BRPI0916515B1

BRPI0916515B1 - polipeptídeo de fator estimulante de colônias de granulócitos bovino (bg-csf), formulação farmacêutica e composição compreendendo o mesmo

Info

Publication number: BRPI0916515B1
Application number: BRPI0916515-0A
Authority: BR
Inventors: Anna Maria A. Hays Putnam; Nick Knudsen; Thea Norman; Alan Koder; Vadim Kraynov; Lillian Ho; Peter C. Canning
Original assignee: Ambrx, Inc.; Elanco Us Inc
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2021-03-16
Also published as: JP2014064581A; AU2009274076C1; CA2729851C; AU2009274076A1; EP3225248B1; EP2318029B1; PL3225248T3; CN106928339A; EA201170242A1; NZ600382A; EP3225248A1; CO6351745A2; BRPI0916515A2; US11542310B2; PL2318029T3; JP5844336B2; NZ591235A; UA118536C2; EP2318029A2; WO2010011735A3

Abstract

POLIPEPTÍDEOS DE G-CSF BOVINOS MODIFICADOS E USOS DOS MESMOS. Polipeptídeos de G-CSF bovinos modificados e usos mesmos são fornecidos.

Description

Campo da Invenção

[0001]Esta invenção se refere a polipeptídeos de fator estimulante de colônias de granulócitos bovino (hG-CSF) opcionalmente modificados com pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural.

Fundamentos da Invenção

[0002]O impacto econômico das doenças infecciosas na produção de alimentos de origem animal está bem documentado. As doenças infecciosas reduzem os lucros, aumentam os custos de produção, e põem em risco os produtos alimentares, bem como afetam o desempenho, a saúde e o bem-estar do animal. As doenças podem reduzir o rendimento e qualidade do leite, resultando em maior perda econômica aos produtores de carne e fazendeiros do leite, particularmente quando, em alguns casos de doenças infecciosas microbianas, causam morbidade e mortalidade de animais recém- nascidos, jovens (por exemplo, estoque de reposição) ou adultos. Duas dessas doenças como, mastite e doenças respiratórias dos bovinos (BRD), podem ter efeitos devastadores sobre a produção de alimentos de origem animal.

[0003]A mastite é definida como uma inflamação da glândula mamária. Ela pode afetar qualquer mamífero, por exemplo, vacas, ovelhas e cabras. A mastite bovina é uma infecção do úbere de ruminantes tais como vacas, causada principalmente por bactérias gram positivas e gram negativas e especialmente em vacas em unidades de produção de leite intensiva. A infecção bacteriana resulta na inflamação da glândula mamária (ou seja, tetas e úbere). Os animais podem se tornar mais suscetíveis à mastite devido à função prejudicada dos neutrófilos microbicidas durante o período periparturiente. A doença é particularmente problemática e de considerável importância econômica porque o patógeno é facilmente transferido de um animal para outro durante o processo de ordenha. Ela frequentemente se desenvolve nas primeiras semanas em torno do parto e pode reaparecer a cada lactação. Alguns dos principais microrganismos patogênicos que causam a mastite bovina são Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa. Veja também Bovine Mastitis, editado por Glenys Bloomfield, V&O Publications, 1987, incorporado aqui por referência. Esses microrganismos invadem o úbere através do canal da teta e produzem inflamação do tecido produtor de leite causando a formação de tecido cicatricial que, uma vez formado, pode causar uma redução permanente da produção do leite de vaca. Uma infecção pode também alterar a composição, quantidade, aparência e qualidade do leite. Os patógenos causadores de mastite pertencem a duas categorias, a saber, a contagiosa e a ambiental. As bactérias contagiosas, tais como Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus, colonizam principalmente sítios de tecido hospedeiro, tais como glândulas mamárias, os canais da teta, e lesões do tecido da teta; e são espalhadas de uma vaca infectada para outra durante o processo de ordenha. As bactérias ambientais, muitas vezes, organismos estreptococos, enterococos e coliformes, estão comumente presentes nos arredores da vaca a partir de fontes como fezes de vaca, solo, material vegetal, de cama, ou água; e infectam pelo contato oportunista casual com um animal. A distinção entre os agentes patógenos contagiosos e ambientais, embora não exclusiva, é de importância prática, porque diferentes medidas de manutenção do rebanho leiteiro são necessárias para os diferentes grupos microrganismos. Em todos os casos de mastite bovina, seja qual for o microrganismo causal, a rota de transmissão do patógeno invasor na glândula interna do úbere é através do orifício da teta e do canal da teta. As fontes mais comuns de microrganismos nocivos incluem equipamentos de ordenha insalubres, o ordenhador, outros animais com mastite, um ambiente estável insalubre, e os processos de eliminação dos próprios animais (defecação / urina).

[0004]Há uma variedade de formas ou tipos de mastite bovina, com gravidade e sintomatologia variável, incluindo as seguintes: (1) infecção do úbere: A invasão da cavidade do úbere por microrganismos que se multiplicam dentro da glândula e causam inflamação; (2) mastite não clínica ou subclínica: uma forma de mastite em que não há inchaço da glândula ou anormalidade observável do leite,apesar de existiremalterações noleite quepodemser detectadas por testes específicos. Este tipo de mastite é de longe a maisprevalentee causa a maior perdaglobal namaioriados rebanhos. Muitas vezes é referida como mastite "escondida"; (3) mastite clínica: uma forma de mastite em que as condições anormais do úbere e secreção são observáveis. A mastite clínica branda envolve alterações no leite, tais como flocos, coágulos, e uma aparência de aguado ou incomum. O calor e a sensibilidade do úbere são leves ou ausentes, mas podem ser sinais de inchaço. A mastite clínica grave envolve um início repentino, com inchaço do quadrante infectado que é quente, duro e sensível. O leite aparenta estar anormal e a produção de leite cai. Às vezes, além dos efeitos locais no úbere, a vaca se torna doente. Há sinais de febre, pulso rápido, depressão, fraqueza, e perda de apetite. A combinação destas condições, muitas vezes é referida como mastite aguda sistêmica, porque não apenas o úbere, mas o animal inteiro é afetado, e (4) mastite crônica: uma forma de mastite causada por uma infecção do úbere persistente que ocorre na maioria das vezes na forma não-clínica, mas ocasionalmente pode se desenvolver para uma forma clínica ativa. Depois dessas "urgências ou flare-ups" a forma não-clínica geralmente retorna temporariamente. (Veja geralmente, Concepts of Bovine Mastite, publicado por National Mastitis Council, Inc., 2nd ed. 1978, p.5).

[0005]A mastite continua a causar grandes prejuízos econômicos para a indústria de laticínios. A mastite afeta a lucratividade de um rebanho de várias maneiras, direta e indiretamente, incluindo: (1) perda de produção de leite; (2) aumento das taxas de abate de vacas infectadas; (3) diminuição do valor do leite; (4) leite descartado após o tratamento com antibióticos; (5) custos veterinários (antibióticos e visitas veterinárias) e (6) mortes. (Bovine Mastitis, Glenys Bloomfield, supra, p.33).

[0006]Outra doença comum que afeta a indústria de gado é a “febre do transporte” (doença respiratória bovina ou BRD). A BRD tem sido referida por alguns como um "complexo de doença" por duas razões: geralmente é causada por uma variedade de patógenos, tanto virais quanto bacterianos, que interagem entre si para produzir a doença completa, e porque o comportamento do patógenos pode seguir um processo sequencial que, passo a passo, resulta em animais doentes. Os patógenos bacterianos são uma das melhores causas conhecidas de síndrome aguda. Os patógenos bactericidas podem invadir o trato respiratório bovino após ter sido comprometido por uma infecção viral e outros fatores, tais como o estresse do desmame, transporte, mudança de alimentação e variação da temperatura ambiente e umidade, podem preceder e contribuir para a infecção. Em muitos casos, esta é adicionada à exposição do gado a patógenos durante o transporte quando eles são misturados com gados de outra origem em caminhões, currais e celeiros de leilão, resultando na alta incidência da doença no gado distribuído ao “cultivar da fábrica” ou “feedlot”.

[0007]Várias espécies de bactérias foram isoladas e associadas com BRD, e algumas das mais comuns são Mannhemia haemolytica, Pasteurella multocida e (ou) Histophilus somni. O Haemophilus somnus é um patógeno virulento que causa septicemia em gados e, por vezes, as manifestações resultantes têm sido referidas como "complexo de Haemophilus somnus", das quais uma forma é a doença respiratória; viroses, tais como rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), diarreia viral bovina (BVD) e vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), também podem estar envolvidas na iniciação de um complexo de BRD, frequentemente abrindo a porta para infecções bacterianas secundárias.

[0008]Devido ao fato de ser praticamente impossível eliminar esses organismos do ambiente, o complexo de BRD deve ser abordado do ponto de vista da prevenção destes agentes causadores de doenças, desde o contágio, detecção e tratamento dos casos clínicos tão rapidamente e eficazmente quanto possível. As doenças respiratórias são a principal causa de perda de doença em bovinos de corte. É geralmente reconhecido que a causa final da morte na maioria dos casos de febre de transporte é uma pneumonia bacteriana (geralmente pasteurella). A Pasteurella haemolytica, geralmente do tipo IA é a bactéria mais comum isolada de casos de doenças respiratórias na América do Norte. A vacinação contra alguns dos agentes infecciosos envolvidos na febre de transporte às vezes é útil, mas as vacinas estão disponíveis e eficazes para apenas alguns dos agentes conhecidos por estar envolvidos no complexo da doença.

[0009]A terapia com antibióticos tem sido um componente principal da estratégia de controle da mastite e BRD. A Patente US No. 7.182.948, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, indica que a imersão de tetas em antimicrobianos contendo iodo têm se mostrado eficaz contra as infecções mamárias e bactérias que causam a mastite (Pankey, J.W. et al., (1983) J. Dairy Sci. 66 (1), 161 167). Essas composições são geralmente administradas para a teta por imersão ou pulverização da teta antes da ordenha, bem como após a remoção do copo de ordenha. Para reduzir a mastite, a imersão comercial de tetas foi desenvolvida com uma variedade de agentes antimicrobianos, incluindo iodóforos, compostos de amônio quaternário, compostos que liberam cloro (por exemplo, hipocloritos alcalinos), compostos oxidantes (por exemplo, peróxido de hidrogênio, perácidos), ácidos carboxílicos protonados (por exemplo, ácidos heptanóico, octanóico, nonanóico, decanóico, undecanóico), ácidos aniônicos (por exemplo, alquil aril ácidos sulfônicos), dióxido de cloro (da clorita), e bisbiguanidas como a clorexidina. Esses agentes, que têm diferentes graus de eficácia, limitam a transmissão da mastite reduzindo as populações do patógeno na teta. No entanto, existem problemas associados ao uso de antimicrobianos. Os mais prevalentes são a irritação da teta e rachaduras da teta. Para aliviar estes problemas, os aditivos emolientes, tais como glicerina e lanolina, foram incluídos em tais composições. No entanto, mesmo com o uso desses emolientes as irritações na pele ainda podem ocorrer.

[00010] A Patente US No. 6.790.867, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, indica que as injeções subcutâneas de formulações que combinam um fármaco anti-inflamatório não- esteroidal (AINE), tal como a flunixina, com antibióticos derivados de tianfenicol ou cloranfenicol fluorado, tal como florfenicol, podem ser usadas para tratar BRD. A Publicação do Pedido de Patente No. 20070155799, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, divulga novos compostos de fenicol que podem ser usados como pró- fármacos de antibióticos e em combinação com AINEs ou outros antibióticos.

[00011] A NMC, antigo National Mastitis Council (Conselho Nacional de Mastite), uma organização sem fins lucrativos dedicada a redução da mastite e melhoria da qualidade do leite, salienta a importância do saneamento da teta, mas também, cuidados adequados com as tetas para a prevenção de mastite. Os prejuízos econômicos causados pela mastite conduziram a muitas pesquisas para seu controle. O estresse físico, bem como as condições ambientais foram relatados como sendo grandes contribuintes para a infecção da glândula mamária. Veja a Publicação de Patente US No. 20020051789, que é Incorporada aqui por referência. Desde que foi documentado que a mastite sub-clínica estava diretamente relacionada à condição pobre das tetas (Neijenhuis, P. et al. (2001) J. Dairy Sci. (84) 2664 2672), uma série de soluções comerciais de imersão das tetas incorporando agentes de condicionamento evoluíram (National Mastitis Council, Resumo de Publicações Revisadas de Peer em “Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants” Publicadas desde 1980; Janeiro 2002). A rugosidade e a calosidade final das tetas mostraram ter um relacionamento direto com a mastite clínica (Neijenhuis, F. et al. (2001) J. Dairy Sci.. (84) 2664 2672). A redução da rachadura e irritação das tetas, bem como a manutenção das tetas flexíveis é muito importante no controle de infecções mamárias. A glicerina também tem sido usada como um condicionador de tetas em soluções para imersão das tetas. No entanto, os estudos não indicam nenhuma redução significativa de bactérias que causam mastite, tais como Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae ou coliformes quando o teor de glicerina é aumentado de 2% para 10% em uma solução para imersão de tetas de iodo a 1% (National Mastitis Council, Resumo de Publicações Revisadas de Peer em “Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants” Publicadas desde 1980; Janeiro 2002). Sendo assim, embora produtos tais como soluções para imersão das tetas estejam disponíveis, há ainda uma necessidade não atendida de modular a incidência, recorrência e/ou gravidade da mastite.

[00012] A Patente US No. 5.849.883, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, divulga uma série de antibióticos usados no tratamento da mastite incluindo, mas não limitado a, antibióticos beta-lactâmicos, tais como as penicilinas (ampicilina, cloxacilina, hetacilina, nafcilina, penicilina G., (benzil penicilina) penicilina procaína) e cefalosporinas (cefoperazona, cefuroxima, cefalônio, cefapirina, cefoxazol, cefracetril); antibióticos aminoglicosídeos (framicetina, neomicina, novobiocina, estreptomicina), antibióticos macrolídeos (eritromicina), tetraciclinas (clortetraciclina, oxitetraciclina) e antibióticos polipeptídeos (polimixina B). O tratamento com antibióticos para mastite geralmente é ministrado por meio de infusões intramamárias, tanto em vacas lactantes, quando a mastite clínica é detectada, quanto na secagem (terapia da vaca seca). (Bovine Mastitis, supra, p.69.). Nos casos em que a doença clínica grave está presente, os antibióticos devem ser ministrados de modo parental uma vez que as infusões intramamárias são ineficazes devido à obstrução dos dutos.

[00013] As crenças iniciais de que os antibióticos permitem o controle completo da doença ainda não foram realizadas. Nenhum dos antibióticos acima mencionados usados até agora foi inteiramente satisfatório. Além disso, foi verificado ser muito desejável a substituição do tratamento com antibiótico pelo tratamento com compostos de fármacos quimioterapêuticos não-antibióticos pelas seguintes razões: (1) Os antibióticos eficazes na medicina humana não devem ser usados em medicina veterinária, a fim de não desenvolver a resistência da cepa das bactérias que aparecem em doenças humanas; (2) os antibióticos devem ser reservados para as doenças as quais nenhum composto de fármaco quimioterapêutico estiver disponível, uma vez que já se provou que as cepas de bactérias desenvolvam resistência a um antibiótico depois o uso prolongado de antibiótico; e (3) Staphylococcus aureus, um dos patógenos acima mencionados, já desenvolveu uma resistência contra a maioria dos antibióticos usados no tratamento da mastite bovina.

[00014] Um método para o tratamento com um composto de fármaco quimioterapêutico não-antibiótico é descrito na Patente US No. 4.610.993, incorporada aqui por referência, a qual reivindica um método para o tratamento de animais com mastite bovina com uma quantidade eficaz de pelo menos um composto de dissulfeto piridina- N-óxido. Outro método dos mesmos inventores é descrito na Patente US No. 4.401.666, incorporada aqui por referência, a qual reivindica um método para o tratamento de animais com mastite bovina com uma quantidade eficaz de pelo menos um sal metálico de óxido de piridina- 2N-tiona. Apesar destes vários métodos publicados, permanece sendo muito importante encontrar métodos de custo eficaz que usam compostos não-antibióticos que substancialmente possam superar as desvantagens dos antibióticos usados até agora, e que ainda sejam eficazes no tratamento e prevenção da mastite.

[00015] Outra doença comum que afeta a indústria do gado é a febre do transporte (doença respiratória bovina). As doenças respiratórias são a principal causa de perda por doença em gados de corte. A "febre do transporte" costuma descrever o complexo de doenças respiratórias observado em gados com 6 meses de idade ou mais velhos após o transporte ou no local de alimentação ou na pastagem. O estresse do desmame, castração, descorna, jejum, superlotação, exposição a agentes infecciosos, alterações na dieta, transporte, extremas temperaturas do ambiente, e outros fatores estressantes combinados com infecções virais, bacterianas, micoplasmas e/ou clamidiais contribuem para o complexo da febre do transporte. Ao se misturar bezerros de diferentes fazendas e/ou tattersais facilita muito a exposição a agentes infecciosos. A Patente US No. 6.497.869, que é incorporada aqui por referência, descreve alguns dos agentes infecciosos iniciais que podem afetar o gado. A mistura da população pode ser um fator de predisposição mais importante para a febre do transporte do que os fatores de estresse, embora a doença possa ocorrer sem a mistura e os fatores de estresse normalmente piorem dramaticamente a doença respiratória. As tentativas de reduzir o estresse do desmame, castração, descorna, etc., e aclimatação do gado para novos dias ou semanas de dietas antes do transporte às vezes são bem-sucedidas (mas podem não ser de custo eficaz) na redução da incidência de febre do transporte. A vacinação contra alguns dos agentes infecciosos envolvidos na febre do transporte às vezes é útil, mas as vacinas estão disponíveis e são eficazes apenas para alguns dos agentes conhecidos por estar envolvidos no complexo da doença.

[00016] É geralmente reconhecido que a causa final da morte na maioria dos casos de febre de transporte é uma pneumonia bacteriana (normalmente por Pasteurella). A Pasteurella haemolytica, sobretudo do tipo 1A, é a bactéria mais comum isolada de casos de doenças respiratórias na América do Norte. As tentativas de reproduzir experimentalmente a pneumonia bacteriana em gados são geralmente sem sucesso, sem estresse grave e danos de predisposição para o trato respiratório. Acredita-se geralmente que, durante os períodos de estresse, os vírus, micoplasmas e/ou clamídios, na maioria das vezes, fornecem o dano inicial para o trato respiratório que predispõe à infecção bacteriana e doença grave.

[00017] Um surto de doença respiratória clínica típica normalmente começa dentro de horas ou dias após a chegada do gado no “cultivar da fábrica”. Recentemente o gado transportado na faixa de peso de 400 a 500 libras tem geralmente de 10 a 80% de morbidade e de 1 a 10% de mortalidade, ou mais, para a doença do trato respiratório. Quando o soro dos gados é analisado para um aumento em quatro vezes de anticorpos (soroconversão) e o trato respiratório e suas secreções são submetidas a isolamentos microbiológicos, uma infinidade de agentes etiológicos pode ser identificada. Muitos animais, os enfermos e os aparentemente saudáveis, podem demonstrar terem passado por infecção por um ou mais agentes (doença do trato respiratório é provavelmente raramente devido a apenas um agente infeccioso). Apesar do complexo de doença respiratória bovina ser reconhecido clinicamente no “cultivar da fábrica” após a chegada, as infecções que dão origem à doença clínica, provavelmente, começam nos tattersais, onde o gado é primeiramente montado a partir de diferentes fazendas. Veja também Bovine Respiratory Disease, Loan, R. W. Texas A & M University Press, 1984, aqui incorporado por referência.

[00018] A administração de um composto que trata ou modula a incidência, recorrência, duração e/ou gravidade da mastite ou doença respiratória em gados ou outras infecções em animais não-humanos, incluindo mas não limitados a, gados, aves, suínos, cavalos, cães e gatos seria útil na medicina veterinária. Exemplos de tais infecções incluem, mas não estão limitados a septicemia neonatal em cavalos, pieuropneumaonia em porcos e pneumonia em animais não-humanos. Tais compostos podem restaurar ou modular a função de neutrófilos no animal.

[00019] A família do supergene do hormônio do crescimento (GH) (Bazan, F. Immunology Today 11: 350 - 354 (1991); Mott, H. R. e Campbell, I. D. Current Opinion in Structural Biology 5:114 - 121 (1995); Silvennoinen, O. e IhIe, J. N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS) representa um conjunto de proteínas com características estruturais semelhantes. Cada membro desta família de proteínas compreende quatro feixes helicoidais. Embora haja ainda mais membros da família para serem identificados, alguns membros da família incluem o seguinte: hormônio do crescimento, prolactina, lactogênio da placenta, eritropoietina (EPO), trombopoietina (TPO), interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidade p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, fator neurotrófico ciliar, fator inibidor de leucemia, interferon alfa, interferon beta, interferon gama, interferon ômega, interferon tau, interferon epsilon, fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colônias de granulócitos- macrófagos e (GM-CSF), fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF) e cardiotrofina-1 (CT-1) ("a família de supergenes GH"). Os membros da família de supergenes GH têm estruturas secundárias e terciárias semelhantes, apesar do fato de que eles geralmente têm limitado a identidade de sequência de DNA e de aminoácidos. As características estruturais compartilhadas permitem que novos membros da família de genes sejam facilmente identificados. Polipeptídeos de quatro feixes helicoidais são descritos no WO 2005/074650 intitulado "Modified Human Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses" (Polipeptídeos de Quatro Feixes Helicoidais Humanos Modificados e seus Usos), que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.

[00020] Um membro da família de supergenes GH é o fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF). O fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF) é um dos vários fatores de crescimento de glicoproteínas conhecidos como fatores estimulantes de colônia (CSFs), porque eles suportam a proliferação de células progenitoras hematopoiéticas. O G-CSF estimula a proliferação de células precursoras específicas da medula óssea e sua diferenciação em granulócitos. É distinto de outros CSFs pela sua capacidade de estimular tanto a formação de colônias de granulócitos neutrofílicos em ágar semissólido quanto induzir a diferenciação terminal de células leucêmicas mielomonocíticas de murino in vitro. O fator estimulante de colônias de granulócitos é um forte estímulo para a proliferação e maturação de neutrófilos in vivo (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1987;84;2484-2488, veja também Heidari et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 2001; 81:45-57, aqui incorporado por referência). O G- CSF também é capaz de induzir a ativação funcional ou "iniciação" ou neutrófilos maduros in vitro (Weisbart, R. H., Gasson, C. G. e D. W. Golde. Annals of Internal Medicine 1989;110:297-303). O G-CSF demonstrou iniciar granulócitos humanos e intensificar a liberação de superóxido estimulada pelo peptídeo quimiotático, N-formil-metionil- leucil-fenalalanina (S. Kitagawa, et al., Biochem. Biophys. Res. C0 mMun. 1987; 144:1143-1146, e C. F. Nathan, Blood 1989; 74:301306), e ativar a fagocitose mediada por neutrófilos humanos IgA (Weisbart, R. H., et al., Nature 1988; 332: 647-649).

[00021] Os neutrófilos são um componente crítico dos mecanismos de defesa do hospedeiro contra infecções bacterianas e fúngicas. O G- CSF é capaz de induzir um aumento no número absoluto de neutrófilos circulantes e intensifica a função dos neutrófilos.

[00022] A clonagem e a expressão de cDNA de G-CSF recombinante humano (hG-CSF) foram descritas, e foi confirmado que o hG-CSF recombinante apresenta a maioria das, se não todas as, propriedades biológicas da molécula nativa (Souza, L. et al. Science 232,61-65(1986)). A análise da sequência dos clones de DNA genômico e cDNA permitiu a dedução da sequência de aminoácidos e divulga que a proteína tem uma extensão de 204 aminoácidos com uma sequência de sinal de 30 aminoácidos. A proteína madura tem extensão de 174 aminoácidos e não possui potenciais sítios de glicosilação N-ligados, mas vários sítios possíveis para a glicosilação O-ligados.

[00023] A clonagem e expressão de cDNA que codifica G-CSF humano foi descrita por dois grupos (Nagata, S. et al., Nature 319, 415-418 (1986); Souza, L. M. et al., Science 232, 61-65 (1986)). O primeiro relato de um clone de cDNA de G-CSF sugeriu que a proteína madura era de 177 aminoácidos de comprimento. Os autores relataram que também identificaram um clone de cDNA para o G-CSF que foi codificado para uma proteína que não tinha um trecho de três aminoácidos. Esta forma mais curta de cDNA de G-CSF expressa a atividade de G-CSF esperada. O segundo relato descreve uma sequência de DNA idêntica a esta forma curta e não faz nenhuma menção de outras variantes. Uma vez que estes autores constataram que o cDNA curto expressa G-CSF com o perfil esperado da atividade biológica, é provável que essa seja a forma importante de G-CSF e que a forma mais longa seja uma variante de splicing menor ou o resultado de um artefato de clonagem.

[00024] Matsumoto et al., em Infection and Immunity, vol. 55, No. 11, p. 2715 (1987) discutem o efeito protetor do G-CSF humano em infecções microbianas em camundongos neutropênicos.

[00025] As publicações de patentes a seguir referem-se ao G-CSF: o WO 8703689, que é incorporado aqui por referência, descreve hibridomas que produzem anticorpos monoclonais específicos para o G-CSF humano e seu uso na purificação do G-CSF; o WO 8702060, que é incorporado aqui por referência, divulga o G-CSF humano como polipeptídeos e métodos para produzi-los; a Pat US No. 4.810.643, que é incorporada aqui por referência, divulga o G-CSF humano como polipeptídeos, sequências que codificam os mesmos e métodos de sua produção, e o WO 8604605 e o WO 8604506, que são incorporados aqui por referência, divulgam um gene que codifica o G- CSF humano e inibidores de infecção contendo G-CSF humana. O isolamento do h-GCSF e a produção de G-CSF em células hospedeiras, tais como E. coli são descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos. 4.810.643, 4.999.291, 5.580.755 e 6.716.606, que são incorporados aqui por referência.

[00026] O G-CSF é uma proteína farmaceuticamente ativa que regula a proliferação, diferenciação e ativação funcional dos granulócitos neutrofílicos (Metcalf, Blood 67:257 (1986), Yan, et al. Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger, et al. Blood 81(11): 31583163 (1993); Roberts, et al., Expt'l Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben, et al. Blood 81 (7):1960-1967 (1993); Welte et al. PNAS-USA 82:1526-1530 (1985); Souza et al. Science 232: 61-65 (1986) e Gabrilove, J. Seminários in Hematology 26:2 1-14 (1989)). O G-CSF foi purificado à homogeneidade a partir de sobrenadantes de cultura de células da linhagem celular 5637 de carcinoma de bexiga humana (Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1526-30). A sequência de cDNA que codifica o hG-CSF nativo é conhecida de Souza et al. Science (1986) 232:61-65. Como consequência do splicing alternativo no segundo íntron, duas formas de ocorrência natural de hG-CSF existem com 204 ou 207 aminoácidos, dos quais os primeiros 30 representam um peptídeo sinal (Lynphokines, IRL Press, Oxford, Washington D. C., Editores D. Male e C. Rickwood). A proteína madura mostrou ter um peso molecular de aproximadamente 19 kDa e 5 resíduos de cisteína que podem formar pontes de dissulfeto intermoleculares ou intramoleculares. Os estudos de ligação demonstraram que o hG-CSF se liga a granulócitos neutrofílicos. Pouca ou nenhuma ligação é observada com eritróide, linhagens de células linfóides eosinofílicas, bem como com os macrófagos.

[00027] Em humanos, o G-CSF endógeno é detectável no plasma sanguíneo (Jones et al. Bailliere’s Clinical Hematology 2:183-111 (1989)). O hG-CSF é produzido por fibroblastos, macrófagos, células T, trofoblastos, células endoteliais e células epiteliais e é o produto da expressão de um gene de cópia única, constituído por quatro éxons e cinco íntrons localizados no cromossomo dezessete. A transcrição deste locus produz uma espécie de mRNA que é diferencialmente processada, resultando em duas formas de mRNA hG-CSF, uma versão que codifica uma proteína de 177 aminoácidos, o outro codifica uma proteína de 174 aminoácidos (Nagata et al. EMBO J 5: 575-581 (1986)), e a forma composta de 174 aminoácidos foi verificada ter a maior atividade biológica específica in vivo. O hG-CSF é uma espécie de reação cruzada, de modo que quando G-CSF humano é administrado a outro mamífero, tal como um camundongo, cão ou macaco, a leucocitose de neutrófilos sustentada é eliciada (Moore et al. PNAS-USA 84: 7134-7138 (1987)).

[00028] O G-CSF pode ser obtido e purificado a partir de várias fontes. O G-CSF (nHG-CSF) natural humano pode ser isolado dos sobrenadantes de culturas de linhagens de células tumorais humanas. O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, ver, por exemplo, Pat. US No. 4.810.643 (Souza) incorporada aqui por referência, possibilitou a produção de quantidades em escala comercial de G-CSF na forma glicosilada como um produto da expressão de células hospedeiras eucarióticas, e do G-CSF na forma não-glicosilada como um produto de expressão de células hospedeiras procarióticas.

[00029] O G-CSF foi verificado ser útil no tratamento de indicações, onde um aumento dos neutrófilos proporcionará benefícios. O G-CSF pode mobilizar células-tronco e precursoras de medula óssea e é usado para tratar pacientes cujos granulócitos foram destruídos pela quimioterapia, ou como um prelúdio para transplantes de medula óssea. Por exemplo, para pacientes com câncer, o G-CSF é benéfico como meio para estimular seletivamente a produção de neutrófilos para compensar os déficits hematopoiéticos resultantes da terapia com quimioterapia ou radioterapia. Outras indicações incluem o tratamento de várias doenças infecciosas e condições relacionadas, tais como sepse, que geralmente é causada por um metabólito de bactérias. O G-CSF é também útil individualmente, ou em combinação com outros compostos, tais como outras citocinas, para o crescimento ou a expansão de células em cultura, por exemplo, para transplantes de medula óssea,

[00030] O receptor de G-CSF (G-CSFR) é um membro da família de receptores do fator do crescimento/ citocina / hematopoiético, que inclui vários outros receptores de fatores de crescimento, tais como os receptores de interleucina (IL) -3,-4 e -6, o receptor de fator estimulante de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), o receptor de eritropoietina (EPO), assim como os receptores do hormônio do crescimento e de prolactina. Veja, Bazan, Proc. Natl. Acad. EUA Sci. 87: 6934-6938 (1990). Os membros da família de receptores de citocinas contêm quatro cisteínas conservadas e um motivo de triptofano-serina-X-triptofano-serina posicionado fora da região transmembrana. As sequências conservadas são consideradas estarem envolvidas em interações proteína-proteína. Ver, por exemplo, Chiba et al. Biochim. Biophys. Res. C0 mM. 184: 485-490 (1992). O receptor de G-CSF consiste de uma cadeia peptídica única com um peso molecular de cerca de 150 kD (Nicola, Immunol. Today, 8 (1987), p. 134).

[00031] O hG-CSF glicosilado foi comparado com o hG-CSF desglicosilado, preparado por digestão enzimática in vitro com neuraminidase e endo-α-N-acetilgalactosaminidase, no que diz respeito à sua estabilidade como uma função do pH e temperatura (Oh-eda et al, 1990, J. Biol Chem 265 (20):. 11432-35). O hG-CSF desglicosilado, dissolvido em uma concentração de 1 g μg/mL em tampão fosfato 20 mM contendo NaCl 0,2 M e Tween 20 a 0,01% foi rapidamente inativado dentro da faixa de pH de cerca de pH 7 a cerca de pH 8 após uma incubação de dois dias a 37°C. Em contraste, o hG- CSF glicosilado reteve mais de 80% de sua atividade nas mesmas condições. Além disso, a avaliação da estabilidade térmica de ambas as formas de hG-CSF, medidas pelo ensaio biológico e análise calorimétrica, indicou que o hG-CSF desglicosilado foi menos estável termicamente do que a forma nativa do hG-CSF.

[00032] Diversas abordagens foram tomadas a fim de proporcionar composições de G-CSF farmaceuticamente aceitáveis, estáveis. Uma abordagem para melhorar a estabilidade da composição do G-CSF envolve a síntese de derivados da proteína. A Patente US No. 5.665.863 divulga a formação de proteínas quiméricas recombinantes compreendendo o G-CSF acoplado com a albumina, que tem novas propriedades farmacocinéticas. A Patente US No. 5.824.784 e a Patente US No. 5.320.840, divulgam a ligação química de polímeros solúveis em água para proteínas a fim de melhorar a estabilidade e fornecer proteção contra a degradação proteolítica e, mais especificamente, moléculas de G-CSF modificadas de forma N- terminal carregando polímeros quimicamente ligados, incluindo o polietileno glicol.

[00033] As estruturas de uma série de citocinas, incluindo o G-CSF (Zink et al. FEBS Lett., 314:435 (1992); Zink et al;. Biochemistry 33:8453 (1994), Hill et al, Proc.. Natl, Acad. Sci. EUA 90:5167 (1993)), GM-CSF (Zink et al., FEBS Lett, 314:435(1992); Zink et al.; Biochemistry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. Natl, Acad. Sci. EUA 90:5167 (1993)), GM-CSF (Diederichs, K., et al. Science 154: 17791782 (1991); Walter et al., J. MoI. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992); McKay, D. B. Science 257: 412(1992)), IL-4 (Redfield et al., Biochemistry 30:11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)), e IL-5 (Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)) foram determinadas por difração de raios X e estudos de RMN e mostraram conservação notável com a estrutura de GH, apesar da falta de homologia de sequência primária significativa.

[00034] Uma abordagem alternativa para aumentar a estabilidade do G-CSF em composições envolve a alteração de sequência de aminoácidos da proteína. A Patente US No. 5.416.195 divulga análogos de G-CSF projetados geneticamente tendo estabilidade de composição melhorada, em que o resíduo de cisteína, normalmente encontrado na posição 17 da cadeia polipeptídica madura, o resíduo de ácido aspártico encontrado na posição 27, e pelo menos um dos resíduos de prolina em tandem encontrados nas posições 65 e 66, são todos substituídos por um resíduo de serina. A Patente US No. 5.773.581 divulga os análogos de G-CSF geneticamente projetados de G-CSF que foram covalentemente conjugados com um polímerosolúvel em água.

[00035] As várias formas de G-CSF humano, incluindo a sua preparação e purificação, úteis em um método para tratar ou prevenir a mastite são descritos em detalhes na Patente US No. 4.810.643, que é aqui incorporada por referência. A Patente US No. 4.810.643 descreve e reivindica novos segmentos de genes, plasmídeos recombinantes biologicamente funcionais e vetores de DNA viral e células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, que contêm um gene de G-CSF ou uma variante geneticamente modificada de um gene de G-CSF. As células hospedeiras expressam o G-CSF biologicamente ativo ou uma variante geneticamente projetada de G-CSF. A Patente US No. 5.849.883 e o WO 89/10932 descrevem vários estudos com o G-CSF humano em gados. Os estudos foram realizados e avaliaram as doenças respiratórias (Pasteurella hemolytica), as respostas às provocações bacterianas (Klebsiella pneumonia) ou mastite de coliformes (E. coli) em gados.

[00036] A Patente US No. 5.849.883, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, apresenta a sequência de polinucleotídeos e polipeptídeos de G-CSF bovino maduro (bG-CSF), e descreve os métodos para clonar, isolar e purificar o polipeptídeo e análogos do mesmo. O b-GCSF maduro é de 174 aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO: 1) que possui 82% de homologia com o hG-CSF. Um polipeptídeo de bG-CSF com um resíduo de aminoácido inicial de metionina é mostrada como SEQ ID NO: 2. A sequência de polinucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 1 é mostrada como a SEQ ID NO: 3. A sequência de polinucleotídeo que codifica a SEQ ID NO: 2 é mostrada como SEQ ID NO: 4. Heidari et al. descrevem a expressão, purificação e atividades biológicas do bG-CSF emVeterinary Immunology and Immunopathology (2001) 81 :45-57.

[00037] A fixação covalente do polímero de poli(etileno glicol) hidrofílico, abreviado como PEG, é um método para aumentar a solubilidade em água, a biodisponibilidade, aumentar a meia-vida sérica, aumentar a meia-vida terapêutica, modular a imunogenicidade, modular a atividade biológica, ou prolongar o tempo de circulação de muitas moléculas biologicamente ativas, incluindo proteínas, peptídeos e moléculas particularmente hidrofóbicas. O PEG tem sido amplamente usado na indústria farmacêutica, em implantes artificiais, e em outras aplicações onde a biocompatibilidade, a ausência de toxicidade e a ausência de imunogenicidade são importantes. A fim de maximizar as propriedades desejadas do PEG, o peso molecular total e o estado de hidratação do polímero PEG ou polímeros fixos à molécula biologicamente ativa devem ser suficientemente elevados para proporcionar as características vantajosas tipicamente associadas com as fixações do polímero PEG, tais como maior solubilidade em água e meia-vida de circulação, embora não impactando adversamente a bioatividade da molécula de origem.

[00038] Os derivados de PEG são frequentemente ligados às moléculas biologicamente ativas através de funcionalidades químicas reativas, como a lisina, cisteína e resíduos de histidina, os grupamentos N-terminais e carboidratos. Proteínas e outras moléculas têm frequentemente, um número limitado de sítios reativos disponíveis para ligação de polímeros. Muitas vezes, os locais mais apropriados para a modificação através de penhora de polímero desempenhar um papel importante na ligação ao receptor, e que são necessárias para a manutenção da atividade biológica da molécula. Como resultado, a fixação indiscriminada de cadeias poliméricas para tais sítios reativos em uma molécula biologicamente ativa muitas vezes leva a uma redução significativa ou mesmo a perda total da atividade biológica da molécula de polímero modificada. R. Clark et al. (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977. Para formar conjugados tendo peso molecular de polímeros suficiente para proporcionar vantagens para uma molécula alvo, as abordagens do estado da técnica tipicamente envolveram a fixação aleatória de numerosos braços de polímeros à molécula, desse modo aumentando o risco de uma redução ou mesmo a perda total da bioatividade da molécula de origem.

[00039] Os sítios reativos que formam o lócus para a fixação dos derivados de PEG às proteínas são ditados pela estrutura da proteína. As proteínas, incluindo enzimas, são compostas de várias sequências de alfa-aminoácidos, que têm a estrutura geral H2N-CHR-COOH. O grupamento alfa amino (H2N--) de um aminoácido se une ao grupamento carboxila (-COOH) de um aminoácido adjacente para formar ligações amida, que podem ser representadas como -- (NH-- CHR--CO)n--, em que o índice "n" pode ser igual a centenas ou milhares. O fragmento representado por R pode conter sítios reativos para a atividade biológica da proteína e para a fixação de derivados de PEG.

[00040] Por exemplo, no caso do aminoácido lisina, existe um grupamento --NH2 na posição epsilon, bem como na posição alfa. O NH2--epsilon é livre para a reação em condições de pH básico. Grande parte da arte no campo da derivatização de proteínas com PEG foi direcionada ao desenvolvimento de derivados de PEG para a fixação ao grupamento NH2--epsilon de resíduos de lisina presentes nas proteínas. "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGuilação", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Todos estes derivados de PEG, no entanto, têm a limitação comum de que não podem ser instalados seletivamente entre os numerosos resíduos de lisina muitas vezes presentes na superfície das proteínas. Esta pode ser uma limitação significativa nos casos em que um resíduo de lisina é importante para a atividade da proteína, existente em um sítio ativo da enzima, por exemplo, ou nos casos em que um resíduo de lisina desempenha um papel na mediação da interação da proteína com outras moléculas biológicas, como no caso dos sítios de ligação ao receptor.

[00041] Uma segunda e de igual importância complicação dos métodos existentes para a PEGuilação da proteína é que os derivativos de PEG podem sofrer reações colaterais indesejáveis com outros resíduos diferentes daqueles desejados. A histidina contém um grupamento de imino reativo, representado estruturalmente como -- N(H)--, mas muitas espécies quimicamente reativas que reagem com NH2--épsilon também podem reagir com --N(H)--. Da mesma forma, a cadeia lateral do aminoácido cisteína apresentra um grupo sulfidrila livre, representado estruturalmente como -SH. Em alguns casos, os derivados de PEG direcionados ao grupo -NH2--epsilon de lisina também reagem com cisteína, histidina ou outros resíduos. Isso pode criar misturas heterogêneas de moléculas bioativas derivadas de PEG- complexas, e o risco de destruir a atividade da molécula bioativa que é alvo. Seria desejável desenvolver derivados de PEG que permitem que um grupo funcional químico seja introduzido em um único sítio dentro da proteína que possibilitaria então o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros de PEG à molécula bioativa em sítios específicos na superfície da proteína que são ambas bem definidas e previsíveis.

[00042] Além dos resíduos de lisina, um esforço considerável na arte tem sido direcionado para o desenvolvimento de reagentes de PEG ativado que têm como alvo outras cadeias laterais de aminoácidos, incluindo cisteína, histidina, e os N-terminais. Ver, por exemplo, Patente US No. 6.610.281, que é incorporada aqui por referência e "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGuilação", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Um resíduo de cisteína pode ser introduzido seletivamente ao sítio na estrutura de proteínas usando mutagêneses sítio-dirigidas e outras técnicas conhecidas na arte, e o grupamento sulfidril livre resultante pode ser reagido com os derivados de PEG que apresentam os grupos funcionais reativos de tiol-. Esta abordagem é complicada, no entanto, pelo fato de que a introdução de um grupo sulfidril livre pode complicar a expressão, o dobramento e a estabilidade da proteína resultante. Desse modo, seria desejável dispor de meios para introduzir um grupo funcional químico em moléculas bioativas que permite o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros de PEG à proteína, enquanto sendo ao mesmo tempo compatível com (ou seja, não participando de reações colaterais indesejáveis) grupos funcionais químicos de sulfidril e outros normalmente encontrados em proteínas.

[00043] Como pode ser visto a partir de uma amostra da arte, muitos destes derivados que foram desenvolvidos para fixação das cadeias laterais das proteínas, em particular, o grupamento --NH2 na cadeia lateral dos aminoácidos lisina e o grupamento -SH na cadeia lateral da cisteína, têm se mostrado problemáticos em sua síntese e uso. Alguns formam ligações instáveis com a proteína que estão sujeitas à hidrólise e, portanto, decompõem, degradam ou são instáveis em ambientes aquosos, tais como na corrente sanguínea. Alguns formam ligações mais estáveis, mas estão sujeitos à hidrólise antes da ligação ser formada, o que significa que o grupo reativo nos derivados de PEG podem ser inativados antes que a proteína possa ser fixa. Alguns são um pouco tóxicos e, portanto, são menos adequados para uso in vivo. Alguns são muito lentos para reagir para serem praticamente úteis. Alguns resultam em uma perda de atividade da proteína pela fixação aos sítios responsáveis pela atividade da proteína. Alguns não são específicos nos sítios para os quais irão se fixar, o que também pode resultar em uma perda de atividade desejável e na falta de reprodutibilidade dos resultados. A fim de superar os desafios associados com as modificações das proteínas com grupamentos de poli (etileno glicol), foram desenvolvidos os derivativos de PEG que são mais estáveis (por exemplo, Patente US 6.602.498, que é incorporada aqui por referência), ou que reagem seletivamente com grupamentos de tiol em moléculas e superfícies (por exemplo, Patente US 6.610.281, que é incorporada aqui por referência). Há claramente uma necessidade de arte por derivativos de PEG que sejam quimicamente inertes em ambientes fisiológicos até serem chamados para reagir seletivamente para formar ligações químicas estáveis.

[00044] O uso de conjugados de hidroxialquil amido e, em particular, o uso de hidróxietil amido (HES), ligado covalentemente a um polipeptídeo foi divulgado, a fim de alterar potencialmente a imunogenicidade do polipeptídeo e/ou de alergenicidade. A HESilação é uma tecnologia alternativa que foi divulgada em uma série de pedidos de patentes designados por Fresenius Kabi AB incluindo as Publicações de Patentes dos US números 20050063943, 20060121073,20010100163,20050234230,20050238723, 20060019877, 20070134197, 20070087961, bem como a patente US número 7.285.661, todos os quais sendo incorporados aqui por referência. O HES é um polímero natural modificado que foi usado clinicamente como um expansor de volume plasmático e a HESilação representa a tecnologia de acoplamento de substâncias de fármacos com derivativos de HES a fim de modificar as características do fármaco, tais como a farmacocinética ou solubilidade em água. Isso também inclui o prolongamento da circulação plasmática de proteínas por meio de uma estabilidade aumentada da molécula e uma depuração renal reduzida, resultando em uma atividade biológica aumentada. Além disso, a imunogenicidade ou alergenicidade pode ser reduzida. Pela variação de diferentes parâmetros, tais como o peso molecular do HES, uma ampla faixa de conjugados de HES pode ser customizada. No entanto, o hidroxietil amido compartilha uma desvantagem comum com todos os outros polímeros atualmente disponíveis: sua polidispersidade. Os conjugados poliméricos são uma mistura de moléculas tendo pesos moleculares distribuídos em torno de um valor médio. Esta falta de homogeneidade resulta em um baixo nível de caracterização química e bioquímica e poderia impedir o componente farmaceuticamente ativo de alcançar seu sítio de ação (enzima, receptor, etc.). Nestes casos, o fármaco a ser ativo requer a sua distribuição na forma não conjugada original e, desse modo, a clivagem do polímero pelas reações metabólicas é necessária para sua eficácia farmacêutica.

[00045] Recentemente, uma tecnologia totalmente nova para a ciência da proteína foi relatada, a qual promete superar muitas das limitações associadas com as modificações sítio-específicas de proteínas. Especificamente, os novos componentes foram adicionados ao maquinário biossintético de proteínas do procarionte Escherichia coli (E. coll) (por exemplo, L. Wang, et al., (2001), Science 292:498500) e o eucarionte Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (por exemplo, J. Chin et al. Science 301:964-7 (2003)), que possibilitou a incorporação de aminoácidos não-geneticamente codificados às proteínas in vivo. Vários novos aminoácidos com novas propriedades químicas, físicas ou biológicas, incluindo marcações de fotoafinidade, aminoácidos fotoisomerizáveis, aminoácidos de fotoreticulação (ver, por exemplo, Chin, J. W., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99:11020-11024; e Chin, J. W. et al. (2002), J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027), ceto aminoácidos, átomo pesado contendo aminoácidos e aminoácidos glicosilados foram incorporados de forma eficiente e com alta afinidade a proteínas em E. coli e a leveduras em resposta ao códon âmbar, TAG, usando esta metodologia. Ver, por exemplo, Chin J. W. et al. (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027;. J. W. Chin; & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3 (11):1135-1137; J. W. Chin et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024 e L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. C0 mM., 1:1-11. Todas as referências são incorporadas aqui por referência na sua totalidade. Estes estudos demonstraram que é possível introduzir seletivamente e rotineiramente grupos funcionais químicos, tais como grupos cetonas, grupos alquinos e grupamentos azida, que não são encontrados nas proteínas, que são quimicamente inertes para todos os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns, e que podem ser usados para reagir eficientemente e seletivamente para formar ligações covalentes estáveis.

[00046] A capacidade de incorporar aminoácidos não geneticamente codificados em proteínas permite a introdução de grupos funcionais químicos que poderiam fornecer alternativas valiosas para os grupos funcionais que ocorrem naturalmente, tais como o NH2-epsilon de lisina, o sulfidrila- SH de cisteína, o grupo imino de histidina, etc.. Certos grupos químicos funcionais são conhecidos por serem inertes para os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns, mas reagem de forma limpa e eficiente para formar ligações estáveis. Os grupos azida e acetileno, por exemplo, são conhecidos na arte por passarem por uma reação de cicloadição de Huisgen [3+2] em condições aquosas na presença de uma quantidade catalítica de cobre. Veja, por exemplo, Tornoe, et al. (2002), J. Org. Chem, 67:3057-3064; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Pela introdução de um grupamento de azida em uma estrutura de proteína, por exemplo, é possível incorporar um grupo funcional que é quimicamente inerte aos grupos aminas, sulfidrilas, ácidos carboxílicos e hidroxilas encontrados nas proteínas, mas que também reagem de forma suave e eficiente com um grupamento de acetileno para formar um produto de cicloadição. Notavelmente, na ausência do grupamento de acetileno, a azida permanece quimicamente inerte e não reativa na presença de outras cadeias laterais de proteínas e em condições fisiológicas.

[00047] A presente invenção trata, entre outras coisas, dos problemas associados com a atividade e a produção de polipeptídeos de bG-CSF, e também trata da produção de um polipeptídeo de bG- CSF com melhores propriedades biológicas ou farmacológicas e/ou meia-vida terapêutica melhorada.

Resumo da invenção

[00048] Esta invenção fornece polipeptídeos de bG-CSF que compreendem um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural.

[00049] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma ou mais modificações pós-translacionais. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF é ligado a um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF é ligado a um polímero bifuncional, ligante bifuncional, ou pelo menos um polipeptídeo de bG- CSF adicional.

[00050] Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural é ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um grupamento de poli (etileno glicol). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural é ligado ao polímero solúvel em água com um ligante ou é ligado ao polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, a molécula de poli (etileno glicol) é um polímero bifuncional. Em algumas modalidades, o polímero bifuncional é ligado a um segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo de bG-CSF.

[00051] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende pelo menos dois aminoácidos ligados a um polímero solúvel em água compreendendo um grupamento de poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, pelo menos um aminoácido é um aminoácido codificado de forma não natural.

[00052] Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições no bG-CSF: antes da posição 1 (ou seja, no N- terminal), 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24,25,26, 27,28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42,43,44, 45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ,55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 , 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG- CSF).

[00053] Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ NO ID: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação dos mesmos da SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 62, 133, e uma combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados na posição 62 do bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados na posição 133 do bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos naturais. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados em uma sequência de líder ou de sinal que é N ou C terminal da SEQ ID NO: 1, 2, ou outras sequências de bG-CSF.

[00054] Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não limitado, as posições: antes da posição 1 (ou seja, no N-terminal) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134, 135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147, 148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160, 161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173, 174,175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO:2 ou aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF).

[00055] Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não limitado, as posições 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado, as posições: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado, as posições: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a, 62,133, e uma combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural na posição 62 é ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural na posição 133 é ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural na sequência sinal ou líder N ou C terminal das SEQ ID NOs: 1, 2, ou uma outra sequência de bG-CSF é ligada a um polímero solúvel em água.

[00056] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a afinidade do polipeptídeo de bG-CSF para um receptor ou parceiro de ligação incluindo, mas não limitado a uma proteína, polipeptídeo, molécula pequena, ou ácidos nucléicos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a estabilidade do polipeptídeo de bG-CSF, quando comparado com a estabilidade do bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. A estabilidade e/ou solubilidade pode ser medida usando uma série de ensaios diferentes conhecidos por aqueles com habilidades comuns na arte. Tais ensaios incluem, mas não estão limitados a, SE-HPLC e RP-HPLC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a imunogenicidade do polipeptídeo de bG-CSF quando comparado com a imunogenicidade do bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a meia-vida sérica ou o tempo de circulação do polipeptídeo de bG-CSF quando comparado com a meia vida sérica ou o tempo de circulação do bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção.

[00057] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a solubilidade aquosa do polipeptídeo de bG-CSF quando comparada à solubilidade aquosa do bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a solubilidade do polipeptídeo de bG-CSF produzido em uma célula hospedeira quando comparada com a solubilidade do bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a expressão do polipeptídeo de bG-CSF em uma célula hospedeira ou aumenta a síntese in vitro, quando comparada com a expressão ou a síntese do bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. O polipeptídeo de bG-CSF que compreende esta substituição mantém a atividade agonista e mantém ou melhora os níveis de expressão em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a resistência da protease do polipeptídeo de bG-CSF quando comparada com a resistência da protease do bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a atividade de transdução de sinal do receptor, quando comparado com a atividade do receptor na interação com o polipeptídeo de bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que modula sua ligação a uma outra molécula, tal como um receptor quando comparado com a ligação do polipeptídeo de bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a hematopoiese em comparação com a hematopoiese do polipeptídeo de bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a proliferação de neutrófilos em comparação com a proliferação de neutrófilos do polipeptídeo de bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG -CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a maturação dos neutrófilos em comparação com a maturação dos neutrófilos do polipeptídeo de bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção.

[00058] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a compatibilidade do polipeptídeo de bG-CSF com conservantes farmacêuticos (por exemplo, m-cresol, fenol, álcool benzílico) em comparação com a compatibilidade do bG-CSF correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Esta compatibilidade aumentada possibilita a preparação de uma formulação farmacêutica conservada que mantém as propriedades físico-químicas e a atividade biológica das proteínas durante o armazenamento.

[00059] Em algumas modalidades, uma ou mais ligações projetadas são criadas com um ou mais aminoácidos não naturais. A ligação intramolecular pode ser criada de várias maneiras incluindo, mas não limitada a uma reação entre dois aminoácidos da proteína em condições adequadas (um ou ambos os aminoácidos podem ser um aminoácido não natural); uma reação com dois aminoácidos, cada um dos quais pode ser naturalmente codificado ou codificado de forma não natural, com um ligante, um polímero, ou outra molécula em condições adequadas; etc.

[00060] Em algumas modalidades, um ou mais substituições de aminoácidos no polipeptídeo de bG-CSF podem ser com um ou mais aminoácidos que ocorrem de forma natural ou que ocorrem de forma não natural. Em algumas modalidades as substituições de aminoácidos no polipeptídeo de bG-CSF podem ser com aminoácidos que ocorrem de forma natural ou que ocorrem de forma não natural, contanto que pelo menos uma substituição seja com um aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos no polipeptídeo de bG-CSF podem ser com um ou mais aminoácidos que ocorrem de forma natural e, adicionalmente, pelo menos uma substituição é com um aminoácido codificado de forma não natural.

[00061] Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonil, um grupo acetil, um grupo amino-oxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alquino.

[00062] Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonil. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural tem a estrutura:

em que n é 0 - 10, R1 é um alquil, aril, alquil substituído ou aril substituído; R2 é H, um alquil, aril, alquil substituído e aril substituído; R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação amino terminal e R4 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação carbóxi terminal.

[00063] Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo amino-oxi. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo hidrazida. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo hidrazina. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo semicarbazida.

[00064] Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo azida. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural tem a seguinte estrutura:

em que n é 0 - 10; Ri é um alquil, aril, alquil substituído, aril substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 - 10; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação amino terminal, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação caxbóxi terminal.

[00065] Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo alquino. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural tem a seguinte estrutura:

em que n é 0 - 10; R1 é um alquil, aril, alquil substituído, ou aril substituído; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 - 10; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação amino terminal, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação carbóxi terminal.

[00066] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um agonista de polipeptídeodebG-CSF,agonistaparcial,antagonista,antagonista parcial ou agonista inverso. Em algumas modalidades, o agonista de polipeptídeodebG-CSF,agonistaparcial,antagonista,antagonista parcial ou agonista inverso compreende um aminoácido codificado de forma não natural ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um grupamento de poli (etileno glicol). Em algumas modalidades, o agonista de polipeptídeo de bG-CSF, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso compreende um aminoácido codificado de forma não natural e uma ou mais modificações pós- translacionais, ligantes, polímeros ou moléculas biologicamente ativas.

[00067] A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas para as SEQ ID NOs: 3, 4 ou ácidos nucléicos que codificam polinucleotídeos das SEQ ID NOs: 1, 2. A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados que compreendem um polinucleotídeo que se hibridiza mediante condições rigorosas para as SEQ ID NOs: 3, 4 ou polinucleotídeos que se hibridizam mediante condições rigorosas para polinucleotídeos que codificam polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs: 1, 2 em que o polinucleotídeo compreende pelo menos um códon seletor. A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados que compreendem um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos mostrados como as SEQ ID NOs: 1, 2. A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados que compreendem um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos mostrados como SEQ ID NOs: 1, 2 com um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural. É facilmente perceptível para aqueles que possuem habilidades comuns na arte que uma série de polinucleotídeos diferentes pode codificar qualquer polipeptídeo da presente invenção.

[00068] Em algumas modalidades, o códon seletor é selecionado do grupo que consiste em um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon único, um códon raro, um códon de cinco bases e um códon de quatro bases.

[00069] A presente invenção também fornece métodos para preparar um polipeptídeo de bG-CSF ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o método compreende contatar um polipeptídeo de bG-CSF isolado compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural com um polímero solúvel em água que compreende um grupamento que reage com o aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipeptídeo de bG- CSF é reativo em relação a um polímero solúvel em água que é, de outra forma, reativo em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipeptídeo de bG-CSF é reativo em relação a um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa que é, de outra forma, reativa em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns.

[00070] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF ligado ao polímero solúvel em água é preparado pela reação de um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido contendo carbonil com uma molécula de poli (etileno glicol) que compreende um grupo amino-oxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o grupo amino-oxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida é ligado à molécula de poli (etileno glicol) por meio de uma ligação de amida. Em algumas modalidades, o grupo amino-oxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida é ligado à molécula de poli (etileno glicol) por meio de uma ligação de carbamato.

[00071] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF ligado ao polímero solúvel em água é preparado pela reação de uma molécula de poli (etileno glicol) compreendendo um grupo carbonil com um polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural que compreende um grupo amino-oxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida.

[00072] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF ligado ao polímero solúvel em água é preparado pela reação de um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido contendo alquino com uma molécula de poli (etileno glicol) que compreende um grupamento de azida. Em algumas modalidades, o grupo azida ou alquino é ligado à molécula de poli (etileno glicol) por meio de umaligação amida.

[00073] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF ligados ao polímero solúvel em água é preparado pela reação de um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um ácido azida contendo amino com um poli (etileno glicol) que compreende uma molécula de alquino metade. Em algumas modalidades, o grupo azida ou alquino está ligado à molécula (etileno glicol), poli por meio de uma ligação de amida.

[00074] Em algumas modalidades, a molécula de poli (etileno glicol) tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli (etileno glicol) tem um peso molecular entre 0,1 kDa e 50 kDa.

[00075] Em algumas modalidades, a molécula de poli (etileno glicol) é um polímero ramificado. Em algumas modalidades, cada ramificação do polímero ramificado de poli (etileno glicol) tem um peso molecular de entre 1 kDa e 100 kDa, ou entre 1 kDa e 50 kDa.

[00076] Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água ligado ao polipeptídeo de bG-CSF compreende um grupamento de polialquileno glicol. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipeptídeo de bG-CSF compreende um grupo carbonil, um grupo amino-oxi, um grupo hidrazida, uma hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alquino. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipeptídeo de bG-CSF compreende um grupamento carbonil e o polímero solúvel em água compreende um grupamento amino-oxi, hidrazida, hidrazina, ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácidos codificado de forma não natural incorporado no polipeptídeo de bG-CSF compreende um grupamento alquino e o polímero solúvel em água compreende um grupamento azida. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipeptídeo de bG- CSF compreende um grupamento azida e o polímero solúvel em água compreende um grupamento alquino.

[00077] A presente invenção também fornece composições que compreendem um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural é ligado a um polímero solúvel em água.

[00078] A presente invenção também fornece células que compreendem um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de bG- CSF compreendendo um códon seletor. Em algumas modalidades, as células compreendem um RNA sintetase ortogonal e/ou um tRNA ortogonal para substituição de um aminoácido codificado de forma não natural no polipeptídeo de bG-CSF.

[00079] A presente invenção também fornece métodos para preparar um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a cultura de células que compreendem um polinucleotídeo ou polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de bG- CSF, um RNA sintetase ortogonal e/ou um tRNA ortogonal em condições que permitam a expressão do polipeptídeo de bG-CSF; e a purificação do polipeptídeo de bG-CSF das células e/ou do meio de cultura.

[00080] A presente invenção também fornece métodos para aumentar a meia-vida terapêutica, a meia-vida sérica ou o tempo de circulação de polipeptídeos de bG-CSF. A presente invenção também fornece métodos para modular a imunogenicidade de polipeptídeos de bG-CSF. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a substituição de um aminoácido codificado de forma não natural para qualquer de um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente em polipeptídeos de bG-CSF e/ou a ligação do polipeptídeo de bG-CSF a um ligante, um polímero, um polímero solúvel em água, ou uma molécula biologicamente ativa.

[00081] A presente invenção também fornece métodos para o tratamento de um paciente com necessidade de tal tratamento com uma quantidade eficaz de uma molécula de bG-CSF da presente invenção. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo de bG-CSF que compreende um aminoácido codificado de forma não natural e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural é ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF é glicosilado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF não é glicosilado.

[00082] A presente invenção também fornece polipeptídeos de bG- CSF que compreendem uma sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 2 ou qualquer outra sequência de polipeptídeo de bG-CSF, exceto que, pelo menos um aminoácido é substituído por um aminoácido codificado de forma não natural. A presente invenção também fornece polipeptídeos de bG-CSF compreendendo uma sequência mostrada como SEQ ID NOs: 1, 2. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural é ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um grupamento de poli (etileno glicol). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonil, um grupo amino-oxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alquino.

[00083] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 2, ou qualquer outra sequência de polipeptídeo de bG-CSF, em que pelo menos um aminoácido é substituído por um aminoácido codificado de forma não natural. A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo de bG-CSF que compreende a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 2. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupamento de polissacarídeo. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água é ligado ao polipeptídeo por meio de um grupamento de polissacarídeo. Em algumas modalidades, um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa é ligada ao polipeptídeo de bG-CSF por meio de um grupamento de polissacarídeo.

[00084] A presente invenção também fornece um polipeptídeo de bG-CSF que compreende um polímero solúvel em água ligado por uma ligação covalente ao polipeptídeo de bG-CSF em um único aminoácido. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende um grupamento de poli (etileno glicol). Em algumas modalidades, o aminoácido ligado de forma covalente ao polímero solúvel em água é um aminoácido codificado de forma não natural presente no polipeptídeo.

[00085] Em algumas modalidades da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF que compreende um HES ligado por uma ligação covalente ao polipeptídeo de bG-CSF é ligado a um aminoácido único. Em algumas modalidades, o aminoácido único ligado de forma covalente ao HES é um aminoácido codificado de forma não natural presente no polipeptídeo. Em algumas modalidades da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreende múltiplos aminoácidos codificados de forma não natural que podem estar ligados a múltiplas moléculas de HES e/ou de PEG.

[00086] A presente invenção fornece um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo pelo menos um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa, em que o referido ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa é fixa ao polipeptídeo por meio de um grupo funcional de um aminoácido codificado de forma não natural incorporado ribossomolmente no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é monoPEGuilado. A presente invenção também fornece um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa que é fixa a um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural em que o referido aminoácido codificado de forma não natural é incorporado ribossomolmente no polipeptídeo em sítios pré-selecionados.

[00087] Incluído no âmbito desta invenção está a sequência de sinal ou líder de bG-CSF unida a uma região de codificação de bG- CSF, bem como uma sequência de sinais heterólogos unida a uma região de codificação de bG-CSF. A sequência de sinal ou líder heteróloga selecionada deve ser aquela que é reconhecida e processada, por exemplo, pelo sistema de secreção de células hospedeiras para secretar e, possivelmente, clivada por uma peptidase de sinal, pela célula hospedeira. Um método para o tratamento de uma condição ou distúrbio com o bG-CSF da presente invenção é destinado para implicar o tratamento com bG-CSF com ou sem um peptídeo sinal ou líder.

[00088] A presente invenção fornece um método para tratamento e prevenção das infecções nos animais. A presente invenção também fornece um método para tratamento e prevenção da mastite e febre de transporte em animais bovinos. A presente invenção também fornece um método para tratamento de infecções em animais, sem desenvolver resistência de cepas das bactérias. Além disso, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado e purificado com parte ou a totalidade da confirmação estrutural primária e uma ou mais das propriedades biológicas de G-CSF bovinos que ocorrem naturalmente, e de sequências de DNA que codificam esses G-CSF bovinos.

[00089] Em outra modalidade da invenção, um ou mais fatores estimulantes de colônias adicionais são administrados aos animais infectados com G-CSF, incluindo, mas não limitado a, GM-CSF, M- CSF e multi-CSF (IL-3). Os CFSs são administrados em conjunto ou separadamente. Em uma modalidade adicional, as infecções animais são tratadas pela administração de G-CSF, com um ou mais dos seguintes: os interferons incluindo, mas não limitado a α-interferon, IL2 e TNF, ou com antibióticos tradicionais incluindo, mas não limitados a, penicilinas, cefalosporinas e aminoglicosídeos.

[00090] Em outra modalidade, o tratamento com bG-CSF é usado de forma profilática. O bG-CSF pode ser usado como terapia profilática para aumentar a defesa do hospedeiro de animais que estão em risco de adquirir uma infecção por levedura, bacteriana ou fúngica. Por exemplo, o bG-CSF pode ser usado como terapia profilática em animais normais em risco de adquirir uma infecção incluindo, mas não limitado a pneumonia. O termo "normal" como aqui usado significa um animal que tem a função imune normal e contagem de células brancas do sangue normal e diferencial. Os gados são tratados profilaticamente antes do transporte ou outras ocorrências que possam debilitar o gado, a fim de impulsionar e iniciar a sua capacidade de combater infecções. A administração do bG-CSF pode ser feita no momento em que os gados são processados, ou seja, vacinados, marcados, etc.. O tratamento com bG-CSF também pode ser feito durante a terapia da vaca seca e/ou pouco antes de uma vaca dar a luz a fim de reduzir a probabilidade de infecções intrauterinas pós- parto, e de mastite durante os primeiros estágios da lactação. Veja Kehrli et al., Am. J. Vet. Res., 50, No.2, 207 (1989);. Oliver et al, J. Dairy Sci. 71:2584-2606 (1988), e Kehrli et al., J Dairy Sci. 74:43994412 (1991) para uma descrição da função dos neutrófilos de bovinos durante o período periparturiente. Convencionalmente, não existe um tratamento com antibióticos pouco antes do nascimento por causa de resíduos que aparecem no leite de vaca tornando-o impróprio para uso.

[00091] Em uma outra modalidade, a conjugação do polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um ou mais aminoácidos que ocorrem de forma não natural para uma outra molécula incluindo, mas não limitado a, PEG, fornece bG-CSF substancialmente purificado devido à reação química única usada para a conjugação com o aminoácido não natural. A conjugação de bG-CSF compreendendo um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural para uma outra molécula, como o PEG, pode ser realizada com outras técnicas de purificação realizadas antes ou após a etapa de conjugação para fornecer bG-CSF substancialmente puro.

Descrição Sumária dos Desenhos

[00092] Figura 1 - Um plasmídeo usado para a expressão de bG- CSF é mostrado.

[00093] Figura 2 - Detalhes sobre a linhagem de célula hospedeira usada para expressar o bG-CSF são mostrados.

[00094] Figura 3- A análise SDS PAGE da expressão dePolipeptídeos de bG-CSF da presente invenção é mostrada.

[00095] Figura 4 - A análise SDS PAGE das frações de pico coluna CM FF do bG-CSF antes da PEGuilação é mostrada.

[00096] Figura 5 - A análise SDS-PAGE de SP HP frações coluna pico de BG-CSF-T133pAF PEGuilado é mostrada.

[00097] Figura 6 - A análise SDS-PAGE de b-GCSF antes e depois da PEGuilação é mostrada.

[00098] Figura 7a - A digestão de Tripsina / Glu-C do bG-CSF tipo selvagem (Detecção de 214 nm) é mostrada.

[00099] Figura 7b - A digestão de Tripsina / Glu-C do bG-CSF T133pAF (Detecção de 214nm) é mostrada.

[000100] Figura 8 - A digestão de Tripsina / Glu-C do bG-CSF do tipo selvagem (Detecção de 250 nm) é mostrada.

[000101]Figura 8b - A digestão de Tripsina / Glu-C do bG-CSF T133pAF (Detecção de 250 nm) é mostrada.

[000102]Figura 9a - A digestão de Glu-C do bG-CSF do tipo selvagem (Detecção de 214 nm) é mostrada.

[000103]Figura 9b- A digestão de Glu-C do bG-CSF T133pAF (Detecção de 214nm) é mostrada.

[000104]Figura 10a - A digestão de Glu-C do bG-CSF do tipo selvagem (Detecção de 250 nm) é mostrada.

[000105] Figura 10b - A digestão de Glu-C do bG-CSF T133pAF (Detecção de 250 nm) é mostrada.

[000106] Figura 11 - A análise de SEC-HPLC do polipeptídeo de bG- CSF PEGuilado é mostrada.

[000107] Figura 12 - A análise de SEC-HPLC do polipeptídeo de bG- CSF é mostrada.

[000108] Figura 13 - Os valores de EC50 de matérias-primas do ensaio de proliferação M-NFS60 de G-CSF T133pAF bovino PEGuilado a 20K e do tipo selvagem são mostrados.

[000109] Figura 14 - As diferenças de EC50 do dobramento no ensaio de proliferação de M-NFS60 de G-CSF T133pAF bovino PEGuilado a 20K vs tipo selvagem são mostrados.

[000110] Figura 15 - Resultados de um experimento analisando neutrófilos de bovinos coradas com o anticorpo CDlIb são mostrados.

[000111] Figura 16 - Resultados da PEGylated administração BG- CSF sobre a ANC são mostrados,

[000112] Figura 17 - Um gráfico de linha mostrando uma contagem absoluta de neutrófilos (média ± erro padrão) em bezerros tratados com formulação de tampão de bG-CSF PEGuilado após uma única injeção subcutânea de 40 μg / kg.

[000113] Figura 18 - Um gráfico de linha mostrando a produção de leite média diária das vacas do exemplo com 40 μg / kg.

[000114] Figura 19 - Um gráfico de barras que mostra as diferenças nas contagens de células somáticas nos dias 3, 5, 7 e 10 pós-parto de bezerros entre quatro grupos vacas, incluindo um grupo controle, grupo tratado diariamente com os bG-CSF não PEGuilados, um grupo injetado com 40 μg / kg de bG-CSF PEGuilado, e um grupo injetado com 20 μg / kg de bG-CSF PEGuilado.

Definições

[000115] É preciso entender que essa invenção não se limita à metodologia particular, protocolos, linhagens celulares, construções, e reagentes descritos neste documento e como tal pode variar. Também é preciso entender que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[000116] Como usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singular "um, uma", "uns umas", e "o, a, os, as" incluem a referência do plural a menos que o contexto indique claramente o contrário. Desse modo, por exemplo, a referência a um "bGCSF", "G-CSF bovino", "bG-CSF", "bG-CSF", "polipeptídeo de G- CSF bovino" ou "polipeptídeo de bG-CSF" e diversas formas com hifens e sem hífens é uma referência a uma ou mais dessas proteínas e inclui os equivalentes das mesmas dos conhecidos por aqueles versados na técnica, e semelhantes.

[000117] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como geralmente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual pertence esta invenção. Embora todos os métodos, aparelhos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da invenção, os métodos, aparelhos e materiais preferidos são agora descritos.

[000118] Todas as publicações e patentes mencionadas neste documento são incorporadas aqui por referência para o propósito de descrever e divulgar, por exemplo, as construções e as metodologias que são descritas nas publicações, que podem ser usadas em conexão com a invenção aqui descrita. As publicações aqui discutidas são fornecidas unicamente para a sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm o direito a anteceder tal divulgação, por força de invenção anterior ou por qualquer outra razão.

