CN101062419B - 干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用 - Google Patents

干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用 Download PDF

Info

Publication number
CN101062419B
CN101062419B CN200710112119.8A CN200710112119A CN101062419B CN 101062419 B CN101062419 B CN 101062419B CN 200710112119 A CN200710112119 A CN 200710112119A CN 101062419 B CN101062419 B CN 101062419B
Authority
CN
China
Prior art keywords
interferon
beta
polymer
physiology
ifn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN200710112119.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101062419A (zh
Inventor
B·佩宾斯基
L·兰科尔
M·布里科尔麦尔
A·维蒂
P·霍奇曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biological Gene Ma Co
Original Assignee
Biological Gene Ma Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26801696&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101062419(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biological Gene Ma Co filed Critical Biological Gene Ma Co
Publication of CN101062419A publication Critical patent/CN101062419A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101062419B publication Critical patent/CN101062419B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

包含与含有聚亚烷基二醇部分的聚合物偶联的干扰素-β-1a的干扰素β多肽，其中干扰素-β-1a和聚亚烷基二醇部分的排列使得干扰素-β-1a的活性相对于干扰素β的另一种治疗性形式(干扰素-β-1b)有所增强，而且展示的活性与非缀合干扰素-β-1a相比没有降低。本发明的缀合物在治疗性以及非治疗性(如诊断性)应用中可以有效采用。

