JP4464684B2 - 広範なtRNAアミノアシル化活性を有するリボザイム - Google Patents
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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Description
本発明により、tRNAをアミノアシル化することができる触媒RNA分子が提供される。これらの触媒RNA分子を用いて、所望の天然または非天然アミノ酸でtRNAをアミノアシル化することができる。
本発明により、非特異的アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAを作製するためのおよび、選択された位置に所望のアミノ酸(非天然アミノ酸を含む)を含んでいるポリペプチドを作製するためのキットがさらに提供される。
明細書および請求の範囲のために本明細書中に用いる「リボザイム」なる用語は、「触媒RNA」と交換して用いることができ、化学反応を触媒することができるRNA分子を意味する。
明細書および請求の範囲のために本明細書中に用いられる「特異的天然アミノ酸」または「特異的アミノ酸」なる用語は、それにてtRNAがインビボで通常チャージされるアミノ酸を意味する。
明細書および請求の範囲のために本明細書中に用いる「チャージ」なる用語は、「アミノアシル化」と交換して用いることができる。
明細書および請求の範囲のために本明細書中に用いられる「非-天然アミノ酸」なる用語は、前記のもの以外のアミノ酸を意味する。
明細書および請求の範囲のために本明細書中に用いられる「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合により結合された2またはそれ以上のアミノ酸から成るアミノ酸のあらゆる連結を意味する。
これらおよび他の具体例は、以下の実施例からより明らかとなろうが、これらは例としてのみ解釈されるべきであって、いずれにせよ限定的なものではない。
選択反応.:選択反応を、以下の条件下で行った。:50μL (第1ラウンドでは100μL)の1 μM RNA プール、2.5 mM ビオチン-Phe-CMEの EK バッファー溶液 [50 mM N- (2-ヒドロキシエチ) ピペラジン-N'-(3-プロパンスルホン酸); EPPS, 12.5 mM KCl pH 7.5]、100 mM MgCl2および5 % エタノール。工程は以下のようである。プールRNAを95℃にて3分間加熱し、次いで25 ℃へと5分間かけて冷却した。MgCl2 (最終濃度100 mM)を添加し、次いで5分間平衡化した。反応を、ビオチン- Phe-CMEのエタノール:水(1:1)溶液の添加により開始し、30分間 (第5および第6ラウンドのためには10分間)インキュベートした。反応を、2容積のエタノールの添加により停止し、RNAを沈殿させた。RNAペレットを70 % エタノールで3回リンスし、EK2バッファー(50 mM EPPS, 500 mM KC1 pH7.5)に溶解し、次いで4ユニットのRNaseインヒビターおよび4μLのストレプトアビジン-アガロースを添加した。混合物を30分間4℃にてインキュベートし、次いで樹脂を6 回100 μLのEK2バッファーで、3回100μLの4Mの尿素で、2回100 μLの水で洗浄した。アガロースに非特異的に結合するRNAを、樹脂を30秒間95 ℃にて100 μLの20 mM EPPS pH 7.0中で加熱し、次いで100 μLの水で洗浄することにより除去した。樹脂を1μMのTR プライマー、125μM dNTPs、50 mM トリス-HCl pH 8.3、75 mM KCl、3 mM MgCl2、10 mM ジチオトレイトール(DTT)、0.2μgのストレプトアビジン、および 50ユニットのMMLV リバース トランスクリプターゼ (PROMEGA(登録商標), WI)から成る10μL溶液に添加し、次いで全反応混合物を1時間42℃にてインキュベートした。5'-および3'-プライマーおよびTaq DNAポリメラーゼを含んでいるPCRバッファーを全RT混合物 (樹脂を含む)に添加し、サーモサイクリングに供して、cDNA配列を増幅した。増幅を、3%アガロース上電気泳動により確認し、dsDNAsを標準的なプロトコルにより単離した。選択の第6ラウンドにおいて、dsDNAsをpGEM-T(登録商標)ベクター (PROMEGA(登録商標))にクローン化し、次いで、標準的なプロトコルを用いる配列決定のために、クローン化したプラスミドを回収した。
リボザイムの樹脂への固定を、RNAの化学構造の利点を用いることにより達成される、樹脂におけるあらゆるリボザイムの固定の例としてr24ミニを用いて、本明細書中にさらに示す。RNAのリボースにおける3'-シス-ジオールの過ヨウ素酸酸化により、対応するジアルデヒドが生じる。この官能基により、安価なヒドラジド樹脂上へのRNAの固定が可能となり、還元アミノ化により、不可逆的な結合の相互作用を生ぜしめる (図8A)。必須の触媒折り畳み構造が樹脂表面によりゆらぐために、リボザイムの完全性および活性が損なわれることを回避するために、r24ミニを操作して、その3'-末端に追加の20ntアデノシンリンカーを保持せしめるよう操作した(r24ミニA20(配列番号46); 図8A)。この変更は、溶液の触媒能力に影響しなかった (図9A、レーン4)。つまり、この操作したr24ミニリボザイムを、ヒドラジド樹脂上、リボザイムの指定の部位に前もって固定した。
以下の具体例により、少なくとも1つの所望のアミノ酸を選択された位置に有するポリペプチドの合成を示す。
方法:
リボザイムおよびtRNAの調製.以下のポリヌクレオチドを化学的に合成し、6%変性 PAGEにより精製した。:Fx(5'-ACCTAACGCC AATACCCTT TCGGGCCTGC GGAAATCTTT CGATCC-3'(配列番号38)、P5-1(5'-ACGCATATGT AATACGACTC ACTATAGGAT CGAAAGATTT CCGC-3')(配列番号39)、P5-2(5'-GGTAACACGC ATATGTAATA CGACTC-3')(配列番号40)、P3-1(5'-T20 ACCTAACGCC AATACCCTTT-3')(配列番号41)、P3-2(5'-T20 ACCTAACGCC-3')(配列番号42)、P5-3(5'-ACGCATATGT AATACGACTC ACTATAGCCT CTGTAGTTCAG TCGGT-3')(配列番号43)、P3-3(5'-TGGTGCCTCT GACTGGACTC-3')(配列番号44)、tR(5'-TGGTGCCTCT GACTGGACTC GAACCAGTGA CATACGGATT XXXAGTCCGC CGTTCTACCG ACTGAACTAC AGAGGC-3', XXX=TAG)(配列番号45)またはGGGT(配列番号60)。