[000119] O termo "substancialmente purificado" se refere a um polipeptídeo de bG-CSF que pode ser substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a proteína, como encontrada em seu ambiente natural, ou seja, uma célula nativa, ou célula hospedeira no caso de polipeptídeos bG-CSF produzidos de forma recombinante. O polipeptídeo de bG-CSF que pode ser substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas que têm menos de cerca de 30%, menos do que cerca de 25%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% (em peso seco) da proteína de contaminação. Quando o polipeptídeo de bG-CSF ou variante do mesmo é produzido de forma recombinante por células hospedeiras, a proteína pode estar presente em cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, ou cerca de 1% ou menos do peso seco das células. Quando o polipeptídeo de bG-CSF ou variante do mesmo é produzido de forma recombinante por células hospedeiras, a proteína pode estar presente no meio de cultura em cerca de 5 g/L, cerca de 4g/L, cerca de 3 g/L, cerca de 2 g/L, cerca de 1 g/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 10 mg/L, ou cerca de 1 mg/L ou menos do peso seco das células. Sendo assim, o polipeptídeo de bG-CSF "substancialmente purificado" tal como são produzidos pelos métodos da presente invenção pode ter um grau de pureza de pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%,pelo menos cercade 65%, pelo menoscerca de 70%, especificamente, um grau de pureza de pelo menos cerca de 75%, 80%,85% e, mais especificamente , umgrau depureza de pelo menos cerca de 90%, umgrau de purezade pelomenos cerca de 95%,um grau de purezade pelo menoscerca de 99% ou maior, conforme determinado por métodos adequados, tais como análise de SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, e eletroforese capilar.

[000120] Uma "célula hospedeira recombinante" ou "célula hospedeira" se refere a uma célula que inclui um polinucleotídeo exógeno, independentemente do método usado para a inserção, por exemplo, a captação direta, transdução, pareamento-f, ou outros métodos conhecidos na arte de criar células hospedeiras recombinantes. Os polinucleotídeos exógenos podem ser mantidos como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo ou, alternativamente, podem ser integrados ao genoma do hospedeiro.

[000121] Como usado neste documento, o termo "meio" ou "meios" inclui qualquer meio de cultura, solução, sólido, semi-sólido, ou suporte rígido que pode suportar ou conter qualquer célula hospedeira, incluindo células hospedeiras de bactérias, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de insetos, células hospedeiras de plantas, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamíferos, células de CHO, células hospedeiras procarióticas, E. coli, ou células hospedeiras de Pseudomonas, e conteúdos de célula. Sendo assim, o termo pode englobar o meio no qual a célula hospedeira foi cultivada, por exemplo, meio no qual o polipeptídeo de bG-CSF foi secretado, incluindo o meio antes ou após a etapa de proliferação. O termo também pode englobar tampões ou reagentes que contêm lisados de células hospedeiras, tais como no caso em que o polipeptídeo de bG-CSF é produzido intracelularmente e as células são lisadas ou rompidas para liberar o polipeptídeo de bG-CSF.

[000122] O "agente redutor", tal como usado neste documento com respeito ao redobramento de proteínas, é definido como qualquer composto ou material que mantém grupos sulfidril no estado reduzido e reduz pontes de dissulfeto intra- ou intermoleculares. Os agentes redutores adequados incluem, mas não estão limitados a ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina, (2- aminoetanotiol), e glutationa reduzida. É facilmente perceptível para aqueles que possuem habilidades comuns na arte que uma ampla variedade de agentes redutores é adequada para uso nos métodos e composições da presente invenção.

[000123] O "agente oxidante", tal como usado aqui com respeito ao redobramento de proteínas, é definido como qualquer composto ou material que é capaz de remover um elétron de um composto que é oxidado. Os agentes oxidantes adequados incluem, mas não limitado a glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado e oxigênio. É facilmente perceptível para aqueles que possuem habilidades comuns na arte que uma ampla variedade de agentes oxidantes é adequada para uso nos métodos da presente invenção.

[000124] O "agente de desnaturação" ou "desnaturante", tal como usado aqui, é definido como qualquer composto ou material que venha a causar um desdobramento reversível de uma proteína. A força de um agente de desnaturação ou desnaturante será determinada pelas propriedades e concentração do agente de desnaturação particular ou desnaturante. Os agentes de desnaturação adequados ou desnaturantes podem ser caotrópicos, detergentes, solventes orgânicos, solventes miscíveis em água, fosfolipídios, ou uma combinação de dois ou mais desses agentes. Os caotrópicos apropriados incluem, mas não estão limitados a uréia, guanidina e tiocianato de sódio. Os detergentes úteis podem incluir, mas não estão limitados a, detergentes fortes, tais como dodecil sulfato de sódio, ou éteres de polioxietileno (por exemplo, Tween ou detergentes de Triton), Sarcosil suave, detergentes não iônicos (por exemplo, digitonina), detergentes catiônicos suaves, tais como N-2,3-(Dioleióxi)- propil-N,N,N-trimetiIamônio, detergentes iônicos suaves (por exemplo, colato de sódio ou desoxicolato de sódio) ou detergentes zwitteriônicos, incluindo mas não limitado a, sulfobetaínas (Zwittergente), sulfato de 3-(3-colamidopropil)dimetilamônio-1-propano (CHAPS) e 3-(3-colamidopropil)dimetilamônio-2-hidróxi-1-propano (CHAPSO). Os solventes orgânicos miscíveis em água, tais como acetonitrila, alcanóis inferiores (especialmente, alcanóis C2-C4, tais como o etanol ou isopropanol), ou alcandióis inferiores (especialmente, alcandióis C2-C4, tais como etileno glicol), podem ser usados como desnaturantes. Os fosfolipídeos úteis na presente invenção podem ser fosfolipídeos naturais, tais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol ou derivados de fosfolipídeo sintético ou variantes dos mesmos, tais como dihexanoilfosfatidilcolina ou diheptanoilfosfatidilcolina.

[000125] O termo "redobramento", tal como usado neste documento descreve qualquer processo de reação, ou método que transforma a ligação de dissulfeto contendo polipeptídeos de um estado indevidamente dobrado ou desdobrado para uma conformação devidamente dobrada ou nativa em relação às ligações de dissulfeto.

[000126] O termo "co-dobramento", tal como usado aqui, se refere especificamente a processos de redobramento, reações ou métodos que empregam pelo menos dois polipeptídeos que interagem uns com os outros e o resultado é a transformação de polipeptídeos dobrados indevidamente ou desdobrados para polipeptídeos dobrados devidamente, nativos.

[000127] Como usado aqui, "fator estimulante de colônias de granulócitos" ou "G-CSF" deve incluir os polipeptídeos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica do G-CSF (tal como as descritas nas Patentes US Nos. 6.716.606,6.689.351;6.565.841, 6.162.426,5.811.301,5.776.895;5.718.893,5.580.755,5.536.495, 5.202.117, 5.043.156, 4.999.291, 4.810.643 e 4.968.618 para hG-CSF, que são incorporadas aqui por referência), bem como análogos de G- CSF, isoformas de G-CSF, miméticos de G-CSF, fragmentos de G- CSF, proteínas de G-CSF híbrido, oligômeros de proteínas de fusão e multímeros, homólogos, variantes padrões de glicosilação e muteínas, independentemente da atividade biológica dos mesmos, e ainda, independentemente do método de síntese ou fabricação dos mesmos, incluindo mas não limitado a, métodos recombinantes (se produzidos a partir do cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou outras formas de ácido nucléico), sintéticos, transgênicos, e de genes ativados. Alguns exemplos específicos de G-CSF incluem, mas não estão limitados a, pegfilgrastim (NEULASTA®), filgrastim (NEUPOGEN®), análogo de G- CSF, mutantes de G-CSF, G-CSF glicosilado alterado, e PEG conjugado aos análogos de G-CSF. Exemplos específicos de linhagens celulares modificadas para a expressão de G-CSF humano endógeno são descritos em Devlin et al. J. Leukoc. Biol. 41:306 (1987); Patentes US No. 6.716.606, 6.379.661, 6.004.548, 5.830.705, 5.582.823, 4.810.643 e 6.242.218, que são incorporadas aqui por referência.

[000128] Como usado aqui, "fator estimulante de colônias de granulócitos bovinos", "G-CSF bovinos" ou "bG-CSF" deve incluir os polipeptídeos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica de bG-CSF, bem como análogos de bG-CSF, isoformas de bG-CSF, miméticos de bG-CSF, fragmentos de bG-CSF, proteínas de bG-CSF híbrido, oligômeros de proteínas de fusão e multímeros, homólogos, variantes de padrões de glicosilação e muteínas, independentemente da atividade biológica dos mesmos e ainda, independentemente do método de síntese ou fabricação do mesmo, incluindo mas não limitado a, métodos recombinantes (sejam produzidos a partir do cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou outras formas de ácido nucléico), sintéticos, transgênicos e de gene ativado. Exemplos específicos de G-CSF incluem, mas não estão limitados a mutantes de bG-CSF, G-CSF glicosilado alterado, e PEG conjugado aos análogos de G-CSF.

[000129] O termo "G-CSF bovino (bG-CSF)" ou "polipeptídeo de bG- CSF" se refere ao fator estimulante de colônia granulócitos bovino ou G-CSF, conforme descrito acima, bem como um polipeptídeo que retém pelo menos uma atividade biológica de bG-CSF de ocorrência natural. Os polipeptídeos de bG-CSF incluem a sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-fármacos e pró-fármacos dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativas e estereoisômeros de G-CSF bovinos que ocorrem naturalmente, bem como variantes agonistas, miméticos e antagonistas de G-CSF bovino de ocorrência natural e fusões de polipeptídeo dos mesmos. Exemplos de Polipeptídeos de bG-CSF e miméticos incluem aqueles descritos no WO 89/10932, Patentes US Nos. 5.849.883 e 6.497.869, que são incorporados aqui por referência na sua totalidade. Fusões compreendendo aminoácidos adicionais no amino terminal, carboxil terminal, ou ambos, são englobados pelo termo "polipeptídeo de bG-CSF". As fusões exemplares incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, metionil bG-CSF em que uma metionina é ligada ao N-terminal do bG-CSF (tal como o polipeptídeo na SEQ ID NO: 2) resultante da expressão recombinante da forma madura do bG-CSF, fusões para o propósito de purificação (incluindo mas não limitado a, poli-histidina ou epítopos de afinidade), fusões com peptídeos que se ligam à albumina sérica e fusões com proteínas séricas, tais como a albumina. As sequências de aminoácidos e ácidos nucléicos de bG-CSF de ocorrência natural para formas maduras ou de comprimento completo e as são conhecidas, na medida em que são variantes, tais como variantes de aminoácidos únicos e variantes de splicing. Para a sequência de aminoácido de bG-CSF maduros, bem como uma sequência de aminoácidos de metionil bG-CSF, vide a SEQ ID NO: 1 e a SEQ ID NO: 2, respectivamente, neste documento. As moléculas de ácido nucléico que codificam hG-CSF mutantes e polipeptídeos de hG-CSF mutante são bem conhecidas.

[000130] O fator estimulante de colônias granulócitos bovina ou bG- CSF tem uma variedade de atividades biológicas, incluindo mas não limitado a ligação ao seu receptor, causando a dimerização do seu receptor, a estimulação da produção de neutrófilos, e estimulação da proliferação e diferenciação celular. Exemplos de algumas das atividades biológicas de fator estimulante de colônias de granulócitos e hG-CSF estão descritos acima e nas Patentes US Nos. 6.676.947, 6.579.525,6.531.121,6.521.245,6.489.293,6.368.854,6.316.254, 6.268.336, 6.239.109, 6.165.283, 5.986.047, 5.830.851, 5.043.156 e 5.773.569, que são incorporadas aqui por referência.

[000131] Como usados neste documento "polipeptídeo de G-CSF bovino", "polipeptídeo de bG-CSF", "G-CFS bovino" ou "bG-CSF" e formas com hífen e sem hífen dos mesmos devem incluir os polipeptídeos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica de um CSF, análogos de bG-CSF, mutantes de bG-CSF, bG-CSF glicosilado alterado, PEG conjugado ao bG-CSF, isoformas de bG- CSF, miméticos de bG-CSF, fragmentos de bG-CSF, proteínas de bG- CSF híbrido, proteínas de fusão, oligômeros e multímeros, homólogos, variantes de padrões de glicosilação, variantes, variantes de splicing, e muteínas dos mesmos, independentemente da atividade biológica dos mesmos e ainda, independentemente do método de síntese ou fabricação do mesmo, incluindo mas não limitado a, métodos recombinantes (sejam produzidos a partir do cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou outras formas de ácidos nucléicos), in vitro, in vivo, por microinjeção de moléculas de ácidos nucléicos, sintéticos, transgênicos, e de genes ativados. O termo "polipeptídeo de G-CSF bovino", "polipeptídeo de bG-CSF", "G-CSF bovinos" ou "bG-CSF" englobam polipeptídeos de bG-CSF que compreendem uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Ver Patente US No. 5.849.883, que é incorporada aqui por referência para os análogos de G-CSF bovinos.

[000132] As substituições em uma ampla variedade de posições de aminoácidos no bG-CSF foram descritas. As substituições, incluindo mas não limitados, aquelas que modulam a estabilidade farmacêutica, aumentam a atividade agonista, aumentam a resistência de protease, convertem o polipeptídeo em um antagonista etc., e são englobadas pelos termos "polipeptídeo de bG-CSF", "polipeptídeo de G-CSF bovino", " G-CSF bovino", ou "bG-CSF".

[000133] Em um aspecto adicional, a invenção fornece ácidos nucléicos recombinantes que codificam as proteínas variantes, vetores de expressão contendo os ácidos nucléicos variantes, células hospedeiras compreendendo os ácidos nucléicos variantes e/ou vetores de expressão e métodos para a produção de proteínas variantes. Em um aspecto adicional, a invenção fornece o tratamento de uma infecção pela administração a um animal de uma proteína variante, geralmente com um carreador farmacêutico em uma quantidade terapeuticamente eficazes.

[000134] Os mutantes de bG-CSF discutidos na Patente US No. 5.849.883, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, incluem polipeptídeos designados com otimização de códons para E. coli e as proteínas híbridas geradas com sequência de G-CSF bovino e humano. A Patente US No. 5.416.195, que é incluída neste documento por referência na sua totalidade, descreve mutantes de hG-CSF nos quais pelo menos uma das seguintes substituições de aminoácidos foi feita (a numeração do aminoácido é em referência à proteína madura, por isso, onde uma metionina N-terminal está presente, está é designada posição -1 ou 0): Cys17 da sequência nativa substituída por um resíduo de Ser17, Asp27 da sequência nativa substituída por um resíduo de Ser27, Leu 15 da sequência nativa substituída por um resíduo de Glu15, Lys23 da sequência nativa substituída por um resíduo de Arg23, Gly28 da sequência nativa substituída por um resíduo de Ala28, Lys40 da sequência nativa substituída por um resíduo de Arg40, Pro44 da sequência nativa substituída por um resíduo de Ala44, Leu49 da sequência nativa substituída por um resíduo de Lys49, Gly55 da sequência nativa substituída por um resíduo de Ala55, Cys60 da sequência nativa substituída por um resíduo de Ser.60, Pro111 da sequência nativa substituída por um resíduo de Glu111, Thr115 da sequência nativa substituída por um resíduo de Ser115, e Tyr165 da sequência nativa substituída por um resíduo de Arg165. Muitos destes resíduos estão presentes na sequência de bG-CSF e uma ou mais destas substituições podem ser encontradas em um polipeptídeo de bG-CSF da invenção. Carter et al. Biologicals (2004) 32:37 descrevem hG-CSF mutante sem sítios de glicosilação. Mutações similares podem ser encontradas nos polipeptídeos de bG-CSF da invenção.

[000135] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF da invenção são substancialmente idênticos as SEQ ID NOs: 1, 2, ou qualquer outra sequência de um polipeptídeo de bG-CSF. As moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos de bG-CSF, incluindo mutantes e métodos para expressar e purificar polipeptídeos de bG-CSF são bem conhecidos.

[000136] O termo "polipeptídeo de bG-CSF" também inclui os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-fármacos e pró-fármacos dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativas e estereoisômeros de bG-CSF que ocorre naturalmente bem como variantes agonistas, miméticos, antagonistas de bG-CSF que ocorrem naturalmente e fusões de polipeptídeos dos mesmos. As fusões que compreendem aminoácidos adicionais no amino terminal, carboxil terminal, ou ambos, são englobadas pelo termo "polipeptídeo de bG-CSF." As fusões exemplar incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, metionil bG-CSF na que uma metionina é ligada ao N-terminal do bG-CSF resultante da expressão recombinante da forma madura do bG-CSF sem peptídeo ou porção líder ou do mesmo (a metionina é ligada ao N-terminal do bG-CSF resultante da expressão recombinante), fusões com o propósito de purificação (incluindo, mas não se limitando, aos epítopos de afinidade ou poli-histidina), fusões com peptídeos que se ligam a albumina sérica e fusões com as proteínas séricas, tais como a albumina sérica. A Patente US No. 5.750.373, que é incorporada aqui por referência, descreve um método para selecionar novas proteínas, tais como variantes de fragmentos de anticorpos e hormônios de crescimento e tendo propriedades de ligação alteradas para as suas respectivas moléculas receptoras. O método compreende fundir um gene que codifica uma proteína de interesse ao domínio carbóxi terminal da proteína de revestimento do gene III do fago filamentoso M13. As moléculas quiméricas compreendem bG-CSF e uma ou mais de outras moléculas. A molécula quimérica pode conter fragmentos ou regiões específicas de um ou de ambos os bG-CSF e outra(s) molécula(s). Qualquer um desses fragmentos pode ser preparado a partir das proteínas por métodos bioquímicos padrões, ou pela expressão de um polinucleotídeo que codifica o fragmento. O bG-CSF, ou um fragmento do mesmo, pode ser produzido como uma proteína de fusão que compreende albumina sérica humana (HSA), Fc, ou uma porção da mesma. Tais construções de fusão são adequadas para intensificar a expressão do bG-CSF, ou fragmentos do mesmo, em uma célula hospedeira eucariótica. As porções de HSA exemplares incluem o polipeptídeo N-terminal (aminoácidos 1-369,1-419, e comprimentos intermediários começando com um aminoácido), conforme divulgado na Patente US No. 5.766.883, e a publicação WO 97/24445, que são incorporadas aqui por referência. Outros polipeptídeos quiméricos podem incluir uma proteína de HSA com o bG-CSF ou fragmentos dos mesmos, fixos a cada uma das extremidades C-terminal e N-terminal do HSA. Outras fusões podem ser criadas pela fusão de bG-CSF com: a) porção de Fc de uma imunoglobulina,eb)um análogo da porçãodeFcdeuma imunoglobulina;ec)fragmentos da porçãodeFcdeuma imunoglobulina.

[000137] Várias referências divulgam a modificação de polipeptídeos pela conjugação ou glicosilação do polímero. O termo "polipeptídeo de bG-CSF" inclui polipeptídeos conjugados com um polímero, tal como PEG e pode ser compreendido de uma ou mais derivatizações adicionais de cisteína, lisina, ou outros resíduos. Além disso, o polipeptídeo de bG-CSF pode compreender um ligante ou polímero, em que o aminoácido para que o ligante ou polímero é conjugado pode ser um aminoácido natural não de acordo com a presente invenção, ou pode ser conjugado a um aminoácido codificado de forma natural usando técnicas conhecidas na arte, tais como o acoplamento com a lisina ou cisteína.

[000138] As modificações poliméricas de polipeptídeos foram relatadas. O IFNβ é mencionado como um exemplo de um polipeptídeo pertencente à superfamília do hormônio do crescimento. O WO 00/23114 divulga IFNβ glicosilada e peguilada. O WO 00/23472 divulga proteínas de fusão de IFNβ. A Patente US No. 4.904.584 divulga polipeptídeos depletados de lisina PEGuilados, em que pelo menos um resíduo de lisina foi deletado ou substituído por qualquer outro resíduo de aminoácido. O WO 99/67291 divulga um processo para conjugar uma proteína com PEG, em que pelo menos um resíduo de aminoácido da proteína é deletado e a proteína é contatada com o PEG em condições suficientes para alcançar a conjugação com a proteína. O WO 99/03887 divulga variantes PEGuiladas de polipeptídeos pertencentes à superfamília do hormônio do crescimento, em que um resíduo de cisteína foi substituído com um resíduo de aminoácido não essencial localizado em uma região específica do polipeptídeo. O WO 00/26354 divulga um método para produzir uma variante de polipeptídeo glicosilada com alergenicidade reduzida, o que, em comparação com um polipeptídeo de origem correspondente compreende pelo menos um sítio de glicosilação adicional. A Patente US No. 5.218.092, que é incorporada aqui por referência, divulga a modificação do fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF) e outros polipeptídeos de modo a introduzir pelo menos uma cadeia de carboidratos adicional em relação ao polipeptídeo nativo.

[000139] O termo "polipeptídeo de bG-CSF" também inclui bG-CSF glicosilados, tais como mas não limitado a, polipeptídeos glicosilados em qualquer posição do aminoácido, formas glicosiladas N-ligadas ou O-ligadas do polipeptídeo. Variantes com alterações nucleotídicas únicas são também consideradas variantes biologicamente ativas de polipeptídeos de bG-CSF. As variantes com alterações nucleotídicas únicas são também consideradas variantes biologicamente ativas do bG-CSF. Além disso, as variantes de splicing também estão incluídas. O termo "polipeptídeo de bG-CSF" também inclui heterodímeros de bG-CSF, homodímeros, heteromultímeros ou homomultímeros de qualquer um de um ou mais bG-CSF ou qualquer outro polipeptídeo, proteína, carboidrato, polímero, molécula pequena, ligante, agente de ligação, ou outras moléculas ativos de qualquer tipo, ligadas por meios químicos ou expressas como uma proteína de fusão (veja as Patentes US Nos. 6.261.550, 6.166.183, 6.204.247, 6.261.550, 6.017.876, que são incorporados aqui por referência), bem como análogos de polipeptídeo contendo, por exemplo, deleções específicas ou outras modificações ainda mantêm a atividade biológica (Patentes US Nos. 6.261.550,6.004.548,6.632.426, que são incorporadas aqui porreferência).

[000140] Todas as referências a posições de aminoácidos no bG- CSF aqui descritos são baseadas na posição da SEQ ID NO: 1, a menos que especificado de outra forma (ou seja, quando se afirma que a comparação é baseada na SEQ ID NO: 2, ou outra sequência de bG-CSF). Por exemplo, o aminoácido na posição 1 da SEQ ID NO: 1, é uma treonina e a treonina correspondente está localizada na SEQ ID NO: 2 na posição 2. Aqueles com habilidade na arte vão apreciar que as posições de aminoácidos correspondentes às posições na SEQ ID NO: 1 podem ser facilmente identificadas em qualquer outra molécula de bG-CSF, tal como na SEQ ID NO: 2. Aqueles com habilidade na arte vão apreciar que posições de aminoácidos correspondentes às posições nas SEQ ID NOs: 1, 2, ou quaisquer outras sequência de bG-CSF podem ser facilmente identificadas em qualquer molécula de bG-CSF, tais como fusões de bG-CSF, variantes, fragmentos, etc.. Por exemplo, os programas de alinhamento de sequência, tal como o BLAST, podem ser usados para alinhar e identificar uma posição particular em uma proteína que corresponde a uma posição nas SEQ ID NOs: 1, 2, ou uma outra sequência de bG-CSF. As substituições, deleções ou adições de aminoácidos aqui descritos em referência às SEQ ID NOs: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF destinam-se também a se referir a substituições, deleções ou adições nas posições correspondentes nas fusões de bG-CSF, variantes, fragmentos, etc. aqui descritos ou conhecidos na arte e são expressamente englobados pela presente invenção.

[000141] O termo "polipeptídeo de bG-CSF" ou "bG-CSF" engloba o polipeptídeos de bG-CSF que compreendem uma ou várias substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Os polipeptídeos de bG-CSF da presente invenção podem ser composto de modificações com um ou mais aminoácidos naturais em conjunção com uma ou mais modificações de aminoácidos não naturais. As substituições exemplares em uma ampla variedade de posições de aminoácidos em polipeptídeos de bG-CSF que ocorrem de forma natural foram descritas, incluindo mas não limitadas às substituições que modulam a estabilidade farmacêutica, que modulam a uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de bG-CSF, tais como, mas não se limitando ao, aumento da atividade agonista, aumento da solubilidade do polipeptídeo, diminuição da susceptibilidade de protease, conversão do polipeptídeo em um antagonista etc., são englobadas pelo termo "polipeptídeo de bG-CSF." Em algumas modalidades, o antagonista de bG-CSF compreende um aminoácido codificado de forma não natural ligado a um polímero solúvel em água que está presente em uma região de ligação ao receptor da molécula de bG-CSF.

[000142] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF compreendem adicionalmente uma substituição, adição ou deleção que modula a atividade biológica do polipeptídeo de bG-CSF. Em algumas modalidades, o polipeptídeos de bG-CSF compreendem adicionalmente uma substituição, adição ou deleção que modula a proliferação de neutrófilos, função e/ou a diferenciação do polipeptídeo de bG-CSF. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular uma ou mais propriedades ou atividades do bG-CSF. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular a afinidade para um receptor, modular a meia-vida de circulação, modular a meia-vida terapêutica, modular a estabilidade do polipeptídeo, modular a clivagem por proteases, modular a dose, modular a liberação ou biodisponibilidade, facilitar a purificação, ou melhorar ou alterar uma rota particular de administração. Da mesma forma, os polipeptídeos de bG-CSF podem compreender sequências de clivagem de proteases, grupos reativos, domínios de ligação ao anticorpo (incluindo mas não limitado a, FLAG ou de poli-His) ou outra afinidade com base em sequências (incluindo mas não limitado a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo mas não limitado à biotina) que melhoram a detecção (incluindo mas não limitado a GFP), purificação ou outras características do polipeptídeo.

[000143] O termo "polipeptídeo de bG-CSF" também engloba homodímeros, heterodímeros, homomultímeros e heteromultímeros que são ligados, incluindo mas não limitados a aqueles ligados diretamente por meio de cadeias laterais de aminoácidos codificados de forma não natural, ou para as mesmas ou diferentes cadeias laterais de aminoácidos codificados de forma não natural, para cadeias laterais de aminoácidos codificados de forma natural, ou indiretamente por meio de um ligante. Os ligantes exemplares incluindo, mas não limitado a pequenos compostos orgânicos, polímeros solúveis em água de uma variedade de comprimentos tais como o poli (etileno glicol) ou polidextrana, ou polipeptídeos de vários comprimentos.

[000144] Um "aminoácido codificado de forma não natural" se refere a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteína. Outros termos que podem ser usados como sinônimos com o termo "aminoácido codificado de forma não natural" são "aminoácido não natural", "aminoácido artificial", "aminoácido que ocorre de forma não natural" e várias versões com hífens e sem hífens dos mesmos. O termo "aminoácido codificado de forma não natural" inclui também, mas não está limitado a aminoácidos que ocorrem pela modificação (por exemplo, modificações pós-translacionais) de um aminoácido codificado de forma não natural (incluindo mas não limitado aos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteína), mas não são, eles próprios, naturalmente incorporados a uma cadeia polipeptídica crescente pelo complexo de tradução. Exemplos de tais aminoácidos que ocorrem de forma não natural incluem, mas não são limitados a N- acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina e O- fosfotirosina.

[000145] Um "grupo de modificação amino terminal" se refere a qualquer molécula que pode ser fixa ao amino terminal de um polipeptídeo. Da mesma forma, um "grupo de modificação carbóxi terminal" se refere a qualquer molécula que pode ser fixa ao carbóxi terminal de um polipeptídeo. Os grupos modificação terminal incluem, mas não estão limitados a vários polímeros solúveis em água, peptídeos ou proteínas tais como a albumina, ou outros grupamentos que aumentam a meia-vida sérica dos peptídeos.

[000146] Os termos "grupo funcional", "grupamento ativo", "grupo ativação", "grupo de saída", "sítio reativo", "grupo quimicamente reativo" e "grupamento quimicamente reativo" são usados na arte e aqui para se referir a porções ou unidades explicativas, distintas de uma molécula. Os termos são sinônimos tanto nas artes químicas e são usados aqui para indicar as porções das moléculas que desempenham alguma função ou atividade e reagem com outras moléculas.

[000147] O termo "ligação" ou "ligante" é aqui usada para se referir a grupos ou ligações que normalmente são formadas como o resultado de uma reação química e, normalmente, são ligações covalentes. As ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis incluindo, mas não limitado a condições fisiológicas por um período de tempo prolongado, talvez até indefinidamente. As ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas incluindo, por exemplo, sangue. As ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Como entendido na arte, o PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis no esqueleto do polímero ou no grupo ligante entre o esqueleto do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula do polímero. Por exemplo, ligações de éster formadas pela reação de ácidos PEG carboxílicos ou ácidos PEG carboxílicos ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo geralmente hidrolisam sob condições fisiológicas para liberar o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não estão limitadas a, ligações de carbonato, ligações de imina resultantes da reação de uma amina e um aldeído; ligações de éster de fosfato formado pela reação de um álcool com um grupo fosfato, ligações de hidrazona que são o produto da reação de uma hidrazida e um aldeído, ligações de acetal que são o produto da reação de um aldeído e um álcool, ligações de ortoésteres que são o produto da reação de um formato e um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amina incluindo, mas não limitadas a, ligações na extremidade de um polímero tal como PEG, e um grupo carboxil de um peptídeo; e ligações de oligonucleotídeos formadas por um grupo fosforamidita incluindo, mas não limitado a, ligações na extremidade de um polímero e um grupo 5’ hidroxil de um oligonucleotídeo.

[000148] O termo "molécula biologicamente ativa", "grupamento biologicamente ativo" ou "agente biologicamente ativo" quando usado aqui significa qualquer substância que pode afetar qualquer propriedade física e bioquímica de um sistema biológico, via, molécula, ou interação relativa a um organismo, incluindo, mas não limitado a, vírus, bactérias, bacteriófago, transposon, prion, insetos, fungos, plantas, animais e seres humanos. Em particular, como aqui usado, moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão limitados a qualquer substância destinada para o diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção da doença em humanos ou outros animais ou, de outra forma, intensificam o bem-estar físico ou mental de humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão limitadas a, peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequenas, vacinas, imunogenes, fármacos duras, fármacos leves, carboidratos, átomos ou moléculas inorgânicas, corantes, lipídios, nucleosídeos, radionuclídeos, oligonucleotídeos, toxóides, toxinas, células procarióticas e eucariontes, vírus, polissacarídeos, ácidos nucléicos e porções dos mesmos obtidos ou derivados de vírus, bactérias, insetos, animais ou qualquer outra célula ou tipodecélula,lipossomos,micropartículase micelas. Os polipeptídeos de bG-CSF podem ser adicionados em uma formulação micelar.Asclassesde agentesbiologicamenteativos que são adequadas para uso com a invenção incluem, mas não estão limitadas a fármacos, pró-fármacos, radionuclídeos, agentes de imageamento, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes anti- inflamatórios, agentes anti-tumorais, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedade, hormônios, fatores do crescimento, agentes esteroidais, toxinas derivadas microbiamente, e semelhantes.

[000149] Um "polímero bifuncional" se refere a um polímero que compreende dois grupos funcionais discretos, que são capazes de reagir especificamente com grupamentos (incluindo, mas não limitado a grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não-covalentes. Um ligante bifuncional reativo tendo um grupo funcional com um grupo ou um componente de partícula biologicamente ativa e outro grupo reativo com um grupo em um segundo componente biológico, podem ser usados para formar um conjugado que inclui o primeiro componente biologicamente ativo, o ligante bifuncional e o segundo componente biologicamente ativo. Muitos procedimentos e moléculas ligantes para fixação de vários compostos de peptídeos são conhecidos. Ver, por exemplo, Pedido de Patente Europeia No. 188256; Patentes US Nos. 4.671.958, 4.659.839,4.414.148,4.699.784,4.680.338 e 4.569.789, que são incorporadas aqui por referência. Um "polímero multifuncional" se refere a um polímero que compreende dois ou mais grupos funcionais discretos que são capazes de reagir especificamente com grupamentos (incluindo, mas não limitados a grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não-covalentes. Um polímero bifuncional ou polímero multifuncional pode ser de qualquer comprimento desejado, ou peso molecular, e pode ser selecionado para fornecer um espaçamento desejado particular ou conformação entre uma ou mais moléculas ligadas à bG-CSF e seu receptor ou bG- CSF.

[000150] Onde grupos substituintes são especificados por suas fórmulas químicas convencionais, escrita da esquerda para a direita, eles igualmente englobam os substituintes quimicamente idênticos que possam resultar da escrita da estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, a estrutura -CH2O é equivalente a estrutura -OCH2.

[000151] O termo "substituinte" inclui, mas não está limitado a "substituintes não interferentes". Os "substituintes não interferentes" são aqueles grupos que produzem compostos estáveis. Os substituintes não interferentes ou radicais adequados incluem, mas não estão limitados a, halo, alquil C1-C10, alquenil C2-C10, alquinil C2C10, alcóxi C1-C10, aralquil C1-C12, alcaril C1-C12, cicloalquil C3-C12, cicloalquenil C3-C12, fenil, fenil substituído, toluoil, xilenil, bifenil, alcoxialquil C2-C12, alcóxiaril C2-C12, ariloxialquil C7-C12, oxiaril C7-C12, alquilsulfinil C1-C6, alquilsulfonil C1-C10, --(CH2)m - O-- (alquil C1-C10), em que m é 1 a 8, aril, aril substituído, alcóxi substituído, fluoroalquil, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, nitroalquil, -NO2-, --CN, --NRC (O)- - (alquil C1- C10),--C(O)--(alquil C1-C10), alquil tioalquil C2-C10,--C(O)O-- (alquil-C1-C10),--OH, --SO2,=S,--COOH, --NR2, carbonil, --C(O)--(alquil C1-C10)-CF3, --C(O)--CF3, --C(O)NR2, --(aril C1- C10)-S--(aril C6-C10), --C(O)-- (aril C1-C10), --(CH2)m--O--(-- (CH2)m—O-- (alquil C1-C10 ), em que cada m é 1 a 8,--(O)NR2, --C(S)NR2, --SO2NR2, --NRC(O)NR2,--NRC(S)NR2, sais dos mesmos, e semelhantes. Cada R como usado aqui é H, alquil ou alquil substituído, aril substituído ou aril, aralquil, ou alcaril.

[000152] O termo "halogênio" inclui flúor, cloro, iodo e bromo.

[000153] O termo "alquil", por si só ou como parte de um outro substituinte, significa, a menos que estabelecido de outro modo, uma cadeia linear ou ramificada, ou radical de hidrocarbonetos cíclicos, ou combinação dos mesmos, que pode ser completamente saturado, mono ou poli-insaturado e pode incluir radicais di- e multivalentes, tendo o número de átomos de carbono designado (ou seja, C1-C10 significa de um a dez átomos de carbono). Exemplos de radicais de hidrocarbonetos saturados incluem, mas não estão limitados a grupos como metil, etil, n-propil, isopropil, n-butil, t-butil, isobutil, sec-butil, ciclohexil, (ciclohexil) metil, ciclopropilmetil, homólogos e isômeros, por exemplo, n-pentil, n-hexil, n-heptil, n-octil, e semelhantes. Um grupo alquil insaturado é aquele que tem uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Exemplos de grupos alquil insaturados incluem, mas não estão limitados a, vinil, 2-propenil, crotil, 2-isopentenil, 2- (butadienil), 2,4-pentadienil, 3-(1,4-pentadienil)etinil, 1- e 3-propinil, 3- butinil, e os homólogos e isômeros superiores. O termo "alquil", a menos que observado de outro modo, também se destina a incluir os derivados de alquil definidos em mais detalhes abaixo, tais como "heteroalquil". Os grupos alquil que são limitados a grupos hidrocarbonetos são chamados de "homoalquil".

[000154] O termo "alquileno" por si ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de um alcano, como exemplificado, mas não limitado, pelas estruturas -CH2CH2- e - CH2CH2CH2CH2-, e inclui adicionalmente os gruposscritos abaixo como "heteroalquileno". Normalmente, um grupo alquil (ou alquileno) terá de 1 a 24 átomos de carbono, com os grupos tendo 10 átomos de carbono ou menos, sendo uma modalidade particular dos métodos e composições descritas aqui. Um "alquil inferior" ou "alquileno inferior" é um alquil de cadeia curta ou grupo alquileno, geralmente tendo oito átomos de carbono ou menos.

[000155] Os termos "alcóxi, "alquilmino" e "alquiltio" (ou tioalcóxi) são usados em seu sentido convencional, e se referem aos grupos alquil fixos ao restante da molécula por meio de um átomo de oxigênio, um grupo amino, ou um átomo de enxofre, respectivamente.

[000156] O termo "heteroalquil", por si só ou em combinação com outro termo, significa, a menos que estabelecido de outro modo, uma cadeia linear ou ramificada estável, ou radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinações dos mesmos, que consiste no número estabelecido de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em O, N, Si e S, e em que os átomos de nitrogênio e enxofre podem ser, opcionalmente, oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser, opcionalmente, quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N e S e Si pode ser colocado em qualquer posição interior do grupo heteroalquil ou na posição em que o grupo alquil é fixo ao restante da molécula. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, -CH2-CH2-O-CH3,-CH2-CH2-NH-CH3-, CH2-CH2- N(CH3)-CH3-, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2- CH3-, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 e -CH=N-CH (CH3)-CH3. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, tal como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e -CH2-O-Si (CH3)3. Da mesma forma, o termo "heteroalquileno", por si ou como parte de um outro substituinte significa um radical divalente derivado do heteroalquil, como exemplificado, mas não limitado por CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S- CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquilenos, heteroátomos iguais ou diferentes podem também ocupar um ou ambos os terminais da cadeia (incluindo, mas não limitado a alquileno-óxi, alquilenodióxi, alquileneamino, amino-oxialquileno, alquilenodiamino, e semelhantes). Além disso, para os grupos ligação alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo ligação está implícita pela direção na qual a fórmula do grupo ligação é escrita. Por exemplo, a fórmula - C(O)2R' representa tanto -C(O)2R' quanto -R' C-(O)2-.

[000157] Os termos "cicloalquil" e "heterocicloalquil", por si sós ou em combinação com outros termos, representam, a menos que estabelecido de outro modo, as versões cíclicas de "alquil" e "heteroalquil", respectivamente. Desse modo, um cicloalquil ou heterocicloalquil incluem ligações do anel completamente insaturadas, parcialmente saturadas e saturadas. Além disso, para heterocicloalquil, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual o heterociclo é fixo ao restante da molécula. Exemplos de cicloalquil incluem, mas não estão limitados a ciclopentil, cicloexil, 1-ciclohexenil, 3-ciclohexenil, cicloheptil, e semelhantes. Exemplos de heterocicloalquil incluem, mas não estão limitados a, 1-(1,2,5,6- tetrahidropiridil), 1-piperidinil, 2-piperidinil, 3- piperidinil, 4-morfolinil, 3- morfolinil, tetrahidrofuran-2-il, tetrahidrofuran-3-il, tetrahidrotien-3-il, tetrahidrotien-3-il, 1-piperazinil, 2-piperazinil, e semelhantes. Adicionalmente, o termo engloba estruturas do anel bicíclicas e tricíclicas. Da mesma forma, o termo "heterocicloalquileno", por si ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado do heterocicloalquil, e o termo "cicloalquileno", por si só ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de cicloalquil.

[000158] Como usado aqui, o termo "polímero solúvel em água" se refere a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água a polipeptídeos de bG-CSF pode resultar em alterações, incluindo mas não limitado a, meia-vida sérica aumenta ou modulada, ou meia-vida terapêutica aumentada ou modulada em relação à forma não modificada, imunogenicidade modulada, características de associação física modulada, tal como agregação e formação de multímero, ligação de receptor alterada, ligação alterada para um ou mais parceiros de ligação, e dimerização ou multimerização de receptor alterada. O polímero solúvel em água pode ou não pode ter sua própria atividade biológica, e pode ser usado como um ligante para fixar o bG-CSF a outras substâncias, incluindo, mas não limitado, a um ou mais polipeptídeos de bG-CSF, ou uma ou mais moléculas biologicamente ativas. Os polímeros adequados incluem, mas não estão limitados a, polietileno glicol, polietileno glicol propionaldeído, mono alcóxi C1-C10 ou derivados de arilóxi dos mesmos (descrito na Patente US No. 5.252.714, que é incorporada aqui por referência), monometóxi- polietileno glicol, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, ácidos poliamino, anidrido maleico diviniléter, N-(2- hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluindo sulfato de dextrano, polipropileno glicol, óxido de polipropileno/copolímero de óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polissacarídeos, oligossacarídeos, glicanos, celulose e derivativos de celulose incluindo, mas não limitado a, metilcelulose e carbóximetil celulose, amido e derivativos de amino, polipeptídeos, polialquileno glicol e derivados dos mesmos, copolímeros de polialquileno glicóis e derivados dos mesmos, polivinil etil éteres, e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, e semelhantes, ou misturas dos mesmos. Exemplos de tais polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a polietileno glicol, e albumina sérica. O WO 03/074087 e WO 03/074088 descrevem a conjugação de proteínas ou de moléculas pequenas ao hidroxialquil amido (HAS). Exemplos de hidroxialquil amidos incluem, mas não limitado a hidroxietilamido. Os conjugados de hidroxialquil amido e outra molécula, por exemplo, podem compreender uma ligação covalente entre os grupos aldeídos terminais entre grupos aldeídos de HAS e grupos reativos da outra molécula.

[000159] Como usado aqui, o termo "polietileno glicol" ou "poli(alqueno glicol)" se refere a polietileno glicol (poli(etileno glicol)), polipropileno glicol, polibutileno glicol, e derivados dos mesmos. O termo "polietileno glicol" engloba tanto os polímeros lineares quanto ramificados e pesos moleculares médios entre 0,1 kDa e 100 kDa. Outras modalidades exemplares são apresentadas, por exemplo, em catálogos de fornecedores comerciais, tais como catálogo de Shearwater Corporation "Polyethyleno glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001).

[000160] O termo "aril" significa, a menos que estabelecido de outro modo, um substituinte de hidrocarboneto aromático, poli-insaturado, que pode ser um anel único ou anel múltiplo (incluindo, mas não limitado a, 1 a 3 anéis) que é fundido em conjunto ou ligado de forma covalente. O termo "heteroaril" se refere a grupos aril (ou anéis) que contêm de um a quatro heteroátomos selecionados de N, O e S, em que os átomos de enxofre e nitrogênio são opcionalmente oxidados, e o(s) átomo(s) de nitrogênio são opcionalmente quartenizados. Um grupo heteroaril pode ser fixo ao restante da molécula por meio de um heteroátomo. Exemplos não limitantes de grupos aril e heteroaril incluem fenil, 1-naftil, 2-naftil, 4-bifenil, 1-pirrolil, 2-pirrolil, 3-pirrolil, 3- pirazolil, 2-imidazolil, 4-imidazol, pirazinil, 2-oxazolil, 4-oxazolil, 2-fenil- 4-oxazolil, 5-oxazoIil, 3-isoxazolil, 4-isoxazolil, 5-isoxazolil, 2-tiazolil, 4- tiazolil, 5-tiazolil, 2-furil, 3-furil, 2-tienil, 3-tienil, 2-piridil, 3-piridil, 4- piridil, 2-pirimidil, 4-pirimidil, 5-benzotiazolil, purinil, 2-benzimidazolil, 5- indolil, 1-isoquinolil, 5- isoquinolil, 2-quinoxalinil, 5-quinoxalinil, 3- quinolil, e 6-quinolil. Os substituintes para cada um dos sistemas de anéis de aril e heteroaril citados acima são selecionados a partir do grupo substituintes aceitáveis descritos abaixo.

[000161] Para resumir, o termo "aril", quando usado em combinação com outros termos (incluindo, mas não limitado a ariloxi, ariltioxi, arilalquil) inclui ambos anéis de aril e heteroaril acima definidos. Assim sendo, o "arilalquil" é destinado a incluir os radicais em que um grupo aril é fixo a um grupo alquil (incluindo, mas não limitado a, benzil, fenetil, piridilmetil e similares), incluindo os grupos alquil em que um átomo de carbono (incluindo, mas não limitado a, um grupo metileno) foi substituído, por exemplo, por um átomo de oxigênio (incluindo, mas não limitado a, fenoximetil, 2-piridiloximetil, 3-(L-naftiloxi) propil, e semelhantes).

[000162] Cada um dos termos acima (incluindo, mas não limitado a "alquil", "heteroalquil", "aril" e "heteroaril") é destinado a incluir ambas as formas substituídas e não substituídas do radical indicado. Os substituintes exemplares para cada tipo de radical são fornecidos abaixo.

[000163] Os substituintes para os radicais alquil e heteroalquil (incluindo, os grupos frequentemente referidos como alquileno, alquenil, heteroalquileno, heteroalquenil, alquinil, cicloalquil, heterocicloalquil, cicloalquenil e heterocicloalquenil) podem ser um ou mais de uma variedade de grupos selecionados de, mas não limitados a: -OR', =O, =NR', =N-OR’, -NR'R", -SR’, -halogênio, -SiR'R"R"’, - OC(O)R', -C-(O)R’, -CO2R', -CONR’R", -OC(O)NR'R", -NR’’C(O)R', - NR’-C(O)NR"R"’,-NR"C(O)2R’,-NR’-C(NR'R"R’")=NR"", -NR- C(NR'R")=NR"’, -S(O)R', -S(O)2R’, -S(O)2NR'R", -NRSO2R’, -CN e - NO2 em um número que varia de zero a (2m' + 1), em que m’ é o número total de átomos de carbono em um tal radical. R', R", R"' e R"" cada um, independentemente, se refere a hidrogênio, heteroalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, incluindo mas não limitado a, aril substituído com 1 a 3 halogênios, grupos alquil, alcóxi ou tioalcóxi substituídos ou não substituídos, ou grupos arilalquil. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada um dos grupos R', R", R"' e R"" quando mais de um desses grupos está presente. Quando R' e R" estão fixos ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel com 5 -, 6 -, ou 7- membros. Por exemplo, o -NR’R’’ é destinado a incluir, mas não se limitando a, 1-pirrolidinil e 4-morfolinil. A partir da discussão de substituintes acima, uma pessoa versada na técnica vai entender que o termo "alquil" é destinado a incluir os grupos que incluem átomos de carbono ligados agrupos diferentes dos grupos hidrogênio, tais como haloalquil (incluindo, mas não limitado a, -CF3 e -CH2CF3) e acil (incluindo, mas não limitado a, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -CCH2OCH3(O), e semelhantes).

[000164] De modo similar aos substituintes descritos para o radical alquil, os substituintes para os grupos aril e heteroaril são variados e são selecionados a partir de, mas não estão limitados a: halogênio, - OR', =O, =NR',=N-OR’, -NR'R", -SR’, -halogênio, -SiR’R"R’’’, - OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R’, - NR’-C(O)NR’’R’’’,-NR"C(O)2R’,-NR-C(NR’R"R’’’)=NR’’’’, -NR- C(NR'R")= NR’’’, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR'R", -NRSO2R’, -CN e - NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro alcóxi (C1-C4) e fluoro alquil (C1-C4), em um número que varia de zero ao número total de valências abertas no sistema de anéis aromáticos; e em que R',R",R’’’ e R’’’’ são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquil, heteroalquil, aril e heteroaril. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como é cada um dos grupos R', R", R’’’ e R’’’’ quando mais de um desses grupos está presente.

[000165] Como usado aqui, o termo "meia-vida sérica modulada", significa a mudança positiva ou negativa na meia-vida circulante de um bG-CSF modificado com relação a sua forma não modificada. A meia- vida sérica é medida pela tomada de amostras de sangue em vários pontos do tempo após a administração do bG-CSF, e determinação da concentração dessa molécula em cada amostra. A correlação entre a concentração sérica com o tempo permite o cálculo da meia vida sérica. A meia-vida sérica aumentada desejavelmente tem pelo menos um aumento de cerca de duas vezes, mas um aumento menor pode ser útil, por exemplo, quando a mesma possibilita um regime de dosagem satisfatória ou evita um efeito tóxico. Em algumas modalidades, o aumento é pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes.

[000166] O termo "meia-vida terapêutica modulada", como usado aqui significa a mudança positiva ou negativa na meia-vida da quantidade terapeuticamente eficaz de bG-CSF, em relação a sua forma não modificada. A meia-vida terapêutica é medida através da medição da farmacocinética e/ou propriedades farmacodinâmicas da molécula em vários pontos de tempo após a administração. A meia- vida terapêutica aumentada desejavelmente possibilita um regime de dosagem particular benéfico, uma dose total particular benéfica, ou evita um efeito indesejado. Em algumas modalidades, a meia-vida terapêutica aumentada resulta da potência aumentada, ligação aumentada ou diminuída da molécula modificada para o seu alvo, degradação aumentada ou diminuída da molécula por enzimas, tais como proteases, ou um aumento ou diminuição em outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada ou um aumento ou diminuição na depuração mediada pelos receptores da molécula.

[000167] O termo "isolado", quando aplicado a um ácido nucléico ou proteína, denota que o ácido nucléico ou proteína é livre de pelo menos alguns dos componentes celulares com os quais ele está associado no estado natural, ou que o ácido nucléico ou proteína foi concentrado a um nível maior do que a concentração de sua produção in vivo ou in vitro. O mesmo pode estar em um estado homogêneo. As substâncias isoladas podem estar em um estado seco ou semi-seco, ou em solução, incluindo, mas não limitado a uma solução aquosa. Pode ser um componente de uma composição farmacêutica que compreende carreadores farmaceuticamente aceitáveis adicionais e/ou excipientes. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analítica, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Em particular, um gene isolado é separado a partir de estruturas de leitura aberta que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse. O termo "purificado" denota que um ácido nucléico ou proteína dá origem substancialmente a uma banda em um gel de electroforese. Particularmente, isso pode significar que o ácido nucléico ou proteína é pelo menos 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 99% puro ou mais puro.

[000168] O termo"ácidonucléico"sereferea desoxirribonucleotídeos, desoxirribonucleosídeos, ribonucleosídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos ou na forma de filamento único ou filamento duplo. A menos que especificamente limitado, o termo engloba ácidos nucléicos que contêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucléico de referência e são metabolizados de uma maneira semelhante à dos nucleotídeos que ocorrem de forma natural. A menos que especificamente de outra forma limitada, o termo também se refere aos análogos de oligonucleotídeos incluindo PNA (ácido peptídeonucleico), análogos de DNA usados na tecnologia antissenso (fosforo tioatos, fosforoamidatos e semelhantes). A menos que indicado de outro modo, uma sequência de ácido nucléico particular também engloba implicitamente variantes modificadas de forma conservativas dos mesmos (incluindo, mas não limitadas a substituições de códon degenerado) e sequências complementares, bem como à sequência explicitamente indicadas. Especificamente, as substituições de códon degenerado podem ser alcançadas pela geração de sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituído com a base mista e/ou resíduos de desoxinosina (Batzer et al. Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol Chem 260:2605-2608 (1985);. Rossolini et al., Mot, Cell Probes 8:91-98 (1994)).

[000169] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e “proteínas” são usados intercambiavelmente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Ou seja, uma descrição direcionada para um polipeptídeo se aplica igualmente a uma descrição de um peptídeo e uma descrição de uma proteína, e vice-versa. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos naturais que ocorrem de forma natural, bem como a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido codificado de forma não natural. Como usado aqui, os termos englobam as cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo as proteínas de comprimento completo, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes.

[000170] O termo "aminoácido" se refere aos aminoácidos que ocorrem de forma não natural e aos que ocorrem de forma natural, bem como aos análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira similar aos ácidos aminados que ocorrem de forma natural. Os aminoácidos codificados de forma natural são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirrolisina e selêniocisteína. Os análogos de aminoácidos se referem aos compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente, ou seja, um carbono α que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxil, um grupo amino e um grupo R, tal como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil metionina sulfônio. Tais análogos tiveram os grupos R modificados (tal como, norleucina) ou esqueleto do peptídeo modificado, mas mantêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente. A referência a um aminoácido inclui, por exemplo, L-aminoácidos proteogênicos que ocorrem naturalmente, D-aminoácidos, aminoácidos quimicamente modificados, tais como variantes e derivativos de aminoácidos; aminoácidos não proteogênicos que ocorrem de forma natural, tais como β-alanina, ornitina, etc.; e compostos quimicamente sintetizados tendo propriedades conhecidas na arte que são características de aminoácidos. Exemplos de aminoácidos que ocorrem de forma não natural incluem, mas não estão limitados a, a-metil-aminoácidos (por exemplo, α-metil-alanina), D-aminoácidos, aminoácidos como histidina, (por exemplo, 2-amino- histidina, β-hidroxi-histidina, homohistidina, α-fluorometil histidina e α- metil-histidina), aminoácidos tendo um metileno extra na cadeia lateral (aminoácidos "homo") e aminoácidos em que um grupo funcional de ácido carboxílico na cadeia lateral é substituído com um grupo ácido sulfônico (por exemplo, ácido cisteico). A incorporação dos aminoácidos não naturais, incluindo os aminoácidos sintéticos não- nativos, os aminoácidos substituídos, ou um ou mais D-aminoácidos nas proteínas da presente invenção pode ser vantajosa em diversos modos diferentes. Os peptídeos contendo D-aminoácidos, etc., apresentam estabilidade aumentada in vitro ou in vivo em comparação com as contrapartes contendo L-aminoácidos. Assim, a construção de peptídeos, etc., incorporando D-aminoácidos pode ser particularmente útil quando uma maior estabilidade intracelular é desejada ou necessária. Mais especificamente, os D-peptídeos, etc., são resistentes às peptidases e proteases endógenas, desse modo, fornecendo biodisponibilidade da molécula melhorada, e vida útil prolongada in vivo, quando tais propriedades são desejáveis. Além disso, os D-peptídeos, etc., não podem ser processados de forma eficiente para a apresentação restrita ao complexo principal de histocompatibilidade de classe II às células T helper e, portanto, com menor probabilidade de induzir respostas imunes humorais em todo o organismo.

[000171] Os aminoácidos podem ser referidos aqui seja por seus símbolos de três letras vulgarmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, igualmente, podem ser identificados por seus códigos comumente aceitos de uma única letra.

[000172] O termo "variantes modificadas de forma conservativa" se aplica tanto às sequências de aminoácidos quanto às sequências de ácidos nucléicos. No que diz respeito às sequências de ácidos nucléicos particulares, o termo "variantes modificadas de forma conservativa" se refere aos ácidos nucléicos que codificam sequências de aminoácidos essencialmente idênticas ou idênticas, ou quando o ácido nucléico não codifica uma sequência de aminoácidos, para sequências essencialmente idênticas. Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos, sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucléico são "variações silenciosas" que são uma espécie de variações modificadas de forma conservativa. Cada sequência de ácidos nucléicos aqui que codifica um polipeptídeo também descreve todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucléico. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para metionina e TGG, que é normalmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Assim, cada variação silenciosa de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[000173] Com respeito as sequências de aminoácidos, um versado na técnica irá reconhecer que substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência de ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, ou proteína que altera, adiciona ou deleta um único aminoácido ou uma pequeno percentual de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante modificada de forma conservativa", onde a alteração resulta na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido, ou substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição conservativa fornecem aminoácidos funcionalmente similares que são conhecidos por aqueles de competência comum na arte. Essas variantes modificadas de forma conservativa são em adição e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da invenção.

[000174] As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos com funcionalidades similares são conhecidas por aqueles versados na técnica. Cada um dos seguintes oito grupos contêm aminoácidos que são substituições conservativas para um outro: 1)Alanina (A), Glicina (G); 2)Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3)Asparagina (N), Glutamina (Q); 4)Arginina (R), Lisina (K); 5)Isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6)Fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W); 7)Serina (S), treonina (T) e 8)Cisteína (C), Metionina (M) (Ver, por exemplo, Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (WH Freeman & Co., 2° edição (Dezembro de 1993)

[000175] O termo "idêntico" ou "percentual de identidade" no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucléicos ou sequências polipeptídicas se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas. As sequências são "substancialmente idênticas" se elas têm percentuais de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (ou seja, identidade de cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95% de identidade sobre uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para a máxima correspondência sobre uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência (ou outros algoritmos disponíveis para pessoas de competência comum em a arte) ou pelo alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição também se refere ao complemento de uma sequência de teste. A identidade pode existir sobre uma região que tem pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou sobre uma região que tem de 75-100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou, quando não especificado, através de toda a sequência de um polinucleotídeo ou polipeptídeo. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção, incluindo os homólogos de espécies diferentes da humana, pode ser obtido por um processo compreendendo as etapas de seleção de uma biblioteca em condições de hibridização rigorosas com uma sonda marcada tendo uma sequência de polinucleotídeos da invenção, ou um fragmento do mesmo e isolamento do cDNA de comprimento completo e de clones genômico contendo as referidas sequências de polinucleotídeo. Tais técnicas de hibridização são bem conhecidas do técnico no assunto.

[000176] Para comparação da sequência, geralmente uma sequência atua como uma sequência de referência, para a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de referência e de teste são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros de programa padrões podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência, então, calcula o percentual das identidades de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

[000177] Uma "janela de comparação", como usado aqui, inclui referência a um segmento de qualquer uma das várias posições de contíguas selecionadas do grupo que consiste em 20 a 600, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150 em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após duas sequências são otimamente alinhadas. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são conhecidos por aqueles de habilidade comum na arte. O alinhamento ótimo de sequências para a comparação pode ser conduzido, incluindo mas não limitado, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:48c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela busca por método de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444, pelas implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software de Wisconsin Genetics, genetics Computer Group, 575 science Dr. Madison, WI), ou pelo alinhamento manual e visual (ver, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento)).

[000178] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar o percentual de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. O Software para realização de análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information disponíveis na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) (Rede de Alcance Mundial (World Wide Web)) em ncbi.nlm.nih.gov. Os parâmetros do algoritmo de BLAST W, T, X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M = 5, N = - 4 e uma comparação entre ambos os filamentos. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra de 3, e a expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5; N = - 4, e uma comparação de ambos os filamentos. O algoritmo BLAST é tipicamente realizado com o filtro de "baixa complexidade" desligado.

[000179] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5873-5787). Uma medidade similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de soma menor (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos que ocorrem por acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade de soma menor em uma comparação do ácido nucléico de teste com o ácido nucléico de referência é inferior a cerca de 0,2 ou inferior a cerca de 0,01 ou inferior a cerca de 0,001.

[000180] A frase "seletivamente (ou especificamente) se hibridiza a" se refere à ligação, duplexação, ou hibridação de uma única molécula de uma sequência de nucleotídeo particular sob condições rigorosas de hibridação, quando a sequência está presente em uma mistura complexa (incluindo, mas não limitado a, RNA ou DNA de biblioteca ou celular total).

[000181] A frase "condições rigorosas de hibridização" se refere à hibridização de sequências de DNA, RNA, PNA, ou outros miméticos de ácidos nucléicos ou combinações dos mesmos mediante condições de baixa força iônica e temperatura elevada como é conhecido na arte. Tipicamente, em condições rigorosas uma sonda se hibridizará a sua subsequência alvo em uma mistura complexa de ácidos nucléicos (incluindo, mas não limitado a, RNA ou DNA de biblioteca ou celular total), mas não se hibridiza para outras sequências na mistura complexa. As condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. As sequências mais longas se hibridizam especificamente em altas temperaturas. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para ser cerca de 5 10°C mais baixo que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica em um pH de força iônica definido, o Tm é a temperatura (em força iônica definida, pH, e concentração nucléica) em que 50% das sondas complementares ao alvo se hibridizam com a sequência alvo no equilíbrio (como as sequências alvos estão presentes em excesso, a Tm, 50% das sondas são ocupadas no equilíbrio). As condições rigorosas podem ser aquelas em que a concentração de sal é inferior a íons de sódio com concentração de cerca de 1,0 M, tipicamente íons de sódio com concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para as sondas curtas (incluindo mas não limitado a, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (incluindo mas não limitado a, maior do que 50 nucleotídeos). As condições rigorosas também podem ser alcançadas com a adição de agentes de desestabilização, tal como a formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser pelo menos duas vezes de fundo, opcionalmente 10 vezes hibridação de fundo. As condições rigorosas de hibridização exemplares podem ser da seguinte forma: formamida a 50%, SSC 5X, SDS a 1%, incubados a 42°C, ou SSC 5X, SDS a 1%, incubados a 65°C, com lavagem em SSC 0,2X e SDS a 0,1% a 65°C. Essas lavagens podem ser realizadas por 5, 15, 30, 60, 120 ou mais minutos.

[000182] Como usado aqui, o termo "eucarionte" se refere a organismos pertencentes ao domínio filogenético Eucaria, tal como animais (incluindo, mas não limitado a, mamíferos, insetos, répteis, aves, etc.), ciliados, plantas (incluindo, mas não limitado a, monocotiledôneas, dicotiledôneas, algas, etc.), fungos, leveduras, flagelados, microsporídeos, protistas, etc..

[000183] Como usado aqui, o termo "não eucarionte" se refere a organismos não eucarióticos.

[000184] Por exemplo, um organismo não eucariótico pode pertencer ao domínio filogenético Eubacteria (incluindo, mas não limitado a, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pulida, etc.), ou domínio filogenético Archaea (incluindo, mas não limitado a, Melhanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, tal como Haloferax volcanii e espécies NRC-1 de Halobacterium, Archaeoglobus fulgidus, Pirococcus furiosus, Pirococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.).

[000185] O termo "indivíduo", como usado aqui, se refere a um animal, em algumas modalidades um mamífero, e em outras modalidades um humano, que é o objeto do tratamento, observação ou experimento. Um animal pode ser um animal de companhia (cães, gatos e semelhantes), um animal de fazenda (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos e semelhantes) ou um animal de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, porquinhos da Índia, e semelhantes.).

[000186] O termo "quantidade eficaz" como usado aqui se refere à quantidade do polipeptídeo de aminoácido não natural modificado que é administrado, o qual vai aliviar em certa medida, um ou mais dos sintomas da doença, condição ou distúrbio a ser tratado. As composições contendo o polipeptídeo de aminoácido não natural modificado descrito aqui podem ser administradas para profilaxia, intensificação e/ou tratamentos terapêuticos.

[000187] Os termos "intensificação" ou "intensificar" significam aumentar ou prolongar tanto a potência quanto a duração do efeito desejado. Sendo assim, com relação a intensificação do efeito de agentes terapêuticos, o termo "intensificar" se refere à capacidade de aumentar ou prolongar, tanto na potência quanto na duração, o efeito de outros agentes terapêuticos em um sistema. Uma "quantidade eficaz para intensificar", tal como aqui usado, se refere a uma quantidade adequada para intensificar o efeito de um outro agente terapêutico em um sistema desejado. Quando usado em um animal, as quantidades eficazes para este uso vão depender da gravidade e do curso da doença, distúrbio ou condição, a terapia anterior, o estado de saúde do animal e a resposta aos fármacos, bem como o julgamento do tratamento veterinário.

[000188] O termo "modificado", como usado aqui se refere a quaisquer alterações feitas para um dado polipeptídeo, tais como mudanças no comprimento do polipeptídeo, sequência de aminoácidos, estrutura química, modificação co-tranducional, ou modificação pós-translacional de um polipeptídeo. O termo forma "(modificada)", significa que os polipeptídeos que são discutidos são opcionalmente modificados, ou seja, os polipeptídeos em discussão podem ser modificados ou não modificados.

[000189] O termo "modificado pós-traducionalmente" se refere a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural, que ocorre com tal aminoácido depois de ser incorporado a uma cadeia polipeptídica. O termo engloba, a título de exemplo apenas, modificações co-traducionais in vivo, modificações co-traducionais in vitro (tal como em um sistema de tradução livre de células), modificações pós-translacionais in vivo e modificações pós- translacionais in vitro.

[000190] Em aplicações profiláticas, as composições contendo o polipeptídeo de bG-CSF são administradas a um animal suscetível a uma doença, distúrbio ou condição particular ou, de outro modo, em risco de uma doença, distúrbio ou condição particular. Tal quantidade é definida como sendo uma "quantidade profilaticamente eficaz". Neste uso, as quantidades precisas também dependem do estado de saúde, peso, e semelhantes do animal. Considera-se bem dentro da habilidade da arte determinar tais quantidades profilaticamente eficazes pela experimentação de rotina (por exemplo, teste clínico de escalonamento de dose).

[000191] O termo "protegidos" se refere a presença de um "grupo de proteção" ou grupamento que previne a reação do grupo reativo funcional, sob certas condições de reação. O grupo de proteção pode variar dependendo do tipo de grupo reativo a ser protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado dentre o grupo terc-butiloxicarbonil (t-Boc) e 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo é um tiol, o grupo de proteção pode ser ortopiridildissulfeto. Se o grupo quimicamente reativo é um ácido carboxílico, tal como ácido butanóico ou propiônico, ou um grupo hidroxil, o grupo de proteção pode ser benzil ou um grupo alquil, tais como metil, etil, ou terc-butil. Outros grupos de proteção conhecidos na arte também podem ser usados com os métodos e composições descritas neste documento, incluindo os grupos fotolábeis, tais como Nvoc e MeNvoc. Outros grupos de proteção conhecidos na arte também podem ser usados com os métodos e composições descritas a seguir.

[000192] A título de exemplo apenas, os grupos de proteção/bloqueio podem ser selecionados a partir de:

[000193] Outros grupos de proteção são descritos em Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque, NY, 1999, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[000194] Em aplicações terapêuticas, as composições contendo o polipeptídeo de aminoácido não natural modificado são administradas a um animal que já sofre de uma doença, condição ou distúrbio, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente reprimir os sintomas da doença, distúrbio ou condição. Tal quantidade é definida como uma "quantidade terapeuticamente eficaz", e vai depender da gravidade e do curso da doença, distúrbio ou condição, da terapia anterior, do estado de saúde do animal e da resposta aos fármacos, bem como do julgamento do tratamento veterinário. Considera-se bem dentro da habilidade da arte determinar tais quantidades terapeuticamente eficazes por experimentação de rotina (por exemplo, um teste clínico de escalonamento de dose).

[000195] O termo "tratamento" é usado para se referir tanto a tratamentos terapêuticos quanto profiláticos.

[000196] Os polipeptídeos de aminoácidos codificados de forma não natural apresentados aqui podem incluir compostos marcados isotopicamente com um ou mais átomos substituídos por um átomo tendo um diferente número de massa ou massa atômica do número de massa ou massa atômica geralmente encontrada na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos presentes compostos incluem os isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, flúor e cloro, tais como o 2H, 3H 13C, 14C, 15N 18O, 7O, 5S, 18F, 36Cl, respectivamente. Certos compostos isotopicamente marcados aqui descritos, por exemplo, aqueles em que os isótopos radioativos, tais como 3H e 14C são incorporados, podem ser úteis em ensaios de distribuição de tecidos de substrato e/ou fármacos. Além disso, a substituição com isótopos tais como o deutério, ou seja, 2H, pode produzir certas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida aumentada in vivo ou requisitos de dosagem reduzida.

[000197] Todos os isômeros incluindo, mas não limitados a, diastereoisômeros, enantiômeros e misturas dos mesmos são consideradas como parte das composições descritas aqui. Em modalidades adicionais ou complementares, os polipeptídeos de aminoácidos codificados de forma não natural são metabolizados mediante a administração a um organismo que necessita produzir um metabólito que é, então, usado para produzir o efeito desejado, incluindo um efeito terapêutico desejado. Em modalidades complementares ou adicionais são metabólitos ativos de polipeptídeos de aminoácidos codificados de forma não natural.

[000198] Em algumas situações, os polipeptídeos de aminoácidos codificados de forma não natural podem existir como tautômeros. Além disso, os polipeptídeos de aminoácidos codificados de forma não natural descritos aqui podem existir em formas não solvatadas, bem como solvatadas com solventes farmaceuticamente aceitáveis, tais como água, etanol e semelhantes. As formas solvatadas também são consideradas como sendo divulgadas aqui. Aqueles de habilidade comum na arte vão reconhecer que alguns dos compostos aqui podem existir em várias formas tautoméricas. Todas essas formas tautoméricas são consideradas como parte das composições aqui descritas.

[000199] A menos que estabelecido de outro modo, os métodos convencionais de espectroscopia de massa, RMN, HPLC, química de proteínas, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro da habilidade da arte são empregados.

Descrição Detalhada I. Introdução

[000200] As moléculas de b-GCSF que compreende pelo menos um aminoácido natural são fornecidas na invenção. Em certas modalidades da invenção, o polipeptídeo de b-GCSF com pelo menos um aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação pós- translacional. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação pós-translacional compreende a fixação de uma molécula incluindo, mas não limitado a, hidroxialquil amido (HAS), hidroxietil amido (HES), um marcador, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietileno glicol, um fotoreticulador, um radionuclídeo, um composto citotóxico, um fármaco, um marcador de afinidade, uma marcação de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um metal quelante, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo antissenso, um sacarídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucleico inibidor, um biomaterial, uma nanopartícula, um marcador de spin, um fluoróforo, um grupamento contendo metal, um grupamento radioativo, um novo grupo funcional, um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, um grupamento photocaged, um grupamento excitável por radiação actínica, um grupamento fotoisomerizável, biotina, um derivativo de biotina, um análogo da biotina, um grupamento que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino tioácido, um grupamento tóxico, um grupamento marcado isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescência, um grupo elétrons densos, um grupo magnético, um grupo intercalação, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, uma marcação detectável, uma molécula pequena, um ponto de quantum, um radionucleotídeo, um nanotransmissor, um radiotransmissor, um agente de captura de nêutrons, ou qualquer combinação dos itens acima ou de qualquer outro composto ou substância desejável, compreendendo um segundo grupo reativo a pelo menos um aminoácido não natural compreendendo um primeiro grupo reativo, usando metodologia de química que é conhecida por uma pessoa versada na técnica como sendo adequada para grupos reativos particulares. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é um grupamento alquinil (incluindo, mas não limitado a p-propargiloxifenilalanina no aminoácido não natural, onde o grupo propargil às vezes também é referido como um grupamento de acetileno) e um segundo grupo reativo é um grupamento azida e metodologias de química cicloadição [3 +2] são usadas. Em outro exemplo, o primeiro grupo reativo é o grupamento azida (incluindo, mas não limitado a p-azida-L-fenilalanina no aminoácido não natural) e o segundo grupo reativo é o grupamento alquinil. Em certas modalidades do polipeptídeo de b-GCSF modificado da presente invenção, pelo menos um aminoácido não natural (incluindo, mas não limitado a aminoácido não natural contendo um grupo funcional cetônico) compreendendo pelo menos uma modificação pós-translacional, é usado quando a pelo menos uma modificação pós-translacional compreende um grupamento sacarídeo. Em certas modalidades, a modificação pós-traducional é feita in vivo em uma célula eucariótica ou em uma célula não- eucariótica. Um ligante, polímero, polímero solúvel em água, ou outras moléculas podem fixar a molécula ao polipeptídeo. A molécula pode ser ligada diretamente ao polipeptídeo.

[000201] Em certas modalidades, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-translacional que é preparada in vivo por uma célula hospedeira, onde a modificação pós-translacional normalmente não é preparada por outro tipo de célula hospedeira. Em certas modalidades, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-translacional que é preparada in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação pós- translacional normalmente não é produzida por uma célula não eucariótica. Exemplos de modificações pós-translacionais incluem, mas não estão limitados a glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídios, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação de glicolipídeo, e semelhantes.