Description

干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用
本案为分案申请，母案申请号为99812202.5(国际申请号为PCT/US99/24201)，发明名称为“干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用”。
发明背景
多肽和蛋白质在特殊疾病的全身性治疗中的使用现在已经被医学实践所接受。这些物质在治疗中的作用非常重要，以至于许多研究活动正致力于通过重组DNA技术大量合成。这些多肽中的许多种是非常有潜力且可特异诱发其生物学作用的内源性分子。
限制这些蛋白质性质的物质用于期望应用的主要因素是，当非胃肠给药时，它们在短时间内由体内消除。这可能是蛋白酶代谢的结果，或者是通过蛋白质消除常规途径(诸如肾的过滤)而被清除。由于胃中的蛋白水解作用和强酸性，在这些物质到达靶组织前就把它们破坏了，所以施用它们的口服路线甚至更有问题。制药业对于这些蛋白质施用路线的相关问题是熟知的，而且正在尝试各种策略解决它们。
已经发表了与蛋白质稳定化有关的大量工作。已知将蛋白质与聚合物物质缀合的多种方法，包括使用葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸。据报道，产生的缀合多肽保留了它们的生物学活性和在非胃肠应用用水中的可溶性。
干扰素是许多临床工作和以改进其施用和生物同化为目的的努力所关注的肽家族。干扰素已经在多种临床疾病状态中进行了测试。人干扰素β(该家族成员之一)的使用在多发性硬化症中得到了最好的确认。最近，在欧洲和美国，重组干扰素β的两种形式获得了用于此疾病治疗的许可。一种形式是干扰素-β-1a(商标，mfg.Biogen公司，Cambridge，MA)，此后可互换使用“干扰素-β-1a”或“IFN-β-1a”。另一种形式是干扰素-β-1b(商标，Berlex，Richmond，CA)，此后使用“干扰素-β-1b”表示。干扰素-β-1a是使用天然人类基因序列在哺乳动物细胞中生产的，并进行了糖基化；而干扰素-β-1b是使用经修饰人类基因序列(在第17位氨基酸位置经基因工程改造用丝氨酸取代半胱氨酸)在大肠杆菌中生产的，而且未进行糖基化。
以前，我们中的一些人直接比较了干扰素-β-1a和干扰素-β-1b在功能性实验中的相对体外潜力，结果显示，干扰素-β-1a的比活性比干扰素-β-1b的比活性高大约10倍(Runkel等人，药物研究(Pharm.Res.)15：641-649，1998)。根据设计用来鉴定这些活性差异的结构基础的研究，我们确认了，糖基化是产物间影响比活性的唯一的已知结构差异。碳水化合物的影响很大程度上是通过其对结构的稳定化作用而显现的。碳水化合物的稳定化作用在热变性实验和SEC分析中是明显的。糖基化的缺乏还与聚集的增加和热变性敏感性的增加有关。用PNG酶F由干扰素-β-1a通过酶方法除去碳水化合物，将引起去糖基化产物的广泛沉淀。
这些研究表明，尽管干扰素-β-1a和干扰素-β-1b之间存在序列保守性，但是它们是不同的生化实体，由此关于干扰素-β-1b已知的许多知识不能应用于干扰素-β-1a，反之亦然。
发明概述
我们利用了糖基化干扰素β相对于非糖基化形式的优势。具体而言，我们发展了干扰素-β-1a组合物，该组合物相对于干扰素-β-1b具有增高的活性、并具有PEG化蛋白质普遍具有的医疗特性，而且相比于干扰素-β-1a非缀合形式其活性没有有效损失。因此，如果进行修饰后的产物(聚合物-干扰素-β-1a缀合物)保留了所有或大部分生物学活性，则可能产生下列特性：导致半衰期增加和组织分布变化的药物动力学和药效动力学变化(如在血管中维持更长时间的能力)、溶液中的稳定性增加、免疫原性降低、保护免受蛋白水解消化和随后的活性消除。这种制剂是制药和医学领域的实质性进步，并将对干扰素具有一些效用的各种疾病(诸如多发性硬化症、纤维变性、和其它炎症性或自身免疫疾病、癌症、肝炎和其它病毒性疾病)的治疗作出显著贡献。具体而言，在血管中维持更长时间的能力使得干扰素-β-1a能够用于抑制血管生成并潜在通过血脑屏障。此外，当配制干扰素-β-1a粉剂形式用于随后的吸入施用时，通过产生聚合物-干扰素-β-1a缀合物得到的热稳定性是有利的。
我们根据干扰素-β-1a的结晶学结构的知识，发展了干扰素-β-1a-聚合物缀合物，其中聚合物在干扰素-β-1a上的连接位点使得缀合物保留了相对于非缀合干扰素-β-1a的全部干扰素-β-1a活性。
本发明的一个方面是缀合的干扰素-β-1a复合物，其中干扰素-β-1a与将聚亚烷基二醇作为完整部分掺入的聚合物共价键合。
在一个特定方面，本发明涉及包含与聚合物(其包含聚亚烷基二醇部分)偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的生理学有活性的干扰素-β-1a组合物，其中干扰素-β-1a和聚亚烷基二醇部分的排列使得组合物中的生理学有活性的干扰素-β-1a相对于单独的干扰素-β-1a(即没有偶联聚合物的非缀合形式)具有增强的半衰期。
本发明的另一方面是包含与聚合物偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的干扰素-β-1a组合物，其中干扰素-β-1a是融合蛋白，优选免疫球蛋白融合体。在这种复合物中，N末端(与聚合物的缀合位点)和C末端(与Ig部分的融合位点)非常接近，说明聚合物缀合有可能降低融合蛋白的免疫原性。
在另一方面，本发明涉及包含与聚合物(其包含聚亚烷基二醇部分)偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的生理学有活性的干扰素-β-1a组合物，其中干扰素-β-1a和聚亚烷基二醇部分的排列使得组合物中的生理学有活性的干扰素-β-1a的活性相对于单独的干扰素-β-1b(即没有偶联聚合物的非缀合形式)增强。
本发明的另一个实施方案是缀合的干扰素-β-1a蛋白，其中干扰素-β-1a部分进行了突变，从而为突变蛋白提供了相对于干扰素-β-1a非突变形式选择性地有所增强的抗病毒和/或抗增殖活性。
本发明的另一个方面涉及包含与生理学相容的聚乙二醇部分共价偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的稳定的、水溶性的缀合干扰素-β-1a复合物。在这种复合物中，干扰素-β-1a可以与生理学相容的聚乙二醇部分通过不稳定共价键在干扰素-β-1a的游离氨基酸基团处共价偶联，其中不稳定的共价键在体内被生化水解作用和/或蛋白水解作用切断。
在另一个方面，本发明涉及包含制药学可接受载体和含有与生理学相容的聚乙二醇偶联的干扰素β的稳定的水溶性干扰素-β-1a复合物的剂型。
在其它方面，诸如上述的共价偶联干扰素-β-1a组合物可以采用用于诊断或体外应用的干扰素-β-1a，其中干扰素-β-1a是例如用于免疫实验或其它诊断性或非体内应用的诊断性试剂。在这种非治疗性应用中，本发明复合物作为稳定的组合物被高度有效采用，其例如可以在相容溶剂或其它基于溶剂的制剂中进行配制，从而提供抗降解能力增强的稳定组合物形式。
用无毒聚合物修饰干扰素-β-1a可以提供某些优势。如果进行修饰后的产物(聚合物-干扰素-β-1a缀合物)保留了所有或大部分生物学活性，则可能产生下列特性：导致半衰期增加和组织分布变化的药物动力学和药效动力学变化(如在血管中维持更长时间的能力)、溶液中的稳定性增加、免疫原性降低、保护经修饰干扰素-β-1a免受蛋白水解消化和随后的活性消除；热稳定性增加，导致用于口服或吸入使用的粉状干扰素-β-1a制剂更有效。
赋予了上述改进特性的干扰素-β-1a可以在口服、气雾剂、或非胃肠施用后有效地发挥治疗作用。其它施用途径，诸如鼻腔和经皮给药，也可能使用经修饰的干扰素-β-1a。
本发明的另一方面是抑制血管生成和新血管形成的方法，包括使用有效量的本发明组合物。因为增加了干扰素在血管中的水平和持续时间，本发明的PEG化产物作为血管生成抑制剂特别有效。
在非治疗性(如诊断性)应用中，本发明还涵盖了干扰素β的诊断性和/或试剂种类的缀合。产生的缀合试剂对环境降解因素有抵抗力，包括溶剂或溶液介导的降解过程。因干扰素-β-1a的抵抗力和稳定性增加，活性成分的稳定性可以显著增加，从而包含干扰素-β-1a的组合物在其具体最终使用中可靠性增加。
通过下面的公开书和所附权利要求书，本发明的其它方面、特征、和修饰将更清楚明白。
附图简述
图1丙氨酸取代的干扰素-β-1a突变体与包含I类干扰素受体链胞外结构域的二聚体融合蛋白IFNAR2/Ig(与人IgG1恒定区融合的IFNAR2胞外结构域)的结合。
如实施例1(D部分)所述，测定丙氨酸取代的IFN突变体(A1-E)与IRNAR2受体链的结合亲和力。矩形图表示它们在此实验中相对于野生型his-IFN-β的结合亲和力(％w.t.)。如下计算％w.t.值：野生型his-IFN-β的亲和力/突变型IFN-β的亲和力x100。图中显示了单个实验的％w.t.(o)(n＝3)和实验组的平均％w.t.(x)。突变体A2、AB1、AB2、和E在比野生型his-IFN-βEC50(*)高500倍的浓度不与IFNAR2/Fc结合。
图2丙氨酸取代的干扰素-β-1a突变体与在DaudiBurkitt氏淋巴瘤细胞上表达的I类干扰素细胞表面受体复合物(“IFNAR1/2复合物”)的结合。
如实施例1(D部分)所述，使用基于FACS的细胞表面受体结合实验，测定了丙氨酸取代突变体(A1-E)的受体结合特性。矩形图表示它们在此实验中相对于野生型his-IFN-β的受体结合亲和力(％w.t.)。如下计算每种突变体的％w.t.：野生型his-IFN-β的亲和力/突变型IFN-β的亲和力x100。图中显示了单个实验的％w.t.值(o)(n＝3)和实验组的平均％w.t.值(x)。
图3丙氨酸取代的干扰素-β-1a突变体的抗病毒活性。
如实施例1(E部分)所述，在受EMC病毒攻击的人A549细胞上，测定了丙氨酸取代突变体(A1-E)的抗病毒活性。矩形图表示它们在此实验中相对于野生型his-IFN-β的活性(％w.t.)。如下计算％w.t.：野生型his-IFN-β的浓度[50％cpe]/突变型IFN-β的浓度[50％cpe]x100。图中显示了多重实验的％w.t.(o)和实验数据组的平均值(x)。
图4丙氨酸取代的干扰素-β-1a突变体的抗增殖活性。
如实施例1(E部分)所述，在DaudiBirkitt氏淋巴瘤细胞上，测定了丙氨酸取代突变体(A1-E)的抗增殖活性。矩形图表示它们在此实验中相对于野生型his-IFN-β的活性(％w.t.)。如下计算％w.t.：野生型his-IFN-β的浓度[50％生长抑制]/突变型IFN-β的浓度[50％生长抑制]x100。图中显示了多重实验的％w.t.(o)和实验数据组的平均值(x)。
图5丙氨酸取代的干扰素-β-1a突变体的相对抗病毒和抗增殖活性。
图中比较了抗病毒(x轴)和抗增殖(y轴)实验中丙氨酸取代突变体(A1-E)的相对活性。此比较使用了图3和图4中表示的平均％野生型his-IFN-β(％w.t.，x)。两种活性显示协同变化的突变体将落在对角线上。那些显示抗病毒活性的变化与抗增殖活性的变化不成比例的突变体明显偏离对角线(DE1、D、C1)。根据所用平均％w.t.固有的标准偏差测定显著性。
图6通过肽谱进行的PEG化位点的定位。
将PEG化和未修饰干扰素-β-1a进行肽谱分析。将样品用内切蛋白酶Lys-C进行消化，并在C4层析柱上进行反相HPLC。将层析柱用0.1％三氟乙酸中的0-70％梯度乙腈进行洗脱。对层析柱流出液于214nm进行监控。图a：未修饰的干扰素-β-1a；图b：PEG化的干扰素-β-1a。箭头标记了含第1-19位氨基酸的干扰素-β-1aN末端内切蛋白酶Lys肽的洗脱位置。
图7缀合和非缀合干扰素-β-1a的抗病毒活性。
在抗病毒实验中使用受脑心肌炎病毒攻击的人肺癌(A549)细胞评价了x轴指示的浓度下干扰素-β-1a或PEG化干扰素-β-1a的活性。与病毒一起温育2天后，用MTT对存活细胞进行染色，于450nm对平板进行读数，y轴显示了反映细胞生存力的吸光值。用误差条显示了标准偏差。提供50％病毒杀伤(“50％致细胞病变效应”)的干扰素-β-1a或PEG化干扰素-β-1a的浓度(50％最大0D450)是大约11pg/ml，而PEG化干扰素-β-1a的50％致细胞病变效应是大约11pg/ml。
图8使用热变性法评价缀合物的稳定性。
将溶于20mMHEPESpH7.5、20mMNaCl的PEG化干扰素-β-1a和未处理干扰素-β-1a对照以1度/分的恒定速率进行加热。通过于280nm监控吸光值变化以追踪变性。(a)未修饰干扰素-β-1a；(b)PEG化干扰素-β-1a。
图9用干扰素-β-1a或PEG化干扰素-β-1a处理的小鼠血浆中干扰素β抗病毒活性的测量。
给小鼠静脉内注射50,000单位干扰素-β-1a或50,000单位PEG化干扰素-β-1a(含20KPEG)。在x轴所示干扰素注射后的多个时间对这些小鼠进行后眼眶取血。每个时间点至少对3只小鼠进行取血，分离血浆并冻存至在抗病毒实验中使用受脑心肌炎病毒攻击的人肺癌(A549)细胞评价干扰素β活性。用MTT溶液对存活细胞进行染色，于450nm对平板进行读数，以测定反映细胞生存力和干扰素β活性的吸光值。使用干扰素-β-1a绘制每个平板的标准曲线，并用于测定每个样品中干扰素β活性的量。图中显示了来自单个动物的数据。
图10组氨酸标识的干扰素β基因的全DNA序列及其蛋白质产物。
显示了组氨酸标识的IFN-β-1a的全DNA(SEQIDNO：1)和蛋白质(SEQIDNO：2)序列。经切割的VCAM-1信号序列在组氨酸标签(His6，第4-9位)的上游留下了3个氨基末端残基(SerGlyGly)。肠激酶接头序列(AspAspAspAspLys)通过间隔区(第10-12位，SerSerGly)与组氨酸标签分开。天然IFN-β-1a蛋白质序列跨越Met18
发明详述
定义
如此处所用，术语“共价偶联”指指定部分彼此间是直接共价键合的，或者彼此间是通过诸如桥、间隔子、或连接部分间接共价连接的。
“干扰素”(也称为“INF”)是哺乳动物应答诸如病毒、多肽、促分裂原等诱导物而产生的小的、物种特异的单链多肽。本发明最优选使用的干扰素是糖基化的人干扰素β，这种干扰素在第80位残基(Asn80)处发生糖基化，并优选通过重组DNA技术衍生。这种优选的糖基化干扰素β称为“干扰素-β-1a”或“IFN-β-1a”，可替换使用。术语“干扰素-β-1a”还意欲包括其突变体(如实施例1)，条件是这些突变体也在第80位残基(Asn80)处发生糖基化。已经知道用于产生包括干扰素在内的蛋白质的重组DNA方法。参阅美国专利4,399,216、5,149,636、5,179,017(Axe1等人)和4,470,461(Kaufman)。
可以在本发明中使用的优选干扰素-β-1a多核苷酸是由多种脊椎动物(优选哺乳动物)的野生型干扰素β基因序列衍生的，可通过诸如下列美国专利中描述的方法等本领域普通技术人员熟知的方法得到：美国专利5,641,656(1997年6月24日发布；编码禽类I型干扰素前蛋白和成熟禽类I型干扰素的DNA)；美国专利5,605,688(1997年2月25日，重组狗和马I型干扰素)；美国专利5,231,176(1993年7月27日，编码人白细胞干扰素的DNA分子)；美国专利5,071,761(1991年12月10日，编码人类淋巴母细胞干扰素LyIFN-α-2和LyIFN-α-3亚序列的DNA序列)；美国专利4,970,161(1990年11月13日，编码人干扰素γ的DNA序列)；美国专利4,738,931(1988年4月19日，包含干扰素γ基因的DNA)；美国专利4,695,543(1987年9月22日，人干扰素αGx-1基因)和美国专利4,456,748(1984年6月26日，编码不同的天然产生的白细胞干扰素亚序列的DNA)。
可以根据本发明使用干扰素-β-1a的突变体。可使用本领域普通技术人员知道的定向诱变的传统方法产生突变。此外，本发明提供了编码功能性等效的干扰素-β-1a多肽的功能性等效的干扰素-β-1a多核苷酸。
如果编码干扰素-β-1a的第一种多核苷酸满足至少一项下列条件，那么它与编码干扰素-β-1a的第二种多核苷酸相比是“功能性等效的”：
(a)“功能性等效物”指与第二种多核苷酸在标准杂交条件下可发生杂交的第一种多核苷酸，和/或是第一种多核苷酸序列的简并序列。更优选的，它编码具有干扰素-β-1a活性的突变型干扰素；
(b)“功能性等效物”指编码第二种多核苷酸编码的氨基酸序列的第一种多核苷酸。
总而言之，术语“干扰素”包括(但不限于)上述试剂及其功能性等效物。如此处所用，术语“功能性等效物”由此指对哺乳动物接受者(其干扰素被认为是功能性等效物)具有相同或改进的有益效果的干扰素-β-1a蛋白质或编码干扰素-β-1a蛋白质的多核苷酸。本领域普通技术人员可以领会，功能性等效的蛋白质可以通过重组技术，如通过表达“功能性等效的DNA”进行生产。相应的，本发明包括天然DNA以及非天然DNA(与天然DNA编码相同的蛋白质)编码的干扰素-β-1a蛋白质。由于核苷酸编码序列的简并性，其它多核苷酸也可以用于编码干扰素-β-1a。这包括通过编码序列内相同氨基酸残基的不同密码子取代而发生改变，由此产生沉默突变的所有或部分上述序列。这些改变了的序列被认为是这些序列的等效物。例如，Phe(F)由TTC或TTT两种密码子编码，Tyr(Y)由TAC或TAT编码，而His(H)由CAC或CAT编码。另一方面，Trp(W)由TGG一种密码子编码。相应的，可以领会，对于编码特定干扰素的给定DNA序列，存在许多种DNA简并序列。这些简并DNA序列被认为是属于本发明范围内。
“融合”指通过编码蛋白质的多核苷酸分子的基因表达产生两种或多种蛋白质或其片段经由其各自肽主链的共线性连接。优选蛋白质或其片段来自不同来源。由此，优选的融合蛋白包括与非干扰素的第二种部分共价连接的干扰素-β-1a蛋白质或片段。具体而言，“干扰素-β-1a/Ig融合体”指包含连接在免疫球蛋白链N末端的本发明的干扰素-β-1a分子或其片段的蛋白质，其中免疫球蛋白的N末端部分被干扰素-β-1a取代。
“重组”，如此处所用，指由重组体哺乳动物表达系统衍生的蛋白质。在大多数细菌培养物(如大肠杆菌)中表达的蛋白质是不含聚糖的，所以这些表达系统不是优选的。在酵母中表达的蛋白质可能含有与在哺乳动物中表达时不同的寡糖结构。
“生物学活性”，如贯穿说明书作为干扰素-β-1a的特征使用，指与此处公开的本发明实施方案享有足够氨基酸序列同源性，从而按实施例1中所示类型的体外抗病毒实验测量时具有抗病毒活性的特殊分子(见下文)。
“治疗性组合物”，如此处所用，定义为包含本发明的蛋白质和其它生理学相容的成分。治疗性组合物可以包含诸如水等赋形剂、矿物质和诸如蛋白质等载体。
本发明试剂的“有效量”指对治疗的具体状况产生结果或发挥影响的量。
“氨基酸”指肽、多肽、或蛋白质的单体单位。在天然产生的肽、多肽和蛋白质中发现20种氨基酸，都是L型异构体。该术语还包括氨基酸类似物和蛋白质氨基酸的D型异构体及其类似物。
“衍生的”氨基酸指天然侧链或末端基团经化学反应修饰过的天然或非天然氨基酸。这些修饰包括例如γ羧基化、β羧基化、硫酸化、磺酸化、磷酸化、酰胺化(amidization)、酯化、N乙酰化、羧苯甲基化、甲苯磺酸化、和其它本领域已知的修饰。“衍生的多肽”指包含一个或多个衍生的氨基酸的多肽。
“蛋白质”指基本上由上述20种氨基酸任意组成的任何聚合物。虽然“多肽”通常用于指相对较大的多肽，而“肽”通常用于指相对较小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用是有重叠的而且是变化的。术语“蛋白质”，如此处所用，指肽、蛋白质和多肽，除非另有注释。
“突变”指有机体遗传物质中的任何变化，尤其是野生型多核苷酸序列中的任何变化(即删除、取代、添加、或改变)或野生型蛋白质中的任何变化。术语“突变体”、“突变型”可以与“突变”互换使用。
“野生型”指蛋白质外显子或其部分、或蛋白质序列或其部分的天然多核苷酸序列，如其在体内正常存在的。
“标准杂交条件”指杂交与洗涤条件基本上与0.5xSSC至约5xSSC和65℃相当的盐和温度条件。术语“标准杂交条件”，如此处所用，因此是操作性定义，并包括一定范围的杂交条件。更高严谨条件可以包括例如与噬斑筛选缓冲液(0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％菲科尔400；0.2％牛血清清蛋白、50mMTris-HClpH7.5：1MNaCl；0.1％焦磷酸钠；1％SDS)；10％硫酸葡聚糖和100μg/ml变性超声破碎鲑鱼精DNA于65℃杂交12-20小时，并用75mMNaCl/7.5mM柠檬酸钠(0.5xSSC)/1％SDS于65℃清洗。更低严谨条件可以包括例如与噬斑筛选缓冲液、10％磷酸葡聚糖和110μg/ml变性超声破碎鲑鱼精DNA于55℃杂交12-20小时，并用300mMNaCl/30mM柠檬酸钠(2.0xSSC)/1％SDS于55℃清洗。还可参阅《分子生物学现行方案》(JohnWiley&Sons，Inc.，纽约，第6.3.1-6.3.6部分，1989)。
“表达控制序列”指当与基因操作性连接后可控制并调控那些基因表达的多核苷酸序列。
“操作性连接”当表达控制序列可控制并调控多核苷酸序列的转录和翻译时，则该多核苷酸序列(DNA、RNA)与表达控制序列是操作性连接的。术语“操作性连接”包括在待表达多核苷酸序列前具有适当的起始信号(如ATG)并维持正确的阅读框架，使得多核苷酸序列能够在表达控制序列的控制下表达并产生该多核苷酸序列编码的期望多肽。
“表达载体”指当导入宿主细胞后能够表达至少一种基因的诸如DNA质粒或噬菌体(以及其它常见实例)等多核苷酸。载体可以在细胞中复制，或者不能复制。
“分离的”(可以与“基本上纯的”互换使用)，当应用于表示编码多肽的核酸(即多核苷酸序列)时，指RNA或DNA多核苷酸、部分基因组多核苷酸、cDNA或合成多核苷酸，由于其起源或操作，它们：(i)与其天然相关的多核苷酸不相关(如作为表达载体或其部分存在于宿主细胞中)；或(ii)与自然状况下并不连接的核酸或其它化学部分连接；或(iii)天然不存在。“分离的”还指下列多核苷酸序列：(i)通过例如聚合酶链式反应(PCR)在体外扩增的；(ii)化学合成的；(iii)通过克隆重组产生的；或(iv)通过切割和凝胶分离纯化的。
由此，“基本上纯的核酸”指与衍生该核酸的有机体天然基因组中正常相连的一侧或两侧编码序列不直接相连的核酸。基本上纯的DNA还包括作为编码额外序列的杂合体基因中一部分的重组DNA。