図12Aでは、本実施例にて用いた、フェニル環のp−位に「R」により示される種々の基を有するシアノメチル活性化アミノ酸を示す。本発明のリボザイムは、この位置における種々の置換に耐えることができる。図12および14に示す非天然アミノ酸の例は、フェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン、p-ベンゾイルフェニルアラニン、p-ビフェニルアラニン、p-ビオチニル-アミノフェニルアラニン、p-アジドフェニルアラニン、p-フェニルアゾフェニルアランである。
1の具体例において、ケトン基を図12Aに示すR位に付加する。ケトン基をこのR位に付加することにより、翻訳されるポリペプチドの広範な翻訳後変更が可能である。そのような変更は、十分当業者の常識の範囲内にある。図12Aに示すR位における巨大R基のケトン基を介した導入など、翻訳後変更をなすことにより、これらの基のために翻訳中に生じる構造的妨害が回避される。これは、ケトンは、ビオチン、蛍光分子、スピン標識および多くの他の実験に用いられる分子を含むヒドラジド分子のアレイを、選択的にヒドラゾン結合により結合させることができる基であるがゆえである。さらに、この可逆的結合は、還元剤、例えばシアノボロ水素化ナトリウムを用いることによるヒドラゾンの選択的還元により、不可逆的結合へと変化させることができる。
前(図13)で得た変異遺伝子由来のmRNAをインビトロ翻訳に用いた。図14A-Cは、151のアミノ酸位のGFPにおける非天然アミノ酸変異形成に関連し、以下の省略を用いる。: aa-tRNA, アミノアシル-tRNA; x, tRNAなし; −, aa-tRNAなし; +; aa-tRNA; (a), 全長タンパク質; (b), 切断されたペプチド。下のバンド(b)は、未知の切断されたペプチドであり、これは、変異タンパク質にのみならず野生型に関する翻訳物にも存在する。
図14Cでは、「抑圧効率」を示す。抑圧効率は、mRNAにおける4-塩基コドン変異(178GGGT)がどれだけ効率的にACCC(アミノアシル-tRNAACCC)を有するアミノアシル-tRNAにより翻訳中に抑圧されるかどうかの基準である。エラーバーの中央は、3つの別個の試験の平均スコア形態を示す。エラーバーは、全試験の標準偏差を示す。
2つの非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを、図15A-Cに示す。
図15Cでは、tRNAsの抑圧効率を示す。抑圧効率は、どれだけ効果的に、mRNAにおけるアンバー変異(151TAG)および4-塩基コドン変異(178GGGT)が、CUA(アミノアシル-tRNACUA)およびACCC(アミノアシル-tRNAACCC)アンチコドンを有する対応するアミノアシル-tRNAにより翻訳中に抑圧されるかの基準である。エラーバーの真ん中は、3つの別の試験からの平均スコア形態を示す。エラーバーは、全試験の標準偏差を示す。
図16Cでは、エッペンドルフチューブ中の変異GFPのSAv-アガロース (aga)捕捉を示す。ビオチン化変異GFPに結合しているSAv-アガロースは好適にGFPを捕捉し、それを樹脂上にて濃縮したが、一方、野生型に関しては、捕捉は認められなかった。
当業者は、本発明の好ましい態様に対して多くの変更および修飾をなし得ること、およびそのような変更および修飾を、本発明の精神から離れることなくなし得ることを認識するであろう。それゆえ、添付の請求の範囲は、全てのそのような均等変更事項を、本発明の真の精神および範囲内のものとして包含するものとする。
SEQUENCE LISTING
<110> Suga, Hiroaki et al.
<120> Ribozymes with broad tRNA aminoacylation activity
<130> 11520.0290
<140>
<141>
<150> 60/357,424
<151> 2002-02-15
<160> 61
<210> 1
<211> 57
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_RNA
<222>
<223>
<400> 1
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uaggugcggg augcuac 57
<210> 2
<211> 76
<212> RNA
<213> otRNA
<220>
<223>
<400> 2
ggugguaucc ccaaggggua agggaccgga uucccgaauc cggcauuccg agguucgaau 60
ccucguaccg cagcca 76
<210> 3
<211> 74
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_RNA
<222>
<223>
<400> 3
ggugguaucc ccaaggguac gggaccggau ucccgaaucc ggcauucgag auucgaaucc 60
ucguaccgca gcca 74
<210> 4
<211> 76
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_RNA
<222>
<223>
<400> 4
gccucuguag uucagucggu agaacggcga cucccgaauc cguaugucac ugguucgagu 60
ccagucagag gcacca 76
<210> 5
<211> 76
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<221> unsure
<222> 21-28, 65-75
<223> n is u,c,a or g
<400> 5
ggaucgucag ugcauugaga nnnnnnnngg cccgaaaggg uauuggcguu aggunnnnnn 60
nnnnncuacg cuaaaa 76
<210> 6
<211> 76
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<221> unsure
<222> 41-44, 61-75
<223> n is u,c,a or g
<400> 6
ggaucgucag uugagauuuc cgcaggcccg aaacccuauu nnnnuuaggu nnnnnnnnnn 60
nnnnncuacg cuaaaa 76
<210> 7
<211> 97
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> unsure