[000202] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural por glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídios, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, ou modificação de ligação de glicolipídeo do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural para a glicosilação do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende um ou mais aminoácidos codificados de forma natural para glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídios, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, ou modificação de ligação de glicolipídeo do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende um ou mais aminoácidos codificados de forma natural na glicosilação do polipeptídeo.

[000203] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende uma ou mais substituições e/ou adições de aminoácidos codificados de forma não natural que intensificam a glicosilação do polipeptídeo.Emalgumasmodalidades,opolipeptídeodeb-GCSF compreende uma ou mais deleções que intensificam a glicosilação do polipeptídeo.Emalgumasmodalidades,opolipeptídeodeb-GCSF compreende uma ou mais substituições e/ou adições de aminoácidos codificados de forma não natural que intensificam a glicosilação em um aminoácido diferente no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeodeb-GCSF compreendeum ou maisdeleçõesque intensificamaglicosilação em um aminoácidodiferente no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende uma ou mais substituições e/ou adições de aminoácidos codificados de forma não natural que intensificam a glicosilação de um aminoácido codificado de forma não natural no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende uma ou mais substituições e/ou adições de aminoácidos codificados de forma não natural que intensificam a glicosilação de um aminoácido codificado de forma natural no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende uma ou mais substituições e/ou adições de aminoácidos codificados de forma natural que intensificam a glicosilação em um aminoácido diferente no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende uma ou mais substituições e/ou adições de aminoácidos codificados de forma não natural que intensificam a glicosilação de um aminoácido codificado de forma natural no polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de b-GCSF compreende uma ou mais substituições e/ou adições de aminoácidos codificados de forma não natural que intensificam a glicosilação em um aminoácido codificado de forma não natural no polipeptídeo.

[000204] Em uma modalidade, a modificação pós-translacional compreende a fixação de um oligossacarídeo a uma asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina (incluindo, mas não limitado a, quando o oligossacarídeo compreende (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc- GlcNAc, e semelhantes). Em outra modalidade, a modificação pós- translacional compreende a fixação de um oligossacarídeo (incluindo, mas não limitado a, Gal-GaINAc, Gal-GIcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina, uma ligação GalNAc- treonina, uma ligação GlcNAc-serina, ou uma ligação GlcNAc-treonina. Em certas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo da invenção pode compreender uma sequência de secreção e de localização, um epítopo marcador (tag), um FLAG marcador, um marcador tipo polihistidina, uma fusão de GST e/ou semelhantes. Exemplos de sequências de sinais de secreção incluem, mas não estão limitados a uma sequência de sinal de secreção procariótica, uma sequência de sinal de secreção eucariótica, uma sequência de sinal de secreção eucariótica 5'-otimizada para a expressão bacteriana, uma nova sequência de sinal de secreção, sequência de sinal de secreção pectato liase, uma sequência de sinal de secreção Omp e uma sequência de sinal de secreção de fago. Exemplos de sequências de sinal de secreção incluem, mas não estão limitados a STII (procariótica), Fd GIII e M13 (fago), Bg12 (levedura), e as sequências de sinal bla derivadas de um transposon. Qualquer sequência pode ser modificada para fornecer um resultado desejado com o polipeptídeo, incluindo, mas não limitado a substituição de uma sequência de sinal por uma sequência de sinal diferente, substituição de uma sequência líder por uma sequência líder diferente, etc.

[000205] A proteína ou polipeptídeo de interesse pode conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou dez ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser os mesmos ou diferentes, por exemplo, eles podem ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos não naturais diferentes. Em certas modalidades, pelo menos um, mas menos do que todos, de um aminoácido particular presente em uma versão de ocorrência natural da proteína é substituído por um aminoácido natural.

[000206] A presente invenção fornece métodos e composições à base de b-GCSF compreendendo pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural. A introdução de pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural em b-GCSF pode permitir a aplicação de químicas de conjugação que envolvem reações químicas específicas, incluindo, mas não limitadas a reações com um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural, enquanto não reagindo com os 20 aminoácidos de ocorrência comum. Em algumas modalidades, o b-GCSF compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural é ligado a um polímero solúvel em água, tal como o polietileno glicol (PEG) por meio da cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Esta invenção fornece um método altamente eficiente para a modificação seletiva de proteínas com derivativos de PEG, que envolve a incorporação seletiva de aminoácidos codificados de forma não genética, incluindo, mas não limitados a, aqueles aminoácidos contendo grupos funcionais ou substituintes não encontrados nos 20 aminoácidos incorporados naturalmente, incluindo, mas não limitados a, uma cetona, um grupamento azida ou acetileno, em proteínas em resposta a um códon seletor e a modificação subsequente dos aminoácidos referidos com um derivativo de PEG adequadamente reativo. Uma vez incorporadas, as cadeias laterais dos aminoácidos podem ser modificadas pelo uso de metodologias químicas conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte que são adequadas para os grupos funcionais particulares ou substituintes presentes no aminoácido codificado de forma não natural. As metodologias químicas conhecidas a partir de uma ampla variedade são adequadas para uso na presente invenção para incorporar um polímero solúvel em água na proteína. Essas metodologias incluem, mas não estão limitadas a uma reação de cicloadição [3 +2] de Huisgen (ver, por exemplo, Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B, M., Pergamon, Oxford, p. 1069- 1109; and, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cvcloaddition Chemistry. (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Nova Iorque, p. 1-176), com, incluindo mas não se limitando a, derivativos de acetileno ou azida, respectivamente.

[000207] Devido ao método de cicloadição de Huisgen [3+2] envolver uma cicloadição ao invés de uma reação de substituição nucleofílica, as proteínas podem ser modificadas com seletividade muito alta. A reação pode ser realizada à temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regiosseletividade (1,4 > 1,5) por meio da adição de quantidades catalíticas de sais de Cu(I) para a mistura reacional. Ver, por exemplo, Tomoe et al.,(2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; e, Rostovtsev, et al., (2002) Aneew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 e WO 03/101972. Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção por meio de uma cicloadição [3 +2] inclui praticamente qualquer molécula com um grupo funcional adequado ou substituinte, incluindo, mas não limitado a uma azida ou derivados de acetileno. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo acetileno, incluindo, mas não limitado a p-propargiloxiphenil alanina, ou grupo azida, incluindo, mas não limitado a, p-azida-fenilalanina, respectivamente.

[000208] O anel de cinco membros que resulta da cicloadição [3 +2] de Huisgen não é geralmente reversível em ambientes de redução e é estável à hidrólise por longos períodos em ambientes aquosos. Por conseguinte, as características físicas e químicas de uma ampla variedade de substâncias podem ser modificadas sob condições de demanda aquosacom os derivativos dePEGativodapresente invenção. Ainda de forma mais importante, devido aos grupamentos azida e acetilenoserem específicos umparaoutro(enão, por exemplo, reagirem com qualquer um dos 20 aminoácidos comuns codificados de forma genética), as proteínas podem ser modificadas em um ou mais sítios específicos com seletividade extremamente alta.

[000209] A invenção também fornece derivados hidroliticamente estáveis e solúveis em água e derivados de PEG e polímeros hidrofílicos relacionados tendo um ou mais grupamentos de acetileno ou azida. Os derivados de polímero PEG que contêm grupamentos de acetileno são altamente seletivos para o acoplamento com grupamentos de azida que foram introduzidos seletivamente nas proteínas em resposta a um códon seletor. Da mesma forma, os derivados de polímero PEG que contêm grupamentos de azida são altamente seletivos para oacoplamento com grupamentosde acetileno que foram introduzidos seletivamente nas proteínas em resposta a um códon seletor.

[000210] Mais especificamente, os grupamentos de azida incluem, mas não estão limitados a alquil azidas, aril azidas e derivados destas azidas. Os derivados de alquil e aril azidas podem incluir outros substituintes, desde que a reatividade específica para acetileno seja mantida. Os grupamentos de acetileno compreendem alquil e aril acetilenos e derivados de cada um. Os derivados de alquil e aril acetilenos podem incluir outros substituintes, desde que a reatividade específica para azida seja mantida.

[000211] A presente invenção fornece conjugados de substâncias que têm uma ampla variedade de grupos funcionais, substituintes ou grupamentos, com outras substâncias, incluindo, mas não limitadas a, hidroxialquil amido (HAS); hidroxietil amido (HES), um marcador, um corante, um polímero; um polímero solúvel em água, um derivado de polietileno glicol, um fotoretuculador; um radionuclídeo; um composto citotóxico, um fármaco, um marcador de afinidade; um marcador de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou polipeptídeo análogo; um fragmento de anticorpo ou anticorpo, um metal quelante, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo antissenso, um sacarídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucléico inibidor; um biomaterial, uma nanopartícula, um marcador de spin, um fluoróforo, um grupamento contendo metal, um grupamento radioativo; um novo grupo funcional, um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, um grupamento photocaged; um grupamento excitável por radiação actínica, um grupamento fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, um grupamento que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo; um amino tioácido; um grupamento tóxico; um grupamento isotopicamente marcado, uma sonda biofísica, um grupo fosforescentes, um grupo quimioluminescência; um grupo elétrons densos, um grupo magnético; um grupo intercalação; um cromóforo; um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um marcador detectável, uma molécula pequena, um ponto de quantum, um nanotransmissor; um radionucleotídeo, um radiotransmissor, um agente de captura de nêutrons, ou qualquer combinação dos itens acima, ou qualquer outro composto ou substância desejável. A presente invenção também inclui conjugados de substâncias tendo grupamentos de azida ou acetileno com derivados de polímero PEG tendo os grupamentos de acetileno ou azida correspondentes. Por exemplo, um polímero PEG contendo um grupamento de azida pode ser acoplado a uma molécula biologicamente ativa em uma posição na proteína que contém um aminoácido codificado de forma não genética apresentando uma funcionalidade de acetileno. A ligação pela qual o PEG e a molécula biologicamente ativa são acopladas inclui, mas não está limitada ao produto de cicloadição [3 +2] de Huisgen.

[000212] Já está bem estabelecido na arte que o PEG pode ser usado para modificar as superfícies de biomateriais (ver, por exemplo, Patente US 6.610.281; Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sci., 3 (1): 125136. (2000) que são incorporados aqui por referência). A invenção também inclui biomateriais que compreendem uma superfície tendo um ou mais sítios reativos de azida ou acetileno e um ou mais dos polímeros contendo acetileno ou azida da invenção acoplados à superfície por meio da ligação de cicloadição [3 +2] de Huisgen. Os biomateriais e outras substâncias também podem ser acoplados aos derivados de polímero ativado por acetileno ou azida por meio de uma ligação diferente da ligação de azida ou acetileno, tal como por meio de uma ligação compreendendo um grupamento de ácido carboxílico, amina, álcool ou tiol, para deixar o grupamento de azida ou acetileno disponível para as reações subsequentes.

[000213] A invenção inclui um método para sintetizar polímeros contendo azida- e acetileno- da invenção. No caso dos derivados de PEG contendo azida, a azida pode ser ligada diretamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, os derivados de PEG contendo azida podem ser preparados pela fixação de um agente de ligação que tem o grupamento azida em um terminal de um polímero convencional ativado de modo que o polímero resultante tenha o grupamento de azida no seu terminal. No caso dos derivados de PEG contendo acetileno, o acetileno pode ser ligado diretamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, os derivados de PEG contendo acetileno podem ser preparados pela fixação de um agente de ligação que tenha o grupamento de acetileno em um terminal de um polímero convencional ativado de modo que o polímero resultante tenha o grupamento de acetileno em seu terminal.

[000214] Mais especificamente, no caso da azida contendo derivados de PEG, um polímero solúvel em água tendo pelo menos um grupamento de hidroxil ativo passa por uma reação para produzir um polímero substituído tendo um grupamento mais reativo, tal como o mesilato, tresilato, tosilato ou grupo de saída de halogênio, nos mesmos. A preparação e uso de derivados de PEG contendo haletos de sulfonil ácido, átomos de halogênio e outros grupos de saída são conhecidos por aqueles de competência comum na arte. O polímero substituído resultante então passa por uma reação para substituir um grupamento azida por um grupamento mais reativo no terminal do polímero. Alternativamente, um polímero solúvel em água tendo pelo menos um grupamento nucleofílico ou eletrofílico ativo passa por uma reação com um agente de ligação que tem uma azida em um terminal, de modo que uma ligação covalente é formada entre o polímero PEG e o agente de ligação, e o grupamento de azida é posicionado no terminal do polímero. Os grupamentos nucleofílicos e eletrofílicos incluindo aminas, tióis, hidrazidas, hidrazinas, álcoois, carboxilatos, aldeídos, cetonas, tioésteres e semelhantes, são conhecidos por aqueles de competência comum na arte.

[000215] Mais especificamente, no caso dos derivados de PEG contendo acetileno, um polímero solúvel em água tendo pelo menos um grupamento hidroxil ativo passa por uma reação para deslocar um halogênio ou um grupo de saída ativado a partir de um precursor que contém um grupamento de acetileno. Alternativamente, um polímero solúvel em água tendo pelo menos um grupamento nucleofílico ou eletrofílico ativo passa por uma reação com um agente de ligação que tem um acetileno em um terminal de modo que uma ligação covalente é formada entre o polímero PEG e o agente de ligação e o grupamento de acetileno é posicionado no terminal do polímero. O uso de grupamentos de halogênio, grupo de saída ativado, grupamentos nucleofílicos e eletrofílicos no contexto da síntese orgânica e na preparação e uso dos derivados de PEG está bem estabelecido para os praticantes da técnica.

[000216] A invenção também fornece um método para a modificação seletiva de proteínas para adicionar outras substâncias para a proteína modificada, incluindo, mas não limitado a polímeros solúveis em água tais como PEG e derivados PEG contendo um grupamento de azida ou acetileno. Os derivados de PEG contendo azida e acetileno podem ser usados para modificar as propriedades das superfícies e de moléculas onde a biocompatibilidade, estabilidade, solubilidade e ausência de imunogenicidade são importantes, enquanto ao mesmo tempo, fornecem um meio mais seletivo para a fixação dos derivados de PEG às proteínas que já eram anteriormente conhecidas no estado da técnica.

GCSF Bovino

[000217] Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção podem ser usados para melhorar ou prevenir infecções em animais. As atividades biológicas, bem como os ensaios para caracterizar as atividades biológicas de G-CSF de humano e de bovino são conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Os ensaios que envolvem uma avaliação do número de neutrófilos e a função de neutrófilos são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

Métodos Gerais de Ácidos Nucléicos Recombinantes para o Uso com a Invenção

[000218] Em diversas modalidades da presente invenção, os ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de bG-CSF de interesse serão isolados, clonados e frequentemente alterados usando métodos recombinantes. Essas modalidades são usadas incluindo, mas não limitado para, a expressão de proteínas ou durante a geração de variantes, derivados, cassetes de expressão, ou de outras sequências derivadas de um polipeptídeo de bG-CSF. Em algumas modalidades, as sequência que codificam os polipeptídeos da invenção são operavelmente ligadas a um promotor heterólogo. O isolamento de hG-CSF e a produção de G-CSF em células hospedeiras são descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos. 4.810.643, 4.999.291, 5.580.755 e 6.716.606, que são incorporadas aqui por referência.

[000219] Uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural pode ser sintetizada com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeos de origem, incluindo, mas não limitado a, sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 2 e em seguida, mudando a sequência de nucleotídeos, de modo a efetuar a introdução (ou seja, incorporação ou substituição) ou remoção (ou seja, deleção ou substituição) do(s) resíduo(s) de aminoácidos relevante(s). A sequência de nucleotídeos pode ser convenientemente modificada por mutagênese sítio-dirigida de acordo com os métodos convencionais. Alternativamente, a sequência de nucleotídeos pode ser preparada por síntese química, incluindo, mas não limitado a síntese usando um sintetizador de oligonucleotídeos, em que os oligonucleotídeos são projetados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e, preferencialmente, selecionar os códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeo recombinante será produzido. Por exemplo, vários oligonucleotídeos pequenos que codificam porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e montados por PCR, reação de ligação em cadeia ou ligação. Veja, por exemplo, Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991) e Patente US 6.521.427 que são incorporados aqui por referência.

[000220] Esta invenção usa técnicas de rotina no campo da genética recombinante, textos básicos que divulgam os métodos gerais de uso desta invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3° ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).

[000221] Textos gerais que descrevem técnicas de biologia molecular incluem Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2° Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989 ("Sambrook") e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (suplementado em 1999) ("Ausubel")). Estes textos descrevem a mutagênese, o uso de vetores, promotores e muitos outros temas relevantes relacionados incluindo, mas não limitados a geração de genes ou polinucleotídeos que incluem Códons Seletoreses para a produção de proteínas que incluem aminoácidos não naturais, tRNAs ortogonais, sintetases ortogonais e pares dos mesmos.

[000222] Os vários tipos de mutagênese são usados na invenção para uma variedade de propósitos incluindo, mas não limitado ao, propósito de produzir novas sintetases ou tRNAs, mutar moléculas de tRNA, mutar polinucleotídeos que codificam sintetases, para produzir bibliotecas de tRNAs, para produzir bibliotecas de sintetases, para produzir Códons Seletoreses, para inserir Códons Seletoreses que codificam aminoácidos não naturais em uma proteína ou polipeptídeo de interesse. Eles incluem, mas não estão limitados a mutagênese sítio-dirigida, ponto aleatória, recombinação homóloga, DNA shuffling ou outros métodos de mutagênese recursiva, construção quimérica, mutagênese que usa uracil contendo modelos, mutagênese dirigida a oligonucleotídeos, mutagênese de DNA modificado por fosforotioato, mutagênese que usa DNA duplex com lacuna, ou semelhantes, a mutagênese mediada por PCT, ou qualquer combinação dos mesmos. Os métodos adequados adicionais incluem o ponto de reparo de bases desemparelhadas, mutagênese usando cepas de hospedeiro deficiente de reparo, seleção por restrição e purificação por restrição, mutagênese por deleção, mutagênese por síntese de gene total, reparação de quebra de filamento duplo e semelhantes. A mutagênese incluindo, mas não limitado a mutagênese envolvendo construções quiméricas, também estão incluídos na presente invenção. Em uma modalidade, a mutagênese pode ser orientada por informações conhecidas da molécula que ocorre naturalmente ou molécula que ocorre naturalmente mutada ou alterada incluindo, mas não limitado a sequência, comparações de sequência, propriedades físicas, estrutura secundária, terciária ou quaternária, de cristal ou semelhantes.

[000223] Os textos e exemplos encontrados aqui descrevem esses procedimentos. Informações adicionais são encontradas nas seguintes publicações e referências citadas em: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2):157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods MoL Biol, 57:369-374(1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortlc, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J. 237:1-7 (1986); Kimkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, em Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.MJ. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245(1988); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide- directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785(1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioaie groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence ofethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456(1984); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide- directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, Cell 38:879887 (1984); Cartel- et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13 : 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154:382-403(1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar e Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13:3305-3316(1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P, C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); e, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 30678 (1995). Detalhes adicionais sobre muitos dos métodos acima pode ser encontrado em Methods in Enzymology Volume 154, que também descreve controles para solucionar problemas (trouble-shooting), com vários métodos de mutagênese.

[000224] Os oligonucleotídeos, por exemplo, para uso na mutagênese da presente invenção, por exemplo, mutando bibliotecas de sintetases, ou alterando tRNAs, são tipicamente sintetizados quimicamente de acordo com o método triéster fosforamidite em fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862,(1981), por exemplo, usando um sintetizador automatizado, conforme descrito em Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984).

[000225] A invenção também se refere a células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras não eucarióticas, e organismos para a incorporação in vivo de um aminoácido não natural por meio de pares de tRNA/RS ortogonais. As células hospedeiras são geneticamente construídas (incluindo, mas não limitado a, células hospedeiras transformadas, traduzidas ou transfectadas) com os polinucleotídeos da invenção ou construções que incluem um polinucleotídeo da invenção incluindo, mas não limitado a, um vetor da invenção, que pode ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Por exemplo, as regiões de codificação para o tRNA ortogonal, a sintetase de tRNA ortogonal, e a proteína a ser derivada são operavelmente ligadas a elementos de controle da expressão gênica que são funcionais na célula hospedeira desejada. O vetor pode ser, por exemplo, sob a forma de um plasmídeo, um cosmídeo, um fago, uma bactéria, um vírus, um polinucleotídeo nu, ou um polinucleotídeo conjugado. Os vetores são introduzidos nas células e/ou microrganismos pelos métodos padrões incluindo eletroporação (Fr0 mM et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), infecção por vetores virais, a penetração balística de alta velocidade por pequenas partículas com o ácido nucléico, quer dentro da matriz de partículas ou esferas pequenas, ou na superfície (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)), e/ou semelhantes. As técnicas adequadas para a transferência de ácidos nucléicos em células in vitro incluem o uso de lipossomos, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrana, o método de precipitação de fosfato de cálcio, etc.. As técnicas de transferência gênica in vivo incluem, mas não estão limitados a, transfecção com vetores virais (tipicamente retrovirais) e transfecção mediada por proteína-lipossoma de revestimento viral [Dzau et al, Trends in Biotechnology 11 205-210 (1993)]. Em algumas situações pode ser desejável fornecer a fonte de ácidos nucléicos com um agente que tem como alvo as células alvos, tal como um anticorpo específico para uma proteína da membrana da superfície da célula ou a célula alvo, um ligante para um receptor na célula alvo, etc.. Quando os lipossomos são empregados, as proteínas que se ligam a uma proteína da membrana da superfície celular associada com endocitose podem ser usadas para direcionar e/ou facilitar a absorção, por exemplo, as proteínas do capsídeo ou fragmentos das mesmas da região trópica para um tipo de célula particular, os anticorpos para proteínas que passam por internalização na ciclização de proteínas que têm como alvo a localização intracelular e intensificam a meia-vida intracelular.

[000226] As células hospedeiras construídas podem ser cultivadas em meios de nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para as atividades como, por exemplo, as etapas de seleção, promotores de ativação ou transformantes de seleção. Estas células podem, opcionalmente, ser cultivadas em organismos transgênicos. Outras referências úteis incluindo, mas não limitadas a, referência para o isolamento e cultura de células (por exemplo, para isolamento de ácido nucléico subsequente) incluem Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, terceira edição, Wiley- Liss, Nova Iorque e referências citadas no mesmo, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque; NY, Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag (Beilm Heidelberg Nova Iorque) e Atlas e Parks (eds.) The Handbook of Miciobiological Media (1993) CRC Pi ess, Boca Raton, FL.

[000227] Diversos métodos bem conhecidos para a introdução de ácidos nucléicos alvos em células estão disponíveis, qualquer um dos quais podendo ser usados na invenção. Estes incluem: a fusão de células receptoras com protoplastos bacterianos contendo o DNA, eletroporação, bombardeiamento de projéteis e infecção com vetores virais (discutido mais abaixo), etc.. As células bacterianas podem ser usadas para ampliar o número de plasmídeos contendo as construções de DNA desta invenção. As bactérias, que são cultivadas para inserir a fase e os plasmídeos dentro das bactérias, podem ser isoladas por uma variedade dos métodos conhecidos na arte (veja, por exemplo, Sambrook). Além disso, os kits estão disponíveis comercialmente para a purificação de plasmídeos a partir de bactérias, (ver, por exemplo, EasyPrepTM, FlexiPrepTM, ambos da Pharmacia Biotech; StrataCleanTM da Stratagene; e, QIAprepTM da Qiagen). Os plasmídeos isolados e purificados são, então, adicionalmente manipulados para produzir outros plasmídeos usados para a transfecção de células ou incorporados em vetores relacionados para infectar organismos. Os vetores típicos contêm os terminadores de transcrição e tradução, as sequências de iniciação de tradução e transcrição, e promotores úteis para a regulação da expressão do ácido nucléico alvo específico. Os vetores, opcionalmente, compreendem cassetes de expressão genérica contendo pelo menos uma sequência de terminador independente, sequências que permitam a replicação do cassete em eucariontes ou procariontes, ou ambos, (incluindo, mas não limitado a vetores bifuncionais (shuttle)) e marcadores de seleção para ambos os sistemas procarióticos e eucarióticos. Os vetores são adequados para a replicação e integração em procariontes, eucariontes ou ambos. Veja, Gillam & Smith, 8:81 Gene (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al. Protein. Expr Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel Sambrook, Berger (todos os supra). Um catálogo de bactérias e bacteriófagos útil para a clonagem é fornecido, por exemplo, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna el al. (eds), publicado pela ATCC. Procedimentos básicos adicionais para o sequenciamento, a clonagem e outros aspectos da biologia molecular e considerações teóricas subjacentes também são encontrados em Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Além disso, essencialmente qualquer ácido nucléico (e praticamente qualquer ácido nucléico marcado, quer padrão ou não padrão) pode ser personalizado ou ordenado tipo padrão de qualquer uma de uma variedade de fontes comerciais, tais como the Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponível na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) em mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponível na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) em genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponível na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) em expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitas outras.

Códons Seletores

[000228] Os Códons Seletores da invenção expandem a estrutura códon genético do maquinário biossintético de proteínas. Por exemplo, um códon seletor inclui, mas não está limitado a um único códon de três bases, um códon nonsense, tal como um códon de parada incluindo, mas não limitado a, um códon âmbar (UAG), um códon ocre, um códon opala (UGA), um códon não natural, um códon de quatro bases ou mais, um códon raro, ou semelhante. É facilmente perceptível para aqueles que possuem habilidades comuns na arte que existe uma ampla variedade no número de Códons Seletores que pode ser introduzido em um gene ou polinucleotídeo desejado incluindo, mas não limitado a um ou mais, dois ou mais, três ou mais, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais em um único polinucleotídeo que codifica pelo menos uma porção do polipeptídeo de bG-CSF.

[000229] Em uma modalidade, os métodos envolvem o uso de um códon seletor que é um códon de parada para a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais in vivo. Por exemplo, um O-tRNA que reconhece o códon de parada é produzido, incluindo, mas não limitado a UAG, e é aminoacilado por um O-RS com um aminoácido natural desejado. Este O-tRNA não é reconhecido pelas aminoacil- tRNA sintetases do hospedeiro de ocorrência natural. A mutagênese sítio-dirigida convencional pode ser usada para introduzir o códon de parada incluindo, mas não limitado a TAG, no sítio de interesse em um polipeptídeo de interesse. Veja, por exemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide- directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802. Quando o O- RS, O-tRNA e o ácido nucléico que codifica o polipeptídio de interesse são combinados in vivo, o aminoácido não natural é incorporado em resposta ao códon UAG para gerar um polipeptídeo contendo o aminoácido não natural na posição especificada.

[000230] A incorporação de aminoácidos não naturais in vivo pode ser feita sem perturbação significativa da célula hospedeira eucariótica. Por exemplo, devido à eficiência de supressão para o códon UAG depender da competição entre os tRNA-O incluindo, mas não limitado a tRNA âmbar supressor, e de um fator de liberação eucariótico (incluindo, mas não limitado a eRF) (que se liga a um códon de parada e inicia a liberação do peptídeo de crescimento do ribossomo), a eficiência de supressão pode ser modulada, incluindo mas não limitado, pelo aumento do nível de expressão de O-tRNA, e/ou o tRNA supressor.

[000231] Os aminoácidos não naturais também podem ser codificados com códons raros. Por exemplo, quando a concentração de arginina em uma reação de síntese de proteína in vitro é reduzida, o códon raro arginina, AGG, provou ser eficiente para a inserção de Ala por um tRNA sintético acilado com alanina. Ver, por exemplo, Ma et al. Biochemistry. 32:7939 (1993). Neste caso, o tRNA sintético compete com o tRNAArg de ocorrência natural, que existe como uma espécie menor em Escherichia coli. Alguns organismos não usam todos os tripletos (códons). Um códon AGA não designado em Micrococcus luteus tem sido usado para a inserção de aminoácidos em um extrato de transcrição/tradução in vitro. Veja, por exemplo, Kowal e Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Os componentes da presente invenção podem ser gerados para usar esses códons raros in vivo.

[000232] Os Códons Seletores também compreendem códons estendidos incluindo, mas não limitados a quatro ou mais códons de base, tais como, códons de quatro, cinco, seis ou mais bases. Exemplos de códons de quatro bases incluem, mas não estão limitados a AGGA, CUAG, UAGA, CCCU e semelhantes. Exemplos de códons de cinco bases incluem, mas não estão limitados a AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC e semelhantes. Uma característica da invenção inclui o uso de códons estendidos com base na supressão por deslocamento do quadro de leitura (frameshift). Códons de quatro bases ou mais podem inserir, incluindo, mas não limitado a um ou múltiplos aminoácidos não naturais na mesma proteína. Por exemplo, na presença de O-tRNAs mutados incluindo, mas não limitado a tRNAs supressores de deslocamento do quadro de leitura (frameshift) especiais, com alças de anticódons, por exemplo, com pelo menos 8-10 alças de anticódons, o códon de quatro bases ou mais é lido como aminoácidos individuais. Em outras modalidades, os laços de anticódons podem decodificar incluindo, mas não limitado a, pelo menos um códon de quatro bases, pelo menos um códon de cinco bases, ou pelo menos um códon de seis bases ou mais. Uma vez que existem 256 possíveis códons de quatro bases, múltiplos aminoácidos não naturais podem ser codificados na mesma célula usando um códon de quatro bases ou mais. Veja, Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Códon and Anticódon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Códons and Identification of "Shifty" Four-base Códons with a Library Approach in Escherichia coli, J. MoI. Biol. 307: 755-769.

[000233] Por exemplo, os códons de quatro bases têm sido usados para incorporar aminoácidos não naturais nas proteínas usando métodos biossintéticos in vitro. Ver, por exemplo, Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; E Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:34. O CGGG e o AGGU foram usados para incorporar simultaneamente dois naftilalanina e um derivado de NBD de lisina em estreptavidina in vitro com dois tRNAs supressores de deslocamento de quadro de leitura (frameshift) quimicamente acilados. Veja, por exemplo, Hohsaka et al. (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 12194. Em um estudo in vivo, Moore et al. examinoram a capacidade dos derivados de tRNALeu com anticódons NCUA para suprimir os códons UAGN (N pode ser U, A, G ou C), e verificaram que o quádrupleto UAGA pode ser decodificado por um tRNALeu com um anticódon UCUA com uma eficiência de 13 a 26 % com pouca decodificação na estrutura 0 ou -1. Veja, Moore et al. (2000) J. Mol. Biol., 298:195. Em uma modalidade, os códons estendidos com base em códons raros ou códons nonsense podem ser usados na presente invenção, o que pode reduzir a supressão por frameshift e continuação da leitura (readthrough) missense em outros sítios não desejados.

[000234] Para um dado sistema, um códon seletor também pode incluir um dos códons de três bases naturais, onde o sistema endógeno não usa (ou raramente usa) o códon de base natural. Por exemplo, este inclui um sistema que está sem um tRNA que reconhece o códon de três bases naturais, e/ou um sistema em que o códon de três bases é um códon raro.

[000235] Os códons seletores opcionalmente incluem pares de bases não naturais. Esses pares de bases não naturais ainda expandem o alfabeto genético existente. Um par extra de bases aumenta o número de códons tripletos 64 a 125. As propriedades de pares de três bases incluem o emparelhamento de base seletiva e estável, a incorporação enzimática eficiente no DNA com alta afinidade por uma polimerase, e a extensão do iniciador eficiente continuada após a síntese do par de bases nascente não natural. Descrições de pares de bases não naturais, que podem ser adaptadas para métodos e composições incluem, por exemplo, Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182. Veja, também, Wu., Y., et al, (2002), L Am. Chem. Soc. 124:14626-14630. Outras publicações relevantes estão listadas abaixo.

[000236] Para uso in vivo, o nucleosídeo não natural é uma membrana permeável e é fosforilada para formar o trifosfato correspondente. Além disso, a informação genética aumentada é estável e não destruída pelas enzimas celulares. Esforços anteriores de Benner e outros tiraram vantagem dos padrões de ligação do hidrogênio, que são diferentes daqueles em pares canônicos de Watson-Crick, o exemplo mais notável de que é o par iso-C: iso-G. Veja, por exemplo, Switzer et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8322 e Piccirilli et al; Nature (1990), 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin, Chem. Biol., 4:602. Estas bases, em geral, se desemparelham até certo grau com bases naturais e não podem ser replicadas enzimaticamente. Kool et al. demonstraram que as interações de empacotameto hidrofóbicas entre as bases podem substituir ligações de hidrogênio para conduzir a formação de pares de bases. Veja, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol, 4:602; e Guckian e Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. Em um esforço para desenvolver um par de bases naturais satisfazendo todos os requisitos acima, Schultz, Romesberg e colaboradores sintetizaram sistematicamente e estudaram uma série de bases hidrofóbicas antinaturais. Um auto-par PICS:PICS foi verificado ser mais estável do que os pares de bases naturais, e pode ser eficientemente incorporado no DNA pelo fragmento de Klenow do DNA polimerase I em Escherichia coli (KF). Veja, por exemplo, McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:11585-6; e Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:3274. Um auto-par 3MN:3MN pode ser sintetizado pelo KF com eficiência e seletividade suficientes para a função biológica. Veja, por exemplo, Ogawa et al. (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:8803. No entanto, ambas as bases atuam como um terminador da cadeia de replicação adicional. A DNA polimerase mutante foi recentemente evoluída para que possa ser usada para replicar o auto-par de PICS. Além disso, um auto-par 7AI pode ser replicado. Ver, por exemplo, Tae et al. (2001) J. Am. Chem. Soc., 123:7439. Um novo par de metalobase, Dipic: Py, também foi desenvolvido, o qual forma um par estável sobre a ligação de Cu (II). Veja, Meggers et al. (2000) J. Am. Chem, Soc, 122:10714. Devido aos códons estendidos e códons não naturais serem intrinsecamente ortogonais aos códons naturais, os métodos da invenção podem tirar vantagem desta propriedade para gerar tRNAs ortogonais para eles.

[000237] Um sistema de desvio (bypass) translacional pode também ser usado para incorporar um aminoácido não natural em um polipeptídeo desejado. Em um sistema de desvio traducional, uma sequência grande é incorporada a um gene, mas não é traduzida na proteína. A sequência contém uma estrutura que serve como uma indicação para induzir o ribossomo a pular por cima da sequência e retomar a tradução a jusante da inserção.

[000238] Em certas modalidades, a proteína ou polipeptídeo de interesse (ou porção do mesmo) nos métodos e/ou composições da invenção é codificado por um ácido nucléico. Normalmente, o ácido nucléico compreende pelo menos um códon seletor, pelo menos dois códons seletores, pelo menos três códons seletores, pelo menos quatro códons seletores, pelo menos cinco códons seletores, pelo menos seis códons seletores, pelo menos sete códons seletores, pelo menos oito códons seletores, pelo menos nove códons seletores, dez ou mais códons seletores.

[000239] Os genes que codificam proteínas ou polipeptídeos de interesse podem ser mutagenizado usando métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica e descritos aqui para incluir, por exemplo, um ou mais códons seletores para a incorporação de um aminoácido natural. Por exemplo, um ácido nucléico para uma proteína de interesse é mutagenizada para incluir um ou mais códons seletores, que fornecem a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais. A invenção inclui qualquer variante desse tipo incluindo, mas não limitado a mutante, versões de qualquer proteína, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido não natural. Da mesma forma, a invenção também inclui ácidos nucléicos correspondentes, ou seja, qualquer ácido nucléico com um ou mais códons seletores que codifica um ou mais aminoácidos não naturais.

[000240] As moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína de interesse, tal como um polipeptídeo de bG-CSF podem ser facilmente mutadas para introduzir uma cisteína em qualquer posição desejada do polipeptídeo. A cisteína é amplamente usada para introduzir moléculas reativas, polímeros solúveis em água, proteínas, ou uma ampla variedade de outras moléculas, em uma proteína de interesse. Os métodos adequados para a incorporação de cisteína na posição desejada de um polipeptídeo são conhecidos por aqueles de competência comum na arte, tais como os descritos na Patente US No. 6.608.183, que é incorporada aqui por referência, e as técnicas de mutagênese padrão.

IV. Aminoácidos Codificados de Forma Não Natural

[000241] Uma ampla variedade de aminoácidos codificados de forma não natural é adequada para uso na presente invenção. Qualquer número de aminoácidos codificados de forma não natural pode ser introduzido em um polipeptídeo de bG-CSF. Em geral, os aminoácidos codificados de forma não natural introduzidos são substancialmente quimicamente inertes em relação aos 20 aminoácidos comuns codificados geneticamente (ou seja, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, triptofano e valina). Em algumas modalidades, os aminoácidos codificados de forma não natural incluem grupos funcionais de cadeia lateral, que reagem de forma eficiente e seletiva com grupos funcionais não encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não limitado a grupos azida, cetona, aldeído e aminooxi) para formar conjugados estáveis. Por exemplo, um polipeptídeo de bG-CSF, que inclui um aminoácido codificado de forma não natural contendo um grupo funcional azida pode ser reagido com um polímero (incluindo, mas não limitado a, poli (etileno glicol) ou, alternativamente, um segundo polipeptídeo contendo uma molécula de alquino para formar um conjugado estável resultante para a reação seletiva da azida e os grupos funcionais alquino para formar um produto de cicloadição [3 +2] de Huisgen.

[000242] A estrutura genérica de um alfa-aminoácido é ilustrada como se segue (Fórmula I):

[000243] Um aminoácido codificado de forma não natural é tipicamente qualquer estrutura tendo a fórmula listada acima na qual o grupo R é qualquer substituinte diferente de um usado nos vinte aminoácidos naturais, e podem ser adequados para uso na presente invenção. Devido aos aminoácidos codificados de forma não natural da invenção tipicamente se diferenciarem dos aminoácidos naturais apenas na estrutura da cadeia lateral, os aminoácidos codificados de forma não natural formam ligações amida com outros aminoácidos incluindo, mas não limitado a codificados de forma natural ou não natural, da mesma maneira em que eles são formados em polipeptídeos que ocorrem naturalmente. No entanto, os aminoácidos codificados de forma não natural têm grupos cadeia lateral que os distinguem dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R opcionalmente compreende um alquil-, aril-, acil-, ceto-, azida-, hidróxi-, hidrazina-, ciano-, halo-, hidrazida-, alquenil-, alquinil, éter, tiol, selênio-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, éster, tioácido, hidroxilamina, grupo amino, ou semelhantes, ou qualquer combinação dos mesmos. Outros aminoácidos não naturais de interesse que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos que compreendem um reticulador fotoativável, aminoácidos marcados por spin, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que se ligam a metais, aminoácidos contendo metais, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, aminoácidos photocaged e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos compreendendo biotina ou um análogo de biotina, aminoácidos glicosilados como uma serina substituída por açúcar, outros aminoácidos modificados por carboidratos, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos compreendendo polietileno glicol ou poliéster, aminoácidos substituídos com átomo pesado, aminoácidos quimicamente cliváveis e/ou fotocliváveis, aminoácidos com cadeias laterais alongadas em comparação com aminoácidos naturais incluindo, mas não limitado a, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia longa incluindo, mas não limitado a, cadeia maior do que cerca de 5 ou maior que cerca de 10 carbonos, aminoácidos contendo açúcar ligado a carbono, aminoácidos redox-ativos, aminoácidos contendo aminotioácido e aminoácidos compreendendo um ou mais grupamentos tóxicos.

[000244] Os aminoácidos exemplares codificados de forma não natural que podem ser adequados para uso na presente invenção, e que são úteis para reações com polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a aqueles com carbonil, amino-oxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida e grupos alquino reativos. Em algumas modalidades, os aminoácidos codificados de forma não natural compreendem um grupamento de polissacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L- galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L- glucosaminil-asparagina e O-manosaminil-L-serina. Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos em que a ligação N- ou O- que ocorre naturalmente entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente que não é normalmente encontrada na natureza, incluindo, mas não limitado a um alquenol, uma oxima, um tioéter, uma amida e semelhantes. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados nas proteínas que ocorrem naturalmente, tais como 2- deoxi-glicose, 2-deoxigalactose e semelhantes.

[000245] Muitos dos aminoácidos codificados de forma não natural aqui fornecidos são disponível comercialmente, por exemplo, da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), Novabiochem (uma divisão da EMD Biosciences, Darmstadt, Alemanha), ou Peptech ( Burlington, MA, EUA). Aqueles que não estão disponíveis comercialmente são sintetizados, opcionalmente, como fornecidos aqui ou usando métodos padrões conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Para as técnicas de síntese orgânica, ver, por exemplo, Organic Chemistry por Fessendon e Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Terceira edição, 1985, Wiley e Sons, Nova Iorque); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg (Terceira edição, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova Iorque). Veja, também, as Patentes US Nos. 7.045.337 e 7.083.970, que são incorporadas aqui por referência. Além dos aminoácidos não naturais que contêm novas cadeias laterais, os aminoácidos não naturais que podem ser adequados para o uso na presente invenção também, opcionalmente, modificados incluem estruturas de esqueleto, incluindo, mas não limitadas a, ilustrada pelas estruturas da Fórmula II e III:

em que Z compreende tipicamente OH, NH2, SH, NH-R’, ou S-R’, X e Y, que podem ser iguais ou diferentes, geralmente compreendem S ou O, e R e R’, que são opcionalmente iguais ou diferentes, são geralmente selecionados a partir da mesma lista de componentes para o grupo R descrito acima para os aminoácidos não naturais tendo a Fórmula I, bem como o hidrogênio. Por exemplo, os aminoácidos não naturais da invenção compreendem, opcionalmente, substituições no grupo amino ou carboxil, como ilustrado pelas fórmulas II e III. Os aminoácidos não naturais deste tipo incluem, mas não estão limitados a ácidos a-hidróxi, a-tioácidos, a- aminotiocarboxilatos incluindo, mas não limitados aos, com cadeias laterais correspondentes aos vinte aminoácidos naturais comuns de ou cadeias laterais não naturais. Além disso, as substituições no carbono- α, opcionalmente, incluem, mas não estão limitadas a L, D, ou aminoácidos α-α- dissubstituídos, tais como a D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, e semelhantes. Outras alternativas estruturais incluem aminoácidos cíclicos, tais como análogos da prolina, bem como análogos de prolina com 3, 4, 6, 7, 8 e 9 membros de anel, β e Y aminoácidos, tal como a β-alanina substituída e ácido Y—amino butírico.

[000246] Muitos aminoácidos não naturais são baseados em aminoácidos naturais, tais como a tirosina, glutamina, fenilalanina, e semelhantes, e são adequados para uso na presente invenção. Os análogos de tirosina incluem, mas não estão limitados a, tirosinas para-substituídas, tirosina orto-substituída, e tirosinas meta- substituídas, em que a tirosina substituída compreende, incluindo mas não limitado a, um grupo cetônico (incluindo, mas não limitado a, um grupo acetil), um grupo benzoil, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidróxiamina, um grupo tiol, um grupo carbóxi, um grupo isopropil, um grupo metil, um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada de C6 - C20, um hidrocarboneto saturado ou insaturado, um grupo O-metil, um grupo poliéter, um grupo nitro, um grupo alquinil ou semelhante. Além disso, múltiplos anéis de aril substituídos são também contemplados. Análogos de glutamina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a os derivados de a-hidróxi, os derivados Y— substituídos, derivados cíclicos, e derivados de glutamina substituídos por amida. Exemplos de análogos de fenilalanina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, fenilalaninas para— substituídas, fenilalaninas orto—substituídas, e fenilalaninas meta—substituídas, em que o substituinte compreende, incluindo, mas não limitado a, um grupo hidróxi, um grupo metóxi, um grupo metil, um grupo alil, um aldeído, uma azida, iodo, bromo, um grupo cetônico (incluindo, mas não limitado a, um grupo acetil), um benzoíl, um grupo alquinil, ou semelhantes. Alguns exemplos específicos de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, uma p-acetil-L-fenilalanina, uma O-metil-L-tirosina, uma L-3-(2-naftil) alanina, uma 3-metil-fenilalanina, uma O-4-alil-L-tirosina, um 4- propil-L-tirosina, um tri-O-acetil- GlcNAcβ-serina, um L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil- L-fenilalanina, uma p-azida-L-fenilalanina, uma p-acil-L-fenilalanina, uma p-benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfoserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p-iodo-fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, um isopropil-L-fenilalanina, e um p- propargiloxi-fenilalanina, e semelhantes. Exemplos de estruturas de uma variedade de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para o uso na presente invenção são fornecidos, por exemplo, no WO 2002/085923, intitulada "In vivo incorporation of unnatural amino acids." Veja também Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, que é incorporado aqui por referência, para análogos adicionais da metionina. O Pedido Internacional PCT/US06/47822 intitulado "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides", que é incorporado aqui por referência, descreve alquilção redutora de um grupamento de amina aromático incluindo, mas não limitado a, p-amino-fenilalanina e aminação redutora.

[000247] Em uma modalidade, as composições de um polipeptídeo de bG-CSF, que incluem um aminoácido natural (tais como, p- (propargiloxi)-fenilalanina) são fornecidos. Várias composições compreendendo p-(propargiloxi) fenilalanina e incluindo, mas não limitado a, proteínas e/ou células, também são fornecidas. Em um aspecto, uma composição que inclui o aminoácido não natural p- (propargiloxi)-fenilalanina, inclui adicionalmente um tRNA ortogonal. O aminoácido natural pode ser ligado (incluindo, mas não limitado a, covalentemente) ao tRNA ortogonal incluindo, mas não limitado a, covalentemente ligado ao tRNA ortogonal apesar de uma ligação de amino-acil, covalentemente ligado a um 3'OH ou 2’OH de um açúcar de ribose terminal do tRNA ortogonal, etc..

[000248] Os grupamentos químicos por meio de aminoácidos não naturais que podem ser incorporados nas proteínas oferecem uma variedade de vantagens e manipulações da proteína. Por exemplo, a reatividade única de um grupo funcional ceto permite a modificação seletiva de proteínas com qualquer uma de uma série de reagentes contendo hidrazina- ou hidroxilamina- in vitro e in vivo. Um aminoácido não natural de átomo pesado, por exemplo, pode ser útil para a introdução progressiva de dados de estrutura de raios-X. A introdução sítio específica de átomos pesados usando aminoácidos não naturais também fornece seletividade e flexibilidade na escolha das posições de átomos pesados. Os aminoácidos não naturais fotorreativos (incluindo, mas não limitado a aminoácidos com cadeias laterais de benzofenona e arilzidas (incluindo, mas não limitado a, fenilazida)), por exemplo, permitem a fotoreticulação eficaz in vivo e in vitro da proteína. Exemplos de aminoácidos fotorreativos não naturais incluem, mas não limitado a p-azida fenilalanina e p-benzoíl-fenilalanina. A proteína com os aminoácidos não naturais fotorreativos pode ser reticulada à vontade pela excitação do controle temporal que fornece o grupo fotorreativo. Em um exemplo, o grupo metil de um aminoácido não natural pode ser substituído com um grupo isotopicamente marcado, incluindo, mas não limitado a um grupo metil, como uma sonda da dinâmica e estrutura local incluindo, mas não limitado a, o uso de ressonância magnética nuclear e espectroscopia vibracional. Os grupos funcionais alquinil ou azida, por exemplo, permitem a modificação seletiva de proteínas com moléculas por meio de uma reação de cicloadição [3 +2].

[000249] Um aminoácido não natural incorporado em um polipeptídeo no terminal amino pode ser composto por um grupo R, que é qualquer substituinte diferente dos usados nos vinte aminoácidos naturais e um segundo (2°) grupo reativo diferente do grupo NH2 normalmente presente em um a-aminoácido (ver fórmula I). Um aminoácido não natural similar pode ser incorporado no terminal carboxil com um segundo grupo reativo diferentes do grupo COOH normalmente presente em a-aminoácidos (vide fórmula I).

[000250] Os aminoácidos não naturais da invenção podem ser selecionados ou projetados para fornecer características adicionais não disponíveis nos vinte aminoácidos naturais. Por exemplo, o aminoácido não natural pode ser opcionalmente projetado ou selecionado para modificar as propriedades biológicas de uma proteína, por exemplo, nas quais são incorporados. Por exemplo, as seguintes propriedades podem ser, opcionalmente, modificadas pela inclusão de um aminoácido não natural em uma proteína: toxicidade, biodistribuição, solubilidade, estabilidade, por exemplo, térmica, hidrolítica, oxidativa e resistência à degradação enzimática e semelhantes, instalações de purificação e processamento, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, atividade catalítica, potencial redox, meia- vida, capacidade de reagir com outras moléculas, por exemplo, covalentemente ou não covalentemente, e semelhantes.

ESTRUTURA E SÍNTESE DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS:GRUPOS CARBONIL, GRUPOS TIPO CARBONIL,GRUPOS CARBONIL MASCARADO, GRUPOS CARBONIL PROTEGIDOS, E GRUPOS HIDRÓXILAMINA

[000251] Em algumas modalidades da presente invenção fornece bG-CSF ligados a um polímero solúvel em água, por exemplo, um PEG, por uma ligação oxima.

[000252] Muitos tipos de aminoácidos codificados de forma não natural são adequados para formação de ligações de oxima. Estes incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos codificados de forma não natural, contendo um grupo carbonil, dicarbonílico ou um grupo hidroxilamina. Esses aminoácidos são descritos nas publicações de pedidos de Patentes US Nos. 2006/0194256,2006/0217532, e 2006/0217289 e o WO 2006/069246 intitulado "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides" (Composições contendo, os métodos que envolvem, e uso de aminoácidos e polipeptídeos não naturais) que são incorporados aqui por referência na sua totalidade. Os aminoácidos codificados de forma não natural também são descritos na Patente US No. 7.083.970 e Patente US No. 7.045.337, que são incorporadas aqui por referência na sua totalidade.

[000253] Algumas modalidades da invenção usam polipeptídeos de bG-CSF que são substituídos em uma ou mais posições com um aminoácido para- acetilfenilalanina. A síntese de p-acetiI-(+/-)- fenilalanina e m-acetil-(+/-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), incorporado aqui por referência. Outros aminoácidos contendo carbonil ou dicarbonil podem ser igualmente preparados por uma pessoa versada na técnica. Além disso, sínteses exemplares não limitantes de aminoácidos não naturais de que são incluídos neste documento são apresentados nas Figuras. 4, 24-34 e 36-39 de patentes US No. 7.083.970, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade.

[000254] Os aminoácidos com um grupo reativo eletrofílico permitem uma variedade de reações para ligar moléculas por meio de reações de adição nucleofílica, entre outras. Tais grupos reativos eletrofílicos incluem um grupo carbonil (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonil), um grupo tipo carbonil (que possui reatividade semelhante a de um grupo carbonil (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonil) e é estruturalmente similar a um grupo carbonil), um grupo carbonil mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo carbonil (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonílico)), ou um grupo carbonil protegido (que tem reatividade similar a de um grupo carbonil (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonil) mediante a desproteção). Esses aminoácidos incluem aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (IV):

em que:A é opcional, e quando presente é alquileno inferior,alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-,-C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')- , -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-,-CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, - N(R')C(O)O-,-S(O)kN(R’)-,-N(R')C(O)N(R')-,-N(R’)C(S)N(R’)-,- N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R’)=N-N=, - C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R') -, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído;

R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; cada R’’ é independentemente H, alquil, alquil substituído, ou um grupo de proteção, ou quando mais de um grupo R" está presente, dois R", opcionalmente, formam um heterocicloalquil; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um dentre R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquil inferior, alquil inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3, opcionalmente, formam um cicloalquil ou um heterocicloalquil; ou os grupos A-B-J-R juntos formam um cicloalquil bicíclico ou tricíclico ou heterocicloalquil compreendendo pelo menos um grupo carbonil, incluindo um grupo dicarbonil, grupo carbonil protegido; incluindo um grupo dicarbonil protegido, ou grupo carbonil mascarado, incluindo um grupo dicarbonil mascarado; ou o grupo -J-R juntos formam um cicloalquil ou heterocicloalquil monocíclico ou bicíclico compreendendo pelo menos um grupo carbonil, incluindo um grupo dicarbonil, grupo carbonil protegido, incluindo um grupo dicarbonil protegido, ou grupo carbonil mascarado, incluindo um grupo dicarbonil mascarado; com a condição de que, quando A é fenileno e cada R3 é H, B está presente; e que quando A é um -(CH2)4 - e cada R3 é H, B não é -NHC(O)(CH2CH2)-; e que, quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R não é metil.

[000255] Além disso, tendo a estrutura da Fórmula (V) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-,-C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')- , -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-,-CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, - N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R’)C(S)N(R’)-, - N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R’)=N-N=, - C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R') -, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 éopcional, equando presente, éOH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; coma condiçãode que, quando Aé fenileno, B está presente;e quequando A éum -(CH2)4, B não é-NHC(O)(CH2CH2)-; e que, quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R não é metil.

[000256] Além disso, os aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (VI) estão incluídos:

em que: B é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, - N(R')C(O)O-,-S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-,-N(R’)C(S)N(R’)-,- N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R’)=N-N=, - C(R’)2-N=N-,e -C(R’)2-N(R')-N(R') -, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1é opcional,e quando presente, é H,umgrupode proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2é opcional,e quando presente, é OH,umgrupode proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquil, alquil substituído, -N(R’)2, - C(O)kR’, em que k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, OR’, e -S(O)kR’, em que cada 'R é independentemente H, alquil ou alquil substituído.

[000257] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:

em que tais compostos são, opcionalmente, grupo amino protegido, carboxil protegido ou um sal dos mesmos. Além disso, qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural.

[000258] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (VII) estão incluídos:

em que: B é opcional, e quando está presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-,-S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, - S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquilenosubstituído)-,-C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-,-C(R’)=N-N=,-C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R') -, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquil, alquil substituído, -N(R’)2,- C(O)kR’, em que k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, OR’, e -S(O)kR’, em que cada R’ é independentemente H, alquil ou alquil substituído; e n é 0 a 8; com a condição de que quando A é -(CH2)4-, B não é - NHC(O)(CH2CH2)-.

[000259] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:

em que tais compostos são opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxil protegidos, opcionalmente amino protegidos e carboxil protegidos, ou um sal dos mesmos. Além disso, esses aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural.

[000260] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (VIII) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-,-C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')- , -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-,-CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, - N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R’)C(S)N(R’)-, - N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R’)=N-N=, - C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R') -, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo;

[000261] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (IX) estão incluídos:

B é opcional, e quando está presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-,-S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, - S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R')-, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquil, alquil substituído, - N(R’)2, -C(O)kR’, em que k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, em cada R' é independentemente H, alquil, ou alquil substituído.

[000262] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:

[000263] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (X) estão incluídos:

em que B é opcional, e quando está presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-,-S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, - S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R')-, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquil, alquil substituído, - N(R’)2, -C(O)kR’, em que k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, em cada R' é independentemente H, alquil, ou alquil substituído, e n é 0 a 8.

[000264] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:

[000265] Além das estruturas monocarbonil, os aminoácidos não naturais descritos neste documento podem incluir grupos tais como dicarbonil, tipo dicarbonil, grupos dicarbonil mascarados e dicarbonil protegidos.

[000266] Por exemplo, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (XI) estão incluídos:

em que A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído,alquinileno,heteroalquilenoinferior, heteroalquilenosubstituído,heterocicloalquilenoinferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, -S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-,-C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')- , -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-,-CON(R')- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, - N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R’)C(S)N(R’)-, - N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R’)=N-N=, - C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R') -, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1é opcional,e quando presente, é H,umgrupode proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2é opcional,e quando presente, é OH,umgrupode proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo;

[000267] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (XII) estão incluídos:

em que B é opcional, e quando está presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-,-S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, - S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R’)C(S)N(R’)-,-N(R’)S(O)kN(R’)-,N-(R')-N=,-C(R')=N-,-C(R')=N- N(R')-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R')-, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquil, alquil substituído, - N(R’)2, -C(O)kR’, em que k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, em cada R' é independentemente H, alquil, ou alquil substituído.

[000268] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:

’ em que tais compostos são opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxil protegidos, opcionalmente amino protegidos e carboxil protegidos, ou um sal dos mesmos. Além disso, estes aminoácidos não naturais qualquer um dos seguintes aminoácidos não natuaris podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural.

[000269] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (XIII) estão incluídos:

em que em que B é opcional, e quando está presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-,-S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- em que k é 1, 2 ou 3, - S(O)k (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, N-(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R')-N(R')-, em que cada R’ é independentemente H, alquil, ou alquil substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquil, alquil substituído, - N(R’)2, -C(O)kR’, em que k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, em cada R' é independentemente H, alquil, ou alquil substituído, e n é 0 a 8.

[000270] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:

[000271] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (XIV) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), em que R' é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil, ou cicloalquil substituído.

[000272] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (XIV-A) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), em que R' é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído.

[000273] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estruturada fórmula (XIV-B) estão incluídos:

[000274] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (XV) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5, e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado a partir grupo que consiste em H, alcóxi, alquilmina, halogênio, alquil, aril, ou qualquer um dentre R8 e R9 pode, em conjunto, formar =O ou um cicloalquil, ou qualquer um dos grupos R8 adjacentes pode, em conjunto, formar um cicloalquil.

[000275] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (XV-A) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5, e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado a partir grupo que consiste em H, alcóxi, alquilmina, halogênio, alquil, aril, ou qualquer um dentre R8 e R9 pode, em conjunto, formar =O ou um cicloalquil, ou qualquer um dos grupos R8 adjacentes pode, em conjunto, formar um cicloalquil.

[000276] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (XV-B) estão incluídos:

[000277] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (XVI) estão incluídos;

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R') (alquileno) ou N(R') (alquileno substituído), em que R' é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído.

[000278] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (XVI-A) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno alquileno, substituídos N (R ') (alquileno) ou N (R') (alquileno substituído), onde R 'é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil, cicloalquil ou substituídos.

[000279] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm a estrutura da fórmula (XVI-B) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído N(R') (alquileno) ou N (R') (alquileno substituído), em que R' é H, alquil, alquil substituído, cicloalquil, ou cicloalquil substituído.

[000280] Além disso, os aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula(XVII) estão incluídos:

em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído;

em que (a) indica ligação com o grupo A e (b) indica a ligação com os respectivos grupos carbonil, R3 e R4 são independentemente escolhidos a partir de H, halogênio, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 opcionalmente formam um cicloalquil, ou um heterocicloalquil; R é H, halogênio, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; T3 é uma ligação, C(R)(R), O ou S, e R é H, halogênio, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo;

[000281] Além disso, os aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (XVIII) estão incluídos:

em que (a) indica ligação com o grupo A e (b) indica a ligação com os respectivos grupos carbonil, R3 e R4 são independentemente escolhidos a partir de H, halogênio, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 opcionalmente formam um cicloalquil, ou um heterocicloalquil; R é H, halogênio, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; T3 é uma ligação, C(R)(R), O ou S, e R é H, halogênio, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquil, alquil substituído, -N(R’)2, - C(O)kR’, em que k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, em cada R' é independentemente H, alquil, ou alquil substituído.

[000282] Além disso, os aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula (XIX) estão incluídos:

em que: R é H, halogênio, alquil, alquil substituído, cicloalquil ou cicloalquil substituído; e T3 é O, ou S.

[000283] Além disso, os aminoácidos que têm a estrutura da Fórmula(XX) estão incluídos:

em que: R é H, halogênio, alquil, alquil substituído, cicloalquil, ou cicloalquil substituído.

[000284] Além disso, os seguintes aminoácidos que têm estruturas de Fórmula (XXI) estão incluídos:

[000285] Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido natural não é quimicamente modificado para gerar um grupo funcional carbonil ou dicarbonil reativo. Por exemplo, uma funcionalidade de aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade tendo grupos amino e hidroxil adjacentes. Quando a molécula biologicamente ativa é um polipeptídeo, por exemplo, uma serina ou treonina N-terminal (que pode normalmente estar presente ou pode estar exposta por meio de digestão química ou enzimática) pode ser usada para gerar uma funcionalidade de aldeído em condições de clivagem oxidativa moderada usando periodato. Veja, por exemplo, Gaertner, et. al. Bioconjug. Chem.3: 262-268 (1992); Geoghegan, K.,& J. Stroh, Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992);. Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Entretanto, os métodos conhecidos na arte são restritos ao aminoácido no N-terminal do peptídeo ou proteína.

[000286] Na presente invenção, um aminoácido não natural que apresenta grupos amina e hidroxil adjacentes pode ser incorporado no polipeptídeo como uma funcionalidade de aldeído "mascarada". Por exemplo, a 5-hidróxi lisina tem um grupo hidroxil adjacente à amina épsilon. As condições reacionais para gerar o aldeído tipicamente envolvem a adição de excesso molar de periodato de sódio em condições moderadas para evitar a oxidação em outros sítios dentro do polipeptídeo. O pH da reação de oxidação é normalmente cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 molar em excesso de meta-periodato de sódio para uma solução tampão do polipeptídeo, seguido de incubação por aproximadamente 10 minutos no escuro. Veja, por exemplo, a Patente US No. 6.423.685.

[000287] A funcionalidade carbonil ou dicarbonil pode ser reagida seletivamente com um reagente contendo hidroxilamina sob condições moderadas em solução aquosa para formar a ligação oxima correspondente, que é estável sob condições fisiológicas. Veja, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao J. e Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além disso, a reatividade única do grupo carbonil ou dicarbonil permite a modificação seletiva na presença de outras cadeias laterais de aminoácidos. Veja, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc.118:8150-8151(1996); K. F. Geoghegan, & Stroh, J. G.,Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).

Estrutura e Síntese de Aminoácidos Não Naturais: Aminoácidos Contendo Hidroxilamina

[000288] O pedido de Patente Provisório US No. 60/638.418 é incorporado aqui por referência na sua totalidade. Desse modo, as divulgações previstas na Seção V (intitulada "Aminoácidos não naturais"), na Parte B (intitulado "Estrutura e Síntese de Aminoácidos não naturais: Aminoácidos Contendo Hidroxilamina"), no pedido de Patente Provisório US No. 60/638.418 aplicam-se copletamente aos métodos, composições (incluindo fórmulas I-XXXV), técnicas e estratégias para preparação, purificação, caracterização e uso de aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácidos não naturais e polipeptídeos de aminoácidos não naturais modificados descritos aqui da mesma forma como se tais divulgações fossem completamente apresentadas aqui. As Publicações de Patente US Nos. 2006/0194256,2006/0217532, e 2006/0217289 e o WO 2006/069246 intitulado “Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides” (Composições contendo, os métodos que envolvem, e uso de aminoácidos e polipeptídeos não naturais) também são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

SÍNTESE QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS

[000289] Muitos dos aminoácidos não naturais adequados para o uso na presente invenção estão disponíveis comercialmente, por exemplo, em Sigma (EUA) ou Aldrich (Milwaukee, WI, EUA). Aqueles que não estão disponíveis comercialmente são, opcionalmente, sintetizados, tal como previsto aqui ou como previsto em várias publicações ou são preparados usando métodos padrões conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Para técnicas de síntese orgânica, ver, por exemplo, Organic Chemistry de Fessendon e Fessendon, (1982, segunda edição, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry de March (Terceira Edição, 1985, Wiley e Sons, Nova Iorque); e Advanced Organic Chemistry de Carey e Sundberg (Terceira Edição, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova Iorque). Publicações adicionais que descrevem a síntese de aminoácidos não naturais incluem, por exemplo, WO 2002/085923, intitulado “In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas et al., (1995) J. Med, Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glulamine and of Y- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc, 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-l- methylbutyl] amino] quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 11671170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem., 54, 1859 - 1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L- Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alpha-AminoAcids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D- alpha-Amino-adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; e, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2- aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Veja também a publicação de pedido de Patente US No. US 2004/0198637 intitulada "Protein Arrays”, que é incorporada aqui por referência.

A.Grupos Carbonil Reativos

[000290] Os aminoácidos com um grupo carbonil reativo permitem uma variedade de reações para ligar moléculas (incluindo, mas não limitado a PEG ou outras moléculas solúveis em água) por meio de adição nucleofílica ou reações de condensação aldólica entre outras.

[000291] Aminoácidos exemplares contendo carbonil podem ser representados da seguinte forma:

em que n é 0 - 10, R1 é um alquil, aril, alquil substituído, ou aril substituído, R2 é H, alquil, aril, alquil substituído, e aril substituído, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação amino terminal, e R4 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação carbóxi terminal. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenil e R2 é um alquil simples (ou seja, metil, etil ou propil) e o grupamento cetona é posicionado na posição para em relação à cadeia lateral alquílica. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenil e R2 é uma alquil simples (ou seja, metil, etil ou propil) e o grupamento cetona é posicionado na posição meta em relação à cadeia lateral alquílica.

[000292] A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-)- fenilalanina é descrito em Zhang, Z. et al, Biochemistry 42:. 6735-6746 (2003), que é incorporado aqui por referência. Outros aminoácidos contendo carbonil podem ser similarmente preparados por uma pessoa versada na técnica.

[000293] Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural é quimicamente modificado para gerar um grupo funcional carbonil reativo. Por exemplo, uma funcionalidade de aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade tendo grupos amino e hidroxil adjacentes. Quando a molécula biologicamente ativa é um polipeptídeo, por exemplo, uma serina ou treonina N-terminal (que pode normalmente estar presente ou pode ser exposta por meio de digestão química ou enzimática) pode ser usada para gerar uma funcionalidade de aldeído em condições de clivagem oxidativa moderada usando o periodato. Veja, por exemplo, Gaertner, et al. Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); K. Geoghegan, & Stroh, J., Bioconjug Chem. 3:138 - 146 (1992); Gaertner et al, J. Biol.. Chem. 269:7224-7230 (1994). Entretanto, os métodos conhecidos na arte são restritos aos aminoácidos no N-terminal do peptídeo ou proteína.

[000294] Na presente invenção, um aminoácido não natural que apresenta grupos amina e hidroxil adjacentes pode ser incorporado no polipeptídeo como uma funcionalidade de aldeído "mascarada". Por exemplo, a 5-hidróxi lisina tem um grupo hidroxil adjacente à amina épsilon. As condições reacionais para gerar o aldeído tipicamente envolvem a adição de excesso molar de periodato de sódio em condições moderadas para evitar a oxidação em outros sítios dentro do polipeptídeo. O pH da reação de oxidação é normalmente cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 molar em excesso de meta-periodato de sódio para uma solução tampão do polipeptídeo, seguido de incubação por aproximadamente 10 minutos no escuro. Veja, por exemplo, a Patente US No. 6.423.685.

[000295] A funcionalidade carbonil pode ser reagida seletivamente com uma hidrazida, hidroxilamina-, ou reagente contendo semicarbazida sob condições moderadas em solução aquosa para formar a ligação de hidrazona, oxima ou semicarbazona correspondente, que são estáveis sob condições fisiológicas. Veja, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao J. e Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além disso, a reatividade única do grupo carbonil permite a modificação seletiva na presença de outras cadeias laterais de aminoácidos. Veja, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); K. F. Geoghegan, & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).

B.Grupos Hidrazina, Hidrazida ou Semicarbazida Reativos

[000296] Os aminoácidos codificados de forma não natural que contém um grupo nucleofílico, tal como hidrazina, hidrazida ou semicarbazida, permitem a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, mas não limitado a conjugados com PEG ou com outros polímeros solúveis em água).

[000297] Os aminoácidos contendo hidrazina, hidrazida, ou semicarbazida exemplares podem ser representados da seguinte forma:

em que n é 0 - 10, R1 é um alquil, aril, alquil substituído, ou aril substituído ou não está presente, X é O, N, S ou não está presente, R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação amino terminal, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação carbóxi terminal.

[000298] Em algumas modalidades, n é 4, R1 não está presente, e X é N. Em algumas modalidades, n é 2, R1 não está presente, e X não está presente. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenil, X é O, e o átomo de oxigênio está na posição para ao grupo alifático no anel aril.

[000299] Os aminoácidos contendo hidrazida-, hidrazina-, e semicarbazida estão disponíveis a partir de fontes comerciais. Por exemplo, L-glutamato- Y—hidrazida é disponível a partir de Sigma Chemical (St. Louis, MO). Outros aminoácidosnão disponíveiscomercialmente podem ser preparados por uma pessoa versada na técnica. Veja, por exemplo, a Pat. US No. 6.281.211, que é incorporada aqui por referência.

[000300] Aminoácidos codificados de forma não natural contendo Polipeptídeos que apresentam funcionalidades de hidrazida, hidrazina, ou semicarbazida podem ser reagidos de forma eficiente e seletiva com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química similar. Ver, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). A reatividade única de grupos funcionais hidrazida, hidrazina e semicarbazida torna-os significativamente mais reativos para aldeídos, cetonas e outros grupos eletrofílicos em comparação com os grupos nucleofílicos presentes nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não limitado a grupo hidroxil de serina ou treonina ou grupos amino de lisina e do N-terminal).

C.Aminoácidos Contendo Amino-oxi

[000301] Os aminoácidos codificados de forma não natural contendo um grupo amino-oxi (também chamados de hidroxilamina) permitem a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, mas não limitado a conjugados com PEG ou outros polímeros solúveis em água). Tal como as hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a nucleofilicidade intensificada do grupo amino-oxi permite que o mesmo reaja de forma eficiente e seletiva com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química semelhante. Ver, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Considerando o resultado da reação com um grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, no entanto, uma oxima resulta é em geral a partir da reação de um grupo amino-oxi com um grupo que contêm carbonil, tal como uma cetona.

[000302] Aminoácidos exemplares contendo grupos amino-oxi podem ser representados como segue:

em que n é 0 - 10, R1 é um alquil, aril, alquil substituído, ou aril substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 - 10, Y = C(O) ou não está presente; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação amino terminal, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação carbóxi terminal. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenil, X é O, m é 1, e Y está presente. Em algumas modalidades, n é 2, R1 e X não estão presentes, m é 0, e Y não está presente.

[000303] Os aminoácidos contendo amino-oxi podem ser preparados a partir de precursores de aminoácidos facilmente disponíveis (homosserina, serina e treonina). Ver, por exemplo, M. Carrasco e R. Brown, J. Org. Chem. 68:8853-8858(2003). Certos aminoácidos contendo amino-oxi, tais como ácido L-2-amino-4-(amino-oxi) butírico, foram isolados de fontes naturais (Rosenthal, G., Life Sci 60: 16351641(1997). Outros aminoácidos contendo amino-oxi podem serpreparados por uma pessoa versada na técnica.

D.Grupos Azida e Alquino Reativos

[000304] A reatividade única de grupos funcionais azida e alquino torna estes grupos extremamente úteis para a modificação seletiva de polipeptídeos e outras moléculas biológicas. As azidas orgânicas, particularmente azidas alifáticas e os alquinos são geralmente estáveis para as condições químicas reativas comuns. Em particular, ambos os grupos funcionais azida e alquino são inertes para as cadeias laterais (ou seja, os grupos R) dos 20 aminoácidos comuns encontrados nos polipeptídeos de ocorrência natural. Quando levados em proximidade, no entanto, a natureza de "mola" (spring-loaded) da azida e dos grupos alquino é revelada e eles reagem de forma seletiva e eficiente através da reação de cicloadição [3 +2] de Huisgen para gerar os triazóis correspondentes, Ver, por exemplo, Chin J. et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003), Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).

