SK287918B6 - Composition containing glycosylated interferon-beta-1a, pharmaceutical composition, use of composition, in-vitro method of prolonging the activity of interferon-beta-1a and use of polymer moiety - Google Patents

Composition containing glycosylated interferon-beta-1a, pharmaceutical composition, use of composition, in-vitro method of prolonging the activity of interferon-beta-1a and use of polymer moiety Download PDF

Info

Publication number
SK287918B6
SK287918B6 SK506-2001A SK5062001A SK287918B6 SK 287918 B6 SK287918 B6 SK 287918B6 SK 5062001 A SK5062001 A SK 5062001A SK 287918 B6 SK287918 B6 SK 287918B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
interferon
leu
polymer
composition
amino acid
Prior art date
Application number
SK506-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK5062001A3 (en
Inventor
Blake Pepinsky
Laura Runkel
Margot Brickelmaier
Adrian Whitty
Paula Hochman
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26801696&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK287918(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of SK5062001A3 publication Critical patent/SK5062001A3/sk
Publication of SK287918B6 publication Critical patent/SK287918B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Abstract

Described is an interferon-beta-1a composition containing a glycosylated interferon-beta-1a coupled to a non-naturally- occurring polymer at N-terminal end of the interferon-beta-1a, whereby the polymer comprising a polyalkylene glycol moiety, use of the composition in the treatment of cancer tumors, autoimmune conditions, viral diseases or angiogenic diseases, an in-vitro method of prolonging the activity of interferon-beta-1a in an in-vitro system.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka najmä kompozícií interferónu-β obsahujúcich interferón-β-la naviazaný na polymér obsahujúci polyalkylénglykolovú časť, pričom interferón-β-1 a a polyalkylénglykolová časť sú usporiadané tak, že interferón-β-1 a má zvýšenú aktivitu vzhľadom na iné terapeutické formy interferónu-β (napr. interferónu-β-1 b) a neprejavuje žiadne zníženie aktivity v porovnaní s nekonjugovaňou formou. Konjugáty podľa vynálezu sú užitočné ako liečivá a iné prípravky, napr. na diagnostické použitie.
Doterajší stav techniky
Použitie polypeptidov a proteínov na systémové liečenie špecifických ochorení je teraz bežne akceptované v lekárskej praxi. Úloha, akú majú látky tohto typu v terapii, je tak dôležitá, že mnohé výskumy sú zamerané na syntézu veľkého množstva týchto látok technológiou rekombinantnej DNA. Mnohé z týchto molekúl sú endogénne molekuly, ktoré sú veľmi účinné a špecifické vo svojom biologickom účinku.
Hlavným faktorom, ktorý obmedzuje užitočnosť látok proteínového charakteru pre ich zamýšľané aplikácie, je, že pri parenterálnom podávaní sú z tela za veľmi krátky čas eliminované. Je to dôsledkom toho, že sú metabolizované proteázami, alebo sa na ich eliminácii podieľa bežná clearancia metabolickými cestami eliminácie proteínov, ako je napr. filtrácia v obličkách. Perorálny spôsob podávania týchto látok je dokonca ešte problematickejší, pretože okrem proteolýzy v žalúdku aj vysoká acidita v žalúdku ničí proteíny ešte pred tým, ako by mohli dosiahnuť zamýšľané cieľové tkanivo. Problémy spojené s uvedenými spôsobmi podávania proteínov sú vo farmaceutickom priemysle dobre známe, a preto sa použili rôzne stratégie, ako im zabrániť.
Publikoval sa rad prác zaoberajúcich sa stabilizáciou proteínov. Sú známe rôzne spôsoby konjugácie proteínov s polymémymi materiálmi, vrátane napr. dextránu, polyvinylpyrolidónu, glykopeptidov, polyetylénglykolu a polyaminokyselín. Výsledné konjugované polypeptidy si podľa publikovaných výsledkov zachovávajú svoju biologickú aktivitu a rozpustnosť vo vode, takže sú použiteľné na parenterálne aplikácie. Peptidovou rodinou, ktorá je cieľom klinického výskumu a mnohých snáh o zlepšenie podávania a bioasimilácie, sú interferóny. Interferóny sa testovali pri viacerých ochoreniach. Použitie humánneho interferónu β, jedného člena tejto rodiny, je najlepšie zavedené pri liečení sklerózy multiplex. Na liečenie tohto ochorenia sa v Európe a v USA teraz schválili dve formy rekombinantného interferónu β. Jednou formou je interferón-β-la (ochranná známka a obchodný názov AVONEX®, výrobca Biogen, Inc., Cambridge, MA). Termíny „interferón^-la“ alebo „ΙΕΝ-β-la“, alebo „ΙΕΝ-β-la“, alebo „interferón-β-la“ sú v opise vynálezu používané celkom zameniteľné. Inou formou je interferón^-lb (ochranná známka a obchodný názov BETASERON®, Berlex, Richmond, CA), ďalej označovaný ako „interferón-β-1 b“ . Interferón β-la je produkovaný v bunkách cicavcov pomocou prírodnej sekvencie ľudského génu aje gylkozylovaný, zatiaľ čo interferón β-l b je produkovaný v bunkách E. coli pomocou modifikovanej sekvencie ľudského génu, ktorý obsahuje substitúciu, cysteín je nahradený serínom, v pozícii 17 a nie je glykozylovaný.
Už skôr sa priamym spôsobom porovnala relatívna in vitro aktivita interferónu β-la interferónu β-lb vo funkčnom teste a ukázalo sa, že špecifická aktivita interferónu β-la je asi lOx vyššia ako špecifická aktivita interferónu β-lb (Runkel a kol., 1998, Pharm, Res. 15: 641-649). V štúdiách, ktorých cieľom je zistiť štruktúrne príčiny rozdielnych aktivít, sa identifikovala glykozylácia ako jediný známy štruktúrny rozdiel medzi uvedenými dvoma produktmi, ktorý ovplyvňuje špecifickú aktivitu. Vplyv sacharidov sa prejavil najmä účinkom na stabilitu štruktúry. Stabilizujúci účinok sacharidov na štruktúru bol evidentný pri experimentoch s tepelnou denaturáciou a v analýze SEC. Neprítomnosť glykozylácie tiež korelovala so zvýšenou agregáciou a zvýšenou citlivosťou k tepelnej denaturácii. Enzymatické odstránenie sacharidov z interferónu β-la pomocou PNGázy F viedlo k extenzívnej precipitácii deglykozylovaného produktu.
Štúdie ukazujú, že aj napriek konzervatívnej aminokyselinovej sekvencii interferónu β-la a interferónu β-lb ide o rôzne biochemické jednotky a väčšina znalostí o interferóne β-lb sa nemôže aplikovať na interferón β-la a naopak.
Podstata vynálezu
Vynález využíva výhody glykozylovaného interferónu-β v porovnaní s neglykozylovanou formou. Vyvinula sa najmä kompozícia obsahujúca interferón-β-la so zvýšenou aktivitou vzhľadom na interferón-β-1 b, ktorý má tiež prospešné vlastnosti PEGylovaného (to znamená PEG-modifikovaného) proteínu všeobecne, bez straty aktivity v porovnaní s formami interferónu-β-la, ktoré nie sú konjugované. Uskutočnili sa teda také modifikácie, že produkty (to znamená konjugáty polymér-interferónu-β-1 a) si uchovávajú väčšinu svojej biologickej aktivity, a pritom sa dosiahli nasledujúce vlastnosti: zmenená farmakokinetika a farmakodynamika, ktorá vedie k dlhšiemu biologickému polčasu a zmenám tkanivovej distribúcie (napr. schopnosť zostať dlhší čas v cievach), zvýšená stabilita v roztoku, redukovaná imunogenicita, zlepšená ochrana pred proteolytickým štiepením a následným zrušením aktivity. Takáto kompozícia predstavuje podstatný pokrok v odbore medicíny farmácie a bola by významným príspevkom na liečenie ochorení, kde interferón preukázal svoju užitočnosť, ako je napríklad skleróza multiplex, fibróza a ďalšie zápalové a autoimunitné ochorenia, rôzne druhy rakovín, hepatitída a ďalšie vírusové ochorenia. Najmä schopnosť zostávať dlhší čas v cievnom systéme umožňuje, aby sa interferón-β-1 a použil na inhibíciu angiogenézy a potenciálne tiež na prestúpenie hematoencefalickej bariéry. Okrem toho teplotná stabilita, získaná vytvorením konjugátov polymér-interferónu-β-la je výhodná na formuláciu interferónu-β-la do práškových prípravkov na podávanie formou inhalácie.
Využili sa znalosti kryštalografickej štruktúry interferónu-β a vyvinul sa taký konjugát polymér-interferón^-la, kde polymér je naviazaný na tie miesta interferónu-β, ktoré dovolia, aby si konjugát uchoval plnú aktivitu interferónu-β v porovnaní s interferónom-β, ktorý nie je konjugovaný.
Jeden aspekt predloženého vynálezu sa týka konjugovaných komplexov interferónu-β-la, kde interferón-β-la je kovalentne naviazaný na polymér, ktorý obsahuje ako svoju integrálnu časť polyalkylénglykol.
Jeden konkrétny aspekt predloženého vynálezu sa týka kompozície fyziologicky aktívneho interferónu-β-la, ktorá obsahuje fyziologicky aktívny interferón-β-la konjugovaný s polymérom obsahujúcim polyalkylénglykolovú časť, pričom interferón-β-la a polyalkylénglykolová časť sú usporiadané tak, že fyziologicky aktívny interferón-β-la v kompozícii má predĺžený biologický polčas vzhľadom na samotný interferón^-la (to znamená takému interferónu-β, ktorý nie je konjugovaný s polymérom).
Iný aspekt predloženého vynálezu predstavuje kompozíciu interferónu-β-la, ktorá obsahuje fyziologicky aktívny interferón-β-la konjugovaný s polymérom, kde interferón-β-la je fúzny protein, výhodne fúzia s imunoglobulínom. V takom komplexe tesná blízkosť N-konca (miesto konjugácie s polymérom) s C-koncom (miesto fúzie s IgN-koncom (miesto konjugácie s polymérom) s C-koncom (miesto fúzie s imunoglobulínovou, Ig, časťou) vedie k predpokladu zníženej imunogenicity takého fúzneho proteínu.
Ďalší aspekt predloženého vynálezu sa týka kompozície fyziologicky aktívneho interferónu-β-la, ktorá obsahuje fyziologicky aktívny interferón-β-la konjugovaný s polymérom obsahujúcim polyalkylénglykolovú časť, pričom interferón-β-la a polyalkylénglykolová časť sú usporiadané tak, že fyziologicky aktívny interfeΓόη-β-la v kompozícii má zvýšenú aktivitu vzhľadom na samotný interferón-β-la (to znamená na taký interferón-β, ktorý nie je konjugovaný s polymérom).
Ďalším uskutočnením vynálezu je konjugovaný protein interferón-β-la, kde interferónová časť sa mutovala, aby vznikli muteíny so selektívne zvýšenou antivírusovou a/alebo antiproliferačnou aktivitou vzhľadom na nemutovanú formu interferónu-β-la.
Ešte ďalší aspekt vynálezu sa týka stáleho, vo vode rozpustného konjugovaného komplexu interferónu-β-la, ktorý obsahuje fyziologicky aktívny interferón-β-la kovalentne naviazaný na fyziologicky kompatibilnú polyetylénglykolovú časť. V takom komplexe je interferón-β-la naviazaný na fyziologicky kompatibilnú polyetylénglykolovú časť labilnými kovalentnými väzbami voľnej aminoskupiny interferónu-β-1 a, pričom labilná kovalentná väzba je prerušená in vivo biochemickou hydrolýzou a/alebo proteolýzou.
V inom aspekte sa predložený vynález týka dávkovej formy obsahujúcej farmaceutický prijateľný nosič a stály, vo vode rozpustný komplex interferónu-β-la obsahujúci interferón-β konjugovaný s fyziologicky kompatibilným polyetylénglykolom.
V ďalšom aspekte predloženého vynálezu kompozície s kovalentne naviazaným interferónom-β-la, ako sú opísané skôr, využívajú interferón-β-la zamýšľaný na diagnostické použitie alebo na použitie in vitro, kde napr. interferón-β-la je diagnostické činidlo pre imunotest alebo iné diagnostické použitie, ktoré sa neuskutočňuje in vivo. Pri takom inom ako liečebnom použití komplex podľa vynálezu je veľmi užitočný ako stabilizovaná kompozícia, ktorá je formulovaná napr. v kompatibilnom rozpúšťadle alebo ako iný prípravok v podobe roztoku, ktorý poskytne prípravok v takej forme, že má zvýšenú rezistenciu proti degradácii.
Modifikácie interferónu-β-la netoxickými polymérmi ponúkajú isté výhody. Ak sú modifikácie uskutočnené tak, že výsledné produkty (to znamená konjugáty polymér-interferón^-la) si uchovávajú väčšinu svojej biologickej aktivity, majú nasledujúce vlastnosti: zmenenú farmakokinetiku a farmakodynamiku vedúcu k predĺženému biologického polčasu a zmenám tkanivovej distribúcie (napr. schopnosti zostávať dlhšie v cievnom systéme), zvýšenú stabilitu v roztoku, zníženú imunogenicitu, lepšiu ochranu interferónu-β-la pred proteolytickou degradáciou a následnou stratou aktivity, zvýšenú teplotnú stabilitu vedúcu k účinnejšej formulácii do práškových prípravkov na perorálny alebo inhalačný spôsob podávania.
Interferón-β-la s opísanými zlepšenými vlastnosťami je účinný pri liečení po perorálnom alebo parenterálnom podaní alebo po podaní formou aerosólu. Ďalšie spôsoby podávania, ako napr. nazálne a transdermálne, sú tiež využiteľné s modifikovaným interferónom-β-la.
Ďalší aspekt predloženého vynálezu sa týka spôsobu inhibície angiogenézy a neovaskularizácie, ktorý spočíva v tom, že sa pacientovi podáva účinné množstvo kompozície podľa vynálezu. Pegylovaný (to znamená PEG-modifikovaný) produkt podľa vynálezu by mal byť teda účinný najmä ako inhibítor angiogenézy v dôsledku zvýšenej hladiny interferónu a jeho predĺženého trvania v cievnom systéme.
V inom ako terapeutickom použití (napr. diagnostickom) ide o konjugáty diagnostických a/alebo reagenčných druhov interferónu-β. Výsledné konjugované činidlá sú odolné proti degradačným faktorom prostredia, vrátane degradačných procesov sprostredkovaných rozpúšťadlami alebo roztokmi. V dôsledku zvýšenej odolnosti a zvýšenej stability interferónu-β-la je možné v kompozícii zvýšiť významne aktivitu účinnej látky a súčasne s tým zvýšiť spoľahlivosť kompozície obsahujúcej interferón^-la pre špecifického koncového užívateľa.
Ďalšie aspekty, vlastnosti a modifikácie predloženého vynálezu sú podrobnejšie vysvetlené v nasledujúcom podrobnom opise a vynález je definovaný v pripojených patentových nárokoch.
Definície
Termín „kovalentne naviazaný“ používaný v opise znamená to, že špecifické skupiny alebo časti sú buď vzájomne priamo kovalentne viazané alebo sú spojené kovalentne prostredníctvom vmedzerenej skupiny alebo časti, alebo skupín, alebo častí, ako je napr. mostík, oddeľovacia časť (spacer) alebo spojovacia časť (linker).
„Interferon“ (skrátene označovaný tiež ako IFN) je malý, druhovo špecifický, jednoreťazcový polypeptid, tvorený v bunkách cicavcov ako reakcia na expozíciu rôznych induktorov, ako sú vírusy, polypeptidy, mitogény a podobne. Najvýhodnejší interferon podľa vynálezu je v glykozylovanej forme, ľudský interferón-β je glykozylovaný na 80. zvyšku (Asn80) a výhodne je pripravený technikami rekombinantnej DNA. Výhodný glykozylovaný interferon je označovaný „interferón-β-la“ alebo tiež ,,ΙΕΝ-β-la“, „ΙΕΝ-β-la“, „interferón-β-la“ alebo „interferón-β-la“, pričom všetky uvedené názvy sú používané zameniteľné. Termín „interferón-β-la“ podľa vynálezu zahŕňa aj mutované formy interferónu (pozri napr. príklad 1) za predpokladu, že tieto mutanty sú glykozylované na 80. zvyšku (Asn80). Metódy prípravy proteínov technikami rekombinatnej DNA sú známe, vrátane prípravy rôznych interferónov, a nijako neobmedzujú predložený vynález, pozri napr. patenty US 4 399 216, 5 149 636 a 5 179 017 (Axel a kol.) a 4 470 461 (Kaufman).
Výhodné polynukleotidy pre interferón-β-la, ktoré je možné použiť podľa predloženého vynálezu, sa odvodili zo sekvencií interferónu divého typu rôznych stavovcov, výhodne cicavcov, a získali sa metódami, ktoré sú odborníkovi známe a sú opísané, pozri napr. patent US 5 641 656 (udelený 24.6.1997, DNA kódujúci vtáčí interferónový pro-proteín typu I a zrelý vtáčí interferon typu I), patent US 5 605 688 (25. februára 1997 - rekombinantné psie a konské interferóny typu I), patent US 5 231 176 (27. júla 1993, DNA molekula kódujúca ľudský leukocytámy interferon), patent US 5 071 761 (10. 12. 1991, DNA sekvencie kódujúce subsekvencie ľudských lymfoblastoidných interferónov LyIFN-a-2 a LyIFN-a-3), patent US 4 970 161 (13. novembra 1990, DNA sekvencie kódujúce ľudský interferon γ), patent US 4 738 931 (19. apríla 1988, DNA sekvencie obsahujúce gén ľudského interferónu β), patent US 4 695 543 (22. septembra 1987, ľudský gén a-interferónu Gx-1) a US 4 456 748 (26. júna 1984, DNA sekvencie kódujúce subsekvencie rôznych prirodzene sa vyskytujúcich leukocytových interferónov).
Vo vynáleze sa môžu použiť tiež mutanty interferónu-β-la. Mutácie sa pripravujú v odbore známymi metódami cielenej mutagenézy. Okrem toho vynález poskytuje funkčne ekvivalentné polynukleotidy interferóηη-β-la, ktoré kódujú funkčne ekvivalentné polypeptidy interferónu-β-la.
Prvý polynukleotid je „funkčne ekvivalentný“ v porovnaní s druhým polynukleotidom, pokiaľ spĺňa aspoň jednu z nasledujúcich podmienok:
a) „funkčne ekvivalentný“ je prvý polynukleotid, ktorý hybridizuje s druhým polynukleotidom za štandardných hybridizačných podmienok a/alebo je degenerovaný vzhľadom na sekvenciu druhého polynukleotidu, najvýhodnejšie kóduje mutanta majúceho aktivitu interferónu-β-la,
b) „funkčne ekvivalentný“ je prvý polynukleotid, ktorý kóduje expresiu aminokyselinovej sekvencie kódovanej druhým polynukleotidom.
Je možné zhrnúť, že všeobecný termín „interferon“ zahŕňa, ale nie je obmedzený len na ne, všetky činidlá uvedené v predchádzajúcom texte a tiež ich funkčné ekvivalenty. Termín „funkčný ekvivalent“ sa týka tak interferónového proteínu, ako aj polynukleotidu kódujúceho interferónový proteín, ktoré majú rovnaký alebo lepší účinok na cicavčieho príjemcu ako pôvodný interferon, na ktorý sa funkčný ekvivalent vzťahuje. Odborníkovi je zrejmé, že funkčne ekvivalentný proteín sa môže pripraviť rekombinantnou technikou, to znamená expresiou „funkčne ekvivalentnej“ DNA. Takže predmetom predloženého vynálezu sú tiež interferóny kódovanej prirodzene sa vyskytujúcej DNA, a tiež kódovanej DNA, ktorá sa prirodzene nevyskytuje, ale kóduje rovnaký proteín, ako je kódovaný prirodzene sa vyskytujúcou DNA. Vďaka degenerácii nukleotidových kódujúcich sekvencií sa môžu použiť iné polynukleotidy na kódovanie interferónov. K nim patria celé alebo časti skôr uvedených sekvencií, ktoré sa zmenili substitúciou rôznych kodónov, ktoré kódujú rovnaký aminokyselinový zvyšok v sekvencií, ide teda o umlčanú zámenu. Také zmenené sekvencie sa považujú za ekvivalenty týchto sekvencií. Tak napr. Phe (F) je kódovaný dvoma kodónmi, a síce TTC alebo TTT, Tyr (Y) je kódovaný TAC alebo TAT a His (H) je kódovaný CAC alebo CAT. Na druhej strane Trp (W) je kódovaný jediným kodónom TGG. Takže je jasné, že pre danú sekvenciu DNA kódujúcu konkrétny interferón existuje veľa degenerovaných sekvencií, ktoré ho kódujú. Tieto degenerované sekvencie sú tiež predmetom predloženého vynálezu.
„Fúzia“ (tiež fúzny polypeptid alebo fúzny proteín) označuje kolineáme spojenie dvoch alebo viacerých proteínov alebo ich fragmentov prostredníctvom peptidovej kostry, a to tým, že sa exprimuje polynukleotidová molekula kódujúca tieto proteíny. K výhodným fúznym proteínom patrí interferón-β-la alebo jeho fragment kovalentne spojený s druhou časťou/skupinou, ktorá nie je interferónom. Špecificky fúzny proteín alebo fúzia „interferón-β-la/Ig“ je proteín obsahujúci molekulu interferónu-β-1 a podľa vynálezu, alebo jej fragment, naviazanú na N-koniec imunoglobulínového reťazca, pričom úsek N-konca imunoglobulínu je nahradený interferónom^-la.
Termín „rekombinantný“ znamená v opise vynálezu proteín pochádzajúci z rekombinantného cicavčieho expresného systému. Proteín exprimovaný vo väčšine bakteriálnych kultúr, ako je napr. E. coli, bude bez glykánov, a preto taký expresný systém nie je výhodný. Proteín exprimovaný v kvasinkách môže obsahovať oligosacharidové štruktúry, ktoré sú odlišné od štruktúr exprimovaných v cicavčích bunkách.
Termín „biologicky aktívny“ používaný v predloženom opise ako charakteristika interferónu-β-la znamená, že príslušná molekula má s opísanými uskutočneniami vynálezu homológiu v sekvencií aminokyselín dostatočnú na to, že má antivírusovú aktivitu pri meraní in vitro antivírusovým testom rovnakého typu, aký je opísaný v príklade 1 (pozri ďalej).
Termín „terapeutická kompozícia“ v opise vynálezu označuje kompozície obsahujúce proteíny podľa vynálezu a ďalšie fyziologicky kompatibilné prísady. Terapeutická kompozícia ďalej obsahuje excipienty, ako je napr. voda, minerály a nosiče ako napr. proteíny.
