BRPI0213207B1 - Processo in vitro, isento de células, para a remodelagem de um peptídeo e processos para formar um conjugado entre peptídeos e um grupo de modificação - Google Patents

Processo in vitro, isento de células, para a remodelagem de um peptídeo e processos para formar um conjugado entre peptídeos e um grupo de modificação Download PDF

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BRPI0213207B1
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Shawn De Frees
David Hakes
Xi Chen
Caryn Bowe
Robert Bayer
David Zopf
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Novo Nordisk A/S
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Abstract

"remodelagem e glicoconjugação de peptídeos". a invenção inclui processos e composições para remodelação de uma molécula de peptídeo, incluindo a adição ou apagamento de um ou mais grupos glicosila em relação a um peptídeo e/ou a adição de um grupo de modificação do peptídeo.

Description

Histórico da Invenção
[001] Os peptídeos que ocorrem mais naturalmente contêm porções de carboidrato anexadas ao peptídeo através de ligações específicas a um número selecionado de aminoácidos, juntamente com o comprimento da cadeia primária do peptídeo. Assim, muitos peptídeos que ocorrem naturalmente são denominados "glicopeptídeos". A capacidade de variação do padrão de glicosilação de qualquer dado peptídeo possui enormes implicações para a função daquele peptídeo. Por exemplo, a estrutura dos glicanos ligados em N em um peptídeo pode impactar várias características do peptídeo, incluindo a suscetibilidade a protease, tráfego intracelular, secreção, tecido alvo, meia vida biológica e antigenicidade do peptídeo em uma célula ou organismo. A alteração de uma ou mais destas características afeta muito a eficácia de um peptídeo em seu ajuste natural e também afeta a eficácia do peptídeo como um agente terapêutico em situações onde o peptídeo foi gerado para aquele fim.
[002] A estrutura do carboidrato anexada à cadeia de peptídeo é conhecida como uma molécula "glicano". A estrutura do glicano específico presente em um peptídeo afeta as características de solubilidade e agregação do peptídeo, a dobra da cadeia primária de peptídeo e, portanto, sua atividade funcional ou enzimática, a resistência do peptídeo ao ataque proteolítico e o controle de proteólise conduzindo a conversão de formas inativas do peptídeo em formas ativas. De modo importante, os resíduos de ácido siálico terminais presentes na molécula de glicano afetam o período da meia vida do peptídeo no sistema circulatório dos mamíferos. Os peptídeos cujos glicanos não contém resíduos de ácido siálico são rapidamente removidos da circulação pelo fígado, um evento que nega qualquer benefício terapêutico em potencial do peptídeo.
[003] As estruturas de glicano encontradas em glicopeptídeos que ocorrem naturalmente são tipicamente divididas em duas classes, os glicanos ligados em N e ligados em O.
[004] Os peptídeos expressos nas células eucarióticas são tipicamente N-glicosilados em resíduos de asparagina nos sítios na estrutura primária de peptídeo contendo a seqüência asparagina-X-serina/treonina, onde X pode se qualquer aminoácido, exceto prolina e ácido aspártico. A porção de carboidrato de tais peptídeos é conhecida como glicano ligado em N. Os eventos precedentes da N- glicosilação ocorrem no retículo endoplasmático (ER) e são idênticos em mamíferos, plantas, insetos e outros eucariotes maiores. Primeiro, uma cadeia de oligossacarídeo compreendendo quatorze resíduos de açúcar é construída em uma molécula transportadora de lipídeo. Como o peptídeo nascente é transportado e translocado para o ER, toda a cadeia de oligossacarídeo é transferida para o grupo amido do resíduo de asparagina em uma reação catalisada por uma enzima de glicosiltransferase ligada a membrana. O glicano ligado em N é adicionalmente processado em ambos no ER e no aparelho de Golgi. O processamento adicional geralmente tenta a remoção de algum dos resíduos de açúcar e adição de outros resíduos de açúcar nas reações catalisadas por glicosilases e glicosiltransferases específicas para os resíduos de açúcar removidos e adicionados.
[005] Tipicamente, as estruturas finais dos glicanos ligados em N dependem do organismo no qual o peptídeo é produzido. Por exemplo, em geral, os peptídeos produzidos na bactéria são completamente não glicosilados. Os peptídeos expressos nas células de inseto contêm manose superior, cadeias de oligossacarídeo ligadas em N paunci- manose, entre outras. Os peptídeos produzidos na cultura de células de mamíferos são geralmente glicosilados de forma diferente, dependendo, por exemplo, das espécies e condições de cultura de célula. Mesmo nas mesmas espécies e sob as mesmas condições, uma determinada quantidade de heterogeneidade na cadeia de glicosila é algumas vezes encontrada. Adicionalmente, os peptídeos produzidos nas células de plantas compreendem estruturas de glicano que diferem significativamente daquelas produzidas nas células animais. O dilema na técnica de produção dos peptídeos recombinantes, especificamente quando os peptídeos devem ser usados como agentes terapêuticos é ser capaz de gerar peptídeos que são corretamente glicosilados, isto é, são capazes de gerar um peptídeo possuindo uma estrutura de glicano que lembra ou é idêntica aquela presente na forma que ocorre naturalmente do peptídeo. A maior parte dos peptídeos produzidos por meios recombinantes compreende estrutura de glicano que são diferentes daqueles glicanos que ocorrem naturalmente.
[006] Vários processos foram propostos na técnica para padronizar o padrão de glicosilação de um peptídeo incluindo aqueles descritos em WO 99/22764, WO 98/58964, WO 99/54342 e patente US número 5.047.335, entre outros. Essencialmente, muitas das enzimas necessárias para glicosilação in vitro dos peptídeos foram clonadas e sequenciadas. Em alguns casos, estas enzimas foram usadas in vitro para adicionar açúcares específicos a uma molécula de glicano incompleta em um peptídeo. Em outros exemplos, as células foram transformadas por engenharia genética para expressar uma combinação de enzimas e peptídeos desejados, tal que, a adição de uma porção de açúcar desejada a um peptídeo expresso ocorre dentro da célula.
[007] Os peptídeos podem também ser modificados por adição de glicanos ligados em O, também denominados glicanos do tipo mucina, devido a sua prevalência de glicopeptídeo mucinoso. Independentemente dos N-glicanos que são ligados aos resíduos de asparagina e são formados por transferência en bloc de oligosascarídeo dos intermediários ligados a lipídeo, os O-glicanos são ligados primariamente à resina e resíduos de treonina e são formados por adição em escala de açúcares dos açúcares de nucleotídeo (Tanner e outros, Biochim. Biophys. Acta. 906: 81-91 (1987); e Hounsell e outros, Glycoconj. J. 13:19-26 (1996)). A função do peptídeo pode ser afetada pela estrutura dos glicanos ligados em O, presentes nos mesmos. Por exemplo, a atividade do ligando de P-seletina é afetada pela estrutura de glicano ligado em O presente. Para uma revisão das estruturas de glicanos ligados em O, vide Schachter e Brockhausen, The Biosynthesis of Branched O- Linked Glycans, 1989, Society for Experimental Biology, pp. 1-26 (Reino Unido). Outros padrões de glicosilação são formados por ligação de glicosilfosfatidilinositol ao grupo carboxila de terminal carboxila da proteína (Takeda e outros, Trends Biochem. Sci. 20: 367-371 (1995); e Udenfriend e outros, Ann. Rev. Biochem. 64: 593-591 (1995).
[008] Embora existam várias técnicas atualmente para modificar os glicanos ligados em N dos peptídeos, existe na técnica a necessidade de um processo geralmente aplicável para produção de peptídeos possuindo um padrão de glicosilação desejado, isto é, padronizado. Existe a necessidade específica na técnica para padronização de glicosilação in vitro de peptídeos, onde o peptídeo resultante pode ser produzido em escala industrial. Estas e outras necessidades são satisfeitas pela presente invenção.
[009] A administração de peptídeos glicosilados e não glicosilados para transformação por engenharia de uma resposta fisiológica específica é bem conhecido nas artes medicinais. Entre os peptídeos melhor conhecidos utilizados para esta finalidade encontra-se a insulina, que é usada para tratar diabetes. As enzimas também foram usadas por seus benefícios terapêuticos. Um fator maior, que tem limitado o uso dos peptídeos terapêuticos é a natureza imunogênica da maior parte dos peptídeos. Em um paciente, uma resposta imunogênica a um peptídeo administrado pode neutralizar o peptídeo e/ou conduzir ao desenvolvimento de uma resposta alérgica no paciente. Outras deficiências dos peptídeos terapêuticos incluem potência subótima e razões de limpeza rápidas. Os problemas inerentes aos terapêuticos de peptídeos são reconhecidos na técnica e vários processos de eliminação de problemas foram investigados. Para prover terapêuticas de peptídeo solúvel, os polímeros sintéticos foram anexados à estrutura de peptídeo.
[0010] O poli(etileno glicol) ("PEG") é um polímero exemplar que foi conjugado aos peptídeos. O uso de PEG para derivatizar terapêuticas de peptídeo foi demonstrado como reduzindo a imunogenicidade dos peptídeos e prolongando o tempo de limpeza da circulação. Por exemplo, a Patente US número 4.179.337 (Davis e outros) refere-se aos peptídeos não imunogênicos, tais como, enzimas e hormônios de peptídeo acoplados ao polietileno glicol (PEG) ou polipropileno glicol. Entre 10 e 100 moles de polímero são usados por mol de peptídeo e pelo menos 15% da atividade fisiológica são mantidos.
[0011] O WO 93/15189 (Veronese e outros) se refere a um processo para manter a atividade das enzimas proteolíticas modificadas por polietileno glicol por ligação da enzima proteolítica a um inibidor macromolecularizado. Os conjugados destinam-se a aplicações médicas.
[0012] O modo principal de anexação de PEG e seus derivados aos peptídeos é uma ligação não específica através de um resíduo de aminoácido de peptídeo. Por exemplo, a Patente US número 4.088.538 revela um conjugado de enzima de polímero enzimaticamente ativo de uma enzima covalentemente ligada ao PEG. De modo semelhante, a Patente US número 4.496.689 revela um complexo covalentemente ligado, de inibidor de α-1 protease com um polímero, tal como PEG ou metóxipoli(etileno glicol) ("mPEG"). Abuchowski e outros (J. Biol. Chem. 252:3578 (1977) revela a anexação covalente de um mPEG a um grupo amina de albumina de soro humano. A Patente US número 4.414.147 revela um processo de tornar o interferon menos hidrófobo por conjugação do mesmo a um anidrido de um ácido dicarboxílico, tal como poli(anidrido etileno succínico). O PCT WO 87/00056 revela conjugação de PEG e polióis poli(oxietilados) a proteínas, tais como, β-interferon, interleucina-2 e imunotoxinas. A EP 154.316 revela e reivindica linfocinas modificadas quimicamente, tais como, PEG contendo IL-2 ligado diretamente a pelo menos um grupo amino primário de linfocina. A Patente US número 4.055.635 revela composições farmacêuticas de um complexo solúvel em água de uma enzima proteolítica ligada covalentemente a uma substância polimérica, tal como, polissacarídeo.
[0013] Outro modo de anexação de PEG aos peptídeos é através da oxidação não específica dos resíduos de glicosila em um peptídeo. O açúcar oxidado é utilizado como um local para anexação de uma porção PEG ao peptídeo. Por exemplo, M'Timkulu (WO 94/05332) revela o uso de uma hidrazina- ou amino-PEG para adicionar PEG a uma glicoproteína. As porções glicosila são aleatoriamente oxidadas nos aldeídos correspondentes, que são subseqüentemente acoplados ao amino-PEG.
[0014] Em cada um dos processos descritos acima, poli(etileno glicol) é adicionado de uma maneira aleatória, não específica, aos resíduos reativos em uma estrutura de peptídeo. Para a produção de peptídeos terapêuticos, é claramente desejável utilizar uma estratégia de derivatização que resulta na formação de um produto especificamente rotulado, prontamente caracterizável e essencialmente homogêneo.
[0015] Duas classes principais de enzima são usadas na síntese dos carboidratos, glicosiltransferases (por exemplo, sialiltransferases, oligosacariltransferases, N- acetilglicosaminiltransferases) e glicosidases. As glicosidases são adicionalmente classificadas como exoglicosidades (por exemplo, β-manosidase, β-glicosidase) e endoglicosidases (por exemplo, Endo-A, Endo-M). Cada uma dessas classes de enzimas foi usada com sucesso sinteticamente para preparar carboidratos. Para uma revisão geral, vide Crout e outros, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98111 (1998).
[0016] As glicosiltransferases modificam as estruturas de oligossacarídeo nos peptídeos. As glicosiltransferases são eficazes na produção de produtos específicos com bom controle estereoquímico e regioquímico. As glicosiltransferases foram usadas para preparar oligossacarídeos e para modificar estruturas de carboidratos ligados ao terminal N e O, especificamente nos peptídeos produzidos em células de mamíferos. Por exemplo, os oligossacarídeos terminais de glicopeptídeos foram completamente sialilados e/ou fucosilados para prover estruturas de açúcar mais consistentes, que aperfeiçoam a farmacodinâmica do glicopeptídeo e uma variedade de outras propriedades biológicas. Por exemplo, β-1,4- galactosiltransferase é usada para sintetizar lactosamina, uma ilustração da utilidade de glicosiltransferases na síntese dos carboidratos (vide, por exemplo, Wong e outros, J. Org Chem. 47: 5416-5418 (1982)). Além disto, vários procedimentos sintéticos usaram α-sialiltransferases para transferir ácido siálico do ácido citidina-5'-monofosfo-N- acetilneuramínico para 3-OH ou 6-OH de galactose (vide, Kevin e outros, Chem. Eur. J. 2: 1359-1362 (1996)). Fucosiltransferases são usadas nas passagens sintéticas para transferir uma unidade de fucose de guanosina-5'- difosfofucose para uma hidroxila específica de um aceitador de sacarídeo. Por exemplo, Ichikawa preparou Sialil Lewis-X por um processo que envolve a fucosilação de lactosamina sialilada com uma fucosiltransferase clonada (Ichikawa e outros, J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992)). Para uma discussão de avanços recentes na síntese de glicoconjugado para uso terapêutico, vide Koeller e outros, Nature Biotechnology 18: 835-841 (2000). Vide também, patentes US números 5.876.980; 6.030.815; 5.728.554; 5.922.577; e WO/9831826.
[0017] As glicosidases também podem ser usadas para preparar sacarídeos. Glicosidases normalmente catalisam a hidrólise de uma ligação glicosídica. Contudo, sob condições apropriadas, elas podem ser usadas para formar essa ligação. A maior parte das glicosidases usadas para síntese de carboidrato são exoglicosidases; a transferência de glicosila ocorre no término de não redução do substrato. A glicosidase liga um doador de glicosila em um intermediário de glicosil-enzima que é tanto interceptado por água para render o produto de hidrólise, quanto por um aceitador, para gerar um novo glicosídeo ou oligossacarídeo. Uma passagem exemplar usando uma exoglicosidase na síntese de trissacarídeo de núcleo de todos os glicopeptídeos ligados em N, incluindo a ligação β-manosido, que é formada por ação de β-manosidase (Singh e outros, Chem. Commun. 993-994 (1996)).
[0018] Em outra aplicação exemplar do uso de uma glicosidase para formar uma ligação glicosídica, uma glicosidase mutante foi preparada, onde o aminoácido nucleófilo normal dentro do sítio ativo é alterado para um aminoácido não nucleófilo. A enzima mutante não hidroliza ligações glicosídicas, porém pode ainda formar as mesmas. Tal glicosidase mutante é suada para preparar oligossacarídeos usando um doador de a-glicosil fluoreto e uma molécula aceitadora de glicosídeo (Whithers e outros, Patente US número 5.716.812).
[0019] Embora o seu uso seja menos comum do que o das exoglicosidases, as endoglicosidases são também utilizadas para preparar carboidratos. Os processos com base no uso de endoglicosidases possuem a vantagem de que um oligossacarídeo, ao invés de um monossacarídeo é transferido. Os fragmentos de oligossacarídeo foram adicionados aos substratos usando endo-β-N- acetilglicosaminas tais como, endo-F, endo-M (Wang e outros, Tetrahedron Lett. 37:1975-1978) e Haneda e outros, Carbohyd. Res. 292: 61-70 (1996)).
[0020] Além do seu uso na preparação dos carboidratos, as enzimas discutidas acima são aplicadas a síntese dos glicopeptídeos. A síntese de uma glicoforma de ribonuclease B foi publicada (Witte K. e outros, J. Am. Chem. Soc. 119: 2114-2118 (1997)). O núcleo de manose alto de ribonuclease B foi clivado por tratamento do glicopeptídeo com endoglicosidase H. A clivagem ocorreu especificamente entre os dois resíduos de GlcNAc de núcleo. O tetrassacarídeo sialila Lewis X foi então enzimaticamente reconstruído no sítio de ancoramento GlcNAc restante na proteína agora homogênea por uso seqüencial de β-1,4- galactosiltransferase, α-2,3-sialiltransferase e α-1,3- fucosiltransferase V. Contudo, embora cada etapa enzimaticamente catalisada prosseguisse com excelente rendimento, tais procedimentos não se adaptaram a geração de glicopeptídeos em escala industrial.
[0021] Os processos que combinam elementos sintéticos químicos e enzimáticos também são conhecidos na técnica. Por exemplo, Yamamoto e colaboradores (Carbohydr. Res. 305: 415-422 (1998)) reportaram a síntese quimioenzimática do glicopeptídeo, peptídeo T glicosilado, usando uma endoglicosidase. O peptídeo N-acetilglicosaminila foi sintetizado por meios puramente químicos. O peptídeo foi subsequente e enzimaticamente elaborado com o oligossacarídeo do peptídeo de transferrina humana. A porção de sacarídeo foi adicionada ao peptídeo por tratamento com uma endo-β-N-acetilgicosaminidase. O peptídeo glicosilado resultante era altamente estável e resistente a proteólise quando comparado ao peptídeo T e peptídeo T de N-acetilglicosaminila.
[0022] O uso de glicosiltransferases para modificar a estrutura de peptídeo com grupos repórter foi explorado. Por exemplo, Brossmer e outros (Patente US número 5.405.753) revela a formação de monofosfato de citidina rotulado fluorescente ("CMP") derivado de ácido siálico e o uso de glicosídeo fluorescente em um ensaio para atividade de sialil transferase e para rotulação fluorescente de superfícies de célula, glicoprotéinas e peptídeos. Gross e outros (Analyt. Biochem. 186: 127 (1990)) descrevem um ensaio semelhante. Bean e outros (Patente US número 5.432.059) revela um ensaio para distúrbios de deficiência de glicosilação utilizando reglicosilação de uma proteína glicosilada de forma deficiente. A proteína deficiente é reglicosilada com um glicosídeo de CMP rotulado fluorescente. Cada um dos derivados de ácido siálico fluorescente é substituído com a porção fluorescente tanto na posição 9 quanto na amina que é normalmente acetilada em ácido siálico. Os processos usando os derivados de ácido siálico fluorescente são ensaios quanto a presença de glicosiltransferases ou para glicoproteínas glicosiladas impropriamente ou não glicosiladas. Os ensaios são conduzidos em pequenas quantidades de enzima ou glicoproteína em uma amostra de origem biológica. A derivatização enzimática de um peptídeo glicosilado ou não glicosilado em uma escala de preparação ou industrial usando um ácido siálico modificado não foi revelada ou sugerida na técnica anterior.
[0023] Esforço considerável foi também direcionado para a modificação de superfícies de célula por alterar os resíduos de glicosila apresentados por aquelas superfícies. Por exemplo, Fukuda e colaboradores desenvolveram um processo para anexação de glicosídeos de estrutura definitiva nas superfícies das células. O processo explora a especificidade de substrato relaxado de uma fucosiltransferase que pode transferir fucose e análogos de fucose portando substratos de glicosila diversos (Tsuboi e outros, J. Biol. Chem. 271: 27213 91996)).
[0024] Os processos enzimáticos foram também usados para ativar resíduos de glicosila em um glicopeptídeo na direção da elaboração química subsequente. Os resíduos de glicosila são tipicamente ativados usando galactose oxidase, que converter um resíduo de galactose terminal no aldeído correspondente. O aldeído é subseqüentemente acoplado ao grupo de modificação contendo amino. Por exemplo, Cesares e outros (Nature Biotech. 19: 142(2001)) anexaram doxorubicina aos resíduos de galactose oxidados de uma quimera de peptídeo MHCII recombinante.
[0025] Os resíduos de glicosila também foram modificados para conter grupos cetona. Por exemplo, Mahal e colaboradores (Science 276: 1125 (1997)) prepararam manosamina N-levulinoila ("ManLev"), que possui uma funcionalidade de cetona na posição normalmente ocupada pelo grupo acetila no substrato natural. As células foram tratadas com ManLev, desta forma incorporando um grupo cetona na superfície da célula. Vide, também, Saxon e outros, Science 287: 2007 (2000); Hang e outros, J. Am. Chem. Soc. 123: 1242(2001); Yarema e outros, J. Biol. Chem. 273: 31168 (1998); e Charter e outros, Glycobiology 10: 1049 (2000).
[0026] Os processos de modificação das superfícies de células não foram aplicados na ausência de uma célula para modificar um peptídeo glicosilado ou não glicosilado. Adicionalmente, os processos de uma modificação de superfície de célula não são utilizados para a incorporação enzimática pré-formada de uma porção de doador de glicosila modificado em um peptídeo. Além disso, nenhum dos processos de modificação de superfície de célula é prático para produzir peptídeos modificados por glicosila em uma escala industrial.
[0027] A despeito dos esforços direcionados para a elaboração enzimática das estruturas de sacarídeo, ainda permanece a necessidade de um processo industrialmente prático para modificação de peptídeos glicosilados e não glicosilados com grupos de modificação, tais como, polímeros solúveis em água, porções terapêuticas, biomoléculas e semelhantes. São de interesse específico os processos nos quais o peptídeo modificado possui propriedades aperfeiçoadas, que melhoram seu uso como agente terapêutico ou de diagnóstico. A presente invenção preenche estas e outras necessidades.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0028] A invenção inclui vários processos de remodelagem de um peptídeo para ter uma estrutura glicano específica anexada ao mesmo. Embora estruturas de glicano específicas sejam descritas aqui, a invenção não seria construída como sendo limitada a qualquer uma estrutura específica. Além disso, embora peptídeos específicos sejam descritos aqui, a invenção não seria limitada pela natureza do peptídeo descrito, porém ao invés disto englobaria quaisquer e todos peptídeos e variações dos mesmos.
[0029] A descrição que se segue revela as modalidades preferidas da invenção e provê uma descrição por escrito das reivindicações aqui apensas. A invenção engloba quaisquer e todas variações destas modalidades que encontram-se ou tornam-se aparentes após uma leitura da presente descrição.
[0030] A invenção inclui um processo in vitro, isento de célula, de remodelagem de um peptídeo possuindo a
Figure img0001
fórmula: onde: AA é um resíduo de aminoácido de término ou interno do peptídeo; X1-X2 é um sacarídeo covalentemente ligado ao AA, onde X1 é um primeiro resíduo de glicosila; e X2 é um segundo resíduo de glicosila covalentemente ligado a X1, onde X1 e X2 são selecionados de resíduos de monosacarila e oligosacarila. O processo compreende: (a) remoção de X2 ou uma subunidade de sacarila do mesmo a partir do peptídeo, desta forma formando um glicano truncado; e (b) contato do glicano truncado com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila em condições apropriadas para transferir pelo menos um doador de glicosila para o glicano truncado, desta forma remodelando o peptídeo.
[0031] Em um aspecto, o processo compreende, adicionalmente: (c) remoção de X1, desta forma desta forma expondo o AA; e (d) contato de AA com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila em condições apropriadas para transferir pelo menos um doador de glicosila para o AA, desta forma remodelando o peptídeo.
[0032] Em outro aspecto, o processo compreende, adicionalmente: (e) antes da etapa (b), remoção de um grupo adicionado ao sacarídeo durante modificação pós translacional.
[0033] Em outra modalidade, o grupo é um elemento selecionado de fosfato, sulfato, carboxilato e ésteres dos mesmos.
[0034] Em outra modalidade, o peptídeo possui a fórmula:
Figure img0002
onde: Z é um elemento selecionado de 0, S, NH e um reticulador.
[0035] Pelo menos um dos doadores de glicosila compreende um grupo de modificação e o grupo de modificação pode ser um elemento selecionado do grupo consistindo em um polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, um rótulo detectável, um grupo ligante reativo e uma porção direcional ou direcional. Preferivelmente, o grupo de modificação é um polímero solúvel em água e, mais preferivelmente, o polímero solúvel em água compreende poli (etileno glicol). Mesmo mais preferivelmente, o poli (etileno glicol) possui uma distribuição de peso molecular que é essencialmente homodispersa.
[0036] Nesta e em várias outras modalidades, o peptídeo pode ser selecionado do grupo consistindo em fator de estimulação de colônia de granulócito, alfa-interferon, beta-interferon, Fator VIIa, Fator IX, hormônio de estimulação do folículo, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, gama- interferon, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, proteína ativadora de plasminogênio de tecido, interleucina-2, Fator VIII, receptor de fator de necrose tumoral quimérico, uroquinase, anticorpo anti-glicoproteína IIb/IIIa quimérico, anticorpo anti-HER2 quimérico, anticorpo anti-vírus sincicial respiratório quimérico, anticorpo anti-CD20 quimérico, DNase, anticorpo anti-fator de necrose tumoral quimérico, insulina humana, hepatite B sAg e hormônio do crescimento humano.
[0037] Também está incluído nesta invenção um processo in vitro, isento de célula, de remodelagem de um peptídeo possuindo a fórmula:
Figure img0003
onde, X3, X4, X5, X6, X7 e X17 são independentemente resíduos de monosacarila ou oligosacarila selecionados; e a, b, c, d, e e x são independentemente selecionados dos inteiros 0, 1 e 2, contanto que pelo menos um elemento selecionado de a, b, c, d, e e x seja 1 ou 2; o processo compreendendo: (a) remoção de pelo menos um de X3, X4, X5, X6, X7 ou X17, ou uma subunidade de sacarila do mesmo a partir do peptídeo, desta forma formando um glicano truncado; e (b) contato do glicano truncado com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila em condições apropriadas para transferir pelo menos um doador de glicosila para o glicano truncado, desta forma remodelando o peptídeo.
[0038] Em um aspecto, a remoção da etapa (a) produz um glicano truncado no qual a, b, c e e x são cada um 0.
[0039] Em outro aspecto, X3, X5 e X7 são selecionados do grupo consistindo em(manose)z e (manose)z-(X8)y onde X8 é uma porção glicosila selecionada de mono e oligo-sacarídeos; y é um inteiro selecionado de 0 e 1; e z é um inteiro entre 1 e 20, onde quando z é 3 ou mais, (manose)z é selecionada de estruturas lineares ou ramificadas.
[0040] Ainda em outro aspecto, X4 é selecionado do grupo consistindo em GlcNAc e xilose. Em um aspecto adicional, onde X3, X5 e X7 são (manose)u, onde u é selecionado dos inteiros entre 1 e 20 e quando u é 3 ou mais, (manose)u é selecionada de estruturas lineares e ramificadas.
[0041] Pelo menos um dos doadores de glicosila compreende um grupo de modificação e o grupo de modificação é um elemento selecionado do grupo consistindo em um polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, um rótulo detectável, um grupo ligante reativo e uma porção direcional ou direcional. Preferivelmente, o grupo de modificação é um polímero solúvel em água e, mais preferivelmente, o polímero solúvel em água compreende poli (etileno glicol). Mesmo mais preferivelmente, o poli (etileno glicol) possui uma distribuição de peso molecular que é essencialmente homodispersa.
[0042] Além disso, o peptídeo pode ser selecionado do grupo consistindo em fator de estimulação de colônia de granulócito, alfa-interferon, beta-interferon, Fator VIIa, Fator IX, hormônio de estimulação do folículo eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, gama-interferon, inibidor de alfa-1- protease, beta-glicosidase, proteína ativadora de plasminogênio de tecido, interleucina-2, Fator VIII, receptor de fator de necrose tumoral quimérico, uroquinase, anticorpo anti-glicoproteína IIb/IIIa quimérico, anticorpo anti-HER2 quimérico, anticorpo anti-vírus sincicial respiratório quimérico, anticorpo anti-CD20 quimérico, DNase, anticorpo anti-fator de necrose tumoral quimérico, insulina humana, hepatite B sAg e hormônio do crescimento humano.
[0043] Também encontra-se incluído um processo in vitro, isento de célula, de remodelagem de um peptídeo compreendendo um glicano possuindo a fórmula:
Figure img0004
onde: r, s e t são inteiros independentemente selecionados de 0 e 1. O processo compreende: (a) contato do peptídeo com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila em condições apropriadas para transferir pelo menos um doador de glicosila para o glicano, desta forma remodelando o peptídeo.
[0044] Em uma modalidade preferida, pelo menos um dos doadores de glicosila compreende um grupo de modificação e o grupo de modificação é um elemento selecionado do grupo consistindo em um polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, um rótulo detectável, um grupo ligante reativo e uma porção direcional. Preferivelmente, o grupo de modificação é um polímero solúvel em água e, mais preferivelmente, o polímero solúvel em água compreende poli (etileno glicol). Mesmo mais preferivelmente, o poli (etileno glicol) possui uma distribuição de peso molecular que é essencialmente homodispersa.
[0045] Adicionalmente, o peptídeo pode ser selecionado do grupo consistindo em fator de estimulação de colônia de granulócito, alfa-interferon, beta-interferon, Fator VIIa, Fator IX, hormônio de estimulação do folículo eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, gama-interferon, inibidor de alfa-1- protease, beta-glicosidase, proteína ativadora de plasminogênio de tecido, interleucina-2, Fator VIII, receptor de fator de necrose tumoral quimérico, uroquinase, anticorpo anti-glicoproteína IIb/IIIa quimérico, anticorpo anti-HER2 quimérico, anticorpo anti-vírus sincicial respiratório quimérico, anticorpo anti-CD20 quimérico, DNase, anticorpo anti-fator de necrose tumoral quimérico, insulina humana, hepatite B sAg e hormônio do crescimento humano.
[0046] Ainda em outro aspecto, o peptídeo possui a (X’k
Figure img0005
fórmula: onde X9 e X10 são independentemente resíduos de monosacarila ou oligosacarila selecionados; e m, n e f são inteiros selecionados de 0 e 1. Em outro aspecto, o peptídeo possui a fórmula:
Figure img0006
onde: X11 e X12 são porções glicosila selecionadas independentemente; e r e x são inteiros independentemente selecionados de 0 e 1.
[0047] Em uma modalidade preferida, X11 e X12 são (manose)q, onde q é selecionado dos inteiros entre 1 e 20 e quando q é três ou mais, (manose)q é selecionada de estruturas lineares e ramificadas.
[0048] Em outro aspecto, o peptídeo possui a fórmula:
Figure img0007
onde X13, X14 e X15 são resíduos de glicosila selecionados independentemente; e g, h, i, j, k e p são independentemente selecionados dos inteiros 0 e 1, contanto que pelo menos um de g, h, i, j, k e p seja 1.
[0049] Em uma modalidade deste aspecto da invenção, X14 e X15 são elementos independentemente selecionados de GlcNAc e Sia; e i e k são independentemente selecionados dos inteiros 0 e 1, contanto que pelo menos um de i e k seja 1 e se k for 1, g, h e j sejam 0.
[0050] Em outro aspecto da invenção o peptídeo possui a fórmula:
Figure img0008
onde X16 é um elemento selecionado de:
Figure img0009
onde s, u e i são independentemente selecionados dos inteiros 0 e 1.
[0051] Em uma modalidade da invenção a remoção utiliza uma glicosidase.
[0052] Também está incluído na invenção um processo in vitro, isento de célula de remodelagem de um peptídeo possuindo a fórmula:
Figure img0010
onde: AA é um resíduo de aminoácido de término ou interno do peptídeo; X1 é um resíduo de glicosila covalentemente ligado ao AA, selecionado de resíduos de monosacarila e oligosacarila; e u é um inteiro selecionado de 0 e 1 O processo compreende: contato do peptídeo com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila em condições apropriadas para transferir pelo menos um doador de glicosila para o glicano truncado, onde o doador de glicosila compreende um grupo de modificação, desta forma remodelando o peptídeo.
[0053] Em uma modalidade preferida, pelo menos um dos doadores de glicosila compreende um grupo de modificação, o grupo de modificação pode ser um elemento selecionado do grupo consistindo em um polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, um rótulo detectável, um grupo ligante reativo e uma porção direcional. Preferivelmente, o grupo de modificação é um polímero solúvel em água e, mais preferivelmente, o polímero solúvel em água compreende poli (etileno glicol). Mesmo mais preferivelmente, o poli (etileno glicol) possui uma distribuição de peso molecular que é essencialmente homodispersa.
[0054] Além disto, o peptídeo pode ser selecionado do grupo consistindo em fator de estimulação de colônia de granulócito, alfa-interferon, beta-interferon, Fator VIIa, Fator IX, hormônio de estimulação do folículo, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, gama-interferon, inibidor de alfa-1- protease, beta-glicosidase, proteína ativadora de plasminogênio de tecido, interleucina-2, Fator VIII, receptor de fator de necrose tumoral quimérico, uroquinase, anticorpo anti-glicoproteína IIb/IIIa quimérico, anticorpo anti-HER2 quimérico, anticorpo anti-vírus sincicial respiratório quimérico, anticorpo anti-CD20 quimérico, DNase, anticorpo anti-fator de necrose tumoral quimérico, insulina humana, hepatite B sAg e hormônio do crescimento humano.
[0055] A invenção inclui, adicionalmente, um conjugado covalente entre um peptídeo e um grupo de modificação que altera a propriedade do peptídeo, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo em um resíduo de glicosila ou aminoácido pré-selecionado peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto.
[0056] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado do grupo consistindo em um polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, um rótulo detectável, um grupo ligante reativo e uma porção direcional.
[0057] Em outro aspecto, o grupo de modificação e um precursor de grupo de ligação glicosila intacto são ligados como uma unidade anexada covalentemente ao peptídeo através da ação de uma enzima, a enzima convertendo o precursor no grupo de ligação glicosila intacto, desta forma formando o conjugado.
[0058] O conjugado covalente da invenção compreende: um primeiro grupo de modificação ligado covalentemente ao primeiro resíduo do peptídeo através de um primeiro grupo de ligação glicosila intacto e um segundo grupo de ligação glicosila ligado a um segundo resíduo do peptídeo através de um segundo grupo de ligação glicosila intacto.
[0059] Em uma modalidade, o primeiro resíduo e o segundo resíduo são estruturalmente idênticos. Em outra modalidade, o primeiro resíduo e o segundo resíduo possuem estruturas diferentes. Em uma modalidade adicional, o primeiro resíduo e o segundo resíduo são resíduos de glicosila. Em uma outra modalidade, o primeiro resíduo e o segundo resíduo são resíduos de aminoácido.
[0060] Ainda em outra modalidade, o peptídeo é remodelado antes de formar o conjugado. Preferivelmente, o peptídeo é remodelado para introduzir uma porção de aceitação para o grupo de ligação glicosila intacto.
[0061] Ainda em outra modalidade, o grupo de modificação é um polímero solúvel em água que pode compreender poli (etileno glicol), que em outra modalidade pode ter uma distribuição de peso molecular que é essencialmente homodispersa.
[0062] Ainda em uma modalidade adicional, o peptídeo é selecionado do grupo consistindo em fator de estimulação de colônia de granulócito, alfa-interferon, beta-interferon, Fator VIIa, Fator IX, hormônio de estimulação do folículo, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, gama-interferon, inibidor de alfa-1- protease, beta-glicosidase, proteína ativadora de plasminogênio de tecido, interleucina-2, Fator VIII, receptor de fator de necrose tumoral quimérico, uroquinase, anticorpo anti-glicoproteína IIb/IIIa quimérico, anticorpo anti-HER2 quimérico, anticorpo anti-vírus sincicial respiratório quimérico, anticorpo anti-CD20 quimérico, DNase, anticorpo anti-fator de necrose tumoral quimérico, insulina humana, hepatite B sAg e hormônio do crescimento humano.
[0063] Em outra modalidade, a unidade de ligação de glicosila intacta é um elemento selecionado do grupo consistindo em um resíduo de ácido siálico, um resíduo de Gal, um resíduo de GlcNAc e um resíduo de GalNAc.
[0064] É também provido na invenção, um processo de formação de um conjugado covalente entre um polímero e um peptídeo glicosilado ou peptídeo não glicosilado, onde o polímero é conjugado ao peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, interposto entre e covalentemente ligado a ambos o peptídeo e o polímero, o processo compreende contato do peptídeo com uma mistura compreendendo um açúcar de nucleotídeo covalentemente ligado ao polímero e a glicosiltransferase para a qual o açúcar de nucleotídeo é um substrato em condições suficientes para formar o conjugado.
[0065] Em uma modalidade preferida, o polímero é um polímero solúvel em água. Em outra modalidade preferida, o grupo de ligação glicosila é ligado covalentemente a um resíduo de glicosila ligado covalentemente ao peptídeo e em outra modalidade, o grupo de ligação glicosila é ligado covalentemente a um resíduo de aminoácido do peptídeo.
[0066] Ainda em uma modalidade adicional, o polímero compreende um elemento selecionado do grupo consistindo em um óxido de polialquileno e a um polipeptídeo. O óxido de polialquileno pode ser óxido de polialquileno é poli (etileno glicol) em uma modalidade da invenção. Em outra modalidade, o poli (etileno glicol) possui um grau de polimerização de cerca de 1 a cerca de 20.000, preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 5.000 ou também preferivelmente, o polietileno glicol possui um grau de polimerização de cerca de 1 a cerca de 1.000.
[0067] Em outra modalidade, a glicosiltransferase é selecionada do grupo consistindo em sialiltransferase, galactosiltransferase, glicosiltransferase, transferase GalNAc, transferase GlcNAc, fucosiltransferase e manosiltransferase. Em uma modalidade, a glicosiltransferase é produzida recombinantemente e em outra modalidade, a glicosiltransferase é uma enzima procariótica recombinante ou uma enzima eucariótica recombinante.
[0068] Ainda em uma modalidade adicional, o açúcar de nucleotídeo é selecionado do grupo consistindo em UDP- glicosídeo, CMP-glicosídeo e GDP-glicosídeo e é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em UDP- galactose, UDP-galactosamina, UDP-glicose, UDP-glicosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, UDP-N-acetilglicosamina, GDP- manose, GDP-fucose, CMP-ácido siálico, CMP-NeuAc.
[0069] Em outra modalidade, o peptídeo é um agente terapêutico.
[0070] Ainda em outra modalidade, o peptídeo glicosilado é parcialmente desglicosilado antes do contato.
[0071] Em uma modalidade adicional, o grupo de ligação glicosila intacto é um resíduo de ácido siálico.
[0072] Adicionalmente, o processo pode ser realizado em um ambiente isento de célula.
[0073] E, em outra modalidade, o conjugado covalente pode ser isolado e preferivelmente, o conjugado covalente é isolado por filtração de membrana.
[0074] Também é provido um processo para formação de conjugado covalente entre um primeiro peptídeo glicosilado ou não glicosilado e um segundo peptídeo glicosilado ou não glicosilado coligado por uma porção de ligação, onde: a porção de ligação é conjugada ao primeiro peptídeo através de um primeiro grupo de ligação glicosila intacto, interposto entre e covalentemente ligado a ambos o primeiro peptídeo e a porção de ligação; e a porção de ligação é conjugada ao segundo peptídeo através de um segundo grupo de ligação glicosila intacto, interposto entre e covalentemente ligado a ambos o segundo peptídeo e a porção de ligação. O processo compreende: (a) contato do primeiro peptídeo com um derivado do precursor de porção de ligação compreendendo um precursor do primeiro grupo de ligação glicosila intacto e um precursor do segundo grupo de ligação glicosila intacto; (b) contato da mistura de (a) com uma glicosil transferase para a qual o precursor do primeiro grupo de ligação glicosila é um substrato, em condições suficientes para converter o precursor do primeiro grupo de ligação glicosila intacto no primeiro grupo de ligação glicosila intacto, desta forma formando um primeiro conjugado entre o precursor de porção de ligação e o primeiro peptídeo; (c) contato do primeiro conjugado com o segundo peptídeo e a glicosil transferase para a qual o precursor do segundo grupo glicosila intacto é um substrato em condições suficientes para converter o precursor do segundo grupo de ligação glicosila intacto, no segundo grupo de ligação glicosila, desta forma formando o conjugado entre a porção de ligação e o primeiro peptídeo glicosilado ou não glicosilado e o segundo peptídeo glicosilado ou não glicosilado.
[0075] Em um aspecto, a porção de ligação compreende um polímero solúvel em água e em uma modalidade, o polímero solúvel em água compreende poli (etileno glicol).
[0076] Também é provido um processo para formação de conjugado covalente entre um primeiro peptídeo glicosilado ou não glicosilado e um segundo peptídeo glicosilado ou não glicosilado coligado por uma porção de ligação, onde: a porção de ligação é covalentemente conjugada ao primeiro peptídeo, e a porção de ligação é conjugada ao segundo peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, interposto entre e covalentemente ligado a ambos o segundo peptídeo e a porção de ligação. O processo compreende: (d) contato do primeiro peptídeo com um derivado ativado da porção de ligação compreendendo; um grupo funcional reativo de reatividade complementar a um resíduo no primeiro peptídeo e um precursor do grupo de ligação glicosila intacto, em condições suficientes para formar uma ligação covalente entre o grupo funcional reativo e o resíduo, desta forma formando um primeiro conjugado; e (e) contato do primeiro conjugado com o segundo peptídeo e uma glicosiltransferase para a qual o precursor do grupo de ligação glicosila intacto é um substrato, em condições suficientes para converter o precursor do grupo de ligação glicosila intacto no grupo de ligação glicosila intacto, desta forma formando o conjugado entre o primeiro peptídeo glicosilado ou não glicosilado e o segundo peptídeo glicosilado ou não glicosilado coligados pela porção de ligação.
[0077] Em uma modalidade, a porção de ligação compreende um polímero solúvel em água, que pode ser poli (etileno glicol).
[0078] Também é provida uma composição farmacêutica compreendendo um diluente farmaceuticamente aceitável e um conjugado covalente entre um polímero e um peptídeo glicosilado ou não glicosilado, onde o polímero é conjugado ao peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, interposto entre e covalentemente ligado a ambos o peptídeo e o polímero.
[0079] A invenção inclui adicionalmente uma composição para formação de um conjugado entre um peptídeo e um açúcar modificado, a composição compreendendo: uma mistura de um açúcar modificado, glicosiltransferase e um substrato aceitador de peptídeo, onde o açúcar modificado possui um elemento selecionado de um polímero, uma porção terapêutica e uma biomolécula covalentemente ligado ao mesmo.
[0080] A invenção também inclui peptídeo remodelado usando os processos da invenção e composições farmacêuticas compreendendo os peptídeos remodelados.
[0081] Também é provido na invenção um composto possuindo a fórmula:
Figure img0011
onde: MS é um açúcar modificado compreendendo um açúcar ligado covalentemente a um grupo de modificação; Nu é um nucleosídeo; e b é um inteiro de 0 a 2.
[0082] Em um aspecto, é incluindo um composto possuindo a fórmula:
Figure img0012
onde: X, Y, Z, A e B são elementos independentemente selecionados de S, O e NH; R2l, R22, R23, R24 e R25 são elementos independentemente selecionados de H e um polímero; R26 é um elemento selecionado de H, OH e um polímero; R27 é um elemento selecionado de COO- e Na+; Nu é um nucleosídeo; e a é um inteiro de 1 a 3.
[0083] A invenção inclui, adicionalmente, um processo in vitro, isento de célula de remodelagem de um peptídeo possuindo a fórmula:
Figure img0013
onde: AA é um resíduo de aminoácido de término ou interno do peptídeo, o processo compreendendo: contato do peptídeo com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila em condições apropriadas para transferir pelo menos um doador de glicosila ao resíduo de aminoácido, onde o doador de glicosila compreende um grupo de modificação, desta forma remodelando o peptídeo.
[0084] Em cada uma das modalidades que são discutidas a seguir, esquemas de remodelagem e peptídeos são identificados unicamente para enfatizar as modalidades preferidas da invenção.
[0085] A invenção, portanto, inclui um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de G-CSF através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de G-CSF compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0014
onde: (a) b, c e e são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; d é 0; e R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose. O processo compreende: (b) contato do peptídeo de G-CSF com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto. Em uma modalidade, o processo adicional compreende: (c) antes da etapa (a), contato do peptídeo de G-CSF com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de G-CSF.
[0086] Em outra modalidade, o processo compreende adicionalmente: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo de G-CSF com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo de G-CSF.
[0087] Em outra modalidade, o processo compreende adicionalmente: (e) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[0088] Em outra modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (f) antes da etapa (a), contato do peptídeo de G-CSF com N-acetilgalactosamina transferase e um doador GalNAc em condições apropriadas para transferir GalNAc para o peptídeo de G-CSF.
[0089] Em uma modalidade adicional, o processo compreende, adicionalmente: (g) antes da etapa (a), contato do peptídeo de G-CSF com endo-N-acetilgalactosaminidase operando sinteticamente e um doador GalNAc em condições apropriadas para transferir GalNAc para o peptídeo de G-CSF.
[0090] Ainda em uma modalidade adicional, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[0091] Nas modalidades específicas, com referência a fórmula de peptídeo G-CSF apresentada acima, a, b, c e e são 0. Alternativamente, a e e são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e b, c e d são 0. Alternativamente, a, b, c, d e e são elementos independentemente selecionados de 0 e 1.
[0092] A invenção inclui, adicionalmente, um conjugado de peptídeo G-CSF, formado pelos processos descritos acima.
[0093] Também está incluído um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo alfa interferon e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao glicopeptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, o glicopeptídeo compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula selecionada de:
Figure img0015
q onde: a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, aa, bb, cc, dd e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 a 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 a 20; v, w, x, y e z são 0; e R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; R' é H, um resíduo de glicosila, um grupo de modificação, ou um glicoconjugado. O processo compreende: (a) contato do glicopeptídeo com um elemento selecionado de uma glicosiltransferase, uma endo- acetilgalactosaminidase operando sinteticamente e uma trans-sialidase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[0094] Em uma modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (b) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do glicopeptídeo.
[0095] Em outra modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (c) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[0096] Ainda em uma modalidade adicional, o processo compreende, adicionalmente: (d) antes da etapa (a) contato do glicopeptídeo com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[0097] Em uma modalidade adicional, o processo compreende, adicionalmente: (e) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do glicopeptídeo.
[0098] Ainda em outra modalidade, o processo também compreende: (f) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o glicopeptídeo.
[0099] Além disto, o processo também compreende: (g) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir galactose para o produto.
[00100] Também, o processo compreende, adicionalmente: (h) antes da etapa (b), contato do glicopeptídeo com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do glicopeptídeo.
[00101] A invenção também compreende, adicionalmente: (i) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma manosidase em condições apropriadas para remover manose do glicopeptídeo.
[00102] Além disto, o processo compreende, adicionalmente: (j) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00103] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00104] De acordo com a invenção e com relação à fórmula de peptídeo alfa-interferon revelada acima, a, b, c, d, aa e bb são 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 1 a 4; i, j, k, l, m, r, s, t, u e cc são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e n, o, p, q, v, w, x, y, z, dd e ee são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, o, p, q, s, u, v, w, x, y, z, cc, dd e ee são 0; e, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e aa e bb são 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, i, j, k, l, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; h é um elemento independentemente selecionado dos inteiros de 1 a 3; dd, v, w, x e y são 0; e aa e bb são 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, x, y e dd são 0; e, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e aa e bb são 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m e dd são 0; r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e aa e bb são 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; j, k, l, m, v, w, x, y e dd são 0; e aa e bb são 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, i, j, k, l, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; h é um elemento independentemente selecionado dos inteiros de 1 a 3; v, w, x, y e dd são 0; e aa e bb são 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, x, y e dd são 0; e, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e aa e bb são 1. Alternativamente, n, o e p são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; q é 1; e z, cc e ee são 0. Alternativamente, n e q são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e o, p, z, cc, e ee são 0. Alternativamente, n é 0 ou 1; q é 1; e o, p, z, cc e ee são 0. Alternativamente, n, o, p e f são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; q é 1; e z e ee são 0. Alternativamente, n, o, p e q são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e z, cc, e ee são 0. Alternativamente, n e q são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e o, Alternativamente, n, o, p, q, z, cc e ee são 0.
[00105] Também é provido um conjugado de peptídeo alfa inteferon formado pelo processo revelado.
[00106] A invenção também inclui um processo de um conjugado entre um peptídeo beta interferon e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo beta interferon através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo beta interferon compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0016
a, b, c, d, i, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, manose ou oligomanose; e R' e H ou uma glicosila, grupo de modificação ou grupo glicoconjugado. O processo compreende: (a) contato do peptídeo beta interferon com um elemento selecionado de uma glicosiltransferase e uma trans-sialidase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00107] Em uma modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta interferon com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo beta interferon.
[00108] Em outra modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (c) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00109] Ainda em outra modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (d) antes da etapa (a) contato do peptídeo beta interferon com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00110] Em uma modalidade adicional, o processo compreende, adicionalmente: (e) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta interferon com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo beta interferon.
[00111] Também, o processo compreende, adicionalmente: (f) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta interferon com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc ao peptídeo beta interferon.
[00112] Adicionalmente, o processo também compreende: (g) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta interferon com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir galactose para o produto.
[00113] Ainda em outra modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (h) antes da etapa (b), contato do peptídeo beta interferon com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo beta interferon.
[00114] Ainda em uma modalidade adicional, o processo compreende, adicionalmente: (i) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta interferon com uma manosidase em condições apropriadas para remover manose do peptídeo beta interferon.
[00115] Além disto, o processo compreende, adicionalmente: (j) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00116] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00117] Nas modalidades preferidas e referindo-se à fórmula de peptídeo beta interferon revelada acima, h é um elemento independentemente selecionado dos inteiros entre 1 e 3; a, b, c, d, e, f, g, i, j, k, l, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; n, v, w, x e y são 0; e q, p são 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e q, p são 1. Alternativamente, a, b, c, d e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x e y são 0; q, p são 1; e i é independentemente selecionado de 0 e 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, I, j, k, l, m, r, s, t, u, v, w, x e y são 0; e p, q são 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m e n são 0; q, p são 1; e r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; j, k, l, m, n, v, w, x e y são 0; e q, p são 1. Alternativamente, a, b, c, d, h, j, k, l, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g, são elementos selecionado dos inteiros entre 0 e 3; n, v, w, x e y são 0; e q, p são 1. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, p e q são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são 1; e n, v, w, x e y são 0.
[00118] Também está incluído um conjugado de peptídeo beta interferon formado pelo processo descrito acima.
[00119] A invenção também provê um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de Fator VIIa e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de Fator VIIa através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de Fator VIIa compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula que é um elemento selecionado de:
Figure img0017
onde: a, b, c, d, i, o, p, q, r, s, t e u, são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g, h e n são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 a 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 a 20; v, w, x e y são 0; e R é um grupo de modificação, uma manose, uma oligomanose, SialilLewisx ou SialilLewisa. O processo compreende: (a) contato do peptídeo de Fator VIIa com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00120] Em uma modalidade preferida, o processo compreende, adicionalmente: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de Fator VIIa com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de Fator VIIa.
[00121] Ainda em outra modalidade preferida, o processo compreende, adicionalmente: (c) antes da etapa (a), contato do peptídeo de Fator VIIa com uma galactosidase em condições apropriadas para remover galactose do peptídeo de Fator VIIa.
[00122] Em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo de Fator VIIa com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose ao peptídeo de Fator VIIa.
[00123] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00124] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00125] Nas modalidades adicionais e com referência à fórmula de peptídeo de Fator VIIa revelada acima, a, b, c, d, e, g, i, j, l, o, p e q são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; r e t são 1; f, h, k, m, s, u, v, w, x e y são 0; e n é selecionado dos inteiros de 0 a 4. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; v, w, x e y são 0; e n é um elemento selecionado dos inteiros de 0 a 4.
[00126] Além disto, é incluído o conjugado de peptídeo de Fator VIIa, formado pelo processo revelado aqui.
[00127] A invenção provê, adicionalmente, um processo de formação de um conjugado entre um peptídeo de Fator IX e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de Fator IX através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de Fator IX compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula que é um elemento selecionado de:
Figure img0018
onde: a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, bb, cc, dd ee, ff e gg são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g, h e aa são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 a 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 a 20; v, w, x, y e z são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose. O processo compreende: (a) contato do peptídeo de Fator IX com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00128] Em uma modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de Fator IX com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de Fator IX.
[00129] Em outra modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (c) contato do produto formado na etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00130] Adicionalmente, o processo compreende: (d) contato do produto da etapa (b) com uma galactosiltransferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o produto.
[00131] Além disto, o processo compreende: (e) contato do produto da etapa (d) com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00132] Ainda em outra modalidade, o processo compreende adicionalmente: (f) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00133] Também está incluído o fato de que o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00134] Nas modalidades adicionais e com referência a fórmula de peptídeo de fator IX revelada acima, a, b, c e d são 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 1 a 4; aa, bb, cc, dd, ee, ff, j, k, l, m, i, n, o, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y, z e gg são 0. Alternativamente, a, b, c, d, n, q são independentemente selecionados de 0 e 1; aa e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 1 a 4; bb, cc, dd, ee, ff, j, k, l, m, i, o, p, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y, z e gg são 0. Alternativamente, a, b, c, d, n, bb, cc, dd e ff são 1; e, f, g, h e aa são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 1 a 4; q, ee, i, j, k, l, m, o, p, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y, z e gg são 0. Alternativamente, a, b, c, d e q são 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 1 a 4; aa, bb, cc, dd, ee, ff, j, k, l, m, i, n, o, p, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y, z e gg são 0. Alternativamente, a, b, c, d, q, bb, cc, dd e ff são 1; aa e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 1 a 4; ee, i, j, k, l, m, o, p, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y, z e gg são 0.
[00135] Também está incluído o conjugado de peptídeo de Fator IX formado pelo processo revelado acima.
[00136] A invenção também provê um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo (FSH) de hormônio de estimulação do folículo e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de FSH através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de FSH compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0019
onde: a, b, c, d, i, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; v, w, x e y são 0; e R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; o processo compreendendo: (a) contato do peptídeo de FSH com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00137] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de FSH com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de FSH.
[00138] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00139] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo de FSH com uma galactosidase em condições apropriadas para remover galactose do peptídeo de FSH.
[00140] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a) contato do peptídeo de FSH com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00141] Ainda em uma modalidade adicional, o processo compreende: (f) antes da etapa (a), contato do peptídeo de FSH com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo de FSH.
[00142] Ainda em outra modalidade, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00143] Nas modalidades preferidas adicionais e com referência à fórmula de peptídeo de FSH descrita acima, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g, e h são 1; e v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, x e y são 0; e e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l e m são 0; i, q, r, s, t, u, v, w, x e y são independentemente selecionados de 0 e 1; p é 1; R (ramificado ou linear) é um elemento selecionado de manose e oligomanose. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, r, s, t, u, v, w e y são 0; i é 0 ou 1; e q é 1.
[00144] Também está incluído um conjugado de peptídeo de FSH formado pelo processo descrito acima.
[00145] A invenção também provê um processo de formação de um conjugado entre um peptídeo de eritropoietina (EPO) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de EPO através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de EPO compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula que é um elemento selecionado de:
Figure img0020
onde: a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 4; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 20; v, w, x, y e z são 0; e R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; o processo compreendendo: (a) contato do peptídeo de EPO com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00146] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de EPO com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de EPO.
[00147] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00148] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo de EPO com uma galactosidase operando sinteticamente em condições apropriadas para adicionar uma galactose ao peptídeo de EPO.
[00149] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a), contato do peptídeo de EPO com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo de EPO.
[00150] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (f) contato do produto da etapa (e) com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00151] Adicionalmente, o processo compreende: (g) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00152] Também, o processo compreende: (h) antes da etapa (a), contato do peptídeo de EPO com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo de EPO.
[00153] Em outro aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00154] Em uma modalidade preferida e com referência à fórmula de peptídeo de EPO acima, a, b, c, d, e, f, g, n e q são 1; h é um elemento selecionado dos inteiros entre 1 e 3; i, j, k, l, m, o, p, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y e z são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, q, s, u, v, w, x, y e z são 0; ee, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y e z são 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, n e q são 1; h é um elemento selecionado dos inteiros entre 1 e 3; i, j, k, l, m, o, p, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y e z são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, o, p, s, u, v, w, x, y e z são 0; e e, g, i, n, q, r e t são independentemente selecionados de 0 e 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, o, p, s, u, v, w, x, y e z são 0; e e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1. Alternativamente, q é 1; a, b, c, d e, f, g, h, i, n, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e j, k, l, m, o, p, v, w, x, y, e z são 0.
[00155] Também está incluído um conjugado de peptídeo de EPO formado pelo processo descrito acima.
[00156] A invenção provê, adicionalmente, um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito (GM-CSF) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de GM-CSF através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de GM-CSF compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula selecionada de:
Figure img0021
onde: a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, aa, bb e cc são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, manose ou oligomanose; e R' é H ou um resíduo de glicosila, ou um grupo de modificação ou um glicoconjugado. O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo de GM-CSF com a glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00157] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de GM-CSF com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de GM-CSF.
[00158] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00159] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a) contato do peptídeo de GM-CSF com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00160] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a), contato do peptídeo de GM-CSF com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo de GM-CSF.
[00161] Também, o processo compreende: (f) antes da etapa (a), contato do peptídeo de GM-CSF com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo de GM-CSF.
[00162] Adicionalmente, o processo compreende: (g) antes da etapa (a) contato do peptídeo de GM-CSF com uma manosidase em condições apropriadas para clivar um resíduo de manose do peptídeo de GM-CSF.
[00163] Adicionalmente, o processo compreende: (h) antes da etapa (a), contato do peptídeo de GM-CSF com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00164] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00165] Nas modalidades preferidas adicionais e com referência ao peptídeo GM-CSF da fórmula descrita acima: a, b, c, d, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t, u e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; bb e, f, g, h e n são 1; e cc, v, w, x, y, e z são 0. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t, u e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; bb e, f, g, h e n são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e cc, v, w, x, y e z são 0. Alternativamente, cc, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, o, p, s, u, v, w, x, y e z são 0; e e, g, i, n, q, r, t e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e bb é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, z e cc são 0; q, r, s, t, u, v, w, x, y e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; bb é 1; e R é manose ou oligomanose. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, o, q, r, s, t, u, aa e bb são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e n, p, v, w, x, y, z e cc são 0.
[00166] É adicionalmente incluído um peptídeo de GM- CSF conjugado formado pelo processo descrito.
[00167] A invenção também inclui um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo gama interferon e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo gama interferon, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo gama interferon compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0022
onde: a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, manose ou oligomanose; e R' é H ou um resíduo de glicosila, um glicoconjugado, ou um grupo de modificação. O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo gama interferon com um elemento selecionado de uma glicosiltransferase e a galactosidase operando sinteticamente e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00168] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo gama interferon com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo gama interferon.
[00169] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00170] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (d) antes da etapa (a) contato do peptídeo gama interferon com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00171] O processo também compreende: (e) antes da etapa (a), contato do peptídeo gama interferon com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo gama interferon.
[00172] Adicionalmente, o processo compreende: (f) antes da etapa (a), contato do peptídeo gama interferon com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo gama interferon.
[00173] O processo também compreende: (g) antes da etapa (a), contato do peptídeo gama interferon com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir galactose para o produto.
[00174] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (h) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00175] Em outro aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00176] Modalidades adicionais preferidas incluem, com referência ao peptídeo de gama interferon da fórmula acima, onde a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, p, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são 1; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; p, q e, f, g e h são 1; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e p é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m e n são 0; q, r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e p é 1; e R é manose ou oligomanose. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g, h e p são 1; e n, v, w, x e y são 0.
[00177] É incluído adicionalmente um conjugado de peptídeo gama interferon formado pelo processo descrito acima.
[00178] A invenção inclui, adicionalmente, um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo inibidor de alfa 1 protease (A-1-PI) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo A- 1-PI através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo A-1-PI compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0023
onde: a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, manose e oligomanose; e R' é H ou um resíduo de glicosila, um glicoconjugado ou um grupo de modificação. O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo A-1-PI com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00179] Em uma modalidade o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo A-1-PI com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo A-1-PI.
[00180] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00181] O processo também compreendendo: (d) antes da etapa (a) contato do peptídeo A-1-PI com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00182] Além disto, o processo compreende: (e) antes da etapa (a), contato do peptídeo A-1-PI com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo A-1-PI.
[00183] Em outra modalidade, o processo compreende: (f) antes da etapa (a), contato do peptídeo A-1-PI com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo A-1-PI.
[00184] Adicionalmente, o processo compreende: (g) antes da etapa (a), contato do peptídeo A-1-PI com uma manosidase em condições apropriadas para remover manose do peptídeo A-1-PI.
[00185] Adicionalmente, o processo compreende: (h) antes da etapa (a), contato do peptídeo A-1-PI com um elemento selecionado de uma manosidase, uma xilosidase, a hexosaminidase e combinações das mesmas, em condições apropriadas para remover um resíduo de glicosila do peptídeo A-1-PI.
[00186] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00187] Em outras modalidades adicionais e com referência ao peptídeo A-1PI da fórmula acima, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e e, f, g e h são 1; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionado de 0 e 1; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1. Alternativamente, n, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l e m são 0; q, r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e p é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, p e q são 0; r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, 1, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; p, v, w, x e y são 0; e n e q são 1.
[00188] Também está incluído um peptídeo inibidor de alfa 1 protease conjugado, formato pelo processo descrito acima.