“分离的”(可以与“基本上纯的”互换使用)，当应用于多肽时，指多肽或其部分由于其起源或操作而：(i)作为表达载体一部分的表达产物存在于宿主细胞中；或(ii)与非天然连接的蛋白质或其它化学部分连接；或(iii)天然不存在。“分离的”还指下列蛋白质：(i)化学合成的；或(ii)在宿主细胞中表达并与相关蛋白质纯化分开的。该术语一般指已经与其它蛋白质和其天然核酸分开的多肽。优选的，多肽还与诸如用于纯化的抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)等物质分开。
“异源启动子”，如此处所用，指与基因或纯化的核酸不是天然相关的启动子。
“同源”，如此处所用，与术语“同一性”同义，指两种多肽分子之间或两种核酸之间的序列相似性。如果比较的两种序列中的某个位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时(例如，如果两种DNA分子中的某个位置都被腺嘌呤占据时，或两种多肽中的某个位置都被赖氨酸占据时)，那么这两种分子在这个位置是同源的。两种序列之间的同源性百分率是两种序列享有的匹配或同源位置数目除以所比较的位置数目x100的函数。例如，如果在两种序列中，10个位置中的6个是匹配的或同源的，则这两种序列是60％同源的。作为例示，DNA序列CTGACT和CAGGTT享有50％同源性(所有6个位置中有3个匹配)。一般而言，比较是在对两种序列进行排列以产生最大同源性时进行的。通过使用例如Needleman等人的方法(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453，1970)，方便的执行诸如Align程序(DNAstar公司)等计算机程序，可以提供这种排列。同源序列享有同一或相似氨基酸残基，其中相似残基是排列的参照序列中相应氨基酸残基的保守性取代，或“允许的点突变”。在这方面，参照序列中残基的“保守性取代”是那些与相应参照残基物理或功能相似的取代，如具有相似大小、形状、电荷、化学特性(包括形成共价键或氢键的能力)等等。特别优选的保守性取代满足Dayhoff等人(5：蛋白质序列和结构图谱(AtlasofProteinSequenceandStructure)，5：增刊3，第22章，第354-352页，Nat.Biomed.Res.Foundation，华盛顿特区，1978)为“可接受的点突变”制定的标准。
术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”此处也可以互换使用。
“血管生成”和“新血管形成”广义上指新血管的补充。血管生成还指肿瘤位点新血管的补充。
“IFNAR2”、“IFNARl”、“IFNAR1/2”指已知包含细胞表面I型干扰素受体的蛋白质。IFNAR2链的细胞外部分(胞外结构域)部分仅自身即可结合干扰素α或β。
除非另有说明，本发明的实践将采用属于本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白质化学、和免疫学的传统技术。参阅，例如，分子克隆：实验室手册，第2版(Sambrook、Fritsch和Maniatis编，冷泉港实验室出版社，1989)；DNA克隆，第I和II卷(D.N.Glover编，1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编，1984)；美国专利号4,683,195(Mullis等人)；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；转录和翻译(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；动物细胞培养(R.I.Freshney编，AlanR.Liss公司，1987)；固定化细胞和酶(IRL出版社，1986)；分子克隆实践指南(B.Perbal，1984)；酶学方法，第154和155卷(Wu等人编，Academic出版社，纽约)；用于哺乳动物细胞的基因转移载体(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，冷泉港实验室)；细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Mayer和Walker编，Academic出版社，伦敦，1987)；实验免疫学手册，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986)；小鼠胚胎操作(冷泉港实验室出版社，1986)。
干扰素β
干扰素-β-1a可以作为试剂，用于疾病状况、生理学状态、症状、或病因的治疗、缓解或减弱，或用于其评价或诊断。该术语还指自身作为融合蛋白(诸如免疫球蛋白-干扰素-β-1a融合蛋白)一部分的干扰素-β-1a，如共同待审的申请系列号60/104,572和60/120,161中所述。融合蛋白的制备一般属于本领域普通技术人员的知识范围内。
我们发现了供聚合物附着但不破坏干扰素-β-1a功能的独特位点。另外，我们还使用了定点诱变方法独立调查聚合物附着位点(见实施例1)。简而言之，我们进行了以定位活性和受体结合所需残基为目的的人干扰素-β-1a的突变性分析。有人干扰素-β-1a的3D晶体结构可供使用(见上文和实施例1)，这使得我们能够通过丙氨酸(或丝氨酸)取代鉴定可与干扰素β受体相互作用的暴露于溶剂的残基，并保留涉及分子内键的氨基酸。设计了沿干扰素-β-1a各个螺旋(A、B、C、D、E)和环(AB1、AB2、AB3、CD1、CD2、DE1、DE2)不同区域取代2至8个残基的1组15种丙氨酸扫描突变。见实施例1。
所含氨基末端的组氨酸标签(“his”标签)用于哺乳动物细胞表达的突变体(图10和SEQIDNO：1和2依次显示了cDNA序列和推导的氨基酸序列)的亲和纯化。在抗病毒和抗增殖实验中评价这些突变的功能性效果。发展了用于分析这些突变体与干扰素β表面细胞受体(IFNAR1/2细胞表面受体)的结合的非放射性结合实验。另外，使用基于ELISA的实验(采用IFNAR2胞外结构域/Ig融合蛋白结合干扰素)进行了干扰素-β-1a和IFNAR2之间相互作用表面的定位(见实施例1)。这些突变分析证明了N和C末端位于对受体结合或生物学功能不重要的干扰素β分子部分。
突变体还包括由于展示野生型干扰素-β-1a中未发现有的新特性而特别有用的本发明干扰素-β-1a部分的变体(见实施例1)。我们鉴定了由靶向诱变引起的3类效应。这些效应对于在某些环境中发展干扰素药物可能是有利的。这3类效应如下：(a)抗病毒活性高于his-野生型干扰素-β-1a的突变体(如突变体C1)；(b)展示抗病毒和抗增殖活性、但是与his-野生型干扰素-β-1a相比，其抗增殖活性相对于抗病毒活性不成比例的低的突变体(如突变体C1、D和DE1)；和(c)与his-野生型干扰素-β-1a相比，显示的抗病毒和抗增殖活性相对于受体结合不成比例的低的功能性拮抗剂(如A1、B2、CD2和DE1)。
聚合物部分
在本发明的宽广范围内，可以采用干扰素-β-1a与一个聚合物分子缀合，但是也涵盖附着多于一个聚合物分子。本发明的缀合干扰素-β-1a组合物可以在体内和非体内应用中都找到效用。另外，可以理解，缀合聚合物可以利用适合于最终应用的任何其它基团、部分、或其它缀合种类。作为例示，在一些应用中向聚合物共价键合可赋予聚合物以UV降解抗性、或抗氧化、或其它特性或特征的功能性部分可能是有用的。作为另一种例示，在一些应用中，使聚合物官能化，从而使其具有反应性或交联功能，增强缀合物整体的各种特性或特征可能是有利的。相应的，聚合物可以包含任何功能性、重复基团、连接、或不妨碍缀合干扰素-β-1a组合物在其设计用途中的功效的其它组成性结构。本发明的其它目的和优势由下面的公开书和所附权利要求书将更加清晰。
在下面的例示性反应方案中描述了可以用于实现这些期望特征的例证性聚合物。在共价键合肽应用中，可以使聚合物官能化，然后与肽的游离氨基酸偶联，形成不稳定键。
干扰素-β-1a经由聚合物末端反应基团缀合是最优选的，但是缀合也可以由非末端反应基团产生分支。具有反应基团的聚合物此处称为“活化的聚合物”。反应基团与蛋白质上的游离氨基或其它反应基团选择性反应。活化的聚合物通过反应可以附着到任何可用的干扰素-β-1a氨基上，诸如α-氨基或赖氨酸的ε-氨基。干扰素-β-1a的游离羧基、适当活化的羰基、羟基、胍基、氧化的碳水化合物部分或巯基(如果可触及)也可以作为附着位点使用。
虽然聚合物可以附着在干扰素-β-1a分子上的任何位点，但是聚合物偶联的最优选位点是干扰素-β-1a的N末端。第二位点位于C末端或附近，并通过糖部分。由此，本发明涵盖(作为最优选的实施方案)：(i)N末端偶联聚合物的干扰素-β-1a缀合物；(ii)C末端偶联聚合物的干扰素-β-1a缀合物；(iii)聚合物缀合物的糖偶联缀合物；(iv)干扰素-β-1a融合蛋白的N、C末端和糖偶联聚合物缀合物。
根据蛋白质浓度，每摩尔蛋白质一般采用由大约1.0至大约10摩尔活化的聚合物。最终的量平衡在使反应程度最大化而产物非特异修饰最小化之间，同时，在维持最佳活性的同时(如果可能)使蛋白质半衰期最优化。优选的，蛋白质的生物学活性保留了至少大约50％，最优选保留了100％。
可以通过使生物学活性物质与惰性聚合物发生反应的任何合适方法进行反应，如果反应基团位于N末端的α-氨基上，则优选大约pH5-7。一般而言，该过程涉及制备活化的聚合物(其可能具有至少一个末端羟基)，然后使蛋白质与活化的聚合物发生反应，以产生适合于制剂的可溶性蛋白质。上述修饰反应可以通过多种方法进行，可能涉及一个或多个步骤。
如上所述，本发明最优选的实施方案利用了干扰素-β-1a的N末端作为与聚合物的连接。可以获得选择性得到N末端修饰的干扰素-β-1a的合适方法。一种方法由还原性烷基化方法例示，其利用了干扰素-β-1a上可用于衍生化的不同种类伯氨基团(赖氨酸的ε-氨基与N末端甲硫氨酸的氨基)的不同反应性。在适当的选择条件下，可以得到在N末端由含羰基的聚合物对干扰素-β-1a进行基本上选择性的衍生化。该反应在能够利用赖氨酸ε-氨基和干扰素-β-1aN末端残基α-氨基的pKa差异的pH进行。这类化学法对本领域普通技术人员是熟知的。
在我们使用的反应方案中，通过在低pH(一般5-6)，在PEG-醛聚合物与干扰素-β-1a在氰基硼氢钠存在时发生反应的条件下进行反应而维持选择性。在对PEG-干扰素-β-1a进行纯化并用SDS-PAGE，MALDI质谱和肽测序/定位进行分析后，产生了N末端由PEG部分特异靶向的干扰素-β-1a。
干扰素-β-1a的晶体结构显示，N和C末端彼此接近(参阅Karpusas等人，1997，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94：11813-11818)。由此，干扰素-β-1aC末端的修饰也应当对活性具有最小的影响。由于没有简单的化学策略可以将聚亚烷基二醇聚合物(诸如PEG)锚定在C末端时，将直接通过基因工程加工可以用于锚定聚合物部分的位点。例如，在C末端位点或附近掺入Cys可使得能够使用马来酰亚胺、乙烯砜或卤代醋酸酯活化的聚亚烷基二醇(如PEG)进行特异修饰。由于这些试剂对Cys有高选择性，故这些衍生物可以特异用于改造的半胱氨酸的修饰。其它策略，诸如掺入能够锚定的组氨酸标签(Fancy等人，1996，化学和生物学(Chem.&Biol.)3：551)或额外的糖基化位点，代表了用于修饰干扰素-β-1aC末端的其它选择。
干扰素-β-1a上的聚糖也处于能够进行进一步修饰而不改变活性的位置。用于锚定作为化学修饰位点的糖的方法也是众所周知的，因此可以向干扰素-β-1a上通过氧化已经活化了的糖直接并特异添加聚亚烷基二醇聚合物。例如，可以产生聚乙二醇-酰肼，其可通过与醛和酮缩合形成相对稳定的腙连接。此特性已经用于通过氧化的寡糖连接对蛋白质进行修饰。参阅H.Andresz等人，1978，高分子化学(Macromol.Chem.)179：301。具体而言，用亚硝酸盐(酯)处理PEG-羧甲基酰肼，产生的PEG-羧甲基氮化物是能与氨基发生反应的亲电子活性基团。此反应也可以用于制备聚亚烷基二醇修饰的蛋白质。参阅美国专利4,101,380和4,179,337。
我们先前已经发现，巯基接头介导的化学法能够进一步促进蛋白质的交联。具体而言，我们使用诸如高碘酸钠在碳水化合物部分上产生反应性醛基、通过醛形成胱胺缀合物、并通过胱胺上的巯基诱导交联等步骤，产生了LFA-3和CD4的同型聚合物。参阅B.Pepinsky等人，1991，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)266：18244-18249和L.L.Chen等人，1991，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)266：18227-18243。因此，我们认为，这类化学法也适于用聚亚烷基二醇聚合物修饰，其中向糖中掺入接头并将聚亚烷基二醇聚合物附着在接头上。含氨基巯基(aminothiol)或肼的接头能够用于加入单个聚合物基团，接头的结构可以有所变化，使得能够加入多个聚合物，且/或改变聚合物相对于干扰素-β-1a的空间取向。
在本发明的实践中，向感兴趣的聚合物系统中掺入C1-C4烷基聚亚烷基二醇的聚亚烷基二醇残基，优选聚乙二醇(PEG)，或这种二醇的聚氧化烯二醇残基是有利的。由此，蛋白质附着的聚合物可以是聚乙二醇(PEG)的同聚物或聚氧乙烯化多元醇，条件是聚合物在所有情况中于室温可溶于水。这些聚合物的非限制性范例包括聚环氧烷同聚物，诸如PEG或聚丙二醇、聚氧乙烯化二元醇、及其共聚物和嵌段共聚物，条件是维持嵌段共聚物的水溶性。聚氧乙烯化多元醇的范例包括例如聚氧乙烯化甘油、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖等等。聚氧乙烯化甘油的甘油主链与天然产生的例如动物或人的单、二、和三甘油酯的主链相同。因此，这种支化不必视为体内外来试剂。
作为聚环氧烷的替代，可以使用葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物等等。本领域普通技术人员将领会，前文所列都是举例，本发明涵盖具有此处所述性质的所有聚合物材料。
聚合物不需要具有任何特殊分子量，但是分子量优选大约300至100,000之间，更优选10,000至40,000之间。具体而言，20,000或更大的分子量最能保护蛋白质免于肾过滤的损失。
聚亚烷基二醇衍生化在本发明的实践中配制聚合物-干扰素-β-1a缀合物中具有大量有利特性，这与聚亚烷基二醇衍生物的下列特性相关：水溶性的改进，同时不诱发抗原性或免疫原性应答；高度生物相容性；聚亚烷基二醇衍生物不存在体内生物降解；和容易通过存活有机体排泄。
此外，在本发明的其它方面，可以利用与聚合物组分共价键合的干扰素-β-1a，其中缀合的本质涉及可切割的共价化学键。这使得能够在从干扰素-β-1a上切下聚合物的过程中进行控制。干扰素-β-1a药物和聚合物之间的这种共价键可以通过化学或酶反应切割。聚合物-干扰素-β-1a产物保留了可接受量的活性。同时，缀合聚合物中存在的聚乙二醇部分赋予聚合物-干扰素-β-1a缀合物以高水溶性和延长的血液循环能力。作为这些改进特征的结果，本发明涵盖了活性聚合物-干扰素-β-1a种类和水解切割后生物可获得的干扰素-β-1a本身在体内应用中通过非胃肠道、鼻、和口的投递。
应当理解，此处所述的反应方案只是例证，而非限制在干扰素-β-1a的修饰(如获得可溶性、稳定性和用于非胃肠道和口施用的细胞膜亲和性)中可利用的反应和结构。为获得最优选的N末端缀合产物的聚合物与干扰素-β-1a的反应，使用多种反应方案可以容易的进行。干扰素-β-1a缀合物的活性和稳定性可以通过使用不同分子大小的聚合物进行改变。缀合物的溶解性可以通过改变掺入聚合物组合物中的聚乙二醇片段的比例和大小进行改变。
效用
聚亚烷基二醇衍生的聚合物值得用于本发明治疗性应用的独特特性是它们的普遍生物相容性。聚合物具有多种水溶性特性，而且是无毒的。它们是无免疫原性和无抗原性的，而且在此处所述条件下缀合后不妨碍干扰素-β-1a部分的生物学活性。它们在血液中的循环周期长，而且可以由存活有机体容易的排泄。
已经发现本发明产物可以用于延长治疗性干扰素-β-1a的半衰期，而且可以例如通过溶于水或可接受液体介质中配制用于治疗性施用。施用包括非胃肠道、气雾剂、或口服途径。可以制备精细胶体悬浮液，用于进行非胃肠道施用以产生长效制剂效应，或者使用可以是液体或干粉的气雾制剂采用口服途径。在冻干状态或溶液制剂中，本发明的干扰素-β-1a-聚合物缀合物应具有优良的保存稳定性。缀合干扰素-β-1a的热稳定性(实施例3)在包含脱水步骤的粉剂配制过程中是有利的。参阅如PCT/US/95/06008(“用于制备干扰素干粉的方法和组合物”)。
本发明的治疗性聚合物缀合物可以用于干扰素-β-1a成分有效的任何状态或疾病状况的预防或治疗。另外，基于聚合物的本发明缀合物可以用于生物学系统或标本中成分、状态或疾病状况的诊断，以及非生理学系统中的诊断目的。
在治疗性用途中，本发明涵盖用于治疗患有或潜在的易患这些状态或疾病状况并需要这种治疗的动物的方法，包括对这种动物施用有效量的对所述状态或疾病状况有治疗性效果的本发明聚合物缀合物。待用本发明的聚合物缀合物进行治疗的个体包括哺乳动物，最优选人。根据待对付的特异状态和疾病状况，可以以任何合适的治疗上有效且安全的剂量对动物施用本发明的聚合物缀合物，这可以由本领域技术人员容易地测定，无需过量实验。由于I型干扰素的物种屏障，由合适物种的干扰素产生此处所述干扰素-聚合物缀合物可能是必要的。
众所周知，干扰素-β-1a具有抗细胞增殖活性。具体而言，此处所述某些干扰素-β-1a聚合物缀合物可用于治疗肿瘤和癌症，诸如骨源性肉瘤、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、乳腺癌、黑色素瘤和鼻咽癌，以及自身免疫状况，诸如纤维变性、狼疮和多发性硬化症。还预计缀合蛋白质展示，具体而言，此处描述的某些干扰素-β-1a突变蛋白缀合物的抗病毒活性可用于治疗病毒性疾病，诸如ECM感染、流感、和其它呼吸道感染、狂犬病、和肝炎。还预计此处描述的缀合蛋白质展示的干扰素-β-1a的免疫调节活性，可用于治疗自身免疫性和炎症性疾病，诸如纤维变性、多发性硬化症。干扰素抑制新血管形成的能力(即抑制血管生成和新血管形成)使得本发明缀合物能够用于治疗血管生成性疾病，诸如糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织形成、潮红和Osler-Webber综合症。
此外，已知干扰素具有抗内皮活性，干扰素作用的一种潜在的机制可能是通过抑制由肿瘤细胞产生的血管生成因子的产生或功效从而干涉内皮细胞的活性。一些血管肿瘤，诸如血管瘤，对干扰素治疗特别敏感。干扰素α治疗是用于此疾病的唯一有记录的治疗。由于预计本发明干扰素-β-1a缀合物在血管中的维持时间比非缀合干扰素长，由此产生作为抗血管生成试剂使用的更有效的疗法，所以预计缀合物治疗将在药物动力学和药效动力学方面提供实质性的治疗益处。参阅实施例8。
本发明的聚合物-干扰素-β-1a缀合物本身可以施用，也可以以制药学可接受的酯、盐、及其其它生理学功能性衍生物施用。在这些制药学和医药制剂中，优选将干扰素-β-1a与一种或多种制药学可接受载体和任选任何其它治疗性成分一起应用。载体必须是制药学可接受的，即与制剂中的其它成分相容，而且对其接受者不过分有害。如上所述，以实现期望的药理学效果的有效量和实现期望的每日剂量的适当量，提供干扰素-β-1a。
制剂包括那些非胃肠道以及胃肠道施用，而具体施用形式包括口服、直肠、经颊、局部、鼻、眼、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴管、阴道、和子宫内施用。优选适用于口服、鼻、和非胃肠道施用的制剂。
当以包含溶液的制剂应用干扰素-β-1a时，通过口或非胃肠道施用制剂可能是有利的。当以悬浮液制剂或生物相容性载体制剂中的粉末形式施用干扰素-β-1a时，通过口、直肠、或支气管施用制剂可能是有利的。
当以固体粉末形式直接应用干扰素-β-1a时，通过口服施用干扰素-β-1a可能是有利的。或者，通过喷雾载气中的粉末，形成粉末的气态分散体，经由鼻或支气管施用而由患者通过包括合适喷雾器装置的呼吸循环仪吸入可能是有利的。
包含本发明聚合物缀合物的制剂可以通过任何药学领域众所周知的方法方便的配制成单位剂型。这些方法一般包括将活性成分与包含一种或多种附属成分的载体混合的步骤。典型的，均一的制备制剂，并将活性成分与液体载体或精细分离的固体载体或二者混合，然后，如果需要，将产物定型为期望制剂的剂型。
适合于通过口服施用的本发明制剂可以以离散单位存在，诸如胶囊、扁囊剂、片剂、或锭剂，各包含预定量的活性成分(粉末或颗粒)；或水性液体或非水性液体中的悬浮液，诸如糖浆、酏剂、乳剂、或饮剂。
片剂可以通过压制或模制生产，并任选的与一种或多种附属成分一起生产。压制片剂可以通过在合适的机器中与自由流动形式(诸如粉末或颗粒)的活性化合物，任选的与结合剂、崩解剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂、或发放剂一起加压生产。包含粉状聚合物缀合物与合适载体的混和物的模制片剂可以在合适的机器中模制生产。
糖浆可以通过向糖(诸如蔗糖)的浓缩水性溶液中加入活性化合物生产，还可以加入任何附属成分。这些附属成分包括调味剂、合适的防腐剂、阻碍糖结晶的试剂、和增加任何其它成分溶解度的试剂，诸如多元醇，例如甘油或山梨醇。
适合于非胃肠道施用的制剂可方便的包含活性缀合物的无菌水性制备物，其优选与接受者的血液等渗(即生理学盐溶液)。这些制剂可以包括悬浮剂和增稠剂或设计将化合物靶向血液成分或一种或多种器官的其它微粒系统。制剂可以以单剂或多剂形式存在。
鼻喷雾制剂包含经纯化的活性缀合物与防腐剂和等渗剂的水溶液。优选将这些制剂调至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。
用于直肠施用的制剂可以与合适载体(诸如可可脂、氢化脂肪、或氢化脂肪酸)的栓剂存在。
眼用制剂，诸如眼药水，优选通过与鼻喷雾剂相似方法制备，不同只是优选调至与眼匹配的pH和等渗系数。
局部用制剂包含溶解或悬浮于一种或多种介质(诸如矿物油、石油、多元醇、或用于局部药理学制剂的其它基质)的本发明缀合物。
除了上述成分，本发明制剂还可以包括一种或多种下列附属成分：稀释液、缓冲液、调味剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等等。