Termín „účinné množstvo“ činidla podľa vynálezu označuje také množstvo, ktoré poskytuje požadovaný výsledok alebo prejavuje vplyv na určité ochorenie, ktoré sa lieči.
„Aminokyselina“ je monoméma jednotka peptidu, polypeptidu alebo proteínu. Existuje dvadsať aminokyselín, ktoré sa vyskytujú v prirodzene sa vyskytujúcich peptidoch, polypeptidoch alebo proteínoch, a všetky sú L-izoméry. Patria sem tiež analógy aminokyselín a D-izoméry aminokyselín tvoriacich proteíny a ich analógy.
„Derivatizovaná“ aminokyselina je prírodná aminokyselina alebo aminokyselina nevyskytujúca sa v prírode, kde normálne sa vyskytujúce postranné reťazce alebo koncové skupiny sú chemicky modifikované. K takým modifikáciám patria napr. y-karboxylácia, β-karboxylácia, sulfatácia, sulfonácia, fosforylácia, amidizácia, esterifikácia, N-acetylácia, karbobenzylácia, tosylácia a ďalšie modifikácie, ktoré sú odborníkom známe. Takže „derivatizovaný polypeptid“ je polypeptid obsahujúci jednu alebo viac derivatizovaných aminokyselín.
„Proteín“ je polymér zložený v podstate z ktorýchkoľvek z dvadsiatich proteínových aminokyselín. Aj keď termín „polypeptid“ sa často používa na označenie relatívne veľkých polypeptidov a termín „peptid“ sa často používa na označenie relatívne malých polypeptidov, použitie týchto termínov v odbore sa často prekrýva a je odlišné. V tomto texte sa používa termín „proteín“ na označenie peptidov, proteínov aj polypeptidov, ak nie je výslovne uvedené inak.
Termín „mutácia“ (prípadne „mutant“) označuje akúkoľvek zmenu v kvalite alebo štruktúre genetického materiálu organizmu, konkrétne je to akákoľvek zmena (to znamená delécia, substitúcia, adícia alebo alterácia) v géne, to znamená polynukleotidovej sekvencií, interferónu divého typu alebo akákoľvek zmena v interferónovom proteíne divého typu.
Termín „divý typ“ označuje prirodzene sa vyskytujúcu polynukleotidovú sekvenciu exónu proteínu alebo jej časť, alebo aminokyselinovú sekvenciu interferónového proteínu, alebo jej časť, tak ako sa normálne vyskytuje in vivo.
„Štandardné hybridizačné podmienky“ sú podmienky definované koncentráciou solí a teplotou v podstate zhodné s podmienkami 0,5 x SSC až 5 x SSC a 65 °C tak pre vlastnú hybridizáciu, ako premývanie. Tu používaný termín „štandardné hybridizačné podmienky“ je preto operačná definícia zahŕňajúca celý rad rôznych hybridizačných podmienok. Podmienky s vysokou stringenciou znamenajú napr. hybridizáciu v pufri pre skríning plakov (0,2 % polyvinylpyrolidón, 0,2 % Ficoll 400, 0,2 % bovinný sérový albumín, 50 mM TrisHCl, pH 7,5, IM NaCl, 0,1 % hydrogénfosforečnan sodný, 1 % SDS) s 10 % dextrasulfátom a 100 pg/ml denaturovaných sonifikovaných DNA lososích spermií pri 65°C počas 12 až 20 hodín a premývanie v 75 mM NaCl/7,5 mM citrát sodný (0,5xSSC)/l % SDS pri 65 °C. Podmienky s nízkou stringenciou môžu napr. zahŕňať hybridizáciu v pufri pre skríning plakov s 10 % dextránsulfátom a 110 pg/ml denaturovaných sonifikovaných DNA lososích spermií pri 55 °C počas 12 až 20 hodín a premývanie v 300 mM NaCl/30 mM citrát sodný (2xSSC)/l % SDS pri 55 °C (pozri Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, Inc., New York, 6.3.1. - 6.3.6., 1989).
„Expresná kontrolná sekvencia“ je polynukleotidovú sekvencia, ktorá riadi a reguluje expresiu génov, keď je s týmito génmi operatívne spojená.
SK 287918 Β6 „Operatívne spojená“ znamená v prípade polynukleotidovej sekvencie (DNA, RNA), že je „operatívne spojená“ s expresnou kontrolnou sekvenciou, keď expresná kontrolná sekvencia riadi a reguluje transkripciu a transláciu tejto polynukletidovej sekvencie. Termín „operatívne spojená“ znamená, že pred polynukleotidovou sekvenciou, ktorá má byť exprimovaná, je vhodný štartovací signál (napr. ATG), a že sekvencia je v správnom čítacom rámci, ktorý dovoľuje expresiu polynukleotidovej sekvencie pod kontrolou expresnej kontrolnej sekvencie, a teda produkciu požadovaného polypeptidu kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvenciou.
„Expresný vektor“ je polynukleotid, väčšinou DNA plazmid alebo fág (ako najbežnejšie príklady z ďalších), ktorý dovoľuje expresiu aspoň jedného génu, keď je vektor vnesený do hostiteľskej bunky. Vektor môže ale nemusí byť schopný replikácie v hostiteľskej bunke.
Termín „izolovaný“ (používaný v predloženej prihláške zameniteľné s termínom „v podstate čistý“) znamená, ak sa týka polynukleotidových sekvencii génov, ktoré kódujú polypeptidy, RNA alebo DNA polynukleotid, časť genómového polynukleotidu, cDNA alebo syntetický polynukleotid, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zaobchádzania s ním:
(I) nie je spojený so všetkými polynukleotidmi, s ktorými je spojený v prírode (napr. je prítomný v hostiteľskej bunke ako časť expresného vektora), (II) je spojený s nukleovou kyselinou alebo inou chemickou skupinou, ktoré sa odlišujú od tých, s ktorými je spojený v prírode, alebo (III) nevyskytuje sa v prírode.
Ako „izolovaná“ sa ďalej označuje polynukleotidová sekvencia:
(I) amplifikovaná in vitro, napr. metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), (II) syntetizovaná chemicky, (III) rekombinantne pripravená klonovaním alebo (IV) purifikovaná, napr. štiepením a gélovou separáciou.
Takže „v podstate čistá nukleová kyselina“ je nukleová kyselina, ktorá nieje bezprostredne súvislo spojená s jednou alebo dvoma sekvenciami, s ktorými je normálne súvislo spojená v prírodné sa vyskytujúcom genóme organizmu, z ktorého je izolovaná. V podstate čistá DNA je tiež rekombinantná DNA, ktorá je časťou hybridného génu kódujúceho ďalšie sekvencie.
Termín „izolovaný“ (používaný v predloženej prihláške zameniteľné s termínom „v podstate čistý“) znamená, ak ide o polypeptidy, polypeptid alebo jeho časť, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zaobchádzaním s ním:
(I) je prítomný v hostiteľskej bunke ako expresný produkt úseku expresného vektora, alebo (II) je spojený s inými proteínmi alebo chemickými skupinami, ako s ktorými je spojený v prírode, alebo (III) nevyskytuje sa v prírode.
Ako „izolovaný“ sa ďalej označuje polypeptid, ktorý:
(I) sa chemicky syntetizoval, (II) sa exprimoval v hostiteľskej bunke a purifikoval od ostatných proteínov a nukleových kyselín hostiteľskej bunky, s ktorými sa v prírodnom stave vyskytuje.
Výhodne je izolovaný polypeptid purifikovaný tiež od ďalších látok, ako sú napr. protilátky alebo gélový matrix (polyakrylamid), ktoré sa používajú na purífikáciu.
Termín „heterológny promótor“ označuje promótor, ktorý v prírode nieje spojený s génom alebo purifikovanou nukleovou kyselinou.
Termín „homológny“ sa tu používa ako synonymum s „identický“ a týka sa sekvenčnej podobnosti dvoch polypeptidov alebo molekúl nukleovej kyseliny. Keď je jedna určitá pozícia v dvoch porovnávaných sekvenciách obsadená rovnakou zásadou alebo aminokyselinou (napr. pozícia v dvoch molekulách DNA je obsadená adenínom alebo pozícia v dvoch polypeptidoch je obsadená lyzínom), potom dve porovnávacie molekuly sú v tejto pozícii homológne. Percento homológie medzi dvoma sekvenciami je funkciou počtu zhodných alebo homológnych pozícií, ktoré majú dve sekvencie, ktorý je delený celkovým počtom pozícií a vynásobený 100. Tak napr. ak 6 z 10 pozícii je zhodných alebo homológnych, potom tieto sekvencie sú na 60 % homológne. Alebo napr. DNA sekvencia CTGACT a CAGGTT majú 50 % homológiu (3 pozície zo 6 sa zhodujú). Všeobecne sa porovnanie uskutočňuje, keď sú sekvencie vzájomne priradené tak, aby sa dosiahla maximálna homológia. Také priradenie a porovnanie je možné uskutočniť metódou, ktorú publikoval Needleman a kol. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970), a ktorá je štandardne implementovaná v príslušných počítačových programoch, ako je napr. program „Align“ (DNAstar, Inc.). Homológne sekvencie majú zhodné alebo podobné zvyšky aminokyselín, kde podobné aminokyselinové zvyšky sú konzervatívne substitúcie alebo „povolené bodové mutácie“ zodpovedajúcich aminokyselinových zvyškov vzhľadom na priradenú referenčnú sekvenciu. V tomto zmysle „konzervatívna substitúcia“ aminokyselinového zvyšku v referenčnej sekvencii znamená substitúciu aminokyselinou, ktorá je fyzicky alebo funkčne podobná zodpovedajúcemu referenčnému zvyšku, teda napr. má podobnú veľkosť, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti vrátane schopnosti vytvárať kovalentné alebo vodíkové väzby a pod. Zvlášť výhodné sú kovalentné substitúcie, ktoré spĺňajú kritériá definované ako „prijateľné bodové mutácie“ v publikácii Dayhoff a kol., Atlas of Protein Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352-354, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington D.C., 1978.
Termíny „polynukleotidová sekvencia“ a „nukleotidová sekvencia“ sú používané v opise zameniteľné. Termíny „angiogenéza“ a „neovaskularizácia“ sú používané v najširšom význame a znamenajú vytváranie nových krvných ciev. Najmä angiogenéza sa týka tiež vytvárania nových krvných ciev v mieste nádoru. Termíny „IFNAR2“ , „IFNAR1“ a „IFNAR1/2“ označujú proteiny, ktoré tvoria interferónový receptor typu I na povrchu buniek. Extracelulámy úsek (ektodoména) receptora 1FNAR2 sama môže viazať interferón β alebo a.
Pri realizácii predloženého vynálezu sa použili štandardné metódy bunkovej biológie, bunkových kultúr, molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie a imunológie, ktoré sú odborníkom známe. Tieto metódy sú publikované v odbornej literatúre. Pozri napr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I a II (D. N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent No. 4 683 195 (Mullis a kol.,); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames a S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu a kol., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Interferón-β
Interferón-β-1 a je užitočný ako činidlo vhodné na liečenie, remisiu alebo zoslabenie ochorení, fyziologických stavov, symptómov alebo etiologických faktorov, alebo na stanovenie takej diagnózy. Termín sa týka aj interferónu-β-la, ktorý je súčasťou fúzneho proteínu, ako je opísané v súčasne prejednávanej patentovej prihláške USA č. 60/104572 a 60/120161. Príprava fúznych proteínov vo všeobecnom zmysle je odborníkom známa.
Pôvodcovia predloženého vynálezu našli jedinečné miesta na naviazanie polyméru, pri ktorom sa nenaruší funkcia interferónu-β-1 a. Okrem toho bola tiež použitá miestne cielená mutagenéza k nezávislému výskumu miest na naviazanie polyméru (pozri príklad 1). Stručne povedané, uskutočnila sa mutačná analýza ľudského interferónu-β-í a s cieľom zmapovať aminokyselinové zvyšky nevyhnutné pre aktivitu a väzbu na receptor. Dostupnosť 3-D kryštálovej štruktúry ľudského interferónu-β-la (pozri príklad 1) dovolila identifikovať pomocou alanínových (alebo serínových) substitúcií zvyšky exponované rozpúšťadlu, prístupné pre interakciu interferónu-β-la s receptorom, a uchovať aminokyseliny podieľajúce sa na intramolekulámych väzbách. Pripravil sa panel pätnástich mutácií získaný „alanínovou skenovacou mutagenézou“ , kde sa nahradilo 2 až 8 aminokyselinových zvyškov v určitom úseku skrutkovníc (A, B, C, D a E) a slučiek (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2, DE1, DE2) molekuly interferónu-β-la (pozri príklad 1).
Histidínová značka („his-tag“) na amino-konci sa vniesla kvôli afinitnej purifikácii expresných mutantov z cicavčích buniek (pozri obr. 10 a sekvencie id. č. 1 a 2, kde sú cDNA sekvencie a dedukovaná aminokyselinová sekvencia). Funkčné dôsledky uskutočnených mutácií sa vyhodnotili v antivírusových a antiproliferačných testoch. Vyvinul sa nerádioaktívny väzbový test pre analýzu mutantov na ich väzbu na povrchový receptor interferónu-β-la (IFNAR1/2 receptor na bunkovom povrchu). Okrem toho sa použil ELISA test používajúci fúzny protein „ektodoména IFNAR2/Ig“ na naviazanie interferónu na mapovanie povrchových interakcií medzi interferónom^-la a receptorom 1FNAR2 (pozri príklad 1). Tieto mutačné analýzy ukázali, že N- a C-konce ležia v úseku molekuly interferónu-β-1 a, ktorý nie je dôležitý pre väzbu receptora alebo biologickú funkciu.
Mutanty sú ďalšími molekulami interferónu-β-1 a vhodnými ako interferónová časť v konjugátoch podľa vynálezu, ktoré sú zvlášť užitočné, ak majú nové vlastnosti, ktoré sa nevyskytujú pri interťeróne-β-1 a divého typu (pozri príklad 1). Identifikovali sa tri druhy účinkov, spôsobené cielenou mutagenézou. Tieto účinky sú za istých okolností výhodné pre vývoj interferónových liečiv.
Tieto účinky sú nasledujúce:
a) mutanty s vyššou antivírusovou aktivitou ako interferón-β-la divého typu s his-značkou (napríklad mutant Cl),
b) mutanty aktívne tak v antivírusovom ako antiproliferatívnom teste, ale ich antiproliferatívna aktivita bola neúmerne nízka v porovnaní s antivírusovou aktivitou, v porovnaní s interferónom^-la divého typu s his-značkou (napr. mutant Cl, D a DE1),
c) funkčné antagonisty (napr. Al, B2, CD2 a DE1), ktoré majú antivírusovú aj antiproliferatívnu aktivitu, ale ich antivírusová aj antiproliferatívna aktivita bola neúmerne nízka v porovnaní s väzbovou aktivitou k receptoru, v porovnaní s interferónom-β-la divého typu.
Polymérová časť
Podľa vynálezu, v jeho najširšom zmysle, je možné na konjugáciu s interferónom-β-la použiť jedinú molekulu polyméru, aj keď vynález zahŕňa použitie viac ako jednej molekuly. Kompozície podľa vynálezu obsahujúce konjugáty interferónu-β-1 a sú užitočné v aplikáciách in vitro a in vivo. Navyše je známe, že konjugujúci polymér môže využiť akékoľvek iné skupiny, časti alebo iné konjugované molekuly v závislosti od výslednej aplikácie. Ako príklad uveďme, že v niektorej aplikácii môže byť užitočné k polyméru kovalentne naviazať funkčnú skupinu zabezpečujúcu rezistenciu proti degradácii UV žiarením alebo oxidáciou, prípadne iné výhodné vlastnosti polyméru. Ako ďalší príklad uveďme, že v niektorých aplikáciách môže byť výhodné funkcionalizovať polymér tak, aby bol reaktívny alebo zosieťovateľný, aby sa zosilnili určité vlastnosti celkovo konjugovaného materiálu. Takže polymér obsahuje akúkoľvek funkčnú skupinu, opakujúce sa skupiny, väzby alebo iné štruktúry, ktoré nie sú na zábranu funkcii a aktivite konjugovaného interferónu-β-la v kompozícii s určitým cieľom. Ďalšie výhody predloženého vynálezu sú zrejmé z ďalšieho opisu a tiež patentových nárokov.
Na ilustráciu sú ďalej uvedené príklady polymérov, ktoré sa môžu použiť na dosiahnutie týchto výhodných vlastností, ako je opísané v reakčných schémach. Pri aplikáciách s kovalentne viazaným peptidom sa polymér funkcionalizuje, a potom sa naviaže na voľnú aminokyselinu (alebo viac aminokyselín) peptidu, kde vytvorí labilné väzby.
Interferón^-la je najvýhodnejšie konjugovaný prostredníctvom terminálnych reaktívnych skupín polyméru, aj keď konjugácie môžu byť tiež rozvetvené z iných ako výsledných reaktívnych skupín. Polymér s reaktívnymi skupinami je v opise vynálezu označovaný termínom „aktivovaný polymér“ . Reaktívne skupiny selektívne reagujú s voľnými aminokyselinami alebo inými reaktívnymi skupinami proteínu. Aktivovaný polymér je zreagovaný tak, že k väzbe môže dôjsť s akoukoľvek dostupnou aminoskupinou interferónu-β-la, ako je napr. a aminoskupina alebo ε aminoskupina lyzínu. Voľné karboxylové skupiny, vhodne aktivované karbonylové skupiny, hydroxylové a guanidylové skupiny, oxidované sacharidové skupiny a merkaptoskupiny interferónu^-la (ak sú dostupné) môžu sa tiež použiť ako miesta naviazania polyméru.
Aj keď polymér môže byť naviazaný v podstate kdekoľvek na molekule interferónu-β-la, najvýhodnejšie miesto na naviazanie polyméru je A-koniec interferónu-β-la. Sekundárne miesta sú v blízkosti C-konca a na sacharidových skupinách. Takže najvýhodnejšie uskutočnenie predloženého vynálezu vyzerá takto: (I) N-koncovo naviazané konjugáty interferónu-β-la, (II) C-koncovo naviazané konjugáty interferónu^-la, (III) cukrom naviazané konjugáty polymémych konjugátov a (IV) A-, C- a cukrom viazané polyméme konjugáty fúznych proteínov interferónu-β-la.
Všeobecne sa používa 1,0 až 10 mol aktivovaného polyméru na jeden mol proteínu, v závislosti od koncentrácie proteínu. Výsledné množstvo je kompromisom medzi maximalizáciou rozsahu reakcie a minimalizáciou nešpecifických modifikácií produktu, a súčasne definovaním takej chémie, ktorá zachová optimum aktivity a súčasne optimalizuje, ak je to možné, biologický polčas proteínu. Výhodne je zachované aspoň 50 % aktivity proteínu, najvýhodnejšie 100 %.
Reakcia sa môže uskutočniť akýmkoľvek známym spôsobom, používaným pre reakciu biologicky aktívneho materiálu s inertným polymérom, výhodne pri pH 5 až 7, ak sú reaktívne skupiny na a aminoskupinách A-konca. Všeobecne celý postup obsahuje prípravu aktivovaného polyméru (ktorý má aspoň jednu koncovú hydroxylovú skupinu), a potom reakciu proteínu s aktivovaným polymérom, čím sa pripraví rozpustný proteín, ktorý je vhodný na formuláciu do prípravku. Skôr uvedené modifikačné reakcie sa môžu uskutočniť rôznymi spôsobmi, ktoré obsahujú jeden alebo viac krokov.
Ako už bolo uvedené, najvýhodnejšie uskutočnenie vynálezu je také, ktoré využíva N-konce interferónu-β-la na naviazanie polyméru. Existujú vhodné metódy na získanie interferónu-β-la modifikovaného na N-konci. Jedným príkladom takých metód je redukčná alkylácia, ktorá využíva rôzne reaktivity rôznych typov primárnych aminoskupín (ε aminoskupiny na lyzíne oproti N-koncovým aminoskupinám metionínu) dostupných pre derivatizáciu interferónu-β-la. Za vhodných selekčných podmienok je možné dosiahnuť v podstate selektívnu derivatizáciu interferónu^-la na N-konci s polymérom obsahujúcim karbonylovú skupinu. Reakcia sa uskutočňuje pri pH, ktoré umožňuje využiť rozdiely v pKa medzi ε aminoskupín lyzínových zvyškov a a aminoskupín N-koncových aminokyselinových zvyškov interferónu-β-la. Tieto chemické postupy sú odborníkom dobre známe.
Pôvodcovia vynálezu použili reakčnú schému, v ktorej je selektivita udržiavaná použitím nízkeho pH (všeobecne 5 až 6) v podmienkach, kde polymémy PEG-aldehyd reaguje s interferónom-β-la v prítomnosti kyanoborohydridu sodného. Tento postup po purifikácii PEG-interferónu^-la, ako ukázali analýzy SDS-PAGE, MALDI hmotnostnej spektrometrie a peptidového sekvenovania/mapovania, poskytuje interferón-β-la, ktorého N-koniec je špecificky zacielený PEG.
Kryštálová štruktúra interferónu-P-la je taká, že N- a C-koniec sú lokalizované vzájomne do tesnej blízkosti (pozri Karpusas a kol., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11813-11818). Takže modifikácia C-konca interferónu-β-la by mala mať minimálny účinok na jeho aktivitu. Zatiaľ čo neexistuje žiadna jednoduchá chemická stratégia na zacielenie polyalkylénglykolového polyméru, ako je napr. PEG, na C-koniec, priamou metódou by sa mohlo upraviť metódami génového inžinierstva požadované miesto tak, aby sa mohlo použiť na zacielenie polymérovej časti. Tak napr. vloženie Cys do miesta v blízkosti C-konca by umožnilo špecifickú modifikáciu použitím polyalkylénglykolu (napr. PEG) aktivovaného maleimidom, vinylsulfónom alebo haloacetátom. Tieto deriváty sa môžu použiť špecificky na modifikáciu vložených cysteínov vzhľadom na vysokú selektivitu týchto činidiel oproti cysteínu. K ďalším stratégiám, ktoré by boli alternatívou k modifikácii C-konca interferónu-p-la, patrí napr. inkorporácia histidínovej značky, na ktorú môže byť zacielený polymér (Fancy a kol., 1996, Chem and Biol. 3: 551) alebo inkorporácia ďalších glykozylačných miest.