[00189] A invenção também inclui um processo para formação de um conjugado entre a peptídeo beta glicosidase e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo beta glicosidase através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo beta glicosidase compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0024
onde: a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; e v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é H ou um resíduo de glicosila, um glicoconjugado, ou um grupo de modificação. O processo compreende: (a) contato do peptídeo beta glicosidase com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00190] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta glicosidase com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo beta glicosidase.
[00191] Em outra modalidade, o processo compreende, adicionalmente: (c) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00192] Em outra modalidade adicional, o processo compreende: (d) antes da etapa (a) contato do peptídeo beta glicosidase com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00193] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta glicosidase com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo beta glicosidase.
[00194] Adicionalmente, o processo compreende: (f) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta glicosidase com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo beta glicosidase.
[00195] Adicionalmente, o processo compreende: (g) antes da etapa (a), contato do peptídeo beta glicosidase com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir galactose para o produto.
[00196] Em outro aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00197] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo beta glicosidase da fórmula descrita acima, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; p, e, f, g e h são 1; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e p é 1. Alternativamente, n, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l e m são 0; q, r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; p é 1; e R é manose ou oligomanose.
[00198] A invenção também inclui um conjugado de peptídeo beta glicosidase formado pelo processo descrito acima.
[00199] A invenção adicionalmente provê um processo para formação de um conjugado entre o peptídeo ativador de plasminogênio de tecido (TPA) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo TPA, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo TPA possuindo uma subunidade de glicosila compreendendo a fórmula:
Figure img0025
onde: a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 e 100; R é um grupo de modificação, manose ou oligomanose; R' é H ou um resíduo de glicosila, um glicoconjugado, ou um grupo de modificação; e R" é um grupo glicosila, um glicoconjugado ou um grupo de modificação.
[00200] O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo TPA com um elemento selecionado de uma glicosiltransferase e uma glicosidase operando sinteticamente e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00201] Em uma modalidade, o processo compreende adicionalmente: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo TPA com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo TPA.
[00202] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00203] Ainda em outra modalidade adicional, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo TPA com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo TPA.
[00204] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a) contato do peptídeo TPA com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00205] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (f) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00206] Em outra modalidade, o processo compreende: (g) antes da etapa (a), contato do peptídeo TPA com N- acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo TPA.
[00207] Além disto, o processo compreende: (h) antes da etapa (a), contato do peptídeo TPA com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo TPA.
[00208] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (i) antes da etapa (a), contato do peptídeo TPA com um elemento selecionado de uma manosidase, uma xilosidase, a hexosaminidase e combinações das mesmas em condições apropriadas para remover um resíduo de glicosila do peptídeo TPA.
[00209] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00210] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo de TPA da fórmula descrita acima, a, b, c, d são 1; e, f, g e h são elementos selecionado dos inteiros entre 1 e 3; i, j, k, l, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e n, o, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, o, s, u, v, w, x e y são 0; e, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e q e p são 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e n, o, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d e, f, g e p são l; h é um elemento selecionado dos inteiros entre 1 e 3; j, k, l, m, i, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e n, o, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; o é 1; e R" é xilose. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são 1; e n, o, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x e y são 0; i e q são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e p é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, o, r, s, t, u, v, w, x e y são 0; i e q são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; p é 0; e n é 1.
[00211] Também está incluído um conjugado de peptídeo TPA formado pelo processo descrito acima.
[00212] A invenção também provê um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de interleucina 2 (IL-2) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de IL-2, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de IL-2 compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0026
onde: a, b, c e e são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; d é 0; e R é um grupo de modificação. O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo de IL-2 com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00213] Em uma modalidade, o processo compreende adicionalmente: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de IL-2 com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de IL-2.
[00214] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) antes da etapa (a), contato do peptídeo de IL-2 com uma endo-N-acetilgalactosaminidase operando sinteticamente em condições apropriadas par5a adicionar GalNAc ao peptídeo de IL-2.
[00215] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (d) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00216] Adicionalmente, o processo compreende: (e) antes da etapa (a), contato do peptídeo de IL-2 com N-acetilgalactosamina transferase e um doador de GalNAc em condições apropriadas para transferir GalNAc para o peptídeo de IL-2.
[00217] Além disto, o processo compreende: (f) antes da etapa (a) contato do peptídeo de IL-2 com galactosiltransferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir galactose para o peptídeo de IL-2.
[00218] Em outro aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00219] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo IL-2 da fórmula descrita acima, a e e são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e b, c e d são 0. Alternativamente, a, b, c, d e e são 0.
[00220] A invenção inclui, adicionalmente, um conjugado de peptídeo IL-2 formado pelo processo descrito acima.
[00221] A invenção também inclui um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de Fator VIII e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao glicopeptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, o glicopeptídeo compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula que é um elemento selecionado de:
Figure img0027
onde: a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, aa, cc e dd são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 20; v, w, x, y e z são 0; e R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; R' é um elemento selecionado de H, um resíduo de glicosila, um grupo de modificação e um glicoconjugado. O processo compreendendo: (a) contato do glicopeptídeo com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00222] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do glicopeptídeo.
[00223] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00224] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o glicopeptídeo.
[00225] Também, a invenção compreende: (e) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00226] Adicionalmente, o processo compreende: (f) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o glicopeptídeo.
[00227] Além disto, o processo compreende: (g) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do glicopeptídeo.
[00228] O processo também compreende: (h) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00229] Além disto, o processo compreende: (i) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma manosidase em condições apropriadas para remover manose do glicopeptídeo.
[00230] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00231] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo de Fator VIII da fórmula descrita acima, e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 1 e 4; a, b, c, d, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t, u, aa e cc são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e v, w, x, y, z e dd são 0.
[00232] É também preferido um conjugado de Peptídeo de Fator VIII formado pelo processo descrito acima.
[00233] A invenção provê adicionalmente um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de fusão de fator de necrose tumoral/IgG (TNF) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao glicopeptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, o glicopeptídeo compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0028
onde: a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t, u, w, ww e z são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 4; n, v, x e y são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é um elemento selecionado de H, um resíduo de glicosila, um grupo de modificação e um glicoconjugado. O processo compreendendo: (a) contato do glicopeptídeo com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00234] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o glicopeptídeo.
[00235] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do glicopeptídeo.
[00236] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00237] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo de fusão de fator de necrose tumoral alfa/IgG da fórmula apresentada acima, a, c, i, j e l são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, g, q, r, t e z são 1; e b, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0. Alternativamente, e, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e q e z são 1.
[00238] É também provido um conjugado peptídeo de fusão de fator de necrose tumoral alfa/IgG, formulado pelo processo descrito acima.
[00239] A invenção também inclui um processo de formação de um conjugado entre um peptídeo de uroquinase e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de uroquinase, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de uroquinase compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0029
onde: a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é H ou um resíduo de glicosila, um glicoconjugado, ou um grupo de modificação. O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo de uroquinase com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00240] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de uroquinase com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de uroquinase.
[00241] Em uma modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00242] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo de uroquinase com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo de uroquinase.
[00243] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a) contato do peptídeo de uroquinase com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00244] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (f) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00245] Adicionalmente, o processo compreende: (g) antes da etapa (a), contato do peptídeo de uroquinase com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo de uroquinase.
[00246] Adicionalmente, o processo compreende: (h) antes da etapa (a), contato do peptídeo de uroquinase com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo de uroquinase.
[00247] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00248] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo de uroquinase da fórmula descrita acima, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são 1; v, w, x e y são 0; e p é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; n, v, w, x e y são 0; e p é 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e p é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x e y são 0; i é 0 ou 1; e q e p são 1. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são independentemente selecionados de 0, 1, 2, 3 e 4; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, o, r, s, t, u, v, w, x e y são 0; q é l; e n é 0 ou 1.
[00249] Também é provido um conjugado de peptídeo de uroquinase pelo processo descrito acima.
[00250] A invenção também inclui um processo de formação de um conjugado entre um peptídeo de anticorpo monoclonal de anti-glicoproteína IIb/IIIa e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao glicopeptídeo, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o glicopeptídeo compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula que é um elemento selecionado de:
Figure img0030
onde: a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, bb, cc e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 e 4; n, v, w, x, y e dd são 0; R é um grupo de modificação uma manose ou uma oligomanose; e R' é um elemento selecionado de H, um resíduo de glicosila, um grupo de modificação e um glicoconjugados. O processo compreendendo: (a) contato do glicopeptídeo com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00251] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do glicopeptídeo.
[00252] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00253] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com a galactosidase operando sinteticamente em condições apropriadas para adicionar uma galactose ao glicopeptídeo.
[00254] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o glicopeptídeo.
[00255] Além disto, o processo compreende: (f) contato do produto da etapa (e) com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00256] Adicionalmente, o processo compreende: (g) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00257] Também, o processo compreende: (h) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o glicopeptídeo.
[00258] Além disto, o processo compreende: (i) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do glicopeptídeo.
[00259] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00260] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo de anticorpo monoclonal de anti-glicoproteína IIb/IIIa da fórmula descrita acima, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; n, v, w, x e y são 0; e z é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, s, t, u, v, w, x e y são 0; i e r são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e z é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m e n são 0; r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e z é 1. Alternativamente, aa, bb, cc e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e dd é 0. Alternativamente, aa e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e bb, cc e dd são 0. Alternativamente, aa, bb, cc, dd, e ee são 0.
[00261] Também é provido um conjugado de peptídeo de anticorpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa formado pelo processo descrito acima.
[00262] Também é provido, na invenção, um processo de formação de um conjugado entre um peptídeo de anticorpo anti-HER2 quimérico e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de anticorpo anti-HER2 quimérico, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de anticorpo anti- HER2 compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0031
onde: a, b, c, d, i, j, k, l, q, r, s, t, u e z são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 4; n, v, w, x e y são 0; m é 0-20; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é um elemento selecionado de hidrogênio e um resíduo de glicosila e um grupo de modificação. O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo de anticorpo anti-HER2 quimérico com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00263] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de anticorpo anti-HER2 quimérico com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo de anticorpo anti-HER2 quimérico.
[00264] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) antes da etapa (a), contato do peptídeo de anticorpo anti-HER2 quimérico com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo de anticorpo anti-HER2 quimérico.
[00265] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00266] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo de anticorpo anti-HER2 da fórmula descrita acima, a, c e i são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, g, r e t são 1; b, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e q e z são 1. Alternativamente, i é 0 ou 1; q e z são 1; e a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x, e y são 0. Alternativamente, e, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e q e z são 1.
[00267] Também é provido um conjugado de peptídeo de anticorpo anti-HER2 formado pelo processo descrito acima.
[00268] A invenção provê, adicionalmente, um processo de formação de conjugado entre um peptídeo anti-RSV F e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo anti-RSV F através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo anti-RSV F compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0032
onde: a, b, c, d, i, j, k, l, m, p, q, r, s, t, u e z são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros de 0 a 4; n, v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é um elemento selecionado de H e um resíduo de glicosila, um glicoconjugado e um grupo de modificação. O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo anti-RSV F com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00269] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo anti-RSV F com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo anti-RSV F.
[00270] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) antes da etapa (b), contato do peptídeo anti-RSV F com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo anti-RSV F.
[00271] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo anti-RSV da fórmula apresentada acima, a, c, e, g e i são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; r e t são 1; b, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e z é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, r, s, t, u, v, w, x, y são 0; i e p são independentemente selecionados de 0 ou 1; q e z são 1; e n é 0. Alternativamente, e, g, i, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e q e z são 1.
[00272] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00273] Também é provido um conjugado de peptídeo RSV F formado pelo processo descrito acima.
[00274] A invenção também inclui um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de anticorpo anti-CD20 e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de anticorpo anti-CD20, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de anticorpo antiCD20 possuindo uma subunidade de glicosila compreendendo a fórmula:
Figure img0033
onde: a, b, c, d, i, j, k, l, m q, r, s, t, u e z são inteiros independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são independentemente selecionados dos inteiros de 0 to 4; h, v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é um elemento selecionado de H, um resíduo de glicosila, um glicoconjugado ou um grupo de modificação.
[00275] O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo de anticorpo antiCD20 com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00276] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de anticorpo anti-CD20 com uma galactosiltransferase e um doador de galactosila em condições apropriadas para a transferência do doador de galactosila para o peptídeo de anticorpo anti-CD20.
[00277] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) antes da etapa (b), contato do peptídeo de anticorpo anti-CD20 com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo de anticorpo anti-CD20.
[00278] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo de anticorpo anti-CD20 com uma manosidase em condições apropriadas para remover manose do peptídeo de anticorpo anti-CD20.
[00279] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00280] Em outro aspecto, a glicosiltransferase é galactosiltransferase e o o doador de glicosila modificada é um doador de galactosila modificada.
[00281] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo anti-CD20 da fórmula apresentada acima, a, c, e, g e i são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; r, t, q e z são 1; e b, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, c, e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; b, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, x, y são 0; e z é 1. Alternativamente, e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y são 0; e z é 1. Alternativamente, i é 0 ou 1; q e z são 1; e a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x e y são 0. Alternativamente, e, g, i, r, t, v, x e z são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, w e y são 0; e z é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, r, s, t, u, v, w, x e y são 0; n e q são 1; e i é 0 ou 1.
[00282] Também encontra-se incluído um conjugado de peptídeo de anticorpo anti-CD30 formado pelo processo descrito acima.
[00283] A invenção provê, adicionalmente, um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo DNase recombinante e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo DNase recombinante através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo DNase recombinante compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0034
onde: a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; v, w, x e y são 0; e R é um elemento selecionado de polímero, um glicoconjugado, uma manose, uma oligomanose e um grupo de modificação. O processo compreendendo: (a) contato do peptídeo DNase recombinante com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação, em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00284] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo DNase recombinante com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo DNase recombinante.
[00285] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00286] Em uma modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo DNase recombinante com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo DNase recombinante.
[00287] Ainda em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a) contato do peptídeo DNase recombinante com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
[00288] Em uma outra modalidade, o processo compreende: (f) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00289] O processo também compreende: (g) antes da etapa (a), contato do peptídeo DNase recombinante com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo DNase recombinante.
[00290] Além disto, o processo compreende: (h) antes da etapa (a), contato do peptídeo DNase recombinante com uma endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do peptídeo DNase recombinante.
[00291] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo DNase da fórmula apresentada acima a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g, h e p são 1; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; p é 1; e n, v, w, x e y são 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, x e y são 0; e e, g, i, q, r e t são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e p é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x e y são 0; i é 0 ou 1; e p é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l e m são 0; i, q, r, s, t, u, v, x e y são independentemente selecionados de 0 ou 1; p é 1; e R é manose ou oligomanose.
[00292] Também é provido um conjugado de peptídeo DNase recombinante formato pelo processo descrito acima.
[00293] A invenção inclui, adicionalmente, um processo para formação de um conjugado entre um alfa peptídeo de fator de necrose antitumor (TNF) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao alfa peptídeo antiTNF através de um grupo de ligação glicosila intacto, o alfa peptídeo antiTNF compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula: onde:
Figure img0035
a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u e z são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 20; n, v, w, x e y são 0; e R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; R' é a glicoconjugado ou um grupo de modificação. O processo compreendendo: (a) contato do alfa peptídeo antiTNF com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00294] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do alfa peptídeo antiTNF com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o alfa peptídeo antiTNF.
[00295] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) antes da etapa (a), contato do alfa peptídeo antiTNF com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do alfa peptídeo antiTNF.
[00296] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00297] Nas modalidades preferidas e com referência ao alfa peptídeo antiTNF da fórmula apresentada acima, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; n é 1; e v, w, x, y e z são 0. Alternativamente, a, c, e, g e i são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; r e t são 1; b, d, f, h, j, k, 1, m, n, s, u, v, w, x e y; e q e z são 1.
[00298] Também está incluído o conjugado de alfa peptídeo antiTNF formado pelo processo descrito acima.
[00299] A invenção também provê um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de insulina e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao glicopeptídeo, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o glicopeptídeo compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula que é um elemento selecionado de:
Figure img0036
onde: a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, bb, cc e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados do inteiro entre 0 e 4; dd, n, v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é um elemento selecionado de H, um resíduo de glicosila, um grupo de modificação e um glicoconjugado. O processo compreendendo: (a) contato do glicopeptídeo com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação, em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00300] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do glicopeptídeo.
[00301] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00302] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o glicopeptídeo.
[00303] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com Endo-H em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do glicopeptídeo.
[00304] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
[00305] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo de insulina da fórmula apresentada acima, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; n, v, w, x e y são 0; e z é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, s, t, u, v, w, x e y são 0; i e r são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e z é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m e n são 0; r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e z é 1. Alternativamente, aa, bb, cc e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e dd é 0. Alternativamente, aa e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e bb, cc e dd são 0. Alternativamente, aa, bb, cc, dd e ee são 0.
[00306] A invenção também inclui um conjugado de peptídeo de insulina formado pelo processo descrito acima.
[00307] Além disto, a invenção provê um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de antígeno de superfície da hepatite B (HbsAg) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao peptídeo de HbsAg, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o peptídeo de HBsAg compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula que é um elemento selecionado de:
Figure img0037
onde: aa, bb, a, b, c, d, i, n, q, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 6; o, p, j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 100; cc, v, w, x e y são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é H ou um resíduo de glicosila, um glicoconjugado, ou um grupo de modificação, o processo compreendendo: (a) contato do peptídeo de HBsAg com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00308] Em uma modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do peptídeo de HBsAg com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do peptídeo de HBsAg.
[00309] Em outra modalidade, o processo compreende: (c) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00310] Ainda em outra modalidade, o processo compreende: (d) antes da etapa (a), contato do peptídeo de HBsAg com a galactosidase em condições apropriadas para clivar um resíduo de glicosila do peptídeo de HBsAg.
[00311] O processo também compreende: (e) antes da etapa (a), contato do peptídeo de HBsAg com uma galactosil transferase e um doador de galactose em condições apropriadas para transferir a galactose para o peptídeo de HBsAg.
[00312] Além disto, o processo compreende: (f) contato do produto da etapa (d) com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00313] O processo também compreende: (g) contato do produto da etapa (a) com uma porção que reage com o grupo de modificação, desta forma constituindo um conjugado entre o grupo de ligação de glicosila intacto e a porção.
[00314] O processo também compreende: (h) antes da etapa (a), contato do peptídeo de HBsAg com N-acetilglicosamina transferase e um doador de GlcNAc em condições apropriadas para transferir GlcNAc para o peptídeo de HBsAg.
[00315] Além disto, o processo compreende: (i) antes da etapa (a), contato do peptídeo de HBsAg com uma manosidase em condições apropriadas para clivar manose do peptídeo de HBsAg.
[00316] O processo também compreende: (j) antes da etapa (a), contato do peptídeo de HBsAg com endoglicanase em condições suficientes para clivar um grupo glicosila do peptídeo de HBsAg.
[00317] Em um aspecto, o grupo de modificação é um elemento selecionado de um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica, um coadjuvante e um glicoconjugado.
[00318] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo HBsAg da fórmula apresentada acima, a, b, c, d, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t, u e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; bb, e, f, g, h e n são 1; e cc, v, w, x, y e z são 0. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t, u e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são independentemente selecionados de 0, 1, 2, 3 ou 4; cc, v, w, x, y e z são 0; e bb é 1. Alternativamente, cc, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, v, w, x, y e z são 0; e q, r, s, t, u, v, w, x, y e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e bb é 1. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, o, q, r, s, t, u e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; bb, e, f, g, h e n são 1; e n, p, cc, v, w, x, y e z são 0. Alternativamente, bb, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t, u, v, w, x, y e z são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; cc é 1; e n é 0 ou 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, o, p, s, u, v, w, x, y, z e cc são 0; bb é 1; e, g, i, n, q, r, t e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, z e cc são 0; q, r, s, t, u, v, w, x, y e aa são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e bb é 1.
[00319] Também encontra-se incluído um conjugado de peptídeo HBsAg formado pelo processo descrito acima.
[00320] A invenção inclui, adicionalmente, um processo para formação de um conjugado entre um peptídeo de hormônio do crescimento humano (HGH) e um grupo de modificação, onde o grupo de modificação é ligado covalentemente ao glicopeptídeo, através de um grupo de ligação glicosila intacto, o glicopeptídeo compreendendo um resíduo de glicosila possuindo uma fórmula que é um elemento selecionado de:
Figure img0038
onde: a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, bb, cc e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dos inteiros entre 0 e 4; h, v, w, x, y e dd são 0; R é um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e R' é um elemento selecionado de H, um resíduo de glicosila, um grupo de modificação e um glicoconjugado. O processo compreendendo: (a) contato do glicopeptídeo com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção glicosila que é um substrato para a glicosiltransferase ligada covalentemente ao grupo de modificação em condições apropriadas para formação do grupo de ligação glicosila intacto.
[00321] Em outra modalidade, o processo compreende: (b) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com uma sialidase em condições apropriadas para remover ácido siálico do glicopeptídeo.
[00322] Em uma modalidade, o processo compreende: (c) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com endoglicanase em condições apropriadas para clivar uma porção glicosila do glicopeptídeo.
[00323] Em outra modalidade, o processo compreende: (d) contato do produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico em condições apropriadas para transferir ácido siálico para o produto.
[00324] Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (e) antes da etapa (a), contato do glicopeptídeo com a galactosidase em condições apropriadas para clivar um resíduo de glicosila do glicopeptídeo.
[00325] Nas modalidades preferidas e com referência ao peptídeo HGH da fórmula apresentada acima, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, r, s, t e u são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; n, v, w, x e y são 0; e z é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, s, t, u, v, w, x e y são 0; i e r são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e z é 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m e n são 0; r, s, t, u, v, w, x e y são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e z é 1. Alternativamente, aa e ee são elementos independentemente selecionados de 0 e 1; e bb, cc e dd são 0. Alternativamente, aa, bb, cc, dd e ee são 0. Alternativamente, aa, bb, cc, dd, ee e n são 0.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00326] Com a finalidade de ilustrar a invenção, são mostradas nos desenhos algumas modalidades da invenção. Contudo, a invenção não está limitada às disposições precisas e instrumentações das modalidades ilustradas nos desenhos.
[00327] A figura 1, compreendendo a figura 1A a figura 1Z e figura 1AA a figura 1CC, é uma lista de peptídeos úteis nos processos da invenção.
[00328] A figura 2 é um esquema ilustrando um glicano de núcleo trimanosila (lado esquerdo) e o processo enzimático para a geração de um glicano possuindo um GlcNAc de bissecção (lado direito).
[00329] A figura 3 é um esquema ilustrando e estrutura de núcleo de trimanosila elementar e cadeias complexas em vários graus de forma completa. A geração enzimática in vitro de uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar de uma estrutura de glicano carboidrato complexa que não contém um resíduo de GlcNAc de bissecção é mostrada como é, a geração de uma estrutura de glicano a partir da mesma que contém um GlcNAc de bissecção. Símbolos: quadrados: GlcNAc; círculos claros: Man; círculos escuros: Gal; triângulos: NeuAc.
[00330] A figura 4 é um esquema para a geração enzimática de uma estrutura de glicano sialilada (lado direito) começando com um glicano possuindo um núcleo de trimanosila e um GlcNAc de bissecção (lado esquerdo).
[00331] A figura 5 é um esquema de uma estrutura de glicano contendo manose superior típica (lado esquerdo) e o processo enzimático para redução desta estrutura a uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar.
[00332] A figura 6 é um diagrama de uma estrutura de glicano ligada em N contendo fucose e xilose tipicamente produzida nas células de planta.
[00333] A figura 7 é um diagrama de uma estrutura de glicano ligada em N contendo fucose tipicamente produzida nas células de inseto.
[00334] A figura 8 é um esquema ilustrando várias passagens para apara de uma estrutura de manose superior e a síntese das cadeias de açúcar complexas da mesma. Símbolos: quadrados: GlcNAc; círculos: Man; diamantes: fucose; pentágono: xilose.
[00335] Figura 9 é um esquema ilustrando estratégias in vitro para a síntese de estruturas complexas de uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar. Símbolos: quadrados escuros: GlcNAc; círculos claros: Man; círculos escuros: Gal; triângulos escuros: NeuAc; GnT: N- acetilglicosaminiltransferase; GalT: galactosiltransferase; ST: sialiltransferase.
[00336] A figura 10 é um esquema ilustrando várias estruturas complexas que podem ser sintetizadas de uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar. Símbolos: quadrados escuros: GlcNAc; círculos claros: Man; círculos escuros: Gal; triângulos escuros: NeuAc; diamantes escuros: fucose; FT e FucT: fucosiltransferase; GalT: galactosiltransferase; ST: sialiltransferase; Le: antígeno de Lewis; SLe: antígeno de Lewis sialilado.
[00337] A figura 11 é um esquema exemplar para preparação de glicopeptídeos ligados em O originados com serina ou treonina.
[00338] A figura 12 é uma série de diagramas ilustrando os quatro tipos de estrutura O-glicano, denominados núcleos 1 a 4. A estrutura do núcleo é ressaltada em linhas pontilhadas.
[00339] A figura 13, compreendendo a figura 13A e figura 13B, é uma série de esquemas mostrando uma modalidade exemplar da invenção, onde os resíduos de carboidrato compreendendo estruturas de carboidrato complexas e/ou estruturas de manose superiores são retroaparadas para a primeira estrutura biantenária de geração. Um açúcar modificado portando um polímero solúvel em água (WSP) é então conjugado em um ou mais dos resíduos de açúcar expostos pelo processo de retroaparamento.
[00340] A figura 14 é um esquema semelhante aquele mostrado na figura 2, onde uma estrutura de manose superior é "retroaparada" para a manose a partir da qual a estrutura biantenária ramifica-se e um açúcar modificado portando um polímero solúvel em água é então conjugado em um ou mais resíduos de açúcar expostos pelo processo de retroaparamento.
[00341] A figura 15 é um esquema semelhante aquele mostrado na figura 2, onde a manose superior é retroaparada para GlcNAc a qual a primeira manose está anexada e um açúcar modificado portando um polímero solúvel em água é então conjugado em um ou mais resíduos de açúcar expostos pelo processo de retroaparamento.
[00342] A figura 16 é um esquema semelhante aquele mostrado na figura 2, onde a manose superior é retroaparada para o primeiro GlcNAc anexado ao Asn do peptídeo, após o que o polímero solúvel em água é conjugado em um ou mais resíduos de açúcar que foram subseqüentemente adicionados.
[00343] A figura 17, compreendendo as figuras 17A e 17B, é um esquema no qual um carboidrato ligado em N é retroaparado e subseqüentemente derivatizado com uma porção de açúcar modificado (GlcNAc) portando um polímero solúvel em água.
[00344] A figura 18 compreendendo as figuras 18A e 18B é um esquema onde um carboidrato ligado em N é retroaparado e subseqüentemente derivatizado com uma poção de ácido siálico portando um polímero solúvel em água.
[00345] A figura 19 é um esquema onde o carboidrato ligado em N é retroaparado e subseqüentemente derivatizado com uma ou mais porções de ácido siálico e terminado com um ácido siálico derivatizado com um polímero solúvel em água.
[00346] A figura 20 é um esquema onde um ascarídeo ligado em O é "retroaparado" e subseqüentemente conjugado em um açúcar modificado contendo um polímero solúvel em água. No esquema exemplar, a porção de carboidrato é "retroaparada" para a primeira geração da estrutura biantenária.
[00347] A figura 21 é um esquema exemplar para retroaparamento da porção de carboidrato de um glicopeptídeo ligado em O para produzir uma manose disponível para conjugação com um açúcar modificado possuindo um polímero solúvel em água anexado ao mesmo.
[00348] A figura 22, compreendendo as figuras 22A a figura 22C é uma série de esquemas exemplares. A figura 22A é um esquema que ilustra a adição de um açúcar PEGilado, seguido por adição de um açúcar não modificado. A figura 22B é um esquema que ilustra a adição de mais do que um tipo de açúcar modificado em um glicano. A figura 22C é um esquema que ilustra a adição de açúcares modificados diferentes aos glicanos ligados em O e glicanos ligados em N.
[00349] A figura 23 é um diagrama de vários processos para aperfeiçoar a função terapêutica de um peptídeo por remodelagem de glicano, incluindo conjugação.
[00350] A figura 24 é um conjunto de esquemas para remodelagem de glicano de um peptídeo terapêutico para tratar Doença de Gaucher.
[00351] A figura 25 é um esquema para remodelagem de glicano para gerar glicanos possuindo uma porção de manose- 6-fosfato terminal.
[00352] A figura 26 é um diagrama ilustrando a fileira de estruturas de glicano encontrada em glicocerebrosidase produzida em CHO (Cerezyme™) após sialilação.
[00353] A figura 27, compreendendo as figuras 27A a 27G, fornece esquemas exemplares para remodelagem das estruturas de glicano em fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF). A figura 27A é um diagrama ilustrando o peptídeo G-CSF indicando o resíduo de aminoácido ao qual um glicano se liga e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 37B a 27G são diagramas de etapas de remodelagem exemplares do glicano do peptídeo na figura 27A com base no tipo de célula de peptídeo expressa e na estrutura de glicano remodelada desejada.
[00354] A figura 28, compreendendo as figuras 28A a 28AA estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em alfa-interferon. A figura 28A é um diagrama ilustrando o peptídeo 14c de isoforma alfa- interferon indicando o resíduo de aminoácido ao qual o glicano se liga e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 28B a 28D são diagramas de etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 28A, com base no tipo de célula que o peptídeo é expresso e na estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 28E é um diagrama ilustrando o peptídeo 14c de isoforma de alfa- interferon indicando o resíduo de aminoácido ao qual um glicano se liga, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 28F a 28N são diagramas de etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 28F, com base no tipo de célula que o peptídeo é expresso e na estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 28O é um diagrama ilustrando os peptídeos 1a ou 2b de isoforma alfa-interferon indicando o resíduo de aminoácido ao qual um glicano se liga e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 38P a 28W são diagramas de etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 28O, com base no tipo de célula que o peptídeo é expresso e na estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 28X é um diagrama ilustrando os peptídeos de fusão alfa- interferon-mucina indicando o(s) resíduo(s) que liga(m)-se aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicanos exemplares ligadas aos mesmos. As figuras 28Y a 28AA são diagramas de etapas de remodelagem contempladas de glicano dos peptídeos na figura 28X com base no tipo de célula que o peptídeo é expresso e na estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 28BB é um diagrama ilustrando os peptídeos de fusão alfa-interferon-mucina e peptídeos alfa-interferon indicando o(s) resíduos(s) que se liga(m) aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas para os glicanos. As figuras 28CC a 28EE são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano dos peptídeos na figura 28BB com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00355] A figura 29, compreendendo as figuras 29A a 29S, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no beta-interferon. A figura 29A é um diagrama ilustrando o peptídeo beta-interferon indicando o resíduo de aminoácido ao qual um glicano se liga, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. Figura 29B a 29O são diagramas de etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 29A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 29P é um diagrama ilustrando o peptídeo beta-interferon indicando o resíduo de aminoácido ao qual um glicano se liga, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 29Q a 29S são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 29P, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00356] A figura 30, compreendendo as figuras 30A a 30D, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no Fator VII e Fator VIIa. A figura 30A é um diagrama ilustrando os peptídeos de Fator-VII e Fator-VIIa A (linha cheia) e B (linha pontilhada) indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e as fórmulas para os glicanos. As figuras 30B a 30D são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 30A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00357] A figura 31, compreendendo as figuras 31A a 31G, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no Fator IX. A figura 31A é um diagrama ilustrando o peptídeo de Fator-IX indicando resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas do glicanos. As figuras 31B a 31G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 31A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00358] A figura 32, compreendendo as figuras 32A a 32J, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no hormônio de estimulação de folículo (FSH), compreendendo subunidades α e β. A figura 32A é um diagrama ilustrando os peptídeos do Hormônio de Estimulação de Folículo FSHα e FSHβ indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicano exemplares ligadas aos mesmos. As figuras 32B a 32J são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano dos peptídeos na figura 32A, com base no tipo de célula na qual os peptídeos são expressos e as estruturas de glicano remodeladas desejadas.
[00359] A figura 33, compreendendo as figuras 33A a 33J, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em Eritropoietina (EPO). A figura 33A é um diagrama ilustrando o peptídeo de EPO indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas para os glicanos. As figuras 33B a 33J são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 33A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e na estrutura de glicano remodelada desejada.
[00360] A figura 34, compreendendo as figuras 34A a 34K estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no Fator de Estimulação de Colônia de Granulócito-Macrófago(GM-CSF). A figura 34A é um diagrama ilustrando o peptídeo de GM-CSF indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas para os glicanos. As figuras 34B a 34G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 34A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 34H é um diagrama ilustrando o peptídeo de GM-CSF indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas para os glicanos. As figuras 34I a 34K são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 34H, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00361] A figura 35, compreendendo as figuras 35A a 35N, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no gama-interferon. A figura 35A é um diagrama ilustrando um peptídeo gama-interferon indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas de glicano exemplares ligadas aos mesmos. As figuras 35B a 35G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 35A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 35H é um diagrama ilustrando um peptídeo gama-interferon indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas de glicano exemplares ligadas aos mesmo. As figuras 35I a 35N são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 35H com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00362] A figura 36, compreendendo as figuras 36A a 36O, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em «1-antitripsina (ATT, ou inibidor de a-i protease). A figura 36A é um diagrama ilustrando um peptídeo de AAT indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicano exemplares ligadas aos mesmos. As figuras 36B a 36G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 36A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 36H é um diagrama ilustrando um peptídeo de AAT indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 36I a 36K são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 36H com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 36L é um diagrama ilustrando um peptídeo de AAT indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 36M a 36O são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 36L, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00363] A figura 37, compreendendo as figuras 37A a 37K, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano na glicocerebrosidase. A figura 37A é um diagrama ilustrando o peptídeo de glicocerebrosidase indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 37B a 37G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 37A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. Figura 37H é um diagrama ilustrando o peptídeo de glicocerebrosidase indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 37I a 37K são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 37H com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00364] A figura 38, compreendendo as figuras 38A a 38W, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em Ativador de Plasminogênio do Tipo de Tecido (TPA). A figura 38A é um diagrama ilustrando o peptídeo de TPA indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas para os glicanos. As figuras 38B a 38G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 38A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 38H é um diagrama ilustrando o peptídeo de TPA indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas para os glicanos. As figuras 38I a 38K são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 38H, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 38L é um diagrama ilustrando um peptídeo de TPA mutante indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e a fórmula para os glicanos. As figuras 38M a 38O são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 38L com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 38P é um diagrama ilustrando um peptídeo TPA mutante indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas para os glicanos. As figuras 38Q a 38S são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 38P com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 38T é um diagrama ilustrando um peptídeo TPA mutante indicando os resíduos que ligam-se aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas para os glicanos. As figuras 38U a 38W são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 38T, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00365] A figura 39, compreendendo as figuras 39A a 39G, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em Interleucina-2 (IL-2). A figura 39A é um diagrama ilustrando o peptídeo de interleucina-2 indicando o resíduo de aminoácido ao qual um glicano se liga, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 39B a 39G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 39A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00366] A figura 40, compreendendo as figuras 40A a 40N, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no Fator VIII. A figura 40A exibe as fórmulas para os glicanos que se ligam aos sítios de glicosilação ligados em N (A e A') e aos sítios ligados em O (B) dos peptídeos de Fator VIII. As figuras 40B a 40F são diagramas das etapas de remodelagem contempladas dos peptídeos na figura 40A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 40G exibe as fórmulas para os glicanos que se ligam aos sítios de glicosilação ligados em N (A e A') e aos sítios ligados em O (B) dos peptídeos de Fator VIII. As figuras 40H a 40M são diagramas das etapas de remodelagem contempladas dos peptídeos na figura 40G, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejadas.
[00367] A figura 41, compreendendo as figuras 41A a 41M, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em uroquinase. A figura 41A é um diagrama ilustrando o peptídeo de uroquinase indicando um resíduo que se liga a um glicano contemplado para remodelagem, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 41B a 41G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 41A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 41H é um diagrama ilustrando o peptídeo de uroquinase indicando um resíduo que se liga a um glicano contemplado para remodelagem e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 41I a 41M são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 41H, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00368] A figura 42, compreendendo as figuras 42A a 42K, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em DNase humana (hDNase). A figura 42A é um diagrama ilustrando o peptídeo de DNase humana indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 42B a 42G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 42A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 42H é um diagrama ilustrando o peptídeo de DNase humana indicando resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 42I a 42K são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 42H, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00369] A figura 43, compreendendo as figuras 43A a 43L, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em insulina. A figura 43A é um diagrama ilustrando o peptídeo de insulina mutado para conter um sítio de N glicosilação e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 43B a 43D são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura INS A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 43E é um diagrama ilustrando peptídeos de fusão de insulina-mucina indicando um resíduo (s) que se liga(m) a um glicano contemplado para remodelagem e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 43F a 43H são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 43E com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 43I é um diagrama ilustrando os peptídeos de fusão de insulina-mucina e peptídeos de insulina indicando um resíduo (s) que se liga(m) a um glicano contemplado para remodelagem, e fórmulas para o glicano. As figuras 43J a 43L são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 43I, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00370] A figura 44, compreendendo as figuras 44A a 44K, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no antígeno M (preS e S) da proteína de superfície da Hepatite B (HbsAg). A figura 44A é um diagrama ilustrando o peptídeo de antígeno M indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas para os glicanos. As figuras 44B a 44G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 44A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 44H é um diagrama ilustrando o peptídeo de antígeno M indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas para os glicanos. As figuras 44I a 44K são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 44H, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00371] A figura 45, compreendendo as figuras 45A a 45K, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano no hormônio do crescimento humano, incluindo N, V e variantes dos mesmos. A figura 45A é um diagrama ilustrando o peptídeo de hormônio do crescimento humano indicando um resíduo que se liga a um glicano contemplado para remodelagem, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 45B a 45D são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano do peptídeo na figura 45A com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 45E é um diagrama ilustrando os três peptídeos de fusão compreendendo o peptídeo de hormônio do crescimento humano e parte ou todo um peptídeo de mucina e indicando um resíduo (s) que se liga(m) a um glicano contemplado para remodelagem e fórmula(s) de glicano exemplar(es) ligada(s) ao mesmo. As figuras 45F a 45K são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano dos peptídeos na figura 45E, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00372] A figura 46, compreendendo as figuras 46A a 46G, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em uma proteína de fusão de região Fc Receptor-IgG de TNF (Enbrel). A figura 46A é um diagrama ilustrando um peptídeo de fusão de região Fc Receptor-IgG de TNF que pode ser mutado para conter os sítios de N- glicosilação adicionais indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas para os glicanos. O peptídeo de receptor de TNF é ilustrado em linha negritada e as regiões Fc de IgG são ilustradas em linha normal. As figuras 46B a 46G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 46A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00373] A figura 47 fornece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em um anticorpo monoclonal anti-HER2 (HerceptinT). A figura 47A é um diagrama ilustrando um anticorpo monoclonal anti-HER2 que foi mutado para conter sítio(s) de N-glicosilação indicando resíduo (s) na cadeia pesada de anticorpo que se liga a um glicano contemplado para remodelagem, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 47B a 47D são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano dos peptídeos na figura 47A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00374] A figura 48, compreendendo as figuras 48A a 48D, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em um anticorpo monoclonal para Proteína F do Vírus Sincitial Respiratório (SynagisTM). A figura 48A é um diagrama ilustrando um anticorpo monoclonal para peptídeo de Proteína F que é mutado para conter sítio(s) de N-glicosilação indicando resíduo(s) que se liga(m) a um glicano contemplado para remodelagem, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 48B a 48D são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 48A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00375] A figura 49, compreendendo as figuras 49A a 49D, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em um anticorpo monoclonal TNF-α (RemicadeTM). A figura 49A é um diagrama ilustrando um anticorpo monoclonal para TNF-α que foi mutado para conter sítio(s) de N-glicosilação indicando um resíduo que se liga a um glicano contemplado para remodelagem, e uma fórmula de glicano exemplar ligada ao mesmo. As figuras 49B a 49D são diagramas das etapas de remodelagem contempladas do peptídeo na figura 49A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00376] A figura 50, compreendendo as figuras 50A a 50D, estabelece esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em um anticorpo monoclonal para glicoproteína IIb/IIIa(Reopro™). A figura 50A é um diagrama ilustrando um anticorpo monoclonal mutante para peptídeos de glicoproteína IIb/IIIa que foram mutados para conter sítio(s) de N-glicosilação indicando o(s) resíduos(s) que se liga(m) aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 50B a 50D são diagramas das etapas de remodelagem contempladas com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 50E é um diagrama ilustrando anticorpo monoclonal para peptídeos de fusão glicoproteína IIb/IIIa-mucina indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 50F a 50H são diagramas das etapas de remodelagem contempladas com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 50I é um diagrama ilustrando anticorpo monoclonal para peptídeos de fusão de glicoproteína IIb/IIIa-mucina e anticorpo monoclonal para peptídeos de glicoproteína IIb/IIIa indicando os resíduos que se ligam aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 50J a 50L são diagramas das etapas de remodelagem contempladas com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00377] A figura 51, compreendendo as figuras 51A a 51D, estabelecem esquemas exemplares para remodelagem de estruturas de glicano em um anticorpo monoclonal para CD20 (Rituxan™). A figura 51A é um diagrama ilustrando anticorpo monoclonal para CD20 que foi mutado para conter sítio(s) de N-glicosilação indicando o resíduo que liga-se aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 51B a 51D são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano dos peptídeos na figura 51A, com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada. A figura 51E é um diagrama ilustrando anticorpo monoclonal para CD20 que foi mutado para conter sítio(s) de N-glicosilação indicando o(s) resíduo(s) que ligam-se aos glicanos contemplados para remodelagem, e fórmulas de glicano exemplares ligadas ao mesmo. As figuras 51F a 51G são diagramas das etapas de remodelagem contempladas de glicano dos peptídeos na figura 51E com base no tipo de célula na qual o peptídeo é expresso e a estrutura de glicano remodelada desejada.
[00378] A figura 52, compreendendo as figuras 51A e 51B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) (Id de Seq NOS: 1 e 2, respectivamente).
[00379] A figura 53, compreendendo as figuras 53A e 53B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de alfa interferon (alfa-IFN) (Id de Seq NOS: 3 e 4, respectivamente).
[00380] A figura 54, compreendendo as figuras 54A e 54B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de beta interferon (beta-IFN) (Id de Seq NOS: 5 e 6, respectivamente).
[00381] A figura 55, compreendendo as figuras 55A e 55B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente do Fator VIIa (Id de Seq NOS: 7 e 8, respectivamente).
[00382] A figura 56, compreendendo as figuras 56A e 56B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente do Fator IX (Id de Seq NOS: 9 e 10, respectivamente).
[00383] A figura 57, compreendendo as figuras 57A a 57D, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente das cadeias alfa e beta de hormônio de estimulação de folículo (FSH), respectivamente (Id de Seq NOS: 11 a 14, respectivamente).
[00384] A figura 58, compreendendo as figuras 58A e 58B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de eritropoietina (EPO) (Id de Seq NOS: 15 e 16, respectivamente).
[00385] A figura 59, compreendendo as figuras 59A e 59B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente do fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) (Id de Seq NOS: 17 e 18, respectivamente).
[00386] A figura 60, compreendendo as figuras 60A e 60B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de gama interferon (gama-IFN) (Id de Seq NOS: 19 e 20, respectivamente).
[00387] A figura 61, compreendendo as figuras 61A e 61B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente do inibidor α-1-protease (A-1-PI, ou α- antitripsina) (Id de Seq NOS: 21 e 22, respectivamente).
[00388] A figura 62, compreendendo as figuras 62A-1 a 62A-2, e 62B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de glicocerebrosidase (Id de Seq NOS: 23 e 24, respectivamente).
[00389] A figura 63, compreendendo as figuras 63A e 63B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de ativador de plasminogênio do tipo de tecido (TPA) (Id de Seq NOS: 25 e 26, respectivamente).
[00390] A figura 64, compreendendo as figuras 64A e 64B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de interleucina-2 (IL-2) (Id de Seq NOS: 27 e 28, respectivamente).
[00391] A figura 65, compreendendo as figuras 65A-1 a 65A-4 e figuras 65B-1 a 65B-4, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente do Fator VIII (Id de Seq NOS: 29 e 30, respectivamente).
[00392] A figura 66, compreendendo as figuras 66A e 66B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de uroquinase (Id de Seq NOS: 33 e 34, respectivamente).
[00393] A figura 67, compreendendo as figuras 67A e 67B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente DNase recombinante humana (hrDNase) (Id de Seq NOS: 39 e 40, respectivamente).
[00394] A figura 68, compreendendo as figuras 68A e 68B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de um anticorpo monoclonal humanizado para glicoproteína IIb/IIIa (Id de Seq NOS: 43 e 44, respectivamente).
[00395] A figura 69, compreendendo as figuras 69A e 69B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de proteína-S de um vírus da Hepatite B (HbsAg) (Id de Seq NOS: 45 e 46, respectivamente).
[00396] A figura 70, compreendendo as figuras 70A e 70B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de hormônio do crescimento humano (HGH) (Id de Seq NOS: 47 e 48, respectivamente).
[00397] A figura 71, compreendendo as figuras 71A e 71B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente do receptor de fator de necrose de tumor 75 kDa (TNF-R), que compreende uma porção de Enbrel™ (receptor de fator de necrose de tumor (TNF-R)/IgG] (Id de Seq NOS: 31 e 32, respectivamente).
[00398] A figura 72, compreendendo as figuras 72A e 72B, é uma seqüência de aminoácido exemplar das cadeias leves e pesadas, respectivamente, de Herceptin™ (anticorpo monoclonal (MAb) para receptor de fator de desenvolvimento epidérmico humano Her-2) (Id de Seq NOS: 35 e 36, respectivamente).
[00399] A figura 73, compreendendo as figuras 73A e 73B, é uma seqüência de aminoácido exemplar das cadeias pesadas e leves, respectivamente, de Synagis™ (MAb para peptídeo F de Vírus Sincitial Respiratório) (Id de Seq NOS: 37 e 38, respectivamente).
[00400] A figura 74, compreendendo as figuras 74A e 74B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente de regiões variáveis não humanas de Remicade™ (MAb para TNFα) (Id de Seq NOS: 41 e 42, respectivamente).
[00401] A figura 75, compreendendo as figuras 75A e 75B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente da porção Fc de IgG humano (Id de Seq NOS: 49 e 50, respectivamente).
[00402] A figura 76 é uma seqüência de aminoácido exemplar de cadeia leve de região variável madura de um anticorpo de murino de anti-glicoproteína IIb/IIIa (Id de Seq NO:52).
[00403] A figura 77 é uma seqüência de aminoácido exemplar da cadeia pesada de região variável madura de um anticorpo de murino de anti-glicoproteína IIb/IIIa (Id de Seq NO:54).
[00404] A figura 78 é uma seqüência de aminoácido exemplar a cadeia leve de região variável de IgG humano (Id de Seq NO:51).
[00405] A figura 79 é uma seqüência de aminoácido exemplar de cadeia pesada de região variável de um IgG humano (Id de Seq NO:53).
[00406] A figura 80 é uma seqüência de aminoácido exemplar de uma cadeia leve de um IgG humano (Id de Seq NO:55).
[00407] A figura 81 é uma seqüência de aminoácido exemplar de uma cadeia pesada de um IgG humano (Id de Seq NO:56).
[00408] A figura 82, compreendendo as figuras 82A e 82B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente da região variável madura de cadeia leve de um anticorpo de murino anti-CD20 (Id de Seq NOS: 59 e 60, respectivamente).
[00409] A figura 83, compreendendo as figuras 83A e 83B, é um nucleotídeo exemplar e seqüência de aminoácido correspondente da região variável madura da cadeia pesada de um anticorpo de murino anti-CD20 (Id de Seq NOS: 61 e 62, respectivamente).
[00410] A figura 84, compreendendo as figuras 84A a 84E, é a seqüência de nucleotídeo do vetor de expressão de anticorpo quimérico em tandem TCAE 8 (Id de Seq NOS:57).
[00411] A figura 85, compreendendo as figuras 85A a 85E, é a seqüência de nucleotídeo do vetor de expressão de anticorpo quimérico TCAE 8 contendo os domínios variáveis leve e pesado do anticorpo de murino anti-CD20 (Id de Seq NO:58).
[00412] A figura 86 é uma imagem de um gel acrilamida ilustrando os resultados da análise FACE de pré e pós- sialilação de TP10. As espécies BiNA0 não possuem resíduos de ácido siálico. As espécies BiNA1 possuem um resíduo de ácido siálico. As espécies de BiNA2 possuem dois resíduos de ácido siálico. Bi = biantenário; NA = ácido neuramínico.
[00413] A figura 87 é um gráfico ilustrando a concentração do plasma em μg/ml com o tempo pré e pós- sialilação de TP10 injetado em ratos.
[00414] A figura 88 é um gráfico ilustrando a área sob a curva de concentração do plasma-tempo (AUC) em μg/h/ml para TP10 pré e pós-sialilado.
[00415] A figura 89 é uma imagem de um gel acrilamida ilustrando os resultados da análise FACE de pré e pós fucosilação de TP10. As espécies BiNA2F2 possuem dois resíduos de ácido neuramínico (NA) e dois resíduos de fucose (F).
[00416] A figura 90 é um gráfico ilustrando a ligação in vitro de TP20 (sCR1sLeX) glicosilado in vitro (diamantes) e in vivo em células Lec11 CHO (quadrados).
[00417] A figura 91 é um gráfico ilustrando a análise por 2-AA HPLC de glicoformas da GlcNAc-ilação de EPO.
[00418] A figura 92, compreendendo as figuras 92A e 92B, constitui-se em dois gráficos ilustrando o espectro MALDI-TOF de RNaseB (figura 92A) e o perfil HPLC dos oligossacarídeos clivados de RNaseB por N-Glicanase (figura 92B). A maioria dos sítios de N-glicosilação do peptídeo são modificados com oligossacarídeos de manose superior consistindo em 5 a 9 resíduos de manose.
[00419] A figura 93 é um esquema ilustrando a conversão de N-glicanos de manose superior em N-glicanos híbridos. A enzima 1 é α1,2-manosidase, de Thichodoma reesei ou Aspergillus saitoi. A enzima 2 é GnT-I(β-1,2-N- acetil glicosaminil transferase I). A enzima 3 é GalT- I(β1,4-galactosiltransferase 1). A enzima 4 é α2,3- sialiltransferase ou α2,6-sialiltransferase.
[00420] A figura 94, compreendendo as figuras 94A e 94B, constitui-se em dois gráficos ilustrando o espectro MALDI-TOF de RNaseB tratado com um T. reesei recombinante α1,2-manosidase (figura 94A) e o perfil de HPLC dos oligossacarídeos clivados por N-glicanase do RNaseB modificado (figura 94B).
[00421] Figura 95 é um gráfico ilustrando o espectro de MALDI-TOF de RNaseB tratado com uma α1,3-manosidase disponível comercialmente, purificada de A. saitoi (Glyko & CalBioChem).
[00422] A figura 96 é um gráfico ilustrando o espectro de MALDI-TOF de RNaseB modificado por tratamento do produto mostrado na figura 96 com um GalT 1 recombinante (GlcNAc transferase-1).
[00423] A figura 97 é um gráfico ilustrando o espectro de MALDI-TOF de RNaseB modificado por tratamento do produto mostrado na figura 96 com um GalT 1 recombinante (galactosiltransferase 1).
[00424] A figura 98 é um gráfico ilustrando o espectro de MALDI-TOF de RNaseB modificado por tratamento do produto mostrado na figura 97 com um ST3Gal III recombinante (α2,3- sialiltransferase III) usando CMP-AS como o doador para a transferase.
[00425] A figura 99 é um gráfico ilustrando o espectro de MALDI-TOF de RNaseB modificado por tratamento do produto mostrado na figura 97 com um ST3Gal III recombinante (a2,3- sialiltransferase III) usando CMP-SA-PEG (10 kDa) como o doador para a transferase.
[00426] A figura 100 é uma série de esquemas ilustrando a conversão de N-glicanos de manose superior em N-glicanos complexos. A enzima 1 é a1,2-manosidase de Trichoderma reesei ou Aspergillus saitoi. A enzima 2 é GnT- I. A enzima 3 é GalT-1. A enzima 4 é a2,3-sialiltransferase ou a2,6-sialiltransferase. A enzima 5 é a-manosidase II. A enzima 6 é a-manosidase. A enzima 7 é GnT-II. A enzima 8 é a1,6-manosidase. A enzima 9 é a1,3-manosidase.
[00427] A figura 101 é um diagrama da ligação catalisada por N-acetilglicosaminiltransferase I a VI (GnTI-VI). R = GlcNAc 1, 4GlcNAc-Asn-X.
[00428] A figura 102, compreendendo as figuras 102A e 102B, constitui-se em gráficos ilustrando a análise 2-AA HPLC dos dois lotes de EPO aos quais N-acetilglicosamina foi adicionada. A figura 102A ilustra a análise do lote A, e figura 102B ilustra a análise do lote B.
[00429] Figura 103 é um gráfico ilustrando a análise 2-AA HPLC dos produtos de reação introduzindo uma terceira ramificação de glicano ao EPO com GnT-V.
[00430] A figura 104 é um gráfico ilustrando um espectro de MALDI-TOF dos glicanos da preparação de EPO após tratamento com GnT-I, GnT-II, GnT-III, GnT-IV e GalT1 com grupos doadores apropriados.
[00431] A figura 105 é uma imagem de um gel de focalização isoelétrico (IEF) gel ilustrando os produtos da reação de desialilação da FSH pituitária humana. As pranchas 1 e 4 são padrão de focalização isoelétrico (IEF). A prancha 2 é FSH nativo. Prancha 3 é FSH desialilado.
[00432] A figura 106 é uma imagem de um gel SDS-PAGE dos produtos das reações para fabricar PEG-sialilação de rFSH. As pranchas 1 e 8 são padrão de peso molecular SeeBlue+2. A prancha 2 representa 15 μg de FSh nativo. A prancha 3 representa 15 μg de asialo-FSH (AS-FSH). A prancha 4 representa 15 μg dos produtos de reação de AS-FSH com CMP-SA. A prancha 5 representa 15 μg dos produtos de reação de AS-FSH com CMP-SA-PEG (1 kDa). A prancha 6 representa 15 μg dos produtos da reação de AS-FSH com CMP- SA-PEG (5 kDa). A prancha 7 representa 15 μg dos produtos de reação de AS-FSH com CMP-SA-PEG (10 kDa).
[00433] A figura 107 é uma imagem de um gel de focalização isoelétrico dos produtos de reações para fabricar PEG-sialilação de FSH. As pranchas 1 e 8 são padrão IEF. A prancha 2 representa 15 μg de FSH nativo. A prancha 3 representa 15 μg de asialo-FSH (AS-FSH). A prancha 4 representa 15 μg dos produtos de reação de AS-FSH com CMP-SA. A prancha 5 representa 15 μg dos produtos de reação de AS-FSH com CMP-SA-PEG (1 kDa). A prancha 6 representa 15 μg dos produtos da reação de AS-FSH com CMP- SA-PEG (5 kDa). A prancha 7 representa 15 μg dos produtos de reação de AS-FSH com CMP-SA-PEG (10 kDa).
[00434] A figura 108 é uma imagem de um gel SDS-PAGE de FSH não recombinante nativo, produzido nas células pituitárias humanas. As pranchas 1,2 e 5 são padrão de peso molecular SeeBlue™+2. As pranchas 3 e 4 são FSH nativo a 5 μg e 25 μg, respectivamente.
[00435] A figura 109 é uma imagem de um gel de focalização isoelétrico (pH 3-7) ilustrando os produtos da reação de asialilação de rFSH. As pranchas 1 e 4 são padrão IEF. A prancha 2 é rFSH nativo. Prancha 3 é asialo-rFSH.
[00436] A figura 110 é uma imagem de um gel SDS-PAGE ilustrando os resultados da PEG-sialilação de asialo-rFSH. A prancha 1 é rFSH nativo. A prancha 2 é asialo-FSH. A prancha 3 representa os produtos de reação de asialo-FSH e CMP-SA. As pranchas 4-7 são os produtos da reação entre asialoFSH e 0,5 mM CMP-SA-PEG (10 kDa) em 2 horas, 5 horas, 24 horas, e 48 horas, respectivamente. A prancha 8 representa os produtos de reação entre asialo-FSH e 1,0 mM CMP-SA-PEG (10 kDa) em 48 horas. A prancha 9 representa os produtos de reação entre asialo-FSH e 1.0 mM CMP-SA-PEG (1 kDa) em 48 horas.
[00437] A figura 111 é uma imagem de um gel de focalização isoelétrico mostrando os produtos da PEG- sialilação de asialo-rFSH com um CMP-SA-PEG (1 kDa). Prancha 1 representa rFSH nativo. Prancha 2 representa asialo-rFSH. Prancha 3 representa os produtos de reação de asialo-rFSH e CMP-SA em 24 horas. Pranchas 4-7 representam os produtos de reação de asialo-rFSH e 0,5 mM CMP-SA-PEG (1 kDa) em 2 horas, 5 horas, 24 horas, e 48 horas, respectivamente. Prancha 8 representa nulo. Pranchas 9 e 10 representam os produtos da reação em 48 horas de asialo- rFSH e CMP-SA-PEG (10 kDa) a 0,5 mM e 1,0 mM, respectivamente.
[00438] A figura 112 é um gráfico dos farmacocinéticos de rFSH e rFSH-SA-PEG(1KDa e 10 KDa). Este gráfico ilustra a relação entre o tempo que um composto rFSH está na corrente sangüínea do rato, e a concentração média do composto rFSH no sangue para rFSH glicoPEGilado, em comparação ao rFSH não PEGilado.
[00439] A figura 113 é um gráfico dos resultados do bioensaio de FSH usando células Sertoli. Esse gráfico ilustra a relação entre a concentração de FSH no meio de incubação da célula Sertoli e a quantidade de 17-β estradiol liberada das células Sertoli.
[00440] A figura 114 é uma imagem de um gel SDS-PAGE: padrão (Prancha 1); transferrina nativa (Prancha 2); asialotransferrina (Prancha 3); asialotransferrina e CMP-SA (Prancha 4); Pranchas 5 e 6, asialotransferrina e CMP-SA- PEG (1 kDa) a 0,5 mM e 5 mM, respectivamente; Pranchas 7 e 8, asialotransferrina e CMP-SA-PEG (5 kDa) a 0,5 mM e 5 mM, respectivamente; Pranchas 9 e 10, asialotransferrina e CMP- SA-PEG (10 kDa) a 0,5 mM e 5 mM, respectivamente.
[00441] A figura 115 é uma imagem de um gel IEF: transferrina nativa (Prancha 1); asialotransferrina (Prancha 2); asialotransferrina e CMP-SA, 24 horas (Prancha 3); asialotransferrina e CMP-SA, 96 horas (Prancha 4) Pranchas 5 e 6, asialotransferrina e CMP-SA-PEG (1 kDa) em 24 horas e 96 horas, respectivamente; Pranchas 7 e 8, asialotransferrina e CMP-SA-PEG (5 kDa) em 24 horas e 96 horas, respectivamente; Pranchas 9 e 10, asialotransferrina e CMP-SA-PEG (10 kDa) em 24 horas e 96 horas, respectivamente.
[00442] A figura 116 é uma imagem de um gel de focalização isoelétrico (pH 3-7) de asialo-Fator VIIa. Prancha 1 representa rFator VIIa; pranchas 2-5 representam asialo-Fator VIIa.
[00443] A figura 117 é um gráfico dos espectros MALDI do Fator VIIa.
[00444] A figura 118 é um gráfico de espectros MALDI do Fator VIIa-PEG (1 kDa).
[00445] A figura 119 é um gráfico ilustrando espectros MALDI de Fator VIIa-PEG (10 kDa).
[00446] A figura 120 é uma imagem de um gel SDS-PAGE de Fator VIIa PEGilado. Prancha 1 representa asialo-Fator VIIa. Prancha 2 representa o produto de reação de asialo- Fator VIIa e CMP-SA- PEG(1 kDa) com ST3Gal3 após 48 horas. Prancha 3 representa o produto de reação de asialo-Fator VIIa e CMP-SA-PEG (1 kDa) com ST3Gal3 após 48 horas. Prancha 4 representa o produto de reação de asialo-Fator VIIa e CMP-SA-PEG (10 kDa) com ST3Gal3 em 96 horas.
[00447] A figura 121 é uma imagem de um gel IEF ilustrando o pI dos produtos do procedimento de desialilação. Pranchas 1 e 5 representam padrão IEF. Prancha 2 representa a proteína do Fator IX. Prancha 3 representa a proteína do rFator IX. Prancha 4 representa a reação de desialilação da proteína do rFator IX em 20 horas.
[00448] A figura 122 é uma imagem de um gel SDS-PAGE ilustrando o peso molecular do Fator IX conjugado com SA- PEG (1 kDa) ou SA-PEG (10 kDa) após reação com CMP- SA-PEG. Pranchas 1 e 6 representam padrão de peso molecular SeeBlue +2. Prancha 2 representa rF-IX. Prancha 3 representa rF-IX desializado. Prancha 4 representa rFator IX conjugado a SA- PEG(1 kDa). Prancha 5 representa rFator IX conjugado ao SA- PEG (10 kDa).
[00449] A figura 123 é uma imagem de um gel SDS-PAGE ilustrando os produtos de reação de sialilação direta do Fator-IX e capeamento de ácido siálico do Fator-IX-SA-PEG. Prancha 1 representa padrão de proteína, a prancha 2 representa nulo; a prancha 3 representa rFator-IX; prancha 4 representa rFator-IX-SA-PEG capeado com SA (10KDa); prancha 5 representa rFator-IX-SA-PEG (10 KDa); prancha 6 representa ST3Gall; prancha 7 representa ST3Gal3; pranchas 8, 9, 10 representam rFator-IX-SA-PEG (10 KDa) sem tratamento de sialidase anterior.
[00450] A figura 124 é um gráfico ilustrando um espectro MALDI os glicanos de EPO nativo.