相应的，本发明涵盖提供用于溶液中干扰素-β-1a的体外稳定的合适聚合物，作为非治疗性应用的优选例证性应用。聚合物可以用于例如增加干扰素-β-1a的热稳定性和酶降解抗性。本发明方式的缀合增强了干扰素-β-1a的热稳定性特征，由此提供了改进保存期、室温稳定性、以及研究试剂和试剂盒可靠性的方法。
下列实施例提供了本发明的例证而非限制。具体而言，应当理解，此处描述的体内动物实验可以有所改变，基本方法学的其它修饰和变化是可能的。例如，在实施例5中，本领域普通技术人员可以使用其它新喋呤实验，或者可以改变所用灵长类动物的数目和种类。实施例的这些修饰和变化被认为属于本发明的精神和范围内。
实施例
实施例1：使用丙氨酸/丝氨酸取代突变进行人干扰素-β-1a的结构/活性研究：受体结合位点和功能性结构域的分析
A.概述
进行人干扰素-β-1a(IFN-β-1a)的广泛的突变分析，以便对活性和受体结合需要的残基定位。人IFNβ的3D晶体结构的获得(M.Carpusas等人，1997，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94：11813-11818)使得我们能够对受体相互作用中可利用的暴露于溶剂的残基进行丙氨酸(或丝氨酸)取代鉴定，并保留涉及分子内键的氨基酸。设计了沿每个螺旋(A、B、C、D、E)和环(AB、CD、DE)的不同区域中取代2-8个残基的1组15种丙氨酸取代突变。引入了用于亲和纯化的包含6个组氨酸残基的氨基末端组氨酸标签，以及用于除去氨基末端延伸的肠激酶切割位点。产生的干扰素称为“his标识的干扰素(IFN)β”或“His-干扰素β”或“His6-干扰素β”等等。
使用野生型IFNβ基因构建物作为诱变模板，构建了多种突变型his标识的IFNβ表达质粒。诱变策略涉及首先向野生型his标识的IFNβ基因引入独特的限制酶切割位点，然后用编码丙氨酸(或丝氨酸)取代突变的合成寡核苷酸双链取代选择的限制性位点间的不同DNA序列。最后，将突变型IFN基因亚克隆到在人293肾细胞系中引导哺乳动物细胞表达的质粒中。
在抗病毒和抗增殖实验中评价这些突变体的功能性效果。发展了用于分析这些突变体与人DaudiBurkitt氏淋巴瘤细胞表面受体(“IFNAR1/2复合物”)的结合的非放射性IFN结合实验。此外，还发展了采用IFNAR2/Ig融合蛋白(包含与人IgGl的铰链、CH2和CH3结构域融合的IFN受体蛋白IFNAR2细胞外结构域)定位his-IFN-β突变体和IFNAR2之间的相互作用表面的实验。
1.作为诱变模板的干扰素β基因的产生
产生IFNβ丙氨酸(或丝氨酸)取代突变体的策略是，首先产生编码野生型蛋白质但是携带散布于基因中的独特限制酶切割位点的经修饰IFNβ基因。使用这些独特位点，从而用编码突变密码子的合成寡核苷酸双链替换野生型序列。为了获得适合于产生突变基团的人IFN-β-1a表达盒，通过PCR扩增IFNβcDNA(GenBank编号E00029)。为了在缺乏特异限制性位点(将通过诱变产生)的质粒中进行基因的定点诱变，将IFNβ基因首先克隆到pACYC184衍生物pMJB107质粒(见Rose等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16(1)：355)中是必需的。
用于亚克隆人IFNβ基因编码序列的PCR引物还使得我们能够将肠激酶切割位点导入IFNβ基因上游并与其读框一致，并可导入可用于克隆到质粒pMJB107中的侧翼限制酶位点(BspEI和XhoI)(5’PCR引物：5’TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3’(SEQIDNO：3：“BET-021”)，和3’PCR引物：5’-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3’(SEQIDNO：4：“BET-022”))。产生的DNA称为PCR片段A。
将来自人血管细胞粘连分子1(VCAM-1)的有效信号序列和六组氨酸标签导入来自pDSW247产生的第二种DNA片段(片段B)的最终构建物。质粒pDSW247是删除了EBNA-1基因、携带融合在六组氨酸标签上游并与其读框一致的VCAM-1信号序列(VCAMss)的pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)衍生物。用于产生VCAMss-1/组氨酸标签盒部分的PCR引物是可掺入能够切除DNA片段B的侧翼限制酶切割位点(NotI和BspEI)的KID-369(5’PCR引物5’-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3’：SEQIDNO：5)和KID-421(3'PCR引物5’-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3’：SEQIDNO：6)。
为了产生携带VCAM-1信号序列、his标签和干扰素β基因的质粒载体，我们使用来自质粒载体pMJB107的经凝胶纯化的DNA片段(经NotI和XhoI切割)、PCR片段A(经BspEI和XhoI切割)和片段B(经NotI和BspEI切割)进行了三片段连接反应。使用连接质粒转化JA221或XL1-Blue大肠杆菌细胞，并挑取氨苄青霉素抗性菌落，通过限制性图谱分析测试插入片段。大量制备DNA并通过DNA测序检验插入片段序列。产生的构建物称为pCMG260。
2.pCMG260中人干扰素β的丙氨酸取代突变体的产生
使用质粒pCMG260作为多轮诱变(U.S.E.定点诱变试剂盒(U.S.E.SiteDirectedMutagenesisKit)，Boehringer-Mannheim)的模板，将独特限制性切割位点导入沿IFNβ蛋白质编码序列的位置，但是不改变产生的蛋白质序列。使用经诱变质粒转化JA221或XLl-Blue大肠杆菌菌株，并选择氯霉素抗性重组菌落。对于氯霉素抗性菌落，通过DNA限制性图谱分析，进一步测试期望的独特限制酶位点的存在。产生的IFNβ质粒pCMG275.8包含全套独特限制酶切割位点，证实其中该基因的DNA序列。图10一起显示了经修饰的、his标识的干扰素β基因整个DNA序列(SEQIDNO：1)与蛋白质编码序列(SEQIDNO：2)。
表1(见下文)描述了全套丙氨酸取代突变。突变体的命名说明了导入突变的结构区域(螺旋和环)。丙氨酸(丝氨酸)取代的全图包括人IFNβ165个氨基酸中65个的突变。
由pCMG275.8，用携带表2(见下文)描述的基因编码信息的合成寡核苷酸双链取代独特限制性位点之间的DNA片段，产生突变体。为了产生各种丙氨酸取代突变体质粒，将经凝胶纯化pCMG275.8载体(经适当限制酶切割，如下表中为每种IFNβ结构区域所示)和寡核苷酸双链(表2显示了编码链序列)连接在一起。使用连接混和物转化JA221大肠杆菌菌株，并选择氨苄青霉素抗性重组菌落。对氨苄青霉素抗性菌落，通过筛选适当限制酶位点测试插入突变的存在。对于两种突变体(A2和CD2)，采用使用携带互补重叠末端的两种合成寡核苷酸双链(表2所示)的克隆策略，在三片段连接反应中，使得它们能够彼此间并与载体-IFN-β主链连接在一起。下表图解了用于克隆表2经突变寡核苷酸的位点。克隆方案(B部分)显示了这些独特位点在干扰素β基因上的位置。
表1
人IFNβ中丙氨酸取代突变的位置
表1中的编号与序列的对应关系如下
SEQ ID N0： 表1中的编号
25 IFN-β
26 A1
27 A2
28 AB1
29 AB2
30 AB3
31 B1
32 B2
33 C1
34 C2
35 CD1
36 CD2
37 D
38 DE1
39 DE2
40 E
命名为IFNβ的线条显示了野生型IFNβ序列。显示了每种突变体中IFNβ残基的丙氨酸或丝氨酸取代，而相关区域下面的短线代表野生型序列。突变体下面的长线指明了螺旋和环结构。DE环跨越D和E螺旋之间的缺口。产生了另外两种丙氨酸取代突变体(H93A、H97A和H121A)，并在抗病毒实验中进行分析，以评价这些在晶体结构二聚体中螯合锌的组氨酸突变的影响。这两种突变体在抗病毒实验中都保留了全部野生型活性，说明锌介导的二聚体的形成对IFNβ活性不重要。
表2
A1SEQIDCCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAAGC
NO：7TTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC
BET-053
A2SEQIDGATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGGCTT
NO：8GAATACT
BET-039
SEQID
NO：9GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
BET-041
AB1SEQIDAATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGACATCC
NO：10CTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
BET-080
AB2SEQIDAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCTATCCC
NO：11TGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
BET-082
AB3SEQIDAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACA
NO：12
BET-084
SEQIDTCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA
NO：13
BET-086
B1SEQIDCGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCAGACAA
NO：14GATTCATCTAGCACTGGCTGGAA
BET-110
B2SEQIDCGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCGCTGCAG
NO：15CTTCATCTAGCACTGGCTGGAA
BET-112
C1SEQIDGGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGATAAACCATC
NO：16TGAAGACAGTTCTAG
BET-114
C2SEQIDGGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATAGCACATC
NO：17TGGCTGCAGTTCTAG
BET-092
CD1SEQIDCTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT
NO：18
BET-094
CD2SEQIDCTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA
NO：19GCGCGCTGCACCTGAAAAGA
BET-096
SEQIDTATTATGGGAGGATTCTCCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACACTGT
NO：20
BET-106
D1SEQIDCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATACCTG
NO：21GCAGCCAAGGAGTACTCACACTGT
BET-108
DE1SEQIDCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTG
NO:22AAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGAT
BET-116
DE2SEQIDCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGA
NO：23AGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGAT
BET-118
E1SEQIDCGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG
NO：24
BET-104
B.EBNA293表达质粒的构建
与VCAM-1信号序列、组氨酸标签和肠激酶切割位点融合的野生型和突变型IFNβ基因经凝胶纯化，为761碱基对的NotI和BamHI限制性片段。如示意图所描述的，将纯化基因亚克隆到经NotI和BamHI切割的质粒载体pDSW247中。质粒pDSW247是用于在人EBNA293肾细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中瞬时表达蛋白质的表达载体。如克隆策略示意图所示(见下文)，它包含巨细胞病毒的早期基因启动子和在此系统中高水平基因表达需要的EBV调控元件，以及用于大肠杆菌(氨苄青霉素抗性)和EBNA293细胞(潮霉素抗性)的选择性标记。使用连接质粒转化JA221或XL1-Blue大肠杆菌细胞，并挑取氨苄青霉素抗性菌落，通过限制性图谱分析测试插入片段。大量制备DNA，并通过DNA测序确认插入片段的序列。如下所述，使用显示所需的经诱变序列的阳性克隆转化人EBNA293肾细胞。
全部克隆策略如下：
克隆策略和IFNβ表达质粒的示意图
C.IFN-β-1a丙氨酸取代突变体的表达和定量分析
在添加10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和250μg/mlGeneticin(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)的经Dulbecco’sModifiedEagle氏培养基中，作为亚铺满培养物维持人EBNA293细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA；T.Chittenden，1989，病毒学杂志(J.Virol.)63：3016-3025)。使用lipofectamine方案(Gibco/BRL，LifeTechnologies)，将pDSW247表达质粒瞬时转染到EBNA293细胞中。转染3-4天后，收获条件培养基，通过离心除去细胞碎片，并通过ELISA对his-IFN-β浓度进行定量分析。
使用多克隆兔抗体(针对经纯化的人IFN-β-1a制备的经蛋白A纯化的IgG抗体)包被96孔ELISA板进行ELISA实验，并使用相同多克隆兔IgG的生物素化形式作为第二种试剂，使得能够使用偶联链霉亲和素的辣根过氧化物酶(HRP；JacksonImmunoResearch，W.Grove，PA)进行干扰素检测。使用一系列稀释度的干扰素-β-1a产生标准浓度曲线。将含有his-IFN-β的来自EBNA转染子的条件培养基进行稀释，以获得ELISA实验的浓度范围在10ng/ml至0.3ng/ml之间的样品。为了确认ELISA测定的培养基中的IFNβ浓度，进行Western印渍分析。将经浓缩培养物上清液和IFN-β-1a标准品进行10-20％梯度的SDS-PAGE(Novex，SanDiego，CA)，并转移到PDVF膜上。用兔多克隆抗IFN-β-1a抗血清(#447，Biogen公司，针对IFN-β-1a制备的第二种抗血清)检测免疫反应性条带，随后用偶联HRP的驴抗兔IgG(JacksonImmunoResearch)进行处理。
D.评价干扰素β突变体的受体结合
使用两种不同的结合实验，评价C中所述干扰素β突变体的受体结合特性。一种实验测量干扰素β突变体与融合蛋白IFNAR2/Ig(包含与部分人IgG恒定区融合的人IFNAR2受体链细胞外结构域)的结合。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达IFNAR2-Fc，并通过蛋白Asepharose亲和层析根据制造商(PierceChem.公司，Rockford，IL，产品目录#20334)的指示进行纯化。在ELISA实验中测量干扰素β突变体与IFNAR2-Fc的结合。通过用50μl/孔的小鼠抗人IgGl单克隆抗体(CDG5-AA9，Biogen公司)(10μg/ml于下述包被缓冲液中：50mMNaHCO3、0.2mMMgCl2、0.2mMCaCl2，pH9.6)于4℃包被平底96孔板过夜制备ELISA板。平板用含0.05％吐温20的PBS清洗两次，并用含0.5％脱脂牛奶的PBS于室温封闭1小时。再清洗2次后，每个孔中加入50μl含1μg/mlIFNAR2-Fc、0.5％奶粉、0.05％吐温20的PBS，并于室温温育1小时，然后再清洗2次。通过加入50μl/孔用添加10％胎牛血清的Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM)系列稀释的突变型干扰素β(在条件培养基中)，并于4℃温育2小时，测量干扰素β突变体与IFNAR2-Fc的结合。干扰素-β突变体的稀释范围通常为大约1μM至10pM。清洗后，通过加入50μl/孔混和液(由稀释1000倍的兔多克隆抗干扰素抗体#447和辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔IgG(JacksonImmunoResearch))，并于4℃温育15分钟，检测与板结合的干扰素β。清洗2次后，加入HRP的底物，将板于4℃温育，然后在ELISA板读数仪上读取450nm吸光值。由这些数据绘制吸光值对突变型干扰素β浓度的图，通过将数据拟合一次双曲线结合方程测定突变型干扰素β与IFNAR2-Fc的结合亲和力。图1显示了这些分析的结果，其中每种突变体至少在3个独立实验中测定的结合亲和力以对His6-野生型干扰素-β-1a的测量值的百分率表示。
使用第二种受体结合实验测量干扰素β突变体与表达受体链IFNAR1和IFNAR2(都包含干扰素β受体)的Daudi细胞的亲和力。这种基于FACS的实验使用针对IFNAR1细胞外结构域的封闭单克隆抗体EA12(Biogen公司)，以辨别未占据(游离)受体和结合了干扰素β的受体。将Daudi细胞(20μl，2.5x107细胞/ml)置于96孔V底ELISA板中，并与各种浓度的干扰素β突变体(20μlFACS缓冲液；5％FBS、含0.1％NaN3的PBS)一起于4℃温育1小时。干扰素β突变体的预期系列稀释范围是0.5μM至0.5pM。向每个孔中加入100ng生物素化鼠抗IFNAR1单克隆抗体EA12(10μl)，并将板于室温再温育2分钟，然后用FACS缓冲液(4℃)清洗2次。然后将细胞与50μl/孔的稀释200倍的缀合R-藻红蛋白的链霉亲和素(JacksonImmunoResearch)一起于4℃温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，重悬于300μl含0.5％低聚甲醛的FACS缓冲液，并转移到12x75mm聚苯乙烯管(Falcon2052)中。然后将样品通过FACScan(BectonDickinson)上的流式细胞仪进行分析。由这些数据绘制平均通道荧光强度(MFCI)对干扰素β突变体浓度的图；结合亲和力定义为对抗体染色产生50％抑制的干扰素β突变体浓度。每种突变体测试多次。图2显示了通过这种方法测定的每种干扰素β突变体对受体的结合亲和力，以每个实验中对His6-野生型干扰素-β-1a测量的亲和力的百分率表示。
E.评价干扰素β突变体的功能
使用评估抗病毒活性和干扰素β抑制细胞增殖能力的体外实验，还测试了干扰素β突变体的功能性活性。每种突变体进行了最少三个抗病毒实验，各取3个数据点。在每个实验中加入His6-野生型干扰素-β-1a作为参考。通过用2倍系列稀释的跨越完全抗病毒保护和无针对病毒细胞杀伤保护的浓度范围的突变型干扰素β处理A549人肺癌细胞(ATCCCCL185)过夜，进行抗病毒实验。第二天，用当不存在干扰素时产生完全细胞杀伤的稀释度的脑心肌炎病毒(ECMV)攻击细胞两天。然后用代谢染料MTT(2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基-苯基]-2H-四唑鎓-5-羧基酰替苯胺)(M-5655，Sigma，St.Louis，M0)对板进行显色。在PBS中制备5mg/ml的MTT储存液并过滤除菌，取50μl此溶液在细胞培养液中稀释(100μl/孔)。于室温温育30-60分钟后，弃去MTT/培养液，用100μlPBS清洗细胞，并将代谢染料溶于100μl1.2N盐酸(在90％异丙醇中)中。通过450nm的吸光值对存活细胞(由染料的存在显示)进行量化。通过绘制吸光值对干扰素β突变体浓度的图对数据进行分析，并将每种突变体的活性定义为50％的细胞被杀死的浓度。图3显示了每种突变体的活性，以每个实验中为对his标识的野生型干扰素β1a测量的活性的百分率表示。
还评价了干扰素β突变体在抗增殖实验中的功能。在添加10％胎牛血清(Hyclone，LoganUtah)和2mML-谷氨酰胺的RPMI1620中以2x105细胞/ml接种人SaudiBurkitt氏淋巴瘤细胞(ATCC#CCL213)。每个孔还含有给定浓度的干扰素β突变体，每个孔培养基最终总体积100μl；选择的所用干扰素β浓度跨越Daudi细胞增殖的最大抑制至无抑制(即完全增殖)之间。对于每个测试的干扰素β突变体浓度使用双重实验点，而且在所有实验中包括两组未处理细胞。将细胞在5％CO2培养箱中于37℃温育2天，此后每个孔中加入溶于50μl培养基的1μCi氚标记的胸苷((甲基-3H)胸苷，AmershamTRK758)，并再温育4小时。使用LKB板收获仪收获细胞，并使用LKBβ板读数仪测量掺入的氚标记的胸苷。平均两份实验值，并计算标准偏差。由这些数据绘制平均每分钟计数对干扰素β突变体浓度的图，并将每种突变体的活性定义为产生观察到的最大生长抑制的50％需要的浓度。对每种突变体进行多份实验。图4显示了以对每次实验中测得的his标识的野生型干扰素β1a活性的百分率表示的结果。
F.干扰素β突变体的特性
