯИ8Е8 (1986); ЕР 0127839 и 0155476) и гена, кодирующего р10 белок (У1ак е! а1., I. СЕК. У1ЯОВ. (1988), 69: 765).

Вновь созданный бакуловирусный вектор экспрессии упаковывают в инфекционные рекомбинантные бакуловирусы и затем выращиваемые бляшки можно очистить, используя методики, хорошо известные специалистам в данной области; см. МШег е! а1., ВIОЕ88АΥ8 (1989), 11(4): 91; 8ИММЕЯ8 апб 8М1ТН, ТЕХА8 АСЯ1СиЬТиЯЛЬ ЕХРЕЯ1МЕКТ 8ТЛТ1ОХ ВиЕЕЕТ1К Ко. 1555 (1987).

Рекомбинантные бакуловирусные экспрессионные векторы были созданы для инфицирования различных клеток насекомых. Например, рекомбинантные бакуловирусы были созданы, наряду с другими, для Аебек аедурй (АТСС № СсЬ-125), ВотЬух топ (аТсС № СЯЬ-8910), Бгокорййа те1аподак!ег (АТСС № 1963), 8робор!ега йидрегба и Тпсйор1ик1ат; см. Упдй!, КАТИЯЕ (1986), 321:718; СагЬопе11 е! а1., I. У1ЯОВ. (1985), 56:153; 8тйй е! а1., МОЙ. СЕЬЬ. ВЮЬ. (1983), 3:2156; см., в общем, Егакег е! а1., ΙΝ У1ТЯО СЕЬЬ. БЕУ. В1ОЬ. (1989), 25:225. Более конкретно, клеточные линии, используемые для систем бакуловирусных векторов экспрессии, обычно включают, без ограничения, 8!9 (8робор!ега !гид1регба) (АТСС № СЯЬ-1711), 8!21 (8робор!ега !гид1регба) (1пуЦгодеп Согр., Са!. №. 11497-013 (Саг1кЬаб, СА)), Тп-368 (ТпсйориШаш) и Шдй-ЕУе™ ВТ1-Т№5В1-4 (ТпсйориШаш).

Клетки и культуральные среды коммерчески доступны как для прямой экспрессии, так и для экспрессии слияния гетерологичных полипептидов в системе бакуловирус/экспрессия, и технология клеточных культур обычно известна специалистам в данной области.

Виды Е. Со11, Ркеиботопак и другие прокариоты.

Методики бактериальной экспрессии известны специалистам в данной области. Широкий круг векторов доступен для использования в бактериальных хозяевах. Указанные векторы могут быть векторами одной копии или векторами небольшого количества или множества копий. Векторы могут служить для клонирования и/или экспрессии. Учитывая большое количество литературы, посвященной векторам, коммерческую доступность многих векторов, и даже руководств, описывающих векторы и их рестрикционные карты и характеристики, нет необходимости все это здесь подробно обсуждать. Как хорошо известно, указанные векторы обычно включают маркеры, обеспечивающие селекцию, причем эти маркеры могут обеспечивать устойчивость к цитотоксическому агенту, прототрофность или иммунитет. Часто присутствуют несколько маркеров, которые обеспечивают различные характеристики.

Бактериальный промотор представляет собой любую последовательность ДНК, способную связывать бактериальную РНК полимеразу и инициировать транскрипцию в прямом направлении (3') кодирующей последовательности (например, структурный ген) в мРНК. Промотор должен иметь участок инициирования транскрипции, который обычно расположен проксимально к 5'-концу кодирующей по

- 75 019968 следовательности. Такой участок инициирования транскрипции обычно включает сайт связывания РНК полимеразы и сайт инициирования транскрипции. Бактериальный промотор может также содержать второй домен, называемый оператором, который может перекрывать соседний сайт связывания РНКполимеразы, который начинает синтез РНК. Такой оператор позволяет негативно регулировать (индуцируемо) транскрипцию, а ген репрессорного белка может связывать оператор и тем самым ингибировать транскрипцию специфического гена. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивную регуляцию может обеспечивать последовательность, связывающая белок активирующего гена, который, если присутствует, обычно расположен проксимально (5') к последовательности, связывающей РНК-полимеразу. Примером белка, активирующего ген, является катаболитный активаторный белок (САР), который помогает инициировать транскрипцию 1ас оперона в Ексйепсй1а сой (Е. сой) [Ва1Ьаиб е! а1., ΛΝΝυ. ВЕУ. СЕНЕТ. (1984), 18: 173]. Поэтому регулируемая экспрессия может быть или позитивной или негативной, тем самым или увеличивая, или уменьшая транскрипцию.

Последовательности, кодирующие метаболический путь ферментов, представляют собой особенно полезные промоторные последовательности. Примеры включают промоторные последовательности, полученные из метаболизирующих сахар ферментов, таких как галактоза, лактоза (1ас) [Сйапд е! а1., NАТиВЕ (1977), 198: 1056] и мальтоза. Дополнительные примеры включают промоторные последовательности, полученные из биосинтетических ферментов, таких как триптофан (!гр) [Соеббе1 е! а1., №.1с. АСГО8 ВЕ8. (1980), 8: 4057; УеВейоп е! а1., ΝυΟΈ. АСГО8 ВЕ8. (1981), 9: 731; патент США № 4738921; публикации ЕР №№ 036776 и 121775, которые включены в описание посредством ссылки]. Промоторная система β-галактозидазы (Ь1а) |\Уе1Кктапп (1981) Тйе с1ошпд оГ т!егГегоп апб о!йег т1к!акек. Ш ШегГегоп 3 (Еб. I. Сгеккег)], бактериофага лямбда РЬ [8й1та!аке е! а1., NАТυВЕ (1981), 292: 128] и Т5 [патент США № 4689406, который включен в описание посредством ссылки], системы промоторов также предоставляют полезные промоторные последовательности. В предпочтительных способах настоящего изобретения используют сильные промоторы, такие как Т7 промотор, чтобы индуцировать полипептиды ЬС-С8Е на высоких уровнях. Примеры таких векторов хорошо известны специалистам в данной области и включают серии рЕТ29 от №уадеп и рРОР векторы, описанные в \УО 99/05297, который включен в описание посредством ссылки. Такие экспрессионные системы могут продуцировать высокие уровни полипептидов ЬС-С8Е в хозяевах, не поступаясь жизнеспособностью клетки-хозяина или параметрами роста. Другим известным специалистам вектором является рЕТ19 (Коуадеп).

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют как бактериальные промоторы. Например, последовательности, активирующие транскрипцию одного бактериального или бактериофагового промотора, можно соединить с последовательностью оперона другого бактериального или бактериофагового промотора, создавая синтетический гибридный промотор [патент США № 4551433, который включен в описание посредством ссылки]. Например, !ас промотор представляет собой гибридный 1гр-1ас промотор, включающий обе (1гр промоторную и 1ас опероновую) последовательности, что регулируется 1ас реперессором [Атапп е! а1., Сепе (1983), 25:167; бе Воег е! а1., РВОС. ХАТЕ. АСАЭ. 8СЕ (1983), 80:21]. Кроме того, бактериальный промотор может включать природные промоторы не бактериального происхождения, которые обладают способностью связывать бактериальную РНК полимеразу и инициатор транскрипции. Природные промоторы не бактериального происхождения можно также соединить РНК полимеразой для достижения высоких уровней экспрессии некоторых генов в прокариотах. Система РНК полимераза Т7 бактериофага/промотор представляет собой пример промоторной системы [8!иб1ег е! а1., I. МОЙ. ВЮЬ. (1986), 189: 113; ТаЬог е! а1., Ргос №111. Асаб. 8с1. (1985), 82: 1074]. Кроме того, гибридный промотор также может состоять из бактериофагового промотора и Е. сой операторного участка (публикация ЕР № 267851).

В дополнение к функционирующей промоторной последовательности эффективный сайт связывания рибосомы также можно использовать для экспрессии чужеродных генов в прокариотах. В Е. сой сайт связывания рибосомы называют 8й1пе-Оа1дато (8Ό) последовательностью, и он включает кодон инициирования (АТС) и последовательность из 3-9 нуклеотидов в длину, расположенную на 3-11 нуклеотидах в обратном направлении от кодона инициирования [8йше е! а1., NАТυВЕ (1975), 254: 34]. Считают, что 8Ό последовательность промотирует связывание мРНК с рибосомой путем спаривания оснований между 8Ό последовательностью и 3' и Е. сой 168 гРИК [8!ейх е! а1. Сепейс к1дпа1к апб пис1еойбе кециепсек ш теккепдег РНК, Ш Вю1одюа1 Веди1а!юп и Оеуе1ортеп1: Сепе Ехргеккюп (Еб. В.Е. Со1бЬегдег, 1979)]. Для экспрессии эукариотных генов и прокариотных генов со слабыми сайтами связывания рибосомы [8атЬгоок е! а1. Ехргеккюп оГ с1опеб депек ш ЕксйепсЫа сой, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 1989].

Термины бактериальный хозяин или бактериальная клетка-хозяин относятся к бактериям, которые могут быть или были использованы в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или других трансферных ДНК. Термины включают потомство исходной бактериальной клетки-хозяина, которая была трансфектирована. Следует понимать, что потомство одной родительской клетки совсем не обязательно будет полностью идентично в плане морфологии или в геноме или полном ДНК комплементе с исходной родительской клеткой из-за случайной или преднамеренной мутации. Потомство родительской

- 76 019968 клетки, которое достаточно близко к родительской клетке при характеризации по соответствующим свойствам, таким как присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ЬС-С8Р, включены в потомство, рассматриваемое в таком определении.

Селекция подходящих бактерий-хозяев для экспрессии полипептидов ЬС-С8Р известна специалистам в данной области. При выборе бактериальных хозяев для экспрессии подходящие хозяева могут включать такие, которые, как было показано, обладают, наряду с другими, хорошей способностью включаться в организм, низкой протеолитической активностью и общей устойчивостью. Бактериальные хозяева обычно доступны из различных источников, включая, без ограничения, !йе Вас!епа1 Сепсис 8!оск Сеп!ег, Иерайтеп! оГ Вюрйукюк и Мей1са1 Рйукюк, ипп'егкйу оГ СайГотта (Вегке1еу, СА); и в Атепсап Туре Си1!иге Со11есйоп (АТСС) (Мапаккак, УА). При промышленной/фармацевтической ферментации обычно используют бактерии, полученные из К штаммов (например, У3110) или из бактерий, полученных из В штаммов (например, ВЬ21). Указанные штаммы особенно удобны, так как параметры их роста хорошо изучены и устойчивы. Кроме того, указанные штаммы не патогенны, что коммерчески важно из соображений безопасности окружающей среды. Другие примеры подходящих Е.со11 хозяев включают, без ограничения, штаммы ВЬ21, ЭН10В или их производные. В других вариантах указанных способов настоящего изобретения Е. сой хозяин представляет собой протеазный минус штамм, включая, без ограничения, ОМР- и ЬОЖ Штамм клеток-хозяев может быть видом Ркеийотопак, включая, без ограничения, Ркеийотопак йиогексепк, Ркеийотопак аегидтока и Ркеийотопак риййа. Известно, что Ркеийотопак йиогексепк Ыоупг 1, сконструированный штамм МВ101, можно использовать для получения рекомбинант и он доступен для процессов получения терапевтических белков. Примеры экспрессионной системы Ркеийотопак включают систему, доступную от Тйе Ωον Сйетюа1 Сотрапу в виде штамма-хозяина (М1й1апй, М1 ахаИнЫе оп !йе \Уог1й У1йе УеЬ а! йо\\\сот).

После того как штамм рекомбинантных клеток-хозяев установлен (т.е. экспрессионная конструкция была введена в клетку-хозяина и клетки-хозяева с соответствующей экспрессионной конструкцией выделены), штамм рекомбинантных клеток-хозяев культивируют в условиях, подходящих для продуцирования полипептидов ЬС-С8Р. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, способ культивирования штамма рекомбинантных клеток-хозяев будет зависеть от природы используемой экспрессионной конструкции и индивидуальности клетки-хозяина. Штаммы рекомбинантных хозяев обычно культивируют, используя методы, хорошо известные специалистам в данной области. Рекомбинантные клетки-хозяева обычно культивируют в жидкой среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганических солей и, необязательно, содержащей витамины, аминокислоты, факторы роста и другие белковоподобные дополнения к культуральной среде, хорошо известные специалистам в данной области. Жидкая среда для культивирования клеток-хозяев может необязательно содержать антибиотики или противогрибковые агенты, чтобы предотвратить рост нежелательных микроорганизмов, и/или соединения, включая, без ограничения, антибиотики для отбора клеток-хозяев, содержащих вектор экспрессии.

Рекомбинантные клетки-хозяева можно культивировать партиями или непрерывно, или собирая клетки (в случае, если полипептид ЬС-С8Р накапливается внутриклеточно), или собирая надосадочную жидкость культуры или порциями либо непрерывно. Для производства в прокариотных клетках-хозяевах предпочтительно порционное культивирование и сбор клеток.

Полипептиды ЬС-С8Р настоящего изобретения обычно очищают после экспрессии в рекомбинантных системах. Полипептид ЬС-С8Р можно выделить из клетки-хозяина или культуральной среды различными способами, хорошо известными специалистам в данной области. В патенте США № 5849883 и \УО 89/10932, которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте, раскрыто клонирование Ь-СС8Р и их аналогов в клетках-хозяевах и методы выделения и очистки. Полипептиды ЬСС8Р, продуцированные в бактериальных клетках-хозяевах, могут быть плохо растворимыми или нерастворимыми (в виде телец включения). В одном варианте настоящего изобретения аминокислотные замещения можно легко осуществить в полипептиде ЬС-С8Р, который выбирают с целью повышения растворимости рекомбинанто получаемого белка, используя раскрытые здесь способы так же, как и те, что известны специалистам. В случае нерастворимого белка белок можно собирать из лизатов клеток-хозев центрифугированием и возможно затем используя гомогенизацию клеток. В случае плохо растворимого белка соединения, включая, без ограничения, полиэтиленимин (РЕ1) можно добавлять для того, чтобы вызвать осаждение частично растворимого белка. Выпавший в осадок белок можно затем обычным образом собрать центрифугированием. Рекомбинантные клетки-хозяева можно разрушить или гомогенизировать для выделения нерастворимых телец из внутренностей клеток, используя различные методы, известные специалистам в данной области. Разрушение клеток или гомогенизацию можно осуществить, используя хорошо известные методики, включая, без ограничения, ферментативное разрушение клеток, обработку ультразвуком, в гомогенизаторе Даунса или осуществление разрушения высоким давлением. В одном варианте соединения настоящего изобретения используют методику высокого давления для разрушения Е. сой клеток-хозяев для высвобождения телец включения полипептидов ЬС-С8Р. При манипулировании с полипептидом ЬС-С8Р может оказаться выгодным минимизировать время гомогенизации при повторениях, чтобы добиться максимального выхода телец включения без потерь, связанных с

- 77 019968 такими факторами, как солюбилизация, механический сдвиг или протеолиз.

Нерастворимые или выпавшие в осадок полипептиды ЬС-СδР можно затем солюбилизировать, используя любой из ряда подходящих агентов для солюбилизации, известных специалистам в данной области. Полипептид ЬС-СδР можно солюбилизировать, используя мочевину или гуанидингидрохлорид. Объем солюбилизированного полипептида ЬС-СδР следует минимизировать с тем, чтобы можно было получать крупные партии, используя обычные размеры партий, которые удобны в обращении. Указанный фактор может оказаться значительным при крупномасштабном коммерческом производстве, где рекомбинантные хозяева можно выращивать партиями объемом в тысячи литров. Кроме того, при производстве полипептида ЬС-СδР в промышленном крупном масштабе, особенно для использования в фармацевтических препаратах для людей, если это возможно, следует избегать агрессивных химикатов, которые могут повредить механизмы и контейнеры, или сам белковый продукт. В способе настоящего изобретения было показано, что более мягкий денатурирующий агент мочевину можно использовать для солюбилизации телец включения полипептида ЬС-СδР вместо более агрессивного денатурирующего агента гуанидингидрохлорида. Использование мочевины значительно увеличивает риск повреждения оборудования из нержавеющей стали в процессе получения и очистки полипептида ЬС-СδР, хотя эффективно солюбилизируя тельца включения полипептида ЬС-СδР.

В случае растворимого ЬС-СδР белка ЬС-СδР могут секретироваться в периплазмическое пространство или в культуральную среду. Кроме того, растворимые ЬС-СδР могут присутствовать в цитоплазме клетки-хозяина. Может оказаться желательным концентрировать растворимые ЬС-СδР перед проведением стадий очистки. Для концентрирования растворимых ЬС-СδР, например, из клеточных лизатов или культуральной среды можно использовать стандартные методики, хорошо известные специалистам в данной области. Кроме того, стандартные методики, хорошо известные специалистам в данной области, можно использовать для разрушения клетки-хозяина и выделения растворимых ЬС-СδР из цитоплазмы или периплазмического пространства клеток-хозяев.

Если полипептид ЬС-СδР получают как белок слияния, последовательность слияния можно удалить. Удаление последовательности слияния можно осуществить ферментативно или используя химическое расщепление. Ферментативное удаление последовательностей слияния можно осуществить, используя методы, известные специалистам в данной области. Выбор фермента для удаления последовательности слияния можно определить, идентифицируя слияние, и условия реакции будут определяться выбором фермента, как должно быть понятно специалистам в данной области. Химическое расщепление можно осуществить, используя реагенты, хорошо известные специалистам в данной области, включая, без ограничения, цианогенбромид, ΤΕV протеазу и другие реагенты. Расщепленный полипептид ЬС-СδР можно очистить от расщепленной последовательности слияния методами, известными специалистам в данной области. Такие методы будут определяться в зависимости от идентичности и свойств последовательности слияния и полипептида ЬС-СδР, как должно быть очевидно специалистам в данной области. Способы очистки могут включать, без ограничения, хроматографию с исключением по размерам, хроматографию гидрофобных взаимодействий, ионообменную хроматографию или диализ или любые их комбинации.

Полипептид ЬС-СδР можно также очистить для удаления ДНК из белкового раствора. ДНК можно удалить любым подходящим способом, известным специалистам, таким как осаждение или ионообменная хроматография, но можно удалить, используя осаждение агентом, осаждающим нуклеиновую кислоту, таким как, без ограничения, протаминсульфат. Полипептид ЬС-СδР можно отделить от осажденной ДНК, используя стандартные, хорошо известные способы, включая, без ограничения, центрифугирование или фильтрацию. Удаление молекулы нуклеиновой кислоты хозяина является важным фактором в определении того, где должен использоваться полипептид ЬС-СδР, для лечения животных или людей, и способы настоящего изобретения уменьшают содержание ДНК клеток-хозяев до фармацевтически приемлемых уровней.

Методы ферментации в лабораторном масштабе или в промышленном масштабе можно также использовать при экспрессии белка, включая, без ограничения, ферментеры, встряхиваемые флаконы, биореакторы с псевдоожиженным слоем, полые волоконные биореакторы, системы культур в роллерных флаконах и системы перемешиваемых биореакторов танкового типа. Каждый из указанных методов можно осуществить в периодическом процессе, в культуре с подпиткой или в непрерывном процессе.

Полипептиды ЬС-СδР настоящего изобретения обычно можно выделить, используя стандартные методы в данной области. Например, культуральную среду или клеточный лизат можно центрифугировать или фильтровать для удаления клеточного дебриса. Надосадочную жидкость можно сконцентрировать или разбавить до нужного объема или подвергнуть диафильтрации в подходящий буфер до состояния препарата для дальнейшей очистки. Дальнейшая очистка полипептида ЬС-СδР настоящего изобретения включает отделение деамидированных и усеченных форм варианта полипептида ЬС-СδР от интактной формы.

Любую из следующих примерных процедур можно использовать для очистки полипептидов ЬССδР настоящего изобретения: аффинную хроматографию; анионо- или катионообменную хроматографию (используя, без ограничения, ЭЕАЕ δΕΡНΑΒОδΕ); хроматографию на силикагеле; высокоэффек

- 78 019968 тивную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ); ВЭЖХ с обращенной фазой; гель-фильтрацию (используя, включая, без ограничения, 8ЕРНА^ЕX С-75); хроматографию гидрофобных взаимодействий; хроматографию с исключением по размерам; металл-хелатную хроматографию; ультрафильтрацию/диафильтрацию; осаждение этанолом; осаждение сульфатом аммония; хроматофокусирование; хроматографию замещения; электрофоретические процедуры (включая, без ограничения, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальную растворимость (включая, без ограничения, осаждение сульфатом аммония), 8Э8-РАСЕ или экстракцию.

Белки настоящего изобретения, включая, без ограничения, белки, включающие неприродные аминокислоты, пептиды, включающие неприродные аминокислоты, антитела к белкам, включающим неприродные аминокислоты, связывающие партнеры для белков, включающих неприродные аминокислоты и т.д., можно очистить или частично, или практически до гомогенности в соответствии со стандартными процедурами, хорошо известными специалистам в данной области. Соответственно полипептиды настоящего изобретения можно выделить и очистить любым из ряда способов, известных специалистам, включая, без ограничения, осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой или основанием, с помощью колоночной хроматографии, аффинной хроматографии, анионо- или катионообменной хроматографии, хроматографии на фосфоцеллюлозе, хроматографии гидрофобных взаимодействий, хроматографии на гидроксилапатите, хроматографии на лектине, гельэлектрофореза и т.п. Стадии рефолдинга белка можно использовать при желании для получения правильно сложенных зрелых белков. Высокоэффективную жидкостную хроматография (ВЭЖХ), аффинную хроматографию или другие подходящие методы можно использовать на стадиях окончательной очистки, когда необходима высокая степень чистоты. В одном варианте антитела, полученные против неприродных аминокислот (или белков или пептидов, включающих неприродные аминокислоты), используют в качестве очищающих реагентов, включая, без ограничения, для очистки на основе аффинности белков или пептидов, включающих одну или более из неприродных аминокислот. После очистки частично или до гомогенности при желании полипептиды необязательно используют в широком круге применений, включая, без ограничения, в качестве аналитических компонентов, терапевтических агентов, профилактических агентов, диагностических агентов, реагентов для исследований и/или в качестве иммуногенов для получения антител. Антитела, созданные против полипептидов настоящего изобретения, можно получить, вводя полипептиды или эпитопсодержащие фрагменты или клетки животному, предпочтительно животному, не являющемуся человеком, используя рутинные протоколы. Любой специалист в данной области может создать антитела, используя различные известные методики. Кроме того, трансгенных мышей или другие организмы, включая других млекопитающих, можно использовать для экспрессии гуманизированных антител. Вышеописанные антитела можно использовать для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептид или для очистки полипептидов. Антитела против полипептидов настоящего изобретения можно также использовать для лечения заболеваний.

Полипептиды и полинуклеотиды настоящего изобретения можно также использовать в качестве вакцин. Соответственно в следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу выработки иммунологической реакции у млекопитающего, который включает инокулирование млекопитающего полипептидом настоящего изобретения, адекватным для выработки антител и/или иммунной реакции Тклеток, включая, например, цитокин-продуцирующие Т-клетки или цитотоксические Т-клетки, для защиты указанного животного от заболевания, независимо от того, проявилось ли уже это заболевание у индивидуума, или нет. Иммунологическую реакцию у млекопитающего можно также вызвать способом, который включает доставку полипептида настоящего изобретения с помощью вектора, управляющего экспрессией полинуклеотида и кодирующего полипептид ш у1уо, для индуцирования такой иммунологической реакции, чтобы вызвать продуцирование антител для защиты указанного животного от заболеваний, указанных в настоящем изобретении. Одним из способов введения указанного вектора является направление его в нужные клетки в виде покрытия на частицах или другим способом. Такие векторы нуклеиновых кислот могут включать ДНК, РНК, модифицированные нуклеиновые кислоты или ДНК/РНК гибриды. Для использования в качестве вакцины полипептидный вектор или вектор нуклеиновой кислоты приготавливают в виде лекарственной формы вакцины (композиции). Лекарственная форма может включать далее подходящий носитель. Так как полипептид может быть разрушен в желудке, его можно вводить парентерально (например, с помощью подкожной, внутримышечной, внутривенной или внутрикожной инъекции). Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферные агенты, бактериостаты и солюты, которые придают лекарственной форме изотоничность в отношении крови реципиента; водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты или загущающие агенты. Лекарственная форма вакцин может также включать системы адъювантов для повышения иммуногенности лекарственной формы, как хорошо известно специалистам в данной области. Дозировка будет зависеть от специфический активности вакцины, и ее можно легко определить в рутинных экспериментах.

В дополнение к другим перечисленным здесь ссылкам специалистам в данной области известны разнообразные другие методы очистки/укладки белка, включая, без ограничения, те, что перечислены в

- 79 019968

В. δсοрек, Рго!еш Рипйса!юп, δр^^ηде^-Vе^1ад, Ν.Υ. (1982); Беи!ксйег, Ме!йобк 1п Епхушокду, νο1. 182: Сшбе !о Рго!ет Рилйсайоп, Асабетк Ргекк, Шс. Ν.Υ. (1990); δапбапа, (1997) Вюкерагайоп οί Рго1етк. Асабетк Ргекк, Шс.; Во11ад е! а1. (1996) Рго!ет Ме!йобк, 2пб Ебйюп №11еу-Шк, ΝΥ; №а1кег, (1996) Рго!ет Рго!осо1к НапбЬоок Нитапа Ргекк, Νί, Натк и Апда1, (1990) Рго!ет Рилйсабоп Арр1ка!юпк: А Ргасйса1 Арргоасй IΒ^ Ргекк а! 0хГогб, 0хГогб, Епд1апб; Натк и Апда1, Рго!ет Рипйсабоп Ме!йобк: А Ргас!ка1 Арргоасй IΒ^ Ргекк а! 0хГогб, 0хГогб, Епд1апб; δсοрек, (1993) Рго!ет Рилйсабоп: Рппаркк апб Ргасйсе 3гб Ебйюп δр^^ηде^ Vе^1ад, ΝΥ; Чапкоп и Вубеп, (1998) Рго!еш Рилйсабоп: Рппс1р1ек, Н1дй Веко1и!юп Ме!йобк апб Арр1ка!юпк, δесοηб Ебйюп №Пеу№СН, ΝΥ; №а1кег (1998), Рго!еш Рго!осо1к оп СБ-В0М Нитапа Ргекк, Νί и цитированные в них ссылки.

Одно из преимуществ получения представляющих интерес белков или полипептидов с неприродными аминокислотами в эукариотных клетках-хозяевах или в не эукариотных клетках-хозяевах состоит в том, что обычно белки или полипептиды будут упаковываться в свои естественные конформации. Однако в некоторых вариантах настоящего изобретения специалистам должно быть понятно, что после синтеза, экспрессии и/или очистки белки или пептиды могут обладать конформацией, которая отличается от желательных конформаций соответствующих полипептидов. В одном аспекте настоящего изобретения экспрессированный белок или полипептид необязательно денатурируют и затем ренатурируют. Это осуществляют, используя методы, известные специалистам, включая, без ограничения, добавление шаперонина к представляющим интерес белку или полипептиду, солюбилизацию белков в разобщающем агенте, таком как гуанидин НС1, использование протеиндисульфидизомеразы и т.д.

Вообще, иногда бывает желательно денатурировать и восстановить экспрессированные полипептиды и затем вызвать процесс сворачивания полипептидов в предпочтительной конформации. Например, гуанидин, мочевину, БТТ, БТЕ и/или шаперонин можно добавлять к представляющему интерес продукту трансляции. Методы восстановления, денатурирования и ренатурирования белков хорошо известны специалистам в данной области (см. приведенные выше ссылки БеЫпккц е! а1. (1993), ί. Вю1. Сйет., 268: 14065-14070; Кгейтап апб Рак!ап (1993), Вюсопщд. Сйет., 4: 581-585 и Висйпег, е! а1., (1992) Апа1. Вюсйет., 205: 263-270). БеЫпккк е! а1., например, описывает денатурирование и восстановление белка в тельцах включения в гуанидин-БТЕ. Такие белки могут быть заново упакованы в окислительновосстановительном буфере, содержащем, включая, без ограничения, окисленный глутатион и Ь-аргинин. Реагенты рефолдинга в потоке или каким-либо другим образом вступают в контакт с одним или более из полипептидов или других продуктов экспрессии, или наоборот.

В случае прокариотного продуцирования полипептида ЬС-СδР полученный таким образом полипептид ЬС-СδР может быть неправильно упакован и таким образом может утратить биологическую активность или может обладать слабой биологической активностью. Биоактивность белка можно восстановить, используя рефолдинг. Обычно неправильно свернутый полипептид ЬС-СδР подвергают рефолдингу путем солюбилизации (когда полипептид ЬС-СδР также нерастворим), разворачиванию и восстановлению полипептидной цепи, используя, например, один или более из разобщающих агентов (например, мочевину и/или гуанидин) и восстанавливающий агент, способный восстановить дисульфидные связи (например, дитиотреитол, БТТ или 2-меркаптоэтанол, 2-МЕ). При умеренных концентрациях разобщающего агента затем добавляют окисляющие агенты (например, кислород, цистин или цистамин), которые позволяют реформировать дисульфидные связи. Можно заново упаковать полипептид ЬС-СδР, используя стандартные известные специалистам методы, такие как раскрыты в патентах США №№ 4511502, 4511503 и 4512 922, которые включены в описание посредством ссылки. Полипептид ЬС-СδР можно также упаковать вместе с другими белками с образованием гетеродимеров или гетеромультимеров.

После рефолдинга ЬС-СδР можно дополнительно очистить. Очистку ЬС-СδР можно осуществить, используя различные методики, известные специалистам в данной области, включая хроматографию гидрофобных взаимодействий, хроматографию с исключением по размерам, ионообменную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой, аффинную хроматографию и т.п. или любую их комбинацию. Дополнительная очистка может также включать стадию сушки или осаждения очищенного белка.

После очистки ЬС-СδР можно обменять в различных буферах и/или сконцентрировать любым из различных способов, известных специалистам в данной области, включая, без ограничения, диафильтрацию и диализ. С-СδР, который представлен в виде отдельного очищенного белка, можно подвергнуть агрегегации и осаждению.

Очищенный ЬС-СδР может иметь степень чистоты по меньшей мере 90% (по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой, ВР-НРЬС, или электрофореза в натрийдодецилсульфат-полиакриламидном геле, δΒδ-РАСЕ), или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% либо больше. Независимо от точного численного значения степени чистоты ЬС-СδР, ЬС-СδР является достаточно чистым для использования в качестве фармацевтического продукта или для последующего процессинга, такого как конъюгирование с водорастворимым полимером, таким как ПЭГ.

Некоторые молекулы ЬС-СδР можно использовать в качестве терапевтических агентов в отсутствие

- 80 019968 других активных ингредиентов или белков (других нежели эксципиенты, носители, стабилизаторы, сывороточный альбумин и т.п.) или они могут образовать комплексы с другими белками или полимерами.

Общие методы очистки.

Любую из различных стадий выделения можно осуществить, используя клеточный лизат, экстракт, культуральную среду, тельца включения, периплазмическое пространство клетки-хозяина, цитоплазму клетки-хозяина или другой материал, включающий полипептид ЬС-С8Е или любые полипептидные ЬСС8Е смеси, полученные на любой стадии выделения, включая, без ограничения, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, гельфильтрационную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ, НРЬС), ВЭЖХ с обращенной фазой (ВР-НРЬС), адсорбцию на слой вспученного реагента или любую их комбинацию и/или их повторение в любом подходящем порядке.

Оборудование и другие необходимые материалы, используемые при осуществлении раскрытых выше методов, коммерчески доступны. Насосы, коллекторы фракций, мониторы, записывающие устройства и целые системы доступны, например, от АррНеб Вюкук!етк (Еок!ег Сйу, СА), Вю-Ваб ЬаЬога!опе8, 1пс. (Негси1ек, СА) и АтегкНат Вюкшепсек, 1пс. (Р1кса1а^ау, N1). Хроматографические материалы, включая, без ограничения, материалы обменных матриц, среды и буферы также доступны от указанных компаний.

Уравновешивание и другие стадии в процессе колоночной хроматографии, раскрытые здесь, такие как промывка и элюирование можно осуществлять более быстро, используя специализированное оборудование, такое как насос. Коммерчески доступные насосы включают, без ограничения, Н1Я0А0® Ритр Р-50, Репк!а1!ю Ритр Р-1, Ритр Р-901 и Ритр Р-903 (АтегкНат Вюкаепсек, Р|кса1а\\'ау, N1).

Примеры коллекторов фракций включают Веб1Егас Егасйоп Со11ес!ог, ЕВАС-100 и ЕВАС-200 Егас11оп Со11ес!огк, 8ИРЕВЕВАС® Егасйоп Со11ес!ог (АтегкНат Вюкшепсек, Р1кса!атау, N1). Доступны также смеси для создания нужной величины рН и линейных градиентов концентраций. Коммерчески доступные смеси включают Сгаб1еп! М1хег СМ-1 и Ιη-Ьте М1хегк (АтегкНат Вюкаепсек, Р1кса!атау, N1).

Хроматографический процесс можно контролировать, используя любой коммерчески доступный монитор. Такие мониторы можно использовать для сбора информации, такой как УФ, рН и проводимость. Примеры детекторов включают Мопйог υν-Ι, υνΐΟ0ΡΩ® 8 II, Мопйог υν-М II, Мопйог υν-900, Мопйог иРС-900, Мопйог рН/С-900 и Сопбисйуйу Мопйог (АтегкНат Вюкаепсек, Р1кса!атау, N1). Кроме того, коммерчески доступны целые системы, включая различные АКТА® системы от АтегкНат Вюкаепсек (Р1кса!атау, N1).

В одном варианте настоящего изобретения, например, полипептид ЬС-С8Е можно восстановить и денатурировать, вначале денатурируя полученный очищенный полипептид ЬС-С8Е в мочевине, с последующим разбавлением в ТШ8 буфере, содержащем восстанавливающий агент (такой как ОТТ) при подходящих значениях рН. В других вариантах полипептид ЬС-С8Е денатурируют в мочевине в интервале концентраций от около 2 до около 9 М, с последующим разбавлением ТЯ!8 буфером при рН в интервале от около 5,0 до около 8,0. Затем рефолдинговую смесь указанного варианта можно инкубировать. В одном варианте рефолдинговую смесь инкубируют при комнатной температуре в течение от 4 до 24 ч. Восстановленную и денатурированную полипептидную ЬС-С8Е смесь можно затем далее выделить или очистить.

Как здесь указано, рН первой полипептидной ЬС-С8Е смеси можно установить до осуществления любой из последующих стадий выделения. Кроме того, первую полипептидную ЬС-С8Е смесь или любую последующую смесь поэтому можно концентрировать, используя методики, известные специалистам. Кроме того, элюирующий буфер, включающий первую полипептидную ЬС-С8Е смесь или любую последующую смесь, поэтому можно заменить на буфер, подходящий для следующей стадии выделения, используя методики, хорошо известные специалистам в данной области.

Ионообменная хроматография.

В одном варианте, и как необязательном, дополнительную стадию ионообменной хроматографии можно осуществить для первой полипептидной ЬС-С8Е смеси; см. в общем IОN ЕXСНАNСЕ СНВ0МАТ0СВАРНУ: РКINСIР^Е8 апб МЕТН0И8 (Са!. № 18-1114-21, АтегкНат Вюкаепсек (Р1кса!атау, N1)). Коммерчески доступные ионообменные колонки включают ШТВАР®, ШРВЕР® и Н[Е0АЭ® колонки (АтегкНат Вюкаепсек, Р|кса1а\\'ау, N1). В таких колонках используют сильные анионообменные смолы, такие как О 8ЕРНАВ08Е® Еак! Е1о\т, О 8ЕРНАВ08Е® НщН РегГогтапсе и О 8ЕРНАВ08Е® Уй; сильные катионообменные смолы, такие как 8Р 8ЕРНАВ08Е® НщН РегГогтапсе, 8Р 8ЕРНАВ08Е® Еак! Е1о\т и 8Р 8ЕРНАВ08Е® ΑΠ слабые анионообменные смолы, такие как ИЕАЕ 8ЕРНАВ08Е® Еак! Е1о\т; и слабые катионообменные смолы, такие как см. 8ЕРНАВ08Е® Еак! Е1о\т (АтегкНат Вюкаепсек, Р1кса1а\тау, N1). Обработку с помощью анионо- или катионооменной колоночной хроматографии можно осуществить для полипептида ЬС-С8Е на любой стадии процесса очистки для выделения практически очищенного полипептида ЬС-С8Е. Стадию катионообменной хроматографии можно осуществить, используя любую подходящую катионообменную матрицу.

Катионообменные матрицы, которые можно использовать, включают, без ограничения, волокни

- 81 019968 стые, пористые, непористые, микрогранулированные, в виде шариков или сшитые катионообменные материалы матриц. Такие катионообменные материалы матриц включают, без ограничения, целлюлозу, агарозу, декстран, полиакрилат, поливинил, полистирол, двуокись кремния, полиэфир или композиты любого из перечисленных.

Катионообменной матрицей может быть любой катионообменный агент, включая сильные и слабые катионообменные агенты. Сильные катионообменные агенты могут оставаться ионизированными в широком интервале значений рН и поэтому способны связывать ЬС-С8Е в широком интервале значений рН. Слабые катионообменные агенты могут терять ионизацию как функцию рН. Например, слабый катионообменный агент может терять заряд, когда рН снижается ниже, чем около рН 4 или 5. Подходящие сильные катионообменные агенты включают, без ограничения, заряженные функциональные группы, такие как сульфопропил (8Р), метилсульфонат (8) или сульфоэтил (8Е). Катионообменная матрица может быть сильным катионообменником предпочтительно со связыванием ЬС-С8Е в интервалое рН от около 2,5 до около 6,0. Альтернативно, сильный катионообменник может быть со связыванием ЬС-С8Е в интервале рН от около 2,5 до около рН 5,5. Катионообменная матрица может быть сильным катионообменником со связыванием ЬС-С8Е при значениях рН около 3,0. Альтернативно, катионообменная матрица может быть сильным катионообменником предпочтительно со связыванием ЬС-С8Е при значениях рН в интервале от около 6,0 до около 8,0. Катионообменная матрица может быть сильным катионообменником предпочтительно со связыванием ЬС-С8Е при значениях рН в интервале от около 8,0 до около 12,5. Альтернативно, сильный катионообменный агент может связывать ЬС-С8Е при значениях рН в интервале от около 8,0 до около 12,0.

Перед загрузкой ЬС-С8Е катионообменную матрицу можно уравновесить, например, используя несколько объемов колонки разбавленной слабой кислотой, например четыре объема колонки 20 мМ уксусной кислоты, рН 3. После уравновешивания можно ввести ЬС-С8Е и колонку промыть от одного до нескольких раз перед элюированием практически чистого ЬС-С8Е, также используя слабый кислотный раствор, такой как слабый раствор уксусной кислоты или слабый раствор фосфорной кислоты. Например, приблизительно 2-4 об. колонки 20 мМ уксусной кислоты, рН 3, можно использовать для промывки колонки. Можно также использовать дополнительные промывки, используя, например, 2-4 об. колонки 0,05 М ацетата натрия, рН 5,5 или 0,05 М ацетата натрия в смеси с 0,1 М хлорида натрия, рН 5,5. Альтернативно, используя методы, известные специалистам, можно уравновесить катионообменную матрицу, используя несколько объемов колонки разбавленного слабого основания.