Glykán na molekule interferónu-P-la je v takej pozícii, ktorá dovoľuje ďalšie modifikácie, bez toho, aby došlo k zmene aktivity. Metódy zacielenia cukrov ako miest pre chemické modifikácie sú odborníkom známe a teda polyalkylénglykolový polymér môže byť pripojený priamo a špecificky na cukry interferónu-P-la ktorý bol aktivovaný oxidáciou. Napr. môže sa pripraviť polyetylénglykolhydrazid, ktorý vytvára relatívne stále hydrazónové väzby kondenzáciou s aldehydmi a ketónmi. Táto vlastnosť sa využila na modifikáciu proteínov prostredníctvom oxidovaných oligosacharidových väzieb (pozri Andresz, H. a kol., 1978, Macromol. Chem. 179: 301). Konkrétne pôsobením nitritu na PEG-karboxymetylhydrazid vzniká PEG-karboxymetylazid, ktorý je elektrofilne aktívnou skupinou vzhľadom na aminoskupinu. Táto reakcia sa už použila na prípravu proteínov modifikovaných polyalkylénglykolom (pozri patenty US 4 101 380 a 4 179 337).
Pôvodcovia už skôr zistili, že chemické postupy s tiolovými spojovacími členmi (linkermi) ďalej uľahčujú zosietenie (cross-linking) proteínov. Konkrétne sa pripravili homotypické multiméry LFA-3 a CD4 použitím postupu, kde sa vytvorili reaktívne aldehydy na sacharidových častiach molekuly použitím jodistanu sodného, vytvorili sa cystamínové konjugáty prostredníctvom týchto aldehydov a indukovalo sa zosietenie prostredníctvom tiolových skupín cystamínov (pozri Pepinsky, B. a kol., 1991, J. Biol. Chem. 266: 18244-18249, Chen, L. L. a kol., 1991, J. Biol. Chem. 266: 18237-18243). Teda je možné sa domnievať, že aj tieto chemické postupy by boli vhodné na modifikácie s polyalkylénglykolovými polymérmi, keď je linker vložený do sacharidovej časti a polyalkylénglykolový polymér je naviazaný na tento linker. Linkery obsahujúce aminotiolovú alebo hydrazínovú skupinu umožnia naviazať jedinú polymérovú skupinu, štruktúra týchto linkerov sa môže meniť tak, že môžu viazať viac polymérov a/alebo sa mení priestorová orientácia polyméru vzhľadom na molekulu interferónu-p-la.
Pri realizácii predloženého vynálezu sú výhodne vložené do požadovaných polymémych systémov polyalkylénglykolové zvyšky alkylpolyalkylénglykolov obsahujúcich alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, výhodne polyetylénglykol (PEG) alebo poly(oxy)-alkylénglykolový zvyšok takých glykolov. Takže polyméry, ku ktorým je proteín pripojený, sú homopolyméry polyetylénglykolu (PEG) alebo je to polyoxyetylovaný polyol, vždy za predpokladu, že polymér je pri teplote miestnosti rozpustný vo vode. K príkladom takých polymérov, pričom tento výpočet nie je nijako obmedzujúci, patria homopolyméry polyalkylénoxidu, ako sú PEG alebo propylénglykoly, polyoxyetylénované glykoly, ich kopolyméry a blokové polyméry, a to za predpokladu, že pri blokových kopolyméroch je zachovaná rozpustnosť vo vode. K príkladom polyoxyetylovaných polyolov patrí polyoxyetylovaný glycerol, polyoxyetylovaný sorbitol, polyoxyetylovaná glukóza a podobne. Glycerolová kostra polyoxyetylovaného glycerolu je zhodná s kostrou vyskytujúcou sa v prírode, napr. v mono-, di- a triglyceridoch živočíchov a človeka. Teda takto rozvetvená kostra nebude v tele rozpoznaná ako cudzorodé činidlo.
Ako alternatíva k polyalkylénoxidom sa môžu použiť dextrán, poly viny lpyrolidóny, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, polyméry založené na sacharidoch a ďalšie. Odborníkovi je zrejmé, že skôr uvedené výpočty sú len ilustratívne a že vynález zahŕňa akékoľvek polyméme materiály opísaných vlastností.
Polymér nemusí mať nutne konkrétnu molekulovú hmotnosť, ale je výhodné, keď molekulová hmotnosť leží v rozsahu 300 až 100 000, výhodnejšie 10 000 až 40 000. Najmä veľkosti 20 000 a viac sú výhodné na zabránenie strát proteínov pri filtrácii v obličkách.
Derivatizácia polyalkylénglykolu má rad výhodných vlastností na formuláciu konjugátov interferónu-β-la s polymérom (polymér-interferón-p-la), spojenú s nasledujúcimi vlastnosťami polyalkylénglykolových derivátov: zlepšenie rozpustnosti vo vode, a pritom zabránenie antigénnej alebo imunogénnej reakcii, vysoký stupeň biologickej kompatibility, absencia biologickej degradácie polyalkylénglykolových derivátov in vivo a ľahké vylučovanie zo živých organizmov.
Navyše v inom aspekte predloženého vynálezu môže sa použiť interferón-P-la kovalentne naviazaný na polymérovú zložku, kde povaha spojenia je taká, že obsahuje štiepiteľné kovalentne chemické väzby. To potom umožňuje kontrolu časového priebehu odštiepenia polyméru od interferónu-β-la. Kovalentná väzba medzi liečivom, to znamená interferónom^-la, a polymérom sa môže štiepiť chemickou alebo enzymatickou reakciou. Produkt polymér-interferón^-la si pritom uchováva prijateľnú úroveň aktivity. Súčasne časti polyetylénglykolu sú prítomné v konjugovanom polymére, ktoré poskytnú produktu polymér-interferón^-la vy9 sokú rozpustnosť vo vode a predĺžený biologický polčas v krvnom obehu. V dôsledku týchto zlepšených vlastností je možné podľa vynálezu uvažovať pri in vivo aplikáciách o parenterálnom, nazálnom alebo perorálnom podávaní obidvoch druhov aktívnych molekúl polymér-interferón-P-la, a po hydrolytickom štiepení je možné očakávať dobrú biologickú dostupnosť interferónu-β-la samotného.
Odborníkovi je jasné, že reakčné schémy tu uvedené sú na ilustratívne potreby a nie sú nijako obmedzujúce vzhľadom na reakcie a štruktúry, ktoré sa môžu použiť pre modifikácie interferónu-β-la, aby sa dosiahla dobrá rozpustnosť, stabilita a afinita k bunkovej membráne pri parenterálnom a perorálnom podávaní. Reakcia polyméru s interferónom-P-la na získanie najvýhodnejšieho N-koncového konjugátu sa môže okamžite uskutočniť použitím celého radu reakčných schém. Aktivita a stabilita konjugátov interferónu-β-1 a podľa predloženého vynálezu môže do istej miery kolísať, keď sa použijú polyméry s rôznou veľkosťou molekuly. Rozpustnosť konjugátov sa môže meniť v závislosti od podielu a veľkosti polyetylénglykolového fragmentu vloženého do polymémej kompozície.
Využitie vynálezu
Jedinečnou vlastnosťou polymérov odvodených z polyalkylénglykolu, ktorá je cenná pre terapeutické aplikácie, je ich všeobecná biologická kompatibilita. Tieto polyméry majú rôzne rozpustnosti vo vode a nie sú toxické. Predpokladá sa, že nie sú ani antigénne ani imunogénne a nijako nenarušujú biologickú aktivitu interferónu-β-la, keď sú s ním konjugované za podmienok opísaných vo vynáleze. Majú tiež dlhý polčas v krvnom obehu a sú ľahko vylučované zo živých organizmov.
Produkty podľa vynálezu sú užitočné na zlepšenie biologického polčasu interferónu-β-la používaného v terapii, a je ich možné pripraviť na terapeutické využitie ľahko, rozpustením vo vode alebo inom vhodnom médiu. Podávanie prebieha parenterálnym alebo perorálnym spôsobom, alebo formou aerosólu. Na perorálne alebo parenterálne podávanie je možné pripraviť jemné koloidné suspenzie, aby sa dosiahol depotný účinok, zatiaľ čo na podávanie formou aerosólu sú vhodné kvapalné formy alebo suché prášky. V suchom lyofilizovanom stave alebo v tekutom prípravku majú konjugáty interferónu-β-la podľa predloženého vynálezu dobrú stabilitu. Tepelná stabilita konjugátov interferónu-β-1 a podľa vynálezu je výhodná najmä pri formulácii práškov, keď je potrebný dehydratačný krok (pozri napr. prihlášku PCT/US/95/06008, Methods and Compsitions for Dry Powder of Inteferons).
Terapeutické polymérové konjugáty interferónu-β-la podľa predloženého vynálezu je možné použiť na profylaxiu aj na liečenie akýchkoľvek ochorení, pre ktoré je účinná zložka interferón-β-la. Okrem toho polymérové konjugáty podľa vynálezu je možné využiť na diagnózu zložiek, podmienok alebo ochorení v biologických systémoch alebo vzorcoch, a tiež na diagnostické ciele v nefyziologických systémoch.
Terapeutické využitie predloženého vynálezu zahŕňa spôsoby liečenia živočícha, ktorý už má alebo je latentné vnímavý k takým ochoreniam alebo poruchám, ktoré vyžadujú také liečenie, ktoré spočíva v tom, že sa takému živočíchovi podáva účinné množstvo polymérového konjugátu podľa vynálezu, ktoré je účinné na liečenie takého ochorenia alebo poruchy. Polymérové konjugáty podľa vynálezu sú vhodné výhodne na liečenie cicavcov a najvýhodnejšie na liečenie človeka. V závislosti od konkrétneho ochorenia, ktoré je potrebné liečiť, sa pacientovi podávajú konjugáty podľa vynálezu v akejkoľvek vhodnej, terapeuticky účinnej a bezpečnej dávke, čo odborník ľahko stanoví bez neprimeraného experimentovania. Vzhľadom na medzidruhové bariéry pre interferóny typu I bude zrejme potrebné pripraviť konjugát polymér-interferón podľa vynálezu vždy z príslušného biologického druhu.
Antiproliferatívna bunková aktivita interferónu-β-la je dobre známa. Konkrétne niektoré polymérové konjugáty interferónu-β-la opísané v predloženej prihláške sú užitočné na liečenie nádorových a rakovinových ochorení, ako je napr. osteogénny sarkóm, lymfóm, akútna lymfocytáma leukémia, karcinóm prsníka, melanóm a nazofaryngeálny karcinóm, a tiež autoimunitných ochorení ako je napr. fibróza, lupus a skleróza multiplex. Tiež sa dá očakávať, že antivírusová aktivita, ktorú prejavujú proteínové konjugáty podľa vynálezu, sa využije na liečenie vírusových ochorení, ako je napr. infekcia ECM, chrípka a ďalšie infekcie respiračného traktu, hepatitída a besnota. Tiež sa dá očakávať, že imunomodulačná aktivita, ktorú prejavujú proteínové konjugáty podľa vynálezu, sa využije na liečenie autoimunitných a zápalových ochorení, ako je napr. fibróza a skleróza multiplex. Schopnosť interferónu-β-1 a inhibovať vytváranie nových krvných ciev (to znamená inhibovať angiogenézu a neovaskularizáciu) predurčuje konjugáty podľa vynálezu na použitie pri liečení angiogénnych ochorení, ako je napr. diabetická retinopatia, retinopatia predčasne narodených, makulárna degenerácia, odvrhnutie štepu rohovky, neovaskulárny glaukóm, retrolentálna fibroplázia, rubeóza a Osler-Weberov syndróm.
Okrem toho antiendoteliálna aktivita interferónu je už nejaký čas známa a jeden z možných mechanizmov pôsobenia interferónu môže byť narušenie aktivity endotelových buniek tým, že inhibuje produkciu alebo aktivitu angiogénnych faktorov produkovaných nádorovými bunkami. Niektoré cievne nádory, ako napr. hemangiómy, sú zvlášť citlivé na liečenie interferónom. Liečenie interferónom a je zatiaľ jediným doloženým spôsobom liečenia tohto ochorenia. Je možné očakávať, že liečenie konjugátmi interferónu-β-la podľa vyná10 lezu poskytne značný farmaceutický prospech v zmysle zlepšenej farmakokinetiky a farmakodynamiky, lebo konjugáty zostávajú v cievach dlhší čas ako nekonjugované interferóny, čo umožňuje oveľa účinnejšiu terapiu pri použití konjugátov ako antiangiogénneho liečiva (pozri príklad 8).
Konjugáty polymér-interferón-β-la podľa vynálezu sa môžu podávať samotné alebo vo forme farmaceutický prijateľných esterov, solí alebo iných fyziologicky aktívnych derivátov. Vo farmaceutických prípravkoch je interferón-β-la výhodne používaný spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi, a voliteľne akýmikoľvek ďalšími terapeutickými zložkami. Nosič musí byť farmaceutický prijateľný v tom zmysle, že musí byť kompatibilný s ostatnými zložkami v prípravku a nesmie byť nadmerne škodlivý pre príjemcu. Prípravok interferónu^-la sa podáva v množstve účinnom na dosiahnutie požadovaného farmakologického účinku, ako je opísané skôr, a v takých čiastkových množstvách, aby sa dosiahla požadovaná denná dávka.
K vhodným liekovým formám patria formy na parenterálne aj iné podávanie, k vhodným špecifickým spôsobom podávania patrí napr. podávanie perorálne, rektálne, bukálne, topické, nazálne, oftalmické, subkutánne, intramuskulárne, intravenózne, transdermálne, intratekálne, intraartikuláme, intraarteriálne, subarachnoidálne, bronchiálne, lymfatické, vaginálne a intrauterinné. Výhodné sú liekové formy na perorálne, nazálne a parenterálne podávanie.
Ak je interferón-β-la použitý v prípravku, ktorý obsahuje tekutý roztok, prípravok sa výhodne podáva perorálne alebo parenterálne. Ak je interferón-β-la použitý v prípravku, ktorý je vo forme tekutej suspenzie alebo suchého prášku formulovaný spolu s biologicky kompatibilným nosičom, potom sa môže výhodne podávať perorálne, rektálne alebo bronchiálne.
Ak je interferón-β-1 a použitý v prípravku priamo ako tuhá látka vo forme prášku, výhodne sa môže podávať perorálne. Alternatívne sa môže podávať nazálne alebo bronchiálne, pomocou nebulizácie prášku v nosičovom plyne, keď sa vytvára disperzia prášku v plyne, ktorú pacient vdychuje, a síce použitím vhodného nebulizačného zariadenia.
Prípravky obsahujúce polymérové konjugáty podľa predloženého vynálezu sa výhodne formulujú do jednotkových liekových foriem, a síce akýmikoľvek metódami, ktoré sú odborníkom vo farmácii známe. Tieto metódy všeobecne obsahujú krok, keď sa účinná zložka zmieša s nosičom a prípadne ďalšími pomocnými zložkami. Typicky sa prípravky pripravujú uniformným a dokonalým zmiešaním účinnej zložky (alebo viac účinných zložiek) s kvapalným nosičom, jemne rozdrobeným pevným nosičom alebo obidvoma, a potom sa produkt podľa potreby formuluje do požadovaných liekových foriem.
Liekové formy vhodné na perorálne podávanie sú v podobe diskrétnych jednotiek ako sú napr. tobolky, oblátky, tablety alebo pastilky, keď každá taká forma obsahuje dopredu stanovené množstvo účinnej zložky v podobe prášku alebo granulátu, alebo v tekutej forme, vodnej alebo bezvodej, ako je napr. sirup, elixír, emulzia alebo pena.
Tablety sa pripravujú lisovaním alebo odlievaním, prípadne s jednou alebo viacerými pomocnými zložkami. Lisované tablety sa pripravujú lisovaním na vhodných zariadeniach, kde sa používa účinná zložka vo voľne sypkej forme, ako je prášok alebo granulát, ktorá sa prípadne mieša so spojivami, rozvoľňujúcimi činidlami, lubrikantmi a inertnými riedidlami, povrchovo aktívnymi činidlami a uvoľňovacími činidlami. Odlievané tablety obsahujú zmes práškového polymérového konjugátu s vhodným nosičom a pripravujú sa odlievaním pomocou vhodného zariadenia.
Sirup sa pripraví pridaním účinnej látky do koncentrovaného vodného roztoku cukru, napr. sacharózy, ku ktorému sa pridajú ešte ďalšie pomocné prísady. K takým prísadám patria príchute, konzervačné činidlá, činidlá spomaľujúce kryštalizáciu cukru a činidlá zvyšujúce rozpustnosť ostatných zložiek, ako sú napr. polyhydroxyalkoholy, ako je glycerol alebo sorbitol.
Liekové formy vhodné na parenterálne podávanie výhodne obsahujú sterilné vodné prípravky aktívneho konjugátu, ktoré sú výhodne izotonické s krvou príjemcu (napr. fyziologický soľný roztok). Také prípravky obsahujú tiež suspendujúce činidlá a zahusťovadlá alebo iné mikročasticové systémy, ktoré sú určené na zacielenie zlúčeniny na krvné zložky alebo do jedného, alebo viacerých orgánov. Prípravky sú buď v jednodávkovej, alebo viacdávkovej liekovej forme.
Prípravky vo forme nosného spreja obsahujú purifikované vodné roztoky aktívneho konjugátu s konzervačnými a izotonickými činidlami. Také prípravky majú obvykle pH a tonicitu upravené tak, aby boli kompatibilné s nosnou sliznicou.
Liekové formy na rektálne podávanie sú obvykle čapíky, kde vhodným nosičom je kakaové maslo, hydrogenované tuky alebo hydrogenované mastné karboxylové kyseliny.
Oftalmické prípravky ako napr. očné kvapky sú pripravené podobne ako nosné spreje, s tým rozdielom, že pH a tonicita sú nastavené kompatibilne pre oko.
Topické prípravky obsahujú konjugáty podľa vynálezu rozpustené alebo suspendované v jednom alebo viacerých médiách, ako je napr. minerálny olej, petroleum, polyhydroxyalkoholy alebo iná farmaceutická zásada pre topické prípravky.
Okrem skôr uvedených zložiek môžu prípravky podľa vynálezu ešte ďalej obsahovať jednu alebo viac doplnkových zložiek, ako sú napr. riedidlá, pufre, príchute, rozvoľňujúce činidlá, povrchovo aktívne látky, zahusťovadlá, lubrikanty, konzervačné látky vrátane antioxidantov a ďalšie.
Takže predložený vynález poskytuje polyméry vhodné na in vitro stabilizáciu interferónu-P-la v roztoku, čo je príklad výhodnej, inej ako terapeutickej aplikácie vynálezu. Polyméry sa môžu využiť tiež na zvýšenie tepelnej stability a odolnosti proti enzymatickej degradácii interferónu-p-la. Zvýšenie tepelnej stability interferónu-P-la prostredníctvom konjugácie podľa predloženého vynálezu poskytuje spôsob, ako zvýšiť čas skladovateľnosti, stabilitu pri teplote miestnosti a trvanlivosť reagencií a súprav používaných pre výskum.
Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu vynálezu a nijako jeho predmet neobmedzujú. Je zrejmé, že najmä experimenty so zvieratami tu opísané môžu byť uskutočnené rôznymi spôsobmi, takže sú možné rôzne modifikácie a variácie základných metód tu opísaných. Tak napr. v príklade 5 môže odborník použiť iný neopterínový test alebo môže zmeniť druh alebo počet primátov v pokuse. Všetky také modifikácie a variácie spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 Väzba mutanta interferónu-β-ΙΑ so substituovaným alanínom na dimérny fúzny proteín obsahujúci extracelulámu doménu receptora interferónu typu I, IFNAR2/Ig (IFNAR2 ektodoména fúzovaná s konštantnou doménou ľudského IgGl)
Väzbové afinity alanínom substituovaného mutanta IFN (Al až E) pre receptor IFNAR2 sa stanovili postupom, ako je opísané v príklade 1 (časť D). Histogram predstavuje väzbové afinity v teste v porovnaní s väzbovými afinitami divého typu his-IFN-β (v % d.t., divého typu). Hodnoty % d.t. sa vypočítali nasledovne: (afinita divého typu his-IFN^/afmita mutovaného IFN-β) x 100. Uvedené sú hodnoty % d.t. (O) pre jednotlivé experimenty (n=3) a priemerné hodnoty % d.t. (x) pre experimentálny súbor. Mutanty A2, AB1, AB2 a E neviažu IFNAR2/Fc v koncentrácii 500x vyššej ako je EC50 divého typu his-IFN-β (*).
Obr. 2 Väzba mutanta interferónu-β-ΙΑ so substituovaným alanínom na povrchový komplex receptora interferónu typu I (IFNAR1/2 komplex) exprimovaný na Daudi bunkách Burkittovho lymfómu
Receptorovo-väzbové vlastnosti mutanta so substituovaným alanínom (Al-E) sa stanovili pomocou väzbového testu pre povrchový bunkový receptor založeného na analýze FACS, ako je opísaný v príklade 1 (časť D). Histogram predstavuje väzbové afinity v teste v porovnaní s väzbovými afinitami divého typu his-IFN-β (v % d.t., divého typu). Hodnoty % d.t. pre každý mutant sa vypočítali nasledovne: (afinita divého typu his-IFN^/afinita mutovaného IFN-β) x 100. Uvedené sú hodnoty % d.t. (O) pre jednotlivé experimenty a priemerné hodnoty % d.t. (x) pre experimentálny súbor.
Obr. 3 Antivírusová aktivita mutantov interferónu-β-la so substituovaným alanínom
Antivírusová aktivita mutantov interferónu^-la so substituovaným alanínom (Al-E) sa stanovila na ľudských bunkách A549 infikovaných EMC vírusom, ako je opísané v príklade 1 (časť E). Histogram predstavuje aktivitu v teste v porovnaní s aktivitou divého typu his-IFN-β (v % d.t., divého typu). Hodnoty % d.t. pre každého mutanta sa vypočítali nasledovne: (koncentrácia divého typu his-IFN-3[50 % cpe]/koncentrácia mutovaného IFN-β [50 % cpe]) x 100. Uvedené sú hodnoty % d.t. (O) pre jednotlivé experimenty a priemerné hodnoty % d.t. (x) pre experimentálny súbor.
Obr. 4 Antiproliferatívna aktivita mutantov interferónu^-la so substituovaným alanínom
Antiproliferatívna aktivita mutantov interferónu^-la so substituovaným alanínom (Al-E) sa stanovila na Daudi bunkách Burkittovho lymfómu, ako je opísané v príklade 1 (časť E). Histogram predstavuje aktivitu v teste v porovnaní s aktivitou divého typu his-IFN-β (v % d.t., divého typu). Hodnoty % d.t. pre každého mutanta sa vypočítali nasledovne: (koncentrácia divého typu his-IFN^[50 % inhibícia rastuj/koncentrácia mutovaného ΙΕΝ-β[50 % inhibícia rastu]) x 100. Uvedené sú hodnoty % d.t. (O) pre jednotlivé experimenty a priemerné hodnoty % d.t. (x) pre experimentálny súbor.