我们发现，组氨酸标识的野生型干扰素-β-1a在抗病毒和抗增殖实验中活性比对未标识的野生型干扰素-β-1a测得的相应活性各低约3倍。由于所有干扰素β突变体A1-E在N末端包含相同的组氨酸标签序列，所以通过将这些突变体在抗病毒、抗增殖和结合实验中的活性与对组氨酸标识的野生型干扰素-β-1a测得的活性进行比较，测定突变对分子特性的影响。在这样做的过程中，我们假定突变体A1-E与组氨酸标识的野生型干扰素-β-1a相比的活性变化，在性质上和数量上与不存在N末端组氨酸标签时这些突变将具有的效果大致相同。其它可溶性细胞因子的标识或融合构建物的同类假设通常被丙氨酸扫描诱变技术从事者认为是正确的，尤其当标识或融合构建物的体外功能性活性与野生型细胞因子的活性接近时，正如此处的情况。参阅例如小K.H.Pearce等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272：20595-20602，1997和J.T.Jones等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273：11667-11674，1998。
图1-4所示数据暗示存在由靶向诱变引起的3种效果。这些效果对于某些环境下的干扰素药物开发可能是有利的。3种效果如下：(a)抗病毒活性比野生型干扰素-β-1a高的突变体(如突变体C1)；(b)在抗病毒和抗增殖实验中都显示活性，但是与野生型干扰素-β-1a相比，其抗增殖活性相对于抗病毒活性不成比例地低的突变体(如突变体C1、D和DE1)；和(c)功能拮抗物，与野生型干扰素-β-1a相比，其抗病毒和抗增殖活性相对于受体结合活性不成比例地低(如A1、B2、CD2和DE1)。可见，一些突变体可归于超过一种类型。这些类型回顾如下。当我们对这些类型突变体列出的那些范例进行了定性分析后，可以理解这些区域内的其它突变将对活性产生相似的、甚至增强的效果：
a)突变体C1的抗病毒活性比野生型组氨酸标识的干扰素-β-1a高大约6倍。据预测，这种突变体和这种类型的其它突变体在降低实现给定水平的抗病毒效果必需施用的干扰素β量中是有用的。预计降低施用蛋白质的量能够降低蛋白质的免疫原性，而且还可能降低非基于机制的毒性的副作用。据预测，这种类型的突变在施用干扰素β的治疗性益处来自其抗病毒活性、抗增殖效果会引起毒性或非期望副作用的情形中是有利的。
b)图5中比较了丙氨酸取代突变体在抗病毒和抗增殖实验中的相对活性(％野生型)。在大多数突变体(位于对角线上的那些)中发现了协同变化的活性(即抗病毒和抗增殖活性相对于野生型组氨酸标识的干扰素-β-1a的活性的变化系数相同)。然而，与野生型组氨酸标识的干扰素-β-1a相比，几种突变体在一种实验中的活性变化高于另一种，如偏离对角线表明的。下文表3显示了这样的3种突变体。突变体C1的抗病毒活性比野生型组氨酸标识的干扰素-β-1a高6倍，但是其在抗增殖实验中的活性与野生型相似。由此，相对于野生型组氨酸标识的干扰素-β-1a，突变体C1的抗病毒活性比其抗增殖活性增强5.2倍。相似的，突变体D在抗病毒实验中显示野生型活性的65％，但是在抗增殖实验中只显示野生型活性的20％，由此，与野生型相比，其抗病毒活性比抗增殖活性增强了3.4倍。突变体DE1在抗病毒实验中显示野生型活性的26％，但是在抗增殖实验中只显示8.5％，由此与野生型组氨酸标识的干扰素-β-1a相比，其抗病毒活性比抗增殖活性增强了3.0倍。当以足够实现期望水平的抗病毒活性的浓度施用时，这些突变型蛋白质的抗增殖活性将显著低于野生型蛋白质。据预测，这种类型的突变体，与a类中的突变一样，在施用干扰素β的治疗性益处来自其抗病毒效果、而抗增殖效果会引起毒性或非期望副作用的情形中是有利的。
表3
突变体 抗病毒活性(AV)(％野生型) 抗增殖活性(AP)(％野生型) AV/AP
C1 571 109 5.2
D 65 19 3.4
DE1 26 8.5 3.0
(c)与野生型组氨酸标识的干扰素-β-1a相比，抗病毒和抗增殖活性相对于受体结合活性比较低的突变体(见下文表4)。突变体A1的抗病毒和抗增殖活性比野生型组氨酸标识的干扰素-β-1a高2.0倍和1.8倍，但是与Daudi细胞上同源受体的结合亲和力比野生型高29倍。由此与蛋白质的抗病毒和抗增殖活性相比，这种突变体与IFN
β受体的结合增强了大约15倍。相似的，突变体B2、CD2和DE1的结合亲和力比抗病毒活性分别增强了4.6、4.6和18倍，比抗增殖活性分别增强了3.5、15和54倍。由于这些蛋白质具有结合和占据受体的能力，而且在靶细胞中产生的功能性应答只占野生型IFNβ的一小部分，所以据预测，它们可以作为内源IFNβ(其它内源性I类干扰素也有可能)活性的功能性拮抗物。
表4
突变体 抗病毒活性(AV)(％野生型) 抗增殖活性(AP)(％野生型) 细胞结合活性(％野生型) 结合活性/AV 结合活性/AP
A1 200 180 2900 15 16
B2 7.1 9.2 33 4.6 3.5
CD2 150 46 690 4.6 15
DE1 26 8.5 460 18 54
G.突变蛋白质与干扰素三维结构的相互关系
发表的鼠干扰素β非糖基化形式(T.Senda、S.Saithoh和Y.Mitsui，重组鼠干扰素β于2.15埃解析度的精细晶体结构。分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)253：187-207，1995)和人干扰素-α-2b(R.Radhakrishnan、L.J.Walter、A.Hruza、P.Reichert、P.P.Trotta、T.L.Nagabhushan和M.R.Walter，由X射线结晶学揭示的人干扰素-α-2b的锌介导二聚体。结构(Structure)4：1453-1463，1996)的晶体结构提供了人干扰素β多肽主链的模型，最近我们还解析了干扰素-β-1a糖基化状态的结构(M.Karpusaa、M.Nolte、C.B.Benton、W.Meier、W.N.Lipscomb、和S.E.Goelz，人干扰素β于2.2埃解析度的晶体结构。美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94：11813-11818，1997)。
我们的突变分析的结果可以概括出干扰素-β-1a的3D结构(此处未显示)。某些突变导致活性降低(降低2至5倍以上)。突变区域对应于表1和2中给出的取代。对抗病毒和抗增殖活性重要的残基位于IFN-β-1a分子的下半部分(图a和图b)。氨基和羧基末端所处的分子上半部分内的突变对生物学活性或受体结合没有影响。
A2螺旋、AB、AB2环和E螺旋中的突变对功能的影响最显著，导致两种活性和细胞表面受体结合显著降低。由于这些突变体在我们的实验中都不结合IFNAR/Fc，所以这个区域(A2螺旋、AB&AB2环和E螺旋)对应于IFNAR2结合位点。
那些对IFNAR2结合重要的突变也影响细胞结合，而细胞表面结合特性也受分子其它区域(B1螺旋、C2螺旋)内残基的影响。在描述丙氨酸取代突变体影响的3D模型(此处未显示)中可见，IFN-β-1a分子的N末端、C末端和糖基化C螺旋区域不在受体结合位点内。这些区域中的突变不降低生物学活性或细胞表面受体结合。
实施例2：缀合的干扰素-β-1a的制备和定性分析
A.PEG化干扰素的制备
将未配制的干扰素-β-1a(以出售的散装中间物，以250μg/ml浓度于100mM磷酸钠pH7.2、200mMNaCl)用等体积100mMMESpH5.0稀释，并用HCl调pH5.0。将样品以6mg干扰素-β-1a/ml树脂的加样量加到FF层析柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)上。将层析柱用5mM磷酸钠pH5.5、75mMNaCl清洗，并用30mM磷酸钠pH6.0、600mMNaCl将产物洗脱。于280nm分析洗脱收集液的吸光值，并利用1mg/ml消光系数1.51，由吸光值估计样品中的干扰素浓度。
向来自SP洗脱液的1mg/ml干扰素-β-1a溶液中，加入0.5M磷酸钠pH6.0至50mM，加入氰基硼氢钠(Aldrich，Milwaukee，WI)至5mM，加入20KPEG醛(ShearwaterPolymers，Huntsville，AL)至5mg/ml。将样品于室温温育20小时。通过5mM磷酸钠pH5.5、150mMNaCl作为流动相的6FPLC大小分离层析柱(Pharmacia)(利用FF)上的顺序层析步骤由反应产物纯化PEG化干扰素。大小分离层析柱使经修饰和未修饰干扰素β得到基线分离(此处没有显示层析图)。将来自凝胶过滤的含PEG-干扰素β的洗脱液用水进行1：1稀释，并以2mg干扰素β/ml树脂的加样量加到层析柱上。将层析柱用5mM磷酸钠pH5.5、75mMNaCl清洗，然后用5mM磷酸钠pH5.5、800mMNaCl将PEG化干扰素β由层析柱洗脱。通过280nm的吸光值分析洗脱收集液的蛋白质含量。由于PEG部分对280nm吸光值没有影响，所以以干扰素等效物表示PEG化干扰素浓度。
B.PEG化干扰素的生化定性分析
通过SDS-PAGE(此处没有显示凝胶)分析样品的修饰程度。单个PEG的加入导致干扰素表观分子量由20kDa变成55kDa(根据分析结果是明显的)。在PEG化样品中，没有明显的未修饰干扰素-β-1a，也没有额外PEG基团的存在产生的更大分子量形式。通过MALDI质谱法确认了单个PEG的存在。通过肽谱评价PEG化反应的特异性。在240μl200mMTris-HClpH9.0、1mMEDTA中，将20μgPEG化干扰素-β-1a(未修饰干扰素β1a作为对照)用1.5μg来自无色杆菌的赖氨酰内切蛋白酶(WakoBioproducts，Richmond，VA)于27℃消化3-4小时。每份样品中加入200mg盐酸胍，并在VydacC4层析柱(0.46x25cm)上使用30分钟于0.1％TFA中的乙腈梯度0-70％，以1.4ml/分钟的流速分离裂解产物。于214nm监控层析流出液的吸光值。
图6显示了分析结果。通过N末端测序和质谱法鉴定干扰素-β-1a经内切蛋白酶Lys-C消化产生的所有预测肽，在这些预测肽中只有包含干扰素N末端的肽(AP8)经修饰发生了变化，由其在图谱中的消失可见。因此作图资料说明PEG部分特异附着在此肽上。由于只有N末端修饰将导致该肽的特异缺失，所以这些资料还表明PEG修饰靶向的是蛋白质的N末端。
通过从内切蛋白酶Lys-C消化物中分离PEG化N末端肽、将该肽用溴化氰(CNBr)进行消化、并将此样品进行矩阵辅助的来源衰退后激光解吸离子化(matrix-assistedlaserdesorptionionizationpostsourcedecay，MALDIPSD)序列分析，观察到此结论的其它证据。N末端肽的CNBr消化进一步将此肽切割成两种片段，即包含PEG部分的末端甲硫氨酸(M1)和SYNLLGFLQR(成熟干扰素β序列的第2-11位残基)。序列分析确认了未修饰肽SYNLLGFLQR，它是此处理的预测产物。
使用涉及上述MTT染色的步骤，在曾暴露于脑心肌炎(EMC)病毒的人肺癌细胞(A549细胞)上测试干扰素-β-1a样品的抗病毒活性。简而言之，在接受病毒攻击前，将A549细胞用干扰素-β-1a或经PEG修饰的干扰素-β-1a(4000、2000、1000、500、250、125、75、62.5、31.25、50、33.3、22.2、14.8、9.9、6.6、4.39pg/ml)预处理24小时。每个干扰素-β-1a浓度使用双份数据点进行实验。图7中以误差条显示了标准偏差。产生50％病毒杀伤(“50％致细胞病变效应”)的干扰素-β-1a(制剂或散剂)浓度(50％最大0D450)为大约11pg/ml，而经PEG修饰的干扰素-β-1a的50％致细胞病变效应为大约11pg/ml。由此，PEG缀合不改变干扰素-β-1a的抗病毒活性。在此实验中，我们例行公事的发现，干扰素-β-1a的比活性比干扰素-β-1b的比活性高大约10倍，因此PEG化干扰素-β-1a的活性显著高于任何干扰素-β-1b产物。
根据用20KPEG醛修饰的所述相同方案(除了反应液含2mg/ml5KPEG)，还用5KPEG-醛部分(Fluka公司，Ronkonkoma，NY，产品目录号75936)对干扰素-β-1a进行PEG化。5KPEG的修饰对N末端也是高度特异的，而且不改变干扰素-β-1a的抗病毒活性。就像20K加成物，在抗病毒实验中5KPEG干扰素-β-1a和未修饰干扰素-β-1a无差异。
实施例3：PEG化可保护干扰素-β-1a免受压力诱导的凝集
干扰素β的凝集对活性具有有害影响。以前，我们已经显示了糖基化对干扰素-β-1a的稳定性相对于干扰素β的非糖基化形式具有显著效果，并推断出糖基化有助于干扰素-β-1a的更高比活性(L.Runkel等人，药物研究(Pharm.Res.)15：641-649)。为了研究与聚亚烷基二醇聚合物缀合能否进一步稳定干扰素β，我们使用下列方案对PEG化干扰素-β-1a施以热压力：
使用配备了计算机控制的电热加热比色杯支架的CARY3UV可视分光光度计，进行热变性。溶于20mMHEPESpH7.5、20mMNaCl的干扰素-β-1a溶液在1ml比色杯中平衡于25℃。然后将比色杯支架的温度以2℃/分钟的速率由25℃升至80℃，并在280nm吸光值的连续监控下追踪蛋白质变性。通过测定测量的吸光值处于由协同展开转变每一侧的线形区域外推的线所定义值的中间的温度，由熔解曲线获得协同展开的中点Tm。
图8显示了此分析结果。非PEG化干扰素-β-1a以50％转变点为60℃变性并凝集，然而，甚至于80℃仍没有PEG化干扰素凝集的明显证据。在一次独立分析中，我们将热压力处理延伸到95℃，甚至在这么高的温度，我们仍没有看到凝集的证据。因此，与这种聚乙二醇聚合物的缀合对蛋白质稳定性具有深刻的和有益的影响。对含20K和5KPEG的经修饰干扰素-β-1a也看到相似的稳定作用。
实施例4：测量经干扰素-β-1a和PEG化干扰素-β-1a处理的小鼠血浆中的干扰素-β-1a抗病毒活性
用50,000单位干扰素-β-1a或50,000单位含20KPEG的PEG化干扰素-β-1a对小鼠(C57B1/6)通过尾部静脉进行静脉注射，等体积磷酸盐缓冲液作为对照。于注射后不同时间点(立即、0.25、1、4、24和48小时)通过后眼眶取血获得这些小鼠的血样。每个时间点至少对3只小鼠进行取血。将全血收集在含抗凝血剂的管中，除去细胞，并将得到的血浆冻存直至实验时间。然后在抗病毒实验中测试这些血浆样品。
将血浆样品用无血清培养基稀释10倍，并通过0.2μm注射滤器过滤。在抗病毒实验中测试经稀释样品。在含A549细胞的96孔组织培养板指定孔中对样品进行滴定。每个板测试了标准干扰素-β-1a的稀释液(10、6.7、4.4、2.9、1.3、0.9和0.6U/ml)和4种血浆样品的稀释液。在接受EMC病毒攻击前，用稀释的血浆样品对A549细胞进行预处理24小时。与病毒一起温育2天后，用MTT溶液(5mg/ml，溶于磷酸盐缓冲液)对存活细胞进行染色1小时，用磷酸盐缓冲液清洗，并溶于含1.2NHCl的异丙醇。于450nm对孔进行读数。绘制每个板的标准曲线，并用于测定每种测试样品中的干扰素-β-1a活性的量。图9绘制了来自不同小鼠的样品中活性对时间点的图。
作为时间函数的PEG化干扰素-β-1a由循环系统较慢损失说明，PEG化样品的半衰期比未处理干扰素-β-1a对照长得多。对照在4小时后大量被清除，而在48小时后还检测到显著部分的PEG化产物。根据血清中的最初活性水平及48小时后保留的活性水平，我们推断出PEG化干扰素的半衰期相对于未修饰干扰素-β-1a延长。由此研究的第二个重要发现是，在分布阶段损失很少的PEG化形式，这可由于时间零点和60分钟后的相似高活性水平所证明。数据说明，与对照干扰素-β-1a不同，PEG化产物的分布大大局限在血管系统。
实施例5：灵长类动物中的比较性药物动力学和药效动力学(一般方案)
用聚合物-干扰素-β-1a缀合物和天然干扰素-β-1a(溶于磷酸钠和NaClpH7.2的非制剂散装中间药干扰素-β-1a)进行了比较性研究，以测定它们在灵长类动物中的相对稳定性和活性。在这些研究中，将聚合物-干扰素-β-1a缀合物在灵长类动物中的药物动力学和药效动力学与天然干扰素-β-1a进行了比较，并可以合理的推广到人。
动物和方法
研究设计
这是平行组，重复用以评价缀合和未缀合干扰素-β-1a的比较性药物动力学和药效动力学的剂量研究。
此实验使用健康的灵长类动物(优选恒河猴)。在服药前，由实验室动物兽医(LabAnimalVeterinary)在测试物质施用前14天内两次评价所有动物的不健康症状；其中一次评价必须在第一次测试物质施用前24小时内。只有健康的动物将接受测试物质。评价将包括一般性体检和服药前取血用于评估基线临床病理学和针对干扰素-β-1a的基线抗体水平。所有动物将称体重，并记录测试物质施用前24小时内的体温。
登记了12个个体，并分组接受1MU/kg干扰素-β-1a(PEG-干扰素-β-1a缀合物或非缀合的相同干扰素-β-1a)。施用通过皮下(SC)或静脉内(IV)途径进行。所有动物必须是首次进行干扰素β处理。每只动物将分2次服药，间隔4周。服药体积是1.0ml/kg。
每次注射后各个时间间隔采集用于药物动力学测试的血样。施用研究药物后采集用于测量干扰素诱导的生物学应答标记物-血清新喋呤的血样。
研究期间的评价包括服药后30分钟和1小时时毒性症状的临床观察。进行每日笼旁观察，并记录一般性外观、毒性症状、不适、和行为变化。记录服药后21天内规则间隔时间的体重和体温。
实验方法
通过致细胞病变效应(CPE)生物实验量化血清中的干扰素β水平。CPE实验测量干扰素介导的抗病毒活性的水平。样品中的抗病毒活性的水平反映了采血时样品中所含活性干扰素分子的数目。这种方法已经成为评价干扰素β药物动力学的标准方法。当前研究中使用的CPE实验检测干扰素β保护人肺癌细胞(A549，ATCC#CCL-185，Rockville，MD)免受脑心肌炎(EMC)病毒的细胞毒性的能力。将细胞与血清样品一起预温育15-20小时，使得诱导并合成干扰素诱导型蛋白质，然后引发抗病毒应答。然后，加入EMC病毒并在通过结晶紫染色进行细胞毒性评价前再温育30小时。在每个实验板上同时测试内部干扰素β标准以及PEG缀合物内部标准。此标准用天然人成纤维细胞干扰素参考标准(WHO的第二种干扰素国际标准，人成纤维细胞，Gb-23-902-53)进行了校准。每个实验板还包括不含任何种类的干扰素β及EMC的细胞生长对照孔，病毒对照孔含细胞和EMC而无干扰素β。还制备了含标准和样品的对照板，以测定样品对细胞生长的影响。对这些板在不加入病毒的情况下进行染色。
在两个复制实验板上双份测试样品和标准，每种样品得到4个数据。得到4次重复的几何平均浓度。在此实验中，检测限度是10单位(U)/ml。
使用商业性实验测定新喋呤的血清浓度(以临床药理学单位表示)。
药物动力学和统计学方法
使用RstripTM软件(MicroMath公司，犹他州盐湖城)，将数据拟合药物动力学模型。绘制了每组几何平均浓度对时间的图。由于实验结果以稀释度表述，所以认为几何平均值比算术平均值更恰当。将血清干扰素水平调至基线值，并将不可检测的血清浓度设为5U/ml，这是检测下限的一半值。
对于静脉内输注数据，将每个个体的可检测血清浓度拟合两区室静脉内输注模型；而SC数据拟合两区室注射模型。
计算下列药物动力学参数：
(i)观察到的峰浓度，Cmax(U/ml)；
(ii)采用梯形规则的曲线下由0至48小时的面积，AUC；
(iii)消除半衰期；
以及由IV输注数据(如果采用IV)计算：
(iv)分布半衰期(h)；
(v)清除(ml/h)；
(vi)分布的表观体积，Vd(L)。
使用WinNonlin软件(ScientificConsulting公司，Apex，NC)计算SC和IM注射后的消除半衰期。
至于新喋呤，显示了每组对时间的算术平均值。计算相对于基线的最大变化Emax。将Cmax、AUC和Emax进行方差单向分析以比较服药组。在分析前将Cmax和AUC转换成对数；以几何平均值表示。
实施例6：PEG化干扰素-β-1a和干扰素-β-1a在恒河猴中的药物动力学的比较性评价
材料和方法
如实施例5一般方案所述，在第1天和第29天通过静脉内(IV)或皮下(SC)途径对恒河猴施用干扰素-β-1a或PEG化IFN-β-1a。第1天，6只猴接受IFN-β-1a(每种途径3只)，另外6只猴接受PEG化IFN-β-1a(每种途径3只)。第29天，重复施药。IV施药采用头静脉或隐静脉的缓慢大丸剂注射。
SC施药采用背部皮肤剃毛后注射。在特定时间点通过股静脉采集血样，并使之凝结获得血清。使用经验证的抗病毒CPE方法分析血清的功能性药物水平，并分析血清新喋呤和β2-微球蛋白水平作为活性的药效动力学测量。使用WinNonlin2.0版软件(ScientificConsulting公司，Apex，NC)计算制药学参数。
通过标准的不依赖于模型的方法(非区室分析)分析浓度数据，以获取药物动力学参数。使用梯形规则计算了曲线下面积(AUC)。使用MicrosoftExcel软件5.0版(Microsoft公司，Redmond，WA)进行了包括算术平均值和标准偏差在内的统计学分析。以定量下限(BLQ)表示的浓度值未用于药物动力学分析。由于不同的计算机和程序对数目的舍位不同，一些表中的值(如平均值、标准偏差、或个别值)可能与其它表中的值、个别计算的数据、或统计学分析数据略有不同。数据的完整性和解释不受这些差异的影响。
结果和讨论
在每种施用途径中，PEG化IFN-β-1a展示了更高的生物利用度(通过血清浓度-时间曲线下的面积测量)。另外，当通过SC途径施药时，PEG化IFN-β-1a与IFN-β-1a相比具有更高的绝对生物利用度。我们在表5中概括了药物动力学参数。通过IV和SC途径施用PEG化IFN-β-1a都导致IFN-β-1a的半衰期以及AUC增加。
表5：
通过IV或SC对恒河猴施用1MU/kgIFN-β-1a或PEG化IFN-β-1a后BG9418药物动力学参数的平均值(±标准偏差)a
制剂 (施用途径) Cmax Tmax AUCU*hr/mL CL(mL/kg) Vss(mL/kg) T1/2
IFNB-1a(IV) 6400(±0) 0.083(±0) 4453(±799) 229(±38) 543(±147) 3.2(±1.4)
PEG化IFN-b-1a(IV) 10800(±3811) 0.083(±0) 34373(±3601) 29(±3) 250(±30) 9.5(±2.1)
IFN B-1a(SC) 277(±75) 5.3(±1.2) 4753(±3170) N/A N/A 10.0(±2.9)27 -->
PEG化 IFNB-1a(SC) 1080(±381) 3.3(±1.2) 42283(±5934) N/A N/A 22.0(±3.4)
an＝3