Альтернативно, практически чистый ЬС-С8Е можно элюировать, используя контактирование катионообменной матрицы с буфером, обладающим достаточно низким значением рН или ионной силы, чтобы вытеснить ЬС-С8Е из матрицы. Величина рН буфера для элюирования может меняться в интервале значений от около рН 2,5 до около 6,0. Более конкретно, величина рН буфера для элюирования может меняться в интервале значений от около рН 2,5 до около 5,5, от около рН 2,5 до около 5,0. Буфер для элюирования может иметь значение рН около 3,0. Кроме того, количество буфера для элюирования может меняться в широких пределах и обычно бывает в интервале от около 2 до около 10 об. колонки.

После адсорбирования полипептида ЬС-С8Е на катионообменной матрице практически очищенный полипептид ЬС-С8Е можно элюировать, осуществляя контактирование матрицы с буфером, имеющим достаточно высокое значение рН или ионную силу, чтобы вытеснить полипептид ЬС-С8Е из матрицы. Подходящие буферы для использования при высокоэффективном элюировании практически чистого полипептида ЬС-С8Е могут включать, без ограничения, цитратный, фосфатный, формиатный, ацетатный, НЕРЕ8 и МЕ8 буферы в интервале концентраций по меньшей мере от около 5 до по меньшей мере около 100 мМ.

Хроматография с обращенной фазой.

ОФ-ВЭЖХ можно осуществить для очистки белков, следуя подходящим протоколам, которые хорошо известны специалистам в данной области; см., например, Реагвоп е1 а1., АНАБ ВЮСНЕМ. (1982), 124: 217-230 (1982); КМег е1 а1., 1. СНК0М. (1983), 268: 112-119; Кипйап е1 а1., 1. СНК0М. (1986), 359: 391-402. ОФ-ВЭЖХ можно осуществить для полипептида ЬС-С8Е для выделения практически чистого полипептида ЬС-С8Е. В таком случае используют двуокись кремния, модифицированную смолами с алкильными функциональностями с большим разнообразием длин цепей, включая, без ограничения, смолы по меньшей мере от около С₃ до по меньшей мере около С₃₀, от по меньшей мере около С₃ до по меньшей мере около С₂₀ или по меньшей мере от около С₃ до по меньшей мере около С₁₈. Альтернативно, можно использовать полимерную смолу. Например, можно использовать смолу ТовоНаав АтЬегсНготе СС10008й, которая представляет собой смолу полистирола. Можно также использовать цианосмолы или полимерные смолы и большим разнообразием длин алкильных цепей. Кроме того, ОФ-ВЭЖХ колонку можно промыть растворителем, таким как этанол. Колонка 8оигсе КР является другим примером ОФВЭЖХ колонок.

Подходящие буферы для элюирования, содержащие агент для образования пары ионов, и органический модификатор, такой как метанол, изопропанол, тетрагидрофуран, ацетонитрил или этанол, можно использовать для элюирования полипептида ЬС-С8Е из ОФ-ВЭЖХ колонки. Наиболее часто используемые образующие ионные пары агенты включают, без ограничения, уксусную кислоту, муравьиную ки

- 82 019968 слоту, перхлоркислоту, фосфорную кислоту, трифторуксусную кислоту, гептафтормасляную кислоту, триэтиламин, тетраметиламмоний, тетрабутиламмоний и ацетат триэтиламмония. Элюирование можно осуществить, используя один или более из градиентов или изократических условий, причем условия градиента должны предпочтительно быть такими, чтобы уменьшить время разделения и снизить ширину пиков. Другой способ включает использование двух градиентов с различными интервалами концентраций растворителя. Примеры подходящих для элюирования буферов для использования в настоящем изобретении могут включать, без ограничения, растворы ацетата аммония и ацетонитрила.

Методы очистки с использованием хроматографии гидрофобных взаимодействий.

Хроматографию гидрофобных взаимодействий (ШС) можно применить для полипептида ЬС-С8Е; см. 11У1)ВС)Р1 ЮВ1С INΤΕВΑСΤЮN СНВΟΜΑΤΟСВΑРНΥ НАХОВСХЖ: РВ1ХС1РВЕ8 зпй ΜΕΤΗΟΌ8 (Сз! № 18-1020-90, Атещйзт Вю5с1ег1се5 (РВсзЕпузу, ΝΡ), которая включена в описание посредством ссылки. Подходящие ШС матрицы могут включать, без ограничения, алкил- или арилзамещенные матрицы, такие как бутил-, гексил-, октил- или фенилзамещенные матрицы, включая агарозу, сшитую агарозу, сефарозу, целлюлозу, двуокись кремния, декстран, полистирол, матрицы поли(метакрилата) и смолы смешанного типа, включая, без ограничения, смолу полиэтиленамина или матрицу бутил- или фенилзамещенного поли(метакрилата). Коммерчески доступные источники для колонок для хроматографии гидрофобных взаимодействий включают, без ограничения, Н^ВАР®, ШРИЕР® и Ш^АО® колонки (АтегеЕзт В^ο5с^еηсе5. РВсзЕпузу, Ν1).

Короче, перед введением ШС колонку можно уравновесить, используя стандартные буферы, известные специалистам в данной области, такие как раствор уксусная кислота/натрийхлорид или НЕРЕ8, содержащий сульфат аммония. Сульфат аммония можно использовать в качестве буфера для загрузки ШС колонки. После введения полипептида ЬС-С8Е колонку можно промыть, используя стандартные буферы и условия для удаления нежелательных материалов, но оставляя полипептид ЬС-С8Е в ШС колонке. Полипептид ЬС-С8Е можно элюировать, используя от около 3 до около 10 об. колонки стандартного буфера, такого как НЕРЕ8 буфер, содержащий Ε^ΤΑ и более низкую концентрацию сульфата аммония, чем его концентрация в уравновешивающем буфере, или буфера уксусная кислота/натрийхлорид, наряду с другими. Можно также использовать градиент линейного уменьшения соли, используя, например, градиент фосфата калия, для элюирования молекул ЬС-С8Е. Затем элюент можно сконцентрировать, например, фильтрацией, такой как диафильтрация или ультрафильтрация. Диафильтрацию можно использовать для удаления соли, использованной для элюирования полипептида ЬС-С8Е.

Другие способы очистки.

Еще другие стадии выделения, используя, например, гель-фильтрацию (СЕЬ ΕI^ΤВΑΤЮN: РВЕЫС.ЧРЕЕ8 ;·ιηά ΜΕΤΗΟ^8 (Сз! № 18-1022-18, Атещйзт В^щеисе^, РВсзЕпузу, ΝΙ), который включен в описание посредством ссылки, хроматографию на гидроксиапатите (подходящие матрицы включают, без ограничения, НА-и11годе1, ШдЕ Ве8ο1иΐ^οη (Сз1Ьюсйет), СОТ Сегзтк Ηуά^οxуараΐ^ΐе (В^οВаά), Вю-Се1 ЭТР Ηуά^οxуараΐ^ΐе (В^οВаά)), ВЭЖХ, адсорбцию на вспученном слое, ультрафильтрацию, диафильтрацию, лиофилизацию и т.п., можно осуществить для первой полипептидной ЬС-С8Е смеси или любой последующей его смеси, для удаления любой избыточной соли для замены буфера подходящим буфером для следующей стадии выделения или даже для получения целевого продукта лекарственного средства.

Выход полипептида ЬС-С8Е, включая практически очищенный полипептид ЬС-С8Е, можно контролировать на каждой раскрытой здесь стадии, используя методики, известные специалистам в данной области. Такие методики можно также использовать для оценки выхода практически очищенного полипептида ЬС-С8Е после последней стадии выделения. Например, выход полипептида ЬС-С8Е можно контролировать, используя любую из нескольких колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой, такую как циано ОФ-ВЭЖХ, С₁₈ ОФ-ВЭЖХ; также как катионообменную ВЭЖХ и гель-фильтрационную ВЭЖХ.

В конкретных вариантах настоящего изобретения выход ЬС-С8Е после каждой стадии очистки может составлять по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 45, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 55, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 65, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 75, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 85, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 91, по меньшей мере около 92, по меньшей мере около 93, по меньшей мере около 94, по меньшей мере около 95, по меньшей мере около 96, по меньшей мере около 97, по меньшей мере около 98, по меньшей мере около 99, по меньшей мере около 99,9 или по меньшей мере около 99,99% ЬС-С8Е в исходном материале для каждой стадии очистки.

Степень чистоты можно определить, используя стандартные методики, такие как 8Э8-РАСЕ, или измеряя полипептид ЬС-С8Е, используя вестерн-блоттинг и ЕЫ8А анализы. Например, можно создать поликлональные антитела против белков, выделенных из негативной контрольной дрожжевой ферментации и катионообменного выделения. Полученные антитела можно также использовать для зондирования в отношении присутствия белков, загрязняющих клетки-хозяева.

ОФ-ВЭЖХ материал Vуάас С4 (Vуάас) состоит из частиц силикагеля, на поверхностях которых расположены С4-алкильные цепи. Выделение полипептида ЬС-С8Е из белковых примесей основано на

- 83 019968 различиях в прочности гидрофобных взаимодействий. Элюирование осуществляют, используя градиент ацетонитрила в разбавленной трифторуксусной кислоте. Препаративную ВЭЖХ осуществляют, используя колонку из нержавеющей стали (заполненную 2,8-3,2 л Vубас С4 силикагеля). Элюат из колонки с гидроксиапатитным ультрагелем (НубгохуараШе ИЙгоде1) подкисляют, добавляя трифторуксусную кислоту, и загружают в Vубас С4 колонку. Для промывки и элюирования используют градиент ацетонитрила в разбавленной трифторуксусной кислоте. Фракции собирают и немедленно нейтрализуют фосфатным буфером. Фракции полипептида ЬС-С8Е, которые находятся в пределах БРС, объединяют.

Материал ПЕЛЕ 8ерйагоке (Рйаттааа) состоит из групп диэтиламиноэтила (ПЕЛЕ), которые ковалентно связаны с поверхностью шариков сефарозы. Связывание полипептида ЬС-С8Е с ОЕАЕ группами происходит за счет ионных взаимодействий. Ацетонитрил и трифторуксусная кислота проходят через колонку без задержки. После того как указанные вещества были вымыты, следовые примеси удаляют, промывая колонку ацетатным буфером с низким значением рН. Затем колонку промывают нейтральным фосфатным буфером и полипептид ЬС-С8Е элюируется вместе с буфером с повышенной ионной силой. Колонку заполняют сорбентом ОЕАЕ сефароза Гак! йоте. Объем колонки выбирают таким, чтобы обеспечить загрузку полипептида ЬС-С8Е в интервале 3-10 мг полипептида ЬС-С8Е/мл геля. Колонку промывают водой и уравновешивают буфером (натрий/калийфосфат). Вводят объединенные фракции элюата после ВЭЖХ и колонку промывают уравновешивающим буфером. Затем колонку промывают промывочным буфером (натрийацетатный буфер), затем промывают уравновешивающим буфером. Затем полипептид ЬС-С8Е элюируют из колонки элюирующим буфером (натрий хлорид, натрий/калий фосфат) и его собирают отдельными фракциями в соответствии с параметрами мастера элюирования. Элюат из колонки с ОЕАЕ сефарозой доводят до установленного значения проводимости. Полученное лекарственное вещество фильтруют в стерильных условиях в тефлоновые контейнеры и хранят при температуре -70°С.

Дополнительные методы, которые можно использовать, включают, без ограничения, стадии для удаления эндотоксинов. Эндотоксины представляют собой липополисахариды (ЬР8), которые расположены на внешней мембране грам-отрицательных клеток-хозяев, таких как, например, ЕксйейсЫа сой. Методы снижения уровней эндотоксина хорошо известны специалистам в данной области и включают, без ограничения, методики очистки с использованием подложки двуокиси кремния, стеклянного порошка или гидроксиапатита, хроматографию с обращенной фазой, аффинную хроматографию, хроматографию с исключением по размерам, анионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, комбинации указанных методов и т.п. Могут потребоваться модификации или дополнительные методы для удаления из представляющего интерес полипептида примесей, таких как совместно мигрирующие белки. Методы измерения уровней эндотоксина хорошо известны специалистам в данной области и включают, без ограничения, анализы Ыти1и8 АтеЬосу!е Ьука!е (БАЕ). ЕпбокаГе™-РТ8 анализ является колориметрическим и включает систему с одной трубкой, в которой используют картриджи, предварительно заполненные БАЕ реагентом, хромогенный субстрат и контрольный стандартный эндотоксин вместе с ручным спектрофотометром. Альтернативные методы включают, без ограничения, кинетический БАЕ метод, который является турбодиметрическим и его используют в формате 96-луночного планшета.

Широкий круг методов и процедур можно использовать для оценки выхода и степени чистоты ЬСС8Е белка, включающего одну или более из не кодируемых в природе аминокислот, включая, без ограничения, анализ Брэдфорда, 8О8-РАСЕ, 808-РАСЕ с окрашиванием серебром, 8О8-РАСЕ с окрашиванием кумасси брильянтовым голубым, масс-спектрометрию (включая, без ограничения, ΜЛ^^I-Т0Ε) и другие методы характеризации белков, хорошо известные специалистам в данной области.

Дополнительные методы включают, без ограничения, 8О8-РАСЕ, совмещенный с методами окрашивания белка, иммуноблоттинг, матричную лазерную десорбционно/ионизационную массспектрометрию (МАЕОЕМБ), жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию, изоэлектрическое фокусирование, аналитический анионообмен, хроматофокусирование и круговой дихроизм.

VIII. Экспрессия в альтернативных системах.

Было использовано несколько подходов для введения неприродных аминокислот в белки в нерекомбинантных клетках-хозяевах, мутагенезированных клетках-хозяевах или в несодержащих клеток системах. Такие системы также пригодны для использования при получении полипептидов ЬС-С8Е настоящего изобретения. Получение производных аминокислот с реакционноспособными боковыми цепями, такими как Бук, Сук и Туг, приводит к превращению лизина в Ф-ацетил-лизин. Химический синтез также предлагает метод прямого включения неприродных аминокислот. Учитывая последние достижения в области ферментативного лигирования и нативного химического лигирования пептидных фрагментов, становится возможным получать более крупные белки; см., например, Р.Е. Оатекоп и 8.В.Н. Кеп!, Аппи. Кет. Вюсйет., 69: 923 (2000). Химическое лигирование пептидов и нативное химическое лигирование раскрыты в патенте США № 6184344, в патентной публикации США № 2004/0138412, в патентных публикациях США № 2003/0208046, \У0 02/098902 и \У0 03/042235, которые включены в описание посредством ссылки. Общий ίη νίίτο биосинтетический способ, в котором супрессорную тРНК, химически ацилированную неприродной аминокислотой, добавляют к ίη νίίτο экстракту, способному поддерживать

- 84 019968 биосинтез белка, использовали для сайт-специфического встраивания более 100 неприродных аминокислот в различные белки практически любого размера; см., например, У/ν. СогЫкЬ, Ό. Меибе1 аиб Р.С. 8сЫ111/, Αидеν. СЬет. 1й. Еб. Еид1., 1995, 34:621 (1995); С.1. №геи, 8.1. ΑйЬоиу-СаЫ1^, М.С. СпГГЬЬ, Р.С. 8сЫ111/, Α деиега1 теГЬоб Гог кйе-кресШс тсогрогайои о! штайнЫ атто ас1бк тГо ргоГешк, 8с1еисе, 244:182-188 (1989) и Ι.Ό. Ват, С.С. С1аЬе, Τ.Α. Όίχ, Α.Β. СЬатЬегйи, Е.8. Э1а1а, ВюкуйЬебс кйе-кресШс тсогрогабои оГ иои-гаГш^ атто аабк тГо ро1урерйбек, 1. Αт. СЬет. 8ос., 111: 8013-8014 (1989). Широкий круг функциональных групп вводили в белки для исследований стабильности белка, укладки белка, ферментного механизма и сигнальной трансдукции.

Был разработан т νί\Ό способ, называемый встраиванием при селективном давлении, чтобы использовать промискуитет дикого типа синтетазы; см., например, Ν. Виб1ка, С. Мткк, 8. ΑΕΓ;^γ, V. Vеиде^, ЕМ. Эоид, Ь. Могобег и В. НиЬег, ЕΑ8ΕВ 1., 13:41 (1999). Ауксотропный штамм, в котором выключен соответствующий метаболический путь, который снабжает клетку конкретной природной аминокислотой, выращивают в минимальной среде, содержащей ограниченные концентрации природной аминокислоты, причем транскрипция мишеневого гена подавлена. При наступлении стационарной фазы роста природная аминокислота истощается и ее заменяют аналогом неприродной аминокислоты. Индуцирование экспрессии рекомбинантного белка приводит к накоплению белка, содержащего неприродный аналог. Например, используя указанную стратегию, о-, м- и п-фторфенилаланины были встроены в белки, и они демонстрируют два характеристических плеча в УФ-спектре, которые легко определяются, см., например, С. Мткк, В. НиЬег, Ь. Могобег и Ν. Виб1ка, Απη! ВюсЬет., 284:29 (2000); трифторметионин был использован для замены метионина в лизоциме Т4 бактериофага для исследования его взаимодействия с хитоолигосахаридными лигандами с помощью ¹⁹Е ЯМР, см., например, Н. Оие\уе1, Е. ЭанЬ, У. ВоЬ1икои аиб ЕЕ. Ноиек, В1осЬет1кГгу, 36:3404 (1997); и трифторлейцин был встроен вместо лейцина, что привело к повышенной термической и химической стабильности белка лейциновой-молнии; см., например, Υ. Таид, С. СЫг1аиба, ν.Α. Ре!ка, Т. Nака^^та, ν.Ε. ЭеСгабо и Ό.Α. Т1гге11, Αι^\ν. СЬет. 1иГ, Еб. Еид1., 40: 1494 (2001). Кроме того, селенометионин и теллурометионин включают в различные рекомбинантные белки для облегчения фаз разрешения в рентгеновской кристаллографии; см., например, ν.Α. Неибпсккои, ЕВ. НогГои аиб О.М. ЬетакГег, ЕМВО 1., 9: 1665 (1990); ЕО. Во1ек, К. Ее\утккк М. КииНе, ΕΌ. Обот, В. Пийар, Ь. ЬеЫоба аиб М. НаГаба, №11, 8ГгисГ. Вю1., 1: 283 (1994); Ν. Виб1ка, В. 8Ге1ре, Р. Петаиде, С. Ескегккоги, 1. Ке^тиии и В. НиЬег, Еиг. 1. ВюсЬет., 230: 788 (1995) и Ν. Виб1ка, V. КагиЬгоск, 8. 8ГетЬасЬег, Α. Нитт, Ь. Ргабе, Т. №иеГетб, Ь. Могобег аиб В. НиЬег, 1. Мо1. Вю1., 270: 616 (1997). Аналоги метионина с алкеновой или алкиновой функциональностями также были эффективно встроены, что позволило осуществить дополнительные модификации белков химическими средствами; см., например, ЕС. уаи НекГ и ΌΑ. Тпте11, ЕЕВ8 Ьей., 428: 68 (1998); ЕС. уаи НекГ, К.Ь. Киск аиб Ό.Α. Тйге11, 1. Αт. СЬет. 8ос., 122: 1282 (2000) и К.Ь. Киск аиб Ό.Α. Тпте11, ТейаЬебгои, 56: 9487 (2000); патент США № 6586207; патентную публикацию США 2002/0042097, которые включены в описание посредством ссылки.

Успех указанного способа зависит от распознавания аналогов неприродной аминокислоты аминоацил-тРНК синтетазой, что обычно требует высокой селективности, чтобы гарантировать точность трансляции белка. Одним из путей увеличения объема указанного способа является ослабление субстратной специфичности аминоацил-тРНК синтетазы, что было достигнуто в ограниченном числе случаев. Например, замена Ма²⁹⁴ на С1у в ЕксЬепсЫа сой фенилаланил-тРНК синтетазе (РЬеВ8) увеличивает размер субстратного связывающего кармана и в результате приводит к ацилированию тРНК РЬе п-С1фенилаланином (р-С1-РЬе); см. М. 1ЬЬа, Р. КакГ аиб Н. Неггиеске, ВюсЬет1кйу, 33: 7107 (1994). Штамм ЕксЬепсЫа сой, несущий эту мутантную РЬеВ8, обеспечивает встраивание п-С1-фенилаланина или п-Вгфенилаланина вместо фенилаланина; см., например, М. 1ЬЬа аиб Н. Негп-юске, ЕЕВ8 Ьей., 364: 272 (1995) и Ν. 8Ьагта, В. ЕигГег, Р. КакГ аиб Ό.Α. Т1гге11, ЕЕВ8 Ьей., 467: 37 (2000). Аналогично, точечная мутация РЬе1308ег вблизи сайта связывания аминокислоты ЕксЬепсЫа сой тирозил-тРНК синтетазы, как было показано, позволяет встраивать азатирозин более эффективно, чем тирозин; см. Е. Натаио-Такаки, Т. 1\\ата, 8. 8айо^аио, К. Такаки, Υ. Моибеи, М. КйаЬаГаке, Ό. 8ой аиб 8. МкЫтига, 1. Вю1. СЬет., 275: 40324 (2000).

Другая стратегия включения неприродных аминокислот в белки 1и у1уо сводится к модификации синтетазы, которая имеет корректирующие механизмы. Такие синтетазы нельзя различить, поэтому активируют аминокислоты, которые структурно близки к когнатным природным аминокислотам. Указанная ошибка исправляется в отдельном сайте, который деацилирует неправильно сосчитанную аминокислоту от тРНК для сохранения точности трансляции белка. Если корректирующую активность синтетазы отключают, структурные аналоги, которые ошибочно активированы, могут избежать функции редактирования и могут быть встроены. Такой подход был недавно продемонстрирован на валил-тРНК синтетазе (Уа1В8); см. У. Эогтд, Н.Э. Моо1/, ЬА. №шд1е, Т.Ь. Неибпсккои, У. бе Сгесу-Ьадагб, Р. 8сЫтте1 и Р. МагЬеге, 8с1еисе, 292: 501 (2001). Уа1В8 могут ошибочно аминоацилировать тРНК Уа1 Сук, ТЬг или аминобутиратом (Αόιι); указанные нонкогнатные аминокислоты затем гидролизуют по редактирующему домену. После случайного мутагенеза хромосомы ЕксЬепсЫа соЬ селектируют мутантный штамм ЕксЬепсЫа сой, который содержит мутацию в сайте редактирования Уа1В8. Такая дефективно

- 85 019968 редактированная Vа1Я8 ошибочно считывает тРНК Vа1 с Суз. Так как АЬи стерически напоминает Суз (-8Н группа в Суз заменена -СН3 в АЬи), мутантная Vа1Я8 также встраивает АЬи в белки, если указанный мутантный штамм ЕзсйегЧсйЧа сой выращивают в присутствии АЬи. Масс-спектрометрический анализ показывает, что около 24% валинов заменены на АЬи в каждом положении валина в нативном белке.

Твердофазный синтез и полусинтетические методы также позволяют проводить синтез многих белков, содержащих новые аминокислоты. Например, см. следующие публикаци и цитированные в них ссылки: СгЧск, Е.Н.С., ВаггеЧЧ, Ь. Вгеппег, 8. АаЧЧз-ТоЬЧп, Я. Сепега1 паЧиге оГ Чйе депебс собе Гог ргоЧеЧпз. №Чиге, 192: 1227-1232 (1961); НоГтапп, К., Войп, Н. 8ЧибЧез оп ро1урерЧ1без. XXXVI. Тйе еГГесЧ оГ ругаζο1е-^т^баζο1е гер1асетепЧз оп Чйе 8-ргоЧеЧп асЧЧуаЧЧпд роЧепсу оГ ап 8-рерЧЧбе ГгадтепЧ, Ч. Ат Сйет, 88(24): 5914-5919 (1966); КаЧзег, Е.Т. 8упЧйеЧЧс арргоасйез Чо Ью1одюа11у асЧЧуе рерЧЧбез апб ргоЧеЧпз тсЧибтд еηуζтез, Асс. Сйет. Яез., 22: 47-54 (1989); NакаЧзика, Т., 8азакЧ, Т., КаЧзег, Е.Т. Рерббе зедтепЧ соирбпд саЧай^еб Ьу Чйе зетЧзупЧйеЧЧс еηζуте ЧйЧозиЬб1ЧзЧп, Ч Ат Сйет 8ос., 109: 3808-3810 (1987); 8сйηο1ζе^. М., КепЧ, 8.В.Н. СопзЧгисЧтд ргоЧеЧпз Ьу боуеЧаШпд ипргоЧесЧеб зупЧйеЧЧс рерИбез: ЬаскЬопе-епдтеегеб НШ ргоЧеазе, 8сЧепсе, 256(5054): 221-225 (1992); СйаЧкеп, ГМ. 8етЧзупЧйебс рерИбез апб ргоЧеЧпз, СЯС СгЧЧ Яеу ВЧосйет, 11(3): 255-301 (1981); ОГГогб, Я.Е. РгоЧеЧп епдЧпеегЧпд Ьу сйетЧсаЧ теапз? РгоЧеЧп Епд., 1(3): 151157 (1987) и Часкзоп, Ό.Υ., ВигпЧег, Ч., Оиап, С., 8Чап1еу, М., Тот, Ч., Ае11з, Ч.А. А БезЧдпеб РерЧЧбе ЬЧдазе Гог ТоЧаЧ 8упЧйезЧз оГ ЯЧЬописЧеазе А \уйй иппаЧига1 СаЧа1убс ЯезЧбиез, 8сЧепсе, 266 (5183): 243 (1994).

Химическая модификация была использована для введения различных неприродных боковых цепей, включая кофакторы, спиновые метки и олигонуклеотиды, в белки Чп уЧЧго; см., например, Согеу, Б.Я., 8сйи1Чζ, Р.С. СепегаЧЧоп оГ а йуЬгЧб зес.|иепсе-зресЧПс зЧпдЧе-зЧгапбеб беохугЧЬописЧеазе, 8сЧепсе, 238(4832): 1401-1403 (1987); КаЧзег, Е.Т., Ьаотепсе Ό.8., ЯокЧЧа, 8.Е. Тйе сйетЧса1 тобЧйсаЧЧоп оГ еηζутаЧЧс зресЧйсЧЧу, Аппи Яеу ВЧосйет, 54: 565-595 (1985); КаЧзег, Е.Т., Ьа^гепсе, Ό.8. СйетЧса1 тиЧаЧЧоп оГ еηуζте асЧЧуе зЧЧез, 8сЧепсе, 226(4674): 505-511 (1984); №еЧ, К.Е., №1псЧ А., Козй1апб, Б.Е. Ргорегйез оГ ЧйЧоЧ-зиЬЧЧЧЧзЧп, Ч. ВЧоЧ. Сйет., 243(24): 6392-6401 (1968); Ро1даг, Ь., М.Ь. Вепбег. А пе\у еηζуте сопЧаЧпЧпд а зупЧйеЧЧса11у Гогтеб асЧЧуе зЧЧе. ТйЧоЧ-зиЬЧЧЧЧзЧп. Ч. Ат Сйет 8ос., 88: 3153-3154 (1966) и Ро11аск, 8.Ч., Nакауата, С. 8сйи1^, Р.С. ШЧгобисбоп оГ писЧеорйЧЧез апб зресбозсорЧс ргоЬез ЧпЧо апЧЧЬобу сотЬЧпЧпд зЧЧез, 8сЧепсе, 242(4881): 1038-1040 (1988).

Альтернативно, биосинтетические методы, в которых используют химически модифицированные аминоацил-тРНК, были использованы для встраивания нескольких биофизических зондов в белки, синтезированные Чп уЧЧго; см. следующие публикации и цитированные в них ссылки: Вгиппег, Ч. №\у РйоЧоЧаЬейпд апб сгоззйпкЧпд теЧйобз, Аппи. Яеу. ВЧосйет., 62:483-514 (1993) и КгЧед, и.С., Аа1Чег, Р., Нойпзоп, А.Е. РйоЧосгоззйпкЧпд оГ Чйе зЧдпа1 зесщепсе оГ пазсепЧ ргергоЧасЧЧп оГ Чйе 54-кЧ1оба1Чоп роЧурерЧЧбе оГ Чйе зЧдпаЧ гесодпЧЧЧоп рагЧЧсЧе, Ргос. №Ч1. Асаб. 8сЧ, 83(22): 8604-8608 (1986).

Ранее было показано, что неприродные аминокислоты могут быть сайт-специфически встроены в белки Чп уЧЧго, путем добавления химически аминоацилированных супрессорных тРНК в реакции синтеза белка, программируемые геном, содержащим необходимую амберную бессмысленную мутацию. Используя такие подходы, можно заменить ряд из обычных двадцати аминокислот близкими структурными гомологами, например фторфенилаланином вместо фенилаланина, используя штаммы, ауксотропные для конкретной аминокислоты; см., например, №геп, С.Ч., АпЧйопу-СайЧЧЧ, СпГйЧй, М.С., 8сйи1Чζ, Р.С. А депега1 теЧйоб Гог зЧЧе-зресЧйс ЧпсогрогаЧЧоп оГ иппаЧигаЧ атЧпо асЧбз ЧпЧо ргоЧеЧпз, 8сЧепсе, 244: 182-188 (1989); М.А. №\уак, еЧ а1., 8сЧепсе, 268: 439-42 (1995); ВаЧп, 4.Ό., С1аЬе, С.С., БЧх, Т.А., СйатЬейЧп, А.Я., ПЧа1а, Е.8. ВЧозупЧйеЧЧс зЧЧе-зресЧйс Шсогрогабоп оГ а поп-паЧига1 атЧпо асЧб ЧпЧо а ро1урерЧЧбе, Ч. Ат Сйет 8ос., 111: 8013-8014 (1989); Ν. ВибЧза еЧ а1., ЕА8ЕВ Ч., 13: 41-51 (1999); Ейтап, Ч.А., Мепбе1, Ό., АпЧйопуСайЧб, 8., №геп, С.Ч., 8сйиЧЧζ, Р.С. ВЧозупЧйеЧЧс теЧйоб Гог ЧпЧгобисЧпд иппаЧига1 атЧпо асЧбз зЧЧе-зресЧйсаПу ЧпЧо ргоЧеЧпз, МеЧйобз Чп Е|у, уо1. 202, 301-336 (1992) и Мепбе1, Ό., СогпЧзй, ν.Α. & 8сйиЧЧζ, Р.С. 8ЧЧеБЧгесЧеб МиЧадепезЧз ^ЧЧй ап Ехрапбеб СепеЧЧс Собе, Аппи Яеу ВЧорйуз. ВЧото1 8ЧгисЧ., 24, 435-62 (1995).

Например, получают супрессорную тРНК, которая распознает стоп-кодон ИАС, и химически аминоацилируют неприродной аминокислотой. Обычный сайт-направленный мутагенез используют для введения стоп-кодона ТАС в представляющий интерес сайт в гене белка; см., например, 8ауегз, Ч.Я., 8сйтЧбЧ, А. ЕскзЧеЧп, Е. 5'-3' Ехопис1еазез Чп рйозрйогоЧйЧоаЧ-Ьазеб о1щпоис1еоибе-бйес1еб тиЧадепзЧз, Νυс1еЧс АсЧбз Яез, 16(3): 791-802 (1988). Если ацилированная супрессорная тРНК и мутантный ген объединяют в Чп уЧЧго транскрипционно/трансляционную систему, неприродную аминокислоту встраивают в ответ на ИАС кодон, что приводит к получению белка, содержащего указанную аминокислоту в специфическом положении. Эксперименты с использованием [³Н]-Рйе и эксперименты с α-гидроксикислотами продемонстрировали, что только целевая аминокислота встроена в положение, специфицированное ИАС кодоном, и что указанная аминокислота не встроена ни в какие другие сайты в белке; см., например, Коген, еЧ а1., см. выше; КоЬауазйЧ еЧ а1. (2003) №1Шге 8ЧгисЧига1 ВЧо1оду, 10 (6): 425-432 и Ейтап, Ч.А., Мепбе1, Ό., 8сйиЧЧζ, Р.С. 8ЧЧе-зресЧйс ЧпсогрогаЧЧоп оГ поуе1 ЬаскЬопе зЧгисЧигез Чп ргоЧеЧпз, 8сЧепсе, 255 (5041): 197200 (1992).

тРНК может быть аминоацилирована нужной аминокислотой с помощью любого способа или методики, включая, без ограничения, химическое или ферментативное аминоацилирование.

Аминоацилирование можно осуществить с помощью аминоацил-тРНК синтетазы или другой фер

- 86 019968 ментной молекулы, включая, без ограничения, рибозимы. Термин рибозим является взаимозаменяемым с термином каталитическая РНК. Сесй с сотрудниками (Сесй, 1987, δс^еηсе, 236: 1532-1539; МсСогк1е е! а1., 1987, Сопсер!к Вюсйет., 64: 221-226) продемонстрировали присутствие природных РНК, которые действуют как катализаторы (рибозимы). Однако, хотя указанные природные РНК катализаторы должны были действовать только на субстраты рибонуклеиновой кислоты для расщепления и сплайсинга, последнее развитие искусственной эволюции рибозим расширило репертуар катализаторов для различных химических реакций. Исследования идентифицировали РНК молекулы, которые могут катализировать аминоацил-РНК связи по их собственным (2')3'-концам (Шапдакекаге е! а1., 1995, δс^еηсе, 267: 643-647), и РНК молекулу, которая способна переносить аминокислоту с одной РНК молекулы на другие (Бойке е! а1., 1996, №!иге, 381: 442-444).

В опубликованной заявке на патент США 2003/0228593, которая включена в описание посредством ссылки, раскрыты методы конструирования рибозимов и их использование при аминоацилировании тРНК кодируемыми в природе и не кодируемыми в природе аминокислотами. Субстратиммобилизованные формы ферментных молекул, которые способны аминоацилировать тРНК, включая, без ограничения, рибозимы, могут способствовать эффективной аффинной очистке аминоацилированных продуктов. Примеры подходящих субстратов включают агарозу, сефарозу и магнитные шарики. Получение и использование субстрат-иммобилизованных форм рибозимов для аминоацилирования раскрыто в Сйе1шк1гу апб Вю1оду, 2003, 10: 1077-1084 и в опубликованной патентной заявке США 2003/0228593, которые включены в описание посредством ссылки.

Методы химического аминоацилирования включают, без ограничения, те, которые представлены Несй! с сотрудниками (Несй!, δΜ. Асс. Сйет. Век., 1992, 25, 545; Неск1ег, Т.С.; Воеккег, кВ.; Xи, С.; Сйапд, Р.; Несй!, δΜ. Вюсйет1к!гу, 1988, 27, 7254; Несй!, δΜ.; А1Гогб, В.Ь.; Кигоба, Υ.; Кйапо, δ. I. Вю1. Сйет., 1978, 253, 4517) апб Ьу δ^υ1!ζ, СйатЬегНп, ПоидйеПу апб о!йегк (Согшкй, ν.ν.; Мепбе1, Ό.; δΛώ!ζ, Р.С. Апде\\\ Сйет. 1п!. Еб. Епд1., 1995, 34, 621; ВоЬейкоп, 8.А.; Е11тап, кА.; δΛπ1!ζ, Р.С. I. Ат. Сйет. δοс., 1991, 113, 2722; №геп, С.к; Ап!йопу-Сай111, δ.Ι.; Спййй, М.С.; δΛώ!ζ, Р.С. δ^ι^, 1989, 244, 182; Ваш, Ι.Ό.; С1аЬе, С.С.; Όίχ, Т.А.; СйатЬегйп, А.В. к Ат. Сйет. 8ос., 1989, 111, 8013; Ваш, Ι.Ό. е! а1., №|1иге, 1992, 356, 537; Са1йуап, кР.; Ьек!ег, Н.А.; ПоидйеПу, О.А. Сйет. Вю1., 1997, 4, 740; ТигсаИк е! а1., к Вю1. Сйет., 1996, 271, 19991; Хомак, ММ. е! а1., δс^еηсе, 1995, 268, 439; δакκ, М.Е. е! а1., к Вю1. Сйет., 1996, 271, 23169; Нойкака, Т. е! а1., I. Ат. Сйет. δοс., 1999, 121, 34), которые включены в описание посредством ссылки, чтобы избежать использования синтетазы при аминоацилировании. Такие методы или другие химические методы аминоацилирования можно использовать для аминоацилирования тРНК молекул.

Методы создания каталитических РНК могут включать создание отдельных пулов случайных рибозимных последовательностей, осуществления направленной эволюции пулов, скрининг пулов в поисках желательной активности аминоацилирования и селекцию последовательностей таких рибозимов, которые демонстрируют необходимую активность аминоацилирования.

Рибозимы могут включать мотивы и/или участки, которые увеличивают активность ацилирования, такие как ССи мотив и υ-обогащенный участок. Например, сообщалось, что υ-обогащенный участок может облегчить распознавание субстрата аминокислоты и ССБ-мотив может образовывать пары оснований с 3'-концом тРНК. В комбинации ССБ и мотив и υ-обогащенный участок облегчают одновременное распознавание и аминокислоты, и тРНК и тем самым облегчают аминоацилирование 3'-конца тРНК.

Рибозимы можно создать, используя ш У1!го селекцию, используя частично рандомизированный г24ш1ш конъюгированный с ΐΒNΑ^Αкη _СССС, с последующим систематическим конструированием консенсусной последовательности, найденной в активных клонах. Пример рибозима, полученного указанным способом, называют Рх3 рибозим и он раскрыт в опубликованной заявке на патент США № 2003/0228593, содержание которой включено в описание посредством ссылки, действует как разносторонний катализатор для синтеза различных аминоацил-тРНК, содержащих когнатные неприродные аминокислоты.

Иммобилизацию на субстрате можно использовать для обеспечения эффективной аффинной очистки аминоацилированных тРНК. Примеры подходящих субстратов включают, без ограничения, агарозу, сефарозу и магнитные шарики. Рибозимы можно иммобилизовать на смолах, используя преимущество химического строения РНК, такое как то, что 3'-цис-диол на рибозе РНК может быть окисленным периодатом с получением соответствующего диальдегида для облегчеия иммобилизации РНК на смоле. Можно использовать различные типы смол, включая дешевые гидразидные смолы, где восстановительное аминирование превращает взаимодействие между смолой и рибозимом в необратимую связь. Синтез аминоацил-тРНК можно значительно облегчить, используя указанную методику аминоацилирования на колонке. Коигоикйк е! а1., Ме!йобк, 2005, 36:239-4 описывает систему аминоацилирования с использованием колонки.

Выделение аминоацилированных тРНК можно осуществить различными способами. Один подходящий способ представляет собой элюирование аминоацилированных тРНК из колонки с помощью буфера, такого как раствор ацетата натрия с 10 мМ ЕОТА, буфера, содержащего 50 мМ Ν-(2гидроксиэтил)пиперазин-№-(3-пропансульфоновой кислоты), 12,5 мМ КС1, рН 7,0, 10 мМ ЕОТА или

- 87 019968 просто ЕЭТА, забуференной воды (рН 7,0).