[000305] Devido a reação de cicloadição de Huisgen envolver uma reação de cicloadição seletiva (ver, por exemplo, Padwa, A., em COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. em 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A.,1984), p. 1-176) ao invés de uma substituição nucleofílica, a incorporação de aminoácidos codificados de forma não natural que apresentam cadeias laterais contendo alquino e azida permite que os polipeptídeos resultantes sejam modificados de forma seletiva na posição do aminoácido codificado de forma não natural. A reação de cicloadição envolvendo polipeptídeo de bG-CSF contendo azida ou alquino pode ser realizada à temperatura ambiente em condições aquosas pela adição de Cu (II) (incluindo, mas não limitado a, sob a forma de uma quantidade catalítica de CuSO4) na presença de um agente redutor para a redução de Cu (II) para Cu (I), in situ, em quantidade catalítica. Ver, por exemplo, Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Agentes redutores exemplares compreendem, incluindo, mas não limitado a ascorbato, cobre metálico, quinino, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2+ Co2+, e um potencial elétrico aplicado.

[000306] Em alguns casos, quando uma reação de cicloadição [3 +2] de Huisgen entre uma azida e um alquino é desejada, o polipeptídeo de bG-CSF compreende um aminoácido codificado de forma não natural compreendendo um grupamento de alquino e o polímero solúvel em água para ser fixo ao aminoácido compreende um grupamento de azida. Alternativamente, a reação inversa (ou seja, com o grupamento de azida sobre o aminoácido e o grupamento de alquino presente no polímero solúvel em água) também pode ser realizada.

[000307] O grupo funcional azida pode ser seletivamente reagido com um polímero solúvel em água contendo um aril éster e apropriadamente funcionalizado com um grupamento de aril fosfina para gerar uma ligação de amida. O grupo aril fosfina reduz a azida in situ e a amina resultante reage eficientemente com uma ligação éster proximal para gerar a amida correspondente. Ver, por exemplo, E. e C. Saxon Bertozzi, Science 287,2007-2010(2000). O aminoácido contendo azida pode ser uma alquil azida (incluindo, mas não limitado a ácido 2-amino-6-azida-1-hexanóico) ou uma aril azida (p-azida- fenilalanina).

[000308] Polímeros solúveis em água contendo um grupamento de aril éster e de fosfina exemplares podem ser representados como segue;

em que X pode ser O, S N3 ou não está presente, o Ph é fenil, W é um polímero solúvel em água e R pode ser H, alquil, aril, alquil substituído e grupos aril substituídos. Grupos R exemplares incluem, mas não estão limitados a -CH2, -C(CH3)3, -OR’, -NR’R’’, -SR’, -halogênio, -C(O)R’, -CONR’R’’, - S(O)2R’, -S(O)2NR'R", -CN e -NO2, R',R’’,R’’’ e R’’’’ se referem, cada um, independentemente a hidrogênio, heteroalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, incluindo mas não limitado a, aril substituído com 1 a 3 halogênios, grupos alquil substituído ou não substituído, alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arillquil. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como é cada um dos grupos R', R", R’’’ e R’’’’ quando mais de um desses grupos está presente. Quando R' e R" estão fixos ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel com 5-, 6, ou 7- membros. Por exemplo, o R-NR’R’’ é destinado a incluir, mas não se limitando a, 1-pirrolidinil e 4-morfolinil. A partir da discussão de substituintes acima, uma pessoa versada na técnica vai entender que o termo “alquil” se destina a incluir os grupos, incluindo átomos de carbono ligados a grupos diferentes do grupos hidrogênio, tais como haloalquil (incluindo mas não limitado a, -CF3 e -CH2CF3) e acil (incluindo, mas não limitado a, -C(O)CH3, -C(O)CF3, CH2OCH3-C(O), e semelhantes).

[000309] O grupo funcional azida pode ser seletivamente reagido com um polímero solúvel em água contendo um tioéster e apropriadamente funcionalizado com um grupamento de aril fosfina para gerar uma ligação de amida. O grupo aril fosfina reduz a azida in situ e a amina resultante, em seguida, reage de forma eficiente com a ligação de tioéster para gerar a amida correspondente. Os polímeros solúveis em água contendo um grupamento de fosfina e de tioéster exemplar podem ser representados como segue:

em que n é 1 - 10; X pode ser O, N, S ou não está presente, Ph é fenil e W é um polímero solúvel em água.

[000310] Os aminoácidos exemplares contendo alquino podem ser representados da seguinte forma:

em que n é 0 - 10, R1 é um alquil, aril, alquil substituído, ou aril substituído ou não estápresente; X éO,N, S ou não está presente; m é 0 - 10, R2 é H,um aminoácido,umpolipeptídeo, ouum grupo de modificação aminoterminal, e R3 éH,um aminoácido,um polipeptídeo, ou um grupode modificaçãocarbóxi terminal.Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenil, X não está presente, m é 0 e o grupamento de acetileno está posicionado na posição para em relação à cadeia lateral alquílica. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenil, X é O, m é 1 e o grupo propargilóxi está posicionado na posição para em relação à cadeia lateral alquílica (ou seja, O-propargil-tirosina). Em algumas modalidades, n é 1, R1 e X não estão presentes e m é 0 (ou seja, proparilglicina).

[000311] Os aminoácidos contendo alquino estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, a propargilglicina está disponível comercialmente a partir de Peptech (Burlington, MA). Alternativamente, os aminoácidos contendo alquino podem ser preparados de acordo com métodos padronizados. Por exemplo, a p- propargiloxifenilalanina pode ser sintetizada, por exemplo, tal como descrito em Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), e a 4-alquinil-L-fenilalanina pode ser sintetizadatal como descrito em Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Outros aminoácidos contendo alquino podem ser preparados por uma pessoa versada na técnica.

[000312] Os aminoácidos exemplares contendo azida podem ser representados da seguinte forma:

em que n é 0 - 10, R1 é um alquil, aril, alquil substituído, aril substituído ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 - 10, R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação amino terminal, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação carbóxi terminal. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenil, X não está presente, m é 0 e o grupamento azida está posicionado na posição para em relação a cadeia lateral alquílica. Em algumas modalidades, n é 0 - 4 e R1 e X não estão presentes, e m = 0. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenil, X é O, m 2 e é o grupamento β-azidaet0xi está posicionado na posição para em relação à cadeia lateral alquílica.

[000313] Os aminoácidos contendo azida estão disponíveis a partir de fontes comerciais. Por exemplo, a 4-azidafenilalanina pode ser obtida a partir da Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL). Para aqueles aminoácidos contendo azida que não estão disponíveis comercialmente, o grupo azida pode ser preparado relativamente de forma fácil, usando métodos padrões conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte, incluindo mas não limitado a, por meio de deslocamento de um grupo adequado deixando (incluindo, mas não se limitando a, haleto, mesilato, tosilato) ou por meio da abertura de uma lactona protegida adequadamente. Ver, por exemplo, Advanced Organic Chemistry de March (terceira edição, 1985, Wiley and Sons, Nova Iorque).

E.Grupos Aminotiol Reativos

[000314] A reatividade única de grupos funcionais de aminotiol beta- substituídos torna-os extremamente úteis para a modificação seletiva de polipeptídeos e outras moléculas biológicas que contêm grupos aldeídos através de formação da tiazolidina. Ver, por exemplo, J. Shao e J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117(14) 3893-3899. Em algumas modalidades, os aminoácidos de aminotiol beta-substituídos podem ser incorporados nos polipeptídeos de bG-CSF e, em seguida, reagidos com polímeros solúveis em água que compreendem uma funcionalidade de aldeído. Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água, conjugado de fármaco ou outra “carga útil” pode ser acoplada a um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido de aminotiol beta-substituído através da formação da tiazolidina.

F.Grupos Reativos Adicionais

[000315] Os grupos reativos adicionais e aminoácidos codificados de forma não natural incluindo, mas não limitado a, para-amino fenilalanina, que pode ser incorporada nos polipeptídeos de bG-CSF da invenção são descritos nos pedidos de patentes a seguir, os quais são incorporados aqui por referência na sua totalidade aqui: publicação de pedido de Patente US No. 2006/0194256, publicação de pedido de Patente US No. 2006/0217532, publicação de pedido de Patente US No. 2006/0217289, pedido de Patente Provisório US No. 60/755.338; pedido de Patente Provisório US No. 60/755, 711; pedido de Patente Provisório US No. 60/755.018; pedido internacional de patente No. PCT/US06/49397; WO 2006/069246; pedido de Patente Provisório US No.60/743.041; pedido de Patente Provisório US No. 60/743.040; pedido de patente internacional PCT No. US06/47822; pedido de Patente Provisório US No. 60/882.819; pedido de Patente Provisório US No. 60/882.500 e pedido de Patente Provisório US No. 60/870.594. Esses pedidos também discutem grupos reativos que podem estar presentes no PEG e outros polímeros incluindo, mas não limitado a grupos hidroxilamina (amino-oxi) para a conjugação.

ABSORÇÃO CELULAR DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS

[000316] A absorção de aminoácidos não naturais por uma célula é uma questão que é normalmente considerada na designação e seleção de aminoácidos não naturais incluindo, mas não limitado a incorporação em uma proteína. Por exemplo, a alta densidade de carga de a-aminoácidos sugere que estes compostos são improváveis de serem permeáveis à célula. Os aminoácidos naturais são levados para a célula eucariótica por meio de uma coleção de sistemas de transporte com base na proteína. Uma rápida triagem, que avalia que aminoácidos não naturais, se houver, são levados pelas células pode ser feita. Ver, por exemplo, os ensaios de toxicidade, por exemplo, na publicação de pedido de Patente US No. 2004/0198637 intitulado "Protein Arrays", que é incorporado aqui por referência, e Liu, D. R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Apesar da absorção ser facilmente analisada com vários ensaios, uma alternativa para designar aminoácidos não naturais, que são responsáveis por vias para absorção celular é fornecer vias biossintéticas para criar aminoácidos in vivo.

BIOSSÍNTESE DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS

[000317] Muitas vias biossintéticas já existem nas células para a produção de aminoácidos e outros compostos. Embora um método biossintético para um aminoácido não natural particular não exista na natureza, incluindo mas não limitado a, em uma célula, a invenção fornece esses métodos. Por exemplo, as vias biossintéticas de aminoácidos não naturais são opcionalmente gerados na célula hospedeira pela adição de novas enzimas ou modificação das vias da célula hospedeira existente. Novas enzimas adicionais são opcionalmente enzimas evoluídas que ocorrem de forma natural ou artificial. Por exemplo, a biossíntese de p-7-aminofenilalanina (como apresentado em um exemplo de WO 2002/085923, intitulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids”) depende da adição de uma combinação de enzimas conhecidas de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos em uma célula eucariótica, pela transformação da célula com um plasmídeo que compreende os genes. Os genes, quando expressos na célula, fornecem uma via enzimática para sintetizar o composto desejado. Exemplos de tipos de enzimas que são opcionalmente adicionadas são fornecidos nos exemplos abaixo. As sequências adicionais de enzimas são encontradas, por exemplo, no Banco de genes. As enzimas artificialmente evoluídas também são opcionalmente adicionadas em uma célula da mesma maneira. Desta forma, o maquinário e recursos celulares de uma célula são manipulados para produzir aminoácidos não naturais.

[000318] Uma variedade de métodos está disponível para a produção de novas enzimas para uso em vias biossintéticas ou para a evolução de vias existentes. Por exemplo, a recombinação recursiva incluindo, mas não limitado a recombinação desenvolvida por Maxigen, Inc. (disponível na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) em maxigen.com), é opcionalmente usada para desenvolver novas enzimas e vias. Ver, por exemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; e, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 91:10747-10751. Da mesma forma, DesignPathTM desenvolvida pela Genencor (disponível na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) em genencor.com), opcionalmente, é usado para a construção da via metabólica incluindo mas não limitado a construção de uma via para a criação de O-metil-L-tirosina em uma célula. Esta tecnologia reconstrói vias existentes em organismos hospedeiros usando uma combinação de genes novos incluindo, mas não limitado a aqueles identificados através de genômicas funcionais, evolução e modelagem molecular. Diversa Corporation (disponível na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) em diversa.com) também fornece tecnologia para uma rápida triagem de bibliotecas de genes e vias de genes incluindo, mas não limitado a vias para criar novas vias.

[000319] Normalmente, o aminoácido não natural produzido com uma via biossintética construída da invenção é produzida em uma concentração suficiente para a biossíntese de proteínas eficientes incluindo, mas não limitado a uma quantidade celular natural, mas não a tal ponto de afetar a concentração de outros aminoácidos ou esgotar os recursos celulares. As concentrações mais comuns produzidas in vivo dessa maneira são de cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mM. Uma vez que uma célula é transformada com um plasmídeo que compreende os genes usados para a produção de enzimas desejadas para uma via específica e um aminoácido não natural é gerado, as seleções in vivo são opcionalmente usadas para otimizar ainda mais a produção do aminoácido não natural tanto para a síntese da proteína ribossomal quanto para o crescimento celular.

POLIPEPTÍDEOS COM AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS

[000320] A incorporação de um aminoácido não natural pode ser feita para uma variedade de propósitos incluindo, mas não limitado a, adaptação às mudanças na estrutura e/ou função da proteína, alteração do tamanho, acidez, nucleofilicidade, ligações de hidrogênio, hidrofobicidade, acessibilidade de sítios que têm como alvo a protease, direcionamento de um grupamento (incluindo, mas não limitado a, para uma matriz de proteína), adição de uma molécula biologicamente ativa, fixação de um polímero, fixação de um radionuclídeo, modulação da meia vida sérica, modulação da penetração nos tecidos (por exemplo, tumores), modulação de transportes ativos, modulação da especificidade ou distribuição de células, tecidos ou órgãos, modulação da imunogenicidade, modulação da resistência de protease, etc.. As proteínas que incluem um aminoácido não natural podem ter propriedades catalíticas ou biofísicas intensificadas ou mesmo totalmente novas. Por exemplo, as seguintes propriedades são opcionalmente modificadas pela inclusão de um aminoácido natural em uma proteína: a toxicidade, biodistribuição,propriedadesestruturais,propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, capacidade catalítica, meia-vida (incluindo, mas não limitado a meia- vida sérica), a capacidade de reagir com outras moléculas incluindo, mas não limitado a, capacidade de reagir covalentemente ou não covalentemente, e semelhantes. As composições, incluindo as proteínas que incluem pelo menos um aminoácido não natural são úteis para, incluindo mas não limitado a, novas terapêuticas, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo, mas não limitado a, anticorpos), incluindo mas não limitado para o estudo da estrutura e função de proteínas. Ver, por exemplo, Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652.

[000321] Em um aspecto da invenção, uma composição inclui pelo menos uma proteína com pelo menos um, incluindo mas não limitado a, pelo menos dois, pelo menos três, menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez, ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser iguais ou diferentes podendo ser incluindo, mas não limitados a, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais aminoácidos não naturais diferentes. Em outro aspecto, uma composição inclui uma proteína com pelo menos um, mas menos do que todos, de um aminoácido particular presente na proteína que é substituído com o aminoácido não natural. Para uma determinada proteína com mais de um aminoácido não natural, os aminoácidos não naturais podem ser iguais ou diferentes (incluindo, mas não limitado, a proteína que pode incluir dois ou mais tipos diferentes de aminoácidos não naturais, ou pode incluir dois aminoácidos não naturais iguais). Para uma determinada proteína com mais de dois aminoácidos não naturais, os aminoácidos não naturais podem ser iguais, diferentes ou uma combinação de múltiplos aminoácidos não naturais do mesmo tipo com pelo menos um aminoácido não natural diferente.

[000322] As proteínas ou polipeptídeos de interesse com pelo menos um aminoácido não natural são uma característica da invenção. A invenção também inclui polipeptídeos ou proteínas com pelo menos um aminoácido não natural produzido a partir das composições e métodos da invenção. Um excipiente (incluindo, mas não limitado a um excipiente farmaceuticamente aceitável) também pode estar presente com a proteína.

[000323] Com a produção de proteínas ou polipeptídeos de interesse com pelo menos um aminoácido não natural nas células eucariontes, as proteínas ou polipeptídeos irão normalmente incluir modificações eucarióticas pós-translacionais. Em certas modalidades, uma proteína inclui pelo menos um aminoácido não natural e pelo menos uma modificação pós-translacional que é feita in vivo por uma célula eucariótica, em que as modificações pós-translacionais não são produzidas por uma célula procariótica. Por exemplo, a modificação pós-translacional inclui, mas não é limitada a acetilação, acilação, modificação de lipídios, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação de glicolipídeo, glicosilação, e semelhantes. Em um aspecto, as modificações pós-translacionais incluem a fixação de um oligossacarídeo (incluindo, mas não limitado a, (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)) a uma asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina. Veja a tabela 1 que lista alguns exemplos de oligossacarídeos N-ligados de proteínas eucarióticas (resíduos adicionais também podem estar presentes, os quais não são mostrados). Em outro aspecto, a modificação pós-translacional inclui a fixação de um oligossacarídeo (incluindo, mas não limitado a, Gal- GaINAc, Gal-GIcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação GalNAc-serina ou GalNAc-treonina, ou uma ligação GlcNAc-serina ou GlcNAc-treonina.Tabela 1: Exemplos de Oligossacarídeos Através de Ligação-GlcNAc

[000324] Ainda em outro aspecto, a modificação pós-translacional inclui o processamento proteolítico de precursores (incluindo, mas não limitado a, precursor da calcitonina, precursor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, hormônio pré-pró-paratireóide, pré-pró- insulina,pró-insulina,pré-pró-opiomelanocortina,pró- opiomelanocortina e semelhantes), a montagem em uma proteína com multi-subunidades ou montagem macromolecular, translado para outro sítio na célula (incluindo, mas não limitado a, para organelas, tal como o retículo endoplasmático, aparelho de Golgi, o núcleo, os lisossomos, peroxissomos, mitocôndrias, cloroplastos, vacúolos, etc., ou através da via secretória). Em certas modalidades, a proteína compreende uma sequência de secreção e localização, um epítopo marcador, um FLAG marcador, um marcador tipo polihistidina, uma fusão de GST, ou semelhante.

[000325] Uma vantagem de um aminoácido não natural é que ele apresenta grupamentos químicos adicionais que podem ser usados para adicionar moléculas adicionais. Essas modificações podem ser feitas in vivo em uma célula eucariótica ou não eucarióticas, ou in vitro. Assim, em certas modalidades, a modificação pós-translacional é feita através do aminoácido não natural. Por exemplo, a modificação pós- translacional pode ser por meio de uma reação nucleofílica-eletrofílica. A maioria das reações atualmente usadas para a modificação seletiva de proteínas envolve a formação de ligação covalente entre os parceiros de reação nucleofílica e eletrofílica, incluindo, mas não limitado, a reação de α-halocetonas com cadeias laterais de histidina ou cisteína. A seletividade nestes casos é determinada pelo número e acessibilidade dos resíduos nucleofílicos na proteína. Nas proteínas da invenção, outras reações mais seletivas podem ser usadas, tais como a reação de um ceto-aminoácido não natural com compostos de hidrazidas e amino-oxi, in vitro e in vivo. Veja, por exemplo, Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science. 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026- 9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99:11020-11024 Wang, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100:56-6; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:67356746; e, Chin, et al., (2003) Science. 301 :964-, que são incorporados aqui por referência. Isso permite a marcação selectiva de praticamente qualquer proteína com um hospedeiro dos reagentes incluindo fluoróforos, agentes de reticulação, derivados de sacarídeo e moléculas citotóxicas. Veja também, Patente US No. 6.927.042, intitulada "Glycoprotein synthesis", que é incorporada aqui por referência. As modificações pós-translacionais incluindo, mas não limitadas a, por meio de um aminoácido com azida, também podem ser feitas através da ligação de Staudinger (incluindo, mas não limitado a, com reagentes triarilfosfina). Ver, por exemplo, Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:1924.

[000326] Esta invenção fornece outro método altamente eficiente para a modificação seletiva de proteínas, que envolve a incorporação genética de aminoácidos não naturais incluindo, mas não limitado àqueles contendo um grupamento de azida ou alquinil nas proteínas em resposta a um códon seletor. Essas cadeias laterais de aminoácido podem ser modificadas por, mas não limitado a uma reação de cicloadição [3 +2] de Huisgen (ver, por exemplo, Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis. Vol. 4. (1991) Ed. Trost, B. M,, Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; ed, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Nova Iorque, p. 1-176) com, incluindo mas não limitado a, derivados de alquinil ou azida, respectivamente. Devido a esse método envolver uma cicloadição ao invés de uma substituição nucleofílica, as proteínas podem ser modificadas com seletividade extremamente alta. Essa reação pode ser realizada à temperatura ambiente em meio aquoso com excelente regiosseletividade (1,4>1,5) pela adição de quantidades catalíticas de Cu (I) sais para a mistura reacional. Veja, por exemplo, Tornoe, et al. (2002), J. Org. Chem. 67:3057-3064 e, Rostovtsev, et al., (2002). Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Outro método que pode ser usado é a troca de ligantes em um composto bi- arsênico com um motivo de tetracisteína, ver, por exemplo, Griffin et al., (1998) :269-281 Science 272.

[000327] Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção por meio de uma cicloadição [3 +2] inclui praticamente qualquer molécula com um derivado de azida ou alquinil. As moléculas incluem, mas não estão limitadas a, corantes, fluoróforos, agentes de reticulação, derivados de sacarídeo, polímeros (incluindo, mas não limitados a, derivados de polietileno glicol), fotoreticuladores, compostos citotóxicos, marcadores de afinidade, derivados de biotina, resinas, esferas, uma segunda proteína ou polipeptídeo (ou mais), polinucleotídeo(s) (incluindo, mas não limitados a, DNA, RNA, etc.), metais quelantes, co-fatores, ácidos graxos, carboidratos, e semelhantes. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo alquinil incluindo, mas não limitado a p-propargiloxifenilalanina, ou grupo azida incluindo, mas não limitado a, p-azida-fenilalanina, respectivamente.

V.Geração in vivo de Polipeptídeos de bG-CSF Compreendendo Aminoácidos Codificados de Forma Não Natural

[000328] Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção podem ser gerados in vivo usando tRNA e tRNA sintetases modificadas para adicionar ou substituir os aminoácidos que não são codificados em sistemas de ocorrência natural.

[000329] Os Métodos para a geração de tRNAs e tRNA sintetases que usam aminoácidos que não são codificados em sistemas de ocorrência natural são descritos, por exemplo, nas Patentes US No. 7.045.337 e 7.083.970, que são incorporadas aqui por referência. Estes métodos envolvem a geração de um maquinário de tradução que funciona independentemente das sintetases e tRNAs endógenos ao sistema de tradução (e, portanto, por vezes referido como "ortogonal"). Normalmente, o sistema de tradução compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e um aminoacil tRNA ortogonal sintetase (O- RS). Normalmente, o O-RS preferencialmente aminoacila os O-tRNA com pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural no sistema de tradução e o O-tRNA reconhece pelo menos um códon seletor que não é reconhecido por outros tRNAs no sistema. O sistema de tradução, portanto, insere o aminoácido codificado de forma não natural em uma proteína produzida no sistema, em resposta a um códon seletor codificado, assim, "substituindo" um aminoácido em uma posição no polipeptídeo codificado.

[000330] Uma grande variedade de tRNAs ortogonais e aminoacil tRNA sintetases foi descrita na arte de inserção de aminoácidos sintéticos particulares em polipeptídeos e são, geralmente, adequados para o uso na presente invenção. Por exemplo, O-tRNA ceto- específico / aminoacil-tRNA sintetases são descritos em Wang, L., et al. Proc. Natl Acad. Sci. 100:56-61 EUA (2003) e Zhang, Z. et al. Biochem. 42 (22: 6735-6746 (2003). Os O-RS exemplares, ou porções dos mesmos, são codificados por sequências de polinucleotídeos e incluem as sequências de aminoácidos divulgadas nas Patentes US Nos. 7.045.337 e 7.083.970, cada uma sendo incorporada aqui por referência. As moléculas de O-tRNA correspondentes para uso com os O-RSs também são descritas nas Patentes US Nos. 7.045.337 e 7.083.970, que são incorporadas aqui por referência. Exemplos adicionais de pares de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetases são descritos no WO 2005/007870, WO 2005/007624 e WO 2005/019415.

[000331] Um exemplo de um sistema de O-tRNA azida-específico /aminoacil-tRNA sintetase é descrito em Chin, J. W., et al., J. Am. Chem, Soc. 124:9026-9027(2002). As sequências de O-RS exemplares para o p-azida-L-Phe incluem, mas não estão limitado a, sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 14 - 16 e 29 - 32 e as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 46 -48 e 61 - 64, tal como divulgadas na Patente US No. 7.083.970, que é incorporada aqui por referência. As sequências de S-tRNA exemplares apropriadas para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 1 - 3, tal como divulgado na Patente US No. 7.083.970, que é incorporada aqui por referência. Outros exemplos de pares de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase específicos para aminoácidos codificados de forma não natural particulares são descritos na Patente US No. 7.045.337, que é incorporada aqui por referência. O O-RS e o O-tRNA que incorporam tanto aminoácidos contendo ceto quanto azida em Saccharomyces cerevisiae são descritos em Chin, J. W., et al., Science 301 :964-967 (2003).

[000332] Diversos outros pares ortogonais foram relatados. Glutaminil (ver, por exemplo, Liu, D. R., e Schultz, P. G. (1999). Proc Natl. Acad. Sci. 96:4780-4785 EUA), aspartil (ver, por exemplo, Pastrnak, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286) e sistemas de tirosina (ver, por exemplo, Ohno, S., et al, (1998) J. Biochem (Tóquio, JPN). 124:1065-1068; e, Kowal, A. K., et al., (2001) Proc Natl, Acad, Sci, EUA 98:2268-2273) derivados de tRNA de S. cerevisiae e sintetases foram descritos para a incorporação potencial de aminoácidos não naturais em E. coli. Sistemas derivados do E. coli glutaminil (ver, por exemplo, Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 98:2268-2273) e tirosil sintetases (ver, por exemplo, Edwards, H. e Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641) foram descritas para uso em S. cerevisiae. O sistema tirosil E. coli foi usado para a incorporação de 3-iodo-L-tirosina, in vivo, em células de mamíferos. Veja, Sakamoto, K., et al. (2002) Nucleic acids Res. 30:4692-4699.

[000333] O uso de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetases envolve a seleção de um códon específico que codifica o aminoácido codificado de forma não natural. Embora qualquer códon possa ser usado, geralmente é desejável selecionar um códon que é raramente ou nunca usado na célula em que o O-tRNA / aminoacil-tRNA sintetase é expresso. Por exemplo, os códons exemplares incluemo códon nonsense, tais como os códons de parada (âmbar, ocre e opala), códons de quatro ou mais bases e outros códons de três bases naturais, de que são raramente usados ou não são usados.

[000334] O(s) códon(s) seletor específico(s) pode ser introduzido na posição apropriada na sequência que codifica o polinucleotídeo de bG- CSF usando métodos de mutagênese conhecidos na arte (incluindo, mas não limitados a, mutagênese sítio-específica, mutagênese de cassete, mutagênese de seleção de restrição, etc.).

[000335] Os métodos para a geração de componentes do maquinário biossintético da proteína, tal como O-RSs, O-tRNAs e pares O- tRNA/O-RS ortogonais que podem ser usados para incorporar um aminoácido codificado de forma não natural são descritos em Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001), Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 67356746 (2003). Os métodos e composições para a incorporação in vivo dos aminoácidos codificados de forma não natural são descritos na Patente US No. 7.045.337, que é incorporada aqui por referência. Os métodos para selecionar um par de tRNA ortogonal-tRNA sintetase para o uso em no sistema de tradução de um organismo vivo são também descritos nas Patentes US Nos. 7.045.337 e 7.083.970, que são incorporadas aqui por referência. A Publicação de PCT WO 04/035743, intitulado "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins", que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, descreve RS ortogonais e pares de tRNA para a incorporação de ceto aminoácidos. A Publicação de PCT WO 04/094593, intitulado "Expanding the Eukaryotic Genetic Code", que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, descreve RS ortogonais e pares de tRNA para a incorporação de aminoácidos codificados de forma não natural em células hospedeiras eucarióticas.

[000336] Os métodos para a produção de pelo menos um aminoacil- tRNA sintetase ortogonal recombinante (O-RS) inclui: (a) gerar uma biblioteca de (opcionalmente mutante) RSs derivados de pelo menos um aminoacil-tRNA sintetase (RS) a partir de um primeiro organismo incluindo, mas não limitado a, um organismo procariótico, tal como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacierium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. Horikoshi, A. pernix, T. thermophilus, ou semelhantes, ou um organismo eucariótico, (b) selecionar (e/ou fazer a triagem), da biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes de RSs) para os membros que aminoacilam um tRNA ortogonal (O-tRNA), na presença de um aminoácido codificado de forma não natural e de um aminoácido natural, fornecendo, assim, um agrupamento (pool) de RSs ativos (opcionalmente mutantes), e/ou (c) selecionar (opcionalmente, através de seleção negativa) o agrupamento para RSs ativos (incluindo mas não limitado a, RSs mutantes), que preferencialmente aminoacilam o O-tRNA na ausência do aminoácido codificado de forma não natural, assim, fornecendo o pelo menos um O-RS recombinante, em que pelo menos um O-RS recombinante aminoacila preferencialmente o O- fRNA com o aminoácido codificado de forma não natural.

[000337] Em uma modalidade, o RS é um RS inativo. O RS inativo pode ser gerado pela mutação de um RS ativo. Por exemplo, o RS inativo pode ser gerada pela mutação, pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, ou pelo menos cerca de 10 ou mais aminoácidos para diferentes aminoácidos, incluindo mas não limitado a, alanina.

[000338] As bibliotecas de RSs mutantes podem ser geradas usando várias técnicas conhecidas na arte incluindo, mas não limitadas a modelagem racional com base na estrutura tridimensional da proteína RS, ou mutagênese de nucleotídeos de RS em uma técnica de modelagem aleatória ou racional. Por exemplo, os RSs mutantes podem ser gerados por mutações sítio-específicas, mutações aleatórias, mutações de recombinação que geram diversidade, construções quiméricas, modelagem racional e por outros métodos aqui descritos ou conhecidos na arte.

[000339] Em uma modalidade, a seleção (e/ou triagem) da biblioteca de RSs (RSs opcionalmente mutantes) para os membros que estão ativos incluindo, mas não limitado a, aquele que aminoacila um tRNA ortogonal (O-tRNA), na presença de um aminoácido codificado de forma não natural e um aminoácido natural, inclui: introdução de um marcador de triagem ou seleção positiva incluindo, mas não limitado a, um gene de resistência antibiótica, ou semelhante, e a biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células, em que o marcador de seleção e/ou triagem positiva compreende pelo menos um códon seletor incluindo, mas não limitado a, uma códon âmbar, ocre, ou opala; o crescimento da pluralidade de células na presença de um agente de seleção; a identificação de células que sobrevivem (ou mostram uma resposta específica) na presença do agente de triagem e/ou seleção pela supressão de pelo menos um códon seletor no marcador de triagem ou seleção positiva, fornecendo, assim, um subconjunto de células selecionadas positivamente que contém o agrupamento (pool) de ativos de RSs (opcionalmente mutantes). Opcionalmente, a seleção e/ou concentração do agente de seleção e/ou triagem pode ser variada.

[000340] Em um aspecto, o marcador de seleção positiva é um gene cloranfenicol acetiltransferase (CAT) e o códon seletor é um códon âmbar de parada no gene com CAT. Opcionalmente, o marcador de seleção positiva é um gene β-lactamase e o códon seletor é um códon âmbar de parada no gene β-lactamase. Em outro aspecto, o marcador de triagem positiva compreende um marcador de triagem fluorescente ou luminescente, ou um marcador de triagem com base na afinidade (incluindo, mas não limitado a um marcador de superfície celular).

[000341] Em uma modalidade, o agrupamento (pool) de seleção ou triagem de forma negativa para RSs ativos (opcionalmente mutantes) que, preferencialmente, aminoacila os O-tRNA na ausência do aminoácido codificado de forma não natural inclui: a introdução de um marcador de seleção ou triagem negativa com o agrupamento (pool) de ativos de RSs (opcionalmente mutantes) a partir da seleção ou triagem positiva em uma pluralidade de células de um segundo organismo, em que o marcador de triagem ou seleção negativa compreende pelo menos um códon seletor (incluindo, mas não limitado a, um gene de resistência antibiótica incluindo, mas não limitado a, genes cloranfenicol acetiltransferases (CAT)); e identificação de células que sobrevivem ou apresentam uma resposta de triagem específica em um primeiro meio suplementado com o aminoácido codificado de forma não natural e um agente de triagem ou seleção, mas não conseguem sobreviver ou mostram a resposta específica em um segundo meio não suplementado com o aminoácido codificado de forma não natural e o agente de seleção ou triagem, desse modo, fornece células sobreviventes ou células de triagem com pelo menos um O-RS recombinante. Por exemplo, um protocolo de identificação do CAT, opcionalmente, age como uma seleção positiva e/ou uma triagem negativa na determinação de recombinantes de O- RS apropriados. Por exemplo, um agrupamento (pool) de clones, opcionalmente, é replicado em placas para contendo CAT (que compreende pelo menos um códon de seletor) com ou sem um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural. As colônias que crescem exclusivamente nas placas contendo aminoácidos codificados de forma não natural são, assim, consideradas como contendo o O-RS recombinante. Em um aspecto, a concentração do agente de seleção (e/ou triagem) é variada. Em alguns aspectos, o primeiro e/ou segundo organismo são diferentes. Assim, o primeiro e/ou segundo organismo opcionalmente compreende(m): um procarionte, um eucarionte, um mamífero, uma Escherichia coli, um fungo, uma levedura, uma arqueobactéria, uma Eubactéria, uma planta, um inseto, um protista, etc.. Em outras modalidades, o marcador de triagem é composto por um marcador de triagem fluorescente ou luminescente ou um marcador de triagem com base na afinidade.

[000342] Em outra modalidade, a triagem ou seleção (incluindo, mas não limitado a, triagem ou seleção selecionada negativamente) o agrupamento (pool) de ativos de RSs (opcionalmente mutantes) inclui: o isolamento do agrupamento (pool) de RSs mutantes ativos a partir da etapa de seleção positiva (b); introdução de um marcador de triagem ou seleção negativa, em que o marcador de triagem ou seleção negativa compreende pelo menos um códon seletor (incluindo, mas não limitado a, um gene marcador de tóxicos incluindo, mas não limitado, um gene da barnase ribonuclease incluindo pelo menos um códon seletor), e o agrupamento (pool) de RSs ativos (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células de um segundo organismo; e identificação das células que sobrevivem, ou mostram uma resposta de triagem específica em um primeiro meio não suplementado com o aminoácido codificado de forma não natural, mas não conseguem sobreviver ou mostrar uma resposta de triagem específica em um segundo meio suplementado com o aminoácido codificado de forma não natural, desse modo, fornecendo células sobreviventes ou de triagem com pelo menos um O-RS recombinante, em que pelo menos um O-RS recombinante é específico para os aminoácidos codificados de forma não natural. Em um aspecto, o pelo menos um códon de seletor compreende cerca de dois ou mais códons seletores. Essas modalidades, opcionalmente, podem incluir aquela em que o pelo menos um códon seletor compreende dois ou mais códons seletores, e em que o primeiro e o segundo organismos são diferentes (incluindo, mas não limitado a cada organismo que é opcionalmente, incluindo, mas não limitado a, um procarionte, um eucarionte, um mamífero, uma Escherichia coli, um fungo, uma levedura, uma arqueobactéria, uma eubactéria, uma planta, um inseto, um protista, etc.). Além disso, alguns aspectos incluem aqueles em que o marcador de seleção negativa compreende um gene da barnase ribonuclease (que compreende pelo menos um códon seletor). Outros aspectos incluem em que o marcador de triagem, opcionalmente, compreende um marcador de triagem fluorescente ou luminescente ou um marcador de seleção com base na afinidade. Nas modalidades aqui, as triagens e/ou seleções, opcionalmente, incluem a variação do rigor da triagem e/ou seleção.

[000343] Em uma modalidade, os métodos para a produção de pelo menos um aminoacil-tRNA recombinante sintetase ortogonal (O-RS) pode compreender adicionalmente: (d) o isolamento de pelo menos um O-RS recombinante; (e) a geração de um segundo conjunto de O- RS (opcionalmente mutado) derivado de pelo menos um O-RS recombinanante, e (f) repetição das etapas (b) e (c) até que um O-RS mutante, que compreende a capacidade de, preferencialmente, aminoacilar os O- tRNA, seja obtido. Opcionalmente, as etapas (d) - (f) são repetidas incluindo, mas não limitadas a, pelo menos cerca de duas vezes. Em um aspecto, o segundo conjunto de O-RS mutado derivada de pelo menos um O-RS recombinante pode ser gerado pela mutagênese incluindo, mas não limitado a mutagênese aleatória, mutagênese sítio-específica, recombinação ou uma combinação dos mesmos.

[000344] O rigor das etapas de seleção/triagem incluindo, mas não limitado, a etapa (b) de seleção/triagem positiva, a etapa (c) de seleção/triagem negativa, ou ambas as etapas (b) e (c) de triagem/seleção positiva e negativa, nos métodos descritos acima, inclui opcionalmente a variação do rigor de seleção/triagem. Em outra modalidade, a etapa (b) de seleção/triagem positiva, a etapa seleção (c) de seleção/triagem negativa, ou ambas as etapas (b) e (c) de seleção/triagem positiva e negativa compreendem o uso de um repórter, em que o repórter é detectado pela separação de células ativadas por fluorescência (FACS), ou em que o repórter é detectado por luminescência. Opcionalmente, o repórter é exibido em uma superfície celular, em uma exposição de fago ou semelhante, e é selecionado com base na atividade catalítica ou afinidade envolvendo o aminoácido codificado de forma não natural ou análogo. Em uma modalidade, a sintetase mutada é exibida em uma superfície celular, em uma exibição de fago ou semelhante.

[000345] Os métodos para a produção de um tRNA recombinante ortogonal (O-tRNA) incluem: (a) a geração de uma biblioteca de tRNAs mutantes derivados de pelo menos um tRNA incluindo, mas não limitado a, um supressor de tRNA, a partir de um primeiro organismo; (b) a seleção (incluindo, mas não limitado a, selecão negativa) ou a triagem da biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por um aminoacil-tRNA sintetase (RS) a partir de um segundo organismo na ausência de um RS a partir do primeiro organismo, desse modo, fornecendo um agrupamento (pool) de tRNAs (opcionalmente mutantes), e (c) a seleção ou triagem do agrupamento (pool) de tRNAs (opcionalmente mutantes) para os membros que são aminoacilados por um RS ortogonal introduzido (O-RS), desse modo, fornecendo pelo menos, um O- tRNA recombinante, em que pelo menos um O-tRNA recombinanante reconhece um códon seletor e não é reconhecido eficientemente pelo RS do segundo organismo e é, preferencialmente, aminoacilado pelo RS-O. Em algumas modalidades o pelo menos um tRNA é um tRNA supressor e/ou compreende uma única base com três códons de bases naturais e/ou não naturais, ou é um códon nonsense, um códon raro, um códon não natural, um códon que compreende pelo menos 4 bases, um códon âmbar, um códon ocre, ou um códon opala de parada. Em uma modalidade, o OtRNA recombinante possui uma melhoria de ortogonalidade. Será apreciado que, em algumas modalidades, o OtRNA, opcionalmente, é importado para um primeiro organismo a partir de um segundo organismo, sem a necessidade de modificação. Em várias modalidades, o primeiro e o segundo organismos são os mesmos ou diferentes e são, opcionalmente, escolhidos a partir de, incluindo mas não limitado a, procariontes (incluindo, mas não limitado a, Methanococcus jannaschii, Methanobacteriumthermoautotrophicum,Escherichiacoli, Halobacterium, etc.), eucariontes, mamíferos, fungos, leveduras, arqueobactérias, eubactérias, plantas, insetos, protistas, etc.. Além disso, o tRNA recombinante é opcionalmente aminoacilado por um aminoácido codificado de forma não natural, em que o aminoácido codificado de forma não natural é biossintetizado in vivo ou naturalmente ou através da manipulação genética. O aminoácido codificado de forma não natural, opcionalmente, é adicionado a um meio de crescimento para pelo menos o primeiro ou segundo organismo.

[000346] Em um aspecto, a seleção (incluindo, mas não limitado a, seleção negativa) ou a triagem da biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por um aminoacil- tRNA sintetase (etapa (b)) inclui: a introdução de um gene marcador tóxico, em que o gene marcador tóxico compreende pelo menos um dos códons seletores (ou um gene que leva à produção de um agente tóxico ou estático ou um gene essencial para o organismo, em que tal gene marcador compreende pelo menos um códon seletor) e a biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células do segundo organismo; e, seleção das células sobreviventes, em que as células sobreviventes contêm o conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) compreendendo pelo menos um tRNA ortogonal ou tRNA não funcional. Por exemplo, as células sobreviventes podem ser selecionadas pelo uso de um ensaio de comparação da razão densidade de celular.

[000347] Em outro aspecto, o gene marcador tóxico pode incluir dois ou mais códons seletores. Em outra modalidade dos métodos, o gene marcador de tóxicos é um gene da barnase ribonuclease, em que o gene da barnase ribonuclease compreende pelo menos um códon âmbar. Opcionalmente, o gene da barnase ribonuclease pode incluir dois ou mais códons âmbar.

[000348] Em uma modalidade, a seleção ou triagem do agrupamento (pool) de tRNAs (opcionalmente mutantes) para os membros que são aminoacilados por um RS ortogonal (O-RS) introduzido pode incluir: a introdução de uma seleção positiva ou gene marcador de triagem, em que o gene marcador positivo compreende um gene de resistência a fármaco (incluindo, mas não limitado, o gene β-lactamase, compreendendo pelo menos um dos códons seletores, tal como o pelo menos um códon âmbar de parada) ou um gene essencial para o organismo, ou um gene que leva a desintoxicação de um agente tóxico, juntamente com o O-RS, e o agrupamento (pool) de tRNAs (opcionalmente mutantes) em uma pluralidade de células do segundo organismo, e, identificação das células sobreviventes ou selecionadas cultivadas na presença de um agente de seleção ou triagem incluindo, mas não limitado a, um antibiótico, fornecendo, assim, um agrupamento (pool) de células que possuem o pelo menos um tRNA recombinante, quando o pelo menos um tRNA recombinante é aminoacilado pelo O-RS e insere um aminoácido em um produto de tradução codificado pelo gene marcador positivo, em resposta a pelo menos um dos códons seletores. Em outra modalidade, a concentração da seleção e/ou agente de seleção é variada.

[000349] Os métodos para a geração de pares de O-tRNA/O-RS específicos são fornecidos. Os métodos incluem: (a) a geração de uma biblioteca de tRNAs mutantes derivados de pelo menos um tRNA a partir de um primeiro organismo; (b) seleção ou triagem de forma negativa da biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que são aminoacilados por um aminoacil-tRNA sintetase (RS) a partir de um segundo organismo na ausência de um RS a partir do primeiro organismo, desse modo, fornecendo um conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes); (c) a seleção ou triagem do agrupamento (pool) de tRNAs (opcionalmente mutantes) para os membros que são aminoacilados por um RS (O-RS) ortogonal introduzido, desse modo, fornecendo pelo menos um O-tRNA recombinanante. O pelo menos um O-tRNA recombinante reconhece um códon seletor e não é reconhecido de forma eficiente pelo RS do segundo organismo e é preferencialmente aminoacilado pelo RS a partir do segundo organismo. O método também inclui (d) a geração de uma biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivados de pelo menos um aminoacil-tRNA sintetase (RS) a partir de um terceiro organismo; (e) a seleção ou triagem da biblioteca de RSs mutantes para os membros que, preferencialmente, aminoacilam pelo menos um O-tRNA recombinante na presença de um aminoácido codificado de forma não natural e um aminoácido natural, desse modo, fornecendo um conjunto de RSs ativos (opcionalmente mutantes); e (f) seleção ou triagem de forma negativa do agrupamento (pool) para RSs ativos (opcionalmente mutantes) que, preferencialmente, aminoacila pelo menos um O-tRNA recombinante na ausência do aminoácido codificado de forma não natural, desse modo, fornecendo o pelo menos um par de O-tRNA/O- RS específico, em que o pelo menos um par de O-tRNA/O-RS específico compreende pelo menos um O-RS recombinante, que é específico para o aminoácido codificado de forma do não natural e pelo menos um O-tRNA recombinanante. Os pares de O-tRNA/O-RS específicos produzidos pelos métodos estão incluídos. Por exemplo, o par de O-tRNA/O-RS específico pode incluir, mas não limitado a um par de mutRNATyr-mutTyrRS, tal como um par de mutRNATyr- SS12TyrRS, um par de mufRNALeu-mutLeuRS, um par de mutRNAThr-mutThrRS, um par de mutRNAGlu-mutGluRS, ou semelhante. Além disso, tais métodos incluem aqueles em que o primeiro e o terceiro organismos são os mesmos (incluindo, mas não limitado a Methanococcus jannaschii).

[000350] Os métodos de seleção de um par de tRNA sintetase-tRNA ortogonal para uso em um sistema de tradução in vivo de um segundo organismo são também incluídos na presente invenção. Os métodos incluem: a introdução de um gene marcador, um tRNA e um aminoacil- tRNA sintetase (RS) isolado ou derivado de um primeiro organismo em um primeiro conjunto de células do segundo organismo; a introdução do gene marcador e do tRNA em um conjunto de células duplicadas partir de um segundo organismo; e, para seleção de células sobreviventes no primeiro conjunto que não conseguem sobreviver no conjunto de células duplicadas ou a triagem de células que mostram uma resposta de triagem específico que não conseguem gerar essa resposta no conjunto de células duplicadas, em que o primeiro conjunto e o conjunto de células duplicadas são cultivados na presença de um agente de seleção ou triagem, em que as células sobreviventes ou selecionadas compreendem o par tRNA ortogonal- tRNA sintetase para o uso no sistema de tradução in vivo do segundo organismo. Em uma modalidade, a comparação e seleção ou triagem inclui um ensaio de complementação in vivo. A concentração do agente de seleção ou triagem pode ser variada.

[000351] Os organismos da presente invenção compreendem uma variedade de organismos e uma variedade de combinações. Por exemplo, o primeiro e o segundo organismos dos métodos da presente invenção podem ser iguais ou diferentes. Em uma modalidade, os organismos são, opcionalmente, um organismo procariótico incluindo, mas não limitado a Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, A. horikoshii, A. pernix, T. thermophilics, ou semelhantes. Alternativamente, os organismos opcionalmente compreendem um organismo eucariótico incluindo, mas não limitado a plantas (incluindo, mas não limitado a, plantas complexas, tais como monocotiledôneas ou dicotiledôneas), algas, protistas, fungos (incluindo, mas não limitado a, levedura, etc.), animais (incluindo, mas não limitado a, mamíferos, insetos, artrópodes, etc.), ou semelhante. Em outra modalidade, o segundo organismo é um organismo procariótico incluindo, mas não limitado a Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, ou semelhante. Como alternativa, o segundo organismo pode ser um organismo eucariótico incluindo, mas não limitado a uma levedura, uma célula animal, uma célula de planta, um fungo, uma célula de mamíferos, ou semelhante. Em várias modalidades o primeiro e o segundo organismos são diferentes.

VI.Localização de Aminoácidos que Ocorrem de Forma Não Natural em Polipeptídeos de bG-CSF

[000352] A presente invenção contempla a incorporação de um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural em polipeptídeos de bG- CSF. Um ou mais aminoácidos que ocorrem de forma não natural podem ser incorporados em uma posição particular que não rompa a atividade do polipeptídeo. Isto pode ser alcançado pela preparação de substituições "conservativas" incluindo, mas não limitado a substituição de aminoácidos hidrofóbicos com aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos volumosos com aminoácidos volumosos, aminoácidos hidrofílicos com aminoácidos hidrofílicos e/ou inserção de um aminoácido que ocorre de forma não natural em um local que não é necessário para a atividade.

[000353] Uma variedade de abordagens bioquímicas e estruturais pode ser empregado para selecionar os locais desejados para a substituição com um aminoácido codificado de forma não natural dentro do polipeptídeo de bG-CSF. É facilmente perceptível para aqueles que possuem habilidades comuns na arte que qualquer posição da cadeia polipeptídica é adequada para a seleção para incorporar um aminoácido codificado de forma não natural, e a seleção pode ser baseada em modelagem racional ou seleção aleatória por qualquer ou nenhum propósito particular desejado. A seleção de sítios desejados pode ser para a produção de uma molécula de bG-CSF tendo qualquer propriedade ou atividade desejada incluindo, mas não limitadoa, agonistas, superagonistas,agonistas inversos, antagonistas, moduladores de ligação a receptores, moduladores de atividade do receptor, ou formação de dímero ou multímero, sem alterar a atividade ou propriedade em comparação com a molécula nativa, ou manipulação de qualquer propriedade física ou química do polipeptídeo, tal como solubilidade, agregação ou estabilidade. Por exemplo, as localizações no polipeptídeo necessárias para a atividade biológica dos polipeptídeos de bG-CSF podem ser identificadas usando métodos de análise de mutação de ponto, varredura de alanina, mutagênese e triagem de saturação para a atividade biológica, ou métodos de varredura de homólogo conhecidos na arte. Outros métodos podem ser usados para identificar os resíduos para modificação de polipeptídeos de bG-CSF incluem, mas não limitado a perfilamento de sequência, seleções de biblioteca de rotâmero, potenciais de pares de resíduo, e modelagem racional usando a tecnologia de Protein Design Automation®. (Veja Patentes US Nos. 6.188.965; 6.269.312, 6.403.312; WO 98/47089, que são incorporados por referência). Os resíduos que são críticos para a bioatividade de bG-CSF, resíduos que estão envolvidos com a estabilidade de produtos farmacêuticos, epítopos de anticorpos, ou resíduos de ligação ao receptor podem ser transformados. As Patentes US Nos. 5.580.723,5.834.250,6.013.478,6.428.954 e 6.451.561, que são incorporadas aqui por referência, descrevem os métodos para a análise sistemática da estrutura e função dos polipeptídeos, tais como os de bG-CSF pela identificação de domínios ativos, que influenciam a atividade do polipeptídeo com uma substância alvo. Os estudos de mutagênese em varredura de alanina de G-CSF foram descritos em Reidhaar-Olson J. F. et al., Biochemistry (1996) Jul 16;35 (28):9034- 41, Young D. C. et al. Protein Sci (1997) Jun; 6(6):1228-36, e Layton et al. (1997) JBC 272(47):29.735-29741. Outros resíduos diferentes daqueles identificados como críticos para a atividade biológica pela mutagênese de varredura de homólogo ou alanina podem ser bons candidatos para a substituição com um aminoácido codificado de forma não natural dependendo da atividade desejada, procurada para o polipeptídeo. Alternativamente, os sítios identificados como críticos para a atividade biológica também podem ser bons candidatos para a substituição com um aminoácido codificado de forma não natural, novamente dependendo da atividade desejada, procurada para o polipeptídeo. Outra alternativa seria a de simplesmente fazer substituições em série em cada posição na cadeia polipeptídica com um aminoácido codificado de forma não natural e observar o efeito sobre as atividades do polipeptídeo. É facilmente perceptível para aqueles que possuem habilidades comuns na arte que qualquer meio, técnica ou método para selecionar uma posição para a substituição com um aminoácido não natural em qualquer polipeptídeo é adequada para uso na presente invenção.

[000354] A estrutura e atividade dos mutantes de polipeptídeos de bG-CSF que contêm deleções também podem ser examinadas para determinar as regiões da proteína que são prováveis de serem tolerantes para a substituição com um aminoácido codificado de forma não natural. De maneira similar, a digestão da protease e de anticorpos monoclonais pode ser usada para identificar regiões do bG- CSF que são responsáveis pela ligação com o seu receptor. Layton et al. (2001) JBC 276(39)36779-36787 descrevem estudos de anticorpos para o hG-CSF e seu receptor. Uma vez que os resíduos que são prováveis de serem intolerantes para a substituição com os aminoácidos codificados de forma não natural foram eliminados, o impacto das substituições propostas em cada uma das posições restantes pode ser examinado. Os modelos podem ser gerados a partir das estruturas cristalinas tridimensionais de outros membros da família de CSF e dos receptores de CSF. O banco de dados de proteínas (Protein Data Bank) (PDB, disponível na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) em rcsb.org) é uma base de dados centralizada contendo dados da estrutura tridimensional de moléculas grandes de proteínas e ácidos nucléicos. Os modelos podem ser feitos pela investigação da estrutura secundária e terciária dos polipeptídeos, se os dados estruturais tridimensionais não estão disponíveis. As estruturas de RMN e cristalográficas de raios-X de hG-CSF estão disponíveis no banco de dados de proteínas (Protein Data Bank) com as IDs de PDB: 1CD9, 1PGR, 1RHG, 1GNC, assim como nas Patentes US Nos. 5.581.476 e 5.790.421, que são incorporadas aqui por referência. Assim, aqueles que possuem habilidades comuns na arte podem facilmente identificar as posições de aminoácidos que podem ser substituídas com os aminoácidos codificados de forma não natural.

[000355] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF da invenção compreendem um ou mais aminoácidos que ocorrem de forma não natural posicionados em uma região da proteína que não rompe a estrutura do polipeptídeo.

[000356] Os resíduos exemplares da incorporação de um aminoácido codificado de forma não natural podem ser aqueles que estão excluídos das regiões de ligação a receptor potencial; podem ser completamente ou parcialmente expostos a solvente; têm pouca ou nenhuma interação de ligações de hidrogênio com os resíduos próximos; podem ser minimamente expostos a resíduos reativos próximos; podem estar em uma ou mais das faces expostas; podem estar em um sítio ou sítios que estão justapostos a um segundo bG- CSF, ou outra molécula ou fragmento do mesmo; podem estar em regiões que são altamente flexíveis, ou estruturalmente rígidas, como previsto pela estrutura tridimensional, secundária, terciária ou quaternária do bG-CSF, ligado ou não ligado ao seu receptor, ou acoplado ou não acoplado a uma outra molécula biologicamente ativa; ou podem modular a conformação do bG-CSF por si sós ou com um dímero ou multímero compreendendo um ou mais bG-CSF, pela alteração da flexibilidade ou rigidez da estrutura completa como desejado.

[000357] Uma pessoa com competências normais na arte reconhece que tal análise de bG-CSF possibilita a determinação de quais resíduos de aminoácidos estão expostos na superfície em comparação com os resíduos de aminoácidos que estão enterrados no interior da estrutura terciária da proteína. Portanto, é uma modalidade da presente invenção a substituição de um aminoácido codificado de forma não natural por um aminoácido que é um resíduo exposto na superfície.

[000358] Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições no bG-CSF: antes da posição 1 (ou seja, no N- terminal), 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24,25,26, 27,28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42,43,44, 45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ,55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 , 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF).

[000359] Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 62, 133, e uma combinação destes produtos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados na posição 62 do bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados na posição 133 do bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, os polipeptídeos da invenção compreendem uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido natural. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados em uma sequência líder ou sinal que é N ou C terminal para as SEQ ID NOs: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 1) e o um ou mais aminoácidos ou ácidos codificados de forma não natural não incluem histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteína, asparagina, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogênicos que ocorrem de forma natural, tais como β-alanina, ornitina, etc.. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 2) e um ou mais aminoácidos ou ácidos codificados de forma não natural não incluem histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteína, asparagina, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogênicos que ocorrem de forma natural, tal como β-alanina, ornitina, etc.. Em algumas modalidades, o aminoácido incorporado na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou posição correspondente na SEQ ID NO: 2, é um aminoácido diferente de histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteína, asparagina, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogênicos que ocorrem de forma natural, tais como β-alanina, ornitina, etc..

[000360] Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados ribossomolmente em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 1) e o um ou mais aminoácidos ou ácidos codificados de forma não natural não incluem histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteína, asparaginas, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogênicos que ocorrem de forma natural, tais como β-alanina, ornitina, etc.. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados ribossomolmente em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 2) e um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural ou ácidos não incluem histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteína, asparagina, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogênicos que ocorrem de forma natural, tais como β-alanina, ornitina, etc.. Em algumas modalidades, o aminoácido incorporado ribossomolmente na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou na posição correspondente na SEQ ID NO: 2, é um aminoácido diferente de histidina, arginina, lisina, isoleucina, fenilalanina, leucina, triptofano, alanina, cisteína, asparagina, valina, glicina, serina, glutamina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, ou aminoácidos não proteogênicos que ocorrem de forma natural, tais como como β- alanina, ornitina, etc.. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO: 1) em que o um ou mais aminoácidos ou ácidos codificados de forma não natural têm um grupo funcional, ou grupos funcionais não reconhecidos por um RS endógeno. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais posições do bG-CSF (SEQ ID NO : 2) em que o um ou mais aminoácidos ou ácidos codificados de forma não natural têm um grupo funcional, ou grupos funcionais não reconhecidos por um RS endógeno. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção tem um aminoácido incorporado na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou na posição correspondente na SEQ ID NO: 2, em que o aminoácido tem um grupo funcional ou grupos funcionais não reconhecidos por um RS endógeno. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção tem uma para- acetilfenilalanina incorporada na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou na posição correspondente na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção tem uma para- aminofenilalanina incorporada na posição 133 da SEQ ID NO: 1, ou na posição correspondente na SEQ ID NO: 2.

[000361] Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a, posições: antes da posição 1 (ou seja, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47, 48, 49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66, 67, 68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85, 86, 87,88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99,100, 101, 102, 103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116, 117,118,119,120,121,122,123,124,125,126 ,127,128,129,130, 131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144, 145,146,147,148,149,150,151 ,152,153,154,155,156,157,158, 159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172, 173,174, 175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO:1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF).

[000362] Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a posições: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a posições: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a posições: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a, 62,133, e uma combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os correspondentes aminoácidos na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural na posição 62 está ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural na posição 133 está ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural na sequência sinal ou líder em N- ou C-terminal de SEQ ID NOs: 1, 2, ou uma outra sequência de bG-CSF é ligada a um polímero solúvel em água.

[000363] Uma avaliação da estrutura cristalina do bG-CSF ou membro(s) da família de bG-CSF e sua interação com o receptor de G-CSF pode indicar que certos resíduos de aminoácidos têm cadeias laterais que são completamente ou parcialmente acessíveis ao solvente. A cadeia lateral de um aminoácido codificado de forma não natural nessas posições pode apontar para longe da superfície da proteína e no solvente.

[000364] Uma grande variedade de aminoácidos codificados de forma não natural pode ser substituída por, ou incorporada em uma determinada posição em um polipeptídeo de bG-CSF. Em geral, um aminoácido codificado de forma não natural particular é selecionado para a incorporação com base em uma avaliação da estrutura tridimensional do cristal de um polipeptídeo de bG-CSF ou outro membro da família de G-CSF em seu receptor, com uma preferência por substituições conservativas (ou seja, aminoácidos codificados de forma não natural baseado em aril, tais como p-acetilfenilalanina ou O- propargiltirosina substituindo Phe, Tyr ou Trp), e a química de conjugação específica que se deseja introduzir no polipeptídeo de bG- CSF (por exemplo, a introdução de 4-azidafenilalanina case se deseje um efeito de cicloadição [3 +2] de Huisgen com um polímero solúvel em água apresentando um grupamento alquino ou uma formação de ligação de amida com um polímero solúvel em água que apresenta um aril éster que, por sua vez, incorpora um grupamento de fosfina) .

[000365] Em uma modalidade, o método inclui adicionalmente a incorporação do aminoácido não natural na proteína, onde o aminoácido não natural compreende um primeiro grupo reativo, e o contato da proteína com uma molécula (incluindo, mas não limitado a, hidroxialquil amido (HAS), hidroxietil amido (HES), um marcador, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietileno glicol, um fotoreticulador, um radionuclídeo, um composto citotóxico, uma fármaco, um marcador de afinidade, um marcador de fotoafinidade, um compostos reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um metal quelante, um co-fator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, o RNA, um polinucleotídeo antissenso, um sacarídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucléico inibidor, um biomaterial, uma nanopartícula, um marcador de spin, um fluoróforo, um grupamento contendo metal, um grupamento radioativo, um novo grupo funcional, um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, um grupamento photocaged, um grupamento excitável por radiação actínica, um grupamento fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, um grupamento incorporando um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo, um amino tioácido, um grupamento tóxico, um grupamento marcado isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo de elétrons densos, um grupo magnético, um grupo intercambiável, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um marcador detectável, uma molécula pequena, um ponto de quantum, um nanotransmissor, um radionucleotídeo, um radiotransmissor, um agente de captura de nêutrons, ou qualquer combinação dos itens acima, ou qualquer outro composto ou substância desejável) que compreende um segundo grupo reativo. O primeiro grupo reativo reage com o segundo grupo reativo para fixar a molécula ao aminoácido não natural por meio de uma cicloadição [3 +2]. Em uma modalidade, o primeiro grupo reativo é grupamento azida ou alquinil e o segundo grupo reativo é um grupamento azida ou alquinil. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é o grupamento alquinil (incluindo, mas não limitado a, no aminoácido não natural p- propargiloxifenilalanina) e o segundo grupo reativo é o grupamento azida. Em outro exemplo, o primeiro grupo reativo é o grupamento azida (incluindo, mas não limitado a aminoácido não natural p-azida-L- fenilalanina) e o segundo grupo reativo é o grupamento alquinil.

[000366] Em alguns casos, a substituição do(s) aminoácido(s) codificado(s) de forma não natural será combinada com outras adições, substituições ou supressões no polipeptídeo de bG-CSF para afetar outras características biológicas do polipeptídeo de bG-CSF. Em alguns casos, outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo, mas não limitado a resistência à degradação proteolítica) do polipeptídeo de bG-CSF ou aumentar a afinidade do polipeptídeo de bG-CSF para o seu receptor. Em alguns casos, outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade farmacêutica do polipeptídeo de bG-CSF. Em alguns casos, outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a atividade biológica do polipeptídeo de bG-CSF. Em alguns casos, outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo, mas não limitado a, quando expressa em E. coli ou outras células hospedeiras) do polipeptídeo de bG-CSF. Em algumas modalidades, adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade polipeptídeo de bG-CSF após a expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os sítios são selecionados para a substituição com um aminoácido codificado de forma não natural além de um outro sítio para a incorporação de um aminoácido não natural que resulta no aumento da solubilidade do polipeptídeo após a expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF compreendem outra adição, substituição, ou deleção que modula a afinidade para um receptor, proteínas de ligação, ou ligantes associados, modula a tradução do sinal após a ligação a um receptor, modula a meia-vida de circulação, modula a liberação ou biodisponibilidade, facilita a purificação, ou melhora ou altera uma rota particular de administração. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF compreendem uma substituição, adição ou deleção que aumenta a afinidade da variante de bG-CSF para o seu receptor. Da mesma forma, os polipeptídeos de bG-CSF podem compreender sequências de clivagem química ou enzimática, sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação ao anticorpo (incluindo, mas não limitado a, FLAG ou poli-His), ou outras sequências com base na afinidade (incluindo, mas não limitado a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, mas não limitado a, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, mas não limitado a, GFP), purificação, transporte através de tecidos e membranas celulares, liberação ou ativação de pró-fármaco, a redução de tamanho de bG-CSF, ou outras características do polipeptídeo.

[000367] Em algumas modalidades, a substituição de um aminoácido codificado de forma não natural gera um antagonista de bG-CSF. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado de forma não natural é substituído ou adicionado em uma região envolvida com a ligação do receptor. Em algumas modalidades, os antagonistas de bG-CSF compreendem pelo menos uma substituição que faz com que o bG- CSF atue como um antagonista. Em algumas modalidades, o antagonista de bG-CSF compreende um aminoácido codificado de forma não natural ligado a um polímero solúvel em água que está presente em uma região de ligação ao receptor da molécula de bG- CSF.

[000368] Em algumas modalidades, a substituição de um aminoácido codificado de forma não natural gera um antagonista do bG-CSF. Em algumas modalidades, o antagonista de bG-CSF compreende um aminoácido codificado de forma não natural ligado a um polímero solúvel em água que está presente em uma região de ligação ao receptor da molécula de bG-CSF.

[000369] Em alguns casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos são substituídos por um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural. Em alguns casos, o polipeptídeo de bG-CSF inclui adicionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de uma ou mais aminoácidos de forma não natural para aminoácidos que ocorrem de forma natural. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais resíduos de bG-CSF são substituídos por um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural. Em alguns casos, o um ou mais resíduos codificados de forma não natural estão ligados a um ou mais PEGs lineares ou ramificados de baixo peso molecular, desse modo, intensificando a afinidade de ligação e a meia-vida sérica comparável em relação às espécies fixas a um PEG único, de elevado peso molecular.

[000370] Em algumas modalidades, até dois dos seguintes resíduos de bG-CSF são substituídos por um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural.

VII. Expressão em Eucariontes e Não Eucariontes

[000371] Para se obter alto nível de expressão de um polinucleotídeo de bG-CSF clonado, é possível subclonar normalmente polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de bG-CSF da invenção em um vetor de expressão que contém um promotor forte para direcionar a transcrição, em um terminador de transcrição/tradução, e se for para um ácido nucléico que codifica uma proteína, um sítio de ligação ao ribossomo para a iniciação translacional. Os promotores bacterianos apropriados são conhecidos por aqueles de competência comum na arte e descritos, por exemplo, em Sambrook et al. e Ausubel et al.

[000372] Os sistemas de expressão bacteriana para expressar polipeptídeos de bG-CSF da invenção estão disponíveis em, incluindo mas não limitado a, E. coli, Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, e Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)). Os Kits para esses sistemas de expressão estão disponíveis comercialmente. Os sistemas de expressão eucarióticos para células de mamíferos, leveduras e células de inseto são conhecidos por aqueles de competência comum na arte e também estão disponíveis comercialmente. Nos casos em que os tRNAs ortogonais e aminoacil tRNA sintetases (descritos acima) são usados para expressar os polipeptídeos de bG-CSF da invenção, as células hospedeiras para a expressão são selecionadas com base na sua capacidade de usar os componentes ortogonais. As células hospedeiras exemplares incluem as bactérias Gram-positivas (incluindo, mas não limitadas a, B. brevis, B. subtilis, ou Strepiomyces) e bactérias Gram-negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putidida), bem como leveduras e outras células eucarióticas. As células que compreendem os pares de OtRNA / O-RS podem ser usadas como aqui descrito.

[000373] Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção fornece a capacidade de sintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em quantidades grandes úteis. Em um aspecto, a composição opcionalmente inclui, incluindo mas não limitado a, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas, pelo menos 100 miligramas, pelo menos um grama, ou mais da proteína que compreende um aminoácido não natural, ou uma quantidade que pode ser alcançada com os métodos de produção de proteínas in vivo (detalhes sobre a produção e purificação de proteína recombinante são fornecidos aqui). Em outro aspecto, a proteína está opcionalmente presente na composição em uma concentração de, incluindo mas não limitado a, pelo menos 10 microgramas de proteínas por litro, pelo menos 50 microgramas de proteínas por litro, pelo menos 75 microgramas de proteínas por litro, pelo menos 100 microgramas de proteína por litro, pelo menos 200 microgramas de proteína por litro, pelo menos 250 microgramas de proteína por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína por litro, ou pelo menos 10 miligramas de proteína por litro ou mais, em, incluindo mas não limitado a, um lisado celular, um tampão, um tampão farmacêutico, ou uma outra suspensão líquida (incluindo, mas não limitado a, em um volume de, incluindo mas não limitado a, em qualquer lugar de cerca de 1 nL a cerca de 100 L ou mais). A produção de grandes quantidades (incluindo, mas não limitado a maior do que a normalmente possível com outros métodos, incluindo, mas não limitado a, tradução in vitro) de uma proteína em uma célula eucariótica, incluindo, pelo menos um aminoácido não natural é uma característica da invenção.

[000374] Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção fornece a capacidade de biosintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais de em grandes quantidades úteis. Por exemplo, as proteínas que compreendem um aminoácido não natural podem ser produzidas em uma concentração de, incluindo mas não limitado a, pelo menos 10 μg/litro, pelo menos 50 μg/litro, pelo menos 75 μg/litro, pelo menos 100 μg/litro, pelo menos 200 μg/litro, pelo menos 250 μg/litro, ou pelo menos 500 μg/litro, pelo menos 1 mg/litro, pelo menos 2 mg/litro, pelo menos3mg/litro,pelo menos4mg/litro,pelomenos5 mg/litro, pelo menos6mg/litro,pelo menos7mg/litro,pelomenos8 mg/litro, pelo menos9mg/litro,pelo menos10mg/litro,pelomenos,20, 30, 40, 50, 60, 70,80, 90, 100, 200, 300,400, 500, 600, 700, 800,900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro ou mais de proteínas em um extrato celular, lisado celular, meio de cultura, tampão, e/ou similares.

[000375] Uma variedade de vetores adequados para a expressão de bG-CSF está disponível comercialmente. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos, incluem, mas não estão limitados a vetores compreendendo sequências de controle de expressão de SV40, o vírus papiloma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Tais vetores incluem pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) e PCI-neo (Stratagene, La Jolla, Califórnia, EUA). Os plasmídeos bacterianos, tais como os plasmídeos de E. coli, incluindo pBR322, pET3a e pET12a, plasmídeos de faixa de hospedeiros mais ampla, tais como RP4, DNAs de fago, por exemplo, os derivados de inúmeros fagos lambda, por exemplo, NM989 e fagos de DNA de outros, tais como M13 e fagos de DNA com filamentos únicos podem ser usados. O plasmídeo 2 μ e derivados dos mesmos, o vetor POT1 (Patente US No. 4.931.373, que é incorporada aqui por referência), o vetor pJSO37 descrito em (Okkels, Ann. Nova Iorque Aced. Sci. 782, 202, 207, 1996) e pPICZ A, B ou C (Invitrogen) pode ser usado com células hospedeiras de levedura. Para as células de insetos, os vetores incluem, mas não estão limitados a, pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685 98 (1986), pBluebac 4.5 e pMelbac (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[000376] A sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de bG-CSF pode incluir ou também não incluir a sequência que codifica um peptídeo sinal. O peptídeo sinal está presente quando o polipeptídeo é para ser secretado pelas células nas quais se expressa. Esses peptídeos sinais podem ser de qualquer sequência. O peptídeo sinal pode ser procariótico ou eucariótico. Coloma, M. (1992) J. Imm. Methods 152:89 104) descrevem um peptídeo sinal para uso em células de mamíferos (peptídeo sinal de cadeia leve Ig kappa de murino). Os peptídeos sinais incluem, mas não estão limitados a, peptídeo sinal do fator-α de S. cerevisiae (Patente US No. 4.870.008, que é incorporada aqui por referência), o peptídeo sinal de amilase salivar de camundongo (O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp 643-646), um peptídeo sinal carbóxipeptidase modificado (L. A. Vails et al., Cell 48, 1987, pp 887-897), o peptídeo sinal de levedura BAR1 (WO 87/02670, que é incorporado aqui por referência), e o peptídeo sinal de aspártico protease 3 (YAP3) de levedura (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp 127-137).

[000377] Exemplos adequados de células hospedeiras de mamíferos são conhecidos por aqueles de competência comum na arte. Tais células hospedeiras podem ser células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), (por exemplo, CHO-K1; ATCC CCL-61), as células do macaco verde (COS) (por exemplo, um COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL- 1651)), células de camundongo (por exemplo, NS/O), linhagens celulares de Rins de filhote de Hamster (BHK) (por exemplo, ATCC CRL-1632 ou ATCC CCL-10), e células humanas (por exemplo, HEK 293 (ATCC CRL-1573)), bem como as células vegetais em cultura de tecidos. Estas linhagens celulares e outras estão disponíveis a partir de depositários públicos, tal como o American Type Culture Collection, Rockville, Md. A fim de fornecer glicosilação melhorada do polipeptídeo de bG-CSF, uma célula hospedeira de mamífero pode ser modificada para expressar sialiltransferase, por exemplo, 1,6- sialiltransferase, por exemplo, como descrito na Patente US No. 5.047.335, que é incorporada aqui por referência.