[00451] A figura 125 é uma imagem de um gel SDS-PAGE dos produtos das reações de PEGilação usando CMP-NAN- PEG(1KDa) e CMP-NAN-PEG(10KDa).
[00452] A figura 126 é um gráfico ilustrando os resultados do bioensaio in vitro de EPO PEGilado. Diamantes representam os dados do EPO sialilado sem moléculas PEG. Quadrados representam os dados obtidos usando EPO com PEG (1 KDa). Triângulos representam os dados obtidos usando EPO com PEG (10 KDa).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00453] A presente invenção inclui processos e composições para a adição in vitro isenta de célula e/ou apagamento de açúcares a ou de uma molécula de peptídeo de tal modo a prover uma molécula de glicopeptídeo possuindo um padrão de glicosilação desejado ou específico, onde o glicopeptídeo é produzido em uma escala industrial. Em uma modalidade preferida da invenção, o glicopeptídeo assim produzido tem anexado ao mesmo um açúcar modificado que foi adicionado ao peptídeo através de uma reação enzimática. Um aspecto chave da invenção é tomar-se um peptídeo produzido por qualquer tipo de célula e gerar uma estrutura de glicano de núcleo no peptídeo, após o que a estrutura de glicano é então remodelada in vitro, para gerar um glicopeptídeo possuindo um padrão de glicosilação apropriado para uso terapêutico em um mamífero. Mais especificamente é possível, de acordo com a presente invenção, preparar uma molécula de glicopeptídeo possuindo uma molécula de açúcar modificada ou outro composto conjugado à mesma, tal que, a molécula de conjugado confere uma propriedade benéfica ao peptídeo. De acordo com a presente invenção, a molécula de conjugado é adicionada ao peptídeo enzimaticamente devido a adição a base de enzima das moléculas de conjugado aos peptídeos ter a vantagem da regioseletividade e estereoseletividade. É, portanto, possível usar-se os processos e composições fornecidas aqui para remodelar um peptídeo de modo a conferir, mediante o peptídeo, uma estrutura de glicano desejada, preferivelmente possuindo açúcar modificado anexado à mesma. É também possível, usando os processos e composições da invenção, gerar moléculas de peptídeo possuindo estruturas de glicano desejadas e/ou modificadas em uma escala industrial, pelo que, pela primeira vez, fornecendo a técnica com uma solução prática para a produção eficaz dos peptídeos terapêuticos aperfeiçoados.
Definições
[00454] A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e específicos usados aqui possuem, geralmente, o mesmo significado comumente entendido por um versado na técnica a qual esta invenção pertence. De modo geral, a nomenclatura usada aqui e os procedimentos laboratoriais na cultura de célula, genética molecular, química orgânica e química de ácido nucléico e hibridização são aqueles bem conhecidos e geralmente empregados na técnica. Técnicas padrão são usadas para síntese de ácido nucléico e peptídeos. As técnicas e procedimentos são geralmente realizados de acordo com os processos convencionais na arte e várias referências gerais (por exemplo, Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), que são fornecidas através de todo este documento. A nomenclatura usada aqui e os procedimentos laboratoriais usados na química analítica e sínteses orgânicas descritas a seguir são bem conhecidos e geralmente empregados na técnica. Técnicas padrão ou modificações dos mesmos, são usadas para síntese química e análises químicas.
[00455] Os artigos "o, a" "um, uma" são usados aqui para referir-se a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Como exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento.
[00456] O termo "anticorpo" conforme usado aqui, se refere a uma molécula de imunoglobulina que é capaz de ligar-se especificamente a um epítopo específico em um antígeno. Anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunoreativas de imunoglobulinas intactas. Anticorpos são tipicamente tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. Os anticorpos na presente invenção podem existir em várias formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, bem como anticorpos de cadeia simples e anticorpos humanizados (Harlow e outros , 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow e outros, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston e outros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird e outros, 1988, Science 242: 423-426).
[00457] O termo "anticorpo sintético" conforme usado aqui, significa um anticorpo que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, um anticorpo expresso por um bacteriófago conforme descrito aqui. O termo também seria construído para significar um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA codificando o anticorpo e a molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo ou uma seqüência de aminoácido especificando o anticorpo, onde o DNA ou seqüência de aminoácido foi obtido usando DNA sintético ou tecnologia de seqüência de aminoácido que está disponível e é bem conhecida na técnica.
[00458] Conforme usado aqui, uma molécula biológica "funcional" é uma molécula biológica em uma forma na qual ela exibe uma propriedade pela qual é caracterizada. Uma enzima funcional, por exemplo, é uma que exibe a atividade catalítica característica pela qual a enzima é caracterizada.
[00459] Conforme usado aqui, a estrutura
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é o ponto de conexão entre um aminoácido na cadeia de peptídeo e a estrutura de glicano.
[00460] Oligossacarídeos "ligados em N" são aqueles oligossacarídeos que são ligados a um esqueleto de peptídeo através de asparagina, por meio de uma ligação de asparagina-N-acetilglicosamina. Oligossacarídeos ligados em N são também denominados "N-glicanos". Todos os oligossacarídeos ligados em N possuem núcleo de pentassacarídeo comum de Man3GlcNAc2. Eles diferem em presença de e no número de ramificações (também denominadas antenase) de açúcares periféricos, tais como, N- acetilglicosamina, galactose, N-acetilgalactosamina, fucose e ácido siálico. Opcionalmente, esta estrutura pode também conter uma molécula de fucose de núcleo e/ou uma molécula de xilose.
[00461] Uma "estrutura de núcleo de trimanosila elementar" se refere a uma porção de glicano compreendendo unicamente uma estrutura de núcleo de trimanosila, sem açúcares adicionais anexados a mesma. Quando o termo "elementar" não está incluído na descrição da "estrutura de núcleo de trimanosila", então o glicano compreende a estrutura de núcleo de trimanosila com açúcares adicionais anexados a mesma. Opcionalmente, esta estrutura pode também conter uma molécula de fucose de núcleo e/ou uma molécula de xilose.
[00462] O termo "glicopeptídeo de núcleo de trimanosila elementar" é usado aqui para referir-se a um glicopeptídeo possuindo estruturas de glicano compreendidas primariamente de uma estrutura de núcleo de trimanosila. Opcionalmente, esta estrutura pode também conter uma molécula de fucose de núcleo e/ou uma molécula de xilose.
[00463] Oligossacarídeos "ligados em O" são aqueles oligossacarídeos que são ligados a um esqueleto de peptídeo através de treonina ou serina.
[00464] Todos os oligossacarídeos descritos aqui são descritos com o nome ou abreviatura para o sacarídeo de não redução (isto é, Gal), seguido pela configuração da ligação glicosídica (α ou β), a ligação do anel (1 ou 2), a posição do anel do sacarídeo de redução envolvido na ligação (2, 3, 4, 6 ou 8) e então o nome ou abreviatura do sacarídeo de redução (isto é, GlcNAc). Cada sacarídeo é preferivelmente uma piranose. Para uma revisão da nomenclatura de glicobiologia padrão vide, Essentials of Glycobiology Varki e outros, eds., 1999, CSHL Press.
[00465] O termo "ácido siálico" se refere a vários de uma família de açúcares carboxilados de nove carbonos. O elemento mais comum da família do ácido siálico é ácido N- acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3,5-dideóxi-D- glicero-D-galactononulopiranos-l-ônico (freqüentemente abreviado como Neu5Ac, NeuAc, ou NANA). Um segundo elemento da família é ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc ou NeuGc), onde o grupo N-acetila de NeuAc é hidroxilado. Um terceiro elemento da família do ácido siálico é o ácido 2- ceto-3-deóxi-nonulônico (KDN) (Nadano e outros (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori e outros, J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). Também estão incluídos os ácidos siálico substituído 9, tal como um 9-O-C1-C6 acil- Neu5Ac semelhante a 9-O-lactil-Neu5Ac ou 9-O-aetil-Neu5Ac, 9-deóxi-9-flúor-Neu5Ac e 9-azido-9-deóxi-Neu5Ac. Para rever a família do ácido siálico, vide, por exemplo, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). A síntese e uso de compostos de ácido siálico em um procedimento de sialilação é revelada no pedido internacional WO 92/16640, publicado em 1° de outubro de 1992.
[00466] Um peptídeo possuindo "glicosilação desejada" conforme usado aqui, é um peptídeo que compreende uma ou mais moléculas que são necessárias para atividade biológica eficaz do peptídeo.
[00467] Uma "doença" é um estado de saúde de um animal, onde o animal não pode manter a homeostase e onde se a doença não melhora, então a saúde do animal continua a deteriorar-se.
[00468] A "área sob a curva" ou "AUC" conforme usado aqui no contexto de administração de um medicamento de peptídeo a um paciente é definido como a área total sob a curva que descreve a concentração do medicamento na circulação sistêmica no paciente como uma função do tempo de zero ao infinito.
[00469] O termo "meia-vida" ou "t V conforme usado aqui no contexto de administração de um medicamento de peptídeo a um paciente, é definido como o tempo necessário para que a concentração de plasma de um medicamento em um paciente seja reduzido pela metade. Pode haver mais do que uma meia vida associada ao medicamento de peptídeo, dependendo de múltiplos mecanismos de espaçamento, redistribuição e outros mecanismos bem conhecidos na técnica. Geralmente, meias vidas alfa e beta são definidas, tal que, a fase alfa está associada com a redistribuição e a fase beta está associada com o apagamento. Contudo, com medicamentos de proteína que são, em sua maior parte, confinados à corrente sangüínea, podem haver pelo menos duas meias vidas de espaçamento. Para alguns peptídeos glicosilados, o espaçamento da fase beta rápido pode ser mediado através de receptores em macrófagos ou células endoteliais que reconhecem galactose terminal, N- acetilgalactosamina, N-acetilglicosamina, manose ou fucose. Espaçamento de fase beta mais lento pode ocorrer através de filtração glomerular renal para moléculas com um raio eficaz < 2 nm (cerca de 68 kD) e/ou absorção específica ou não específica e metabolismo nos tecidos. A glicoPEgilação pode tampar ou capear açúcares terminais (por exemplo, galactose ou N-acetilgalactosamina) e desta forma bloquear o espaçamento de fase alfa rápido, através de receptores que reconhecem esses açúcares. Ela pode também conferir um raio eficaz maior e desta forma, aumentar o volume de distribuição e absorção do tecido, desta forma prolongando a fase beta tardia. Assim, o impacto preciso da glicoPEgilação nas meias vidas de fase alta e fase beta variará dependendo do tamanho, estado de glicosilação e outros parâmetros, como é bem conhecido na técnica. Explicação adicional da "meia-vida" é encontrada em Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120).
[00470] O termo "tempo de residência", conforme usado aqui no contexto de administração de um medicamento de peptídeo a um paciente, é definido como o tempo médio que o medicamento permanece no corpo do paciente após a dosagem.
[00471] Um "ácido nucléico isolado" se refere a um segmento de ácido nucléico ou fragmento que foi separado das seqüências que flanqueiam o mesmo em um estado que ocorre naturalmente, por exemplo, um fragmento de DNA que foi removido das seqüências que estão normalmente adjacentes ao fragmento, por exemplo, as seqüências adjacentes ao fragmento em um genoma no qual ele ocorre naturalmente. O termo também se aplica aos ácidos nucléicos que foram substancialmente purificados de outros componentes que acompanham naturalmente o ácido nucléico, por exemplo, RNA ou DNA ou proteínas que acompanham naturalmente o mesmo na técnica. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma ou no DNA genômico de um procariote ou eucariote, o que existe como uma molécula separada (por exemplo, como DNA ou um fragmento genômico ou de cDNA produzido por PCR ou digestão de enzima de restrição) independente de outras seqüências. Isto também inclui um DNA recombinante que faz parte da seqüência de peptídeo adicional codificando um ácido nucléico híbrido.
[00472] Um "polinucleotídeo" significa um filamento simples ou filamentos anti-paralelos e paralelos de um ácido nucléico. Assim, um polinucleotídeo pode ser tanto um ácido nucléico de filamento simples ou filamento duplo.
[00473] O termo "ácido nucléico" tipicamente se refere aos polinucleotídeos grandes. O ermo "oligonucleotídeo" se refere, tipicamente, aos polinucleotídeos pequenos, geralmente não superiores a cerca de 50 nucleotídeos.
[00474] Uma nota convencional é usada aqui para descrever seqüências de polinucleotídeo: a extremidade a esquerda de uma seqüência de polinucleotídeo de filamento simples é extremidade 51; a direção a esquerda da seqüência de polinucleotídeo de filamento duplo é referida como direção 5'. A direção de adição 5' a 3' dos nucleotídeos para transcritos de RNA nascentes é referida como a direção de transcrição. O filamento de DNA possuindo a mesma seqüência que um mRNA é referido como o "filamento de codificação"; seqüências no filamento de DNA que estão localizadas a 5' em relação a um ponto de referência no DNA são referidas como "seqüências a montante"; seqüências no filamento de DNA que estão a 3' em relação a um ponto de referência no DNA são referidas como "seqüências a jusante".
[00475] "Codificação" se refere à propriedade inerente das seqüências específicas dos nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como, gene, um cDNA ou um mRNA para servir como gabaritos para síntese de outros polímeros e macromoléculas nos processos biológicos possuindo tanto uma seqüência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma seqüência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultantes dos mesmos. Assim, uma seqüência de ácido nucléico codifica uma proteína se a transcrição e a tradução de mRNA correspondentes aquele ácido nucléico produzem a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Ambos o filamento de codificação, a seqüência de nucleotídeo do mesmo sendo idêntica à seqüência de mRNA e sendo geralmente provida na listagem de seqüências, e o filamento de não codificação, usado como o gabarito para transcrição de um gene ou cDNA, podem ser referidos como codificando a proteína ou outro produto daquele ácido nucléico ou cDNA.
[00476] A menos que de outra forma especificado, uma "seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de aminoácido" inclui todas as seqüências de nucleotídeo que são versões degeneradas uma da outra e que codificam a mesma seqüência de aminoácido. Seqüências de nucleotídeo que codificam proteínas e RNA podem incluir introns.
[00477] "Homóloga" conforme usada aqui, se refere a similaridade da seqüência de subunidade entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucléico, por exemplo, duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA ou entre duas moléculas de peptídeo. Quando uma posição de subunidade em ambas as duas moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então elas são homólogas naquela posição. A homologia entre duas seqüências é uma função direta do número de combinações ou posições homólogas, por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero de dez subunidades de comprimento) das posições em duas seqüências de composto são homólogas, então, as duas seqüências são 50% homólogas, se 90% das posições, por exemplo 9 de 10, são combinadas ou homólogas, as duas seqüências compartilham 90% de homologia. Como exemplo, as seqüências de DNA 3'ATTGCC5' e 3'TATGGC compartilham 50% de homologia.
[00478] Conforme usado aqui, "homologia" é usada como sinônimo para "identidade".
[00479] A determinação do percentual de identidade entre duas seqüências de nucleotídeo ou aminoácido pode ser realizada, usando um algoritmo matemático. Por exemplo, um algoritmo matemático útil para comparar duas seqüências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268), modificado como em Karlin and Altschul (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Este algoritmo é incorporado aos programas NBLAST e XBLAST de Altschul, e outros (1990, J. Mol. Biol. 215: 403- 410), e pode ser acessado, por exemplo, no site do National Center for Biotechnology Information (NCBI) possuindo o locador de recurso universal "http://www. ncbi. nhn. nih.gov/BLAST/". Pesquisas com o nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST (designado "blastn" no site NCBI) usando os seguintes parâmetros: penalidade da fenda = 5; penalidade de extensão da fenda = 2; penalidade de combinação = 3; recompensa da combinação = 1; valor esperado 10,0 e tamanho da palavra = 11 para obter seqüências de nucleotídeo homólogas a um ácido nucléico descrito aqui. As pesquisas da proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST (designado "blastn" no site NCBI) ou o programa "blastp" do NCBI usando os seguintes parâmetros: valor esperado 10,0, matriz de classificação BLOSUM62 para obter-se seqüências de aminoácido homólogas a uma molécula de proteína descrita aqui. Para obtenção de alinhamentos em fendas para fins de comparação, BLAST fendido pode ser utilizado como descrito em Altschul e outros (1997, Nucleic Acids Res. 25: 33893402). Alternativamente, PSI-Blast ou PHI-Blast podem ser usados para realizar uma pesquisa que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.) e relações entre as moléculas que compartilham um padrão comum. Quando se utiliza programas BLAST, BLAST Fendido, PSI-Blast e PHI- Blast, os parâmetros de falha dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Vide http://www.ncbi.nlm. nih. gov.
[00480] A identidade percentual entre duas seqüências pode ser determinada usando técnicas semelhantes aquelas descritas acima com ou sem permitir fendas. No cálculo do percentual de identidade, são contadas tipicamente combinações exatas.
[00481] Uma "unidade de expressão de ácido nucléico heteróloga" codificando um peptídeo é definida como um ácido nucléico possuindo uma seqüência de codificação para um peptídeo de interesse operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controle de expressão, tais como, seqüências promotoras e/ou repressoras, onde pelo menos uma das seqüências é heteróloga, isto é, não é normalmente encontrada na célula hospedeira.
[00482] Pela descrição de dois polinucleotídeos como "operavelmente ligados" isto significa que um filamento simples ou porção de ácido nucléico de filamento duplo compreende os dois polinucleotídeos dispostos dentro da porção de ácido nucléico, de tal maneira que, pelo menos um dos dois polinucleotídeos é capaz de exercer um efeito fisiológico pelo que ele é caracterizado pelo outro. Por meio de exemplo, um promotor operavelmente ligado à região de codificação de um ácido nucléico é capaz de promover transcrição da região de codificação.
[00483] Conforme usado aqui o termo "seqüência promotora/reguladora" significa uma seqüência de ácido nucléico que é necessária para expressão de um produto de gene operavelmente ligado à seqüência promotora/reguladora. Em alguns casos, essa seqüência pode ser a seqüência promotora de núcleo e em outros casos, esta seqüência pode também incluir uma seqüência melhoradora e outros elementos reguladores que são necessários para expressão do produto de gene. A seqüência promotora/reguladora pode, por exemplo, ser uma que expresse o produto de gene em uma maneira específica de tecido.
[00484] Um "promotor constitutivo" é um promotor que direciona a expressão de um gene ao qual está operativamente ligado, em uma maneira constante em uma célula. Por exemplo, promotores que direcionam expressão dos genes que cuidam das células são considerados como sendo promotores constitutivos.
[00485] Um promotor "induzível" é uma seqüência de nucleotídeo que, quando operativamente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto de gene, faz com que o produto de gene seja produzido em uma célula viva, substancialmente e apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.
[00486] Um promotor "específico de tecido" é uma seqüência de nucleotídeo que, quando operavelmente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto de gene, faz com que o produto de gene seja produzido em uma célula viva, substancialmente e apenas quando a célula for uma célula do tempo de tecido correspondendo ao promotor.
[00487] Um "vetor" é uma composição da matéria que compreende um ácido nucléico isolado e que pode ser usada para liberar o ácido nucléico isolado para o interior da célula. Vários vetores são conhecidos na técnica incluindo, porém não limitado aos polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados aos compostos iônicos e anfifílicos, plasmídeos e vírus. O termo "vetor" inclui um plasmídeo ou um vírus de replicação autônoma. O termo também poderia incluir compostos não plasmídeo e não viróticos, que facilitam a transferência do ácido nucléico para as células, tal como, por exemplo, compostos polilisina, lipossomas e semelhantes. Exemplos de vetores viróticos incluem, porém não estão limitados aos vetores adenoviróticos, vetores de vírus associados a adeno, vetores retroviróticos e semelhantes.
[00488] "Vetor de expressão" se refere a um vetor compreendendo um polinucleotídeo recombinante contendo sequencias de controle de expressão operativamente ligadas a uma seqüência de nucleotídeo a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de atuação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, tais como, cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, puros ou contidos em lipossomas) e vírus que incorporam o polinucleotídeo recombinante.
[00489] Uma célula "modificada geneticamente" ou "recombinante" é uma célula possuindo uma ou mais modificações ao material genético da célula. Tais modificações incluem, porém não estão limitadas às inserções de material genético, apagamentos de material genético e inserção de material genético que é extracromossômico se tal material for mantido ou não estavelmente.
[00490] Um "peptídeo" é um oligopeptídeo, polipeptídeo, peptídeo, proteína ou glicoproteína. O uso do termo "peptídeo" aqui inclui um peptídeo possuindo uma molécula de açúcar anexada ao mesmo, quando a molécula de açúcar é anexada ao mesmo.
[00491] Conforme usado aqui, "forma nativa" significa a forma do peptídeo quando produzido por células e/ou organismos nos quais ele é encontrado na natureza. Quando o peptídeo é produzido por várias células e/ou organismos, o peptídeo pode ter várias formas nativas.
[00492] "Peptídeo" se refere a um polímero no qual os monômeros são aminoácidos e são ligados em conjunto através das ligações amida, alternativamente referidos como peptídeo. Adicionalmente, aminoácidos não naturais, por exemplo, β-alanina, fenilglicina e homoarginina são também incluídos. Aminoácidos que não são codificados por ácido nucléico também podem ser usados na presente invenção. Adicionalmente, aminoácidos que foram modificados para incluir grupos reativos, sítios de glicosilação, polímeros, porções terapêuticas, biomoléculas e semelhante podem também ser usados na invenção. Todos os aminoácidos usados na presente invenção podem ser tanto isômeros D ou L dos mesmos. O isômero L é geralmente o preferido. Além disto, outros que imitam os peptídeos são também úteis na presente invenção. Conforme usado aqui "peptídeo" se refere aos peptídeos glicosilados e não glicosilados. Também estão incluídos os peptídeos que são glicosilados de modo incompleto pelo sistema que expressa o peptídeo. Para uma revisão geral vide, Spatola, A. F., em CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983).
[00493] O termo "conjugado de peptídeo" se refere as espécies da invenção onde um peptídeo é conjugado com um açúcar modificado, conforme estabelecido aqui.
[00494] O termo "aminoácido" se refere aos aminoácidos sintéticos e que ocorrem naturalmente, bem como análogos de aminoácido e imitadores de aminoácido que funcionam de modo semelhante aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são modificados mais tarde, por exemplo, hidróxiprolina, y-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se referem aos compostos que possuem a mesma estrutura química básica que o aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um α carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfônio metionina. Tais análogos possuem grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou esqueletos de peptídeo modificados, porém retêm a mesma estrutura química básica do aminoácido que ocorre naturalmente. Os imitadores de aminoácido se referem aos compostos químicos que possuem uma estrutura que é diferente daquela da estrutura química geral de um aminoácido, porém que funcionam de maneira semelhante ao aminoácido que ocorre naturalmente.
[00495] Conforme usado aqui, aminoácidos são representados pelo nome completo dos mesmos, pelo código de três letras correspondente aos mesmos ou pelo código de uma letra correspondendo aos mesmos, conforme indicado na tabela 1 que se segue:
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[00496] A presente invenção também provê análogos de proteínas ou peptídeos que compreendem uma proteína conforme identificada acima. Análogos podem diferir das proteínas ou peptídeos que ocorrem naturalmente, por seqüências diferenças de seqüência de aminoácido conservadoras ou por modificações que não afetam a seqüência ou por ambas. Por exemplo, alterações de aminoácido conservadoras podem ser feitas, que, embora alterem a seqüência primária da proteína ou peptídeo, não alteram normalmente sua função. As substituições de aminoácido conservadoras tipicamente incluem substituições dentro dos grupos que se seguem: Glicina, alanina; Valina, isoleucina, leucina; Ácido aspártico, ácido glutâmico; Asparagina, glutamina; Serina, treonina; Lisina, arginina; Fenilalanina, tirosina
[00497] Modificações (que normalmente não alteram a seqüência primária) incluem derivação química in vivo ou in vitro de peptídeos, por exemplo, acetilação ou carboxilação. Também estão incluídas modificações de glicosilação, por exemplo, aquelas por modificação dos padrões de glicosilação de um peptídeo durante sua síntese e processamento ou em etapas de processamento adicionais; por exemplo, por exposição do peptídeo as enzimas que afetam a glicosilação, por exemplo, enzimas de glicosilação de mamíferos ou desglicosilação. Também estão englobadas as seqüências que possuem resíduos de aminoácido fosforilados, por exemplo, fosfotirosina, fosfoserina ou fosfotreonina.
[00498] Será apreciado, naturalmente, que os peptídeos podem incorporar resíduos de aminoácido que são modificados sem afetar a atividade. Por exemplo, o término pode ser derivatizado para incluir grupos de bloqueio, isto é, substitutos químicos apropriados para proteger e/ou estabilizar o terminal N- e C de "degradação indesejável", um termo que significa englobar qualquer tipo de rompimento enzimático, químico ou bioquímico do composto e seu terminal que, provavelmente, afetará a função do composto, isto é, a degradação seqüencial do composto em uma extremidade terminal do mesmo.
[00499] Os grupos de bloqueio incluem grupos de proteção convencionalmente usados na técnica da química de peptídeo o que não afetará adversamente as atividades in vitro do peptídeo. Por exemplo, os grupos de bloqueio de terminal N apropriados podem ser introduzidos por alquilação ou acilação do terminal N. Exemplos de grupos de bloqueio de terminal N incluem grupos alquila ramificados C1-5 ou não ramificados, grupos acila, tais como, grupos formila e acetila, bem como grupos formila e acetila, bem como formas substituídas dos mesmos, tais como, grupos acetamidometil (Acm), Fmoc ou Boc. Análogos de desamino dos aminoácidos são também grupos de bloqueio de terminal N úteis e podem tanto ser acoplados ao terminal N do peptídeo como usados no lugar do resíduo de terminal N. Grupos de bloqueio de terminal C apropriados, os quais o grupo de carboxila do terminal C é incorporado ou não, incluem ésteres, cetonas ou amidas. Os grupos alquila de formação de éster ou cetona, especificamente grupos alquila inferiores, tais como, grupos amino de formação de metila, etila e propila, tais como, aminas primárias (-NH2) e grupos mono e dialquilamino, tais como, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, metiletilamino e semelhantes são exemplos de grupos de bloqueio de terminal C. Análogos de aminoácido descarboxilados tais como, agmatina são também grupos de bloqueio de terminal C úteis e podem ser acoplados ao resíduo de terminal C do peptídeo quanto usados no lugar dos mesmos. Adicionalmente, será apreciado que os grupos de amino livre e carboxila no terminal pode ser removidos em conjunto do peptídeo para render formas desamino e descarboxiladas do mesmo, sem afetar a atividade do peptídeo.
[00500] Outras modificações podem também ser incorporadas sem afetar adversamente a atividade e estas incluem, porém não estão limitadas a substituição de um ou mais dos aminoácidos na forma isomérica L natural com aminoácidos na forma isomérica D. Assim, o peptídeo pode incluir um ou mais resíduos de aminoácido D ou pode compreender aminoácidos que estão todos na forma D. As formas retroinversas de peptídeos de acordo com a presente invenção são também contempladas, por exemplo, peptídeos invertidos onde todos os aminoácidos são substituídos com formas de aminoácido D.
[00501] Os sais de adição de ácido da presente invenção são também contemplados como equivalentes funcionais. Assim, um peptídeo de acordo com a presente invenção tratado com um ácido inorgânico, tal como, clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico e semelhantes ou um ácido orgânico, tal como, acético, propiônico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malônico, succínico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, benzóico, cinâmico, mandélico, metanossulfônico, etanossulfônico, p- toluenossulfônico, salicíclico e semelhante, para prover um sal solúvel em água do peptídeo é apropriado para uso na invenção.
[00502] Os peptídeos também estão incluídos os quais foram modificados usando técnicas de biologia molecular comum, de modo a aperfeiçoar sua resistência a degradação proteolítica ou para otimizar as propriedades de solubilidade ou tornar os mesmos mais apropriados como agente terapêutico. Análogos de tais peptídeos incluem aqueles contendo resíduos que não os aminoácidos L que ocorrem naturalmente, por exemplo, aminoácidos D ou aminoácidos sintéticos que não ocorrem naturalmente. Os peptídeos da invenção não estão limitados aos produtos de qualquer um dos processos exemplares específicos listados aqui.
[00503] Conforme usado aqui, o termo "MALDI" é uma abreviação de Ionização de Dessorção a Laser Auxiliada de Matriz. Durante a ionização, SA-PEG (ácido siálico- poli(etileno glicol)) pode ser parcialmente eliminado da estrutura de N-glicano da glicoproteína.
[00504] Conforme usado aqui, o ermo "glicosiltransferase" se refere a qualquer enzima/proteína que tenha a capacidade de transferir um açúcar doador para uma porção aceitadora.
[00505] Conforme usado aqui, o termo "açúcar modificado" se refere a um carboidrato que ocorre naturalmente ou não que é adicionado enzimaticamente a um aminoácido ou um resíduo glicosila de um peptídeo em um processo da invenção. O açúcar modificado é selecionado de vários substratos de enzima incluindo, porém, não limitado aos nucleotídeos de açúcar (mono, di e trifosfatos), açúcares ativados (por exemplo, haletos de glicosila, mesilatos de glicosila) e açúcares que não são ativados ou nucleotídeos.
[00506] O "açúcar modificado" é covalentemente funcionalizado com um "grupo de modificação". Grupos de modificação úteis incluem, porém não estão limitados aos polímeros solúveis em água, porções terapêuticas, porções de diagnóstico, biomoléculas e semelhantes. Os locais de funcionalização com o grupo de modificação são selecionados, tal que, eles não impedem que o "açúcar modificado" seja adicionado enzimaticamente a um peptídeo.
[00507] O termo "solúvel em água" se refere as porções que possuem algum grau detectável de solubilidade em água. Os processos para detectar e/ou quantificar solubilidade em água são bem conhecidos na técnica. Polímeros solúveis em água exemplares incluem peptídeos, sacarídeos, poli(éteres), poli(aminas), poli(ácidos carboxílicos) e semelhantes. Os peptídeos podem ter seqüências misturadas ou ser compostos de um aminoácido simples, por exemplo, poli(lisina). De modo semelhante, os sacarídeos podem ser de seqüência mista ou composta de uma subunidade de sacarídeo simples, por exemplo, dextrano, amilose, quitosano e poli(ácido siálico). Um poli(éter) exemplar é poli(etileno glicol). Poli(etileno imina) é uma poliamina exemplar e ácido poli(aspártico) é um poli(ácido carboxílico) representativo.
[00508] O termo "grupo de ligação de glicosila" conforme usado aqui se refere a um resíduo de glicosila ao qual foi anexado covalentemente um agente (por exemplo, polímero solúvel em água, porção terapêutica, biomolécula). Nos processos da invenção, o "grupo de ligação de glicosila" torna-se covalentemente ligado a um peptídeo glicosilado ou não glicosilado, desta forma ligando o agente a um aminoácido e/ou resíduo de glicosila no peptídeo. Um "grupo de ligação glicosila" é geralmente derivado de um "açúcar modificado" por anexação enzimática do "açúcar modificado" a um aminoácido e/ou resíduo de glicosila do peptídeo. Um "grupo de ligação de glicosila intacto" se refere a um grupo de ligação que é derivado de uma porção glicosila onde o monômero de sacarídeo individual que liga o conjugado não é degradado, por exemplo, oxidado, por exemplo, por metaperiodato de sódio. "Grupos de ligação de glicosila intactos" da invenção podem ser derivados de um oligossacarídeo que ocorre naturalmente por adição de unidade(s) glicosila ou remoção de uma ou mais unidade glicosila de uma estrutura de sacarídeo de origem.
[00509] Os termos "porção direcional" e "agente direcional" são usados aqui, com referência as espécies que seletivamente serão localizadas em um tecido específico ou região do corpo. A localização é mediada por reconhecimento específico de determinantes moleculares, tamanho molecular do agente direcional ou conjugado, interações iônicas, interações hidrófobas e semelhantes. Outros mecanismos direcionais de um agente a um tecido específico ou região são conhecidos dos versados na técnica.
[00510] Conforme usado aqui, "porção terapêutica" significa qualquer agente útil para terapia incluindo, porém, não limitado aos antibióticos, agentes antiinflamatórios, medicamentos antitumor, citotoxinas e agentes radioativos. "Porção terapêutica" inclui promedicamentos de agentes bioativos, construções nas quais mais de uma porção terapêutica é ligada a um veículo, por exemplo, agentes multivalentes. A porção terapêutica pode incluir também peptídeos e construções que incluem peptídeos. Peptídeos exemplares incluem aqueles revelados na figura 1 e Tabelas 5 e 6, aqui.
[00511] Conforme usado aqui, "medicamento antitumor" significa qualquer agente útil para combater câncer incluindo, porém não limitado a, citotoxinas e agentes, tais como, antimetabólitos, agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos, agentes antimicóticos, procarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, corticosteróides, interferons e agentes radioativos. O termo "medicamento antitumor" também engloba conjugados de peptídeo com atividade antitumor, por exemplo, α-TNF. Conjugados incluem, porém não estão limitados aqueles formados entre uma proteína terapêutica e uma glicoproteína da invenção. Um conjugado representativo é aquele formado entre PSGL-1 e α-TNF.
[00512] Conforme usado aqui, "uma citotoxina ou agente citotóxico" significa qualquer agente que é prejudicial as células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, antracinadiona diidróxi, mitoxantrona, mitramcina, actinomicina D, 1- dehidrotestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propanolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Outras toxinas incluem, por exemplo, ricina, CC-1065 e análogos de duocarmicinas. Ainda outras toxinas incluem toxina de difteria e veneno de cobra (por exemplo, veneno de naja).
[00513] Conforme usado aqui, "um agente radioativo" inclui qualquer radioisótopo que é eficaz no diagnóstico ou destruição de tumor. Exemplos incluem, porém não estão limitados a índio-111, cobalto-60 e technétio. Adicionalmente, os elementos radioativos que ocorrem naturalmente, tais como, urânio, rádio e tório, que tipicamente representam misturas de radioisótopos, são exemplos apropriados de agente radioativo. Os íons metálicos são tipicamente quelados com uma porção de quelação orgânica.
[00514] Muitos grupos quelantes úteis, éteres de coroa, criptandos e semelhantes são conhecidos na técnica e podem ser incorporados aos compostos da invenção (por exemplo, EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA, etc. e seus análogos fosfonato, tais como, DTPP, EDTP, HDTP, NTP, etc.). Vide, por exemplo, Pitt e outros, "The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload, "In, INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE; Martell, Ed.; American Chemical Society, Washington, D. C., 1980, pp. 279-312; Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES; Cambridge University Press, Cambridge, 1989; Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer-Verlag, New York, 1989 e referências contidas aqui.
[00515] Adicionalmente, várias vias que permitem a anexação de agentes quelantes, éteres de coroa e ciclodextrinas a outras moléculas encontram-se disponíveis aos versados na técnica. Vide, por exemplo, Meares e outros, "Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides." In, MODIFICATION OF PROTEINS:FOOD, NUTRITIONAL, AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS;" Feeney, e outros, Eds. , American Chemical Society, Washington, D. C., 1982, pp. 370-387; Kasina e outros, Bioconjugate Chem., 9: 108-117 (1998); Songet e outros, Bioconjugate Chem., 8: 249-255 (1997).
[00516] Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com o conjugado, mantém a atividade da atividade do conjugado e não é reativo com o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, porém não estão limitados a quaisquer veículos farmacêuticos padrão tais como, solução de salmoura tamponada com fosfato, água, emulsões, tais como, óleo/emulsão de água e vários tipos de agentes umectantes. Outros veículos podem também inclui soluções estéreis, comprimidos incluindo comprimidos revestidos e cápsulas. Tipicamente, tais veículos contêm excipientes, tais como, amido, milho, açúcar, determinados tipos de argila, gelatina, ácido esteárico ou sais dos mesmos, estearato de magnésio ou cálcio, talco, gorduras ou óleos vegetais, gomas, glicóis ou outros excipientes conhecidos. Tais veículos podem também incluir aditivos aromatizantes e corantes ou outros ingredientes. Composições compreendendo tais veículos são formuladas por processos convencionais bem conhecidos.
[00517] Conforme usado aqui, "administração" significa administração oral, administração como um supositório, contato tópico, intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal ou administração subcutânea, administração intratecal ou a implantação de um dispositivo de liberação lenta, por exemplo, uma minibomba osmótica ao indivíduo.
[00518] O termo "isolado" se refere a um material que é substancial ou essencialmente isento de componentes, que são usados para produzir o material. Para os conjugados de peptídeo da invenção, o termo "isolado" se refere ao material que é substancial ou essencialmente isento de componentes, que normalmente acompanham o material na misturada usada para preparar o conjugado de peptídeo. "isolado" e "puro" são usados alternadamente. Tipicamente, os conjugados de peptídeo isolado da invenção possuem um nível de pureza preferivelmente expresso como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de pureza para conjugados de peptídeo é de cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80% e a extremidade superior da faixa de pureza é de cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou mais ou menos cerca de 90%.
[00519] Quando os conjugados de peptídeo são superiores a cerca de 90% puro, suas purezas são também preferivelmente expressas como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de pureza é cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 96% ou cerca de 98%. A extremidade superior da faixa de pureza é de cerca é de cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 96%, cerca de 98% ou cerca de 100% de pureza.
[00520] A pureza é determinada por qualquer processo de análise reconhecido na técnica (por exemplo, intensidade de faixa em um gel manchado com prata, eletroforese de gel poliacrilamida, HPLC ou meios semelhantes).
[00521] "Essencialmente cada elemento da população" conforme usado aqui, descreve uma característica de uma população de conjugados de peptídeo da invenção onde uma porcentagem selecionada de açúcares modificados adicionados a um peptídeo é adicionada aos sítios aceitadores idênticos, múltiplos no peptídeo. "Essencialmente cada elemento da população" fala da "homogeneidade" dos sítios no peptídeo conjugado para um açúcar modificado e se refere aos conjugados da invenção, que são pelo menos cerca de 80%, preferivelmente pelo menos 90% e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% homogêneos.
[00522] "Homogeneidade" se refere à consistência estrutural através de uma população de porções de aceitador a qual os açúcares modificados são conjugados. Assim, em um conjugado de peptídeo da invenção, onde cada porção de açúcar modificado é conjugada a um sítio aceitador possuindo a mesma estrutura que o sítio aceitador ao qual cada outro açúcar modificado é conjugado, o conjugado de peptídeo é cerca de 100% homogêneo. A homogeneidade é tipicamente expressa como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de homogeneidade para os conjugados de peptídeo é de cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80% e a extremidade superior da faixa de pureza é de cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou mais do que cerca de 90%.
[00523] Quando os conjugados de peptídeo são superiores ou iguais a cerca de 90% homogêneo, sua homogeneidade é também preferivelmente expressa como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de homogeneidade é de cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 96% ou cerca de 98%. A extremidade superior da faixa de pureza é de cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 96%, cerca de 98% ou cerca de 100% de homogeneidade. A pureza dos conjugados de peptídeo é tipicamente determinada por um ou mais processos conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS), tempo de massa de dessorção a laser auxiliado de matriz de espectrometria de vôo (MALDI-TOF), eletroforese capilar e semelhantes.
[00524] "Glicoforma substancialmente uniforme" ou um "padrão de glicosilação substancialmente uniforme", quando se refere as espécies de glicopeptídeo, se refere à porcentagem das porções aceitadores que são glicosiladas pela glicosiltransferase de interesse (por exemplo, fucosiltransferase). Por exemplo, no caso de uma α1,2 fucosiltransferase, um padrão de fucosilação substancialmente uniforme existe se substancialmente todo (conforme definido abaixo) de Galβ1,4-GlcNAc-R e análogos sialilados do mesmo forem fucosilados em um conjugado de peptídeo da invenção. Será entendido por um versado na técnica, que o material de partida pode conter porções aceitadoras glicosiladas (por exemplo, porções Galβ1,4- GlcNAc-R). Assim, o percentual de glicosilação calculado incluirá porções aceitadoras que são glicosiladas pelos processos da invenção, bem como aquelas porções aceitadoras já glicosiladas no material de partida.
[00525] O termo "substancialmente" nas definições acima de "substancialmente uniforme" geralmente significa pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% das porções aceitadoras para uma glicosiltransferase específica são glicosilados.
Descrição da Invenção I - Processo para Remodelar Cadeias de Glicanos
[00526] A presente invenção inclui processos e composições para a adição in vitro e/ou apagamento de açúcares para ou de uma molécula de glicopeptídeo de tal modo a prover uma molécula de peptídeo possuindo um padrão de glicosilação desejado ou padronizado, preferivelmente incluindo a adição de um açúcar modificado a mesma. Um aspecto chave da invenção, portanto, é tomar um peptídeo produzido por qualquer tipo de célula e gerar uma estrutura de glicano de núcleo no peptídeo, seguindo-se que a estrutura de glicano é então remodelada in vitro para gerar um peptídeo possuindo um padrão de glicosilação apropriado para uso terapêutico em um mamífero.
[00527] A importância do padrão de glicosilação de um peptídeo é bem conhecido na técnica como as limitações dos presentes processos in vivo para a produção de peptídeos apropriadamente glicosilados, especificamente quando estes peptídeos são produzidos usando metodologia de DNA recombinante. Além disto, até a presente invenção, não era possível gerar glicopeptídeos possuindo uma estrutura de glicano desejada, onde o peptídeo pode ser produzido em escala industrial.
[00528] Na presente invenção, um peptídeo produzido por uma célula é enzimaticamente tratado in vitro pela adição sistemática das enzimas apropriadas e substratos a mesma, tal que, as porções de açúcar que não estariam presentes no peptídeo são removidas e porções de açúcar, opcionalmente incluindo açúcares modificados, que seriam adicionadas aos peptídeos são adicionadas de modo a prover um glicopeptídeo possuindo "glicosilação desejada" conforme definido aqui em algum lugar.
A - Processo para remodelar glicanos ligados em N
[00529] Em um aspecto, a presente invenção tira vantagem do fato de que a maior parte dos peptídeos de interesse comercial ou farmacêutico compreende uma estrutura de cinco açúcares comum referida aqui como o núcleo de trimanosila, que é ligado em N à asparagina na seqüência Asn-X-Ser/Thr em uma cadeia de peptídeo. O núcleo trimanosila elementar consiste, essencialmente, em dois resíduos N-acetilglicosamina (GlcNAc) e três resíduos manose anexados ao peptídeo, isto é, compreende esses cinco resíduos de açúcar e nenhum açúcar adicional, exceto que ele pode incluir, opcionalmente, um resíduo de fucose. O primeiro GlcNAc é anexado ao grupo amida de asparagina e o segundo GlcNAc é anexado ao primeiro através de uma ligação β1,4. Um resíduo de manose é anexado ao segundo GlcNAc através da ligação β1,4 e dois resíduos de manose são anexados a esta manose através de uma ligação α1,3 e a1,6 respectivamente. Uma ilustração esquemática de uma estrutura de núcleo de trimanosila é mostrada na figura 2, lado esquerdo. Embora seja o caso onde as estruturas de glicano na maioria dos peptídeos compreendam outros açúcares além do núcleo de trimanosila, a estrutura de núcleo de trimanosila representa um aspecto essencial dos glicanos ligados em N nos peptídeos de mamíferos.
[00530] A presente invenção inclui a geração de um peptídeo possuindo uma estrutura de núcleo de trimanosila como um elemento fundamental da estrutura das moléculas de glicano contidas no mesmo. Dada à variedade de sistemas celulares usados para produzir peptídeos, se os sistemas estão propriamente ocorrendo naturalmente ou se eles envolvem metodologia de DNA recombinante, a presente invenção provê processos, pelos quais uma molécula de glicano em um peptídeo produzido em qualquer tipo de célula pode ser reduzida a uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar. Uma vez que a estrutura de núcleo de trimanosila elementar foi gerada, então é possível usando os processos descritos aqui, gerar in vitro uma estrutura de glicano desejada no peptídeo, que confere no peptídeo uma ou mais propriedades que melhoram a eficácia terapêutica do peptídeo.
[00531] Deve ficar claro a partir da discussão aqui que o termo "núcleo de trimanosila" é usada para descrever a estrutura de glicano mostarda na figura 2, lado esquerdo. Glicopeptídeos possuindo estrutura de núcleo de trimanosila podem também possuir açúcares adicionais adicionados aos mesmos, e para a maior parte, possuem estruturas adicionais independentemente se os açúcares dão surgimento a um peptídeo possuindo a estrutura de glicano desejada. O termo "estrutura de núcleo de trimanosila elementar" é definida em algum lugar aqui. Quando o termo "elementar" não está incluído na descrição da "estrutura de núcleo de trimanosila", então o glicano compreende a estrutura de núcleo de trimanosila com açúcares adicionais anexados a mesma.
[00532] O termo "glicopeptídeo de núcleo de trimanosila elementar" é usada aqui para referir-se a um glicopeptídeo possuindo estruturas de glicano compreendidas primariamente de uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar. Contudo, pode também conter opcionalmente um resíduo de fucose anexado ao mesmo. Conforme discutido aqui, glicopeptídeos de núcleo de trimanosila elementares são um material de partida ótimo e, portanto, preferido, para os processos de remodelagem de glicano da invenção.
[00533] Outro material de partida ótimo para o processo de remodelagem de glicano da invenção é uma estrutura de glicano possuindo um núcleo de trimanosila, onde um ou dois resíduos de GlcNAc adicionais são acrescentados a cada um dos resíduos α1,3 e a1,6 manose (vide, por exemplo, a estrutura na segunda linha da figura 3, segunda estrutura da esquerda da figura). Esta estrutura é referida aqui como "Man3GlcNAc4". Opcionalmente, esta estrutura pode também conter uma molécula de fucose de núcleo. Uma vez que a estrutura Man3GlcNAc4 foi gerada, então é possível, usando os processos descritos aqui, gerar in vitro, uma estrutura de glicano desejada no glicopeptídeo que confira ao glicopeptídeo uma ou mais propriedades que melhoram a eficácia terapêutica do peptídeo.
[00534] Em sua forma nativa, os glicopeptídeos ligados em N da invenção e especificamente os glicopeptídeos de mamíferos e seres humanos úteis na presente invenção são glicosilados ligados em N com estrutura de núcleo de trimanosila e um ou mais açúcares anexados aos mesmos.
[00535] Os termos "glicopeptídeo" e "glicopolipeptídeo" são usados aqui como sinônimos para referir às cadeias de peptídeo possuindo porções de açúcar anexadas as mesmas. Nenhuma distinção é feita aqui para diferenciar os glicopolipeptídeos pequenos ou glicopeptídeos de glicopolipeptídeos grandes ou glicopeptídeos. Assim, moléculas de hormônio possuindo muito poucos aminoácidos em sua cadeia de peptídeo (por exemplo, freqüentemente tão pouco quanto três aminoácidos) e outros peptídeos muito maiores estão incluídas nos termos gerais "glicopolipeptídeo" e "glicopeptídeo", contando que elas tenham porções de açúcar anexadas as mesmas. Contudo, o uso do termo "peptídeo" não elimina aquele peptídeo de ser um glicopeptídeo.
[00536] Um exemplo de um glicopeptídeo ligado em N possuindo glicosilação desejada é um peptídeo possuindo um glicano ligado em N possuindo um núcleo de trimanosila com pelo menos um resíduo de GlcNAc anexado ao mesmo. Este resíduo é adicionado ao núcleo de trimanosila usando N- acetil glicosaminiltransferase I (GnT-I). Se um segundo resíduo de GlcNAc for adicionado, N-acetil glicosaminiltransferase II (GnT-II) é usada. Opcionalmente, resíduos de GlcNAc adicionais podem ser adicionados ao GnT- IV e/ou GnT-V e uma terceira bissecção do resíduo de GlcNAc pode ser anexada à β1,4 manose do núcleo de trimanosila usando N-acetil glicosaminiltransferase III (GnT-III). Opcionalmente, esta estrutura pode ser estendida por tratamento com β1,4 galactosiltransferase para adicionar um resíduo de galactose a cada GlcNAc de não bissecção e mesmo adicional e opcionalmente, usando enzimas a2,3 ou a2,6 sialiltransferase, resíduos de ácido siálico podem se adicionados a cada resíduo de galactose. A adição de um GlcNAc de bissecção ao glicano não é necessária para a adição subsequente de galactose e resíduos de ácido siálico; contudo, com relação a afinidade de substrato de enzimas de GnT-III de rato e do homem, a presença de um ou mais resíduos de galactose no glicano impede a adição do GlcNAc de bissecção pelo que, o glicano contendo galactose não é um substrato para estas formas de GnT-III. Assim, nos exemplos onde a presença de GlcNAc de bissecção é desejado e estas formas de GnT-III são usadas, é importante que o glicano contenha adicionados resíduos de galactose e/ou siálicos, que possam ser removidos antes da adição de GlcNAc de bissecção. Outras formas de GnT-III podem não precisar desta ordem específica de substratos para sua atividade.
[00537] Exemplos de estruturas de glicano que representam os vários aspectos dos peptídeos possuindo "glicosilação desejada" são mostrados nos desenhos providos aqui. Os procedimentos precisos para a geração in vitro de um peptídeo possuindo "glicosilação desejada" são descritos aqui em algum lugar. Contudo, a invenção de modo algum estaria limita unicamente a qualquer uma estrutura de glicano revelada aqui. Ao invés disto, a invenção incluiria qualquer e todas as estruturas de glicano que podem ser feitas usando a metodologia provida aqui.
[00538] Em alguns casos, um núcleo de trimanosila elementar sozinho pode constituir a glicosilação desejada de um peptídeo. Por exemplo, um peptídeo possuindo apenas um núcleo de trimanosila foi mostrado como estando envolvido na doença de Gaucher (Mistry e outros, 1996, Lancet 348: 1555-1559; Bijsterbosch e outros, 1996, Eur. J. Biochem. 237:344-349).
[00539] De acordo com a presente invenção, os procedimentos que se seguem para a geração de peptídeos possuindo glicosilação desejada ficam claros. a) Começando com um glicopeptídeo possuindo uma ou mais moléculas de glicano que possuem como um aspecto comum uma estrutura de núcleo de trimanosila e pelo menos um ou mais de uma mistura heterogênea ou homogênea de um ou mais açúcares adicionados a mesma, sendo possível aumentar a proporção dos glicopeptídeos possuindo estrutura de núcleo de trimanosila elementar como a única estrutura glicano ou que possuem Man3GlcNAc4 como a única estrutura de glicano. Isto é obtido in vitro pela adição sistemática ao glicopeptídeo de um número apropriado de enzimas em uma seqüência apropriada que cliva a mistura heterogênea ou homogênea de açúcares na estrutura de glicano, até ela ser reduzida a um núcleo de trimanosila elementar ou estrutura Man3GlcNAc4. Exemplos específicos de como isto é realizado dependerão de vários fatores incluindo, em grande parte, o tipo de célula no qual o peptídeo é produzido e, portanto, o grau de complexidade da(s) estrutura(s) de glicano presente(s) no peptídeo inicialmente produzido pela célula. Exemplos de como uma estrutura complexa de glicano pode ser reduzida a um núcleo de trimanosila elementar ou uma estrutura de Man3GlcNAc4 são apresentados na figura 3, descrita em detalhes aqui em algum lugar. b) É possível gerar um peptídeo possuindo uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar como a única estrutura de glicano no peptídeo por isolamento de uma célula que ocorre naturalmente, cuja maquinaria de glicosilação produz um peptídeo. DNA codificando um peptídeo de escolha é então transfectado para a célula onde o DNA é transcrito, traduzido e glicosilado, tal que, o peptídeo de escolha possui uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar como a única estrutura de glicano no mesmo. Por exemplo, uma célula que não tem uma enzima GnT-I funcional produzirá vários tipos de glicopeptídeos. Em alguns exemplos, estes serão glicopeptídeos que não possuem açúcares anexados ao núcleo de trimanosila. Contudo, em alguns exemplos, os peptídeos produzidos podem ter dois resíduos de manose adicionais anexados ao núcleo de trimanosila, resultando em um glicano Man5. Este é também um material de partida desejado para o processo de remodelagem da presente invenção. Exemplos específicos da geração de tais estruturas de glicano são descritos aqui. c) Alternativamente, é possível transformar geneticamente uma célula para conferir a mesma uma maquinaria de glicosilação específica, tal que é produzido um peptídeo possuindo um núcleo de trimanosila elementar ou estrutura de Man3GlcNAc4 como a única estrutura de glicano no peptídeo. DNA codificando um peptídeo de escolha é então transferido para a célula onde o DNA é transcrito, traduzido e glicosilado, tal que, o peptídeo de escolha possui um número grande de glicanos compreendendo unicamente uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar. Por exemplo, determinados tipos de células que são transformadas geneticamente para perder GnT-I, podem produzir um glicano possuindo uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar ou, dependendo da célula, podem produzir um glicano possuindo um núcleo de trimanosila mais dois resíduos de manose adicionais anexados ao mesmo (Man5). Quando a célula produz uma estrutura de glicano Man5, a célula pode ser adicionalmente transformada geneticamente para expressar manosidase 3, que cliva os dois resíduos de manose adicionais para gerar o número de trimanosila. Alternativamente, o glicano Man5 pode ser incubado in vitro com manosidase 3 para ter o mesmo efeito. d) Fica claro da discussão em b) e c) que não será necessário que as células produzam apenas peptídeos possuindo um núcleo de trimanosila elementar ou estruturas Man3GlcNAc4 anexadas aos mesmos. Ao invés disto, a menos que as células descritas em b) e c) produzam peptídeos possuindo 100% de estruturas de núcleo de trimanosila elementar (isto é, sem açúcares adicionais anexados) ou 100% de estruturas Man3GlcNAc4, as células de fato produzem uma mistura heterogênea de peptídeos possuindo, em combinação, estruturas de núcleo de trimanosila elementares ou estruturas Man3GlcNAc4, como a única estrutura de glicano além daquelas estruturas possuindo açúcares adicionais anexados as mesmas. A proporção de peptídeos possuindo um núcleo de trimanosila ou estrutura Man3GlcNAc4 açúcares adicionais anexados aos mesmos, opostos aqueles possuindo uma estrutura, variará dependendo da célula que produz os mesmos. A complexidade dos glicanos (isto é quais e como muitos açúcares são anexados ao núcleo de trimanosila) também variará, dependendo da célula que produz os mesmos. e) Uma vez que um glicopeptídeo possuindo um núcleo de trimanosila elementar ou um núcleo de trimanosila com um ou dois resíduos de GlcNAc anexados ao mesmo é produzido por a), b) ou c) acima, de acordo com a presente invenção, moléculas de açúcar adicionais são anexadas in vitro à estrutura de núcleo de trimanosila para gerar um peptídeo possuindo glicosilação desejada (isto é, um peptídeo possuindo uma estrutura de glicano padronizada in vitro). f) Contudo, quando é o caso de um peptídeo possuindo um núcleo de trimanosila elementar ou estrutura Man3GlcNAc4 com algum porém não todos os açúcares desejados anexados ao mesmo ser produzido, então é apenas necessário adicionar quaisquer açucares desejados restantes, sem reduzir a estrutura de glicano ao núcleo de trimanosila elementar ou estrutura Man3GlcNAc4. Portanto, em alguns casos, um peptídeo possuindo uma estrutura de glicano possuindo uma estrutura de núcleo de trimanosila com açúcares adicionais anexados ao mesmo, será um substrato apropriado para remodelagem. Isolamento de um Glicopeptídeo de Núcleo de Trimanosila Elementar
[00540] O núcleo de trimanosila elementar ou glicopeptídeos Man3GlcNAc4 da invenção pode ser isolado e purificado, caso necessário, usando técnicas bem conhecidas na arte da purificação de peptídeo. Técnicas apropriadas incluem técnicas cromatográficas, técnicas de focalização isoelétrica, técnicas de ultrafiltração e semelhantes. Com a utilização de quaisquer de tais técnicas, a invenção pode ser preparada, onde os glicopeptídeos da invenção são isolados de outros peptídeos e de outros componentes normalmente encontrados dentro do meio de cultura da célula. O grau de purificação pode ser, por exemplo, de 90% com relação a outros peptídeos ou 95% ou maiores, mesmo de 98%. Vide, por exemplo, Deutscher e outros (ed., 1990, Guide to Peptide Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego).
[00541] A heterogeneidade dos glicanos ligados em N nos glicopeptídeos produzidos pela metodologia da técnica anterior geralmente permite apenas o isolamento de uma pequena porção dos gicopeptídeos direcionais que pode ser modificada para produzir os glicopeptídeos desejados. Nos presentes processos, quantidades maiores de glicopeptídeos de núcleo trimanosila elementar e outros glicopeptídeos desejados, incluindo glicanos Man3GlcNAc4, podem ser produzidas as quais podem então ser adicionalmente modificadas para gerar quantidades maiores de peptídeos possuindo glicosilação desejada.
[00542] O enriquecimento específico de qualquer tipo específico de glicano ligado a um peptídeo pode ser realizado usando lectinas que possuem uma afinidade em relação ao glicano desejado. Tais técnicas são bem conhecidas na arte de glicobiologia.
[00543] Um aspecto chave da invenção que é descrito em maiores detalhes a seguir, é que, uma vez que a estrutura de glicano de núcleo é gerada em qualquer peptídeo, a estrutura de glicano é então remodelada in vitro para gerar um peptídeo possuindo glicosilação desejada que possui uso terapêutico aperfeiçoado em um mamífero. O mamífero pode ser qualquer tipo de mamífero apropriado e é preferivelmente um ser humano.
[00544] Os vários cenários e os processos precisos e composições para geração de peptídeos com glicosilação desejada ficarão evidentes da revelação que se segue.
[00545] O objetivo final da produção de peptídeos para uso terapêutico em mamíferos é o de que os peptídeos compreenderiam estruturas de glicano que facilitam ao invés de negar o benefício terapêutico do peptídeo. Conforme revelado através de toda a presente descrição, os peptídeos produzidos nas células podem ser tratados in vitro com uma variedade de enzimas que catalisam a clivagem de açúcares que não estariam presentes no glicano e a adição de açúcares que estariam presentes no glicano, tal que, um peptídeo possuindo glicosilação desejada e assim apropriados para uso terapêutico em mamíferos é gerado. A geração de glicoformas diferentes de peptídeos nas células é descrita acima. Uma variedade de mecanismos para a geração de peptídeos possuindo glicosilação desejada é descrita agora, onde o material de partida, isto é, o peptídeo produzido por uma célula pode diferir de um tipo de célula para outro. Conforme ficará claro da presente descrição, não é necessário que o material de partida seja uniforme com relação a sua composição de glicano. Contudo, é preferível que o material de partida seja enriquecido para determinadas glicoformas, a fim de que grandes quantidades do produto final, isto é, peptídeos corretamente glicosilados sejam produzidos.
[00546] Em uma modalidade preferida de acordo com a presente invenção, a degradação e eventos de síntese que resultem em um peptídeo possuindo glicosilação desejada envolvem, em algum grau, a geração de uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar ou uma estrutura de Man3GlcNAc4 no peptídeo.
[00547] A presente invenção também provê dispositivos para adicionar um ou mais resíduos glicosila selecionados ao peptídeo, após o que, um açúcar modificado é conjugado para pelo menos um dos resíduos de glicosila selecionados do peptídeo. A presente modalidade é útil, por exemplo, quando é desejado conjugar o açúcar modificado para um resíduo de glicosila selecionado que tanto não está presente em um peptídeo ou não está presente em uma quantidade desejada. Assim, antes do acoplamento de um açúcar modificado a um peptídeo, o resíduo de glicosila selecionado é conjugado em relação ao peptídeo por acoplamento enzimático ou químico. Em outra modalidade, o padrão de glicosilação de um peptídeo é alterado antes da conjugação do açúcar modificado por remoção de um resíduo de carboidrato do peptídeo. Vide, por exemplo, WO 98/31826.
[00548] A adição ou remoção de quaisquer porções de carboidrato presentes no peptídeo é realizada tanto química quanto enzimaticamente. A desglicosilação química é preferivelmente alcançada por exposição da variante do peptídeo ao composto de ácido trifluormetanossulfônico ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maior parte ou todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N- acetilgalactosamina), embora deixando o peptídeo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin e outros, 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 e por Edge e outros, 1981, Anal. Biochem. 118:131. A clivagem enzimática das porções de carboidrato nas variantes dos peptídeos pode ser obtida por uso de várias endo e exo-glicosidases conforme descrito por Thotakura e outros, 1987, Meth. Enzymol. 138:350.
[00549] A adição química de porções de glicosila é realizada por qualquer processo reconhecido na técnica. A adição enzimática de porções de açúcar é preferivelmente obtida usando uma modificação dos processos estabelecidos aqui, substituindo unidades de glicosila nativas para os açúcares modificados usados na invenção. Outros processos de adição de porções de açúcar são revelados na Patente US número 5.876.980, 6.030.815, 5.728.554 e 5.922.577.
[00550] Pontos de anexação exemplares para resíduo de glicosila selecionado incluem, porém não estão limitados a: (a) sítios para glicosilação em N e O; (b) porções de glicosila terminal que são aceitadoras de glicosiltransferase; (c) arginina, asparagina e histidina; (d) grupos carboxila livre; (e) grupos sulfidrila livre, tais como aqueles de cisteina; (f) grupos hidroxila livres tais como aqueles de serina, treonina ou hidróxiprolina; (g) resíduos aromáticos tais como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano; ou (h) o grupo amida de glutamina. Processos exemplares de uso na presente invenção são descritos no WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987 e no Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259-306 (1981).
[00551] Lidando especificamente com os exemplos mostrados em várias figuras providas aqui, é fornecida agora uma descrição da seqüência das reações enzimáticas in vitro para a produção de estruturas de glicano desejadas nos peptídeos. As condições precisas de reação para cada uma das conversões enzimáticas reveladas a seguir são bem conhecidas dos versados na técnica da glicobiologia e, portanto, não são repetidas aqui. Para uma revisão das condições de reação para estes tipos de reações, vide Sadler e outros, 1982, Methods in Enzymology 83:458-514 e referências citadas aqui.