Аминоацилированные тРНК можно добавлять в реакции трансляции для того, чтобы встроить аминокислоту, которой была аминоацилирована тРНК, в положение, выбранное в полипептиде, полученном в реакции трансляции. Примеры трансляционных систем, в которых можно использовать аминоацилированную тРНК настоящего изобретения, включают, без ограничения, клеточные лизаты. Клеточные лизаты представляют собой компоненты реакции, необходимые для ш уйго трансляции полипептида из добавленной мРНК. Примеры таких компонентов реакций включают, без ограничения, рибосомальные белки, рРНК, аминокислоты, тРНК, СТР, АТР, инициаторы трансляции, факторы элонгации и дополнительные факторы, связанные с трансляцией. Кроме того, системы трансляции могут быть периодическими или раздельными трансляциями. В системе периодической трансляции скомбинированы компоненты системы в одном отделении, тогда как в системе раздельной трансляции компоненты реакции трансляции отделены от продуктов реакции, которые могут снизить эффективность трансляции. Такие трансляционные системы доступны коммерчески.

Кроме того, можно использовать объединенную систему транскрипции/трансляции. Объединенные системы транскрипции/трансляции позволяют осуществлять как транскрипцию вводимой ДНК в соответствующие мРНК, которые, в свою очередь, транслируются компонентами реакции. Примером коммерческой объединенной системы транскрипции/трансляции является Яар1б Тгапк1а!юп 8ук!ет (ЯТ8, ЯосНе Шс.). Указанная система включает смесь, содержащую лизат Е. сой, для обеспечения трансляционных компонентов, таких как рибосомы и факторы трансляции. Кроме того, РНК полимеразу включают для транскрипции вводимой ДНК в матрицу мРНК для использования при трансляции. ЯТ8 может использовать разделение компонентов реакции, располагая мембрану между отделениями для реакции, включая отделение подачи/отходов и отделение транскрипции/трансляции.

Аминоацилирование тРНК можно осуществить другими агентами, включая, без ограничения, трансферазы, полимеразы, каталитические антитела, многофункциональные белки и т.п.

8!еНап в 8с1еп!1к!, 2005, 0с!. 10; р. 30-33 описывает дополнительные методы встраивания не кодируемых в природе аминокислот в белки. Ьи е! а1., шМо1. Се11., 2001, 0с!.; 8(4): 759-69 раскрывают способ, в котором белок химически лигируют с синтетическим пептидом, содержащим неприродные аминокислоты (лигирование экспрессированного белка).

Микроинъекционные методики также были использованы для внедрения неприродных аминокислот в белки; см., например, МАУ. №\\'ак, Р.С. Кеагпеу, !Я. 8атркоп, М.Е. 8акк, С.С. ЬаЬагса, 8.К. 811уегтап, \У.С. 2йопд, I. Тйогкоп, к№ АЬе1коп, N. Этэбкоп, Р.С. 8с1и.111/, Э.А. ЭондНеПу апб Н.А. Ьек!ег, 8с1епсе, 268:439 (1995) и ΌΑ. ЭондНеПу, Сигг. 0рт. СНет. Вю1., 4:645 (2000). Xепοрик ооцит конъюгируют с двумя видами РНК, полученными ш уйго: мРНК, кодирующей белок-мишень с ИАС стопкодоном в представляющем интерес положении аминокислоты, и амбер супрессорную тРНК, аминоацилированную нужной неприродной аминокислотой. Затем механизм трансляции ооцита встраивают в неприродную аминокислоту в положение, специфицировнное ИАС. Указанный способ позволил осуществить 1п у1уо структурно-функциональные исследования интегральных мембранных белков, которые обычно не поддаются ш уйго экспрессиионным системам. Примеры включают встраивание флуоресцентной аминокислоты в тахикининовый рецептор нейрокинина-2 для измерения расстояний с помощью резонансного переноса флуоресцентной энергии; см., например, С. Тигса!Б, К. №те!й, Μ.Ό. ЕбдеПоп, и. Меке!й, Е. Та1аЬо!, М. Рейксй, I. КпоМек, Н. ^де1 апб А. СНо11е!, I. Вю1. СНет., 271: 19991 (1996); !Не шсогрогаБоп оТ Ью!шу1а!еб атто аабк !о 1беп!йу кигТасе-ехрокеб геыбиек ш юп сНаппе1к, кее, е.д., ТР. Са1йуап, Н.А. Ьек!ег апб Ό.Λ. ОоидНеПу, СНет. Вю1., 4: 739 (1997); !Не ике оТсадеб 1угок1пе апа1одк !о топйог сопТогта!юпа1 сНапдек т ап юп сНаппе1 ш геа1 Бте, кее, е.д., ТС. МШег, 8.К. 8йуегтап, Р.М. Епд1апб, Ό.Λ. ЭондНеПу апб Н.А. Ьек!ег, Хейган, 20: 619 (1998); апб !йе ике оТ а1рНа Нубгоху атто аабк !о сНапде юп сНаппе1 ЬаскЬопек Тог ргоЬтд !Ней дайпд тесйатктк. 8ее, е.д., Р.М. Епд1апб, Υ. 2йапд, Ό.Λ. ЭондНеПу апб Н.А. Ьек!ег, Се11, 96: 89 (1999) апб Т. Ьи, ΑΥ. Ттд, Т Мат1апб, ΚΥ. Бт, Р.С. 8сНн11х апб I Υапд, №11. №игокск, 4: 239 (2001).

Способность встраивать неприродные аминокислоты непосредственно в белки ш у1уо предлагает широкий круг преимуществ, включая, без ограничения, высокие выходы мутантных белков, техническую простоту, возможность исследования мутантных белков в клетках или, возможно, в живых организмах, и использование указанных мутантных белков в терапевтических и диагностических целях. Способность включать неприродные аминокислоты с различными размерами, кислотностями, нуклеофильностями, гидрофобностями и другими свойствами в белки может значительно расширить наши возможности рационально и систематически изменять структуры белков как для исследования функций белков, так и для создания новых белков или организмов с новыми свойствами.

В одной из попыток сайт-специфического встраивания рага-Е-РБе пару дрожжевая амбер супрессорная тРНК-НеСиА/фенилаланил-тРНК синтетаза используют в п-Е-РНе устойчивом, РНе ауксотрофическом штамме ЕксНегЫпа сой; см., например, Я. ЕшТег, Рго!еш 8ск, 7:419 (1998).

Может также оказаться возможным добиться экспрессии полинуклеотида ЬС-С8Е настоящего изобретения, используя не содержащую клеток (ш-уйго) трансляционную систему. Трансляционные системы могут быть клеточными или могут не содержать клеток и могут быть прокариотными или эукариот

- 88 019968 ными. Клеточные трансляционные системы включают, без ограничения, препараты целых клеток, такие как пермеабилизированные клетки или клеточные культуры, где нужную последовательность нуклеиновой кислоты можно транскрибировать в мРНК и транслировать полученную мРНК. Не содержащие клеток трансляционные системы коммерчески доступны и хорошо известны различные типы и системы. Примеры не содержащих клеток систем включают, без ограничения, прокариотные лизаты, такие как лизаты ЕксйепсЫа сой, и эукариотные лизаты, такие как экстракты зародышей пшеницы, клеточные лизаты насекомых, лизаты кроличьих ретикулоцитов, лизаты кроличьих ооцитов и человеческие клеточные лизаты. Эукариотные экстракты или лизаты могут оказаться предпочтительными, если получающийся белок является гликозилированным, фосфорилированным или модифицированным каким-либо другим способом, так как многие такие модификации возможны только в эукариотных системах. Некоторые из указанных экстрактов и лизатов доступны коммерчески (Рготеда; Майкоп, У1к.; 8!га!адепе; Ьа 1о11а, Са11Г.; Атегкйат; Аг1тд!оп Не1дй!к, 111.; С1ВСО/ВКЙ; Сгапй 1к1апй, Ν.Υ.). Мембранные экстракты, такие как экстракты поджелудочной железы собаки, содержащие микросомальные мембраны, также доступны и их можно использовать для трансляции секреторных белков. В указанных системах, которые могут включать или мРНК в качестве матрицы (т-νίίτο трансляция) или ДНК в качестве матрицы (объединенная тνίίτο транскрипция и трансляция), ш νίίτο синтез управляется рибосомами. Было предпринято множество попыток создания белковых экспрессионных систем, не содержащих клеток; см., например, К1т, Э.М. апй РЯ. 8\уагМ, В|о1есйпо1оду апй Вюепдтееппд, 74:309-316 (2001); К1т, Э.М. апй РЯ. 8\уагМ, Вю!есйпо1оду Ье!!егк, 22, 1537-1542, (2000); К1т, О.М., апй РЯ. 8νν;·ιπζ, ВюЮсйикИоду Ргодгекк, 16, 385-390, (2000); К1т, О.М. апй РЯ. 8νν;·ιπζ, ВюЮсйикИоду апй Вюепдтееппд, 66, 180-188, (1999) и Ра!па1к, Я. апй и 1.Я. 8ντίζ, Вюйсйтциек, 24, 862-868, (1998); патент США № 6337191; патентную публикацию США № 2002/0081660; \УО 00/55353; \УО 90/05785, которые включены в описание посредством ссылки. Другие подходы, которые можно использовать для экспрессии полипептидов ЬС-С8Р, включающих не кодируемую в природе аминокислоту, включают методику слияния мРНК-пептид; см., например, Я. ЯоЬейк апй I. 8ζοкίак, Ргос. №Й. Асай. 8ск И8А, 94: 12297-12302 (1997); А. Ргапке1, е! а1., Сйет1кйу & Вю1оду, 10: 1043-1050 (2003). При таком подходе матрицу мРНК, связанную с пиромицином, транслируют в пептид на рибосоме. Если одна или более из тРНК молекул была модифицирована, неприродные аминокислоты также можно включить в пептид. После того как считан последний мРНК кодон, пуромицин захватывает С-конец пептида. Если обнаруживают, что полученный конъюгат мРНК-пептид обладает интересными свойствами в ш νίίτο анализе, его идентичность можно легко определить из мРНК последовательности. Таким образом, можно скринировать библиотеки полипептидов ЬС-С8Р, включающие одну или более из не кодируемых в природе аминокислот, для идентификации полипептидов, обладающих нужными свойствами. Сообщается, что позднее проведенные т νίίτο трансляции рибосомов с очищенными компонентами позволили синтезировать пептиды, замещенные не кодируемыми в природе аминокислотами; см., например, А. Рогк!ег е! а1., Ргос. Асай. 8с1 И8А, 100: 6353 (2003).

Можно также использовать восстановительные трансляционные системы. Смеси очищенных факторов трансляции также с успехом были использованы для трансляции мРНК в белок, также как и комбинации лизатов или лизатов, дополненных очищенными факторами трансляции, такими как фактор-1 инициирования (1Р-1), 1Р-2, 1Р-3 (α или β), фактор удлинения Т (ЕР-Ти) или факторы терминации. Системы без клеток можно также соединить с системами транскрипции/трансляции, где ДНК вводят в систему, транскрибируют в мРНК и полученную мРНК транслируют, как раскрыто в Сиггеп! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду (Р.М. АикиЬе1 е! а1., еййотк, \УПеу 1п!егкс1епсе, 1993), что специально включено в описание посредством ссылки. РНК, транскрибированная в эукариотной транскрипционной системе, может быть в форме гетероядерной РНК (йпКХА) или кэпов 5'-конца (7-метилгуанозин) и 3'-конца поли А с наращенным хвостовым олигонуклеотидом зрелой мРНК, которые могут оказаться выгодными в некоторых трансляционных системах. Например, кэпированные мРНК транслируют с высокой эффективностью в систему лизата ретиулоцитов.

IX. Макромолекулярные полимеры, присоединенные к полипептидам ЬС-С8Р.

Раскрытые здесь различные модификации полипептидов с неприродными аминокислотами могут быть осуществлены с использованием раскрытых здесь композиций, методов, методик и стратегий. Такие модификации включают встраивание дополнительной функциональности в компонент полипептида с неприродной аминокислотой, включая, без ограничения, гидроксиалкилкрахмал (НА8), гидроксиэтилкрахмал (НЕ8); метку; краситель; полимер; водорастворимый полимер; производное полиэтиленгликоля; фотосшивающий линкер; радионуклид; цитотоксическое соединение; лекарственное средство; метку аффинности; метку фотоаффинности; реакционноспособное соединение; смолу; второй белок или полипептид или аналог полипептида; антитело или фрагмент антитела; металлохелатор; кофактор; жирную кислоту; углеводород; полинуклеотид; ДНК; РНК; антисмысловой полинуклеотид; сахарид; водорастворимый дендример; циклодекстрин; ингибиторную рибонуклеиновую кислоту; биоматериал; наночастицы; спиновую метку; флуорофор, металлсодержащую молекулу; радиоактивную молекулу; новую функциональную группу; группу, которая ковалентно или нековалентно взаимодействует с другими молекулами; фотозахватывающую молекулу; молекулу, возбуждаемую актиничным излучением; фотоизомеризуемую молекулу; биотин; производное биотина; аналог биотина; молекулу, включающую тяжелый

- 89 019968 атом; химически отщепляемую группу; фотоотщепляемую группу; удлиненную боковую цепь; связанный с углеродом сахар; окислительно-восстановительный агент; аминотиокислоту; токсическую молекулу; изотопномеченную молекулу; биофизический зонд; фосфоресцентную группу; хемилюминесцентную группу; электроноплотную группу; магнитную группу; интеркалирующую группу; хромофор; агент переноса энергии; биологически активный агент; детектируемую метку; малые молекулы; наночастицы; нанотрансмиттер; радионуклеотид; радиотрансмиттер; агент захвата нейтронов; или любую комбинацию вышеперечисленных или других необходимых соединений или веществ. В качестве иллюстрации нелимитирующие примеры раскрытых здесь композиций, методов, методик и стратегий, следующие описания сфокусированы на добавлении макромолекулярных полимеров к полипептидам неприродных аминокислот при понимании того, что раскрытые здесь композиции, методы, методики стратегии также применимы (с соответствующими модификациями, при необходимости, и для того, чтобы специалист в данной области мог воспользоваться приведенными здесь раскрытиями) для добавления других функциональностей, включая, без ограничения, те, что перечислены выше.

Широкий круг макромолекулярных полимеров и других молекул может быть связан с полипептидами ЬС-С8Е настоящего изобретения для модулирования биологических свойств полипептидов ЬС-С8Е и/или для придания новых биологических свойств молекулам ЬС-С8Е. Такие макромолекулярные полимеры могут быть связаны с полипептидом ЬС-С8Е через кодируемую в природе аминокислоту, через не кодируемую в природе аминокислоту, или через любой функциональный заместитель природной или неприродной аминокислоты, или любой заместитель или функциональную группу, добавленную к природной или неприродной аминокислоте. Молекулярная масса полимера может меняться в широком интервале значений, включая, без ограничения, значения от около 100 до около 100000 Да или более. Молекулярная масса полимера может быть от около 100 до около 100000, включая, без ограничения, 100000, 95000, 90000, 85000, 80000, 75000, 70000, 65000, 60000, 55000, 50000, 45000, 40000, 35000, 30000, 25000, 20000, 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса полимера составляет величину от около 100 до около 50000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса полимера составляет величину от около 100 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса полимера составляет величину от около 1000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса полимера составляет величину от около 5000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса полимера составляет величину от около 10000 до около 40000 Да.

В настоящем изобретении предложены практически гомогенные препараты конъюгатов полимер:белок. Выражение практически гомогенный означает, что молекулы конъюгата полимер:белок наблюдаются больше чем в половине всего белка. Конъюгат полимер:белок обладает биологической активностью и представленные здесь практически гомогенные препараты ПЭГилированного полипептида ЬС-С8Е являются такими, которые в достаточной степени гомогенны, чтобы проявлять преимущества гомогенного препарата, например простоту клинического применения в предсказуемости сходимости фармакокинетических результатов.

Можно также выбрать приготовление смеси молекул конъюгата полимер:белок, и преимущество при таком выборе будет состоять в том, что можно выбрать соотношение монополимер:белок в конъюгате для включения в смесь. Так, при желании можно приготовить смесь различных белков с различным числом присоединенных к ним молекул полимера (т.е. ди-, три-, тетра- и т.д.) и, комбинируя указанные конъюгаты с конъюгатом монополимер:белок, полученным в соответствии с указанными способами настоящего изобретения, и получить смесь с заранее определенным соотношением монополимер:белковые конъюгаты.

Выбранный полимер может быть водорастворимым, так что белок, к которому он присоединен, не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Для терапевтического применения полученного в конечном виде препарата полимер должен быть фармацевтически приемлемым.

Примеры полимеров включают, без ограничения, полиалкиловые эфиры и их алкоксикэпированные аналоги (например, полиоксиэтиленгликоль, полиоксиэтилен/пропиленгликоль и их метокси- или этоксикэпированные аналоги, особенно полиоксиэтиленгликоль, причем последний известен также как полиэтиленгликоль или ПЭГ); поливинилпирролидоны; поливинилалкиловые простые эфиры; полиоксазолины, полиалкилоксазолины и полигидроксиалкилоксазолины; полиакриламиды, полиалкилакриламиды и полигидроксиалкилакриламиды (например, полигидроксипропилметакриламид и их производные); полигидроксиалкилакрилаты; полисиаловые кислоты и их аналоги; гидрофильные пептидные последовательности; полисахариды и их производные, включая декстран и производные декстрана, например карбоксиметилдекстран, сульфаты декстрана, аминодекстран; целлюлозу и ее производные, например карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозы; хитин и его производные, например хитозан, сукцинилхитозан, карбоксиметилхитин, карбоксиметилхитозан; гиалуроновую кислоту и ее производные; крахмалы; альгинаты; хондроитинсульфат; альбумин; пуллулан и карбоксиметилпуллулан; полиаминокислоты и их производные, например полиглутаминовые кислоты, полилизины, полиаспарагиновые кислоты, полиаспартамиды; сополимеры малеинового ангидрида, такие как сополимер стирола и

- 90 019968 малеинового ангидрида, сополимер дивинилэтилового эфира и малеинового ангидрида; поливиниловые спирты; их сополимеры; их терполимеры; их смеси; гидроксиалкилкрахмал (НА8), включая, без ограничения, гидроксиэтилкрахмал (НЕ8); и производные вышеперечисленных.

Отношение количества молекул полиэтиленгликоля к молекулам белка будет меняться, также как и их концентрации в реакционной смеси. Обычно оптимальное отношение (с точки зрения эффективности реакции в том, чтобы был минимальный избыток непрореагировавшего белка или полимера) можно определить по молекулярным массам выбранного полиэтиленгликоля и по количеству доступных реакционноспособных групп. Что касается молекулярного веса, то обычно чем больше молекулярная масса самого полимера, тем меньшее число полимерных молекул может быть присоединено к белку. Аналогично, при оптимизации параметров следует принимать во внимание разветвленность полимера. Обычно чем выше молекулярная масса (или чем больше разветвленность) тем выше отношение полимер:белок.

Когда речь идет о конъюгатах ПЭГ:полипептид ЬО-С8Р, выражение терапевтически эффективное количество относится к такому количеству, которое приносит животному необходимую пользу. Такое количество может меняться для различных индивидуумов и будет зависеть от ряда факторов, включая общее физическое состояние пациента и причины, которые вызвали подлежащее лечению заболевание. Количество полипептида ЬО-С8Р, которое используют для лечения, обеспечивает приемлемую степень изменения и сохранения необходимой реакции на благоприятном уровне. Терапевтически эффективное количество композиции настоящего изобретения может легко определить специалист в данной области, используя общедоступные материалы и процедуры.

Водорастворимый полимер может иметь любую структурную форму, включая, без ограничения, линейную, вилкообразную или разветвленную. Обычно водорастворимый полимер представляет собой поли(алкиленгликоль), такой как поли(этиленгликоль) (ПЭГ), но можно использовать другие водорастворимые полимеры. Так, например, ПЭГ использован для описания некоторых вариантов настоящего изобретения.

ПЭГ представляет собой хорошо известный водорастворимый полимер, который коммерчески доступен или его можно получить с помощью полимеризации этиленгликоля с раскрытием кольца в соответствии со способами, известными специалистам в данной области (8апб1ег апб Кага, Ро1утег 8уп!кек1к, Асабетк Ргекк, Хе\ν Υо^к, \о1. 3, р. 138-161). Термин ПЭГ широко используют для охвата всех молекул полиэтиленгликоля, независимо от размера или модификации на концах ПЭГ, и он может быть представлен как связанный с полипептидом ЬО-С8Р следующей формулой:

хо- (СН₂СН₂О) _п-сн₂сн₂-у, где п принимает значения от 2 до 10000 и Х представляет собой Н или терминальную модификацию, включая, без ограничения, С₁.₄ алкил, защитную группу или терминальную функциональную группу.

В некоторых случаях ПЭГ, используемый в настоящем изобретении, заканчивается на одном конце гидрокси или метокси, то есть X представляет собой Н или СН₃ (метокси ПЭГ). Альтернативно, ПЭГ может заканчиваться реакционноспособной группой, тем самым формируя бифункциональный полимер. Типичные реакционноспособные группы могут включать такие реакционноспособные группы, которые обычно используют для осуществления реакций с функциональными группами, находящимися в обычных аминокислотах (включая, без ограничения, малеимидные группы, активированные карбонаты (включая, без ограничения, п-нитрофениловый эфир), активированные сложные эфиры (включая, без ограничения, Ν-гидроксисукцинимид, п-нитрофениловый эфир) и альдегиды), также как функциональные группы, которые инертны в отношении 20 обычных аминоксилот, но которые реагируют специфически с комплементарными функциональными группами, присутствующими в не кодируемых в природе аминокислотах (включая, без ограничения, азидные группы, группы алкина). Следует заметить, что другой конец ПЭГ, который представлен в вышеприведенной формуле как Υ, будет присоединяться прямо или косвенно к полипептиду ЬО-С8Р через природную или не кодируемую в природе аминокислоту. Например, Υ может быть амидной, карбаматной или мочевинной связью с аминогруппой (включая, без ограничения, эпсилон аминлизина или Ν-конец) полипептида. Альтернативно, Υ может быть малеимидной связью с группой тиола (включая, без ограничения, тиольную группу цистеина). Альтернативно, Υ может быть связью с остатком, который обычно не доступен через 20 обычных аминокислот. Например, азидную группу на ПЭГ можно подвергнуть взаимодействию с группой алкина полипептида ЬО-С8Р с образованием [3+2] продукта циклоприсоединения Хьюсгена. Альтернативно, группу алкина ПЭГ можно подвергнуть взаимодействию с азидной группой, присутствующей в не кодируемой в природе аминокислоте с образованием аналогичного продукта. В некоторых вариантах сильный нуклеофил (включая, без ограничения, гидразин, гидразид, гидроксиламин, семикарбазид) можно подвергнуть взаимодействию с альдегидной или кетонной группой, присутствующей в не кодируемой в природе аминокислоте, с образованием гидразона, оксима или семикарбазона, как применимо, которые в некоторых случаях можно дальше восстановить путем обработки соответствующим восстанавливающим агентом. Альтернативно, сильный нуклеофил можно включить в полипептид ЬО-С8Р через не кодируемую в природе аминокислоту и использовать в реакции предпочтительно с кетонной или альдегидной группой, присутствующей в водорастворимом полимере.

- 91 019968

При желании можно использовать ПЭГ практически с любой подходящей молекулярной массой, включая, без ограничения, массы от около 100 до 100000 Да или больше при желании (включая, без ограничения, иногда 0,1-50 или 10-40 кДа). Молекулярная масса ПЭГ может меняться в широком интервале значений, включая, без ограничения, значения от около 100 до около 100000 Да или больше. Молекулярная масса ПЭГ может быть от 100 до около 100000, включая, без ограничения, 100000, 95000, 90000, 85000, 80000, 75000, 70000, 65000, 60000, 55000, 50000, 45000, 40000, 35000, 30000, 25000, 20000, 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 Да. В некоторых вариантах масса ПЭГ находится от около 100 до около 50000 Да. В некоторых вариантах масса ПЭГ находится от около 100 до около 40000 Да. В некоторых вариантах масса ПЭГ находится от около 1000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах масса ПЭГ находится от около 5000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах масса ПЭГ находится от около 10000 до около 40000 Да. Можно также использовать ПЭГс с разветвленными цепями, включая, без ограничения, ПЭГ молекулы, каждая из цепей которых имеет ММ в интервале 1-100 кДа (включая, без ограничения, 1-50 или 5-20 кДа). Молекулярная масса каждой из цепей ПЭГ с разветвленной цепью может быть, включая, без ограничения, величиной от около 1000 до около 100000 Да или больше. Молекулярная масса каждой из цепей ПЭГ с разветвленной цепью может находиться от около 1000 до около 100000 Да, включая, без ограничения, 100000, 95000, 90000, 85000, 80000, 75000, 70000, 65000, 60000, 55000, 50000, 45000, 40000, 35000, 30000, 25000, 20000, 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 и 1000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой цепи ПЭГ с разветвленной цепью находится от около 1000 до около 50000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой цепи ПЭГ с разветвленной цепью находится от около 1000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой цепи ПЭГ с разветвленной цепью находится от около 5000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой цепи ПЭГ с разветвленной цепью находится от около 5000 до около 20000 Да. Широкий круг молекул ПЭГ раскрыт, включая, без ограничения, в Ле 811еаг\уа1ег Ро1утег8, Лс. са!а1од, №1<1аг ТегареиЕсв са!а1од, который включен в описание посредством ссылки.

Обычно по меньшей мере один конец молекулы ПЭГ доступен для реакции с не кодируемой в природе аминокислотой. Например, ПЭГ производные, содержащие алкинную и азидную молекулы для взаимодействия с боковыми цепями аминокислоты, можно использовать для присоединения ПЭГ к не кодируемым в природе аминокислотам, как здесь раскрыто. Если не кодируемая в природе аминокислота включает азид, тогда ПЭГ обычно содержит или алкиновую молекулу для осуществления образования [3+2] продукта циклоприсоединения, или активированные виды ПЭГ (т.е. сложный эфир, карбонат), содержащие фосфиновую группу для осуществления образования амидной связи. Альтернативно, если не кодируемая в природе аминокислота включает алкин, тогда ПЭГ обычно содержит азидную молекулу для осуществления образования [3+2] продукта циклоприсоединения Хьюсгена. Если не кодируемая в природе аминокислота включает карбонильную группу, ПЭГ обычно включает эффективный нуклеофил (включая, без ограничения, гидразидную, гидразиновую, гидроксиламинную или семикарбазидную функциональность) для осуществления образования соответствующих гидразоновой, оксимной и семикарбазоновой связей соответственно. В других вариантах можно использовать обратную ориентацию реакционноспособных групп по сравнению с вышеописанной, то есть азидную молекулу в не кодируемой в природе аминокислоте можно подвергнуть взаимодействию с производным ПЭГ, содержащим алкин.

В некоторых вариантах вариант полипептида ЬС-С8Е с производным ПЭГ содержит химическую функциональность, которая является реакционноспособной в отношении химической функциональности, присутствующей на боковой цепи не кодируемой в природе аминокислоты.

В настоящем изобретении предложены в некоторых вариантах производные азид- и ацетиленсодержащего полимера, включающие основную цепь водорастворимого полимера, со средней молекулярной массой от около 800 до около 100000 Да. Основной полимерной цепью водорастворимого полимера может быть поли(этиленгликоль). Однако следует понимать, что большое разнообразие водорастворимых полимеров, включая, без ограничения, поли(этилен)гликоль и другие родственные полимеры, включая поли(декстран) и поли(пропиленгликоль), также являются подходящими для использования в практике настоящего изобретения, и предполагатся, что использование термина ПЭГ или поли(этиленгликоль) охватывает и включает все такие молекулы. Термин ПЭГ включает, без ограничения, поли(этиленгликоль) в любой из его форм, включая бифункциональные ПЭГ, многоплечие ПЭГ, производные ПЭГ, вилкообразные ПЭГ, разветвленные ПЭГ, ПЭГ с подвесками (т.е. ПЭГ или родственные полимеры, содержащие одну или более из функциональных групп, подвешенную к основной цепи полимера) или ПЭГ, содержащие разлагаемые связи внутри цепи.

ПЭГ обычно является прозрачным, бесцветным, без запаха, растворимым в воде, термостабильным, инертным в отношении многих химических агентов, негидролизуемым или неразлагающимся и обычно нетоксичным. Поли(этиленгликоль) считают биосовместимым, то есть говорят, что ПЭГ способен сосуществовать с живыми тканями или организмами не нанося им вреда. Более конкретно, ПЭГ является практически неиммуногенным, то есть говорят, что у ПЭГ отсутствует тенденция вызывать иммунную реакцию в организме. Будучи присоединен к молекуле, обладающей некоторыми желательными функ

- 92 019968 циями в организме, такими как свойства биологически активного агента, ПЭГ имеет тенденцию маскировать указанный агент и уменьшать или исключать любую иммунную реакцию, так что организм становится толерантным к присутствию указанного агента. Конъюгаты ПЭГ практически, по существу, не вызывают иммунной реакции, не вызывают коагуляции или других нежелательных эффектов. ПЭГ, имеющий формулу -СН₂СН₂О-(СН₂СН₂О)_п-СН₂СН₂-, где п принимает значения от около 3 до около 4000, обычно от около 20 до около 2000, является подходящим для использования в настоящем изобретении. ПЭГ с молекулярной массой от около 800 до около 100000 Да в некоторых вариантах настоящего изобретения особенно пригодны в качестве основной полимерной цепи. Молекулярная масса ПЭГ может меняться в широких пределах, включая, без ограничения, от около 100 до около 100000 Да или больше. Молекулярная масса ПЭГ может быть от около 100 до около 100000, включая, без ограничения, 100000, 95000, 90000, 85000, 80000, 75000, 70000, 65000, 60000, 55000, 50000, 45000, 40000, 35000, 30000, 2000, 20000, 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса ПЭГ находится от около 100 до около 50000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса ПЭГ находится от около 100 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса ПЭГ находится от около 1000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса ПЭГ находится от около 5000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса ПЭГ находится от около 10000 до около 40000 Да.

Основная полимерная цепь может быть линейной или разветвленной. Разветвленные основные полимерные цепи хорошо известны специалистам в данной области. Обычно разветвленный полимер имеет центральную разветвленную коровую молекулу и множество полимерных цепей, связанных с центральной основной цепью. ПЭГ обычно используют в разветвленных формах, которые можно получить путем добавления этиленоксида к различным полиолам, таким как глицерин, олигомеры глицерина, пентаэритритол и сорбит. Центральную разветвленную молекулу можно также получить из нескольких аминокислот, таких как лизин. Разветвленный поли(этиленгликоль) можно в общем виде представить как К(-ПЭГΟ^^ в котором К получен из коровой молекулы, такой как глицерин, олигомеры глицерина или пентаэритритол, и т представляет собой число ветвей. ПЭГ молекулы, состоящие из многих ветвей, такие как те, что раскрыты в патентах США №№ 5932462; 5643575; 5229490; 428872; опубликованном патенте США 2003/0143596; νΟ 96/21469 и νΟ 93/21259, которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте, также можно использовать в качестве основной полимерной цепи.

Разветвленный ПЭГ может также быть в форме вилкообразного ПЭГ, представленного ПЭГ(Υί',ΉΖ^),,, где Υ представляет собой связывающую группу и Ζ представляет собой активированную концевую группу, связанную с СН цепочкой атомов определенной длины.

Еще одна разветвленная форма, ПЭГ с подвесками, имеет реакционноспособные группы, такие как карбоксил, скорее вдоль основной цепи ПЭГ, нежели у конца цепи ПЭГ.

Кроме указанных форм, ПЭГ можно также получить полимер со слабыми или разлагаемыми связями в основной цепи. Например, можно получить ПЭГ со сложноэфирными связями в основной цепи полимера, которые подвергаются гидролизу. Как показано далее, такой гидролиз приводит к расщеплению полимера на фрагменты с более низкой молекулярной массой —ЛЭГ—СО₂—ЛЭГ—+Н₂О—· ПЭГ-СО₂Н+НО-ПЭГСпециалистам в данной области должно быть понятно, что термин поли(этиленгликоль)или ПЭГ представляет или включает все известные специалистам формы, включая, без ограничения, те, что здесь раскрыты.

Многие другие полимеры также являются подходящими для использования в настоящем изобретении. В некоторых вариантах основная полимерная цепь, которая является водорастворимой, содержащая от 2 до около 300 концов, особенно пригодна для использования в настоящем изобретении. Примеры подходящих полимеров включают, без ограничения, другие поли(алкиленгликоли), такие как поли(пропиленгликоль) (РРС), их сополимеры (включая, без ограничения, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля), их терполимеры, их смеси и т.п. Хотя молекулярная масса каждой основной цепи полимера может меняться, обычно она составляет величину в интервале от около 800 до около 100000, часто от около 6000 до около 80000 Да. Молекулярная масса каждой основной цепи полимера может быть от около 100 до около 100000 Да, включая, без ограничения, 100000, 95000, 90000, 85000, 80000, 75000, 70000, 65000, 60000, 55000, 50000, 45000, 40000, 35000, 30000, 25000, 20000, 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой основной цепи полимера составляет величину от около 100 до около 50000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой основной цепи полимера составляет величину от около 100 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой основной цепи полимера составляет величину от около 1000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой основной цепи полимера составляет величину от около 5000 до около 40000 Да. В некоторых вариантах молекулярная масса каждой основной цепи полимера составляет величину от около 10000 до около 40000 Да.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что приведенный выше список для практически водорастворимых основных цепей никоим образом не является исчерпывающим, но лишь иллюст

- 93 019968 ративным, и что все полимерные материалы, обладающие раскрытыми выше качествами, рассматриваются как подходящие для использования в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах настоящего изобретения производные полимера являются многофункциональными, что подразумевает, что основная цепь полимера имеет по меньшей мере два конца и возможно так много, как около 300 концов, функционализированных или активированных функциональными группами. Многофункциональные производные полимеров включают, без ограничения, линейные полимеры, содержащие два конца, причем каждый конец связан с функциональной группой, которые могут быть одинаковыми или различными.

В одном варианте производное полимера имеет стуктуру

Χ-Α-ΡΟΣΥ-Β-Ν=Ν=Ν, где Ν=Ν=Ν представляет собой азидную молекулу;

В представляет собой связывающую молекулу, которая может присутствовать или отсутствовать; ΓΟΕΥ представляет собой водорастворимый неантигенный полимер;

А представляет собой связывающую молекулу, который может присутствовать или отсутствовать и которая может быть одинаковой с В или может отличаться от него; и

X представляет собой вторую функциональную группу.

Примеры связывающих молекул для А и В включают, без ограничения, множественнофункционализированную алкильную группу, содержащую вплоть до 18 атомов углерода, которая может содержать от 1 до 10 атомов углерода. Гетероатомы, такие как азот, кислород или сера, могут быть включены в алкильную цепь. Алкильная цепь может также быть разветвленной у гетероатома. Другие примеры связывающих молекул для А и В включают, без ограничения, множественнофункционализированную арильную группу, содержащую вплоть до 10 атомов углерода, и обычно содержащую 5-6 атомов углерода. Арильная группа может быть замещена одним или более из атомов углерода, азота, кислорода или серы. Другие примеры подходящих связывающих групп включают такие связывающие группы, которые раскрыты в патентах США №№ 5932462; 5643575 и опубликованном патенте США 2003/0143596, которые включены в описание посредством ссылки. Специалистам в данной области должно быть ясно, что приведенный выше список связывающих молекул никоим образом не является исчерпывающим, но только иллюстративным, и что все связывающие молекулы, обладающие свойствами, раскрытыми выше, рассматриваются как подходящие для использования в настоящем изобретении.

Примеры подходящих функциональных групп для использования в качестве X включают, без ограничения, гидроксил, защищенный гидроксил, алкоксил, активный сложный эфир, такой как сложные эфиры Ν-гидроксисукцинимидила и сложные эфиры 1-бензотриазолила, активные карбонаты, такие как Ν-гидроксисукцинимидилкарбонаты и 1-бензотриазолилкарбонаты, ацеталь, альдегид, гидраты альдегидов, алкенил, акрилат, метакрилат, акриламид, активный сульфон, амин, аминоокси, защищенный амин, гидразид, защищенный гидразид, защищенный тиол, карбоновую кислоту, защищенную карбоновую кислоту, изоцианат, изотиоцианат, малеимид, винилсульфон, дитиопиридин, винилпиридин, иодоацетамид, эпоксид, глиоксали, дионы, мезилаты, тозилаты, трезилат, алкен, кетон и азид. Как должно быть понятно специалисту в данной области, выбранная X молекула должна быть совместима с азидной группой так, чтобы реакция с азидной группой не происходила. Азидсодержащие производные полимеров могут быть гомобифункциональными, что означает, что вторая функциональная группа (т.е. X) также является азидной молекулой, или гетеробифункциональными, что означает то, что вторая функциональная группа является отличающейся функциональной группой.

Термин защищенный относится к присутствию защитной группы или молекулы, которые предотвращают реакцию химически реакционноспособной функциональной группы в некоторых условиях реакции. Защитная группа будет меняться в зависимости от типа химически реакционноспособной группы, которую необходимо защитить. Например, если химически реакционноспособной группой является амин или гидразид, защитную группу можно выбрать из группы, состоящей из трет-бутилоксикарбонила (ΐВос) и 9-фторенилметоксикарбонила (Ртос). Если химически реакционноспособной группой является тиол, защитной группой может быть ортопиридилдисульфид. Если химически реакционноспособной группой является карбоновая кислота, такая как бутановая или пропионовая кислота, или гидроксильная группа, защитной группой может быть бензильная или алкильная группа, такая как метил, этил или третбутил. Другие защитные группы, известные специалистам, также можно использовать в настоящем изобретении.

Специфические примеры терминальных функциональных групп, известные из литературы, включают, без ограничения, Ν-сукцинимидилкарбонат (см., например, патенты США №№ 5281698, 5468478), амин (см., например, Висктапп е( а1., Макгото1. СЬет., 182: 1379 (1981), 2айркку е( а1. Еиг. Ро1ут, к 19: 1177 (1983)), гидразид (см., например, Апйгекх е( а1., Макгото1. СЬет., 179: 301 (1978)), сукцинимидилпропионат и сукцинимидилбутаноат (см., например, Ο1коη е( а1. в Ро1у(е1Ьу1епе д1усо1) СЬетщйу & Вю1одюа1 АррНсайопк, р. 170-181, Натк & 2айркку Ейк., АС8, ’№акЫпд1оп, О.С., 1997; см. также патент США № 5672662), сукцинимидилсукцинат (см., например, АЬисЬотак1 е( а1., Сапсег ВюсЬет. ВюрЬук., 7: 175 (1984) и .ТорркЬ е( а1., Макгото1. СЬет., 180: 1381 (1979), сложный эфир сукцинимидила (см., на

- 94 019968 пример, патент США № 4670417), бензотриазолкарбонат (см., например, патент США № 5650234), глицидиловый простой эфир (см., например, Рййа е! а1., Еиг. I. Вюсйет., 94: 11 (1979), ЕШпд е! а1., В1о!есй. Арр1. Вюсйет., 13: 354 (1991), оксикарбонилимидазол (см., например, Веаисйатр, е! а1., Апа1. Вюсйет., 131:25 (1983), ТопбеШ е! а1., I. Соп!го11еб Ке1еаке, 1:251 (1985)), п-нитрофенилкарбонат (см., например, Vе^οηеке. е! а1., Арр1. Вюсйет. Вю!есй., 11: 141 (1985) и 8айоге е! а1., Арр1. Вюсйет. Вю!есй., 27: 45 (1991)), альдегид (см., например, Натк е! а1. I. ройт. 8сй Сйет. Еб., 22: 341 (1984), патент США № 5824784, патент США № 5252714), малеимид (см., например, Сообкоп е! а1., Вю!есйпо1оду (НУ), 8: 343 (1990), Котап е! а1., ίη СйепйкЦу оГ Рерйбек апб РгсЛетк, 2: 29 (1984)) и Кодап, 8уп!йейс Сотт., 22: 2417 (1992)), ортопиридилдисульфид (см., например, ХУодййеп, е! а1., Вюсоп). Сйет., 4: 314(1993)), акрилоил (см., например, 8атейпеу е! а1., Масгото1еси1ек, 26:581 (1993)), винилсульфон (см., например, патент США № 5900461). Все вышеперечисленные ссылки и патенты включены в описание посредством ссылки.