<222> 21-28,55-65
<223> n is g, a, t or c
<400> 7
ggatcgtcag tgcattgaga nnnnnnnngg cccgaaaggg tattggcgtt aggtnnnnnn 60
nnnnnactac gctaaaagcc tctgtagttc agtcggt 97
<210> 8
<211> 101
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> unsure
<222> 45-48, 55-69
<223> n is g, a, t or c
<400> 8
ggatcgtcag tgcattgaga tttccgcagg cccgaaaggg tattnnnntt aggtnnnnnn 60
nnnnnnnnna ctacgctaaa agcctctgta gttcagtcgg t 101
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 9
ggtaacacgc atatgtaata cgactcacta taggatcgtc agtgcattga ga 52
<210> 10
<211> 77
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 10
tggtgcctct gactggactc gaaccagtga catacggatt cgggagtccg ccgttctacc 60
gactgaacta cagaggc 77
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 11
tggtgcctct gactggactc 20
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 12
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgcggga tgctactacg ctaaaa 56
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 13
accccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgggagg taactctacg ctaaaa 56
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 14
tcacccgcag gcccgaaagg gtattggcgt taggtagccg acttgactac gctaaaa 57
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 15
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtttgagc gggtctgaac tacgctaaaa 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 16
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgctcct agctttctac tacactaaaa 60
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 17
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgcatca cagggctttc tacgctaaaa 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 18
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtaggccg tggcgggaac tacgctaaaa 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 19
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgaacgc gaaagaggac tacgctaaaa 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 20
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgcgata tccgattgcg tacgctaaaa 60
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 21
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtaattaa gcgactcgcg tacgctaaaa 60
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 22
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtacaaag gcgtccagcg tacgctaaaa 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 23
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgccgtt agttactgac tacgctaaaa 60
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 24
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgcaata gctatgaggc tagctaaaa 59
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 25
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggttagata gcaaataggc tcgctaaaa 59
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 26
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtttgcag cacagtggct acgctaaaa 59
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 27
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgctgga gagttggact acgctaaaa 59