Obr. 5 Relatívne antivírusové a antiproliferatívne vlastnosti mutantov interťerónu-3-la so substituovaným alanínom
Relatívne aktivity mutantov interferónu-[3-la so substituovaným alanínom (Al-E) v teste antivírusovej (os x) a antiproliferatívnej (os y) aktivity sa porovnali. Na porovnanie sa použili hodnoty priemerného % divého typu his-IFN-β (% d.t., x) uvedené na obr. 3 a 4. Mutanty, ktoré majú koordinované zmeny v obidvoch aktivitách, sa objavia na vertikálnej čiare. Mutanty vykazujúce zmenu antivírusovej aktivity, ktorá nie je úmerná zmene v antiproliferačnej aktivite, sa objavia výrazne pod diagonálou (DE1, D, Cl). Významnosť sa stanovila na základe smerodajných odchýlok príslušných použitej priemernej hodnote % d.t..
Obr. 6 Lokalizácia miesta PEGylácie peptidovým mapovaním
PEGylovaný a nemodifikovaný interferón-P-la sa analyzovali peptidovým mapovaním. Vzorky sa naštiepili endoproteinázou Lys-C a potom analyzovali HPLC na kolóne C4 s reverznou fázou. Kolóna sa vyvíjala gradientom 0-70 % acetonitrilu v 0,1 % trifluóroctovej kyseline. Eluent z kolóny sa monitoroval pri 214 nm. Na paneli a je zobrazený nemodifikovaný interferón-P-la, na paneli b je PEGylovaný interferón-P-la. Šípky označujú elučnú pozíciu N-koncového peptidu interferónu-P-la obsahujúceho aminokyselinové zvyšky 1 až 19, ktorý sa odštiepil lyzínovou endoproteinázou.
Obr. 7 Antivírusová aktivita konjugovaného a nekonjugovaného interferónu-p-la
Aktivita interferónu-P-la a PEGylovaného interferónu-P-la v koncentráciách uvedených na osi x sa vyhodnotili v antivírusovom teste použitím buniek ľudského pľúcneho karcinómu (A549) infikovaných vírusom encefalomyokarditídy. Po dvojdennej inkubácii za prítomnosti vírusu sa živé bunky zafarbili MTT a misky sa vyhodnotili na čítacom zariadení pri 450 nm, absorbancie, ktorá je odrazom životnosti buniek. Smerodajné odchýlky sú uvedené ako zvislé úsečky. Koncentrácia interferónu-fi-la alebo PEGylovaného interferónu-p-la, pri ktorej došlo k 50 % usmrteniu buniek vírusom (50 % cytopatický účinok) (50 % maxima pri 450 nm), bola 11 pg/ml a 50 % cytopatický účinok pre PEGylovaný interferón-P-la bol asi 11 pg/ml.
Obr. 8 Hodnotenie stability konjugátov použitím tepelnej denaturácie
PEGylovaný interferón-P-la a neošetrený interferón-P-la ako kontrola v pufri 20 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM NaCl, sa zahrievali konštantnou rýchlosťou 1 stupeň za minútu. Denaturácia sa sledovala meraním zmien absorbancie v 280 nm. a) nemodifikovaný interferón-p-la, b) PEGylovaný interferón-P-la.
Obr. 9 Meranie antivírusovej aktivity interferónu-β v plazme myší ošetrených interferónom-P-la alebo PE -Gylovaným interferónom-P-la
Myšiam sa injikovalo buď 50 000 jednotiek interferónu-β-la, alebo PEGylovaného interferónu-β-la (obsahujúceho 20K PEG). Krv z týchto zvierat sa získala retroorbitálnym odberom v rôznych časoch po injekcii, ako ukazuje os x. Pre každý časový bod sa odobrala krv aspoň z troch myší, pripravila sa plazma a zamrazila až do stanovenia aktivity interferónu-β v antivírusovom teste s bunkami ľudského pľúcneho karcinómu (A549) po infekcii vírusom encefalomyokarditídy. Živé bunky sa zafarbili roztokom MTT, doštičky sa potom odmerali v 450 nm na stanovenie absorbancie, ktorá je odrazom životnosti buniek a aktivity interferónu-β. Na stanovenie množstva aktivity interferónu-β-la vo vzorke sa na každej doštičke pripravili tiež štandardné (kalibračné) krivky s interferónom-P-la. Graf ukazuje dáta z jednotlivých zvierat.
Obr. 10 Úplná DNA sekvencie génu interferónu-β s histidínovou značkou a zodpovedajúci proteínový produkt
Na obrázku sú uvedené úplné DNA sekvencie (sekvencia id. č. 1.) a proteínová sekvencia (sekvencia id. č. 2) histidínom označeného („His-tagg“) IFN-P-la. Štiepená signálna sekvencia VCAM-1 zanechá 3 zvyšky amino-konca (SerGlyGly) „upstream“ od histidínovej značky (His6, pozícia 4 až 9). Sekvencia enterokinázovej spojky (linkera) (AspAspAspAspLys) je od histidínovej značky oddelená oddeľovacou sekvenciou (spacerom) (SerSerGly, pozícia 10 až 12). Prírodná sekvencia proteínu IFN-P-la predstavuje sekvencie Metl8 až Asn 183.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Štúdie štruktúry/aktivity ľudského interferónu-β-la s použitím substitučných mutácií alanín/serín: analýza väzbových miest receptora a funkčných domén
A. Prehľad
Uskutočnila sa obsiahla mutačná analýza ľudského interferónu-p-la (IFN-P-la) s cieľom mapovať zvyšky potrebné pre aktivitu a väzbu receptora. Dostupnosť trojrozmernej (3-D) kryštálovej štruktúry ľudského IFN-β (Karpusas, M. a kol., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 11813-11818) umožnila pôvodcom identifikovať alanínové (alebo serínové) substitúcie zvyškov vystavených rozpúšťadlu dostupných pre receptorové interakcie a ponechať aminokyseliny zapojené do intramolekulámych väzieb. Navrhol sa panel 15 alanínových substitúcií, ktoré nahradili 2 až 8 zvyškov v priebehu rozdielnych oblastí každého helixu (A, B, C, D) a slučiek (AB, CD2, DE). Na ciele afinitnej purifikácie sa začlenila aminokoncová histidínová značka obsahujúca 6 histidínových zvyškov, ako aj štiepne miesto enterokinázy na odstránenie aminokoncovej extenzie.
Výsledné interferóny sa nazývajú ako „interferón(IFN)-fi so značkou his“ alebo „His-interferón-β“, alebo „His6-interferón-P a podobne.
Konštruovali sa rôzne mutácie expresných plazmidov IFN-β so značkou his s použitím génového konštruktu s divým typom IFN-β ako templátu pre mutagenézu. Stratégia mutagenézy vyžadovala najskôr vnesenie štiepneho miesta jedinečného reštrikčného enzýmu prostredníctvom génu IFN-β so značkou his, a potom nahradenie presných sekvencií DNA medzi vybranými reštrikčnými miestami syntetickými oligonukleotidovými duplexmi, ktoré kódovali alanínové (alebo serínové) substitučné mutácie. Nakoniec sa mutované gény IFN subklonovali do plazmidu, ktorý riadil expresiu cicavčích buniek v bunkovej línii 293 z ľudských obličiek.
Funkčné následky týchto mutácií sa hodnotili antivírusovými a antiproliferačnými testami. Vyvinul sa nerádioaktívny väzbový test pre IFN, ktorý analyzoval väzbu týchto mutantov k povrchovému receptoru („IFNAR1/2 komplex) buniek Daudi ľudského Burkittovho lymfómu. Navyše sa vyvinul test na mapovanie povrchov pri interakciách medzi mutantmi his-IFN-β a IFNAR2, ktorý používal fúzny proteín IFNAR2/Ig, zložený z extracelulámej domény proteínu IFNAR2 receptora IFN fúzovanej ku kĺbovej doméne, doménam CH2 a CH3 ľudského IgGl.
1. Vytvorenie génu interferónu-β ako templátu pre mutagenézu
Pri stratégii pôvodcov na tvorenie mutantov IFN-β substituovaných alanínom (alebo serínom) najskôr vznikol modifikovaný gén IFN-β, ktorý kódoval proteín divého typu, ale ktorý niesol štiepne miesta jedinečných reštrikčných enzýmov v géne. Jedinečné miesta sa použili na zámenu sekvencií divého typu syntetickými oligonukleotidovými duplexmi, ktoré kódovali mutované kodóny. Aby sa získala expresná kazeta ľudského ΙΡΝ-β-la vhodná na tvorbu mutovaných génov, bola cDNA IFN-β (GenBank prístupové Č.E00029) amplifikovaná pomocou PCR. Bolo nevyhnutné začiatočné klonovanie génu IFN-β do plazmidu pMJB107, derivátu pACYC184, (pozri Rose, a kol., 1988, Nucleic Acids Res., 16(1), 355), aby sa mohla uskutočňovať miestne cielená mutagenéza génu v plazmide, ktorému chýbali špecifické reštrikčné miesta vytvárané v priebehu mutagenézy.
Priméry pre PCR použité na subkionovanie kódujúcich sekvencií génu ľudského IFN-β tiež umožnili pôvodcom zaviesť štiepne miesto enterokinázy v protismere a v rámci s génom IFN-β:
PCR primér:
5-TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3 (sekvencia id. č. 3: „BET-021“) a 3 PCR primér:
5-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3 (sekvencia id č. 4: „BET-022“) a hraničné oblasti miest reštrikčných enzýmov (BspEI a Xhol) užitočné na klonovanie do miest plazmidu pMJB107. Výsledná DNA sa nazvala PCR fragment A.
Výkonná signálna sekvencia z ľudskej adhezívnej molekuly cievnej bunky-1 (V CAM-1) a značka šiestich histidínov sa zaniesli do výsledného konštruktu z druhého fragmentu DNA vytvoreného z pDSW247 (fragment B). Plazmid pDSW247 je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), z ktorého sa odstránil gén EBNA-1, a ktorý nesie signálnu sekvenciu VCAM-1 (VCAMss) fúzovanú v protismere a v rámci so značkou šiestich histidínov. Priméry PCR, ktoré sa použili na vytvorenie kazetovej skupiny VCAMMss-l/histidínová značka, boli KID-369 (5 PCR primér):
5-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3 (sekvencia id. č. 5) a KID-421 (3 PCR primér):
5-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3' (sekvencia id. č. 6) začleňujúce hraničné štiepne miesta reštrikčných enzýmov (Notl a BspEl), ktoré umožnili excíziu fragmentu B DNA.
Na vytvorenie plazmidového vektora, ktorý niesol signálnu sekvenciu VCAM-1, značku his a gén interferón-β, uskutočňovali pôvodcovia trojcestnú ligáciu s použitím DNA fragmentov purifikovaných cez gél z plazmidového vektora pMJB 107 (štiepeného Notl a Xhol), PCR fragmentu A (štiepeného BspEl a Xhol) a fragmentu B (štiepeného Notl a BspEl). Ligovaný plazmid sa použil na transformáciu buniek E. coli buď JA221, alebo XLl-Blue a vyberali sa kolónie rezistentné na ampicilín a testovali sa na výskyt inzertov analýzou reštrikčných máp. Izolovala sa DNA pomocou Maxiprepu a sekvencia inzertu sa overila sekvenovaním DNA. Výsledný konštrukt sa nazval pCMG260.
2. Vznik mutantov ľudského interferónu-β v pCMG260 substitúciou alanínu
Plazmid pCMG260 sa použil ako templát pre niekoľkokrát opakovanú mutagenézu (U.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim), ktorá zaviedla jedinečné reštrikčné štiepne miesta do pozícií v priebehu kódujúcej sekvencie proteínu IFN-β, ale nezmenila výslednú sekvenciu proteínu. Mutované plazmidy sa použili na transformáciu buď JA221, alebo XLl-Blue kmeňa E. coli a rekombinantná kolónie sa vy14 berali podľa rezistencie na chloramfenikol. Kolónie rezistentné na chloramfenikol sa ďalej testovali na výskyt požadovaného miesta jedinečného reštrikčného enzýmu pomocou analýzy reštrikčných máp DNA. Výsledný plazmid IFN-β, pCMG275.8, obsahoval úplnú súpravu jedinečných štiepnych miest reštrikčných enzýmov a DNA sekvencie génu sa overili. Kompletná sekvencia DNA (sekvencia id. č. 1) modifikovaného génu interferón-β so značkou his, spolu s kódujúcou sekvenciou proteínu (sekvencia id. č. 2), sú uvedené na obrázku 10.
Kompletný súbor alanínových substitučných mutácií je uvedený v tabuľke 1. Názvy mutantov špecifikujú štrukturálne oblasti (helixy a slučky), do ktorých sa vniesli mutácie. Panel všetkých mutácií alanínových (serínových) substitúcií má za následok mutácie 65 až 165 aminokyselín ľudského IFN-β.
Panel mutantov sa vytvoril z pCMG275.8 nahradením segmentov DNA medzi jedinečnými reštrikčnými miestami syntetickými oligonukleotidovými duplexmi, ktoré niesli genetickú kódujúcu informáciu uvedenú v tabuľke 2. Aby sa vytvorili plazmidy s rôznymi alanínovými substitučnými mutantmi, boli spolu ligované vektor pCMG275.8 purifikovaný cez gél (štiepený príslušným reštrikčným enzýmom, ako je uvedené na zozname ďalej v teste, pre každú štrukturálnu oblasť IFN-β) a oligonukleotidové duplexy (kódujúce sekvencie vláken sú uvedené v tabuľke 2). Ligačné zmesi sa použili na transformáciu JA221 kmeňa E. coli a rekombinantné kolónie sa vyberali podľa rezistencie na ampicilín. Kolónie rezistentné na ampicilín sa testovali na výskyt inzertov s mutáciami prostredníctvom skríningu na príslušné miesta reštrikčných enzýmov. Pre dvoch mutantov (A2 a CD2) stratégia klonovania vyžadovala použitie dvoch duplexov syntetických oligonukleotidov (uvedených v tabuľke 2), ktoré niesli komplementárne presahujúce konce, aby bolo možné ligovať ich k sebe navzájom, a ku kostre vektora IFN-β v trojcestnej ligácii. Nasledujúci zoznam ukazuje miesta, ktoré sa použili na klonovanie mutovaných oligonukleotidov z tabuľky 2. Schéma klonovania (pododdiel B) ukazuje pozície týchto jedinečných miest v géne interferón β.
Tabuľka 1
Pozícia alanínových substitučných mutácií ΗυΙΕΝ-β
10 20 20 «0 SO ' . . ·.....' .J......I ......« . . .
IFN-β MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLMQLNGRLEYCLICDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE
Al -A-AA—A—A-----------------------------------------AB1 ---------------------------AAA-AA-------------------AB2 -----------------------------------AA-A--A----------£33 --------------------------------------------AAAAA-AAA j_helix A_11_AB loop_|
IFN-β
Bl
B2
Cl
C2
CD1
IFN-β
CD2
D
DE1
DE2
E
70 60 SO 100
I . 1 i.....i . .1......
DAALTIYEMLQNIFAJTRQDSSSTGWNETIVENLiLANVYííQINHLKTVLEEKLEKE ----------A—AS---------------------------------------------------------AAA--------------------------------------------------------------AS— AA— S---------------------------------------------------------A---A—AA--------------------------------------------------------AA—AAA j_helix B_| j_j j_CD loop_
110 120 130 140 ISO 160
i.....i i......ς i ... i
DFTRGALMSSLHLKRYYGRIIjHYLKAKEY'SIíCAWTIVRVEIIjRNFYRINRLTGYIjRN
AA-A—A—A----------------------------------------------------------------A-AA—A---------------------------------------------------------AA---------------------------------------------------------AA---------------------------------------------------------------A---A—A—A-------CD loop_| j_.helix D_j j_helix E_j
Riadok označený IFN-β ukazuje divý typ sekvencie ľuského IFN-β. Alanínové alebo serínové substitúcie zvyškov IFN-β sú ukázané pre každý mutant a čiarky, pod relevantnými oblasťami, označujú sekvencie divého typu. Štruktúry helixov a slučiek sú uvedené ako plné čiary pod mutantmi. Slučka DE preklenuje medzeru medzi helixmi D a E. Vytvorili sa dva ďalšie alanínové substitučné mutanty (H93A, H97A a H121A) a analyzovali sa v antivírusových testoch na stanovenie účinku mutácií týchto histidínov, ktoré tvoria cheláty so zinkom v kryštálovej štruktúre diméru. Obidva tieto mutanty si podržali plnú aktivitu divého typu v antiví rusových testoch, čo svedčí o tom, že zinkom sprostredkovaná tvorba diméru nieje dôležitá pre aktivitu IFN -β5 Tabuľka 2
Al sekv. id. č.7
BET-053
A2 sekv. id. č.8
BET-039 sekv. id. č. 9
BET-041
AB1 sekv. id. č. 10 BET-080
AB2 sekv. id. č. 11 BET-082
AB3 sekv. id. č. 12 BET-084 sekv. id. č. 13
BET -086
BI sekv. id. č.14 BET-110
B2 sekv. id. č. 15 BET-112
Cl sekv. id. č.16 BET-114
C2 sekv. id. č. 17 BET-092
CD1 sekv. id. č.18 BET-094
CD2 sekv. id. č.19 BET-096
CCGGAGÄCGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAA
GCTTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC
GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGG
CTTGAATACT
GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTG
CA
AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGAC
ATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCT
ATCCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGAC
A
TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA
CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCA
GACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAA
CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCG
CT
GCAGCTTCATCTAGCACTGGCTGGAA
GGAATGCTT CAATTGTTGCTGCACT CCTGAGCAATGTCTAT CAT CAGATA AA
CCATC TGAAGACAGTTCTAG
GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATA
GC
ACATCTGGCTGCAGTTCTAG
CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT
CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA
GCGCGCTGCACCTGAAAAGA
sekv. id. č.20 BET-106 TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACAC TGT
Dl sekv. id. č.21 BET-108 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATAC CTGGCAGCCAAGGAGTACTCACACTGT
DE1 sekv. id. č.22 BET-116 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTA CCTGAAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGAT
DE2 sekv. id. č.23 BET-118 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTA CCTGAAGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGAT
El sekv. id. CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG č.24 BET-104 B. Konštrukcia expresných plazmidov EBNA 293 Gén divého typu a mutovaný gén IFN-β, fúzované so signálnou sekvenciou VCAM-1, značkou his
štiepnym miestom enterokinázy, sa purifikovali cez gél ako reštrikčné fragmenty Nôti. a BamHi s veľkosťou
761 párov zásad. Purifikované gény sa subklonovali do plazmidového vektora pDSW247 štiepeného Nôti a
BamHi, ako je ukázané v schéme. Plazmid pDSW247 je expresný vektor pre prechodnú expresiu proteínu v bunkách EBNA 293 z ľudských obličiek (Invitrogen, Carlsbad, CA). Obsahuje cytomegalovírusový promótor skorého génu a EBV regulačné prvky, ktoré sú nevyhnutné na vysokú hladinu génovej expresie v tomto systéme, ako aj markery selekcie pre E. coli (rezistencia na ampicilín) a pre bunky EBNA 293 (rezistencia na hygromycín), ako je možné vidieť na schéme stratégie klonovania. Ligované plazmidy sa použili na transformáciu buď JA221, alebo XLl-Blue kmeňov E. coli a kolónie rezistentné na ampicilín sa vyberali a testovali na výskyt inzertov analýzou reštrikčných máp. Izoloval sa DNA pomocou Maxiprepu a sekvencie inzertov sa overili sekvenovaním DNA. Pozitívne klony prejavujúce požadované mutované sekvencie sa použili na transfekciu buniek EBNA 293 ľudských obličiek tak, ako je opísané ďalej.
Súhrn klonovacej stratégie je uvedený v nasledujúcej schéme.
Schematické znázornenie klonovacej stratégie a IFN-expresných plazmidov
izba na Daudi bunky antivírusový test antiproliferačný test väzba na IFNAR2-Fc
C. Expresia a kvantifikácia ΙΕΝ-β-la alanínových substitučných mutantov
Ľudské bunky EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chittenden, T. 1989, J. Virol. 63, 3016-3025) sa udržiavali ako subkonfluentné kultúry v Eagleho médiu modifikovanom podľa Dulbecca doplnenom 10 % fetálnym bovinným sérom, 2 mM glutamínom a 250 g/ml geneticínu (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Expresné plazmidy pDSW247 sa prechodne transfekovali do buniek EBNA 293 s použitím protokolu s lipofektamínom (Gibco/BRL, Life Technologies). Kondicionované médiá sa odobrali 3-4 dni po transfekcii, bunkové zvyšky sa odstránili centrifugáciou a koncentrácia his-IFN-β sa kvantifikovala testom ELISA.
ELISA sa uskutočňovala s použitím polyklonálnych králičích protilátok (metódou proteínu A purifikovanej IgG, protilátky sa pestovali proti purifikovanému ľudskému ΙΕΝ-β-la) na naviazanie na 96-jamkové doštičky pre testy ELISA a biotinylovaná forma toho istého polyklonálneho králičieho IgG sa použila ako sekundárna reagencia na umožnenie detekcie interferónu s použitím chrenovej peroxidázy konjugovanej so streptavidínom (HRP: Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA). Na vytvorenie štandardných kriviek koncentrácie sa použil rad riedení interferónu^-la. Kondicionované média z EBNA transfektantov obsahujúce his-IFN-β sa zriedili tak, aby sa získali vzorky s koncentráciami v rozsahu od 10 ng/ml do 0,3 ng/ml v teste ELISA. Aby boli koncentrácie IFN-β v médiu zistené testom ELISA potvrdené, uskutočnila sa analýza westemovým prenosom. Redukované supematanty z tkanivových kultúr a štandardy ΙΕΝ-β-la sa podrobili SDAPAGE na géloch s gradientom 10-20 % (Novex, San Diego, CA) a preniesli na membrány PDVF. Imunoreaktívne pásy sa detegovali králičím polyklonálnym antisérom anti-IFN^-la (č. 447, Biochem. Inc., druhé antisérum, ktoré sa pestovalo proti ΙΕΝ-β-la), a potom nasledovalo ošetrenie oslím protikráličím IgG konjugovanom s HRP (Jackson ImmunoResearch).