В некоторых вариантах настоящего изобретения производные полимера настоящего изобретения включают основную цепь полимера, имеющую структуру

Х-СН₂СН₂О- (СН₂СН₂О) _г-СН₂СН_;-Г<-Н-М, где X представляет собой функциональную группу, как раскрыто выше; и п принимает значения от около 20 до около 4000.

В других вариантах производные полимера настоящего изобретения включают основную полимерную цепь, имеющую следующую структуру:

х-сн₂сн₂о- (сн₂сн₂о) _п-сн₂сн₂-о- (сн₂) , -н-м=и=п, где представляет собой алифатическую группу или ароматическую линкерную молекулу, включающую от 1 до 10 атомов углерода;

п принимает значения от около 20 до около 4000 и

X представляет собой функциональную группу, как раскрыто выше;

т принимает значения от 1 до 10.

Азидосодержащие производные ПЭГ настоящего изобретения можно получить различными известными специалистам способами или здесь раскрытыми. В одном способе, раскрытом далее, водорастворимую основную полимерную цепь со средней молекулярной массой от около 800 до около 10000, причем основная полимерная цепь имеет первый конец, связанный с первой функциональной группой, и второй конец, связанный с подходящей отщепляемой группой, подвергают взаимодействию с азидным анионом (который может быть спарен с любым из числа подходящих противоионов, включая натрий, калий, трет-бутиламмоний и т.д.). Отщепляемая группа подвергается нуклеофильному замещению и заменяется азидной молекулой, в результате чего получают целевой азидосодержащий полимер ПЭГ.

Х-П'Л'-Ь+У-— х-пэг-ы₃

Как показано, подходящая основная полимерная цепь, подходящая для использования в настоящем изобретении, имеет формулу Х-ПЭГ -Ь, где ПЭГ представляет собой поли(этиленгликоль), и X представляет собой функциональную группу, которая не реагирует с азидной группой, и Ь представляет собой подходящую отщеплямемую группу. Примеры подходящих функциональных групп включают, без ограничения, гидроксил, защищенный гидроксил, ацеталь, алкенил, амин, аминоокси, защищенный амин, защищенный гидразид, защищенный тиол, карбоновую кислоту, защищенную карбоновую кислоту, малеимид, дитиопиридин, винилпиридин и кетон. Примеры подходящих отщепляемых групп включают, без ограничения, хлорид, бромид, йодид, мезилат, трезилат и тозилат.

В другом способе получения производных азидсодержащего полимера по настоящему изобретению связывающий агент, содержащий азидную функциональность, подвергают взаимодействию с основной цепью водорастворимого полимера со средней молекулярной массой от около 800 до около 100000, где связывающий агент содержит химическую функциональность, которая селективно реагирует с химической функциональностью полимера ПЭГ, с образованием продукта производного азидосодержащего полимера, где азид отделен от основной полимерной цепи связывающей группой.

Далее приведен пример реакционной схемы:

Х-ПЭГ-Μ+Ν-линкер-Ы=Ы=Ы^Р2-Х-ПЭГ-линкер-Ν=Ν=Ν, где ПЭГ представляет собой поли(этиленгликоль);

X представляет собой кэппинг группу, такую как алкокси, или функциональную группу, как раскрыто выше;

М представляет собой функциональную группу, которая не является реакционноспособной в отношении азидной функциональности, но которая эффективно и селективно реагирует с N функциональной группой.

Примеры подходящих функциональных групп включают, без ограничения, М, являющийся карбоновой кислотой, карбонатом или активным сложным эфиром, если N представляет собой амин; М, являющийся кетоном, если N представляет собой гидразид или аминоокси молекулу; М, являющийся отщепляемой группой, если N представляет собой нуклеофил.

Очистку сырого продукта можно осуществить известными способами, включая, без ограничения, осаждение продукта с последующей хроматографической обработкой, при необходимости.

- 95 019968

Далее представлен более специфический пример в случае ПЭГ диамина, в котором один из аминов защищен молекулой защитной группы, такой как трет-бутил-Вос, и полученный моно-защищенный ПЭГ диамин подвергают взаимодействию со связывающей молекулой, которая содержит азидную функциональность

ВосНЫ-ПЭГ-ЫН₂+Н0₂С- (СН_г) 3~Ν=Ν=Ν

В таком случае группа амина может быть присоединена к группе карбоновой кислоты, используя различные активирующие агенты, такие как тионилхлорид, или карбодиимидные реагенты и Νгидроксисукцинимид или Ν-гидроксибензотриазол для создания амидной связи между моноаминсодержащим производным ПЭГ и азидосодержащей линкерной молекулой. После успешного создания амидной связи полученное Ν-трет-бутил-Вос-защищенное азидсодержащее производное можно использовать непосредственно для модификации биоактивной молекулы или его можно обработать далее, чтобы встроить другие полезные функциональные группы. Например, Ν-1-Вос группу можно гидролизовать, обрабатывая сильной кислотой до создания омега-амино-ПЭГ-азида. Полученный амин можно использовать как синтетический инструмент для встраивания других полезных функциональностей, таких как малеимидные группы, активированные дисульфиды, активированные сложные эфиры и т.д. для создания ценных гетеробифункциональных реагентов.

Гетеробифункциональные производные являются особенно полезными, если необходимо присоединить различные молекулы к каждому концу полимера. Например, омега-N-амино-N-азидо ПЭГ позволит осуществить присоединение молекулы, содержащей активированную электрофильную группу, такую как альдегид, кетон, активированный сложный эфир, активированный карбонат и т.д., к одному концу ПЭГ, и молекулу, содержащую ацетиленовую группу, к другому концу ПЭГ.

В другом варианте настоящего изобретения производное полимера имеет структуру

Х-А-РОЬУ-В-С^С-К, где Я может быть или Н или алкильной, алкенильной, алкокси либо арильной или замещенной арильной группой;

В представляет собой связывающую молекулу, которая может присутствовать или отсутствовать;

РОЕ-Υ представляет собой водорастворимый неантигенный полимер;

А представляет собой связывающую молекулу, которая может присутствовать или отсутствовать и которая может быть такой же как В или может отличаться от него; и

Х представляет собой вторую функциональную группу.

Примеры связывающих молекул для А и В включают, без ограничения, множественнофункционализированную алкильную группу, содержащую вплоть до 18 атомов углерода и которая может содержать от 1 до 10 атомов углерода. Гетероатомы, такие как азот, кислород или сера, могут быть включены в алкильную цепь.

Алкильная цепь может также быть разветвленной у гетероатома. Другие примеры связывающих молекул для А и В включают, без ограничения, множественно-функционализированную арильную группу, содержащую вплоть до 10 атомов углерода, которая может содержать 5-6 атомов углерода. Арильная группа может быть замещена одним или более из атомов углерода, азота, кислорода или серы. Другие примеры подходящих связывающих групп включают связывающие группы, раскрытые в патентах США №№ 5932462 и 5643575 и опубликованной заявке на патент США 2003/0143596, которые включены в описание посредством ссылки. Специалистам в данной области должно быть понятно, что вышеприведенный список связывающих молекул никоим образом не является исчерпывающим и является только иллюстративным и что широкий круг связывающих молекул, обладающих раскрытыми выше свойствами, рассматривают как полезные для использования в настоящем изобретении.

Примеры подходящих функциональных групп для использования в качестве Х включают гидроксил, защищенный гидроксил, алкоксил, активный сложный эфир, такой как Νгидроксисукцинимидильные сложные эфиры и 1-бензотриазолильные сложные эфиры, активный карбонат, такой как Ν-гидроксисукцинимидильные карбонаты и 1-бензотриазолильные карбонаты, ацеталь, альдегид, гидраты альдегидов, алкенил, акрилат, метакрилат, акриламид, активный сульфон, амин, аминоокси, защищенный амин, гидразид, защищенный гидразид, защищенный тиол, карбоновую кислоту, защищенную карбоновую кислоту, изоцианат, изотиоцианат, малеимид, винилсульфон, дитиопиридин, винилпиридин, иодоацетамид, эпоксид, глиоксали, дионы, мезилаты, тозилаты, и трезилат, алкен, кетон, и ацетилен. Следует понимать, что выбранная Х молекула должна быть совместима с ацетиленовой группой таким образом, чтобы реакция с ацетиленовой группой не происходила. Производные ацетиленсодержащего полимера могут быть гомобифункциональными, что означает, что вторая функциональная группа (т.е. Х) также представляет собой ацетиленовую молекулу, или могут быть гетеробифункциональными, что означает, что вторая функциональная группа является отличающейся функциональной группой.

В другом варианте настоящего изобретения производные полимера включают основную полимерную цепь следующей структуры:

Х-СН₂СН₂О- (СН₂СН₂О) _П-СН₂СН₂-О- (СН₂)_т-С=СН, где Х представляет собой функциональную группу, как раскрыто выше;

- 96 019968 п принимает значения от около 20 до около 4000 и т принимает значения от 1 до 10.

Специфические примеры каждого из гетеробифункциональных полимеров ПЭГ представлены далее.

Ацетиленсодержащие производные ПЭГ настоящего изобретения можно получить, используя методы, хорошо известные специалистам в данной области и/или здесь раскрытые. В одном способе основную цепь водорастворимого полимера со средней молекулярной массой от около 800 до около 100000, где у основной полимерной цепи имеется первый конец, связанный с первой функциональной группой, и второй конец, связанный с подходящей нуклеофильной группой, подвергают взаимодействию с соединением, которое содержит как ацетиленовую функциональность, так и отщепляемую группу, которая является подходящей для реакции с нуклеофильной группой на ПЭГ. Если полимер ПЭГ, содержащий нуклеофильную молекулу и молекулу, содержащую отщепляемую группу, объединяют, отщепляемая группа претерпевает нуклеофильное замещение и заменяется нуклеофильной молекулой, что приводит к получению целевого ацетиленсодержащего полимера.

Х-ПЭГ-Ыи+Ь-А-С->Х-ПЭГ-Ыи-А-С=СК'

Как показано, предпочтительная основная полимерная цепь для использования в реакции имеет формулу Х-ПЭГ-Ии, где ПЭГ представляет собой поли(этиленгликоль);

Νυ представляет собой нуклеофильную молекулу и

X представляет собой функциональную группу, которая не реагирует с Νυ, Ь или ацетиленовой функциональностью.

Примеры Νυ включают, без ограничения, амин, алкокси, арилокси, сульфгидрил, имино, карбоксилат, гидразид, аминоокси группы, которые будут реагировать преимущественно по механизму 8К2-типа. Дополнительные примеры Νυ групп включают такие функциональные группы, которые будут реагировать преимущественно по типу реакции нуклеофильного присоединения. Примеры Ь групп включают хлорид, бромид, йодид, мезилат, трезилат и тозилат и другие группы, которые, как ожидают, будут претерпевать реакцию нуклеофильного замещения, также как кетоны, альдегиды, тиоэфиры, олефины, альфа-бета-ненасыщенные карбонильные группы, карбонаты и другие электрофильные группы, которые, как ожидают, будут претерпевать замещение нуклеофилами.

В других вариантах настоящего изобретения А представляет собой алифатический линкер, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, или замещенное арильное кольцо, содержащее от 6 до 14 атомов углерода. X представляет собой функциональную группу, которая не реагирует с азидными группами, и Ь представляет собой подходящую отщепляемую группу.

В другом способе получения ацетиленсодержащих производных полимеров настоящего изобретения полимер ПЭГ со средней молекулярной массой от около 800 до около 100000, содержащий или защищенную функциональную группу либо кэппинг-агент на одном конце и подходящую отщепляемую группу на другом конце, подвергают взаимодействию с ацетиленовым анионом. Примерная схема реакции представлена далее

где ПЭГ представляет собой поли(этиленгликоль) и

X представляет собой кэппинг-группу, такую как алкокси или функциональную группу, как раскрыто выше; и

В' представляет собой или Н, алкильную, алкоксильную, арильную или арилоксигруппу или замещенную алкильную, алкоксильную, арильную или арилоксигруппу.

В приведенном выше примере отщепляемая группа Ь должна быть достаточно реакционноспособной, чтобы претерпеть замещение δN2-типа при контактировании с достаточной концентрацией ацетиленового аниона. Условия реакции, необходимые для осуществления δΝ2 замещения отщепляемой группы ацетиленовыми анионами, хорошо известны специалистам в данной области.

Очистку сырого продукта обычно осуществляют способами, известными специалистам, включая, без ограничения, осаждение продукта с последующей хроматографической обработкой, при необходимости.

Водорастворимые полимеры можно связать с полипептидами ЬС-СδР настоящего изобретения. Водорастворимые полимеры можно связать через не кодируемую в природе аминокислоту, встроенную в полипептид ЬС-СδР, или любую функциональную группу, или заместитель не кодируемой в природе или кодируемой в природе аминокислоты, или любую функциональную группу или заместитель, добавленные к не кодируемой в природе или кодируемой в природе аминокислоте. Альтернативно, водорастворимые полимеры связывают с полипептидом ЬС-СδР со встроенной не кодируемой в природе аминокислотой через природную аминокислоту (включая, без ограничения, цистеин, лизин или группу амина Νтерминального остатка). В некоторых случаях полипептиды ЬС-СδР настоящего изобретения включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 неприродных аминокислот, где одна или более из не кодируемых в природе аминокислот связаны с водорастворимым полимером (полимерами), (включая, без ограничения, ПЭГ и/или олигосахариды). В некоторых случаях полипептиды ЬС-СδР настоящего изобретения включают далее 1,

- 97 019968

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше кодируемых в природе аминокислот, связанных с водорастворимыми полимерами. В некоторых случаях полипептиды ЬС-С8Е настоящего изобретения включают одну или более из не кодируемых в природе аминокислот, связанных с водорастворимыми полимерами, и одну или более из природных аминокислот, связанных с водорастворимыми полимерами. В некоторых вариантах водорастворимые полимеры, используемые в настоящем изобретении, увеличивают время полужизни полипептидов ЬС-С8Е по сравнению с неконъюгированной формой.

Количество водорастворимых полимеров, связанных с полипептидом ЬС-С8Е (т.е. степень ПЭГилирования или гликозилирования) настоящего изобретения, можно установить таким образом, чтобы они не изменяли (включая, без ограничения, улучшение или ухудшение) фармакологических, фармакокинетических или фармакодинамических характеристик, таких как ίη у1уо время полужизни. В некоторых вариантах время полужизни ЬС-С8Е увеличивается по меньшей мере на около 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, 2-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно, 10-кратно, 11-кратно, 12-кратно, 13кратно, 14-кратно, 15-кратно, 16-кратно, 17-кратно, 18-кратно, 19-кратно, 20-кратно, 25-кратно, 30кратно, 35-кратно, 40-кратно, 50-кратно или по меньшей мере около 100-кратно по сравнению с немодифицированным полипептидом.

Производные ПЭГ, содержащие сильную нуклеофильную группу (т.е. гидразид, гидразин, гидроксиламин или семикарбазид).

В одном варианте настоящего изобретения полипептид ЬС-С8Е, включающий карбонилсодержащую не кодируемую в природе аминокислоту, модифицирован производным ПЭГ, которое содержит терминальную гидразиновую, гидроксиламиновую, гидразидную или семикарбазидную молекулу, которая связана непосредственно с основной цепью ПЭГ.

В некоторых вариантах гидроксиламинтерминальное производное ПЭГ имеет структуру

КО- (СН₂СН₂О) _П-О- (СН₂) „-ο-νη₂ , где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); т принимает значения 2-10 и η принимает значения 100-1000 (т.е. средняя молекулярная масса находится между 5-40 кДа).

В некоторых вариантах гидразин- или гидразидсодержащее производное ПЭГ имеет структуру

КО- (СН₂СН₂О) „-О- {СН₂) _т-χ-νη-νη₂ где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); т принимает значения 2-10, η принимает значения 100-1000 и X представляет собой необязательно карбонильную группу (С=О), которая может присутствовать или отсутствовать.

В некоторых вариантах семикарбазидсодержащее производное ПЭГ имеет структуру КО-{СН₂СН₂О)„-О- (ϋΗ₂)„,-ΝΗ-Ο(Ο) -νη-νη₂, где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); т принимает значения 2-10 и η принимает значения 100-1000.

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬС-С8Е, включающий карбонилсодержащую аминокислоту, модифицирован производным ПЭГ, которое содержит терминальную гидроксиламиновую, гидразидную, гидразиновую или семикарбазидную молекулу, которая связана с основной цепью ПЭГ амидной связью.

В некоторых вариантах гидроксиламинтерминальные производные ПЭГ имеют структуру

КО- (СН₂СН₂О)_П-О- (СНгЬ-ИН-С (О) (СНг)_т-О-ЙЕ₂, где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); т принимает значения 2-10 и η принимает значения 100-1000 (т.е. средняя молекулярная масса находится между 5-40 кДа).

В некоторых вариантах гидразин- или гидразидсодержащие производные ПЭГ имеют структуру КО-(СН₂СН₂О)_п-0- (ΟΗ₂)2-ΝΗ-Ο(Ο) (СН₂)_я-Х-ЫН-ЙН₂, где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); т принимает значения 2-10, η принимает значения 100-1000 и X представляет собой необязательно карбонильную группу (Ο=Ο), которая может присутствовать или отсутствовать.

В некоторых вариантах семикарбазидсодержащие производные ПЭГ имеют структуру

НО- (СН₂СН₂О) „-О- {СН₂) 2-ИН-С (О) (СН₂) _т-ын-с (О) -ΝΗ-ΝΗ₂ , где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); т принимает значения 2-10 и η принимает значения 100-1000.

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬС-С8Е, включающий карбонилсодержащую аминокислоту, модифицирован разветвленным производным ПЭГ, которое содержит терминальную гидразиновую, гидроксиламиновую, гидразидную или семикарбазидную молекулу, причем каждая цепь разветвленного ПЭГ имеет ММ в интервале 10-40 кДа и возможно 5-20 кДа.

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬС-С8Е, включающий не кодируемую в природе аминокислоту, модифицирован производным ПЭГ с разветвленной структурой. Например, в некоторых вариантах гидразин- или гидразидтерминальное производное ПЭГ имеет следующую струк^туру^: [КО- (СН₂СН_гО)_п-О- (СН₂)₂-НН-С(О) ]₂СН(СН₂)_т-Х-НН-ЫН2, где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); т принимает значения 2-10 и η принимает значения 100-1000; X представляет собой необязательно карбонильную группу (С=О), кото

- 98 019968 рая может присутствовать или отсутствовать.

В некоторых вариантах производные ПЭГ, содержащие семикарбазидную группу, имеют структуру [КО- (СН₂СН₂О) „-О- (СН₂) 2-С (О) -ЦН-СН₂-СН₂] ₂СН-Х- (СН₂)_и-ИН-С (О) ΝΗ-ЫНз, где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.);

X представляет собой необязательно N4, О, 8, С (О) или отсутствует;

т принимает значения 2-10 и п принимает значения 100-1000.

В некоторых вариантах производные ПЭГ, содержащие группу гидроксиламина, имеют структуру

где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); X представляет собой необязательно N4, О, 8, С(О) или отсутствует; т принимает значения 2-10 и п принимает значения 100-1000.

Порядок и сайты, в которых водорастворимый полимер (полимеры) связаны с полипептидом ЬСС8Е, могут модулировать связывание полипептида ЬС-С8Е с рецептором. В некоторых вариантах связи организованы таким образом, что полипептид ЬС-С8Е связывает рецептор с К_б около 400 нМ или меньше, с К_б 150 нМ или меньше и в некоторых случаях с К_б 100 нМ или меньше по данным анализа равновесного связывания, как раскрыто у 8репсег е! а1., 1. Вю1. СНет., 263: 7862-7867 (1988).

Методы и реакции для активации полимеров, также как для конъюгирования полипептидов, раскрыты в литературе и известны специалистам. Обычно используемые методы активации полимеров включают, без ограничения, активацию функциональных групп цианогенбромидом, периодатом, глутаральдегидом, биэпоксидами, эпихлоргидрином, дивинилсульфоном, карбодиимилом, сульфонил галогенидами, трихлортриазином и т.д. (см. В. Е. Тау1ог, (1991), РВ0ТЕГН IММОΒI^I8АТIОN. ЕυN^АМЕNТАЬ апб АРРЫСАТЮ^, Магсе1 Оеккег, Ц.У.; 8. 8. \\ опа (1992), СНЕМКТВУ 0Е РВ0ТЕШ СС)\',1к'САТIОN апб СВО88^INКINС, СВС Ргекк, Воса Ва!оп; С.Т. Негтапкоп е! а1. (1993), IттοЬ^1^ζеб АГПшпу Ыдапб ТесНп1циек, Асабеппс Ргекк, КУ.; Иипп, В.Ь., е! а1., Ебк. РО^ΥМЕВIС ИВиС8 апб ИВиС ИЕЬШЕВУ 8У8ТЕМ8, АС8 8утрокшт 8епек, ^1. 469, Атепсап СНет1са1 8ос1е1у, ХУакНтЦоп, Э.С., 1991).

Доступны некоторые обзоры и монографии, относящиеся к функционализации и конъюгированию ПЭГ; см., например, Натк, Масгото1. СНет. РНук., С25: 325-373 (1985); 8сои!еп, Ме!Нобк ш Епхуто1оду 135: 30-65 (1987); \Уопд е! а1., Еηζуте М1сгоЬ. ТесНпо1., 14: 866-874 (1992); ЭеЦабо е! а1., Сп!юа1 Веу1еак т ТНегареийс Эгид Саглег 8ук!етк, 9: 249-304 (1992); Ζа1^ркку, В1осоп)ида!е СНет., 6: 150-165 (1995).

Методы активации полимеров можно также найти в \У0 94/17039, патенте США № 5324844, \У0 94/18247, ΑΌ 94/04193, патенте США № 5219564, патенте США № 5122614, ΑΌ 90/13540, патенте США № 5281698 и \У0 93/15189 и для конъюгирования между активированными полимерами и ферментами, включая, без ограничения, фактор коагуляции VIII (\У0 94/15625), гемоглобин (\У0 94/09027), молекулы, содержащие кислород (патент США № 4412989), рибонуклеазу и супероксиддисмутазу ^етопеке а! а1., Арр. ВюсНет. Вю!есН., 11: 141-52 (1985)). Все ссылки и цитированные патенты включены в описание посредством ссылки.

ПЭГилирование (т.е. присоединение любого водорастворимого полимера) полипептидов ЬС-С8Е, содержащих не кодируемую в природе аминокислоту, таких как п-азидо-Ь-фенилаланин, осуществляют обычным способом. Например, полипептид ЬС-С8Е ПЭГилируют алкил-терминированным производным т-ПЭГ. Короче, при перемешивании добавляют избыток твердого т-ПЭГ(5000)-О-СН₂-С=СН к водному раствору п-азидо-Ь-РНе-содержащему полипептиду ЬС-С8Е при комнатной температуре. Обычно водный раствор буферируют буфером с рК_а около рН и при этом значении ведут реакцию (обычно около рН 410). Примеры подходящих буферов для ПЭГилирования при рН 7,5, например, включают, без ограничения, НЕРЕ8, фосфат, борат, ТВК-НО, ЕРР8 и ТЕ8. Величину рН непрерывно контролируют и, при необходимости, корректируют. Реакцию обычно ведут в течение 1-48 ч.

Затем продукт реакции обрабатывают, используя хроматографию гидрофобных взаимодействий для отделения вариантов ПЭГилированного полипептида ЬС-С8Е от свободного т-ПЭГ(5000)-О-СН₂-С=СН и любых высокомолекулярных комплексов ПЭГилированного полипептида ЬС-С8Е, которые могут образовываться, если неблокированный ПЭГ активируют с обоих концов молекулы, тем самым вызывая сшивку молекул вариантов полипептида ЬС-С8Е. Условия во время хроматографии гидрофобных взаимодействий таковы, чтобы свободные т-ПЭГ(5000)-О-СН₂-С=СН проходили бы через колонку, тогда как все комплексы сшитых вариантов ПЭГилированных полипептидов ЬС-С8Е элюировались бы после искомых форм, которые содержат одну молекулу варианта полипептида ЬС-С8Е, конъюгированную с одной или более из ПЭГ групп. Подходящие условия варьируются в зависимости от относительных размеров сшитых комплексов и нужных конъюгатов, и их легко могут определить специалисты в данной области. Элюент, содержащий искомые конъюгаты, концентрируют, используя ультрафильтрацию и обессоливают с помощью диафильтрации.

При необходимости, ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е, полученный после обработки с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий, можно далее очистить, используя одну или более из процедур, известных специалистам в данной области, включая, без ограничения, аффинную хроматогра

- 99 019968 фию; анионо- или катионообменную хроматографию (используя, включая, без ограничения, ИЕАЕ 8ЕРНАЯО8Е); хроматографию на двуокиси кремния; ВЭЖХ с обращенной фазой; гель-фильтрацию (используя, включая, без ограничения, 8ЕРНАЭЕХ О-75); хроматографию гидрофобных взаимодействий; хроматографию с исключением по размерам, металл-хелатную хроматографию; ультрафильтрацию/диафильтрацию; осаждение этанолом; осаждение сульфатом аммония; хроматофокусирование; вытеснительную хроматографию; электрофоретические процедуры (включая, без ограничения, препаративное изоэлектрическое фокусирование); дифференциальную растворимость (включая, без ограничения, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию. Кажущуюся молекулярную массу можно оценить с помощью ОРС, сравнивая глобулярные белковые стандарты (Ргепе!а, А^. ш РЯОТЕШ РυΚIРIСΑТIОN МЕТНОИ8, А РЯАСПСАЬ АРРЯОАСН (Натк & Апда1, Ебк.) ШЬ Ргекк, 1989, 293-306). Степень чистоты ЬО-С8Р-ПЭГ конъюгатов можно оценить с помощью протеолитического разложения (включая, без ограничения, расщепление трипсином) с последующим масс-спектрометрическим анализом; Рерткку Я.В., е! а1., 1. Ркагтсок & Ехр. Ткег., 297(3); 1059-66 (2001).

Водорастворимый полимер, связанный с аминокислотой полипептида ЬО-С8Р настоящего изобретения, можно далее дериватизировать или осуществить замещения без ограничений.

Азидосодержащие производные ПЭГ.

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬО-С8Р модифицируют, используя производное ПЭГ, которое содержит азидную молекулу, которая будет реагировать с алкинной молекулой, расположенной на боковой цепи не кодируемой в природе аминокислоты. Обычно производные ПЭГ имеют среднюю молекулярную массу в интервале 1-100 кДа и в некоторых вариантах от 10 до 40 кДа.

В некоторых вариантах азидтерминальное производное ПЭГ имеет структуру

КО- (СН2СН2О) п-О- (СН₂) _Β-Ν₃, где Я представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.);

т принимает значения 2-10 и п принимает значения 100-1000 (т.е. средняя молекулярная масса находится в интервале 5-40 кДа).

В других вариантах азидтерминальное производное ПЭГ имеет структуру

КО- (СН₂СН₂О) η-О- (СН₂ ) _Л-ЫН-С (О) - (СН₂) _р-ы₃ где Я представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.);

т принимает значения 2-10;

р принимает значения 2-10 и п принимает значения 100-1000 (т.е. средняя молекулярная масса находится в интервале 5-40 кДа).

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬО-С8Р, включающий алкинсодержащую аминокислоту, модифицируют разветвленным производным ПЭГ, которое содержит терминальную азидную молекулу, причем каждая из цепей разветвленного ПЭГ имеет ММ в интервале 10-40 кДа и может быть в интервале 5-20 кДа. Например, в некоторых вариантах азидтерминальное производное ПЭГ имеет следующую структуру:

где Я представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.);

т принимает значения 2-10;

р принимает значения 2-10;

п принимает значения 100-1000 и

Х представляет собой необязательно О, Ν, 8 или карбонильную группу (С=О), которые в каждом случае могут присутствовать или отсутствовать.

Алкинсодержащие производные ПЭГ.

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬО-С8Р модифицируют производным ПЭГ, которое содержит алкинную молекулу, которая будет реагировать с азидной молекулой, присутствующей на боковой цепи не кодируемой в природе аминокислоты.

В некоторых вариантах алкилтерминальное производное ПЭГ имеет следующую структуру:

КО- (СН₂СН₂0)„-О- (СН₂)_т-СэСН, где Я представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.);

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬО-С8Р, включающий алкинсодержащую не кодируемую в природе аминокислоту, модифицируют производным ПЭГ, которое содержит терминальную азидную или терминальную алкинную молекулу, которые связаны с основной цепью ПЭГ амидной связью.

где Я представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.); т принимает значения 2-10;

р принимает значения 2-10 и п принимает значения 100-1000.

- 100 019968

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬС-С8Е, включающий азидосодержащую аминокислоту, модифицируют разветвленным производным ПЭГ, которое содержит терминальную алкинную молекулу, причем каждая цепь разветвленного ПЭГ имеет ММ в интервале значений 10-40 кДа и может быть в интервале 5-20 кДа. Например, в некоторых вариантах алкилтерминальное производное ПЭГ имеет следующую структуру:

[КО- (СН₂СН₂О) „-О- (СН₂) 2-ИН-С(О) ]₂СН(СН₂)_т-Х- (СН₂)рС=СН, где В представляет собой низший алкил (метил, этил, пропил и т.д.);

т принимает значения 2-10;

р принимает значения 2-10;

п принимает значения 100-1000 и

Х представляет собой необязательно О, Ν, 8 или карбонильную группу (С=О) или отсутствует. Фосфинсодержащие производные ПЭГ.

В других вариантах настоящего изобретения полипептид ЬС-С8Е модифицируют производным ПЭГ, которое содержит активированную функциональную группу (включая, без ограничения, сложноэфирную, карбонатную) и включает далее арилфосфиновую группу, которая будет реагировать с азидной молекулой, присутствующей на боковой цепи не кодируемой в природе аминокислоты. Обычно производные ПЭГ имеют среднюю молекулярную массу в интервале 1-100 кДа и в некоторых вариантах в интервале 10-40 кДа.

В некоторых вариантах производное ПЭГ имеет структуру δ X РИ₂Р(Н₂С)4 γ “νν о если п принимает значения 1-10;

Х может быть О, Ν, 8 или может отсутствовать;

Рй представляет собой фенил и

V представляет собой водорастворимый полимер.

В некоторых вариантах производное ПЭГ имеет структуру

где X может быть О, Ν, 8 или может отсутствовать; Рй представляет собой фенил; V представляет собой водорастворимый полимер и В представлять собой Н, алкильную, арильную, замещенную алкильную и замещенную арильную группы. Примеры В групп включают, без ограничения, -СН2, -С(СН3)3, -ОВ', -ХВ'В, -8В', -галоген, -С(О)В', -СОЯ^'В, -8(О)₂В', -δ^ΝΒ'Β, -ΟΝ и -ЫО₂. В', В, В''' и В'''', каждый независимо, обозначает водород, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, включая, без ограничения, арил замещенный 1-3 галогенами, замещенный или незамещенный алкил, алкокси- или тиоалкоксигруппы или арилалкильные группы. Если соединение настоящего изобретения включает более чем одну В группу, например, каждую из В групп независимо выбирают как каждую В', В, В''' и В группу, если присутствует более чем одна из этих групп. Если В' и В присоединены к одному и тому же атому азота, взятые вместе с атомом азота они могут образовывать 5-, 6- или 7-членное кольцо. Например, подразумевается, что -ИВВ. включает, без ограничения, 1пирролидинил и 4-морфолинил. Из приведенного выше обсуждения заместителей специалисту в данной области должно быть понятно, что термин алкил включает группы, включающие атомы углерода, связанные с группами, которые отличаются от водородных групп, такие как галогеноалкил (включая, без ограничения, -СЕ₃ и -СЫ₂СЕ₃) и ацил (включая, без ограничения, -С(О)СН₃, -С(О)СЕ₃, -С(О)СН₂ОСН₃ и т.п.).

Другие производные ПЭГ и общие способы ПЭГилирования.

Другие примеры ПЭГ молекул, которые могут быть связаны с полипептидами ЬС-С8Е, также как методики ПЭГилирования, включают, без ограничения, те, что раскрыты, например, в патентных публикациях США и в патентах США №№ 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/008 6939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; 6646110; 5824778; 5476653; 5219564; 5629384; 5736625; 4902502; 5281698; 5122614; 5473034; 5516673; 5382657;

6552167; 6610281; 6515100; 6461603; 6436386; 6214966; 5990237; 5900461; 5739208; 5672662; 5446090;

5808096; 5612460; 5324844; 5252714; 6420339; 6201072; 6451346; 6306821; 5559213; 5747646; 5834594;

5849860; 5980948; 6004573; 6129912; \\'О 97/32607, ЕР 229108, ЕР 402,378, \\'О 92/16555, \\'О 94/04193, \\'О 94/14758, \\'О 94/17039, \\'О 94/18247, \\'О 94/28024, \\'О 95/00162, \\'О 95/11924, \О95/13090, \\'О

95/33490, \О 96/00080, \О 97/18832, \О 98/41562, \О 98/48837, \О 99/32134, \О 99/32139, \О

99/32140, \О 96/40791, \О 98/32466, \О 95/06058, ЕР 439508, \О 97/03106, \О 96/21469, \О

95/13312, ЕР 921131, \О 98/05363, ЕР 809 996, \О 96/41813, \О 96/07670, ЕР 605963, ЕР 510356, ЕР

400472, ЕР 183503 и ЕР 154316, которые включены в описание посредством ссылки. Любые из раскрытых здесь молекул ПЭГ можно использовать в любой форме, включая, без ограничения, простую цепь,

- 101 019968 разветвленную цепь, многоплечую цепь, однофункциональную цепь, бифункциональную цепь, многофункциональные цепи или любые их комбинации.

Дополнительный полимер и производные ПЭГ, включая, без ограничения, гидроксиламин(аминоокси) производные ПЭГ, раскрыты в следующих патентных публикациях, которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте: патентная публикация США № 2006/0194256, патентная публикация США № 2006/0217532, патентная публикация США № 2006/0217289, предварительная заявка на патент США № 60/755338; предварительная заявка на патент США № 60/755711; предварительная заявка на патент США № 60/755018; международная заявка на патент РСТ/И806/49397; \У0 2006/069246; предварительная заявка на патент США № 60/743041; предварительная заявка на патент США № 60/743040; международная заявка на патент № РСТ/И806/47822; предварительная заявка на патент США № 60/882819; предварительная заявка на патент США № 60/882500 и предварительная заявка на патент США № 60/870594.

Гетерологичные слитые белки Ес.

Раскрытые выше ЬС-С8Е соединения можно слить непосредственно или через пептидный линкер с Ес-участком иммуноглобулина. Иммуноглобулины представляют собой молекулы, содержащие полипептидные цепи, удерживаемые вместе дисульфидными связями, обычно содержащие две легкие цепи и две тяжелые цепи. В каждой цепи один домен (V) содержит вариабельную аминокислотную последовательность, зависящую от специфичности антитела в отношении указанной молекулы. Другие домены (С) имеют скорее постоянные последовательности, общие для молекул того же класса.

Ес-участок иммуноглобулина имеет значение, обычно присущее указанному термину в области иммунологии. Более конкретно указанный термин относится к фрагменту антитела, который получают, удаляя два антиген-связывающих участка (ЕаЬ фрагменты) из антитела. Одним способом удаления указанных ЕаЬ фрагментов является переваривание иммуноглобулина протеазой папаина. Так, Ес-участок образован из фрагментов примерно равного размера постоянного участка из обеих тяжелых цепей, которые ассоциированы в результате нековалентных взаимодействий и дисульфидных связей. Ес-участок может включать шарнирные участки и простираться через СН2 и СН3 домены к С-концу антитела. Представительные шарнирные участки человеческого и мышиного иммуноглобулинов можно найти в Ап11Ьойу Епдтеегтд, А Ргасйса1 Сшйе, ВоггеЬаеск, С.А.К., ей., \У.Н. Егеетап и Со., 1992, содержание которых включено в описание посредством ссылки. Ес-участок может включать далее один или более из сайтов гликозилирования. Аминокислотные последовательности множества репрезентативных Ес-белков, содержащих шарнирный участок, СН2 и СН3 домены и один сайт N-гликозилирования, хорошо известны специалистам.

Существует пять типов Ес-участков человеческого иммуноглобулина с различными эффекторными функциями и фармакокинетическими свойствами: ЦС, ЦА, ЦМ, ЦЭ и IдЕ. ЦС представляет собой наиболее распространенный иммуноглобулин в сыворотке. ЦС отличается также самым длительным временем полужизни в сыворотке из всех иммуноглобулинов (23 дня). В отличие от других иммуноглобулинов ЦС эффективно циркулирует после связывания с Ес-рецептором. Существует четыре ЦС подкласса С1, С2, С3 и С4, каждый из которых имеет отличающиеся эффекторные функции. С1, С2 и С3 могут связывать С1с.| и фиксировать комплемент, тогда как С4 не может. Даже хотя С3 способен связывать С1с.| более эффективно, чем С1, С1 более эффективен в опосредовании комплемент-направленного клеточного лизиса. С2 фиксирует комплемент весьма неэффективно. Сайт связывания С1с.| в ЦС расположен у карбокситерминального участка СН2 домена.

Все подклассы ЦС способны связываться с Ес-рецепторами (СЭ16, СЭ32, СЭ64), причем С1 и С3 более эффективны, чем С2 и С4. Участок связывания Ес-рецептора в ЦС образован остатками, расположенными как в шарнирном, так и в карбокситерминальном участках СН2 домена.

ЦА может существовать как в мономерной, так и в димерной формах, удерживаемых вместе 1цепью. ЦА является вторым из наиболее распространенных Ц в сыворотке, но его время полужизни составляет всего 6 дней. ЦА имеет три эффекторные функции. Он связыватся со специфическим рцептором ЦА на макрофагах и эозинофилах, которые управляют фагоцитозом и дегрануляцией соответственно. Он также может фиксировать комплемент через неизвестную альтернативную схему.

IдМ экспрессируется или как пентамер, или как гексамер, причем оба они удерживаются вместе 1цепью. Время полужизни ЦМ в сыворотке составляет 5 дней. Он слабо связывается с С1с.| через сайт связывания, расположенный в его СН3 домене. Время полужизни ЦЭ в сыворотке составляет 3 дня. Остается неясным, какие эффекторные функции приписаны указанному Ц. IдЕ является мономерным Ц и его время полужизни в сыворотке составляет 2,5 дня. ЦЕ связывается с двумя Ес-рецепторами, которые управляют дегрануляцией, и приводит к выделению провоспалительных агентов.

В зависимости от желательных ш у1уо эффектов гетерологичные слитые белки по настоящему изобретению могут содержать любой из раскрытых выше изотипов или могут содержать мутировавшие Есучастки, где были изменены функции связывания комплемента и/или Ес-рецептора. Так, гетерологичные слитые белки по настоящему изобретению могут содержать полный Ес-участок иммуноглобулина, фрагменты Ес-участка иммуноглобулина или их аналоги, слитые с соединением ЬС-С8Е.