[000378] Os métodos para a introdução de DNA exógeno em células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não estão limitados a, transfecção mediada por cálcio fosfarase, eletroporação, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção mediada por lipossomos, vetores virais e os métodos de transfecção descritos por Life Technologies Ltd, Paisley, UK, usando Lipofectamin 2000 e Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, EUA usando FuGENE 6. Esses métodos são bem conhecidas na arte e são descritos por Ausbel et al. (Eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, EUA. A cultura de células de mamíferos pode ser realizado de acordo com métodos estabelecidos, por exemplo, conforme divulgado em (Animal Cell Biotechnology, methods and Protocols, editado por Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totowa, NJ, EUA e Harrison Mass, e Rae IF, General Techniques de Cell Culture, Cambridge University Press, 1997).

I. Sistemas de Expressão, Cultura e Isolamento

[000379] Os polipeptídeos de bG-CSF podem ser expressos em qualquer número de sistemas de expressão adequado incluindo, por exemplo, leveduras, células de insetos, células de mamíferos, e bactérias. Uma descrição dos sistemas de expressão exemplares é fornecida abaixo.

[000380] Levedura como usado aqui: o termo "levedura" inclui qualquer uma das diversas leveduras capazes de expressar um gene que codifica um polipeptídeo de bG-CSF. As leveduras incluem, mas não estão limitadas a leveduras ascoesporogenosas (Endomycetales), leveduras basidioesporogenosas e leveduras pertencentes ao grupo dos fungos imperfeitos(Blastomycetes).As leveduras ascoesporogenosas são divididas em duas famílias, e Spermophthoraceae e Saccharomycetaceae. Este último é composto de quatro subfamílias, Schizosaccharomycoideae (por exemplo, gênero Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae e Saccharomycoideae (por exemplo, gêneros Pichia, Kluyveromyces e Saccharomyces). As leveduras basidioesporogenosas incluem os gêneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium e Filobasidiella. As leveduras pertencentes ao grupo Fungos imperfeitos (Blastomycetes) são divididos em duas famílias, Sporobolomycetaceae (por exemplo, gêneros Sporobolomyces e Bullera) e Cryptococcaceae (por exemplo, o gênero Candida).

[000381] De interesse particular para uso com a presente invenção são as espécies dentro do gênero Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansemtla, Torulopsis, e Candida incluindo, mas não limitado a, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragillis, C. albicans, C. maltosa, e H. polymorpha.

[000382] A seleção de leveduras adequadas para expressão de polipeptídeos de bG-CSF está dentro da competência de uma pessoa de competências normais na arte. Na seleção de hospedeiros de leveduras para a expressão, os hospedeiros adequados podem incluir aqueles que mostraram ter, por exemplo, a boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica, boa capacidade de secreção, boa produção de proteínas solúveis e, toda a robustez em geral. As leveduras geralmente estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes incluindo, mas não limitado ao Yeast Genetic Stock Center (Centro de Estoque Genético de Leveduras), Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade da California (Berkeley, CA), e a American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA).

[000383] O termo "hospedeiro de levedura" ou "células hospedeiras de levedura" inclui a levedura que pode ser, ou tenha sido usada como um receptor para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui os descendentes da célula hospedeira original que receberam os vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. Entende-se que a descendência de uma única célula parental não pode ser necessariamente completamente idêntica na morfologia ou na genômica ou no complemento de DNA total a de origem da original, devido a mutação acidental ou deliberada. As descendências das células parentais, que são suficientemente similares às originais a serem caracterizadas pelas propriedades relevantes, tais como a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de bG-CSF, estão incluídas na descendência destinada por esta definição.

[000384] Os vetores de expressão e transformação, incluindo replicons extracromossômicos ou vetores de integração, foram desenvolvidos para transformação em muitos hospedeiros de leveduras. Por exemplo, os vetores de expressão foram desenvolvidos para S. cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1989) 122:19; Ito et al., J. Bacteriol (1983) 153: 163; Hinnen et al., PROC NATL. ACAD. SCI. EUA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL. CELL BIOL. (1986.). 6:142);. C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL (1985) 25: 141); H. polymorpha (Gleeson et al., J. GEN MICROBIOL (1986) 132:3459; Roggenkamp et al, a MOL, da genética e genómica (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL (1984.). 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL (1983.). 154:737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990), 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL (1985.) 25:141); P. pastoris (Patentes US Nos. 5.324.639,4.929.555 e 4.837.148 Cregg et al., MOL, CELL BIOL (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., NATURE (1982) 300:706.); e Y. lipolytica; A. nidulans (Ballance et al., BIOCHEM BIOPHYS RES C0 MMUN (1983) 112:284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221, e Yelton et al., PROC ACAD NACIONAL SCI EUA (1984) 81: 1470-1474); A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. (1985 ) 4:475-479); T. reesia (EP 0 244 234) e fungos filamentosos, tais como, por exemplo, Neurospora, Peniciltium, Tolypocladium (WO 91/00357), cada um incorporado aqui por referência.

[000385] As sequências de controle para vetores de leveduras são conhecidas por aqueles de competência comum na arte e incluem, mas não estão limitadas a regiões promotoras dos genes, tais como álcool desidrogenase (ADH) (EP 0 284 044); enolase; glucoquinase; glicose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexoquinase, fosfofrutoquinase, 3-fosfoglicerato mutase e piruvato quinase (Pyk) (EP 0 329 203). O gene da levedura PHO5, que codifica a fosfatase ácida, também pode fornecer sequências promotoras úteis (Miyanohara et al. PROC. NATL. ACAD. SCI. EUA (1983), 80:1). Outras sequências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de leveduras podem incluir os promotores para a 3-fosfoglicerato quinase (Hitzeman et al. J. BIOL CHEM (1980) 255:12073) e outras enzimas glicolíticas, tais como piruvato descarboxilse, triosefosfato isomerase e fosfoglicose isomerase (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess et al., J. ADV ENZIMA REG (1969), 7:149). Os promotores de leveduras induzíveis têm a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento podem incluir as regiões promotoras de álcool desidrogenase 2; isocitocromo C.; fosfatase ácida; metalotioneína; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do nitrogênio e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Os vetores e promotores apropriados para uso na expressão de leveduras são descritos na EP 0 073 657.

[000386] Os intensificadores de leveduras também podem ser usados com os promotores de levedura. Além disso, os promotores sintéticos também podem funcionar como promotores de levedura. Por exemplo, as sequências de ativação a montante (UAS) de um promotor de levedura pode ser unida com a região de ativação da transcrição de um outro promotor de levedura, criando um promotor híbrido sintético. Exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência reguladora ADH ligada à região de ativação da transcrição GAP. Veja as Patentes US Nos. 4.880.734 e 4.876.197, que são incorporadas aqui por referência. Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem em sequências reguladoras de genes ADH2, GAL4, GaL10, ou PHO5, combinados com a região de ativação transcricional de um gene da enzima glicolítica, tal como a GAP ou Pyk. Veja EP 0 164 556. Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores que ocorrem naturalmente de origem diversa da levedura que têm a capacidade de ligar RNA polimerase e iniciar a transcrição.

[000387] Outros elementos de controle que podem compreender parte dos vetores de expressão de leveduras incluem terminadores, por exemplo, a partir dos genes GAPDH ou enolase (Holland et al. J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385). Além disso, a origem de replicação de origem do plasmídeo 2μ é adequado a para a levedura. Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura. Ver Tschumper et al. GENE, (1980) 10:157; Kingsman et al., GENE (1979),7:141. O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura que não possui a habilidade de crescer em triptofano. Da mesma forma, cepas de leveduras deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que apresentam o gene Leu2.

[000388] Os métodos para introdução de DNA exógeno em hospedeiros de levedura são conhecidos por aqueles de competência comum na arte e, normalmente, incluem, mas não estão limitados a, transformação de esferoplastos ou de células hospedeiras de leveduras intactas tratados com cátions alcalinos. Por exemplo, a transformação de levedura pode ser realizada de acordo com o método descrito em Hsiao et al. PROC. NATL. ACAD. SCI. EUA (1979) e Van 76:3829 Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946. No entanto, outros métodos para a introdução de DNA em células, tais como pela injeção nuclear, eletroporação, ou a fusão de protoplastos também podem ser usados como descrito em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001). As células hospedeiras de levedura podem então ser cultivadas usando-se técnicas padrão conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte.

[000389] Outros métodos para a expressão de proteínas heterólogas em células hospedeiras de leveduras são conhecidos por aqueles de competência comum na arte. Veja, geralmente publicação de pedido de Patentes US No. 20020055169, Patentes US Nos. 6.361.969, 6.312.923,6.183.985,6.083.723,6.017.731,5.674.706,5.629.203, 5.602.034 e 5.089.398; Patentes US Re-examinadas Nos. RE 37.343 e RE 35.749; pedidos de patente PCT publicados WO 99/07862, WO 98/37208 e WO 98/26080, pedidos de Patentes Europeias EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274 e EP 0 164 556. Veja também Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2) :79-93;. Romano et al., YEAST (1992)8(6):423-488;. Goeddel, METHODS INENZIMOLOGY (1990)185:3-7, cada um incorporado aqui porreferência.

[000390] As cepas de hospedeiros de leveduras podem ser crescidas em fermentadores, durante o estágio de amplificação usando métodos padrões de fermentação com alimentação em batelada conhecidos por aqueles de competência comum na arte. Os métodos de fermentação podem ser adaptados para atender às diferenças em uma via de utilização de carbono de hospedeiro de leveduras particular ou o modo de expressão de controle. Por exemplo, a fermentação de um hospedeiro de levedura tipo Saccharomyces pode necessitar de uma alimentação de glicose única, fonte complexa de nitrogênio (por exemplo, hidrolisados de caseína), e suplementação vitamínica múltipla. Em contrapartida, a levedura metiIotrófica P. pastoris podem necessitar de glicerol, metanol e alimentos com traços de minerais, mas apenas sais de amônio simples (nitrogênio), para o ótimo crescimento e expressão. Ver, por exemplo, Patente US No. 5.324.639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM (1990) 9:95; e Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG.(1987)29:1113, incorporados aqui por referência.

[000391] Tais métodos de fermentação, no entanto, podem ter certas características em comum independente da cepa de hospedeiro de levedura usada. Por exemplo, um nutriente limitante do crescimento, normalmente de carbono, pode ser adicionado ao fermentador durante a fase de ampliação para permitir o crescimento máximo. Além disso, os métodos de fermentação geralmente empregam um meio de fermentação destinado a conter quantidades adequadas de carbono, nitrogênio, sais basais, fósforo e outros nutrientes menores (vitaminas, sais e traços de minerais, etc.). Exemplos de meios de fermentação adequados para uso com Pichia estão descritos nas Patentes US Nos. 5.324.639 e 5.231.178, que são incorporadas aqui por referência.

[000392] Células de Inseto Infectadas com Baculovirus: O termo "hospedeiro de inseto" ou "célula hospedeira de inseto" se refere a um inseto que pode ser, ou tenha sido usado como um receptor para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui os descendentes da célula hospedeira de inseto original que foram transfectados. Entende-se que a descendência de uma única célula parental não pode ser necessariamente completamente idêntica na morfologia ou na genômica ou complemento de DNA total a de origem da original, devido a mutação acidental ou deliberada. As descendências das células parentais, que são suficientemente similares às originais a serem caracterizadas pelas propriedades relevantes, tais como a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de bG-CSF, estão incluídas na descendência destinada por esta definição.

[000393] A seleção de células de inseto adequadas para a expressão de polipeptídeos de bG-CSF é conhecida por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Várias espécies de insetos são bem descritas na arte e estão comercialmente disponíveis, incluindo o Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Na seleção de hospedeiros de insetos para a expressão, os hospedeiros adequados podem incluir aqueles que mostraram ter, nomeadamente, a capacidade de boa secreção, baixa atividade proteolítica e, toda a robustez em geral. Os insetos geralmente estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes incluindo, mas não limitado ao Insetic Genetic Stock Center (Centro de Estoque Genético de Insetos), Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade da California (Berkeley, CA), e a American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA).

[000394] Geralmente, os componentes de um sistema de expressão de insetos infectados por baculovírus inclui um vetor de transferência, geralmente um plasmídeo bacteriano, que contém tanto um fragmento do genoma do baculovírus, quanto um sítio de restrição conveniente para a inserção do gene heterólogo ser expresso; um baculovírus selvagem com sequências homólogas ao fragmento específico para baculovírus no vetor de transferência (isto permite a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovírus); e células hospedeiras de inseto adequadas e os meios de crescimento. Os materiais, métodos e técnicas usados na construção de vetores, células de transferência, placas de colhedoras (picking), crescimento de células em cultura, e semelhantes são conhecidos na arte e manuais descrevendo essas técnicas estão disponíveis.

[000395] Depois de inserir o gene heterólogo no vetor de transferência, o vetor e o genoma viral tipo selvagem são transfectados em uma célula hospedeira do inseto, onde o vetor e o genoma viral se recombinam. O vírus recombinante empacotado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos para sistemas de expressão de células de inseto/baculovirus estão comercialmente disponíveis na forma de kit a partir de, por exemplo, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Estas técnicas são geralmente conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte e são completamente descritos em SUMMERS E SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555(1987), aqui incorporado por referência. Veja também, Richardson, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY:BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING E POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); e O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL (1992).

[000396] Com efeito, a produção de várias proteínas heterólogas usando sistemas de expressão células de inseto/baculovírus é conhecida por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Ver, por exemplo, as Patentes US Nos. 6.368.825, 6.342.216, 6.338.846, 6.261.805,6.245.528,6.225.060,6.183.987,6.168.932,6.126.944, 6.096.304,6.013.433,5.965.393,5.939.285,5.891.676,5.871.986, 5.861.279,5.858.368,5.843.733,5.762.939,5.753.220,5.605.827; 5.583.023,5.571.709,5.516.657,5.290.686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956, WO 00/55345; WO 00/20032, WO99/51721;WO99/45130,WO99/31257;WO99/10515;WO 99/09193, WO 97/26332; WO 96/29400, WO 96/25496; WO 96/06161, WO95/20672;WO93/03173,WO92/16619;WO92/02628;WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082, que são incorporados aqui por referência.

[000397] Os vetores que são úteis em sistemas de expressão de células de inseto / baculovirus são conhecidos na arte e incluem, por exemplo, a expressão de insetos e vetores de transferência derivados do vírus baculovirus da poliedrose nuclear de Autographacalifornica (AcNPV), que é um vetor de expressão viral, auxiliador-independente. Os vetores de expressão viral derivados deste sistema normalmente usam o promotor do gene polihedrina viral forte para direcionar a expressão dos genes heterólogos. Ver, em geral, O'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORYMANUAL (1992).

[000398] Antes de inserir o gene estranho no genoma do baculovírus, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, líder (se desejar), sequência de codificação de interesse, e sequência de terminação da transcrição, são normalmente montados em uma construção intermediária por transplacement (vetor de transferência). As construções intermediárias por transplacement são frequentemente mantidas em um replicon, tal como um elemento cromossômico extra (por exemplo, plasmídeos), capazes de manutenção estável em um hospedeiro, tal como as bactérias. O replicon terá um sistema de replicação permitindo, assim, que ele seja mantido em um hospedeiro adequado para clonagem e amplificação. Mais especificamente, o plasmídeo pode conter o sinal de poliadenilação poliedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL.(1988) 42:177) e um gene de resistência à ampicilina procariótica (amp) e a origem de replicação para a seleção e propagação em E. coli.

[000399] Um vetor de transferência comumente usado para a introdução de genes estranhos em AcNPV é o pAc373. Muitos outros vetores, conhecidos por aqueles de habilidade na arte, também foram projetados, incluindo, por exemplo, o pVL985, que altera o códon de partida de poliedrina a partir de ATG para ATT, e que introduz 32 pares de bases em um sítio de clonagem BamHI, a jusante da ATT. Veja Luckow e Summers, VIROLOGY 170:31 (1989). Outros vetores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, PBlueBac4.5/V5- His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).

[000400] Apósainserçãodo geneheterólogo, o vetorde transferência eogenomabaculoviraltipo selvagem sãoco- transfectados em um hospedeiro de células de inseto. Os métodos para a introdução de DNA heterólogo em um sítio desejado no vírus baculovírus são conhecidos na arte. Veja Summers e Smith, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow e Summers, VIROLOGY (1989) 170:31.. Por exemplo, a inserção pode ser em um gene, tal como o gene da poliedrina pela recombinação de reticulação homóloga dupla; a inserção também pode ser em um sítio de enzimas de restrição construído no gene de baculovírus desejado. Veja Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11 (4): 91.

[000401] A transfecção pode ser realizada por eletroporação. Veja Summers e Smith, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow e Summers, VIROLOGY (1989)170:31. Alternativamente, os lipossomos podem ser usados para a transfecção de células de inseto com o vetor de expressão recombinante e o baculovirus. Veja, por exemplo, Liebman et al., BlOTECHNlQUES (1999)26(1):36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998)37:6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998)18:45; Tilkins et al., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost et al., GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376; Reverey et al., J. BIOL. CHEM. (1996)271(39):23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68(2):766; e Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274. Os lipossomos comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, Cellfectin® e Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA), Além disso, a transfecção com fosfato de cálcio pode ser usada. Veja Trotter e Wood, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19):5667; and Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501.

[000402] Os vetores de expressão de baculovírus geralmente contêm um promotor de baculovírus. Um promotor de baculovírus é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar uma RNA polimerase de baculovírus e iniciar a transcrição (3') a jusante de uma sequência de codificação (por exemplo, o gene estrutural) em mRNA. O promotor irá ter uma região de iniciação de transcrição que normalmente é colocada próxima à extremidade 5' da sequência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição normalmente inclui um sítio de ligação do RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor de baculovírus também pode ter um segundo domínio conhecido como um intensificador, que, se presente, está geralmente distal ao gene estrutural. Além disso, a expressão pode ser regulada ou constitutiva.

[000403] Os genes estruturais, abundantemente transcritos tardiamente no final do ciclo de infecção, fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem as sequências derivadas do gene que codifica a proteína poliedron viral (FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression em MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EP 0 127 839 e EP 0 155 476) e o gene que codifica a proteína p10 (Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765).

[000404] O vetor de expressão de baculovírus recentemente formado é empacotado em um baculovírus recombinante infeccioso e, posteriormente, as placas para crescimento podem ser purificadas por técnicas conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Veja Miller et al., BIOESSAYS (1989)11(4):91; Summers e Smith, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987).

[000405] Os vetores de expressão recombinantes em baculovírus foram desenvolvidos para a infecção em várias células de inseto. Por exemplo, os baculovírus recombinantes forma desenvolvidos para, nomeadamente, o Aedes aegypti (ATCC No. CCL-125), Bombyx mori (ATCC No. CRL-8910), Drosophila melanogaster (ATCC No. 1963), Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni. Veja Wright, NATURE (1986) 321 :718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56:153; Smith et al., MOL. CELL.BIOL. (1983) 3:2156. Ver, em geral, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225. Mais especificamente, as linhagens celulares usadas para os sistemas de vetores de expressão em baculovírus comumente incluem, mas não estão limitados a, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC No. CRL-1711), Sf21 (Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., Cat.. No. 11497-013 (Carlsbad, CA)), Tri- 368 (Trichopulsia ni) e High-FiveTM BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni).

[000406] As Células e os meios de cultura estão comercialmente disponíveis tanto para a expressão direta quanto de fusão de polipeptídeos heterólogos em um baculovírus / expressão e a tecnologia de cultura celular é geralmente conhecida por aqueles que possuem habilidades comuns na arte.

[000407] E. Coli, Espécies de Pseudomonas, e outros Procariontes: As técnicas de expressão bacterianas são conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Uma ampla variedade de vetores está disponível para uso em hospedeiros bacterianos. Os vetores podem ser de cópia única ou vetores de multicópia baixa ou alta. Vetores podem servir para clonagem e/ou expressão. Tendo em vista a ampla literatura com relação a vetores, a disponibilidade comercial de muitos vetores, e até mesmo manuais descrevendo vetores e seus mapas e características de restrição, nenhuma discussão ampla é necessária aqui. Como é bem conhecido, os vetores normalmente envolvem marcadores que permitem a seleção, cujos marcadores podem proporcionar resistência ao agente citotóxico, prototopia ou imunidade. Frequentemente, uma pluralidade de marcadores que proporciona características diferentes está presente.

[000408] Um promotor bacteriano é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar a RNA polimerase bacteriana e iniciar a a transcrição (3’) a jusante de uma sequência de codificação (por exemplo, gene estrutural) em mRNA. Um promotor irá ter uma região de iniciação de transcrição que normalmente é colocada próxima à extremidade 5' da sequência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição normalmente inclui um sítio de ligação do RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor bacteriano também pode ter um segundo domínio chamado de um operador, que pode sobrepor-se um sítio de ligação do RNA polimerase adjacente no qual se inicia a síntese de RNA. O operador permite a transcrição regulada (induzível) negativa, na medida em que uma proteína repressora de gene pode se ligar ao operador e, assim, inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, tal como o operador. Além disso, a regulação positiva pode ser alcançada por uma sequência de ligação de ativação da proteína ativadora de gene, que, se presente está geralmente proximal (5’) à sequência de ligação de RNA polimerase. Um exemplo de uma proteína ativadora do gene é a proteína ativadora catabólica (CAP), que ajuda a iniciar a transcrição do operon lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. ANNU. REV. GENET. (1984)] 18:173. A expressão regulada pode, portanto, ser positiva ou negativa, desse modo, intensificando ou reduzindo a transcrição.

[000409] As enzimas de via metabólica que codificam sequências fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem as sequências de promotor derivadas das enzimas que metabolizam açúcar, tais como galactose, lactose (lac) [Chang et al. NATURE (1977) 198:1056], e maltose. Exemplos adicionais incluem sequências de promotor derivadas de enzimas biossintéticas, tais como triptofano (trp) [Goeddel et al. NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057;. Yelverton Nucl et al. ACIDS RES. (1981), 9:731; Patente US No. 4.738.921; Publicações EP. Nos. 036 776 e 121775, que são incorporados aqui por referência]. O sistema de promotor β- galactosidase (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." Em sistemas de promotor interferon 3 (Ed. I. Gresser)], bacteriofage lambda PL [Shimatake et al., NATURE (1981) 292: 128] e T5 [Pat. US No. 4.689.406, que são incorporados aqui por referência] também fornecem sequências promotoras úteis. Os métodos preferidos da presente invenção usam promotores fortes, tais como o promotor T7 para induzir os polipeptídeos de bG-CSF em níveis elevados. Exemplos de tais vetores são conhecidos por aqueles de competência comum na arte e incluem as séries de pET29 da Novagen, e os vetores pPOP descritos no WO 99/05297, que é incorporado aqui por referência. Tais sistemas de expressão podem produzir altos níveis de polipeptídeos de bG-CSF no hospedeiro, sem comprometer a viabilidade das células hospedeiras ou parâmetros de crescimento. O pET19 (Novagen) é outro vetor conhecido na arte.

[000410] Além disso, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores bacterianos. Por exemplo, as sequências de ativação da transcrição de um outro promotor bacteriano ou bacteriófago podem ser unidas com as sequências do operon de outro promotor bacteriano ou bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético [Patente US No. 4.551.433, que é incorporada aqui por referência]. Por exemplo, o promotor tac é um promotor trp-lac híbrido compreendido por ambas as sequências de promotor trp e de operon lac, o qual é regulado pelo repressor lac [Amann et al., GENE (1983) 25:167;. Boer et al, PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir, naturalmente, os promotores que ocorrem naturalmente de origem não bacteriana que têm a capacidade de ligar o RNA polimerase bacteriano e iniciar a transcrição. Um que ocorre naturalmente de origem não bacteriana também pode estar associado com uma RNA polimerase compatível para produzir altos níveis de expressão de alguns genes em procariontes. O sistema de promotor / bacteriófago T7 RNA polimerase é um exemplo de um sistema de promotor acoplado [Studier et al. J. MOL. BIOL. (1986) 189: 113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985)] 82:1074. Além disso, um promotor híbrido também pode ser compreendido por um promotor de bacteriófago e uma região de operação de E. coli (Publicação EP No. 267 851).

[000411] Além do funcionamento de uma sequência de promotor, um sítio de ligação ao ribossomo eficiente de também é útil para a expressão de genes estranhos em procariontes. Na E. coli, o sítio de ligação ao ribossomo é chamado de sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um códon de iniciação (ATG) e uma sequência de 3 - 9 nucleotídeos de comprimento situada a montante de 3 - 11 nucleotídeos do códon de iniciação [Shine et al. NATURE (1975) 254:34]. Considera-se que a sequência de SD promove a ligação do mRNA ao ribossomo pelo emparelhamento de bases entre a sequência de SD e o 3' e de E. coli 16S rRNA [Steitz et al. "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", em Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. Para expressar genes eucarióticos e genes procarióticos com sítios de ligação ao ribossomo fracos [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989].

[000412] O termo "hospedeiro bacteriano" ou "célula hospedeira bacteriana" se refere a uma que pode ser, ou tenha sido usada como um receptor paravetoresrecombinantesou outroDNAde transferência. O termo inclui os descendentes da célula hospedeira de inseto original que foramtransfectados.Entende-se que a descendência de uma única célula parental não pode ser necessariamente completamente idêntica na morfologia ou na genômica ou complemento de DNA total a de origem da original, devido a mutação acidental ou deliberada. As descendências das células parentais, que são suficientemente similares às originais a serem caracterizadas pelas propriedades relevantes, tais como a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de bG-CSF, estão incluídas na descendência destinada por esta definição.

[000413] A seleção de bactérias hospedeiras adequadas para expressão de polipeptídeos de bG-CSF é conhecida por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Na seleção de hospedeiros de insetos para a expressão, os hospedeiros adequados podem incluir aqueles que mostraram ter, nomeadamente, boa capacidade de formação corporal de inclusão, baixa atividade proteolítica e, toda a robustez em geral. Os hospedeiros bacterianos geralmente estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes incluindo, mas não limitado a bacterial Genetic Stock Center (Centro de Estoque Genético Bacteriano), Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade da California (Berkeley, CA), e a American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). A Fermentação Industrial / farmacêutica geralmente usa derivados bacterianas de cepas K. (por exemplo, W3110) ou a partir de derivados bacterianos de cepas B (por exemplo, BL21). Essas cepas são particularmente úteis porque os seus parâmetros de crescimento são extremamente bem conhecidos e robustos. Além disso, estas cepas não são patogênicas, o que é comercialmente importante, por razões de segurança e razões ambientais. Outros exemplos de hospedeiros de E. coli adequados incluem, mas não estão limitados a, cepas de BL21, DH10B, ou derivados das mesmas. Em uma outra modalidade dos métodos da presente invenção, o hospedeiro de E. coli é uma cepa sem protease incluindo, mas não limitado a OMP- e LON-. A cepa da célula hospedeira pode ser uma espécie de Pseudomonas incluindo, mas não limitado a Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas putida. As Pseudomonas fuorescens tipo biovar 1, designaram cepas MB101, é conhecido por ser útil para a produção recombinante e está disponível para os processos de produção de proteínas terapêuticas. Exemplos de um sistema de expressão de Pseudomonas incluem o sistema disponível a partir de The Dow Chemical Company como uma cepa de hospedeiro (Midland, MI disponíveis na Rede de Alcance Mundial (World Wide Web) em dow.com).

[000414] Uma vez que uma cepa de células hospedeiras recombinantes foi estabelecida (ou seja, a construção da expressão foi introduzida na célula hospedeiras e células hospedeiras com construção de expressão própria são isoladas), a cepa de célula hospedeira recombinante é cultivada em condições apropriadas para a produção de polipeptídeos de bG-CSF. Como será evidente para uma pessoa versada na técnica, o método de cultura da cepa da célula hospedeira recombinante será dependente da natureza da construção da expressão usada e da identidade da célula hospedeira. As cepas de hospedeiros recombinantes são normalmente cultivadas usando métodos que são conhecidos por aqueles de competência comum na arte. As células hospedeiras recombinantes são normalmente cultivadas em meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos e, opcionalmente, contendo vitaminas, aminoácidos, fatores de crescimento, e outros suplementos de cultura proteicos conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. O meio líquido para a cultura de células hospedeiras pode, opcionalmente, conter antibióticos ou antifúngicos para evitar o crescimento de microrganismos e/ou compostos indesejáveis incluindo, mas não limitado a antibióticos para selecionar as células hospedeiras contendo o vetor de expressão.

[000415] As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em formatos de batelada ou contínuo, com colheita celular (no caso em que o polipeptídeo de bG-CSF acumula intracelularmente) ou da colheita do sobrenadante da cultura em ambos os formatos de batelada ou contínuo. Para a produção em células hospedeiras procariontes, a cultura em batelada e a colheita de células são preferidas.

[000416] Os polipeptídeos de bG-CSF da presente invenção são normalmente purificados após expressão em sistemas recombinantes. O polipeptídeo de bG-CSF pode ser purificado a partir de células hospedeiras ou meio de cultura por uma variedade de métodos conhecidos para a arte. A Patente US No. 5.849.883 e o WO 89/10932, que são incorporados aqui por referência na sua totalidade, descrevem a clonagem de bG-CSF e análogos dos mesmos em células hospedeiras, e métodos para o isolamento e purificação. Os polipeptídeos de bG-CSF produzidos em células hospedeiras bacterianas podem ser fracamente solúveis ou insolúveis (na forma de corpos de inclusão). Em uma modalidade da presente invenção, as substituições de aminoácidos podem facilmente feitas ser no polipeptídeo de bG-CSF, que são selecionadas com o propósito de aumentar a solubilidade da proteína produzida de forma recombinante usando os métodos divulgados aqui, bem como aqueles conhecidos na arte. No caso da proteína insolúvel, a proteína pode ser coletada a partir de lisados de célula hospedeira por centrifugação e pode adicionalmente ser seguido de homogeneização das células. No caso das proteínas fracamente solúveis, compostos, incluindo mas não limitado a, imina de polietileno (PEI) podem ser adicionados para induzir a precipitação de proteínas parcialmente solúveis. A proteína precipitada pode então ser convenientemente coletada por centrifugação. As células hospedeiras recombinantes podem ser rompidas ou homogeneizadas para liberar os corpos de inclusão a partir do interior das células usando uma variedade de métodos conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. O rompimento ou homogeneização da célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas bem conhecidas incluindo, mas não limitado a rompimento celular enzimático, sonicação homogeneização Dounce, ou rompimento por liberação a alta pressão. Em uma modalidade do método da presente invenção, a técnica de liberação em alta pressão é usada para romper as células hospedeiras de E. coli para liberar os corpos de inclusão dos polipeptídeos de bG-CSF. Ao manipular os corpos de inclusão de polipeptídeo de bG-CSF, pode ser vantajoso minimizar o tempo de homogeneização em repetições de forma a maximizar o rendimento de corpos de inclusão, sem perda devido a fatores como a solubilização, cisalhamento mecânico ou proteólise.

[000417] O polipeptídeo de bG-CSF insolúvel ou precipitado pode, em seguida, ser solubilizado usando qualquer uma de uma variedade de agentes de solubilização adequados conhecidos da arte. O polipeptídeo de bG-CSF pode ser solubilizado com ureia ou cloridrato de guanidina. O volume do polipeptídeo de bG-CSF solubilizado deve ser minimizado de modo que grandes bateladas possam ser produzidas usando tamanhos de batelada convenientemente gerenciáveis. Este fator pode ser significante em um cenário de grande escala comercial, onde o hospedeiro recombinante pode ser crescido em bateladas que são de milhares de litros de volume. Além disso, quando se fabrica polipeptídeo de bG-CSF em um cenário de grande escala comercial, em particular para usos em produtos farmacêuticos humanos, a evasão de produtos químicos severos que podem danificar o maquinário e no recipiente, ou o produto da proteína em si, deve ser evitada, se possível. Foi demonstrado no método da presente invenção que o agente de desnaturação mais suave, a ureia, pode ser usado para solubilizar os corpos de inclusão de polipeptídeo de bG- CSF em lugar do agente de desnaturação mais severo, cloridrato de guanidina. O uso de ureia reduz significativamente o risco de dano ao equipamento de aço inoxidável usado no processo de fabricação e purificação do polipeptídeo de bG-CSF, ao solubilizar com eficiência os corpos de inclusão de polipeptídeos de bG-CSF.

[000418] No caso das proteínas de bG-CSF solúveis, o bG-CSF pode ser secretado no espaço periplásmico ou no meio de cultura. Além disso, o bG-CSF solúvel pode estar presente no citoplasma da célula hospedeira. Pode ser desejado concentrar o bG-CSF solúvel antes da realização das etapas de purificação. As técnicas padrões conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte podem ser usadas para concentrar o bG-CSF solúvel, por exemplo, a partir de lisados celulares ou meio de cultura. Além disso, as técnicas padrões conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte podem ser usadas para romper células hospedeiras e liberar o bG-CSF solúvel do citoplasma ou do espaço periplásmico das células hospedeiras.

[000419] Quando polipeptídeo de bG-CSF é produzido como uma proteína de fusão, a sequência de fusão pode ser removida. A remoção de uma sequência de fusão pode ser realizada por clivagem enzimática ou química. A remoção enzimática de sequências de fusão pode ser realizada usando métodos conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. A escolha da enzima para a remoção da sequência de fusão será determinada pela identidade da fusão, e as condições de reação serão determinadas pela escolha da enzima, como será evidente para uma pessoa versada na técnica. A clivagem química pode ser realizada usando os reagentes conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte incluindo, mas não limitada a clivagem com brometo de cianogênio, protease TEV, e outros reagentes. O polipeptídeo de bG-CSF clivado pode ser purificado a partir da sequência de fusão clivada por métodos conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Tais métodos serão determinados pela identidade e pelas propriedades da sequência de fusão e do polipeptídeo de bG-CSF, como será evidente para uma pessoa versada na técnica. Os métodos de purificação podem incluir, mas não estão limitados a purificação por cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica ou diálise ou qualquer combinação dos mesmos.

[000420] O polipeptídeo de bG-CSF também pode ser purificado para remover o DNA de uma solução de proteína. O DNA pode ser removido por qualquer método adequado conhecido na arte, tais como cromatografia de precipitação ou de troca iônica, mas pode ser removido pela precipitação com agente de precipitação de ácido nucléico, tais como, mas não limitado a sulfato de protamina. O polipeptídeo de bG-CSF pode ser separado do DNA precipitado usando métodos padrões bem conhecidos incluindo, mas não limitados a centrifugação ou filtração. A remoção de moléculas de ácido nucléico de hospedeiro é um fator importante em um cenário em que o polipeptídeo de bG-CSF é para ser usado para o tratamento de animais ou humanos e os métodos da presente invenção reduzem o DNA da célula hospedeira para níveis farmaceuticamente aceitáveis.

[000421] Os métodos para a fermentação em pequena escala ou em grande escala também podem ser usados na expressão de proteínas incluindo, mas não limitados a fermentadores, frascos de agitação, bioreatores de leito fluidizado, bioreatores de fibra oca, os sistemas de cultura em garrafa rotatória e sistemas de biorreatores de tanque agitado. Cada um desses métodos pode ser realizado em um processo em batelada, batelada alimentada, ou de modo contínuo.

[000422] Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção geralmente podem ser recuperados usando métodos padrões da arte. Por exemplo, o meio de cultura ou lisado celular pode ser centrifugado ou filtrado para remover os restos celulares. O sobrenadante pode ser concentrado ou diluído até um volume desejado ou diafiltrado em um tampão adequado para condicionar a preparação para posterior purificação. A purificação adicional do polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção inclui a separação de formas de desamidadas e cortadas da variante de polipeptídeo de bG-CSF da forma intacta.

[000423] Qualquer um dos seguintes procedimentos exemplares pode ser empregado para a purificação de Polipeptídeos de bG-CSF da invenção: cromatografia de afinidade; cromatografia de troca de cátions ou de ânions (usando, incluindo mas não limitado a, DEAE SEPHAROSE), cromatografia em sílica; cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), HPLC de fase reversa, filtração em gel (usando, incluindo mas não limitado a, SEPHADEX G-75), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por exclusão de tamanho; cromatografia de metal-quelato; ultrafiltração/diafiltração; precipitação em etanol; precipitação em sulfato de amônio; cromatofocagem; cromatografia de deslocamento; procedimentos eletroforéticos (incluindo, mas não limitados a focagem isoelétrica preparativa) solubilidade diferencial (incluindo, mas não limitado a, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração.

[000424] As proteínas da presente invenção incluindo, mas não limitadas a proteínas compreendendo aminoácidos não naturais, peptídeos compreendendo aminoácidos não naturais, anticorpos para proteínas compreendendo aminoácidos não naturais, parceiros de ligação para proteínas compreendendo aminoácidos não naturais, etc., podem ser purificadas parcialmente ou substancialmente para homogeneidade, de acordo com procedimentos padrões conhecidos e usado por aqueles de habilidade na arte. Em consequência, os polipeptídeos da invenção podem ser recuperados e purificados por qualquer uma de uma variedade de métodos conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte incluindo, mas não limitados a, precipitação em etanol ou em sulfato de amônio, extração ácido ou base, cromatografia de coluna, cromatografia de coluna por afinidade, cromatografia de troca de ânions ou de cátions, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia em hidroxiapatita, cromatografia em lectina, eletroforese em gel e semelhantes. As etapas de re-enovelamento de proteína podem ser usadas, como desejado, na preparação de proteínas maduras dobradas corretamente. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia de afinidade ou outros métodos adequados podem ser usados nas etapas de purificação final, onde a elevada pureza é desejada. Em uma modalidade, os anticorpos feitos contra aminoácidos não naturais (ou proteínas ou peptídeos compreendendo aminoácidos não naturais) são usados como reagentes de purificação incluindo, mas não limitado a purificação com base em afinidade de proteínas ou peptídeos compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais. Uma vez purificados, parcialmente ou até homogeneidade, como desejado, os polipeptídeos são opcionalmente usados para uma ampla variedade de utilidades incluindo, mas não limitado a componentes do ensaio, produtos terapêuticos, profilaxia, diagnósticos, reagentes de pesquisa e/ou como imunogenes na produção de anticorpos. Os anticorpos gerados contra os polipeptídeos da presente invenção podem ser obtidos pela administração dos polipeptídeos ou fragmentos que apresentam epítopos, ou células para um animal, preferencialmente, um animal não humano, usando protocolos de rotina. Uma pessoa de competência normal na arte poderia gerar anticorpos, usando uma variedade de técnicas conhecidas. Além disso, camundongos transgênicos, ou outros organismos, incluindo outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados. Os anticorpos descritos acima podem ser empregados para isolar ou identificar clones que expressam o polipeptídeo ou para purificar os polipeptídeos. Os anticorpos contra os polipeptídeos da presente invenção também podem ser usados para tratar doenças.

[000425] Os polipeptídeos e polinucleotídeos da presente invenção podem também ser usados como vacinas. Assim, em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para induzir uma resposta imune em um mamífero que compreende, a inoculação do mamífero com um polipeptídeo da presente invenção, adequada para produzir a resposta imune de células T e/ou anticorpo, incluindo, por exemplo, as células T produtoras de citocinas ou células T citotóxicas, para proteger os referidos animais da doença, quer a doença já esteja estabelecida dentro do indivíduo ou não. Uma resposta imune em um mamífero pode também ser induzida por um método compreendendo a distribuição de um polipeptídeo da presente invenção por meio de uma expressão direcionada por vetor do polinucleotídeo e a codificação para o polipeptídeo in vivo a fim de induzir uma resposta imunológico para produzir anticorpos para proteger os referidos animais das doenças da invenção. Um modo de administrar o vetor é pela acelerando os mesmos nas células desejadas como um revestimento de partículas, ou de outra forma. Tais vetores de ácido nucléico podem conter DNA, RNA, um ácido nucléico modificado, ou um híbrido de DNA/RNA. Para o uso como uma vacina, um vetor de ácido nucléico ou um polipeptídeo será normalmente fornecido como uma formulação da vacina (composição). A formulação pode compreender adicionalmente um carreador adequado. Uma vez que um polipeptídeo pode ser degradado no estômago, ele pode ser administrado por via parenteral (por exemplo, por via subcutânea, intramuscular, endovenosa, ou injeção intradérmica). As formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções estéreis de injeção aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação instônica com o sangue do receptor; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes suspensão ou agentes de espessamento. A formulação da vacina também pode incluir sistemas adjuvantes para intensificar a imunogenicidade da formulação, os quais são conhecidos por aqueles de competência comum na arte. A dosagem vai depender da atividade específica da vacina e pode ser facilmente determinada pela experimentação de rotina.

[000426] Além de outras referências mencionadas aqui, uma variedade de métodos de dobramento de proteínas/purificação é conhecida por aqueles de competência comum na arte incluindo, mas não limitados a aqueles estabelecidos em R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. NY (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins. Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2° Edição Wiley-Liss, NY.; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris e Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris e Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3° Edição Springer Verlag, NY.; Janson e Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Segunda Edição Wiley-VCH, NY; e Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; e as referências citadas aqui.

[000427] Uma vantagem de produzir uma proteína ou um polipeptídeo de interesse com um aminoácido não natural em uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucarióticas é que, normalmente, as proteínas ou polipeptídeos serão dobradas em suas conformações nativas. No entanto, em certas modalidades da invenção, aqueles com habilidade na arte vão reconhecer que, após a síntese, expressão e/ou purificação, as proteínas ou peptídeos podem possuir uma conformação diferente das conformações desejadas dos polipeptídeos relevantes. Em um aspecto da invenção, a proteína expressa ou polipeptídeo é, opcionalmente, desnaturado e, em seguida, renaturado. Isso é realizado usando métodos conhecidos na arte incluindo, mas não limitado a adição de uma chaperonina à proteína ou polipeptídeo de interesse, pela solubilização das proteínas em um agente caotrópico, tal como guanidina HCl, usando proteína dissulfeto isomerase, etc.

[000428] Em geral, é por vezes desejável desnaturar e reduzir os polipeptídeosexpressos e,emseguida, fazercom que os polipeptídeosse enovelemparaa conformaçãopreferida.Por exemplo, guanidina, ureia, DTT, DTE, e/ou uma chaperonina pode ser adicionada a um produto de tradução de interesse. Os métodos de redução, desnaturação e renaturação de proteínas são conhecidos por aqueles de competência comum da arte (veja as referências acima, e Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman e Pastan (1993) Bioconiug. Chem.. 4: 581-585; e Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205:263-270). Debinski, et al., por exemplo, descrevem a desnaturação e redução das proteínas no corpo de inclusão na guanidina-DTE. As proteínas podem ser redobradas em um tampão redox contendo, incluindo mas não limitado a, glutationa oxidada e L-arginina. Os reagentes de redobramento podem ser fluídos ou, de outro modo, colocados em contato com um ou mais polipeptídeos ou outros produtos de expressão, ou vice-versa.

[000429] No caso da produção procariótica do polipeptídeo de bG- CSF, o polipeptídeo de bG-CSF assim produzido pode ser desdobrado e, portanto, tem atividade biológica reduzida ou nenhuma atividade biológica. A bioatividade da proteína pode ser restaurada pelo "redobramento". Em geral, o polipeptídeo de bG-CSF é redobrado pela solubilização (onde o polipeptídeo de bG-CSF também é insolúvel), desdobramento e redução da cadeia polipeptídica usando, por exemplo, um ou mais agentes caotrópicos (por exemplo, uréia e/ou guanidina) e um agente de redução capaz de reduzir as ligações de dissulfeto (por exemplo, ditiotreitol, DTT ou 2-mercaptoetanol, 2-ME). Em uma concentração moderada de caotrópico, um agente de oxidação é então adicionado (por exemplo, oxigênio, cistina ou cistamina), que permite a reformação de ligações de dissulfeto. Os polipeptídeo de bG-CSF podem ser redobrados usando métodos padrões conhecidos na arte, tais como os descritos nas Patentes US Nos. 4.511.502, 4.511.503 e 4.512.922, que são incorporadas aqui por referência. O polipeptídeo de bG-CSF também pode ser co- reenovelamento com outras proteínas para formar heterodímeros ou heteromultímeros.

[000430] Após o redobramento, o bG-CSF pode ser purificado. A purificação do bG-CSF pode ser realizada usando uma variedade de técnicas conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte, incluindo cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa, cromatografia de afinidade, e semelhantes ou qualquer combinação dos mesmos. A purificação adicional pode também incluir uma etapa de secagem ou precipitação da proteína purificada.

[000431] Após a purificação, o bG-CSF pode ser trocado em tampões diferentes e/ou concentrados por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na arte incluindo, mas não limitado a diafiltração e diálise. O bG-CSF, que é fornecido como uma única proteína purificada pode ser objeto de agregação e precipitação.

[000432] O bG-CSF purificado pode ser, pelo menos 90% puro (medido por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa, RP-HPLC, ou eletroforese em gel de poliacrilamida - dodecil sulfato de sódio, SDS-PAGE), ou pelo menos 95% ou pelo menos 98% puro, ou pelo menos 99% ou mais puro. Independentemente do valor numérico exato da pureza do bG-CSF, o bG-CSF é suficientemente puro para uso como um produto farmacêutico ou para posterior processamento, tal como a conjugação com um polímero solúvel em água, tal como o PEG.

[000433] Certas moléculas bG-CSF podem ser usadas como agentes terapêuticos na ausência de outros ingredientes ativos ou proteínas (diferentes de excipientes, carreadores e estabilizantes, albumina sérica e semelhantes), ou podem ser complexados com uma outra proteína ou um polímero.

[000434] Métodos Gerais de Purificação: Qualquer uma de uma variedade de medidas de etapas de isolamento pode ser realizada no lisado celular, extrato, meio de cultura, corpos de inclusão, espaço periplásmico das células hospedeiras, citoplasma de célula hospedeiras, ou outro material, compreendendo o polipeptídeo de bG- CSF ou em qualquer mistura de polipeptídeo de bG-CSF resultante de quaisquer etapas de isolamento incluindo, mas não limitado a, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), HPLC de fase reversa (“RP-HPLC”), adsorção em leito expandido, ou qualquer combinação e/ou repetição dos mesmos e, em qualquer ordem apropriada.

[000435] Os equipamentos e outros materiais necessários usados na execução das técnicas aqui descritas estão disponíveis comercialmente. Bombas, coletores de fração, monitores, gravadores e sistemas completos são disponíveis, por exemplo, a partir de Applied Biosystems (Foster City, CA), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA), e Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ). Os materiais de cromatografia incluindo, mas não limitados a materiais de matriz de troca, meios, e tampões estão também disponíveis nessas empresas.

[000436] Equilíbrio e outras etapas nos processos de cromatografia de coluna aqui descritos, tais como lavagem e eluição, podem ser mais rapidamente realizados usando equipamento especializado, tal como uma bomba. As bombas disponíveis comercialmente incluem, mas não estão limitadas a Bomba P-50 HILOAD®,bomba P1 peristálticas, bomba P-901, e bomba P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

[000437] Exemplos de coletores de fração incluem o RediFrac Fraction Collector, os coletores de fração FRAC-100 e FRAC-200, e SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Os misturadores também estão disponíveis para formar gradientes de concentração de pH e linear. Os misturadores disponíveis comercialmente incluem os misturadores gradiente Mixer GM-1 e InLine Mixers (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

[000438] O processo cromatográfico pode ser monitorado por meio de qualquer monitor disponível comercialmente. Esses monitores podem ser usados para coletar informações como UV, pH e condutividade. Exemplos de detectores incluem o Monitor UV-1, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C-900 e Monitor de condutividade (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). De fato, sistemas inteiros estão comercialmente disponíveis, incluindo os vários sistemas de AKTA®, da Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

[000439] Em uma modalidade da presente invenção, por exemplo, o polipeptídeo de bG-CSF pode ser reduzido e desnaturado, primeiramente desnaturando o polipeptídeo de bG-CSF purificado resultante em ureia, seguido pela diluição em tampão TRIS contendo um agente de redução (tal como DDT) em um pH adequado. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF é desnaturado em ureia em uma faixa de concentração entre cerca de 2 M a cerca de 9 M, seguido de diluição em tampão TRIS, em pH na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 8,0. A mistura de redobramento desta modalidade pode, então, ser incubada. Em uma modalidade, a mistura de redobramento é incubada em temperatura ambiente por quatro - vinte e quatro horas. A mistura de polipeptídeos de bG-CSF reduzido e desnaturado pode então ser isolada ou purificada.

[000440] Como estabelecido aqui, o pH da primeira mistura de polipeptídeo de bG-CSF pode ser ajustado antes de executar qualquer etapa de isolamento subsequente. Além disso, a primeira mistura de polipeptídeos de bG-CSF ou qualquer mistura subsequente dos mesmos pode ser concentrada usando técnicas conhecidas na arte. Além disso, o tampão de eluição compreendendo a primeira mistura de polipeptídeos de bG-CSF ou qualquer mistura subsequente dos mesmos pode ser trocada por um tampão adequado para a próxima etapa de isolamento usando técnicas conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte.

[000441] Cromatografia de troca iônica: Em uma modalidade, e como uma etapa adicional, opcional, a cromatografia de troca iônica pode ser realizada na primeira mistura de polipeptídeos de bG-CSF. Veja, geralmente ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ)). As colunas de troca iônica comercialmente disponíveis incluem as colunas HITRAP®, HIPREP® e HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Essas colunas utilizam trocadores de ânions fortes, tais como Q SEPHAROSE® de Fluxo Rápido, Q SEPHAROSE® de alto desempenho, e Q SEPHAROSE® XL; trocadores catiônicos fortes, tal como SP SEPHAROSE® de alto desempenho, SP SEPHAROSE® de fluxo rápido e SP SEPHAROSE® XL, trocadores aniônicos fracos, tal como DEAE SEPHAROSE® de Fluxo Rápido e trocadores catiônicos fracos, tal como CM SEPHAROSE® de Fluxo Rápido (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A cromatografia em coluna de troca de ânions ou de cátions pode ser realizada no polipeptídeo de bG-CSF, em qualquer estágio do processo de purificação para isolar substancialmente o polipeptídeo de bG-CSF purificado. A etapa de cromatografia de troca de cátions pode ser realizada usando qualquer matriz de troca de cátions adequada. As matrizes de troca de cátions úteis incluem, mas não estão limitadas a materiais fibrosos, porosos, não porosos, microgranulares, com esferas, ou matriz de troca de cátions reticulada. Esses materiais de matriz de troca de cátions incluem, mas não estão limitados a celulose, agarose, dextrano, poliacrilato, polivinil, poliestireno, sílica, poliéster, ou compósitos de qualquer uma das anteriores.

[000442] A matriz de troca de cátions pode ser qualquer um trocador de cátions adequado, incluindo os trocadores de cátions fortes e fracos. Os trocadores de cátions fortes podem permanecer ionizados sobre uma ampla faixa de pH e, portanto, podem ser capazes de se ligar ao bG-CSF sobre uma ampla faixa de pH. Os trocadores de cátions fracos, no entanto, podem perder a ionização em função do pH. Por exemplo, um trocador de cátion fraco pode perder a carga quando o pH cai para abaixo de pH 4 ou pH 5. Os trocadores de cátions fortes apropriados incluem, mas não estão limitados a grupos funcionais carregados, tais como sulfopropil (SP), sulfonato de metila (S), ou sulfoetil (SE). A matriz de troca de cátions pode ser um trocador de cátion forte, preferencialmente tendo uma faixa de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de 2,5 a cerca de 6,0. Alternativamente, o trocador de cátions fortes pode ter uma faixa de pH de ligação ao bG- CSF de cerca de pH 2,5 a cerca de pH 5,5. A matriz de troca de cátions pode ser um trocador de cátion forte tendo um pH de ligação ao bG-CSF de cerca de 3,0. Alternativamente, a matriz de troca de cátions pode ser um trocador de cátion forte, preferencialmente tendo uma faixa de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. A matriz de troca de cátions pode ser um trocador de cátion forte, preferencialmente tendo uma faixa de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de 8,0 a cerca de 12,5. Alternativamente, o trocador de cátions forte pode ter uma faixa de pH de ligação ao bG-CSF de cerca de pH 8,0 a cerca de pH 12,0.

[000443] Antes de carregar o bG-CSF, a a matriz de troca de cátions pode ser equilibrada, por exemplo, usando vários volumes de coluna de um ácido fraco, diluído, por exemplo, quatro volumes de coluna de de ácido acético 20 mM, pH 3. Após atingir o equilíbrio, o bG-CSF pode ser adicionado e a coluna pode ser lavada de uma a várias vezes, antes de eluição do bG-CSF substancialmente purificado, também usando uma solução de ácido fraco, tal como uma solução de ácido fosfórico ou ácido acético fraco. Por exemplo, cerca de 2 - 4 volumes de coluna de ácido acético 20 mM, pH 3, podem ser usados para lavar a coluna. As lavagens adicionais com, por exemplo, 2 - 4 volumes de coluna com acetato de sódio 0,05 M, pH 5,5, ou acetato de sódio 0,05 M misturado com cloreto de sódio 0,1 M, pH 5.5, pode também ser usados. Alternativamente, os usos de métodos conhecidos na arte, a matriz de troca de cátions pode ser equilibrada com vários volumes de coluna de uma base fraca, diluída.

[000444] Alternativamente, o bG-CSF substancialmente purificado pode ser eluído pelo contato com a matriz de troca de cátions com um tampão tendo um pH ou força iônica suficientemente baixa, para deslocar o bG-CSF da matriz. O pH do tampão de eluição pode variar entre cerca de pH 2,5 a cerca de pH 6,0. Mais especificamente, o pH do tampão de eluição pode variar entre cerca de pH 2,5 a cerca de pH 5,5, cerca de pH 2,5 a cerca de pH 5,0. O tampão de eluição pode ter um pH de aproximadamente 3,0. Além disso, a quantidade de tampão de eluição pode variar amplamente e, geralmente, na faixa de 2 até cerca de 10 volumes de coluna.

[000445] Após a adsorção do polipeptídeo de bG-CSF para a matriz de troca de cátions, o polipeptídeo de bG-CSF substancialmente purificado pode ser eluído pelo contato da matriz com um tampão tendo um pH ou força iônica suficientemente alta para deslocar o polipeptídeo de bG-CSF da matriz. Os tampões adequados para uso em eluição com pH elevado do polipeptídeo de bG-CSF substancialmente purificado podem incluir, mas não estão limitados a, tampões citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES e MES variando na concentração de pelo menos cerca de 5 mM a pelo menos cerca de 100 mM.

[000446] Cromatografia em Fase Reversa: A RP-HPLC pode ser realizada para purificar proteínas seguindo protocolos apropriados, que são conhecidos por aqueles de competência comum na arte. Ver, por exemplo, Pearson et al. ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. CHROM (1986)359:391-402. A RP-HPLC pode ser realizada no polipeptídeo de bG-CSF para isolar o polipeptídeo de bG-CSF substancialmente purificado. Neste sentido, as resinas derivadas de sílica com funcionalidades de alquil com uma ampla variedade de comprimentos, incluindo, mas não limitados a, resinas com pelo menos cerca de C3, pelo menos cerca de C30, pelo menos cerca de C3, pelo menos cerca de C20, ou pelo menos cerca de C3 a pelo menos cerca de Q18, podem ser usadas. Alternativamente, uma resina polimérica pode ser usada. Por exemplo, a resina TosoHaas Amberchrome CG1000sd, que é uma resina de polímero de estireno, pode ser usada. Resinas poliméricas ou com ciano com uma ampla variedade de comprimentos de cadeia alquil também podem ser usadas. Além disso, a coluna de RP-HPLC pode ser lavada com um solvente, tal como o etanol. A coluna RP Source é um outro exemplo de uma coluna RP-HPLC.

[000447] Um tampão de eluição adequado contendo um agente de emparelhamento de íons e um modificador orgânico, tal como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, etanol ou acetonitrila, pode ser usado para eluir o polipeptídeo de bG-CSF da coluna RP-HPLC. Os agentes de emparelhamento de íon mais comumente usados incluem, mas não estão limitados a ácido acético, ácido fórmico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutírico, trietilamina, tetrametil amônio, tetrabulilamônio e acetato trietilamônio. A eluição pode ser realizada usando uma ou mais condições isocráticas ou gradientes, com condições de gradiente preferidas para reduzir o tempo de separação e diminuir a largura de pico. Outro método envolve o uso de dois gradientes com diferentes faixas de concentração do solvente. Exemplos de tampões de eluição adequados para o uso aqui podem incluir, mas não estão limitados a, acetato de amônio e soluções de acetonitrila.

[000448] Técnicas de Purificação por Cromatografia de Interação Hidrofóbica: A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) pode ser realizada no polipeptídeo de bG-CSF. Veja, geralmente, HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), que é incorporado aqui por referência. As matrizes de HIC adequadas podem incluir, mas não estão limitadas a matrizes de alquil- ou aril-substituído, tais como matrizes de butil-, hexil-, octil-ou fenil-substituídos incluindo matrizes de agarose, agarose reticulada, sepharose, celulose, sílica, dextrana, poliestireno, poli (metacrilato), e resinas de modo misto, incluindo mas não limitadas a, uma resina polietilenoamina ou matriz de poli (metacrilato) butil- ou fenil-substituída. As fontes comercialmente disponíveis para a cromatografia com coluna de interação hidrofóbica incluem, mas não estão limitadas a colunas HITRAP®, HIPREP® e HILO AD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

[000449] Em suma, antes do carregamento, a coluna de HIC pode ser equilibrada com soluções padrão conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte, tais como uma solução de ácido acético / cloreto de sódio ou HEPES contendo sulfato de amônio. O sulfato de amônio pode ser usado como o tampão para carregar a coluna de HIC. Depois de carregar o polipeptídeo de bG-CSF, a coluna pode, então, ser lavada usando tampões e condições padrões para a remoção de materiais indesejáveis, mas mantendo o polipeptídeo de bG-CSF na coluna de HIC. O polipeptídeo de bG-CSF pode ser eluído com cerca de 3 a cerca de 10 volumes de coluna de um tampão padrão, tal como um tampão HEPES contendo EDTA e menor concentração de sulfato de amônio que o tampão de equilíbrio, ou um tampão de ácido acético/cloreto de sódio, entre outros. Um gradiente salino linear decrescente usando, por exemplo, um gradiente de fosfato de potássio, também pode ser usado para eluir as moléculas de bG-CSF. O eluente pode, então, ser concentrado, por exemplo, por filtração, tal como diafiltração ou ultrafiltração. A diafiltração pode ser utilizada para remover o sal usado para eluir o polipeptídeo de bG-CSF.

[000450] Outras Técnicas de Purificação:Outra etapa de isolamento, usando, por exemplo, filtração em gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No.18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), que é incorporado aqui por referência, cromatografia de hidroxiapatita (matrizes adequadas incluem, mas não estão limitados a, HA-Ultrogel, de Alta Resolução (Calbiochem), CHT cerâmicaHidroxiapatita (BioRad),Bio Gel - HTPhidroxiapatita (BioRad)), HPLC, adsorção emleito expandido,ultrafiltração, diafiltração, liofilização, e semelhantes, pode ser realizada na primeira mistura de polipeptídeo de bG-CSF ou qualquer mistura subsequente do mesmo, para remover qualquer excesso de sal e para substituir o tampão comum tampão adequado para apróxima etapa de isolamento ou até mesmo a formulação do produto de fármaco final.

[000451] Orendimento do polipeptídeo debG-CSF, incluindo substancialmente o polipeptídeo de bG-CSF purificado, pode ser monitorado a cada etapa aqui descrita usando as técnicas conhecidas por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Essas técnicas também podem ser usadas para avaliar o rendimento do polipeptídeo de bG-CSF substancialmente purificado após a etapa de isolamento. Por exemplo, o rendimento do polipeptídeo de bG-CSF pode ser monitorado usando qualquer uma das várias colunas para cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa, tendo uma variedade de comprimentos de cadeia alquil, tais como RP-HPLC ciano, C18RP-HPLC, bem como HPLC de troca de cátions e HPLC de filtração em gel.

[000452] Em modalidades específicas da presente invenção, o rendimento do bG-CSF após cada etapa de purificação pode ser, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% , pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,9%, ou, pelo menos cerca de 99,99%, do bG-CSF no material de partida para cada etapa de purificação.

[000453] A pureza pode ser determinada usando técnicas padrões, tais como SDS-PAGE, ou pela medição do polipeptídeo de bG-CSF usando Western blot e ELISA. Por exemplo, os anticorpos policlonais podem ser gerados contra proteínas isoladas a partir da fermentação de leveduras de controle negativo e da recuperação por troca de cátions. Os anticorpos também podem ser usados para investigar a presença de proteínas de células hospedeiras contaminantes.

[000454] O material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste em partículas de sílica gel, as superfícies que transportam as cadeias de alquil-C4. A separação do polipeptídeo de bG-CSF das impurezas proteicas é baseada nas diferenças da resistência das interações hidrofóbicas. A eluição é realizada com um gradiente de acetonitrila em ácido trifluoroacético diluído. A HPLC preparativa é realizada usando uma coluna de aço inoxidável (preenchida com 2,8 a 3,2 litros de silicagel Vydac C4). O eluato hidroxiapatita UItrogel é acidificado por adição de ácido trifluoroacético e carregado para a coluna C4 Vydac. Para a lavagem e eluição um gradiente de acetonitrila em ácido trifluoroacético diluído é usado. As frações são coletadas e imediatamente neutralizadas com tampão fosfato. As frações de polipeptídeo de bG-CSF que estão dentro dos limites do IPC são agrupadas.

[000455] O material de DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste em grupos de dietilaminoetil (DEAE) que estão covalentemente ligados à superfície das esferas de Sepharose. A ligação do polipeptídeo de bG- CSF aos grupos de DEAE é mediada por interações iônicas. A Acetonitrila e o ácido trifluoroacético passam através da coluna sem serem retidos. Após essas substâncias terem sido lavadas, os traços de impurezas são removidos por lavagem da coluna com tampão de acetato em pH baixo. Em seguida, a coluna é lavada com tampão fosfato neutro e o polipeptídeo de bG-CSF é eluído com um tampão com a força iônica aumentada. A coluna é empacotada com DEAE Sepharose de fluxo rápido. O volume da coluna é ajustado para garantir uma carga de polipeptídeo de bG-CSF na faixa de 3 - 10 mg de polipeptídeo de bG-CSF / mL de gel. A coluna é lavada com água e tampão de equilíbrio (sódio / fosfato de potássio). As frações agrupadas do eluato de HPLC são carregadas e a coluna é lavada com tampão de equilíbrio. Em seguida, a coluna é lavada com tampão de lavagem (tampão de acetato de sódio), seguido pela lavagem com tampão de equilíbrio. Posteriormente, o polipeptídeo de bG-CSF é eluído da coluna com o tampão de eluição (cloreto de sódio, fosfato de sódio/potássio) e coletado em uma única fração de acordo com o perfil de eluição mestre. O eluato da coluna de DEAE Sepharose é ajustado para a condutividade especificada. A substância resultante, fármaco, é filtrada de forma estéril em frascos de Teflon e armazenada a 70 °C.

[000456] Os métodos adicionais que podem ser empregados incluem, mas não estão limitados a etapas para remover endotoxinas. As endotoxinas são lipolissacarídeos (LPSs), que estão localizados na membrana externa das células hospedeiras Gram-negativas, como, por exemplo, Escherichia coli. Os métodos para reduzir os níveis de endotoxina são conhecidos por uma pessoa versada na técnica e incluem, mas não estão limitados a técnicas de purificação usando suportes de sílica, pó de vidro ou hidroxiapatita, fase reversa, afinidade, exclusão por tamanho, cromatografia de troca de ânions, cromatografia de interação hidrofóbica, uma combinação dos mesmos, e semelhantes. As modificações ou métodos adicionais podem ser necessários para remover os contaminantes, tais como métodos para a co-migração de proteínas do polipeptídeo de interesse. Os métodos para medir os níveis de endotoxina são conhecidos por uma pessoa versada na técnica e incluem, mas não estão limitados a ensaios do Lisado de Amebócitos do Limulus (LAL). O ensaio EndosafeTM-PTS é um sistema de tubo único, colorimétrico, que usa cartuchos pré- carregados com reagente de LAL, substrato cromogênico, e endotoxina de controle padrão, juntamente com um espectrofotômetro portátil. Os métodos alternativos incluem, mas não estão limitados a um método cinético LAL que é turbidimétrico e usa um formato de 96 poços.

[000457] Uma ampla variedade de métodos e procedimentos pode ser usada para avaliar o rendimento e a pureza de uma proteína de bG-CSF compreendendo um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural, incluindo, mas não limitado a, ensaio de Bradford, SDS-PAGE, SDS-PAGE colorido com prata, SDS-PAGE colorido com coomassie, espectrometria de massa (incluindo, mas não limitado a, MALDI-TOF) e outros métodos para caracterização de proteínas conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[000458] Os métodos incluem, mas não estão limitados a: SDS- PAGE acoplado com métodos de coloração das proteínas, imunoblotting, espectrometria de massas com ionização/ dessorção a laser assistida em matriz (MALDI-MS), espectrometria de massa/cromatografia líquida, focagem isoelétrica, troca analítica de ânion, cromatofocagem e dicroísmo circular.

VIII. Expressão em Sistemas Alternados

[000459] Várias estratégias foram empregadas para introduzir aminoácidos não naturais em proteínas em células hospedeiras não recombinantes, células hospedeiras mutagenizadas, ou em sistemas livres de células. Estes sistemas também são adequados para uso na preparação de polipeptídeos de bG-CSF da presente invenção. A derivatização de aminoácidos com cadeias laterais reativas, tais como Lys, Tyr e Cys resultou na conversão da lisina para N2-acetil-lisina. A síntese química também fornece um método direto para incorporar aminoácidos não naturais. Com o desenvolvimento recente da ligação enzimática e ligação química nativa de fragmentos de peptídeos, é possível fazer proteínas maiores. Ver, por exemplo, P. E. Dawson e S. B. H, Kent, Annu. Rev. Biochem. 69:923 (2000). A ligação química dos peptídeos e a ligação química nativa estão descritas na Patente US No. 6.184.344,publicaçãode pedidosdePatentesUSNo. 2004/0138412,publicaçãodepedidosdePatentesUS No 2003/0208046, WO 02/098902, e WO 03/042235, que são incorporados aqui por referência. Um método biossintético geral in vitro em que um tRNA supressor acilado quimicamente com o aminoácido não natural desejado é adicionado a um extrato in vitro capaz de suportar biossíntese de proteínas, tem sido usado para incorporar de forma sítio-específica mais de 100 aminoácidos não naturais em uma variedade de proteínas virtualmente de qualquer tamanho. Ver, por exemplo, V. W. Cornish, D. Mendel e P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C. J. Noren, SJ. Anthony-Cahili, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for sitespecific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188(1989); e, J. D. Bain, CG. Glabe, TA. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111 :8013-8014 (1989). Uma ampla variedade de grupos funcionais foi introduzida em proteínas para estudos de estabilidade de proteínas, dobramento de proteínas, mecanismo enzimático e tradução de sinal.

[000460] Um método in vivo, denominado incorporação de pressão seletiva, foi desenvolvido para explorar a heterogeneidade de sintetases de tipo selvagem. Ver, por exemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J.,13:41(1999). Uma cepa auxotrófica, na qual o via metabólica relevante que supre a célula com um aminoácido natural particular é interrompida, é crescida em meio mínimo contendo concentrações limitadas do aminoácido natural, enquanto a transcrição do gene alvo é reprimida. No início de uma fase de crescimento estacionário, o aminoácido natural é depletado e substituído com o análogo do aminoácido não natural. A indução da expressão da proteína recombinante resulta no acúmulo de uma proteína que contém o análogo não natural. Por exemplo, usando esta estratégia, a m, e p- fluorofenilalaninas foram incorporadas em proteínas, e apresentaram dois ombros característicos no espectro de UV que podem ser facilmente identificados, ver, por exemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder e N. Budisa, Anal. Bio Chem, 284:29(2000); a trifluorometionina tem sido usada para substituir metionina em lisozima de bacteriófago T4 para estudar sua interação com ligantes de chito- oligossacarídeos por 19F RMN, ver, por exemplo H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997); e a trifluoroleucina foi incorporada no lugar de leucina, resultando em estabilidade térmica e química aumentadas de uma proteína do zipper da leucina. Ver, por exemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, WA Petka, T. Nakajima, DeGrado WF e Tirrell DA, Angew. Chem. Int, Ed. Engl. 40:1494 (2001). Além disso, a selenometionina e a telurometionina são incorporadas em várias proteínas recombinantes para facilitar a solução das fases em cristalografia de raios-X. Ver, por exemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Hoiton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda e M. Hatada, Nat, Struct. Biol., 1 :283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskom, J. Kellermann e R. Huber, Eur. J. Biochem. 230:788 (1995); e, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder e R. Huber, J. MoI. Biol., 270:616(1997). Os análogos de metionina com funcionalidades alquenol ou alquino também foram incorporados de forma eficiente, permitindo a modificação adicional de proteínas por meios químicos. Ver, por exemplo, J. C. van Hest e D. A. Tirrell, FEBS Lett. 428:68 (1998); J. C. van Hest, K. L. Kiick e D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122: 1282 (2000); e, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); Patente US No. 6.586.207, publicação de pedido de Patente US 2002/0042097, que são incorporados aqui por referência.

[000461] O sucesso deste método depende do reconhecimento de análogos de aminoácidos não naturais por aminoacil-tRNA sintetases, que, em geral, exigem uma alta seletividade para garantir a fidelidade da tradução da proteína. Uma forma de ampliar o escopo desse método é relaxar a especificidade do substrato de aminoacil-tRNA sintetase, que foi alcançada em um número limitado de casos. Por exemplo, a substituição da Ala294 por Gly em fenilalanina-tRNA sintetase de Escherichia coli (PheRS) aumenta o tamanho da bolsa de ligação do substrato, e resulta na acilação de tRNAPhe por p-Cl- fenilalanina (p-Cl-Phe). Veja, M. Ibba, P. Kast e H. Herrnecke, Biochemistry, 33:7107(1994). Uma cepa de Escherichia coli que abriga esse tipo de mutante permite a incorporação de p-Cl- fenilalanina ou p-Br-fenilalanina no lugar de fenilalanina. Ver, por exemplo, M. Ibba e H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); e, N. Sharma, R. Furter, P. Kast e D. A. Tin-ell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Da mesma forma, uma mutação de ponto Phe130Ser próxima ao sítio de ligação aos aminoácidos de tirosil-tRNA sintetase de Escherichia coli mostrou permitir que a azatirosina fosse incorporada de forma mais eficiente do que a tirosina. Veja, F. Hamano Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Solo e Nishimura S., J. Biol, Chem., 275:40324 (2000 ).