D. Hodnotenie mutantov interferónu-β na väzbu receptora
Vlastnosť viazať receptor mutantov interferónu-β opísaných v časti C sa hodnotila s použitím dvoch odlišných väzbových testov. Jeden test meral väzbu mutantov interferónu-β k fúznemu proteínu, IFNAR2/Ig, zahŕňajúcemu extracelulárnu doménu ľudského receptora IFNAR2 fuzovanú k častí konštantnej oblasti ľudského IgG. IFNAR2-Fc sa exprimoval v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) a purifikoval prostredníctvom afinitnej chromatografie na sepharose s proteínom A podľa inštrukcií výrobcu (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, kat. č. 20334). Väzba mutantov interferónu-β k IFNAR2-Fc sa merala v teste ELISA. Doštičky pre test ELISA sa pripravili cez noc v 4 °C naviazaním 50 μΐ/jamku myší proti-ľudskej IgGl monoklonálnej protilátky (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) v koncentrácii 10 g/ml vo väzbovom pufri 50 mM NaHCO3, 0,2 mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, pH 9,6 na 96-jamkové doštičky s plochým dnom. Doštičky sa dvakrát premyli s PBS obsahujúcim 0,05 % Tween-20, a blokovali s 0,5 % netučným sušeným mliekom v PBS 1 hodinu pri teplote miestnosti. Po dvoch ďalších premytiach sa do každej jamky pridalo 50 μΐ 1 g/ml IFNAR2-Fc v 0,5 % mlieku v PBS obsahujúcom 0,05 % Tween-20 a inkubovalo 1 hodinu pri teplote miestnosti a doštičky sa potom ešte dvakrát premyli. Väzba mutantov interferónu-β k IFNAR2-Fc sa merala pridaním 50 μΐ/jamku mutantu interferónu-β v kondicionovanom médiu, sériovo riedeným Eagleho médiom modifikovaným podľa Dulbecca (DMEM) doplnenom 10 % fetálnym bovinným sérom, a inkubáciou 2 hodiny pri 4 °C. Riedenie mutantu interferónu-β sa typicky pohybovalo od asi 1 M dole k 10 pM. Po premytí sa interferón-β naviazaný na doštičky detegoval pridaním 50 μΐ/jamku koktejlu skladajúceho sa z 1 : 1000 riedenej králičej polyklonálnej antiinterferónovej protilátky (č. 447) plus oslieho protikráličieho IgG značeného chrenovou peroxidázou (HRP) (Jackson ImmunoResearch), a prebiehala inkubácia 15 minút pri 4 °C. Po dvoch premytiach sa pridal HRP substrát a doštička sa inkubovala pri 4 °C pred odčítaním na čítacom zariadení pre doštičky ELISA pri absorbancii 450 nm. Dáta sa vyniesli ako absorbancie proti koncentrácii mutantov interferónu-β a afinita väzby mutantu interferónu-β k IFNAR2-Fc sa určovala vynesením dát do jednoduchej hyperbolickej väzbovej rovnice. Výsledky z týchto analýz sú ukázané na obrázku 1, na ktorom je väzbová afinita každého mutanta, zisťovaná aspoň v troch nezávislých pokusoch, vyjadrená ako percento afinity meranej pre His6-divý typ interferónu-β-la.
Druhý test väzby receptora sa použil na meranie afinity, s ktorou sa mutanty interferónu-β viažu na bunky Daudi exprimujúce obidva receptorové reťazce, IFNAR 1 a IFNAR 2, ktoré spolu obsahujú receptor pre interferón-β. Tento test založený na FACS používal blokujúcu monoklonálnu protilátku namierenú proti extracelulámej doméne 1FNAR1, EA12 (Biogen, Inc.) na odlíšenie neobsadeného (voľného receptora od receptora, na ktorý bol naviazaný interferón-β). Bunky Daudi (20 μΐ pri 2,5 x 107 buniek/ml) sa naniesli na 96-jamkové doštičky pre test ELISA s dnom v tvare V a inkubovali 1 hodinu pri 4 °C s rôznymi koncentráciami mutanta interferónu-β (20 μΐ v pufri FACS, 5 % FBS, 0,1 % NaN3 v PBS). Žiaduce sériové riedenie mutantov interferónu-β sa pohybovalo v rozsahu od 0,5 M do 0,5 pM. Ku každej jamke sa pridalo 100 ng biotinylovanej myšej anti-IFNARl monoklonálnej protilátky EA12 (10 μΐ) a doštičky sa inkubovali ďalšie dve minúty pri teplote miestnosti pred dvojitým premytím pufrom FACS (4°C). Potom sa bunky inkubovali 30 minút v 4 °C s 50 μΐ/jamku 1 : 200 zriedeného streptavidínu konjugovaného s R-fykoerytrinom (Jackson Im18 munoResearch), dvakrát sa premyli pufrom FACS, resuspendovali v 300 μΐ pufra FACS obsahujúcom 0,5 % paraformaldehydu a preniesli do polystyrénových skúmaviek 12x75 (Falcon 2052). Potom sa vzorky analyzovali prietokovou cytometriou na prístroji FACScan (Becton Dickinson). Dáta sa vyniesli do grafu ako priemerná intenzita fluorescencie kanála (MFCI) proti koncentrácii mutanta interferónu-β, väzbové afinity sa definovali ako koncentrácie mutanta interferónu-β poskytujúce 50 % inhibíciu farbenia protilátky. Každý mutant sa testoval niekoľkonásobne. Obrázok 2 ukazuje väzbovú afinitu k receptoru pre každého mutanta interferónu-β, zistenú touto metódou, vyjadrenou ako percento afinity merané pre His6-divý typ interferónu-β-la v každom pokuse.
E. Vyhodnotenie funkcie mutantov interferónu-β
Mutanty interferónu-β sa tiež testovali na funkčnú aktivitu s použitím in vitro testov na antivírusovú aktivitu a na schopnosť interferónu-β inhibovať bunkovú proliferáciu. Pre každého mutanta sa uskutočňovali minimálne tri antivírusové testy, každý v trojitom opakovaní. His6-divý typ interferónu-β-la sa do každého pokusu zahrnul ako referencia. Antivírusové testy sa uskutočňovali ošetrením buniek A549 z ľudského pľúcneho karcinómu (ATCC CCL 185) cez noc dvojkovým sériovým riedením mutantov interferónu-β v koncentráciách, ktoré preklenovali rozsah medzi plnou antivírusovou ochranou a žiadnou ochranou pred usmrtením buniek vírusom. Nasledujúci deň sa bunky stimulovali počas dvoch dní vírusom encefalomyokarditídy (ECMV) v zriedení, ktoré malo za následok úplnú smrť buniek pri chýbaní interferónu. Doštičky sa potom vyvíjali s metabolickým farbivom MTT (2,3-bis[2-metoxy-4-nitro-5-sulfofenyl]-2/í-tetrazólium-5-karboxyanilid) (M-5655, Sigma, St. Louis. MO). Zásobný roztok MTT sa pripravil v koncentrácii 5 mg/ml v PBS a sterilizoval filtráciou a 50 μΐ tohto roztoku sa zriedilo do tkanivových kultúr (100 μΐ na jamku). Po inkubácii pri teplote miestnosti počas 30-60 minút sa roztok MTT/médium odstránil, bunky sa premyli so 100 μΐ PBS a nakoniec sa metabolizovaná farba solubilizovala v 100 μΐ 1,2N kyseliny chlorovodíkovej v 90 % izopropanole. Životaschopné bunky (ako je preukázané prítomnosťou farbiva) sa kvantifikovali pri absorbancii v 450 nm. Dáta sa analyzovali vynesením do grafu absorbancie proti koncentrácii mutanta interferónu-β a aktivita každého mutanta sa definovala ako koncentrácia, v ktorej bolo usmrtených 50 % buniek. Obrázok 3 ukazuje aktivitu každého mutanta vyjadrenú ako percento aktivity merané pre divý typ interferónu-β-la so značkou his v každom pokuse.
Pri mutantoch interferónu-β sa tiež hodnotila funkcia v antiproliferačnom teste. Bunky Daudi ľudského Burkittovho lymfómu (ATCC č. CCL 213) sa vysiali v koncentrácii 2 x 105 buniek/ml v RPMI 1620 doplnenom 10 % definovaným fetálnym teľacím sérom (Hyclone, Logan Utah) a 2 mM L-glutamínom. Každá jamka tiež obsahovala danú koncentráciu mutanta interferónu-β vo výslednom celkovom objeme 100 μΐ média na jamku, použité koncentrácie interferónu-β sa vybrali tak, aby preklenuli rozsah od maximálnej inhibície proliferácie Daudi buniek k žiadnej inhibícii (to znamená plná proliferácia). Každá koncentrácia testovaného mutanta interferónu-β sa použila v duplikátoch a vo všetkých pokusoch sa zaradila séria neošetrených buniek v duplikátoch. Bunky sa inkubovali dva dni pri 37 °C, v inkubátoroch s 5 % CO2, a potom sa do každej jamky pridal 1 Ci tymidínu s tríciom ((metyl-3H)tymidín, Amersham TRK758) v 50 μΐ média a inkuboval ďalšie 4 hodiny. Bunky sa odoberali s použitím prístroja LKB na odoberanie buniek z doštičiek a merala sa inkorporácia tymidínu s tríciom pri použití čítacieho zariadenia pre doštičky LKB β. Duplikáty experimentálnych hodnôt sa spriemerovali a určili štandardné odchýlky. Dáta sa vyniesli do grafu ako priemerné počty za minútu proti koncentrácii mutanta interferónu-β a aktivita každého mutanta sa definovala ako koncentrácia požadovaná poskytnúť 50 % maximálnej pozorovanej inhibície rastu. Pre každý mutant sa uskutočňovali niekoľkonásobné testy. Obrázok 4 ukazuje výsledky vyjadrené ako percento aktivity nájdené pre divý typ interferónu^-la so značkou his v každom pokuse.
F. Vlastnosti mutantov interferónu-β
Zistilo sa, že divý typ interferónu-β-la s histidínovou značkou mal v antivírusových a antiproliferačných testoch aktivitu, ktorá bola asi 3-krát nižšia ako zodpovedajúca aktivita nájdená pri neoznačenom divom type interferónu-β-1 a. Pretože zo všetkých mutantov interferónu-β-la obsahovali Al-E na svojich N-koncoch totožnú sekvenciu značky his, boli účinky mutácií na vlastnosti molekuly určované porovnaním aktivít týchto mutantov v antivírusových, antiproliferačných a väzbových testoch s aktivitou pozorovanou pre divý typ interferónu-β-1 a so značkou his. Pri uskutočňovaní tohto porovnania pôvodcovia predpokladali, že odchýlky aktivít mutantov Al-E, v porovnaní s divým typom interferónu-β-la so značkou his, sú kvalitatívne a kvantitatívne približne rovnaké, ako účinok, ktorý by tie isté mutanty mali v neprítomnosti N-koncovej značky his. Zodpovedajúci predpoklad pre značené alebo fúzne konštrukty iných rozpustných cytokínov je všeobecne považovaný za platný odborníkmi pracujúcimi s technikou alanínovej skenovacej mutagenézy („alanine scanning mutagenesis“), najmä keď in vitro funkčná aktivita značeného alebo fúzneho konštruktu je blízka aktivite divého typu cytokinu, ako je tomu v tomto prípade (pozri napríklad Pearce, K.H. Jr, a kol., J. Biol. Chem., 272, 20595-20602, 1997, a Jones, J.T., a kol., J. Biol. Chem. 273, 11667-11674,1998).
Dáta ukázané na obrázkoch 1-4 naznačujú tri typy účinku, ktorý sa vyvolal cielenou mutagenézou. Tento účinok môže byť výhodný pre vývoj interferónových liečiv za istých okolností. Tieto tri typy účinku sú: a) mutanty s vyššou antivírusovou aktivitou ako je aktivita divého typu interferónu-β-la (napr. mutant Cl), b) mutanty, ktoré prejavujú aktivitu v obidvoch testoch, antivírusovom a antiproliferačnom, ale pri ktorých je antiproliferačná aktivita disproporčne nízka vzhľadom na antivírusovú aktivitu v porovnaní s divým typom interferónu-β-la (napr. nutanty Cl, D a DE1), a c) funkčné antagonisty (napr. Al, B2, CD2 a DE1), ktoré vykazujú antivírusovú a antiproliferačnú aktivitu, ktorá je disproporčne nízka vzhľadom na väzbu receptora v porovnaní s divým typom interferónu-β-la. Je možné pozorovať, že niektoré mutanty spadajú do viac ako jednej skupiny. Tieto skupiny sú uvedené v prehľade ďalej. Aj keď pôvodcovia charakterizovali tieto skupiny mutantov vzhľadom na tieto príklady uvedené v zozname, je potrebné si uvedomiť, že ďalšie mutácie v týchto oblastiach môžu mať za následok podobný alebo dokonca zvýšený vplyv na aktivitu:
a) Mutant Cl má antivírusovú aktivitu, ktorá je asi 6-krát väčšia ako aktivita divého typu interferónu-p-la so značkou his. Predpokladá sa, že tento mutant a ďalšie rovnakého typu sú užitočné na zníženie množstva interferónu-β, ktoré sa musí podávať na dosiahnutie daného stupňa antivírusového účinku. Očakáva sa, že zníženie množstva podávaného proteínu zredukuje imunogenicknosť proteínu a môže tiež znížiť vedľajšie účinky toxicity, ktorá nie je založená na mechanizme účinku. Predpokladá sa, že mutácie v tejto skupine sú výhodné v situáciách, keď terapeutický prospech podávania interferónu-β vyplýva z jeho antivírusových účinkov a keď antiproliferačné účinky prispievajú k toxicite alebo nežiaducim vedľajším účinkom.
b) Relatívne aktivity (% divého typu) alanínových substitučných mutantov v antivírusovom a antiproliferačnom teste sú porovnané na obrázku 5. Pri väčšine mutantov (ktoré sú uvedené na diagonálnej čiare) je možné pozorovať koordinovane zmenené aktivity (to znamená antivírusové a antiproliferačné aktivity, ktoré sa líšia o rovnaký faktor od aktivít divého typu interferónu-β-la so značkou his). Ale niekoľko mutantov má väčšie odchýlky v aktivite v jednom teste relatívne k druhému, v porovnaní s divým typom interferónu-β-la so značkou his, ako je dokázané posunom od diagonálnej línie. Tieto tri mutanty sú uvedené v tabuľke 3. Mutant Cl má antivírusovú aktivitu, ktorá je ~6-krát väčšia, ako je aktivita divého typu interferónu-β-la so značkou his, ale jeho aktivita v antiproliferačnom teste je podobná aktivite divého typu. Mutant Cl má teda antivírusovú aktivitu, ktorá je zvýšená faktorom 5,2 oproti jeho antiproliferačnej aktivite, relatívne k divému typu interferónu-β-la so značkou his. Podobne mutant D prejavuje 65 % aktivity divého typu v antivírusovom teste, ale len 20 % aktivity divého typu v antiproliferačnom teste, a teda má antivírusovú aktivitu, ktorá je zvýšená 3,4-krát oproti jeho antiproliferačnej aktivite v porovnaní s divým typom. Mutant DE1 prejavuje 26 % aktivity divého typu v antivírusovom teste, ale len 8,5 % v antiproliferačnom teste, a má teda antivírusovú aktivitu, ktorá je zvýšená 3,0-krát oproti jeho antiproliferačnej aktivite v porovnaní s divým typom interferónu-β-1 a so značkou hid. Keď sú podávané v koncentrácii postačujúcej na dosiahnutie požadovaného stupňa antivírusovej aktivity, ukazujú tieto mutanty proteínov podstatne nižšiu úroveň antiproliferačnej aktivity ako proteín divého typu. Predpokladá sa, že mutácia v tejto skupine, ako tie v skupine a), sú výhodné v situáciách, keď terapeutický prospech podávania interferónu-β vyplýva z jeho antivírusových účinkov, a keď antiproliferačné účinky prispievajú k toxicite alebo nežiaducim vedľajším účinkom.
Tabuľka 3
Mutant Antivírusová (AV) aktivita (% divého typu) Antiproliferačná (AP) aktivita (% divého typu) AV/AP
Cl 571 109 5,2
D 65 19 3,4
DE1 26 8,5 3,0
c) Mutanty s antivírusovou a antiproliferačnou aktivitou, ktorá je nízka vzhľadom na väzbu receptora, v porovnaní s divým typom interferónu-β-1 a so značkou his (pozri tabuľka 4). Mutant Al prejavuje antivírusovú a antiproliferačnú aktivitu, ktoré sú 2,0-krát a 0,8-krát väčšie ako aktivity pozorované pri divom type interferónu-β-la so značkou his, ale viaže sa na analogický receptor na bunkách Daudi s afinitou, ktorá je 29-krát väčšia ako pri divom type. Väzba tohto mutanta na receptor IFN-β je teda zvýšená asi 15-krát v porovnaní s antivírusovou a antiproliferačnou aktivitou proteínu. Podobne mutanty B2, CD2 a DE1 vykazujú zvýšenie väzby oproti antiproliferačnej aktivite 3,5-krát, 15-krát a 54-krát. Predpokladá sa, že tieto proteíny sú užitočné ako funkčné antagonisty aktivity endogénneho IFN-β, a možno ďalších endogénnych interferónov typu I, pretože majú schopnosť viazať a obsadiť receptor a navyše vyvolať len malú časť funkčnej odpovede v cieľových bunkách, aká by sa pozorovala pri divom type IFN-β.
Tabuľka 4
Mutant Antivírusová aktivita (AV) (% wt) Antiproli-feračná aktivita (AP)(% wt) Väzbová aktivita k bunkám (% hmotn.) Väzba/AV Väzba/AP
Al 200 180 2900 15 16
B2 7,1 9,2 33 4,6 3,5
cD2 150 46 690 4,6 15
DE1 26 8,5 460 18 54
G. Vzťah muteínu k trojrozmernej štruktúre interferónu
Zatiaľ čo publikované kryštálové štruktúry neglykozylovanej formy myšieho interferónu-β (T. Senda, S. Saitoh a Y. Mitsui, Refind Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon- at 2.15 Resolution, J. Mol. Biol., 253, 187-207, 1995) a ľudského interferónu-a-2b (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hrúza, P. Reichert, P.P. Trotta, T.L. Nagabhushan a M.R. Walter, Zinc Mediated Dimer of Human Interferon- 2b Revealed by X-ray Crystallography, Structure, 4, 1453-1463) poskytli modely pre polypeptidovú kostru ľudského interferónu-β, pôvodcovia nedávno doriešili štruktúru interferónu-β-la v jeho glykozylovanom stave (M. Karpusas, M. Nolte, C.B. Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb a S.E. Goelz, The Crystal Structure of Human Interferon- at 2,2 Resolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 11813-11818, 1997).
Výsledky mutačných analýz pôvodcov je možné zhrnúť vzhľadom na trojrozmernú štruktúru interferónu-β-la (tu neuvedené). Niektoré mutácie vyvolali zníženie aktivity (2 až 5 krát zníženie). Mutované oblasti zodpovedali substitúciám uvedeným v tabuľkách 1 a 2. Zvyšky dôležité pre antivírusovú a antiproliferačnú aktivitu sú lokalizované v nižšej polovici molekuly ΙΕΝ-β-la (panel a a b). Mutácie v hornej polovici molekuly, kde sú umiestnené amino- a karboxy-konce, nemali žiadny vplyv na biologické aktivity alebo väzbu receptora.
Mutácie v A2 helixe, AB, AB2 slučkách a E helixe sú najvýznamnejšie, čo sa týka ich účinku na funkciu a mali za následok dramatické zníženie tak aktivity, ako väzby bunkového povrchového receptora. Táto oblasť (A2 helix, AB a AB2 slučky a E hetix) zodpovedá väzbovému miestu IFNAR2, pretože žiadny z týchto mutantov neviazal v testoch pôvodcov IFNAR/Fc.
Aj keď tieto mutácie, ktoré boli dôležité pre väzbu IFNAR2, tiež ovplyvnili bunkovú väzbu, väzbové vlastnosti bunkového povrchu sú tiež ovplyvnené zvyškami v ďalších oblastiach molekuly (B 1 helix, C2 helix). Na trojrozmerných modeloch (tu neuvedených), ktoré zobrazujú pôsobenie alanínových substitučných mutantov, je možné pozorovať, že N-koncová oblasť, C-koncová oblasť a glykozylovaná oblasť C helixu molekuly ΙΕΝ-β-la neleží vo väzbovom mieste receptora. Mutácie v týchto oblastiach neznížili biologickú aktivitu alebo väzbu bunkového povrchového receptora.
Príklad 2
Príprava a charakterizácia konjugovaného interferónu-β-la
A. Príprava PEGylovaného interferónu
Neformulovaný voľný medziprodukt interferónu-β-la (predávaný ako AVONEX®) v koncentrácii 250 g/ml v 100 mM fosfátu sodnom, pH 7,2, 200 mM NaCl, sa zriedil rovnakým objemom 100 mM MES, pH 5,0 a pH sa upravilo na 5,0 s HCI. Vzorka sa naniesla na kolónu SP-Sepharose® FF (Pharmacia, Piscataway, NJ) v množstve 6 mg interferónu-β-1 a/ml živice. Kolóna sa premyla 5 mM fosfátom sodným, pH 5,5, 75 mM NaCl, a produkt sa eluoval 30 mM fosfátom sodným, pH 6,0, 600 mM NaCl. Elučné frakcie sa analyzovali pomocou absorbancie v 280 nm a koncentrácia interferónu vo vzorkách sa určila z absorbancie s použitím extinkčného koeficienta 1,51 na 1 mg/ml roztoku.
K roztoku 1 mg/ml interferónu-β-la zo SP eluátu sa pridal 0,5 M fosfát sodný, pH 6,0, do koncentrácie 50 mM, sa pridal kyanoborohydrid sodný (Aldrich, Milwaukee, WI) do koncentrácie 5 mM, a 20 K PEGaldehyd (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) sa pridal do koncentrácie 5 mg/ml. Vzorka sa inkubovala pri teplote miestnosti 20 hodín. PEGylovaný interferon sa purifikoval z reakčných produktov postupne uskutočňovanou chromatografiou na vylučovacej kolóne Superose® 6 FPLC (Pharmacia) s 5 mM fosfátom sodným, pH 5,5, 150 mM NaCl ako mobilnej fázy a SP-Sepharose® FF. Výsledkom použitia vylučovacej kolóny bola východisková separácia modifikovaného a nemodifíkovaného interferónu-β (chromatogram tu neuvedený). Elučný pól z gélovej filtrácie obsahujúci PEG-interferón-β sa zriedil 1 : 1 vodou a naniesol v množstve 2 mg interferónu-p/ml živice na kolónu SP Sepharose®. Kolóna sa premyla 5 mM fosfátom sodným, pH 5,5, 75 mM NaCl, a potom sa PEGylovaný interferón-β eluoval z kolóny 5 mM fosfátom sodným, pH 5,5, 800 mM NaCl. Elučné frakcie sa analyzovali na obsah proteínu pomocou absorbancie v 280 nm. Koncentrácia PEGylovaného interferónu je udávaná v ekvivalentoch interferónu, pretože skupina PEG neprispievala k absorbancii v 280 nm.