第一次IV施药后，IFN-β-1a和PEG化IFN-β-1a的峰血清浓度(Cmax)的平均值(±标准偏差)依次为6400(±0)和10800(±3.5)U/ml。AUC的平均值(±标准偏差)依次为4453(±799)和34373(±3601)U*hr/ml。第一次SC施药后，IFN-β-1a和PEG化IFN-β-1a的Cmax的平均值(±标准偏差)依次为277(±75)和1080(±381)U/ml。AUC值的平均值(±标准偏差)依次为4753(±3170)和44952(±1443)U*hr/ml。
用IFNβ和PEG化IFNβ进行处理后，血清新喋呤和血清β2微球蛋白水平均升高，说明了产物的药理学活性。在测试化合物使用的大剂量，通过两种途径施用的IFN-β-1a和PEG化IFN-β-1a的药理学活性没有差异(此处没有显示数据)。
实施例7：PEG化干扰素-β-1a和干扰素-β-1a在进行了多种方式施用后的大鼠中的药物动力学的比较性评价
此研究的目的是测定通过多种途径施用的干扰素-β-1a和PEG化干扰素-β-1a的相对生物利用度。
材料和方法
我们在药物动力学分析中使用了雌性Lewis大鼠(每只体重190g)，每种途径每种制剂使用了2只大鼠。对大鼠进行颈静脉插管，并通过静脉内、腹膜内、口、皮下或气管内施用人干扰素-β-1a或5KPEG化人干扰素-β-1a或20KPEG化人干扰素-β-1a(在含14mg/mlHAS的50mM磷酸钠、100mMNaClpH7.2的载体中)。在72小时内的多个时间进行采血(零点、5分钟、15分钟、30分钟、75分钟、3小时、24小时、48小时和72小时)。表6显示了方案。对血清样品进行致细胞病变效应(CPE)生物实验，以检测血清中的干扰素β。表7显示了未修饰干扰素-β-1a和20KPEG化干扰素-β-1a产生的结果。在所有情况中，PEG化导致t1/2和AUC显著增加。
表6
表7：
通过IV、SC、IP或IT对大鼠施用干扰素-β-1a(IFN)和PEG化IFN-β-1a(IFN-PEG)后的药物动力学参数
制剂 (施用途径) Cmax(U/mL) Tmax(hr) AUC/Dose(U hr)/(mL ug) T1/2(hr)
IFN(IV，20ug剂量) 64000 0.25 3035 1.25
IFN-PEG(IV，3ug剂量) 23970 0.08 47728 8.44
IFN(SC，20ug剂量) 2400 1.00 464.4 0.96
UFN-PEG(SC，3ug剂量) 2400 7.00 14688 11.9
|IFN(IP，20ug|剂量) 26000 1.25 4159 1.53
IFN-PEG(IP，3ug剂量) 9700 1.25 52148 16.2
IFN(IT，15ug剂量) 240 1.5 70.7 1.29
IFN-PEG(IT，15ug剂量) 270 7.0 233.5 6.21
实施例8：聚合物缀合的干扰素-β-1a的抗血管生成效果：PEG化干扰素-β-1a抑制体内内皮细胞增殖的能力的评价
用CS-C培养基试剂盒(CellSystems，产品目录号#4Z0-500)维持培养人静脉内皮细胞(CellSystems，产品目录号#2V0-P75)和人真皮微血管内皮细胞(CellSystems，产品目录号#2M1-C25)。实验前24小时，对细胞进行胰酶消化，并重悬于实验培养基(90％M199和10％胎牛血清(FBS))中，调至期望的细胞密度。然后将细胞在明胶包被的24或96孔板上分别以12,500细胞/孔或2,000细胞/孔铺开。
温育过夜后，用含20ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(BectonDickinson，产品目录号40060)和各种浓度的缀合和非缀合干扰素-β-1a蛋白质或阳性对照(endostatin可以作为阳性对照使用，针对bFGF的抗体也可以使用)的新鲜培养基替换实验培养基。将终体积调至0.5ml(24孔板)或0.2ml(96孔板)。
72小时后，对细胞进行胰酶消化以进行Coulter计数，冻结用于CyQuant荧光读数，或用[3H]胸苷进行标记。缀合和非缀合干扰素-β-1a对内皮细胞体外增殖的抑制是相当的，表明PEG化不干扰干扰素在此情形中发挥功能的能力。
此体外实验测试了本发明人干扰素β分子对内皮细胞增殖的影响，可以说明体内抗血管生成效应。参阅M.S.0’Reilly、T.Boehm、Y.Shing、N.Fukal、G.Vasios、W.Lane、E.Flynn、J.Birkhead、B.Olsen、和J.Folkman，(1997)endostatin：血管生成和肿瘤生长的内源抑制剂。细胞(Cell)88：277-285。
实施例9：用于测试缀合干扰素-β-1a的抗血管生成和新血管形成效果的体内模型
已经发展了用以测试此处所述分子的抗血管生成和抗新血管形成效应的多种模型。这些模型中的一些描述于美国专利5,733,876(1998年3月31日：“抑制血管生产的方法”)和5,135,919(1992年8月4日：“用于抑制血管生成的方法和药物组合物”)。其它实验包括无壳尿囊绒膜(CAM)实验(S.Taylor和J.Folkman，自然(Nature)297：307，1982；和R.Crum、S.Szabo、J.Folkman，科学(Science)230：1375，1985)；小鼠背部气囊方法抗血管生成模型(J.Folkman等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)133：275，1971)；和大鼠角膜微囊实验(小M.A.Gimbrone等人，国家癌症学会杂志(J.Natl.CancerInst.)52：413，1974)，其中通过向每个角膜移植500ng包埋在EVA(乙烯-醋酸乙烯酯共聚物)颗粒中的碱性FGF(牛的，R&DSystems公司)，在Sprague-Dawley品系(CharlesRiver，日本)的成年雄性大鼠中诱导角膜血管形成。
用于在动物模型中测试PEG化鼠干扰素β的抗血管生成效应的其它方法包括(但不限于)最初的癌症化疗报告(第3部分，第3卷，No.2，1972年9月)和体内癌症模型增刊(1976-1982，NIHPublicationNo.84-2635，1984年2月)中所述用于筛选新的潜在的抗癌试剂的方案。
由于I型干扰素的物种屏障，为了评价聚合物缀合的干扰素β在啮齿类动物模型中的抗血管生成活性，制备了聚合物缀合的啮齿类干扰素β制备物。这种筛选方法的范例是用以测试PEG化鼠干扰素β对皮下移植Lewis肺癌的抗血管生成效应的方案。
肿瘤系的起源：
1951年自发产生，为C57BL/6小鼠中的肺癌。
测试步骤的概述：
将肿瘤块皮下移植到B6D2F1小鼠的腋下区域。肿瘤移植后于多个日子通过皮下(SC)或腹膜内(IP)以各种剂量施用检测试剂(即本发明的PEG化干扰素)。测量的参数是存活期中值。结果以对对照存活期的百分比表述。
动物：
增殖：C57BL/6小鼠
测试：B6D2F1小鼠
体重：最小体重雄性18g雌性17g，范围3g
性别：在一次实验中，所有测试和对照动物使用一种性别
来源：在一次实验中，如果可行，所有动物使用一种来源
实验规模：
每个测试组10只动物
肿瘤转移：
增殖：制备皮下供体肿瘤的2-4mm肿块
时间：第13-15天
位点：经腹股沟区内的孔将肿块皮下移植到腋下区域
测试：
肿块：制备皮下供体肿瘤的2-4mm肿块
时间：第13-15天
位点：经腹股沟区内的孔将肿块皮下移植到腋下区域
测试日程：
第0天：移植肿瘤。进行细菌培养。在每个奇数实验中测试阳性对照化合物。制备材料。每日记录死亡情况。
第1天：检查培养物。如果有污染则丢弃。对动物进行随机化。根据指示进行处理(第1天和随后的日子)。
第2天：再检查培养物。如果有污染则丢弃。
第5天：称量第2天和最初待测试剂毒性评价日的重量。
第14天：对照早期死亡日。
第48天：对照无摄取日。
第60天：结束并评价实验。肉眼检查肺肿瘤。
质量对照：
在每个奇数实验中安排阳性对照化合物(NSC26271，癌得星(Cytoxan)每次注射剂量为100mg/kg)，其方案是只在第1天腹膜内注射。阳性对照的测试/对照下限是140％。可接受的未处理对照存活期中值是19-35.6天。
评价：
测量的参数是存活期中值。计算第1天和第5天的平均动物体重。计算所有测试组的测试/对照比率。计算实验期间和最后评价日的平均动物体重。计算存活大于65％的所有测试组在第5天的测试/对照比率。小于86％的测试/对照比率指示有毒性。在评价毒性时还可以使用过量体重变化差异(测试减去对照)。
活性标准：
初始测试/对照比率高于或等于140％被认为是展示中等活性必需的。可重复的测试/对照比率高于或等于150％被认为有显著活性。
序列表
<110>Pepinsky，Blake
　　Runkel，Laura
Brickelmaier，Margot
Whitty，Adrian
Hochman，Paula
<120>干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用
<130>00689-514/A065
<140>09/832,658
<141>2001-04-11
<150>PCT/US99/24201
<151>1999-10-15
<150>60/104,572
<151>1998-10-16
<150>60/120,161
<151>1999-02-16
<160>40
<210>1
<211>549
<212>DNA
<213>鼠
<400>1
<210>2
<211>183
<212>PRT
<213>鼠
<400>2
<210>3
<211>60
<212>DNA
<213>人
<400>3
<210>4
<211>39
<212>DNA
<213>人
<400>4
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人
<400>5
<210>6
<211>35
<212>DNA
<213>人
<400>6
<210>7
<211>87
<212>DNA
<213>人
<400>7
<210>8
<211>60
<212>DNA
<213>人
<400>8
<210>9
<211>52
<212>DNA
<213>人
<400>9
<210>10
<211>76
<212>DNA
<213>人
<400>10
<210>11
<211>76
<212>DNA
<213>人
<400>11
<210>12
<211>51
<212>DNA
<213>人
<400>12
<210>13
<211>43
<212>DNA
<213>人
<400>13
<210>14
<211>78
<212>DNA
<213>人
<400>14
<210>15
<211>78
<212>DNA
<213>人
<400>15
<210>16
<211>72
<212>DNA
<213>人
<400>16
<210>17
<211>72
<212>DNA
<213>人
<400>17
<210>18
<211>44
<212>DNA
<213>人
<400>18
<210>19
<211>69
<212>DNA
<213>人
<400>19
<210>20
<211>51
<212>DNA
<213>人
<400>20
<210>21
<211>76
<212>DNA
<213>人
<400>21
<210>22
<211>87
<212>DNA
<213>人
<400>22
<210>23
<211>87
<212>DNA
<213>人
<400>23
<210>24
<211>50
<212>DNA
<213>人
<400>24
<210>25
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>25
<210>26
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>26
<210>27
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>27
<210>28
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>28
<210>29
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>29
<210>30
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>30
<210>31
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>31
<210>32
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>32
<210>33
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>33
<210>34
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>34
<210>35
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>35
<210>36
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>36
<210>37
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>37
<210>38
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>38
<210>39
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>39
<210>40
<211>166
<212>PRT
<213>人
<400>40
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyAlaLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgAlaGluIleLeuAlaAsnPheAlaArgIleAlaArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>41
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>41
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>42
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>42
MetAlaTyrAlaAlaLeuGlyAlaLeuGlnAlaSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>43
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>43
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnAlaAla
151015
CysAlaAlaLeuLeuAlaAlaLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>44
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>44
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgAlaAlaAlaCysAla
202530
AlaAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>45
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>45
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgAlaAlaPheAlaIleProAlaGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>46
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>46
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleAlaAlaAlaAla
354045
AlaPheAlaAlaAlaAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>47
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>47
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuAla
505560
AsnIleAlaSerIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>48
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>48
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheAlaAlaAlaSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>49
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>49
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
AlaSerIleValAlaAlaLeuLeuSerAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>50
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>50
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValAlaHisGlnIleAla
859095
HisLeuAlaAlaValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>51
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>51
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuAlaAlaLysLeuAlaAlaAlaAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>52
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>52
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAlaAlaThr
100105110
AlaGlyLysAlaMetSerAlaLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>53
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>53
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyAla
115120125
IleAlaAlaTyrLeuAlaAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>54
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>54
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaAlaAlaTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>55
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>55
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrAlaAlaCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPheIleAsnArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165
<210>56
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>56
MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGln
151015
CysGlnLysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeu
202530
LysAspArgMetAsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGln
354045
GlnPheGlnLysGluAspAlaAlaLeuThrIleTyrGluMetLeuGln
505560
AsnIlePheAlaIlePheArgGlnAspSerSerSerThrGlyTrpAsn
65707580
GluThrIleValGluAsnLeuLeuAlaAsnValTyrHisGlnIleAsn
859095
HisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLysGluAspPheThr
100105110
ArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyrGlyArg
115120125
IleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr
130135140
IleValArgAlaGluIleLeuAlaAsnPheAlaPheIleAlaArgLeu
145150155160
ThrGlyTyrLeuArgAsn
165