[000462] Outra estratégia para incorporar aminoácidos não naturais nas proteínas in vivo é modificar as sintetases que têm mecanismos de revisão. Estes sintetases não podem discriminar e, portanto, ativam os aminoácidos que são estruturalmente similares aos aminoácidos naturais cognatos. Este erro é corrigido em um sítio separado, que desacila o aminoácido descarregado do tRNA para manter a fidelidade da tradução da proteína. Se a atividade de revisão da sintetase é desativada, os análogos estruturais que são desativados podem escapar da função de edição e ser incorporados. Esta abordagem foi demonstrada recentemente com a valil-tRNA sintetase (VaIRS). Veja, V. Doring, Mootz HD, LA Nangle, Hendrickson TL, V. de Crecy Lagard, P. Schimmel e P. Marlière, Science, 292:501 (2001). A VaIRS pode desaminoacilar a tRNAVal com Cys, Thr ou aminobutirato (Abu); estes aminoácidos não cognatos são posteriormente hidrolisados pelo domínio de edição. Depois de mutagênese aleatória do cromossomo de Escherichia coli, uma cepa de Escherichia coli mutante, que tinha uma mutação no sítio de edição de VaIRS, foi selecionada. Esta VaIRS com defeito de edição carrega incorretamente a tRNAVal com Cys. Devido a Abu se assemelhar estericamente a Cys (o grupo-SH da cisteína é substituído por -CH3 no Abu), o VaIRS mutante também incorpora Abu nas proteínas, quando a cepa de Escherichia coli mutante é crescida na presença de Abu. A análise de espectrométrica de massa mostra que cerca de 24% das valinas são substituídas por Abu em cada posição da valina na proteína nativa.

[000463] Os métodos semissintéticos e de síntese em fase sólida também permitiram a síntese de uma série de proteínas que contendo novos aminoácidos. Veja, por exemplo, as seguintes publicações e referências bibliográficas citadas aqui, que são as seguintes: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192: 1227- 1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides XXXVI. The effect ofpyrazole- imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E. T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J. Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem. 11(3):255-301(1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); e, Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994).

[000464] As modificações químicas foram usadas para introduzir uma variedade de cadeias laterais não naturais, incluindo co-fatores, marcadores de spin e oligonucleotídeos em proteínas in vitro. Ver, por exemplo, Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science. 238(4832):1401- 1403 (1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984); Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. et M. L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154(1966); e, Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction ofnucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 242(4881):1038-1040 (1988).

[000465] Como alternativa, os métodos biossintéticos que empregam aminoacil-tRNAs quimicamente modificados têm sido usados para incorporar várias sondas biofísicas em proteínas sintetizadas in vitro. Consulte as seguintes publicações e referências citadas em: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514(1993); e, Krieg, U.C., Walter, P. Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci., 83(22): 8604- 8608 (1986).

[000466] Anteriormente, foi demonstrado que aminoácidos não naturais podem ser incorporados de forma sítio-específica nas proteínas in vitro através da adição de tRNAs supressores aminoacilados quimicamente para reações de síntese protéica programadas com um gene que contém uma mutação nonsense âmbar desejada. Usando estas abordagens, pode-se substituir vários dos vinte aminoácidos comuns com homólogos estruturais próximos, por exemplo, fluorfenilalanina para fenilalanina, usando cepas auxotrópicas para um aminoácido particular. Ver, por exemplo, Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:43942 (1995); Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51(1999); Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site- specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); e, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct, 24, 435-62 (1995).

[000467] Por exemplo, um tRNA supressor, que reconheceu o códon UAG e foi quimicamente aminoacilado com um aminoácido não natural, foi preparado. A mutagênese sítio-dirigida convencional foi usada para introduzir o códon TAG de parada, no sítio de interesse no gene da proteína. Ver, por exemplo, Sayers, J. R., Schmidt, W. Eckstein,F.5'-3'Exonucleases in phosphorothioate- basedolignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988). Quando o tRNA supressor acilado e o gene mutante foram combinados em um sistema de transcrição/tradução in vitro, o aminoácido não natural foi incorporado em resposta ao códon UAG que deu uma proteína que contém aminoácidos na posição especificada. Experimentos usando [3H]-Phe e experimentos com α- hidróxi ácidos demonstraram que somente o aminoácido desejado é incorporado na posição especificada pelo códon UAG e que este aminoácido não é incorporado em qualquer outro sítio da proteína. Ver, por exemplo, Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425 - 432; e, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P, G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992).

[000468] Um tRNA pode ser aminoacilado com um aminoácido desejado por qualquer método ou técnica incluindo, mas não limitado a aminoacilação química ou enzimática.

[000469] A aminoacilação pode ser realizada por aminoacil tRNA sintetases ou por outras moléculas enzimáticas incluindo, mas não limitado a ribozimas. O "ribozima" é intercambiável com "RNA catalítico". Cech e colaboradores (Cech, 1987, Science, 236:15321539; McCorkle et al.,1987, Concepts Biochem 64:221-226) demonstroram a presença de RNAs de ocorrência natural que podem agir como catalisadores (ribozimas). No entanto, embora estes catalisadores de RNA naturais tenham apenas mostrado agir em substratos de ácido ribonucleico para a clivagem e splicing, o recente desenvolvimento da evolução artificial de ribozimas expandiu o repertório de catálise de diversas reações químicas. Estudos identificaram moléculas de RNA que podem catalisar ligações de aminoacil-RNA por si sós (2') 3' terminais (Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647) e uma molécula de RNA que pode transferir um aminoácido de uma molécula RNA para outra (Lohse et al. 1996, Nature 381 :442-444).

[000470] A publicação de pedido de Patente 2003/0228593, que é incorporada aqui por referência, descreve métodos para construir ribozimas e seu uso na aminoacilação de tRNAs com aminoácidos codificados de forma não natural e codificados de forma natural. As formas imobilizadas para substrato de moléculas enzimáticas que podem aminoacilar tRNAs incluindo, mas não limitado a ribozimas, podem possibilitar a purificação por afinidade eficiente dos produtos aminoacilados. Exemplos de substratos adequados incluem agarose, sefarose e esferas magnéticas. A produção e o uso de uma forma imobilizada de substrato de ribozima para aminoacilação é descrito em Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 e publicação de pedidos de Patente US 2003/0228593, que são incorporados aqui por referência.

[000471] Os métodos de aminoacilação química incluem, mas não estão limitados àqueles introduzidos por Hecht e colaboradores (Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) e por Schultz, Chamberlin, Dougherty e outros (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature1992,356,537;Gallivan, J. P.; Lester,H. A.; Dougherty, D. A.Chem.Biol.1997,4, 740;Turcatti, et al.J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem.1996,271, 23169; Hohsaka, T.et al. J. Am. Chem. Soc.1999,121,34), que sãoincorporados aqui por referência, para evitar o uso de sintetases em aminoacilação. Tais métodos ou outros métodos de aminoacilação química podem ser usados para aminoacilar moléculas de tRNA.

[000472] Os métodos para a geração de RNA catalítico podem envolver a geração de agrupamentos (pools) separados de sequências randomizadas de ribozima, realizando evolução dirigida nos agrupamentos, realizando a triagem dos agrupamentos para a atividade de aminoacilação desejável, e selecionando sequências das ribozimas que exibem a atividade de aminoacilação desejada.

[000473] As ribozimas podem compreender motivos e/ou regiões que facilitam a atividade de acilação, tal como um motivo GGU e uma região rica em U. Por exemplo, foi relatado que as regiões ricas em U podem facilitar o reconhecimento de um substrato de aminoácidos, e um motivo GGU pode formar pares de bases com terminais 3' de um tRNA. Em combinação, o motivo GGU e a região rica em U facilitam o reconhecimento simultâneo tanto do aminoácido quanto do tRNA simultaneamente facilitando, assim, a aminoacilação do 3' terminal do tRNA.

[000474] As ribozimas podem ser geradas por seleção in vitro, usando um conjugado r24mini parcialmente randomizado com tRNAAsnCCCG seguido por construção sistemática de uma sequência consenso encontrada nos clones ativos. Uma ribozima exemplar obtida por este método é denominada "ribozima Fx3" e é descrita na publicação de pedido de Patente US No. 2003/0228593, os conteúdos da mesma sendo incorporados aqui por referência, age como um catalisador versátil para a síntese de vários aminoacil-tRNAs carregados com aminoácidos cognatos não naturais.

[000475] A imobilização sobre um substrato pode ser usada para possibilitar a purificação de afinidade eficiente dos tRNAs aminoacilados. Exemplos de substratos apropriados incluem, mas não limitado a agarose, sepharose e esferas magnéticas. As ribozimas podem ser imobilizadas em resinas aproveitando a estrutura química do RNA, tal como o 3'-cis-diol na ribose do RNA pode ser oxidada com periodato para produzir o dialdeído correspondente para facilitar a imobilização do RNA na resina. Vários tipos de resinas podem ser usadas incluindo as resinas de hidrazida baratas em que a aminação redutiva torna a interação entre a resina e o ribozima uma ligação irreversível. A síntese de aminoacil-tRNAs pode ser significativamente facilitada por esta técnica de aminoacilação em coluna. Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4 descrevem um sistema de aminoacilação com base em colunas.

[000476] O isolamento de tRNAs aminoacilados pode ser realizado de uma variedade de maneiras. Um método adequado é eluir os tRNAs aminoacilados de uma coluna com um tampão tal como uma solução de acetato de sódio com EDTA 10 mM e um tampão contendo ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-( 3-propanossulfônico) 50 mM, KCl3 12,5 mM, pH 7,0, EDTA 10 mM, ou simplesmente água tamponada em EDTA (pH 7,0).

[000477] Os tRNAs aminoacilados podem ser adicionados às reações de tradução, a fim de incorporar o aminoácido com o tRNA que foi aminoacilado em uma posição de escolha em um polipeptídeo feito pela reação de tradução. Exemplos de sistemas de tradução em que os tRNAs aminoacilados da presente invenção podem ser usados incluem, mas não estão limitados a lisados celulares. Os lisados celulares fornecem componentes de reações necessários para a tradução in vitro de um polipeptídeo a partir de um mRNA de entrada. Exemplos de tais componentes da reação incluem, mas não estão limitados a proteínas ribossomais, rRNA, aminoácidos, tRNAs, GTP, ATP, iniciação da tradução e fatores de alongamento e fatores adicionais associados com a tradução. Além disso, os sistemas de tradução podem ser de traduções em batelada ou tradução compartimentalizada. Os sistemas de tradução em batelada combinam os componentes de reação em um compartimento único, enquanto os sistemas de tradução compartimentalizada separam os componentes de reação de tradução dos produtos de reação que podem inibir a eficiência da tradução. Tais sistemas de tradução estão disponíveis comercialmente.

[000478] Além disso, os sistema de transcrição/tradução acoplados podem ser usados. Os sistemas de transcrição/tradução acoplados permitir a transcrição de um DNA de entrada em um mRNA correspondente, que é, por sua vez, traduzido pelos componentes da reação. Um exemplo de um sistema de transcrição/tradução acoplado disponível comercialmente é o Rapid Translation System (Sistema de Tradução Rápida) (RTS, Roche Inc.). O sistema inclui uma mistura contendo lisado de E. coli para fornecer componentes de tradução, tais como os fatores de tradução e os ribossomos. Além disso, uma RNA polimerase é incluída para a transcrição do DNA de entrada em um modelo de mRNA para uso na tradução. O RTS pode usar compartimentalização dos componentes da reação por meio de uma membrana interposta entre os compartimentos de reação, incluindo um compartimento de suprimento/resíduos e um compartimento de transcrição/tradução.

[000479] A aminoacilação do tRNA pode ser realizada por outros agentes incluindo, mas não limitado a transferases, polimerases, anticorpos catalíticos, proteínas multifuncionais, e semelhantes.

[000480] Stephan, em Scientist 2005 de 10 de outubro, páginas 3033 descreve métodos adicionais para incorporar aminoácidos codificados de forma não natural em proteínas. Lu et al. em célula Mol. Cell, Outubro 2001, 8(4) 759-69 descrevem um método em que uma proteína é quimicamente ligada a um peptídeo sintético contendo aminoácidos não naturais (ligação de proteína expressa).

[000481] As técnicas de microinjeção também têm usado a incorporação de aminoácidos não naturais em proteínas. Ver, por exemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty e H. A. Lester, Science. 268:439 (1995); e D. A. Dougherty, Curr. Opin, Chem. Biol., 4:645 (2000). Um ovócito Xenopus foi co-injetado com duas espécies de RNA feitas in vitro: um mRNA que codifica a proteína alvo com um códon UAG de parada na posição do aminoácido de interesse e um tRNA supressor âmbar aminoacilado com o aminoácido natural desejado. O maquinário de tradução do ovócito, em seguida, insere o aminoácido não natural na posição especificada pela UAG. Este método permitiu estudos da função da estrutura in vivo de proteínas da membrana integral, que geralmente não são responsáveis pela expressão em sistemas in vitro. Os exemplos incluem a incorporação de um aminoácido fluorescente em receptor taquicinina neuroquinina-2 para medir as distâncias por meio de transferência de energia de ressonância de fluorescência, ver, por exemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch , J. Knowles, H. Vogel e A. Chollet, J. Biol. Chem, 271:19.991 (1996), a incorporação de aminoácidos biotinilados para identificar resíduos expostos na superfície em canais iônicos, ver, por exemplo, J. P. Gallivan, H. A. Lester e D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); o uso de análogos da tirosina caged para monitorar as mudanças conformacionais em um canal iônico em tempo real, ver, por exemplo, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty e H. A. Lester, Neuron, 20: 619 (1998), e, o uso de alfa hidróxi aminoácidos para mudar os esqueletos do canal iônico para sondar os seus mecanismos de propagação. Ver, por exemplo, P. M. England, Y. Zhang, Dougherty D. A. e H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999) e, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz e J. Yang, Nat. Neurosci 4:239 (2001).

[000482] A capacidade de incorporar aminoácidos não naturais diretamente em proteínas in vivo oferece uma ampla variedade de vantagens incluindo, mas não limitado a rendimentos elevados de proteínas mutantes, facilidade técnica, potencial para estudar as proteínas mutantes em células ou, eventualmente, nos organismos vivos e o uso destas proteínas mutantes em tratamentos terapêuticos e usos para diagnóstico. A capacidade de incluir aminoácidos não naturais com diferentes tamanhos, acidez, nucleofilicidades, hidrofobicidades e outras propriedades em proteínas pode expandir bastante a nossa capacidade para manipular de forma racional e sistemática as estruturas de proteínas, tanto para investigar a função da proteína quanto para criar novas proteínas ou organismos com novas propriedades.

[000483] Em uma tentativa de incorporar de forma sítio-específica para-F-Phe, um par de fenillanil-tRNA sintetase / tRNAPheCUA de supressor âmbar de levedura foi usado em uma cepa de Escherichia coli auxotrófica Phe, resistente a pF-Phe. Ver, por exemplo, R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998).

[000484] Também pode ser possível obter expressão de um polinucleotídeo de bG-CSF da presente invenção usando um sistema de tradução de célula livre (in vitro). Os sistemas de tradução podem ser celulares ou livres de células, e podem ser procarióticos ou eucarióticos. Os sistemas de tradução celulares incluem, mas não estão limitados a preparações de células inteiras, tais como as células permeabilizadas ou culturas de células em que uma sequência de ácido nucléico desejada pode ser transcrita para o mRNA e o mRNA traduzido. Os sistemas de tradução livres de células (ou sem células) estão disponíveis comercialmente e muitos tipos e sistemas diferentes são bem conhecidos. Exemplos de sistemas livres de células incluem, mas não estão limitados a lisados procarióticos, tais como lisados de Escherichia coli, e lisados eucarióticos, tais como extratos de gérmen de trigo, lisados de células de inseto, lisados de reticulócito de coelho, lisados de ovócitos de coelho e lisados de células humanas. Os extratos eucarióticos ou lisados podem ser preferidos quando a proteína resultante é glicosilada, fosforilada ou, de outro modo, modificada devido a muitas dessas modificações serem apenas possíveis em sistemas eucarióticos. Alguns destes extratos e lisados estão disponíveis comercialmente (Promega, Madison, Wisconsin; Stratagene, La Jolla, Califórnia; Amersham; Arlington Heights, III;. GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.). Os extratos membranosos, tais como os extratos de pâncreas canino contendo membranas microssomais, que são úteis para traduzir proteínas secretoras, estão também disponíveis. Nestes sistemas, o que podem incluir tanto o mRNA como um modelo (tradução in-vitro) quanto o DNA como um modelo (transcrição e tradução combinada in vitro), a síntese in vitro é dirigida pelos ribossomos. Um esforço considerável tem sido aplicado para o desenvolvimento de sistemas de expressão de proteínas livres de células. Ver, por exemplo, Kim, D.M. e J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001); Kim, D. M. e J. R. Swartz, Biotechnology Letters, 22,1537-1542, (2000); Kim, D. M., e J. R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D. M., e J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); e Patnaik, R. e J. R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); Patente USNo. 6.337.191; publicação depedido de Patente No. 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, que são incorporados aquiporreferência.Outra abordagemque podeser aplicada à expressão de polipeptídeos de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural inclui a técnica de fusão de mRNA-peptídeo. Ver, por exemplo, R. Rodrigues e J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (EUA) 94: 12297-12302 (1997), Frankel A., et al. Chemistry & Biology 10:1043-1050(2003). Nesta abordagem, um modelo de mRNA ligado à puromicina é traduzido em peptídeo no ribossomo. Se uma ou mais moléculas de tRNA forem modificadas, os aminoácidos não naturais podem ser incorporados ao peptídeo também. Após o último códon do mRNA ser lido, a puromicina captura o C-terminal do peptídeo. Se for verificado que o conjugado de peptídeo-mRNA resultante tem propriedades interessantes em um ensaio in vitro, sua identidade pode ser facilmente revelada a partir da sequência do mRNA. Desta forma, pode-se fazer a triagem de bibliotecas de polipeptídeos de bG-CSF que compreendem um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural para identificar os polipeptídeos que têm propriedades desejadas. Mais recentemente, as traduções de ribossomos in vitro com componentes purificados relataram a possibilidade da síntese de peptídeos substituídos com aminoácidos codificados de forma não natural. Ver, por exemplo, A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci. (EUA) 100:6353 (2003).

[000485] Os sistemas de tradução reconstituídos podem também ser usados. As misturas de fatores de tradução purificadas também têm sido usadas com sucesso para traduzir o mRNA em proteína, bem como combinações de lisados ou lisados suplementado com fatores de tradução purificados, tal como o fator-1 de iniciação (IF-1), IF-2, IF- 3 (α ou β), fator de alongamento T (EF-Tu), ou fatores de terminação. Os sistemas livres de células também podem ser sistemas de transcrição/tradução acoplados em que o DNA é introduzido no sistema, transcrito no mRNA e o mRNA traduzido como descrito em Current Protocols in Molecular Biology (editores F. M. Ausubel et al., Wiley Interscience, 1993), que é especificamente incorporado aqui por referência. O RNA transcrito no sistema de transcrição eucariótico pode estar na forma de RNA heteronuclear (hnRNA) ou caps da extremidade 5' (7-metil guanosina) e da extremidade 3' do mRNA maduro da cauda poli A, que pode ser uma vantagem em certos sistemas de tradução. Por exemplo, mRNAs com caps são traduzidos com alta eficiência no sistema de lisado de reticulócitos.

IX. Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipeptídeos de bG-CSF

[000486] Várias modificações para os polipeptídeos de aminoácidos não naturais aqui descritos podem ser efetuadas usando as composições, métodos, técnicas e estratégias aqui descritas. Essas modificações incluem a incorporação de funcionalidades adicionais no componente de aminoácido não natural do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, hidroxialquil amido (HAS), hidroxietil amido (HES), um marcador, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietileno glicol, um agente fotoreticulador; um radionuclídeo; um composto citotóxico, uma fármaco, um marcador de afinidade; um marcador de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um metal quelante,um co-fator, um ácido graxo,umcarboidrato,um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo antissenso, um sacarídeo,umdendrímero solúvel em água,umaciclodextrina,um ácido ribonucléico inibidor; um biomaterial; uma nanopartícula, um marcador de spin, um fluoróforo, um grupamento contendo metal, um grupamento radioativo; um novo grupo funcional, um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, um grupamento photocaged; um grupamento excitável de radiação actínica; um grupamento fotoisomerizável; biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, um grupamento que incorpora um átomo pesado, um grupo clivável quimicamente, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado a carbono, um agente redox-ativo; um amino tioácido, um grupamento tóxico; um grupamento marcado isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente; um grupo elétrons densos, um grupo magnético; um grupo de intercalação; um cromóforo; um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo e um marcador detectável, uma molécula pequena, um ponto de quantum, um nanotransmissor; um radionucleotídeo, um radiotransmissor, um agente de captura de nêutrons, ou qualquer combinação dos itens acima, ou qualquer outro composto ou substância desejável. Como um exemplo ilustrativo, exemplos não limitantes de composições, métodos, técnicas e estratégias descritos aqui, a seguinte descrição irá focar a adição de polímeros macromoleculares aos polipeptídeos de aminoácidos não naturais com o entendimento de que as composições, métodos, técnicas e estratégias descritos também são aplicáveis (com as modificações apropriadas, se necessário, e para os quais uma pessoa versada na técnica poderia realizar com as divulgações aqui) para adicionar outras funcionalidades incluindo mas não limitadas às listadas acima.

[000487] Uma ampla variedade de polímeros macromoleculares e outras moléculas pode ser ligada aos polipeptídeos de bG-CSF da presente invenção para modular as propriedades biológicas do polipeptídeo de bG-CSF, e/ou fornecer novas propriedades biológicas para a molécula de bG-CSF. Estes polímeros macromoleculares podem ser ligados ao polipeptídeo de bG-CSF por meio de um aminoácido codificado de forma natural, por meio de um aminoácido codificado de forma não natural, ou qualquer substituinte funcional de um aminoácido não natural ou natural, ou qualquer substituinte ou grupo funcional adicionado a um aminoácido natural ou não natural. O peso molecular do polímero pode ser de uma ampla faixa incluindo, mas não limitado a, entre cerca de 100 Da e 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode ser entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000Da incluindo, mas nãolimitado a, 100.000Da,95.000Da, 90.000Da,85.000Da,80.000 Da,75.000 Da, 70.000Da,65.000Da, 60.000Da,55.000Da,50.000 Da,45.000 Da, 40.000Da,35.000Da, 30.000Da,25.000Da,20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9000Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4000 Da, 3000 Da, 2000 Da, 1000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é de cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é de cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é de cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é de cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é de cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da.

[000488] A presente invenção fornece preparações substancialmente homogêneas de conjugados polímeros:proteína. "Substancialmente homogênea" como usado aqui significa que as moléculas de conjugado polímero:proteínas são observadas como sendo maiores do que a metade da proteína total. O conjugado polímero:proteína tem atividade biológica e as preparações de polipeptídeo de BG-CSF PEGuilado "substancialmente homogêneas" presentes fornecidas aqui que são homogêneas o suficiente para mostrar as vantagens de uma preparação homogênea, por exemplo, a facilidade na aplicação clínica na previsibilidade da farmacocinética lote a lote.

[000489] Pode-se também optar por preparar uma mistura de moléculas de conjugado proteína:polímero, e a vantagem fornecida aqui é que se pode selecionar a proporção do conjugado mono- polímero:proteína para incluir na mistura. Assim, se desejado, pode-se preparar uma mistura de proteínas diversas, com vários números de grupamentos de polímeros fixos (ou seja, di-, tri-, tetra, etc.) e combinar os referidos conjugados com o conjugado de mono- polímero:proteína preparado usando os métodos da presente invenção, e ter uma mistura com uma proporção predeterminada de conjugados de mono-polímero:proteína.

[000490] O polímero selecionado pode ser solúvel em água de modo que a proteína à qual o mesmo é ligado não se precipita em um meio aquoso, tal como um meio fisiológico. O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para o uso terapêutico da preparação do produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável.

[000491] Exemplos de polímeros incluem, mas não estão limitados a, polialquil éteres e análogos de alcóxi com caps dos mesmos (por exemplo, polióxietileno glicol, polióxietileno/propileno glicol, e análogos de metóxi ou etóxi com caps dos mesmos, especialmente, polioxietileno glicol, este último também é conhecido polietilenoglicol ou PEG); polivinilpirrolidonaes, polivinilalquil éteres; polioxazolinas, polialquil oxazolinas e polihidróxialquil oxazolinas; poliacrilamidas, polialquil acrilamidas, e polihidróxialquil acrilamidas (por exemplo, polihidroxipropilmetacrilamido e derivados dos mesmos); polihidroxialquil acrilatos; ácidos polissiálicos e análogos dos mesmos; sequências de peptídeo hidrofílicos; polissacarídeos e seus derivados, incluindo dextrana e derivados de dextrana, por exemplo, carboximetildextrana, sulfatos de dextrana, aminodextrana; celulose e seus derivados, por exemplo, carboximetil celulose, hidroxialquil celulose; quitina e seus derivados, por exemplo, quitosana, succinil quitosana, carboximetilquitina,carboximetil quitosana; ácido hialurônico e seus derivados, amidos, alginatos, sulfato de condroitina, albumina; pululana e carbóximetil pululana; poliaminoácidos e derivados dos mesmos, por exemplo, ácidos poliglutâmicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamida; copolímeros de anidrido maleico, tais como; copolímeros de anidrido maleico - estireno; copolímero de anidrido maleico - divinil etil éter, álcoois polivinílicos; copolímeros dos mesmos; terpolímeros dos mesmos, misturas dos mesmos; hidroxialquil amido (HAS) incluindo, mas não limitado a, hidroxietil amido (HES), e derivados dos mencionados anteriormente.

[000492] A proporção de moléculas de polietileno glicol para moléculas de proteína pode variar, assim como as suas concentrações na mistura reacional. Em geral, a razão ideal (em termos de eficiência de reação em que há excesso mínimo de proteína ou polímero não reagido) pode ser determinada pelo peso molecular do polietileno glicol selecionado e pelo número de grupos reativos disponíveis. Na medida em se relaciona o peso molecular, normalmente quanto maior o peso molecular do polímero, menor é número de moléculas de polímero que podem ser associadas à proteína. Da mesma forma, a ramificação do polímero deve ser levada em conta na otimização destes parâmetros. Geralmente, quanto maior o peso molecular (ou mais ramificações), maior o polímero é a razão polímero:proteína.

[000493] Como usado aqui, e quando se contempla os conjugados de PEG:polipeptídeo de bG-CSF, o termo "quantidade terapêuticamente eficaz" se refere a uma quantidade que dá o benefício desejado para um animal. A quantidade vai variar de um indivíduo para outro e dependerá de uma série de fatores, incluindo a condição física geral do paciente e as causas subjacentes da doença a ser tratada. A quantidade de polipeptídeo de bG-CSF usada para a terapia gera uma taxa aceitável de mudança e mantém a resposta desejada a um nível benéfico. A quantidade terapeuticamente eficaz das composições presentes pode ser facilmente verificada por uma pessoa versada na técnica usando os materiais e procedimentos disponíveis no estado da técnica.

[000494] O polímero solúvel em água, pode ser de qualquer forma estrutural incluindo, mas não limitado a linear, bifurcada ou ramificada. Tipicamente, o polímero solúvel em água é um poli (alquileno glicol), tal como poli (etileno glicol) (PEG), mas outros polímeros solúveis em água também podem ser empregados. A título de exemplo, o PEG é usado para descrever certas modalidades da presente invenção.

[000495] O PEG é um polímero solúvel em água, bem conhecido, que está comercialmente disponível ou pode ser preparado pela polimerização da abertura do anel de etileno glicol de acordo com métodos conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte (Sandler e Kara, Polymer Synthesis, Academic Press, Nova Iorque, vol. 3, páginas 138 - 161). O termo "PEG" é amplamentemente usado para englobar qualquer molécula de polietileno glicol, sem considerar o tamanho ou a modificação em uma extremidade do PEG, e pode ser representada como ligada ao polipeptídeo de bG-CSF pela fórmula: XO- (CH2CH2O)n-CH2CH2-Y em que n é de 2 a 10.000 e X é H ou uma modificação do terminal incluindo, mas não limitado a, um alquil C1-4, um grupo de proteção ou um grupo funcional terminal.

[000496] Em alguns casos, um PEG usado na invenção termina em uma extremidade com hidróxi ou metóxi, ou seja, X é H ou CH3 (“metóxi PEG”). Alternativamente, o PEG pode terminar com um grupo reativo, desse modo, formando um polímero bifuncional. Os grupos reativos típicos podem incluir os grupos reativos que são comumente usados para reagir com os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não limitados a, grupos maleimida, carbonatos ativados (incluindo, mas não limitados a, p- nitrofenil éster), ésteres ativados (incluindo, mas não limitados a, N- hidroxisuccinimida, p-nitrofenil ésteres) e aldeídos), bem como grupos funcionais que são inertes aos 20 aminoácidos comuns, mas que reagem especificamente com grupos funcionais complementares presentes nos aminoácidos codificados de forma não natural (incluindo, mas não limitados a, grupos azida, grupos alquino). Note-se que a outra extremidade do PEG, que é mostrada na fórmula acima por Y, irá se fixar direta ou indiretamente, a um polipeptídeo de bG- CSF por meio de um aminoácido de ocorrência natural ou codificado de forma não natural. Por exemplo, Y pode ser uma ligação de amida, carbamato ou uréia a um grupo amina (incluindo, mas não limitado a amina epsilon da lisina ou do N-terminal) do polipeptídeo. Alternativamente, Y pode ser uma ligação de maleimida a um grupo tiol (incluindo, mas não limitado a grupo tiol da cisteína). Alternativamente, Y pode ser uma ligação a um resíduo não comumente acessível por meio dos 20 aminoácidos comuns. Por exemplo, um grupo azida no PEG pode ser reagido com um grupo alquino no polipeptídeo de bG-CSF para formar um produto de cicloadição [3 +2] de Huisgen. Como alternativa, um grupo alquino no PEG pode ser reagido com um grupo azida presente em um aminoácido codificado de forma não natural para formar um produto semelhante. Em algumas modalidades, um nucleófilo forte (incluindo, mas não limitado a, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) pode ser reagido com um grupo aldeído ou cetona presente em um aminoácido codificado de forma não natural para formar uma hidrazona, oxima ou semicarbazona, conforme aplicável, que em alguns casos pode ser adicionalmente reduzido pelo tratamento com um agente de redução adequado. Alternativamente, o nucleófilo forte pode ser incorporado no polipeptídeo de bG-CSF por meio de um aminoácido codificado de forma não natural e usado para reagir preferencialmente com um grupo cetona ou aldeído presente no polímero solúvel em água.

[000497] Qualquer massa molecular para PEG pode ser usada como praticamente desejado incluindo, mas não limitado a, de cerca de 100 Daltons (Da) a 100.000 Da ou mais, como desejado (incluindo, mas não limitado a, às vezes de 0,1 - 50 kDa ou 10 - 40 kDa). O peso molecular do PEG pode ser de uma ampla faixa incluindo, mas não limitado a, entre cerca de 100 Da e 100.000 Da ou mais. O PEG pode ser entre cerca de100Da e cercade 100.000Da incluindo, masnão limitado a, 100.000 Da,95.000Da,90.000Da,85.000Da,80.000Da, 75.000 Da, 70.000Da,65.000Da,60.000,Da,55.000Da,50.000Da, 45.000 Da, 40.000Da,35.000Da,30.000Da,25.000Da,20.000Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o PEG está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da. Os PEGs de cadeia ramificada incluindo, mas não limitado a, moléculas de PEG com cada cadeia tendo um Peso Molecular variando de 1 - 100 kDa (incluindo, mas não limitado a, 1 - 50 kDa e 5 - 20 kDa) também podem ser usados. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode ser, incluindo mas não limitado a, entre cerca de 1.000 Da e 100.000 Da ou mais. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode ser entre cerca de 1.000 Da e 100.000 Da incluindo, mas não limitado a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000Da,85.000 Da, 80.000Da,75.000Da, 70.000Da,65.000 Da, 60.000Da,55.000 Da, 50.000Da,45.000Da, 40.000Da,35.000 Da, 30.000Da,25.000 Da, 20.000Da,15.000Da, 10.000Da,9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da,5000 Da, 4000 Da, 3000 Da, 2.000 Da e 1.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia da cadeia ramificada do PEG é entre cerca de 1.000 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia da cadeia ramificada do PEG é entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia da cadeia ramificada do PEG é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia da cadeia ramificada do PEG é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 20.000 Da. Uma ampla faixa de moléculas de PEG é descrita incluindo, mas não limitado a, o Polímeros Shearwater, Inc., catálogo, Nektar Therapeutics Catalog, aqui incorporado por referência.

[000498] Geralmente, o pelo menos um terminal da molécula de PEG está disponível para reação com o aminoácido codificado de forma não natural. Por exemplo, os derivados de PEG apresentando grupamentos de alquino e azida para reação com cadeias laterais de aminoácidos podem ser usados para fixar o PEG aos aminoácidos codificados de forma não natural como descrito aqui. Se o aminoácido codificado de forma não natural compreende uma azida, então o PEG irá normalmente conter um grupamento de alquino para efetuar a formação do produto de cicloadição [3 +2], ou uma espécie de PEG ativada (ou seja, éster, carbonato), contendo um grupo fosfina para efetuar a formação da ligação de amida. Alternativamente, se o aminoácido codificado de forma não natural compreende um alquino, então o PEG irá normalmente conter um grupamento azida para efetuar a formação de produto de cicloadição [3 +2] de Huisgen. Se o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonil, o PEG irá normalmente incluir um nucleófilo potente (incluindo, mas não limitado a uma funcionalidade hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ou semicarbazida), para efetuar a formação das ligações de hidrazona, oxima, e semicarbazona correspondentes, respectivamente. Em outra alternativa, uma inversão da orientação dos grupos reativos descritos acima pode ser usada, ou seja, um grupamento de azida em um aminoácido codificado de forma não natural pode ser reagido com um derivado de PEG contendo um alquino.

[000499] Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo de bG-CSF com um derivado de PEG contém uma funcionalidade química que é reativa com a funcionalidade química presente na cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural.

[000500] A invenção fornece, em algumas modalidades, derivados de polímero contendo azida- e acetileno- que contêm compreendendo um esqueleto de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da. O esqueleto polimérico do polímero solúvel em água pode ser poli (etileno glicol). No entanto, deve ser entendido que uma grande variedade de polímeros solúveis em água incluindo, mas não limitada a, poli (etileno) glicol e outros polímeros relacionados incluindo poli (dextrano) e poli (propileno glicol), também são adequados para o uso na prática desta invenção e que o uso do termo PEG ou poli (etileno glicol) destina-se a englobar e incluir todas essas moléculas. O termo PEG inclui, mas não está limitado a, poli (etileno) glicol em qualquer de suas formas incluindo o PEG bifuncional, PEG com multibraços, PEG derivatizado, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendente (ou seja, PEG ou polímeros relacionados com um ou mais grupos funcionais pendentes para o esqueleto do polímero), ou PEG com ligações degradáveis no mesmo.

[000501] O PEG é normalmente claro, incolor, inodoro, solúvel em água, estável ao calor, inerte a muitos agentes químicos, não se hidrolisam ou se deteriora, e geralmente não é tóxico. O poli (etileno glicol) é considerado biocompatível, o que significa dizer que o PEG é capaz de coexistir com tecidos ou organismos vivos sem causar danos. Mais especificamente, o PEG é substancialmente não imunogênico, o que significa dizer que o PEG não tende a produzir uma resposta imune no corpo. Quando fixo a uma molécula tendo alguma função desejável no corpo, tal como um agente biologicamente ativo, o PEG tende a mascarar o agente e pode reduzir ou eliminar qualquer resposta imune de forma que um organismo pode tolerar a presença do agente. Os conjugados de PEG tendem a não produzir uma resposta imune substancial ou causar coagulação ou outros efeitos indesejáveis. O PEG tendo a fórmula -- CH2CH2O-- (CH2CH2O)n -- CH2CH2-, em que n é de cerca de 3 a cerca de 4.000, tipicamente de cerca de 20 a cerca de 2.000, é adequado para uso na presente invenção. Os PEGs tendo um peso molecular de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da estão em algumas modalidades da presente invenção, particularmente úteis como o esqueleto do polímero. O peso molecular do PEG pode ser de uma ampla variedade incluindo, mas não limitado a, entre cerca de 100 Da e 100.000 Da ou mais. O peso molecular do PEG pode ser entre cerca de100 Da e cerca de 100.000 Da incluindo, mas não limitado a, 100.000 Da, 95.000Da,90.000Da,85.000Da,80.000Da,75.000Da,70.000Da, 65.000Da,60.000Da,55.000Da,50.000Da,45.000Da,40.000Da, 35.000Da,30.000Da,25.000Da,20.000Da,15.000Da,10.000Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da,5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG está entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da.

[000502] O esqueleto do polímero pode ser linear ou ramificado. Os esqueletos de polímero ramificado são geralmente conhecidos na arte. Tipicamente, um polímero ramificado tem um grupamento de núcleo ramificado central e uma pluralidade de cadeias poliméricas lineares ligada ao núcleo da ramificação central. O PEG é comumente usado em formas ramificada que podem ser preparadas por adição de óxido de etileno para vários polióis, tais como glicerol, oligômeros de glicerol, pentaeritrol e sorbitol. O grupamento ramificado central também pode ser derivado de vários aminoácidos, como lisina. O poli (etileno) glicol ramificado pode ser representado de forma geral como R(-PEG-OH)m em que R é derivado de um grupamento de núcleo, tal como glicerol, oligômeros de glicerol, ou pentaeritritol, e m representa o número de braços. As moléculas de PEG com multibraços, tais como as descritas nas Patentes US Nos. 5.932.462; 5.643.575, 5.229.490, 4.289.872, pedido de Patente US 2003/0143596; WO 96/21469 e WO 93/21259, cada um dos quais sendo incorporado aqui por referência na sua totalidade, podem também ser usados como o esqueleto do polímero.

[000503] O PEG ramificado também pode estar na forma de um PEG bifurcado representado por PEG (--YCHZ2)n, em que Y é um grupo de ligação e Z é um grupo terminal ativado ligado ao CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido.

[000504] Ainda em uma outra forma ramificada, o PEG pendente, tem grupos reativos, tal como carboxil, ao longo da cadeia de PEG, em vez de no final das cadeias de PEG.

[000505] Além destas formas de PEG, o polímero pode também ser preparado com ligações fracas ou degradáveis no esqueleto. Por exemplo, o PEG pode ser preparado com ligações de éster no esqueleto do polímero que estão sujeitas a hidrólise. Como mostrado abaixo, esta hidrólise resulta na clivagem do polímero em fragmentos do peso molecular inferior: -PEG-CO2-PEG-+ H2O ^ PEG-CO2H + HO-PEG-

[000506] Entende-se por aqueles de competência comum na arte que o termo poli (etileno glicol) ou PEG representa ou inclui todas as formas conhecidas na arte, incluindo mas não limitadas as divulgadas neste documento.

[000507] Muitos outros polímeros também são adequados para uso na presente invenção. Em algumas modalidades, os esqueletos do polímero que são solúveis em água, com 2 a cerca de 300 terminais, são particularmente úteis na invenção. Exemplos de polímeros adequados incluem, mas não estão limitados a, poli (alquileno glicóis), tais como poli (propileno glicol) (“PPG”), copolímeros dos mesmos (incluindo, mas não limitado a copolímeros de etileno glicol e propileno glicol), terpolímeros dos mesmos, misturas dos mesmos, e semelhantes. Embora o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero pode variar, o qual é geralmente na faixa de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, frequentemente de cerca de 6.000 Da a cerca de 80.000 Da. O peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero pode ser entre 100 Da e cerca de 100.000 Da incluindo, mas não limitado a, 100.000 Da e 95,000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9000 Da, 8000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4000 Da, 3000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto dopolímeroéentrecerca de100 Daecercade50.000Da.Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto dopolímeroéentrecerca de100 Daecercade40.000Da.Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto dopolímeroéentrecercade1.000 Daecercade40.000Da.Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do esqueleto do polímero é entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da.

[000508] Aqueles com habilidade comum na arte reconhecem que a lista anterior substancialmente para esqueletos solúveis em água não é de forma exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todos os materiais poliméricos que tem as qualidades descritas acima são contemplados como sendo adequados para uso na presente invenção.

[000509]Emalgumasmodalidadesda presenteinvençãoos derivados de polímeros são "multifuncionais", o que significa que o esqueletodo polímero tem pelomenos doisterminaise, possivelmente, até cerca de 300 terminais, funcionalizados ou ativados com um grupo funcional. Os derivados de polímeros multifuncionais incluem, mas não estão limitados a polímeros lineares tendo dois terminais, cada terminal sendo ligado a um grupo funcional que pode ser o mesmo ou diferente.

[000510] Em uma modalidade, o derivado de polímero tem a seguinte estrutura: XA---POLI---B---N = N = N em que: N = N = N é um grupamento de azida; B é um grupamento de ligação, que pode estar presente ou ausente; POLI é um polímero não antigênico solúvel em água; A é um grupamento de ligação, que pode estar presente ou ausente e que pode ser o mesmo B ou diferente, e X é um segundo grupo funcional.

[000511] Exemplos de um grupamento de ligação para A e B incluem, mas não estão limitados a um grupo alquil multiplamente- funcionalizado contendo até 18, e podendo conter entre 1 - 10 átomos de carbono. Um heteroátomo, como nitrogênio, oxigênio ou enxofre pode ser incluído na cadeia de alquil. A cadeia de alquil também pode ser ramificada em um heteroátomo. Outros exemplos de um grupamento de ligação para A e B incluem, mas não estão limitados a um grupo aril multiplamente funcionalizado, contendo até 10, e podendo conter 5 - 6 átomos de carbono. O grupo aril pode ser substituído por um ou mais átomos de carbono, nitrogênio, oxigênio ou átomos de enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem os grupos de ligação descritos nas Patente US Nos. 5.932.462;5.643.575 e publicação de pedido de Patente US 2003/0143596, cada uma das quais sendo incorporada aqui por referência. Aqueles com habilidades comuns na arte reconhecem que a lista anterior para grupamentos de ligação não é de forma exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todos os grupamentos de ligação tendo as qualidades descritas acima são contemplados como sendo adequados para uso na presente invenção.

[000512] Exemplos de grupos funcionais adequados para uso como X incluem, mas não estão limitados a, hidroxil, hidroxil protegido, alcoxil, éster ativo, tais como ésteres N-hidróxisuccinimidil ésteres e 1- benzotriazolil ésteres, carbonato ativo, tal como N-hidróxisuccinimidil carbonatos e 1- benzotriazolil carbonatos, acetal, aldeídos, hidratos de aldeídos, alquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, amino-oxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilssulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alqueno, cetona, e azida. Como é entendido por aqueles que possuem habilidades comuns na arte, o grupamento X selecionado deve ser compatível com o grupo azida de modo que a reação com o grupo azida não ocorre. Os derivados de polímeros contendo azida podem ser homobifuncionais, o que significa que o segundo grupo funcional (ou seja, X) é também um grupamento azida ou heterobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.

[000513] O termo "protegido" se refere a presença de um grupo ou grupamento de proteção que impede a reação do grupo funcional quimicamente reativo sob certas condições de reação. O grupo de proteção irá variar dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo a ser protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado do grupo terc-butiloxicarbonil (t-Boc) e 9-fluoroenilmetóxicarbonil (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo é um tiol, o grupo de proteção pode ser ortopiridildissulfeto. Se o grupo reativo é um ácido carboxílico, tal como ácido butanóico ou propiônico, ou um grupo hidroxil, o grupo de proteção pode ser um grupo benzil ou alquil, tais como metil, etil, ou terc-butil. Outros grupos de proteção conhecidos na arte também podem ser usados na presente invenção.

[000514] Exemplos específicos de grupos funcionais terminais na literatura incluem, mas não estão limitados a carbonato de N- succinimidil(ver,porexemplo, Patentes USNos.5.281.698, 5.468.478),amino(ver,por exemplo, Buckmannet al.Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym, 19:1177 J. (1983)), hidrazida (Ver, por exemplo, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidil propionato e succinimidil butanoato (ver, por exemplo, Olson et al. em Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp. 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; Ver também a Patente US No. 5.672,662), succinimidil succinato (Ver, por exemplo, Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) e Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979), succinimidil éster (ver, por exemplo, Patente US No. 4.670.417), benzotriazol carbonato (ver, por exemplo, Patente US No. 5.650.234), glicidil éter (ver, por exemplo, Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11(1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (ver, por exemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131 :25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), p-nitrophenil carbonato (ver, por exemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141(1985); e Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldeídeo (ver, por exemplo, Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), Patente US No. 5.824.784, Patente US No. 5.252.714), maleimida (ver, por exemplo, Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al. em Chemistry of Peptides and Proteins 2:29(1984)), e Kogan, Synthetic C0 mM. 22:2417 (1992)), ortopiridil-dissulfeto (ver, por exemplo, Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acrilol (ver, por exemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilssulfona (ver, por exemplo, Patente US No. 5.900.461). Todas as referências acima e patentes são incorporadas aqui por referência.

[000515] Em certas modalidades da presente invenção, os derivados de polímeros da invenção compreendem um esqueleto de polímero tendo a estrutura: X--CH2CH2O-- (CH2CH2O)n--CH2CH2-N = N = N em que: X é um grupo funcional tal como descrito acima; e n é cerca de 20 a cerca de 4000.

[000516] Em outra modalidade, os derivados de polímeros da invenção compreendem um esqueleto do polímero tendo a estrutura: X--CH2CH2O-- (CH2CH2O)n--CH2CH2 -- O-(CH2)m-W-N = N = N em que: W é um grupamento ligante alifático ou aromático compreendendo entre 1 - 10 átomos de carbono; n é cerca de 20 a cerca de 4.000; e X é um grupo funcional tal como descrito acima, m está entre 1 e 10.

[000517] Os derivados de PEG contendo azida da invenção podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na arte e/ou divulgados neste documento. Em um método, mostrado abaixo, um esqueleto de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, o esqueleto do polímero tendo um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo de saída adequado, é reagido com um ânion azida (que pode ser emparelhado com qualquer um de uma série de contra-íons adequados, incluindo sódio, potássio, terc-butilamônio e semelhantes). O grupo de saída sofre um deslocamento nucleofílico e é substituído pelo grupamento azida, produzindo o polímero PEG contendo azida desejado. X-PEG-L + N3- ^ X-PEG-N3

[000518] Como mostrado, o esqueleto de polímero adequado para uso na presente invenção tem a fórmula X-PEG-L, em que PEG é poli (etileno glicol) e X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de saída adequado. Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não estão limitados a hidroxil, hidroxil protegido, acetal, alquenil, amina, amino-oxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimida, ditiopiridina e vinilpiridina e cetona. Exemplos de grupos de saída adequado incluem, mas não estão limitados a cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato.

[000519] Em outro método para a preparação de derivados de polímeros contendo azida da presente invenção, um agente de ligação que apresenta uma funcionalidade de azida é contatado com um esqueleto de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de Da 100.000, em que o agente de ligação apresenta uma funcionalidade de química que irá reagir seletivamente com uma funcionalidade química no polímero PEG, para formar um produto derivado de polímero contendo azida em que a azida é separada do esqueleto do polímero por um grupo ligação.

[000520] Um esquema de reação exemplar é mostrado a seguir: X-PEG-M + N-ligante-N = N = N ^ PG-X-PEG-ligante-N = N = N em que: PEG é poli (etileno glicol) e X é um grupo de cobertura (capping), tal como alcóxi ou um grupo funcional, tal como descrito acima; e M é um grupo funcional que não é reativo com a funcionalidade de azida, mas que vai reagir de forma eficiente e seletiva com o grupo N funcional.

[000521] Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não estão limitados a M sendo um ácido carboxílico, carbonato ou éster ativo, se N é uma amina; M sendo uma cetona se N é um hidrazida ou grupamento de amino-oxi; M sendo um grupo de saída se N é um nucleófilo.

[000522] A purificação do produto bruto pode ser obtida por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados a precipitação do produto após a cromatografia, se necessário.

[000523] Um exemplo mais específico é mostrado a seguir no caso de PEG diamina, na qual uma das aminas é protegida por um grupamento de grupo proteção, tal como terc-butil-Boc e a PEG diamina mono-protegida resultante é reagida com um grupamento de ligação que apresenta a funcionalidade de azida: BocHN-PEG-NH2 + HO2C (CH2)3-N = N = N

[000524] Neste caso, o grupo amina podem ser acoplado ao grupo ácido carboxílico usando uma variedade de agentes de ativação, tais como reagentes de cloreto de tionila ou carbodiimida e N- hidroxipucanimida ou N-hidroxibenzotriazol para criar uma ligação de amida entre o derivado de PEG monoamina e o grupamento ligante apresendo azida. Após a formação bem-sucedida da ligação de amida, o derivado contendo azida protegida por N-terc-butil-Boc resultante pode ser usado diretamente para modificar moléculas bioativas ou pode ser adicionalmente elaborado para instalar outros grupos funcionais úteis. Por exemplo, o grupo N-t-Boc pode ser hidrolisado pelo tratamento com ácido forte para gerar um ômega-amino-PEG azida. A amina resultante pode ser usada como uma alça sintética para instalar outras funcionalidades úteis, tais como grupos maleimida, dissulfetos ativado, ésteres ativados e semelhantes para a criação de reagentes heterobifuncionais de valor.

[000525] Os derivados heterobifuncionais são particularmente úteis quando se deseja fixar moléculas diferentes para cada terminal do polímero. Por exemplo, o PEG omega-N-amino-N-azida permitiria a fixação de uma molécula contendo um grupo eletrofílico ativado, tais como um aldeído, cetona, éster ativado, carbonato e semelhantes, para um terminal do PEG e uma molécula tendo um grupo acetileno para outro terminal do PEG.

[000526] Em outra modalidade da invenção, o derivado de polímero tem a seguinte estrutura: X—A—POLI—B—C = C-R em que: R pode ser H ou um grupo alquil, alqueno, alcóxi, ou aril ou aril substituído; B é um grupamento de ligação, que pode estar presente ou ausente; POLI é um polímero não antigênico solúvel em água; A é um grupamento de ligação, que pode estar presente ou ausente e que pode ser o mesmo que B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional.

[000527] Exemplos de um grupamento de ligação para A e B incluem, mas não estão limitados a, um grupo alquil multiplamente- funcionalizado contendo até 18, e podendo conter entre 1-10 átomos de carbono. Um heteroátomo, tal como nitrogênio, oxigênio ou enxofre pode ser incluído na cadeia de alquil. A cadeia de alquil também pode ser ramificada em um heteroátomo. Outros exemplos de um grupamento de ligação para A e B incluem, mas não estão limitados a um grupo aril multiplamente funcionalizado, contendo até 10, e podendo conter 5 - 6 átomos de carbono. O grupo aril pode ser substituído por um ou mais átomos de carbono, nitrogênio, oxigênio ou átomos de enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem os grupos de ligação descritos nas Patente US Nos. 5.932.462; 5.643.575 e publicação de pedido de Patente US 2003/0143596, cada uma das quais sendo incorporada aqui por referência. Aqueles com habilidades comuns na arte reconhecem que a lista anterior para grupamentos de ligação não é de forma exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todos os grupamentos de ligação tendo as qualidades descritas acima são contemplados como sendo adequados para uso na presente invenção.

[000528] Exemplos de grupos funcionais adequados para uso como X incluem, hidroxil, hidroxil protegido, alcoxil, éster ativo, tais como ésteres N-hidroxisuccinimidil ésteres e 1-benzotriazolil ésteres, carbonato ativo, tal como N-hidroxisuccinimidil carbonatos e 1- benzotriazolil carbonatos, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, amino-oxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilssulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, e tresilato, alqueno, cetona, e acetileno. Como é entendido por aqueles que possuem habilidades comuns na arte, o grupamento X selecionado deve ser compatível com o grupo acetileno de modo que a reação com o grupo acetileno não ocorra. Os derivados de polímeros contendo acetileno podem ser homobifuncionais, o que significa que o segundo grupo funcional (ou seja, X) é também um grupamento acetileno ou heterobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.

[000529] Em outra modalidade da presente invenção, os derivados de polímeros compreendem um esqueleto de polímero tendo a estrutura: X--CH2CH2O-- (CH2CH2O)n --CH2CH2 - O -- (CH2)m C = CH em que: X é um grupo funcional tal como descrito acima; n é cerca de 20 a cerca de 4.000, e m é entre 1 e 10.

[000530] Alguns exemplos específicos de cada um dos polímeros heterobifuncionais PEG são mostrados abaixo.

[000531] Os derivados de PEG contendo acetileno da invenção podem ser preparados usando métodos conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte e/ou são divulgados aqui. Em um método, um esqueleto de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, o esqueleto do polímero tendo um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo nucleofílico adequado, é reagido com um composto que apresentam uma funcionalidade de acetileno e um grupo de saída que é adequado para reação com o grupo nucleofílico no PEG. Quando o polímero PEG apresentando o grupamento nucleofílico e a molécula apresentando o grupo de saída são combinados, o grupo de saída sofre um deslocamento nucleofílico e ésubstituído pelo grupamento nucleofílico, produzindo o polímero contendo acetileno desejado. X-PEG-Nu + L-A-C ^ X-PEG-Nu-A-C = CR'

[000532] Como mostrado, o esqueleto do polímero preferido para uso na reação tem a fórmula X-PEG-Nu, em que o PEG é poli (etileno glicol), Nu é um grupamento nucleofílico e X é um grupo funcional que não reage com o Nu, L ou com a funcionalidade de acetileno.

[000533] Exemplos de Nu incluem, mas não estão limitados a, grupos amino, alcóxi, ariloxi, sulfidril, imino, carboxilato, hidrazida, aminoxi que reagem principalmente por meio de um mecanismo tipo SN2. Outros exemplos de grupos Nu incluem os grupos funcionais que reagem principalmente por meio de uma reação de adição nucleofílica. Exemplos de grupos L incluem grupos cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato e outros grupos que deverão sofrer deslocamento nucleofílico, bem como cetonas, aldeídos, tioésteres, olefinas, grupos carbonil alfa-beta insaturados, carbonatos e outros grupos eletrofílicos que deverão sofrer adição nucleofílica.

[000534] Em uma outra modalidade da presente invenção, A é um ligante alifático de entre 1 - 10 átomos de carbono ou um anel aril substituído de entre 6 - 14 átomos de carbono. X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de saída apropriado.

[000535] Em um outro método para a preparação de derivados de polímeros contendo acetileno da invenção, um polímero PEG tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, apresentando ou um grupo funcional protegido ou um agente de cobertura (capping) em um terminal e um grupo de saída adequado no outro terminal é contatado por um ânion de acetileno.

[000536] Um esquema de reação exemplar é mostrado a seguir: X-PEG-L + C = CR' ^ X-PEG-C = CR’ em que: PEG é poli (etileno glicol) e X é um grupo de cobertura, tal como alcóxi ou um grupo funcional tal como descrito acima; e R' é ou H, um grupo alquil, alcóxi, aril ou arilóxi ou um grupo alquil substituído, alcoxil, aril ou arilóxi.

[000537] No exemplo acima, o grupo de saída L deve ser suficientemente reativo para sofrer deslocamento tipo SN2, quando contatado com uma concentração suficiente de ânion acetileno. As condições de reação necessárias para realizar o deslocamento SN2 do grupo de saída pelos ânions acetileno são conhecidas por aqueles de competência comum na arte.

[000538]A purificaçãodo produtobruto normalmentepodeser realizadapor métodosconhecidosna arte, incluindo,masnão limitados a precipitação do produto, seguida de cromatografia, se necessário.

[000539] Os polímeros solúveis em água podem ser ligados aos polipeptídeos de bG-CSF da invenção. Os polímeros solúveis em água podem ser ligados por meio de um aminoácido codificado de forma não natural incorporado no polipeptídeo de bG-CSF ou qualquer grupo funcional, ou substituinte de um aminoácido codificado de forma não natural ou codificado de forma natural, ou qualquer grupo funcional, ou adicionado a um substituinte adicionado a um aminoácido codificado de forma não natural ou codificado de forma natural. Alternativamente, os polímeros solúveis em água são ligados a um polipeptídeo de bG- CSF incorporando um aminoácido codificado de forma não natural por meio de um aminoácido que ocorre naturalmente (incluindo, mas não limitado a, cisteína, lisina, ou o grupo amina do resíduo N-terminal). Em alguns casos, os polipeptídeos de bG-CSF da invenção compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 aminoácidos não naturais, em que um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural estão ligados a polímero(s) solúvel em água (incluindo, mas não limitado a, PEG e/ou oligossacarídeos). Em alguns casos, os polipeptídeos de bG-CSF da invenção compreendem mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos codificados de forma natural ligados à polímeros solúveis em água. Em alguns casos, os polipeptídeos de bG-CSF da invenção compreendem um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural ligados à polímeros solúveis em água e um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente ligados à polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, os polímeros solúveis em água usados na presente invenção intensificam a meia-vida sérica do polipeptídeo de bG-CSF em relação à forma não conjugada.

[000540] O número de polímeros solúveis em água ligados a um polipeptídeo de bG-CSF (ou seja, a extensão da PEGuilação ou glicosilação) da presente invenção pode ser ajustado para fornecer uma característica (incluindo, mas não limitado a aumentada ou diminuída) farmacológica, farmacodinâmica ou farmacocinética alterada, tal como a meia-vida "in vivo". Em algumas modalidades, a meia-vida do bG-CSF é aumentada pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por cento, 2 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes ao longo de um polipeptídeo não modificado.

Derivados de PEG Contendo um Grupo Nucleofílico Forte (ou seja, Hidrazida, Hidroxilamina, Hidrazina, ou Semicarbazida)

[000541] Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural contendo carbonil é modificado com um derivado de PEG que contém um grupamento terminal de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida que é diretamente ligado ao esqueleto de PEG.

[000542] Em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal hidroxilamina terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH2 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 - 10 e n é 100 - 1.000 (ou seja, peso molecular médio é entre 5 - 40 kDa).

[000543] Em algumas modalidades, o derivado de PEG contendo hidrazina ou hidrazida terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 - 10 e n é 100 - 1.000 e X é opcionalmente, um grupo carbonil (C = O) que pode estar presente ou ausente.

[000544] Em algumas modalidades, o derivado de PEG contendo semicarbazida terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m -NH-C(O)-NH-NH2 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 - 10 e n é 100 - 1.000.

[000545] Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido contendo carbonil é modificado com um derivado de PEG que contém um grupamento terminal de hidroxilamina, hidrazida, hidrazina, ou semicarbazida que é ligado ao esqueleto de PEG por meio de uma ligação de amida.

[000546] Em algumas modalidades, os derivados de PEG de terminal hidroxilamina têm a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2 -NH-C(O)(CH2)m-O-NH2 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 - 10 e n é 100 - 1.000 ( ou seja, peso molecular médio é entre 5 - 40 kDa).

[000547] Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo hidrazina- ou hidrazida- têm a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2 -NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2 em que R é uma alquil simples (metil, etil, propil, etc), m é 2-10, n é 100-1,000 e X é opcionalmente, um grupo carbonil (C = O) que pode estar presente ou ausente.

[000548] Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo semicarbazida têm a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2 -NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 - 10 e n é 100 - 1.000.

[000549] Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido contendo carbonil é modificado com um derivado do PEG ramificado que contém um grupamento terminal de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um Peso Molecular variando de 10 - 40 kDa, e pode serde 5 - 20 kDa.

[000550] Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural é modificado com um derivado de PEG tendo uma estrutura ramificada. Por exemplo, em algumas modalidades, os derivados de PEG de terminal hidrazida ou hidrazina terão a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2 -NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc), m é 2 - 10 e n é 100 -1.000, e X é opcionalmente, um grupo carbonil (C = O) que pode estar presente ou ausente.

[000551] Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo um grupo semicarbazida terão a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X- (CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 em que R é uma alquil simples (metil, etil, propil, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2 - 10 e n é 100 - 1.000.

[000552] Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo um grupo hidroxilamina terão a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O- NH2 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2 - 10 e n é 100 - 1.000.

[000553] O grau e os sítios em que o(s) polímero(s) solúve(is) em água está(ão) ligados ao polipeptídeo de bG-CSF podem modular a ligação do polipeptídeo de bG-CSF a um receptor. Em algumas modalidades, as ligações são arranjadas de tal forma que o polipeptídeo de bG-CSF se liga ao receptor com um Kd de cerca de 400 nM ou menor, com um Kd de 150 nM ou menor, e em alguns casos com um Kd de 100 nM ou menor, conforme medido por um ensaio de ligação no equilíbrio, como o descrito em Spencer et al, J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988).

[000554] Os métodos e a química para a ativação de polímeros, bem como para a conjugação de peptídeos são descritos na literatura e são conhecidos na arte. Os métodos comumente usados para a ativação de polímeros incluem, mas não estão limitados a ativação dos grupos funcionais com brometo de cianogênio, periodato, glutaraldeído, biepoxidas, epicloridrina, divinilssulfona, carbodi-imida, haletos de sulfonila, triclorotriazina, etc. (Ver, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. (1991).

[000555] Várias revisões e monografias sobre a funcionalização e conjugação de PEG estão disponíveis. Veja, por exemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304(1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6; 150-165 (1995).

[000556] Os métodos para a ativação de polímeros também podem ser encontradas no WO 94/17039, Patente US No. 5.324.844, WO 94/18247, WO 94/04193, Patente US No. 5.219.564, Patente US No. 5.122.614, WO 90/13540, Patente US No. 5.281.698, e WO 93/15189, e para a conjugação entre enzimas e polímeros ativados, incluindo mas não limitado a, fator VIII de coagulação (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula carreadora de oxigênio (Patente US No. 4.412.989), ribonuclease e superóxido dismutase (Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)). Todas as referências citadas e patentes são incorporadas aqui por referência.

[000557] A PEGuilação (ou seja, a adição de qualquer polímero solúvel em água) da polipeptídeos de bG-CSF contendo um aminoácido codificado de forma não natural, tal como p-azida-L- fenilalanina, é efetuada por qualquer método conveniente. Por exemplo, o polipeptídeo de bG-CSF é PEGuilado com um derivado de mPEG terminado com alquino. Resumidamente, um excesso de mPEG(5000)-O-CH2-C = CH sólido é adicionado, sob agitação, a uma solução aquosa de polipeptídeo de bG-CSF contendo p-azida-L-Phe em temperatura ambiente. Tipicamente, a solução aquosa é tamponada com um tampão de tendo um pKa próximo do pH em que a reação deve ser realizada (geralmente cerca de pH 4 - 10). Exemplos de tampões adequados para PEGuilação em pH 7,5, por exemplo, incluem, mas não estão limitados a HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCl, EPPS, e TES. O pH é continuamente monitorado e ajustado se necessário. A reação é normalmente deixada continuar por entre cerca de 1 - 48 horas.

[000558] Os produtos de reação são posteriormente submetidos a cromatografia de interação hidrofóbica para separar as variantes de polipeptídeo de bG-CSF PEGuiladas do mPEG(5000)-O-CH2-CEHC livre e quaisquer complexos de alto peso molecular do polipeptídeo de bG-CSF peguilado que podem se formar quando o PEG desbloqueado é ativado em ambas as extremidades da molécula, desse modo, reticulando as moléculas de variantes de polipeptídeo de bG-CSF. As condições durante a cromatografia de interação hidrofóbica são tais que o mPEG(5000)-O-CH2-CEHC livre flui através da coluna, enquanto quaisquer complexos de variante de polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado reticulado eluir depois das formas desejadas, as quais contém uma molécula de variante de polipeptídeo de bG-CSF conjugada com um ou mais grupos PEG. As condições adequadas variam dependendo dos tamanhos relativos dos complexos reticulados versus os conjugados desejados e são prontamente determinados por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. O eluente contendo os conjugados desejados é concentrado por ultrafiltração e dessalgado por diafiltração.

[000559] Se necessário, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado obtidoa da cromatografia de interação hidrofóbica pode ser adicionalmente purificado por um ou mais procedimentos conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte, incluindo, mas não limitados a, cromatografia de afinidade; cromatografia de troca de cátions ou de ânions (usando, incluindo mas não limitado a, DEAE SEPHAROSE), cromatografia em sílica; HPLC de fase reversa, filtração em gel (usando, incluindo mas não limitado a, SEPHADEX G-75), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de metal-quelato; ultrafiltração/diafiltração, precipitação do etanol, precipitação de sulfato de amônio; cromatofocagem; cromatografia de deslocamento; procedimentos eletroforéticos (incluindo, mas não limitados a focagem isoelétrica preparativa) solubilidade diferencial (incluindo mas não limitado a precipitação com sulfato de amônio), ou extração peso molecular aparente pode ser estimado pela GPC, por comparação com padrões de proteínas globulares (Preneta, A. Z. em PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989,293-306).A pureza doconjugadodebG-CSF-PEG pode ser avaliada por degradação proteolítica (incluindo mas não limitado a,clivagemda tripsina), seguidopor análise de espectrometria de massa. Pepinsky R. B. et al, J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297 (3), 1059-1066 (2001).

[000560] Um polímero solúvel em água ligado a um aminoácido de um polipeptídeo de bG-CSF da invenção pode ainda ser derivado ou substituído, sem limitação.

Derivados de PEG contendo Azida

[000561] Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF é modificado com um derivado de PEG que contém um grupamento de azida que irá reagir com uma molécula de alquino presente na cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Em geral, os derivados de PEG terão um peso molecular médio variando de 1 - 100 kDA e, em algumas modalidades, a partir de 10 - 40 kDA.

[000562] Em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal azida terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 - 10 e n é 100 -1.000 (ou seja, média de peso molecular entre 5 - 40 kDA).

[000563] Em uma outra modalidade, o derivado de PEG de terminal azida terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m--NH-C-(O)-(CH2)p-N3, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, et.), m é 2 - 10, p é 2 - 10 e n é 100 - 1.000 (ou seja, peso molecular médio é entre 5 - 40 kDa).

[000564] Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido contendo alquino é modificado com um derivado do PEG ramificado que contém um grupamento de terminal azida, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um Peso Molecular variando de 10 - 40 kDA e podendo ser de 5 - 20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal azida terá a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X- (CH2)PN3 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.) m é 2 - 10, p é 2 - 10 e n é 100 - 1.000; e X é opcionalmente, um O, N, S ou um grupo carbonil (C = O), em cada caso, que pode estar presente ou ausente.

Derivados de PEG contendo Alquino

[000565] Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG- CSF é modificado com um derivado de PEG que contém um grupamento de alquino, que reage com um agrupamento de azida presente na cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural.

[000566] Em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal alquino terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C ECH em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 - 10 e n é 100 -1.000 (ou seja, peso molecular médio está entre 5 - 40 kDa).

[000567] Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificados de forma não natural contendo um alquino é modificado com um derivado de PEG que contém um grupamento de terminal azida ou terminal alquino que está ligado ao esqueleto de PEG por meio de uma ligação de amida.

[000568] Em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal alquino terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p- C ECH em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é de 2 -10, p é de 2 - 10 e n é 100 -1.000.

[000569] Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido contendo azida são modificados com um derivado de PEG ramificado que contém um grupamento de terminal alquino, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um Peso Molecular variando de 10 - 40 kDa e pode ser 5 - 20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado do PEG de terminal alquino terá a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)-NH-C(O)]2CH-(CH2)m-X-(CH2)p- C ECH em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc), m é 2 - 10, p é 2 - 10, e n é 100 - 1.000, e X é opcionalmente, um grupo O, N, S ou carbonil (C = O), ou não está presente.

Derivados de PEG contendo Fosfina

[000570] Em outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de bG- CSF é modificado com um derivado de PEG que contém um grupo funcional ativado (incluindo mas não limitado a, éster, carbonato) compreende adicionalmente um grupo aril fosfina que irá reagir com um grupamento azida presente na cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Em geral, os derivados de PEG terão um peso molecular médio variando de 1 - 100 kDa e, em algumas modalidades, de 10 - 40 kDa.

[000571] Em algumas modalidades, o derivado de PEG terá a seguinte estrutura:

[000572] Em algumas modalidades, o derivado do PEG terá a seguinte estrutura:

em que X pode ser O, N, S ou não está presente, o pH é fenil, W é um polímero solúvel em água e R pode ser os grupos H, alquil, aril, alquil substituído e aril substituído. Os grupos R exemplares incluem, mas não estão limitados a, -CH2, -C(CH3)3, -OR’, -NR'R", - SR’, -halogênio, -C(O)R', -CONR’R’’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R’’, -CN e NO2. R’, R’’, R’’’ e R’’’’ se referem, cada um independentemente, a hidrogênio, heteroalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído incluindo, mas não limitado a aril substituído com 1 - 3 halogênios, grupos alquil substituído ou não substituído, alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arillquil. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como é cada grupo R,’ R’’, R’’’ e R’’’’ quando mais de um desses grupos está presente. Quando R' e R" estão fixos ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel com 5-, 6- ou 7- membros. Por exemplo, o -NR’R’’ é destinado a incluir, mas não está limitado a, 1-pirrolidinil e 4-morfolinil. A partir da discussão de substituintes acima, uma pessoa com habilidade na arte vai entender que o termo "alquil" é destinado a incluir os grupos que incluem átomos de carbono ligados a grupos diferentes dos grupos hidrogênio, tal como haloalquil (incluindo, mas não limitado a, -CF3 e -CH2CF3) e acil (incluindo, mas não limitado a, -C(O)CH3, -C(O)CF3, - C(O)CH2OCH3, e semelhantes).

Outros derivados de PEG e Técnicas Gerais dePEGuilação

[000573] Outras moléculas de PEG exemplares, que podem ser ligadas a polipeptídeos de bG-CSF, bem como métodos de PEGuilação incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos, por 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; Patente US No. 6.646.110,5.824.778,5.476.653,5.219.564,5.629.384; 5.736.625,4.902.502,5.281.698,5.122.614,5.473.034,5.516.673, 5.382.657,6.552.167,6.610.281,6.515.100,6.461.603,6.436.386, 6.214.966,5.990.237,5.900.461,5.739.208,5.672.662,5.446.090, 5.808.096,5.612.460,5.324.844,5.252.714,6.420.339,6.201.072, 6.451.346;6.306.821,5.559.213,5.747.646,5.834.594,5.849.860, 5.980.948, 6.004.573; 6.129.912; WO 97/32607, EP 229 108, EP 402 378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247; WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO95/33490,WO96/00080, WO 97/18832,WO98/41562,WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO98/32466,WO95/06058, EP 439508,WO97/03106,WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 e EP 154 316, que são incorporadas aqui por referência. Qualquer uma das moléculas de PEG aqui descritas podem ser usadas em qualquer forma incluindo, mas não limitado a, de cadeia simples, cadeia ramificada, cadeia de multibraços, funcional única, bi- funcional, multifuncional, ou qualquer combinação dos mesmos.

[000574] Os polímero adicionais e derivados de PEG incluindo, mas não limitados a, derivados PEG de hidroxilamina (amino-oxi), estão descritos nos seguintes pedidos de patentes que são todos incorporados aqui por referência na sua totalidade aqui: publicação de pedido de Patente US No. 2006/0194256, publicação de pedido de Patente US No. 2006/0217532, publicação de pedido de Patente US No. 2006/0217289, Patente Provisória US No. 60/755.338 e Patente Provisória US No. 60/755.711; Patente Provisória US No. 60/755.018; pedido de patente internacional No. PCT/US06/49397; WO 2006/069246; Patente Provisória US No. 60/743.041; Patente Provisória US No. 60/743.040; pedido internacional de patente No. PCT/US06/47822; Patente Provisória US No. 60/882.819; Patente Provisória US No. 60/882.500 e Patente Provisória US No. 60/870.594.

Proteínas Heterólogas de Fusão de Fc

[000575] Os compostos de bG-CSF acima descritos podem ser fundidos diretamente ou por meio de um ligante de peptídeo para a porção de Fc de uma imunoglobulina. As imunoglobulinas são moléculas que contêm cadeias polipeptídicas unidas por pontes de dissulfeto, geralmente tendo duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Em cada cadeia, um domínio (V) tem uma sequência de aminoácidos variável, dependendo da especificidade do anticorpo da molécula. Os outros domínios (C) têm uma sequência mais ou menos constante comum às moléculas da mesma classe.