[00552] Na figura 2 é mostrada uma estrutura de um glicano de núcleo trimanosila elementar no lado esquerdo. É possível converter esta estrutura em uma estrutura de glicano completa possuindo um GlcNAc de bissecção por incubação da estrutura de núcleo de trimanosila elementar em presença de GnT-I, seguido por GnT-II e adicionalmente seguido por GnT-III e um doador de açúcar compreendendo UDP-GlcNAc, onde GlcNAc é seqüencialmente adicionado à estrutura de núcleo de trimanosila para gerar um núcleo de trimanosila possuindo um GlcNAc de bissecção.
[00553] Na figura 4 é mostrada a conversão de um GlcNAc de bissecção contendo glicano de núcleo de trimanosila em uma estrutura de glicano complexa compreendendo galactose e ácido N-acetil neuramínico. O GlcNAc de bissecção contendo glicano de núcleo de trimanosila é primeiro incubado com galactosiltransferase e UDP-Gal como uma molécula doadora, onde dois resíduos de galactose são adicionados aos resíduos de GlcNAc periféricos na molécula. A enzima NeuAc-transferase é então usada para adicionar dois resíduos NeuAc um a cada um dos resíduos de galactose.
[00554] Na figura 5 é mostrada a conversão de uma estrutura de glicano de manose superior em um glicano de núcleo de trimanosila elementar. O glicano de manose superior (Man9) é incubado seqüencialmente em presença de manosidase 1 para gerar uma estrutura Man5 e então em presença de manosidase 3, onde todos os três resíduos de manose são removidos do glicano. Alternativamente, a incubação da estrutura Man9 pode ser retroaparada para a estrutura de núcleo de trimanosila unicamente por incubação em presença de manosidase 3. De acordo com os esquemas apresentados nas figuras 2 e 4 acima, a conversão deste glicano de núcleo de trimanosila elementar em uma molécula de glicano complexa é então possível.
[00555] Na figura 6 é mostrada uma estrutura típica de glicano ligado em N complexa produzida nas células de plantas. É importante observar que, quando as células da planta são deficientes em atividade enzimática de GnT-I, xilose e fucose não podem ser adicionadas ao glicano. Assim, o uso de células de colisão de GnT-I, provê uma vantagem específica na presente invenção, pelo que, estas células produzem peptídeos possuindo um núcleo de trimanosila elementar no qual os açúcares adicionais podem ser adicionados sem realizar quaisquer reações de "retroaparamento". De modo semelhante, nos momentos onde a estrutura produzida em uma célula de planta puder ser da variedade Man5 de glicano, se GnT-I estiver ausente nestas células, xilose e fucose não podem ser adicionadas à estrutura. Neste caso, a estrutura Man5 pode ser retroaparada para um núcleo de trimanosila elementar (Man3) usando manosidase 3. De acordo com os processos providos aqui, agora é possível adicionar porções de açúcar desejadas ao núcleo de trimanosila para gerar uma estrutura de glicano desejada.
[00556] Na figura 7 é mostrada uma estrutura de glicano ligada em N complexa, típica, produzida nas células de inseto. Como é evidente, açúcares adicionais, tais como, por exemplo, fucose, podem também estar presentes. Adicionalmente, embora não mostrado aqui, as células de inseto podem produzir glicanos de manose superior possuindo tantos quanto 9 resíduos de manose e podem ter açúcares adicionais anexados aos mesmos. É também o caso nas células de inseto, onde as células que colidem com GnT-I impedem a adição de resíduos de fucose ao glicano. Assim, a produção de um peptídeo nas células de inseto é preferivelmente realizada em uma célula de colisão de GnT-I. O glicano assim produzido pode então ser retroaparado in vitro, caso necessário, usando quaisquer dos processos e esquemas descritos aqui e açúcares adicionais podem ser acrescentados in vitro também usando os processos e esquemas providos aqui.
[00557] A figura 3 mostra estruturas de glicano em vários estágios de terminação. Especificamente, é mostarda a geração enzimática in vitro de uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar de uma estrutura de glicano de carboidrato complexa que não contém um resíduo de GlcNAc de bissecção. Também é mostrada a geração de uma estrutura de glicano da mesma que contém um GlcNAc de bissecção. Várias estruturas de glicano intermediárias que podem ser produzidas são mostradas. Estas estruturas podem ser produzidas por células ou podem ser produzidas nas reações de retroaparamento in vitro descritas aqui. Porções de açúcar podem ser adicionadas in vitro à estrutura de núcleo de trimanosila elementar ou a qualquer estrutura intermediária apropriada, a fim de que um glicano desejado seja produzido.
[00558] Na figura 8 é mostrada uma série de reações in vitro possíveis que podem ser realizadas para retroaparar e adicionar glicanos começando com uma estrutura de manose superior. Por exemplo, um glicano Man9 pode ser aparado usando manosidase 1 para gerar um Glicano Man5 ou pode ser aparada em um núcleo de trimanosila usando manosidade 3 ou uma ou mais manosidases microbianas. GnT-I e ou GnT-II podem então ser usados para transferir resíduos GlcNAc adicionais para o glicano. Adicionalmente, é mostrada a situação que não ocorreria quando a molécula de glicano e produzida em uma célula que não tem GnT-I (vide caixa anexa). Por exemplo, fucose e xilose podem ser adicionados a um glicano apenas quanto GnT-I está ativo e facilita a transferência de GlcNAc para a molécula.
[00559] A figura 9 ilustra estratégias bem conhecidas para a síntese de estruturas de glicano biantenário, triantenário e mesmo tetraantenário começando com a estrutura de núcleo de trimanosila. De acordo com os processos da invenção é possível sintetizar cada uma destas estruturas in vitro usando as enzimas apropriadas e condições de reação bem conhecidas na técnica de glicobiologia.
[00560] A figura 10 mostra um esquema para a síntese estruturas de carboidrato ainda mais complexas começando com uma estrutura de núcleo de trimanosila. Por exemplo, é mostrado um esquema para a produção in vitro de estruturas de antígeno de Lewis x e Lewis a, que pode ou não ser sialilada. Tais estruturas quando presentes em um peptídeo podem conferir vantagens imunológicas de peptídeo para regular para cima ou regular para baixo a resposta imune. Além disto, tais estruturas são úteis para direcionar o peptídeo para células específicas, pelo que estes tipos de estruturas estão envolvidas na ligação aos peptídeos de adesão de célula e semelhantes.
[00561] A figura 11 é um esquema exemplar para preparação de uma fileira de peptídeos ligados em O originando-se de serina ou treonina.
[00562] A figura 12 ilustra uma série de diagramas mostrando os quatro tipos de núcleos denominados de estrutura de glicano ligado em O 1 a 4. A estrutura de núcleo é ressaltada em linhas pontilhadas. Açúcares que podem também ser incluídos nesta estrutura incluem resíduos de ácido siálico adicionados aos resíduos de galactose e resíduos de fucose adicionados aos resíduos de GlcNAc.
[00563] Assim, nas modalidades preferidas, a presente invenção provê um processo para fabricação de glicopeptídeo glicosilado ligado em N pela provisão de um glicopeptídeo isolado e purificado ao qual é anexado um núcleo de trimanosila elementar ou uma estrutura Man3GlcNAc4, contatando o glicopeptídeo com uma enzima de glicosiltransferase e uma molécula doadora possuindo uma porção glicosila sob condições apropriadas para transferir a porção de glicosila para o glicopeptídeo. A habitualidade de um glicopeptídeo de núcleo de trimanosila ou glicopeptídeo Man3GlcNAc4 de produzir um peptídeo possuindo um padrão de glicosilação desejado é então obtida por adição seqüencial das porções de açúcar desejadas usando técnicas bem conhecidas na arte. Determinação da Estrutura Primária de Glicano
[00564] Quando um glicopeptídeo ligado em N é produzido por uma célula, conforme observado aqui, ele pode compreender uma mistura heterogênea de estruturas de glicano que deve ser reduzida a um núcleo de trimanosila comum, geralmente elementar ou estrutura Man3GlcNAc4, antes da adição de outras porções de açúcar a mesma. A fim de determinar exatamente quais açúcares deveriam ser removidos de qualquer estrutura de glicano específica, algumas vezes é necessário que a estrutura de glicano primária seja identificada. Técnicas para determinação da estrutura primária de glicano são bem conhecidas na arte e são descritas em detalhes, por exemplo, em Montreuil, "Structure and Biosynthesis of Glycopeptides" In Polysaccharides in Medicinal Applications, páginas 273-327, 1996, Eds. Severian Damitriu, Marcel Dekker, NY. Portanto é uma matéria simples para um versado na técnica da glicobiologia isolar uma população de peptídeos produzidos por uma célula e determinar a(s) estrutura(s) dos glicanos anexados ao mesmo. Por exemplo, processos eficazes são disponíveis para (i) divisão das ligações glicosídicas tanto por clivagem química tal como hidrólise, acetólise, hidrazinólise ou por desaminação nitrosa; (ii) metilação completa seguido por hidrólise ou metanólise e por cromatografia de gás-líquido e espectroscopia de massa do monossacarídeo parcialmente metilado; e (iii) a definição de ligações anoméricas entre monossacarídeos usando exoglicosidases, o que também provê discernimento com relação a estrutura de glicano primária por degradação seqüencial. Especificamente, as técnicas de espectroscopia de massa e espectrometria de ressonância magnética nuclear (NMR), especialmente NMR de campo superior foram usadas sucessivamente para determinar estrutura primária de glicano.
[00565] Kits e equipamento para análise de carboidrato encontram-se também disponíveis. Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE®) encontra-se disponível na Glyko, Inc. (Novato, CA). Na análise de FACE, os glicoconjugados são liberados do peptídeo tanto com Endo H quanto N-glicanase (PNGase F) para glicanos ligados em N ou hidrazina para glicanos ligados em Ser/Thr. O glicano é então rotulado na extremidade de redução com um flúorforo em uma maneira que não discrimina a estrutura. Os glicanos rotulados flúorforo são então separados em géis de poliacrilamida com base na razão de carga/massa do sacarídeo, bem como o volume hidrodinâmico. São feitas imagens do gel sob luz UV e a composição dos glicanos é determinada por distância de migração, quando comparada aos padrões. Os oligossacarídeos podem ser sequenciados desta maneira por análise dos giros de migração devido a remoção seqüencial dos sacarídeos por digestão de exoglicosidase. Modalidade Exemplar
[00566] A remodelagem da glicosilação ligada em N é melhor ilustrada com referência à Fórmula 1:
Figure img0041
onde X3, X4, X5, X6, X7 e X17 são resíduos de monossacarídeo ou oligossacarídeo (independentemente selecionados); e a, b, c, d, e e x são 0, 1 ou 2 (independentemente selecionados) contanto que pelo menos um elemento selecionado de a, b, c, d, e e x seja 1 ou 2.
[00567] A fórmula 1 descreve a estrutura de glicano compreendendo o núcleo de tri-manosila, que é preferível e covalentemente ligado a um resíduo asparagina em um esqueleto de peptídeo. Sistemas de expressão preferidos expressam e secretam peptídeos exógenos com glicanos ligados em N compreendendo o núcleo tri-manosila. Usando o processo de remodelagem da invenção, as estruturas de glicano nesses peptídeos podem ser convenientemente remodeladas para qualquer estrutura glicano desejada. As condições de reação exemplares são encontradas através dos exemplos e na literatura.
[00568] Nas modalidades preferidas, as estruturas de glicano são remodeladas, de modo que a estrutura descrita na Fórmula 1 tem determinantes específicas. A estrutura do glicano pode ser escolhida para melhorar a atividade biológica do peptídeo, fornece ao peptídeo uma nova atividade biológica, remove a atividade biológica do peptídeo ou aproxima melhor o padrão de glicosilação do peptídeo nativo, entre outras.
[00569] Na primeira modalidade preferida, os glicanos ligados em N do peptídeo são remodelados para aproximarem- se melhor do padrão de glicosilação das proteínas nativas humanas. Nesta modalidade, a estrutura de glicano descrita na Fórmula 1 é remodelada para ter as seguintes porções: X3 e X5 = |-GlcNAc-Gal-SA; a e c = 1; d = 0 ou 1; b, e e x = 0
[00570] Esta modalidade é especificamente vantajosa para peptídeos humanos expressos nos sistemas de expressão celular heterólogos. Por remodelagem das estruturas de glicano ligadas em N a esta configuração, o peptídeo pode ser menos imunogênico a um paciente humano e/ou mais estável, entre outras coisas.
[00571] Na segunda modalidade preferida, os glicanos ligados em N ao peptídeo são remodelados para ter um resíduo de GlcNAc de bissecção no núcleo de tri-manosila. Nesta modalidade, a estrutura de glicano descrita na Fórmula 1 é remodelada para ter as seguintes porções: X3 e X5 = |-GlcNAc-Gal-SA; a e c = 1; X4 é GlcNAc; b = 1; d = 0 ou 1; e e x = 0
[00572] Esta modalidade é especificamente vantajosa para peptídeos humanos expressos nos sistemas de expressão celular heterólogos. Quando a molécula de anticorpo inclui uma citotoxicidade celular mediada por Fc, sabe-se que a presença de oligossacarídeos bissecionados ligados ao domínio Fc aumenta dramaticamente a citotoxicidade celular dependente de anticorpo.
[00573] Em uma terceira modalidade preferida, os glicanos ligados em N de peptídeo são remodelados para ter uma porção de Lewis X sialilada. Nesta modalidade, a estrutura de glicano descrita na Fórmula 1 é remodelada para ter as seguintes porções: X3 e X5 são:
Figure img0042
a, c, d = 1; b, e e x = 0; X6 = fucose.
[00574] Esta modalidade é especificamente vantajosa quando o peptídeo que está sendo remodelado destina-se a ser direcionado para moléculas de selectina e células exibindo a mesma.
[00575] Em uma quarta modalidade preferida, os glicanos ligados em N do peptídeo são remodelados para ter uma porção conjugada. A porção conjugada pode ser uma molécula PEG, outro peptídeo, uma molécula pequena, tal como um medicamento, entre outros. Nesta modalidade, a estrutura de glicano descrita na Fórmula 1 é remodelada para ter as seguintes porções: X3 e X5 = |-GlcNAc-Gal-SA-R; a e c = 1 ou 2; d = 0 ou 1; b, d e x = 0; onde R = grupo de conjugado.
[00576] A porção conjugada pode ser uma molécula PEG, outro peptídeo, uma molécula pequena tal como medicamento, entre outros. Esta modalidade, portanto, é útil para conjugação do peptídeo às moléculas PEG que tornarão lento o apagamento do peptídeo da corrente sangüínea do paciente, aos peptídeos que direcionarão ambos os peptídeos para um tecido ou célula específica ou a outro peptídeo de uso terapêutico complementar.
[00577] Ficará claro a um versado na técnica que a invenção não está limitada às moléculas de glicano preferidas descritas acima. As modalidades preferidas são apenas algumas das muitas moléculas de glicano úteis que podem ser feitas pelo processo de remodelagem da invenção. Os versados na técnica saberão como projetar outros glicanos úteis.
[00578] Na primeira das modalidades exemplares, o peptídeo é expresso em uma CHO (linhagem de célula ovariana de hamster chinês) de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. Quando um peptídeo com sítios de consenso de glicano ligado em N é expresso e secretado das células CHO, os glicanos ligados em N terão as estruturas ilustradas na fileira superior da figura 3. Embora todas estas estruturas possam estar presentes, de longe as estrutura mais comuns são duas no lado direito. Nos termos da Fórmula 1, X3 e X5 = |-GlcNAc-Gal-(SA); a e c = 1; b, d e x = 0.
[00579] Portanto, em uma modalidade exemplar, os glicanos ligados em N dos peptídeos expressos nas células CHO são remodelados para o glicano humanizado preferido por contato dos peptídeos com uma glicosiltransferase que é específica para uma molécula aceitadora de galactose e uma molécula doadora de ácido siálico. Este processo é ilustrado na figura 3 e no Exemplo 2. Em outra modalidade exemplar, os glicanos ligados em N de um peptídeo expresso e secretado das células CHO são remodelados para as estruturas PEGiladas preferidas. O peptídeo é primeiro contatado com a glicosidase específica para ácido siálico para remover a porção SA terminal e então contatado com a glicosiltransferase específica para a porção aceitadora de galactose e uma porção aceitadora de ácido siálico, em presença de moléculas doadoras de nucleotídeo de ácido siálico PEG. Opcionalmente, o peptídeo pode então ser contatado com uma glicosiltranferase específica para uma porção aceitadora de galactose e uma porção aceitadora de ácido siálico, em presença de moléculas doadoras de nucleotídeo-ácido siálico para garantir o capeamento completo de SA em todas as moléculas de glicano.
[00580] Em outras modalidades exemplares, o peptídeo é expresso nas células de inseto, tais como, a linhagem de célula SF-9, de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. Quando um peptídeo com sítios de consenso de glicano ligado em N é expresso e secretado de células SF-9, os glicanos ligados em N freqüentemente terão as estruturas ilustradas na fileira superior da figura 7. Em termos da Fórmula 1: X3 e X5 = |-GlcNAc; a e c = 0 ou 1; b = 0; X6 é fucose, d = 0, 1 ou 2 e e e x = 0.
[00581] O núcleo de trimanose está presente na vasta maioria dos glicanos ligados em N fabricados por células de inseto e algumas vezes um GlcNAc antenário e/ou resíduo(s) de fucose estão presentes. Em uma modalidade exemplar, os glicanos ligados em N de um peptídeo expresso e secretado das células de inseto é remodelado para o glicano humanizado preferido, primeiro, por contato do glicano com uma glicosidase específica para as moléculas de fucose, então contato dos glicanos com uma glicosiltransferase específica para a molécula aceitadora de manose em cada antenário do núcleo de trimanose, molécula doadora de GlcNAc em presença de moléculas GlcNAc de nucleotídeo; então contatando os glicanos com uma glicosiltransferase específica para um molécula aceitadora de GlcNAc, uma molécula doadora de Gal em presença de moléculas de nucleotídeo-Gal e então contato dos glicanos com uma glicosiltransferase específica para uma molécula aceitadora de galactose, uma molécula doadora de ácido siálico em presença de moléculas de nculeotídeo-SA. Um versado na técnica apreciará que as moléculas de fucose, se existirem, podem ser removidos a qualquer hora durante o procedimento. Em outra modalidade exemplar, o glicano humanizado do exemplo anterior é remodelado adicionalmente para o glicano de Lewis X sialilado por contato do glicano adicionalmente com uma glicosiltransferase específica para uma molécula aceitadora de GlcNAc, uma molécula doadora de fucose em presença de moléculas de nucleotídeo-fucose. Este processo é ilustrado na figura 10 e Exemplo 3.
[00582] Ainda em outras modalidades exemplares, o peptídeo é expresso em levedura, tal como, Saccharomyces cerevisiae, de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. Quando um peptídeo com sítios de consenso de glicano ligados em N é expresso e secretado de células S.cerevisiae, os ligados em N terão as estruturas ilustradas à esquerda na figura 5. Os glicanos ligados em N terão sempre o núcleo trimanosila, que freqüentemente será elaborado com manose ou polissacarídeos correlatos de até 1.000 resíduos. Nos termos da Fórmula 1: X3 e X5 = |-Man - Man - (Man)0-1.000; a e c = 1 ou 2; b, d e x = 0.
[00583] Em uma modalidade exemplar, os glicanos ligados em N de um peptídeo expresso e secretado de células de levedura são remodelados para o núcleo de trimanose elementar primeiro por contato dos glicanos com uma glicosidase específica para moléculas α2 manose, então contato dos glicanos com uma glicosidase específica para moléculas α6 manose. Este processo é ilustrado na figura 5 e Exemplo 6. Em outra modalidade exemplar, os glicanos ligados em N são adicionalmente remodelados para fabricar um glicano apropriado para um anticorpo recombinante com função de toxicidade celular mediada por Fc por contato dos glicanos de núcleo de trimanose elementar com uma glicosiltransferase específica para a molécula aceitadora de manose em cada antenário do núcleo de trimanose, uma molécula doadora de GlcNAc em presença de moléculas de nucleotídeo-GlcNAc; então contato dos glicanos com uma glicosiltranferase específica para a molécula aceitadora de manose no meio do núcleo de trimanose, uma molécula doadora de GlcNAc em presença de moléculas de nucleotídeo-GlcNAc; então contato dos glicanos com uma glicosiltransferase específica para uma molécula aceitadora de GlcNAc, uma molécula doadora de Gal em presença de moléculas de nucleotídeo-Gal; e então contato dos glicanos com uma glicosiltransferase específica para a molécula aceitadora de galactose, uma molécula doadora de ácido siálico em presença de moléculas de nucleotídeo-SA. Este processo é ilustrado nas figuras 2, 3 e 4.
[00584] Em outra modalidade exemplar, o peptídeo é expresso nas células bacterianas, especificamente células E.coli, de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. Quando um peptídeo com sítios de consenso de glicanos ligados em N é expresso nas células de E.coli, os sítios de consenso ligados em N não serão glicosilados. Em outra modalidade exemplar, uma molécula de glicano humanizada é construída do esqueleto do peptídeo por contato dos peptídeos com uma glicosiltransferase específica para o sítio de consenso ligado em N e uma molécula doadora de GlcNAc em presença de nucleosídeo- GlcNAc e adicionalmente contatando seqüencialmente os glicanos em desenvolvimento com glicosiltransferases específicas para as porções aceitadoras e doadoras em presença de porção doadora necessária, até a estrutura glicano desejada estar completa. Quando um peptídeo com glicanos ligados em N é expressa em uma célula eucariótica, porém sem as seqüências líderes apropriadas que direcionam o peptídeo novo para o aparelho de Golgi, o peptídeo maduro provavelmente não será glicosilado. Neste caso, o peptídeo pode ser fornecido para glicosilação ligada em N por construção do sítio de consenso ligado em N do peptídeo conforme mencionado anteriormente. Quando uma proteína é quimicamente modificada com uma porção de açúcar, ela pode ser construída conforme mencionado anteriormente.
[00585] Estes exemplos são ilustrativos e não devem limitar a invenção. Um versado na técnica apreciará que as etapas tomadas em cada exemplo podem, em alguns casos, ser capazes de serem realizadas em uma ordem diferente para obter o mesmo resultado. Um versado na técnica também entenderá que um conjunto diferente de etapas pode também produzir o mesmo glicano resultante. O glicano remodelado preferido não é específico para o sistema de expressão onde o peptídeo é expresso. Os glicanos remodelados são apenas ilustrativos e um versado na técnica saberá como absorver os princípios destes exemplos e aplicar os mesmos aos peptídeos produzidos nos diferentes sistemas de expressão, de modo a fabricar glicanos não descritos aqui especificamente. B - Processo para Remodelar Glicanos Ligados em O
[00586] A glicosilação em O é caracterizada por anexação de vários monossacarídeos em uma ligação glicosídica em O aos aminoácidos hidróxi. A glicosilação em O é uma modificação pós translacional difundida nos reinos animal e vegetal. A complexidade estrutural dos glicanos ligados em O às proteínas excede em muito aquela dos glicanos ligados em N. Resíduos de serina ou treonina de um peptídeo que sofreu translado recentemente tornam-se modificados em virtude de uma transferase de GalNAc peptidila nos compartimentos cis para trans do Golgi. O sítio de gicosilação em O é determinado não apenas pela especificidade de seqüência da glicosiltransferase, porém também regulação epigenética medida por competição entre diferentes sítios de substrato e competição com outras glicosiltransferases responsáveis pela formação do glicano.
[00587] O glicano ligado em O foi arbitrariamente definido como tendo três regiões: o núcleo, a região de esqueleto e a região periférica. A região de "núcleo" de um glicano ligado em O é a mais interna de dois ou três açúcares da cadeia de glicano próxima ao peptídeo. A região de esqueleto contribui, principalmente, para o comprimento da cadeia de glicano formada por alongamento uniforme. A região periférica exibe um alto grau de complexidade estrutural. A complexidade estrutural dos glicanos ligados em O começa com a estrutura de núcleo. Na maior parte dos casos, o primeiro resíduo de açúcar adicionado ao sítio de consenso de glicano ligado em O é GalNAc; contudo, o açúcar pode também ser GlcNAc, glicose, manose, galactose ou fucose, entre outros. A figura 11 é um diagrama de algumas das estruturas de núcleo de glicano ligadas em O conhecidas e as enzimas responsáveis por sua síntese in vivo.
[00588] Nas células de mamíferos, pelo menos oito estruturas de núcleo ligadas em O diferentes são encontradas, todas com base no resíduo de núcleo-a-GalNAc. As quatro estruturas de núcleo ilustradas na figura 12 são as mais comuns. O núcleo 1 e o núcleo 2 são as estruturas mais abundantes nas células de mamíferos e o núcleo 3 e o núcleo 4 são encontrados em sistemas de expressão característicos de órgão, mais restritos. Os glicanos ligados em O são revisto em Montreuil, Structure and Synthesis of Glycopeptides, In Polysaccharides in Medicinal Applications, páginas 273-327, 1996, Eds. Severian Damitriu, Marcel Dekker, NY, e em Schachter and Brockhausen, The Biosysnthesis of Branched O-Linked Glycans, 1989, Society for Experimental Bioogy, páginas 126 (Reino Unido).
[00589] Ficará claro da presente revelação que a estrutura de glicano dos peptídeos glicosilados em O pode ser remodelada usando técnicas semelhantes àquelas descritas para glicanos ligados em N. Os O-glicanos diferem dos N-glicanos pelo que eles são ligados a um resíduo de serina ou treonina ao invés de um resíduo de asparagina. Conforme descrito aqui, com relação a remodelagem de N- glicano, as enzimas hidrolíticas podem ser usadas para clivar porções de açúcar indesejadas em um glicano ligado em O e açúcares desejados adicionais podem então ser adicionados para construir uma estrutura de O-glicano habitual no peptídeo (Vide figuras 11 e 12).
[00590] A etapa inicial na glicosilação em O nas células de mamíferos é a anexação de N-acetilgalactosamina (GalNAc) usando qualquer de uma família de pelo menos onze α-N-acetilgalactosaminiltransferase conhecidas, cada uma possuindo especificidade de peptídeo aceitador restrita. De modo geral, o peptídeo aceitador reconhecido por cada enzima constitui uma seqüência de pelo menos dez aminoácidos. Os peptídeos que contêm a seqüência de aminoácido reconhecida por uma GalNAc-transferase específica tornam-se glicosilados em O no sítio aceitador es eles são expressos em uma célula expressando a enzima e se eles estão apropriadamente localizados no aparelho Golgi onde UDP-GalNAc também está presente.
[00591] Contudo, no caso das proteínas recombinantes, a anexação inicial de GalNAc pode não acontecer. A enzima α-N-acetilgalactosaminiltransferase nativa para a célula de expressão pode ter uma especificidade de seqüência de consenso que difere daquela do peptídeo recombinante sendo expresso.
[00592] O peptídeo recombinante desejado pode se expresso em uma célula bacteriana, tal como, E.coli, que não sintetiza cadeias de glicano. Nesses casos, é vantajoso adicionar a porção GalNAc inicial in vitro. A porção GalNAc pode ser introduzida in vitro no peptídeo, uma vez que o peptídeo recombinante tiver sido recuperado na forma solúvel, por contato do peptídeo com a GalNAc transferase apropriada em presença de UDP-GalNAc.
[00593] Em uma modalidade, uma seqüência adicional dos aminoácidos que constitui um aceitador eficaz para transferência de um açúcar ligado em O pode estar presente. Tal seqüência de aminoácido é codificada por uma seqüência de DNA fundida na estrutura à seqüência de codificação do peptídeo ou alternativamente, pode ser introduzida por dispositivos químicos. O peptídeo pode não possuir cadeias glicano. Alternativamente, o peptídeo pode ter cadeias glicano ligadas em N e/ou O, porém requer um sítio de glicosilação adicional, por exemplo, quando um substituto de glicano adicional é desejado.
[00594] Em uma modalidade exemplar, a seqüência de aminoácido PTTTK-COOH, que é a seqüência aceitadora natural de GalNAc na mucina humana MUC-1, é adicionada a uma etiqueta de fusão. A proteína de fusão é então expressa em E.coli e purificada. O peptídeo é então contatado com as GalNAc-transferases T3 ou T6 humanas recombinantes em presença de UDP-GalNAc para transferir um resíduo GalNAc para o peptídeo in vitro.
[00595] Esta cadeia de glicano no peptídeo pode então ser adicionalmente alongada usando os processos descritos com referência aos glicanos ligados em N ou O. Alternativamente, a reação de transferase de GalNAc pode ser realizada em presença de UDP-GalNAc para que PEG seja covalentemente substituído nas posições O-3, 4 ou 6 ou na posição N-2. A glicoconjugação é descrita em detalhes aqui em algum lugar. Qualquer antigenicidade introduzida no peptídeo pela mesma sequência de peptídeo pode ser convenientemente mascarada por PEGilação do glicano associado. A técnica de fusão de sítio aceitador pode ser usada para introduzir não apenas uma porção PEG, porém para introduzir outras porções glicano e não glicano, incluindo, porém, não limitado a toxinas, antiinfecciosos, agentes citotoxina, queladores para radionucleotídeos e glicanos com outras funcionalidades, tais como, direcionamento de tecido. Modalidades Exemplares
[00596] A remodelagem de glicosilação ligada em O é melhor ilustrada com referência à Fórmula 2:
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[00597] A fórmula 2 descreve uma estrutura de glicano compreendendo um GalNAc que é covalentemente ligado, preferivelmente a um resíduo de serina ou treonina em um esqueleto do peptídeo. Embora esta estrutura seja usada para ilustrar as formas mais comuns de glicanos ligados em O, não deve ser construída para limitar a invenção unicamente a estes glicanos ligados em O. Outras formas de glicanos ligados em O são ilustradas na figura 11. Os sistemas de expressão preferidos úteis na presente invenção expressam e secretam peptídeos exógenos possuindo glicanos ligados em O compreendendo o resíduo de GalNAc. Com o uso dos processos de remodelagem da invenção, as estruturas de glicano nestes peptídeos podem ser convenientemente remodeladas para gerar qualquer estrutura de glicano desejada. Um versado na técnica apreciará que os glicanos ligados em O podem ser remodelados usando os mesmos princípios, enzimas e condições de ração que aquelas disponíveis na técnica, uma vez articuladas com a presente descrição. Condições de reação exemplares são encontradas através de todos os Exemplos.
[00598] Nas modalidades preferidas, as estruturas de glicano são remodeladas, de modo que a estrutura descrita na Fórmula 2 possui porções específicas. A estrutura do glicano pode ser escolhida para melhorar a atividade biológica do peptídeo, conferir mediante o peptídeo uma nova atividade biológica, remover ou alterar uma atividade biológica do peptídeo ou aproximar melhor o padrão de glicosilação do peptídeo nativo, entre outras.
[00599] Na primeira modalidade preferida, os glicanos ligados em O do peptídeo são remodelados para aproximarem- se melhor do padrão de glicosilação das proteínas humanas nativas. Nesta modalidade, a estrutura de glicano descrita na Fórmula 2 é remodelada para ter as seguintes porções: X2 é |-SA; ou |-SA-SA; f e n = 0 ou 1; X10 é SA; m = 0.
[00600] Esta modalidade é especificamente vantajosa para peptídeos humanos expressos em sistemas de expressão celular heterólogos. Por remodelação das estruturas de glicano ligadas em O para ter esta configuração, o peptídeo pode tornar-se menos imunogênico em um paciente humano e/ou mais estável.
[00601] Em outra modalidade preferida, os glicanos ligados em O do peptídeo são remodelados para mostrar um antígeno de Lewis X sialilado. Nesta modalidade, a estrutura de glicano descrita na fórmula 2 é remodelada para ter as seguintes porções: X2 é \-SA; X10 é Fuc ou |-GlcNAc(Fuc)-Gal-SA; f e n = 1; m = 0.
[00602] Esta modalidade é especificamente vantajosa quando o peptídeo que está sendo remodelado é mais eficaz quando direcionado para uma molécula de selectina e células exibindo a mesma.
[00603] Ainda em outra modalidade preferida, os glicanos ligados em O são remodelados para conter uma porção conjugada. A porção conjugada pode ser uma molécula PEG, outro peptídeo, uma molécula pequena tal como um medicamento, entre outros. Nesta modalidade, a estrutura de glicano descrita na Fórmula 2 é remodelada para ter as seguintes porções: X2 é |-SA-R; f = 1; n e m = 0; onde R é o grupo de conjugado.
[00604] Esta modalidade é útil para conjugação do peptídeo às moléculas PEG que tornarão lento o apagamento do peptídeo da corrente sangüínea do paciente, aos peptídeos que direcionarão ambos os peptídeos para um tecido ou célula específica ou a outro peptídeo de uso terapêutico complementar.
[00605] Ficará claro a um versado na técnica que a invenção não está limitada às moléculas de glicano preferidas descritas acima. As modalidades preferidas são apenas algumas das muitas moléculas de glicano úteis que podem ser feitas pelos processos de remodelagem da invenção. Os versados na técnica saberão como projetar outros glicanos úteis.
[00606] Na primeira modalidade exemplar, o peptídeo é expresso em uma CHO (linhagem de célula ovariana de hamster chinês) de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. Quando um peptídeo com sítios de consenso de glicano ligado em O é expresso e secretado das células CHO, a maioria dos glicanos ligados em O terão freqüentemente a estrutura nos termos da fórmula 2, X2 = |-SA; f = 1; m e n = 0
[00607] Portanto, a maior parte dos glicanos nas células CHO não requerem remodelagem a fim de serem aceitáveis para uso em um paciente humano. Em uma modalidade exemplar, os glicanos ligados em O dos peptídeos expressos nas células CHO são remodelados para conter uma estrutura Lewis X sialilada por contato dos peptídeos com uma glicosiltransferase que é específica para uma molécula aceitadora de GalNAc e uma porção doadora de fucose, em presença de nucleotídeo-fucose. Este processo é ilustrado nos glicanos ligados em N na figura 10 e Exemplo 3.
[00608] Em outras modalidades exemplares, o peptídeo é expresso nas células de inseto, tais como, sf9, de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. Quando um peptídeo possuindo sítios de consenso de glicano ligado em O é expresso e secretado da maioria das células sf9, a maioria dos glicanos ligados em O possui a estrutura, em termos da Fórmula 2: X2 = H; f = 0 ou 1; n e m = 0.
[00609] Vide, por exemplo, Marchal e outros (2001, Biol. Chem. 382:151-159). Em uma modalidade exemplar, o glicano ligado em O em um peptídeo expresso em uma célula de inseto é remodelado para um glicano humanizado por contato dos glicanos com uma glicosiltransferase específica para uma molécula aceitadora de GalNAc e uma molécula doadora de galactosose em presença de nucleotídeo-Gal; e então contatando os glicanos com uma glicosiltranferase específica para uma molécula aceitadora de Gal e uma molécula doadora de SA em presença de nucleotídeo-SA. Em outra modalidade específica, os glicanos ligados em O são remodelados adicionalmente da forma humanizada para a forma de Lewis X sialilada por contato adicional dos glicanos com uma glicosiltransferase específica para uma molécula aceitadora de GalNAc e uma molécula doadora de fucose, em presença de nucleotídeo-fucose.
[00610] Ainda em outra modalidade exemplar, o peptídeo é expresso nas células de fungos, especificamente células S. cerevisiae, de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. Quando um peptídeo com sítios de consenso de glicanos ligados em O é expresso e secretado de células S. cerevisiae, a maior parte dos glicanos ligados em O possuem a estrutura: |-AA-Man-Man1-2.
[00611] Vide Gemmill e Trimble (1999, Biochim. Biopys. Acta 1426:227-237). A fim de remodelar estes glicanos ligados em O para uso em seres humanos, é preferível que o glicano seja clivado no nível de aminoácido e reconstruído a partir deste.
[00612] Em uma modalidade exemplar, o glicano é glicano ligado em O em um peptídeo expresso em uma célula de fungo e é remodelado em um glicano humanizado por contato do glicano com uma endoglicosilase específica para uma ligação de aminoácido - GalNAc; e então contatando o glicano com uma glicosiltransferase específica para um sítio de consenso ligado em O e uma molécula doadora de GalNAc em presença de nucleotídeo-GalNAc; contato do glicano com uma glicosiltransferase específica para uma molécula aceitadora de GalNAC e uma molécula doadora de galactose em presença de nucleotídeo-Gal; e então contato dos glicanos com uma glicosiltransferase específica para uma molécula aceitadora de Gal e uma molécula aceitadora de SA em presença de nucleotídeo-SA.
[00613] Alternativamente, em outra modalidade exemplar, o glicano é glicano ligado em O em um peptídeo expresso em uma célula de fungos e é remodelado para um glicano humanizado por contato do glicano com uma proteína O-manose β-1,2-N-acetilglicosamiltransferase (POMGnTI) em presença do nucleotídeo GlcNAc; então contatando o glicano com uma galactosiltransferase em presença de nucleotídeo- Gal; e então concentrando o glicano com uma sialiltransferase em presença de nucleotídeo-SA.
[00614] Em outra modalidade exemplar, o peptídeo é expresso em células bacterianas, especificamente células E.coli, de acordo com processos bem conhecidos na técnica. Quando um peptídeo com um sítio de consenso de glicano ligado em O é expresso nas células de E.coli, o sítio de consenso ligado em O não será glicosilado. Neste caso, a molécula de glicano desejada deve ser construída do esqueleto do peptídeo de maneira semelhante aquela descrita para a expressão S. cerevisiae descrita acima. Adicionalmente, quando um peptídeo possuindo um glicano ligado em O é expresso em uma célula eucariótica sem as seqüências líder apropriadas para direcionar o peptídeo nascente para o aparelho Golgi, o peptídeo maduro provavelmente não é glicosilado. Neste caso, uma estrutura de glicosila ligada em O pode ser adicionada ao peptídeo por construção do glicano diretamente do sítio de consenso ligado em O do peptídeo. Adicionalmente, quando uma proteína é quimicamente modificada com uma porção de açúcar, ela pode também ser remodelada conforme descrito aqui.
[00615] Estes exemplos destinam-se a ilustrar a invenção e não limitam a mesma de que forma for. Um versado na técnica apreciará que as etapas tomadas em cada exemplo podem em alguma circunstância ser realizadas em uma ordem diferente para obter o mesmo resultado. Um versado na técnica também entenderá que um conjunto diferente de etapas pode também produzir o mesmo glicano resultante. Adicionalmente, o glicano preferido remodelado não é específico para o sistema de expressão que o peptídeo é expresso. Os glicanos remodelados são apenas ilustrativos e um versado na técnica saberá como utilizar os princípios destes exemplos e aplicar os mesmos aos peptídeos produzidos nos diferentes sistemas de expressão, de modo a gerar glicanos não especificamente descritos aqui. C - Glicoconjugação, em geral
[00616] A invenção provê processos para preparar um conjugado de um peptídeo glicosilado ou não glicosilado. Os conjugados da invenção são formados entre peptídeos e diversas espécies, tais como, polímeros solúveis em água, porções terapêuticas, porções de diagnóstico, porções direcionais e semelhantes. Também são providos os conjugados que incluem dois ou mais peptídeos ligados em conjunto através de um braço de ligante, isto é, conjugados multifuncionais. Os conjugados multifuncionais da invenção podem incluir duas ou mais cópias do mesmo peptídeo ou uma coleção de diversos peptídeos com estruturas diferentes e/ou propriedades.
[00617] Os conjugados da invenção são formados por anexação enzimática de um açúcar modificado ao peptídeo glicosilado ou não glicosilado. O açúcar modificado, quando interposto entre o peptídeo e o grupo de modificação no açúcar torna-se o que é referido aqui como "um grupo de ligação glicosila intacto". Usando a seletividade esquisita das enzimas, tal como glicosiltransferases, o presente processo provê peptídeos que portam um grupo desejado em uma ou mais localizações específicas. Assim, de acordo com a presente invenção, um açúcar modificado é anexado diretamente a um local selecionado na cadeia de peptídeo ou, alternativamente, o açúcar modificado é anexado à porção de carboidrato de um peptídeo. Os peptídeos nos quais os açúcares modificados são ligados a ambos o carboidrato de peptídeo e diretamente a um resíduo de aminoácido do esqueleto do peptídeo também encontram-se dentro do escopo da presente invenção.
[00618] Em contraste às estratégias de elaboração de peptídeo químicas e enzimáticas, os processos desta invenção tornam possível reunir peptídeos e glicopeptídeos que possuem um padrão de derivatização substancialmente homogêneo; as enzimas usadas na invenção são geralmente seletivas para um resíduo de aminoácido específico ou combinação de resíduos de aminoácido do peptídeo. Os processos são também práticos para produção em grande escala de peptídeos e glicopeptídeos modificados. Assim, os processos da invenção fornecem um dispositivo prático para preparação em grande escala de peptídeos possuindo padrões de derivatização substancialmente uniformes e pré- selecionados. Os processos são especificamente bem apropriados para modificação dos peptídeos terapêuticos, incluindo, porém, não limitado aos peptídeos que são incompletamente glicosilados durante a produção nas células de cultura de célula (por exemplo, células de mamíferos, células de insetos, células de plantas, células de fungos, células de leveduras ou células procarióticas) ou plantas ou animais transgênicos.
[00619] Os processos da invenção assim fornecem conjugados de peptídeos glicosilados e não glicosilados com meia vida terapêutica aumentada, devido, por exemplo, a razão de apagamento reduzida, ou razão reduzida de absorção pelo sistema imune ou reticuloendotelial (RES). Além disto, os processos da invenção fornecem um meio para mascarar determinantes antigênicos nos peptídeos, reduzindo ou eliminando a resposta imune do hospedeiro contra o peptídeo. A anexação seletiva dos agentes direcionais pode também ser usada para direcionar um peptídeo a um tecido específico ou receptor de superfície de célula que é específico para o agente direcional específico. Além disto, é provida uma classe de peptídeos que são especificamente modificados com uma porção terapêutica. 1 - Os Conjugados
[00620] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um conjugado entre um peptídeo e uma porção seletiva. O ligante entre o peptídeo e a porção selecionada inclui um grupo de ligação glicosila intacto, interposto entre o peptídeo e a porção selecionada. Conforme discutido aqui, a porção selecionada é essencialmente qualquer espécie que pode ser anexada a uma unidade de sacarídeo, resultando em um "açúcar modificado" que é reconhecido por uma enzima transferase apropriada, que anexa o açúcar modificado no peptídeo. O componente de sacarídeo do açúcar modificado, quando interposto entre o peptídeo e uma porção selecionada, torna-se um "grupo de ligação glicosila intacto". O grupo de ligação de glicosila é formado de qualquer mono ou oligo-sacarídeo que, após modificação, com uma porção selecionada, é um substrato para uma trasnferase apropriada.
[00621] Os conjugados da invenção tipicamente corresponderão à estrutura geral:
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onde os símbolos a, b, c, d e s representam um inteiro positivo, não zero; e t é tanto 0 ou um inteiro positivo. O "agente" é um agente terapêutico, um agente bioativo, um rótulo detectável, porção solúvel em água ou semelhantes. O "agente" pode ser um peptídeo, por exemplo, enzima, anticorpo, antígeno, etc. O ligante pode ser qualquer de uma ampla faixa de grupos de ligação, infra. Alternativamente, o ligante pode ser uma ligação simples ou um "ligante da ordem zero". A identidade do peptídeo não tem limitação. Peptídeos exemplares são fornecidos na figura 1.
[00622] Em uma modalidade exemplar, a porção selecionada é um polímero solúvel em água. O polímero solúvel em água é covalentemente anexado ao peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto. O grupo de ligação glicosila é covalentemente anexado a cada resíduo de aminoácido ou um resíduo glicosila do peptídeo. Alternativamente, o grupo de ligação glicosila é anexado a uma ou mais unidades de glicosila de um glicopeptídeo. A invenção também provê conjugados nos quais o grupo de ligação de glicosila é anexado ao resíduo de aminoácido e um resíduo de glicosila.
[00623] Além da provisão de conjugados que são formados através de um grupo de ligação glicosila intacto adicionado enzimaticamente, a presente invenção provê conjugados que são altamente homogêneos em seus padrões de substituição. Usando os processos da invenção, é possível formar conjugados de peptídeo nos quais essencialmente todas as porções de açúcar modificado atravessam uma população de conjugados da invenção e são anexadas ás cópias múltiplas de um aminoácido idêntico ou resíduo de glicosila. Assim, em um segundo aspecto, a invenção provê um conjugado de peptídeo possuindo uma população de porções de polímero solúveis em água, que são covalentemente ligadas ao peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto. Em um conjugado preferido da invenção, essencialmente cada elemento da população é ligado através do grupo de ligação de glicosila a um resíduo glicosila do peptídeo e cada resíduo de glicosila do peptídeo ao qual o grupo de ligação glicosila é anexado possui a mesma estrutura.
[00624] É também provido um conjugado de peptídeo possuindo uma população de porções de polímero solúveis em água covalentemente ligadas ao mesmo através de um grupo de ligação glicosila intacto. Em uma modalidade preferida, essencialmente cada elemento da população de porções de polímero solúveis em água é ligado a um resíduo de aminoácido do peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto e, cada resíduo de aminoácido possuindo um grupo de ligação glicosila intacto anexado ao mesmo possui a mesma estrutura.
[00625] A presente invenção também provê conjugados análogos aos descritos acima onde o peptídeo é conjugado a uma porção terapêutica, porção de diagnóstico, porção direcional, porção de toxina ou semelhante através de um grupo de ligação glicosila intacto. Cada uma das porções citada acima pode ser uma molécula pequena, polímero natural (por exemplo, peptídeo) ou polímero sintético.
[00626] Em uma modalidade exemplar, interleucina-2 (IL-2) é conjugado em transferrina através de um ligante bifuncional que inclui um grupo de ligação glicosila em cada término da porção PEG (Esquema 1). Por exemplo, um término do ligante PEG é funcionalizado com um ligante de ácido siálico intacto que é anexado à transferrina e o outro é funcionalizado com um ligante GalNAc intacto que é anexado ao IL-2.
[00627] Em outra modalidade exemplar, EPO é conjugado na transferrina. Em outra modalidade exemplar, EPO é conjugado ao fator de crescimento neurotrópico derivado glical (GDNF). Nestas modalidades, cada conjugação é realizada através de um ligante bifuncional que inclui um grupo de ligação glicosila intacto em cada término da porção PEG, conforme mencionado anteriormente. A transferrina transfere a proteína através da barreira cerebral de sangue.
[00628] Conforme estabelecido nas figuras anexas aqui, os conjugados da invenção podem incluir grupos de ligação glicosila que são mono ou multivalentes (por exemplo, estruturas antenárias), vide, figuras 13-21. Os conjugados da invenção também incluem grupos de ligação de glicosila que são glicanos ligados em O originários de serina ou treonina (figura 10). Assim, os conjugados da invenção incluem ambas as espécies nas quais uma porção selecionada é anexada a um peptídeo através de um grupo de ligação glicosila monovalente. Também estão incluídos na invenção os conjugados nos quais mais do que uma porção selecionada é anexada a um peptídeo através de um grupo de ligação multivalente. Uma ou mais proteínas podem ser conjugadas para tirar vantagem de suas propriedades biofísicas e biológicas.
[00629] Ainda em uma modalidade adicional, a invenção provê conjugados que localizam seletivamente em um tecido específico, devido a presença de um agente direcional como um componente do conjugado. Em uma modalidade exemplar, o agente direcional é uma proteína. Proteínas exemplares incluem transferrina (cérebro, grupo sangüíneo), soro humano (HS)-glicoproteína (osso, cérebro, grupo sangüíneo), anticorpos (cérebro, tecido com antígeno específico de anticorpo, grupo sangüíneo), fatores de coagulação V-XII (tecido danificado, coágulo, câncer, grupo sangüíneo), proteínas do soro, por exemplo, glicoproteína de a-ácido, fetuina, proteína a-fetal (cérebro, grupo sangüíneo), β2- glicoprotéina (fígado, placas de arteriosclerose, cérebro, grupo sangüíneo), G-CSF, GM-CSF, M-CSF e EPO (estimulação imune, canceres, grupo sangüíneo, superprodução de hemácias, neuroproteção) e albumina (aumento a meia vida).
[00630] Além dos conjugados discutidos acima, a presente invenção provê processos para preparação destes e outros conjugados. Assim, em um aspecto específico, a invenção provê um processo de formação de um conjugado covalente entre uma porção selecionada e um peptídeo. Adicionalmente, a invenção provê processos para direcionar conjugados da invenção para um tecido específico ou região do corpo.
[00631] Nas modalidades exemplares, o conjugado é formado entre um polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, porção direcional ou uma biomolécula e um peptídeo glicosilado ou não glicosilado. O polímero, porção terapêutica ou biomolécula é conjugado ao peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, que é interposto entre e covalentemente ligado a ambos o grupo de modificação e o peptídeo (por exemplo, polímero solúvel em água). O processo inclui contato do peptídeo com uma mistura contendo um açúcar modificado e uma glicosiltransferase para a qual o açúcar modificado é um substrato. A reação é conduzida sob condições suficientes para formar uma ligação covalente entre o açúcar modificado e o peptídeo. A porção de açúcar do açúcar modificado é preferivelmente selecionada de açúcares de nucleotídeo, açúcares ativados e açúcares, que não são nucleotídeos nem ativados.
[00632] Em uma modalidade, a invenção provê um processo para ligação de dois ou mais peptídeos através de um grupo de ligação. O grupo de ligação é de qualquer estrutura útil e pode ser selecionado de cadeia linear e estruturas de cadeia ramificada. Preferivelmente, cada término do ligante, que é anexado a um peptídeo, inclui um açúcar modificado (isto é, um grupo de ligação de glicosila intacto nascente).
[00633] Em um processo exemplar da invenção, dois peptídeos são ligados em conjunto através de uma porção ligante que inclui um ligante PEG. A construção conforma-se na estrutura geral estabelecida no quadro acima. Conforme descrito aqui, a construção da invenção inclui dois grupos de ligação glicosila intactos (isto é, s + t = 1). O foco em um ligante PEG que inclui dois grupos glicosila é para fins de clareza e não deve ser interpretado como limitando a identidade dos braços de ligante de uso nesta modalidade da invenção.
[00634] Assim, uma porção PEG é funcionalizada em um primeiro término com uma primeira unidade glicosila e em um segundo término, com uma segunda unidade glicosila. As primeira e segunda unidades glicosila são preferivelmente substratos para transferases diferentes, permitindo anexação ortogonal dos primeiro e segundo peptídeos às primeira e segunda unidades glicosila, respectivamente. Na prática, o ligante (glicosila)1-PEG-(glicosila)2 é contatado com o primeiro peptídeo e uma primeira transferase para a qual a primeira unidade glicosila é um substrato, desta forma constituindo o (peptídeo)1- (glicosila)1-PEG-(glicosila)2.A primeira transferase e/ou peptídeo não reagido é então opcionalmente removida da mistura de reação. O segundo peptídeo e a segunda transferase para a qual a segunda unidade de glicosila é um substrato são adicionados ao conjugado de (peptídeo)1- (glicosila)1-PEG-(glicosila)2 constituindo (peptídeo)1- (glicosila)1-PEG-(glicosila)2-(peptídeo)2. Os versados na técnica apreciarão eu o processo ressaltado acima é também aplicável para formação de conjugados entre mais do que dois peptídeos, por exemplo, o uso de um PEG ramificado, dendrímero, poli(aminoácido), polissacarídeo ou semelhante.
[00635] Conforme citado anteriormente, em uma modalidade exemplar, interleucina-2 (IL-2) é conjugado na transferrina através de um ligante bifuncional que inclui um grupo de ligação glicosila intacto em cada término da porção PEG (Esquema 1). O conjugado IL-2 possui uma meia vida in vivo que é aumentada em relação aquela de IL-2 sozinha, em virtude do tamanho molecular maior do conjugado. Além disto, a conjugação de IL-2 em transferrina serve para direcionar seletivamente o conjugado para o cérebro. Por exemplo, um término do ligante PEG é funcionalizado com um ácido siálico CMP e o outro é funcionalizado com um UDP-GalNAc. O ligante é combinado com IL-2 em presença de uma transferase GalNAc, resultando na anexação de GalNAC do braço do ligante a uma serina e/ou resíduo de treonina no IL-2.
[00636] Em outra modalidade exemplar, a transferrina é conjugada em um ácido nucléico para uso na terapia genética. Esquema 1
Figure img0045
[00637] O processo descrito acima pode ser realizado através de tantos ciclos quantos desejados, e não é limitado a formação de um conjugado entre dois peptídeos com um ligante simples. Além disto, os versados na técnica apreciarão que as reações que funcionalizam os grupos de ligação de glicosila intactos no término de PEG (ou outro) ligante com o peptídeo podem ocorrer simultaneamente no mesmo vaso de reação ou podem ser realizadas em um modo escalonado. Quando as reações são realizadas em uma maneira escalonada, o conjugado produzido em cada etapa é opcionalmente purificado de um ou mais componentes de reação (por exemplo, enzimas, peptídeos).
[00638] Uma modalidade adicional é estabelecida no Esquema 2. O Esquema 2 mostra um processo de preparação de um conjugado que direciona uma proteína selecionada, por exemplo, EPO, para os ossos e aumenta a meia vida circulatória da proteína selecionada. Esquema 2
Figure img0046
[00639] O uso de derivados reativos de PEG (ou outros ligantes) para anexar uma ou mais porções de peptídeo ao ligante encontra-se dentro do escopo da presente invenção. A invenção não está limitada a identidade do análogo de PEG reativo. Muitos derivados ativados de poli(etileno glicol) estão disponíveis comercialmente e na literatura. Um versado na técnica poderia escolher, dentro de suas habilidades, e sintetizar, caso necessário, um derivado de PEG apropriado ativado com o qual preparar um substrato útil para a presente invenção. Vide, Abuchowski e outros Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984); Abuchowski e outros, J Biol. Chem., 252: 3582-3586 (1977); Jackson e outros, Anal. Biochem., 165: 114-127 (1987); Koide e outros, Biochem Biophys. Res. Commun., 111: 659-667 (1983)), tresilato (Nilsson e outros, Methods Enzymol., 104: 56-69 (1984); Delgado e outros, Biotechnol. Appl. Biochem., 12: 119-128 (1990)); ésteres ativos derivados de N-hidróxisuccinimida (Buckmann e outros, Makromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981); Joppich e outros, Malkromol. Chem., 180: 1381-1384 (1979); Abuchowski e outros, Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984); Katre e outros Proc. Matt. Acad. Sci. U.S.A., 84: 1487-1491 (1987); Kitamura e outros, Cancer Res., 51: 4310-4315 (1991); Boccu e outros, Z. Naturforsch., 38C: 94-99 (1983), carbonatos (Zalipsky e outros, POLY(ETHYLENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, Harris, Ed., Plenum Press, New York, 1992, pp. 347-370; Zalipsky e outros, Biotechnol. Appl. Biochem., 15: 100-114 (1992); Veronese e outros, Appl. Biochem. Biotech., 11: 141-152 (1985)), formatos imidazolila (Beauchamp e outros, Anal. Biochem., 131: 25-33 (1983); Berger e outros, Blood, 71: 1641-1647 (198 8)), 4-ditiopiridinas (Woghiren e outros, Bioconjugate Chem., 4: 314-318 (1993)), isocianatos (Byun e outros, ASA-TO Journal, M649-M-653 (1992)) e epóxidos (Patente US número 4.806.595, emitida para Noishiki e outros, (1989). Outros grupos de ligação incluem ligação de uretano entre grupos amino e PEG ativado. Vide, Veronese, e outros, Appl. Biochem. Biotechnol., 11: 141-152 (1985).
[00640] Em outra modalidade exemplar, onde um derivado PEG reativo é utilizado, a invenção provê um processo para estender a meia vida de circulação sangüínea de um peptídeo selecionado, em essência direcionando o pepetídeo para o grupo sangüíneo, por conjugação do peptídeo para um polímero sintético ou natural de um tamanho suficiente para retardar a filtração da proteína por glomerulos (por exemplo, albumina). Esta modalidade da invenção é ilustrada no Esquema 3 onde eritropoietina (EPO) é conjugada em albumina através de um ligante PEG usando uma combinação de modificação química e enzimática. Esquema 3
Figure img0047
[00641] Assim, conforme é mostrado no Esquema 3, um resíduo de aminoácido de albumina é modificado com um derivado PEG reativo, tal como X-PEG-(CMP-ácido siálico), onde X é um grupo de ativação (por exemplo, éster ativo, isotiocianato, etc.). O derivado PEG e EPO são combinados e contatados com uma transferase para a qual ácido siálico-CMP é um substrato. Em uma modalidade ilustrativa adicional, uma ε-amina de lisina é reagida com o éster N-hidróxisuccinimida do ligante PEG para formar o conjugado de albumina. O ácido siálico-CMP do ligante é enzimaticamente conjugado a um resíduo apropriado no EPO, por exemplo, Gal, pelo que, formando o conjugado. Os versados na técnica apreciarão que o processo descrito acima não é limitado aos padrões de reação estabelecidos. Além disto, o processo pode ser praticado para formar conjugados que incluem mais do que duas porções de proteína por exemplo, utilizando um ligante ramificado possuindo mais do que dois terminais. 2 - Açúcares Modificados
[00642] Espécies doadoras de glicosila modificada ("açúcares modificados") são preferivelmente selecionados de nucleotídeos de açúcar modificados, açúcares modificados ativados e açúcares modificados que são sacarídeos que nem são nucleotídeos nem ativados. Qualquer estrutura de carboidrato desejada pode ser adicionada a um peptídeo usando os processos da invenção. Tipicamente, a estrutura será um monossacarídeo, porém a presente invenção não está limitada ao uso dos açúcares de monossacarídeo modificados; oligossacarídeos e polissacarídeos são úteis.
[00643] O açúcar de modificação é anexado a uma porção de açúcar por meios enzimáticos, químicos ou uma combinação dos mesmos, desta forma produzindo um açúcar modificado. Os açúcares são substituídos em qualquer posição que permita a anexação da porção de modificação, ainda que permitindo que o açúcar funcione como um substrato para a enzima usada para ligar o açúcar modificado ao peptídeo. Em uma modalidade preferida, quando ácido siálico é o açúcar, o ácido siálico é substituído com o grupo de modificação tanto na posição 9 na cadeia lateral de piruvila quanto na posição 5, na porção amina que é normalmente acetilada no ácido siálico.
[00644] Em determinadas modalidades da presente invenção, um nucleotídeo de açúcar modificado é utilizado para adicionar o açúcar modificado ao peptídeo. Nucleotídeos de açúcar exemplares que são usados na presente invenção e sua forma modificada incluem mono, di ou trifosfatos de nucleotídeo ou análogos dos mesmos. Em uma modalidade preferida, o nucleotídeo de açúcar modificado é selecionado de UDP-glicosídeo, CMP-glicosídeo ou um GDP-glicosídeo. Mesmo mais preferivelmente, o nucleotídeo de açúcar modificado de uma UDP-galactose, UDP- galactosamina, UDP-glicose, UDP-glicosamina, GDP-manose, GDP-fucose, CMP-ácido siálico ou CMP-NeuAc. Os derivados de N-acetilamina dos nucleotídeos de açúcar são também usados no processo da invenção.
[00645] A invenção também provê processos para sintetização de um peptídeo modificado usando um açúcar modificado, por exemplo, galactose modificada, fucose e ácido siálico. Quando um ácido siálico modificado é suado, tanto uma sialiltransferase quanto trans-sialidase (apenas para ácido a2,3-siálico ligado) pode ser usada nestes processos.
[00646] Em outras modalidades, o açúcar modificado é um açúcar ativado. Os açúcares modificados ativados que são úteis na presente invenção são tipicamente glicosídeos que foram sinteticamente alterados para incluir um grupo de partida ativado. Conforme usado aqui, o termo "grupo de partida ativado" se refere aquelas porções que são facilmente deslocadas nas reações de substituição nucleófila regulada por enzima. Muitos açúcares ativados são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Vocadlo e outros, em CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY, volume 2, Ernst e outros, Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Alemanha, 2000; Kodama e outros, Tetrahedron Lett. 34: 6419 (1993); Lougheed e outros, J. Biol. Chem. 274:37717 (1999)).
[00647] Exemplos de grupos de ativação (grupos de partida) incluem flúor, cloro, bromo, éster tosilato, éster mesilato, éster triflato e semelhantes. Os grupos de partida ativados preferidos para uso na presente invenção, são aqueles que não sobrecarregam significativa e estericamente a transferência enzimática do glicosídeo para o aceitador. Correspondentemente, as modalidades preferidas dos derivados de glicosídeo ativados incluem fluoretos de glicosila e mesilatos de glicosila, com os fluoretos de glicosila sendo especificamente preferidos. Entre os fluoretos de glicosila, fluoreto de α-galactosila, fluoreto de α-manosila, fluoreto de α-glicosila, fluoreto de α- fucosila, fluoreto de α-xilosila, fluoreto de α-sialila, fluoreto de α-N-acetilglicosaminila, fluoreto de α-N- acetilgalactosaminila, fluoreto de β-galactosila, fluoreto de β-manosila, fluoreto de β-glicosila, fluoreto de β- fucosila, fluoreto de β-xilosila, fluoreto de β-silila, fluoreto de β-N-acetilglicosaminila e fluoreto de β-N- acetilgalactosaminila são os mais preferidos.
[00648] Como ilustração, os fluoretos de glicosila podem ser preparados do açúcar livre primeiro por acetilação do açúcar e então tratamento do mesmo com HF/piridina. Isto gera o anômero mais estável termodinamicamente do fluoreto de glicosila (acetilado) protegido (isto é, o fluoreto de α-glicosila). Se o anômero menos estável (isto é, o fluoreto de β-glicosila) for desejado, ele pode ser preparado por conversão do açúcar peracetilado com HBr/HOAc ou com HCl para gerar o brometo ou cloreto anomérico. Este intermediário é reagido com um sal de fluoreto, tal como, fluoreto de prata, para gerar o fluoreto de glicosila. Fluoretos de glicosila acetilados podem ser desprotegidos por reação com base branda (catalítica) em metanol (por exemplo, NaOMe/MeOH). Além disto, muitos fluoretos de glicosila são comercialmente disponíveis.