Claims (23)

1.一种与聚合物偶联的蛋白质，其包含与所述蛋白质N末端的聚合物偶联的本文表1中IFN-β、A1、A2、AB1、AB2、AB3、B1、B2、C1、C2、CD1、CD2、D、DE1、DE2或E所示的氨基酸序列，所述聚合物包含聚亚烷基二醇，并且所述蛋白质是糖基化的。
2.权利要求1的与聚合物偶联的蛋白质，其中所述聚合物附着于所述蛋白质的氨基基团。
3.一种用于制备权利要求1的与聚合物偶联的蛋白质的方法，包括在还原性烷基化条件下使蛋白质和聚合物反应，所述蛋白质包含本文表1中IFN-β、A1、A2、AB1、AB2、AB3、B1、B2、C1、C2、CD1、CD2、D、DE1、DE2或E所示的氨基酸序列，所述聚合物包含羰基部分。
4.包含与非天然产生的聚合物偶联的干扰素-β-1a的稳定的水溶性缀合干扰素-β-1a复合物，其中所述非天然产生的聚合物包括聚乙二醇部分，所述干扰素-β-1a包含本文表1中IFN-β、A1、A2、AB1、AB2、AB3、B1、B2、C1、C2、CD1、CD2、D、DE1、DE2或E所示的氨基酸序列，所述干扰素-β-1a与所述聚乙二醇部分通过不稳定键偶联，其中所述不稳定键可被生化水解作用和/或蛋白质水解作用切割。
5.权利要求4的干扰素β-1a复合物，其中聚合物的分子量为大约5kD至大约40kD。
6.包含权利要求5的干扰素β-1a复合物的药物组合物。
7.包含在其N－末端与非天然聚合物偶联的糖基化干扰素β-1a的组合物，其中所述糖基化干扰素β-1a包含本文表1中IFN-β、A1、A2、AB1、AB2、AB3、B1、B2、C1、C2、CD1、CD2、D、DE1、DE2或E所示氨基酸序列，并且该聚合物包含聚亚烷基二醇部分。
8.权利要求7的组合物，其中聚亚烷基部分通过选自下述的基团与糖基化干扰素β-1a偶联：醛基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、卤代醋酸酯基、多个组氨酸残基、肼基和氨基巯基。
9.权利要求7的组合物，其中所述糖基化干扰素β-1a是干扰素-β-1a融合蛋白。
10.权利要求9的组合物，其中干扰素-β-1a融合蛋白包含免疫球蛋白分子的一部分。
11.包含与含有聚亚烷基二醇部分的聚合物偶联的生理学有活性的干扰素-β-1a的生理学有活性的干扰素β组合物，所述生理学有活性的干扰素-β-1a包含本文表1中IFN-β、A1、A2、AB1、AB2、AB3、B1、B2、C1、C2、CD1、CD2、D、DE1、DE2或E所示氨基酸序列，其中干扰素β-1a在其N－末端与聚合物偶联，其中生理学有活性的干扰素-β-1a和聚亚烷基二醇部分的排列使得，生理学有活性的干扰素β组合物中的生理学有活性的干扰素-β-1a在抗病毒实验中测量时，相对于生理学有活性的干扰素-β-1b具有至少大2倍的活性。
12.权利要求11的组合物，其中生理学有活性的干扰素-β-1a与聚合物在某个位点通过生理学有活性的干扰素-β-1a上的聚糖部分偶联。
13.权利要求11的组合物，其中生理学有活性的干扰素-β-1a是干扰素-β-1a融合蛋白。
14.权利要求13的组合物，其中干扰素-β-1a融合蛋白包含免疫球蛋白分子的一部分。
15.包含在其N－末端与含有聚亚烷基二醇部分的聚合物偶联的生理学有活性的糖基化干扰素-β-1a的生理学有活性的干扰素β组合物，所述生理学有活性的糖基化干扰素-β-1a包含本文表1中IFN-β、A1、A2、AB1、AB2、AB3、B1、B2、C1、C2、CD1、CD2、D、DE1、DE2或E所示氨基酸序列，其中生理学有活性的干扰素β-1a和聚亚烷基二醇部分的排列使得，生理学有活性的干扰素β组合物中的生理学有活性的干扰素β-1a在抗病毒实验中测量时，相对于缺乏所述部分的生理学有活性的干扰素β具有基本上相等的活性。
16.权利要求15的组合物，其中生理学有活性的干扰素β与聚合物在某个位点通过干扰素β上的聚糖部分偶联。
17.权利要求15的组合物，其中生理学有活性的干扰素β-1a是干扰素β融合蛋白。
18.权利要求17的组合物，其中干扰素β融合蛋白包含免疫球蛋白分子的一部分。
19.包含在其N－末端与包含聚乙二醇部分的聚合物偶联的干扰素-β-1a的稳定的水溶性缀合干扰素-β-1a复合物，所述干扰素-β-1a包含本文表1中IFN-β、A1、A2、AB1、AB2、AB3、B1、B2、C1、C2、CD1、CD2、D、DE1、DE2或E所示氨基酸序列，其中所述干扰素-β-1a与聚乙二醇部分通过不稳定键偶联，其中所述不稳定键可被生化水解作用和/或蛋白质水解作用切割。
20.权利要求7或15的干扰素β组合物，其中聚合物的分子量为大约5kD至大约40kD。
21.权利要求19的复合物，其中聚合物的分子量为大约5kD至大约40kD。
22.包含权利要求20的干扰素β组合物或权利要求21的复合物的药物组合物。
23.权利要求20的组合物或权利要求21的复合物在制备用于抑制个体内血管生成的药物中的用途，所述药物包含有效量的所述组合物。
CN200710112119.8A 1998-10-16 1999-10-15 干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用 Expired - Lifetime CN101062419B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10457298P 1998-10-16 1998-10-16
US60/104,572 1998-10-16
US12016199P 1999-02-16 1999-02-16
US60/120,161 1999-02-16