B. Biochemická charakterizácia PEGylovaného interferónu
Rozsah modifikácie vzoriek sa analyzoval pomocou SDS-PAGE (gél tu neuvedený). Pridanie samotného PEG malo za následok posun zjavnej hmotnosti interferónu z 20 kDa na 55 kDa, čo bolo pri analýze zrejmé ihneď. V PEGylovanej vzorke nebol žiadny dôkaz nemodifikovaného interferónu-β-la ani foriem s vyššou hmotnosťou plynúcich z prítomnosti ďalších skupín PEG. Výskyt samostatného PEG sa overil hmotnostnou spektrometriou MALDI. Špecifita PEGylačnej reakcie sa hodnotila peptidovým mapovaním. Alikvóty 20 pg PEGylovaného a nemodifikovaného interferónu^-la ako kontroly, v 240 μΐ 200 mM Tris HCI, pH 9,0, 1 mM EDTA, sá štiepili 1,5 g lyzylendoproteinázy od firmy Achromobacter (Wako Bioproducts, Richmond, V A) počas 3 až 4 hodín pri 27 °C. Ku každej vzorke sa pridalo 200 mg guanidínu HCI a štiepne produkty sa rozdelili do frakcií na kolóne Vydac C4 (0,64x25 cm) s použitím 30 minútového gradientu od 0 do 70 % acetonitrilu, v 0,1 % TFA pri rýchlosti prietoku 1,4 ml/minúta. Pri výtoku z kolóny sa monitorovala absorbancia v 214 nm.
Výsledky z analýzy sú uvedené na obrázku 6. Všetky z predikovaných peptidov zo štiepenia endoproteinázou Lys-C interferónu-β-la sa identifikovali N-koncovým sekvenovaním a hmotnostnou spektrometriou a z nich sa len peptid, ktorý obsahoval N-koniec interferónu (AP8) zmenil modifikáciou, ako je zjavné vďaka tomu, že zmizol z mapy. Dáta z mapovania teda ukazujú, že skupina PEG je špecificky pripojená k tomuto peptidu. Dáta ďalej ukazujú, že PEG modifikácia je cielená na N-koniec proteínu, pretože len N-koncová modifikácia mala za následok špecifickú stratu tohto peptidu.
Ďalší dôkaz pre tento záver sa získal izoláciou PEGylovaného N-koncového peptidu zo štiepenia endoproteinázou Lys-C tak, že sa peptid ďalej štiepil s kyanobromidom (CNBr) a potom bola táto vzorka postúpená sekvenčnej analýze MALDI-PSD („matrix-assisted laser desorption ionization post source decay“). Štiepenie CNBr N-koncového peptidu naštiepilo tento peptid na dva fragmenty, terminálny metionín (Ml) obsahujúci skupinu PEG a SYNLLGFLQR (zvyšky 2-11 v sekvencií zrelého interferónu-β). Sekvenčná analýza identifikovala nemodifíkovaný peptid SYNLLGFLQR, ktorý bol predpokladaný výsledok tohto štiepenia.
Anti vírusová aktivita vzoriek interferón-β-la sa testovala na bunkách ľudského pľúcneho karcinómu (bunky A549), ktoré sa vystavili vírusu encefalomyokarditídy (EMC) s použitím postupov vyžadujúcich MTT farbenie, naznačené skôr. Krátko, bunky A549 sa ošetrili dopredu počas 24 hodín interferónom-β-la alebo interferónom^-la modifikovaným PEG (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14,8, 9,9, 6,6, 4,39 pg/ml) pred stimuláciou vírusom. Test sa uskutočňoval s použitím dát v duplikátoch pre každú koncentráciu interferónu-β-la. Štandardné odchýlky sú ukázané ako zvislé úsečky na obrázku 7. Koncentrácia interferónu-β-la (formulovaného alebo voľného neformulovaného), ktorá zabezpečila 50 % usmrtenie vírusu (50 % cytopatický účinok) (50 % maximum OD450), bola asi 11 pg/ml a 50 % cytopatický účinok pre interferón-β-la modifikovaný PEG bol asi 11 pg/ml. Konjugácia s PEG teda nezmenila antivírusovú aktivitu interferónu^-la. V tomto teste pôvodcovia rutinne nachádzali, že špecifická aktivita interferóηιι-β-la je asi 10-krát väčšia ako špecifická aktivita interferónu-β-1 b, a preto PEGylovaný interferón-β-la je významne aktívnejší ako akýkoľvek produkt interferónu-β-1 b.
Interferón-β-la sa tiež PEGyloval s 5K PEG-aldehydovou skupinou, ktorá je zakúpená od firmy Fluka, Inc. (kat. č. 75936, Ronkonkoma, NY) pri sledovaní rovnakého protokolu opísaného pre modifikáciu s 20K PEG aldehydom s výnimkou, že reakcia obsahovala 2 mg/ml 5K PEG. Modifikácia s 5K PEG je tiež vysoko špecifická pre N-koniec a nezmenila antivírusovú aktivitu interferónu-β-la. Ako adičná zlúčenina 20K bol 5K PEG interferón-β-1 a nerozoznateľný od nemodifikovaného interferónu-β-la v antivírusovom teste.
Príklad 3
PEGylácia chráni interferón-β-la od agregácie vyvolanej stresom
Agregácia interferónu-β má škodlivý vplyv na aktivitu. Pôvodcovia už skôr ukázali, že glykozylácia má dramatický účinok na stabilitu interferónu-β-la oproti neglykozylovaným formám interferónu-β (Runkel L., a kol., Pharm. Res., 15, 641-649). Aby skúmali, či konjugácia s polymérom polyalkylénglykolu môže ďalej stabilizovať interferón-β, podrobili pôvodcovia PEGylovaný interferón-β-la tepelnému stresu podľa nasledujúceho protokolu:
Tepelná denaturácia sa uskutočňovala s použitím spektrofotometra ČARY 3 pre UV-viditeľné svetlo, vybaveného termoelektricky zahrievaným držiakom kyviet, ktorý sa riadil počítačom. Roztoky interferónu-b-la v 20 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM NaCl sa ekvilibrovali v 25 °C v 1 ml kyvete. Teplota držiaka kyviet sa potom zvyšovala z 25 °C na 80 °C rýchlosťou 2 °C/minútu a denaturácia proteínu sa sledovala kontinuálnym monitorovaním absorbancie v 280 nm. Teplota „topenia“, resp. rozpadu polovice molekúl, Tm, sa získala z kriviek topenia určením teploty, v ktorej meraná absorbancia bola uprostred medzi hodnotami definovanými líniami extrapólovanými z lineárnych oblastí na každej strane závislosti zmeny stavu od teploty.
Výsledky z tejto analýzy sú ukázané na obrázku 8. Zatiaľ čo nePEGylovaný interferón-β-la denaturoval a agregoval s 50 % bodom prechodného štádia v 60 °C, nebol žiadny dôkaz agregácie PEGylovaného interfe22 rónu dokonca pri 80 °C. V nezávislej analýze zväčšili pôvodcovia ošetrenie tepelným stresom na 95 °C a dokonca pri tejto zvýšenej teplote nevideli žiadny dôkaz agregácie. Takže konjugácia s týmto polymérom polyetylénglykolu mala dôkladný a prospešný vplyv na stabilitu proteínu. Podobná stabilizácia sa pozorovala s modifikovaným interferónom-p-la obsahujúcim 20K a 5K PEG.
Príklad 4
Meranie anti vírusovej aktivity interferónu-P-la v plazme myší ošetrených interferónom-β-la a PEGylovaným interferónom-β-la
Myšiam (C57B1/6) sa podala i.v. chvostovou žilou injekcia buď 50 000 jednotiek interferónu-p-la, alebo 50 000 jednotiek PEGylovaného interferónu-P-la obsahujúceho 20K PEG, alebo rovnaký objem fosfátového pufra ako kontrola. Myšiam sa odoberala krv retroorbitálnymi krvnými odbermi v rôznych časových bodoch po injekcii (ihneď, 0,25, 1, 4, 24 a 48 hodín). V každom časovom bode sa odobrala krv aspoň trom myšiam. Plná krv sa odoberala do skúmaviek obsahujúcich antikoagulans, bunky sa odstránili a zvyšná plazma sa zmrazila až do času testovania. Tieto vzorky plazmy sa potom testovali v antivírusových testoch.
Vzorky plazmy sa zriedili 1:10 médiom bez séra a nechali sa pretiecť cez 0,2 m filter v striekačke. Zriedené vzorky sa testovali v antivírusových testoch. Vzorky sa titrovali do určených jamiek na 96-jamkovej doštičke pre tkanivové kultúry obsahujúce bunky A549. Na každej doštičke sa testovalo riedenie štandardov interferónu-P-la (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 a 0,6 U/l) a štyri vzorky plazmy. Bunky A549 sa dopredu ošetrili zriedenými vzorkami plazmy počas 24 hodín pred stimuláciou vírusom EMC. Po dvojdennej inkubácii s vírusom sa životaschopné bunky farbili roztokom MTT (5 mg/ml vo fosfátovom pufri) počas 1 hodiny, premyli sa fosfátovým pufrom a solubilizovali s 1,2N HCI v izopropanole. Jamky sa potom odpočítali v 450 nm. Pre každú doštičku sa vytvorili štandardné krivky a použili sa na určenie množstva aktivity interferónu-P-la v každej testovanej vzorke. Aktivita vo vzorkách od rôznych myší sa vyniesla do grafu proti časovým bodom na obrázku 9.
Pomalšia strata PEGylovaného interferónu-P-la z krvného obehu ako funkcia času ukazuje, že biologický polčas PEGylovanej vzorky je oveľa dlhší ako polčas neošetrenej kontroly interferónu-P-la. Zatiaľ čo kontrola sa z veľkej časti odstránila po 4 hodinách, významná frakcia PEGylovaného produktu sa detegovala po 48 hodinách. Na základe východiskovej hladiny aktivity v sére a aktivity, ktorá ostala po 48 hodinách, pôvodcovia usudzujú, že polčas PEGylovaného interferónu je predĺžený v porovnaní s polčasom nemodifikovaného interferónu-P-la. Druhé veľmi významné zistenie z tejto štúdie bolo to, že veľmi málo PEGylovanej formy sa stratilo v priebehu distribučnej fázy, ako je preukázané podobnými vysokými hladinami aktivity v čase 0 a po 60 minútach. Dáta ukazujú, že na rozdiel od kontrol interferónu-P-la je distribúcia PEGyiovaného produktu prevažne obmedzená na cievne zásobenie.
Príklad 5
Porovnávacie farmakokinetické a farmakodynamické štúdie na primátoch (všeobecný protokol)
Komparatívne štúdie sa uskutočňovali s konjugátmi polymér-interferón-P-la a natívnym interferónom-β-la (ako neformulovaný voľný medziprodukt interferónu-P-la vo fosfáte sodnom a NaCl, pH 7,2) na zistenie ich relatívnej stability a aktivity na primátoch. V týchto štúdiách sa porovnávala farmakokinetika a farmakodynamika konjugátu polymér-interferón-P-la u primátov s natívnym interferónom-P-la a racionálne závery sa môžu rozšíriť na človeka.
Zvieratá a metódy
Návrh štúdie
Toto bola štúdia s paralelnými skupinami a opakovanými dávkami na vyhodnotenie komparatívnej farmakokinetiky a farmakodynamiky konjugovaného a nekonjugovaného interferónu-P-la.
Na túto štúdiu sa použili zdravé primáty (výhodne makak „rhesus“ , Macaca mullatá). Pred podávaním dávok sa u všetkých zvierat vyšetrili príznaky ochorení veterinárom pri dvoch príležitostiach v priebehu 14 dní pred prvým podaním testovanej zlúčeniny. Len zdravé zvieratá dostali testovanú zlúčeninu. Vyhodnotenie zahŕňalo všeobecné fyzikálne vyšetrenia a krvné odbery pred podaním dávky na vyšetrenie základných klinických patologických ukazovateľov a východiskovej hladiny protilátok proti interferónu-P-la. Všetky zvieratá sa odvážili a v priebehu 24 hodín pred podaním testovanej zlúčeniny sa zaznamenávala telesná teplota.
Zaregistrovalo sa dvanásť zvierat a rozdelilo sa do skupín, ktoré dostávali 1 MU/kg interferónu-p-la buď ako konjugát PEG-interferón-P-la, alebo nekonjugo vaný, ale inak identický interferón-P-la. Podávanie sa ukustočňovalo buď subkutánne (SC), alebo intravenózne (IV). Všetky zvieratá museli byť nedotknuté ošetrením interferónom-β, čiže tzv. naivné. Každému zvieraťu sa podávali dávky v dvoch časoch, dávky boli oddelené štyrmi týždňami. Objem dávky bol 1,0 ml/kg.
Na farmakokinetické testovanie sa odoberala krv v rôznych časových intervaloch po každej injekcii. Po podávaní študovaného liečiva sa tiež odoberali vzorky krvi na meranie markera biologickej reakcie indukovanej interferónom, sérového neopterínu.
Hodnotenia v priebehu štúdie zahŕňajú klinické vyšetrovanie známok toxicity uskutočňované 30 minút a 1 hodinu po podaní dávky. Uskutočňovalo sa denné pozorovanie cez klietku a zaznamenával sa celkový vzhľad, príznaky toxicity, nepokoj a zmeny chovania. V priebehu 21 dní po podaní dávky sa zaznamenávala telesná hmotnosť a telesná teplota.
Testovacie metódy
Hladiny interferónu-β v sére sa kvantifikovali s použitím testu na hodnotenie cytopatického účinku (CPE). Test CPE meral stupeň antivírusovej aktivity sprostredkovanej interferónom. Stupeň antivírusovej aktivity vo vzorke odráža počet molekúl aktívneho interferónu obsiahnutých vo vzorke v okamihu, keď je odoberaná krv. Tento prístup bol štandardnou metódou na stanovenie farmakokinetiky interferónu-β. Test CPE použitý v predloženej štúdii deteguje schopnosť interferónu-β chrániť bunky ľudského pľúcneho karcinómu (A549, č. CCL-185, ATCC, Rockville, MD) pred cytotoxicitou spôsobenou vírusom encefalomyokarditídy (EMC). Bunky sa dopredu inkubovali 15 až 20 hodín zo vzorky séra, aby sa umožnila indukcia a syntéza proteínov, ktoré je možné indukovať interferónom, a ktoré potom zvyšujú antivírusovú reakciu. Potom sa pridal vírus EMC a inkuboval sa ďalších 30 hodín pred tým, ako sa vyhodnotila cytotoxicita s použitím farbenia kryštálovou fialovou. Na každej testovanej doštičke sa súčasne so vzorkami testoval vnútorný štandard interferónu-β, ako aj vnútorný štandard PEG konjugátu. Tento štandard sa kalibroval proti referenčnému štandardu prirodzeného interferónu ľudských fibroblastov (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). Každá testovaná doštička zahŕňala tiež jamky s kontrolou bunkového rastu, ktoré neobsahovali ani interferón-β akéhokoľvek druhu, ani EMC, a jamky s vírusovou kontrolou, ktoré obsahovali bunky a EMC, ale neobsahovali interferón-β. Na zisťovanie účinku, keď nejaký bol, vzoriek na bunkový rast sa tiež pripravili kontrolné doštičky obsahujúce štandardy a vzorky. Tieto doštičky sa zafarbili bez pridania vírusu.
Vzorky a štandardy sa testovali v duplikátoch na každej z dvoch opakujúcich sa testovacích doštičkách, poskytujúcich štyri údaje o vzorke. Uvádzal sa geometrický priemer hodnôt koncentrácie zo štyroch opakovaní. Limit detekcie v tomto teste je 10 jednotiek (U)/ml.
Sérové koncentrácie neopterínu sa určovali na oddelení klinickej farmakológie s použitím komerčne dostupných testov.
Farmakokinetické a štatistické metódy
Software RstripTM (MicroMath, Inc., Sált Lake City, UT) sa použil na prekladanie (fitovanie) dát pomocou farmakokinetických modelov. Geometrické priemery hodnôt koncentrácie sa vyniesli do grafu oproti času pre každú skupinu. Pretože výsledky testov sú vyjadrené ako riedenie, sú geometrické priemery považované za vhodnejšie ako aritmetické priemery. Hladiny sérového interferónu sa porovnali podľa východiskových hodnôt a nedetegovateľné koncentrácie v sére sa stanovili na 5 U/ml, čo predstavovalo jednu polovicu spodného limitu detekcie.
Pre dáta z IV infúzie sa fitoval IV infúzny model s dvoma kompartmentmi pre detegovateľné koncentrácie v sére pre každý subjekt a SC dáta sa fítovali podľa injekčného modelu s dvoma kompartmentmi.
Vypočítali sa nasledujúce farmakokinetické parametre:
i) pozorovaná vrcholová koncentrácia, Cmax (U/ml), ii) oblasť pod krivkou od 0 do 48 hodín, AUC sa vypočítala pomocou lichobežníkového pravidla, iii) polčas eliminácie, a, z dát získaných pri IV infúzii (keď sa použil IV spôsob podávania):
iv) polčas distribúcie (hodiny, h),
v) clearencia (ml/h), vi) zjavný distribučný objem, Vd (1).
Na výpočet polčasu eliminácie po SC a IM injekcii sa použil softvér WinNonlin (Scientific Consulting Inc., Apex, NC). Pre neopterín sú uvedené hodnoty aritmetického priemeru v každej skupine. Emax, maximálna hodnota zmeny oproti základnej hodnote, sa tiež vypočítala. Cmax, AUC a Emax sa potom analyzovali jednosmernou analýzou rozptylu na porovnanie skupín líšiacich sa dávkami. Hodnoty Cmax a AUC sa logaritmický transformovali, na analýzu sú uvádzané geometrické priemery.
Príklad 6
Porovnanie farmakokinetiky PEG-interferónu-fi-la a interferónu-fi-la pri makakoch
Interferón-β-la alebo jeho PEGylovaná forma PEG-interferón-fi-la sa podali makakom „rhesus“ 1. a 29.
deň štúdie buď intravenózne (IV), alebo subkutánne (SC), ako je opísané vo všeobecnom protokole v príklade 5. 1. deň dostalo 6 opíc interferón-β-1 a (vždy 3 pre každý spôsob podania) a ďalších 6 opíc PEGylovaný interferón-β-la. 29. deň štúdie sa dávky opakovali. IV dávky sa podali ako pomalá bolusová injekcia do mozgovej artérie alebo do skrytej žily.
SC dávky sa podali pod kožu na chrbte po predchádzajúcom vyholení miesta pre injekciu. Krv sa odoberala z femorálnej cievy v určených intervaloch a nechala skoagulovať, aby sa získalo sérum. Sérum sa analyzovalo na prítomnosť funkčných látok liečiva použitím overeného antivírusového testu CPE, a ďalej sa stanovila hladina neopterínu a β-2-mikroglobulínu v sére ako farmakodynamické meradlá aktivity. Farmakologické parametre sa vypočítali použitím programu WinNonlin verzia 2.0 (Scientific Consulting Inc., Apex, NC).
Hodnoty koncentrácií sa analyzovali štandardnými metódami nezávisle od modelu (nekompartmentová analýza) na získanie farmakokinetických parametrov. Plocha pod krivkou (AUC) závislosti sa vypočítala pomocou lichobežníkového pravidla. Štatistické analýzy vrátane výpočtu aritmetického priemeru a smerodajnej odchýlky sa uskutočnili pomocou Microsoft Excel verzia 5 (Microsoft Corp., Redmond WA). Hodnoty koncentrácie uvádzané ďalej ako hodnoty pod limitom kvantifikácie (BLQ) neboli ďalej použité vo farmakokinetickej analýze. Vzhľadom na to, že na výpočty sa použili rôzne programy, ktoré rôznym spôsobom čísla zaokrúhľujú alebo skracujú, hodnoty (to znamená priemery, smerodajné odchýlky alebo aj jednotlivé hodnoty) v niektorých tabuľkách sa môžu líšiť od iných tabuliek, od individuálne vypočítaných hodnôt alebo od dát po štatistickej analýze. Ani integrita, ani interpretácia týchto dát však uvedenými rozdielmi neboli ovplyvnené.
Výsledky a diskusia
Pri obidvoch spôsoboch podávania PEGylovaný interferón-β-la mal vyššiu biologickú dostupnosť (meranú ako plocha pod krivkou závislosti koncentrácie v sére od času). Okrem toho PEGylovaný interferón-β-la mal vyššiu absolútnu biologickú dostupnosť ako interferón^-la pri SC podávaní. Farmakokinetické parametre sú zhrnuté v príklade 5. Podávanie PEGylovaného interferónu-β-la tak IV ako SC spôsobom viedlo k zvýšeniu biologického polčasu aj AUC interferónu^-la.
Po IV podaní prvej dávky, priemerná hodnota (± smerodajná odchýlka) vrcholovej koncentrácie v sére (Cmax) interferónu-β-la a PEG-interferónu^-la bola 6400 (±0) a 1080 (±3,5) U/ml, v uvedenom poradí. Priemerné hodnoty (± smerodajná odchýlka) AUC boli 4453 (±799) a 34373 (±3601) U*hod/ml. Po prvom SC podaní priemerné hodnoty (± smerodajná odchýlka) Cmax interťerónu^-la a PEG-interferónu-p-la boli 277 (±75) a 1080 (±381). Priemerné hodnoty (± smerodajná odchýlka) AUC boli 4753 (±3170) a 44952 (±1443) U*hod/ml.
Tabuľka 5
BG9418 priemerné hodnoty (priemer ± smerodajná odchýlka) farmakokinetických parametrov po SC (dávka 1) alebo IV podaní 1 MU/kg interferón^-la alebo PEG-interferón^-la makakom „rhesus“ (n=3)
Prípravok (podanie) r '-'max Tmax AUC (U*hod/ml) CL (ml/kg) vss (ml/kg) Ti/2
IFN^-la 6400 0,083 4453 229 543 3,2
(IV) (±0) (±0) (±799) (±38) (±147) (±1,4)
PEG-IFN-β—la 1080 0,083 34373 29 250 9,5
(IV) (±3,5) (±0) (±3601) (±3) (±30) (±2,1)
IFN^-la (SC) 277 (±75) 5,3 (±1,2) 4753 (±3170) nemer. nemer. 10,0 (±2,9)
PEG-IFN^-la (SC) 1080 (±381) 3,3 (±1,2) 42283 (±5934) nemer. nemer. 22,0 (±3,4)
Tak hladina neopterínu ako aj β-2-mikroglobínu v sére sa zvýšili po liečení interferónom-β a PEGylovaným interferónom-β, čo dokazuje farmakologickú aktivitu produktov. Pri vysokých dávkach testovaných zlúčenín neboli rozdiely vo farmakologickej aktivite interferónu-β-la a PEGylovaného interferónu-β-la pri obidvoch spôsoboch podávania (dáta nie sú uvedené).
Príklad 7
Porovnanie farmakokinetiky PEG-interferónu^-la a interferónu^-la pri potkanoch po rôznych spôsoboch podania liečiva
Cieľom tejto štúdie je stanoviť komparatívnu biologickú dostupnosť interferónu-β-la a PEGylovaného interferónu-β-la pri rôznych spôsoboch podávania.