<210> 28
<211> 53
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 28
tttccgcagg cccgaaaggg tattggcgtt aggtgtttgg ctctacgcta aaa 53
<210> 29
<211> 44
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 29
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uagg 44
<210> 30
<211> 45
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 30
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uaggu 45
<210> 31
<211> 46
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 31
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uaggug 46
<210> 32
<211> 47
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 32
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uaggugc 47
<210> 33
<211> 64
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 33
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uaggaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaa 64
<210> 34
<211> 65
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 34
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uagguaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaa 65
<210> 35
<211> 66
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 35
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uaggugaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaa 66
<210> 36
<211> 67
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 36
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uaggugcaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaa 67
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 37
ggtaacacgc atatgtaata cgactcacta taggatcgaa agatttccgc 50
<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 38
acctaacgcc aatacccttt cgggcctgcg gaaatctttc gatcc 45
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 39
acgcatatgt aatacgactc actataggat cgaaagattt ccgc 44
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 40
ggtaacacgc atatgtaata cgactc 26
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 41
tttttttttt tttttttttt acctaacgcc aatacccttt 40
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 42
tttttttttt tttttttttt acctaacgcc 30
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 43
acgcatatgt aatacgactc actatagcct ctgtagttca gtcggt 46
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 44
tggtgcctct gactggactc 20
<210> 45
<211> 76
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 45
tggtgcctct gactggactc gaaccagtga catacggatt tagagtccgc cgttctaccg 60
actgaactac agaggc 76
<210> 46
<211> 77
<212> RNA
<213> artificial
<220>
<223>
<400> 46
ggaucgaaag auuuccgcag gcccgaaagg guauuggcgu uaggugcggg augcuacaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaa 77
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
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gactgaacta cagaggc 77
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<223>
<400> 61
ggcg 4
Claims (31)
- 非特異的アミノ酸でtRNAをアミノアシル化することができるリボザイムをコードしている配列を含むポリヌクレオチドであって、前記リボザイムをコードしている配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31、および配列番号32から成る群から選択される、ポリヌクレオチド。