Слитые белки по настоящему изобретению могут состоять из одноцепочечных белков или быть

- 102 019968 мультицепными полипептидами. Два или более из Рс слитых белков можно получить так, что они будут взаимодействовать через дисульфидные связи, которые естественно образуются между Рс-участками.

Такие мультимеры могут быть гомогенными в отношении соединения ЬС-С8Р или они могут содержать различные соединения ЬС-С8Р, слитые по Ν-концу Рс-участка слитого белка.

Независимо от окончательной структуры слитого белка Рс или Рс-подобный участок может служить пролонгированию ш у1уо в плазме времени полужизни ЬС-С8Р соединения слитого по Ν-концу. Также компонент ЬС-С8Р соединения слитого белка сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность ЬС-С8Р. Увеличение времени терапевтической или циркуляционной полужизни можно продемонстрировать, используя раскрытый здесь способ или способ, известный специалистам, где время полужизни слитого белка сравнивают с периодом полужизни одного только соединения ЬС-С8Р. Биологическую активность можно определить ш У1!го и ш у1уо методами, известными специалистам.

Так как Рс-участок 1дС, полученный в результате протеолиза, имеет тот же самый ш у1уо время полужизни, что и интактная 1дС молекула, и РаЬ фрагменты быстро деградируют, считают, что соответствующая последовательность для пролонгирования времени полужизни находится в СН2 и/или СН3 доменах. Кроме того, в литературе было показано, что скорости катаболизма вариантов 1дС, которые не связывают высокоаффинный Рс-рецептор или С1д, неразличимы со скоростью клиренса родительского дикого типа антитела, указывая на то, что катаболический сайт отличается от сайтов, включенных в Рсрецептор или С1с.| связывания ^а\\тхупсхак е! а1. (1992), Мо1еси1аг 1шшипо1о§у, 29: 221]. Исследования сайт-направленного мутагенеза с использованием Рс-участка мышиного 1дС1 позволили предположить, что сайт Рс-участка, который контролирует скорость катаболизма, расположен у интерфейса СН2-СН3 домена. Рс-участки можно модифицировать по катаболическому сайту, чтобы оптимизировать время полужизни слитых белков. Рс-участок, используемый для слитых белков по настоящему изобретению, можно получить из 1дС1 или Рс-участка 1дС4 и он может содержать как СН2, так и СН3 участки, включая шарнирный участок.

Гетерологичные слитые белки альбумина.

Описанные здесь ЬС-С8Р можно слить непосредственно или через пептидный линкер, водорастворимый полимер или пролекарственный линкер с альбумином или его аналогом, фрагментом или его производным. Вообще белки альбумина, которые являются частью слитых белков по настоящему изобретению, можно получить из альбумина, клонированного из любых видов, включая человека. Человеческий сывороточный альбумин (Н8А) состоит из одной негликозилированной полипептидной цепи из 585 аминокислот с формульной молекулярной массой 66500. Аминокислотная последовательность человеческого Н8А известна [см. Ме1оип, е! а1. (1975), РЕВ8 Ье!!егк, 58:136; Вейгепк, е! а1. (1975), Реб. Ргос., 34: 591; Ьа\\п, е! а1. (1981), Ν^1^ Ас1бк Кекеагсй, 9: 6102-6114; МтдйеШ, е! а1. (1986), I. Вю1. Сйет., 261: 6747, причем все они включены в описание посредством ссылки]. Были раскрыты различные полиморфные варианты, также как аналоги и фрагменты альбумина [см. Vе^ΐкатр, е! а1. (1973), Апп. Нит. Сепе!., 37: 219]. Например, в ЕР 322094 различны более короткие формы Н8А. Раскрыты некоторые из указанных фрагментов Н8А, включая Н8А(1-373), Н8А(1-388), Н8А(1-389), Н8А(1-369) и Н8А(1-419) и фрагменты между 1-369 и 1-419. В ЕР 399666 раскрыты фрагменты альбумина, которые включают Н8А(1-177) и Н8А(1-200) и фрагменты между Н8А(1-177) и Н8А(1-200).

Следует понимать, что гетерологичные слитые белки по настоящему изобретению включают ЬСС8Р соединения, которые соединены с любым белком альбумина, включая фрагменты, аналоги и производные, где такой слитой белок биологически активен и имеет более длительное время полужизни в плазме, чем одно только соединение ЬС-С8Р. Так, альбуминная часть слитого белка необязательно должна иметь время полужизни в плазме, равное периоду нативного человеческого альбумина. Фрагменты, аналоги и производные известны или их можно создать таким образом, чтобы их время полужизни было больше или находилось между соответствующими временами полужизни нативного человеческого альбумина и представляющего интерес ЬС-С8Р соединения.

Гетерологичные слитые белки по настоящему изобретению охватывают белки, содержащие замещения консервативных аминокислот в соединении ЬС-С8Р и/или Рс или часть альбумина слитого белка. Консервативное замещение представляет собой замещение аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет тот же суммарный электронный заряд и приблизительно такой же размер и форму. Аминокислоты с боковыми цепями с алифатическими или замещенными алифатическими аминокислотами имеют приблизительно одинаковый размер, если полное число атомов углерода и гетероатомов в их боковых цепях отличается не более чем примерно на четыре. Они имеют приблизительно одинаковую форму, если число ветвей в их боковых цепях отличается не более чем на единицу. Считают, что аминокислоты с фенильными или замещенными фенильными группами в их боковых цепях имеют примерно одинаковый размер и форму. За исключением тех случаев, специально предусмотренных в настоящем документе, консервативные замещения предпочтительно осуществляют природными аминокислотами.

Белки альбумина и иммуноглобулина дикого типа можно получить из различных источников. Например, такие белки можно получить из кДНК библиотеки, полученной из ткани или из клеток, которые экспрессируют представляющие интерес мРНК на детектируемом уровне. Библиотеки можно скринировать с помощью зондов, сконструированных с использованием опубликованных последовательностей

- 103 019968

ДНК или белков для конкретного, представляющего интерес, белка. Например, константные участки легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина раскрыты у Абатк, е! а1. (1980), Вюсйет1кбу, 19: 2711-2719; Соидйе!, е! а1. (1980), Вюсйет1к!гу, 19: 2702-2710; Бо1Ьу, е! а1. (1980), Ргос. №!1. Асаб. δ^. υδΑ 77: 60276031; Все е! а1. (1982), Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. ИВА, 79: 7862-7862; Ра1кпег, е! а1. (1982), ЫаЩге, 298: 286-288 и Мотком, е! а1. (1984), Апп. Βеν. Iттυηο1., 2: 239-256. Некоторые ссылки, раскрывающие белки и ДНК последовательности альбумина, включают Ме1оип, е! а1. (1975), РЕВЗ Ьейегк, 58: 136; Вейгепк, е! а1. (1975), Реб. Ргос., 34: 591; Ьа^п, е! а1. (1981), №1с1ек Ас1бк Векеагсй, 9: 6102-6114 и МшдйеШ, е! а1. (1986), 1. Вю1. Сйет., 261: 6747.

Характеризация гетерологичных слитых белков по настоящему изобретению.

Существуют многочисленные методы характеризации слитых белков по настоящему изобретению. Некоторые из указанных методов включают, без ограничения, ЗБЗ-РАСЕ, объединенный с методами окрашивания белков, или иммуноблоттинг с использованием антиНдС или янти-НЗА антител. Другие методы включают, например, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией/ионизацией с использованием матрицы (МАйБНМЗ), жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию, изоэлектрическое фокусирование, аналитический анионообмен, хроматофокусировку и круговой дихроизм.

Повышение аффинности сывороточного альбумина.

Различные молекулы можно также слить с полипептидами ЬС-СЗР по настоящему изобретению, чтобы модулировать время полужизни полипептидов ЬС-СЗР в сыворотке. В некоторых вариантах молекулы связывают или сливают с полипептидами ЬС-СЗР по настоящему изобретению для повышения аффинности эндогенного сывороточного альбумина у животного.

Например, в некоторых случаях осуществляют рекомбинантное слияние полипептида ЬС-СЗР и связывающей последовательности альбумина. Примеры связывающей последовательности альбумина включают, без ограничения, связывающий домен альбумина из стрептококкового белка С (см., например, Макпбек е! а1., 1. Рйагтасо1. Ехр. Тйег., 277: 534-542 (1996) и 8|о1апбег е! а1., 1. Iттυпο1. Ме!йобк, 201: 115-123 (1997)) или связывающие альбумин пептиды, такие как те, что раскрыты, например, у Бептк, е! а1., 1. Вю1. Сйет., 277: 35035-35043 (2002).

В других вариантах полипептиды ЬС-СЗР по настоящему изобретению ацилируют жирными кислотами. В некоторых случаях жирные кислоты промотируют связывание с сывороточным альбумином; см., например, КигБйак, е! а1., Вюсйет. 1., 312: 725-731 (1995).

В других вариантах полипептиды ЬС-СЗР по настоящему изобретению сливают непосредственно с сывороточным альбумином (включая, без ограничения, человеческий сывороточный альбумин). Специалистам в данной области должно быть понятно, что широкий круг других молекул также можно связать с ЬС-СЗР в настоящем изобретении, чтобы модулировать связывание с сывороточным альбумином или другими сывороточными компонентами.

X. Гликозилирование полипептидов ЬС-СЗР.

Настоящее изобретение включает полипептиды ЬС-СЗР, включающие одну или более из не кодируемых в природе аминокислот, содержащих сахаридные остатки. Сахаридные остатки могут быть или природными (включая, без ограничения, Ν-ацетилглюкозамин) или неприродными (включая, без ограничения, 3-фторгалактозу). Указанные сахариды могут быть связаны с не кодируемыми в природе аминокислотами или Ν- или О-связанной гликозидной связью (включая, без ограничения, Ν-ацетилгалактозаЬ-серин) или неприродной связью (включая, без ограничения, оксим или соответствующие С- или δсвязанные гликозиды).

Сахаридные (включая, без ограничения, гликозил) молекулы можно добавлять к полипептидам ЬССЗР или 1п νίνο, или 1п νίΐτο. В некоторых вариантах по настоящему изобретению полипептид ЬС-СЗР, включающий карбонилсодержащую не кодируемую в природе аминокислоту, модифицируют производным сахарида с аминооксигруппой, чтобы создать соответствующий гликозилированный полипептид, связанный через оксимную связь. После присоединения к не кодируемой в природе аминокислоте указанный сахарид можно далее освободить путем обработки гликозилтрансферазой и другими ферментами для создания олигосахаридной связи с ЬС-СЗР; см., например, Н. Ьш, е! а1. 1. Ат. Сйет. Зос., 125: 17021703 (2003).

В некоторых вариантах настоящего изобретения полипептид ЬС-СЗР, включающий карбонилсодержащую не кодируемую в природе аминокислоту, модифицируют непосредственно гликаном определенной структуры, полученным как аминооксипроизводное. Специалистам в данной области должно быть понятно, что другие функциональности, включая азид, алкин, гидразид, гидразин и семикарбазид, можно использовать для связывания сахарида с не кодируемой в природе аминокислотой.

В некоторых вариантах настоящего изобретения полипептид ЬС-СЗР, включающий азид- или алкинилсодержащую не кодируемую в природе аминокислоту, можно затем модифицировать, включая, без ограничения, [3+2] реакцию циклоприсоединения Хьюсгена с, включая, без ограничения, алкинил- или азидопроизводные соответственно. Указанный способ позволяет модифицировать белки с чрезвычайно высокой селективностью.

- 104 019968

XI. Димеры и мультимеры ЬС-СδР.

В настоящем изобретении также предложены комбинации ЬС-СδР и ЬС-СδР аналогов, такие как гомодимеры, гетеродимеры, гомомультимеры или гетеромультимеры (т.е. тримеры, тетрамеры и т.д.), где ЬС-СδР, содержащий одну или более из не кодируемых в природе аминокислот, связывают с другим ЬС-СδР или вариантом ЬС-СδР либо с любым другим полипептидом, который не является ЬС-СδР или вариантом ЬС-СδР, или непосредственно с основной цепью полипептида либо через линкер. Благодаря увеличенной молекулярной массе по сравнению с мономерами димерные или мультимерные конъюгаты ЬС-СδР могут демонстрировать новые или искомые свойства, включая, без ограничения, различные фармакологические, фармакокинетические, фармакодинамические свойства, модулированное терапевтическое время полужизни или модулированное время полужизни в плазме по сравнению с характеристиками для мономерного ЬС-СδР. В некоторых вариантах ЬС-СδР димеры по настоящему изобретению модулируют сигнал трансдукции рецептора С-СδР. В других вариантах димеры или мультимеры ЬС-СδР по настоящему изобретению действуют как рецепторные антагонисты, агонисты или модуляторы.

В некоторых вариантах одна или более из молекул ЬС-СδР, присутствующих в ЬС-СδР, содержащем димер или мультимер, включает не кодируемую в природе аминокислоту, связанную с водорастворимым полимером.

В некоторых вариантах полипептиды ЬС-СδР связывают непосредственно, включая, без ограничения, через Акп-Ьук амидную связь или Сук-Сук дисульфидную связь. В некоторых вариантах полипептиды ЬС-СδР и/или связанные не ЬС-СδР молекулы включают различные не кодируемые в природе аминокислоты для облегчения димеризации, включая, без ограничения, алкин в одной не кодируемой в природе аминокислоте первого полипептида ЬС-СδР и азид во второй не кодируемой в природе аминокислоте второй молекулы, конъюгируют с помощью [3+2] циклоприсоединения Хьюсгена. Альтернативно, ЬССδР и/или связанную не ЬС-СδР молекулу, включающую кетонсодержащую не кодируемую в природе аминокислоту, можно конъюгировать со вторым полипептидом, включающим гидроксиламинсодержащую не кодируемую в природе аминокислоту, и полипептиды реагируют через образование соответствующего оксима.

Альтернативно, два полипептида ЬС-СδР и/или связанную не ЬС-СδР молекулу связывают через линкер. Можно использовать любые гетеро- или гомобифункциональные линкеры для связывания двух молекул и/или связанных не ЬС-СδР молекул, которые могут содержать одинаковые или различные первичные последовательности. В некоторых случаях линкер, использованный для связывания ЬС-СδР и/или связанной не ЬС-СδР молекулы вместе, может быть бифункциональным реагентом ПЭГ. Молекулярная масса или длина линкера может меняться в широком интервале значений. Линкеры с большей или меньшей молекулярными массами линкеров можно использовать для обеспечения необходимого пространственного положения или конформации между ЬС-СδР и связанным объектом или между ЬССδР и его рецептором либо между связанным объектом и его связывающим партнером, если он присутствует. Более длинные или более короткие линкеры можно также использовать для обеспечения необходимого пространственного положения или гибкости между ЬС-СδР и связанным объектом или между связанным объектом и его связывающим партнером, если он присутствует.

В некоторых вариантах в настоящем изобретении предложены водорастворимые бифункциональные линкеры, которые имеют строение гантели, которые включают а) азид, алкин, гидразин, гидразид, гидроксиламин или карбонилсодержащую молекулу, по меньшей мере, на первом конце основной полимерной цепи, и Ь) по меньшей мере, вторую функциональную группу на втором конце основной полимерной цепи. Вторая функциональная группа может быть такой же, как первая функциональная группа, или может отличаться от нее. Вторая функциональная группа в некоторых вариантах является нереакционноспособной в отношении первой функциональной группы. В настоящем изобретении предложены в некоторых вариантах водорастворимые соединения, которые включают по меньшей мере одну ветвь разветвленной молекулярной структуры. Например, разветвленной молекулярной структурой может быть дендритная структура.

В некоторых вариантах настоящего изобретения предложены мультимеры, включающие один или более из полипептидов ЬС-СδР, образованных в реакции с водорастворимыми активированными полимерами, которые имеют структуру к- (СН₂СН_гО) „-о- (СН₂)„-Х где п принимает значения от около 5 до 3000; т принимает значения 2-10; X может представлять собой азид, алкин, гидразин, гидразид, аминооксигруппу, гидроксиламин, ацетил или карбонилсодержащую молекулу и В представляет собой кэппирующую группу, функциональную группу или отщепляемую группу, которые могут быть одинаковыми с X или могут отличаться. В может быть, например, функциональной группой, выбранной из группы, состоящей из гидроксила, защищенного гидроксила, алкоксила, сложного эфира Ν-гидроксисукцинимидила, сложного эфира 1-бензотриазолила, Νгидроксисукцинимидилкарбоната, 1-бензотриазолилкарбоната, ацеталя, альдегида, гидратов альдегидов, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, активного сульфона, амина, аминоокси, защищенного амина, гидразида, защищенного гидразида, защищенного тиола, карбоновой кислоты, защищенной карбоновой кислоты, изоцианата, изотиоцианата, малеимида, винилсульфона, дитиопиридина, винилпири- 105 019968 дина, иодоацетамида, эпоксида, глиоксалей, дионов, мезилатов, тозилатов и трезилата, алкена и кетона.

XII. Измерение активности полипептида ЬС-С8Е и аффинности ЬС-С8Е в отношении рецептора.

Активность полипептида ЬС-С8Е можно определить, используя стандартные или известные ш уйго или ш νί\Ό анализы. Полипептиды ЬС-С8Е можно анализировать в отношении биологической активности подходящими методами, известными специалистам. Такие анализы включают, без ограничения, те, что раскрыты у Небап е! а1. Уе!егшагу [ттипо1оду апб [ттипора11то1оду (2001), 81: 45-57, и анализы, в которых оценивают биологические активности йС-С8Е.

Полипептиды ЬС-С8Е можно анализировать в отношении их способности повышающе регулировать СБ 11а, СБ11Ь, СБ11с и/или СБ18 в нейтрофилах. Измерения указанной активности можно осуществить, используя ЕАС8, как раскрыто Небап е! а1. (см. выше). В дополнительных анализах, хорошо известных специалистам в данной области, измеряют активацию нейтрофилов, включая, без ограничения, анализы, в которых измеряют Ь-селектин. В других анализах, которые можно осуществить, оценивают пролиферацию и/или дифференциацию клеток, используя полипептиды ЬС-С8Е по настоящему изобретению.

Полипептиды ЬС-С8Е можно анализировать в отношении их способности связываться с рецептором. Рецептор С-С8Е можно получить, используя методики и способы, хорошо известные специалистам в данной области. Рецептор йС-С8Е можно получить по способу патента США № 5574136, который включен в описание посредством ссылки. Например, клетки или клеточные линии, которые действуют в ответ на С-С8Е или связывают С-С8Е (включая, без ограничения, клетки, содержащие активные рецепторы С-С8Е, такие как клетки, продуцирующие рекомбинантный рецептор С-С8Е), можно использовать для контроля за рецепторным связыванием ЬС-С8Е. Для не ПЭГилированного или ПЭГилированного полипептида ЬС-С8Е, включающего неприродную аминокислоту, аффинность ЬС-С8Е в отношении его рецептора или в отношении другого рецептора С-С8Е можно измерить, используя биосенсор Высоте™ (Рйагтааа). Подходящие анализы связывания включают, без ограничения, Высоте анализы (Реагсе е! а1., ВюсйетйРу, 38: 81-89 (1999)) и А1рйа8сгееп™ анализы (Регк1пЕ1тег). А1рйа8сгееп™ представляет собой нерадиоактивный люминесцентный анализ близости, основанный на шариках, в котором донорные шарики возбуждают лазером на длине волны 680 нм, для выделения синглетного кислорода. Синглетный кислород диффундирует и реагирует с производным тиоксена на поверхности акцепторных шариков, что приводит к эмиссии флуоресценции на длине волны 600 нм. Эмиссия флуоресценции происходит только, если донорные и акцепторные шарики оказываются в тесной близости за счет возникновения молекулярных взаимодействий, происходящих тогда, когда каждый связан с лигандом и рецептором соответственно. Такое взаимодействие лиганд-рецептор можно устранить за счет конкуренции, используя связывающие рецептор варианты, тогда как несвязывающие варианты не принимают участия в конкуренции.

Полипептидную ЬС-С8Е активность можно определить, используя стандартные или известные ш νίΐΐΌ или ш νί\Ό анализы. Например, клетки или клеточные линии, которые пролиферируют в присутствии йС-С8Е или связывают йС-С8Е (включая, без ограничения, клетки, содержащие активные С-С8Е рецепторы, такие как мышиные клетки костного мозга, УЕШ-3В (Б+), АМЬ-193 (АТСС) или клетки, продуцирующие рекомбинантные С-С8Е рецепторы), можно использовать для контроля за ЬС-С8Е рецепторным связыванием; см., например, Ктд е! а1., Ехр. Нета!о1., 20: 223 (1992); патент США № 6385505, которые включены в описание посредством ссылки. Ш νί\Ό модели на животных так же, как человеческие клинические испытания в тестировании активности йС-С8Е, включают те, что раскрыты, например, в патентах США № 6166183; 6565841; 6162426; 5718893, которые включены в описание посредством ссылки. Такие модели можно использовать для оценки ЬС-С8Е активности.

Независимо от того, какой метод используют для создания существующих аналогов ЬС-С8Е, указанные аналоги подвергают анализам на биологическую активность. Анализы с использованием меченного тритием тимидина можно осуществить для оценки степени деления клеток. Другие биологические анализы можно использовать для определения интересующей активности. Биологические анализы, такие как оценка способности индуцировать терминальную дифференциацию в мышиной лейкемической клеточной линии УЕШ-3В (Б+), также являются индикатором активности С-С8Е; см. №со1а, е! а1. В1ооб, 54: 614-27 (1979). Другие 1п νίΙΐΌ анализы можно использовать для оценки биологической активности; см. №со1а, Апп. Яеν. Вюсйет., 58: 45-77 (1989). Вообще тест на биологическую активность должен обеспечить анализ для необходимого результата, такого как возрастание или уменьшение биологической активности (по сравнению с неизмененными С-С8Е), отличающаяся биологическая активность (по сравнению с неизмененным С-С8Е), анализы рецепторной аффинности или аффинности связывания партнера, конформационные или структурные изменения самого ЬС-С8Е или его рецептора (по сравнению с модифицированным ЬС-С8Е) или анализ времени полужизни в сыворотке.

Ранее сообщалось, что УЕШ-3ВБ⁺ клетки и человеческие лейкемичные клетки из вновь диагностированных лейкемий связывают Ύ-меченые мышиные С-С8Е и что такому связыванию можно составить конкуренцию, добавляя немеченые С-С8Е или человеческий ί.'8Ρ-β. Тестируют способность природных С-С8Е и ЬС-С8Е конкурировать за связывание ¹²⁵БС-С8Е с человеческими или мышиными лейкемичными клетками. Высокой степени очистки природные С-С8Е (>95% чистоты; 1 мкг) йодируют [Те- 106 019968 |ебог, е! а1., Αηа1.В^осЬет., 127, 143 (1982)] и выделяют из реагентов, используя гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. Специфическая активность природного ¹²⁵1-С-С8Е составляет приблизительно 100 мкКюри/мкг белка.

Приведенная выше компиляция ссылок на методики анализов вовсе не является исчерпывающей, и специалистам в данной области должны быть известны другие анализы, которые можно использовать для тестирования желательного конечного результата. Изменения, которые можно вносить в такие анализы, хорошо известны специалистам в данной области.

XIII. Измерения эффективности, функционального времени 1и у1уо полужизни и фармакокинетических параметров.

Важный аспект настоящего изобретения состоит в пролонгировании биологического времени полужизни, что достигается путем конструирования полипептида Ь-СС8Е с конъюгированием полипептида или без конъюгирования полипептида с водорастворимой полимерной молекулой. Быстрое после введения снижение концентраций полипептида ЬС-С8Е в сыворотке делает его важным для оценки биологических реакций на обработку конъюгированным и неконъюгированным полипептидом ЬС-С8Е и его вариантами. Конъюгированные и неконъюгированные полипептиды ЬС-С8Е и их варианты по настоящему изобретению могут иметь пролонгированное время полужизни также после введения, например подкожного или внутривенного, делая возможным измерение, например, методом Ε^I8Α или в анализе первичного скрининга. Можно использовать Ε^I8Α или ΚΙΑ наборы из коммерческих источников. Другим примером анализа для измерения 1и у1уо времени полужизни ЬС-С8Е или его вариантов раскрыт в патенте США № 5824778, который включен в описание посредством ссылки. Измерение 1и у1уо биологического времени полужизни осуществляют, как здесь раскрыто.

Эффективность и функциональное время полужизни полипептида ЬС-С8Е, включающего не кодируемую в природе аминокислоту, можно определить в соответствии с протоколом, раскрытым в патентах США № 6646110; 6555660; 6166183; 5985265; 5824778; 5773581, которые включены в описание посредством ссылки. Указанные протоколы можно использовать также для ЬС-С8Е.

Фармакокинетические параметры полипептида ЬС-С8Е, включающего не кодируемую в природе аминокислоту, можно оценить в модели на 8ргадие-ОаМеу самцах крыс (N=5 животных в группе испытуемых). Животным вводят или одну дозу в 25 мкг/крысу внутривенно или 50 мкг/крысу подкожно и отбирают приблизительно 5-7 образцов крови в соответствии с заранее определенным расписанием, обычно на протяжении 6 ч для полипептида ЬС-С8Е, включающего не кодируемую в природе аминокислоту, не конъюгированную с водорастворимым полимером, и около 4 дней для полипептида ЬС-С8Е, включающего не кодируемую в природе аминокислоту и конъюгинованного с водорастворимым полимером. Фармакокинетические данные для ЬС-С8Е без не кодируемой в природе аминокислоты можно непосредственно сравнить с данными для полипептидов ЬС-С8Е, включающих не кодируемую в природе аминокислоту.

Фармакокинетические исследования полипептидов ЬС-С8Е можно осуществить в опытах на мышах, крысах или на приматах, например суиото1дик обезьянах. Обычно вводят одну инъекцию или подкожно или внутривенно и регистрируют изменения во времени сывороточных уровней ЬС-С8Е.

В патенте США № 5849883 и VО 89/10932, которые включены в описание посредством ссылки, раскрыт ряд моделей на животных, которые можно использовать для оценки полипептидов ЬС-С8Е по настоящему изобретению. Исследования на животных, которые можно осуществить, включают контрольное заражение крупного рогатого скота Рак1еиге11а Ьето1убса, скота с бактериальным заражением молочной железы/маститом (К1еЬк1е11а риеитоша). Другие исследования, которые можно осуществить, оценивают контроль, инцидентность и длительность бычьего респираторного заболевания или предотвращение колиформного мастита. Методы оценки здоровья животных, производства молока, количества нейтрофилов и других параметров хорошо известны специалистам в данной области. Другие модели, которые можно использовать для оценки полипептидов ЬС-С8Е по настоящему изобретению, включают без ограничения, модели на животных инфицирования или экспонирования инфекции, такие как модель Ркеиботоиак аегидтока пневмонии на хомяках, модель Саиб1ба а1Ь1саик пиелонефрита на крысах, модели, включающие новорожденных жеребят, и модели, включающие растущих свиней. Некоторые из указанных моделей раскрыты в патенте США № 5849883 и VО 89/10932. Модели, такие как те, что известны специалистам в данной области.

Дальнейшие примеры анализов для измерения 1и у1уо биологической активность ЬС-С8Е или его вариантов раскрыты в патентах США №№ 5681720; 5795968; 5824778; 5985265 и Во^еи е! а1., Ехрептеи!а1 Нета1о1оду, 27: 425-432 (1999), каждый из которых включен в описание посредством ссылки.

ХГУ. Введение и фармацевтические композиции.

Полипептиды или белки по настоящему изобретению (включая, без ограничения, ЬС-С8Е, синтетазы, белки, включающие одну или более из неприродных аминокислот и т.д.) необязательно используют для терапевтического применения, включая, без ограничения, в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Такие композиции, например, включают терапевтически эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Такой носитель или эксципиент включает, без ограничения, солевой раствор, буферированный солевой раствор, декстрозу, воду, глице- 107 019968 рин, этанол и/или их комбинации. Лекарственную форму приготавливают таким образом, чтобы она соответствовала способу введения. Обычно способы введения белков хорошо известны специалистам в данной области и могут быть применены для введения полипептидов по настоящему изобретению. Композиции могут быть в водорастворимой форме, такой как фармацевтически приемлемые соли, что означает, что включены и соли присоединения кислот и соли присоединения оснований. Патент США № 6497869, который включен в описание посредством ссылки, раскрывает лекарственные формы и введение полипептидов С-С8Е, включая, без ограничения, НС-С8Е и ЬС-С8Е. Обсуждаются соли, включающие сульфатные ионы, такие как сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат магния и их смеси, также как буферирующие агенты, такие как ацетат, цитрат, фосфат, НЕРЕ8, ВЕ8, ТАР8, ЕРР8, ТЕ8 и их смеси.

Терапевтические композиции, включающие один или более из полипептидов по настоящему изобретению, необязательно тестируют в одной или более из подходящих т уйго и/или т у1уо моделей заболеваний на животных для подтверждения эффективности, тканевого метаболизма и для оценки размеров доз в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. В частности, дозы можно вначале определить по активности, стабильности или другим подходящим характеристикам от раскрытых здесь неприродных до природных гомологов аминокислот (включая, без ограничения, сравнение полипептида ЬС-С8Е, модифицированного так, что он включает одну или более из неприродных аминокислот, с полипептидом ЬС-С8Е с природными аминокислотами, и сравнение полипептида ЬСС8Е, модифицированного так, что он включает одну или более из неприродных аминокислот, с доступной в настоящее время обработкой ЬС-С8Е), то есть в соответствующем анализе.

Введение осуществляют любым из способов, который используют для введения молекулы в тесный контакт с кровью или клетками ткани. Полипептиды с неприродной аминокислотой по настоящему изобретению вводят любым подходящим способом, необязательно с одним или более из фармацевтически приемлемых носителей. Подходящие способы введения таких полипептидов пациенту в контексте настоящего изобретения доступны, и, хотя можно использовать более одного способа для введения конкретной композиции, конкретный способ часто может обеспечить более быстрое или более эффективное действие или реакцию, чем другие способы.

Фармацевтически приемлемые носители определяются частично конкретной композицией, которую вводят так же, как конкретным способом, который используют для введения композиции. Соответственно существует широкий круг подходящих лекарственных форм фармацевтических композиций по настоящему изобретению.

Полипептиды ЬС-С8Е по настоящему изобретению можно вводить любым обычным способом, подходящим для белков или пептидов, включая, без ограничения, парентеральный, например, с помощью инъекций, включая, без ограничения, подкожную или внутривенную или любую другую форму инъекций или вливаний. Полипептидные композиции можно вводить рядом способов, включая, без ограничения, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, чрескожно, подкожно, наружно, сублингвально, интраваскулярно, интрамаммарно или ректально. Композиции, включающие полипептиды с неприродными аминокислотами, модифицированные или немодифицированные, можно также вводить, используя липосомы. Такие способы введения и соответствующие лекарственные формы обычно хорошо известны специалистам в данной области. Полипептид ЬС-С8Е можно использовать отдельно или в комбинации с другими подходящими компонентами, такими как фармацевтический носитель. Полипептид ЬС-С8Е можно использовать в комбинации с другими агентами или терапевтическими средствами.

Полипептиды ЬС-С8Е, включающие неприродную аминокислоту, отдельно или в комбинации с другими подходящими компонентами, можно также приготовить в аэрозольной лекарственной форме (т.е. их можно распылять) для введения путем ингаляции. Аэрозольные лекарственные формы могут быть распределены под давлением в приемлемых пропеллантах, таких как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п.

Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, такие как, например, интраартикулярное (в суставы), внутривенное, внутримышечное, интрадермальное, внутрибрюшинное и подкожное, включают водные и неводные, изотоничные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты буферы, бактериостаты и солюты, которые придают лекарственной форме изотоничность в отношении крови предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Лекарственные формы ЬС-С8Е могут быть представлены в виде единичной дозы или в многодозовых герметичных контейнерах, таких как ампулы и пробирки.

Парентеральное введение и внутривенное введение являются предпочтительными методами введения. В частности, способы введения, которые существуют в настоящее время, для терапевтических гомологов природных аминокислот (включая, без ограничения, те, которые обычно используют для ЕРО, СН,

С-С8Е, СМ-С8Е, ШИ, интерлейкинов, антител, ЕСЕ и/или любых других фармацевтически доставляемых белков), наряду с лекарственными формами, используемыми в настоящее время, представляют собой предпочтительные способы введения и лекарственные формы для полипептидов по настоящему изобретению.

- 108 019968

Доза, вводимая животному, в контексте настоящего изобретения достаточна, чтобы обеспечить благоприятную терапевтическую реакцию у животного в течение времени или другую соответствующую активность в зависимости от применения. Дозу определяют по эффективности конкретного вектора или лекарственной формы и активности, стабильности или времени полужизни в сыворотке используемого полипептида с неприродной аминокислотой и состояния животного, также как от веса тела или площади тела подлежащего лечению животного. Размер дозы также определяется сущностью, природой и степенью любых вредных воздействий, которые сопровождают введение конкретного вектора, лекарственной формы или т.п. у конкретного животного.

При определении эффективного количества указанного вектора или лекарственной формы, которое следует ввести при лечении или для профилактики заболевания, ветеринар оценивает циркулирующие уровни в плазме, токсичности лекарственных форм, степень развития заболевания и/или, при необходимости, продуцирование анти(полипептид с неприродной аминокислотой) антител.

Вводимая доза обычно бывает в интервале, эквивалентном дозам, в которых в настоящее время используют терапевтические белки, с поправкой на измененную активность или время полужизни в сыворотке соответствующей композиции. Указанные векторы или фармацевтические лекарственные формы по настоящему изобретению могут дополнять условия лечения любым известным обычным способом, включая введение антител, введение вакцины, введение цитотоксических агентов, полипептидов с натуральными аминокислотами, нуклеиновых кислот, аналогов нуклеотидов, модификаторов биологических реакций и т.п.

Для введения лекарственные формы по настоящему изобретению вводят в количестве, определяемом по ЬИ-50 или ЕС-50 соответствующей лекарственной формы, и/или по наблюдениям за присутствующими побочными эффектами полипептидов с неприродными аминокислотами при различных концентрациях, включая, без ограничения, как это применимо с точки зрения массы и общего состояния здоровья животного. Введение можно осуществить в виде единичной дозы или раздельных доз.

Если у животного, подвергшегося введению лекарственной формы, развивается лихорадка, озноб или ломота в мышцах, ему можно ввести подходящую дозу аспирина, ибупрофена, ацетаминофена или других лекарственных средств, контролирующих боль/лихорадку у животных. Животным, которые испытывают реакции на введение, такие как лихорадка, мышечная боль и озноб, за 30 мин до следуюющего введения проводят премедикацию, используя или аспирин, или ацетаминофен или, включая, без ограничения, дифенгидрамин, или другое лекарственное средство, подходящее для животных. В более тяжелых случаях ознобов и мышечных болей, которые быстро не реагируют на антипиретики и антигистамины, можно использовать меперидин. Введение клеток осуществляют медленно или с перерывами в зависимости от тяжести реакции.

Полипептиды ЬС-С8Р по настоящему изобретению можно вводить непосредственно животному. Для введения полипептида ЬС-С8Р субъекту используют любой из обычно используемых способов. Полипептидные ЬС-С8Р композиции в соответствии с вариантами по настоящему изобретению включают композиции, подходящие для перорального, ректального введения, местного, для ингаляций (включая, без ограничения, аэрозоли), для буккального (включая, без ограничения, сублингвальное), вагинального, парентерального (включая, без ограничения, подкожное, внутримышечное, внутрикожное, внутрисуставное, интраплевральное, внутрибрюшинное, интрацервикальное, внутриартериальное или внутривенное), местного (т.е. как на поверхность кожи, так и на слизистую, включая слизистую дыхательных путей), через легкие, интраокулярного, интраназального и трансдермального введения, хотя наиболее подходящий способ в каждом конкретном случае будет зависеть от природы и тяжести состояния, подлежащего лечению. Введение может быть или локальным или системным. Лекарственные формы соединений могут быть представлены в герметичных контейнерах, содержащих единичну дозу или множество доз, таких как ампулы и пробирки. Полипептиды ЬС-С8Р по настоящему изобретению можно приготовить в единичной дозовой форме для инъекций (включая, без ограничения, растворы, суспензии или эмульсии) в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Полипептиды ЬС-С8Р по настоящему изобретению можно также вводить с помощью непрерывных вливаний (используя, включая, без ограничения, мининасосы, такие как осмотические насосы), единичные болюсы или лекарственные формы депо с замедленным выделением.

Подходящие для введения лекарственные формы включают водные и неводные растворы, изотонические стерильные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворы, которые придают лекарственным формам изотоничность, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, агенты, способствующие растворению, загустители, стабилизаторы и консерванты. Растворы и суспензии можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток описанных ранее типов.

Для представления белков обычно используют технику сушки вымораживанием, которая служит для удаления воды из представляющих интерес белковых препаратов. Сушка вымораживанием или лиофилизация представляет собой процесс, с помощью которого подлежащий сушке материал вначале замораживают, а затем лед или замораживающий растворитель удаляют путем сублимации в вакууме.

Эксципиенты могут быть включены в прелиофилизированные лекарственные формы для повышения

- 109 019968 стабильности во время процесса сушки вымораживанием и/или для повышения стабильности лиофилизированного продукта при хранении; см. Р1ка1, М. ВюрЬагт., 3(9)26-30 (1990) и Атакама е( а1. РЬагт. Кек., 8(3): 285-291 (1991).

Сушка распылением фармацевтических препаратов также хорошо известна специалистам в данной области. Например, см. ВгоайЬеай, 1. е( а1., ТЬе 8ргау Ьгутд оГ Ркагтасеийса1к т Эгид Ьеу. Шй. РЬагт, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992). Кроме малых молекул фармацевтических препаратов, сушкой распылением сушат различные биологические препараты, которые включают ферменты, сыворотку, плазму, микроорганизмы и дрожжи. Сушка распылением представляет собой весьма подходящий способ, так как с ее помощью можно превратить жидкий фармацевтический препарат в тонкий, без пыли или агломератов порошок в одностадийном процессе. Основной способ включает следующие четыре стадии: а) распыление подаваемого раствора до состояния тумана; Ь) контактирование тумана с воздухом; с) сушка тумана и й) удаление воздуха из высушенного продукта. В патентах США №№ 6235710 и 6001800, которые включены в описание посредством ссылки, описывается приготовление рекомбинантного эритропоэтина сушкой распылением.

Фармацевтические композиции лекарственных форм по настоящему изобретению могут включать фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или стабилизатор. Фармацевтически приемлемые носители определяются частично в зависимости от предполагаемой для введения композиции, также как от конкретного способа введения композиции. Соответственно существует широкий круг подходящих лекарственных форм фармацевтических композиций (включающих необязательные фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы) по настоящему изобретению (см., например, КеттдФп 'к РЬагтасеи11са1 8с1епсек, 17'¹' ей. 1985)).