[00649] Outros derivados de glicosila ativados podem ser preparados usando processos convencionais conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, mesilatos de glicosila podem ser preparados por tratamento da forma hemiacetal completamente benzilada do açúcar com cloreto de mesila, seguido por hidrogenação catalítica para remover grupos benzila.
[00650] Em uma modalidade adicionalmente exemplar, o açúcar modificado é um oligossacarídeo possuindo uma estrutura antenária. Em uma modalidade preferida, um ou mais dos terminais da antenária portam a porção de modificação. Quando mais do que uma porção de modificação é anexada a um oligossacarídeo possuindo uma estrutura antenária, o oligossacarídeo é útil para "ampliar" a porção de modificação; cada unidade de oligossacarídeo conjugada ao peptídeo anexa múltiplas cópias do grupo de modificação ao peptídeo. A estrutura geral de um quelato típico da invenção conforme estabelecida nos desenhos acima, engloba espécies multivalentes da preparação de um conjugado da invenção utilizando uma estrutura antenária. Muitas estruturas de sacarídeo antenárias são conhecidas na técnica e o presente processo pode ser praticado com as mesmas sem limitação.
[00651] Grupos de modificação exemplares são discutidos a seguir. Os grupos de modificação podem ser selecionados para uma ou mais propriedades desejáveis. Propriedades exemplares incluem, porém não estão limitadas aos farmacocinéticos melhorados, farmacodinâmicos melhorados, biodistribuição aperfeiçoada, provisão de espécies polivalentes, solubilidade em água aperfeiçoada, lipofilicidade diminuída ou melhorada e direcionamento do tecido. D - Conjugados de Peptídeo a) Polímeros solúveis em água
[00652] A hidrofilicidade de um peptídeo selecionado é melhorada por conjugação com moléculas polares tais como, moléculas contendo amina, éster, hidroxila e polihidroxila. Exemplos representativos incluem, porém não estão limitados a polilisina, polietilenoimina, poli(etileno glicol) e poli(propilenoglicol). Polímeros solúveis em água preferidos são essencialmente não fluorescentes ou emitem uma quantidade mínima de fluorescente, de modo que eles são impróprios para uso como marcador fluorescente em um ensaio. Os polímeros que não são açúcares que ocorrem naturalmente podem ser usados. Além disto, o uso de um açúcar que ocorre naturalmente, de outra forma, que é modificado por anexação covalente de outra entidade (por exemplo, poli(etileno glicol), poli(propileno glicol), poli(aspartato), biomolécula, porção terapêutica, porção de diagnóstico, etc.) é também contemplado. Em outra modalidade exemplar, uma porção de açúcar terapêutico é conjugada a um braço de ligante e o braço de ligante-açúcar é subseqüentemente conjugado ao peptídeo através do processo da invenção.
[00653] Os processos e química para ativação de polímeros solúveis em água e sacarídeos bem como processos para conjugação de sacarídeos e polímeros para várias espécies são descritos na literatura. Os processos usados geralmente para ativação de polímeros incluem ativação de grupos funcionais com brometo de cianogeno, periodato, glutaraldeído, biepóxidos, epicloroidrina, divinilsulfona, carbodiimida, haletos de sulfonila, triclorotriazina, etc. (vide, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson e outros, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.; Dunn, R. L., e outros, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991).
[00654] As vias para preparação de moléculas PEG reativas e formação de conjugados usando as moléculas reativas são conhecidas na técnica. Por exemplo, a Patente US número 5.672.662 revela um conjugado isolável e solúvel em água de um éster ativo de um polímero ácido selecionado de poli(óxidos de alquileno), poli (polióis oxietilados), poli(álcoois olefínicos) e poli(acrilomorfolina) lineares ou ramificados, onde o polímero possui cerca de 44 ou mais unidades recorrentes.
[00655] A Patente US número 6.376.604 estabelece um processo para preparação de um éster 1- benzotriazolilcarbonato solúvel em água de um polímero solúvel em água e não peptídico, por reação de uma hidroxila terminal do polímero com di(1- benzotriazoil)carbonato em um solvente orgânico. O éster ativo é usado para formar conjugados com um agente biologicamente ativo, tal como uma proteína ou peptídeo.
[00656] O WO 99/45964 descreve um conjugado compreendendo um agente biologicamente ativo e um polímero solúvel em água ativado compreendendo um esqueleto de polímero possuindo pelo menos um término ligado ao esqueleto de polímero através de uma ligação estável, onde pelo menos um término compreende uma porção de ramificação possuindo grupos reativos proximais ligados à porção de ramificação, onde o agente biologicamente ativo é ligado a pelo menos um dos grupos proximais reativos. Outros poli(etileno glicóis) ramificados são descritos no WO 96/21469. A Patente US número 5.932.462 descreve um conjugado formado com uma molécula PEG ramificada que inclui um término ramificado que inclui grupos funcionais reativos. Os grupos reativos livres são disponíveis para reagir com as espécies biologicamente ativas, tais como, uma proteína ou peptídeo, formando conjugados entre o poli(etileno glicol) e as espécies biologicamente ativas. A Patente US número 5.446.090 descreve um ligante PEG bifuncional e seu uso a formação de conjugados possuindo um peptídeo em cada um dos términos de ligante PEG.
[00657] Os conjugados que incluem ligações PEG degradáveis são descritos no WO 99/34833; e WO 99/14259, bem como na Patente US número 6.348.558. Tais ligações degradáveis são aplicáveis na presente invenção.
[00658] Embora os derivados PEG reativos e conjugados formados usando os derivados sejam conhecidos na técnica, até a presente invenção, não foi reconhecido que um conjugado poderia ser formado entre PEG (ou outro polímero) e outras espécies, tais como, peptídeo ou glicopeptídeo, através de um grupo de ligação glicosila intacto.
[00659] Muitos polímeros solúveis em água são conhecidos dos versados na técnica e são úteis na prática da presente invenção. O termo polímero solúvel em água engloba espécies, tais como, sacarídeos (por exemplo, dextrano, amilose, ácido hialurônico, poli(ácido siálico), heparanos, heparinas, etc.), poli (aminoácidos); ácidos nucléicos; polímeros sintéticos (por exemplo, poli(ácido acrílico), poli(éteres), por exemplo, poli(etileno glicol); peptídeos, proteínas e semelhantes. A presente invenção pode ser praticamente com qualquer polímero solúvel em água com a única limitação de que o polímero deve incluir um ponto onde o restante do conjugado pode ser anexado.
[00660] Os processos para ativação de polímeros podem também ser encontrados no WO 94/17039, Patente US número 5.324.844, WO 94/18247, WO 94/04193, Patente US número 5.219.564, Patente US número 5.122.614, WO 90/13540, Patente US número 5.281.698, e mais WO 93/15189 e para conjugação entre polímeros ativados e peptídeos, por exemplo, Fator de Coagulação VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula transportando oxigênio (Patente US número 4.412.989), ribonuclease e dismutase de superóxido (Veronese e outros, App. Biochem. Biotech. 11: 141-45(1985)).
[00661] Polímeros solúveis em água preferidos são aqueles nos quais uma proporção substancial das moléculas de polímeros em uma amostra do polímero possuem aproximadamente o mesmo peso molecular; tais polímeros são "homodispersos".
[00662] A presente invenção é adicionalmente ilustrada com referência a um conjugado poli(etileno glicol). Várias revisões e monografias da funcionalização e conjugação de PEG encontram-se disponíveis. Vide, por exemplo, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong e outros, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado e outros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); e Bhadra, e outros, Pharmazie, 57: 5-29 (2002).
[00663] Moléculas de poli(etileno glicol) apropriadas para uso na invenção incluem, porém não estão limitadas aquelas descritas pela Fórmula 3 que se segue: Fórmula 3:
Figure img0048
R = H, alquila, benzilo, arila, acetal, OHC-, H2NCH2CH2-, HS-CH2CH2-,
Figure img0049
, açúcar-nucleotídeo, proteína, metila, etila; X, Y, W, U (independentemente selecionados) = O, S, NH, N-R'; R',R"' (independentemente selecionados) = alquila, benzilo, arila, alquil arila, piridila, arila substituída, acrilalquila, acilarila; n = 1 a 2000; m, q, p (independentemente selecionados) = 0 a 20 o = 0 a 20; Z = HO, NH2, halogênio, S-R"', ésteres ativados,
Figure img0050
açúcar-nucleotídeo, proteína, imidazol, HOBT, tetrazol, haleto; e V = HO, NH2, halogênio, S-R"', ésteres ativados, amidas ativadas, açúcar-nucleotídeo, proteína.
[00664] Nas modalidades preferidas, a molécula poli(etileno glicol) é selecionada do que se segue:
Figure img0051
[00665] O poli(etileno glicol) útil na formação do conjugado da invenção é tanto linear quanto ramificado. Moléculas de poli(etileno glicol) ramificadas apropriadas para uso na invenção incluem, porém não estão limitadas aquelas descritas pela fórmula que se segue: Fórmula 4:
Figure img0052
R', R", R"' (independentemente selecionados) = H, alquila, benzilo, arila, acetal, OHC-, H2N-CH2CH2-, HS- CH2CH2-, -(CH2)qCY-Z, açúcar-nucleotídeo, proteína, metila, etila, heteroarila, acilalquila, acilarila, acilalquilarila; X, Y, W, A, B (independentemente selecionados) = O, S, NH, N-R', (CH2)l; n, p (independentemente selecionados) = 1 a 2.000; m, q, o (independentemente selecionados) = 0 a 20; Z = HO, NH2, halogênio, S-R"', ésteres ativados,
Figure img0053
açúcar-nucleotídeo, proteína; V = HO, NH2, halogênio, S-R"', ésteres ativados, amidas ativadas, açúcar-nucleotídeo, proteína.
[00666] A meia vida in vivo, área sob a curva e/ou tempo de residência de peptídeos terapêuticos pode também ser melhorada com polímeros solúveis em água, tais como, polietileno glicol (PEG) e polipropileno glicol (PPG). Por exemplo, modificação química de proteínas com PEG (PEGilação) aumenta seu tamanho molecular e diminui sua superfície e acessibilidade de grupo funcional, cada um dos quais dependendo do tamanho do PEG anexado à proteína. Esta invenção em um aperfeiçoamento das meias vidas de plasma e na estabilidade proteolítica e uma diminuição na imunogenicidade e absorção hepática (Chaffee e outros, J. Clin. Invest. 89: 1643-1651 91992); Pyatak e outros Res. Commun. Chem. Pathol Pharmacol. 29: 113-127 (1980)). A PEGilação de interleucina-2 foi reportada como aumentando sua potência antitumor in vivo (Kratre e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1487-1491 (1987)) e PEGilação de um derivado de F(ab')2 de um anticorpo monoclonal A7 aperfeiçoou sua localização de tumor (Kitamura e outros, Biochem. Biphys. Res. Commun. 28: 1387-1394 (1990)).
[00667] Em uma modalidade preferida, a meia vida in vivo de um peptídeo derivatizado com um polímero solúvel em água por um processo da invenção é aumentada relevante a meia vida in vivo do peptídeo não derivatizado. Em outra modalidade preferida, a área sob a curva de um peptídeo derivatizado com um polímero solúvel em água usando um processo da invenção é aumentada relevante a área sob a curva do peptídeo não derivatizado. Em outra modalidade preferida, o tempo de residência de um peptídeo derivatizado com um polímero solúvel em água usando um processo da invenção é aumentado relevante ao tempo de residência do peptídeo não derivatizado. As técnicas para determinar a meia vida in vivo, a área sob a curva e o tempo de residência são bem conhecidas na técnica. As descrições de tais técnicas podem ser encontradas em J.G. Wagner, 1993, Pharmacokinetics for the Pharmaceutical Scientist, Technomic Publishing Company, Inc. Lancaster PA.
[00668] O aumento no peptídeo em sua meia vida in vivo é melhor expresso como uma faixa do aumento percentual nesta quantidade. A extremidade inferior da faixa de aumento em percentual é de cerca de 40%, cerca de 60%, cerca de 80%, cerca de 100%, cerca de 150% ou cerca de 200%. A extremidade superior da faixa é de cerca de 60%, cerca de 80%, cerca de 100%, certa de 150% ou mais do que 250%.
[00669] Em uma modalidade exemplar, a presente invenção provê um hormônio de estimulação de folículo PEGilado (Exemplos 9 e 10). Em uma modalidade exemplar adicional, a invenção provê uma transferrina PEGilada (Exemplo 13).
[00670] Outros polímeros solúveis em água exemplares de uso nesta invenção incluem, porém não estão limitados aos poli(óxidos de alquileno), poli (polióis oxietilados), poli(álcoois olefínicos) e poli(acrilomorfolina) lineares ou ramificados, dextrano, amido, poli(aminoácidos), etc. b) Polímeros insolúveis em água
[00671] Os conjugados da invenção podem também incluir um ou mais polímeros insolúveis em água. Esta modalidade da invenção é ilustrada por uso do conjugado como um veículo com o qual liberar um peptídeo terapêutico em uma maneira controlada. Os sistemas de liberação de medicamento polimérico são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Dunn e outros, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIBERY SYSTEMS, ACS Symposium Series volume 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Os versados na técnica apreciarão que substancialmente qualquer sistema de liberação de medicamento conhecido é aplicável aos conjugados da presente invenção.
[00672] Polímeros insolúveis em água representativos incluem, porém não estão limitados as polifosfazinas, poli(álcoois vinílicos), poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, éteres de polivinila, ésteres de polivinila, haletos de polivinila, polivinilpirrolidona, poliglicolidos, polisiloxanas, poliuretanas, poli(metacrilato de metila), poli(metacrilato de etila), poli(metacrilato de butila), poli(metacrilato de isobutila), poli(metacrilato de hexila), poli(metacrilato de isodecila), poli(metacrilato de laurila), poli(metacrilato de fenila), poli(acrilato de metila), poli(acrilato de isopropila), poli(acrilato de isobutila), poli(acrilato de octadecila), polietileno, polipropileno, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno, poli(acetato de vinila), cloreto de polivinila, poliestireno, polivinil pirrolidona, plurônicos e polivinilfenol e copolímeros dos mesmos.
[00673] Polímeros naturais modificados sinteticamente de uso em conjugados da invenção incluem, porém não estão limitados as alquil celuloses, hidroxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose e nitroceluloses. Elementos especificamente preferidos de classes amplas de polímeros naturais modificados sinteticamente incluem, porém não estão limitados a metil celulose, etil celulose, hidróxipropil celulose, hidróxipropil metil celulose, hidróxibutil metil celulose, acetato de celulose, propionato de celulose, butirato acetato de celulose, ftalato acetato de celulose, carboximetil celulose, triacetato de celulose, sal de sódio sulfato de celulose e polímeros de ésteres acrílico e metacrílico e ácido algínico.
[00674] Estes e outros polímeros discutidos aqui podem ser prontamente obtidos de fontes comerciais, tais como, Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Polysciences (Warrenton, PA), Aldrich (Milwaukee, WI), Fluka (Ronkonkoma, NY) e BioRad (Richmond, CA) ou também sintetizados de monômeros obtidos destes fornecedores usando técnicas padrão.
[00675] Polímeros biodegradáveis representativos de uso nos conjugados da invenção incluem, porém não estão limitados aos polilactídeos, poliglicolidos e copolímeros dos mesmos, poli(tereftalato de etileno), poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactido-co- caprolactona), poli(lactido-co-glicolido), polianidridos, poliortoésteres, combinações e copolímeros dos mesmos. São de uso específico as composições que formam géis, tais como aquelas incluindo colágeno, plurônicos e semelhantes.
[00676] Os polímeros de uso na invenção incluem polímeros "híbridos" que incluem materiais insolúveis em água possuindo dentro de pelo menos uma porção de sua estrutura, uma molécula bioressorvível. Um exemplo de tal polímero é um que inclui um copolímero insolúvel em água, que possui uma região bioresorvível, uma região hidrófila e vários grupos funcionais reticuláveis por cadeia polimérica.
[00677] Para fins da presente invenção, "materiais insolúveis em água" inclui materiais que são substancialmente insolúveis em água ou ambientes contendo água. Assim, embora determinadas regiões ou segmentos do copolímero possam ser hidrófilos ou mesmo solúveis em água, a molécula de polímero, como um todo, não precisa substancialmente dissolver em água.
[00678] Para fins da presente invenção, o termo "molécula biodegradável" inclui uma região que é capaz de ser metabolizada ou rompida e ressorvida e/ou eliminada através de vias excretoras normais pelo corpo. Tais metabólitos ou produtos de rompimento são preferível e substancialmente não tóxicos ao corpo.
[00679] A região bioressorvível pode ser tanto hidrófoba quanto hidrófila, a medida que a composição de copolímero, como um todo não se torna solúvel em água. Assim, a região bioressorvível é selecionada com base na preferência daquele polímero, como um todo, permanecendo insolúvel em água. Conseqüentemente, as propriedades relativas, isto é, os tipos de grupos funcionais contidos e as proporções relativas da região bioressorvível e a região hidrófila são selecionadas para garantir que composições bioressorvíveis permaneçam insolúveis em água.
[00680] Polímeros ressorvíveis exemplares incluem, por exemplo, copolímeros em bloco ressorvíveis produzidos sinteticamente de poli(a-hidróxi-ácido carboxílico)/poli(oxialquileno, (vide, Cohn e outros, patente US número 4.826.945). Estes copolímeros não são reticulados e são solúveis em água, de modo que o corpo pode excretar as composições de copolímero em bloco degradadas. Vide, Younces e outros, J. Biomed. Mater. Res. 21: 1301-1316 (1987) e Cohn e outros, J. Biomed. Mater. Res. 22: 993-1009 (1988).
[00681] Presentemente, polímeros bioressorvíveis preferidos incluem um ou mais componentes selecionados de poli(ésteres), poli(ácidos hidróxi), poli(lactonas), poli(amidas), poli(éster-amidas), poli(aminoácidos), poli(anidridos), poli(ortoésteres), poli(carbonatos), poli(fosfazinas), poli(fosfoésteres), poli(tioésteres), polissacarídeos e misturas dos mesmos. Ainda mais preferivelmente, o polímero bioressorvível inclui um componente poli(hidróxi)ácido. Dos poli(hidróxi)ácidos, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido policapróico, ácido polibutírico, ácido polivalérico e copolímeros e misturas dos mesmos são preferidos.
[00682] Além dos fragmentos de formação que são absorvidos in vivo ("bioressorvidos"), revestimentos poliméricos preferidos para uso nos processos da invenção podem também formar um fragmento excretável e/ou metabolizável.
[00683] Copolímeros de ordem superior podem também ser usados na presente invenção. Por exemplo, Casey e outros, patente US número 4.438.253, emitida em 20 de março de 1984, revela copolímeros tribloco produzidos de transesterificação de poli(ácido glicólico) e um poli(alquileno glicol) terminado em hidroxila. Tais composições são reveladas para uso como suturas de monofilamento ressorvíveis. A flexibilidade de tais composições é controlada pela incorporação de um ortocarbonato aromático, tal como, tetra-p-tolil ortocarbonato na estrutura do copolímero.
[00684] Outros revestimentos, com base nos ácidos lácticos e/ou glicólicos podem também ser utilizados. Por exemplo, Spinu, Patente US número 5.202.413, emitida em 13 de abril de 1993, revela copolímeros multibloco biodegradáveis possuindo blocos ordenados seqüencialmente de poliláctido e/ou poliglicolido produzidos por polimerização de abertura de anel de lactido e/ou glicolido tanto em um diol oligomérico quanto um resíduo de diamina seguido por extensão de cadeia com um composto difuncional, tal como, um diisocianato, cloreto de diacila ou diclorosilano.
[00685] Regiões bioressorvíveis de revestimentos úteis na presente invenção podem ser projetadas para serem hidrolítica e/ou enzimaticamente cliváveis. Para fins da presente invenção "hidroliticamente clivável" se refere a suscetibilidade do copolímero, especialmente a região bioressorvível, a hidrólise em água ou um ambiente contendo água. De modo semelhante, "enzimaticamente clivável" conforme usado aqui, se refere a suscetibilidade do copolímero, especialmente a região bioressorvível, de clivar por enzimas endógenas ou exógenas.
[00686] Quando colocada dentro do corpo, a região hidrófila pode ser processada em fragmentos excretáveis e/ou metabolizáveis. Assim, a região hidrófila pode incluir, por exemplo, poliéteres, óxidos polialquileno, polióis, poli(vinil pirrolidina), poli(álcool vinílico), poli(alquil oxazolinas), polissacarídeos, carboidratos, peptídeos, proteínas e copolímeros e misturas dos mesmos. Adicionalmente, a região hidrófila pode ser também, por exemplo, um óxido poli(alquileno). Tais óxidos poli(alquileno) podem incluir, por exemplo, óxido de poli(etileno), óxido de poli(propileno) e misturas e copolímeros dos mesmos.
[00687] Polímeros que são componentes de hidrogéis são também úteis na presente invenção. Hidrogéis são materiais poliméricos que são capazes de absorver quantidades relativamente grandes de água. Exemplos de compostos de formação de hidrogel incluem, porém não são limitados aos ácidos poliacrílicos, carboximetilcelulose de sódio, álcool polivinílico, polivinil pirrolidina, gelatina, carragenan e outros polissacarídeos, ácido hidróxietilenometacrílico (HEMA), bem como derivados dos mesmos e semelhantes. Podem ser produzidos hidrogéis que são estáveis, biodegradáveis e bioressorvíveis. Além disto, as composições de hidrogel podem incluir subunidades que exibem uma ou mais destas propriedades.
[00688] Composições hidrogel biocompatíveis cuja integridade pode ser controlada através de reticulação são conhecidos e são presentemente preferidas para uso nos processos da invenção. Por exemplo, Hubbell e outros, Patentes US números 5.410.016 emitida em 25 de abril de 1995 e 5.529.914 emitida em 25 de junho de 1996, revela sistemas solúveis em água, que são copolímeros de bloco reticulados possuindo um segmento de bloco central solúvel em água intercalado entre duas extensões hidroliticamente lábeis. Tais copolímeros são adicionalmente tampados na extremidade com funcionalidades acrilato fotopolimerizáveis. Quando reticulados, estes sistemas tornam-se hidrogéis. O bloco central solúvel em água de tais copolímeros pode incluir poli(etileno glicol); considerando-se que as extensões hidroliticamente lábeis podem ser um poli(a-ácido hidróxi), tal como, ácido poliglicólico ou ácido poliláctico. Vide, Sawhney e outros, Macromolecules 26: 581-587 (1993).
[00689] Em outra modalidade preferida, o gel é gel termoreversível. Os géis termoreversíveis incluindo componentes, tais como, plurônicos, colágeno, gelatina, ácido hialourônico, polissacarídeos, hidrogel poliuretano, hidrogênio poliuretano-uréia e combinações dos mesmos são presentemente preferidos.
[00690] Ainda em outra modalidade exemplar, o conjugado da invenção inclui um componente de um lipossoma. Lipossomas podem ser preparados de acordo com os processos conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, conforme descrito em Eppstein e outros, Patente US número 4.522.811, emitida em 11 de junho de 1985. Por exemplo, formulações de lipossomas podem ser preparadas por dissolução do(s) lipídeo(s) (tais como, etanolamina fosfatidila estearoila, colina fosfatidila estearoila, colina fosfatidila aracadoila e colesterol) em um solvente inorgânico, que é então evaporado, deixando atrás uma película fina de lipídeo seco sobre a superfície do recipiente. Uma solução aquosa do composto ativo ou seu sal farmaceuticamente aceitável é então introduzida no recipiente. O recipiente é então girado manualmente para liberar o material de lipídeo das laterais do recipiente e dispersar os agregados de lipídeo, formando assim a suspensão lipossômica.
[00691] As micropartículas citadas acima e os processos para preparação das micropartículas são oferecidos por meio de exemplo e elas não se destinam a definir o escopo das micropartículas de uso na presente invenção. Será aparente aos versados na técnica, que uma fileira de micropartículas, fabricada por diferentes processos, é utilizada na presente invenção. c) Biomoléculas
[00692] Em outra modalidade preferida, o açúcar modificado porta uma biomolécula. Ainda nas modalidades adicionalmente preferidas, a biomolécula é uma proteína funcional, enzima, antígeno, anticorpo, peptídeo, ácido nucléico (por exemplo, nucleotídeos simples ou nucleosídeos, oligonucleotídeos, polinucleotídeos e ácidos nucléicos filamentados simples e superiores), lectina, receptor ou uma combinação dos mesmos.
[00693] Algumas biomoléculas preferidas são essencialmente não fluorescentes ou emitem uma quantidade mínima de fluorescência, o que torna as mesmas inapropriadas para uso como um marcador fluorescente em um ensaio. Outras biomoléculas podem ser fluorescentes. O uso de um açúcar que de outra forma ocorre naturalmente, sendo modificado por anexação covalente de outra entidade (por exemplo, PEG, biomolécula, porção terapêutica, porção de diagnóstico, etc.) é apropriado. Em uma modalidade exemplar, uma porção de açúcar, que é uma biomolécula, é conjugada a um braço ligante e o cassete de braço ligante- açúcar é subseqüentemente conjugado em um peptídeo, através de um processo da invenção.
[00694] Biomoléculas úteis na prática da presente invenção podem ser derivadas de qualquer fonte. As biomoléculas podem ser isoladas de fontes naturais ou podem ser produzidas por processos sintéticos. Os peptídeos podem ser peptídeos naturais ou peptídeos mutados. As mutações podem ser efetuadas por mutagenese química, mutagenese direcionada ao local ou outros meios de indução de mutações conhecidos dos versados na técnica. Os peptídeos úteis na prática da presente invenção incluem, por exemplo, enzimas, antígenos, anticorpos e receptores. Os anticorpos podem tanto ser policlonais quanto monoclonais; tanto intactos quanto em fragmentos. Os peptídeos são opcionalmente os produtos de um programa de evolução direcionada.
[00695] Ambos os peptídeos derivados sintética ou naturalmente e os ácidos nucléicos são de uso em conjunto com a presente invenção; estas moléculas podendo se anexadas a um componente de resíduo de açúcar ou um agente de reticulação por qualquer grupo reativo apropriado. Por exemplo, os peptídeos podem ser anexados através de um grupo de amina reativa, carboxila, sulfidrila ou hidroxila. O grupo reativo pode residir em um término de peptídeo ou em um sítio interno à cadeia de peptídeo. Os ácidos nucléicos podem ser anexados através de um grupo reativo em uma base (por exemplo, amina exocíclica) ou um grupo hidroxila disponível em uma porção açúcar (por exemplo, 3'- ou 5'-hidroxila). As cadeias de peptídeo e ácido nucléico podem adicionalmente ser derivatizadas em um ou mais sítios, de modo a permitir a anexação de grupos reativos apropriados à cadeia. Vide, Chrisey e outros, Nucleic Acids Res. 24: 3031-3039 (1996).
[00696] Em uma modalidade preferida adicional, a biomolécula é selecionada para direcionar o peptídeo modificado pelos processos da invenção a um tecido específico, desta forma melhorando a liberação do peptídeo para aquele tecido em relação a quantidade de peptídeo não derivatizado que é liberada para o tecido. Ainda em uma modalidade adicionalmente preferida, a quantidade de peptídeo derivatizado liberada para um tecido específico dentro de um período de tempo selecionado é melhorada por derivatização por pelo menos cerca de 20%, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 40% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 100%. Presentemente, as biomoléculas preferidas para aplicações de direcionamento incluem anticorpos, hormônios e ligandos para receptores de superfície de célula.
[00697] Em uma modalidade presentemente preferida, o grupo de modificação é uma proteína. Em uma modalidade exemplar, a proteína é um interferon. Os interferons são glicoproteínas antivirais que, em seres humanos, são secretadas por fibroblastos primários humanos após indução com vírus ou RNA de filamento duplo. Os interferons são de interesse como terapêuticos, por exemplo, antivirais e tratamento de esclerose múltipla. Para referências quanto ao interferon-β vide, por exemplo, Yu, e outros, J. Neuroimmunol., 64(1): 91-100 (1996); Schmidt, J., J. Neurosci. Res., 65(1): 59-67 (2001); Wender, e outros, Folia Neuropathol., 39 (2): 91-93 (2001); Martin, e outros, Springer Semin. Immunopathol., 18(1): 1-24 (1996); Takane e outros, J. Pharmacol. Exp. Ther., 294 (2): 746-752 (2000); Sburlati e outros, Biotechnol.Prog., 14: 189-192 (1998); Dodd, e outros, Biochimica et Biophysica Acta, 787: 183-187 (1984); Edelbaum e outros, J Interferon Res., 12: 449-453 (1992); Conradt, e outros, J. Biol. Chem., 262 (30): 14600-14605 (1987); Civas, e outros, Eur. J. Biochem., 173: 311-316(1988); Demolder, e outros, J. Biotechnol., 32: 179-189 (1994); Sedmak, e outros, J. Interferon Res., 9 (Suppl 1): S61-S65 (1989); Kagawa, e outros, J.Biol. Chem., 263 (33): 17508-17515(1988); Hershenson e outros, Número de Patente US 4.894.330; Jayaram, e outros, J. Interferon Res., 3 (2): 177-180 (1983); Menge e outros, Develop. Biol. Standard., 66: 391-401 (1987); Vonk, e outros J. Interferon Res., 3 (2): 169-175 (1983); e Adolf, e outros, J. Interferon Res., 10: 255-267 (1990). Para referências relevantes ao interferon-a, vide, Asano, e outros, Eur. J. Cancer, 27 (Suppl 4):S21-S25 (1991); Nagy e outros, Anticancer Research, 8 (3): 467-470 (1988); Dron, e outros, J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 3(1): 13-19 (1989); Habib e outros, Am. Surg, 67 (3): 257-260 (3/2001); e Sugyiama, e outros, Eur. J. Biochem., 217: 921-927 (1993).
[00698] Em um conjugado de interferon exemplar, o interferon β é conjugado a um segundo peptídeo através de um braço de ligante. O braço de ligante inclui um grupo de ligação glicosila intacto, através do qual ele é anexado ao segundo peptídeo através de um processo da invenção. O braço do ligante também inclui, opcionalmente, um segundo grupo de ligação glicosila intacto, através do qual ele é anexado ao interferon.
[00699] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê um conjugado de hormônio de estimulação de folículo (FSH). FSH é um hormônio de glicoproteína. Vide, por exemplo, Saneyoshi e outros, Biol. Reprod., 65: 1686-1690 (2001); Hakola, e outros, J. Endocrinol., 158: 441-448 (1998); Stanton e outros, Mol. Cell. Endocrinol., 125:133-141 (1996); Walton, e outros, J. Clin. Endocrinol. Metab., 86 (8): 3675-3685(08/2001); Ulloa-Aguirre, e outros, Endocrine, 11 (3): 205-215 (12/1999); Castro-Fernández, e outros, I. J. Clin. Endocrinol. Matab., 85 (12): 4603-4610 (2000); Prevost, Rebecca R., Pharmacotherapy, 18 (5): 1001-1010(1998); Linskens, e outros, The FASEB Journal, 13: 639- 645(04/1999); Butnev, e outros, Biol. Reprod., 58: 458-469 (1998); Muyan e outros, Mol. Endo., 12 (5): 766-772 (1998); Min e outros, Endo. J., 43 (5): 585-593 (1996); Boime, e outros, Recent Progress in Hormone Research, 34: 271-289 (1999); e Rafferty, e outros, J. Endo., 145: 527-533 (1995). O conjugado FSH pode ser formado em uma maneira semelhante aquela descrita para interferon.
[00700] Ainda em outra modalidade exemplar, o conjugado inclui eritropoietina (EPO). EPO é conhecido por mediar resposta para hipoxia e estimular a produção de hemácias. Para referências pertinentes, vide, Cerami e outros, Seminars in Oncology, 28 (2) (Suppl 8): 66-70 (04/2001). Um conjugado EPO exemplar é formado analogamente ao conjugado de interferon.
[00701] Em uma modalidade exemplar adicional, a invenção provê um conjugado de fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF). G-CSF é uma glicoproteína que estimular a proliferação, diferenciação e ativação de células progenitoras neutropoiéticas em neutrófilos funcionalmente maduros. G-CSF injetado é conhecido por ser rapidamente apagado do corpo. Vide, por exemplo, Nohynek e outros, Cancer Chemother. Pharmacol., 39: 259-266 (1997); Lord, e outros, Clinical Cancer Research, 7 (7): 2085-2090 (07/2001); Rotondaro, e outros, Molecular Biotechnology, 11 (2): 117-128 (1999); e Bonig e outros, Bone Marrow Transplantation, 28: 259-264 (2001). Um conjugado exemplar de G-CSF é preparado conforme discutido acima, para o conjugado dos interferons. Um versado na técnica apreciará que muitas outras proteínas podem ser conjugadas ao interferon usando os processos e composições da invenção incluindo, porém, não limitado, aos peptídeos listados na Tabela 6 (apresentada em qualquer lugar aqui) e a figura 1, e nas figuras 27-51, onde os esquemas de modificação individuais são apresentados.
[00702] Ainda em uma modalidade exemplar, é provido um conjugado com biotina. Assim, por exemplo, um peptídeo seletivamente bionitilado é elaborado por anexação de uma porção avidina ou estreptavidina portando um ou mais grupos de modificação.
[00703] Em uma modalidade adicionalmente preferida, a biomolécula é selecionada para direcionar o peptídeo modificado pelos processos da invenção para um compartimento intracelular específico, pelo que, melhorando a liberação do peptídeo para aquele compartimento intracelular em relação a quantidade de peptídeo não derivatizado que é liberada para o tecido. Ainda em uma modalidade adicionalmente preferida, a quantidade de peptídeo derivatizado liberado para um compartimento intracelular específico em um período de tempo selecionado é melhorada por derivatização por pelo menos cerca de 20%, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 40% e, mais preferivelmente ainda, pelo menos cerca de 100%. Em outra modalidade especificamente preferida, a biomolécula é ligada ao peptídeo por um ligante clivável que pode hidrolizar uma vez internalizado. Presentemente, biomoléculas preferidas para aplicações de direcionamento intracelular incluem transferrina, lactotransferrina (lactoferrina), melanotransferrina (p97), ceruloplasmina e transportador de cátion divalente. Ligações contempladas incluem, porém não estão ligadas a proteína-açúcar-ligante- açúcar-proteína, proteína-açúcar-ligante-proteína e formas multivalentes das mesmas e proteína-açúcar-ligante- medicamento, onde o medicamento inclui moléculas pequenas, peptídeos, lipídeos, entre outros.
[00704] Liberação específica para sítio ou orientada para o alvo dos agentes terapêuticos é desejável para fins de tratar uma ampla variedade de doenças humanas, tais como, tipos diferentes de malignidades e determinados distúrbios neurológicos. Tais procedimentos são acompanhados por alguns efeitos colaterais e uma eficácia maior do medicamento. Vários princípios contaram com a designação destes sistemas de liberação. Para uma revisão vide, Garnett, Advanced Drug Delivery Reviews 51:171-216 (2001).
[00705] Uma consideração é importante na designação de um sistema de liberação de medicação para tecidos alvo especificamente. A descoberta dos antígenos de superfície de tumor tornou possível desenvolver abordagens terapêuticas onde células de tumor mostrando antígenos de superfície definíveis são especificamente direcionadas e mortas. Existem três classes principais de anticorpos monoclonais terapêuticos (MAb) que demonstraram eficácia nas experiências clínicas humanas no tratamento de malignidades: (1) MAb não conjugado, que tanto induz diretamente a inibição de crescimento e/ou apoptose, ou ativa indiretamente os mecanismos de defesa do hospedeiro para mediar citotoxicidade antitumor; (2) MAb conjugado ao medicamento, que preferivelmente libera uma toxina citotóxica potente para as células de tumor e desta forma minimiza a citotoxicidade sistêmica, geralmente associada a quimioterapia convencional; e (3) MAb conjugado a radioisótopo, que libera uma dose de esterilização de radiação ao tumor. Vide, revisão por Reff e outros, Cancer Control 9:152-166 (2002).
[00706] De modo a montar MAbs com a potência para exterminar células malignas, os MAbs podem ser conectados a uma toxina, que pode ser obtida de uma planta, bactéria ou fonte de fungos, para formar proteínas quiméricas denominadas imunotoxinas. Toxinas de plantas freqüentemente usadas são divididas em duas classes: (1) holotoxinas (ou proteínas de inativação de ribossoma classe II), tais como, ricina, abrina, erva-de-passarinho, lectina e modecina e (2) hemitoxinas (proteínas de inativação de ribossoma classe I), tais como, proteína antiviral de erva-dos- cancros (PAP), saporina, Briodina 1, bouganina e gelonina. Toxinas bacterianas geralmente usadas incluem toxina de difteria (DT) e exotoxina de Pseudomonas (PE). Kreitman, Current Pharmaceutical Biotechnology 2:313-325 (2001).
[00707] Imunotoxinas convencionais contêm um MAb quimicamente conjugado a uma toxina que é mutada ou quimicamente modificada para ligação minimizada para células normais. Exemplos incluem ricina anti-B4-bloqueada, direcionamento de CD5; e cadeia A de ricina RFB4- desglicosilada, direcionamento de CD22. As imunotoxinas recombinantes desenvolvidas mais recentemente são proteínas quiméricas consistindo na região variável de um anticorpo direcionada contra um antígeno de tumor fundido a uma toxina de proteína usando tecnologia de DNA recombinante. A toxina é também freqüente e geneticamente modificada para remover sítios de ligação de tecido normais, porém retém sua citotoxicidade. Um grande número de antígenos de diferenciação, receptores super expressos ou antígenos específicos para câncer foram identificados como alvos para imunotoxinas, por exemplo, CD19, CD22, CD20, receptor IL-2 (CD25), CD33, receptor de IL-4, receptor de EGF e seus mutantes, ErB2, carboidrato de Lewis, mesotelina, receptor de transferrina, receptor de GM-CSF, Ras, Bcr-Ab1 e kit-c para o tratamento de várias malignidades incluindo canceres hematopoiéticos, glioma, e de mama, colo, ovários, bexiga e canceres gastrointestinais. Vide, por exemplo, Brinkmann e outros, Expert Opin. Biol. Ther. 1:693-702 (2001); Perentesis e Sievers, Hematology/Oncology Clinics of North America 15:677-701 (2001).
[00708] MAbs conjugados com radioisótopo são suados como outros meios de tratar malignidades humanas, especificamente malignidades hematopoiéticas, com um nível superior de especificidade e eficácia. Os isótopos usados mais comumente para terapia são emissores de energia superior, tais como, 131I e 90Y. Recentemente, MAb humanizado 213-bi-rotulado anti-CD33 também foi testado nas experiências clínicas de fase I humanas. Reff e outros, supra.
[00709] Vários MAbs foram usados para fins terapêuticos. Por exemplo, o uso de rituximab (Rituxan™), um recombinante quimérico anti-CD20 MAb, para tratamento de determinadas malignidades hematopoiéticas foi aprovado pelo FDA em 1997. Outros MAbs que foram até agora aprovados para usos terapêuticos no tratamento de canceres humanos incluem: alemtuzumab (Campath-1H™), um anticorpo de rato humanizado contra CD52 e ozogamicina gemtuzumab (Mylotarg™), um anti-CD33 MAb de camundongo humanizado conjugado com caliqueamicina. O FDA também examina atualmente a segurança e eficácia de vários outros MAbs com a finidade de liberação específica ao sítio de agentes citotóxicos ou de radiação, por exemplo, Zevalin™ radiorotulado e Bexxar™, Reff e outros, supra.
[00710] Uma segunda consideração importante na designação de um sistema de liberação de medicamento é a capacidade de acesso de um tecido alvo a um agente terapêutico. Esta é uma questão específica relacionada ao caso de tratamento de uma doença do sistema nervoso central (CNS), onde a barreira de cérebro-sangue impede a difusão das macromoléculas. Várias abordagens foram desenvolvidas para desviar a barreira de cérebro-sangue para liberação eficaz dos agentes terapêuticos para o CNS.
[00711] entendimento do mecanismo de transporte de ferro do plasma para o cérebro provê uma ferramenta útil no desvio da barreira de cérebro-sangue (BBB). Ferro, transportado no plasma por transferrina, é um componente essencial virtualmente de todos os tipos de células. O cérebro precisa de ferro para os processos metabólicos e recebe ferro dos receptores de transferrina localizados nas células endoteliais capilares do cérebro através de transcitose e endocitose mediada por receptor. Moos e Morgan, Cellular and Molecular Neurobiology 20: 77-95 (2000). Os sistemas de liberação a base de interação de receptor de transferrina-transferrina foram estabelecidos para a liberação eficaz dos peptídeos, proteínas e lipossomas no cérebro. Por exemplo, os peptídeos podem ser acoplados a um MAb direcionado contra o receptor de transferrina para obter maior absorção pelo cérebro, Moos e Morgan, Supra. De modo semelhante, quando acoplados ao MAb dirigido contra receptor de transferrina, o transporte do fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) através da barreira de cérebro-sangue é melhorado. Song e outros, The Journal of Pharmacology and Experimental Therepeutics 301:605-610 (200); Wu e outros, Journal of Drug Targeting 10:239-245 (2002). Além disto, um sistema de liberação lipossômica para transporte eficaz do medicamento de quimioterapia, doxorubicina, no glioma C6 foi reportado, onde a transferrina foi anexada às extremidades distais das cadeias PEG lipossômicas. Eavarone e outros, J. Biomed. Mater. Res. 51:10-14 (2000). Várias patentes US também se referem aos processos de liberação que desviam a barreira de cérebro-sangue com base na interação de receptor de transferrina-transferrina. Vide, por exemplo, as Patentes US números 5.154.924; 5.182.107; 5.527.527; 5.833.988; 6.015.555.
[00712] Existem outros parceiros de conjugação apropriados para que um agente farmacêutico desvie da barreira de cérebro-sangue. Por exemplo, as Patentes US números 5.672.683, 5.977.307 e WO 95/02421 se referem a um processo para liberação de um agente neurofarmacêutico através da barreira de cérebro-sangue, onde o agente é administrado na forma de uma proteína de fusão com um ligando que é reativo com um receptor de célula endotelial capilar cerebral; WO 99/00150 descreve um sistema de liberação de medicamento onde o transporte de um medicamento através da barreira de cérebro-sangue é facilitado por conjugação com um MAb direcionado contra receptor de insulina humano; WO 89/10134 descreve um peptídeo quimérico, que inclui um peptídeo capaz de atravessar a barreira de cérebro-sangue em uma razão relativamente alta e um neuropeptídeo hidrófilo incapaz de transcitose, como um meio de introdução de neuropeptídeos hidrófilos no cérebro; WO 01/60411 A1 provê uma composição farmacêutica que pode transportar facilmente um ingrediente farmaceuticamente ativo para o cérebro. O ingrediente ativo é ligado a uma proteína específica para hibernação que é usada como um conjugado e administrada com um hormônio de tiróide ou uma substância que promova a produção de hormônio de tiróide. Além disto, uma rota alternativa de liberação de medicamento para desvio da barreira de cérebro-sangue foi explorada. Por exemplo, a liberação intranasal dos agentes terapêuticos sem a necessidade de conjugação mostrou ser um processo de liberação alternativo promissor (Frey, 2002, Drug Delivery Technology, 2 (5): 46 49).
[00713] Além de facilitar o transporte dos medicamentos através de uma barreira de cérebro-sangue, a interação do receptor de transferrina-transferrina é também útil para direcionamento específico de determinadas células de tumor como muitas células de tumor expressam excessivamente receptor de transferrina sobre sua superfície. Esta estratégia foi usada para liberar macromoléculas bioativas em células K562 através de um conjugado de transferrina (Wellhoner e outros, The Journal of Biological Chemistry 266: 4309-4314 (1991)), e para liberação de insulina para as células Caco-2 semelhantes a enterócito, através de um conjugado de transferrina (Shah e Shen, Journal of Pharmaceutical Sciences 85: 1306-1311 (1996)).
[00714] Adicionalmente, quanto mais se torna conhecido a respeito das funções das várias proteínas de transporte de ferro, tais como, receptor de lactotransferrina, melanotransferrina, ceruloplasmina e Transportador de Cátion Divalente e seu padrão de expressão, algumas das proteínas envolvidas no mecanismo de transporte de ferro (por exemplo, melanotransferrina) ou seus fragmentos, foi verificado serem similarmente eficazes no auxílio do transporte de agentes terapêuticos através da barreira de cérebro-sangue ou direcionamento de tecidos específicos (WO 02/13843 A2, WO 02/13873 A2). Para uma revisão no uso de transferrina e proteínas correlatas envolvidas na absorção de ferro como conjugados na liberação de medicamento, vide Li e Qian, Medical Research Reviews 22: 225-250 (2002).
[00715] O conceito de liberação específica de tecido dos agentes terapêuticos vai além da interação entre transferrina e receptor de transferrina ou suas proteínas correlatas. Por exemplo, um sistema de liberação específico para os ossos foi descrito, no qual as proteínas são conjugadas com um aminobisfosfato de busca óssea para liberação aperfeiçoada de proteínas para o tecido mineralizado. Uludag e Yang, Biotechnol. Prog 18: 604-611 (2002). Para uma revisão neste tópico, vide, Vyas e outros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System 18: 1 76(2001). Uma variedade de ligantes pode ser usada no processo de geração de bioconjugados para o fim de liberação específica de agentes terapêuticos. Ligantes apropriados incluem reagentes de reticulação homo e heterobifuncionais, que podem ser cliváveis por, por exemplo, dissociação catalisada com ácido ou não clivável (vide, por exemplo, Srinivasachar e Neville, Biochemistry 28: 2501-2509 (1989); Wellhoner e outros, The Journal of Biological Chemistry 266: 4309-4314 (1991)). A interação entre muitos componentes de ligação conhecidos, tais como, biotina e avidina/estreptavidina, pode também ser usada como um meio de ligar um agente terapêutico e um componente de conjugado que garante a liberação específica e eficaz do agente terapêutico. Usando os processos da invenção, as proteínas podem ser usadas para liberar as moléculas para compartimentos intracelulares como conjugados. Proteínas, peptídeos, hormônios, citocinas, moléculas pequenas ou semelhantes que ligam-se aos receptores de superfície de célula específicos que são internalizados após ligação do ligando podem ser usados para direcionamento intracelular de compostos terapêuticos conjugados. Tipicamente, o complexo de receptor-ligando é internalizado em veículos intracelulares que são liberados para os compartimentos de célula específicos, incluindo, porém, não limitado aos núcleos, mitocôndrios, golgi, ER, lisossoma e endosoma, dependendo da localização intracelular direcionada pelo receptor. Conjugando-se o ligando de receptor com a molécula desejada, o medicamento será transportado com o complexo de ligando-receptor e pode ser liberado para os compartimentos intracelulares, normalmente direcionados pelo receptor. O medicamento, portanto, pode ser liberado para uma localização intracelular específica na célula, onde ele é necessário para tratar a doença.
[00716] Muitas proteínas podem se usadas para direcionar os agentes terapêuticos para tecidos específicos e órgãos. As proteínas de direcionamento incluem, porém não são limitadas aos fatores de crescimento (EPO, HGH, EGF, fator de desenvolvimento do nervo, FGF, entre outros), citocinas (GM-CSF, G-CSF, a família do interferon, interleuquinas, entre outros), hormônios (FSH, LH, as famílias de esteróides, estrogênio, corticosteróides, insulina, entre outros), proteínas de soro (albumina, lipoproteínas, fetoproteína, proteínas de soro humano, antibióticos e fragmentos de antibióticos, entre outros) e vitaminas (folato, vitamina C, vitamina A, entre outros). Os agentes de direcionamento são disponíveis, os quais são específicos para receptores na maioria dos tipos de células.
[00717] Configurações de ligação contempladas incluem, porém não estão limitadas a proteína-açúcar-ligante-açúcar- proteína e formas multivalentes dos mesmos, proteína- açúcar-ligante-proteína e formas multivalentes dos mesmos, agente de proteína-açúcar-ligante-terapêutico, onde o agente terapêutico inclui, porém não está limitado a moléculas pequenas, peptídeos e lipídeos. Em algumas modalidades, um ligante hidrolisável é usado o qual pode ser hidrolisado uma ver internalizado. Um ligante instável de ácido pode ser usado com vantagem, onde o conjugado de proteína é interligado nos endossomas ou lipossomas que possuem um pH ácido. Uma vez internalizado no endossoma ou lisossoma, o ligante é hidrolizado e o agente terapêutico é liberado do agente de direcionamento.
[00718] Em uma modalidade exemplar, a transferrina é conjugada através de um ligante para uma enzima desejada para ser direcionada para uma célula que apresenta receptores de transferrina em um paciente. O paciente poderia, por exemplo, requerer terapia de substituição da enzima para aquela enzima específica. Especificamente nas modalidades preferidas, a enzima é uma que falta em um paciente com uma doença de armazenamento lisossômico (vide tabela 4). Uma vez na circulação, o conjugado de enzima de transferrina liga-se aos receptores de transferrina e é internalizada em endossomas precoces (Xing e outros, 1998, Biochem. J. 336: 667; Li e outros, 2002, Trends in Pharmcol. Sci. 23:206; Suhaila e outros, 1998, J. Biol. Chem. 273: 14355). Outros agentes de direcionamento contemplados que estão relacionados a transferrina incluem, porém não estão limitados a, lactotransferrina (lactoferrina), melanotransferrina (p97), ceruloplasmina e transportador de cátion divalente.
[00719] Em outra modalidade exemplar, os conjugados de transferrina-distrofina teriam endossomas por passagem de transferrina. Uma vez lá, a distrofina é liberada devido a um ligante hidrolizável que pode então ser tomado no compartimento intracelular onde ele é necessário. Esta modalidade pode ser usada para tratar um paciente com distrofia muscular por suplementação de um gene de distrofina geneticamente defeituoso e/ou proteína com o peptídeo de distrofina funcional conectado a transferrina.
E - Porções Terapêuticas
[00720] Em outra modalidade preferida, o açúcar modificado inclui uma porção terapêutica. Os versados na técnica apreciarão que existe uma sobreposição entre a categoria das porções terapêuticas e as biomoléculas; muitas biomoléculas possuem propriedades terapêuticas ou potenciais.
[00721] As porções terapêuticas podem ser agentes já aceitos para uso clínico ou elas podem ser medicamentos cujo uso é experimental, ou cuja atividade ou mecanismo de ação esteja sob investigação. As porções terapêuticas podem ter uma ação provada em um dado estado de doença ou pode-se apenas hipotetizar que elas mostrem uma ação desejável em um dado estado de doença. Em uma modalidade preferida, as porções terapêuticas são compostos, que estão sendo classificados quanto a sua capacidade de interagir com um tecido de escolha. As porções terapêuticas, que são úteis na prática da presente invenção incluem medicamentos de uma ampla faixa de classes de medicamento possuindo várias atividades farmacológicas. Em algumas modalidades, é preferido usar porções terapêuticas que não são açúcares. Uma exceção a esta preferência é o uso de um açúcar que é modificado por anexação covalente de outra entidade, tal como, PEG, biomolécula, porção terapêutica, porção de diagnóstico e semelhante. Em outra modalidade exemplar, uma porção de açúcar terapêutico é conjugada a um braço de ligante e o cassete de braço de ligante-açúcar é subseqüentemente conjugado a um peptídeo através de um processo da invenção.
[00722] Os processos de conjugação de agentes terapêuticos e de diagnóstico para várias outras espécies são bem conhecidos dos versados na técnica. Vide, por exemplo, Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; e Dunn e outros, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991.
[00723] Em uma modalidade específica, a porção terapêutica é anexada ao açúcar modificado através de uma ligação que é clivada sob condições selecionadas. Condições exemplares incluem, porém não estão limitadas a um pH selecionado (por exemplo, estômago, intestino, vacúolo endocitótico), a presença de enzima ativa (por exemplo, esterase, protease, reductase, oxidase), luz, aquecimento e outros. Muitos grupos cliváveis são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Jung e outros, Biochem. Biophys. Acta, 761: 152-162 (1983); Joshi e outros, J. Biol. Chem., 265: 14518-14525 (1990); Zarling e outros, J. Immunol., 124: 913-920 (1980); Bouizar e outros, Eur. J. Biochem., 155: 141-147(1986); Park e outros, J. Biol.Chem., 261: 205-210 (1986); Browning e outros, J. Immunol., 143: 1859-1867 (1989).
[00724] Classes de porções terapêuticas úteis incluem, por exemplo, medicamentos antiinflamatórios não esteroidais (NSAIDS). Os NSAIDs podem ser, por exemplo, selecionados das categorias que se seguem: (por exemplo, derivados de ácido propiônico, derivados de ácido acético, derivados de ácido fenâmico, derivados de ácido bifenilcarboxílico e oxicamas); medicamentos antiinflamatórios esteroidais incluindo hidrocortisona e semelhantes; coadjuvantes, medicamentos antihistamínicos (por exemplo, clorfeniramina, triprolidina); agentes antitosse (por exemplo, dextrometorfano, codeina, caramifeno e carbetapentano); medicamentos antipruríticos (por exemplo, metdilazina e trimeprazina); medicamentos anticolinérgicos (por exemplo, escopolamina, atropina, homatropina, levodopa); medicamentos antieméticos e antinauseantes (por exemplo, ciclizina, meclizina, clorpromazina, buclizina); medicamentos anoréxicos (por exemplo, benfetamina, fentermina, clorfentermina, fenfluramina); medicamentos estimuladores centrais (por exemplo, anfetamina, metaanfetamina, dextroanfetamina e metilfenidato); medicamentos antiarrítmicos (por exemplo, propanolol, procainamida, disopiramida, quinidina, encainida); medicamentos bloqueadores P-adrenérgicos (por exemplo, metoprolol, acebutlol, betaxolol, labetalol e timolol); medicamentos cardiotônicos (por exemplo, milrinona, amrinona e dobutamina); medicamentos anti-hipertensivos (por exemplo, enalapril, clonidina, hidralazina, minoxidila, guanadrel, guanetidina); medicamentos diuréticos (por exemplo, amilorido e hidroclorotiazido); medicamentos vasodilatadores (por exemplo, diltiazem, amiodarona, isoxsuprina, nilidrina, tolazina e verapamil); medicamentos vasoconstritores (por exemplo, diidroergotamina, ergotamina e metilsergido); medicamentos antiulcera (por exemplo, ranitidina e cimetidina); medicamentos anestésicos (por exemplo, lidocaina, bupivacaina, cloroprocaina, dibucaina); medicamentos antidepressivos (por exemplo, imipramina, desipramina, amitriptilina, nortriptilina); medicamentos sedativos e tranqüilizantes (por exemplo, clordiazepóxido, benacitizia, benzqinamida, flurazepam, hidroxizina, loxapina e promazina); medicamentos antipsicóticos (por exemplo, clorprotixeno, flurfenazina, haloperidol, molindona, tioridazina e triflúorperazina); medicamentos antimicrobianos (medicamentos antibactericidas, antifungos, antiprotozoários e antivirais).
[00725] Classes de porções terapêuticas úteis incluem coadjuvantes. Os coadjuvantes podem se selecionados, por exemplo, de conjugados de linfeto hemocianina, lipídeo de monofosforila A, lipopeptídeo derivado de micoplasma MALP- 2, subunidade B de toxina do cólera, toxina instável de Escherichia coli, epítopo auxiliador T universal de toxóide de tétano, interleiquim-12, oligodeoxinucleotídeos CpG, brometo de dimetildioctadecilamônio, ciclodextrina, esqualeno, sais de alumínio, veículo de membrana externa meningocócica (OMV), montanido ISA, TiterMax™ (disponível na Sigma, St. Louis, MO), absorção de nitrocelulose, complexos de estimulação imune tais como Quil A, coadjuvante Gerbu™ (Gerbu Biotechnik, Kirchwald, Alemanha), dipeptídeo de muramila treonila, alfa timosina, bupivacaina, GM-CSF, Coadjuvante de Freund Incompleto, MTP- PE/MF59 (Ciba/Geigy, Basel, Suíça), polifosfazeno, derivado de saponina de casca da árvore Quillaja saponaria e formulação de coadjuvante Syntex (Biocine, Emeryville, CA), entre outros, são bem conhecidos na técnica.
[00726] Medicamentos antimicrobianos que são preferidos para incorporação na presente composição incluem, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis de medicamentos β-lactama, medicamentos de quinolona, ciprofloxacina, norfloxacina, tetraciclina, eritromicina, amicacina, triclosano, doxiciclina, capreomicina, clorexidina, clortetraciclina, oxitetraciclina, clindamicina, etanbutol, isotionato de hexamidina, metronidazol, pentamidina, gentamicina, canamicina, lineomicina, metaciclina, metenamina, minociclina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina, tobramicina, miconazol e amantadina.
[00727] Outras porções de medicamento para uso na prática da presente invenção incluem medicamentos antineoplásticos (por exemplo, antiandrógenos (por exemplo, leuprolido ou flutamida), agentes citocidais (por exemplo, adriamicina, doxorubicina, taxol, ciclofosfamida, busulfano, cisplatina, β-2-interferon) anti-estrogênios (por exemplo, tamoxifeno), antimetabólitos (por exemplo, flúoracil, metotrexato, mercaptopurina, tioguanina). Também estão incluídos nesta classe os agentes a base de radioisótopo para ambos diagnóstico e terapia e toxinas conjugadas, tais como, ricina, geldanamicina, mitansina, CC-1065, C-1027, as duocarmicinas, caliqueamicina e estruturas correlatas e análogos das mesmas.
[00728] A porção terapêutica pode também ser um hormônio (por exemplo, medroxiprogesterona, estradiol, leuprolido, megestrol, octreotídeo ou somatostatina); medicamentos relaxantes musculares (por exemplo, cinamedrina, ciclobenzaprina, flavoxato, orfenadrina, papaverina, mebeverina, idaverina, ritodrina, difenoxilato, dantroleno e azumoleno); medicamentos antiespasmódicos; medicamentos ativos no osso (por exemplo, difosfonato e compostos de medicamento fosfonoalquilfosfinato); medicamentos moduladores endócrinos (por exemplo, contraceptivos (por exemplo, etinodiol, estradiol etinila, noretindrona, mestranol, desogestrel, medroxiprogesterona), moduladores de diabetes (por exemplo, gliburido ou clorpropamida), anabólicos, tais como, testolactona ou estanozolo, andrógenos (por exemplo, metiltestosterona, testosterona ou fluoximesterona), antidiuréticos (por exemplo, desmopressina) e calcitoninas).
[00729] Também são usados na presente invenção os estrogênios (por exemplo, dietilestilbesterol), glicocorticóides (por exemplo, triamcinoleno, betametanose, etc.) e progesteronas, tais como, noretindrona, etinodiol, noretrindona, levonorgestrel; agentes de tiróide (por exemplo, liotironina ou levotiroxina) ou agentes anti- tiróide (por exemplo, metimazol); medicamentos antihiperprolactinemicos (por exemplo, cabergolina); supressores de hormônio (por exemplo, danazol ou goserelina), oxitócicos (por exemplo, metilergonovina ou oxitocina) e prostaglandinas, tais como, mioprostol, alprostadila ou dinoprostona, podem ser empregados.
[00730] Outros grupos de modificação úteis incluem medicamentos imunomoduladores (por exemplo, anti- histaminas, estabilizadores de células mastóides, tais como, lodoxamida e/ou cromolina, esteróides (por exemplo, triamcinolona, beclometazona, cortisona, dexametasona, prednisolona, metilprednisolona, beclometasona ou clobetasol), antagonistas H2 de histamina (por exemplo, famotidina, cimetidina, ranitidina), imunosupressores (por exemplo, azatioprina, ciclosporina), etc. Grupos com atividade antiinflamatória, tais como, sulindac, etodolac, cetoprofeno e cetorolac são também de uso. Outros medicamentos de uso em conjunto com a presente invenção serão aparentes aos versados na técnica.
F - Preparação de Açúcares Modificados
[00731] Açúcares modificadores úteis na formação de conjugados da invenção são discutidos aqui. A discussão foca-se na preparação de um açúcar modificado com um polímero solúvel em água para clareza de ilustração. Especificamente, a discussão foca-se na preparação de açúcares modificados que incluem uma porção poli(etileno glicol). Os versados na técnica apreciarão que os processos estabelecidos aqui são amplamente aplicáveis para a preparação de açúcares modificados, portanto, a discussão não seria interpretada como limitando o escopo da invenção.
[00732] Em geral, a porção de açúcar e o grupo de modificação são ligados em conjunto através do uso de grupos de reação, que são tipicamente transformados pelo processo de ligação em um novo grupo funcional orgânico ou espécies não reativas. O(s) grupo(s) funcionais reativos ao açúcar está(ão) localizados em qualquer posição na porção de açúcar. Os grupos reativos e classes de reação úteis na prática da presente invenção são geralmente aqueles que são bem conhecidos na técnica da química de bioconjugado. Classes atualmente favorecidas de reações disponíveis com porções de açúcar reativo são aquelas, que processam-se sob condições relativamente brandas. Estes incluem, porém não são limitados às substituições nucleófilas (por exemplo, reações de aminasa e álcoois com haletos de acila, ésteres ativos), substituições eletrófilas (por exemplo, reações e enamina) e adições as ligações múltiplas de carbono-carbono e carbono-heteroátomo (por exemplo, reação de Michael, adição de Diels-Alder). Estas e outras reações úteis são discutidas aqui, por exemplo, em Smith e March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 5th Ed., John Wiley & Sons, New York, 2001; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; e Feeney e outros, MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D. C., 1982.