Materiál a metódy
V pokuse sa použili samice laboratórneho potkana kmeňa Lewis (s hmotnosťou 190 g) na stanovenie farmakokinetických parametrov, vždy 2 zvieratá pre jeden spôsob podávania. Potkanom sa do jugulámej cievy vložila kanyla a potom intravenózne podal ľudský interferón-p-la alebo 5K PEG interferón-β-la, a/alebo
20K PEG interferón-β-la (vo vehikule obsahujúcom 14 mg/ml HSA v 50 mM fosforečnanu sodnom, 100 mM NaCl, pH 7,2), a síce intravenózne, intraperitoneálne, perorálne, subkutánne alebo intratracheálne. Krv sa odoberala niekoľkokrát v priebehu 72 hodín, a síce v čase 0, 5 minút, 13, 30 a 75 minút, 3 hodiny, 24, 48 a 72 hodín. Protokol je uvedený v tabuľke 6. Test cytopatického účinku (CPE) sa uskutočnil so vzorkami séra pre detekciu interferónu-β v sére. Výsledky, ku ktorým viedlo podanie nemodifikovaného interferónu-β-la a interferónu-β-la modifikovaného 20K PEG, sú uvedené v tabuľke 7. Vo všetkých prípadoch PEGylácia viedla k významnému zvýšeniu t|/2 a AUC.
Tabuľka 6
Tabuľka 7
Farmakokinetické parametre po IV, SC, IP a IT podaní interferónu-β-la (IFN) a PEGylovaného interferónu-β-la (IFN-PEG) pri laboratórnych potkanoch
Prípravok (podanie) c '-max (U/ml) T A max (hodiny) AUC ((U*hod/*pg)) T,/2 (hodiny)
IFN (IV dávka 20 pg) 64000 0,25 3035 1,25
IFN-PEG (IV dávka 3 pg) 23970 0,08 47728 8,44
IFN (SC dávka 20 pg) 2400 1,00 464,4 0,96
IFN-PEG (SC dávka 3 pg) 2400 7,00 14688 11,9
IFN (IP dávka 20 pg) 26000 1,25 4159 1,53
IFN-PEG (IP dávka 3 pg) 9700 1,25 52148 16,2
IFN (IT dávka 15 pg) 240 1,5 70,7 1,29
IFN-PEG (IT dávka 15 pg) 270 7,0 233,5 6,21
SK 287918 Β6
Príklad 8
Antiangiogénne účinky konjugátov interferónu-β-la s polymérom: Hodnotenie schopnosti PEGylovaného interferónu-β-la inhibovať proliferáciu endotelových buniek in vitro
Bunky z ľudského cievneho endotelu (Celí Systems, katalóg, č. 2VO-P75) a bunky endotelu kožných kapilár (Celí Systems, katalóg, č. 2M1-C25) sa udržiavali v kultúre s médiom zo súpravy CS-C Médium Kit (Celí Systems, katalóg, č. 4Z0-500). Dvadsaťštyri hodín pred pokusom sa bunky ošetrili trypsínom, resuspendovali v testovacom médiu, 90 % M199 a 10 % fetálne hovädzie sérum (FBS), a upravili na požadovanú hustotu. Potom sa bunky vysiali na 24 alebo 96 jamkové doštičky potiahnuté želatínou, s hustotou 12500 buniek/jamka alebo 2000 buniek/jamka.
Po inkubácii cez noc sa testovacie médium nahradilo čerstvým médiom obsahujúcim 20 ng/ml ľudského rekombinantného zásaditého ŕíbroblastového rastového faktora bFGF (Becton Dickinson, katalóg, č. 400600) a rôzne koncentrácie konjugovaných alebo nekonjugovaných proteínov interferónu-β-la alebo pozitívnu kontrolu (ako pozitívnu kontroluje možné použiť endostatín alebo protilátku k bFGF). Celkový objem sa nastavil na 0,5 ml v 24 jamkovej doštičke alebo 0,2 ml v 96 jamkovej doštičke.
Po 72 hodinách sa bunky ošetrili trypsínom na prepočítanie na Coulteru, zamrazili na odčítanie fluorescencie CyQuant alebo označili [3H] tymidínom. Inhibícia proliferácie endotelových buniek in vitro konjugovaným alebo nekonjugovaným interferónom-β-la bola porovnateľná, čo ukazuje na to, že PEGylácia nijako nepoškodzuje schopnosť interferónu normálne v tomto usporiadaní fungovať.
Tento test slúžil na hodnotenie molekuly ľudského interferónu-β-1 a podľa vynálezu z hľadiska in vitro účinkov na proliferáciu endotelových buniek, ktorá môže byť indikátorom antiangiogénnych účinkov in vivo. Pozri napr. O'Reilly, M.S., T. Boehm., Y. Shing, N. Fúkal, G. Vasios, W. Lane, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen, J. Folkman, 1997, Endostatín: An Endogenous Inhibítor of Angiogenesis and Tumor Growth. Celí 88: 277-285.
Príklad 9
In vivo model na testovanie antiangiogénneho a antineovaskularizačného účinku konjugátov interferónu-β-la
Na testovanie antiangiogénnych a antineovaskularizačných účinkov molekúl podľa vynálezu sa vyvinuli rôzne metódy. Niektoré z týchto modelov sú opísané v patentoch US 5 733 876 (31. marca 1998, „Methods of inhibíting angiogenesis“) a 5 135 9191 (4. augusta 1992, „Method and pharmaceutical composition for the inhibition of angogenesis“). K ďalším testom patrí napr. test s chorialantoidnou membránou bez škrupiny (CAM) podľa S. Taylor a J. Folkman, Náture 297, 307, 1982 a R. Crum, S. Szabo a J. Folkman, Science 230, 1375, 1985, model angiogenézy so vzdušným dorzálnym vakom pri myšiach podľa J. Folkman, a kol., J. Exp. Med. 133, 275, 1971, a test s mikrokapsou rohovky podľa Gimbrone, M.A.Jr. a kol., Natl. Cancer Inst. 52, 413, 1974, kde je vaskularizácia rohovky indukovaná pri dospelých samcoch laboratórnych potkanov kmeňa Sprague-Dawley (Charles River, Japonsko) implantáciou 500 ng zásaditého FGF (hovädzie, R and D systems, Inc.) impregnovaného v EVA (kopolymér etylén-vinylacetátu) peletách do každej rohovky.
K ďalším metódam testovania PEGylovaného myšieho interferónu-β-1 a na antiangiogénne účinky na zvieracom modeli patria, aj keď výpočet tým nie je obmedzený, skríningové testy nových potenciálnych protirakovinových liečiv, ako sú opísané v pôvodnej publikácii Cancer Chemotherapy Reports, Part 3, Vol. 3, No. 2, september 1972 a v suplemente In vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH Publ. No. 84-2635, február 1984.
Vzhľadom na medzidruhovú bariéru pre interferóny typu I, na hodnotenie antiangiogénnej aktivity konjugátov interferónu-β-la s polymérom na modeli hlodavcov sa pripravili polymérové konjugáty interferónuβ-la hlodavcov. Skríningové metódy sú ukázané na príklade protokolu na testovanie antiangiogénneho účinku PEGylovaného myšieho interferónu-β-la na subkutánne implantovaný Lewisov pľúcny karcinóm.
Pôvod nádorovej línie
Vznikla spontánne v roku 1951 ako karcinóm pľúc pri myši C57BL/6.
Súhrn testovacích procedúr
Fragment nádoru sa implantoval subkutánne do axilámej oblasti myší B6D2F1. Testované činidlo (napr. PEGylovaný interferón podľa vynálezu) sa podávalo v rôznych dávkach subkutánne (SC) alebo interperitoneálne (IP) počas niekoľkých dní po implantácii nádoru. Meraným parametrom potom bol medián času prežitia, výsledky sú uvedené ako percentá času prežitia kontroly.
Zvieratá
Propagácia nádoru: C57BL/6.
Testovacie zvieratá: B6D2F1.
Hmotnosť: myši by mali mať hmotnosť v rozsahu 3 g s minimálnou hmotnosťou pri samcoch 18 g a samiciach 17 g.
SK 287918 Β6
Pohlavie: zvieratá jedného pohlavia sa použili na test aj kontrolu v jednom pokuse. Zdroj: jeden zdroj, ak je to možné, pre všetky zvieratá v jednom pokuse.
Rozsah experimentu zvierat v jednej testovanej skupine.
Prenos nádoru
Propagácia nádoru:
Fragment: pripraviť 2 až 4 mm fragment nádoru SC darcovského nádoru.
Čas: 13. až 15. deň.
Miesto: fragment implantovaný SC do axilámej oblasti punkciou ingvinálnej oblasti.
Testovanie:
Fragment: príprava fragmentu s veľkosťou 2-4 mm zo s.c. darcovského tumoru.
Čas: dni 13-15.
Miesto: implantácia fragmentu s.c. do axilámej oblasti s punkciou v ingvinálnej oblasti.
Testovacia schéma:
Deň 0: implantácia tumoru. Založenie bakteriálnych kultúr. Testovanie pozitívnej kontrolnej zlúčeniny v každom experimente s nepárnym číslom. Príprava materiálov. Denný záznam úmrtí.
Deň 1: Kontrola kultúr. Odstránenie kontaminovaného experimentu. Randomizácia zvierat. Ošetrovanie podľa inštrukcií (v deň 1 a nasledujúce dni).
Deň 2: opakovaná kontrola kultúr. Odstránenie kontaminovaného experimentu.
Deň 5: Hodnotenie dňa 2 a deň začiatočného testu vyhodnotenia toxicity prípravku.
Deň 14 : Kontrolný deň skorého úmrtia.
Deň 48: Kontrolný deň.
Deň 60: Koniec a vyhodnotenie experimentu. Vyšetrenie tumoru pľúc voľným okom.
Kontrola kvality:
Stanovenie pozitívnej kontrolnej zlúčeniny (NSC 26271 (Cytoxan v dávke 100 mg/kg/injekcia)) v každom experimente s nepárnym číslom, ktorého režim bol v deň 1 len intraperitoneálny. Spodný limit testu/kontroly pre pozitívnu kontroluje 140 %. Prijateľný medián prežitia pri neošetrenej kontrole bol 19 až 35,6 dní.
Vyhodnotenie:
Meraný parameter je medián prežitia. Výpočet priemernej telesnej hmotnosti zvierat v deň 1 a v deň 5, výpočet pomeru test/kontrola pre všetky testované skupiny. Vypočítané sú priemerné telesné hmotnosti zvierat v dňoch odpočítania a v deň výsledného vyhodnotenia. Pomer test/kontrola je vypočítaný pre všetky testované skupiny s > 65 % prežívajúcich v deň 5. Pomer test/kontrola < 86 % indikuje toxicitu. Na hodnotenie toxicity môže sa tiež použiť neprimeraná zmena telesnej hmotnosti (test mínus kontrola).
Meradlá aktivity:
Východiskový pomer test/kontrola väčší alebo rovnajúci sa 140 % je považovaný za nevyhnutný pre dôkaz miernej aktivity. Reprodukovateľná hodnota pomeru test/kontrola väčšia alebo rovnajúca sa 150 % je považovaná za významnú aktivitu.
ZOZNAM SEKVENCIÍ <170> Patentln ver. 2.1 <210> 1 <211> 549 <212> DNA <213> Mus sp.
<400> 1 tccgggggcc atcatcatca tcatcatagc tccggagacg atgatgacaa gatgagctac aacttgcttg gattcctaca aagaagcagc aattttcagt gtcagaagct cctgtggcaa ttgaatggga ggcttgaata ctgcctcaag gacaggatga actttgacat ccctgaggag attaagcagc tgcagcagtt ccagaaggag gacgccgcat tgaccatcta tgagatgctc cagaacatct ttgctatttt cagacaagat tcatctagca ctggctggaa tgagactatt gttgagaacc tcctggctaa tgtctatcat cagataaacc atctgaagac agtcctggaa gaaaaactgg agaaagaaga tttcaccagg ggaaaactca tgagcagtct gcacctgaaa agatattatg ggaggattct gcattacctg aaggccaagg agtacagtca ctgtgcctgg accatagtca gagtggaaat cctaaggaac ttttacttca ttaacagact tacaggttac ctccgaaac
120
180
240
300
360
420
480
540
549 <21O> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2
Ser 1 Gly Gly His His 5 His Hi S His HÍS ser ser Gly Asp Asp 10 ASp 15 Asp
Lys Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser ser Asn phe
20 25 30
Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys
35 40 45
Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu
50 55 60
Gin Gin Phe Gin Lys Glu ASP Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu
65 70 75 80
Gin Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser Ser ser Thr Gly Trp
85 90 95
Asn Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin íle
100 105 110
Asn HIS Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe
11S 120 125
Thr i?? Gly Lys Leu Met Ser 135 ser Leu His Leu Lys 140 Arg Tyr Tyr Gly
Arg íle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr ser His cys Ala Trp
145 150 155 160
Thr íle Val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg
165 170 175
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180
<210> 3
<211> 60
<212> ONA
<213> Homo
<400> 3
ttctccggag
<210> 4
<211> 39
<212;» ONA
<213> HOfflO
<400> 4
gccgctcgag
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Homo
<400> 5
agcttccggg
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Homo
<400> 6
ccggagctat
<210> 7
<211> 87
<212> ONA
<213> Homo
<400> 7
ccggagacga attttcagtg
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo
<400> 8
gatctagcaa
<210> 9
sapiens acgatgatga sapiens ttatcagttt sapiens ggccatcatc sapiens gatgatgatg sapiens tgatgacaag tcagaagctc sapiens tgctgcctgt caagatgagc cggaggtaac atcatcatca atgatggccc atggcttacg ctgtggc gctgccctcc tacaacttgc ctgtaagtc tagct ccgga ttggattcct acaaagaagc ccgctcttgg agccctacaa gcttctagca tggctgcctt gaatgggagg cttgaatact <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcctcaagga caggatgaac tttgacatcc ctgaggagat taagcagctg ca <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 aattgaatgg gagggctgca gcttgcgctg cagacaggat gaactttgac atccctgagg agattaagca gctgca <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacagggc tgcatttgct atccctgcag agattaagca gctgca <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac a <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tccctgagga gattgctgca gctgcagctt tcgctgcagc tga <210> 14 <211> 78 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cgccgcgttg accatctatg agatgctcgc taacatcgct agcattttca gacaagattc atctagcact ggctggaa <210> 15 <211> 78 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cgccgcattg accatctatg agatgctcca gaacatcttt gctattttcg ctgcagcttc atctagcact ggctggaa <210> 16 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggaatgcttc aattgttgct gcactcctga gcaatgtcta tcatcagata aaccatctga agacagttct ag
SK 287918 Β6 <210> 17 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ggaatgagac cattgttgag aacctcctgg ctaatgtcgc tcatcagata gcacatctgg 60 ctgcagttct ag 72 <210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ctagctgcaa aactggctgc agctgatttc accaggggaa aact 44 <210> 19 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ctagaagaaa aactggagaa agaagcagct accgctggaa aagcaatgag cgcgctgcac 60 ctgaaaaga 69 <210> 20 <211> SI <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tattatggga ggattctgca ttacctgaag gccaaggagt actcacactg t 51 <210> 21 <211> 163 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 catgagcagt ctgcacctga aaagatatta tggggcaatt ggagtactca cactgtcatg agcagtctgc acctgaaaag attacctgaa ggccgctgca tactcacact gtgcctggac gctgcatacc atattatggg gat tggcagccaa aggattctgc
120
163 <210> 22 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 catgagcagt |gagtacgct ctgcacctga gcatgtgcct aaagatatta tgggaggatt ggacgat ctgcattacc tgaaggcaaa <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cgtcagagct gaaatcctag caaactttgc attcattgca agacttacag <210> 24 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 24 Leu Gin 10 Arg ser Ser Asn Phe 15 Gin
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
HÍS Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Al a Leu Met ser Ser Leu Hi S Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser HÍS Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Arg íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 25 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Met 1 Ala Tyr Ala Ala 5 Leu Gly Ala Leu Gin Ala Ser ser Asn Phe Gin
10 15
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gl n Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr HÍS Gin íle Asn
85 90 95
HÍS Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Ala Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu Hi s Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser Hi s cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Arg íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg 165 Asn
<210> 26 <211> 166 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg ser Ser Asn Ala Ala
1 5 10 15
Cys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu ASp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle Val Gl u Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Ala Leu Met ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr ser His cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg Val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Arg íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 27 <211> 166 <212> PRT
<213> Homo : sapiens
<400> 27 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg ser Ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
Cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Ala Ala Ala 30 cys Ala
Ala Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp ser ser ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val GlU Asn Leu Leu Ala Α5Π val Tyr His Gin íle Asn
90 95
ΗΊ S Leu Lys Thr 100 Val Leu Glu Glu
Arg Gly Ala 115 Leu Met Ser ser Leu 120
íle Leu 130 Hi S Tyr Leu Lys Ala 135 Lys
íle 145 val Arg val Glu íle 150 Leu Arg
Thr Gly Tyr Leu Arg 165 Asn
Lys 105 Leu Glu Lys Glu Asp 110 Phe Thr
HiS Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
Glu Tyr ser Hi s 140 cys Ala Trp Thr
Asn Phe Tyr 155 Arg íle Asn Arg Leu 160
<210> 28 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Met 1 ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe
Cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu
Lys Asp Arg 35 Ala Ala Phe Ala íle 40
Gl n Phe 50 Gin Lys Glu Asp Ala 55 Ala
Asn 65 íle Phe Ala íle Phe 70 Arg Gin
Glu Thr íle val Gl u 85 Asn Leu Leu
His Leu Lys Thr 100 val Leu Glu Glu
Arg Gly Al a 115 Leu Met Ser Ser Leu 120
íle Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Lys
íle 145 Val Arg val Glu íle 150 Leu Arg
Thr Gly Tyr Leu Arg 165 Asn
Leu Gin 10 Arg ser ser Asn Phe 15 Gin
Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 cys Leu
Pro Ala Glu íle Lys 45 Gin Leu Gin
Leu Thr íle Tyr 60 Glu Met Leu Gin
Asp Ser ser 75 Ser Thr Gly Trp Asn 80
Ala Asn 90 val Tyr His Gin íle 95 Asn
Lys 105 Leu Glu Lys Glu Asp 110 Phe Thr
His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
Glu Tyr Ser Hi s 140 cys Ala Trp Thr
Asn Phe Tyr 155 Arg íle Asn Arg Leu 160
<210> 29 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Phe Ala Ala Ala Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser ser ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Ala 115 Leu Met Ser Ser Leu 120 HÍS Leu Lys Arg Ss Tyr Gly Arg
íle Leu Hi S Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr ser His cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn phe Tyr Arg íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210> 30 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser 10 Ser Α5Π Phe 15 Gin
Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gl n Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu HÍS Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 31 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31
Met 1 Ala Tyr Al a Ala 5 Leu Gly Ala Leu Gin Ala Ser Ser Asn Phe Gin
10 15
cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe ASP íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gl n Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser Hi 5 Cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210> 32 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser 10 Asn Ala 15 Ala
cys Ala Ala Leu 20 Leu Ala Ala Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu ASp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp ser Ser ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser ser Leu HiS Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg 145 Val Glu íle 150 Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 33 <211> 166 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33 Gin
Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser ser Asn Phe
1 5 10 15
Cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Ala Ala Ala 30 Cys Ala
Ala Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gl n Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Gl u Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr HÍS Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu ASp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu His Tyr Leu Lys Ala tys Glu Tyr ser His cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210> 34 <211> 166 <212> PRT
<213 (> Homo sapiens
<400> 34
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg ser ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Ala Ala Phe Ala íle Pro Ala Glu íle Lys Gin Leu Gl n
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu ASP Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
HIS Leu Lys Thr 100 val Leu Glu Glu
Arg Gly Lys 115 Leu Met ser Ser Leu 120
íle Leu 130 Hi S Tyr Leu Lys Ala 135 Lys
íle 145 val Arg val Glu íle 150 Leu Arg
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
95
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
105 110
His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
Glu Tyr Ser His 140 Cys Ala Trp Thr
Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
155 160
<210> 35
<211> 166
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Phe Ala Ala Ala Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys 115 Leu Met Ser ser Leu 120 Hi S Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
íle Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Lys Glu Tyr ser Hi s 140 Cys Ala Trp Thr
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210> 36 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36
Met 1 ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin 10 Arg Ser ser Asn Phe 15 Gin
cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Ala
50 55 60
Asn íle Ala Ser íle Phe Arg Gin Asp Ser ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
HiS Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys 115 Leu Met Ser ser Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
íle Leu HÍS Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210> 37 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin Arg 10 Ser Ser Asn Phe 15 Gin
CyS Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg 35 Met Asn Phe Asp íle 40 Pro Glu Glu íle Lys 45 Gl n Leu Gin
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Al a Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Ala Ala Al a ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
HÍS Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu ASP Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys 115 Leu Met ser Ser Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
íle Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Lys Glu Tyr ser His 140 cys Ala Trp Thr
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 38 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gl n Lys Glu ASp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Ala Ser íle val Ala Ala Leu Leu Ser Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys 11S Leu Met Ser ser Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
íle Leu Hi S Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr ser His cys Ala Trp Thr
130 135 140
Xle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 39 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser ser Asn 10 Phe 15 Gin
cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle phe Arg Gin Asp Ser ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Ala His Gin íle Ala
85 90 95
Hi S Leu Ala Ala val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr ser His Cys Ala Trp Thr
135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210> 40 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40
Met 1 ser Tyr Asn Leu Leu Gly 5 Phe Leu Gin Arg 10 ser Ser Asn Phe 15 Gin
Cys Gin Lys Leu Leu T rp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys ASP Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Gl u íle Lys Gin Leu Gl n
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gl n
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Gl u Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr HIS Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Ala Ala Lys Leu Ala Ala Ala Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu Hi s Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <21O> 41 <211> 166 <212> PRT
<213> Homo · sapiens
<400> 41
Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gl y Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Al a Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser Ser ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
GlU Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
HIS Leu Lys Thr val Leu Glu GlU Lys Leu Glu Lys Glu Ala Ala Thr
100 105 110
Ala Gly Lys Ala Met Ser Ala Leu Hi 5 Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 42 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser 10 ser Asn Phe 15 Gin
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Gl u Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
Hi S Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Al a
115 120 125
íle Ala Ala Tyr Leu Ala Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg Val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165 <210> 43 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val GlU Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
Hi S Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys 115 Leu Met Ser Ser Leu 120 Hi S Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
íle Leu His Tyr Leu Lys Al a Ala Ala Tyr Ser Hi s cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg ASn
165 <210> 44 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44
Met 1 Ser Tyr Asn Leu Leu 5 Gly Phe Leu Gin 10 Arg Ser Ser Asn Phe 15 Gin
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Al a íle Phe Arg Gin ASp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
Hi S Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
íle Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Lys Glu Tyr Ala Ala 140 cys Ala Trp Thr
íle val Arg Val Glu íle Leu Arg Asn Phe Tyr Phe íle Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 45 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45
Met 1 Ser Tyr Asn Leu Leu 5 Gly Phe Leu Gin 10 Arg Ser Ser Asn Phe 15 Gin
cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp íle Pro Glu Glu íle Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr íle Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn íle Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr íle val Glu Asn Leu Leu Ala Asn val Tyr His Gin íle Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys 115 Leu Met ser ser Leu 120 Hi S Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
íle Leu Hi s Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His cys Ala Trp Thr
130 135 140
íle val Arg Ala Glu íle Leu Ala Asn Phe Ala Phe íle Ala Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje glykozylovaný interferón-β-ί a zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK
    10 AKEYSHCAWTIVR-VEILRNFYFINRLTGYLRN spojený s polymérom nevyskytujúcim sa v prírode na N-konci uvedeného glykozylovaného interferónu-β-1 a, pričom tento polymér obsahuje polyalkylénglykolovú časť.