Подходящие носители включают, без ограничения, буферы, содержащие сукцинат, фосфат, борат, НЕРЕ8, цитрат, гистидин, имидазол, ацетат, бикарбонат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая, без ограничения, аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные полипептиды, включая, без ограничения, те, которые имеют менее чем около 10 остатков; белки, включая, без ограничения, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, включая, без ограничения, поливинилпирролидон; аминокислоты, включая, без ограничения, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин, гистидин или производные гистидина, метионин, глутамат или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая, без ограничения, трегалозу, сахарозу, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, включая, без ограничения, ЕЬТА и динатрий эдентат; ионы двухвалентных металлов, включая, без ограничения, цинк, кобальт или медь; спирты; сахара, включая, без ограничения, маннит или сорбит; образующие соли противоионы, включая, без ограничения, натрий и натрийхлорид; наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, кукурузный и другие крахмалы; связывающие агенты; подсластители и другие вкусовые агенты; красящие агенты; и/или неионные поверхностно активные агенты, включая, без ограничения, Тмееп™ (включая, без ограничения, Тмееп 80 (полисорбат 80) и Тмееп 20 (полисорбат 20), Плуроникс (Р1игошск™) и другие плуроновые кислоты, включая, без ограничения, плуроновую кислоту Р68 (полоксамер 188) или ПЭГ. Подходящие поверхностноактивные вещества включают, например, без ограничения, полиэфиры на основе поли(этиленоксид)поли(пропиленоксид)-поли(этиленоксид), то есть (РЕО-РРО-РЕО), или поли(пропиленоксид)поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксида), то есть (РРО-РЕО-РРО), или их комбинации. РЕО-РРО-РЕО и РРО-РЕО-РРО коммерчески доступны под торговыми марками Р1игошск™, К-Р1игошск™, Те1гошск™ и К-Те1гошск™ (ВА8Р Vуаηйойе Согр., ‘№уапйойе, М1сЬ.) и подробно раскрыты в патенте США № 4820352, который включен в описание посредством ссылки во всей своей полноте. Другие этилен/полипропилен блок-сополимеры могут быть подходящими поверхностно-активными веществами. Поверхностно-активное вещество или комбинацию поверхностно-активных веществ можно использовать для стабилизации ПЭГилированного ЬС-С8Р против одного или более из стрессов, включая, без ограничения, стрессы, которые возникают при перемешивании. Некоторые из вышеперечисленных агентов можно именовать как увеличивающие объем агенты. Некоторые агенты можно именовать как модификаторы тоничности. Противомикробные консерванты также можно использовать для придания стабильности и противомикробной эффективности; подходящие консерванты включают, без ограничения, бензиловый спирт, бензалконийхлорид, метакрезол, метил/пропилпарабен, крезол и фенол или их комбинации. В патенте США № 7144574, который включен в описание посредством ссылки, раскрыты дополнительные материалы, которые могут быть полезны в фармацевтических композициях и лекарственных формах по настоящему изобретению и в других препаратах для доставки.

Полипептиды ЬС-С8Р по настоящему изобретению, включая те, которые связаны с водорастворимыми полимерами, такими как ПЭГ, также можно вводить в виде частей систем с замедленным выделением. Композиции с замедленным выделением, которые включают, без ограничения, полупроницаемые полимерные матрицы в форме формованных изделий, включая, без ограничения, пленки или микрокапсулы. Матрицы с замедленным выделением включают матрицы из биосовместимых материалов, таких как поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Ьапдег е( а1., 1. Вютей. Ма1ег. Кек., 15: 267-277 (1981); Ьапдег,

СЬет, ТесЬ., 12: 98-105 (1982), этиленвинилацетат (Ьапдег е( а1., см.выше) или поли-Э-(-)-3- 110 019968 гидроксимасляная кислота (ЕР 133,988), полилактиды (полимолочные кислоты) (патент США № 3773919; ЕР 58481), полигликолиды (полимеры гликолевой кислоты), полилактиды со-гликолиды (сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты), полиангидриды, сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (81бтап е! а1., Вюро1утегк, 22, 547-556 (1983), поли(орто)эфиры, полипептиды, гиалуроновую кислоту, коллаген, хондроитинсульфат, карбоновые кислоты, жирные кислоты, фосфолипиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, полиаминокислоты, аминокислоты, такие как фенилаланин, тирозин, изолейцин, полинуклеотиды, поливинилпропилен, поливинилпирролидон и силикон. Композиции с замедленным выделением также включают заключенные в липосомы соединения. Липосомы, содержащие указанные соединения, получают способами, хорошо известными специалистам в данной области: ЭЕ 3218121; Еррк!ет е! а1., Ргос. Νι!1. Асаб. 8ск И8А, 82: 3688-3692 (1985); Нтапд е! а1., Ргос. №6 Асаб. 8ск И8А, 11: 4030-4034 (1980); ЕР 52322; ЕР 36676; патент США № 4619794; ЕР 143949; патент США № 5021234; японский опубликованный патент 83-118008; патенты США №№ 4485045 и 4544545 и ЕР 102324. Все цитированные ссылки и патенты включены в описание посредством ссылки.

Включенные в липосомы полипептиды ЬО-С8Р можно получить способами, раскрытыми, например, в ИЕ 3218121; Еррк!еш е! а1., Ргос. Νι!1. Асаб. 8ск И8А, 82: 3688-3692 (1985); Н\гапд е! а1., Ргос. №!1 Асаб. 8сЕ И8А, 11: 4030-4034 (1980); ЕР 52322; ЕР 36676; патент США № 4619794; ЕР 143949; патент США № 5021234; японский опубликованный патент 83-118008; патенты США №№ 4485045 и 4544545 и ЕР 102324. Композиции и размеры липосом хорошо известны или их легко может определить эмпирически специалист в данной области. Некоторые примеры липосом раскрыты, например, в Рагк ГУ., е! а1., Ргос. Νι!1. Асаб. 8ск И8А, 92:1327-1331 (1995); Ьакк Ό. и Раракаб.)орои1ок Ό. (ебк): \1В1Ж'АВ АРРЫСАΡΩΝΈ ОР ^ΥРО8ОΜЕ8 (1998); Игиттопб Э.С., е! а1., Ырокота1 бгид беКгегу кук!етк £ог сапсег Шегару, ш Теккег В (еб): СА^ЕЯ ВВВС Ο^ίΌνΒΒΥ апб ПЕ^ЬОРМЕЭТ (2002); Рагк ЕУ., е! а1., С1ш. Сапсег Яек., 8:1172-1181 (2002); Мекеп и.В., е! а1., ВксЫт. Вюркук. Ас!а, 1591(1-3): 109-118 (2002); Мато! С., е! а1., Сапсег Яек. 63: 3154-3161 (2003). Все цитированные ссылки и патенты включены в описание посредством ссылки. Множество лекарственных форм кО-С8Р было раскрыто, и они хорошо известны специалистам в данной области.

Доза, вводимая животному в контексте настоящего изобретения, должна быть достаточной для того, чтобы вызвать благоприятную реакцию у субъекта через некоторое время. Обычно полное фармацевтически эффективное количество полипептида ЬО-С8Р по настоящему изобретению, вводимого парентерально, составляет дозу в интервале от около 0,01 мкг/кг/день до около 100 мкг/кг или от около 0,05 до около 1 мг/кг веса тела животного, хотя это является предметом терапевтического рассмотрения. Частота введения доз также является предметом терапевтического рассмотрения, и вводить дозы можно чаще или реже, чем коммерчески доступные полипептидные ЬО-С8Р продукты, рекомендованные для использования для животных. Обычно ПЭГилированный полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению можно вводить любым из указанных выше способов.

Х\. Терапевтические применения полипептидов ЬО-С8Р по настоящему изобретению.

Полипептиды Ь-ОС8Р по настоящему изобретению можно использовать для лечения широкого круга нарушений. Введение кО-С8Р продуктов приводит к образованию белых кровяных телец у людей. Так, введение полипептидов ЬО-С8Р по настоящему изобретению может быть полезным для предотвращения инфицирования животных, которые подвержены риску такого инфицирования. Полипептиды ЬОС8Р по настоящему изобретению можно вводить животным, которые инфицированы. Инфекции, которые можно лечить полипептидами ЬО-С8Р по настоящему изобретению, включают, без ограничения, мастит и транспортную лихорадку. В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГилированный полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению вводят животному в интервале от двух недель до одного дня перед отелом. В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГилированный полипептид ЬОС8Р по настоящему изобретению вводят животному в интервале от двух недель до одного дня перед отелом и дополнительно вводят в день отела или вплоть до одной недели после отела. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению вводят животному в интервале от двух недель до одного дня перед отелом. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению вводят животному в интервале от двух недель до одного дня перед отелом и дополнительно вводят в день отела или вплоть до одной недели после отела. В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГилированный полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению вводят животному в интервале от одной недели до одного дня перед отелом. В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГилированный полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению вводят животному в интервале от одной недели до одного дня перед отелом и дополнительно вводят в день отела или вплоть до одной недели после отела. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению вводят животному в интервале от одной недели до одного дня перед отелом. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению вводят животному в интервале от одной недели до одного дня перед отелом и дополнительно вводят в день отела или вплоть до одной недели после отела.

В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬО-С8Р по настоящему изобретению

- 111 019968 вводят животному в интервале от двух недель до транспортировки и в день транспортировки. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят животному в интервале от одной недели до одного дня до транспортировки. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят животному в интервале от одной недели до одного дня до транспортировки и дополнительно вводят в день транспортировки или вплоть до одной недели после транспортировки.

В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят животному за семь дней до отела. В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят животному за семь дней до отела и дополнительно вводят в день отела или вплоть до одной недели после отела. В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят животному за семь дней до отела и дополнительно вводят в день отела. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят животному за семь дней до отела. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят животному за одну неделю до отела и дополнительно вводят в день отела или вплоть до одной недели после отела. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят животному за одну неделю до отела и дополнительно вводят в день отела. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят корове за один день или в день отела, чтобы предотвратить заболевание теленка. В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГ илированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят корове за один день или в день отела, чтобы предотвратить заболевание теленка. В одном варианте по настоящему изобретению полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят корове за один день до отела, чтобы предотвратить заболевание теленка. В одном варианте по настоящему изобретению ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят корове за один день до отела, чтобы предотвратить заболевание теленка. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19;

0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39;

0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49 или 0,50 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28;

0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48;

0,49 или 0,50 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению ПЭГилируют и вводят в дозе 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37;

0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49 или 0,50 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению ПЭГилируют и вводят в дозе 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22;

0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42;

0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49 или 0,50 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,01 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,01 мкг/кг.

В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 или 1,0 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 или 1,0 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению ПЭГилируют и вводят в дозе 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 или 1,0 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению ПЭГилируют и вводят в дозе 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 или 1,0 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,1 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,1 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬСС8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,2 мкг/кг. В одном варианте ПЭГ илированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,2 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,3 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,3 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,4 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬСС8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,4 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,5 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬСС8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 0,5 мкг/кг.

В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

39, 40, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,

32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в

- 112 019968 дозе 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,

33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,

26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,

56, 57, 58, 59, 60 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 10 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 10 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 20 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 20 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 30 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 30 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 40 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 40 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 50 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе 50 мкг/кг. В одном варианте полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе больше чем 0,5 мкг/кг. В одном варианте ПЭГилированный полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят в дозе больше чем 0,5 мкг/кг.

Фармацевтические композиции, содержащие ЬС-С8Е, можно приготовить такой степени эффективности для введения различными способами животному, испытывающему нарушение, характеризующееся низким или ненормальным продуцированием лейкоцитов, или отдельно либо как часть состояния или заболевания. Средние количества ЬС-С8Е могут варьироваться и, в частности, должны основываться на рекомендациях и предписаниях квалифицированного ветеринара. Точное количество ЬС-С8Е составляет вопрос предпочтений субъекта относительно таких факторов, как точный тип состояния, подлежащего лечению, состояния животного, подлежащего лечению, так же, как и других ингредиентов композиции. Настоящее изобретение также предусматривает введение терапевтически эффективного количества другого активного агента. Вводимое количество может легко определить специалист в данной области на основании сведений о лечении ЬС-С8Е. ЬС-С8Е по настоящему изобретению, таким образом, можно использовать для стимулирования продуцирования лейкоцитов и корректировки пониженных уровней эритроцитов. Чаще всего, количество лейкоцитов снижается из-за раковых заболеваний, инфекций или химиотерапии. Также можно лечить состояния, которые могут привести к нейтропении у других, в остальном здоровых животных. Обычно любые состояния, которые лечат, используя йС-С8Е, можно также лечить, используя ЬС-С8Е и/или конъюгаты ПЭГ:ЬС-С8Е по настоящему изобретению. В настоящем изобретении предложено также введение терапевтически эффективного количества другого активного агента, такого как противораковый химиотерапевтический агент. Необходимое для введения количество может легко определить специалист в данной области с учетом информации о лечении с помощью ЬСС8Е.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получить обычными способами.

Примеры

Следующие примеры представлены для иллюстрации и никоим образом не ограничивают изобретение.

Пример 1. Выбор сайта для встраивания не кодируемых в природе аминокислот в ЬС-С8Е.

Этот пример раскрывает некоторые из многих потенциальных наборов критериев для выбора сайтов для встраивания не кодируемых в природе аминокислот в ЬС-С8Е.

Была создана теоретическая модель бычьего СС8Е с использованием кристаллической структуры человеческого СС8Е, связанного с рецепторами (РБВ Ю NО: 2Б9О). Координаты для этой структуры человеческого СС8Е доступны из банка данных для белков (РБВ) (ВетзЧеш еЧ а1. 1. Мо1. В1о1., 1997, 112, р. 535). Потенциальные остатки для замещения включают, без ограничения, сайты консервативного замещения и остатки с самой большой доступностью для растворителя, используя Сх программу (РшЧаг еЧ а1. (2002) ВюЧпГогтаЧюз, 18(7): 980-4). Сайты консервативных замещений, идентифицированные для замещения пара-ацетилфенилаланином, включают, без ограничения, тирозиновые, фенилаланиновые и аргининовые остатки, которые содержат гидрофобное ядро с зарядом или без него. Остатки, которые могут быть структурно релевантными, не были выбраны для замещений, включая, без ограничения, глицины, пролины и остатки, включенные в кэппинг конца спирали. Остатки в известных участках рецепторного связывания также не выбирают для замещения. Положения 123 (Азр) и 141 (Тйг) в 8ЕО Ш NО: 1 могут быть критическими для взаимодействия с рецептором. Положение 7 (Агд) может быть критическим для способа укладки полипептида. Положение 133 (Тйг) представляет собой сайт О-связанного гликозилирования в человеческом С-С8Е.

В некоторых вариантах одна или более не кодируемых в природе аминокислот встроены в одном или более из следующих положений в ЬС-С8Е: перед положением 1 (т.е. на Ν-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,

69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,

- 113 019968

99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (т.е. на карбоксильном конце белка) и любой их комбинации (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2 либо соответствующие аминокислоты в других полипептидах ВС-С8Е).

В некоторых вариантах одна или более не кодируемых в природе аминокислот встроены в одно или более из следующих положений ЙС-С8Е: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173 и любые их комбинации 8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот встроены в одно или более из следующих положений ЙС-С8Е: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166 и в любые их комбинации (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот встроены в одно или более из следующих положений ВС-С8Е: 3, 7, 62, 133, 166 и любые их комбинации 8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2. В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот встроены в одно или более из следующих положений ВС-С8Е 62, 133 и их комбинации (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот встроены в положение 62 ВС-С8Е (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующая аминокислота в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах одна или более из не кодируемых в природе аминокислот встроены в положение 133 ВС-С8Е (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующая аминокислота в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах полипептид по настоящему изобретению включает одно или более из замещений, добавлений или делеций природных аминокислот. В некоторых вариантах одна или более из неприродных аминокислот встроены в лидерную или сигнальную последовательность, которые представляют собой Ν- или С-конец 8ЕО ГО NΟ: 1, 2, или других ВС-С8Е последовательностей.

159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (т.е. на карбоксильном конце белка) и любые их комбинации (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ:

либо соответствующие аминокислоты в других полипептидах ВС-С8Е).

В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173 и любые их комбинации (8ЕО ГО ЫО: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166 и любые их комбинации (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, положения: 3, 7, 62, 133, 166 и любые их комбинации (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в одном или более из указанных положений связана с водорастворимым полимером, включая, без ограничения, 62, 133 и их комбинации (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в положении 62 связана с водорастворимым полимером (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующая аминокислота в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах не кодируемая в природе аминокислота в положении 133 связана с водорастворимым полимером (8ЕО ГО NΟ: 1 или соответствующая аминокислота в 8ЕО ГО NΟ: 2). В некоторых вариантах неприродная аминокислота в сигнальной или лидерной последовательности Ν- или С-конца 8ЕО ГО NΟ: 1, 2, или другой последовательности ВС-С8Е связана с водорастворимым полимером.

Пример 2. Клонирование и экспрессия полипептида ВС-С8Е, содержащего не кодируемую в природе аминокислоту, и продуцирование в Е. со11.

Этот пример детализирует клонирование и экспрессию полипептида ВС-С8Е, включающего не кодируемую в природе аминокислоту в Е. со11, и способы оценки биологической активности модифицированных полипептидов ВС-С8Е.

Методы клонирования ВС-С8Е хорошо известны специалистам в данной области. Полипептидная и полинуклеотидная последовательности ВС-С8Е и клонирование ВС-С8Е в клетки-хозяева, также как способы очистки ЙС-С8Е, подробно раскрыты в патенте США № 5849883, который включен в описание по- 114 019968 средством ссылки во всей своей полноте, и у Не1йаг1 е! а1. Vеΐе^^ηа^у Iттиηο1οду апй (2001) 81: 45-57.

кДНК, кодирующие зрелый ЬС-С8Е, представлены как 8ЕЦ ΙΌ N0: 3. Полипептид, кодируемый указанной последовательностью, представлен как 8ЕЦ ΙΌ N0: 1.

кДНК, кодирующая зрелый ЬС-С8Е с метионином на №конце, представлена как 8ЕЦ ΙΌ N0: 4. Полипептид, кодируемый указанной последовательностью, представлен как 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.

Введенную трансляционную систему, которая включает ортогональную тРНК (О-тРНК) и ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (0-К8), используют для экспрессии ЬС-С8Е, содержащего не кодируемую в природе аминокислоту. 0-К8 преимущественно аминоацилирует О-тРНК с не кодируемой в природе аминокислотой. В свою очередь, трансляционная система встраивает не кодируемую в природе аминокислоту в ЬС-С8Е, в ответ на кодируемый селекторный кодон. Подходящие 0-К8 и О-тРНК последовательности раскрыты в \У0 2006/068802, озаглавленном СотровШопв оГ АттоасуНКПА 8уп1Не1аве апй Ивев ТНегеоГ' (Е9--8ЕЦ ΙΌ N0: 22 & Ό286Β мутант Е9--8ЕЦ ΙΌ N0: 24 в указанной заявке), и \У0 2007/021297, озаглавленном СотровШопв оГ ГКЫА апй Ивев ТНегеоГ (Е13; 8ЕЦ ΙΌ N0: 23 в указанной заявке), которые включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Таблица 2

0-К8 и О-тРНК последовательности

ЗЕС Ю N0:5	М. ] аппазсЬИ ттРНК^туг _Сил	тРНК
5Е0 Γϋ N0:6	НЬАООЗ; оптимизированная атЬег супрессорная тРНК	тРНК
ЗЕО Ю N0:7	НЕ325А; оптимизированная А-ЗСА со сдвигом рамки супрессорная тРНК	ТРНК
ЗЕО 10 N0:8	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-азидо-Ь-фенилаланина ρ-Αζ-РНеВЗ(6)	КЗ
ЗЕО 10 N0:9	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-бензоил-Ь-фенилаланина р-ВраВЗ(6)	ЕЗ
ЗЕО Ю N0:10	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания лропаргилфенилаланина РгорагдИ-РЬеКЗ	КЗ
ЗЕО Ю N0:11	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания пропаргилфенилаланина РгорагдИ-РИеКЗ	КЗ
ЗЕО 10 N0:12	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания лропаргилфенилаланина РгорагдЦ-РЬеКЗ	КЗ
ЗЕО Ю N0:13	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания л-азидофенилаланина ρ-Αζ-РйеКЗ(1)	КЗ
ЗЕО Ю N0:14	Аминоацил тРНК синтетаза для встраивания л-азидофенилаланина ρ-Αζ-РЬеЕЗ(3)	КЗ
5Е0 10 N0:15	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-азидофенилаланина ρ-Αζ-РЪеВЗ(4)	КЗ
5Е2 10 N0:16	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-азидофенилаланина ρ-Αζ-РИеКЗ(2)	ЕЗ
ЗЕО Ю N0:17	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-ацетилфенилаланина (ЪИ1)	КЗ
ЗЕО 10 N0:18	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-ацетилфенилаланина (ЬИ5)	КЗ
ЗЕО 10 N0:19	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-ацетилфенилаланина (1И6)	КЗ
5Е0 10 N0:20	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-азидофенилаланина (АгРЬеВЗ-5)	КЗ
ЗЕО Ю N0:21	Аминоацил-тРНК синтетаза для встраивания п-азидофенилаланина (АгРЪеРЗ-б)	КЗ

Трансформация Е. со11 плазмидами, содержащими модифицированную ЬС-С8Е полинуклеотидную последовательность и пару ортогональная аминоацил-тРНК синтетаза/тРНК (специфических для нужной не кодируемой в природе аминокислоты), позволяет осуществить сайт-специфическое встраивание не кодируемой в природе аминокислоты в полипептид ЬС-С8Е. Плазмида, использованная для экспрессии ЬС-С8Е, представлена на фиг. 1. Представляющий интерес ген, представленный как пример, представляет собой ЬС-С8Е с селекторным кодоном (атЬег), заменяющим кодон, кодирующий Т133. Полипептид с пара-ацетилфенилаланином в положении 133 обозначают как ЬС-С8Е Т133рАЕ. Р1рр - конститутивный Е. со11 промотор; Рго кластер - тандемные копии Е. со11 пролин-тРНК; Е13 кластер - тандемные копии модифицированных МеЛапососсив )аппавсН| тирозин-тРНК из \¥0 2007/021297; Е9 К8 (Ό286Ε) МеЛапо- 115 019968 соссик )аппакс1и тирозил-тРНК-синтетаза из VО 2006/068802; Т7 рго - Т7 промотор; Т7 терминатор; оп источник репликации; Ь1а (ар) последовательность - ген устойчивости к ампициллину.

Полинуклеотиды, кодирующие ЬС-СδР дикого типа или один из 15 мутантных полипептидов, клонируют и затем субклонируют рАК6 вектор, используя Собоп Пеуюек, Шс. Каждая созданная конструкция имеет селекторный кодон, амбер-кодон в различных положениях. Полученные полипептиды ЬС-СδР содержат не кодируемую в природе аминокислоту, пара-ацетилфенилаланин (рАР; рАсР), замещающую кодируемые в природе аминокислоты в одном из следующих положений: Ь3, В7, Е33, Н43, Ц58, δ62, 067, Ь69, Ь99, Ό123, Ь124, Т133, Р134, Т141 и В166 (нумерация положений относится к δΕ^ ГО NО: 1). Так как каждый из созданных мутантных полипептидов Ь-ССδР имеет метионин на Ν-конце (см. δΕ^ ГО NО: 2 для дикого типа последовательности бычьего С-СδР с метионином на Ν-конце), экспрессируемые полипептиды Ь-ССδР имеют замещения неприродной аминоксилоты в положениях номер +1 (например, один мутант содержит лейцин в положении 4 δΕ^ ГО NО: 2, замещенной рАР). После проверки последовательности плазмиды трансформируют в ν3110 В2 клетки и колонии выращивают на ампициллиновых планшетах. Информация о клеточной линии Е. сой представлена на фиг. 2. Указанные колонии используют для инокулирования 5 мл ЬВ разбавленным 1:1000 ампициллиновыми культурами, которые выращивают при 37°С до ОГО.600=0,8. Затем добавляют рАР (пара-ацетилфенилаланин) к 15 различным культурам до конечной концентрации 4 мМ. Спустя приблизительно 30 мин культуры инициируют Ьарабинозой до конечной концентрации 0,2% и культуры инкубируют при 37°С еще 5 ч. В это время отбирают образцы по 500 мкл из каждой культуры и осаждают центрифугированием при скорости 13000 об/мин в течение 4 мин. Надосадочную жидкость сливают и осадок снова суспендируют в 150 мкл ВРЕВ, используя 1 мкл ДНКзы, и инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. На следующее утро добавляют 4Х ΕΌδ образцовый буфер Цпуйгодеп, Саг1кЬаб, СА), образцы нагревают до 95°С в течение 5 мин и добавляют 10Х образцовый восстанавливающий агент Цпуйгодеп, Саг1кЬаб, СА). Затем образцы разделяют, используя δΌδ-РАСЕ на гелях с градиентом 4-12% Цпуйгодеп, Саг1кЬаб, СА) в МΕδ буфере, и визуализируют, используя краситель δ^тр1у В1ие δаГеδ!а^η Цпуйгодеп, Саг1кЬаб, СА). На фиг. 3 представлены образцы, полученные из дикого типа и ЬС-СδР мутантных культур после анализа на гелях с градиентом 4-12% и окрашивания Кумасси.

Солюбилизация препаратов телец включения.

Клеточную пасту снова суспендируют, смешивая до конечной концентрации 10% твердой части в 4°С буфере I для телец включения (ГО) (50 мМ Тпк рН 8,0; 100 мМ №С1; 1 мМ ЕИТА; 1% Тп!оп X-100; 4°С). Клетки лизируют, пропуская вновь суспендированный материал через микрофлюидайзер два раза. Образцы центрифугируют при 10000 д в течение 15 мин при 4°С и надосадочную жидкость декантируют. Осадок телец включения (ГВ) промывают, снова суспендируя в дополнительном объеме ГВ буфера I (50 мМ Тпк рН 8,0; 100 мМ №С1; 1 мМ ЕИТА; 1% Тп!оп Х-100; 4°С), и вновь суспендированный материал пропускают через микрофлюидайзер два раза. Образцы затем центрифугируют при 10000 д в течение 15 мин при 4°С и надосадочную жидкость декантируют. ГО осадок снова суспендируют в одном объеме буфера II (50 мМ Тпк рН 8,0; 100 мМ №С1; 1 мМ ЕИТА; 4°С). После повторного суспендирования образцы центрифугируют при 10000 д в течение 15 мин при 4°С и надосадочную жидкость декантируют. Осадок ГО снова суспендируют в 1/2 об. буфера II (50 мМ Тпк рН 8,0; 100 мМ №С1; 1 мМ ЕИТА; 4°С). Затем отбирают аликвоты ГО в подходящие контейнеры. Образцы центрифугируют при 10000 д в течение 15 мин при 4°С и надосадочную жидкость декантируют. Затем тельца включения солюбилизируют или хранят при -80°С до использования.

Солюбилизация телец включения.

Тельца включения солюбилизируют до конечной концентрации 10-15 мг/мл в солюбилизационном буфере (20 мМ Тпк, рН 8,0; 8М гуанидин; 10 мМ β-МЕ). Солюбилизированные ГО инкубируют при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 1 ч или до тех пор, пока они полностью не солюбилизируются. Концентрацию белка регулируют, разбавляя дополнительным количеством солюбилизационного буфера, если концентрация белка велика.

Рефолдинг.

Рефолдинг осуществляют, разбавляя образцы до конечной концентрации белка 0,5 мг/мл в 0,5 М аргинине, рН 8,0; 4°С. Образцы оставляют для рефолдинга на 48-72 ч при 4°С.

Очистка.

Твердый (NН₄)₂δО₄ добавляют к образцам до конечной концентрации 20% при осторожном перемешивании. Образцы осторожно перемешивают при 4°С в течение 30 мин. Осажденный белок (содержащий ЬС-СδР) центрифугируют при 12000 д в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют и осадок снова суспендируют в 1/2-кратном объеме 20 мМ №Ас, рН 4,5. Весь осадок не возвращается в раствор. Один только ЬС-СδР возвращается в раствор. Нерастворимый материал осаждают центрифугированием при 12000 д в течение 15 мин. Образцы декантируют и надосадочную жидкость сохраняют. ЬССδР материал фильтруют через 0,45-мкм фильтр. Затем полученный материал вводят в СМ РР колонку (СЕ Неа1!йсаге), уравновешенную буфером А (20 мМ №1Ас, рН 4,5). Материал был <10 м/с перед загрузкой в колонку. ЬС-СδР элюируют из колонки, используя линейный градиент более 10 об. колонки до 100% буфера В (20 мМ №Ас, рН 4,5; 500 мМ №1С1). На фиг. 4 представлен окрашенный Кумасси δΌδ- 116 019968

РАСЕ анализ пиковой фракции из СМ РР цикла колонки с ЬС-С8Р-Т133рАР.

ПЭГилирование и очистка.

Величину рН пула СМ доводят до рН 4,0, используя 50% ледяную уксусную кислоту. Затем пул концентрируют до примерно 4,0 мг/мл белка. К пулу добавляют 12:1 или 8:1 молярный избыток гидроксиламин ПЭГ :ЬС-С8Р. Полученную смесь инкубируют при температуре 28°С в течение 48-72 ч. Затем смесь разбавляют 8-10-кратно водой (<8 м/с) и затем вводят в 8Р НР колонку (СЕ НеаИйсаге), уравновешенную буфером А (20 мМ NаΑс, рН 4,5). ПЭГилированный ЬС-С8Р элюируют, используя линейный градиент более 40 об. колонки до 100% буфера В (20 мМ №1Ас, рН 4,5; 500 мМ №1С1). На фиг. 5 представлен 808-РАСЕ анализ пиковой фракции из 8Р НР колонки для ПЭГилированного ЬС-С8Р-Т133рАР. В качестве буфера для элюирования можно также, например, использовать 5% этиленгликоль.

Фракции ПЭГилированного ЬС-С8Р собирают и подвергают диализу против ЬС-С8Р буфера, используемого для приготовления лекарственной формы (4,26 мМ NаΑс, рН 4,0; 0,565 мМ №С1; 0,0033% Т\\ееп 20; 5% сорбит). Полученный ПЭГ материал концентрируют до 6-8 мг/мл белка, стерильно фильтруют, используя 0,22 мкм РЕ8 фильтр. Белок хранят при 4°С или мгновенно замораживают и хранят при -80°С для длительного хранения. На фиг. 6 представлен 8О8-РАСЕ анализ Ь-СС8р до и после ПЭГилирования. Полоса 1: ЬС-С8Р-Т133рАР; полоса 2: ЬС-С8Р-Т133рАР-20КПЭГ; полоса 3: см. В1ие Р1ик 2 маркер молекулярной массы.

Картирование пептида (трипсин/эндопротеиназа С1и-С) ЬС-С8Р.

Картирование пептида осуществляют для подтверждения встраивания пара-ацетилфенилаланина (рАР) в полипептид ЬС-С8Р. Очищенный ЬС-С8Р Т133рАР до ПЭГилирования и дикого типа ЬС-С8Р разбавляют до конечных значений 6 М гуанидин-НС1, 50 мМ Тпк рН 7,8 и восстанавливают 10 мМ ОТТ при 37°С в течение 1 ч. Образец алкилируют, используя 20 мМ 1АА, в течение 40 мин в темноте при комнатной температуре и реакцию гасят, добавляя 20 мМ ОТТ. Полученный материал диализуют в 100 мМ бикарбоната аммония рН 7,7 и обрабатывают трипсином 1:50 (белок:фермент) в течение 4 ч при 37°С. После указанной реакции добавляют С1и-С 1:20 в течение ночи при 25°С. Расщепление останавливают, добавляя ТРА до конечной концентрации 0,1%. Образец вводят в Сгасе Уубас С8 колонку с обращенной фазой в тандеме с масс-спектрометром ТйегтоРшшдап ЬС’О Оеса с захватом ионов течение 90 мин при детектировании на 214 и 250 нм. Градиент начинается при 98% подвижной фазы А (0,05% ТРА в воде) с изократическим элюированием в течение 8 мин и затем уменьшается до 60% подвижной фазы В (0,05% ТРА в ацетонитриле) в течение 90 мин с детектированием на 214 и 250 нм. Скорость потока составляет 0,2 мл/мин и температура в колонке 40°С. Капиллярный вольтаж устанавливают 15 В и полный интервал сканирования 100-2000 ш/ζ. Напряжение столкновения для М8/М8 составляет 42% от нормализованного.

На фиг. 7а представлен трипсин/С1и-С перевар дикого типа ЬС-С8Р (детектирование на 214 нм). На фиг. 7Ь представлен трипсин/С1и-С перевар ЬС-С8Р Т133рАР (детектирование на 214 нм). Показана повышенная гидрофобность от треонина до рАР (пара-ацетилфенилаланин) замещения. Для дикого типа ЬС-С8, время удерживания пептида, содержащего Т133, составляет 42,79 мин; для ЬС-С8Р Т133рАР, пептида, содержащего Т133рАР, и время удерживания сдвигается и составляет 46,89 мин.

Фиг. 8а демонстрирует трипсин/С1и-С перевар дикого типа ЬС-С8Р (детектирование на 250 нм). Фиг. 8Ь демонстрирует трипсин/С1и-С перевар ЬС-С8Р Т133рАР (детектирование на 250 нм). При анализе на 250 нм сигналы белок/пептид слабы, но сигнал, связанный с рАР, является сильным. Пептид, содержащий Т133 рАР, указан на фиг. 8Ь со временем удерживания 46,89 мин.

Картирование пептида (эндопротеиназа С1и-С) ЬС-С8Р.

Очищенную ЬС-С8Р Т133рАР до ПЭГилирования разбавляют до значений 6 М гуанидин-НС1, 50 мМ Тпк рН 7,8 и восстанавливают, используя 10 мМ ОТТ при 37°С в течение 1 ч. Образец алкилируют, используя 20 мМ 1АА в течение 40 мин в темноте при комнатной температуре, и реакцию гасят, добавляя 20 мМ ОТТ. Полученный материал диализуют в 100 мМ бикарбоната аммония рН 7,7 и обрабатывают С1и-С 1:20 (белок:фермент) в течение ночи при 25°С. Расщепление прекращают, добавляя ТРА до конечной концентрации 0,1%. Полученный образец вводят в Сгасе Уубас С8 колонку с обращенной фазой в тандеме с масс-спектрометром ТйегтоР1пп1дап ЬС’О Оеса с захватом ионов. Градиент начинают при 98% подвижной фазы А (0,05% ТРА в воде) с изократическим элюированием в течение 8 мин и затем уменьшают до 60% подвижной фазы В (0,05% ТРА в ацетонитриле) в течение 90 мин с детектированием на 214 и 250 нм. Скорость потока составляет 0,2 мл/мин и температура в колонке 40°С. Капиллярный вольтаж устанавливают 15 В и полный интервал сканирования 100-2000 ш/ζ. Напряжение столкновения для М8/М8 составляет 42% от нормализованного.

На фиг. 9а представлен С1и-С перевар дикого типа ЬС-С8Р (детектирование на 214 нм). На фиг. 9Ь представлен С1и-С перевар ЬС-С8Р Т133рАР (детектирование на 214 нм). Для дикого типа ЬС-С8Р пептид, содержащий Т133, имеет время удерживания 52,04 мин; для Т133рАР ЬС-С8Р, пептида, содержащего Т133рАР, время удерживания составляет 53,95 мин.

На фиг. 10а представлен С1и-С перевар дикого типа ЬС-С8Р (детектирование на 250 нм). На фиг.

10Ь представлен С1и-С перевар ЬС-С8Р Т133рАР (детектирование на 250 нм). При анализе на длине волны 250 нм сигналы белок/пептид слабые, но сигнал рАР является сильным. Пептид, содержащий Т133

- 117 019968 рАЕ, представлен на фиг. 10Ь с временем удерживания 53,95 мин.

Анализ полипептидов ЬС-С8Е с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и эксклюзионной ВЭЖХ.

ВР-НЬРС и 8ЕС-НБРС используют для анализа степени чистоты и для определения идентичности образцов после очистки. Очищенный 20К ПЭГ-ЬС-С8Е Τ133рΑΡ разбавляют до 1 мг/мл в буфере для приготовления лекарственного состава (4,26 мМ натрий ацетат рН 4,0, 0,565 мМ хлорид натрия, 0,0033% Τ\\^η-20 и 5% сорбит) и 10 мл вводят в колонку с обращенной фазой (РТ. Взкег ν^άе роге Ο^1 (С8)) (4,6x100 мм, 5 мкм). Градиент начинают с 50% подвижной фазы А (0,1% ΤΕΑ в воде) и снижают до 70% подвижной фазы В (0,1% ΤΕΑ в ацетонитриле) за 26 мин. Колонку восстанавливают, используя 90% подвижной фазы В в течение 4 мин и заново уравновешивая 50% подвижной фазой А в течение 5 мин. Используют скорость потока 1,5 мл/мин и температуру в 60°С с детектированием на 214 нм. Анализ осуществляют, используя программное обеспечение АдПеШ Сйет5ίаΐ^οη. В табл. 3 представлен основной пик (20К ПЭГ-ЬС-С8Е Τ133рΑΡ) с временем удерживания 8,50 мин. Расчет процента площади показал, 91,2% образца составляет ПЭГилированный-Ь-СС8Е.

Таблица 3

Время (минуты)	Площадь	площадь %
4.2	50.8	0.6
5.0	20.0	0.3
6.8	155.2	2.0
7.3	99.7	1.3
8.0	121.2	1.5
8.5	7245.0	91.2
9.3	87 9	1.1
9.7	31.9	0.4
10.1	135.5	1.7

ЬС-С8Е, который не был ПЭГилирован, также анализируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. В табл. 4 представлен основной пик (ЬС-С8Е Τ133рΑΡ) с временем удерживания 8,893 мин. При расчете процента площадей оказывается, что 64,3% образца составляют ЬС-С8Е Τ133рΑΡ.

Таблица 4

Время (минуты)	Площадь	Площадь %
5.6	1143	1.6
7.4	17.4	0.2
8.1	12.2	02
8.2	13.6	0.2
8.3	13.7	02
8.9	4622.1	64.3
9.3	930.8	13.0
10.2	13.9	02
10.3	12.0	02
10.8	1151 5	16.0
11.1	273 9	3.8
11.8	10.0	0.1

Очищенный 20К ПЭГ-ЬС-С8Е Τ133рΑΡ также анализируют, используя эксклюзионную ВЭЖХ. Чистый образец (2 мкл) вводят в колонку Το5ο11з35 Τ8Κ 8ирег 8ν3000 размером (4,6x300 мм, 4 мкм 250 А), используя 25 мин изократический градиент. Подвижная фаза содержит 97% 63 мМ фосфата натрия рН 7,0 и 3% 2-пропанола. Скорость потока 0,3 мл/мин и температура внутри колонки 25°С с детектированием на 214 нм. Анализ осуществляют, используя программное обеспечение АдИеН Сйет5ίаΐ^οη. В табл. 5 представлен основной пик с временем удерживания 9,157 мин. При расчете площадей оказалось, что 98,3% образца составляет мономерный ПЭГ-ЬС-С8Е; см. фиг. 11 для эксклюзионного ВЭЖХ анализа ПЭГилированного полипептида.

Таблица 5

Время (минуты)	Площадь	Площадь%
7.0	50.3	0.1
8.2	228.0	0.6
93!	36454.5	98.3
10.1	361.4	1.0

ЬС-С8Е, который не был ПЭГилирован, также анализируют, используя эксклюзионную ВЭЖХ. В табл. 6 представлен основной пик с временем удерживания 13,125 мин. При расчете процента площадей оказалось, что 99,0% образца составляет мономерный ЬС-С8Е Τ133рΑΡ; см. фиг. 12 для эксклюзионного ВЭЖХ анализа полипептида.