[00733] Grupos funcionais reativos úteis pendentes de um núcleo de açúcar ou grupo de modificação incluem, porém não estão limitados a: (a) grupos carboxila e vários derivados dos mesmos incluindo, porém, não limitados aos ésteres de N- hidróxisuccinimida, ésteres de N-hidróxibenzotriazol, haletos de ácido, imidazóis de acila, tioésteres, ésteres de p-nitrofenila, alquila, alquenila, alquinila e ésteres aromáticos; (b) grupos hidroxila, que podem ser convertidos, por exemplo, em ésteres, éteres, aldeídos, etc.; (c) grupos haloalquila, onde o haleto pode ser o último deslocado com um grupo nucleófilo, tais como, por exemplo, uma amina, um ânion carboxilato, ânion tiol, carbânion, ou um íon alcóxido, desta forma resultando na anexação covalente de um novo grupo no grupo funcional do átomo de halogênio; (d) grupos dienófilos, que são capazes de participar nas reações Diels-Alder, tais como, por exemplo, grupos maleimido; (e) grupos aldeído ou cetona, tais que, a derivatização subsequente é possível através da formação de derivados carbonila, tais como, por exemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas ou oximas ou através de mecanismos, tais como, adição de Grignard ou adição de alquilítio; (f) grupos de haleto sulfonila para reação subsequente com aminas, por exemplo, para formar sulfonamidas; (g) grupos tiol que podem ser, por exemplo, convertidos em dissulfetos ou reagidos com alquila e haletos de acila; (h) grupos amina ou sulfidrila, que podem ser, por exemplo, acilados, alquilados ou oxidados; (i) alcenos, que podem sofrer, por exemplo, cicloadições, acilação, adição de Michael, etc.; e (j) epóxidos, que podem reagir, por exemplo, com aminas e compostos hidroxila.
[00734] Os grupos funcionais reativos podem ser escolhidos, tal que, eles não participam ou interferem com as reações necessárias para montar o núcleo de açúcar reativo ou grupo de modificação. Alternativamente, um grupo funcional reativo pode ser protegido de participar na reação por presença de um grupo de proteção. Os versados na técnica entenderão como proteger um grupo funcional específico, tal que ele não interfira com um conjunto escolhido de condições de reação. Por exemplo, os grupos de proteção úteis, vide, por exemplo, Greene e outros, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991.
[00735] Na discussão que se segue, vários exemplos específicos de açúcares modificados que são úteis na prática da presente invenção são estabelecidos. Nas modalidades exemplares, um derivado de ácido siálico é utilizado como o núcleo de açúcar ao qual o grupo de modificação é anexado. O foco da discussão nos derivados de ácido siálico é apenas para clareza de ilustração, e não limita o escopo da invenção. Os versados na técnica apreciarão que uma variedade de outras porções de açúcar pode ser ativadas e derivatizadas em uma maneira análoga aquela estabelecida usando ácido siálico, como exemplo. Por exemplo, vários processos são disponíveis para modificação de galactose, glicose, N-acetilgalactosamina e fucose para denominar alguns substratos de açúcar, que são prontamente modificados por processos reconhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Elhalabi e outros, Curr. Med. Chem. 6:93 (1999) e Schefer e outros, J. Org. Chem. 65:24 (2000).
[00736] Em uma modalidade exemplar, o peptídeo que é modificado por um processo da invenção é um peptídeo que é produzido nas células de mamíferos (por exemplo, células CHO) ou em um animal transgênico e assim, contém cadeias oligossacarídeo ligadas em N e/ou O, que são sialiladas incompletamente. As cadeias de oligossacarídeo do glicopeptídeo que não possuem um ácido siálico e contendo um resíduo de galactose terminal podem ser PEGiladas, PPGiladas ou de outra forma modificadas com um ácido siálico modificado.
[00737] No Esquema 4, o glicosídeo 1 de manosamina é tratado com o éster ativo de um derivado de aminoácido protegido (por exemplo, glicina), convertendo o resíduo de amina açúcar no aduto de amida de aminoácido protegido correspondente. O aduto é tratado com uma aldolase para formar o ácido siálico 2. O composto 2 é convertido no derivado CMP correspondente por ação de sintetase CMP-SA, seguido por hidrogenação catalítica do derivado de CMP para produzir o composto 3. A amina introduzida através da formação do aduto de glicina é utilizada como um local de anexação PEG ou PPG por reação do composto 3 com o derivado PEG ou PPG ativado (por exemplo, PEG-C(O)NHS, PPG-C(O)NHS0, produzindo 4 ou 5, respectivamente. Esquema 4
Figure img0054
[00738] A tabela 2 estabelece exemplos representativos de monofosfatos de açúcar que são derivatizados de uma porção PEG ou PPG. Determinados dos compostos da Tabela 2 são preparados pelo processo do Esquema 1. Outros derivados são preparados por processos reconhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Keppler e outros, Glycobiology 11: 11R (2001) e Charter e outros, Glycobiology 10: 1049 (2000)). Outros análogos PEG e PPG reativos de amina são comercialmente disponíveis ou eles podem ser preparados por processos prontamente acessíveis aos versados na técnica. Tabela 2: Exemplos de monofosfatos de açúcar que são derivatizados com uma porção PEG ou PPG
Figure img0055
[00739] Os fosfatos de açúcar modificados de uso na prática da presente invenção podem ser substituídos em outras posições, bem como aqueles estabelecidos acima. Substituições presentemente preferidas de ácido siálico são estabelecidas na Fórmula 5. Fórmula 5:
Figure img0056
onde X é um grupo de ligação, que é preferivelmente selecionado de -O-, -N(H)-, -S-, CH2- e N(R)2, onde cada R é um elemento independentemente selecionado de R1-R5. Os símbolos, Y, Z, A e B representam cada um, um grupo que é selecionado do grupo estabelecido acima para a identidade de X. X, Y, Z, A e B são cada um independentemente selecionados e, portanto eles podem ser os mesmos ou diferentes. Os símbolos, R1, R2, R3, R4 e R5 representam H, polímeros, um polímero solúvel em água, porção terapêutica, biomolécula ou outra porção. O símbolo R6 representa H, OH ou um polímero. Alternativamente, estes símbolos representam um ligante que é ligado a um polímero, polímero solúvel em água, porção terapêutica, biomolécula ou outra porção.
[00740] Em outra modalidade exemplar, uma manosamina é simultaneamente acilada e ativada para uma substituição nucleófila por uso de um anidrido cloroacético conforme estabelecido no Esquema 5. Esquema 5
Figure img0057
[00741] O glicano derivatizado com cloro resultante é contatado com piruvato em presença de uma aldolase, formando um ácido siálico derivatizado com cloro. O açúcar de nucleotídeo correspondente é preparado por contato do derivado de ácido siálico com trifosfatos de nucleotídeo apropriados e uma sintetase. O grupo cloro na porção de ácido siálico é então deslocado com um derivado PEG nucleófilo, tal como, tio-PEG.
[00742] Em uma modalidade exemplar adicional, conforme mostrado no Esquema 6, uma manosamina é acilada com um dicarboxilato bis-HOPT, produzindo o ácido amido-alquila- carboxílico correspondente, que é subseqüentemente convertido no derivado de ácido siálico. O derivado de ácido siálico é convertido em um açúcar de nucleotídeo e o ácido carboxílico é ativado e reagido com um derivado PEG nucleófilo, tal como, amino-PEG. Esquema 6
Figure img0058
[00743] Em outra modalidade exemplar, estabelecida no Esquema 7, ácido neuramínico protegido por amina e carboxila é ativado convertendo o grupo hidroxila primário no éster p-toluenossulfonato correspondente e o éster metila é clivado. O ácido neuramínico ativado é convertido no açúcar de nucleotídeo correspondente e o grupo de ativação é deslocado por uma espécie PEG de nucleófilo, tal como, tio-PEG. Esquema 7
Figure img0059
[00744] Ainda em uma outra modalidade adicionalmente exemplar, conforme estabelecido no Esquema 8, a porção hidroxila primária de um derivado de ácido neuramínico protegido por amina e carboxila é alquilado usando um PEG eletrófilo, tal como, cloro-PEG. O éster metila é subseqüentemente clivado e o açúcar-PEG é convertido em um açúcar de nucleotídeo. Esquema 8
Figure img0060
[00745] Glicanos que não ácido siálico podem se derivatizados com PEG usando os processos estabelecidos aqui. Os glicanos derivatizados, propriamente, também estão dentro do escopo da invenção. Assim, o esquema 9 provê uma rota sintética exemplar para um açúcar de nucleotídeo de galactose PEGilado. O grupo hidroxila primário da galactose é ativado como o éster toluenossulfonato correspondente, que é subseqüentemente convertido em um açúcar de nucleotídeo. Esquema 9
Figure img0061
[00746] O Esquema 10 estabelece uma rota exemplar para preparação de derivado de galactose-PEG que baseia-se em uma porção de galactose-6-amina. Assim, a galactosamina é convertida em um açúcar de nucleotídeo e a porção amina de galactosamina é funcionalizada com um derivado de PEG. Esquema 10
Figure img0062
[00747] O Esquema 11 fornece outra rota exemplar para os derivados de galactose. O ponto de partida para o Esquema 11 é a galactose-2-amina, que é convertida em açúcar de nucleotídeo. A porção amina do açúcar de nucleotídeo é o local para anexação de um derivado PEG, tal como, ácido metóxi-PEG(mPEG) carboxílico. Esquema 11
Figure img0063
[00748] Porções exemplares anexadas aos conjugados revelados aqui incluem, porém não estão limitadas aos derivados PEG (por exemplo, acil-PEG, acil-alquil-PEG, alquil-acil-PEG carbamoil-PEG, aril-PEG, alquil-PEG), derivados de PPG (por exemplo, acil-PPG, acil-alquil-PPG, alquil-acil-PPG carbamoil-PPG, aril-PPG), ácido poliaspártico, poliglutamato, polilisina, porções terapêuticas, porções de diagnóstico, manose-6-fosfato, heparina, heparan, SLex, manose, manose-6-fosfato, Sialil Lewis X, FGF, VFGF, proteínas (por exemplo, transferrina), condroitina, queratano, dermatano, dextrano, dextrano modificado, amilose, bifosfato, poli-SA, ácido hialurônico, queritano, albumina, integrinas, oligossacarídeos antenários, peptídeos e semelhantes. Os processos de conjugação de vários grupos de modificação para uma porção de sacarídeo são prontamente acessíveis aos versados na técnica (POLY (ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY : BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; POLY (ETHYLENE GLYCOL) CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; e Dunn e outros, Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991).
Purificação de açúcares, açúcares de nucleotídeo e derivados
[00749] Os açúcares de nucleotídeo e derivados produzidos pelos processos acima podem se usados sem purificação. Contudo, é geralmente preferido recuperar o produto. Técnicas padrão bem conhecidas para recuperação de sacarídeos glicosilados, tais como, cromatografia de camada fina ou espessa, cromatografia de coluna, cromatografia de troca de íon ou filtração por membrana podem ser usadas. É preferido usar filtração por membrana, mais preferivelmente, utilizando uma membrana osmótica inversa ou uma ou mais técnicas cromatográficas de coluna para a recuperação conforme é discutido aqui anteriormente e na literatura citada aqui. Por exemplo, a filtração por membrana onde as membranas possuem corte de peso molecular de cerca de 3.000 a cerca de 10.000 pode ser usada para remover as proteínas para reagentes possuindo um peso molecular inferior a 10.000 Da. A filtração por membrana ou osmose inversa pode então ser usada para remover sais e/ou purificar os sacarídeos do produto (vide, por exemplo, o WO 98/15581). As membranas de nanofiltro são uma classe de membranas de osmose inversa que passam sais monovalentes, porém retêm sais polivalentes e solutos não carregados maiores do que cerca de 100 a cerca de 2.000 Daltons, dependendo da membrana usada. Assim, em uma aplicação típica, os sacarídeos preparados pelos processos da presente invenção serão retidos na membrana e os sais de contaminação passarão através da mesma. G - Grupos de Reticulação
[00750] A preparação do açúcar modificado para uso nos processos da presente invenção inclui anexação de um grupo de modificação a um resíduo de açúcar e formação de um aduto estável, que é um substrato para a glicosiltransferase. Assim, é freqüentemente preferido usar um agente de reticulação para conjugar o grupo de modificação e o açúcar. Compostos bifuncionais exemplares que podem se usados para anexar grupos de modificação às porções carboidrato incluem, porém não estão limitados aos poli(etileno glicóis) bifundionais, poliamidas, poliéteres, poliésteres e semelhante. Abordagens gerais para ligação dos carboidratos às outras moléculas são conhecidas na literatura. Vide, por exemplo, Lee e outros, Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia e outros, Anal. Biochem. 178: 408 (1989); Janda e outros, J. Am. Chem. Soc. 112: 8886 (1990) e Bednarski e outros, WO 92/18135. Na discussão que se segue, os grupos reativos são tratados como benignos na porção de açúcar do açúcar modificado nascente. O foco da discussão é quanto a clareza da ilustração. Os versados na técnica apreciação que a discussão é relevante aos grupos reativos no grupo de modificação.
[00751] Uma estratégia exemplar envolve a incorporação de uma sulfidrila protegida no açúcar usando o reticulador heterobifuncional SPDP (n-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato e então desprotegendo a sulfidrila para formação de uma ligação de dissulfeto com outra sulfidrila no grupo de modificação.
[00752] Se SPDP afeta prejudicialmente a capacidade do açúcar modificado de atuar como um substrato de glicosiltransferase, um de uma fileira de outros reticuladores, tais como, 2-iminotiolano ou N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) é usado para formar uma ligação dissulfeto. 2-iminotiolano reage com aminas primárias, incorporando instantaneamente uma sulfidrila não protegida à molécula contendo amina. SATA também reage com aminas primárias, porém incorpora uma sulfidrila protegida, que é mais tarde desacetilada usando hidroxilamina para produzir uma sulfidrila livre. Em cada caso, a sulfidrila incorporada é livre para reagir com outras sulfidrilas ou sulfidrila protegida, como SPDP, formando a ligação de dissulfeto necessária.
[00753] A estratégia descrita acima é exemplar e não limitante de ligantes de uso na invenção. Outros reticuladores estão disponíveis, os quais podem ser usados em estratégias diferentes para reticulação do grupo de modificação para o peptídeo. Por exemplo, TPCH(S-(2- tiopiridil)-L-cisteina hidrazida e TPMPH ((S-(2- tiopiridila)mercapto-propionohidrazida) reagem com porções de carboidrato que foram anteriormente oxidadas por tratamento com periodato brando, assim formando uma ligação hidrazona entre a porção de hidrazida do reticulador e os aldeídos gerados de periodato. TPCH e TPMPH introduzem um grupo sulfidrila protegido com 2-piridiltiona no açúcar, que pode ser desprotegido com DTT e então subseqüentemente usado para conjugação, tal como, formação de ligações de dissulfeto entre os componentes.
[00754] Se a ligação do dissulfeto for verificada como sendo inapropriada para produção de açúcares modificados estáveis, outros reticuladores podem ser usados os quais incorporam ligações mais estáveis entre os componentes. Os reticuladores heterobifuncionais GMBS (N-gama- malimidobutirilóxi)succinimida) e SMCC (sucinimidil 4-(N- maleimido-meil)ciclohexano) reagem com aminas primárias, assim introduzindo um grupo maleimida no componente. O grupo maleimida pode reagir subseqüentemente com sulfidrilas no outro componente, que pode ser introduzido por reticuladores mencionados anteriormente, formando assim uma ligação tioéter estável entre os componentes. Se o impedimento estérico entre os componentes interferir com a atividade dos componentes ou com a capacidade do açúcar modificado de agir como um substrato de glicosiltransferase, os reticuladores podem ser usados, os quais introduzem braços espaçadores longos entre os componentes e incluem derivados de alguns dos reticuladores mencionados anteriormente, (isto é, SPDP). Assim, existe uma abundância de reticuladores apropriados, os quais são úteis; cada um dos quais é selecionado, dependendo dos efeitos que possui no conjugado de peptídeo ótimo e produção de açúcar modificado.
[00755] Uma variedade de reagentes é usada para modificar os componentes do açúcar modificado com reticulações químicas intramoleculares (para revisão dos reagentes de reticulação e procedimentos de reticulação vide: Wold, F., Meth. Enzymol. 25: 623-651,1972; Weetall, H. H. r Cooney, D. A., Em: ENZYMES AS DRUGS. (Holcenberg, and Roberts, eds.) pp. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, T. H., Meth. Enzymol. 91: 580-609,1983; Mattson e outros, Mol. Biol. Rep. 17: 167- 183, 1993, todos os quais estão incorporados aqui como referência). Reagentes de reticulação preferidos são derivados de vários reagentes de reticulação de comprimento zero, homo-bifuncionais e hetero-bifuncionais. Os reagentes de reticulação de comprimento zero incluem conjugação direta de dois grupos químicos intrínsecos sem introdução do material extrínseco. Os agentes que catalisam a formação de uma ligação de dissulfeto pertencem a esta categoria. Outro exemplo é o dos reagentes que induzem a condensação de uma carboxila e um grupo amino primário para formar uma ligação de amida, tal como, carbodiimidas, etilcloroformato, reagente K de Woordward (2-etil-5-fenilisoxazólio-3'-sulfonato) e carbonildiimidazol. Além destes reagentes químicos, a transglutaminase de enzima (glutamil-peptídeo y- glutamiltransferase; EC 2.3.2.13) pode ser usada como reagente de reticulação de comprimento zero. Esta enzima catalisa reações de transferência de acila nos grupos de carboxamida dos resíduos de glutaminila ligada a proteína, geralmente com um grupo amino primário como substrato. Reagentes homo e hetero-funcionais contêm dois sítios idênticos ou não semelhantes, respectivamente, que podem ser reativos para amino, sulfidrila, guanidino, indol ou grupos não específicos.
2 - Sítios Específicos Preferidos nos Reagentes de Reticulação a - Grupos amino reativos
[00756] Em uma modalidade preferida, os sítios no reticulador são grupos amino reativos. Exemplos não limitantes úteis de grupos amino reativos incluem ésteres de N-hidróxisuccinimida (NHS), imidoésteres, isocianatos, acilhaletos, arilazidos, ésteres de p-nitrofenila, aldeídos e cloretos de sulfonila.
[00757] Ést eres de NHS reagem preferivelmente com grupos amino primários (incluindo aromáticos) de um componente de açúcar modificado. Os grupos imidazol de histidinas são conhecidos por competirem com aminas primárias quanto a reação, porém os produtos de reação não são instáveis e prontamente hidrolizados. A reação envolve o ataque de nucleófilo de uma amina do ácido carboxila de um éster NHS para formar uma amida, liberando a H- hidróxisuccinimida. Assim, a carga positiva do grupo amino original é perdida.
[00758] Imidoésteres são os reagentes de acilação mais específicos para reação com os grupos amina dos componentes de açúcar modificado. Em um pH entre 7 e 10, os imidoésteres reagem apenas com as aminas primárias. As aminas primárias atacam nucleofilicamente os imidatos para produzir um intermediário que se rompe em amidina em pH superior ou em um novo imidato em pH inferior. O novo imidato pode reagir com outra amina primária, assim reticulando dois grupos amino, um caso de imidato putativamente monofuncional reagindo bifuncionalmente. O produto principal da reação com aminas primárias é uma amidina que é uma base mais forte do que a amina original. A carga positiva do grupo amino original é, portanto, retida.
[00759] Isocianatos (e isotiocianatos) reagem com aminas primárias dos componentes de açúcar modificados para formar ligações estáveis. Suas reações com grupos sulfidrila, imidazol e tirosila fornecem produtos relativamente instáveis.
[00760] Acilazidos são também usados como reagentes específicos para amino nos quais as aminas nucleófilas do componente de afinidade atacam grupos carboxila ácidos sob condições ligeiramente alcalinas, por exemplo, pH 8,5.
[00761] Arilhaletos, tais como, 1,5-diflúor-2,4- dinitrobenzeno reagem preferivelmente com os grupos amino e grupos fenólicos de tirosina de componentes de açúcar modificado, porém também com grupos sulfidrila e imidazol.
[00762] É steres n-nitrofenila de ácidos mono e dicarboxílicos são também grupos amino reativos úteis. Embora a especificidade do reagente não seja muita alta, grupos α e ε-amino parecem reagir mais rapidamente.
[00763] Aldeídos, tais como, glutaraldeído reagem com aminas primárias de açúcar modificado. Embora bases Schiff instáveis sejam formadas mediante reação dos grupos amino com os aldeídos dos aldeídos, glutaraldeído é capaz de modificar o açúcar modificado com reticulações estáveis. Em pH 6-8, o pH das condições de reticulação típicas, os polímeros sofrem uma desidratação para formar polímeros aldeído α-β insaturados. As bases Shiff, contudo, são estáveis quando conjugadas a outra ligação dupla. A interação ressonante de ambas as ligações duplas impede hidrólise da ligação de Schiff. Adicionalmente, aminas em concentrações altas locais podem atacar a ligação dupla etilênica para formar um produto de adição de Michael.
[00764] Cloretos aromáticos de sulfonila reagem com vários sítios de componentes de açúcar modificados, porém reação com os grupos amino é a mais importante, resultando em uma ligação sulfonamida estável. b - Grupos sulfidrila reativos
[00765] Em outra modalidade preferida, os grupos são sulfidrila reativos. Exemplos não limitantes úteis de grupos sulfidrila reativos incluem maleimidas, haletos de alquila, dissulfetos de piridila e tioftalimidas.
[00766] As maleimidas reagem preferivelmente com o grupo sulfidrila dos componentes de açúcar modificado para formar ligações tioéster estáveis. Elas também reagem em uma razão muito mais lenta com os grupos de amina primária e os grupos imidazol de histidinas. Contudo, em pH 7, o grupo maleimida pode ser considerado um grupo específico sulfidrila, uma vez que neste pH, a razão de reação de tióis simples é 1.000 vezes maior do que aquela da amina correspondente.
[00767] Haletos de alquila reagem com grupos sulfidrila, sulfetos, imidazóis e grupos amino. Em pH neutro para ligeiramente alcalino, os haletos de alquila reagem primariamente com grupos sulfidrila para formar ligações tioéter estáveis. Em pH maior, a reação com grupos amino é favorecida.
[00768] Dissulfetos de piridila reagem com sulfidrilas livres através de troca de dissulfeto para fornecer dissulfetos misturados. Como resultado, os dissulfetos de piridila são os grupos sulfidrila reativos mais específicos.
[00769] As tioftalimidas reagem com os grupos sulfidrila livres para formar dissulfetos. c - Resíduo carboxila reativo
[00770] Em outra modalidade, carbodiimidas solúveis em água e solvente orgânico, são usadas como reagentes carboxila reativos. Estes compostos reagem com grupos carboxila livre formando uma pseudouréia que pode então ser acoplada as aminas disponíveis rendendo uma ligação amida. Procedimentos para modificar um grupo carboxila com carbodiimida são bem conhecidos na técnica (vide, Yamada e outros, Biochemistry 20: 4836-4842, 1981).
3 - Sítios Não Específicos Preferidos nos Reagentes de Reticulação
[00771] Além do uso de porções reativas específicas para o sítio, a presente invenção contempla o uso de grupos reativos não específicos para ligar o açúcar ao grupo de modificação.
[00772] Reticuladores não específicos exemplares incluem grupos fotoativáveis, completamente inertes no escuro, que são convertidos nas espécies reativas mediante absorção de um fóton de energia apropriada. Em uma modalidade preferida, grupos fotoativáveis são selecionados de precursores de nitrenos gerados mediante aquecimento ou fotólise das azidas. Nitrenos deficientes de elétron são extremamente reativos e podem reagir com várias ligações químicas, incluindo N-H, O-H, C-H e C=C. Embora três tipos de azidas (derivados de arila, alquila e acila) possam ser empregados, arilazidas são presentemente preferidas. A reatividade das arilazidas mediante fotólise é melhor realizada com N-H e O-H do que as ligações C-H. Arilnitrenos deficientes de elétron expandem rapidamente o anel para formar desidroazepinas, que tendem a reagir com os nucleófilos, ao invés de formarem produtos de inserção de C-H. A reatividade das arilazidas pode ser aumentada em presença de substituintes de retirada de elétron, tais como, grupos nitro ou hidroxila no anel. Tais substituintes empurram a absorção máxima de arilazidas para um comprimento de onda mais longo. Arilazidas não substituídas possuem uma absorção máxima na faixa de 260-280 nm, embora hidróxi e nitroarilazidas absorvam luz significativa além de 305 nm. Portanto, hidróxi e nitroarilazidas são mais preferidas, uma vez que elas permitem empregar condições de fotólise menos prejudicial para o componente de afinidade, do que as arilazidas não substituídas.
[00773] Em outra modalidade preferida, os grupos fotoativáveis são selecionados de arilazidas fluoradas. Os produtos de fotólise de arilazidas fluoradas são arilnitrenos, todos os quais sofrem de reações características deste grupo incluindo inserção de ligação C-H, com alta eficiência (Keana e outros, J. Org. Chem. 55: 3640-3647, 1990).
[00774] Em outra modalidade, os grupos fotoativáveis são selecionados de resíduos de benzenofenona. Os reagentes de benzenofenona geralmente fornecessem rendimentos de reticulação maiores do que os reagentes de arilazido.
[00775] Em outra modalidade, os grupos fotoativáveis são selecionados de compostos diazo, que formam um carbeno deficiente de elétrons mediante fotólise. Estes carbenos sofrem várias reações incluindo inserção nas ligações C-H, adição as ligações duplas (incluindo sistemas aromáticos), atração de hidrogênio e coordenação para centros nucleófilos para fornecer íons carbono.
[00776] Ainda em outra modalidade, grupos fotoativáveis são selecionados de diazopiruvatos. Por exemplo, o éster p-nitrofenila de diazopiruvato de p- nitrofenila reage com aminas alifáticas para fornecer amidas de ácido diazopirúvico que sofrem fotólise ultravioleta para formar aldeídos. O componente de afinidade modificado por diazopiruvato fotolisado reagirá como o aldeído fórmico ou glutaraldeído formando reticulações.
4 - Reagentes Homobifuncionais a - Reticuladores Homobifuncionais Reativos com Aminas Primárias
[00777] Síntese, propriedades e aplicações de reticuladores reativos a amina são comercialmente descritas na literatura (para revisão de procedimentos de reticulação e reagentes, vide acima). Muitos reagentes encontram-se disponíveis (por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, III; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.).
[00778] Exemplos preferidos, não limitantes de ésteres NHS homobifuncionais incluem glutarato de disuccinimidila (DSG), suberato de disuccinimidila (DSS), suberato de bis(sulfosuccinimidila) (BS), tartarato de disuccinimidila (DST), tartarato de dissulfosuccinimidila (sulfo-DST), bis- 2-(succinimidooxicarbonilóxi)etilssulfona (BSOCOES), bis-2- (sulfosuccinimidoóxi-carbonilóxi)etilssulfona (sulfo- BSOCOES), glicolbis etileno (succinimidilsuccinato) (EGS), glicolbis etileno (sulfosuccinimidilsuccinato) (sulfo-EGS), ditiobis(succinimidil-propionato) (DSP) e ditiobis(sulfosuccinimidilpropionato) (sulfo-DSP). Exemplos não limitantes preferidos de imidoésteres homobifuncionais incluem maonimidato de dimetila (DMM), succinimidato de dimetila (DMSC), adipimidato de dimetila (DMA), pimelimidato de dimetila (DMP), suberimidato de dimetila (DMS), dimetil-3,3'-oxidipropionimidato (DODP), dimetil- 3,3'-(metilenodióxi)dipropionimidato (DMDP), dimetil-3'- (dimetilenodióxi)dipropionimidato (DDDP), dimetil-3,3'- (tetrametilenodióxi)-dipropionimidato (DTDP) e dimetil- 3,3'-ditiobispropionimidato (DTBP).
[00779] Exemplos preferidos, não limitantes de isotiocianatos homobifuncionais incluem: p- fenilenodiisotiocianato (DITC) e estilbeno de ácido 4,4'- diisotiocianato-2,2'-dissulfônico (DIDS).
[00780] Exemplos preferidos, não limitantes de isocianatos homobifuncionais incluem xileno-diisocianato, tolueno-2,4-diisocianato, tolueno-2-isocianato-4- isotiocianato, 3-metóxidifenilmetano-4,4'-diisocianato, 2,2'-dicarbóxi-4,4'-azofenildiisocianato e hexametilenodiisocianato.
[00781] Exemplos preferidos, não limitantes, de arilhaletos homobifuncionais incluem 1,4-diflúor-2,4- dinitrobenzeno (DFDNB) e 4,4'-diflúor-3,3'-dinitrofenil- sulfona.
[00782] Exemplos preferidos, não limitantes de reagentes aldeído alifático homobifuncionais incluem glioxal, malondialdeído e glutaraldeído.
[00783] Exemplos preferidos, não limitantes de reagentes de acilação homobifuncionais incluem ésteres nitrofenila de ácidos dicarboxílicos.
[00784] Exemplos preferidos, não limitantes, de cloretos aromáticos de sulfonila homobifuncionais incluem cloreto de fenol-2,4-dissulfonila e cloreto de a-naftol- 2,4-dissulfonila.
[00785] Exemplos preferidos, não limitantes, de reagentes homobifuncionais amino reativos adicionais incluem eritritolbiscarbonato que reage com aminas para fornecer biscarbamatos. b - Reticuladores Homobifuncionais Reativos com Grupos Sulfidrila Livres
[00786] Síntese, propriedades e aplicações de tais reagentes são descritas na literatura (para revisão de procedimentos de reticulação e reagentes, vide acima). Muitos reagentes encontram-se disponíveis comercialmente (por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, III; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.).
[00787] Exemplos preferidos, não limitantes de maleimidas homobifuncionais incluem bismaleimidohexano (BMH), N,N'-(1,3-fenileno)bismaleimida, N,N'-(1,2- fenileno)bismaleimida, azofenildimaleimida e éster bis(N- maleimidometila).
[00788] Exemplos preferidos, não limitantes de dissulfetos piridila homobifuncionais incluem 1,4-di-3'- (2'-piridiltio)propionamidobutano (DPDPB).
[00789] Exemplos preferidos, não limitantes de haletos alquila homobifuncionais incluem 2,2'-dicarbóxi-4,4'- diiodoacetamidoazobenzeno, ácido α,α'-diiodo-p- xilenossulfônico, ácido α, a'-dibromo-p-xilenossulfônico, N,N'-bis(b-bromoetil)benzilamina, N,N'- di(bromoacetil)feniltidrazina e 1,2-di(bromoacetil)amino-3- fenilpropano. c - Reticuladores Fotoativáveis Homobifuncionais
[00790] Síntese, propriedades e aplicações de tais reagentes são descritas na literatura (para revisão de procedimentos de reticulação e reagentes, vide acima). Alguns dos reagentes encontram-se disponíveis comercialmente (por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, III; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.).
[00791] Exemplos preferidos, não limitantes de reticulador fotoatiável homobifuncional incluem bis-β-(4- azidosalicilamido)etildissulfeto (BASED), di-N-(2-nitro-4- azidofenil)-cistamina-S,S-dióxido (DNCO) e 4,4'- ditiobisfenilazido.
5 - Reagentes Heterobifuncionais a - Reagentes Heterobifuncionais Amino Reativos com uma porção de Dissulfeto de Piridila
[00792] Síntese, propriedades e aplicações de tais reagentes são descritas na literatura (para revisão de procedimentos de reticulação e reagentes, vide acima). Muitos reagentes encontram-se disponíveis comercialmente (por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, III; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.).
[00793] Exemplos preferidos, não limitantes de reagentes heterobifuncionais com uma porção de dissulfeto de piridila e um NHS amino reativo incluem N-succinimidil- 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil 6-3-(2- piridilditio)propionamidohexanoato (LC-SPDP), sulfosuccinimidil 6-3-(2-piridilditio)propionamidohexanoato (sulfo-LCSPDP), 4-succinimidilóxicarbonil-a-metil-a-(2- piridilditio)tolueno (SMPT) e sulfosuccinimidil 6-a-metil- a-(2-piridilditio)toluamidohexanoato (sulfo-LC-SMPT). b - Reagentes Heterobifuncionais Amino Reativos com uma Porção Maleimida
[00794] Síntese, propriedades e aplicações de tais reagentes são descritas na literatura. Exemplos preferidos, não limitantes de reagentes heterobifuncionais com uma porção maleimida e um éster NHS amino-reativo incluem maleimidilacetato de succinimidila (AMAS), 3- maleimidilpropionato de succinimidila (BMPS), éster N-y- maleimidobutirilóxisuccinimida (GMBS), éster N-y- maleimidobutirilóxisulfossuccinimida (sulfo-GMBS), 6- maleimidilhexanoato de succinimidila (EMCS), 3- maleimidilbenzoato de succinimidila (SMB), éster m- maleimidobenzoil-N-hidróxisuccinimida (MBS), éster m- maleimidobenzoil-N-hidróxisulfosuccinimida (sulfo-MBS), succinimidil 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano- 1-carboxilato (sulfo-SMCC), succinimidil 4-(p- maleimidofenil)butirato (SMPB) e sulfosuccinimidil 4-(p- maleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB). c - Reagentes Heterobifuncionais Amino Reativos com uma Porção de Haleto de Alquila
[00795] Síntese, propriedades e aplicações de tais reagentes são descritas na literatura. Exemplos preferidos, não limitantes de reagentes heterobifuncionais com uma porção haleto de alquila e um éster NHS amino reativo incluem N-succinimidil-(4-iodoacetil)aminobenzoato (SIAB), sulfossuccinimidil-(4-iodoacetil)aminobenzato (sulfo-SIAB), succinimidil-6-(iodoacetil)aminohexanoato (SIAX), succinimidil-6-(6-iodoacetil)-amino)hexanoilamino)hexanoato (SIACC), succinimidil-6-(((4-(iodoacetil)-amino)-metil)- ciclohexano-1-carbonil)aminohexanoato (SIACX) e succinimidil-4-((iodoacetil)-amino)metilciclohexano-1- carboxilato (SIAC).
[00796] Um exemplo preferido de um reagente heterobifuncional com um éster NHS amino reativo e uma porção diaheto alquila é N-hidróxisuccinimidil 2,3- dibromopropionato (SDBP). SDBP introduz reticulações intramoleculares ao componente de afinidade por conjugação de seus grupos amino. A reatividade da porção dibromopropionila em direção aos grupos amina primários é controlada por temperatura de reação (McKenzie e outros, Protein Chem. 7:581-592 (1988)).
[00797] Exemplos preferidos não limitantes de reagentes heterobifuncionais com uma porção haleto de alquila e uma porção de éster p-nitrofenila amino reativa incluem iodoacetato de p-nitrofenila (NPIA).
[00798] Outros agentes de reticulação são conhecidos dos versados na técnica. Vide, por exemplo, Pomato e outros, Patente US número 5.965.106. Encontra-se dentro das habilidades de um versado na técnica escolher um agente de reticulação apropriado para uma aplicação específica. d - Grupos de Ligante Cliváveis
[00799] Ainda em uma modalidade adicional, o grupo ligante é provido com um grupo que pode ser clivado para liberar o grupo de modificação do resíduo de açúcar. Muitos grupos cliváveis são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Jung e outros, Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983); Joshi e outros, J. Biol. Chem. 265:14518-14525 (1990); Zarling e outros, J. Immunol. 124: 913-920 (1980); Bouizar e outros, Eur. J. Biochem. 155: 141-147 (1986); Park e outros, J. Biol. Chem. 261: 205-210 (1986); Browning e outros, J. Immunol. 143: 1859-1867 (1989). Além disto, uma ampla faixa de grupos ligantes bifuncionais, cliváveis (ambos homo e heterobifuncionais) encontra-se comercialmente disponível dos fornecedores como a Pierce.
[00800] Porções cliváveis exemplares podem ser clivadas usando luz, aquecimento ou reagentes, tais como, tióis, hidroxilamina, bases, periodato e semelhantes. Além disto, determinados grupos preferidos são clivados in vivo em resposta a serem endocitosados (por exemplo, cis- aconitil; vide Shen e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048 (1991)). Grupos cliváveis preferidos compreendem uma porção clivável que é um elemento selecionado do grupo consistindo em grupos dissulfeto, éster, imida, carbonato, nitrobenzila, fenacila e benzoina. e - Conjugação de Açúcares Modificados em Peptídeos
[00801] Os açúcares modificados são conjugados em um peptídeo glicosilado ou não glicosilado usando uma enzima apropriada para mediar a conjugação. Preferivelmente, as concentrações de açúcar(es) doador(es) modificado(s), enzima(s) e peptídeo(s) aceitador(es) são selecionados, tal que, a glicosilação prossegue até o aceitador ser consumido. As considerações discutidas abaixo, embora estabelecidas no contexto de uma sialiltransferase são geralmente aplicáveis a outras reações de glicosiltransferase.
[00802] Vários processos de uso de glicosiltransferases para sintetizar estruturas de oligossacarídeo desejadas são conhecidos e são geralmente aplicáveis à presente invenção. Processos exemplares são descritos, por exemplo, no WO 96/32491, Ito e outros, Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993), e Patente US números 5.352.670, 5.374,541 e 5.545.553.
[00803] A presente invenção é praticada usando uma glicosiltransferase simples ou uma combinação de glicosiltransferases. Por exemplo, pode-se usar uma combinação de sialiltransferase e uma galactosiltransferase. Naquelas modalidades usando mais do que uma enzima, as enzimas e substratos são preferivelmente combinados em uma mistura de reação inicial ou as enzimas e reagentes para a segunda reação enzimática são adicionados ao meio de reação, uma vez que a primeira reação enzimática está completa ou quase completa. Por condução de duas reações enzimáticas em seqüência em um recipiente simples, os rendimentos totais são aperfeiçoados em relação aos procedimentos nos quais uma espécie intermediária é isolada. Além disto, a limpeza e descarte de solventes extras e subprodutos é reduzida.
[00804] Em uma modalidade preferida, cada uma das primeira e segunda enzimas é uma glicosiltransferase. Em outra modalidade preferida, uma enzima é uma endoglicosidase. Em outra modalidade preferida, uma enzima é uma exoglicosidase. Em uma terceira modalidade preferida, adicional, mais do que duas enzimas são usadas para montar a glicoproteína modificada da invenção. As enzimas são usadas para alterar uma estrutura de sacarídeo no peptídeo em qualquer ponto antes ou após a adição do açúcar modificado ao peptídeo.
[00805] Em outra modalidade, pelo menos duas das enzimas são glicosiltransferases e o último açúcar adicionado à estrutura de sacarídeo do peptídeo é um açúcar não modificado. Ao invés disto, o açúcar modificado é interno à estrutura de glicano e, portanto, não precisa ser o último açúcar no glicano. Em uma modalidade exemplar, galactosiltransferase pode catalisar a transferência de Gal-PEG de UDP-Gal-Peg para o glicano, seguido por incubação em presença de ST3Gal3 e CMP-SA que serve para adicionar um ácido siálico não modificado "de capeamento" no glicano (figura 22A).
[00806] Em outra modalidade, pelo menos duas das enzimas usadas são glicosiltransferases e pelo menos dois açúcares modificados são adicionados às estruturas de glicano no peptídeo. Desta maneira, dois ou mais glicoconjugados diferentes podem ser adicionados a um ou mais glicanos em um peptídeo. Este processo gera estruturas de glicano possuindo dois ou mais açúcares modificados, funcionalmente diferentes. Em uma modalidade exemplar, a incubação do peptídeo com GnT-I,II e UDP-GlcNAc-PEG serve para adicionar uma molécula de GlcNAc-PEG ao glicano; incubação com galactosiltransferase e UDP-Gal então serve para adicionar um resíduo de Gal a mesma; e incubação com ST3Gal3 e CMP-SA-Man-6-Fosfato serve para adicionar uma molécula de SA-manose-6-fosfato ao glicano. Esta série de reações resulta em uma cadeia de glicano possuindo as características funcionais de um glicano PEGilado, bem como, atividade direcionada de manose-6-fosfato (figura 22B).
[00807] Em outra modalidade, pelo menos duas das enzimas usadas na reação são glicosiltransferases e novamente, açúcares modificados diferentes são adicionados aos glicanos ligados em N e O no peptídeo. Esta modalidade é útil quando dois açúcares modificados diferentes devem ser adicionados aos glicanos em um peptídeo, porém quando é importante separar espacialmente os açúcares modificados no peptídeo um do outro. Por exemplo, se os açúcares modificados compreendem moléculas volumosas, incluindo, porém, não limitadas a PEG e outras moléculas, tais como, molécula de ligante, este processo pode ser preferível. Os açúcares modificados podem ser adicionados simultaneamente às estruturas de glicano em um peptídeo, ou eles podem ser adicionados seqüencialmente. Em uma modalidade exemplar, a incubação com ST3Gal3 e CMP-SA-PEG serve para adicionar ácido siálico-PEG aos glicanos ligados em N, enquanto a incubação com ST3Gal1 e CMP-SA-bisFosfto serve para adicionar ácido sialítico-Bisfofonato aos glicanos ligados em O (figura 22C).
[00808] Em outra modalidade, o processo faz uso de uma ou mais exo ou endoglicosidase. A glicosidase é tipicamente um mutante, que é transformado por engenharia para formar ligações glicosila ao invés de romper as mesmas. A glicanase mutante, algumas vezes denominada uma glicosintase inclui, tipicamente, uma substituição de um resíduo de aminoácido para um resíduo de aminoácido ácido de sítio ativo. Por exemplo, quando a endoglicanase é endo-H, os resíduos de sítio ativo substituídos tipicamente serão Asp na posição 130, Glu na posição 132 ou uma combinação dos mesmos. Os aminoácidos são geralmente substituídos por serina, alanina, asparagina ou glutamina. Exoglicosidases tais como, transialidase são também úteis.
[00809] A enzima mutante catalisa a reação, geralmente por uma etapa de síntese que é análoga à reação inversa da etapa de hidrólise de endoglicanase. Nestas modalidades, a molécula doadora de glicosila (por exemplo uma estrutura oligo ou monossacarídea desejada) contém um grupo de partida e a reação se processa com a adição da molécula doadora a m resíduo de GlcNAc na proteína. Por exemplo, o grupo de partida pode ser um halogênio, tal como flúor. Em outras modalidades, o grupo de partida é uma porção Asn ou Asn-peptídeo. Ainda em modalidades adicionais, o resíduo de GlcNAc na molécula doadora de glicosila é modificado. Por exemplo, o resíduo de GlcNAc pode compreender uma porção 1,2-oxazolina.
[00810] Em uma modalidade preferida, cada uma das enzimas utilizada para produzir um conjugado da invenção está presente em uma quantidade catalítica. A quantidade catalítica de uma enzima específica varia de acordo com a concentração daquele substrato da enzima, bem como as condições de reação tais como, temperatura, tempo e valor de pH. Meios para determinar a quantidade catalítica para uma dada enzima sob concentrações de substrato pré- selecionadas e condições de reação são bem conhecidas dos versados na técnica.
[00811] A temperatura na qual um processo descrito acima é realizado pode variar de imediatamente acima do congelamento para a temperatura na qual a maior parte da enzima sensível desnatura. As faixas de temperatura preferidas são de cerca de 0C a cerca de 55°C e, mais preferivelmente, cerca de 30°C a cerca de 37°C. Em outra modalidade exemplar, um ou mais componentes do presente processo são conduzidos em uma temperatura elevada usando uma enzima termofílica.
[00812] A mistura de reação é mantida por um período de tempo suficiente para que o aceitador seja glicosilado, desta forma formando o conjugado desejado. Algum conjugado pode freqüentemente ser detectado após algumas horas, com quantidades recuperáveis geralmente sendo obtidas dentro de 24 horas ou menos. Os versados na técnica entenderão que a razão de reação depende de vários fatores variáveis (por exemplo, concentração de enzima, concentração de doador, concentração de aceitador, temperatura, volume do solvente) que são otimizados para um sistema selecionado.
[00813] A presente invenção também provê a produção em escala industrial de peptídeos modificados. Conforme usado aqui, uma escala industrial geralmente produz pelo menos um grama de conjugado purificado, acabado.
[00814] Na discussão que se segue a invenção é exemplificada pela conjugação de porções de ácido siálico modificadas para um peptídeo glicosilado. O ácido siálico modificado exemplar é rotulado com PEG. O foco da discussão que se segue no uso do ácido siálico modificado por PEG e peptídeos glicosilados é quanto a clareza de ilustração e não se destina a implicar no fato de que a invenção esteja limitada a conjugação destes dois parceiros. Um versado entenderá que a discussão é geralmente aplicável as adições de porções de glicosila modificada que não ácido siálico. Além disto, a discussão é igualmente aplicável à modificação de uma unidade de glicosila com agentes que não PEG incluindo outros polímeros solúveis em água, porções terapêuticas e biomoléculas.
[00815] Uma abordagem enzimática pode ser usada para a introdução seletiva de carboidratos PEGilados ou PPGilados em um peptídeo ou glicopeptídeo. O processo utiliza açúcares modificados contendo PEG, PPG ou um grupo funcional reativo mascarado e é combinado com a glicosiltransferase ou glicosintase apropriada. Selecionando-se a glicosiltransferase que tornará a ligação carboidrato desejada e utilização do açúcar modificado como o substrato doador, PEG ou PPG podem ser introduzidos diretamente no esqueleto do peptídeo, nos resíduos de açúcar existentes de um glicopeptídeo ou em resíduos de açúcar que foram adicionados a um peptídeo.
[00816] Um aceitador para a sialiltransferase está presente no peptídeo a ser modificado pelos processos da presente invenção, tanto como uma estrutura ocorrendo naturalmente quanto uma colocada lá recombinante, enzimática ou quimicamente. Aceitadores apropriados incluem, por exemplo, aceitadores de galactosila tais como Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, lacto-N- tetraose, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlcNAc, Galβ1,4Glc (lactose) e outros aceitadores conhecidos dos versados na técnica (vide, por exemplo, Paulson e outros, J. Biol. Chem. 253:5617-5624 (1978)).
[00817] Em uma modalidade, um aceitador para a sialiltransferase está presente no peptídeo a ser modificado mediante sintase in vivo do peptídeo. Tais peptídeos podem ser sialilados usando os processos reivindicados sem modificação anterior do padrão de glicosilação do peptídeo. Alternativamente, os processos da invenção podem ser usados para sialilar um peptídeo que não inclui um aceitador apropriado, um primeiro modifica o peptídeo para incluir um aceitador por processos conhecidos na técnica. Em uma modalidade exemplar, um resíduo GalNAc é adicionado por ação de uma GalNAc transferase.
[00818] Em uma modalidade exemplar, o aceitador de galactosila é montado por anexação de um resíduo de galactose a um aceitador apropriado ligado ao peptídeo, por exemplo um GlcNAc. O processo inclui incubação do peptídeo a ser modificado com uma mistura de reação que contém uma quantidade apropriada de uma galactosiltransferase (por exemplo, galβ1,3 ou galβ1,4) e um doador de galactosila apropriado (por exemplo, UDP-galactose). A reação é deixada processar simultaneamente até terminar ou alternativamente, a reação é terminada quando uma quantidade pré-selecionada do resíduo de galactose é adicionada. Outros processos de montagem de um aceitador de sacarídeo selecionado ficarão aparentes aos versados na técnica.
[00819] Ainda em outra modalidade, os oligossacarídeos ligados ao peptídeo são primeiro "aparados", tanto no total quanto em parte, para expor tanto um aceitador para a sialiltransferase quanto uma porção a qual um ou mais resíduos apropriados podem ser adicionados para obter um aceitador apropriado. Enzimas, tais como, glicosiltransferases e endoglicosidades (vide, por exemplo, Patente US número 5.716.812) são úteis para reações de anexação e aparamento. Uma discussão detalhada de "aparamento" e remodelação de glicanos ligados em O e ligados em N é provida em qualquer lugar aqui.
[00820] Na discussão que se segue, o processo da invenção é exemplificado pelo uso de açúcares modificados possuindo polímero solúvel em água anexado aos mesmos. O foco da discussão é para clareza da ilustração. Os versados na técnica apreciarão que a discussão é igualmente relevante para aquelas modalidades nas quais o açúcar modificado porta uma porção terapêutica, biomolécula ou semelhante.
[00821] Uma modalidade exemplar da invenção na qual um resíduo de carboidrato é "aparado" antes da adição do açúcar modificado é estabelecida na figura 13, que estabelece um esquema onde a manose superior é retroaparada para a primeira geração de estrutura biantenária. Um açúcar modificado contendo um polímero solúvel em água é conjugado em um ou mais dos resíduos de açúcar expostos pela "retroaparação". Em um exemplo, um polímero solúvel em água é adicionado através de uma porção de GlcNAc conjugado ao polímero solúvel em água. O GlcNAc modificado é anexado a um ou ambos os resíduos de manose terminais da estrutura biantenária. Alternativamente, um GlcNAc não modificado pode ser adicionado a um ou ambos dos terminais das espécies ramificadas.
[00822] Em oura modalidade exemplar, um polímero solúvel em água é adicionado a um ou ambos dos resíduos de manose terminal da estrutura biantenária através de um açúcar modificado possuindo um resíduo de galactose, que é conjugado ao resíduo de GlcNAc adicionado aos resíduos de manose terminal. Alternativamente, uma Gal não modificada pode ser adicionada a um ou ambos resíduos de GlcNAc terminal.
[00823] Ainda em outro exemplo, um polímero solúvel em água é adicionado ao resíduo de Gal usando um ácido siálico modificado.
[00824] Outra modalidade exemplar é estabelecida na figura 14, que revela um esquema semelhante aquele mostrado na figura 13, onde a estrutura de manose é "retroaparada" para a manose a partir da qual a estrutura biantenária se ramifica. Em um exemplo, um polímero solúvel em água é adicionado através de um GlcNAc modificado com o polímero. Alternativamente, um GlcNAc não modificado é adicionado à manose, seguido por um Gal com um polímero solúvel em água anexado. Ainda em outra modalidade, GlcNAc não modificado e resíduos de Gal são adicionados seqüencialmente à manose, seguido por uma porção de ácido siálico modificada com um polímero solúvel em água.
[00825] A figura 15 estabelece uma modalidade exemplar e adicional usando um esquema semelhante aquele ilustrado na figura 13, onde manose superior é "retroaparada" para GlcNAc a qual a primeira manose é anexada. GlcNAc é conjugado no resíduo Gal portanto um polímero solúvel em água. Alternativamente, uma Gal não modificada é adicionada ao GlcNAc, seguido por adição de um ácido siálico modificado com um açúcar solúvel em água. Ainda em um exemplo adicional, o GlcNAc terminal é conjugado com Gal e o GlcNAc é subseqüentemente fucosilado com uma fucose portando um polímero solúvel em água.
[00826] A figura 16 é um esquema semelhante aquele mostrado na figura 13, onde a manose superior é retroaparada para o primeiro GlcNAc anexado a Asn do peptídeo. Em um exemplo, o GlcNAc do resíduo de GlcNAc- (Fuc)a é conjugada a uma GlcNAc portando um polímero solúvel em água. Em outra modalidade, o GlcNAc do resíduo GlcNAc-(Fuc)a é modificado com Gal, que porta um polímero solúvel em água. Ainda em uma modalidade adicional, o GlcNAc é modificado com Gal, seguido por conjugação na Gal de um ácido siálico modificado com um polímero solúvel em água.
[00827] Outras modalidades exemplares são estabelecidas na figuras 17-21. Uma ilustração do conjunto de tipos de reação com os quais a presente invenção pode ser praticada é provida nas figuras mencionadas anteriormente.
[00828] Os exemplos estabelecidos acima fornecem uma ilustração da força dos processos estabelecidos aqui. Usando os processos da invenção, é possível "retroaparar" e constituir um resíduo de carboidrato de qualquer estrutura substancialmente desejada. O açúcar modificado pode ser adicionado ao terminal da porção de carboidrato conforme estabelecido acima, ou pode ser intermediário entre o núcleo do peptídeo e o término do carboidrato.
[00829] Em uma modalidade exemplar, um ácido siálico existente é removido do glicopeptídeo usando uma sialidase, desta forma desmascarando todos ou a maioria dos resíduos de galactosila subjacentes. Alternativamente, um peptídeo ou glicopeptídeo é rotulado com resíduos de galactose ou um resíduo de oligossacarídeo que termina em uma unidade de galactose. Seguindo-se a exposição ou adição dos resíduos de galactose, uma sialiltransferase apropriada é usada para adicionar um ácido siálico modificado. A abordagem é resumida no Esquema 12. Esquema 12
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[00830] Ainda em uma abordagem adicional, resumida no Esquema 13, uma funcionalidade mascaradamente reativa está presente no ácido siálico. O grupo reativo mascarado preferivelmente não é afetado pelas condições usadas para atacar o ácido siálico modificado para o peptídeo. Após uma anexação covalente do ácido siálico modificado ao peptídeo, a mascara é removida e o peptídeo é conjugado com uma gente, tal como, PEG, PPG, uma porção terapêutica, biomolécula ou outro agente. O agente é conjugado ao peptídeo em uma maneira específica por sua reação com o grupo reativo não mascarado no resíduo de açúcar modificado. Esquema 13
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[00831] Qualquer açúcar modificado pode ser usado com sua glicosiltransferase apropriada, dependendo dos açúcares terminais das cadeias laterais de oligossacarídeo do glicopeptídeo (Tabela 3). Conforme discutido acima, o açúcar terminal do glicopeptídeo necessário para introdução da estrutura PEGilada ou PPGilada pode ser introduzido naturalmente durante a expressão ou pode ser produzido após expressão usando a(s) glicosidase(s), glicosiltransferase(s) apropriadas ou mistura de glicosidase(s) e glicosiltransferase(s). Tabela 3
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[00832] Em uma modalidade exemplar adicional, UDP- galactose-PEG é reagida com leite bovino β1,4- galactosiltransferase, pelo que, transferindo a galactose modificada para a estrutura N-acetilglicosamina terminal apropriada. Os resíduos de GlcNAc terminal no glicopeptídeo podem ser produzidos durante expressão, como pode ocorrer em tais sistemas de expressão como de mamíferos, insetos, plantas ou fungos, porém também podem ser produzidos por tratamento do glicopeptídeo com uma sialidase e/ou glicosidase e/ou glicosiltransferase, conforme necessário.
[00833] Em outra modalidade exemplar, uma transferase de GlcNAc, tal como GnTI-V é utilizada para transferir GlcNc PEGilado para um resíduo de manose no glicopeptídeo. Ainda em uma modalidade exemplar, as estruturas de glicano ligadas em N e/ou O são removidas enzimaticamente do glicopeptídeo para expor um aminoácido ou um resíduo glicosila terminal que é subseqüentemente conjugado com o açúcar modificado. Por exemplo, uma endoglicanase é usada para remover as estruturas ligadas em N de um glicopepídeo para expor um GlcNAc terminal como um GlcNAc-ligado-Asn no glicopeptídeo. UDP-Gal-PEG e a galactosiltransferase apropriada é usado para introduzir a funcionalidade de PEG ou PPG-galactose no GlcNAc exposto.
[00834] Em uma modalidade alternativa, o açúcar modificado é adicionado diretamente ao esqueleto do peptídeo usando uma glicosiltransferase conhecida por transferir resíduos de açúcar para o esqueleto do peptídeo. Esta modalidade exemplar é estabelecida no Esquema 14. Glicosiltransferases exemplares úteis na prática da presente invenção incluem, porém não estão limitadas as GalNAC transferases (GalNAc T1-14), GlcNAc transferases, fucosiltransferases, glicosiltranferases, xilosiltransferases, manosiltransferases e semelhantes. O uso desta abordagem permite a adição direta de açúcares modificados nos peptídeos que não possuem qualquer carboidrato ou, alternativamente nos glicopeptídeos existentes. Em ambos os casos, a adição de açúcar modificado ocorre em posições específicas no esqueleto de peptídeo, conforme definido pela especificidade do substrato da glicosiltransferase e não em uma maneira aleatória como ocorre durante a modificação de um esqueleto de peptídeo de proteína usando processos químicos. Um conjunto de agentes pode ser introduzido nas proteínas ou glicopeptídeos que não possuem seqüência de peptídeo de substrato de glicosiltransferase por transformação por engenharia da seqüência de aminoácido apropriada na cadeia de peptídeo. Esquema 14
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[00835] Em cada uma das modalidades exemplares estabelecidas acima, uma ou mais etapas de modificação química ou enzimática adicionais podem ser utilizadas seguindo-se a conjugação do açúcar modificado no peptídeo. Em uma modalidade exemplar, uma enzima (por exemplo, fucosiltransferase) é usada para anexar uma unidade de glicosila (por exemplo, fucose) ao açúcar modificado por terminal anexado ao peptídeo. Em outro exemplo, uma reação de enzima é utilizada para "capear" sítios aos quais o açúcar modificado falhou em conjugar. Alternativamente, uma reação química é utilizada para alterar a estrutura do açúcar modificado conjugado. Por exemplo, o açúcar modificado conjugado é reagido com agentes que estabilizam ou desestabilizam sua ligação com o componente de peptídeo ao qual o açúcar modificado é anexado. Em outro exemplo, um componente do açúcar modificado é desprotegido, seguindo-se sua conjugação ao peptídeo. Um versado apreciará que existe um conjunto de procedimentos enzimáticos e químicos que são úteis nos processos da invenção em um estágio após o açúcar modificado ser conjugado no peptídeo. Elaboração adicional do conjugado de açúcar-peptídeo modificado encontra-se dentro do escopo da invenção.
Direcionamento do Peptídeo com Manose-6-Fosfato
[00836] Em uma modalidade exemplar, o peptídeo é derivatizado com pelo menos uma porção de manose-6-fosfato. A porção de manose-6-fosfato direciona o peptídeo para um lisossoma de uma célula e é útil, por exemplo, para direcionar proteínas terapêuticas para os lisossomas para terapia de doenças de armazenamento lisossômico.
[00837] Doenças de armazenamento lisossômico são um grupo de mais de 40 distúrbios que são o resultado dos defeitos nos genes codificando as enzimas que rompem glicolipídeo ou produtos residuais de polissacarídeo dentro dos lisossomas das células. Os produtos enzimáticos, por exemplo, açúcares e lipídeos, são então reciclados em novos produtos. Cada um destes distúrbios resulta de um trato autossômico herdado ou recessivo ligado em X que afeta os níveis de enzimas no lisossoma. Geralmente, não há atividade biológica ou funcional das enzimas afetadas nas células e tecidos dos indivíduos afetados. A tabela 4 fornece uma lista de doenças de armazenamento representativas e defeito enzimático associado com as doenças. Em tais doenças, a deficiência na função da enzima cria uma deposição sistêmica progressiva de lipídeo ou substrato de carboidrato nos lisossomas nas células no corpo, eventualmente causando perda da função do órgão e morte. A etiologia genética, manifestações clínicas, biologia molecular e possibilidade de doenças de armazenamento de lisossoma são detalhadas em Scriver e outros, eds, THE METABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITED DISEASE, 7.sup.th Ed., volume II, McGraw Hill, (1995). Tabela 4: Doenças de Armazenamento Lisossômico e Defeitos
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*MPS = mucopolissacaridose
[00838] De Duve sugeriu primeiro que a substituição da enzima lisossômica faltante com enzima exógena biologicamente ativa pode ser uma abordagem viável para o tratamento de doenças de armazenamento lisossômico (De Duve, Fed. Proc. 23: 1045 (1964). Desde aquela época, vários estudos foram sugeridos de que a terapia de substituição de enzima pudesse ser benéfica para tratamento de várias doenças de armazenamento de lisossomas. O melhor sucesso foi mostrado com indivíduos com doença de Gaucher do tipo I, que foram tratadas com enzima exógena (β- glicocerebrosidase), preparadas de placenta (Ceredase™) ou mais recentemente, recombinantemente (Cerezyme™). Foi sugerido que a substituição da enzima pode também ser benéfica para o tratamento da doença de Fabry, bem como outras doenças de armazenamento lisossômicas. Vide, por exemplo, Dawson e outros, Ped. Res. 7(8) : 684-690 (1973) (in vitro) e Mapes e outros, Science 169: 987 (1970) (in vivo). Experiências clínicas de terapia de substituição de enzima foram reportadas pelos pacientes de Fabry usando infusões de plasma normal (Mapes e outros, Science 169: 987-989 (1970)), α-galactosidase A purified from placenta (Brady e outros, N. Eng. J. Med. 279: 1163 (1973)); ou α- galactosidase A purified from spleen or plasma (Desnick e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76: 5326-5330 (1979)) e demonstraram a eficácia bioquímica de substituição da enzima direta para doença de Fabry. Estes estudos indicaram o potencial para eliminação ou redução significativa do armazenamento de glicolipídeo patológico por substituição repetida das enzimas. Por exemplo, em um estudo (Desnick e outros, supra), injeção intravenosa de enzima purificada resultou em uma redução transiente nos níveis de plasma de substrato de lipídeo armazenado, globotriasilceramida.
[00839] Conseqüentemente, existe uma necessidade na técnica de processos para prover quantidades suficientes de enzimas lisossômicas biologicamente ativas, tais como, α- galactosidase A humana, para células deficientes. Recentemente, abordagens recombinantes foram tentadas para suprir estas necessidades, vide, por exemplo, Patente US número 5.658. 567; 5.580.757; Bishop e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 83: 4859- 4863 (1986); Medin e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 93: 7917-7922 (1996); Novo, F. J., Gene Therapy. 4: 488-492 (1997); Ohshima e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 94: 2540- 2544 (1997); e Sugimoto e outros, Human Gene Therapy 6: 905-915, (1995). Através do direcionamento mediado por manose-6-fosfato dos peptídeos terapêuticos para lisossomas, a presente invenção provê composições e processos para liberação de quantidades suficientes de peptídeos lisossômicos biologicamente ativos para células deficientes.
[00840] Assim, é uma modalidade exemplar da presente invenção prover um peptídeo de acordo com a Tabela 6 que seja derivatizado de manose-6-fosfato (figura 23 e figura 24). O peptídeo pode ser preparado de forma recombinante ou quimicamente. Além disto, o peptídeo pode ser a seqüência natural, plena ou pode ser modificado por exemplo, por truncagem, extensão ou pode incluir substituições ou apagamentos. Proteínas exemplares que são remodeladas usando o processo da presente invenção incluem glicocerebrosidase, β-glicosidase, α-galactosidase A, ácido-a-glicosidade (maltase de ácido). Peptídeos modificados representativos que estão em uso clínico incluem, porém não são limitados a Ceredase™, Cerezyma™ e Fabryzima™. Um grupo glicosila nos peptídeos modificados e clinicamente relevantes pode também ser alterado usando um processo da invenção. A manose-6-fosfato é anexada ao peptídeo através de um grupo de ligação glicosila. Em uma modalidade exemplar, o grupo de ligação glicosila é derivado de ácido siálico. Grupos de ligação glicosila derivados de ácido siálico exemplares são estabelecidos na Tabela 2, onde um ou mais de porções "R" é manose-6-fosfato ou um grupo espaçador possuindo uma ou mais porções manose- 6-fosfato anexadas ao mesmo. A porção de ácido siálico modificada é preferivelmente o resíduo terminal de uma ligação oligossacarídeo para a superfície do peptídeo (figura 25).