  2. 2. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že polyalkylénová časť je naviazaná na interferón-β prostredníctvom skupiny vybranej zo skupín, ako je aldehydová, maleínimidová, vinylsulfó15 nová, haloacetátová skupina, väčší počet histidínových zvyškov, hydrazínová a aminotiolová skupina.
  3. 3. Kompozícia podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že interferónom^-la je fúzny proteín interferónu^-la.
  4. 4. Kompozícia podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že fúzny proteín interferónu^-la obsahuje časť imunoglobulínovej molekuly.
    20
  5. 5. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúca sa tým, že interferónu-β-la je naviazaný na polymér na mieste prostredníctvom glykánového zvyšku interferónu-β-la.
  6. 6. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 5, vyznačujúca sa tým, že polymér má molekulovú hmotnosť 5 až 40 kDa.
  7. 7. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje kompozíciu interferónu25 -β-la podľa niektorého z nárokov 1 až 6.
  8. 8. Použitie kompozície podľa niektorého z nárokov 1 až 6 na prípravu farmaceutickej kompozície.
  9. 9. Použitie kompozície podľa niektorého z nárokov 1 až 6 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie nádorov a rakovín, autoimunitných stavov, vírusových ochorení alebo angiogénnych ochorení.
  10. 10. Použitie podľa nároku 9, pričom nádory a rakoviny sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z osteogénneho sarkómu, lymfómu, akútnej lymfatickej leukémia, karcinómu prsníka, melanómu a nazofaryngeálneho karcinómu.
  11. 11. Použitie podľa nároku 9, pričom autoimunitné stavy sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z fibrózy, lupusu a sklerózy multiplex.
  12. 12. Použitie podľa nároku 9, pričom vírusové ochorenia sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z infekcie ECM, chrípky, vírusových infekcií respiračného traktu, besnoty a hepatitídy.
  13. 13. Použitie podľa nároku 9, pričom angiogénne ochorenia sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z diabetickej retinopatie, retinopatie predčasne narodených, makulámej degenerácie, odvrhnutia štepu rohovky, neovaskulámeho glaukómu, retrolentálnej fibroplázie, rubeózy a Osler-Weberov syndrómu.
  14. 14. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje mutant glykozylovaného interferónu-β-la vybraný zo skupiny pozostávajúcej z INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu MAYAALGALQASSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIF RQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAK EYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNAACAALLAALNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK
    AKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRAAACAADRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNI
    FAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYL
    KAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRAAFAIPAEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK
    AKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIAAAAAFAAADAALTIYEMLQNI
    FAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYL
    KAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLANI
    ASIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYL
    KAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFAAASSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK
    AKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLĽWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNASIVAALLSNVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK
    AKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVAHQIAHLAAVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK
    AKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLAAKLAAADFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYL
    KAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEAATAGKAMSALHLKRYYGRILHYL
    KAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGAIAAYLA
    AKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK
    AAAYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN,
    INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF
    AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK
    AKEYAACAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN, a INF-β zahrnujúceho aminokyselinovú sekvenciu
    MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIF AIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLK AKEYSHCAWTIVRAEILANFAFIARLTGYLRN, spojený s polymérom nevyskytujúcim sa v prírode na N-konci uvedeného glykozylovaného interférónu-P-la, pričom tento polymér obsahuje polyalkylénglykolovú časť.
  15. 15. Kompozícia podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že mutantom glykozylovaného interferónu^-laje fúzny proteín interferón^-la.
  16. 16. Kompozícia podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že fúzny proteín interferón^-la zahrnuje časť imunoglobulínovej molekuly.
  17. 17. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje kompozíciu podľa niektorého z nárokov 14 až 16.
  18. 18. In vitro spôsob predĺženia účinnosti interťerónu^-la v in vitro systéme, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje naviazanie interferónu-fi-la na N-koniec polymérovej časti, ktorá sa nevyskytuje v prírode, čím vznikne spojená kompozícia polymér-interferón-p-la, a vnesenie tejto spojenej kompozície polymér-interferón^-la do in vitro systému.
  19. 19. Použitie polymérovej časti, ktorá sa nevyskytuje v prírode na získanie spojenej kompozície polymér-interferón^-la ako je definované v niektorom z nárokov 1 až 6 na prípravu farmaceutickej kompozície.
  20. 20. Použitie kompozície podľa nároku 6 na prípravu farmaceutickej kompozície na inhibíciu angiogenézy u pacienta.
  21. 21. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 5a 14 až 16, vyznačujúca sa tým, že polymérom je polyetylénglykol.
  22. 22. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 5a 14 až 16a21, vyznačujúca sa tým, že polymér má molekulovú hmotnosť medzi 10 000 a 40 000 Da.
  23. 23. Kompozícia podľa nároku 22, vyznačujúca sa tým, že polymér má molekulovú hmotnosť 20 000 Da.
SK506-2001A 1998-10-16 1999-10-15 Composition containing glycosylated interferon-beta-1a, pharmaceutical composition, use of composition, in-vitro method of prolonging the activity of interferon-beta-1a and use of polymer moiety SK287918B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10457298P 1998-10-16 1998-10-16
US12016199P 1999-02-16 1999-02-16
PCT/US1999/024201 WO2000023114A2 (en) 1998-10-16 1999-10-15 Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK5062001A3 SK5062001A3 (en) 2002-01-07
SK287918B6 true SK287918B6 (sk) 2012-03-02

Family

ID=26801696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK506-2001A SK287918B6 (sk) 1998-10-16 1999-10-15 Composition containing glycosylated interferon-beta-1a, pharmaceutical composition, use of composition, in-vitro method of prolonging the activity of interferon-beta-1a and use of polymer moiety

Country Status (30)

Country Link
US (5) US6962978B2 (sk)
EP (4) EP1121156B1 (sk)
JP (5) JP4616478B2 (sk)
KR (1) KR100630849B1 (sk)
CN (2) CN101062419B (sk)
AT (1) ATE318149T1 (sk)
AU (1) AU762616B2 (sk)
BR (1) BRPI9915542C1 (sk)
CA (1) CA2345138C (sk)
CY (2) CY1105022T1 (sk)
CZ (1) CZ299164B6 (sk)
DE (1) DE69930015T2 (sk)
DK (2) DK1121156T3 (sk)
EA (1) EA004789B9 (sk)
EE (2) EE04967B1 (sk)
ES (4) ES2257884T3 (sk)
HK (2) HK1042434B (sk)
HU (1) HU229888B1 (sk)
IL (2) IL142282A0 (sk)
IS (1) IS2926B (sk)
LT (2) LT2599503T (sk)
NO (1) NO20011860L (sk)
NZ (1) NZ510689A (sk)
PL (1) PL206536B1 (sk)
PT (2) PT1656952E (sk)
SG (2) SG110047A1 (sk)
SI (2) SI1656952T1 (sk)
SK (1) SK287918B6 (sk)
TR (1) TR200101086T2 (sk)
WO (1) WO2000023114A2 (sk)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2257884T3 (es) * 1998-10-16 2006-08-01 Biogen Idec Ma Inc. Conjugados de polimero e interferon beta-1a y sus usos.
EA005005B1 (ru) * 1998-10-16 2004-10-28 Байоджен, Инк. ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
IL147581A0 (en) * 1999-08-27 2002-08-14 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
EP1334128A2 (en) * 2000-11-02 2003-08-13 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
SK11882003A3 (sk) 2001-02-27 2004-03-02 Maxygen Aps Variant štandardného ľudského interferónu ß, nukleotidová sekvencia kódujúca tento variant, expresný vektor a hostiteľská bunka s jej obsahom, farmaceutický prostriedok s obsahom uvedeného variantu a jeho použitie
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
BRPI0213207B1 (pt) * 2001-10-10 2021-06-15 Novo Nordisk A/S Processo in vitro, isento de células, para a remodelagem de um peptídeo e processos para formar um conjugado entre peptídeos e um grupo de modificação
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
PL397261A1 (pl) * 2002-01-18 2012-03-26 Biogen Idec Ma Inc. Aktywowany polimer glikolu polialkilenowego, kompozycja i kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
RS20050255A (en) * 2002-09-27 2007-08-03 Biogen Idec Ma Inc., Therapies for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy using interferon-betha
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
MXPA05006945A (es) * 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas polipeptidicas y sus antagonistas con actividad conservada de union al receptor.
MXPA05006944A (es) * 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de interferon-beta cion potencia biologica aumentada.
MXPA05009726A (es) 2003-03-14 2005-11-04 Neose Technologies Inc Polimeros ramificados, solubles en agua y sus conjugados.
WO2004084949A2 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Xencor Generating protein pro-drugs using reversible ppg linkages
JP2006521372A (ja) * 2003-03-28 2006-09-21 バイオポリメド インコーポレーテッド 生物学的活性物質と生体適合性高分子の１：１接合体、この製造方法とこれを含む薬学組成物
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
EP1613261A4 (en) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
AU2004240748B2 (en) * 2003-05-21 2010-07-15 Ares Trading S.A. Method of chromatographic analysis of a protein solution
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
JP4850514B2 (ja) * 2003-08-25 2012-01-11 東レ株式会社 インターフェロンβ複合体
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
JP5743368B2 (ja) 2004-01-08 2015-07-01 ラショファーム ゲーエムベーハー ペプチドのｏ結合型グリコシル化
EP1718664A4 (en) 2004-02-02 2008-08-13 Ambrx Inc MODIFIED HUMAN FOUR FIXED PROPELLANT (4HB) BEAM POLYPEPTIDES, AND USE THEREOF
US20090214472A1 (en) * 2004-03-01 2009-08-27 Enzon Pharmaceuticals Inc. Interferon-beta polymer conjugates
WO2005112911A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders
WO2006004959A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
MX2007008229A (es) 2005-01-10 2007-09-11 Neose Technologies Inc Factor estimulador de colonias de granulocitos glicopegilado.
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
JP5216580B2 (ja) 2005-05-25 2013-06-19 ノヴォ ノルディスク アー／エス グリコペグ化第ｉｘ因子
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
CN101291684A (zh) * 2005-10-21 2008-10-22 阿维季尼克斯股份有限公司 甘醇化和糖基化的禽类来源的治疗性蛋白
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
AU2006314497A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Ares Trading S.A. Interferon in influenza
CA2634034A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
WO2007110231A2 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Nautilus Biotech, S.A. MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
CA2647314A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US8637325B2 (en) * 2009-02-16 2014-01-28 University Of Wyoming Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
EP2059527B1 (en) 2006-09-01 2014-12-03 Novo Nordisk Health Care AG Modified glycoproteins
AU2007296843C1 (en) 2006-09-15 2012-08-16 Creabilis Therapeutics S.P.A. Polymer conjugates of Box-A of HMGB1 and Box-A variants of HMGB1
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
JP5876208B2 (ja) 2006-12-15 2016-03-02 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 延長されたｉｎｖｉｖｏ半減期を有する第ＶＩＩａ因子−（ポリ）シアル酸結合体
EP2111230A4 (en) * 2006-12-19 2010-11-17 Merrimack Pharmaceuticals Inc COMMON ADMINISTRATION OF ALPHA-FETOPROTEIN AND AN IMMUNOMODULATING AGENT TO TREAT MULTIPLE SCLEROSE
PL2144923T3 (pl) 2007-04-03 2013-12-31 Biogenerix Ag Sposoby leczenia z użyciem glikopegilowanego G-CSF
JP2010525821A (ja) 2007-05-02 2010-07-29 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾ＩＦＮβポリペプチドおよびこれらの使用
EP2170919B8 (en) 2007-06-12 2016-01-20 ratiopharm GmbH Improved process for the production of nucleotide sugars
JP5933923B2 (ja) * 2007-10-09 2016-06-22 ポリテリクス リミテッド 新規な複合タンパク質及びペプチド
ES2387236T3 (es) * 2007-12-20 2012-09-18 Merck Serono S.A. Formulaciones de interferón beta pegilado
NZ602170A (en) 2008-02-08 2014-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
DK2257311T3 (da) 2008-02-27 2014-06-30 Novo Nordisk As Konjugerede Faktor VIII-Molekyler
CN102057054B (zh) 2008-04-11 2015-06-10 梅里麦克制药股份有限公司 人血清白蛋白接头以及其结合物
BRPI0910686A2 (pt) 2008-04-21 2015-09-29 Tissue Regeneration Therapeutics Inc células perivasculares do cordão umbilical humano geneticamente modificadas para a profilaxia contra agentes biológicos e químicos ou para o tratamento dos mesmos.
CA2729851C (en) 2008-07-23 2019-01-15 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
KR20110112301A (ko) 2008-11-18 2011-10-12 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트
GB0912485D0 (en) * 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
WO2010127172A2 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor h binding proteins (fhbp) and methods of use
EP2440251A4 (en) 2009-06-09 2013-01-16 Defyrus Inc INTERFERON ADMINISTRATION FOR PROPHYLAXIS AGAINST PATHOGEN INFECTION OR TREATMENT OF PATHOGEN INFECTION
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
WO2011012850A2 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8637640B2 (en) 2009-07-27 2014-01-28 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
HUE028056T2 (en) 2009-07-27 2016-11-28 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
CN107674121A (zh) 2009-12-21 2018-02-09 Ambrx 公司 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途
CN104017063A (zh) 2009-12-21 2014-09-03 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
CN101906213B (zh) * 2010-07-23 2012-12-05 华南理工大学 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法
US20130195799A1 (en) * 2010-08-19 2013-08-01 Peg Biosciences, Inc. Synergistic biomolecule-polymer conjugates
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
MX2013003599A (es) * 2010-10-01 2013-07-29 Biogen Idec Inc Interferon-beta para uso como monoterapia o en combinacion con otras terapias de cancer.
CN103269723B (zh) 2010-12-22 2017-04-05 百深有限责任公司 用于偶联水溶性脂肪酸衍生物与蛋白质的材料和方法
US10358470B2 (en) 2011-10-01 2019-07-23 Glytech, Inc. Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
KR20140130705A (ko) 2012-02-29 2014-11-11 도레이 카부시키가이샤 체강액 저류 억제제
WO2014036520A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
BR112015024423B1 (pt) 2013-03-29 2023-04-25 Glytech, Inc Polipeptídeo glicosilado tendo atividade de interferon ?, composição farmacêutica e uso de um polipeptídeo glicosilado
KR101671501B1 (ko) 2014-07-24 2016-11-03 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론-베타 변이체
EP3454887B1 (en) 2016-05-13 2021-01-20 Orionis Biosciences BV Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
JP2020506727A (ja) 2017-02-06 2020-03-05 オリオンズ バイオサイエンス エヌブイ 標的化キメラタンパク質及びその使用
RU2661088C1 (ru) * 2017-05-24 2018-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза
WO2019152979A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
RU2739261C1 (ru) * 2019-12-31 2020-12-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
JP2024511465A (ja) 2021-03-26 2024-03-13 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム Ｎｋ細胞エンゲージングのためにサイトカインに融合したｎｋｐ４６結合性部位、がん抗原結合性部位を含む多特異性タンパク質
WO2022258662A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2360794C2 (de) * 1973-12-06 1984-12-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von Peptiden
CH596313A5 (sk) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
IL47468A (en) 1975-06-12 1979-05-31 Rehovot Res Prod Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
WO1982002715A1 (fr) 1981-02-04 1982-08-19 Sugano Haruo Gene d'interferon (beta)humain
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
EP0098876A1 (en) 1982-01-19 1984-01-25 Cetus Corporation Multiclass hybrid interferons
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
CA1302320C (en) 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
US5231176A (en) 1984-08-27 1993-07-27 Genentech, Inc. Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons
FI90990C (fi) 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4885166A (en) 1985-06-11 1989-12-05 Ciba-Geigy Corporation Hybrid interferons
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
EP0229108B1 (en) * 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5183746A (en) 1986-10-27 1993-02-02 Schering Aktiengesellschaft Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β-
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5004605A (en) 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847625A (en) * 1988-02-16 1989-07-11 Ford Aerospace Corporation Wideband, aperture-coupled microstrip antenna
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
AU4660789A (en) 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
ES2199935T3 (es) 1991-03-15 2004-03-01 Amgen Inc. Pegilacion de polipeptidos.
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
AU3423293A (en) 1991-12-19 1993-07-19 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5306344A (en) * 1992-12-02 1994-04-26 Edward C. Levy Company Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5641656A (en) 1993-10-22 1997-06-24 University Of Connecticut Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
EP0730470B1 (en) 1993-11-10 2002-03-27 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
EP1090645B1 (en) 1994-02-08 2005-12-07 Amgen Inc., Oral delivery of chemically modified proteins
US5545723A (en) 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
MX9704137A (es) 1994-12-07 1997-09-30 Novo Nordisk As Polipeptidos de alergenicidad reducida.
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
ATE200030T1 (de) 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
AU751898B2 (en) 1997-07-14 2002-08-29 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
CN100335503C (zh) 1998-04-28 2007-09-05 应用研究系统Ars股份公司 多元醇干扰素β偶联物
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
ES2257884T3 (es) * 1998-10-16 2006-08-01 Biogen Idec Ma Inc. Conjugados de polimero e interferon beta-1a y sus usos.
EA005005B1 (ru) 1998-10-16 2004-10-28 Байоджен, Инк. ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
IL147581A0 (en) * 1999-08-27 2002-08-14 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
WO2001046291A1 (en) 1999-12-22 2001-06-28 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US9506008B2 (en) 2013-12-23 2016-11-29 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for improving engine fuel efficiency

Also Published As

Publication number Publication date
HK1042434A1 (en) 2002-08-16
SI1121156T1 (sl) 2006-08-31
US20030021765A1 (en) 2003-01-30
EP1656952A2 (en) 2006-05-17
ATE318149T1 (de) 2006-03-15
ES2630278T3 (es) 2017-08-21
WO2000023114A9 (en) 2001-07-05
US20090104150A1 (en) 2009-04-23
EP2260872B1 (en) 2017-08-30
CN101062419B (zh) 2016-06-29
LTPA2017030I1 (lt) 2017-10-25
PT1656952E (pt) 2014-02-21
JP2014129420A (ja) 2014-07-10
US9314534B2 (en) 2016-04-19
US7446173B2 (en) 2008-11-04
JP5863865B2 (ja) 2016-02-17
TR200101086T2 (tr) 2001-08-21
EE200100220A (et) 2002-06-17
HU229888B1 (en) 2014-11-28
AU762616B2 (en) 2003-07-03
CA2345138A1 (en) 2000-04-27
ES2257884T3 (es) 2006-08-01
CZ299164B6 (cs) 2008-05-07
EP1121156A2 (en) 2001-08-08
HK1089393A1 (en) 2006-12-01
DK1121156T3 (da) 2006-06-06
EE200700058A (et) 2008-02-15
EP1656952A3 (en) 2006-11-29
KR100630849B1 (ko) 2006-10-04
CN1329082C (zh) 2007-08-01
PL347968A1 (en) 2002-04-22
HUP0200444A2 (en) 2002-06-29
US20070098688A1 (en) 2007-05-03
DE69930015D1 (de) 2006-04-27
WO2000023114A2 (en) 2000-04-27
ES2653589T3 (es) 2018-02-07
EA004789B9 (ru) 2017-05-31
EP2260872A2 (en) 2010-12-15
CA2345138C (en) 2009-12-15
EE05201B1 (et) 2009-08-17
EP2599503B1 (en) 2017-05-17
EP2599503A2 (en) 2013-06-05
JP2002527491A (ja) 2002-08-27
LT2599503T (lt) 2017-06-26
NO20011860D0 (no) 2001-04-11
EE04967B1 (et) 2008-02-15
BR9915542A (pt) 2001-08-14
ES2447772T3 (es) 2014-03-12
JP2007063283A (ja) 2007-03-15
EP2260872A3 (en) 2011-04-27
PT1121156E (pt) 2006-05-31
CN1323225A (zh) 2001-11-21
EA004789B1 (ru) 2004-08-26
EP1656952B1 (en) 2013-12-18
CY1105022T1 (el) 2010-03-03
US20160250340A1 (en) 2016-09-01
CN101062419A (zh) 2007-10-31
JP2011026329A (ja) 2011-02-10
SG2008070138A (en) 2017-08-30
SK5062001A3 (en) 2002-01-07
CZ20011329A3 (cs) 2001-09-12
SI1656952T1 (sl) 2014-04-30
IL142282A (en) 2007-03-08
CY1115125T1 (el) 2016-12-14
HK1042434B (zh) 2008-01-25
IS5913A (is) 2001-03-30
PL206536B1 (pl) 2010-08-31
DK1656952T3 (da) 2014-01-20
AU1446500A (en) 2000-05-08
BRPI9915542C1 (pt) 2021-05-25
NO20011860L (no) 2001-06-15
LTC2599503I2 (lt) 2019-06-25
EP2599503A3 (en) 2013-07-24
BR9915542B1 (pt) 2016-06-07
US6962978B2 (en) 2005-11-08
WO2000023114A3 (en) 2000-09-28
SG110047A1 (en) 2005-04-28
US20150011732A1 (en) 2015-01-08
BR9915542B8 (pt) 2017-10-31
JP5396358B2 (ja) 2014-01-22
JP2011093937A (ja) 2011-05-12
NZ510689A (en) 2003-07-25
EP1121156B1 (en) 2006-02-22
JP4616478B2 (ja) 2011-01-19
IL142282A0 (en) 2002-03-10
KR20010103605A (ko) 2001-11-23
IS2926B (is) 2015-09-15
DE69930015T2 (de) 2006-10-12
EA200100446A1 (ru) 2001-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5863865B2 (ja) インターフェロン−β−１ａのポリマー結合体および使用
JP4761621B2 (ja) インターフェロン−β融合タンパク質および使用
JP2002527491A5 (sk)
JP2002527100A5 (sk)
MXPA01003791A (es) Conjugados polimericos de interferon beta - 1a y usos de los mismos

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Expiry of patent

Expiry date: 20191015