- 当該非特異的アミノ酸が、天然および非天然アミノ酸から成る群から選択される、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 非天然アミノ酸が、p-ベンゾイルフェニルアラニン、p-アゾフェニルフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン、p-ビフェニルアラニン、p-アジドフェニルアラニン、およびp-フェニルアゾフェニルアラニンから成る群から選択される、請求項2記載のポリヌクレオチド。
- 当該非特異的アミノ酸が、遊離α-アミノ基を有する、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 当該tRNAがストップコドンに対応するアンチコドンを有する、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 当該tRNAが4つのヌクレオチドから成るアンチコドンを有する、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- リボザイムが、3'末端に複数のアデノシン残基をさらに含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが固体基質上に固定されている、請求項7記載のポリヌクレオチド。
- 固体基質が、アガロース、セファロース、および磁気ビーズから成る群から選択される、請求項8記載のポリヌクレオチド。
- a)非特異的アミノ酸でtRNAをアミノアシル化することができるリボザイムであって、配列番号29、配列番号30、配列番号31、および配列番号32から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するリボザイムを提供すること、
b)tRNAを提供すること、
c)非特異的アミノ酸を提供すること、および
d)a)、b)およびc)を組み合わせて、非特異的アミノ酸でのtRNAのアミノアシル化をなすこと、
の工程を含む、非特異的アミノ酸でtRNAをアミノアシル化する方法。 - 非特異的アミノ酸が非天然アミノ酸である、請求項10記載の方法。
- 非天然アミノ酸が、p-ベンゾイルフェニルアラニン、p-アゾフェニルフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン、p-ビフェニルアラニン、p-アジドフェニルアラニンおよびp-フェニルアゾフェニルアラニンから成る群から選択される、請求項11記載の方法。
- 非特異的アミノ酸が遊離α-アミンを有する、請求項10記載の方法。
- tRNAがストップコドンに対応するアンチコドンを有する、請求項10記載の方法。
- tRNAが4つのヌクレオチドから成るアンチコドンを有する、請求項10記載の方法。
- リボザイムが固体基質に固定されている、請求項10記載の方法。
- リボザイムを、3'末端の複数のアデノシン残基を経由して固体基質へと固定してある、請求項16記載の方法。
- アミノアシル化されたtRNAをリボザイムから単離する工程をさらに含む、請求項10記載の方法。
- a)tRNAを非特異的アミノ酸でアミノアシル化することができるリボザイムであって、配列番号29、配列番号30、配列番号31、および配列番号32から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するリボザイムを提供すること、
b)tRNAを非特異的アミノ酸で、a)のリボザイムによりアミノアシル化すること、
c)b)のtRNAのアンチコドンに対応するコドンを有するmRNAを提供すること、および、
d)b)とc)を合わせてインビトロ翻訳反応を行い、特定の位置に所望の非特異的アミノ酸を有するポリペプチドを得ること、
の工程を含む、特定の位置に所望の非特異的アミノ酸を有するポリペプチドを作製する方法。 - 非特異的アミノ酸が、p-ベンゾイルフェニルアラニン、p-アゾフェニルフェニルアラニン、p-ヨードフェニルアラニン、p-ビフェニルアラニン、p-アジドフェニルアラニンおよびp-フェニルアゾフェニルアラニンから成る群から選択される、請求項19記載の方法。
- tRNAがストップコドンに対応するアンチコドンを有する、請求項19記載の方法。
- tRNAが4つのヌクレオチドから成るアンチコドンを有する、請求項19記載の方法。
- 工程d)のインビトロ翻訳反応を行う前に、アミノアシル化tRNAをリボザイムから単離するステップをさらに含む、請求項19記載の方法。
- リボザイムを固体基質に固定してある、請求項23記載の方法。
- 基質がアガロース、セファロース、および磁気ビーズからなる群から選択される、請求項24記載の方法。
- a)非特異的アミノ酸でtRNAをアミノアシル化することができるリボザイムであって、配列番号29、配列番号30、配列番号31、および配列番号32から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するリボザイム、
b)1つまたはそれ以上の非特異的アミノ酸、
c)tRNA
を含む、非特異的アミノ酸でtRNAをアミノアシル化するためのキット。 - tRNAが、ストップコドンに対応するアンチコドンを有するtRNAおよび4つのヌクレオチドから成るアンチコドンを有するtRNAから成る群から選択される、請求項26記載のキット。
- リボザイムが固体基質へと固定されている、請求項26記載のキット。
- 固体基質が、アガロース、セファロース、および磁気ビーズからなる群から選択される、請求項28記載のキット。
- 固体基質がカラムにパックされている、請求項28記載のキット。
- a)配列番号29、配列番号30、配列番号31、および配列番号32から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するリボザイムを用いて、第2のアミノ酸に対応するアンチコドンを有するtRNAを、第1のアミノ酸でアミノアシル化することにより、第2のアミノ酸に対応するアンチコドンを有し、第1のアミノ酸でアミノアシル化されているtRNAを提供する工程、
b)
1)ポリペプチドをコードしているmRNAであって、第2のアミノ酸のためのコドンを含むもの、
2)a)からのtRNA、
を合わせてインビトロ翻訳反応を行う工程、
を含み、b)由来の翻訳産物が、第2のアミノ酸の代わりに第1のアミノ酸を含んでいるポリペプチドである、第2のアミノ酸の代わりに置換された第1のアミノ酸を有するポリペプチドを作製する方法。
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