Таблица 6

Время (минуты)	Площадь	ГТлощадь%
10.4	10.0	0.0
11.1	6.8	0.0
11.7	178.2	0.5
12.6	129.5	0.4
13.1	33514.3	990

Ε8I-ΤΟΕ высокоточный анализ (АдПей ΤесЬηο1οду) полипептида ЬС-С8Е также осуществляют для подтверждения идентичности полипептида ЬС-С8Е. Очищенный ЬС-С8Е Τ133рΑΡ диализуют в 0,1% муравьиной кислоте. Образец вводят в С-18 картридж в течение 1 мин с водой, а затем элюируют 50%

- 118 019968 ацетонитрилом в воде. Полное время цикла составляет 3 мин, скорость потока - 0,3 мл/мин. Е8I капиллярный вольтаж устанавливают 4 кВ и вольтаж М8Т0Е фрагментера устанавливают 300 В. Сканированную кривую зарядов развертывают для получения значения МН+. Ожидаемое значение МН+ММ составляет 19145. В результате получают МН+ММ 19146.

Анализ пролиферации М-ЫЕ860.

Для оценки эффективности ЬС-С8Е молекул осуществляют анализ пролиферации для клеточной линии М-ИЕ'860. Клеточную линию получают из АТСС (№ в каталоге СВБ-1838). Клетки оттаивают и сохраняют в среде ВРМП640 + 10%ЕВ8 + пенициллин/стрептомицин + 50 мкМ 2-меркаптоэтанола + 20 нг/мл тШ-3 Цпуйтодеп, Саг1кЬаб, СА; ШШ3 от ВИ РНатттдеп са!#554579). Клетки разводят каждые два дня и высевают при плотности 0,02х 10⁶ клеток/мл.

В день накануне анализа клетки разводят до 0,1х10⁶ клеток/мл. Через 16-24 ч клетки высевают в аналитическую среду в черные плоскодонные 96-луночные планшеты в концентрации 10000 клеток/лунку и добавляют серийные разбавления ЬС-С8Е соединения (в двух экземплярах). Полный объем в лунке составляет 100 мкл, и используют аналитическую среду КРМI 1640 + 10% ЕВ8 + Р/8. Добавляют стандарты, такие как №иродеп® и \УТ ЬС-С8Е, в двух экземплярах для каждого планшета. Планшеты инкубируют при 37°С, 5% СО₂ в течение 42 ч. После 42-часового инкубирования добавляют 10 мкл/лунку А1атаг В1ие (Вюкоигсе са! #: ΌΆΚ1100) и планшеты инкубируют еще 6 ч при 37°С, 5% СО₂. Планшеты вращают со скоростью 4000 об/мин в течение 2 мин при комнатной температуре, чтобы полностью избавиться от воздушных пузырьков. Результаты считывают, используя флуориметр Тесап с параметрами длины волны возбуждения 535 нм и эмиссии на 590 нм. Планшеты заворачивают в фольгу, чтобы избежать экспонирования свету светочувствительного красителя А1атаг В1ие.

Для анализа результатов дублированные серийные разбавления для каждого соединения усредняют и величины ЕС50 рассчитывают, используя 81дта Р1о!. Необработанные значения ЕС50 перечислены для всех соединений, и рассчитывают кратность различий (ПЭГ илированные бычьи СС8Е сравнивают с \¥Т ЬС-С8Е). Эксперименты проводят несколько раз для оценки среднестатистической погрешности Ον<20% и вариативности результатов СУ<30%. Фиг. 13/табл. 7=М-ИЕ'860 анализ пролиферации - необработанные данные анализа пролиферации ЕС50 значения для 20К ПЭГилированных бычьих С-С8Е Т133рАЕ и для дикого типа. Фиг. 14/табл. 8=М-ИЕ'860 анализ пролиферации - кратность ЕС50 разностей 20К ПЭГилированных бычьих С-С8Е Т133рАЕ относительно дикого типа.

Были проанализированы другие С-С8Е молекулы, включающие замещение не кодируемой в природе аминокислотой. В табл. 9 представлены полученные средние значения ЕС50.

Таблица 7

		Νβιιροαβη	Меи1аз1а	и/тьеСЭР	20К РЕС- ЬТТЗЗ 1партия ΝΚ2]
Описание	Ачд ЕС50 [нг/мл 1	0.025	0.077	0.053	0.270
		0.005	0.004	0.005	0.042
	ον	18%	5%	9%	16%
	N	14	5	16	2

Таблица 8

		Меироаеп	№и1аз1а	иггьоС5Р	20К РЕС- ЬТ133 [партия ΝΚ21
Описание	Кратность различий ЕС5О [X]	1 0	3.2	1	5.1
	50	0.0	0.7	0	0.5
	ον	0%	23%	0%	9%
	Ν	14	5	12	2

Таблица 9

	Αν<1 ЕС50 значения	5Ц	СТ
Иеиродеп	0 025	0.005	18%
9УГЬ6-С5Р	0.053	0.005	9%
Ыеи1аз(а	0.077	0.004	5%
20кРЕО-Ь862	0 150	0.008	5%
20кРЕС-ЬТ133 [ΝΚ1]	0.258	0.045	17%
20кРЕО-ЬТ133 [ΝΚ2]	0.270	0.042	16%
20кРЕО-ЬК7	0.348	0.073	21%
20кРЕВ-ЬЕ166	0.363	0.033	9%
20кРЕ6-Ы 3	0.477	0.081	17%

Окрашивание бычьих нейтрофилов СИ11Ь.

мкл бычей крови помещают в необработанный полистирольный планшет (Са1 Ро1у Ротопа).

Клетки стимулируют, добавляя 50 мкл Nеирοдеη®, №и1ак1а® или ЬС-С8Е-Т133рАсЕ-20К ПЭГ, разбавленных в РВ8 (200 нг/мл до конечной концентрации 0,001 нг/мл). Полученный раствор осторожно пере- 119 019968 мешивают и инкубируют в течение 30 мин при 39°С в СО₂ инкубаторе. К клеткам добавляют 20 мкг/мл первичного антитела (мышиный антибычий СО11Ь: ММ12А, УМЯО). Клетки инкубируют при 4°С в течение 30 мин. Аналитический планшет центрифугируют при 800 д в течение 2 мин и надосадочную жидкость сливают. Эритроциты лизируют в течение 1 мин, добавляя 150 мкл холодного лизисного раствора (0,15 М фосфат, рН 7,2) и восстанавливают изотоничность, добавляя 50 мкл восстанавливающего раствора (0,15 М фосфат, 0,5 М ^1, рН 7,4). Планшет снова центрифугируют и надосадочную жидкость сливают. Процедуру лизиса повторяют до удаления всех видимых эритроцитов. Клетки дважды промывают 200 мкл ЕАС8 буфера (1хРВ8, 2,5 мМ НЕРЕ8, 0,1% азида натрия, 2,0% ЕВ8) и снова суспендируют в 100 мкл ЕАС8 буфера. Добавляют 20 мкг/мл вторичного антитела (козий антимышиный ^С1, человеческий абк-РЕ) и инкубируют при 4°С в течение 30 мин в темноте. Клетки осаждают и промывают дважды, затем снова суспендируют в 200 мкл ЕАС8 буфера. Используют прибор ВО ЕАС8 Аггау для накопления 50000 результатов и подсчитывают позитивные СО11Ь клетки.

На фиг. 15 представлены результаты эсперимента, в котором бычьи нейтрофилы окрашивают СО 11Ь антителом для оценки их реакционных способностей в отношении различных молекул. Среднюю интенсивность флуоресценции (МИ) для гранулоцитов используют для определения уровня СО11Ь презентации на поверхности клеток. Процент МИ представляет собой нормализованное значение относительно нестимулированной контрольной группы. Дозо-зависимые кривые и значения ЕС50 получены для №иродеп, №и1ак!а и ЬС-С8Е Т133рАГ-20К ПЭГ с использованием 4-параметрической подгонки. Значение ЕС50 для №иродеп® составило 3,18 нг/мл. Для №и1ак!а® значение ЕС50 составило 2,84 нг/мл и для ЬС-С8Е Т133рАГ-20К ПЭГ значение ЕС50 составило 6,23 нг/мл.

Пример 3. Введение карбонилсодержащей аминокислоты и последующая реакция с аминооксисодержащим ПЭГ.

Этот пример демонстрирует способ создания полипептида ЬС-С8Е, в котором встраивают кетонсодержащую не кодируемую в природе аминокислоту, которая затем реагирует с аминооксисодержащим ПЭГ с ММ приблизительно 5000. Каждый из остатков перед положением 1 (т.е. на №конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119,

120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141,

142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163,

164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (т.е. на карбоксильном конце белка) и любые их комбинации (8ЕЦ Ш N0: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕЦ Ш N0: 2 либо соответствующие аминокислоты в других полипептидах ЬС-С8Е) отдельно замещены не кодируемой в природе аминокислотой следующей структуры:

Последовательности, использованные для сайт-специфического встраивания п-ацетилфенилаланина в ЬС-С8Е, представляют собой 8ЕЦ Ш N0: 3 или 4 (ЬС-С8Е), и 8ЕЦ Ш N0: 23 или 5 (тиЙЯХА, М. _)аппаксйл тΐЯNΛ^Туг _сυл), и 8ЕО ГО N0: 22, 24, 17, 18, 19 (ТугЯ8 Ь№11, 5 или 6), раскрытые в примере 2 (см. выше).

После модификации вариант полипептида ЬС-С8Е, включающий карбонилсодержащую аминокислоту, подвергают взаимодействию с производным аминооксисодержащего ПЭГ формы: Я-ПЭГ(К)-О(СН₂)_п-0-ЫН₂, где Я представляет собой метил, п равно 3 и ММ для N составляет приблизительно 5000. Очищенный Ь-СС8Е, содержащий п-ацетилфенилаланин, растворенный до 10 мг/мл в 25 мМ МЕ8 (81дта СНетюа1, 8!. Ьошк, МО) рН 6,0, 25 мМ Нерек (81дта СНет1са1, 8!. Ьошк, М0) рН 7,0, или в 10 мМ ацетата натрия (81дта СНетюа1, 8!. Ьошк, М0) рН 4,5, подвергают взаимодействию с 10-100-кратным избытком аминооксисодержащего ПЭГ и затем перемешивают в течение 10-16 ч при комнатной температуре (1епскк, V. I. Ат. СНет. 8ос., 1959, 81, р. 475). Затем ПЭГ-Ь-СС8Е разбавляют в соответствующем буфере для немедленной очистки и анализа.

Пример 4. Конъюгирование с ПЭГ, состоящим из группы гидроксиламина, связанного с ПЭГ амидной связью.

Реагент ПЭГ следующей структуры присоединяют к кетонсодержащей не кодируемой в природе аминокислоте, используя процедуру, раскрытую в примере 3:

В-ПЭГ (Ν) -О- (СН₂)₂-КН-С (О) (СН₂) η-Ο-ΝΗ₂, где Я=метил;

п=4 и

ММ для N составляет приблизительно 20000.

Условия реакции, очистки и анализа такие же, как в примере 3.

- 120 019968

Пример 5. Введение двух различных не кодируемых в природе аминокислот в полипептиды ЬСС8Р.

Этот пример демонстрирует способ создания полипептида ЬС-С8Р, который встраивает не кодируемые в природе аминокислоты, включающие кетонную функциональность, в два положения среди следующих остатков: перед положением 1 (т.е. на Ν-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,

105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,126,

127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147,148,

149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169,170,

171, 172, 173, 174, 175 (т.е. на карбоксильном конце белка) и любые их комбинации (8ЕО ГО NО: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NО: 2 либо соответствующие аминокислоты в других полипептидах ЬС-С8Р). Полипептид ЬС-С8Р получают по способу примеров 1 и 2, за исключением того, что селекторный кодон встроен в два различных сайта в нуклеиновой кислоте.

Пример 6. Конъюгирование полипептида ЬС-С8Р гидразидсодержащим ПЭГ и последующее ш кйи восстановление.

Полипептид ЬС-С8Р, включающий карбонилсодержащую аминокислоту, получают по способу примеров 2 и 3. Будучи модифицирован, гидразидсодержащий ПЭГ следующей структуры конъюгируют с полипептидом ЬС-С8Р:

где Я=метил;

п=2;

ММ для Ν=10000 и

X представляет собой карбонильную (С=О) группу.

Очищенный Ь-СС8Р, содержащий п-ацетилфенилаланин, растворяют до концентрации 0,1-10 мг/мл в 25 мМ МЕ8 (81дта Сйетюа1, 8ί. Ьошк, МО) рН 6,0, 25 мМ Нерек (81дта Сйетюа1, 8ί. Ьошк, МО) рН 7,0, или в 10 мМ ацетата натрия (81дта Сйетюа1, 8ί. Ьошк, МО) рН 4,5, подвергают взаимодействию с 1100-кратным избытком гидразидсодержащего ПЭГ и соответствующий гидразон восстанавливают ш к1!и, добавляя исходный 1 М №С'^ВН₃ (81дта Сйетка1, 8ί. Ьошк, МО), растворенный в Н₂О до конечной концентрации 10-50 мМ. Реакции ведут в темноте при температуре от 4°С до комнатной температуры в течение 18-24 ч. Реакции останавливают, добавляя 1 М Тпк (81дта Сйетка1, 8ί. Ьошк, МО) при около рН 7,6 до конечной Тпк концентрации 50 мМ, или разбавляют в соответствующем буфере для немедленной очистки.

Пример 7. Введение алкилсодержащей аминокислоты в полипептид ЬС-С8Р и получение производных с использованием т-ПЭГ-азида.

Следующие остатки, перед положением 1 (т.е. на Ν-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,

126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147,

148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169,

170, 171, 172, 173, 174, 175 (т.е. на карбоксильном конце белка) и любые их комбинации (8ЕО ГО NО: 1 или соответствующие аминокислоты в 8ЕО ГО NО: 2 либо соответствующие аминокислоты в других полипептид ЬС-С8Р), каждый замещают следующей не кодируемой в природе аминокислотой:

Последовательности, использованные для сайт-специфического встраивания п-пропаргил-тирозина в ЬС-С8Р, представляют собой 8ЕО ГО NО: 3 или 4, 8ЕО ГО NО: 5 (ти!ίЯNΑ, М.|аппаксйй т®ИА^Туг _СиА) и 10, 11, 12, раскрытые выше в примере 2. Полипептид ЬС-С8Р, содержащий пропаргил-тирозин, экспрессируют в Е. со11 и очищают, используя условия, раскрытые в примере 3.

Очищенный ЬС-С8Р, содержащий пропаргил-тирозин, растворяют до концентрации 0,1-10 мг/мл в

РВ буфере (100 мМ натрийфосфата, 0,15 М №С1, рН 8) и к реакционной смеси добавляют 10-1000кратный избыток азидсодержащего ПЭГ. Затем к реакционной смеси добавляют каталитическое количество Си8О₄ и стружку Си. После инкубирования смеси (включая, без ограничения, около 4 ч при комнатной температуре или при 37°С либо в течение ночи при 4°С) добавляют Н₂О и полученную смесь фильтруют через диализную мембрану. Полученные образцы можно анализировать в отношении присоединения, включая, без ограничения, процедуры, раскрытые в примере 3. В этом примере ПЭГ имеет

- 121 019968 следующую структуру:

К-ПЭГ (Ν)-О-(СН₂) ί-ΝΗ-С (О) (СН₂) η~Ν₃, где В представляет собой метил; п= 4 и

ММ для Ν составляет 10000.

Пример 8. Замещение крупной, гидрофобной аминокислоты в полипептиде ЬС-СЗР пропаргил тирозином.

Рйе, Тгр или Туг остаток, присутствующий в одном из следующих участков ЬС-СЗР: перед положением 1 (т.е. на Ν-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,

57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,

87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,

113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,

135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156,

157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (т.е. на карбоксильном конце белка) и любой их комбинации (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующие аминокислоты в δΕρ ГО Ν0: 2 либо соответствующие аминокислоты в других полипептидах ЬС-СЗР), замещают следующей не кодируемой в природе аминокислотой, как раскрыто в примере 7:

После модификации ПЭГ присоединяют к варианту полипептида ЬС-СЗР, включающему алкинсо держащую аминокислоту.

ПЭГ имеет следующую структуру:

и осуществляют присоединение по способу примера 7. В результате получают вариант полипептида ЬС-СЗР, включающий не кодируемую в природе аминокислоту, которая является приблизительно изостерической в отношении одной из природных, крупных гидрофобных аминокислот и которая модифицирована производным ПЭГ в различных сайтах внутри полипептида.

Пример 9. Создание полипептидных ЬС-СЗР гомодимеров, гетеродимеров, гомомультимеров или гетеромультимеров, разделенных одним или более из ПЭГ линкеров.

Алкинсодержащий вариант полипептида ЬС-СЗР, полученный в примере 7, подвергают взаимодействию с бифункциональным производным ПЭГ формулы

Ν₃- (СН₂) „-С (О) -ЫН- (СН₂) 2-О-ПЭГ (Ν) -О- (СН₂) ₂-ЫН-С(О) - (СН₂) _П-Ы₂ где п=4 и

ПЭГ имеет среднюю ММ приблизительно 5000, для создания соответствующего полипептидного ЬС-СЗР гомодимера, в котором две ЬС-СЗР молекулы физически разделены ПЭГ. Аналогичным образом полипептид ЬС-СЗР можно присоединить к одному или более из других полипептидов с образованием гетеродимеров, гомомультимеров или гетеро мультимеров.

Присоединение, очистку и анализ осуществляют по способу примеров 7 и 3.

Пример 10. Присоединение сахаридной молекулы к полипептиду ЬС-СЗР.

Один из следующих приведенных далее остатков замещен не кодируемой в природе аминокислотой: перед положением 1 (т.е. на Ν-конце), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,

52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,

82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,

109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129,130,

131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151,152,

153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173,174,

175 (т.е. на карбоксильном конце белка) и любые их комбинации (δΕρ ГО Ν0: 1 или соответствующие аминокислоты в δΕρ ГО Ν0: 2 либо соответствующие аминокислоты в других полипептидах ЬС-СЗР), как раскрыто в примере 3.

После модификации вариант полипептида ЬС-СЗР, включающий карбонилсодержащую аминокислоту, подвергают взаимодействию с β-связанным аминооксианалогом Ν-ацетилгюкозамина (СкЫАс).

- 122 019968

Вариант полипептида ЬС-С8Е (10 мг/мл) и аминооксисахарид (21 мМ) смешивают в водном 100 мМ натрийацетатном буфере (рН 5,5) и инкубируют при 37°С в течение 7-26 ч. Второй сахарид присоединяют к первому ферментативно, инкубируя конъюгированный с сахаридом полипептид ЬС-С8Е (5 мг/мл) с ИОР-галактозой (16 мМ) и в-1,4-галактозилтрансферазой (0,4 ед./мл) в 150 мМ НЕРЕ8 буфере (рН 7,4) в течение 48 ч при комнатной температуре (8сЬаиЬасЬег еГ а1., 1. Вю1. СЬет., 1970, 245, 5057-5061).

Пример 11. Создание антагониста ПЭГилированного полипептида ЬС-С8Е.

Остатки, включая, без ограничения, те, которые участвуют в связывании рецептора ЬС-С8Е, замещают следующей не кодируемой в природе аминокислотой, как раскрыто в примере 3.

После модификации вариант полипептида ЬС-С8Е, включающий карбонилсодержащую аминокислоту, подвергают взаимодействию с аминооксисодержащим производным ПЭГ формулы

где В представляет собой метил;

и=4 и

ММ для Ν составляет 20000, для создания антагониста полипептида Ь-СС8Е, включающего не кодируемую в природе аминокислоту, которая модифицирована производным ПЭГ по одному сайту внутри полипептида. Присоединение, очистку и анализ осуществляют по способу примера 3.

Пример 12. Создание гомодимера, гетеродимера, гомомультимера или гетеромультимера полипептида ЬС-С8Е, в которых ЬС-С8Е молекулы связаны непосредственно.

Вариант полипептида ЬС-С8Е, включающий алкинсодержащую аминокислоту, можно непосредственно присоединить к другим вариантам полипептида ЬС-С8Е, включающего азидосодержащую аминокислоту. Аналогичным образом полипептид ЬС-С8Е можно присоединить к одному или более из других полипептидов с образованием гетеродимеров, гомомультимеров или гетеромультимеров. Присоединение, очистку и анализ осуществляют по способу примеров 3, 6 и 7.

ПЭГ-ОН + Вг-(СН₂)„-СВСВ'^ПЭГ-О-(СН₂) п-С^СК'

Пример 13. ^{А в}

Полиалкиленгликоль (Р-ОН) подвергают взаимодействию с алкилгалогенидом (А) с образованием простого эфира (В). В указанных соединениях и представляет собой целое число от одного до девяти и В' может быть неразветвленной или разветвленной цепью или насыщенной или ненасыщеной С1-С20 алкильной или гетероалкильной группой. В' может также быть С3-С7 насыщенной или ненасыщенной циклической алкильной или циклической гетероалкильной, замещенной или незамещенной арильной или гетероарильной группой или замещенной или незамещенной алкарильной (где алкил может быть С1-С20 насыщенным или ненасыщенным алкилом) или гетероалкарильной группой. Обычно ПЭГ-ОН представляет собой полиэтиленгликоль(ПЭГ) или монометоксиполиэтиленгликоль (тПЭГ) с молекулярной массой от 800 до 40000 Да.

Пр_имер 14. и1ПЭГ-ОН+Вг-СН₂-С=СН-тПЭГ-О-СН₂С=СН т-ПЭГ-ОН с молекулярной массой 20000 Да (тПЭГ-ОН 20 кДа; 2,0 г, 0,1 ммоль, 8ииЬю) обрабатывают МаН (12 мг, 0,5 ммоль) в ТНЕ (35 мл). Раствор пропаргилбромида приготавливают как 80 вес.% раствор в ксилоле (0,56 мл, 5 ммоль, 50 экв., Α16πΛ), к раствору добавляют каталитическое количество К! и полученную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 2 ч. Затем добавляют воду (1 мл) и растворитель удаляют в вакууме. К остатку добавляют СН2С12 (25 мл) и органический слой выделяют, сушат над безводным №ь8О₄ и объем уменьшают приблизительно до 2 мл. Полученный СН₂С1₂ раствор добавляют к диэтиловому эфиру (150 мл) по каплям. Образовавшийся осадок собирают, промывают несколькими порциями холодного диэтилового эфира и сушат, получая пропаргил-О-ПЭГ.

Пр_имер 15. тпэг-он+вг- (СН₂) _З~с=сн .тпэг-О- (сн₂) ₃-с=сн т-ПЭГ-ОН с молекулярной массой 20000 Да (т-ПЭГ-ОН 20 кДа; 2,0 г, 0,1 ммоль, 8ииЬю) обрабатывают МаН (12 мг, 0,5 ммоль) в ТГФ (35 мл). К смеси добавляют 50 экв. 5-бром-1-пентина (0,53 мл, 5 ммоль, Α16πΟι) и каталитическое количество КЕ Полученную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 16 ч. Затем добавляют воду (1 мл) и растворитель удаляют в вакууме. К остатку добавляют СН₂С1₂ (25 мл) и органический слой выделяют, сушат над безводным №ь8О₄ и объем уменьшают до приблизительно 2 мл. Полученный СН2С12 раствор добавляют к диэтиловому эфиру (150 мл) по каплям. Образовавшийся осадок собирают, промывают несколькими порциями холодного диэтилового эфира и сушат, получая соответствующий алкин. В аналогичной реакции можно использовать 5хлор-1-пентин.

- 123 019968

Пример 16. Получение П1-ПЭГ-О-СН2-С₍Н |О-СН₂С.=СН.

(1) м-НОСН₂С₆Н₄ОН+КаОН+Вг-СН₂-С^СН^М-НОСН₂С₆Н₄0-СН₂-СеСН (2) м-НОСН_гС₆Н₄0-СН2-С=СН+М5С1+Н |Εί| ₃^М₃0СНгС₆Н₄О-СНг-С=СН (3) м-МзОСН₂С_еН₄0СН₂-С=СН+Ь1Вг-.м~Вг-СН₂С₆Н₄0-СН₂-С=СН (4) тПЭГ-ОН+м-Вг-СН₂С₆Н₄0-СН_г-С=СН-тПЭГ-0-СНг-С₆Н₄0-СН_г-С=СН

К раствору 3-гидроксибензилового спирта (2,4 г, 20 ммоль) в ТГФ (50 мл) и воде (2,5 мл) вначале добавляют порошок гидроксида натрия (1,5 г, 37,5 ммоль) и затем раствор пропаргилбромида, растворенного как 80 вес.% раствор в ксилоле (3,36 мл, 30 ммоль). Реакционную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 6 ч. К смеси добавляют 10% лимонную кислоту (2,5 мл) и растворитель удаляют в вакууме. Остаток экстрагируют этилацетатом (3x15 мл) и объединенные органические слои промывают насыщенным раствором №1С1 (10 мл), сушат над Мд§О₄ и концентрируют до получения 3-пропаргилоксибензилового спирта.

Метансульфонилхлорид (2,5 г, 15,7 ммоль) и триэтиламин (2,8 мл, 20 ммоль) добавляют к раствору соединения 3 (2,0 г, 11,0 ммоль) в СН₂С1₂ при 0°С и реакционную смесь помещают в холодильник на 16 ч. В результате обычной обработки получают мезилат в виде масла желтого цвета. Это масло (2,4 г, 9,2 ммоль) растворяют в ТГФ (20 мл) и добавляют Ь1Вг (2,0 г, 23,0 ммоль). Реакционную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 1 ч и затем охлаждают до комнатной температуры. К полученной смеси добавляют воду (2,5 мл) и растворитель удаляют в вакууме. Остаток экстрагируют этилацетатом (3x15 мл) и объединенные органические слои промывают насыщенным раствором №1С1 (10 мл), сушат над безводным №₂8О₄ и концентрируют до получения целевого бромида.

ш-ПЭГ-ОН 20 кДа (1,0 г, 0,05 ммоль, 8ипЬю) растворяют в ТГФ (20 мл) и полученный раствор охлаждают на бане со льдом. ΝηΗ (6 мг, 0,25 ммоль) добавляют при интенсивном перемешивании в течение нескольких минут с последующим добавлением полученного выше бромида (2,55 г, 11,4 ммоль) и каталитического количества ΚΙ. Охлаждающую баню удаляют и полученную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 12 ч. К смеси добавляют воду (1/0 мл) и растворитель удаляют в вакууме. К остатку добавляют СН₂С1₂ (25 мл) и органический слой выделяют, сушат над безводным Νη₂8Ο | и объем уменьшают до примерно 2 мл. Добавление по каплям к эфирному раствору (150 мл) вызывает образование осадка белого цвета, который собирают, получая производное ПЭГ.

Пример 17. тПЭГ-ЫН₂+Х-С (О) - (СН₂) „-С^СК'-тПЭГ-ИН-С (О) -сн₂) _п-с=св

Терминал алкинсодержащих полимеров поли(этиленгликоля) можно также получить, присоединяя полимер поли(этиленгликоля), содержащий концевую функциональную группу, к реакционноспособной молекуле, содержащей алкиновую функциональность, как представлено выше, и принимает значения от 1 до 10, К' может быть Н или небольшой алкильной группой от С1 до С4.

Пример 18. Получение т-ПЭГ-1\1Н-С(О)-(СН₂)₂-С=СН.

(1) НО₂С- (СН₂) ₂-С=СН+ИН8+ОСС-.ЫНЗО-С (О) - (СН₂) ₂-с=сн (2 ) тПЭГ-ЫН₂+ИНЗО-С (О) - (СН₂) ₂-С=СН-тПЭГ-ЫН-С (О) - (СН₂) ₂-С-СН

4-Пентиновую кислоту (2,943 г, 3,0 ммоль) растворяют в СН₂С1₂ (25 мл). Добавляют Νгидроксисукцинимид (3,80 г, 3,3 ммоль) и ОСС (4,66 г, 3,0 ммоль) и полученный раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Полученный сырой сложный эфир ΝΗ8 7 используют в следующей реакции без дополнительной очистки.

πι-Π3Γ-ΝΗ₂ с молекулярной массой 5000 Да (ιη-Π3Γ-ΝΗ_;. 1 г, 8ипЬю) растворяют в ТГФ (50 мл) и полученную смесь охлаждают до 4°С. ΝΗ8 эфир 7 (400 мг, 0,4 ммоль) добавляют порционно при интенсивном перемешивании. Смесь оставляют при перемешивании на 3 ч, при этом происходит нагревание до комнатной температуры. Затем добавляют воду (2 мл) и растворитель удаляют в вакууме. К остатку добавляют СН₂С1₂ (50 мл) и органический слой выделяют, сушат над безводным №₂8О₄ и объем уменьшают до приблизительно 2 мл. Этот СН₂С1₂ раствор добавляют к простому эфиру (150 мл) по каплям. Полученный осадок собирают и сушат в вакууме.

Пример 19. Получение метансульфоната или мезилата поли(этиленгликоля).

В этом примере раскрыто получение метансульфонилового эфира поли(этиленгликоля), который можно также называть как метансульфонат или мезилат поли(этиленгликоля). Соответствующие тозилат и галогениды можно получить аналогичными способами.

тПЭГ-ОН+СНз5О2С1+И (ΕΊ:) ₂ >тГТЭГ-О-ЗО₂СН-_ч..тПЗГ-П₂ ш-ПЭГ-ОН (ММ=3400, 25 г, 10 ммоль) в 150 мл толуола азеотропно перегоняют в течение 2 ч в атмосфере азота и полученный раствор охлаждают до комнатной температуры. 40 мл сухого СН₂С1₂ и 2,1 мл сухого триэтиламина (15 ммоль) добавляют к раствору. Раствор охлаждают на бане со льдом и 1,2 мл перегнанного метансульфонилхлорида (15 ммоль) добавляют по каплям. Полученный раствор перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи и реакцию гасят, добавляя 2 мл абсолютного этанола. Смесь выпаривают в вакууме для удаления растворителей, преимущественно других, нежели толуол, фильтруют, снова концентрируют в вакууме и затем осаждают в 100 мл диэтилового эфира. Полученный фильтрат промывают несколькими порциями холодного диэтилового эфира и сушат в вакууме до получения мезилата.

-124 019968

Мезилат (20 г, 8 ммоль) растворяют в 75 мл ТГФ и полученный раствор охлаждают до 4°С. К охлажденному раствору добавляют азид натрия (1,56 г, 24 ммоль). Реакционную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 2 ч. Затем растворители выпаривают и остаток разбавляют СН₂С1₂ (50 мл). Органические фракции промывают раствором №С1 и сушат над безводным М§8О₄. Объем уменьшают до 20 мл и продукт осаждают, добавляя к 150 мл холодного сухого эфира.

Пример 20. Получение т-ПЭГ-О-СН^С^-^.

(1) Из“С_бН4-СО2Н^Нз-С₅Н4СН2ОН (2) И₃-С_бН₄СН₂ОН-В1—СН₂“С₆Н₄-Мз (3) тПЭГ-ОН+Вг-СН2“С₆Н4-И₃--тПЭГ-О-СН₂-С₆Н_!1-Нз

4-Азидобензиловый спирт можно получить, используя способ, раскрытый в патенте США 5998595, который включен в описание посредством ссылки. Метансульфонилхлорид (2,5 г, 15,7 ммоль) и триэтиламин (2,8 мл, 20 ммоль) добавляют к раствору 4-азидобензилового спирта (1,75 г, 11,0 ммоль) в СН2С12 при 0°С и реакционную смесь помещают в холодильник на 16 ч. В результате обычной обработки получают мезилат в виде масла бледно желтого цвета. Это масло (9,2 ммоль) растворяют в ТГФ (20 мл) и добавляют ЫВг (2,0 г, 23,0 ммоль). Реакционную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 1 ч и затем охлаждают до комнатной температуры. К полученной смеси добавляют воду (2,5 мл) и растворитель удаляют в вакууме. Остаток экстрагируют этилацетатом (3x15 мл) и объединенные органические слои промывают насыщенным раствором №С1 (10 мл), сушат над безводным Nа₂8О₄ и концентрируют до получения целевого бромида.

т-ПЭГ-ОН 20 кДа (2,0 г, 0,1 ммоль, 8ипЫо) обрабатывают \а11 (12 мг, 0,5 ммоль) в ТГФ (35 мл) и к смеси добавляют бромид (3,32 г, 15 ммоль) вместе с каталитическим количеством КЪ Полученную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 12 ч. К смеси добавляют воду (1,0 мл) и растворитель удаляют в вакууме. К остатку добавляют СН2С12 (25 мл) и органический слой выделяют, сушат над безводным Nа₂8О₄ и объем уменьшают до приблизительно 2 мл. По каплям добавляют эфирный раствор (150 мл), что вызывает образование осадка, который собирают, получая т-ПЭГ-О-СН2С6Н4-^.

НН₂-ПЭГ-О-СН₂СН₂СО₂Н+Кз-СН₂СН₂СО₂-ЫНЗ-+Ыз-СН₂СН₂-С (О) ΝΗ-ПЭГ-ОПример 21. сн₂си₂со₂и

NН₂-ПЭГ-О-СН₂СН₂СО₂Н (ММ 3400, 2,0 г) растворяют в насыщенном водном растворе №НСО₃(10 мл) и полученный раствор охлаждают до 0°С. 3-Азидо-1-N-гидроксисукцинимидопропионат (5 экв.) добавляют при интенсивном перемешивании. Через 3 ч добавляют 20 мл Н₂О и смесь перемешивают еще дополнительные 45 мин при комнатной температуре. Величину рН доводят до 3, используя 0,5н. Н₂8О₄, и добавляют №С1 до концентрации приблизительно 15 вес.%. Реакционную смесь экстрагируют СН₂С1₂(100 млх3), сушат над Nа₂8О₄ и концентрируют. После осаждения холодным диэтиловым эфиром продукт собирают фильтрованием и сушат в вакууме, получая омега-карбоксиазидное производное ПЭГ.

Пр_имер 22. тПЭГ-ОМз+НС=СЬ1 >тПЭГ-О-СН₂-СН₂-С=С-Н

К раствору ацетилида лития (4 экв.), полученному известным специалистам способом, охлажденному до -78°С в ТГФ, по каплям добавляют раствор т-ПЭГ-ОМк, растворенного в ТГФ при интенсивном перемешивании. Через 3 ч реакционной смеси дают нагреться до комнатной температуры и гасят, добавляя 1 мл бутанола. Затем добавляют 20 мл Н₂О и полученную смесь перемешивают дополнительно 45 мин при комнатной температуре. Величину рН доводят до 3, используя 0,5н. Н₂8О₄, и №С1 добавляют до концентрации приблизительно 15 вес.%. Реакционную смесь экстрагируют СН₂С1₂ (100 млх3), сушат над Nа₂8О₄ и концентрируют. После осаждение холодным диэтиловым эфиром продукт собирают фильтрованием и сушат в вакууме, получая 1-(бут-3-инилокси)метоксиполиэтиленгликоль (т-ПЭГ).

Пример 23. Встраивание азид- и ацетиленсодержащих аминокислот.

Азид- и ацетиленсодержащие аминокислоты можно сайт-селективно встроить в белки, используя способы, раскрытые Ь. Уапд, е! а1. (2001), 8с1епсе, 292: 498-500, 1.У. СЫп е! а1., 8с1епсе, 301:9 64-7 (2003)), 1.У. СЫп е! а1. (2002), 1оигпа1 о! !йе Атепсап Сйет1са1 8ос1е!у, 124: 9026-9027; 1.У. СЫп, & Р.С. 8сйи1!/ (2002), Сйет Вю Сйет., 3(11): 1135-1137; ЙУ. СЫп, е! а1. (2002), РNА8 Ипйеб 8!а!ек о! Атепса, 99: 11020-11024 и й. Уапд, & Р.С. 8сйи1!/ (2002), Сйет. Сотт., 1: 1-11. После того как аминокислоты встроены, реакцию циклоприсоединения осуществляют, используя 0,01 мМ белка в фосфатном буфере (РВ), рН 8, в присутствии 2 мМ производного ПЭГ, 1 мМ Си8О₄, и ~1 мг стружек Си в течение 4 ч при 37°С.

Пример 24. Синтез п-ацетил-П,й-фенилаланина (рАЕ) и м-ПЭГ-гидроксиламиновых производных.

Рацемические рАЕ синтезируют, используя процедуру, описанную ранее Ζйаη§, Ζ., 8тйй, В.А.С., Уапд, й., Вгоск, А., Сйо, С. & 8сйи1!/, Р.С., Вюсйет1к!гу (2003) 42, 6735-6746.

Для синтеза м-ПЭГ-гидроксиламинового производного осуществляют следующую процедуру. К раствору (N-!-Вοс-аминоокси)уксусной кислоты (0,382 г, 2,0 ммоль) и 1,3-диизопропилкарбодиимида (0,16 мл, 1,0 ммоль) в дихлорметане (БСМ, 70 мл), который перемешивают при комнатной температуре (ЯТ) в течение 1 ч, добавляют метокси-полиэтиленгликольамин (м-ПЭГ^Н₂, 7,5 г, 0,25 ммоль, М!. 30К

- 125 019968 от Β^οVесΐ^а) и диизопропилэтиламин (0,1 мл, 0,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 48 ч и затем концентрируют до около 100 мл. Полученную смесь добавляют по каплям к холодному эфиру (800 мл). Ч-Вос-защищенный продукт выпадает в осадок и его собирают фильтрованием, промывают эфиром 3x100 мл. Очищают далее, снова растворяя в БСМ (100 мл) и осаждая в эфире (800 мл) дважды. Полученный продукт сушат в вакууме, получая 7,2 г (96%), идентичность подтверждена по данным ЯМР и нингидринового теста.

Удаление защитных групп у полученного выше Вос-защищенного продукта (7,0 г) осуществляют в 50% ТЕА/БСМ (40 мл) при 0°С в течение 1 ч и затем при комнатной температуре в течение 1,5 ч. После удаления большей части ТЕА в вакууме ТЕА соль производного гидроксиламина превращают в НС1 соль, добавляя к остатку 4н. НС1 в диоксане (1 мл). Осадок растворяют в БСМ (50 мл) и снова осаждают в эфире (800 мл). Конечный продукт (6,8 г, 97%) собирают фильтрованием, промывают эфиром 3x100 мл, сушат в вакууме, хранят в атмосфере азота. Другие гидроксиламиновые производные ПЭГ (5К, 20К) синтезируют тем же способом.

Пример 25. Ш уЧЧго и Чп уЧуо активность ПЭГилированных ЬС-С8Е.

ПЭГ-ЬС-С8Е, немодифицированные ЬС-С8Е и буферный раствор вводят мышам или крысам. Результаты демонстрируют превосходную активность и пролонгированное время полужизни ПЭГилированных ЬС-С8Е по настоящему изобретению по сравнению с немодифицированными ЬС-С8Е, о чем свидетельствует значительное увеличение количества нейтрофилов и сдвиг количества лейкоцитов в сторону максимума при одинаковых вводимых мышам дозах.

Фармакокинетические анализы.

Полипептид ЬС-С8Е по настоящему изобретению вводят мышам внутривенно или подкожно. У животных отбирают кровь до введения дозы и после в определенные моменты времени. Собирают плазму из каждого из образцов и анализируют, используя радиоиммуноанализ. Элиминирование времени полужизни можно рассчитать и сравнить между полипептидами ЬС-С8Е, включающими не кодируемую в природе аминокислоту и дикого типа ЬС-С8Е или различными формами полипептидов ЬС-С8Е по настоящему изобретению. Аналогично, полипептиды ЬС-С8Е по настоящему изобретению можно вводить супото1диз обезьянам. У животных отбирают кровь до введения дозы и после в определенные моменты времени. Собирают плазму из каждого из образцов и анализируют, используя радиоиммуноанализ.