[00841] Além da manose-6-fosfato, os peptídeos da invenção podem ser adicionalmente derivatizados com uma porção, tal como, polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, ou uma porção de direcional adicional. Os processos para anexação destes e outros grupos são estabelecidos aqui. Em uma modalidade exemplar, o grupo que não manose-6-fosfato é anexado ao peptídeo através de um derivado de ácido siálico derivatizado de acordo com a Tabela 2, onde uma ou mais das porções "R" é um grupo que não manose-6-fosfato.
[00842] Em uma modalidade exemplar, uma porção de ácido siálico modificada com um braço de ligante a base de glicina protegido por Cbz é preparado. O açúcar de nucleotídeo correspondente é preparado e o grupo Cbz é removido por hidrogenação catalítica. O açúcar de nucleotídeo resultante possui uma amina reativa disponível que é contatada com um derivado de manose-6-fosfato ativado, provendo um açúcar de nucleotídeo derivatizado de manose-6-fosfato que é útil na prática dos processos da invenção.
[00843] Conforme mostrado no esquema abaixo (esquema 15), um derivado de manose-6-fosfato exemplar ativado é formado por conversão de um fosfotriéster protegido por 2- bromo-benzilo no triflato correspondente, in situ, e reação do triflato com um ligante possuindo uma porção contendo oxigênio reativo, formando uma ligação de éter entre o açúcar e o ligante. Os grupos de proteção benzilo são removidos por hidrogenação catalítica e o éster metílico do ligante é hidrolizado, provendo o ácido carboxílico correspondente. O ácido carboxílico é ativado por qualquer processo conhecido na técnica. Um procedimento de ativação exemplar fia-se na conversão do ácido carboxílico no éster de N-hidróxisuccinimida. Esquema 15
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[00844] Em outra modalidade exemplar, conforme mostrado no esquema abaixo (esquema 16), um ácido siálico N-acetilado é convertido em uma amina por manipulação da porção de piruvila. Assim, a hidroxila primária é convertida em um éster sulfonato e reagida com azido de sódio. O azido é cataliticamente reduzido na amina correspondente. O açúcar é subseqüentemente convertido no seu análogo de nucleotídeo e acoplado, através do grupo amina à manose-6-fosfato derivatizada do braço, preparada conforme discutido acima. Esquema 16
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[00845] Os peptídeos úteis para tratar doença de armazenamento lisossômica podem ser derivatizados com outras porções direcionais incluindo, porém, não limitado a transferrina (para liberar o peptídeo através da barreira cerebro-sangüínea e para endossomas), carnitina (para liberar o peptídeo para as células musculares) e fosfonatos, por exemplo, bisfosfonato (para direcionar o peptídeo para os ossos e outros tecidos calcíferos). A porção direcionar e peptídeo terapêutico são conjugados por qualquer processo discutido aqui ou de outra forma conhecido na técnica.
[00846] Em uma modalidade exemplar, o agente direcional e o peptídeo terapêutico são acoplados através de uma porção de ligante. Nesta modalidade, pelo menos um do peptídeo terapêutico ou o agente direcional é acoplado a porção de ligante através de um grupo de ligação glicosila intacto, de acordo com o processo da invenção. Em uma modalidade exemplar, a porção de ligante inclui um poli(éter) tal como poli(etileno glicol). Em outra modalidade exemplar, a porção de ligante inclui, pelo menos, uma ligação que é degradada in vivo, liberando o peptídeo terapêutico do agente direcional, seguindo a liberação do conjugado para o tecido direcionado ou região do corpo.
[00847] Ainda em outra modalidade exemplar, a distribuição in vivo da porção terapêutica é alterada através da alteração de uma glicoforma na porção terapêutica sem conjugar o peptídeo terapêutico a uma porção direcional. Por exemplo, o peptídeo terapêutico pode ser retirado da absorção pelo sistema reticuloendotelial por capeamento da porção de galactose terminal do grupo glicosila com ácido siálico (ou um derivado do mesmo) (figuras 23 e 26). A sialilação para recuperar Ga1 terminal evita a absorção do peptídeo pelos receptores de asialoglicoproteína hepática (ASGP) e pode estender a meia vida do peptídeo, quando comparado aos peptídeos possuindo apenas cadeias glicano complexas, na ausência de sialilação.
II - Peptídeo/Glicopeptídeos da Invenção
[00848] Em uma modalidade, a presente invenção provê uma composição compreendendo cópias múltiplas de um peptídeo simples possuindo um núcleo de trimanosila elementar como a estrutura de glicano primária anexada ao mesmo. Nas modalidades preferidas, o peptídeo pode ser uma molécula terapêutica. A forma natural do peptídeo pode compreender glicanos ligados em N complexos ou pode ser um glicano de manose superior. O peptídeo pode ser um peptídeo de mamífero e é preferivelmente um peptídeo humano. Em algumas modalidades, o peptídeo é selecionado do grupo consistindo em uma imunoglobulina, eritropoietina, peptídeo ativador do tipo de tecido e outros (vide figura 1).
[00849] Peptídeos exemplares cujos glicanos podem ser remodelados usando os processos da invenção são estabelecidos na figura 1. Tabela 5 - Peptídeos Preferidos para Remodelagem de Glicano
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[00850] Uma lista mais detalhada dos peptídeos úteis na invenção e sua fonte é provida na figura 1.
[00851] Outros peptídeos exemplares que são modificados pelos processos da invenção incluem elementos da família da imunoglobulina (por exemplo, anticorpos, moléculas de MHC, receptores de célula T, e semelhantes), receptores intracelulares (por exemplo, integrinas, receptores para hormônios ou fatores do crescimento e semelhantes), lecitinas e citocinas (por exemplo, interleuquins). Exemplos adicionais incluem ativador de plasminogênio do tipo tecido (TPA), renina, fatores coagulantes, tais como, Fator VIII e Fator IX, brombesina, trombina, fator do crescimento hematopoiético, fatores de estimulação de colônia, antígenos virais, peptídeos de complemento, α1-antitripsina, eritropoietina, ligando-1 de glicopeptídeo P-seletina (PSGL-1), fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago, anti-trombina III, interleuquins, interferons, peptídeos A e C, fibrinogênio, herceptin™, leptina, glicosidases, entre outros. Esta lista de peptídeos é exemplar e não deve ser considerada como sendo exclusiva. Ao invés disto, como é aparente da revelação provida aqui, os processos da invenção são aplicáveis a qualquer peptídeo onde uma estrutura de glicano desejada possa ser talhada.
[00852] Os processos da invenção são também úteis para modificação de peptídeos quiméricos, incluindo, porém, não limitado aos peptídeos quiméricos que incluem uma porção derivada de uma imunoglobulina, tal como IgG.
[00853] Peptídeos modificados pelos processos da invenção podem ser sintéticos ou peptídeos do tipo selvagem ou eles podem ser peptídeos mutados, produzidos pelos processos conhecidos na técnica, tais como, mutagenese direcionada ao sítio. A glicosilação dos peptídeos é tipicamente ligada em N ou ligada em O. Uma ligação em N exemplar é a anexação do açúcar modificado á cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para anexação enzimática de uma porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença destas seqüências de tripeptídeo em um peptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. Conforme descrito aqui em qualquer lugar, a glicosilação ligada em O se refere a anexação de um açúcar (por exemplo, N- acetilgalactosamina, galactose, manose, GlcNAc, glicose, fucose ou xilose) a uma cadeia de sítio hidroxila de um ácido hidróxiamino, preferivelmente serina ou treonina, embora 5-hidróxiprolina ou 5-hidróxilisina possam também ser usadas.
[00854] Várias modalidades exemplares da invenção são discutidas a seguir. Embora várias destas modalidades usem peptídeos possuindo nomes de marcas registradas e outros peptídeos específicos, como o peptídeo exemplar, estes exemplos não são confinados a qualquer peptídeo específico. As modalidades exemplares que se seguem são contempladas para incluir todos os equivalentes de peptídeo e variantes de qualquer peptídeo. Tais variantes incluem, porém não estão limitadas a adição e apagamento de sítios de glicosilação ligados em N e ligados em O e proteínas de fusão com sítios de glicosilação adicionados. Um versado na técnica apreciará que as modalidades que se seguem e os processos básicos revelados aqui podem ser aplicados a muitos peptídeos com sucesso igual.
[00855] Em uma modalidade exemplar, a presente invenção provê processos para modificação do Fator de Estimulação de Colônia de Granulócito (G-CSF). As figuras 27A a 27G estabelecem alguns exemplos de como isto é realizado usando a metodologia descrita aqui. Na figura 27B, um peptídeo G-CSF que é expresso em um sistema de célula de mamífero é retroaparado usando uma sialidase. Os resíduos assim expostos são modificados por adição de uma porção de ácido-poli(etileno glicol) (porção PEG), usando um doador apropriado para a mesma e SAT3Gal1. A figura 27C estabelece um esquema exemplar para modificação de um peptídeo G-CSF que é expresso em uma célula de inseto. O peptídeo é modificado por adição de uma porção de galactose usando um doador apropriado para o mesmo e uma galactosiltransferase. Os resíduos de galactose são funcionalizados com PEG com um derivado de ácido siálico- PEG, através da ação de ST3Gal1. Na figura 27D, G-CSF expresso bacterianamente é contatado com um doador de N- acetilgalatosamina e N-acetilgalactosamina transferase. O peptídeo é funcionalizado com PEG usando um doador de ácido siálico PEGilado e uma sialiltransferase. Na figura 27E, G- CSF expresso em célula de mamífero é contatado com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila no glicano no peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção, tal como, hidrazina ou amina-PEG. Na figura 27F, G-CSF expresso bacterianamente é remodelado por contato do peptídeo com uma enzima endo-GalNAc sob condições onde ela funciona em uma maneira sintética ao invés de hidrolítica, desta forma adicionando uma molécula PEG-Gal-GalNAc de um derivado ativado da mesma. A Figura 27G provê outra via para remodelagem de G-CSF expresso bacterianamente. O polipeptídeo é derivatizado com um resíduo de N- acetilgalactosamina PEGilada por contato do polipeptídeo com uma N-acetilgalactosamina e um doador apropriado de N- acetilgalactosamina PEGilada.
[00856] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de a-14 Interferon (IFNa14C), conforme mostrado nas figuras 28A a 28N. As várias formas de IFNa são reveladas aqui em algum lugar. Na figura 28B, IFNO.14C expresso em células de mamífero é tratado primeiramente com sialidase para retroaparar as unidades de ácido siálico e então a molécula é PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 28C, N- acetilglicosamina é adicionada primeiro ao IFNa14C que foi expresso nas células de inseto ou fungos, onde a reação é conduzida através da ação de GnT-I e/ou II usando um doador de N-acetilglicosamina. O polipeptídeo é então PEGilado usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG- galactose. Na figura 28D, IFNa14C expresso na levedura é primeiro tratado com Endo-H para retroaparar as unidades de glicosila. A molécula é galactosilada usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose, e é então PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 28F, IFNa14C produzido por células de mamíferos é modificado gradualmente para uma porção PEG usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 28G, IFNa14C expresso nas células de insetos ou fungos primeiro possui adicionada N-acetilglicosamina usando um ou mais de GnT I, II, IV e V e um doador de N-acetilglicosamina. A proteína é subseqüentemente galactosilada usando um doador apropriado e uma galactosiltransferase. Então, IFNa14C é PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 28H, levedura que produziu IFNa14C é primeiro tratada com manosidases para retroaparar os grupos manosila. N- acetilglicosamina é então adicionada usando um doador de N- acetilglicosamina e um ou mais de GnT I, II, IV e V. IFNα14C é adicionalmente galactosilado usando um doador apropriado e uma galactosiltransferase. Então, o peptídeo é PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 28I, IFNα14C expresso em célula NOS é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, desta forma adicionando uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção, tal como hidrazina ou amina-PEG. Na figura 28J, IFNα14C expresso por células mamárias é PEGilado usando um doador de PEG-ácido siálico e uma α 2,8-sialiltarnsferase. Na figura 28K, IFNα14C produzido por células de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminais, e então a molécula é PEGilada usando trans-sialidase e complexo de lactose-ácido siálico PEGilado. Na figura 28L, IFNα14C expresso em um sistema de mamíferos é sialilado usando um doador de ácido siálico e α 2,8-sialiltransferase. Na figura 28M, IFNα14C expresso nas células de inseto ou fungos primeiro possui N- acetilglicosamina adicionada usando um doador apropriado e GnT I e/ou II. A molécula é então contatada com uma galactosiltransferase e um doador de galactose que é primeiro derivatizado com um ácido siálico através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado ao ácido siálico reativo através do ligante e do resíduo de galactose. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal3 e transferrina, e assim torna-se conectado à transferrina através do resíduo de ácido siálico. Na figura 28N, IFNa14C expresso em cada célula de inseto ou fungo é primeiro tratado com endoglicanase para retroaparar os grupos glicosila e é então contatado com uma galactosiltransferase e um doador de galactose que é derivatizado com um ácido siálico reativo através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado ao ácido siálico reativo através do ligante e do resíduo de galactose. A molécula é então contatada com ST3Gal3 e transferrina e assim torna-se ligada à transferrina através do resíduo de ácido siálico.
[00857] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificar Interferon a-2a ou 2b (IFNa), conforme mostrado nas figuras 28O a 28EE. Na figura 28P, IFNa produzido nas células de mamíferos é primeiro reagido com sialidase para retroaparar as unidades de glicosila e é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 28Q, IFNa expresso nas células de inseto é primeiro galactosilado usando um doador apropriado e uma galactosiltransferase e é então PEGilado usando ST3Gal1 e um doador de ácido siálico PEGilado. A figura 28R oferece outro processo para remodelagem de IFNa expresso na bactéria: N-acetilgalactosamina PEGilada é adicionada à proteína usando um doador apropriado e N- acetilgalactosamina transferase. Na figura 28S, IFNa expresso nas células de mamíferos é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina-ou amina-PEG. Na figura 28T, IFNα expresso na bactéria é PEGilado usando uma enzima modificada Endo-N- acetilgalactosamidase, que funciona de uma maneira sintética ao invés de hidrolítica e usando doador de N- acetilgalactosamina derivatizado com uma porção PEG. Na figura 28U, N-acetilgalactosamina é primeiro adicionada ao IFNα usando um doador apropriado e N-acetilgalactosamina transferase, e então é PEGilada usando uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 28V, IFNα expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico e é então PEGilado usando um doador apropriado e ST3Gal1 e/ou ST3Gal3. Na figura 28W, IFNα expresso em células de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal1 e dois resíduos de ácido siálico reativos que são conectados através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a um ácido siálico reativo através do ligante e do segundo resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é subseqüentemente contatado com ST3Gal3 e transferrina, e assim é conectado a transferrina através do resíduo de ácido siálico. Na figura 28Y, IFNα expresso nas células de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico e é então PEGilado usando ST3Gal1 e um doador de ácido PEG-siálico. Na figura 28Z, IFNα produzido por células de inseto é PEGilado usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose PEGilada. Na figura 28α, IFNα expresso bacterianamente primeiro recebe adição de N-acetilgalactosamina usando um doador apropriado e N-acetilgalactosamina transferase. A proteína é então PEGilada usando uma sialiltransferase e um doador de PEG- ácido siálico. Na figura 28CC, IFNa expresso na bactéria é modificado em outro procedimento: N-acetilgalctosamina PEGilada é adicionada à proteína por N-acetilgalactosamina transferase usando um doador de N-acetilgalactosamina PEGilado. Na figura 28DD, IFNa expresso na bactéria é remodelado ainda em outro esquema. O polipeptídeo é primeiro contatado com N-acetilgalactosamina transferase e um doador de N-acetilgalactosamina que é derivatizado com um ácido siálico reativo através de um ligante, de modo que IFNa é anexado ao ácido siálico reativo através do ligante e da N-acetilgalactosamina. IFNa é então contatado com ST3Gal3 e asialo-transferrina, de modo que torna-se conectado a transferrina através do resíduo de ácido siálico. Então, IFNa é capeado com resíduos de ácido siálico usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Um processo adicional para modificação de IFNa expresso bacterianamente é revelado na figura 28EE, onde IFNa é primeiro exposto ao NSH-CO-ligante-SA-CMP e é então conectado a um ácido siálico reativo através do ligante. Ele é subseqüentemente conjugado com transferrina usando ST3Gal3 e transferrina.
[00858] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de β Interferon (IFN-β), conforme mostrado nas figuras 29A a 29S. Na figura 29B, IFN-β expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminais. A proteína é então PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. A figura 29C é um esquema para modificação de IFN-β produzido pelas células de inseto. Primeiro, N-acetilglicosamina é adicionada ao IFN-β usando um doador apropriado e GnT-I e/ou II. A proteína é então galactosilada usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase. Finalmente, IFN-β é PEGilado usando ST3Gal2 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 29D, IFN-β expresso na levedura é primeiro tratado com Endo-H para retroaparar suas cadeias de glicosila e é então gaalctosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase e é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 29E, IFN-β produzido por células de mamíferos é modificado por PEGilação usando St3Gal3 e um doador de ácido siálico já derivatizado com porção PEG. Na figura 29F, IFN-β expresso nas células de inseto primeiro possui N-acetilglicosamina adicionada por um ou mais de GnT I, II, IV e V usando um doador de N-acetilgicosamina e então é galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase e é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 29G, IFN-β expresso na levedura é primeiro tratado com manosidases para retroaparar as unidades manosila, então possui N-acetilglicosamina adicionada usando um doador de N-acetilglicosamina e um ou mais de GnT I, II, IV e V. A proteína é adicionalmente galactosilada usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase e é então PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 29H, IFN-β expresso em célula de mamífero é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção, tal como, hidrazina ou amina-PEG. Na figura 29I, IFN-β expresso em um sistema de mamífero é PEGilado usando um doador de PEG-ácido siálico e α 2,8- sialiltransferase. Na figura 29J, IFN-β expresso por células de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar seus resíduos de ácido siálico terminais, e então PEGilado usando transialidase e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 29K, IFN-β expresso nas células de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminais, então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico, e então sililado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 29L, IFN-β expresso nas células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase e galactosidase para retroaparar as cadeias de glicosila, então galactosilado usando um doador de galactose e uma α-galactosiltransferase e então PEGilada usando ST3Gal3 ou uma sialiltransferase e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 29M, IFN-β expresso nas células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar as unidades glicosila. Ele é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico e é então sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 29N, IFN-β expresso nas células de mamífero é modificado por capeamento dos resíduos de terminal apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição ao resíduo glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção, tal como, hidrazina ou amina-PEG. Na figura 29O, IFN-β expresso nas células de mamífero é sialilado usando um doador de ácido siálico e α 2,8 -sialiltransferase. Na figura 29Q, IFN-β produzido por células de inseto primeiro possui adicionada N-acetilglicosamina usando um doador de N-acetilglicosamina e um ou mais de GnT I, II, IV e V e é adicionalmente PEGilado usando um doador de PEG-galactose e uma galactosiltransferase. Na figura 29R, IFN-β expresso na levedura é primeiro tratado com endoglicanase para retroaparar os grupos glicosila, então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 29S, IFN-β expresso em um sistema de mamífero é primeiro contatado com ST3Gal3 3 dois resíduos de ácido siálico reativos conectados através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a um ácido siálico reativo através do ligante e o segundo resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal3 e transferrina desialilada e assim torna-se conectado à transferrina através do resíduo de ácido siálico. Então, IFN-β é adicionalmente sialilado usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3.
[00859] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação do Fator VII ou VIIa, conforme mostrado nas figuras 30A a 30D. Na figura 30B, o Fator VII ou VIIa produzido por um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminais e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 30C, o Fator VII ou VIIa expresso por células de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminais e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Adicionalmente, o polipeptídeo é sialilado com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. A figura 30D oferece outro esquema de modificação para o Fator VII ou VIIa produzido por células de mamífero: o polipeptídeo é primeiro tratado com sialidase e galactosidase para retroaparar seu ácido siálico e resíduos de galactose, então galactosilado usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado.
[00860] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de Fator IX, alguns exemplos dos quais estão incluídos nas figuras 31A a 31G. Na figura 31B, o Fator IX produzido pelas células de mamífero é tratado primeiro com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminal, e é então PEGilado com ST3Gal3 usando um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 31C, o Fator IX expresso por células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminal, ele é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico e adicionalmente sialilado usando ST3Gal1 e um doador de ácido siálico. Outro esquema para remodelagem de Fator IX produzido de células de mamíferos pode ser encontrado na figura 31D. O polipeptídeo é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminal, então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, adicionalmente sialilada usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3, e então é PEGilado usando um doador de ácido siálico PEGilado e ST3Gal1. Na figura 31E, o Fator IX que é expresso em um sistema de mamífero é PEGilado através do processo de sialidação catalisado por ST3Gal3 usando um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 31F, o Fator IX expresso em células de mamíferos é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adicionando uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção, tal como, hidrazina ou amina-PEG. A figura 31G provê um processo adicional de modificação do Fator IX. O polipeptídeo, produzido por células de mamíferos é PEGilado usando um doador de PEG- ácido siálico e α 2,8-sialiltransferase.
[00861] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação do Hormônio de Estimulação de Folículo (FSH). As figuras 32A a 32J apresentam alguns exemplos. Na figura 32B, FSH é expresso em um sistema de mamífero e modificado por tratamento de sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminal, seguido por PEGilação usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 32C, FSH expresso nas células de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico terminal, então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico e então sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. A figura 32D provê um esquema para modificar FSH expresso em um sistema de mamífero. O polipeptídeo é tratado com sialidase e galactosidase para retroaparar seu ácido siálico e resíduos de galactose, então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 32E, FSH expresso nas células de mamífero é modificado no procedimento que se segue: FSH é primeiro tratado com sialilase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG- ácido siálico e é então sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. A Figura 32F oferece outro exemplo de modificação de FSH produzido por células de mamíferos: O polipeptídeo é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 32G, FSH expresso em um sistema de mamífero é modificado em outro procedimento: o polipeptídeo é remodelado com adição de ácido siálico usando um doador de ácido siálico e uma α 2,8-sialiltransferase. Na figura 32H, FSH é expresso em células de inseto e modificado no procedimento que se segue: N-acetilglicosamina é primeiro adicionada ao FSH usando um doador de N-acetilglicosamina apropriado e um ou mais de GnTI, II, IV e V; FSH é então PEGilado usando um doador de PEG-galactose e uma galactosiltransferase. A figura 32I ilustra um esquema de modificação de FSH produzido por levedura. De acordo com este esquema, FSH é primeiro tratado com endoglicanase para retroaparar os grupos glicosila, galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e é então PEGilado com ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 32J, FSH expresso por células de mamíferos é primeiro contatado com ST3Gal3 e dois resíduos de ácido siálico reativo através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a um ácido siálico reativo através do ligante e um segundo resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal1 e gonadotrofina coriônica desialilada (CG) produzida em CHO, e assim fica conectado com CG através do segundo resíduo de ácido siálico. Então, FSH é sialilado usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3 e/ou ST3Gal1.
[00862] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de eritropoietina (EPO), as figuras 33Aa 33J estabelecem alguns exemplos que são relevantes para remodelagem de ambos peptídeos de EPO do tipo selvagem e mutante. Na figura 33B, EPO expresso em vários sistemas de mamíferos é remodelado por contato da proteína expressa com uma sialidase para remover resíduos terminais de ácido siálico. O peptídeo resultante é contatado com uma sialiltransferase e um CMP-ácido siálico que é derivatizado com uma porção PEG. Na figura 33C, EPO que é expresso em células de inseto é remodelado com N- acetilglicosamina, usando GnT I e/ou GnT II. Galactose é então adicionada ao peptídeo, usando galactosiltransferase. Grupo PEG é adicionado ao peptídeo remodelado por contato do mesmo com uma sialiltransferase e um CMP- ácido siálico que é derivatizado com uma porção PEG. Na figura 33D, EPO que é expresso em um sistema de célula de mamífero é remodelado por remoção porções de ácido siálico terminal através da ação de uma sialidase. Galactose é adicionada ao aos terminais expostos recentemente, usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose. Os resíduos de galactose terminal das unidades de glicosila ligadas em N são "capeados" com ácido siálico, usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Os resíduos de galactose terminal são funcionalizados com a ácido siálico portando uma porção PEG, usando um doador apropriado de ácido siálico e ST3Gal1. Na figura 33E, EPO que é expresso em um sistema de célula de mamífero é remodelado por funcionalização os resíduos de glicosila ligados em N com a Porção de ácido siálico derivatizada com PEG. O peptídeo é contatado com ST3Gal3 e um doador apropriadamente modificado de ácido siálico. Na figura 33F, EPO que é expresso em um sistema de célula de inseto é remodelado por adição de um ou mais dos resíduos de N-acetilglicosamina terminal por contato do peptídeo com a doador de N-acetilglicosamina e de um ou mais dos GnTI, GnTII e GnTV. O peptídeo é então PEGilado por contato do mesmo com a doador PEGilado de galactose e uma galactosiltransferase. Na figura 33G, EPO que é expresso em um sistema de célula de inseto é remodelado por adição de resíduos de N-acetilglicosamina terminal, usando um doador de N-acetilglicosamina apropriado e um ou mais de GnTI, GnTII e GnTV. A galactosidase que é feita para operar em uma maneira sintética, ao invés de hidrolítica é utilizada para adicionar um doador ativado PEGilado de galactose aos resíduos de N-acetilglicosamina. Na figura 33H, um EPO mutante expresso em células de mamíferos é remodelado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. A figura 33I estabelece uma passagem de modelagem exemplar para um mutante EPO que é expresso em um sistema de célula de mamífero. PEG é adicionado ao resíduo de glicosila usando um Ácido siálico modificado com PEG e uma α 2,8-sialiltransferase. A figura 33J estabelece outra passagem de remodelagem exemplar para um mutante EPO que é expresso em um sistema de célula de mamífero. O ácido siálico é adicionado ao resíduo de glicosila com um doador de ácido siálico e uma α 2,8- sialiltransferase.
[00863] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), conforme mostrado nas figuras 34A a 34K. Na figura 34B, GM-CSF expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG- ácido siálico. Na figura 34C, GM-CSF expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico, e então é adicionalmente sialilado usando um doador de ácido siálico e ST3Gal1 e/ou ST3Gal3. Na figura 34D, GM-CSF expresso em células NSO é primeiro tratado com sialidase e α-galactosidase para retroaparar os grupos glicosila, então sialilado usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3, e é então PEGilado usando ST3Gal1 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 34E, GM-CSF expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico, então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG- ácido siálico, e então é adicionalmente sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 34F, GM-CSF expresso em células de mamíferos é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 34G, GM-CSF expresso em células de mamíferos é sialilado usando um doador de ácido siálico e α 2,8-sialiltransferase. Na figura 34I, GM-CSF expresso em células de inseto é modificado por adição de N- acetilglicosamina usando um doador apropriado e um ou mais de GnT I, II, IV, e V, seguido por adição de galactose PEGilada usando um doador apropriado e uma galactosiltransferase. Na figura 34J, GM-CSF expresso em levedura é primeiro tratado com endoglicanase e/ou manosidase para retroaparar as unidades de glicosila, e subseqüentemente PEGilado usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 34K, GM-CSF expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico, e é sialilado subseqüentemente usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal1 e dois resíduos de ácido siálico reativo conectados através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a um ácido siálico reativo através do ligante e segundo resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é adicionalmente contatado com ST3Gal3 e transferrina, e assim fica conectado com transferrina.
[00864] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de y Interferon (IFNy). As figuras 35A a 35N contêm alguns exemplos. Na figura 35B, IFNy expresso em uma variedade de células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos terminais de ácido siálico, e é subseqüentemente PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 35C, IFNy expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos terminais de ácido siálico. O polipeptídeo é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico, e é adicionalmente sialilado com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 35D, IFNy expresso em célula de mamífero é primeiro tratado com sialidase e a-galactosidase para retroaparar resíduos de ácido siálico e galactose. O polipeptídeo é então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase. Então, IFNy é PEGilado usando um doador de PEG-ácido siálico e ST3Gal3. Na figura 35E, IFNy que é expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos terminais de ácido siálico. O polipeptídeo é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico, e é adicionalmente sialilado com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. A figura 35F descreve outro método para modificação de IFNy expresso em um sistema de mamífero. A proteína é modificada por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 35G, IFNy expresso em células de mamíferos é remodelado por adição de ácido siálico usando um doador de ácido siálico e uma α 2,8-sialiltransferase. Na figura 35I, IFNy expresso em células de inseto ou fungos é modificado por adição de N-acetilglicosamina usando um doador apropriado e um ou mais de GnTI, II, IV, e V. A proteína é adicionalmente modificada por adição de porções PEG usando um doador de galactose PEGilada e uma galactosiltransferase. A figura 35J oferece um processo para modificação de IFNy expresso em levedura. O polipeptídeo é primeiro tratado com endoglicanase para retroaparar as cadeias de sacarídeo, e então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase. Então, IFNy é PEGilado usando um doador de ácido siálico PEGilado e ST3Gal3. Na figura 35K, IFNy produzido por células de mamíferos é modificado como se segue: o polipeptídeo é primeiro contatado com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico que é derivatizado com uma galactose reativa através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado à galactose reativa através do ligante e resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com a galactosiltransferase e transferrina pré- tratadas com endoglicanase, e assim fica conectado com transferrina através do resíduo de galactose. No esquema ilustrado pela Figura 35L, IFNy, que é expresso em um sistema de mamífero, é modificado através da ação de ST3Gal3: ácido siálico PEGilado é transferido de um doador apropriado para IFN. A figura 35M é um exemplo de modificação de IFNy expresso em células de inseto ou fungos, onde PEGilação do polipeptídeo é obtida por transferência N-acetilglicosamina PEGilada de um doador para IFNy usando GnT I e/ou II. Na figura 35N, IFNy expresso em um sistema de mamífero é remodelado com adição de ácido siálico PEGilado usando um doador apropriado e uma α 2,8-sialiltransferase.
[00865] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de α1 anti-tripsina (inibidor de α1-protease). Alguns de tais exemplos podem ser encontrados na figuras 36A a 36O. Na figura 36B, α1 anti-tripsina expressa em uma variedade de células de mamíferos é primeiro tratada com sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico. Resíduos PEGilados de ácido siálico são então adicionados usando um doador apropriado, tal como CMP-SA-PEG, e uma sialiltransferase, tal como ST3Gal3. A figura 36C demonstra outro esquema de modificação de α1 anti-tripsina. α1 anti-tripsina expressa em um sistema de mamífero é primeiro tratada com sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico. Resíduos de ácido siálico derivatizados com PEG são então adicionados usando um doador apropriado e uma sialiltransferase, tal como ST3Gal3. Subseqüentemente, a molécula é adicionalmente modificada por adição de resíduos de ácido siálico usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3. Na figura 36D, α1 anti-tripsina expressa em célula de mamífero é primeiro tratada com sialidase e uma galactosidase para retroaparar terminal ácido siálico e resíduos de galactose de ligação α. O polipeptídeo é então galactosilado usando galactosiltransferase e um doador apropriado de galactose. Adicionalmente, ácido siálico derivatizado com PEG é adicionado por ação de ST3Gal3 usando um doador PEGilado de ácido siálico. Na figura 36E, α1 anti-tripsina expressa em um sistema de mamífero primeiro tem os resíduos terminais de ácido siálico retroaparados usando sialidase. PEG é então adicionado a Resíduos de glicosila ligados em N através da ação de ST3Gal3, que media a transferência de ácido siálico PEGilado de um doador, tal como CMP-SA-PEG, para α1 anti-tripsina. Mais resíduos de ácido siálico são subseqüentemente anexados usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3. A figura 36F ilustra outro processo através do qual α1 anti-tripsina é remodelada. α1 anti-tripsina expressa em células de mamíferos é modificada por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 36G, ainda outro método de modificação de α1 anti-tripsina é revelado. α1 anti-tripsina obtida de um sistema de expressão de mamífero é remodelada com adição de ácido siálico usando um doador de ácido siálico e uma α 2,8-sialiltransferase. Na figura 36I, α1 anti-tripsina é expressa em células de inseto ou levedura, e remodelada por adição de resíduos de N-acetilglicosamina terminal por meio de contato do polipeptídeo com UDP-N-acetilglicosamina e um ou mais de GnT I, II, IV ou V. Então, o polipeptídeo é modificado com porções PEG usando um doador de galactose PEGilada e uma galactosiltransferase. Na figura 36J, α1 anti-tripsina expressa em células de levedura é tratada primeiro com endoglicanase para retroaparar cadeias de glicosila. Ela é então galactosilada com a galactosiltransferase e um doador de galactose. Então, o polipeptídeo é PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG- ácido siálico. Na figura 36K, a1 anti-tripsina é expressa em um sistema de mamífero. O polipeptídeo é primeiro contatado com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico que é derivatizado com uma galactose reativa através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a galactose reativa através do ligante e resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com a galactosiltransferase e transferrina pré-tratada com endoglicanase, e assim fica conectado com transferrina através do resíduo de galactose. Na figura 36M, al anti-tripsina expressa em levedura é primeiro tratada com endoglicanase para retroaparar seus grupos glicosila. A proteína é então PEGilada usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose com uma porção PEG. Na figura 36N, al anti-tripsina expressa em células de planta é tratada com hexosaminidase, manosidase, e xilosidase para retroaparar suas cadeias de glicosila, e subseqüentemente modificada com N-acetilglicosamina derivatizada com uma porção PEG, usando N-acetilglicosamina transferase e um doador apropriado. Na figura 36O, al anti- tripsina expressa em células de mamíferos é modificada por adição de resíduos PEGilados de ácido siálico usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico derivatizados com PEG.
[00866] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de glicocerebrosidase(β- glicosidase, Cerezyme™ ou Ceredase™) conforme mostrado na figuras 37A a 37K. Na figura 37B, Cerezyme™ expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos terminais de ácido siálico, e é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 37C, Cerezyme™ expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, então tem o grupo manose-6-fosfato anexado usando ST3Gal3 e um ácido siálico reativo derivatizado com manose-6-fosfato, e então é sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 37D, Cerezyme™ expresso em célula NSO é primeiro tratado com sialidase e galactosidase para retroaparar os grupos glicosila, e é então galactosilado usando um doador de galactose e uma α-galactosiltransferase. Então, a porção manose-6-fosfato é adicionada à molécula usando ST3Gal3 e um ácido siálico reativo derivatizado com manose-6-fosfato. Na figura 37E, Cerezyme™ expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico, e é então sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 37F, Cerezyme™ expresso em células de mamíferos é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como um ou mais dos grupos manose-6-fosfato. Na figura 37G, Cerezyme™ expresso em células de mamíferos é sialilado usando um doador de ácido siálico e α 2,8-sialiltransferase. Na figura 37I, Cerezyme™ expresso em células de inseto primeiro tem a N- acetilglicosamina adicionada usando um doador apropriado e um ou mais de GnTI, II, IV, e V, e então é PEGilado usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 37J, Cerezyme™ expresso em levedura é primeiro tratado com endoglicanase para retroaparar os grupos glicosila, então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 37K, Cerezyme™ expresso em células de mamíferos é primeiro contatado com ST3Gal3 e dois resíduos de ácido siálico reativo conectados através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a um ácido siálico reativo através do ligante e o segundo resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal3 e transferrina desialilada, e assim fica conectado com transferrina. Então, o polipeptídeo é sialilado usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3.
[00867] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de Ativador de Plasminogênio do Tipo de Tecido (TPA) e seu mutante. Vários esquemas de modificação específicos são apresentados nas figuras 38A a 38W. A figura 38B ilustra um procedimento de modificação: após TPA é expresso por células de mamíferos, é tratado com um ou mais de manosidase(s) e sialidase para retroaparar manosila e/ou resíduos de ácido siálico. N- acetilglicosamina terminal é então adicionada por contato do polipeptídeo com a doador apropriado de N- acetilglicosamina e um ou mais de GnT I, II, IV, e V. TPA é adicionalmente galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase. Então, PEG é anexado à molécula por meio de sialilação catalisada por ST3Gal3 e usando um doador de ácido siálico derivatizado com uma porção PEG. Na figura 38C, TPA é expresso em células de inseto ou fungos. A modificação inclui as etapas de adição de N-acetilglicosamina usando um doador apropriado de N- acetilglicosamina e GnT I e/ou II; galactosilação usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase; e anexação de PEG por meio de sialilação usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico derivatizados com PEG. Na figura 38D, TPA é expresso em levedura e subseqüentemente tratado com endoglicanase para retroaparar as cadeias de sacarídeo. O polipeptídeo é adicionalmente PEGilado através da ação de uma galactosiltransferase, que catalisa a transferência de uma PEG-galactose de um doador para TPA. Na figura 38E, TPA é expresso em células de inseto ou levedura. O polipeptídeo é então tratado com α- e β-manosidases para retroaparar resíduos de manosila terminal. Adicionalmente, porções PEG são anexadas à molécula através da transferência de PEG- galactose de um doador apropriado para TPA, que é mediada por uma galactosiltransferase. A figura 38F fornece um processo diferente para modificação de TPA obtido de um sistema de inseto ou levedura: o polipeptídeo é remodelado por adição de N-acetilglicosamina usando um doador de N- acetilglicosamina e GnT I e/ou II, seguido por PEGilação usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose PEGilada. A figura 38G oferece outro esquema para remodelagem de TPA expresso em células de inseto ou levedura. N-acetilglicosamina terminal é adicionada usando um doador de N-acetilglicosamina e GnT I e/ou II. A galactosidase que é modificada para operar em uma maneira sintética, ao invés de hidrolítica, é utilizada para adicionar galactose PEGilada de um doador próprio aos resíduos de N-acetilglicosamina. Na figura 38I, TPA expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase e galactosidase para retroaparar resíduos de ácido siálico e galactose. O polipeptídeo é adicionalmente modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 38J, TPA, que é expresso em um sistema de mamífero, é remodelado seguindo este esquema: primeiro, o polipeptídeo é tratado com α e β- manosidases para retroaparar os resíduos de manosila terminal; resíduos de ácido siálico são então anexados aos resíduos de galactosila terminal usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3; adicionalmente, TPA é PEGilado através da transferência de galactose PEGilada de um doador para o resíduo de N-acetilglicosaminila catalisada por uma galactosiltransferase. Na figura 38K, TPA é expresso em sistema de planta. O procedimento de modificação neste exemplo é como se segue: TPA é primeiro tratado com hexosaminidase, manosidase, e xilosidase para retroaparar seus grupos glicosila; N-acetilglicosamina PEGilada é então adicionada ao TPA usando um doador próprio e N- acetilglicosamina transferase. Na figura 38M, um TPA mutante (TNK TPA), expresso em células de mamíferos, é remodelado. Resíduos terminais de ácido siálico são primeiro retroaparados usando sialidase; ST3Gal3 é então usado para transferir ácido siálico PEGilado de um doador para TNK TPA, tal que o polipeptídeo é PEGilado. Na figura 38N, TNK TPA expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos terminais de ácido siálico. A proteína é então PEGilada usando CMP- SA-PEG como um doador e ST3Gal3, e adicionalmente sialilada usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3. Na figura 380, TNK TPA expresso em célula NSO é primeiro tratado com sialidase e α-galactosidase para retroaparar resíduos terminais de ácido siálico e galactose. TNK TPA é então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase. A última etapa neste esquema de remodelagem é a transferência de ácido siálico derivatizado com porção PEG de um doador para TNK TPA usando sialiltransferase ou ST3Gal3. Na figura 38Q, TNK TPA é expresso em um sistema de mamífero e é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos terminais de ácido siálico. A proteína é então PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Então, a proteína é sialilada usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3. Na figura 38R, TNK TPA expresso em um sistema de mamífero é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 38S, TNK TPA expresso em células de mamíferos é modificado através um processo diferente: o polipeptídeo é remodelado com adição de ácido siálico usando um doador de ácido siálico e a2,8- sialiltransferase. Na figura 38U, TNK TPA expresso em células de inseto é remodelado por adição de N- acetilglicosamina usando um doador apropriado e um ou mais de GnT I, II, IV, e V. A proteína é adicionalmente modificada por adição de porções PEG usando um doador de galactose PEGilada e uma galactosiltransferase. Na figura 38V, TNK TPA é expresso em levedura. O polipeptídeo é primeiro tratado com endoglicanase para retroaparar suas cadeias de glicosila e então PEGilado usando um doador de galactose derivatizado com PEG e uma galactosiltransferase. Na figura 38W, TNK TPA é produzido em um sistema de mamífero. O polipeptídeo é primeiro contatado com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico que é derivatizado com uma galactose reativa através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a galactose reativa através do ligante e resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com a galactosiltransferase e uma quimera anti- TNF IG produzida em CHO, e assim fica conectado com a quimera através do resíduo de galactose.
[00868] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de Interleucina-2 (IL-2). As figuras 39A a 39G fornecem alguns exemplos. A figura 39B fornece um esquema de modificação de duas etapas: IL-2 produzido por células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar seus resíduos terminais de ácido siálico, e é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 39C, IL-2 expresso em célula de inseto é modificado primeiro por galactosilação usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase. Subseqüentemente, IL-2 é PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 39D, IL-2 expresso em bactéria é modificado com N-acetilgalactosamina usando um doador próprio e N- acetilgalactosamina transferase, seguido por uma etapa de PEGilação com a PEG- doador de ácido siálico e uma sialiltransferase. A figura 39E oferece outro esquema de modificação de IL-2 produzido por um sistema de mamífero. O polipeptídeo é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. A figura 39F ilustra um exemplo de remodelagem de IL-2 expresso por E. coli. O polipeptídeo é PEGilado usando um complexo reativo de N-acetilgalactosamina derivatizado com um grupo PEG e uma enzima que é modificada de modo que funciona como uma enzima sintética ao invés de hidrolítica. Na figura 39G, IL-2 expresso por bactéria é modificado por adição de N-acetilgalactosamina PEGilada usando um doador próprio e N-acetilgalactosamina transferase.
[00869] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de Fator VIII, conforme mostrado nas figuras 40A a 40N. Na figura 40B, Fator VIII expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, e é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 40C, Fator VIII expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador próprio, e é então adicionalmente sialilado usando ST3Gal1 e um doador de ácido siálico.
[00870] Na figura 40E, Fator VIII produzido em célula de mamífero é modificado por etapa simples de PEGilação, usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. A figura 40F oferece outro exemplo de modificação de Fator VIII que é expresso por células de mamíferos. A proteína é PEGilada usando ST3Gal1 e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 40G, Fator VIII expresso em célula de mamífero é remodelado seguindo outro esquema: ele é PEGilado usando uma 2,8-sialiltransferase e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 40I, Fator VIII produzido por células de mamíferos é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 40J, Fator VIII expresso por células de mamíferos é primeiro tratado com Endo-H para retroaparar grupos glicosila. Ele é então PEGilado usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 40K, Fator VIII expresso em um sistema de mamífero é primeiro sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico, então tratado com Endo-H para retroaparar os grupos glicosila, e então PEGilado com a galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 40L, Fator VIII expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com manosidases para retroaparar resíduos de manosila terminal, então possui grupo N- acetilglicosamina adicionado usando um doador apropriado e GnT I e/ou II, e então é PEGilado usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 40M, Fator VIII expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com manosidases para retroaparar unidades de manosila, então tem Grupo N-acetilglicosamina adicionado usando N-acetilglicosamina transferase e um doador apropriado. Ele é adicionalmente galactosilado usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose, e então sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 40N, Fator VIII é produzido por células de mamíferos e modificado como se segue: ele é primeiro tratado com manosidases para retroaparar os grupos manosila terminal. Um grupo N-acetilglicosamina PEGilada é então adicionado usando GnTI e um doador apropriado de N-acetilglicosamina PEGilada.
[00871] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de uroquinase, conforme mostrado nas figuras 41A a 41M. Na figura 41B, uroquinase expressa em células de mamíferos é primeiro tratada com sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico, e é então PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 41C, uroquinase expressa em células de mamíferos é primeiro tratada com sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico, então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico PEGilado, e então sialilada usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 41D, uroquinase expressa em um sistema de mamífero é primeiro tratada com sialidase e galactosidase para retroaparar cadeias de glicosila, então galactosilada usando um doador de galactose e uma α-galactosiltransferase, e então PEGilada usando ST3Gal3 ou sialiltransferase e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 41E, uroquinase expressa em células de mamíferos é primeiro tratada com sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico, então PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico, e então adicionalmente sialilada usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 41F, uroquinase expressa em células de mamíferos é modificada por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 41G, uroquinase expressa em células de mamíferos é sialilada usando um doador de ácido siálico e α 2,8-sialiltransferase. Na figura 41I, uroquinase expressa em células de inseto é modificada nas seguintes etapas: primeiro, N-acetilglicosamina é adicionada ao polipeptídeo usando um doador apropriado de N-acetilglicosamina e um ou mais de GnTI, II, IV e V; então galactose PEGilada é adicionada, usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 41J, uroquinase expressa em levedura é primeiro tratada com endoglicanase para retroaparar grupos glicosila, então galactosilada usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e então PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 41K, uroquinase expressa em células de mamíferos é primeiro contatada com ST3Gal3 e dois resíduos de ácido siálico reativo que são conectados através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a um ácido siálico reativo através do ligante e segundo resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal1 e uroquinase desialilada produzida em células de mamíferos, e assim fica conectado com uma segunda molécula de uroquinase. Então, toda a molécula é adicionalmente sialilada usando um doador siálico e ST3Gal1 e/ou ST3Gal3. Na figura 41L, uroquinase isolada é primeiro tratada com sulfohidrolase para remover grupos sulfato, e é então PEGilada usando um sialiltransferase e um doador de PEG- ácido siálico. Na figura 41M, uroquinase isolada é primeiro tratada com sulfohidrolase e hexosaminidase para remover grupos sulfato grupos hexosamina, e então PEGilada usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose.
[00872] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de DNase I, conforme mostrado nas figuras 42A a 42K. Na figura 42B, DNase I é expressa em um sistema de mamífero e modificada nas etapas que se seguem: primeiro, a proteína é tratada com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico; então a proteína é PEGilada com ST3Gal3 usando um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 42C, DNase I expressa em células de mamíferos é primeiro tratada com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, então PEGilada com ST3Gal3 usando um PEG-doador de ácido siálico, e é então sialilada usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 42D, DNase I expressa em um sistema de mamífero é primeiro exposta a sialidase e galactosidase para retroaparar os grupos glicosila, então galactosilada usando um doador de galactose e uma α-galactosiltransferase, e então PEGilada usando ST3Gal3 ou sialiltransferase e um doador de PEG- ácido siálico. Na figura 42E, DNase I expressa em células de mamíferos é primeiro tratada com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, então PEGilada usando ST3Gal3 e um PEG-doador de ácido siálico, e então sialilada com ST3Gal3 usando um doador de ácido siálico. Na figura 42F, DNase I expressa em células de mamíferos é modificada por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 42G, DNase I expressa em células de mamíferos é sialilada usando um doador de ácido siálico e α 2,8-sialiltransferase. Na figura 42I, DNase I expressa em células de inseto primeiro tem N- acetilglicosamina adicionada usando um doador apropriado e um ou mais de GnT I, II, IV, e V. A proteína é então PEGilada usando um galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 42J, DNase I expressa em levedura é primeiro tratada com endoglicanase para retroaparar as unidades de glicosila, então galactosilada usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e então PEGilada usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 42K, DNase I expressa em células de mamíferos é primeiro contatada com ST3Gal3 e dois resíduos de ácido siálico reativo conectados através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado a um ácido siálico reativo através do ligante e do segundo resíduo de ácido siálico. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal1 e inibidor de a- 1-protase desialilada, e assim fica conectado ao inibidor através da resíduo de ácido siálico. Então, o polipeptídeo é adicionalmente sialilado usando um doador apropriado e ST3Gal1 e/ou ST3Gal3.
[00873] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de insulina que é mutada para conter Sítio de N glicosilação, conforme mostrado nas figuras 43A a 43L. Na figura 43B, insulina expressa em um sistema de mamífero é primeiro tratada com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, e então PEGilada usando ST3Gal3 e um PEG-doador de ácido siálico. Na figura 43C, insulina expressa em células de inseto é modificada por adição de N-acetilglicosamina PEGilada usando um doador apropriado e GnT I e/ou II. Na figura 43D, insulina expressa em levedura é primeiro tratada com Endo-H para retroaparar os grupos glicosila, e então PEGilada usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 43F, insulina expressa em células de mamíferos é primeiro tratada com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico e então PEGilada usando ST3Gal1 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 43G, insulina expressa em células de inseto é modificada por adição de galactose PEGilada usando um doador apropriado e uma galactosiltransferase. Na figura 43H, insulina expressa em bactéria primeiro tem N-acetilgalactosamina adicionada usando um doador próprio e N-acetilgalactosamina transferase. O polipeptídeo é então PEGilado usando uma sialiltransferase e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 43J, insulina expressa em bactéria é modificada através de um processo diferente: N-acetilgalactosamina PEGilada é adicionada à proteína usando um doador apropriado e N-acetilgalactosamina transferase. Na figura 43K, insulina expressa em bactéria é modificada seguindo outro esquema: o polipeptídeo é primeiro contatado com N- acetilgalactosamina transferase e uma N-acetilgalactosamina reativa que é derivatizada com a ácido siálico reativo através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado ao ácido siálico reativo através do ligante e N- acetilgalactosamina. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal3 e asialo-transferrina, e após isto, fica conectado com transferrina. Então, o polipeptídeo é sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 43L, insulina expressa em bactéria é modificado usando ainda outro método: o polipeptídeo é primeiro exposto ao NHS-CO- ligante-SA-CMP e fica conectado ao resíduo do ácido siálico reativo através do ligante. O polipeptídeo é então conjugado à transferrina usando ST3Gal3 e asialo- transferrina. Então, o polipeptídeo é adicionalmente sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico.
[00874] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de antígeno de Hepatite B (antígeno M - pre S2 e S), conforme mostrado na figuras 44A a 44K. Na figura 44B, antígeno M é expresso em um sistema de mamífero e modificado por tratamento inicial de sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico e subsequente conjugação lipídeo A, usando ST3Gal3 e um ácido siálico reativo ligado ao lipídeo A através de um ligante. Na figura 44C, Antígeno M expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos terminais de ácido siálico, então conjugado com toxina do tétano através de um ligante usando ST3Gal1 e um resíduo do ácido siálico reativo ligado a toxina através do ligante, e então sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 44D, antígeno-M expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com uma galactosidase para retroaparar resíduos de galactosila e então sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. O polipeptídeo então tem o ácido siálico derivatizado com KLH adicionado usando ST3Gal1 e um doador apropriado. Na figura 44E, antígeno M expresso em levedura é primeiro tratado com uma manosidase para retroaparar os resíduos de manosila, e então conjugado à uma toxina de difteria usando GnT I e um doador de N-acetilglicosamina ligado a toxina de difteria. Na figura 44F, antígeno M expresso em célula de mamífero é modificado por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila do peptídeo, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina- ou amina-PEG. Na figura 44G, o antígeno M obtido de um sistema de mamífero é remodelado por sialilação usando um doador de ácido siálico e poli α 2,8-sialiltransferase. Na figura 44I, antígeno M expresso em células de inseto é conjugado a proteína Neisseria usando GnT II e um doador apropriado de N-acetilglicosamina ligado a proteína Neisseria. Na figura 44J, o antígeno M expresso em levedura é primeiro tratado com endoglicanase para retroaparar suas cadeias de glicosila, e então conjugado à a proteína Neisseria usando uma galactosiltransferase e um doador próprio de galactose ligado a proteína Neisseria. A figura 44K é outro exemplo de modificação de antígeno M expresso em levedura. O polipeptídeo é primeiro tratado com manosidases para retroaparar resíduos de manosila terminal, e então tem N- acetilglicosamina adicionada usando GnT I e/ou II. Subseqüentemente, o polipeptídeo é galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e então capeado com resíduos de ácido siálico usando uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico.
[00875] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de hormônio do crescimento humano (variantes N, V, e do mesmo), conforme mostrado na figuras 45A a 45K. Na figura 45B, hormônio do crescimento humano tanto mutado para conter um sítio ligado em N quanto ocorrendo em isoforma natural que possui um lado ligado em N (isto é, a enzima placentária) produzido por células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar resíduos terminais de ácido siálico e subseqüentemente PEGilado com ST3Gal3 e usando um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 45C, hormônio do crescimento humano expresso em células de inseto é modificado por adição de N- acetilglicosamina PEGilada usando GnT I e/ou II e um doador próprio de N-acetilglicosamina PEGilada. Na figura 45D, hormônio do crescimento humano é expresso em levedura, tratado com Endo-H para retroaparar grupos glicosila, e adicionalmente PEGilado com uma galactosiltransferase usando um doador de galactose PEGilada. Na figura 45F, proteína de fusão de hormônio do crescimento humano-mucina expressa em um sistema de mamífero é modificado por tratamento inicial da sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico e subsequente PEGilação usando um doador de PEG-ácido siálico e ST3Gal1. Na figura 45G, proteína de fusão de hormônio do crescimento humano-mucina expressa em células de inseto é remodelado por PEGilação com uma galactosiltransferase e usando um doador de galactose PEGilada. Na figura 45H, proteína de fusão de hormônio do crescimento humano-mucina é produzida em bactéria. N- acetilgalactosamina é primeiro adicionada a proteína de fusão por ação de N-acetilgalactosamina transferase usando um doador de N-acetilgalactosamina, seguido por PEGilação da proteína de fusão usando um doador de PEG-ácido siálico e uma sialiltransferase. A figura 45I descreve outro esquema de modificação de proteína de fusão de hormônio do crescimento humano-mucina: a proteína de fusão é PEGilada através da ação de N-acetilgalactosamina transferase usando um doador de N- acetilgalactosamina PEGilado. A figura 45J fornece adicionalmente um esquema de remodelagem para proteína de fusão de hormônio do crescimento humano-mucina. A proteína de fusão é primeiro contatada com N- acetilgalactosamina transferase e um doador de N- acetilgalactosamina que é derivatizado com a ácido siálico reativo através de um ligante, de modo que a proteína de fusão é anexada ao ácido siálico reativo através do ligante e N-acetilgalactosamina. A proteína de fusão é então contatada com uma sialiltransferase e asialo-transferrina, e assim fica conectada com transferrina através do resíduo de ácido siálico. Então, a proteína de fusão é capeada com resíduos de ácido siálico usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico. Na figura 45K, é fornecido ainda outro esquema para modificação de hormônio do crescimento humano(N) produzido em bactérias. O polipeptídeo é primeiro contatado com NHS-CO-ligante-SA-CMP e fica acoplado ao ácido siálico reativo através do ligante. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal3 e asialo-transferrina e liga-se à transferrina através do resíduo de ácido siálico. Então, o polipeptídeo é sialilado usando ST3Gal3 e um doador de ácido siálico.
[00876] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para remodelação de Proteína de fusão de IgG receptor de TNF (TNFR-IgG, ou Enbrel™), conforme mostrado na figuras 46A a G. A figura 46B ilustra um procedimento de modificação onde TNFR-IgG, expresso em um sistema de mamífero é primeiro sialilado com um doador de ácido siálico e uma sialiltransferase, ST3Gal1; a proteína de fusão é então galactosilada com um doador de galactose e uma galactosiltransferase; então, a proteína de fusão é PEGilada através da ação de ST3Gal3 e um doador de ácido siálico derivatizado com PEG. Na figura 46C, TNFR-IgG expresso em células de mamíferos é inicialmente tratado com sialidase para retroaparar resíduos de ácido siálico. Porções PEG são subseqüentemente anexadas ao TNFR-IgG por meio de transferência de ácido siálico PEGilado de um doador para a proteína de fusão em uma reação catalisada por ST3Gal1. Na figura 46D, TNFR-IgG é expresso em um sistema de mamífero e modificado por adição de PEG através do processo de galactosilação, que é mediado por uma galactosiltransferase usando um PEG-doador de galactose. Na figura 46E, TNFR-IgG é expresso em um sistema de mamífero. A primeira etapa na remodelagem de uma proteína de fusão é a adição de resíduos ligados em O de ácido siálico usando um doador de ácido siálico e uma sialiltransferase, ST3Gal1. Subseqüentemente, galactose PEGilada é adicionada a proteína de fusão usando uma galactosiltransferase e um doador apropriado de galactose com porção PEG. Na figura 46F, TNFR-IgG expresso em células de mamíferos é modificado primeiro por capeamento de resíduos terminais apropriados com um doador de ácido siálico que é modificado com ácido levulínico, adição de uma cetona reativa ao doador de ácido siálico. Após adição a um resíduo de glicosila de uma proteína de fusão, a cetona é derivatizada com uma porção tal como uma hidrazina-ou amina-PEG. Na figura 46G, TNFR- IgG expresso em células de mamíferos é remodelado por 2,8- sialiltransferase, que catalisa a reação na qual ácido siálico PEGilado é transferido para a proteína de fusão de um doador de ácido siálico com porção PEG.
[00877] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para geração de conjugados de Herceptin™, conforme mostrado nas figuras 47A a 47D. Na figura 47B, Herceptin™ é expresso em um sistema de mamífero e é primeiro galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase. Herceptin™ é então conjugado com uma toxina através de ácido siálico por ação de ST3Gal3 usando um complexo de toxina reativo com ácido siálico. Na figura 47C, Herceptin™ produzido em células de mamíferos ou fungos é conjugado à toxina através do processo de galactosilação, usando uma galactosiltransferase e um complexo de toxina- galactose reativo. A figura 47D contém outro esquema para fabricação de conjugados de Herceptin™: Herceptin™ produzida em fungos é primeiro tratado com Endo-H para retroaparar grupos glicosila, então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e então conjugado com um radioisótopo por meio de sialilação, por uso de ST3Gal3 e um complexo de radioisótopo reativo com ácido siálico.
[00878] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para fabricação de Synagis™, conforme mostrado nas figuras 48A a 48D. Na figura 48B, Synagis™ expresso em células de mamíferos é primeiro galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 48C, Synagis™ expresso em células de mamíferos ou fungos é PEGilado usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 48D, Synagis™ expresso é primeiro tratado com Endo-H para retroaparar os grupos glicosila, então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e é então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico.
[00879] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para geração de conjugados de Remicade™, conforme mostrado nas figuras 49A a 49D. Na figura 49B, Remicade™ expresso em um sistema de mamífero é primeiro galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e então PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 49C, Remicade™ expresso em um sistema de mamífero é modificado por adição de galactose PEGilada usando um doador apropriado e uma galactosiltransferase. Na figura 49D, Remicade™ expresso em fungos é primeiro tratado com Endo-H para retroaparar as cadeias de glicosila, então galactosilado usando um doador de galactose e uma galactosiltransferase, e então conjugado a um radioisótopo usando ST3Gal3 e um ácido siálico reativo derivatizado com o radioisótopo.
[00880] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para modificação de Reopro, que é mutado para conter um sítio de N glicosilação. As figuras 50A a 50L contêm tais exemplos. Na figura 50B, Reopro expresso em um sistema de mamífero é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico, e o PEGilado usando ST3Gal3 e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 50C, Reopro expresso em células de inseto é modificado por adição de N-acetilglicosamina PEGilada usando um doador apropriado e GnT I e/ou II. Na figura 50D, Reopro expresso em levedura é primeiro tratado com Endo-H para retroaparar os grupos glicosila. Subseqüentemente, a proteína é PEGilada usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 50F, Reopro expresso em células de mamíferos é primeiro tratado com sialidase para retroaparar os resíduos de ácido siálico e então PEGilado com ST3Gal1 usando um doador de ácido siálico PEGilado. Na figura 50G, Reopro expresso em células de inseto é modificado por PEGilação usando uma galactosiltransferase e um doador de PEG-galactose. Na figura 50H, Reopro expresso em bactérias primeiro tem N-acetilgalactosamina adicionado usando N- acetilgalactosamina transferase e um doador apropriado. A proteína é então PEGilada usando uma sialiltransferase e um doador de PEG-ácido siálico. Na figura 50J, Reopro expresso em bactéria é modificado em um esquema diferente: ele é PEGilado através da ação de N-acetilgalactosamina transferase, usando um doador de N-acetilgalactosamina PEGilada. Na figura 50K, Reopro bacterialmente expresso é modificado ainda por outro processo: primeiro, o polipeptídeo é contatado com N-acetilgalactosamina transferase e um doador de N-acetilgalactosamina que é derivatizado com um ácido siálico reativo através de um ligante, de modo que o polipeptídeo é anexado ao ácido siálico reativo através do ligante e N-acetilgalactosamina. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal3 e asialo- transferrina e assim fica conectado com transferrina através do resíduo de ácido siálico. Então, o polipeptídeo é capeado com resíduos de ácido siálico usando um doador próprio e ST3Gal3. A figura 50L oferece um esquema adicional de modificação de Reopro bacterialmente expresso. O polipeptídeo é primeiro exposto ao NHS-CO-ligante-SA-CMP e fica conectado com o ácido siálico reativo através do ligante. O polipeptídeo é então contatado com ST3Gal3 e asialo-transferrina e assim fica conectado com transferrina através do resíduo de ácido siálico. Então, o polipeptídeo é capeado com resíduos de ácido siálico usando um doador próprio e ST3Gal3.