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998122025A Division CN1329082C (zh) 1998-10-16 1999-10-15 干扰素－β－1a的聚合物缀合物及其使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101062419A CN101062419A (zh) 2007-10-31
CN101062419B true CN101062419B (zh) 2016-06-29

Family

ID=26801696

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998122025A Expired - Lifetime CN1329082C (zh) 1998-10-16 1999-10-15 干扰素－β－1a的聚合物缀合物及其使用
CN200710112119.8A Expired - Lifetime CN101062419B (zh) 1998-10-16 1999-10-15 干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998122025A Expired - Lifetime CN1329082C (zh) 1998-10-16 1999-10-15 干扰素－β－1a的聚合物缀合物及其使用

Country Status (30)

Country Link
US (5) US6962978B2 (zh)
EP (4) EP2599503B1 (zh)
JP (5) JP4616478B2 (zh)
KR (1) KR100630849B1 (zh)
CN (2) CN1329082C (zh)
AT (1) ATE318149T1 (zh)
AU (1) AU762616B2 (zh)
BR (1) BRPI9915542C1 (zh)
CA (1) CA2345138C (zh)
CY (2) CY1105022T1 (zh)
CZ (1) CZ299164B6 (zh)
DE (1) DE69930015T2 (zh)
DK (2) DK1656952T3 (zh)
EA (1) EA004789B9 (zh)
EE (2) EE05201B1 (zh)
ES (4) ES2257884T3 (zh)
HK (2) HK1042434B (zh)
HU (1) HU229888B1 (zh)
IL (2) IL142282A0 (zh)
IS (1) IS2926B (zh)
LT (2) LT2599503T (zh)
NO (1) NO20011860L (zh)
NZ (1) NZ510689A (zh)
PL (1) PL206536B1 (zh)
PT (2) PT1656952E (zh)
SG (2) SG110047A1 (zh)
SI (2) SI1656952T1 (zh)
SK (1) SK287918B6 (zh)
TR (1) TR200101086T2 (zh)
WO (1) WO2000023114A2 (zh)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA004789B9 (ru) * 1998-10-16 2017-05-31 Байоджен, Инк. Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование
SK287491B6 (sk) * 1998-10-16 2010-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Fúzne proteíny interferónu- beta-1a a ich použitie
WO2001015736A2 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Maxygen Aps Interferon-beta conjugates
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
EP1334128A2 (en) * 2000-11-02 2003-08-13 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
YU48703A (sh) 2001-02-27 2006-05-25 Maxygen Aps Novi interferonu beta-slični molekuli
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
EP2292271A3 (en) 2001-10-10 2011-09-14 BioGeneriX AG Remodelling and glycoconjugation of an antibody
AU2003210564B2 (en) * 2002-01-18 2008-10-23 Biogen Ma Inc. Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
WO2004020468A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
EP1539960B1 (en) * 2002-09-09 2010-04-28 Hanall Pharmaceutical Co., Ltd. Protease-resistant modified interferon alpha polypeptides
PL377612A1 (pl) * 2002-09-27 2006-02-06 Biogen Idec Ma Inc. Terapie przewlekłej zapalnej polineuropatii demielinizacyjnej z użyciem interferonu-ß
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
DK1667708T5 (da) * 2002-12-26 2012-11-12 Mountain View Pharmaceuticals Polyethylenglycolkonjugater af interferon-beta-1b med forøget biologisk styrke in vitro
MXPA05006945A (es) * 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas polipeptidicas y sus antagonistas con actividad conservada de union al receptor.
NZ542094A (en) 2003-03-14 2008-12-24 Neose Technologies Inc Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains
WO2004084949A2 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Xencor Generating protein pro-drugs using reversible ppg linkages
MXPA05010411A (es) * 2003-03-28 2006-05-31 Biopolymed Inc Material activo biologicamente conjugado con polimeros biocompatibles con el complejo 1:1, metodo de preparacion del mismo y composicion farmaceutica que lo contienen.
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EP1613261A4 (en) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
ES2297423T3 (es) * 2003-05-21 2008-05-01 Ares Trading S.A. Metodo de analisis cromatografico de una solucion proteica.
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
PL1666496T3 (pl) * 2003-08-25 2014-08-29 Toray Industries Kompozyt interferonu beta
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
CN101072789B (zh) 2004-01-08 2013-05-15 生物种属学股份公司 肽的o-连接的糖基化
MXPA06008496A (es) 2004-02-02 2007-01-30 Ambrx Inc Polipeptidos de interferon humano modificados y sus usos.
CA2556339A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-15 David Ray Filpula Interferon-beta polymer conjugates
WO2005112911A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders
JP2008509889A (ja) * 2004-06-30 2008-04-03 イージェン コーポレーション ペグ化インターフェロンα−１ｂ
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
WO2009100255A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
EP1799249A2 (en) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
CA2593682C (en) 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20070092486A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Avigenics, Inc. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
JP2009515933A (ja) * 2005-11-18 2009-04-16 アレス トレーディング ソシエテ アノニム インフルエンザにおけるインターフェロン
US8334257B2 (en) 2005-12-20 2012-12-18 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
US20080038224A1 (en) * 2006-03-28 2008-02-14 Thierry Guyon Modified interferon-beta (IFN-beta) polypeptides
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
KR20080108147A (ko) 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
US8637325B2 (en) * 2009-02-16 2014-01-28 University Of Wyoming Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins
JP2009544327A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
EP2059527B1 (en) 2006-09-01 2014-12-03 Novo Nordisk Health Care AG Modified glycoproteins
PL2068935T3 (pl) * 2006-09-15 2011-11-30 Creabilis Therapeutics S R L Polimerowe koniugaty BOX-A HMGB1 i warianty HMGB1
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
CN103804489A (zh) 2006-12-15 2014-05-21 巴克斯特国际公司 具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物
CN101743018A (zh) * 2006-12-19 2010-06-16 梅里麦克药品公司 甲胎蛋白和免疫调谐剂的共同施用以治疗多发性硬化
KR20150064246A (ko) 2007-04-03 2015-06-10 바이오제너릭스 게엠베하 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
AU2008247815B2 (en) 2007-05-02 2012-09-06 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
EP2209494B1 (en) * 2007-10-09 2016-07-20 Polytherics Limited Novel conjugated proteins and peptides
PL2234645T3 (pl) 2007-12-20 2012-10-31 Merck Serono Sa Preparaty interferonu-beta modyfikowanego PEG
CN101965200B (zh) 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
CA2721093A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
WO2009129616A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Tissue Regeneration Therapeutics, Inc. Genetically modified human umbilical cord perivascular cells for prophylaxis against or treatment of biological or chemical agents
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
JP5677972B2 (ja) 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
GB0912485D0 (en) * 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
BRPI1013902A2 (pt) * 2009-04-30 2019-09-24 Children´S Hospital & Res Center At Oakland proteínas de ligação de fator quimérico h(fhbp) é método de uso
WO2010142017A1 (en) 2009-06-09 2010-12-16 Defyrus, Inc . Administration of interferon for prophylaxis against or treatment of pathogenic infection
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
TWI537006B (zh) 2009-07-27 2016-06-11 巴克斯歐塔公司 凝血蛋白接合物
NZ597600A (en) 2009-07-27 2014-05-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
CA2784800A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
AU2010341516B2 (en) 2009-12-21 2014-01-16 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
CN101906213B (zh) * 2010-07-23 2012-12-05 华南理工大学 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法
CN103068853B (zh) * 2010-08-19 2016-08-10 Peg生物制药公司 协同性生物分子-聚合物轭合物
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
EP2621516B1 (en) * 2010-10-01 2016-06-22 Biogen MA Inc. Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
BR112014007766B1 (pt) 2011-10-01 2022-05-10 Glytech, Inc Polipeptídeo glicosilado, método para fabricação do mesmo e composição farmacêutica
CA2865879A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Toray Industries, Inc. Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation
WO2014036520A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
AU2014245917B2 (en) 2013-03-29 2017-09-28 Glytech, Inc. Polypeptide having sialylated sugar chains attached thereto
KR101671501B1 (ko) 2014-07-24 2016-11-03 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론-베타 변이체
CA3023883A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
CN110546160A (zh) 2017-02-06 2019-12-06 奥里尼斯生物科学公司 靶向嵌合蛋白及其用途
RU2661088C1 (ru) * 2017-05-24 2018-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза
AU2019215440A1 (en) 2018-02-05 2020-08-27 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
RU2739261C1 (ru) * 2019-12-31 2020-12-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
MX2023011310A (es) 2021-03-26 2023-10-05 Innate Pharma Anclajes de citocina para proteinas de celulas nk de union a nkp46.
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
BR112023025331A2 (pt) 2021-06-09 2024-02-27 Innate Pharma Proteína multiespecífica, composição farmacêutica, célula recombinante, ácido nucleico ou conjunto de ácidos nucleicos, uso de uma proteína ou composição, métodos ou uso

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
CN1329082C (zh) * 1998-10-16 2007-08-01 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素－β－1a的聚合物缀合物及其使用

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2360794C2 (de) * 1973-12-06 1984-12-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von Peptiden
CH596313A5 (zh) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
IL47468A (en) 1975-06-12 1979-05-31 Rehovot Res Prod Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
EP0070906B1 (en) 1981-02-04 1986-10-15 Juridical Foundation Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon-beta gene
US4414147A (en) * 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
WO1983002461A1 (en) 1982-01-19 1983-07-21 Cetus Corp Multiclass hybrid interferons
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
EP0098110B1 (en) 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) * 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
CA1302320C (en) 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
US5231176A (en) 1984-08-27 1993-07-27 Genentech, Inc. Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons
FI90990C (fi) 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3685996T2 (de) 1985-06-11 1993-01-14 Ciba Geigy Ag Hybrid-interferone.
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5183746A (en) 1986-10-27 1993-02-02 Schering Aktiengesellschaft Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β-
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5004605A (en) 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847625A (en) * 1988-02-16 1989-07-11 Ford Aerospace Corporation Wideband, aperture-coupled microstrip antenna
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
JPH04502011A (ja) 1988-11-23 1992-04-09 ジェネンテク，インコーポレイテッド ポリペプチド誘導体
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2288429C (en) 1991-03-15 2006-04-25 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
AU2147192A (en) 1991-06-28 1993-01-25 Genentech Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
WO1993012145A1 (en) * 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5306344A (en) * 1992-12-02 1994-04-26 Edward C. Levy Company Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5641656A (en) 1993-10-22 1997-06-24 University Of Connecticut Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
PT730470E (pt) * 1993-11-10 2002-08-30 Enzon Inc Conjugados melhorados de interferao-polimero
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
DE69534676T2 (de) 1994-02-08 2006-08-17 Amgen Inc., Thousand Oaks Orale Verabreichung von chemisch modifizierten Proteinen
US5545723A (en) * 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
GB9415379D0 (en) * 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
AU697440B2 (en) * 1994-12-07 1998-10-08 Novozymes A/S Polypeptide with reduced allergenicity
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) * 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) * 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
AU5773798A (en) 1997-01-29 1998-08-18 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
WO1999003887A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
WO1999045964A1 (en) 1998-03-12 1999-09-16 Shearwater Polymers, Incorporated Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
JP4574007B2 (ja) * 1998-04-28 2010-11-04 メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム ポリオール−ｉｆｎ−ベータ複体
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
SK287491B6 (sk) * 1998-10-16 2010-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Fúzne proteíny interferónu- beta-1a a ich použitie
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
WO2001015736A2 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Maxygen Aps Interferon-beta conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
ATE317868T1 (de) 1999-12-22 2006-03-15 Nektar Therapeutics Al Corp Sterisch gehinderte derivate von wasserlöslichen polymeren
US9506008B2 (en) 2013-12-23 2016-11-29 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for improving engine fuel efficiency

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
CN1329082C (zh) * 1998-10-16 2007-08-01 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素－β－1a的聚合物缀合物及其使用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L.D. Jacobs et al..Intramuscular Interferon Beta-la for Disease Progression inRelapsing Multiple Sclerosis.Annals of NeurologyVol.39 No.3.1996,Vol.39(No.3),285-294. *
N. V. Katre.The conjugation of proteins with polyethylene glycol and otherpolymers.Advanced Drug Delivery ReviewsVol.l0 No.1.1993,Vol.l0(No.1),91-114. *

Also Published As

Publication number Publication date
PT1121156E (pt) 2006-05-31
SK287918B6 (sk) 2012-03-02
EA004789B1 (ru) 2004-08-26
US20150011732A1 (en) 2015-01-08
EP2260872B1 (en) 2017-08-30
KR100630849B1 (ko) 2006-10-04
EE05201B1 (et) 2009-08-17
EP2599503B1 (en) 2017-05-17
IS5913A (is) 2001-03-30
EA200100446A1 (ru) 2001-10-22
EP2260872A2 (en) 2010-12-15
CA2345138A1 (en) 2000-04-27
EE04967B1 (et) 2008-02-15
JP5396358B2 (ja) 2014-01-22
DK1121156T3 (da) 2006-06-06
EP1121156B1 (en) 2006-02-22
US9314534B2 (en) 2016-04-19
AU762616B2 (en) 2003-07-03
CN1323225A (zh) 2001-11-21
EP2260872A3 (en) 2011-04-27
CY1115125T1 (el) 2016-12-14
EP1656952A3 (en) 2006-11-29
SI1121156T1 (sl) 2006-08-31
PL347968A1 (en) 2002-04-22
CN1329082C (zh) 2007-08-01
US7446173B2 (en) 2008-11-04
WO2000023114A9 (en) 2001-07-05
NO20011860L (no) 2001-06-15
EP1656952A2 (en) 2006-05-17
IL142282A0 (en) 2002-03-10
SK5062001A3 (en) 2002-01-07
HK1042434A1 (en) 2002-08-16
WO2000023114A3 (en) 2000-09-28
NO20011860D0 (no) 2001-04-11
JP2007063283A (ja) 2007-03-15
LT2599503T (lt) 2017-06-26
US20160250340A1 (en) 2016-09-01
ES2653589T3 (es) 2018-02-07
JP2011026329A (ja) 2011-02-10
BR9915542B1 (pt) 2016-06-07
JP5863865B2 (ja) 2016-02-17
ES2257884T3 (es) 2006-08-01
SG2008070138A (en) 2017-08-30
ES2447772T3 (es) 2014-03-12
LTPA2017030I1 (lt) 2017-10-25
US6962978B2 (en) 2005-11-08
BR9915542A (pt) 2001-08-14
EP1121156A2 (en) 2001-08-08
EE200700058A (et) 2008-02-15
AU1446500A (en) 2000-05-08
HK1089393A1 (zh) 2006-12-01
DE69930015T2 (de) 2006-10-12
IS2926B (is) 2015-09-15
LTC2599503I2 (lt) 2019-06-25
KR20010103605A (ko) 2001-11-23
JP2002527491A (ja) 2002-08-27
JP4616478B2 (ja) 2011-01-19
ES2630278T3 (es) 2017-08-21
US20090104150A1 (en) 2009-04-23
US20070098688A1 (en) 2007-05-03
CZ299164B6 (cs) 2008-05-07
BR9915542B8 (pt) 2017-10-31
CY1105022T1 (el) 2010-03-03
EP2599503A2 (en) 2013-06-05
EA004789B9 (ru) 2017-05-31
HU229888B1 (en) 2014-11-28
CZ20011329A3 (cs) 2001-09-12
EP2599503A3 (en) 2013-07-24
EE200100220A (et) 2002-06-17
DE69930015D1 (de) 2006-04-27
WO2000023114A2 (en) 2000-04-27
US20030021765A1 (en) 2003-01-30
ATE318149T1 (de) 2006-03-15
BRPI9915542C1 (pt) 2021-05-25
CN101062419A (zh) 2007-10-31
NZ510689A (en) 2003-07-25
EP1656952B1 (en) 2013-12-18
JP2011093937A (ja) 2011-05-12
HK1042434B (zh) 2008-01-25
HUP0200444A2 (en) 2002-06-29
PT1656952E (pt) 2014-02-21
IL142282A (en) 2007-03-08
JP2014129420A (ja) 2014-07-10
DK1656952T3 (da) 2014-01-20
PL206536B1 (pl) 2010-08-31
SG110047A1 (en) 2005-04-28
CA2345138C (en) 2009-12-15
SI1656952T1 (sl) 2014-04-30
TR200101086T2 (tr) 2001-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101062419B (zh) 干扰素-β-1a的聚合物缀合物及其使用
CN100480266C (zh) 干扰素-β融合蛋白及用途
JP2002527491A5 (zh)
TW200418507A (en) Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
MXPA01003791A (es) Conjugados polimericos de interferon beta - 1a y usos de los mismos

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Massachusetts USA

Applicant after: Biological gene MA company

Address before: Massachusetts USA

Applicant before: Biogen IDEC Ma Inc.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM:

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: BIOGEN IDEC MA INC. TO: BIOGEN MA INC.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20160629