Полипептиды по настоящему изобретению можно вводить животным, используемым в моделях заболевания. Исследования на животных, которые можно осуществить, включают заражение скота РазЧеигейа йето1уЧЧса, бактериальное заражение скота маститом молочной железы (К1еЬзЧеЦа пневмония). Другие исследования, которые можно осуществить, оценивают контроль, заболеваемость и длительность бычьих респираторных заболеваний или профилактику со1ЧГогт тазЧЧЧЧз. Методы оценки здоровья животных, производительности молока, количества нейтрофилов и других параметров хорошо известны специалистам в данной области. Другие модели, которые можно использовать для оценки полипептидов ЬС-С8Е по настоящему изобретению, включают, без ограничения, животные модели инфицирования или экспонирования инфекции, такие как модель на хомячках пневмонии Рзеиботопаз аегидЧпоза, модель на крысах пиелонефрита СапбЧба а1ЬЧсапз, модель на новорожденных жеребятах и модели на растущих поросятах. Некоторые из указанных моделей раскрыты в патентах США № 5849883 и АО 89/10932. Такие модели, как указанные выше, хорошо известны специалистам в данной области.

³Н-тимидиновый анализ.

³Н-тимидиновый анализ осуществляют, используя стандартные методы. Костный мозг получают из умерщвленных самок мышей штамма Ва1Ь С или из других животных. Клетки костного мозга коротко суспендируют, центрифугируют и снова суспендируют в среде для роста. В каждую лунку 96-дуночного микротитровального планшета помещают аликвоту в 160 мкл, содержащую приблизительно 10000 клеток. Образцы очищенных аналогов С-С8Е (как получено выше) добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 68 ч. В лунки добавляют меченный тритием тимидин и оставляют в инкубаторе еще на пять дополнительных часов. После 5 ч инкубирования клетки собирают, фильтруют и тщательно промывают. Фильтры добавляют в ампулу, содержащую сцинтилляционную жидкость. Подсчитывают бета-эмиссию (сцинтилляционный счетчик ЬКВ ВеЧа р1аЧе). Стандарты и аналоги анализируют трижды и образцы, результаты для которых попадают выше или ниже стандартной кривой, снова анализируют с соответствующими разбавлениями. Результаты представляют как среднее из трех аналогичных результатов относительно стандартных результатов для неизмененных ЬС-С8Е.

Индуцирование пролиферации клеток костного мозга человека анализируют, используя увеличение встраивания ³Н-тимидина. Клетки человеческого костного мозга от здоровых доноров разделяют по плотности, используя ЕЧсо11-Нурас|ие (1,077 г/мл, РйагтасЧа), и клетки низкой плотности суспендируют в среде Искова (СГВСО), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и глутамин пенициллинсрептомицин. Затем 2х10⁴ клеток человеческого костного мозга инкубируют или в контрольной среде или с рекомбинантным, полученным из Е. Со1Ч, ЬС-С8Е материалом в 96-ячеечных плоскодонных планшетах при 37°С в 5% СО₂ на воздухе в течение 2 дней. Образцы анализируют в двойном экземпляре и концентрации изменяют в 10000-кратном интервале. Культуры бомбардируют в течение 4 ч, используя

- 126 019968

0,5 мкКюри/лунку ³Н-тимидина (№те Епд1апб Νπ^ιγ, Вок!оп, Макк.). Захват ³Н-тимидин определяют по способу \епи1а, е! а1., В1ооб, 61, 781 (1983).

Индуцирование дифференцирования УЕШ-3В Ό⁺.

Способность полипептидов ЬО-С8Р по настоящему изобретению индуцировать дифференцирование мышиной клеточной линии миеломоноцитной лейкемии УЕНИ3В Ό⁺ оценивают в среде полутвердого агара, как раскрыто у Ме!са1£, Ш!. ί. Сапсег, 25, 225 (1980). Продукт рекомбинантных ЬО-С8Р и контрольные среды инкубируют в количестве около 60 УЕНИ3В Ό⁺ клеток/лунку при 37°С в 5% СО₂ на воздухе в течение 7 дней. Образцы инкубируют в 24-луночных плоских планшетах, причем концентрации меняют в 2000-кратном интервале. Колонии классифицируют как недифференцированные, частично недифференцированные или полностью дифференцированные и количество клеток в колониях подсчитывают, используя микроскоп.

СРИ-ОМ, ВРИ-Е и СРИ-ОЕММ анализы.

Было обнаружено, что природные изоляты человеческих О-С8Р и кО-С8Р вызывают пролиферацию и дифференциацию человеческих клеток костного мозга. Указанные активности измеряют, используя СРИ-ОМ [Вгохтеуег, е! а1., Ехр. Нета!о1., 5, 87, (1971)], ВРИ-Е и СРИ-ОЕММ анализы [Ьи, е! а1., В1ооб, 61, 250 (1983)], используя низкой плотности, не прилипшие клетки костного мозга от здоровых добровольцев. Можно использовать клетки из других источников. Осуществляют сравнение СРИ-ОМ, ВРИ-Е и СРИ-ОЕММ биологических активностей, используя или 500 единиц О-С8Р или полипептидов ЬО-С8Р по настоящему изобретению.

Анализы колоний осуществляют, используя низкой плотности, не прилипшие клетки костного мозга. Человеческие клетки костного мозга разделяют по плотности, используя Нсо11-Нурас.|ие (плотность, 1,077 г/см³; Ркагтас1а). Затем клетки низкой плотности снова суспендируют в среде Искова, модифицированной средой Дульбекко, содержащей фетальную телячью сыворотку, и помещают для прилипания на чашки Петри (Ра1соп) (№ 3003, Вес!оп Июкткоп, СоскеукуШе, Мб.) на 1,5 ч при 37°С.

Контрольная среда состоит из среды Искова, модифицированной средой Дульбекко плюс 10% РС8, 0,2 мМ гемина и 1 ед. рекомбинантного эритропоэтина. Для СРИ-ОМ анализа клетки-мишени высевают в количестве 1х 10⁵ в 1 мл 0,3% агарную культуральную среду, которая дополнена средой МсСоу 5А и 10% термоинактивированной фетальной телячьей сывороткой. Культуры подсчитывают по колониям (более чем 40 клеток в агрегате) и морфологию оценивают на 7 день культивирования. Количество колоний представлено как среднее ± 8ЕМ по данным для четырех экземпляров планшетов.

Для ВРИ-Е и СРИ-ОЕММ анализов клетки (1х10⁵) добавляют к 1 мл смеси среды Искова, модифицированной средой Дульбекко (О1Ьсо), 0,8% метилцеллюлозы, 30% фетальной телячьей сыворотки, 0,05 нМ 2-меркаптоэтанола, 0,2 мМ гемина и 1 ед. рекомбинантного эритропоэтина. Чашки инкубируют во влажной атмосфере с 5% СО2 и 5% О2. Низкое давление кислорода обеспечивают, используя кислородный редуктор от Яеттд Вютк1гитеп!к (8угасике, Ν.Υ.). Колонии подсчитывают после 14 дней инкубирования. Количество колоний определяют как среднее ± 8ЕМ с учетом двух экземпляров планшетов.

Ожидается, что все колонии, образовавшиеся в СРИ-ОМ анализе, должны быть хлорацетатэстеразапозитивными и в отношении неспецифической эстеразы (альфа-нафтилацетатэстераза) негативными, что соответствует колониям гранулоцитарного типа. Ожидается, что природные О-С8Р и полипептиды ЬОС8Р по настоящему изобретению должны иметь специфическую активность приблизительно 1х 10 ед/мг чистого белка при анализе серийных разбавлений в СРИ-ОМ анализе. Важно отметить, что ЬО-С8Р по настоящему изобретению могут быть очень чистыми и не содержать других потенциальных факторов роста млекопитающих за счет их продуцирования в Е. со11. Так, ЬО-С8Р способны поддерживать смешанное колониеобразование (СРИ-ОЕММ) и ВРИ-Е, будучи добавлены в присутствии рекомбинантного эритропоэтина.

Измерения т у1уо времени полужизни конъюгированных и неконъюгированных ЬО-С8Р и их вариантов. Используют самцов крыс штамма Ма1е 8ргадие Эа\\'1еу (возраст около 7 недель). В день введения измеряют вес каждого животного. 100 мкг/кг веса тела каждого неконъюгированных и конъюгированных образцов ЬО-С8Р вводят внутривенно в хвостовые вены трех крыс. Через 1, 30 мин, 1, 2, 4, 6 и 24 ч после инъекции у каждой из крыс отбирают по 500 мкл крови под СО₂-анестезией. Образцы крови хранят при комнатной температуре в течение 1,5 ч с последующим выделением сыворотки центрифугированием (4 С, 18000хд, 5 мин). Образцы сыворотки хранят при -80°С до дня анализа. Количество активного ЬО-С8Р в образцах сыворотки квалифицируют по анализу ЬО-С8Р т У1!го активности после оттаивания образцов на льду.

Измерение т у1уо биологической активности у здоровых крыс конъюгированного и неконъюгированного ЬО-С8Р и их вариантов.

Измерение т у1уо биологических эффектов ЬО-С8Р у крыс штамма 8РР 8ргадие ИаМеу используют для определения биологической эффективности конъюгированного и неконъюгированного ЬО-С8Р и их вариантов. В день прибытия крыс произвольно разделяют на группы по 6 крыс в каждой. Животные отдыхают в течение 7 дней, после чего отбраковывают крыс в плохом состоянии или с экстремальным весом. Интервал весов крыс в начале периода отдыха составлял 250-270 г.

- 127 019968

В день введения крысам не дают пищи в течение 16 ч, после чего подкожно вводят инъекцию 100 мкг на 1 кг веса тела ЬС-С8Р или его варианта. Каждый ЬС-С8Р образец вводят инъекцией группе из 6 произвольных крыс. Образцы крови 300 мкг ЕИТА стабилизированной крови отбирают из хвостовой вены крыс перед тем, как вводят дозу, и затем через 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 и 144 ч после введения дозы. Образцы крови анализируют по следующим гематологическим параметрам: гемоглобин, количество эритроцитов, гематокрит, средний объем клеток, средняя концентрация клеток гемоглобина, среднее количество гемоглобина, количество лейкоцитов, дифференциальное количество лейкоцитов (нейтрофилов, лимфоцитов, эозинофилов, базофилов, моноцитов). На основании указанных измерений оценивают биологическую эффективность конъюгированного и неконъюгированного ЬС-С8Р и их вариантов.

Измерения ίη νίνο биологической активности у крыс с индуцированной химиотерапией нейтропенией конъюгированных и неконъюгированных ЬС-С8Р и их вариантов.

Для этого анализа используют крыс штамма 8РР 8ргадие Иате1еу. В день прибытия крыс произвольно разделяют на группы по 6 крыс в каждой. Животные отдыхают в течение 7 дней, после чего отбраковывают крыс в плохом состоянии или экстремального веса. Интервал весов крыс в начале периода отдыха составлял 250-270 г.

За 24 ч перед введением образцов ЬС-С8Р крысам вводят внутрибрюшинно 50 мг на 1 кг веса тела циклофосфамида (СРА) для индуцирования нейтропении, которая имитирует нейтропению, вызываемую противораковой химиотерапией. В день 0 подкожно вводят инъекцию 100 мкг/кг веса ЬС-С8Р или его варианта. Каждый ЬС-С8Р образец инъектируют группе из 6 случайных крыс. Образцы крови по 300 мкл ЕИТА стабилизированной крови отбирают из хвостовой вены крыс перед введением дозы и через 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 и 168 ч после введения. Образцы крови анализируют по следующим гематологическим параметрам: гемоглобин, количество эритроцитов, гематокрит, средний объем клеток, средняя концентрация клеток гемоглобина, среднее количество гемоглобина, количество лейкоцитов, дифференциальное количество лейкоцитов (нейтрофилов, лимфоцитов, эозинофилов, базофилов, моноцитов). На основании указанных измерений оценивают биологическую эффективность конъюгированного и неконъюгированного ЬС-С8Р и их вариантов.

Пример 26. Ш νίνο исследования, оценивающие влияние ЬС-С8Р-Т133рАР 20К варианта ПЭГ на гематологические реакции скота.

Рекомбинантные ЬС-С8Р, содержащие одно рАР замещение в положении Т133 (ЬС-С8Р Т133рАР20К ПЭГ), получают в Е. сой. У этого белка есть ^концевой метионин (8Еф ГО N0: 2) и треонин в положении 134 8Еф ГО N0: 2 был замещен пара-ацетилфенилаланином. Белок был ПЭГилирован по сайту встраивания рАР, используя 20 кДа оксиамино ПЭГ, и очищен с помощью катионообменной жидкостной хроматографии до >98% чистоты.

Конечная лекарственная форма содержит 7,377 мг/мл.

ПЭГилированного ЬС-С8Р в буфере для лекарственных форм, состоящем из 4,26 мМ №1Ас; 5% сорбита; 0,0033% Ттеееп 20; 0,565 мМ ЫаС1; рН 4,0.

Коммерческих мясных бычков-кастратов, результатов скрещивания английских и континентальных родителей весом приблизительно 150 кг покупают и транспортируют в исследовательский центр, где их индивидуально идентифицируют по ушным ярлыкам и акклиматизируют в течение 7 до включения в исследование. Животным не вводят ни антибиотики, ни вакцины во время прибытия или акклиматизации. На протяжении исследований животным не вводят никаких других медикаментов. Животных помещают в стойла с бетонным наклонным полом и содержат при комнатных температурах. Животных кормят один раз в день по желанию полным гранулированным кормом (КитПаЬ® 5508).

Исследования проводят, используя произвольный полный блок-дизайн, в котором бычки заключены в стойла. Двенадцать животных оценивают с точки зрения обработанных или негативного контроля (лекарственная форма буфера без белка) в группах (6 животных/обработка). Животных произвольно разделяют на блоки и обработку проводят внутри блоков.

В день -1 бычков осматривает ветеринар на предмет клинических признаков заболевания. Оценки включают частоту пульса, скорость дыхания и ректальную температуру так же, как общее состояние. Вес тел и ректальные температуры определяют и анти-коагуляционные образцы крови собирают для гематологических оценок (образцы предварительной обработки). Для включения в исследования отбирают животных в конкретном весовом интервале с нормальными гематологическими профилями на основании литературных ссылочных интервалов и без клинических признаков заболевания.

В день 0 бычков обрабатывают или одной подкожной инъекцией ПЭГилированного ЬС-С8Р Т133рЛР (40 мкг/кг), или буфером для лекарственных форм (1 мл/125 кг). Инъекции вводят в предлопаточную область с левой стороны шеи.

Полные образцы венозной крови (~30 мл) собирают в стерильные ампулы, содержащие или ЕИТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту) для определения абсолютного числа лейкоцитов либо АСИ (кислота-цитрат-декстроза) для определения абсолютного числа нейтрофилов. Абсолютное число лейкоцитов определяют, используя анализатор крови Весктап Сои1!ег АСТ₁₀™. Абсолютное число нейтрофилов (АКС) определяют, используя проточно-цитометрическую оценку процента нейтрофилов в СЭ45- 128 019968 окрашенных образцах полной крови с помощью биоанализатора Всйоп ОюИшоп ЕАС8зггзу™. Абсолютное число нейтрофилов рассчитывают, умножая абсолютное число лейкоцитов на процент нейтрофилов.

Кроме образцов до обработки, полученных в день -1, образцы собирают спустя 4, 8 и 12 ч в день 0, через 24 и 36 ч после обработки и ежедневно в дни 3-14.

Результаты введения ПЭГилированных ЬС-С8Е ΑNС представлены на фиг. 6. Животные, которых обрабатывают только буфером для лекарственных форм, демонстрируют относительно постоянные ΑNС значения на протяжении всей длительности исследований. Напротив, животные, которым вводили ПЭГилированный ЬС-С8Е, демонстрируют заметное увеличение ΑNС в течение 8 ч после обработки. Максимальные АИС значения (приблизительно 10-кратное превышение уровней до обработки) наблюдаются через 72 ч после обработки. Абсолютное количество нейтрофилов снижается приблизительно в 4-5 раз по сравнению с уровнем до обработки на 5 день после обработки и остается на этом уровне до дня 10. Значения продолжают уменьшаться и к 11-14 дням достигают 3,5-кратного уменьшения по сравнению с уровнем до обработки с дня 11 до дня 14.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что сайт-специфическое ПЭГилирование ЬС-С8Е в положении Т133 позволяет достигать высокой гематопоэтической активности, которая сохраняется в течение по меньшей мере двух недель у бычков, которым ввели одну инъекцию белка.

Пример 27. Результаты гематологического исследования ПЭГилированного варианта ЬС-С8Е Τ133.

Ш у1уо исследования осуществляют, чтобы оценить влияние Ь^-С8Ε-Τ133рΑΕ 20К варианта ПЭГ в отношении гематологических реакций скота.

Рекомбинантные Ь6-С8Е, содержащие одно рАЕ замещение в положении Т133 (Ь6-С8Е Τ133рΑΕ20К ПЭГ), получают в Е. сой. Белок был ПЭГилирован по сайту встраивания рАЕ, используя 20 кДа оксиамино-ПЭГ, и очищают с помощью эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии до >98% чистоты. Конечная лекарственная форма содержит 7,377 мг/мл ПЭГилированного ЬС-С8Е в буфере для лекарственных форм, состоящего из 4,26 мМ №1Ас; 5% сорбита; 0,0033% Жуеен 20; 0,565 мМ №С1; рН 4,0.

Коммерческих мясных бычков-кастратов результатов скрещивания английских и континентальных родителей весом приблизительно 150 кг покупают и транспортируют в исследовательский центр, где их индивидуально идентифицируют по ушным ярлыкам и акклиматизируют в течение 7 дней до включения в исследование. Животным не вводят ни антибиотики, ни вакцины во время прибытия или акклиматизации. На протяжении исследований животным не вводят никаких других медикаментов. Животных помещают в стойла с бетонным наклонным полом и содержат при комнатных температурах. Животных кормят один раз в день по желанию полным гранулированным кормом (Кл.ппИзЬ® 5508).

В день 0 бычков обрабатывают или одной подкожной инъекцией ПЭГилированного ЬС-С8Е Τ133рΑΕ (40 мкг/кг) или буфером для лекарственных форм (1 мл/125 кг). Инъекции вводят в предлопаточную область с левой стороны шеи.

Полные образцы венозной крови (~30 мл) собирают в стерильные ампулы, содержащие или Ε^ΤΑ (этилендиаминтетрауксусную кислоту) для определения абсолютного числа лейкоцитов либо АСЭ (кислота-цитрат-декстроза) для определения абсолютного числа нейтрофилов. Абсолютное число лейкоцитов определяют, используя анализатор крови Βескшаη СоиЙег АСТ₁₀™. Абсолютное число нейтрофилов (АЛС) определяют, используя проточно-цитометрическую оценку процента нейтрофилов в СЭ45окрашенных образцах полной крови с помощью биоанализатора Всйоп ОюИшоп ЕАС8зггзу ™. Абсолютное число нейтрофилов рассчитывают, умножая абсолютное число лейкоцитов на процент нейтрофилов.

Результаты введения ПЭГилированных ЬС-С8Е в отношении ΑNС представлены на фиг. 17. Животные, которых обрабатывают только буфером для лекарственных форм, демонстрируют относительно постоянные значения АЫС на всем протяжении исследований. Напротив, животные, которым вводили

ПЭГилированный ЬС-С8Е, демонстрируют заметное увеличение ΑNС в течение 8 ч после обработки.

- 129 019968

Максимальные АИС значения (приблизительно 10-кратное превышение уровней по сравнению с уровнями до обработки) наблюдаются через 72 ч после обработки. Абсолютное количество нейтрофилов снижается приблизительно в 4-5 раз по сравнению с уровнем до обработки на 5 день после обработки и остаются на этом уровне до 10 дня. Значения продолжают уменьшаться и достигают 3,5-кратного уменьшения по сравнению с уровнем до обработки с 11 до 14 дня (см фиг. 17).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что сайт-специфическое ПЭГилирование ЬС-С8Р в положении Т133 позволяет достигать высокой гематопоэтической активности, которая сохраняется в течение по меньшей мере двух недель у бычков, которым вводят одну инъекцию белка.

Следует понимать, что раскрытые здесь примеры и варианты представлены только с иллюстративной целью и что различные модификации или изменения в их свете, которые могут предложить специалисты в данной области, должны быть включены в объем и сферу действия рассматриваемого изобретения и объема формулы изобретения. Все цитированные в рассматриваемом изобретении публикации, патенты, патентные заявки и/или другие документы включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей до той же степени, как если бы каждые отдельные публикации, патенты, патентные заявки и/или другие документы были включены в описание посредством ссылки для всех целей.

Пример 28. Результаты исследования эффективности ПЭГилированного варианта ЬС-С8Р Т-133 в отношении мастита.

Метафилактическая эффективность ЬС-С8Р-Т133рАР 20К варианта ПЭГ против природных интрамаммарных инфекций, связанных с ключевыми патогенами мастита, оценивают, используя модель искусственно вызванного мастита.

Рекомбинантные ЬС-С8Р, содержащие одно рАР замещение в положении Т133, продуцированы в Е. сой. Белок ПЭГ илируют по сайту встраивания рАР, используя 20 кДа оксиамино-ПЭГ, и очищают, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию исключения по размерам. Конечная лекарственная форма содержит ПЭГилированный ЬС-С8Р в буфере для лекарственных форм, состоящем из 10 мМ №1Ас; 5% сорбита и 0,0033% Т\уееп 20 при рН 4,0.

Многократно телившихся Но1к!ет-Рпек1ап репрайийеп! коров весом приблизительно 600-800 кг отбирают из коммерческого продуктивного поголовья. Никакого противобактериального лечения коровам не проводят в течение 30 дней до включения в исследования. Животных кормят соответствующим сухим кормом для коров до отела, переходный рацион для коров включают в день отела и он используется на всем протяжении исследований. Животным предоставляется доступ к свежей воде ай НЬйит. Затем следуют рутинные процедуры и коров доят дважды в день.

Состояние здоровья коров регистрируют в исследовании приблизительно за семь дней до даты их ожидаемого отела на основании племенного учета и оценки их готовности к отелу ветеринаром. Коров совершенно произвольно разбивают на группы по обработке. В каждой такой группе содержится приблизительно пятьдесят коров.

Коров обрабатывают или стерильным солевым раствором (негативный контроль), ежедневные инъекции (с дня -7 до дня 6) неПЭГилированного ЬС-С8Р-Т133рАР, или различными дозами ЬС-С8РТ133рАР 20К ПЭГ варианта в день регистрации и в день отела. Инъекции вводят подкожно в предлопаточный участок шеи.

Индивидуум, которому неизвестно разделение на группы, наблюдает животных в отношении клинических признаков мастита при дойке в каждый из дней 0-28. Специфические наблюдения включают определение клинической оценки на основании внешнего вида молока и состояния молочных желез. Если обнаруживаются какие-либо ненормальности, проводят тест на СайГогша Макййк на пораженном соске (сосках) и измеряют ректальную температуру животного. У каждого погибшего во время испытаний животного берут биопсию для определения причины гибели, если это возможно.

Удои записывают в каждый из 0-28 дней и исследуют состав образцов молока, полученного из здоровых сосков в дни 3, 5, 7 и 10, причем исследования состава включают определение количества соматических клеток, жирность молока, молочный белок, лактозу и твердую часть. Собирают также дополнительные образцы молока, полученные из сосков, демонстрирующих клинические ненормальности, для определения бактериальных патогенов.

Процент живорожденных и оценки концепции первой помощи после ребридинга с искусственным осеменением собирают для всех коров, включенных в исследования, чтобы оценить влияние обработки на репродуктивное здоровье. Ежедневные наблюдения за здоровьем всех телят также регистрируют в течение первых 30 дней их жизни и любые ненормальности документируют, чтобы оценить влияние обработки на здоровье телят.

Эффективность оценивают, сравнивая степени заболеваемости между группами как для коров, так и для отдельных четвертей. Вторичные конечные точки включают оценку влияния обработок на случаи заболеваемости, производство молока, состав молока и степень концепции первой помощи.

- 130 019968

Влияние различных обработок на клинический мастит и смертность суммированы в табл. 10.

Таблица 10

Описание обработки	Заболеваемость	Смертность
Стерильный солевой раствор (ЗЮх 2-7 дни и день 0)	26/50(52%)	4
ЬС-СЗР Т 133-рАЕ (з мкг/кг, 310x14, день-7 - день 6]	16/40 (33%)	6

ЬС-СВЕ ПЗЗ-рАЕ 20К РЕС (40мкг/кг.8Юх2, д«„ь-7ида* 01	6/53(11%)	2

5С-С8Р Т133-ОАЕ 20К РЕС (20мкг/кг.ЗЮх2 _лмь -7 и день 01	7/52(13%!	3

Введение ежедневных доз неПЭГилированных ЬС-СЗР Т-133 рАР значительно снижает количество случаев новой инфекции клинического мастита по сравнению с контролем солевым раствором или с ежедневными инъекциями неПЭГилированного ЬС-СЗР Т133-рАР. Введение каждой дозы ЬС-СЗР Т133рАР 20К ПЭГ приводит к небольшому численному уменьшению смертности по сравнению с контролями и с солевым раствором.

Влияние обработки на ежедневные удои у здоровых коров суммировано на фиг. 18. Уровни удоев были аналогичными у коров, обработанных стерильным солевым раствором или неПЭГилированным ЬС-СЗР Т133-рАР и низшими дозами ЬС-СЗР Т133-рАР 20К ПЭГ. Указанные животные демонстрируют повышение удоев на протяжении исследования, что обычно наблюдается для первого месяца лактации. Животные, обработанные более высокими дозами ЬС-СЗР Т133-рАР 20К ПЭГ, демонстрируют значительно пониженные удои по сравнению с удоями для групп с другими обработками на протяжении всей длительности исследований.

Влияние обработок на количество соматических клеток представлено на фиг. 19. Животные, обработанные или неПЭГилированным ЬС-СЗР Т133-рАР либо ЬС-СЗР Т133 рАР 20К ПЭГ, демонстрируют количество соматических клеток, которое или равно или меньше, чем количество, которое наблюдалось у контрольных животных, обработанных солевым раствором в дни 3, 5 и 7 после отела. К десятому дню после отела количество соматических клеток у животных, обработанных неПЭГилированным ЬС-СЗР Т133-рАР или ЬС-СЗР Т133 рАР 20К ПЭГ, было значительно ниже, чем у контрольных животных, что предполагает, что такие обработки, по-видимому, уменьшают количество случаев неклинического мастита в дополнение к клиническому маститу.

Результаты микробиологических анализов указывают на то, что заболеваемость коров находится в типичном интервале бактериальных патогенов, включая кишечные бактерии, З1гер1ососсик крес1ек, З!арйу1ососсик крес1ек и ВасШик креаек. Полученные результаты предполагают, что введение ЬС-СЗР Т133-рАР 20К ПЭГ оказывается эффективным в плане уменьшения заболеваемости как против грамположительных, так и грам-отрицательных видов бактерий.

Влияние обработок на живорождение и оценки концепции первой помощи суммировано в табл. 11. Не наблюдается заметных различий в процентах живорождения между обработками, что предполагает, что экспериментальные обработки не оказывают влияния на жизнеспособность телят в матке. Наблюдается несколько улучшений в оценках концепции первой помощи среди животных, обработанных или неПЭГилированным ЬС-СЗР Т133-рАР либо ЬС-СЗР Т133 рАР 20К ПЭГ, и животных, обработанных солевым раствором. Указанные результаты предполагают, что экспериментальные обработки не оказывают вредного воздействия на репродуктивное здоровье.

Таблица 11

Описание обработки	% живорожденных	Оценка концепции первой помощи
Стерильный солевой раствор ($Юх 2-7 дни и день 0)	94%	25.6%
ЬС-СЗЕТ133-рАР (3 мкг/кг. ЗЮх14,день-7и деньб)	98%	41.2%
ЬС-С5Г Т133-рАЕ 20К РЕС (40 мкг/кг, 810х2,день-7и день 0)	92%	34.2%
ЬС-СЗР ИЗЗ-рАЕ 20КРЕС (20 мкг/кг, 510x2,день-7 и деньО)	93%	34.2%

Влияние на здоровье во время пребывания в матке живорожденных телят, включенных в исследования, суммировано в табл. 12. Полученные результаты свидетельствуют о том, что никакие экспериментальные обработки не уменьшают количество случаев кишечных или респираторных заболеваний по сравнению со случаями для группы, обработанной солевым раствором в первые тридцать дней жизни. Однако введение как неПЭГилированного ЬС-СЗР Т133-рАР, так и ЬС-СЗР Т133 рАР 20К ПЭГ значительно уменьшает смертность по сравнению с контролями с солевым раствором. Приведенные результаты позволяют предположить, что экспериментальные обработки оказывают положительное влияние на тяжесть заболевания.

- 131 019968

Таблица 12

Описание обработки	Случаи кишечных заболеваний	Случаи респираторных заболеваний	Смертность
Стерильный солевой раствор (ЗЮх 2*7 дни и день 0)	28	1	6
Ье-С5РТ133-рАЕ(3 мкг/кг, 5Юх14_1Яень-7-день6)	32	1	1
ЫЗ-С5Р Τ133-рАР 20К ΡΕΘ (40 мкг/кг. 810х2,_явнь-7и день 0)	30	2	0
Ь6Ю8ЕТ133-рАР20КРЕС(20 мкг/кг. 810x2,день-7_Ид_ень0)	34	2	1

Пример 29. Влияние ЬС-С8Е Т-133 ПЭГилированного варианта на респираторное заболевание. Результаты изучения эффективности.

Метафилактическую эффективность различных доз ЬС-С8Е-Т133 рАЕ 20К варианта ПЭГ против природного респираторного заболевания крупного рогатого скота оценивают в промышленных условиях фермы.

Рекомбинантные ЬС-С8Е, содержащие одно рАР замещение в положении Т133, продуцированы в Е. со11. Белок ПЭГилируют по сайту встраивания рАЕ, используя 20 кДа оксиамино-ПЭГ, и очищают, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию исключения по размерам. Конечная лекарственная форма содержит ПЭГилированный ЬС-С8Е в буфере для лекарственных форм, состоящем из 10 мМ №Ас; 5% сорбита и 0,0033% Тгаееп 20 при рН 4,0.

Коммерческих бычков от скрещивания английской и континентальной пород весом приблизительно 225 кг и типичных промышленных телят-откормочников закупают на фермах на юго-востоке США. После прибытия на место назначения животных идентифицируют и их осматривает ветеринар на предмет клинических нарушений. Регистрируют также ректальную температуру и животных без клинических симптомов и с ректальными температурами <40°С отбирают для включения в исследования. Образцы крови для определения полного и дифференциальных количеств лейкоцитов отбирают до обработки.

Телят произвольно разбивают на группы для различных обработок, как представлено в табл. 13.

Таблица 13

Обработка	Дозовый режим	Число животных
1} Стерильный солевой раствор	8ЮХ1	40
2) Ь&С8Е-Т133 20К РЕВ (20 мкг/кг)	810X1	40
3) Ь6-СЗР-Т133 20К РЕЗ (10 мкг/кг)	8ЮХ1	40
4) 0&СЗР-Т133 20К РЕЗ (5 мхг/кг)	5ЮХ1	40

Стерильный солевой раствор или ЬС-С8Р-Т133 рАЕ 20К ПЭГ вводят подкожной инъекцией в предплечевой участок шеи.

На следующее утро телят погружают в грузовики и отвозят приблизительно за 2250 км на промышленную ферму в Северном Колорадо. По прибытии телят размещают в стойла и снабжают кормом и водой. В течение 4 ч после прибытия телят перемещают в зону обработки, где их взвешивают и у первых десяти телят, приписанных к каждой из групп обработки, отбирают кровь для получения образцов для определения полного и дифференциальных количеств лейкоцитов. Эти цифры используют для подтверждения того, что животные реагируют на обработку, о чем свидетельствует увеличение абсолютного числа нейтрофилов. Телят произвольно распределяют в загоны для исследования, по пять животных в каждой обрабатываемой группе при полном количестве 20 животных в загоне.

Ветеринар, не осведомленный о принадлежности животных к той или иной группе, ежедневно наблюдает телят в течение 14 дней после прибытия в отношении клинических симптомов заболевания. Каждое животное получает оценку заболеваемости по шкале от 0 (здоровый) до 4 (умирающий). Животных с оценкой заболеваемости >0 перемещают в зону осмотра и регистрируют их ректальную температуру. Животных, которые демонстрируют оценку заболеваемости >0 при ректальных температурах >40°С, идентифицируют как умирающих, обрабатывают соответствующими антибиотиками и возвращают в их исследовательские стойла. Идентичность животных, которые гибнут во время исследований, регистрируют и берут образцы биопсии для определения причины гибели.

Основным критерием для определения эффективности является показатель относительной заболеваемости между группами с различной обработкой. Вторичные критерии эффективности включают оценки смертности, среднее дневное увеличение веса и среднюю оценку дневной заболеваемости для каждой обрабатываемой группы.

Следует понимать, что раскрытые здесь примеры и варианты приведены только с иллюстративными целями и что различные модификации или изменения в их свете, которые могут предпринять специалисты в данной области, должны быть включены в объем и границы рассматриваемого изобретения и прилагаемой формулы изобретения. Все цитированные в рассматриваемом изобретении публикации, патенты, патентные заявки и/или другие документы включены в описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей, как если бы каждые из публикаций, патентов, патентных заявок и/или других документов были отдельно включены по ссылке для всех целей.

- 132 019968

Таблица 14

Цитированные последовательности

ЗЕ<?ГО#	Тип и название последовательности	П о след овательность
1	Аминокислотная последов ательность бычьего Э-С2Е	ТР1СРАК5ЬРр5РЬЬКСЬЕ(2УК.КЛбАРбАЕЬЗ ЕКЪСААНК.1,СНРЕЕЬМЬЪВ.Н5ЬО1РрАРЬ88С 8 8 9 8 Ь 0ЬТ5 СЬИ б ЬН О 0 Ь Е Ь Υ ОСЬИ} А ЬА С 18 Р ЕЕ А РТБϋТ Ь ЬИ VΤϋ Е ΑΤΝ IV/Е9 Μ ЕО ЬС А А Р А V фР ТО О АМРТЕТ8 Α ГОКК А 6 О V Б V А 8 ОЕНК. Е Ь Е Ь Α Υ Р 6 Ь К Υ Ь А Е Р
2	Аминокислотная последовательность бычьего О-СЗЕ с метионином на N конце	МТРЫЗРАК8ЬР0 8РЬЬКСЬЕ0УК.К1рАГОАЕЬ ОЕКЬС А А НК ЕСНР ЕЕБМБЕКН 5 Б ΟΙΡ 0 А РБЗ 8 СЗЗОЗЬОЕТЗСЬМОЪНООЪГЬУОаЬЬОАЕАСИ ЗРЕБАРТЬОТБОБОУТРЕ АТЕН^/БОМЕБЕС А А РАУОРТООАМРТГТЗАЕОККАваУЪУАЗОЬН КГ Ь Е Ъ Α Υ В О ί К Υ Ь А Е Р
3	Нуклеотидная последовательность бычьего Э-СЗЕ	ас!ссайай^^сс15^сас8^гаё^сс{В^{сс[сзаа}§^^с1:8^с18^ааа1З^сс1^:ёЁ^аё^саХ8^1с'^с8^сгаа· аИсаа5с(£а1д§1:^с§заас(дса£§а§с5(оС§Т§!§сс§саса1ааас1§Тдссассс§§аа§ 5са§с18асиса^2сс^а!саао(бсас^§есс1§псс(^тса8581ст5с!в^са88^с5^с1^сс§@^аСПсс«с@@аЗст@§сасо§асасг@^асассст^саас{@ёа(^аас^асгазс Тас1ааса1с<6ёС1§саёа1:8ваа§агс[888азс88сссса§сац15СаассГасаса5§§с8с Ш^ссвассисасё^Сбёсв1йсаёс§1с8^с5ссв81§е^&£Й^с^ё*^с8^саа8^ссаас1;З^са1^ кЕИсс1едакс1кяс1йасс№й₽МесйКа1с1яйс££аассй1аа
А	Нуклеотидная последовательность бычьего С-СЗР с метионином на N конце	а1£ас1<гайа^се{{>сас^&сс1£сх>Ссааа{ДО<й£сТ£аяа(£Сс1£^зсаЁ£(ссёс ааааТЕсаа^Ц^1^£С£{^ас1£са^авс^с1ЗД^@ж£саса1ааас1£{£ссаос(ЗД’ аае£ас!§а1йс1ё.сС§с§ссаПсас!§8@аа!ссеаса^§с!сс1сГ§1ссГс8!§(а§сГС1сааа £1с1£СЛ£сТ§ас((са(^сс(§ааГсаэс{§сас^а£@сс1£Псс1^а1са^£1с1£С(^са£Ё с5с^сс£Я£атсссс^а£с!£8сасс£асас1^асассс(£саас1£5а!5!аас§£ас1Т Цс!ас1ааса1с<Еес1\|гса(га^Ё;аа£а!с1гя2арсг£сссса£са1#ясаасс1асаса£££ С£С№(@ссдосШсасДОедсДОсаёс^зс$сс^@£сДОс1зд^ясааБссаас*£с а!сд№сс1йда)?с1вйсй1ассдсцд!с-1йсяйа1:сЦ1йс-С«аассЕиа

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид ЬС-С8Е, содержащий последовательность 8Е0 ГО NΟ: 1 или 8Е0 ГО NΟ: 2, причем положение 133 в 8Е0 ГО NΟ: 1 или положение 134 в 8Е0 ГО NΟ: 2 замещено на параацетилфенилаланин; и полипептид связан с водорастворимым полимером, содержащим молекулу поли(этиленгликоля).
2. Полипептид ЬС-С8Е по п.1, где молекулярная масса водорастворимого полимера составляет от около 0,1 до около 100 кДа.
3. Полипептид ЬС-С8Е по п.1, где молекулярная масса водорастворимого полимера составляет от около 0,1 до около 50 кДа.
4. Полипептид ЬС-С8Е по п.1, где молекулярная масса водорастворимого полимера составляет около 20 кДа.
5. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ЬС-С8Е по п.1.
6. Вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п.5.
7. Вектор по п.6, дополнительно содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую ортогональную тРНК-синтетазу и ортогональную тРНК, специфичные для включения пара-ацетилфенилаланина в ЬСС8Е.
8. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по п.5 или вектор по п.6 или 7.
9. Клетка-хозяин по п.8, дополнительно включающая ортогональную тРНК-синтетазу и ортогональную тРНК, специфичные для включения пара-ацетилфенилаланина в ЬС-С8Е.
10. Способ получения полипептида ЬС-С8Е, содержащего не кодируемую в природе аминокислоту, включающий культивирование клетки-хозяина по п.8 в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида ЬСС8Е;

очищение полипептида ЬС-С8Е и пэгилирование полипептида ЬС-С8Е.
11. Композиция, включающая полипептид ЬС-С8Е по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.
12. Применение композиции по п.11 в приготовлении фармацевтического продукта для лечения или профилактики инфекции, модулируемой ЬС-С8Е.
13. Применение по п.12, где инфекция присутствует у крупного рогатого скота.
14. Применение по п.12, где инфекция представляет собой мастит крупного рогатого скота.