[000576] Como usado aqui, a porção de Fc de uma imunoglobulina tem o significado comumente dado ao termo no campo da imunologia. Especificamente, este termo se refere a um fragmento de anticorpo que é obtido pela remoção de duas regiões de ligação do antígeno (fragmentos Fab) do anticorpo. Uma forma para remover os fragmentos Fab é digerir a imunoglobulina com papaína protease. Assim, a porção de Fc é formada a partir de fragmentos de tamanho aproximadamente igual da região constante de ambas as cadeias pesadas, que se associam através de interações não covalentes e pontes de dissulfeto. A porção de Fc pode incluir regiões de dobradiça e se estender, através dos domínios de CH2 e CH3 ao C-terminal do anticorpo. As regiões de dobradiça representativas de imunoglobulinas de humanos e de camundongos podem ser encontradas em Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman e Co., 1992, os ensinamentos dos quais sendo incorporado aqui por referência. A porção de Fc pode ainda incluir um ou mais sítios de glicosilação. As sequências de aminoácidos de numerosas proteínas Fc representativas contendo uma região de dobradiça, domínios CH2 e CH3, e um sítio de N-glicosilação são bem conhecidas na arte.

[000577] Existem cinco tipos de regiões Fc de imunoglobulina humana com diferentes funções efetoras e propriedades farmacocinéticas: IgG, IgA IgM, IgD e IgE. A IgG é a imunoglobulina mais abundante no soro. A IgG também tem meia-vida mais longa no soro de uma imunoglobulina (23 dias). Ao contrário de outras imunoglobulinas, IgG é eficientemente recirculada após a ligação para um receptor Fc. Há quatro subclasses de IgG, G1, G2, G3 e G4, cada qual com diferentes funções efetoras. O G1, G2 e G3 podem se ligar a C1q e fixar o complemento, enquanto G4 não pode. Apesar de G3 ser capaz de ligar C1q mais eficientemente do que G1, G1 é mais eficaz na mediação da lise celular direcionada pelo complemento. G2 fixa o complemento muito ineficientemente. O sítio de ligação C1q em IgG está localizado na região carbóxi terminal do domínio CH2.

[000578] Todas as subclasses de IgG são capazes de se ligar aos receptores de Fc (CD16, CD32, CD64) com o G1 e G3 sendo mais eficazes que G2 e G4. A região de ligação do receptor Fc de IgG é formada por resíduos localizados em ambas as regiões carbóxi terminal e de dobradiças do domínio CH2.

[000579] A IgA pode existir tanto na forma monomérica quanto dimérica mantidas juntos por uma cadeia J. A IgA é a segunda Ig mais abundante no soro, mas tem uma meia-vida de apenas 6 dias. A IgA tem três funções efetoras. Ela se liga a um receptor de IgA específico em macrófagos e eosinófilos, que direciona a fagocitose e a degranulação, respectivamente. Ela também pode fixar o complemento por meio de uma via alternativa desconhecida.

[000580] A IgM é expressa como um pentâmero ou como um hexâmero, ambos os quais sendo mantidos juntos por uma cadeia J. A IgM sérica tem uma meia-vida de 5 dias. Ela se liga fracamente aos C1q por meio de um sítio de ligação localizado em seu domínio CH3. A IgD tem uma meia-vida de 3 dias no soro. Não está claro quais funções efetoras são atribuíveis a esta Ig. A IgE é uma Ig monomérica e tem uma meia-vida sérica de 2,5 dias. A IgE se liga a dois receptores de Fc que direcionam a degranulação e resulta na liberação de agentes pró-inflamatórios.

[000581] Dependendo do efeito in vivo desejado, as proteínas heterólogas de fusão da presente invenção podem conter qualquer um dos isotipos descritos acima ou podem conter regiões Fc mutantes em que as funções de ligação ao receptor Fc e/ou complemento foram alteradas. Assim, as proteínas heterólogas de fusão da presente invenção podem conter toda a porção de Fc de uma imunoglobulina, fragmentos da porção de Fc de uma imunoglobulina, ou análogos das mesmas fundidas a um composto de bG-CSF.

[000582]Asproteínasdefusão da presenteinvenção podem consistiremproteínasdecadeia simples oupolipeptídeos de multicadeia. Duas ou mais proteínas de fusão de Fc podem ser produzidas de tal forma que elas interagem através de pontes de dissulfeto, que naturalmente se formam entre as regiões de Fc. Esses multímeros podem ser homogêneos em relação ao composto de bG- CSF ou podem conter diferentes compostos de bG-CSF fundidos no N-terminal da porção de Fc da proteína de fusão.

[000583] Independentemente da estrutura final da proteína de fusão, o Fc ou região tipo Fc pode servir para prolongar a meia-vida plasmática "in vivo" do composto de bG-CSF fundido no N-terminal. Além disso, o componente de bG-CSF de um composto de proteínas de fusão deve reter pelo menos uma atividade biológica de bG-CSF. Um aumento na meia-vida de circulação ou terapêutica pode ser demonstrado usando o método descrito aqui ou conhecido na arte, em que a meia-vida da proteína de fusão é comparada com a meia-vida do composto de bG-CSF individualmente. A atividade biológica pode ser determinada por métodos in vitro e in vivo conhecidos na arte.

[000584] Uma vez que a região de Fc da IgG produzida por proteólise tem a mesma meia-vida "in vivo" que a molécula de IgG intacta e os fragmentos Fab são rapidamente degradados, acredita-se que a sequência relevante para prolongar a meia-vida reside nos domínios de CH2 e/ou CH3. Além disso, foi mostrado na literatura que as taxas catabólicas das variantes de IgG que não se ligam a C1q ou receptor Fc de alta afinidade são indistinguíveis a partir da taxa de depuração do anticorpo do tipo selvagem de origem, indicando que o sítio catabólico é distinto dos sítios envolvidos na ligação de C1q ou receptor Fc. [Wawrzynczak et al. (1992) Molecular Immunology 29:221]. Estudos de mutagênese sítio-dirigida usando uma região de Fc de IgG1 de murino sugeriram que o sítio da região de Fc de IgG1 que controla a taxa catabólica está localizado na interface do domínio CH2-CH3. As regiões de Fc podem ser modificadas no sítio catabólico para otimizar a meia-vida das proteínas de fusão. A região de Fc usada para as proteínas de fusão da presente invenção podem ser derivadas de uma região de Fc de IgG1 ou IgG4, e podem conter ambas as regiões CH2 e CH3, incluindo a região de dobradiça.

Proteínas Albuminas Heterólogas de Fusão

[000585] O bG-CSF descrito neste documento pode ser fundido diretamente ou por meio de um ligante de peptídeo, polímero solúvel em água, ou ligante de pró-fármaco à albumina ou um análogo, fragmento ou derivado do mesmo. Geralmente, as proteínas albumina que são parte das proteínas de fusão da presente invenção podem ser derivadas da albumina clonada a partir de quaisquer espécies, incluindo a espécie humana. A albumina sérica humana (HSA) consiste em uma cadeia polipeptídica única não glicosilada de 585 aminoácidos com um peso molecular de fórmula de 66.500. A sequência de aminoácidos de HSA humana é conhecida [Ver Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114; Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6747, cada um dos quais sendo incorporado aqui por referência]. Uma variedade de variantes polimórficas, bem como análogos e fragmentos de albumina foram descritos. [Ver Weitkamp, et al. (1973). Ann Hum. Genet. 37:219]. Por exemplo, no EP 322 094, diversas formas menores de HSA. Alguns desses fragmentos de HSA são divulgados, incluindo HSA (1 - 373), HSA (1 - 388), HSA (1 - 389), HSA (1- 369), e HSA (1- 419) e fragmentos entre 1 - 369 e 1 - 419. O EP 399 666 divulga fragmentos de albumina que incluem HSA (1 - 177) e HSA (1 - 200) e fragmentos entre HSA (1 - 177) e HSA (1 -200).

[000586] Entende-se que as proteínas heterólogas de fusão da presente invenção incluem compostos de bG-CSF que são acoplados a quaisquer fragmentos análogos e derivados incluindo a proteína albumina, em que tal proteína de fusão é biologicamente ativa e tem uma meia-vida plasmática mais longa do que o composto de bG-CSF individualmente. Sendo assim, a porção de albumina da proteína de fusão não necessita ter uma meia-vida plasmática igual a da albumina humana nativa. Os fragmentos, análogos e derivados são conhecidos ou podem ser gerados, os quais têm meias-vidas mais longas ou têm meias-vidas intermediárias às da albumina humana nativa e do composto de bG-CSF de interesse.

[000587] As proteínas heterólogas de fusão da presente invenção englobam proteínas tendo substituições conservativas de aminoácidos no composto de bG-CSF e/ou o Fc ou porção de albumina da proteína de fusão. A "substituição conservativa" é a substituição de um aminoácido com um outro aminoácido que tem a mesma carga líquida eletrônicos e aproximadamente o mesmo tamanho e forma. Os aminoácidos com cadeias laterais de aminoácidos alifáticos ou alifáticos substituídos têm aproximadamente o mesmo tamanho quando o número total de carbono e heteroátomos em suas cadeias laterais difere por não mais que cerca de quatro. Eles têm aproximadamente a mesma forma quando o número de ramificações em suas cadeias laterais difere por não mais do que um. Os aminoácidos com grupos fenil ou fenil substituído em suas cadeias laterais são considerados como tendo aproximadamente o mesmo tamanho e forma. Exceto quando expressamente permitido aqui, as substituições conservativas são preferencialmente feitas com aminoácidos de ocorrência natural.

[000588] As proteínas imunoglobulinas e albumina do tipo selvagem podem ser obtidas a partir de uma variedade de fontes. Por exemplo, essas proteínas podem ser obtidas a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecidos ou células que expressam o mRNA de interesse em um nível detectável. As bibliotecas podem ser selecionadas com sondas designadas usando a sequência de proteína ou de DNA publicado para a proteína de interesse particular. Por exemplo, as regiões constantes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina são descritas em Adams, et al. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 79:7862-7862; Falkner, et al. (1982) Nature 298:286-288; e Morrison, et al. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2:239-256. Algumas referências que divulgam as sequências de DNA e proteína albumina incluem Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proc. 34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114; e Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261 :6747.

Caracterização das Proteínas Heterólogas de Fusão da Presente Invenção

[000589] Existem numerosos métodos para caracterizar as proteínas de fusão da presente invenção. Alguns desses métodos incluem, mas não estão limitados a: SDS-PAGE acoplado com a proteína, métodos de coloração de proteína ou imunoblotting usando anticorpos anti-IgG ou anticorpos anti-HSA. Outros métodos incluem espectrometria de massas com ionização/dessorção a laser assistida em matriz (MALDI- MS), espectrometria de massa/cromatografia líquida, focagem isoelétrica, troca analítica de ânions, cromatofocagem e dicroísmo circular, por exemplo.

Intensificação da Afinidade para a Albumina Sérica

[000590] Várias moléculas também podem ser fundidas aos polipeptídeos de bG-CSF da invenção para modular a meia-vida de polipeptídeos de bG-CSF no soro. Em algumas modalidades, as moléculas são ligadas ou fundidas aos polipeptídeos de bG-CSF da invenção para intensificar a afinidade para a albumina sérica endógena em um animal.

[000591] Por exemplo, em alguns casos, uma fusão recombinante de um polipeptídeo de bG-CSF e uma sequência de ligação à albumina é feita. As sequências exemplares de ligação à albumina incluem, mas não estão limitadas a, domínio de ligação à albumina a partir da proteína Gestreptocócica (ver, porexemplo,Makridesetal,J. Pharmacol.Exp. Ther. 277:534-542(1996) eSjolanderetal,J. Immunol Methods 201: 115-123 (1997)), ou peptídeos que se ligam a albumina tais como os descritos em, por exemplo, Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).

[000592] Em outras modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF da presente invenção são acilados com ácidos graxos. Em alguns casos, os ácidos graxos promovem a ligação à albumina sérica, Veja, por exemplo, Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995).

[000593] Em outras modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF da invenção são fundidos diretamente à albumina sérica (incluindo, mas não limitada a albumina humana). Aqueles com habilidades na arte vão reconhecer que uma ampla variedade de outras moléculas também podem ser ligados à bG-CSF na presente invenção para modular a ligação à albumina sérica ou outros componentes do soro.

X.Glicosilação de Polipeptídeos de bG-CSF

[000594] A invenção inclui Polipeptídeos de bG-CSF que incorporam um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural apresentando resíduos de sacarídeos. Os resíduos de sacarídeos podem ser naturais (incluindo, mas não limitado a N-acetilglicosamina) ou não naturais (incluindo, mas não limitado a, 3-fluorogalactose). Os sacarídeos podem estar ligados aos aminoácidos codificados de forma não natural quer por uma ligação glicosídica N- ou O- ligadas (incluindo, mas não limitado a N-acetilgalactose-L-serina) ou uma ligação não natural (incluindo, mas não limitado a, uma oxima ou o glicosídeo C- ou S- ligado correspondente).

[000595] Os grupamentos de sacarídeos (incluindo, mas não limitado a glicosil) podem ser adicionados a polipeptídeos de bG-CSF, quer in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural contendo carbonil é modificado com um sacarídeo derivatizado com um grupo amino-oxi para gerar o polipeptídeo glicosilado correspondente ligado por meio de uma ligação de oxima. Uma vez fixado ao aminoácido codificado de forma não natural, o sacarídeo pode ainda ser elaborado pelo tratamento com glicosiltransferases e outras enzimas para gerar um oligossacarídeo ligado ao bG-CSF. Ver, por exemplo, H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003).

[000596] Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural contendo carbonil é modificado diretamente com um glicano com estrutura definida, preparado como um derivado de amino-oxi. Uma pessoa com competências comuns na arte vai reconhecer que outras funcionalidades, incluindo azida, alquino, hidrazida, hidrazina, e semicarbazida, podem ser usadas para ligar o sacarídeo ao aminoácido codificado de forma não natural.

[000597] Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural contendo azida ou alquinil pode ser modificado por, incluindo mas não limitado a, uma reação de cicloadição [3 +2] de Huisgen, com a, incluindo mas não limitado a, derivados de alquinil ou azida, respectivamente. Este método permite que as proteínas sejam modificadas com seletividade muito alta.

XI.Multímeros e Dímeros de bG CSF

[000598] A presente invenção também fornece combinações de análogos de bG-CSF e bG-CSF, tais como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros (ou seja, trímeros, tetrâmeros, etc.) onde o bG-CSF contendo um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural é ligado a um outro bG- CSF ou variante de bG-CSF do mesmo, ou qualquer outro polipeptídeo que não seja o bG-CSF ou variante de bG-CSF do mesmo, seja diretamente ao esqueleto de polipeptídeo ou por meio de um ligante. Devido ao seu peso molecular aumentado em comparação comos monómeros, odímero de bG-CSF ouconjugados de multímeros podem exibir propriedades novas ou desejáveis, incluindo mas não limitadoa,diferentespropriedadesfarmacológicas, farmacocinéticas, farmacodinâmicas, meia vida terapêutica modulada, ou meia-vida plasmática modulada em relação ao bG-CSF monomérico. Em algumas modalidades, os dímeros de bG-CSF da invenção vão modular a transdução de sinal do receptor de G-CSF. Em outras modalidades, os dímeros ou multímeros de bG-CSF da presente invenção funcionarão como um antagonista do receptor, agonista ou modulador.

[000599] Em algumas modalidades, uma ou mais das moléculas de bG-CSF presentes em um bG-CSF contendo dímeros ou multímeros compreendem um aminoácido codificado de forma não natural ligado a um polímero solúvel em água.

[000600] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF estão diretamente ligados, incluindo mas não limitado a, por meio de uma ligação de amida Asn-Lys ou a ligação de dissulfeto Cys-Cys. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de bG-CSF, e/ou a molécula de não-bG-CSF ligada, compreenderá diferentes aminoácidos codificados de forma não natural para facilitar a dimerização, incluindo mas não limitado a, um alquino em um aminoácido codificado de forma não natural de um primeiro polipeptídeo de bG-CSF e uma azida em um segundo aminoácido codificado de forma não natural de uma segunda molécula será conjugado por meio de uma cicloadição [3 +2] de Huisgen. Alternativamente, a molécula de bG-CSF, e/ou a de não- bG-CSF ligada compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural contendo cetona pode ser conjugado com um segundo polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural contendo hidroxilamina e os polipeptídeos são reagidos através da formação da oxima correspondente.

[000601] Como alternativa, os dois polipeptídeos de bG-CSF, e/ou a molécula de não-bG-CSF ligada, estão ligados por meio de um ligante. Qualquer ligante hetero ou homo-bifuncional pode ser usado para ligar as duas moléculas e/ou as moléculas de não-bG-CSF ligadas, que podem ter a mesma ou diferente sequência primária. Em alguns casos, o ligante usado para amarrar o bG-CSF, e/ou as moléculas de não-bG-CSF ligadas em conjunto pode ser um reagente de PEG bifuncional. Os ligantes podem ter uma ampla faixa de peso molecular ou comprimento molecular. Os ligantes de peso molecular maior ou menor podem ser usados para fornecer uma conformação ou relação espacial desejada entre o bG-CSF e a entidade ligada ou entre o bG- CSF e o seu receptor, ou entre a entidade ligada e os seus parceiros de ligação, se houver. Os ligantes tendo maior ou menor comprimento molecular também podem ser usados para fornecer um espaço ou flexibilidade desejado entre o bG-CSF e a entidade ligada, ou entre a entidade ligada e os seus parceiros de ligação, se houver.

[000602] Em algumas modalidades, a invenção fornece ligantes bifuncionais solúveis em água que têm uma estrutura de halteres, que inclui: a) uma azida, um alquino, uma hidrazina, uma hidrazida, uma hidroxilamina, ou um grupamento contendo carbonil em pelo menos uma primeira extremidade de um esqueleto do polímero, e b) pelo menos um segundo grupo funcional em uma segunda extremidade do esqueleto do polímero. O segundo grupo funcional pode ser igual ou diferente ao primeiro grupo funcional. O segundo grupo funcional, em algumas modalidades, não é reativo com o primeiro grupo funcional. A invenção fornece, em algumas modalidades, os compostos solúveis em água que compreende pelo menos um braço de uma estrutura molecular ramificada. Por exemplo, a estrutura molecular ramificada pode ser dendríticas.

[000603] Em algumas modalidades, a invenção fornece multímeros compreendendo um ou mais polipeptídeos de bG-CSF formados por reações com polímeros ativados solúveis em água, que têm a seguinte estrutura: R-(CH2CH2O)n-(CH2)m-X em que n é de cerca de 5 a 3.000, m é 2 - 10, X pode ser uma azida, um alquino, uma hidrazina, uma hidrazida, um grupo amino-oxi, uma hidroxilamina, um grupamento contendo acetil ou carbonil, e R é um grupo de cobertura, um grupo funcional, ou um grupo de saída que pode ser igual ou diferente, como X. R pode ser, por exemplo, um grupo funcional selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxil, hidroxil protegido, alcóxil, N-hidróxisuccinimidil éster, 1-benzotriazolil éster, carbonato de N-hidróxisuccinimidil, carbonato de 1-benzotriazolil, acetal, aldeídos, hidratos de aldeído, alquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, maleimida, isotiocianatos, vinilssulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos e tresilatos, alqueno, e cetona.

XII.Medição da Atividade de Polipeptídeo de bG-CSF e Afinidade de bG-CSF para um Receptor

[000604] A atividade de polipeptídeos de bG-CSF pode ser determinada usando ensaios in vitro ou in vivo padrões ou conhecidos. Os polipeptídeos de bG-CSF podem ser analisados para a atividade biológica através de métodos adequados conhecidos na arte. Os ensaios incluem, mas não estão limitados àqueles descritos em Hedari et al. Veterinary Immunology and Imunopatology (2001) 81:45-57 e ensaios que avaliam as atividades biológicas do hG-CSF.

[000605] Os polipeptídeos de bG-CSF podem ser analisados por sua capacidade de sobreregular CD11a, CD11b, CD11c e/ou CD18 em neutrófilos. A medição dessa atividade pode ser medida por FACS, como descrito por Hedari et al. (supra). Ensaios adicionais conhecidos por aqueles que possuem habilidades comuns na arte de ativação de medição de neutrófilos incluem, mas não limitado a ensaios que medem a L-selectina. Outros ensaios que podem ser realizados avaliam a proliferação e/ou diferenciação de células pelos polipeptídeos de bG-CSF da invenção.

[000606] Os polipeptídeos de bG-CSF podem ser analisada por sua capacidade de se ligar a um receptor. O receptor de G-CSF pode ser preparado usando técnicas e métodos que são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. O receptor de hG-CSF pode ser preparado como descrito na Patente US No. 5.574.136 que é incorporada aqui por referência. Por exemplo, as células ou linhagens celulares que agem em resposta ao G-CSF ou lingam G-CSF (incluindo, mas não limitado a, células que contém receptores ativos de G-CSF, tal como as células que produzem receptor de G-CSF recombinante) podem ser usadas para monitorar a ligação de receptor de bG CSF. Para um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado ou não PEGuilado compreendendo um aminoácido não natural, a afinidade do bG-CSF por seu receptor ou por um outro receptor de G-CSF pode ser medida usando um biossensor BIAcoreTM (Pharmacia). Os ensaios adequados de ligação incluem, mas não estão limitados a ensaios da BIAcore (Pearce et al., Bioqchemistry 38:81-89(1999)) e ensaios da AlphaScreenTM (PerkinElmer). O AlphaScreenTM é um ensaio de proximidade luminescente não-radioativa com base em esferas, onde as esferas doadoras são excitadas por um laser de 680 nm para a liberação de oxigênio singlete. O oxigênio singlete difunde e reage com o derivado de tioxeno na superfície das esferas receptoras levando à emissão de fluorescência em ~600 nm. A emissão de fluorescência ocorre apenas quando as contas doadoras e receptoras são colocadas em estreita proximidade com as interações moleculares que ocorrem quando cada um está ligado ao ligante e ao receptor, respectivamente. Esta interação ligante-receptor pode ser competitiva usando variantes de ligação do receptor, uma vez que as variantes sem ligação não irão competir.

[000607] A atividade do polipeptídeo de bG-CSF pode ser determinada usando ensaios padrões in vitro ou in vivo conhecidos. Por exemplo, as células ou linhagens celulares que se proliferam na presença de hG-CSF ou se ligam a hG-CSF (incluindo, mas não limitado a células que contém receptores de G-CSF ativos, tais como as células de medula óssea de camundongo, WEHI-3B (D+), AML-193 (ATCC), ou células que produzem receptor de G-CSF recombinante) podem ser usadas para monitorar a ligação do receptor de bG-CSF. Veja, por exemplo, King et al., Exp. Hematol. 20:223 (1992); Patente US No. 6.385.505, que são incorporados aqui por referência. Em modelos animais in vivo, bem como testes clínicos humanos para testar a atividade de hG-CSF incluem aqueles descritos, por exemplo, nas Patentes US No. 6.166.183, 6.565.841, 6.162.426, 5.718.893, que são incorporadas aqui por referência. Esses modelos podem ser usados para avaliar a atividade de bG-CSF.

[000608] Independentemente de quais métodos são usados para criar os presentes análogos de bG-CSF, os análogos são sujeitos a ensaios de atividade biológica. Os ensaios de timidina tritiada podem ser realizados para avaliar o grau de divisão celular. Outros ensaios biológicos, no entanto, podem ser usados para avaliar a atividade desejada. Os ensaios biológicos, tais como o ensaio para a capacidade de induzir a diferenciação terminal em linhagens celulares leucêmicas de camundongo WEHI-3B(D+), também fornece indicação da atividade de G-CSF. Veja Nicola, et al. Blood 54: 614-27 (1979). Outros ensaios in vitro podem ser usados para verificar a atividade biológica. Veja Nicola, Ann. Rev. Biochem. 58: 45-77 (1989). Em geral, o teste de atividade biológica deve proporcionar análise para o resultado desejado, tal como aumento ou diminuição da atividade biológica (em comparação com os G-CSF não alterados), a atividade biológica diferente (em comparação com os G-CSF não alterados), análise de afinidade de ligação ao parceiro ou ao receptor, mudanças conformacionais ou estruturais do bG-CSF em si ou do seu receptor (em comparação com o bG-CSF modificado), ou a análise de meia- vida sérica.

[000609] Foi relatado anteriormente que as células leucêmicas de humanos e de células de WEHI-3BD+ de leucemias diagnosticadas recentemente se ligarão a G-CSF de murino marcado com 125I e que esta ligação pode ser competida pela adição de G-CSF humana não marcado ou CSF-β. A capacidade natural de G-CSF e bG-CSF para competir pela ligação de 125IG-CSF a células leucêmicas de humanos e de murinos é testada. Os G-CSF naturais altamente purificados (> 95% de pureza; 1 μg) é iodado, e está separado de reagentes por filtração em gel e íon [Tejedor, et al., Anal. Biochem, 127, 143 (1982)], e é separado dos reagentes por cromatografia de troca iônica e filtração em gel. A atividade específica 125IG-CSF do natural é de aproximadamente 100 μCi/μg de proteína.

[000610] A compilação de referências acima para as metodologias de ensaio não é exaustiva, e aqueles com habilidade comum na arte vão reconhecer outros ensaios úteis para testar o resultado final desejado. As alterações de tais ensaios são conhecidas por aqueles de competência comum na arte.

XIII.Medição de Potência, Meia-Vida Funcional in vivo, e Parâmetros Parmacocinéticos

[000611] Um aspecto importante da invenção é a meia-vida biológica prolongada que é obtida pela construção do polipeptídeo de b-GCSF com ou sem conjugação do polipeptídeo com um grupamento de polímero solúvel em água. A rápida diminuição de concentrações séricas após a administração de polipeptídeo de bG-CSF tornou importante a avaliação das respostas biológicas ao tratamento com polipeptídeo de bG-CSF conjugado e não conjugado e variantes dos mesmos. O polipeptídeo de bG-CSF conjugado e não conjugado e variantes dos mesmos da presente invenção podem ter prolongado a meia-vida sérica também após a administração via, por exemplo, subcutânea ou administração intravenosa, tornando possível a medição, por exemplo, por método de ELISA ou por um ensaio de triagem primária. Os kits de ELISA ou RIA a partir de fontes comerciais podem ser usados. Outro exemplo de um ensaio para a medição da meia-vida in vivo no de hG-CSF ou variantes dos mesmos é descrita na Patente US No. 5.824.778, que é incorporada aqui por referência. A medição da meia-vida biológica in vivo é realizada como descrito aqui.

[000612] A potência e a meia-vida funcional in vivo de um polipeptídeo de hG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural pode ser determinada de acordo com o protocolo descrito nas Patente US Nos. 6.646.110,6.555.660,6.166.183, 5.985.265,5.824.778,5.773.581, que são incorporadas aqui por referência. Estes protocolos podem ser usados para bG-CSF também.

[000613] Os parâmetros farmacocinéticos para um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural podem ser avaliados em camundongos do sexo masculino Sprague-Dawley normais (N = 5 animais por grupo de tratamento). Os animais receberão uma dose única de 25 ug/rato ou i.v. ou 50 ug/rato s.c., e cerca de 5 - 7 amostras de sangue serão tomadas de acordo com um curso de tempo pré-definido, geralmente cobrindo cerca de 6 horas para um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural não conjugado a com um polímero solúvel em água e cerca de 4 dias para um polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural e conjugado com um polímero solúvel em água. Os dados farmacocinéticos para o bG-CSF sem um aminoácido codificado de forma não natural podem ser comparados diretamente com os dados obtidos para os polipeptídeos de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural.

[000614] Os estudos farmacocinéticos de polipeptídeos de bG-CSF podem ser realizados em camundongos, ratos, ou em um primata, por exemplo, macacos cinomolgos. Normalmente, uma injeção única é administrada por via subcutânea ou intravenosa, e os níveis séricos de bG-CSF são monitorados ao longo do tempo.

[000615] A Patente US No. 5.849.883 e WO 89/10932, que são incorporados aqui por referência, descrevem uma série de modelos animais que pode ser usada para avaliar os polipeptídeos de bG-CSF da invenção. Os estudos em animais que podem ser realizados envolvem gados provocados com Pasteurella hemolytica, gado com provocação bacteriana da glândula mamária / provocação de mastite (Klebsiella pneumonia). Outros estudos que podem ser realizados avaliam o controle, a incidência e duração de doença respiratória bovina, ou a prevenção de mastites coliformes. Os métodos para avaliar a saúde dos animais, produção de leite, contagem de neutrófilos e outros parâmetros são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Outros modelos que podem ser usados para avaliar os polipeptídeos de bG-CSF da invenção incluem, mas não estão limitados a modelos animais de infecção ou de exposição à infecção, como um modelo de Hamster com pneumonia por Pseudomonas aeruginosa, um modelo do rato com pielonefrite por Candida albicans, modelos que envolvem potros recém-nascidos, e os modelos envolvendo suínos em crescimento. Alguns desses modelos são descritos na Patente US No. 5.849.883 e WO 89/10932. Modelos como estes são conhecidos por aqueles de competência comum na arte.

[000616] Exemplos adicionais de ensaios para a medição de uma atividade biológica in vivo de hG-CSF ou variantes dos mesmos são descritos nas Patente US Nos. 5.681.720;5.795.968,5.824.778, 5.985.265, e Bowen et al., Experimental Hematology 27:425-432 (1999), cada qual sendo incorporado aqui por referência.

XIV. Composições Farmacêuticas e Administração

[000617] Os polipeptídeos ou proteínas da invenção (incluindo, mas não limitado a bG-CSF, sintetases, proteínas compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais, etc.) são opcionalmente usados para fins terapêuticos, incluindo mas não limitado a, em combinação com um carreador farmacêutico adequado. Estas composições, por exemplo, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Esse carreador ou excipiente inclui, mas não está limitado a solução salina, salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e/ou combinações dos mesmos. A formulação é feita para se adequar ao modo de administração. Em geral, os métodos de administração de proteínas são conhecidos por aqueles de competência comum na arte e podem ser aplicados à administração dos polipeptídeos da invenção. As composições podem estar em uma forma solúvel em água, tal como estando presentes como sais farmaceuticamente aceitáveis, que é destinado a incluir ambos os sais de adição de ácido e de base. A Patente US No. 6.497.869, que é incorporada aqui por referência, discute as formulações e a administração de polipeptídeos de G-CSF incluindo, mas não limitado a hG-CSF e bG-CSF. Os sais compreendendo íons sulfato, tal como o sulfato de amônio, sulfato de sódio, sulfato de magnésio, e misturas dos mesmos, bem como agentes tamponantes, tais como acetato, citrato, fosfato, HEPES, BES, TAPS, EPPS, TES, e misturas dos mesmos foram discutidos.

[000618] As composições terapêuticas compreendendo um ou mais polipeptídeos da invenção são, opcionalmente, testadas em um ou mais modelos animais com doença in vitro e/ou in vivo apropriados, para confirmar a eficácia, o metabolismo do tecido, e para estimar as dosagens, de acordo com métodos conhecidos por aqueles com competências comuns na arte. Em particular, as dosagens podem ser inicialmente determinadas pela atividade, estabilidade ou outras medidas adequadas de homólogos de aminoácidos não naturais da invenção em comparação com os naturais (incluindo, mas não limitado a, um polipeptídeo de bG-CSF modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais a um polipeptídeo de bG-CSF de aminoácido natural e comparação com um polipeptídeo de bG-CSF modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais para um tratamento com bG-CSF atualmente disponível), ou seja, em um ensaio relevante.

[000619] A administração é por qualquer uma das rotas normalmente usadas para a introdução de uma molécula em contato final com células do sangue ou dos tecidos. Os polipeptídeos de aminoácidos não naturais da invenção são administrados de qualquer maneira adequada, opcionalmente, com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Os métodos adequados para administrar tais polipeptídeos, no contexto da presente invenção a um paciente estão disponíveis e, embora mais de uma rota poder ser usada para a administração de uma composição particular, uma rota particular pode frequentemente fornecer uma ação ou reação mais imediata e mais eficaz do que uma outra rota.

[000620] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição particular que está sendo administrada, bem como pelo método especial usado para administrar a composição. Assim, há uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas da presente invenção.

[000621] Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção podem ser administrados por qualquer via convencional adequada para proteínas ou peptídeos incluindo, mas não limitado a, via parenteral, por exemplo, injeções, incluindo, mas não limitado a, por via subcutânea ou intravenosa, ou quaisquer outras formas de injeções ou infusões. As composições polipeptídicas podem ser administradas por uma série de rotas, incluindo mas não limitadas a, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, subcutânea, tópica, sublingual, intravascular, intramamária, ou por via retal. As composições que compreendem polipeptídeos de aminoácidos não naturais, modificado ou não modificados, também podem ser administradas por meio de lipossomos. Essas rotas de administração e formulações apropriadas são geralmente conhecidas por aqueles com habilidade na arte. O polipeptídeo de bG-CSF pode ser usado individualmente ou em combinação com outros componentes adequados, tais como um carreador farmacêutico. O polipeptídeo de bG-CSF pode ser usado em combinação com outros agentes ou produtos terapeuticos.

[000622] O polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido não natural, individualmente ou em combinação com outros componentes adequados, também pode ser feito em formulações de aerossóis (ou seja, eles podem ser "nebulizados") para serem administrados por via inalatória. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifiuorometano, propano, nitrogênio e semelhantes.

[000623] As formulações adequadas para administração parenteral, tais como, por exemplo, intra-articular (nas juntas), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea e rotas, incluem soluções isotônicas de injeção esterilizadas, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor de destino, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas, que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. As formulações do bG-CSF podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou multi-dose, tais como ampolas e frascos.

[000624] A administração parenteral e administração intravenosa são os métodos preferidos de administração. Em particular, as rotas de administração já em uso para terapêuticos homólogos de aminoácidos não natural (incluindo, mas não limitado aos normalmente usados para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticorpos, FGFs e/ou qualquer outra proteína que pode ser distribuída farmaceuticamente), juntamente com as formulações de uso corrente, fornecem as rotas preferidas de administração e formulação para os polipeptídeos da invenção.

[000625] A dose administrada a um animal, no contexto da presente invenção, é suficiente para ter uma resposta terapêutica benéfica no animal com o tempo, ou outras atividades apropriadas, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia do vetor específico, ou formulação e a atividade, estabilidade, ou meia-vida sérica do polipeptídeo de aminoácido não natural empregado e a condição do animal, bem como o peso do corpo ou área superficial do animal a ser tratado. O tamanho da dose é determinado também pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos adversos que acompanham a administração de um vetor particular da formulação, ou similares em um animal particular.

[000626] Para determinar a quantidade efetiva do vetor ou formulação a ser administrada no tratamento ou profilaxia da doença, o veterinário avalia os níveis circulantes do plasma, a toxicidade da formulação, a progressão da doença, e/ou se quando importante, a produção de anticorpos anti-polipeptídeo de aminoácido não natural.

[000627] A dose administrada é tipicamente na faixa equivalente de dosagens de proteínas terapêuticas atualmente usadas, ajustadas para a meia-vida sérica ou atividade alterada da composição relevantes Os vetores ou formulações farmacêuticas desta invenção podem suplementar as condições de tratamento por qualquer terapia convencional conhecida, incluindo a administração de anticorpos, a administração de vacina, a administração de agentes citotóxicos, polipeptídeos de aminoácidos não naturais, ácidos nucléicos, análogos de nucleotídeos, modificadores de resposta biológica, e semelhantes.

[000628] Para a administração, as formulações da presente invenção são administradas a uma taxa determinada por LD-50 ou ED-50 da formulação em causa, e/ou observação de quaisquer efeitos colaterais dos polipeptídeos de aminoácido não natural em várias concentrações incluindo, mas não limitado a, como é aplicado à massa e à saúde geral do animal. A administração pode ser feita através de doses únicas ou fracionadas.

[000629] Se um animal que sofre à infusão de uma formulação desenvolve febre, calafrios ou dores musculares, ele pode receber a dose apropriada de aspirina, ibuprofeno, acetaminofeno ou outros fármacos que controlam a dor/febre apropriados para animais. Os animais que experimentam as reações da infusão, tais como febre, dores musculares e calafrios são pré-medicados 30 minutos antes para infusões futuras com aspirina, acetaminofeno, ou, incluindo mas não limitado a, difenidramina, ou outro fármaco apropriado para os animais. A meperidina pode ser usada para calafrios e dores musculares mais graves que não respondem rapidamente a antipiréticos e anti-histamínicos. A infusão de células é retardada ou suspensa, dependendo da gravidade da reação adversa.

[000630] Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção podem ser administrados diretamente a um indivíduo animal. A administração é feita por qualquer uma das rotas normalmente usadas para a introdução de polipeptídeo de bG-CSF a um indivíduo. As composições de polipeptídeo de bG-CSF, de acordo com modalidades da presente invenção, incluem aqueles adequadas para administração oral, retal, tópica, por inalação, (incluindo, mas não limitado a, por meio de um aerossol), bucal (incluindo, mas não limitado a, sublingual), vaginal, parenteral, (incluindo, mas não limitado a, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intra-articular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial ou intravenosa), tópicas (ou seja, ambas as superfícies da pele e da mucosa, incluindo superfícies das vias aéreas), pulmonar, intraocular, intranasal, e transdérmica, embora a rota mais adequada em cada caso dado dependa da natureza e da gravidade da condição a ser tratada. A administração pode ser local ou sistêmica. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes selados de dose única ou multi-dose, tais como ampolas e frascos. Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção podem ser preparados em uma mistura em uma forma de dosagem unitária injetável (incluindo, mas não limitado a solução, suspensão ou emulsão), com um carreador farmaceuticamente aceitável. Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção também podem ser administrados por infusão contínua (usando, incluindo mas não limitado a, minibombas, tais como bombas osmóticas), bólus simples ou formulações de depósito de liberação lenta.

[000631] As formulações adequadas para administração incluem soluções estéreis isotônicas, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas, que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. As soluções e suspensões podem ser preparadas a partir de pó estéril, grânulos e comprimidos do tipo descrito anteriormente.

[000632] A secagem a frio é uma técnica comumente empregada para a apresentação de proteínas que servem para remover a água da preparação da proteína de interesse. A secagem a frio ou liofilização é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e depois o solvente resfriado ou congelado é removido por sublimação em ambiente de vácuo. Um excipiente pode ser incluído em formulações pré-liofilizadas para intensificar a estabilidade durante o processo de liofilização e/ou para melhorar a estabilidade do produto liofilizado mediante armazenagem. Pikal M., Biopharm. 3(9)26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991).

[000633] A secagem por aspersão (Spray Drying) de produtos farmacêuticos também é conhecida por aqueles que possuem habilidades comuns na arte. Por exemplo, veja Broadhead, J. et al. "The Spray Drying in Pharmaceutics", em Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169 - 1206 (1992). Além dos produtos farmacêuticos com moléculas pequenas, uma variedade de materiais biológicos, têm sido seca por aspersão e estes incluem: enzimas, soro, plasma, microorganismos e leveduras. A secagem por aspersão é uma técnica útil porque pode converter uma preparação farmacêutica líquida em um pó aglomerado ou sem poeira, fino, em um processo de uma etapa. A técnica básica compreende quatro etapas: a) atomização da solução de alimentação em aspersão (spray), b) contato ar-aspersão, c) secagem da aspersão, e d) a separação do produto seco do ar seco. A Patente US Nos. 6.235.710 e 6.001.800, que são incorporadas aqui por referência, descrevem a preparação da eritropoetina recombinante por secagem a seco.

[000634] As composições farmacêuticas e formulações da invenção podem compreender um carreador excipiente, ou estabilizante farmaceuticamente aceitável. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados, em parte, pela composição particular que está sendo administrada, bem como pelo método particular usado para administrar a composição. Assim, há uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas (incluindo opcionaiscarreadores,excipientesouestabilizantes farmaceuticamente aceitáveis) da presente invenção (ver, por exemplo, a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17° ed. 1985)).

[000635] Os carreadores adequados incluem, mas não estão limitados a, tampões contendo succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes, incluindo, mas não limitados a, ácido ascórbico, polipeptídeos de baixo peso molecular incluindo, mas não limitados a, aqueles com menos de cerca de 10 resíduos, proteínas incluindo, mas não limitadas a, albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos incluindo, mas não limitados a, polivinilpirrolidona, aminoácidos, incluindo mas não limitados a, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina, ou derivados de histidina, metionina, glutamato, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo, mas não limitados a, trealose, sacarose, glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes incluindo, mas não limitados a, EDTA dissódico e edentado; íons metálicos divalentes incluindo, mas não limitados a, zinco, cobalto, cobre ou, álcoois de açúcar incluindo, mas não limitado a, manitol ou sorbitol; contra-íons que forma sal incluindo, mas não limitados a, sódio e cloreto de sódio; cargas, tais como celulose microcristalina, lactose, milho e outros amidos; agentes de ligação, edulcorantes e outros agentes aromatizantes, agentes corantes; e/ou surfactantes não iônicos incluindo, mas não limitados a, TweenTM (incluindo, mas não limitado a, Tween 80 (polissorbato 80) e Tween 20 (polissorbato 20), PluronicsTM e outros ácidos plurônicos incluindo, mas não limitados a, ácido plurônico F68 (poloxâmero 188), ou PEG. Os surfactantes apropriados incluem, por exemplo, mas não estão limitados a, poliéteres com base em poli (óxido de etileno)-poli-(óxido de propileno)-poli (óxido de etileno), ou seja, (PEO-PPO-PEO) ou poli (óxido de propileno)-poli (óxido de etileno)- poli (óxido de propileno), ou seja, (PPO-PEO-PPO), ou uma combinação dos mesmos. O PEO- PPO-PEO e PPO-PEO-PPO estão comercialmente disponíveis sob os nomes comerciais PluronicsTM, R-PluronicsTM, TetronicsTM e R- TetronicsTM (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Michigan) e estão adicionalmente descritos na Patente US No. 4.820.352 aqui incorporada na sua totalidade por referência. Outros polímeros de bloco etileno/ polipropileno podem ser surfactantes adequados. Um surfactante ou uma combinação de surfactantes pode ser usado para estabilizar o bG-CSF PEGuilado contra um ou mais estresses incluindo, mas não limitado ao estresse que resulta da agitação. Alguns dos mencionados acima podem ser referidos como "agentes de volume". Alguns podem também ser referidos como "modificadores de tonicidade". Os conservantes antimicrobianos podem também ser aplicados para a estabilidade do produto e a eficácia antimicrobiana; conservantes adequados incluem, mas não estão limitados a álcool benzílico, cloreto de benzalcônio, metacresol, metil/propil parabeno, cresol e fenol, ou uma combinação dos mesmos. A Patente US No. 7.144.574, que é aqui incorporada por referência, descreve materiais adicionais que podem ser adequados em composições e formulações farmacêuticas da invenção e outras preparações de distribuição.

[000636] Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção, incluindo os relacionados com os polímeros solúveis em água, tal como o PEG, podem também ser administrados por, ou como parte de sistemas de liberação sustentada. As composições de liberação sustentada incluem, mas não estão limitadas a matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos incluindo, mas não limitado a, filmes ou microcápsulas. As matrizes de liberação sustentada incluem materiais biocompatíveis, tais como poli (2-hidróxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed Mater Res., 15: 267-277 (1981), Langer, Chem., Tech., 12 : 98-105 (1982), etileno acetato de vinila (Langer et al., supra) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133988), polilactídeos (ácido polilático) (Patente US No. 3.773.919 (EP 58 481)), poliglicolídeo (polímero de ácido glicólico), poli lactídeo co-glicólico (copolímeros de ácido lático e ácido glicólico) polianidridos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al. Biopolymers, 22, 547- 556 (1983), poli(orto)ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídeos, polissacarídeos, ácidos nucléicos, ácidos poliamino, aminoácidos, tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona e silicone. As composições de liberação sustentada também incluem um composto lipossomicamente capturado Lipossomalmente. Os compostos contendo lipossomos são preparados por métodos conhecidos, em si: DE 3.218.121; Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 82: 3688 - 3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 77: 4030 - 4034 (1980); EP 52 322; EP 36 676; Patente US No. 4.619.794; EP 143 949; Patente US No. 5.021.234; pedido de patente Japonês 83118008;. Patentes Us Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102 324. Todas as referências e patentes citadas são incorporadas aqui por referência.

[000637] Os polipeptídeos de bG-CSF capturados lipossomicamente podem ser obtidos por métodos descritos, por exemplo, DE 3.218.121; Eppstein et al., Proc. Acad. Nalt. Sci. EUA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Acad. Nalt. Sci. EUA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52 322; EP 36 676; Patente US No. 4.619.794; EP 143 949; Patente US No. 5.021.234; pedido de Patente japonês 83-118008; Patentes US Nos. 4.485.045 e 4.544.545;. EP 102 324. A composição e o tamanho dos lipossomos são bem conhecidos ou capazes de ser facilmente determinados empiricamente por uma pessoa versada na técnica. Alguns exemplos de lipossomos, são como descritos em, por exemplo, Park JW, et a., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92:1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Sistemas para a distribuição de fármaco Lipossomal para terapia de cancer em Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1591(1-3): 109 - 118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154 - 3161 (2003). Todas as referências e patentes citadas são incorporadas aqui por referência. Uma série de formulações de hG-CSF foi descrita e as referidas formulações são conhecidas por aqueles de competência comum na arte.

[000638] A dose administrada a um animal no contexto da presente invenção deve ser suficiente para causar uma resposta benéfica no indivíduo ao longo do tempo. Geralmente, a quantidade farmaceuticamente eficaz total do polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção por dose administrada por via parenteral está na faixa de cerca de 0,01 μg/kg/dia a cerca de 100 μg/kg, ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal do animal, embora o mesmo esteja sujeito ao critério terapêutico. A frequência da dosagem também está sujeita ao critério terapêutico, e pode ser mais frequente, ou menos frequente do que os produtos de polipeptídeo de bG-CSF as disponíveis comercialmente aprovados para uso em animais. Geralmente, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da invenção pode ser administrado por qualquer uma das vias de administração acima descritas.

XV. Usos Terapêuticos dos Polipeptídeos de bG-CSF da Invenção

[000639] Os polipeptídeos de bG-CSF da invenção são úteis para tratar uma ampla faixa de distúrbios. A administração dos produtos de hG-CSF resulta na formação de glóbulos brancos no sangue de humanos. Assim, a administração dos Polipeptídeos de bG-CSF da presente invenção pode ser útil para prevenir a infecção nos animais que têm o risco de infecção. Os polipeptídeos de bG-CSF da presente invenção podem ser administrados a animais que têm uma infecção. As infecções que podem ser tratadas com os polipeptídeos de bG-CSF da invenção incluem, mas não estão limitadas a, mastite e febre de transporte. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas e um dia antes do parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas e um dia antes do parto e, adicionalmente, administrado no dia do parto ou até uma semana após o parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas e um dia antes do parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre duas semanas e um dia antes do parto e, adicionalmente, administrado no dia do parto ou até uma semana após o parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes do parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes do parto e, adicionalmente, administrado no dia do parto ou até uma semana após o parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes do parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes do parto e, adicionalmente, administrado no dia do parto ou até uma semana após o parto.

[000640] Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrada a um animal entre duas semanas antes e no dia do transporte. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes do transporte. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal entre uma semana e um dia antes do transporte e, adicionalmente, administrado no dia do transporte ou até uma semana após a expedição.

[000641] Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal, sete dias antes do parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal, sete dias antes do parto e, adicionalmente, administrado no dia do parto ou até uma semana após o parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a um animal, sete dias antes do parto e, adicionalmente, administrado no dia do parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrada a um animal, sete dias antes do parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal uma semana antes do parto e, adicionalmente, administrado no dia do parto ou até uma semana após o parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a um animal uma semana antes do parto e, adicionalmente, administrado no dia do parto. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a uma vaca antes ou no dia do parto para prevenir a doença no bezerro. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a uma vaca antes ou no dia do parto para prevenir a doença no bezerro. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado a uma vaca antes do dia do parto para prevenir a doença no bezerro. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado a uma vaca antes do dia do parto para prevenir a doença no bezerro. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11;0,12;0,13;0,14;0,15;0,16;0,17;0,18;0,19;0,20;0,21;0,22; 0,23;0,24;0,25;0,26;0,27;0,28;0,29;0,30;0,31;0,32;0,33;0,34; 0,35;0,36;0,37;0,38;0,39;0,40;0,41;0,42;0,43;0,44;0,45;0,46; 0,47;0,48;0,49; ou 0,50 μg/kg. Emuma modalidade,o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49; ou 0,50 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG- CSF da presente invenção é PEGuilado e é administrado em uma dose de 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,15; 0,16; 0,17; 0,18; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22; 0,23; 0,24; 0,25; 0,26; 0,27; 0,28; 0,29; 0,30; 0,31; 0,32; 0,33; 0,34; 0,35; 0,36; 0,37; 0,38; 0,39; 0,40; 0,41; 0,42; 0,43; 0,44; 0,45; 0,46; 0,47; 0,48; 0,49; ou 0,50 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG- CSF PEGuilado da presente invenção é PEGuilado e é administrado em uma dose de 0,01;0,02;0,03;0,04;0,05;0,06;0,07;0,08;0,09; 0,10;0,11;0,12;0,13;0,14;0,15;0,16;0,17;0,18;0,19;0,20;0,21; 0,22;0,23;0,24;0,25;0,26;0,27;0,28;0,29;0,30;0,31;0,32;0,33; 0,34;0,35;0,36;0,37;0,38;0,39;0,40;0,41;0,42;0,43;0,44;0,45; 0,46;0,47;0,48;0,49; ou 0,50 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 0,01 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 0,01 μg/kg.

[000642] Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; ou 1,0 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8, ou 1,0 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é PEGuilado e é administrado em uma dose de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; ou 1,0 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG- CSF PEGuilado da presente invenção é PEGuilado e é administrado em uma dose de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; ou 1,0 μg/kg. Em uma modalidade,o polipeptídeodebG-CSFdapresente invençãoé administradoemuma dosede0,1μg/kg.Emuma modalidade,o polipeptídeodebG-CSFPEGuilado dapresente invençãoé administradoemuma dosede0,1μg/kg.Emuma modalidade,o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 0,2 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 0,2 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invençãoéadministradoemumadosede0,3μg/kg.Emuma modalidade,o polipeptídeo debG-CSF PEGuilado da presente invençãoéadministradoemumadosede0,3μg/kg.Emuma modalidade,o polipeptídeodebG-CSF da presente invençãoé administradoem uma dosede0,4 μg/kg. Em uma modalidade,o polipeptídeode bG-CSFPEGuilado da presente invençãoé administradoem uma dosede0,4 μg/kg. Em uma modalidade,o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 0,5 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 0,5 μg/kg.

[000643] Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção éadministrado em umadose de 1,2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22,23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 1,2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22,23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,1, 2, 3,4, 5, 6,7, 8, 9,10,11, 12, 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49, 50,51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 10 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 10 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 20 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 20 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 30 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 30 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dose de 40 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose de 40 μg/kg. Em uma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado emumadose de50μg/kg.Emuma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado emumadose de50μg/kg.Emuma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF da presente invenção é administrado em uma dosemaiordo que0,5μg/kg.Emuma modalidade, o polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado da presente invenção é administrado em uma dose maior do que 0,5 μg/kg.

[000644] As composições farmacêuticas contendo bG-CSF podem ser formuladas em uma quantidade eficaz para a administração, por vários meios um animal experimentando distúrbios caracterizados pela baixa produção de glóbulos brancos do sangue ou com produção defeituosa de glóbulos brancos do sangue, seja isoladamente ou como parte de uma condição ou distúrbio. As quantidades médias do bG- CSF podem variar e, em especial, devem basear-se nas recomendações e prescrições de um médico veterinário qualificado. A quantidade exata de bG-CSF é uma questão de preferência sujeita a fatores como o tipo exato de condição a ser tratada, a condição do animal a ser tratado, assim como dos outros ingredientes na composição. A invenção também fornece a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um outro agente ativo. A quantidade a ser administrada pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica com base na terapia com bG-CSF. O bG-CSF da presente invenção pode, assim, ser usado para estimular a produção de glóbulos brancos e corrigir níveis de glóbulos vermelhos deprimidos. Mais comumente, os níveis de glóbulos brancos são diminuídos devido ao câncer, infecção ou quimioterapia. Também são condições tratáveis que podem levar a neutropenia em um animal saudável, tal como um tratamento antecipado com agentes anticâncer. Em geral, qualquer doença tratável com hG-CSF também pode ser tratada com o bG-CSF e/ou conjugados de PEG: bG-CSF da presente invenção. A invenção também fornece a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um outro agente ativo, tal como um agente quimioterápico anticâncer. A quantidade a ser administrada pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na arte com base em terapia com bG-CSF.

[000645] As composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas de forma convencional.

EXEMPLOS

[000646] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não estão limitados a invenção reivindicada.

Exemplo 1 Seleçãode Sítio para aIncorporação de AminoácidosCodificados de Forma Não Natural em bG-CSF

[000647] Este exemplo descreve alguns dos muitos conjuntos potenciais de critérios para a seleção dos sítios de incorporação de aminoácidos codificados de forma não natural em bG-CSF.

[000648] Um modelo teórico de GCSF bovino foi gerado usando a estrutura de cristal de GCSF humano ligada a receptores (PDB ID No. 2D9Q). As coordenadas para essa estrutura de GCSF humano estão disponíveis no Protein Data Bank (Banco de Dados de Proteína) (PDB) (Bernstein et al. J. MoI. Biol. 1997, 112 pp 535). Os resíduos potenciais substituição incluem, mas não estão limitados a sítios de substituição conservativa e resíduos com maior acessibilidade do solvente usando o programa Cx (Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18(7) :980-4). Os sítios de substituição conservativas identificados para substituição com para-acetilfenilalanina incluem, mas não estão limitados a, tirosina, fenilalanina e resíduos de arginina, que contêm um núcleo hidrofóbico com ou sem carga. Os resíduos que podem ser estruturalmente relevantes não foram selecionados para a substituição incluindo, mas não limitados a glicinas, prolinas e os resíduos envolvidos na forma espiral (hélice) e cobertura (capping). Os resíduos nas regiões conhecidas de ligação ao receptor também não foram selecionados para substituição. A posição 123 (ASP) e a posição 141 (Thr) de SEQ ID NO: 1 podem ser críticas para a interação com um receptor. A posição 7 (Arg) pode ser crítica para o dobramento do polipeptídeo. A posição 133 (Thr) é o sítio de glicosilação O-ligado no G-CSF humano.

[000649] Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições no bG-CSF: antes da posição 1 (ou seja, no N- terminal), 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22,23,24,25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33,34, 35, 36,37, 38,39,40,41,42,43, 44, 45, 46, 47,48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ,55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75,76,77,78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,86, 87, 88,89, 90, 91,92, 93,94,95,96, 97, 98, 99, 100, 101,102,103, 104 ,105, 106, 107, 108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121, 122,123,124,125,126,127,128,129 ,130,131,132,133,134,135, 136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149, 150, 151, 152, 153, 154 , 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF).

[000650] Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98 , 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados em uma ou mais das seguintes posições do bG-CSF, 62, 133, e uma combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados na posição 62 do bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados na posição 133 do bG-CSF (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, os polipeptídeos da invenção compreendem uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido natural. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos não naturais são incorporados em uma sequência líder ou sinal que é N ou C terminal para as SEQ ID NOs: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF.

[000651] Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a, posições: antes da posição 1 (ou seja, no N-terminal), 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 10O5 101, 102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115, 116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129, 130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143, 144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157, 158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171, 172,173,174,175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF).

[000652] Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a, posições: 3, 7, 11, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 98, 99, 123, 124, 125, 133, 134, 136, 141, 159, 166, 169, 170, 173, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a posições: 3, 7, 33, 43, 58, 62, 67, 69, 99, 123, 124, 133, 134, 141, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a posições: 3, 7, 62, 133, 166, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural em uma ou mais destas posições é ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não limitado a, 62,133, e uma combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural na posição 62 é ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural na posição 133 é ligado a um polímero solúvel em água (SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente na SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o aminoácido que ocorre de forma não natural na sequência sinal ou líder N- ou C-terminal das SEQ ID NOs: 1, 2, ou outra sequência de bG-CSF é ligado a um polímero solúvel em água.

Exemplo 2 Clonagem e Expressão de um Polipeptídeo de bG-CSFContendo um Aminoácido Codificado de Forma não Natural e Produzida em E. coli

[000653] Este exemplo detalha a clonagem e a expressão de um polipeptídeo de bG-CSF, incluindo um aminoácido codificado de forma não natural em E. coli e os métodos para avaliar a atividade biológica dos polipeptídeos de bG-CSF modificados.

[000654] Os métodos de clonagem de bG-CSF são conhecidos por aqueles de competência comum na arte. As sequências de polipeptídeos e polinucleotídeos para bG-CSF e clonagem de bG-CSF em células hospedeiras, bem como para a purificação do bG-CSF estão detalhadas na Patente US No. 5.849.883, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, e Heidari et al. Veterinary Immunology and Immunopathology (2001) 81:45-57.

[000655] O bG-CSF maduro que codifica cDNA é mostrado como SEQ ID NO: 3. O polipeptídeo codificado por essa sequência é mostrado como SEQ ID NO: 1.

[000656] O bG-CSF maduro que codifica cDNA com uma metionina no N terminal é mostrado como SEQ ID NO: 4. O polipeptídeo codificado por essa sequência é mostrado como SEQ ID NO: 2.

[000657] Um sistema de tradução introduzido, que compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e um aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O- RS), é usado para expressar o bG-CSF contendo um aminoácido codificado de forma não natural. O O-RS preferencialmente aminoacila o tRNA-O com um aminoácido codificado de forma não natural. Por sua vez, o sistema de tradução insere o aminoácido codificado de forma não natural no bG-CSF, em resposta a um códon seletor codificado. As sequências de O-tRNA e O-RS são descritas no WO 2006/068802 intitulado "Compositions of Aminoacyl-tRNA-synthetase and Uses Thereof” (Composições do aminoacil-tRNA Sintetase e Usos dos mesmos (E9 - SEQ ID NO: 22 & mutante D286R de E9 - SEQ ID NO: 24 neste pedido de patente) e WO 2007/021297 intitulado “Compositions of tRNA and Uses Thereof” (Composições de tRNA e seus Usos) (F13, SEQ ID NO: 23 neste pedido), que são incorporados aqui por referência na sua totalidade.Tabela 2: Sequências de O-tRNA e S-RS.

[000658] A transformação de E. coli com o plasmídeo contendo a sequência de polinucleotídeo de bG-CSF modificado e o par de aminoacil tRNA sintetase ortogonal/tRNA (específico para o aminoácido codificado de forma não natural desejado) permite a incorporação sítio-específica de aminoácidos codificados de forma não natural no polipeptídeo de bG-CSF. O plasmídeo usado para a expressão do bG-CSF é mostrado na Figura 1. O gene de interesse mostrado como um exemplo é o bG-CSF com um códon seletor (âmbar), que substitui o T133 que codifica o códon. O polipeptídeo com para-cetilfenilalanina na posição 133 é referido como bG-CSF T133pAF. P1pp - promotor de E. coli constitutiva; Pró cluster - conjunto de cópias de tRNA prolina de E. coli; cluster F13 - cópias em tandem de uma tRNA tirosina de Methanococcus jannaschi modificadas a partir do WO 2007/021297; E9 RS (D286R) tRNA tirosil de Methanococcus jannaschi WO 2006/068802; promotor pró T7; terminador T7; ori - origem de replicação; sequência bla (ap) - genes de resistência a ampicilina.

[000659] Os polinucleotídeos que codificam bG-CSF tipo selvagem ou um dos 15 polipeptídeos mutantes foram clonados e, subsequentemente, subclonados no vetor pVK6 por Codon Devices, Inc. Cada construção gerada tinha um códon seletor e um códon âmbar, em posição diferente. Os polipeptídeos de bG-CSF resultantes tinham o aminoácido codificado de forma não natural, para- acetilfenilalanina (pAF; pAcF), substituído pelo aminoácido codificado de forma natural em uma das seguintes posições: L3, R7, E33, H43, Q58, S62, Q67, L69, L99, D123, L124, T133, Q134, T141 e RL66 (os números da posição se referem a SEQ ID NO: 1). Uma vez que cada um dos polipeptídeos de b-GCSF mutantes gerados tinha uma metionina no N-terminal (ver SEQ ID NO: 2 para a sequência do tipo selvagem de G-CSF bovino com a metionina no N-terminal), os polipeptídeos de b-GCSF expressos tinham substituições de aminoácidos não naturais na posição de número +1 (por exemplo, um mutante teve a leucina na posição 4 da SEQ ID NO: 2 substituída por pAF). Após a verificação de sequência, os plasmídeos foram transformados em células W3110 B2, e as colônias foram crescidas em placas de ampicilina. A informação da linhagem celular de E. coli é mostrada como Figura 2. Estas colônias foram usadas para inocular 5 mL de LB com diluição de 1:1000 das culturas de ampicilina, as quais foram crescidas a 37 °C para um O.D.600 = 0,8. A pAF (para- acetilfenilalanina) foi então adicionada à 15 culturas diferentes para uma concentração final de 4 mM. Após aproximadamente 30 minutos, as culturas foram induzidas com L-arabinose para uma concentração final de 0,2%, e as culturas foram incubadas a 37 °C por mais 5 horas. Neste momento, uma amostra de 500 μL foi tomada de cada cultura e centrifugada a 13.000 rpm por 4 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pélete foi ressuspenso em 150 μL de B-PER, com 1 μL de DNAse e incubado à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, o tampão de amostra de LDS 4X (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi adicionado, as amostras foram aquecidas a 95°C por 5 minutos, e o agente redutor de amostra 10X (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi adicionado. As amostras foram então resolvidas por SDS- PAGE em géis com gradiente de 4 - 12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) em tampão MES e visualizadas usando Simply Blue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA). A Figura 3 mostra as amostras geradas a partir de culturas de bG-CSF mutantes tipo selvagem após a análise em géis com gradiente de 4 - 12% e coloração com Coomassie.

Solubilização Prep de Corpo de Inclusão

[000660] A pasta celular foi ressuspensa pela mistura com um sólido final a 10% em Tampão I de corpos de inclusão (IB) a 4 °C (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 a 1%; 4 °C).

[000661] As células foram lisadas pela passagem de material ressuspenso através de um microfluidizador por um total de duas vezes. As amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos, 4°C, e o sobrenadante foi decantado. O pélete de corpo de inclusão (IB) foi lavado pela ressuspensão em um volume adicional de Tampão I de IB (Tris 50mM pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA1 mM, Triton X-100 a 1%;4°C) e o material ressuspenso foi passado através de um microfluidizador por um total de duas vezes. As amostras foram então centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi decantado. O pélete de IB foi ressuspenso em um volume de tampão II (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM; 4°C). Após a ressuspensão, as amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi decantado. O pélete de IB foi então ressuspenso em 1/2 volume de tampão II (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM; 4°C). O IB foi então aliquotado em recipientes apropriados. As amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 15 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi decantado, os corpos de inclusão foram então solubilizados e armazenados em 80°C até uso adicional.

Solubilização de Corpos de Inclusão

[000662] Os corpos de inclusão foram solubilizados a uma concentração final entre 10 - 15 mg/mL em tampão de solubilização (Tris 20 mM, pH 8,0; Guanidina 8 M; β-ME 10 mM). Os IB solubilizados foram incubados em temperatura ambiente sob agitação constante durante 1 hora ou até que eles fossem totalmente solubilizados. A concentração de proteína era ajustada por diluição com tampão de solubilização adicional se a concentração de proteína fosse elevada.

Redobramento

[000663] O redobramento foi realizado pela diluição das amostras para uma concentração final de proteína de 0,5 mg/mL em Arginina 0,5 M, pH 8,0; 4°C. As amostras foram deixadas redobrar por 48 a 72 horas a 4°C.

Purificação

[000664] O (NH4)2SO4 sólido foi adicionado às amostras para uma concentração final de 20% sob agitação branda. As amostras foram homogeneizadas a 4°C por 30 minutos. A proteína precipitada (contendo bG-CSF) foi peletizada por centrifugação a 12.000 g por 15 minutos. O sobrenadante foi removido e o pélete foi ressuspenso em ^ de volume de redobramento de NaAc 20 mM, pH 4,5. Todos os péletes não voltaram para a solução. Apenas o bG-CSF voltou para a solução. O material não solubilizado foi peletizado por centrifugação a 12.000 g por 15 minutos. As amostras foram decantadas, e o sobrenadante foi recolhido. O material de bG-CSF foi filtrado através de um filtro de 0,45 μm. O material foi, então, colocado sobre uma coluna CM FF (GE Healthcare), equilibrada em tampão A (NaAc 20 mM, pH 4,5). O material foi < 10 m/s antes de carregar na coluna. O bG-CSF foi eluído da coluna com um gradiente linear sobre 10 volumes da coluna para tampão B a 100% (NaAc 20 mM, pH 4,5, NaCl 500 mM). A Figura 4 mostra análise SDS-PAGE colorida com Coomassie das frações de pico a partir da execução da coluna CM FF com bG-CSF - T133pAF.

PEGuilação e Purificação

[000665] O pH do agrupamento (pool) CM foi ajustado para pH 4,0 com ácido acético glacial a 50%. O agrupamento foi então concentrado para, aproximadamente, 4,0 mg/mL de proteína. Um excesso molar de 12:1 ou 8:1 de hidroxilamina PEG: bG-CSF foi adicionado ao agrupamento. A mistura foi incubada a 28°C por 48 - 72 horas. As misturas foram então diluídas de 8 - 10 vezes com água (< 8 m/s) e, em seguida, foram carregadas sobre uma coluna de SP HP (GE Healthcare), equilibrada em tampão A (NaAc 20 mM, pH 4,5). O bG-CSF PEGuilado foi eluído com um gradiente linear sobre 40 volumes de coluna de tampão B 100% (NaAc 20 mM, pH 4,5; NaCl 500 mM). A Figura 5 mostra a análise de SDS-PAGE das frações de pico da coluna HP SP para bG-CSF PEGuilado-T133pAF. Etileno glicol 5%, por exemplo, também pode ser usado no tampão de eluição.

[000666] As frações de bG-CSF PEGuilado foram agrupadas e dialisadas contra formulação de tampão de bG-CSF (NaAc 4,26 mM, pH 4,0; NaCl 0,565 mM, Tween 20 a 0,0033%, sorbitol a 5%). O material de PEG foi concentrado entre 6 - 8 mg/mL de proteínas e foi filtrado de forma estéril por filtração usando filtro PES de 0,22 μm. A proteína foi armazenada a 4°C ou congelada com flash e armazenada em 80°C para o armazenamento prolongado. A Figura 6 mostra a análise de SDS-PAGE de b-GCSF antes e depois da PEGuilação. Corrida 1: bG-CSF-T133pAF; Corrida 2: bG-CSF-T133pAF-20KPEG; Corrida 3: SeeBlue Plus 2 marcador de peso molecular.

Mapeamento de Peptídeos (Tripsina / Endoproteinase Glu-C) do bG-CSF

[000667] O mapeamento do peptídeo foi realizado para confirmar a incorporação de para-acetilfenilalanina (pAF) em um polipeptídeo de bG-CSF. O bG-CSF T133pAF purificado antes da PEGuilação e o bG- CSF do tipo selvagem foram diluídos para uma concentração final de guanidina-HCl 6M, Tris 50 mM pH 7,8 e reduzido com DTT 10 mM a 37 °C por uma hora. A amostra foi alquilada com IAA 20 mM por 40 minutos no escuro à temperatura ambiente, e a reação foi temperada com a adição de DTT 20 mM final. O material foi dialisado em bicarbonato de amônio 100 mM pH 7,7 e tratado com tripsina 1:50 (proteína:enzima) por quatro horas a 37°C. Esta reação foi seguida com a adição de Glu-C 1:20 durante a noite a 25°C. A digestão foi temperada com a adição de TFA para uma concentração final de 0,1%. A amostra foi aplicada em uma coluna de fase reversa Grace C8 Vydac em tandem espectrômetro de massas com captura de íons ThermoFinnigan Deca LCQ. O gradiente iniciou com 98% de fase móvel A (TFA a 0,05% em água) isocraticamente por oito minutos e, em seguida, aumentou para 60% da fase móvel B (TFA a 0,05% em acetonitrila) durante 90 minutos, com detecção a 214 nm e 250 nm. A vazão de 0,2 mL/min e temperatura da coluna de 40°C foram aplicadas. A tensão capilar foi ajustada para 15V com uma faixa completa de varredura de 100 - 2000 m/z. A tensão de colisão para o MS/MS foi de 42% do normalizado.

[000668] A Figura 7a mostra a digestão de tripsina/Glu-C do bG-CSF tipo selvagem (detecção de 214 nm). A Figura 7b mostra a digestão de tripsina/Glu-C do bG-CSF T133pAF (detecção de 214 nm). A hidrofobicidade aumentada da substituição de treonina para pAF (para-acetilfenilalanina) é mostrada. Para o bG-CSF tipo selvagem, o tempo de retenção do peptídeo contendo T133 foi 42,79 minutos; para o bG-CSF T133pAF, o peptídeo contendo T133pAF foi deslocado e teve um tempo de retenção de 46,89 minutos.

[000669] A Figura 8 mostra a digestão de tripsina/Glu-C do bG-CSF tipo selvagem (detecção de 250 nm). A Figura 8b mostra a digestão de tripsina/Glu-C do bG-CSF T133pAF (detecção de 250 nm). Com a análise a 250 nm, os sinais de proteína/peptídeo são baixos, mas o sinal devido a pAF é forte. O peptídeo contendo T133 pAF é indicado na Figura 8b com um tempo de retenção de 46,89 minutos.

Mapeamento de Peptídeos (Endoproteinase Glu-C) de bG-CSF

[000670] O bG-CSF T133pAF purificado antes PEGuilação foi diluído para uma concentração final de guanidina-HCl 6M, Tris 50 mM pH 7,8 e reduzido com 10 mM DTT a 37°C por uma hora. A amostra foi alquilada com IAA 20 mM por 40 minutos no escuro à temperatura ambiente, e a reação foi aquecida bruscamente com a adição de DTT 20 mM final. O material foi dialisado em bicarbonato de amônio 100 mM pH 7,7 e tratado com Glu-C 1:20 (proteína enzimática) durante a noite a 25 °C. A digestão foi temperada com a adição de TFA para uma concentração final de 0,1%. A amostra foi aplicada em uma coluna de fase reversa Vydac Grace C8 em tandem com o espectrômetro de massas com captura de íons ThermoFinnigan Deca LCQ. O gradiente iniciou com 98% de fase móvel A (TFA 0,05% em água) isocraticamente por oito minutos e, em seguida, aumenta para 60% da fase móvel B (TFA 0,05% em acetonitrila) durante 90 minutos, com detecção a 214 nm e 250 nm. A vazão de 0,2 mL/min e temperatura da coluna de 40°C foram aplicadas. A tensão capilar foi ajustada para 15V com faixa completa de varredura de 100 - 2000 m/z. A tensão de colisão para o MS/MS foi 42% do normalizado.

[000671] A Figura 9 mostra a digestão de Glu-C do bG-CSF tipo selvagem (Detecção de 214 nm). A Figura 9b mostra a digestão de Glu-C do bG-CSF T133pAF (detecção de 214 nm). Para o bG-CSF tipo selvagem, o peptídeo contendo T133 teve um tempo de retenção de 52,04 minutos; para T133pAF bG-CSF5, o peptídeo contendo T133pAF teve um tempo de retenção de 53,95 minutos.

[000672] A Figura 10a mostra a digestão de Glu-C do bG-CSF tipo selvagem (Detecção de 250 nm). A Figura 10b mostra a digestão de Glu-C do bG-CSF T133pAF (detecção de 250 nm). Com a análise a 250 nm, os sinais de proteína/peptídeo são baixos, mas o sinal devido a pAF é forte. O peptídeo contendo T133 pAF é indicado na Figura 10b com um tempo de retenção de 53,95 minutos.

Análise de RP-HPLC e SEC-HPLC de Polipeptídeos de bG-CSF

[000673] O RP-HPLC e o SEC-HPLC foram usados para analisar a pureza e determinar a identidade das amostras após a purificação. O PEG-bG-CSF T133pAF 20 K purificado foi diluído a 1 mg/mL com o formulação de tampão (acetato de sódio 4,26 mM pH 4,0, cloreto de sódio 0,565 mM, Tween-20 a 0,0033% e sorbitol a 5%) e 10 μL foi injetado em uma coluna de fase reversa amplo poro de Octil (C8), J.T. Baker, (4,6 x 100 mm, 5 μm). O gradiente iniciou com 50% de fase móvel A (TFA a 0,1% em água) e aumentado para 70% da fase móvel B (TFA a 0,1% em acetonitrila) durante 26 minutos. A coluna foi regenerada com 90% de fase B por 4 minutos e re-equilibrada com 50% de fase móvel A durante 5 minutos. A vazão de 1,5 mL/min e temperatura da coluna de 60°C foram aplicadas com detecção em 214 nm. A análise foi realizada usando software Agilent Chemstation. A Tabela 3 mostra o pico principal (PEG-bG-CSF T133pAF 20K) com um tempo de retenção de 8,50 minutos. Pelo cálculo do percentual de área (%), 91,2% da amostra foi de bG-CSF PEguilado.

[000674] O bG-CSF que não foi PEGuilado foi também analisado por RP-HPLC. A Tabela 4 mostra o pico principal (bG-CSF T133pAF) com um tempo de retenção de 8,893 minutos. Pelo cálculo do percentual de área (%), 64,3% da amostra foi bG-CSF T133pAF.

[000675] O PEG-bG-CSF T133pAF purificado 20 K foi também analisado por SEC-HPLC. A amostra foi injetada pura (2 μL) em uma coluna de dimensionamento Tosohaas TSK Super SW3000 (4,6 x 300 mm, 4 μm 250 Â) usando um gradiente isocrático de 25 minutos. A fase móvel contém 97% de fosfato de sódio de 63 mM pH 7,0 e 3% de 2-propanol. A vazão de 0,3 mL/min e temperatura da coluna de 25°C foram aplicadas com detecção em 214 nm. A análise foi realizada usando software Agilent Chemstation. A Tabela 5 mostra o pico principal com um tempo de retenção de 9,157 minutos. Pelo cálculo do percentual de área (%),98,3% da amostra foi PEG-bG-CSFmonomérico. Ver Figura 11 para a análise da SEC-HPLC do polipeptídeo PEGuilado.

[000676] O bG-CSF que não foi PEGuilado foi também analisado por SEC-HPLC. A Tabela 6 mostra o pico principal com um tempo de retenção de 13,125 minutos. Pelo cálculo do percentual de área (%), 99,0% da amostra foi bG-CSF T133pAF monomérico. Ver Figura 12 para a análise da SEC-HPLC do polipeptídeo.

[000677] A análise de alta precisão por ESI-TOF (Agilent Tecnologia) do polipeptídeo de bG-CSF também foi realizada para confirmar a identidade do polipeptídeo de bG-CSF. O bG-CSF T133pAF purificado foi dialisado em ácido fórmico 0,1%. A amostra foi aplicada em um cartucho C-18 por um minuto com água e então eluída com acetonitrila a 50% em água. O tempo total de execução foi de três minutos com uma vazão de 0,3 mL/min. A tensão capilar ESI foi ajustada para 4 kV, e a tensãodo fragmentor MSTOF foi ajustada em 300 V. O envelope do estado de carga varrido foi desconvoluído para fornecer um valor MH+. O MW esperado era MH+ 19,145. O MW MH + observado foi 19146.

Ensaio de Proliferação M -NFS60

[000678] Para avaliar a potência das moléculas de bG-CSF, um ensaio de proliferação foi realizado com a linhagem celular M NFS60. A linhagem celular foi adquirida de ATCC (catálogo # CRL-1838). As células foram descongeladas e mantidas em RPMI 1640 + SFB 10% + de penicilina/estreptomicina + 2-mercaptoetanol 50 uM + 20 ng/mL de mIL-3 (Invitrogen, Carlsbad, CA; mIL3 de BD PharMingen cat. # 554579). As células foram divididas a cada dois dias e semeadas em 0,02 x 106 células/mL.

[000679] Um dia antes do ensaio, as células foram divididas para 0,1 x 106 células/mL. Após 16 - 24 horas, as células foram semeadas em meio de ensaio em placas com 96 poços de fundo plano, pretas em 10.000 células/poço e as diluições dos compostos de bG-CSF foram adicionadas em duplicata. O volume total por poço foi 100 uL e o meio de ensaio foi RPMI 1640 + SFB 10% + P/S. Padrões, tais como Neupogen® e WT bG-CSF, foram adicionados em duplicata para cada placa também. As placas foram então incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 42 horas. Após estas 42 horas de incubação 10 uL/poço de Alamar Blue (Biosource cat. #: DAL1100) foi adicionado, e as placas foram incubadas por mais 6 horas a 37°C, 5% de CO2. As placas foram, então, centrifugadas (spun down) a 4000 rpm por 2 minutos em temperatura ambiente para se livrar de quaisquer bolhas de ar. As placas foram lidas no fluorímetro Tecan com excitação de 535 nm, e emissão a 590 nm. As placas foram embrulhadas em papel alumínio para evitar exposição à luz ao corante azul Alamar sensível à luz.

[000680] Para análise dos dados, as diluições seriais em duplicata para cada composto foram medidas, e os valores de EC50 foram calculados em SigmaPlot. Os valores de EC50 da matéria-prima foram listados para todos os compostos, e as diferenças de vezes foram calculadas (compostos de GCSF bovino PEGuilado foram comparados a WT bG-CSF). Os experimentos foram executados múltiplas vezes para estabelecer um CV <20% intraensaio e um CV <30% interensaio. A Figura 13 /Tabela 7 = ensaio de proliferação de M NFS60 - valores de EC50 da matéria-prima de G-CSF T133pAF PEGuilado bovino 20K e do tipo selvagem. A Figura 14/Tabela 8 = ensaio de proliferação M-NFS60 - vezes de diferenças de EC50 de G- CSF T133pAF bovino PEGuilado 20K vs tipo selvagem.

[000681] Outras moléculas de bG-CSF compreendendo uma substituição de aminoácido codificado de forma não natural foram ensaiadas. A Tabela 9 mostra os valores médios de EC50 obtidos.

Coloração de CD11b de Neutrófilos Bovinos

[000682] 50ul de sangue bovino foram adicionados a uma placa com 96 poços com poliestireno não-tratado (Cal Poly Pomona). As células foram estimuladas pela adição de 50ul de Neupogen®, Neulasta®, ou bG-CSF-T133pAcF- PEG 20K diluído em SFB (200 ng/ml a 0,001 ng/ml final). A solução foi levemente misturada e incubada por 30 minutos a 39°C em uma incubadora de CO2. 20 ug/ml do anticorpo primário foram adicionados às células (anti-CD11b bovino de camundongo: MM12A, VMRD). As células foram incubadas a 4°C por 30 minutos. A placa de ensaio foi centrifugada a 800 x g por 2 minutos, e o sobrenadante foi descartado. Os eritrócitos foram lisados por 1 minuto pela adição de 150 ul de solução de lise fria (fosfato 0,15 M, pH 7,2), e a isotonicidade foi restaurada pela adição de 50 ul de solução restauradora (fosfato 0,15 M, NaCl 0,5 M, pH 7,4). A placa foi novamente centrifugada, e o sobrenadante foi descartado. O procedimento de lise foi repetido até que todas as células vermelhas do sangue que eram visíveis foram removidas. As células foram lavadas com 200 ul de tampão FACS duas vezes (1 x PBS, HEPES 2,5 mM, azida sódica 0,1%, SFB 2,0%) e ressuspensas em tampão 100 ul de FACS. 20 ug/ml do anticorpo secundário (IgG1 de cabra anti- camundongo, ads-PE humana) foram adicionados e incubados a 4°C por 30 minutos no escuro. As células foram centrifugadas e lavadas duas vezes e ressuspensas em 200ul de tampão FACS. O instrumento de arranjo BD FACS foi usado para aquisição de 50.000 eventos e contagens de células CD11b-positivas.

[000683] A Figura 15 mostra os resultados do experimento em que os neutrófilos de bovinos foram corados com o anticorpo de CD11b para avaliar a sua capacidade de resposta às várias moléculas. A Intensidade Fluorescente Média (IFM) para granulócitos foi usada para determinar o nível de apresentação CD11b na superfície da célula. A %MFI é um valor normalizado em relação a um grupo controle não estimado. As curvas de dose resposta e valores de EC50 foram gerados para Neupogen, Neulasta e bG-CSF T133pAF- PEG 20K com base em um ajuste de 4 parâmetros. O valor de EC50 para Neupogen® foi de 3,18 ng/ml. Para Neulasta®, o valor de EC50 foi 2,84 ng/ml, e para bG-CSF T133pAF- PEG 20K o valor de EC50 foi 6,23 ng/ml.

Exemplo 3 Introdução de um Aminoácido Contendo Carbonil e Reação Subsequente com um PEG Contendo Amino-oxi

[000684] Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipeptídeo de bG-CSF que incorpora um aminoácido codificado de forma não natural contendo cetona que é subsequentemente reagido com um PEG contendo amino-oxi de aproximadamente 5.000 MW. Cada um dos resíduos antes da posição 1, (ou seja, no N-terminal) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60, 61, 62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79, 80, 81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126, 127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140, 141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154, 155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF) é substituído separadamente com um aminoácido codificado de forma não natural com a seguinte estrutura:

[000685] As sequências usadas para incorporação sítio-específica de p-acetil-fenilalanina em bG-CSF são SEQ ID NO: 3 ou 4 (bG-CSF), e SEQ ID NO: 23 ou 5 (muttRNA, M. jannaschii mtRNATyrCUA), e SEQ ID NOs: 22, 24, 17, 18, 19 (TyrRS LW1, 5 ou 6) descritas no Exemplo 2 acima.

[000686] Uma vez modificado, a variante de polipeptídeo de bG-CSF compreendendo o aminoácido contendo carbonil é reagido com um derivado de PEG contendo amino-oxi da forma: R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2 em que R é N-metil, n é 3 e N é de aproximadamente 5.000 PM (peso molecular). A b-acetilfenilalanina contendo bG-CSF purificado dissolvido em 10 mg/mL em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6,0, HEPES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7,0, ou em acetato de sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4,5, é reagido com um excesso de 10 a 100 vezes do PEG contendo amino-oxi, e então agitado por 10 - 16 horas em temperatura ambiente (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475). O PEG-b-GCSF é então diluído em tampão apropriado para a purificação e análise imediata.

Exemplo4 Conjugação com um PEG que Consiste em um Grupo Hidroxilamina Ligado ao PEG por meio de uma Ligação deAmida

[000687] Um reagente de PEG tendo a seguinte estrutura é acoplado a um aminoácido codificado de forma não natural contendo cetona usando o procedimento descrito no Exemplo 3: R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2 em que R = metil, n = 4 e N é de aproximadamente 20.000 PM. As condições de reação, purificação, análise são as descritas no Exemplo 3.

Exemplo 5 Introdução de Dois Aminoácidos Codificados de Forma Não Natural Distintos em Polipeptídeos de bG-CSF

[000688] Este exemplo demonstra um método para a geração de um polipeptídeo de bG-CSF, que incorpora aminoácidos codificados de forma não natural compreendendo uma funcionalidade de cetona em duas posições entre os seguintes resíduos: antes da posição 1, (ou seja, no N-terminal) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54, 55, 56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73, 74, 75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122, 123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136, 137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150, 151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou o aminoácido correspondente em outro polipeptídeo de bG-CSF). O polipeptídeo de bG-CSF é preparado conforme descrito nos exemplos 1 e 2, exceto que o códon seletor é introduzido em dois sítios distintos dentro do ácido nucléico.

Exemplo 6 Conjugação de Polipeptídeo de bG-CSF a um PEG contendo hidrazida e Subsequente Redução in situ

[000689] Um polipeptídeo de bG-CSF que incorpora um aminoácido contendo carbonil é preparado de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos 2 e 3. Uma vez modificado, um PEG contendo hidrazida tendo a seguinte estrutura é conjugado ao polipeptídeo de bG-CSF: R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)nX-NH-NH2 em que R = metil, n = 2 e N = 10.000 PM e X é um grupo carbonil (C = O). O bG-CSF purificadoa contendo p-acetilfenilalanina é dissolvido, entre 0,1 - 10 mg/mL em MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6,0, HEPES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7.0, ou em acetato de sódio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4,5, é reagido com um excesso de 1 a 100 vezes de PEG contendo hidrazida, e a hidrazona correspondente é reduzida in situ através da adição NaCNBH3 1M de estoque (Sigma Chemical, St. Louis, MO), dissolvido em H2O, para uma concentração final de 10 - 50 mM. As reações são realizadas no escuro a 4°C até temperatira ambiente (RT) por 18 - 24 horas. As reações são interrompidas pela adição de Tris 1 M (Sigma Chemical, St. Louis, MO) em torno de pH 7,6 a uma concentração final de Tris 50 mM ou diluído em tampão apropriado para purificação imediata.

Exemplo 7 Introdução de um Aminoácido Contendo Alquino em um Polipeptídeo de bG-CSF e Derivatização com mPEG-azida

[000690] Os resíduos a seguir, antes da posição 1, (ou seja, no N- terminal) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37, 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55, 56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,61,68,69,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121, 122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135, 136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149, 150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e uma combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF), são substituídos com os seguintes aminoácidos codificados de forma não natural:

[000691] As sequências usadas para incorporação sítio-específica de p-propargil-tirosina em bG-CSF são as SEQ ID NOs: 3 ou 4, SEQ ID NO: 5 (muttRNA, M. jannaschii mtRNATyrCUA), e 10, 11, 12 descritas noExemplo 2. O polipeptídeo de bG-CSF contendo a propargil tirosina é expresso em E. coli e purificado usando as condições descritas no Exemplo 3.

[000692] A bG-CSF purificado contendo propargil tirosina dissolvido entre 0,1 - 10 mg/ L em tampão PB (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 0,15 M, pH = 8) e um excesso de 10 a 1000 vezes de um PEG contendo azida é adicionado à mistura reacional. A quantidade catalítica de CuSO4 e fios de cobre é então adicionada à mistura reacional. Após isso, a mistura é incubada (incluindo mas não limitado a, cerca de 4 horas à temperatura ambiente ou 37°C, ou durante a noite de 4°C), H2O é adicionada e a mistura é filtrada através de uma membrana de diálise. A amostra pode ser analisada para a adição incluindo, mas não limitado a, através de procedimentos semelhantes aos descritos no Exemplo 3.

[000693] Neste exemplo, o PEG terá a seguinte estrutura: R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C (O)(CH2)n-N3, em que R é metil, n é 4 e N é de 10.000 PM.

Exemplo 8 A Substituição de um Aminoácido Hidrofóbico, grande, em um Polipeptídeo de bG-CSF com Propargil Tirosina.

[000694] O resíduo Phe, Tyr ou Trp presente dentro de uma das seguintes regiões do bG-CSF: antes da posição 1, (ou seja, no N- terminal) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 , 35, 36, 37, 38, 39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56, 57, 58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75, 76, 77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94, 95, 96,97,98,99, 100, 101,102, 103, 104,105, 106,107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149, 150, 151, 152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163, 164, 165, 166,167,168,169,170,171,172,173,174,175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO:1 ou osaminoácidos correspondentes naSEQID NO: 2 ou aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF) é substituído pelo seguinte aminoácido codificado de forma não natural como descrito no Exemplo 7:

[000695] Uma vez modificado, o PEG é fixo à variante de polipeptídeo de bG-CSF compreendendo o aminoácido contendo alquino. O PEG terá a seguinte estrutura:

[000696] Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3e os procedimentos de acoplamento seguem aqueles do Exemplo 7. Isso irá gerar uma variante de polipeptídeo de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural que é aproximadamente isostérica com um dos aminoácidos hidrofóbicos, grandes, que ocorrem de forma natural e que é modificado com um derivado de PEG em um sítio distinto dentro do polipeptídeo.

Exemplo 9 Geração de Um Homodímero, Heterodímero, Homomultímero ou Heteromultímero de Polipeptídeo de bG-CSF Separado por Um ou Mais Ligantes de PEG

[000697] A variante de polipeptídeo de bG-CSF contendo alquino produzida no Exemplo 7 é reagida com um derivado de PEG bifuncional da seguinte forma: N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)- (CH2)n-N3, em que n é 4 e o PEG tem um PM médio de cerca de 5.000, para gerar o homodímero de polipeptídeo de bG-CSF correspondente, em que duas moléculas de bG-CSF estão fisicamente separadas por PEG. De forma análoga um polipeptídeo de bG-CSF pode ser acoplado a um ou mais outros polipeptídeos para formar heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros.Oacoplamento, purificação e análise serão realizados como nos Exemplos 7 e 3.

Exemplo 10 Acoplamento de um Grupamento de Sacarídeo com Um Polipeptídeo de bG-CSF

[000698] Um dos seguintes resíduos é substituído com o aminoácido codificado de forma não natural abaixo: antes da posição 1 (ou seja, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37, 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55, 56, 57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74, 75, 76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109,1 10,111, 112,113,114, 115,116,117,118,119,120,121,122, 123,124,125,126,127,128,129,130,131, 132,133, 134 ,135,136, 137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150, 151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 (ou seja, no terminal carboxil da proteína), e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 1 ou os aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos correspondentes em outro polipeptídeo de bG-CSF), conforme descrito no Exemplo 3.

[000699] Uma vez modificado, a variante de polipeptídeo de bG-CSF compreendendo o aminoácido contendo carbonil é reagida com um análogo de amino-oxi β-ligado de N-acetilglucosamina (GIcNAc). A variante de polipeptídeo de bG-CSF (10 mg/mL) e o sacarídeo de aminooxi (21 mM) são misturados em tampão de acetato de sódio 100 mM aquoso (pH 5,5) e incubados a 37°C por 7 - 26 horas. Um segundo sacarídeo é acoplado ao primeiro de forma enzimática pela incubação do polipeptídeo de bG-CSF conjugado ao sacarídeo (5 mg/ml) com UDP- galactose (16 mM) e β-1,4- galacitosiltransferase (0,4 unidades/mL) em tampão HEPES 150 mM (pH 7,4) por 48 horas à temperatura ambiente (Schanbacher et al. J. Biol. Chem. 1970, 245, 5057 - 5061).

Exemplo 11 Geração de um Antagonista de Polipeptídeo de bG-CSF PEGuilado.

[000700] Um resíduo, incluindo mas não limitados a, aqueles envolvidos na ligação ao receptor de bG-CSF é substituído com o seguinte aminoácido codificado de forma não natural como descrito no Exemplo 3.

[000701] Uma vez modificado, a variante de polipeptídeo de bG-CSF compreendendo o aminoácido contendo carbonil será reagido com um derivado de PEG contendo amino-oxi da forma: R-PEG (N)-O-(CH2)n-(O)-NH2 em que R é metil, n é 4 e N é de 20.000 PM para gerar um antagonista de polipeptídeo de b-GCSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural que é modificado com um derivado do PEG em um sítio único no polipeptídeo. O acoplamento, purificação e análises são realizadas como no Exemplo 3.

Exemplo 12 Geração de um Homodímero, Heterodímero, Homomultímero ou Heteromultímero de Polipeptídeo de bG-CSF no qual as Moléculas de bG-CSF são Diretamente Ligadas

[000702] Uma variante de polipeptídeo de bG-CSF compreendendo o aminoácido contendo alquino pode ser acoplada diretamente a uma outra variante de polipeptídeo de bG-CSF compreendendo o aminoácido contendo azida. De forma análoga, um polipeptídeo de bG-CSF pode ser acoplado a um ou mais outros polipeptídeos para formar heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros. O acoplamento, purificação e análises são realizadas como nos Exemplos 3, 6 e 7.

Exemplo 13 PEG-OH + Br-(CH2)n-CECR' ^ PEG-O-(CH2)n-C ECR’ AB

[000703] O polialquileno glicol (P-OH) é reagido com o haleto de alquil (A) para formar o éter (B). Nestes compostos, n é um número inteiro de 1 a 9 e R’ pode ser um grupo heteroalquil ou alquil C1 a C20 de cadeia linear ou ramificada, saturado e insaturado. R’ também pode ser um heteroalquil ciclica ou alquil cíclico, saturado ou insaturado com C3 a C7, um grupo aril ou heteroaril substituído ou não substituído ou grupo heteroalcaril ou alcaril substituído ou não substituído (a alquil é um alquil saturado ou insaturado com C1 a C20). Normalmente, o PEG- OH é polietileno glicol (PEG) ou monometoxi polietileno glicol (mPEG), tendo um peso molecular de 800 a 40.000 Daltons (Da).

Exemplo 14 mPEG-OH + Br-CH2-CECH ^ mPEG-O-CH2-C ECH

[000704] O mPEG-OH com um peso molecular de 20.000 Da (mPEG-OH 20 kDa e 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL). Uma solução de brometo de propargil, dissolvido para uma solução de 80% em peso em xileno (0,56 mL, 5 mmol, 50 equiv., Aldrich), e uma quantidade catalítica de KI foram, em seguida, adicionados à solução e a mistura resultante foi aquecida sob refluxo durante 2 horas. Água (1 mL) foi então adicionada e o solvente foi removido sob vácuo. Para o resíduo foi adicionado CH2Cl2 (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca com Na2SO4 anidro, e o volume foi reduzido para aproximadamente 2 mL. Esta solução de CH2Cl2 foi adicionada a éter etílico (150 mL) gota a gota. O precipitado resultante foi coletado, lavado com várias porções de éter dietílico frio e seco para produzir propargil-O-PEG.

Exemplo 15 mPEG-OH + Br-(CH2)3-CECH ^ mPEG-O-(CH2)s-C ECH

[000705] O mPEG-OH com um peso molecular de 20.000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 nil). Cinquenta equivalentes de 5-bromo-1- pentino (0,53 mL, 5 mmol, Aldrich) e uma quantidade catalítica de KI foram, em seguida, adicionados à mistura. A mistura resultante foi aquecida sob refluxo por 16 horas. Água (1 mL) foi então adicionada e o solvente foi removido sob vácuo. Para o resíduo foi adicionado CH2Cl2 (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca com Na2SO4 anidro, e o volume foi reduzido a aproximadamente 2 mL. Esta solução de CH2Cl2 foi adicionada em éter etílico (150 mL) gota a gota. O precipitado resultante foi coletado, lavado com várias porções de éter dietílico frio e seco para produzir o alquino correspondente. O 5-cloro- 1-pentino pode ser usado em uma reação semelhante.

Exemplo 16 Produção de vídeo mPEG-O-CH2-C6H4θ-CH2-CECH (1)m-HOCH2C6H4OH + NaOH + Br- CH2-CECH ^ m- HOCH2C6H4O-CH2-CECH (2)m-HOCH2C6H4O-CH2-CECH + MsCl + N(Et)3 ^ m- MSOCH2C6H4O-CH2-CECH (3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-CECH+ LiBr ^ m-Br- CH2C6H4O-CH2-CE CH (4)mPEG-OH + m-Br-CH2CβH4O-CH2-CE CH ^ mPEG-O- CH2-C6H4O-CH2-CECH

[000706] Para uma solução de álcool 3-hidróxi benzílico (2,4 g, 20 mmol) em THF (50 mL) e água (2,5 mL) foi adicionado hidróxido de sódio em pó (1,5 g, 37,5 mmol) e, em seguida, uma solução de brometo de propargil, dissolvido para uma solução de 80% em peso, em xileno (3,36 mL, 30 mmol). A mistura foi aquecida sob refluxo por 6 horas. Para a mistura foi adicionado ácido cítrico 10% (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etila (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl (10 mL), secas sobre MgSO4 e concentradas para dar o álcool 3-propargiloxibenzílico.

[000707] O cloreto de metanossulfonil (2,5 g, 15,7 mmol) e trietilamina (2,8 mL, 20 mmol) foram adicionados a uma solução do composto 3 (2,0 g, 11,0 mmol) em CH2Cl2 a 0 °C e a reação foi colocada na geladeira por 16 horas. Uma prática usual produziu o mesilato como um óleo amarelo-pálido. Este óleo (2,4 g, 9,2 mmol) foi dissolvido em THF (20 mL) e LiBr (2,0 g, 23,0 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida sob refluxo durante uma hora e foi então resfriada à temperatura ambiente. Para a mistura foi adicionada água (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etila (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl (10 mL), secas com Na2SO4 anidro e concentradas para produzir o brometo desejado.

[000708] O mPEG-OH 20 kDa (1,0 g, 0,05 mmol, Sunbio) foi dissolvido em THF (20 mL) e a solução foi resfriada em banho de gelo. NaH (6 mg, 0,25 mmol) foi adicionado com agitação vigorosa durante um período de vários minutos, seguido da adição do brometo obtido acima (2,55 g, 11,4 mmol) e de uma quantidade catalítica de KI. O banho de resfriamento foi removido e a mistura resultante foi aquecida sob refluxo por 12 horas. Água (1,0 mL) foi adicionada à mistura e o solvente foi removido sob vácuo. Para o resíduo foi adicionado CH2Cl2 (25 mL) e a fase orgânica foi separada, seca com Na2SO4 anidro, e o volume foi reduzido a cerca de 2 mL. A adição gota a gota de uma solução de éter (150 mL) resultou em um precipitado branco, que foi coletado para produzir o derivado de PEG.

Exemplo 17 mPEG-NH2 + X-C(O)-(CH2)n-CECR’^ mPEG-NH-C(O)-(CH)n-C ECR’

[000709] Os polímeros de poli (etileno glicol) contendo alquino terminal também podem ser obtidos pelo acoplamento de um polímero de poli (etileno glicol) contendo um grupo funcional terminal com uma molécula reativa contendo a funcionalidade alquino, como mostrado acima, n é entre 1 e 10. R’ pode ser H ou um pequeno grupo alquil C1 a C4.

Exemplo 18 Produção de mPEG-NH-CQMCHh-C ECH (1) HO2C(CH2)2-CECH + NHS + DCC ^ NHSO-C(O)- (CH2)2-CECH (2) mPEG-NH2 + NHSO-C(O)-(CH2)2-CECH ^ mPEG-NH- C(O)-(CH2)2-C ECH

[000710] O ácido 4-pentinóico (2,943 g, 3,0 mmol) foi dissolvida em CH2Cl2 (25 mL). N-hidroxipucanimida (3,80 g, 3,3 mmol) e DCC (4,66 g, 3,0 mmol) foram adicionados e a solução foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. O éster NHS 7 bruto resultante foi usado na reação seguinte, sem purificação adicional.

[000711] O mPEG-NH2, com um peso molecular de 5.000 Da (mPEG-NH2, 1 g, Sunbio) foi dissolvido em THF (50 mL) e a mistura foi resfriada a 4°C. éster NHS 7 (400 mg, 0,4 mmol) foi adicionado pouco a pouco com agitação vigorosa. A mistura foi deixada em agitação durante 3 horas, enquanto aquecia até à temperatura ambiente. A água (2 mL) foi então adicionada e o solvente foi removido sob vácuo. Para o resíduo foi adicionado CH2Cl2 (50 mL) e a camada orgânica foi separada, seca com Na2SO4 anidro, e o volume foi reduzido a cerca de 2 mL. Esta solução de CH2Cl2 foi adicionada ao éter (150 mL) gota a gota. O precipitado resultante foi recolhido e seco em vácuo.

Exemplo 19 Preparação de Metanossulfonato ou Mesilato de Poli (etilenoglicol)

[000712] Este exemplo representa a preparação do metano sulfonil éster de (etileno glicol), que também pode ser referido como metanossulfonato ou mesilato de poli (etileno glicol). O tosilato e os haletos correspondentes podem ser preparados por procedimentos similares.mPEG-OH + CH3SO2CI + N(Et)3 ^ mPEG-O-SO2CH3 ^ mPEG-N3

[000713] O mPEG-OH (PM = 3.400, 25 g, 10 mmol) em 150 mL de tolueno foi destilada azeotropicamente por duas horas sob atmosfera de nitrogênio e a solução foi resfriada à temperatura ambiente. 40 mL de CH2Cl2 seco e 2,1 mL de trietilamina seca (15 mmol) foram adicionados à solução. A solução foi resfriada em banho de gelo e 1,2 mL de cloreto de metanossulfonil destilado (15 mmol) foi adicionado gota a gota. A solução foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de nitrogênio durante a noite, e a reação foi temperada pela adição de 2 mL de etanol absoluto. A mistura foi evaporada sob vácuo, para remover os solventes, principalmente aqueles diferentes de tolueno, filtrada, concentrada novamente sob vácuo e, em seguida, precipitada em 100 ml de éter etílico. O filtrado foi lavado com várias porções de éter dietílico frio e seco em vácuo para produzir o mesilato.

[000714] O mesilato (20 g, 8 mmol) foi dissolvido em 75 ml de THF e a solução foi resfriada a 4°C. Para a solução resfriada foi adicionada azida sódica (1,56 g, 24 mmol). A reação foi aquecida sob refluxo em atmosfera de nitrogênio por 2 horas. Os solventes foram evaporados e o resíduo foi diluído com CH2Cl2 (50 mL). A fração orgânica foi lavada com solução de NaCl e seca com MgSO4 anidro. O volume foi reduzido para 20 ml, o produto foi precipitado pela adição de 150 ml de éter seco e frio.

Exemplo 20 Produção de mPEG-O-CH2-C6H4-CH2θH (1)N3-C6H4-CO2H ^ N3-C6H4CH2OH (2)N3-C6H4CH2OH ^ BFCH2-C6H4-N3 (3)mPEG-OH + BPCH2-C6H4-N3 ^ mPEG-O-CH2-C6H4-N3

[000715] O álcool 4-azidobenzílico pode ser produzido usando o método descrito na Patente US 5.998.595, que é incorporada aqui por referência. O cloreto de metanossulfonila (2,5 g, 15,7 mmol) e trietilamina (2,8 mL, 20 mmol) foram adicionados a uma solução de álcool 4-azidabenzílico (1,75 g, 11,0 mmol) em CH2Cl2 a 0°C e a reação foi colocada em uma geladeira por 16 horas. Uma prática usual produziu o mesilato como um óleo amarelo pálido. Este óleo (9,2 mmol) foi dissolvido em THF (20 mL) e LiBr (2,0 g, 23,0 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida sob refluxo durante 1 hora e foi então resfriada a temperatura ambiente. Para a mistura foi adicionada água (2,5 mL) e o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi extraído com acetato de etila (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl (10 mL), secas com Na2SO4 anidro e concentradas para produzir o brometo desejado.

[000716] O mPEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) foi tratado com NaH (12 mg, 0,5 mmol) em THF (35 mL) e o brometo de (3,32 g, 15 mmol) foi adicionado à mistura juntamente com uma quantidade catalítica de KI. A mistura resultante foi aquecida sob refluxo por 12 horas. Água (1,0 mL) foi adicionada à mistura e o solvente foi removido sob vácuo. Para o resíduo foi adicionado CH2Cl2 (25 mL) e a camada orgânica foi separada, seca com Na2SO4 anidro, e o volume foi reduzido a cerca de 2 mL. A adição gota a gota de uma solução de éter (150 mL) resultou em um precipitado que foi coletado para produzir mPEG-O-CH2-C6H4-N3.

Exemplo 21 NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H + N3-CH2CH2CO2-NHS ^ N3- CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H

[000717] O NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H (PM = 3.400 Da, 2,0 g) foi dissolvido em uma solução aquosa saturada de NaHCO3 (10 mL) e a solução foi resfriada a 0°C. Propionato de 3-azida-1-N- hidroxisuccinimida (5 equiv.) foi adicionado com agitação vigorosa. Após 3 horas, 20 mL de H2O foram adicionados e a mistura foi agitada por um período adicional de 45 minutos em temperatura ambiente. O pH foi ajustado para 3 com H2SO4 0,5 N e NaCl foi adicionada a uma concentração de aproximadamente 15% em peso. A mistura reacional foi extraída com CH2Cl2 (100 mL x 3), seca em Na2SO4 e concentrada. Após precipitação com éter dietílico frio, o produto foi coletado por filtração e seco sob vácuo para produzir os derivados ômega-carbóxi- azida PEG.

Exemplo 22 mPEG-OMs + HC ECLi ^ mPEG-O-CH2-CH2-CECH

[000718] Para uma solução de acetileto de lítio (4 equiv.), preparada como é conhecido na arte e resfriada a -78°C em THF, é adicionada gota a gota uma solução de mPEG-OMS dissolvida em THF com vigorosa agitação. Após 3 horas, a reação é deixada aquecer à temperatura ambiente e temperada com a adição de 1 mL de butanol. 20 mL de H2O foram, então, adicionados e a mistura foi agitada por um período adicional de 45 minutos em temperatura ambiente. O pH foi ajustado para 3 com H2SO4 0,5 N e o NaCl foi adicionado a uma concentração de aproximadamente 15% em peso. A mistura reacional foi extraída com CH2Cl2 (100 mL x 3), seca sobre Na2SO4 e concentrada. Após precipitação com éter dietílico frio, o produto foi coletado por filtração e seco sob vácuo para produzir 1-(but-3-inilóxi) metóxipolietileno glicol (mPEG).

Exemplo 23 Incorporação de Aminoácidos Contendo Azida- e Acetileno-

[000719] Os aminoácidos contendo azida e acetileno podem ser incorporados de form sítio-seletiva em proteínas usando os métodos descritos em L. Wang, et al., (2001), Science 292:498 - 500, J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3(11):1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024: e, L. Wang, & P, G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1: 1-11. Uma vez que os aminoácidos foram incorporadas, a reação de cicloadição é realizada com a proteína em tampão fosfato (PB) 0,01 mM, pH 8, na presença de derivado de PEG 2 mM, CuSO4 1 mM, e aproximadamente 1 mg de fios de Cu por 4 horas a 37 °C.

Exemplo 24 Síntese de p-acetil-D,L-fenilalanina (pAF) e Derivados de mPEG-hidroxilamina

[000720] A pAF é sintetizada usando o procedimento descrito previamente em Zhang, Z., Smith, B. A. C, Wang, L., Brock, A., Cho, C, & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746.

[000721] Para sintetizar os derivados de m-PEG-hidroxilamina, os seguintes procedimentos foram completados. Para uma solução de ácido (N-t-Boc-amino-oxi) acético (0,382 g, 2,0 mmol) e 1,3-Di- isopropilcarbodiimida (0,16 mL, 1,0 mmol) em diclorometano (DCM, 70 mL), que é agitada em temperatura ambiente (RT) por 1 hora, metoxi poli (etileno glicol) amina (m-PEG-NH2, 7,5 g, 0,25 mmol, MT. 30 K, BioVectra) e Di-isopropiletilamina (0,1 mL, 0,5 mmol) foram adicionados. A reação é agitada à temperatura ambiente por 48 horas e, em seguida, é concentrada para cerca de 100 mL. A mistura é adicionada gota a gota para o éter frio (800 ml). O produto t-Boc- protegido é precipitado e é recolhido por filtração, lavado com éter 3 x 100 mL. O mesmo é, adicionalmente, purificado pela re-dissolução em DCM (100 mL) e precipitação em éter (800 mL) duas vezes. O produto é seco em vácuo pruduzindo 7,2 g (96%), confirmada por RMN e teste com Nihidrina.

[000722] O de-Boc do produto protegido (7,0 g) obtido acima é realizado em TFA/DCM 50% (40 mL) a 0 °C por 1 hora e, em seguida, na temperatura ambiente por 1,5 horas. Depois de remover a maioria dos TFA em vácuo, o sal de TFA do derivado de hidroxilamina é convertido para o sal de HCl pela adição de HCl 4N em dioxano (1 mL) para o resíduo. O precipitado é dissolvido em DCM (50 mL) e re- precipitado em éter (800 mL). O produto final (6,8 g, 97%) é recolhido por filtração, lavado com éter 3 x 100 mL, seco em vácuo, armazenado em nitrogênio. Outros derivados de PEG-hidroxilamina (5K, 20K) são sintetizados usando o mesmo procedimento.

Exemplo 25 Atividade in vitro e in vivo do bG CSF-PEGuilado

[000723] O PEG-bG-CSF, bG-CSF não modificado e solução tampão foram administrados a camundongos ou ratos. Os resultados mostraram atividade superior e meia-vida prolongada do bG-CSF PEGuilado da presente invenção em comparação com bG-CSF inalterado, que é indicado pelas quantidades significativamente maiores de neutrófilos e um desvio da contagem máxima das células brancas do sangue usando a mesma dose por camundongo.

Análise Farmacocinética

[000724] Um polipeptídeo de bG-CSF da invenção é administrado por via intravenosa ou subcutânea em camundongos. Os animais são sangrados antes e nos momentos após a dosagem. O plasma é coletado de cada amostra e analisado por radioimunoensaio. A meia- vida de eliminação pode ser calculada e comparada entre os polipeptídeos de bG-CSF compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural e bG-CSF do tipo selvagem ou várias formas de polipeptídeos de bG-CSF da invenção. Da mesma forma, os polipeptídeos de bG-CSF da invenção podem ser administrados aos macacos cinomolgos. Os animais são sangrados antes e nos momentos após a dosagem. O plasma é coletado de cada amostra e analisado por radioimunoensaio.

[000725] Os polipeptídeos da invenção podem ser administrados a um modelo animal com doença. Os estudos em animais que podem ser realizados envolvem gados provocados com Pasteurella hemolytica, gado com provocação bacteriana da glândula mamária/provocação com mastite (Klebsiella pneumonia). Outros estudos que podem ser realizados para avaliar o controle, incidência e duração de doença respiratória bovina, ou a prevenção de mastites coliformes. Os métodos para avaliar a saúde dos animais, produção de leite, contagem de neutrófilos e outros parâmetros são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Outros modelos que podem ser usados para avaliar os polipeptídeos de bG-CSF da invenção incluem, mas não estão limitados a modelos de animais com infecção ou de exposição à infecção, tal como um modelo de hamsnter com pneumonia por Pseudomonas aeruginosa, um modelo de rato com pielonefrite por Candida albicans, modelos que envolvem potros recém-nascidos, e os modelos que envolvem suínos em crescimento. Alguns desses modelos são descritos na Patente US No. 5.849.883 e WO 89/10932. Modelos como estes são conhecidos por aqueles de competência comum na arte.

[000726] Ensaio de 3H-timidina. O ensaio de 3H-timidina é realizado usando métodos padrões. A medula óssea é obtida a partir de camundongos BaIb C do sexo feminino sacrificadas ou a partir de outros animais. As células da medula óssea são brevemente suspensas, centrifugado e ressuspensas em um meio de crescimento. Uma alíquota de 160 μl, contendo aproximadamente 10.000 células é colocada em cada poço de uma placa de microtitulação com 96 poços. As amostras do análogo de G-CSF purificado (preparado anteriormente) são adicionadas a cada poço e incubadas por 68 horas. A timidina tritiada é adicionada aos poços e deixada para incubação durante cinco horas adicionais. Após o tempo de incubação de cinco horas, as células são colhidas, filtradas e cuidadosamente lavadas. Os filtros são adicionados a um frasco contendo fluido de cintilação. As emissões beta são contadas (contador de cintilação LKB Betaplate). Os padrões e os análogos são analisados em triplicata, e as amostras que ficarão substancialmente acima ou abaixo da curva padrão são re- ensaiadas com a diluição adequada. Os resultados são apresentados como a média dos dados analógicos em triplicata em relação aos resultados padrões de inalterados de bG-CSF.

[000727] A indução da proliferação de células da medula óssea humana é ensaiada com base na incorporação aumentada de 3H- timidina. A medula óssea humana de doadores saudáveis é submetida a um corte de densidade com Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia) e as células de baixa densidade são suspensas em meio de Iscove (GIBCO), contendo soro fetal bovino 10% e glutamina penicilina/estreptomicina (pen/strep). Posteriormente, 2 x 104 células da medula óssea humana são incubadas com um meio de controle ou o material de bG-CSF derivado de E. coli recombinante em placas com 96 poços de fundo plano a 37°C em 5% de CO2 no ar por 2 dias. As amostras são ensaiadas em duplicata e a concentração variou em uma faixa de 10.000 vezes. As culturas são, então, pulsadas por 4 horas com 0,5 μCi/poço de 3H-timidina (Nova Inglaterra, Nuclear, Boston, Massachusetts). A absorção de 3H-timidina é medida conforme descrito em Venuta, et al. Blood, 61, 781 (1983).

[000728] Indução de Diferenciação WEHI-3B D+. A capacidade dos polipeptídeos de bG-CSF da presente invenção para induzir a diferenciação da linhagem de células WEHI-3B D+ leucêmicas mielomonocíticas de murino é ensaiada em meio de ágar semissólido, tal como descrito em Metcalf, Int. J. Cancer, 25, 225 (1980). O produto de bG-CSF recombinante e os controles do meio são incubados com cerca de 60 células WEHI-3B D+/poço, a 37 °C em 5% de CO2 no ar durante 7 dias. As amostras são incubadas em placas com 24 poços de fundo plano e a concentração variou em uma faixa de 2.000 vezes. As colônias são classificadas como não diferenciadas, parcialmente diferenciadas ou totalmente diferenciadas e a contagem de células da colônia é feita microscopicamente.

[000729] Ensaios de CFU-GM, BFU-E e CFU-GEMM. Verificou-se que isolados naturais de G-CSF humano e hG-CSF fazem com que as células da medula óssea humana se proliferem e se diferenciem. Essas atividades são medidos em ensaios de CFU-GM [Broxmeyer et al. Exp. Hematol., 5, 87, (1971)], BFU-E e CFU-GEMM [Lu et al. Blood, 61,250(1983)] usando células da medula óssea com baixa densidade, não aderentes a partir de voluntários humanos saudáveis. As células de outras fontes podem ser usadas. Uma comparação das atividades biológicas de CFU-GM, BFU-E e CFU-GEMM usando 500 unidades de G-CSF ou polipeptídeos de bG-CSF da invenção é realizada.

[000730] Os ensaios de colônia são realizados com células da medula óssea de baixa densidade não aderentes. As células da medula óssea humana são sujeitos a um corte de densidade com Ficoll-Hypaque (densidade, 1,077 g/cm3; Pharmacia). As células de baixa densidade são, então, ressuspensas em soro fetal bovino contendo meio Dulbecco modificado por Iscove e colocadas para a aderência em pratos de cultura de tecido Falcão (No. 3003, Becton Dickinson, Cockeysville, Md.), para 1 hora e meia a 37°C.

[000731] O controle do meio consiste em meio Dulbecco modificado por Iscove, acrescido de SFB 10%, Hemina 0,2 mM e 1 unidade de uma eritropoietina recombinante. Para o ensaio de CFU-GM, as células alvo são plaqueadas em 1 x 105 em 1 ml de meio de cultura de ágar 0,3%, que inclui completado meio 5A de McCoy suplementado e soro fetal bovino 10% inativado por calor. As culturas são pontuadas por colônias (maior de 40 células por agregado) e morfologia é avaliada no dia 7 de cultura. O número de colônias é mostrado como a média ± SEM como determinado a partir de placas quadruplicadas.

[000732] Para os ensaios de CFU-GEMM e BFU-E, as células (1 x 105) são adicionadas a uma mistura de 1 mL de meio Dulbecco modificado por Iscove (Gibco), metilcelulose 0,8%, soro fetal bovino 30%, 2-mercaptoetanol 0,05 nM, hemina 0,2mM e 1 unidade de eritropoietina recombinante. Os pratos são incubadas em uma atmosfera húmida de 5% de CO2 e 5% de O2. A baixa tensão de oxigênio é obtida usando um instrumento oxiredutor da Remining Bioinstruments (Syracuse, NY). As colônias são pontuadas após 14 dias de incubação. O número de colônias é definido como a média ± SEM, como determinado de placas em duplicata.

[000733] Espera-se que as colônias formadas no ensaio de CFU-GM sejam cloracetateo esterase positivas e esterase não específicas negativas (alfa-naftil acetato esterase), em consonância com as colônias que são do tipo granulócitos. Tanto o G-CSF natural quanto os polipeptídeos de bG-CSF da invenção são esperados ter uma atividade específica de uma proteína pura de aproximadamente 1 x 108 U/mg, quando ensaiadas por diluição em série em um ensaio de CFU-GM. É importante notar que o bG-CSF da invenção pode ser extremamente puro e livre de outros potenciais fatores de crescimento de mamíferos em virtude da sua produção em E. coli. Assim, o bG- CSF pode ser capaz de suportar a formação de colônias mistas (CFU- GEMM) e BFU-E quando adicionado na presença de eritropoietina recombinante.

[000734] Medição da Meia-Vida "in vivo" de bG-CSF Conjugados e Não Conjugados e de Variantes dos Mesmos. Ratos Sprague-Dawley do sexo masculino (cerca de 7 semanas de idade) são usados. No dia da administração, o peso de cada animal é medido. 100 μg por kg de peso do corpo das amostras de bG-CSF conjugado e não conjugado são, cada, injetadas por via intravenosa na veia da cauda de três ratos. No primeiro minuto, minuto 30, 1, 2, 4, 6 e 24 horas após a injeção, 500 μl de sangue é retirado de cada rato enquanto sob anestesia-CO2. As amostras de sangue são armazenadas em temperatura ambiente por 1,5 horas, seguido pelo isolamento de soro por centrifugação (4°C, 18000 x g por 5 minutos). As amostras de soro são armazenadas a -80°C até o dia da análise. A quantidade de bG- CSF ativos nas amostras de soro é quantificada pelo ensaio de atividade in vitro de bG-CSF após o descongelamento das amostras em gelo.

[000735] Medição da Atividade Biológica in vivo em Ratos Saudáveis de bG-CSF conjugados e não conjugados e Variantes dos Mesmos. A medição dos efeitos biológicos in vivo do bG-CSF em ratos Sprague Dawley SPF é usada para avaliar a eficácia biológica de bG-CSF conjugados e não conjugados e das Variantes do mesmo. No dia da chegada, os ratos são locados aleatóriamente em grupos 6. Os animais devem repousar durante um período de 7 dias em que os indivíduos em mau estado ou em pesos extremos são rejeitados. A faixa de peso dos ratos no início do período de repouso é de 250 - 270 g.

[000736] No dia da administração, os ratos ficaram em jejum por 16 horas seguido de injeção subcutânea de 100 μg por kg de peso corporal do bG-CSF ou de uma variante do mesmo. Cada amostra de bG-CSF é injetada em um grupo 6 ratos randomizados. Amostras de sangue de 300 μg de sangue estabilizado com EDTA são retiradas de uma veia da cauda dos ratos antes da dosagem em 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 e 144 horas após a administração. As amostras de sangue são analisadas para os seguintes parâmetros hematológicos: hemoglobina, contagem de célelas vermelhas do sangue, hematócrito, volume de meio celular, concentração de hemoglobina no meio celular, hemoglobina no meio celular, contagem de células brancas do sangue, contagem diferencial de leucócitos (neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, basófilos, monócitos). Com base nessas medições, a eficácia biológica de bG-CSF conjugado e não conjugado e das variantes dos mesmos é avaliada.

[000737] Medição da Atividade Biológica in vivo em Ratos com Neutropenia induzida po Quimioterapia de bG-CSF Conjugados e Não Conjugados e Variantes dos Mesmos. Ratos Sprague Dawley SPF são usados para esta análise. No dia da chegada, os ratos são aleatoriamente alocados em grupos 6. Os animais devem repousar durante um período de 7 dias em que os indivíduos em mau estado ou com pesos extremos são rejeitados. A faixa de peso dos ratos no início do período de repouso é de 250 - 270 g.

[000738] Após 24 horas antes da administração das amostras de bG- CSF, os ratos são injetados i.p. com 50 mg por kg de peso corporal de ciclofosfamida (CPA) para induzir neutropenia que mimetiza a neutropenia resultante da quimioterapia anticâncer. No dia 0, 100 μg por kg de peso corporal do bG-CSF ou uma Variante do mesmo é injetada s.c.. Cada amostra de bG-CSF é injetada em um grupo 6 ratos randomizados. As amostras de sangue de 300 μl de sangue estabilizado com EDTA são retiradas de uma veia da cauda dos ratos antes da dosagem em 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas após a dosagem. As amostras de sangue são analisadas para os seguintes parâmetros hematológicos: hemoglobina, contagem de células vermelhas do sangue, hematócrito, volume do meio celular, concentração de hemoglobina no meio celular, hemoglobina no meio celular, contagem de células brancas do sangue, contagem diferencial de leucócitos (neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, basófilos, monócitos). Com base nessas medições, a eficácia biológica do bG-CSF conjugado e não conjugado e das variantes dos mesmos é avaliada.

Exemplo 26 Um Estudo in vivo para Avaliação do Impacto da Variante bG- CSF-T133pAF 20K PEG Sobre as Respostas Hematológicas de Bovinos

[000739] O bG-CSF recombinante contendo uma única substituição de pAF na posição T133 (bG-CSF T133pAF-20K PEG) foi produzida em E. coli. Esta proteína tinha uma metionina N terminal (SEQ ID NO: 2) e a treonina na posição 134 da SEQ ID NO: 2 foi substituída por para-acetilfenilalanina. A proteína foi PEGuilada no sítio de incorporação de pAF usando PEG oxiamino de 20KD e purificada por cromatografia líquida de troca de cátions com pureza >98%. A formulação final continha 7,377 mg/mL de bG-CSF PEGuilado em formulação de tampão composto de NaAc 4,26 mM; sorbitol 5%, Tween 20 0,0033%; NaCl 0,565 mM, pH 4,0.

[000740] Bois de corte mestiços Continentais ou Ingleses comerciais, pesando aproximadamente 150 kg foram adquiridos e transportados para as instalações da pesquisa onde foram individualmente identificados com marcas auriculares e aclimatados por 7 dias antes da inclusão no estudo. Nenhum antibiótico ou vacina foi administrado aos animais durante os períodos de aquisição ou de aclimatação. Nenhuma medicação concomitante foi administrada aos animais durante o estudo. Os animais foram alojados em baias com pisos de concreto encaixado e foram expostos à temperatura ambiente. Os animais foram alimentados uma vez por dia para o apetite com uma ração peletizada, completa (Rumilab® 5508).

[000741] O estudo foi conduzido usando um modelo de bloco completo randomizado, em que os bezerros foram bloqueados no curral. Doze animais foram designados para grupos (6 animais /tratamento) de controle negativo (proteína sem formulação de tampão) ou tratados. Os animais foram designados aleatoriamente para blocos e tratamentos dentro dos blocos.

[000742] No dia -1 os bezerros foram avaliados por um veterinário para os sinais clínicos da doença. As avaliações incluíram a taxa de pulso, frequência respiratória e temperatura retal, bem como a condição geral. O peso corporal e as temperaturas retais foram determinados e as amostras de sangue anti-coagulado foram coletadas para avaliação de hematologia (amostra de pré-tratamento). Os animais dentro da faixa de peso especificada com perfis hematológicos normais com base nas faixas referênciadas na literatura e sem sinais clínicos da doença foram selecionados para inclusão no estudo.

[000743] No dia 0, os bezerros foram tratados com uma injeção subcutânea única de bG-CSF T133pAF PEGuilado (40 μg/kg) ou formulação de tampão (1mL/125kg). As injeções foram administradas na região pré-escapular no lado esquerdo do pescoço.

[000744] As amostras de sangue venoso total (~30 ml) foram coletadas em tubos estéreis contendo um EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) para contagens de leucócitos absolutos ou ACD (ácido citrato dextrose) para determinação das contagens de neutrófilos absolutos. As contagens de leucócitos absolutos foram determinadas usando um analisador de sangue tipo Beckman Coulter ACT10TM. As contagens de neutrófilos absolutos (ANC) foram determinadas por avaliação citométrica de fluxo da percentagem de neutrófilos nas amostras de sangue total coradas com CD45 usando um bioanalisador tipo Becton Dickinson FACSarrayTM. As contagens de neutrófilos absolutos foram calculadas pela multiplicação da contagem de leucócitos absolutos pela percentagem de neutrófilos.

[000745] Além das amostras de pré-tratamento coletadas no dia -1, as amostras foram coletadas em 4, 8 e 12 horas no dia 0, 24 e 36 horas pós-tratamento, e uma vez por dia nos dias 3 - 14.

[000746] Os resultados da administração de bG-CSF PEGuilado em ANC são apresentados na Figura 16. Os animais tratados com formulação tamponada individualmente apresentaram valores de ANC relativamente constantes ao longo da duração do estudo. Em contraste, os animais que receberam bG-CSF PEGuilado apresentaram um aumento acentuado no ANC dentro de 8 horas pós- tratamento. Os valores máximos de ANC (aproximadamente 10 vezes acima dos níveis de pré-tratamento) foram observados com 72 horas pós-tratamento. As contagens de neutrófilos absolutos diminuiu a cerca de 4 a 5 vezes acima do nível de pré-tratamento por 5 dias pós- tratamento e permaneceu neste nível por 10 dias. Os valores ainda caíram para cerca de 3,5 vezes em relação ao nível de pré-tratamento a partir do dia 11 até o 14 dias.

[000747] Estes resultados indicam que a PEGuilação sítio-específica do bG-CSF na posição T133 possibilitou a obtenção de atividade hematopoética potente que persistiu por pelo menos duas semanas em bezerros tratados com uma injeção única de proteína.

Exemplo 27 Sumário do Estudo de Hematologia de Variante de bG-CSF T133

[000748] Um estudo in vivo foi realizado para avaliar o impacto da variante de bG-CSF-T133pAF 20K PEG nas respostas hematológicas de gados.

[000749] O bG-CSF recombinante contendo uma substituição de pAF única na posição T133 foi produzido em E. coli. A proteína foi PEGuilada no sito de incorporação de pAF usando PEG oxiamino de 20KD e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência com exclusão de tamanho com pureza > 98%. A formulação final continha 7,377 mg/ml de bG-CSF PEGuilado em formulação de tampão composta de NaAc 4,26 mM; sorbitol 5%, Tween 20 0,0033%; NaCl 0,565 mM, pH 4,0.

[000750] Bois de corte mestiços Continentais ou Ingleses comerciais, pesando aproximadamente 150 kg foram adquiridos e transportados para as instalações da pesquisa onde foram individualmente identificados com marcas auriculares e aclimatados por 7 dias antes do registro no estudo. Nenhum antibiótico ou vacina foi administrado aos animais durante os períodos de aquisição ou de aclimatação. Nenhuma medicação concomitante foi administrada aos animais durante o estudo. Os animais foram alojados em baias com pisos de concreto encaixado e foram expostos à temperatura ambiente. Os animais foram alimentados uma vez por dia para o apetite com uma ração peletizada, completa (Rumilab® 5508).

[000751] O estudo foi conduzido usando um modelo de bloco completo randomizado, em que os bezerros foram bloqueados no curral. Doze animais foram designados para grupos (6 animais /tratamento) de controle negativo (proteína sem formulação de tampão) ou tratados. Os animais foram designados aleatoriamente para blocos e tratamentos dentro dos blocos.

[000752] No dia -1 os bezerros foram avaliados por um veterinário para os sinais clínicos da doença. As avaliações incluíram a taxa de pulso, frequência respiratória e temperaturas retais, bem como a condição geral. O peso corporal e as temperaturas retais foram determinados e as amostras de sangue anti-coagulado foram coletadas para avaliações de hematologia (amostra de pré- tratamento). Os animais dentro da faixa de peso especificada com perfis hematológicos normais com base nas faixas referenciadas na literatura e sem sinais clínicos da doença foram selecionados para inclusão no estudo.

[000753] No dia 0, os bezerros foram tratados com uma injeção subcutânea única de bG-CSF T133pAF PEGuilado (40 μg/kg) ou formulação de tampão (1mL/125kg). As injeções foram administradas na região pré-escapular no lado esquerdo do pescoço.

[000754] As amostras de sangue venoso total (~ 30 ml) foram coletadas em tubos estéreis contendo um EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) para contagens de leucócitos absolutos ou ACD (ácido citrato dextrose) para determinação das contagens de neutrófilos absolutos. As contagens de leucócitos absolutos foram determinadas usando um analisador de sangue tipo Beckman Coulter ACT10TM. As contagens de neutrófilos absolutos (ANC) foram determinadas por avaliação citométrica de fluxo da percentagem de neutrófilos nas amostras de sangue total coradas com CD45 usando um bioanalisador tipo Becton Dickinson FACSarrayTM. As contagens de neutrófilos absolutos foram calculadas pela multiplicação da contagem de leucócitos absolutos pela percentagem de neutrófilos.

[000755] Além das amostras de pré-tratamento coletadas no dia -1, as amostras foram coletadas em 4, 8 e 12 horas no dia 0, 24 e 36 horas no dia 1, e uma vez por dia nos dias 3 - 14.

[000756] Os resultados da administração de bG-CSF PEGuilado em ANC são apresentados na Figura 17. Os animais tratados com formulação tamponada individualmente apresentaram valores de ANC relativamente constantes ao longo da duração do estudo. Em contraste, os animais que receberam bG-CSF PEGuilado apresentaram um aumento acentuado no ANC dentro de 8 horas pós- tratamento. Os valores máximos de ANC (aproximadamente 10 vezes acima dos níveis de pré-tratamento) foram observados com 72 horas pós-tratamento. As contagens de neutrófilos absolutos diminuiu para cerca de 4 a 5 vezes acima do nível de pré-tratamento por 5 dias pós- tratamento e permaneceu neste nível por 10 dias. Os valores ainda diminuíram para cerca de 3,5 vezes em relação ao nível de pré- tratamento a partir do dia 11 até o dia 14 (Ver Figura 17).

[000757] Estes resultados indicam que a PEGuilação sítio-específica do bG-CSF na posição T133 possibilitou a obtenção de atividade hematopoética potente que persistiu por pelo menos duas semanas em bezerros tratados com uma injeção única de proteína.

[000758] Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz da mesma serão sugeridas para aqueles com habilidade comum na arte e devem ser incluídos dentro do espírito e alcance deste pedido e o escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e/ou outros documentos citados nesse pedido são incorporados por referência na sua totalidade para todos os propósitos, na mesma medida, como se cada publicação individual, patente, pedido de patente, e/ou outro documento fossem indicadas individualmente para serem incorporadas por referência para todos os propósitos.

Exemplo 28 Sumário do Estudo da Eficácia de Variante de bG-CSF T-133 PEGuilado em Mastite

[000759] A eficácia metafilática da variante de bG-CSF-T133pAF PEG 20K contra infecções intramamárias que ocorrem naturalmente associadas com patógenos de mastite chave foi avaliada usando um modelo de infecção de mastite induzida.

[000760] O bG-CSF recombinante contendo uma única substituição do pAF na posição T133 foi produzido em E. coli. A proteína foi PEGuilada no sito de incorporação de pAF usando PEG oxiamino de 20KD e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência com exclusão de tamanho. A formulação final continha bG-CSF PEGuilado em formulação de tampão composta de NaAc 10 mM; sorbitol 5%, Tween 20 0,0033%; pH 4,0.

[000761] Vacas multíparas Holstein-Friesian periparturientes pesando aproximadamente 600 - 800 kg foram selecionados entre os rebanhos de produção comercial. Nenhum tratamento antibacteriano foi administrado às vacas em até 30 dias antes da inclusão no estudo. Os animais foram alimentados com uma ração de vaca seca adequada antes do parto e uma ração de vaca de transição a partir do dia do parto e continuando pela duração do estudo. Os animais foram deixados com acesso ad libitum à água potável. Os procedimentos de rotina da criação de gado foram seguidos e as vacas foram ordenhadas duas vezes ao dia.

[000762] As vacas saudáveis foram incluídas no estudo, aproximadamente, sete dias antes da data prevista do parto com base no registo da criação e uma avaliação da sua disponibilidade para parir pelos criadores. As vacas foram distribuídas em grupos de tratamento usando um modelo completamente randomizado. Cada grupo de tratamento continha aproximadamente cinquenta vacas.

[000763] As vacas foram tratadas com solução salina estéril (controle negativo), injeções diárias (dia 7 ao dia 6), de bG-CSF-T133pAF não PEGuilado ou várias doses de variante bG-CSF-T133pAF 20K PEG no dia da inclusão e no dia do parto. Os tratamentos foram administrados via injeção subcutânea na região pré-escapular do pescoço.

[000764] Os animais foram observados quanto aos sinais clínicos da mastite em cada ordenha nos dias 0 - 28 por grupos de tratamento cego indivídual. As observações específicas incluíram a designação de uma pontuação clínica com base na aparência do leite e condição da glândula mamária. Se nenhuma anormalidade foi observada, um “Califórnia Mastite Teste” era realizado na(s) parte afetada e a temperatura do reto do animal foi registrada. Todos os animais que morreram durante o curso do estudo foram necropsiados para determinar a causa da morte se possível.

[000765] O rendimento de leite foi registrado a cada ordenha nos dias 0 - 28, e amostras de leite compósito foram coletadas a partir das partes saudáveis nos dias 3, 5, 7 e 10 para análises da composição do leite, incluindo: contagens de células somáticas, gordura do leite, proteínas do leite, lactose e sólidos. Amostras de leite adicionais também foram coletadas a partir das partes que apresentaram anormalidades clínicas para a identificação de patógenos bacterianos.

[000766] As percentagens de nascidos vivos e taxas de concepção do primeiro serviço após reprocriação pela inseminação artificial foram coletadas para todas as vacas incluídas no estudo para avaliar o impacto dos tratamentos sobre a saúde reprodutiva. As observações diárias da saúde também foram registradas para todos os bezerros durante os primeiros 30 dias de vida e quaisquer anomalias foram documentados para avaliar o impacto dos tratamentos sobre a saúde dos bezerros.

[000767] A eficácia foi avaliada pela comparação das taxas de morbidade entre os grupos de tratamento para as vacas e partes individuais. Os pontos finais secundários incluíram a avaliação do impacto dos tratamentos sobre a incidência de mortalidade, produção de leite e composição de leite e as taxas de concepção de primeiro serviço.

[000768] O impacto dos diversos tratamentos sobre a incidência de mastite clínica e mortalidades está resumido na Tabela 10.

[000769] A administração de doses diárias de bG-CSF T-133 pAF não PEGuilado reduziu significativamente a incidência de novas infecções de mastite clínica em relação aos controles de salina. A administração de uma dose de bG-CSF T133-pAF 20K PEG reduziu significativamente a incidência de novas infecções de mastite clínica em relação aos controles de salina ou injeções diárias de bG-CSF T133-pAF não PEGuilado. A administração de uma dose de bG-CSF T133-pAF 20K PEG apresentou uma pequena redução numérica no número de mortalidades em relação ao controle de salina.

[000770] O impacto dos tratamentos sobre a produção diária de leite de vacas sadias é resumido na Figura 18. Os níveis de produção de leite foram semelhantes para as vacas tratadas com solução salina estéril, bG-CSF T133-pAF não PEGuilado e dose menor de bG-CSF T133-pAF 20K PEG. Esses animais apresentaram aumento na produção de leite durante o período do estudo típico daqueles normalmente observados durante o primeiro mês de lactação. Os animais tratados com a dose mais elevada do bG-CSF T133-pAF 20K PEG apresentaram uma produção diária de leite significativamente reduzida em relação aos outros tratamentos ao longo da duração do estudo.

[000771] O impacto dos tratamentos sobre as contagens de células somáticas está resumido na Figura 19. Os Animais tratados com bG- CSF T-133 pAF não PEGuilado ou bG-CSF T133-pAF 20K PEG apresentaram contagens de células somáticas, que eram semelhantes ou inferiores as observadas nos controles de salina nos dias 3, 5 e 7 pós-parto. No dia 10 pós-parto, as contagens de células somáticas de animais tratados com o bG-CSF T133-pAF não-PEGuilado ou bG-CSF T133 pAF 20K PEG foram significativamente menores que as dos controles de salina sugerindo que estes tratamentos foram provavelmente reduzindo a incidência de mastite não-clínica, além de mastite clínica.

[000772] Os resultados das análises microbiológicas indicaram que as vacas mórbidas exibiram uma faixa típica de bactérias patógenas, incluindo coliformes, espécie Streptococcus, espécie Staphilococcus e espécies de Bacillus. Estes resultados sugerem que a administração do bG-CSF T133-pAF 20K PEG foi eficiente na redução da doença contra as espécies de bactérias Gram positivas e Gram negativas.

[000773] O impacto dos tratamentos sobre os nascidos vivos e taxas de concepção do primeiro serviço está resumido na Tabela 11. Não houve diferença significativa no percentual de nascidos vivos entre os tratamentos, sugerindo que os tratamentos experimentais não tiveram impacto sobre a viabilidade dos bezerros no útero. Houve uma melhora numérica nas taxas de concepção de primeiro serviço entre os animais tratados com bG-CSF T133-pAF não PEGuilado ou bG- CSF T133 pAF 20K PEG e os controles de salina. Estes resultados sugerem que os tratamentos experimentais não tiveram impacto negativo sobre a saúde reprodutiva.

[000774] O impacto da exposição no útero aos tratamentos dos bezerros saudáveis nascidos de animais incluídos no estudo está resumido na Tabela 12. Estes resultados indicam que nenhum dos tratamentos experimentais reduziu aincidênciadedoenças respiratórias ou entéricas em relação aos controles de salina durante os primeiros 30 dias de vida. No entanto, tanto o bG-CSF T133 pAF não PEGuilado quanto obG-CSFT133 pAF 20KPEG reduziu significativamente o número de mortalidades em relação aos controles de salina. Estes resultados sugerem que os tratamentos experimentais tiveram um impacto positivo sobre a gravidade da doença.

Exemplo 29 Doença Respiratória com Variante de bG-CSF-T133 PEGuiladoResumo do Estudo de Eficácia

[000775] A eficácia metafilática de várias doses de variante de bG- CSF-T133 pAF 20K PEG contra doença respiratória bovina que ocorre naturalmente é avaliada em condições de confinamento comercial.

[000776] O bG-CSF recombinante contendo uma única substituição do pAF na posição T133 é produzido em E. coli. A proteína foi PEGuilada no sito de incorporação de pAF usando PEG oxiamino de 20KD e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência com exclusão de tamanho. A formulação final continha bG-CSF PEGuilado em formulação de tampão composta de NaAc 10 mM; sorbitol 5% e Tween 20 0,0033%; pH 4,0.

[000777] Bois de corte mestiços Continentais ou Ingleses comerciais com peso de aproximadamente de 500 libras e típicos de bezerros alimentadores comerciais são adquiridos em um ou mais postos de venda de gados no Sudeste dos EUA. À chegada ao sítio de fungibilidade, os animais são identificados individualmente e examinados por um veterinário para anormalidades clínicas. As temperaturas retais também são registradas e os animais que estão livres de sinais clínicos da doença e têm temperaturas retais < 104 °F são selecionados para inclusão no estudo. Amostras de sangue para contagem total e diferencial de células brancas do sangue são obtidas antes do tratamento.

[000778] Os bezerros são alocados aleatoriamente aos grupos de tratamento como resumido na Tabela 13.

[000779] A salina estéril ou o bG-CSF-T133 pAF 20K PEG foi administrado por injeção subcutânea na região pré-escapular, do pescoço.

[000780] Na manhã seguinte, os bezerros foram carregados em caminhões e transportados aproximadamente 1.400 milhas para um posto de venda comercial no Colorado do Norte. À chegada, os animais são descarregados em currais de chegada e o acesso a alimentos e água é permitido. Dentro de quatro horas após a chegada, os animais são deslocados para uma área de processamento onde são pesados e os primeiros dez bezerros designados para cada grupo de tratamento são sangrados para obtenção de amostras para a contagem total e diferencial de células brancas do sangue. Estas contagens são usadas para confirmar se os animais estão respondendo ao tratamento como evidenciado por um aumento no número absoluto de neutrófilos. Os bezerros são distribuídos aleatoriamente em baias de estudo com cinco animais de cada grupo de tratamento para um total de 20 animais por baia.

[000781] Os bezerros são observados diariamente durante 14 dias após a sua chegada por um veterinário, cegos para as designações de tratamento, para os sinais clínicos da doença. Cada animal recebe uma pontuação de doença variando de 0 (saudável) a 4 (moribundo). Os animais que apresentam a pontuação de doença > 0 são movidos para uma área de processamento e sua temperatura retal é registrada. Os animais que apresentam a pontuação de doença > 0 e temperatura retal > 104 °F são identificados como mórbidos e são tratados com um antibiótico aprovado e retornam para sua baia de estudo. As identidades dos animais que morrem durante o curso do estudo são registradas e o animal é necropsiado para determinar a causa da morte.

[000782] O ponto final primário para a determinação da eficácia é a taxa de morbidade relativa entre os grupos de tratamento. Os pontos finais de eficácia secundários incluem taxas de mortalidade, média de ganho de peso diário e média de pontuações de doença diária para cada grupo de tratamento.

[000783] Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações em função dos mesmos serão sugeridas por aqueles com habilidade comum na arte e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e/ou outros documentos citados nesse pedido são incorporados por referência na sua totalidade para todos os propósitos, na mesma medida, como se cada publicação individual, patente, pedido de patente, e/ou outro documento fossem indicados individualmente para serem incorporados por referência para todos os propósitos.Tabela 14 - Sequências Citadas

Claims

1.Polipeptídeo de fator estimulante de colônias de granulócitos bovino (bG-CSF) compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 133 da SEQ ID NO: 11, ou o aminoácido correspondente da SEQ ID NO: 2, é substituído com o aminoácido codificado de forma não natural para- acetilfenilalanina; o aminoácido codificado de forma não natural sendo ligado a um polímero solúvel em água compreendendo um grupamento poli(etileno)glicol; e o polímero solúvel em água possuindo um peso molecular entre 0,1 kDa e 50 kDa; em que o referido polipeptídeo bG-CSF é determinado por induzir uma contagem absoluta de neutrófilos (ANC) 7 vezes a 12 vezes maior do que ANC pré-tratamento de 12 horas a 96 horas após uma única injeção subcutânea a 40 μg/kg em um bezerro bovino saudável.

2.Polipeptídeo de bG-CSF, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre 10 kDa e 40 kDa.

3.Polipeptídeo de bG-CSF, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polímero solúvel em água tem um peso molecular de 20 kDa.

4.Polipeptídeo de bG-CSF consistindo em uma sequência de aminoácidos consistindo na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 133 da SEQ ID NO: 1 ou o aminoácido correspondente da SEQ ID NO: 2, é substituído com o aminoácido codificado de forma não natural para- acetilfenilalanina; o aminoácido codificado de forma não natural é ligado a um polímero solúvel em água compreendendo um grupamento poli(etileno)glicol; e o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e 50 kDa.

5.Polipeptídeo de bG-CSF, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre 10 kDa e 40 kDa.

6.Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de bG-CSF, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

7.Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de bG-CSF, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.