[00881] Em outra modalidade exemplar, a invenção provê processos para produção de conjugados de Rituxan™. As figuras 51A a 51G apresentam alguns exemplos. Na figura 51B, Rituxan™ expresso em vários sistemas de mamíferos é primeiro galactosilado usando um doador próprio de galactose e uma galactosiltransferase. O peptídeo é então funcionalizado com a ácido siálico derivatizado com uma porção de toxina, usando um doador de ácido siálico e ST3Gal3. Na figura 51C, Rituxan™ expresso em células de mamíferos ou células de fungos é galactosilado usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose, que fornece a galactose de peptídeo contendo uma porção de medicamento. A figura 51D fornece outro exemplo de remodelagem de Rituxan™ expresso em um sistema de fungos. Os grupos de glicosila do polipeptídeo são primeiro retroaparados usando Endo-H. A galactose é então adicionada usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose. Subseqüentemente, um radioisótopo é conjugado a molécula, através de um doador complexado com radioisótopo de ácido siálico e uma sialiltransferase, ST3Gal3. Na figura 51F, Rituxan™ é expresso em um sistema de mamífero e primeiro galactosilado usando um galactosiltransferase e um doador próprio de galactose; ácido siálico com uma porção PEG é então anexado à molécula usando ST3Gal3 e um doador PEGilado de ácido siálico. Conforme mostrado na figura 51G, Rituxan™ expresso em fungo, levedura, ou células de mamíferos pode também ser modificado no processo que se segue: o polipeptídeo é tratado com α e β-manosidases para remover resíduos de manosila terminal; GlcNAc é então anexado à molécula usando GnT-I, II e um doador de GlcNAc, radioisótopo é então anexado por meio de galactosilação usando uma galactosiltransferase e um doador de galactose que é acoplado a uma porção de quelação capaz de ligar um radioisótopo. A - Criação ou Eliminação de Sítios de Glicosilação Ligados em N
[00882] A presente invenção contempla o uso de peptídeos nos quais o sítio de cadeia(s) de glicano no peptídeo foram alterados a partir daquele(s) do peptídeo nativo. Tipicamente, as cadeias de glicano ligadas em N são ligadas a estrutura de peptídeo primário nos resíduos de asparagina, onde o resíduo de asparagina está dentro de uma seqüência de aminoácido que é reconhecida por uma glicosiltransferase ligada em membrana no retículo endoplásmico (ER). Tipicamente, o sítio de reconhecimento na estrutura de peptídeo primário é a seqüência de asparagina-X-serina/treonina, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina e ácido aspártico. Embora este sítio de reconhecimento seja típico, a invenção adicionalmente engloba peptídeos que possuem cadeias de glicano ligadas em N em outros sítios de reconhecimento, onde as cadeias ligadas em N são adicionadas usando glicosiltransferases naturais ou recombinantes.
[00883] Uma vez que o sítio de reconhecimento para glicosilação ligada em N de um peptídeo é conhecido, está dentro do conhecimento das pessoas versadas na técnica para criar seqüências de peptídeo primária mutadas, onde um sítio de reconhecimento de glicosilação ligado em N nativo é removido ou alternativamente ou além disto, um ou mais sítios de reconhecimento de N-glicosilação adicionais são criados. Mais simplesmente, um resíduo de asparagina pode ser removido da seqüência primária do peptídeo, pelo que, removendo o sítio de anexação para um glicano, removendo assim um glicano do peptídeo maduro. Por exemplo, um sítio de reconhecimento nativo com a seqüência de asparagina- serina-serina pode ser geneticamente transformado por engenharia para ter a seqüência leucina-serina-serina, eliminando assim o sítio de glicosilação ligado em N nesta posição.
[00884] Adicionalmente, um sítio de glicosilação ligado em N pode ser removido por alteração dos resíduos no sítio de reconhecimento, de modo que, mesmo que o resíduo de asparagina esteja presente, um ou mais dos resíduos de reconhecimento adicionais estão ausentes. Por exemplo, uma seqüência nativa de asparagina-serina-serina pode ser mutada para asparagina-serina-lisina, eliminando assim um sítio de N-glicosilação naquela posição. No caso de sítios de glicosilação liados em N compreendendo resíduos que não sítios de reconhecimento típicos descritos acima, um versado na técnica pode determinar a seqüência e resíduos necessários para reconhecimento pela glicosiltransferase apropriada e então mutar pelo menos um resíduo, de modo que a glicosiltransferase apropriada não mais reconhece aquele sítio. Em outras palavras, está dentro do conhecimento de um versado na técnica a manipulação da seqüência primária de um peptídeo, tal que, os sítios de glicosilação são criados ou são removidos, ou ambos, desta forma gerando um peptídeo possuindo um padrão de glicosilação alterado. A invenção, portanto, não seria construída para limiar qualquer seqüência de peptídeo primária, provida aqui como a única seqüência para remodelagem de glicano, porém ao invés disto, deveria ser construída para incluir qualquer e toda seqüência de peptídeo apropriada para remodelagem de glicano.
[00885] Para criar um peptídeo de mutante, a seqüência de ácido nucléico codificando a seqüência primária do peptídeo é alterado, de modo que os códons nativos codificando os resíduos de aminoácido nativos são mutados para gerar um códon codificando outro resíduo de aminoácido. As técnicas para alterar a seqüência de ácido nucléico são comuns na técnica e são descritas por exemplo em qualquer manual de biologia molecular conhecido.
[00886] Além disso, o ácido nucléico codificando uma estrutura de peptídeo primário pode ser sintetizado in vitro usando técnicas padrão. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico pode ser sintetizada em uma "máquina de gene" usando protocolos, tais como, o processo de dosforamidita. Se o DNA de filamento duplo quimicamente sintetizado for necessário para uma aplicação, tal como a síntese de um ácido nucléico ou um fragmento do mesmo, então cada filamento complementar é sintetizado separadamente. A produção de ácidos nucléicos curtos (60 a 80 pares de base) é tecnicamente avançada e pode ser realizada por sintetização de filamentos complementares e então recombinação dos mesmos. Para a produção de ácidos nucléicos mais longos (> 300 partes de base), estratégias especiais podem ser requerida, uma vez que a eficácia de acoplamento de cada ciclo durante síntese de DNA química é seldom 100%. Para superar este problema, os genes sintéticos (filamentos duplos) são montados na forma modular de fragmentos de filamento simples que são de 20 a 100 nucleotídeos de comprimento. Para revisões nas sínteses de polinucleotídeo, por exemplo, Glick e Pasternak (Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, 1994, ASM Press), Itakura e outros (1984, Annu. Rev. Biochem. 53: 323), e Climie e outros (1990, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 633).
[00887] Adicionalmente, as alterações na seqüência de ácido nucléico codificando o peptídeo podem ser feitas por mutagenese direcionada para o sítio. Conforme será apreciado, esta técnica tipicamente emprega um vetor de fato que existe em uma forma de filamento simples e dupla. Vetores típicos úteis na mutagenese direcionada ao sítio incluem vetores, tais como fago M13. Estes fagos são prontamente disponíveis e seu uso é geralmente bem conhecido de um versado na técnica. Plasmídeos de filamento duplo são também rotineiramente empregados na mutagenese direcionada ao sítio, que elimina a etapa de transferência de ácido nucléico de interesse de um plasmídeo para um fago.
[00888] Em geral, a mutagenese direcionada ao sítio é realizada primeiro por obtenção de um vetor de filamento simples ou fusão de dois filamentos de um vetor de filamento duplo que inclui dentro de sua seqüência uma seqüência de DNA que codifica o peptídeo desejado. Um primer de oligonucleotídeo portanto a seqüência mutada desejada é preparado geralmente de forma sintética. Este primer é então recombinado com o vetor de filamento simples e submetido às enzimas de polimerização de DNA, tais como, fragmento I Klenow de polimerase de E.coli, a fim de completar a síntese do filamento portando mutação. Assim, um heteroduplo é formado, onde um filamento codifica a seqüência não mutada original e o segundo filamento porta a mutação desejada. Este vetor heteroduplo é então usado para transformar ou transfectar as células apropriadas, tais como, células de E.coli e clones são selecionados, os quais incluem vetores recombinantes portando o arranjo de seqüência mutada. Um esquema de seleção genético foi mostrado por Kunkel e outros, (1987, Kunkel e outros, Methods Enzymol. 154: 367-382) para enriquecer os clones incorporando o ogliconucleotídeo mutagênico. Alternativamente, o uso de PCR™ com enzimas termoestáveis disponíveis comercialmente, tais como, polimerase Taq pode ser empregado para incorporar um primer de oligonucleotídeo mutagênico em um fragmento de DNA ampliado que pode então ser clonado em uma clonagem apropriada ou vetor de expressão. Os procedimentos de mutagenese mediados por PCR™ de Tomic e outros (1990, Nucl. Acids Res., 12:1656) e Upender e outros (1995, Biotechniques, 18:29-31) fornecem dois exemplos de tais protocolos. Um PCR™ empregando uma ligase termoestável além de uma polimerase termoestável pode também ser usado para incorporar um oligonucleotídeo mutagênico fosforilado em um fragmento de DNA ampliado que pode então ser clonado em um vetor de clonagem ou de expressão apropriado. O procedimento de mutagenese descrito por Michael (1994, Biotechniques 16: 410-412) fornece um exemplo de tal protocolo
[00889] Nem todas as seqüências Asn-X-Ser/Thr são N- glicosiladas sugerindo que o contexto no qual o motivo está presente é importante. Em outra abordagem, as coletâneas de peptídeos mutantes possuindo novos sítios de consenso ligados em N são criadas, a fim de identificar novos sítios ligados em N que são glicosilados in vivo e são benéficos para a atividade, estabilidade ou outras características do peptídeo.
[00890] Conforme anteriormente observado, a seqüência de consenso para adição cadeias de glicano ligadas em N em glicoproteínas é Asn-X-Ser/Thr onde X pode ser qualquer aminoácido. A seqüência de nucleotídeo codificando o aminoácido duas posições para o lado terminal de carboxila de Asn pode ser mutado para codificar um resíduo Ser e/ou Thr usando procedimentos padrão conhecidos dos versados na técnica comum. Conforme afirmado acima, nem todos os sítios Asn-X-Ser/Thr são modificados por adição de glicanos. Portanto, cada glicoproteína mutada recombinante pode ser expressa em um fungo, levedura ou animal ou sistema de expressão de mamífero e analisado quanto a adição de uma cadeia de glicano ligada em N. As técnicas para a caracterização de sítios de glicosilação são bem conhecidas de um versado na técnica. Adicionalmente, a função biológica da glicoproteína recombinante mutante pode ser determinada usando ensaios padrão para a proteína específica sendo examinada. Assim, torna-se uma matéria simples manipular a seqüência primária de um peptídeo e identificar novos sítios de glicosilação contidos na mesma e assim determinar o efeito dos novos sítios na atividade biológica do peptídeo.
[00891] Em uma modalidade alternativa, a seqüência de nucleotídeo codificando o aminoácido duas posições para o lado terminal amino de resíduos Ser/Thr pode ser mutado para codificar um Asn usando procedimentos padrão conhecidos dos versados na técnica comum. Os procedimentos para determinar se um novo sítio de glicosilação foi criado e o efeito deste sítio na atividade biológica do peptídeo são descritos acima. B - Criação ou Eliminação de Sítios de Glicosilação Ligados em O
[00892] A adição de um sítio de glicosilação ligado em O para o peptídeo é convencionalmente realizada por alterar a seqüência de aminoácido primário do peptídeo, tal que, contém um ou mais sítios de glicosilação ligados em O adicionais em comparação com o começo da seqüência de aminoácido primário do peptídeo. A adição de um sítio de glicosilação ligado em O para o peptídeo pode também ser realizada por incorporação de uma ou mais espécies de aminoácido no peptídeo que compreende um grupo -OH, preferivelmente resíduos de serina ou treonina, dentro da seqüência de peptídeo, tal que, o grupo OH é acessível e disponível para glicosilação liada em O. De forma semelhante à discussão de alteração de sítios de glicosilação ligados em N em um peptídeo, a seqüência de aminoácido primária do peptídeo é preferivelmente alterada no nível de nucleotídeo. Nucleotídeos específicos na seqüência de DNA codificando o peptídeo podem ser alterados, tal que, um aminoácido desejado é codificado pela seqüência. Mutação(ões) no DNA é (são) preferivelmente feito(s) usando processos conhecidos na técnica, tais como, técnicas de síntese de DNA de processo de fosforamidita e mutagenese direcionada para o sítio descrita acima.
[00893] Alternativamente, a seqüência de nucleotídeo codificando um sítio putativo para adição de glicano ligado em O pode ser adicionada à molécula de DNA em uma ou mais cópias tanto para a extremidade 5' quanto 3 da molécula. A seqüência de DNA alterada é então expressa em qualquer um de fungo, levedura, ou sistema de expressão de animais ou mamíferos e analisada quanto a adição da seqüência ao peptídeo e se ou não esta seqüência é um sítio de glicosilação ligado em O funcional. Em resumo, uma seqüência aceitador de peptídeo sintética é introduzida tanto na extremidade 5' quanto 3' da molécula de nucleotídeo. Em princípio, a adição deste tipo de seqüência é menos destruidora para a glicoproteína resultante quando expressa em um sistema de expressão apropriado. O DNA alterado é então expresso nas células CHO ou outro sistema de expressão apropriado e as proteínas expressas desta forma são examinadas quanto a presença de um sítio de glicosilação liado em O. Além disto, a presença ou ausência de cadeias glicano pode ser determinada.
[00894] Ainda em outra abordagem, sítios de vantagem para novos sítios ligados em O podem ser encontrados em um peptídeo por criação de coletâneas do peptídeo contendo vários novos sítios ligados em O. Por exemplo, a seqüência de aminoácido de consenso para adição de N- acetilgalactosamina por uma N- acetilgalactosaminiltransferase depende da transferase específica usada. A seqüência de aminoácido de um peptídeo pode ser escaneada por identificação de grupos contínuos de aminoácidos que podem ser mutados para gerar sítios em potencial para adição de cadeias de ligado ligadas em O. Estas mutações podem ser geradas usando procedimentos padrão conhecidos dos versados na técnica comum conforme descrito anteriormente. A fim de determinar se qualquer sítio de glicosilação descoberto é realmente glicosilado, cada peptídeo mutado recombinante é então expresso em um sistema de expressão apropriado e é subseqüentemente analisado quanto a adição do sítio e/ou da presença de uma cadeia de glicano ligada em O. C - Síntese química de peptídeos
[00895] Embora a estrutura primária dos peptídeos úteis na invenção possa ser gerada mais eficazmente em um sistema de expressão a base de célula, está dentro do escopo da presente invenção que os peptídeos podem ser gerados sinteticamente. A síntese química de peptídeos é bem conhecida dos versados na técnica e inclui, sem limitação, síntese de fase sólida em etapas e condensação de fragmento em solução ou em fase sólida. Uma síntese de fase sólida em etapas clássica envolve ligação covalente de um aminoácido correspondente ao aminoácido terminal carbóxi da cadeia de peptídeo desejada a um suporte sólido e extensão da cadeia de peptídeo na direção da extremidade amino por acoplamento escalonado dos derivados de aminoácido ativados possuindo grupos carboxila ativados. Após término do conjunto de cadeia de peptídeo liada de fase sólida completamente protegida, a ligação covalente da fase sólida do peptídeo é clivada por química apropriada e os grupos de proteção são removidos para render o peptídeo de produto. Vide, R. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis: The Synthesis of a Tetrapeptide, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963). Quanto mais longa a cadeia de peptídeo, mais desafiante é obter produtos bem definidos de pureza alta. Devido a produção de misturas complexas, a abordagem de síntese de fase sólida em etapas possui limitações de tamanho. Em geral, os peptídeos bem definidos de 100 resíduos de aminoácido contínuos ou mais não são rotineiramente preparados através de uma síntese de fase sólida em etapas.
[00896] O processo de condensação de segmento envolve a preparação de vários segmentos de peptídeo pelo processo em escalas de fase sólida, seguido por clivagem de fase sólida e purificação destes segmentos protegidos de forma máxima. Os segmentos protegidos são condensados um a um para o primeiro segmento, que é ligado à fase sólida.
[00897] Os peptídeos úteis na presente invenção podem se sintetizados por síntese de fase sólida exclusiva, processos de fase sólida parciais, condensação de fragmento ou síntese de solução clássica. Estes processos de síntese são bem conhecidos dos versados na técnica (vide, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart e outros, "Solid Phase Peptide Synthesis" (2a Edição), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton e outros, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis, "Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), e Lloyd-Williams e outros, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Peptides (CRC Press, Inc. 1997)). Variações nas estratégias de síntese química total, tais como, "ligação química nativa" e "ligação de peptídeo expressa" são também padrão (vide, por exemplo, Dawson e outros, Science 266: 776 (1994), Hackeng e outros, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir e outros, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 6705 (1998), e Severinov e Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)). Também são úteis os processos de síntese de peptídeo de fase sólida desenvolvidos por Gryphon Sciences, South San Francisco, CA. Vide Patentes US números U. S. 6.326.468, 6.217.873, 6,174,530 e 6.001.364, todos os quais são incorporados aqui em sua totalidade. D - Modificações Pós-Translacionais
[00898] Será apreciado por um versado na técnica comum, que os peptídeos podem sofrer modificação pós- translacional, além da adição de ligados em O e/ou ligados em N aos mesmos. É contemplado que os peptídeos possuindo modificações pós-translacionais que não glicosilação podem se usados como peptídeos na invenção, à medida que a atividade biológica desejada ou função do peptídeo seja mantida ou aperfeiçoada. Tais modificações pós- translacionais podem ser modificações naturais, geralmente realizadas in vivo, ou modificações por engenharia do peptídeo realizadas in vitro. As modificações conhecidas contempladas incluem, porém não estão limitadas a acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, anexação covalente de flavina, anexação covalente de uma porção heme, anexação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, anexação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, anexação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteina, formação de piroglutamato, formilação, gama carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição medida de transferência-RNA de aminoácidos para peptídeos, tais como, arginilação e ubiquitinação. As enzimas que podem ser usadas para realizar muitas destas modificações são bem conhecidas na técnica e disponíveis comercialmente de companhias, tais como, Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) e Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), entre outros.
[00899] Tais modificações são bem conhecidas dos versados na técnica e foram descritas em detalhes na literatura científica. Várias modificações comuns específicas, glicosilação, anexação de lipídeo, sulfação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ribosilação ADP, por exemplo, são descritas nos textos mais básicos, tais como, Peptides--Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993). Muitas revisões detalhadas são disponíveis neste contexto, tais como por Wold, F., Post-translational Covalent Modificação de Peptides, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 (1983); Seifter e outros (Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990)) e Rattan e outros (Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)).
[00900] Modificações covalentes de um peptídeo podem também ser introduzidas na molécula in vitro por reação dos resíduos de aminoácido direcionados do peptídeo com um agente de derivatização orgânico, que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos de aminoácido terminal. Resíduos mais geralmente derivatizados são cisteinila, histidila, lisinila, arginila, tirosila, gutaminila, asparaginila e resíduos de terminal amino. Hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila e treonila, metilação de grupos alfa-amino de lisina, histidina e cadeias laterais de histidina, acetilação de amina terminal N e amidação de grupos carboxílicos de terminal C. Tais porções derivatizadas podem aperfeiçoar a solubilidade, absorção, meia vida biológica e semelhantes. As porções podem também eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejável do peptídeo e semelhantes.
[00901] Além disto, a derivatização com agentes bifuncionais é útil para reticular o peptídeo para matrizes de suporte insolúveis em água ou para outros veículos macromoleculares. Agentes de reticulação geralmente usados incluem glutaraldeído, ésteres de N-hidróxisuccinimida, imidoésteres homobifuncionais, 1,1-bis(-diazolacetil)-2- feniletano e maleimidas bifuncionais. Agentes de derivatização, tais como, metil-3-[9p- azidofenil)]ditipropioimidato rendem intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulações em presença de luz. Alternativamente, as matrizes insolúveis em água reativas tais como, carboidratos ativados de brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Patentes US números 3.969.287 e 3.691.016 podem ser empregados para imobilização de peptídeo. E - Peptídeos/peptídeos de fusão
[00902] Os peptídeos úteis na presente invenção podem compreender peptídeos de fusão. Os peptídeos de fusão são especificamente vantajosos quando características biológicas e/ou funcionais dos dois peptídeos são desejadas de serem combinadas em uma molécula de peptídeo. Tais peptídeos de fusão podem estar presentes em combinações de atividade biológica e função que não são encontradas na natureza para criar moléculas novas e úteis de aplicações terapêuticas e industriais. Atividades biológicas de interesse incluem, porém não estão limitadas a atividade enzimática, receptor e/ou atividade de ligando, motivos imunogênicos e domínios industriais.
[00903] Tais peptídeos de fusão são bem conhecidos na técnica e os processos de criação serão bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um peptídeo de fusão a-interferon- humano foi fabricado, onde o peptídeo resultante possui os benefícios terapêuticos de a-interferon combinados com a vida de circulação longa de albumina, desta forma criando uma composição terapêutica que permite freqüência de dosagem reduzida e efeitos colaterais potencialmente reduzidos nos pacientes. Vide, Albuferon™ de Human Genome Sciences, Inc. e Patente US 5.766.883. Outros peptídeos de fusão incluem moléculas de anticorpo que são descritas aqui em qualquer lugar. F - Geração de Moléculas Menores "Biologicamente Ativas"
[00904] Os peptídeos usados na invenção podem ser variantes de peptídeos nativos, onde um fragmento do peptídeo nativo é usado no lugar do peptídeo nativo de comprimento pleno. Além disto, pré-pró e pré-peptídeos são contemplados aqui. Peptídeos variantes podem ser menores em tamanho do que o peptídeo nativo e podem compreender um ou mais domínios de um peptídeo maior. Seleção de domínios de peptídeo específicos pode ser vantajosa quando a atividade biológica de determinados domínios no peptídeo é desejada, porém a atividade biológica de outros domínios no peptídeo não é desejada. Também são incluídas truncagens do peptídeo e apagamentos internos que podem melhorar o efeito terapêutico desejado do peptídeo. Quaisquer de tais formas de um peptídeo são contempladas para serem úteis na presente invenção, contanto que atividade biológica desejada do peptídeo seja preservada.
[00905] Versões mais curtas de peptídeos podem ter vantagens únicas não encontradas no peptídeo nativo. No caso de albumina humana, foi verificado que uma forma truncada compreendendo tão pouco quanto 63% do peptídeo de albumina nativo é vantajosa como um expansor de volume de plasma. O peptídeo de albumina truncado é considerado como sendo melhor do que o peptídeo nativo para este fim terapêutico, devido a uma dose de peptídeo individual de apenas metade de dois terços daquela da albumina de soro humano natural ou albumina de soro humano recombinante ser necessária para o efeito osmótico de colóide. Vide Patente US 5.380.712, a totalidade da qual é incorporada aqui como referência.
[00906] Peptídeos menores "biologicamente ativos" foram verificados como possuindo atividade terapêutica melhorada em comparação ao peptídeo nativo. O potencial terapêutico de IL-2 é limitado por vários efeitos colaterais dominados por síndrome de vazamento vascular. Uma versão sintetizada quimicamente mais curta do peptídeo consistindo em resíduos 1-30 correspondendo a toda hélice α foi encontrada para dobrar apropriadamente e conter a atividade biológica de IL-2 natural sem os efeitos colaterais. G - Geração de Novos Peptídeos
[00907] O peptídeo da invenção pode se um derivado de uma seqüência primária de um peptídeo nativo, ou pode ser transformado por engenharia usando quaisquer dos muitos meios conhecidos dos versados na técnica. Tais peptídeos transformados por engenharia podem ser designados e/ou selecionados devido as novas proteínas ou melhoradas quando comparado ao peptídeo nativo. Por exemplo, os peptídeos podem sofrer transformação por engenharia para aumentar as razões de reação de enzima, afinidade de ligação aumentada ou reduzida para um substrato ou ligando, afinidade de ligação aumentada ou diminuída em relação a um receptor, especificidade alterada para um substrato, ligando, receptor ou outro parceiro do ligando, estabilidade aumentada ou diminuída in vitro e/ou in vivo ou imunogenicidade aumentada ou diminuída em um animal. H - Mutações 1 - Mutação de Projeto Racional
[00908] Os peptídeos úteis nos processos da invenção podem ser mutados para melhorar uma atividade biológica ou função desejada, para diminuir uma propriedade indesejada do peptídeo e/ou adicionar novas atividades ou funções ao peptídeo. "Projeto de peptídeo racional" pode ser usado para gerar tais peptídeos alterados. Uma vez que a seqüência de aminoácido e estrutura do peptídeo é conhecida e uma mutação desejada planejada, as mutações podem ser feitas mais convenientemente em relação ao códon de ácido nucléico correspondente, que codifica o resíduo de aminoácido que deseja-se mudar. Um versado na técnica pode facilmente determinar como a seqüência de ácido nucléico seria alterada com base no código genético universal e conhecimento das preferências de códon no sistema de expressão de escolha. Uma mutação em um códon pode ser feita para alterar o resíduo de aminoácido que será polimerizado no peptídeo durante a tradução. Alternativamente, um códon pode ser mutado, de modo que o resíduo de aminoácido codificado correspondente seja o mesmo, porém a escolha do códon é mais apropriada ao sistema de expressão de peptídeo desejado. Por exemplo, resíduos cis podem ser substituídos com outros aminoácidos para remover ligações dissulfeto do peptídeo maduro, domínios catalíticos podem ser mutados para alterar a atividade biológica e em geral, isoformas do peptídeo podem ser transformadas por engenharia. Tais mutações podem ser mutações de ponto, pagamentos, inserções e truncagens, entre outros.
[00909] Técnicas para mutar aminoácidos específicos em um peptídeo são bem conhecidas na técnica. A técnica de mutagenese direcionada ao sítio, discutida acima, é em apropriada a mutação dirigida dos códons. O processo de mutagenese mediado por oligonucleotídeo é também discutido em detalhes em Sambrook e outros (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, começando página 15.51). Os apagamentos sistemáticos, inserções e truncagens podem ser feitos usando mutagenese de inserção de ligante, digestão com nuclease Bal31, e mutagenese de escaneamento de ligante, entre outros processos bem conhecidos na arte (Sambrook e outros, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).
[00910] O projeto de peptídeo racional foi usado sucessivamente para aumentar a estabilidade das enzimas com relação a termoinativação e oxidação. Por exemplo, a estabilidade de uma enzima foi aperfeiçoada por remoção de resíduos de asparagina em a-amilase (Declerck e outros, 2000, J. Mol. Biol. 301: 1041-1057), a introdução de elementos estruturais mais rígidos, tais como, prolina em a-amilase (Igarashi e outros, 1999, Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 1535-1540) e D-xilose isomerase (Zhu e outros, 1999, Peptide Eng. 12:635-638). Adicionalmente, a introdução de contatos hidrófobos adicionais estabilizou 3- isopropilmalato desidrogenase (Akanuma e outros, 1999, Eur. J. Biochem. 260: 499-504) e desidrogenase de formato obtida de Pseudomonas sp. (Rojkova e outros, 1999, FEBS Lett. 445:183-188). Os mecanismos atrás do efeito de estabilização destas mutações é geralmente aplicável a muitos peptídeos. Estas e outras mutações semelhantes são contempladas para ser úteis com relação aos peptídeos remodelados nos processos da presente invenção. 2 . Técnicas de Mutagênese Aleatória
[00911] Os peptídeos novos úteis nos processos da invenção podem ser gerados empregando-se técnicas que introduzem mutações aleatórias na sequência de codificação do ácido nucléico. O ácido nucléico é então expresso em um sistema de expressão desejado, e o peptídeo resultante é avaliado quanto as propriedades de interesse. As técnicas para se introduzir mutações aleatórias nas seqüências de DNA são conhecidas na arte e incluem mutagênese por PCR, mutagênese por saturação e abordagens de oligonucleotídeos degenerados. Vide Sambrook, e Russell (2001, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) e Ausubel e outros (2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
[00912] Na mutagênese por PCR, a fidelidade de Taq polimerase reduzida é usada para se introduzir mutações aleatórias em um fragmento clonado de DNA (Leung e outros, 1989, Technique 1:11-15). Este é um processo muito poderoso e relativamente rápido de introdução de mutações aleatórias em uma seqüência de DNA. A região de DNA a ser submetida a mutagênese é amplificada empregando-se reação de cadeia de polimerase (PCR) em condições que reduzem a fidelidade da síntese de DNA por Taq DNA polimerase, isto é, empregando- se uma relação de dGTP/dATP alterada e acrescentando-se Mn2+ à reação PCR. A combinação de fragmentos amplificados de DNA é inserida nos vetores adequados de clonagem para produzir coletâneas de mutantes aleatórios.
[00913] A mutagênese por saturação permite a rápida introdução de um grande número de substituições de uma única base em fragmentos clonados de DNA (Mayers e outros, 1985, Science 229:242). Esta técnica inclui a geração de mutações, por tratamento químico ou irradiação de DNA de um único filamento in vitro, e síntese de um filamento complementar de DNA, por exemplo. A freqüência de mutação pode ser modulada modulando-se a gravidade do tratamento, e essencialmente todas as substituições de base possíveis podem ser obtidas. Como este procedimento não abrange uma seleção genética para os fragmentos mutantes, são obtidas tanto as substituições neutras como aquelas que alteram a função. A distribuição de mutações de pontos não é direcionada a elementos conservados de seqüência.
[00914] Uma coletânea de homólogos de ácidos nucléicos pode também ser gerada a partir de um conjunto de seqüências de oligonucleotídeos degenerados. A síntese química de uma seqüência de oligonucleotídeos degenerados pode ser conduzida em um sintetizador automático de DNA, e os genes sintéticos podem então se ligados em um vetor de expressão adequado. A síntese de oligonucleotídeos degenerados é conhecida na técnica (vide, por exemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura e outros (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rc. Clevalend Sumpos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier p. 273-289; Itakura e outros (1984) Annu. Rev. Biochem. 52:323; Itakura e outros (19840 Science 198:1056; Ike e outros (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Tais técnicas foram empregadas na evolução direcionada de outros peptídeos (vide, por exemplo, Scott e outros, (1990) Science 249:386-390; Roberts e outros (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin e outros (1990) Science 249:404-406; Cwirla e outros (1990) PNAS 87: 6378-6382; assim como as patentes U.S. 5.223.409; 5.198.346, e 5.096.815). a. Evolução Direcionada
[00915] Os peptídeos úteis nos processos da invenção podem também ser gerados empregando-se técnicas de "evolução direcionada". Ao contrário das técnicas de mutagênese dirigida a sítio, em que é necessário o conhecimento da estrutura do peptídeo, existem agora estratégias para gerar coletâneas de mutações a partir das quais se podem obter peptídeos com propriedades melhoradas sem se conhecer as características estruturais do peptídeo. Estas estratégias são geralmente conhecidas como tecnologias de "evolução direcionada" e são diferentes dos procedimentos de mutagênese aleatória tradicional pois abrangem se submeter a seqüência de ácidos nucléicos que codificam o peptídeo de interesse a ciclos repetidos de mutação, teste e amplificação.
[00916] Em algumas técnicas de "evolução direcionada", a diversidade nos ácidos nucléicos obtida é gerada por processos de mutação que criam aleatoriamente mutações de pontos na seqüência de ácidos nucléicos. As técnicas de mutação de pontos incluem, sem limitação, "error-prone PCRTM" (Caldwell e Joyce, 1994; PCR Methods Appl. 2: 28-33; e Ke e Madison, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3371-3372), mutagênese dirigida por oligonucleotídeos repetidos (Reidhaar-Olson e outros, 1991, Methods Enzymol. 208: 564 586), e qualquer um dos processos citados acima de mutagênese aleatória.
[00917] Outro processo de se criar diversidade sobre a qual a evolução direcionada pode atuar é o emprego de genes mutadores. O ácido nucléico de interesse é cultivado em uma cepa de células mutadoras cujo genoma tipicamente codifica genes de reparo de DNA defeituoso (patente U.S. No. 6.365.410; Selifonova e outros, 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 3645-3649; Long-McGie e outros, 2000, Biotech. Bioeng. 68: 121-125; vide, Genencor International Inc., Palo Alto CA).
[00918] Pode-se também atingir diversidade empregando- se técnicas de evolução direcionada empregando-se mutagênese por saturação juntamente com primers degenerados (Gene Site Saturation MutagenesisTM, Diversa Crop., San Diego, CA). Neste tipo de mutagênese por saturação os primers degenerados projetados para cobrir o comprimento da seqüência de ácidos nucléicos para ser diversificada são usados como primers para a polimerase nas reações PCR. Deste modo, cada códon de uma seqüência de codificação para um aminoácido pode sofrer mutação para codificar cada um dos dezenove aminoácidos comuns restantes. Esta técnica pode também ser usada para se introduzir mutações, apagamentos e inserções a regiões específicas de uma seqüência de codificação de ácidos nucléicos deixando ao mesmo tempo o resto da molécula de ácido nucléico intocada. Os procedimentos para a técnica de saturação genética são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados na patente U.S. No. 6.171.820. b. Rearranjo de DNA
[00919] Os peptídeos novos úteis no processo da invenção podem também ser gerados empregando-se as técnicas de rearranjo de genes, rearranjo de motivos, rearranjo de éxons e/ou rearranjo de códons (a que se refere em conjunto como "rearranjo de DNA"). As técnicas de rearranjo de DNA podem ser empregadas para modular as atividades de peptídeos úteis na invenção e podem ser usadas para gerar peptídeos que têm uma atividade alterada. Vide em linhas gerais, as Patentes U.S. 5.606.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; e 5.837.458, e Stemmer e outros (1994, Nature 370 (6488): 389-391); Crameri e outros (1998, Nature 391 (6664): 288-291); Zhang e outros (1997, Proc. Natl. Aca. Sci. USA 94 (9): 4504-4509); Stemmer e outros (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (22): 10747-10751), Patten e outros (1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-733); Harayama, (1998, Trends Biotechnol. 16 (2): 76-82); Hansson e outros, (1999, J. Mol. Biol. 287: 265-76); e Lorenzo e Blasco (1998, Biotechniques 24 (2): 308-13) (sendo cada uma destas patentes integralmente incorporadas ao presente documento a título de referência).
[00920] O rearranjo de DNA abrange a montagem de dois ou mais segmentos de DNA por recombinação homóloga ou específica a sítio para gerar variação na seqüência de polinucleotídeos. O rearranjo de DNA vem sendo usado para gerar variações inéditas de proteínas do vírus de imunodeficiência humana do tipo 1 (Pekrun e outros, 2002, J. Virol. 76 (6): 2924-35), hidrolases de triazina (Raillard e outros, 2001, Chem. Biol. 8(9): 891-898), proteínas de vírus da leucemia murina (MLV) (Powell e outros, 2000, Nat. Biotechnol. 18 (12): 1279-1282), e fosfato de indolglicerol sintase (Merz e outros, 2000, Biochemistry 39 (5): 880-889).
[00921] A técnica de rearranjo de DNA foi desenvolvida para gerar diversidade biomolecular por imitação da recombinação natural, permitindo uma recombinação homóloga in vitro de DNA (Stemmler, 1994, Nature 370: 389-391); e Stemmler, 1994 PNAS 91: 10747-10751). Geralmente, neste processo, uma população de genes correlatos é fragmentada e submetida a ciclos repetidos de desnaturação, re- hibridização, seguidos pela extensão das extremidades de 5' por Taq polimerase. Com cada ciclo, o comprimento dos fragmentos aumenta e a recombinação de DNA ocorre quando os fragmentos que se originam de diferentes genes se hibridizam um com outro. A fragmentação inicial do DNA é geralmente obtida por digestão por nuclease, tipicamente utilizando-se DNAse (vide as referências de Stemmler acima), mas pode também ser obtida interrompendo-se a síntese de PCR (Patente U.S. 5.965.408, inteiramente incorporada ao presente documento a título de referência; vide, Diversa Corp., San Diego, CA). Os processos de rearranjo de DNA têm vantagens sobre processos de mutação por pontos aleatórios, uma vez que é obtida a recombinação direta de mutações benéficas gerada por cada rodada de rearranjo e há, portanto, uma auto seleção para fenótipos melhorados de peptídeos.
[00922] As técnicas de rearranjo de DNA são bem conhecidas nesta técnica. As explicações detalhadas de tal tecnologia são encontradas em Stemmler, 1994, Nature 370: 389-391 e Stemmler, 1994, PNAS 91: 10747-10751. A técnica de rearranjo de DNA é também descrita nas Patentes U.S. 6.180.406; 6.165.793; 6.132.970; 6.117679; 6.096.548; 5.837.458; 5.834.252; 5.830.721; 5.811.238, e 5.605.793 (todas integralmente incorporadas ao presente documento a título de referência).
[00923] A técnica também propõe modificações ainda mais recentes da técnica básica de rearranjo de DNA. Em um exemplo, no rearranjo de éxons, os éxons ou as combinações de éxons que codificam domínios específicos de peptídeos são amplificados empregando-se oligonucleotídeos quiméricos. As moléculas amplificadas são então recombinadas por montagem de PCR com auto-primers (Kolkman e Stemmler, 2001, Nat. Biotech. 19:423-428). Em um outro exemplo, empregando-se a técnica de quimerogênese aleatória sobre construção de coletâneas de gabaritos transitórios (RACHITT), os fragmentos de DNA progenitor de um único filamento são desnaturados sobre um gabarito de um único filamento total (Coco e outros, 2001, Nat. Biotechnol. 19: 354-359). Em um outro exemplo ainda, um processo de extensão graduado (StEP), termociclagem com ciclos muito abreviados de desnaturação/extensão, empregado para interromper repetidamente a polimerização de DNA a partir de primers flanqueadores (Zhao e outros, 1998, Nat. Biotechnol. 16: 258-261). Na técnica conhecida como de CLERY, o rearranjo da família in vitro é combinado com a recombinação homóloga em levedura (Abecassis e outros, 2000, Nucleic Acids Res. 28: E88;). Para se maximizar a recombinação intergênica, DNA de um único filamento proveniente de filamento complementares de cada um dos ácidos nucléicos são digeridos com DNase e desnaturados (Kikuchi e outros, 2000, Gene 243: 133-137). As extremidades cegas dos dois ácidos nucléicos truncados de comprimentos variáveis que são ligados por uma seqüência clivável são então ligados para gerar fusão de genes sem uma recombinação homóloga (Sieber e outros, 2001, Nat. Biotechnol. 19:456-460; Lutz e outros, 2001, Nucleic Acids Res. 29: #16; Ostermeier e outros, 1999, Nat. Biotechnol. 17: 1205-1209; Lutz e Benkovic, 2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11: 319-324). A recombinação entre ácidos nucléicos com uma pequena homologia de seqüências em comum tem também sido melhorada empregando-se as extremidades cegas mediadas por exonuclease de fragmentos de DNA e ligando-se os fragmentos entre si para recombiná-los (Patente U.S. 6.361.974, incorporada ao presente documento a título de referência integralmente). A invenção contempla o emprego de toda e qualquer variação descrita acima como um meio de se melhorar as propriedades biológicas de qualquer um de peptídeos e/ou enzimas úteis nos processos da invenção.
[00924] Além dos protocolos publicados descrevendo com detalhes a evolução direcionada e as técnicas de rearranjo de genes, os serviços comerciais são agora disponíveis que se encarregarão dos procedimentos de rearranjo de genes e de seleção nos peptídeos escolhidos. Maxygen (Redwood City, CA) oferece serviços comerciais para gerar coletâneas de DNA rearranjo sob medida. Além disso, esta firma efetuará os procedimentos de evolução direcionada sob medida que incluem o rearranjo e seleção numa família de peptídeos selecionada.
[00925] Optigenix, Inc. (Newark, DE) oferece o serviço correlato de rearranjo de plasmídeos. Optigenix usa famílias de genes para obter mutantes nela que têm novas propriedades. O ácido nucléico de interesse é clonado em um plasmídeo em um sistema de expressão de Aspergillus. O DNA da família correlata é então introduzido no sistema de expressão e recombinação nas regiões conservadas da família ocorre na hospedeira. Os DNAs mutantes resultantes são então expressos e o peptídeo produzido deles sé testado para a presença de propriedades desejadas e a ausência de propriedades indesejáveis. c. Procedimentos de Teste
[00926] Depois de cada volta repetida de "evolução", os peptídeos desejados expressos pelos genes que sofreram a mutação são testados para características de interesse. Os genes "candidatos" são então amplificados e combinados para a seguinte volta de rearranjo de DNA. O procedimento de teste usado é extremamente dependente do peptídeo que está "em evolução" e da característica que interessa. As características tais como estabilidade, atividade biológica, antigenicidade do peptídeo, dentre outros podem ser selecionadas empregando-se procedimentos que são bem conhecidos na técnica. Os testes individuais para a atividade biológica dos peptídeos preferidos úteis nos processos da invenção são descritos em outra parte do presente documento. d. Combinações de Técnicas
[00927] Será observado pelo versados na técnica que as técnicas acima de mutação e seleção podem ser combinadas entre si e com procedimentos adicionais para gerar a molécula útil de peptídeo melhor possível nos processos da invenção. Assim, a invenção não é limitada a qualquer um processo para a geração de peptídeos, e deve ser interpretada como abrangendo toda e qualquer metodologia descrita no presente. Um procedimento para a introdução de mutações por ponto em uma sequência de ácidos nucléicos, por exemplo, pode ser conduzida inicialmente, seguida por voltas repetidas de rearranjo, seleção e amplificação de DNA. A introdução inicial de mutações por pontos pode ser usada para introduzir a diversidade em uma população de genes onde ela estiver faltando, e a volta seguinte de rearranjo e triagem de DNA selecionará e recombinará mutações em pontos vantajosos. 11. Glicosidases e Glicotransferases A. Glicosidases
[00928] As glicosidases são glicosiltransferases que usam água como uma molécula aceitadora, e como tal, são tipicamente enzimas glicosídeo-hidrolíticas. As glicosidases podem ser usadas para a formação de ligações glicosídicas in vitro pelo controle da termodinâmica ou da cinética da mistura de reação. Mesmo nas condições modificadas de reação, no entanto, as reações de glicosidase podem ser difíceis de se operar, e as glicosidases tendem a resultar em rendimentos sintéticos baixos como resultado da reação de transglicosilase reversível e da reação hidrolítica concorrente.
[00929] Uma glicosidase pode funcionar conservando a estereoquímica na ligação que estiver sendo quebrada durante hidrólise ou por inversão da estereoquímica na ligação que estiver sendo quebrada durante hidrólise, classificando a glicosidase ou como uma glicosidase "conservadora" ou uma glicosidase "inversora", respectivamente. As glicosidases conservadoras têm duas porções ácido carboxílico críticas presentes no sítio ativo, um carboxilato atuando como um catalisador de ácido/base e o outro como um nucleófilo, ao passo que com as glicosidases inversoras, um ácido carboxílico funciona como um ácido e o outro funciona como uma base.
[00930] Os processos para se determinar a atividade e especificidade de ligação de qualquer glicosidase são bem conhecidos na técnica, incluindo um protocolo HPLC simplificado (Jacob e Scudder, 1994, Methods in Enzymol. 230: 280-300). Uma discussão geral de glicosidases e de tratamento de glicosidase se encontra em Glycobiology A Practical Approach, (1993, Fukuda e Kobata eds., Oxford University Press Inc., Nova York). As glicosidases úteis na invenção incluem, sem limitação, sialidase, galactosidase, endoglucanase, manosidase (isto é α e β, ManI, ManII e ManIII), xilosidase, fucosidase, β-glicosidase de Agrobacterium sp., manosidase 2A de Cellulomonas fimi, glicosidase de Humicola insolens, glicosidase de Sulfolobus solfataricus e glicosidase de Bacillus licheniformis.
[00931] A escolha de fucosidases para serem usadas na invenção depende da ligação da fucose a outras moléculas. As especificidades de muitas α-fucosidases úteis nos processos da invenção são bem conhecidas dos versados na técnica e muitas variedades de fucosidase são também disponíveis no comércio (Glyko, Novato, CA; PROzyme, San Leandro, CA; Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA; dentre outros). As fucosidases de interesse incluem, mas sem limitação, α-fucosidases provenientes de Turbo cornutus, Charonia lampas, Bacillus fulminans, Aspergillus niger, Clostridium perfringens, rim bovino (Glyko), fígado de galinha (Tyagarajan e outros, 1996, Glycobiology 6:8393) e α-fucosidase II de Xanthomonas minihotis (Glyko, PROzyme). A fucosidase do fígado de galinha é especialmente útil para a remoção de fucose nuclear de glicanos ligados a N. B. Glicosiltransferases
[00932] As glicosiltransferases catalisam a adição de açúcares ativados (açúcares NDP de doador) de um modo passo a passo a uma proteína, glicopeptídeo, lipídio ou glicolipídio ou a extremidade não redutora de um oligossacarídeo em crescimento. Os glicopeptídeos ligados por N são sintetizados por uma transferase e um doador de oligossacarídeo ligado a lipídio Dol-PP-NAG2Glc3Man9 em uma transferência em bloco seguida com desbaste do núcleo. Neste caso a natureza do sacarídeo "de núcleo" é um tanto diferente das ligações subseqüentes. Um número bastante grande de glicosiltransferases é conhecido na técnica.
[00933] A glicosiltransferase a ser usada na presente invenção pode ser qualquer uma, desde que ela possa utilizar o açúcar modificado como um doador de açúcar. Exemplos de tais enzimas incluem a glicosiltransferase da via de Leloir, tais como galactosiltransferase, N-acetil- glicosaminiltransferase, N-acetil- galactosaminiltransferase, fucosiltransferase, sialiltransferase, manosiltransferase, xilosil-transferase, glicurononil-transferase e semelhantes.
[00934] Para as sínteses enzimáticas de sacarídeos que abrangem as reações de glicosiltransferase, a glicosiltransferase pode ser clonada, ou isolada de qualquer fonte. Muitas glicosiltransferases clonadas são conhecidas, assim como as suas seqüências de polinucleotídeos. Vide, por exemplo, Taniguchi e outros, 2002, Handbook of glycosyltransferases and related genes, Springer, Tokyo.
[00935] As seqüências de aminoácidos de glicosiltransferase e as seqüências de nucleotídeos que codificam glicosiltransferase a partir das quais podem ser deduzidas seqüências de aminoácidos são também encontradas em diversas bases de dados disponíveis ao público, incluindo GenBank, Swiss-Prot, EMBL e outros.
[00936] As glicosiltransferases que podem ser empregadas nos processos da invenção incluem, sem limitação, galactosiltransferases, fucosiltransferases, glicosiltransferases, N-acetil-galactosaminiltransferases, N-acetil-glicosaminiltransferases, glicoroniltransferases, sialiltransferases, manosiltransferases, transferases do ácido glicurônico, transferases do ácido galacturônico, e oligossacaril-transferases. As glicosiltransferases adequadas incluem aquelas obtidas de eucariontes assim como de procariontes.
[00937] As glicosiltransferases que codificam DNA podem ser obtidas por síntese química por teste de transcrições reversas de mRNA a partir de células ou culturas de linhagens celulares adequadas, por teste de coletâneas genômicas a partir de células adequadas ou por combinações destes procedimentos. O teste de mRNA ou do DNA genômico pode ser conduzido empregando-se sondas de oligonucleotídeos geradas a partir da seqüência de aminoácidos de glicosiltransferases. As sondas podem ser rotuladas com um rótulo detectável, tal como, sem limitação, um grupamento fluorescente, um átomo radioativo ou um grupamento quimioluminescente de acordo com procedimentos conhecidos e usados em ensaios de hibridização convencionais. Como alternativa as seqüências de ácidos nucléicos de glicosiltransferases podem ser obtidas empregando-se o procedimento da reação de cadeia de polimerase (PCR), sendo os primers de oligonucleotídeos de PCR produzidos a partir da seqüência de ácidos nucléicos de glicosiltransferases. Vide a Patente U.S. 4.683.195 concedida a Mullis e outros, e Patente U.S. 4.683.202 concedida a Mullis.
[00938] Uma enzima glicosiltransferase pode ser sintetizada em uma célula hospedeira transformada com um vetor que contém o DNA que codifica a enzima glicosiltransferase. Um vetor é uma construção replicável de DNA. Os vetores são usados ou para amplificar o DNA que codifica a enzima glicosiltransferase e/ou para expressar o DNA que codifica a enzima glicosiltransferase. Um vetor de expressão é uma construção replicável de DNA em que a seqüência de DNA que codifica a enzima glicosiltransferase é ligada de modo operável a seqüências de controle adequadas capazes de efetuar a expressão da enzima glicosiltransferase em uma hospedeira adequada. A necessidade de tais seqüências de controle variará, dependendo da hospedeira selecionada e do processo de transformação escolhido. Geralmente, as seqüências de controle incluem um promotor transcricional, uma seqüência operadora opcional para controlar a transcrição uma seqüência que codifica sítios de ligação adequados de mRNA ribossômico, e seqüências que controlam o término da transcrição e da tradução. Os vetores de amplificação não exigem domínios de controle de expressão. Tudo que é preciso é a capacidade de se replicar em uma hospedeira, geralmente conferida por uma origem de replicação e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento dos transformantes. 1. Fucosiltransferases
[00939] Em algumas modalidades, uma glicosiltransferase usada no processo da invenção é uma fucosiltransferase. As fucosiltransferases são conhecidas dos versados na técnica. As fucosiltransferases exemplares incluem enzimas que transferem L-fucose da GDP-fucose para uma posição hidróxi de um açúcar aceitador. As fucosiltransferases que transferem de açúcares de não nucleotídeos para um aceitador são também úteis na presente invenção.
[00940] Em algumas modalidades, o açúcar aceitador é, por exemplo, o GlcNAc em um grupo Galβ (1^3,4)GlcNAcβ em um glicosídeo oligossacarídeo. As fucosiltransferases adequadas para esta reação incluem Galβ (1^3,4)GlcNAcβ1-α (1 ^3,4)fucosiltransferase (FTIII E.C. No. 2.4.1.65) que foi caracterizado pela primeira vez a partir de leite humano (vide, Palcic e outros, Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels e outros, J. Biol. Chem. 256: 10456-10463 (1981); e Nunez e outros, Can. J. Chem. 59: 1086-2095 (1981)) e as Galβ (1>3,4)GlcNAcβ-αfucosiltransferases (FTIV, FTV, FTVI) que se encontram no soro humano. FTVII (E.C. No. 2.4.1.65), uma sialil α (2>3) Galβ . 1 >3,4 GlcXAcβ fucosiltransferase, também foi caracterizada. Uma forma recombinante de Galβ(1>3,4)GlcNAcβ-α(1>3,4) fucosiltransferase foi também caracterizada (vide, Dumas e outros, Bioorg. Med. Letters 1: 425-428 (1991) e Kukowska-Latallo e outros, Genes and Development 4: 1288-1303 (1990). Outras fucosiltransferases exemplares incluem, por exemplo, α1,2 fucosiltransferases (E.C. No. 2.4.1.69). A fucosilação enzimática pode ser conduzida pelos processos descritos em Mollicone e outros, Eur. J. Biochem. 191: 169-176 (1990) ou na patente U.S. 5.374.655. 2. Galactosiltransferases
[00941] Em um outro grupo de modalidades, a glicosiltransferase é uma galactosiltransferase. As galactosiltransferases exemplares incluem α(1,3) galactosiltransferases (E.C. No. 2.4.1.151, vide por exemplo, DAbkowski e outros, Transplant Proc. 25: 2921 (1993) e Yamamoto e outros, Nature 345: 229-233 (1990), bovinas (GenBankj04989, Joziasse e outros, J. Biol. Chem. 264: 14290-14297 (1989)), murinas (GenBank m26925; Larsen e outros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989)), porcinas (GenBank L36152; Strahan e outros, Immunogenetics 41: 101-105 (1995)). Uma outra α1,3 galactosiltransferase é aquela que está implicada na síntese do antígeno do grupo B do sangue (EC 2.4.2.37, Yamamoto e outros, J. Biol. Chem. 265: 1146-1151 (1990) (humano)).
[00942] Também adequadas para serem empregadas nos processos da invenção são β(1,4)galactosiltransferases que incluem, por exemplo, EC 2.4.1.90 (LaNAc sintetase) e EC 2.4.1.22 (lactose sintetase) (bovinas (D'Agostaro e outros, Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), humanas (Masri e outros, Biochem. Byophys. Res. Commun. 157: 657-663 (1988)), murinas (Nakazawa e outros, J. Biochem. 104: 165168 (1988)), assim como E.C. 2.4.1.38 e a ceramida galactosiltransferase (EC 2.4.1.45, Stahl e outros, J. Neurosci. Res. 38: 234-242 (1994)). Outras galactosiltransferases adequadas incluem, por exemplo a1,2galactosiltransferases (provenientes, por exemplo, de Schizosaccharomyces pombe, Chapell e outros, Mol. Biol. Cell 5: 519-528 (1994)). Para outra galactosiltransferases adequadas vide Taniguchi e outros (2002, Handbook of Glycosyl-transferases and related Genes, Springer, Tokyo), Guo e outros (2001, Glycobiology, 11(10): 813-820), e Breton e outros (1998, J. Biochem. 123: 1000-1009).
[00943] A produção de proteínas tais como a enzima GalNAc T I-XIV proveniente de genes clonados por engenharia genética é bem conhecida. Vide, por exemplo, a patente U.S. 4.761.371. Um processo abrange a coleta de um número suficiente de amostras, sendo então a seqüência de aminoácidos da enzima determinada por seqüenciamento de terminal N. Estas informações são então usadas para se isolar um clone de cDNA que codifica uma transferase de comprimento total (ligado por membrana) que depois da expressão na linhagem de células Sf9 de insetos resultou na síntese de uma enzima plenamente ativa. A especificidade de aceitadora da enzima é então determinada, empregando-se uma análise semiquantitativa dos aminoácidos que circundam os sítios de glicosilação conhecidos nas 16 diferentes proteínas, seguindo-se estudos de glicosilação in vitro dos peptídeos sintéticos. Este trabalho demonstrou que determinados resíduos de aminoácidos são sobre- representados em segmentos de peptídeos glicosilados e que os resíduos em posições específicas circundando os resíduos glicosilados de serina e treonina podem ter uma influência mais distinta sobre a eficiência de aceitadora do que outras porções de aminoácidos. 3. Sialiltransferases
[00944] As sialiltransferases são um outro tipo de glicosiltransferase que é útil nas células recombinantes e nas misturas de reação da invenção. Exemplos de sialiltransferases que são adequadas para serem usadas na presente invenção incluem ST3Gal III (ST3Gal III humana ou de rato, por exemplo), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II, e ST6GalNAc III (a nomenclatura de sialiltransferases usada no presente documento é conforme descrito em Tsuji e outros, Glycobiology 6: v-xiv (1996)). Uma α (2,3)sialiltransferase exemplar a que se refere como α (2,3)sialiltransferase (EC 2.4.99.6) transfere o ácido siálico ao terminal Gal não redutor de um glicosídeo ou dissacarídeo Galβ1^3Glc. Vide Van den Eijnden e outros, J. Biol. Chem. 256: 3159 (1981), Weinstein e outros, J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982) e Wen e outros, J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992). Uma outra α 2,3-sialiltransferase (EC 2.4.99.4) exemplar transfere o ácido siálico ao terminal Gal não redutor do dissacarídeo ou glicosídeo, vide Rearick e outros, J. Biol. Chem. 254: 4444 (1979) e Gillespie e outros, J. Biol. Chem. 267: 21004 (1992). Outras enzimas exemplares incluem Gal-1,4-GlcNAc-a- 2,6 sialiltransferase (Vide Kurosawa e outros Euro. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)).
[00945] É preferível, para a glicosilação dos carboidratos de glicopeptídeos, que as sialiltransferase sejam capazes de transferir o ácido siálico à seqüência Galβ(1,4)GlcNAc-, Galβ(1,3)GlcNAc-, ou Galβ(1,3)GalNAc-, as penúltimas seqüências mais comuns subjacentes ao ácido siálico terminal em estruturas totalmente sialiladas de carboidratos (vide, Tabela 7). As 2,8-sialiltransferases capazes de transferir l ácido siálico para α2,3Galβ1,4GlcNAc são também úteis nos processos da invenção. Tabela 7. Sialiltransferases que Empregam a Seqüência Galβ1,4GlcNAc como um Substrato Aceitador
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(1996)
[00946] Um exemplo de uma sialiltransferase que é útil nos processos reivindicados é ST3Gal III, a que se refere também como α (2,3)sialiltransferase (EC 2.4.99.6). Esta enzima catalisa a transferência do ácido siálico do Gal de um glicosídeo Galβ1,3GlcNAc ou Galβ1,4GlcNAc (vide, por exemplo, Wen e outros, J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden e outros, J. Biol. Chem. 256: 3159 (1991)) e é responsável pela sialilação de oligossacarídeos ligados por asparagina em glicopeptídeos. O ácido siálico é ligado a um Gal com a formação de uma ligação α entre os dois sacarídeos. A ligação entre os sacarídeos se encontra entre a posição 2 de NeuAc e a posição 3 de Gal. Esta enzima específica pode ser isoladas do fígado de rato (Wainstein e outros, J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982)); as seqüências do cDNA humano (Sasaki e outros (1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-117877; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394-1401) e de DNA genômico (Kitagawa e outros (1996) J. Biol. Chem. 271: 931-938) são conhecidas, facilitando a produção desta enzima por expressão recombinante. Em uma modalidade preferida os processos de sialilação reivindicados empregam ST3Gal III do rato.
[00947] Outras sialiltransferases exemplares para serem usadas na presente invenção incluem as isolados de Camphylobacter jejuni, inclusive a α(2,3). Vide, por exemplo, WO99/49051.
[00948] Outras sialiltransferases, inclusive as relacionadas na Tabela 7 são também úteis em um processo de grande escala econômico e eficiente para a sialilação de glicopeptídeos comercialmente importantes. Como um teste simples para se descobrir a utilidades destas outras enzimas, faz-se reagir diversas quantidades de cada enzima (1-100 mU/mg de proteína) com asialo-α 1 AGP (a 1-10 mg/ml) para comparar a capacidade da sialiltransferase de interesse de sialilar os glicopeptídeos em relação ou a ST6Gal I ou a ST3Gal II ou às duas sialiltransferases. Alternativamente, outros glicopeptídeos ou glicopeptídeos ou oligossacarídeos ligados em N liberados enzimaticamente do esqueleto do peptídeo podem ser usados no lugar de asialo-α 1 AGP para esta avaliação. A sialiltransferases com a capacidade de sialilar oligossacarídeos ligados em N de glicopeptídeos mais eficientemente do que ST6Gal I são úteis em um processo prático em grande escala para a sialilação de peptídeos (conforme ilustrado para ST3Gal III nesta descrição). 4) Outras Glicosiltransferases
[00949] Os versados na técnica compreenderão que outras glicosiltransferases podem também ser usadas em substituição nos ciclos de transferase análogos, conforme foi descrito detalhadamente para a sialiltransferase. Mais especificamente, a glicosiltransferase pode também consiste, por exemplo, em glicosiltransferases, tais como Alg8 (Stagljov e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5977 (1994)) ou Alg5 (Heesen e outros, Eur J. Biochem. 224: 71 (1994)).
[00950] As N-acetilgalactosaminiltransferases são também úteis na colocação em prática da presente invenção. As N-acetilgalactosaminiltransferases adequadas incluem, sem limitação, α(1,3)N-acetilgalactosaminiltransferase, β(1,4)N-acetilgalactosaminiltransferases (Nagata e outros, J. Biol. Chem. 267: 12082-12089 (1992) e Smith e outros, J. Biol. Chem. 269: 15162 (1994)) e peptídeo N- acetilgalactosaminiltransferase (Homa e outros, J. Biol. Chem. 268: 12609 (1993)). As N- acetilglicosaminiltransferases adequadas incluem GnTI (2.4.1.101, Hull e outros, BBRTC 176: 608 (1991)), GnTII, GnTIII (Ihara e outros, J. Biochem. 113: 692 (1993)), GnTIV, GnTV (Shoreibah e outros, J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)) e GnTVI, N-acetil glicosaminiltransferase ligadas com O (Bierhuizen e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9326 (1992)), N-acetilglicosamino-1-fosfato transferase (Rajput e outros, Biochem J. 285: 985 (1992) e hialuronan sintase.
[00951] As manosiltransferases são úteis para a transferência de porções modificadas de manose. As manosiltransferases adequadas incluem α(1,2)manosiltransferase, α(1,3)manosiltransferase, α(1,6)manosiltransferase, β(1,4)manosiltransferase, Dol-P- Man sintase, OCh1 e PmtI (vide, Kornfeld e outros, Annu. Rev. Biochem. 54: 631-664 (1985)).
[00952] As xilosiltransferases são também úteis na presente invenção. Vide, por exemplo, Rodgers e outros, Biochem. J., 288: 817-822 (1992); e Elbain e outros, Patente U.S. 6.168.937.
[00953] Outros ciclos adequados de glicosiltransferase são descritos em Ichikawa e outros, JACS 114: 9293 (1992), Wong e outros, J. Org. Chem. 57: 4343 (1992), e Ichikawa e outros em CARBOHYDRATES AND CARBOHYDRATE POLYMERS, Yaltami, ed. (ATL Press, 1993).
[00954] As glicosiltransferases procarióticas são também úteis na colocação em prática da invenção. Tais glicosiltransferases incluem enzimas implicadas na síntese de lipo-oligo-sacarídeos (LOS) que são produzidos por muitas bactérias ram negativas. Os LOS tipicamente têm seqüências glicano terminais que imitam os glico-conjugados encontrados na superfície de células epiteliais humanas ou em secreções de hospedeiras (Preston e outros, Critical Reviews in Microbiology 23 (3): 139-180 (1996)). Tais enzimas incluem, sem limitação as proteínas dos óperons rfa de espécies tais como E. coli e Salmonella typhimurium, que incluem uma β1,6galactosiltransferase e uma β1,3galactosiltransferase (vide, por exemplo, EMBL Nos. de Acesso M80599 e M86935 (E. coli); EMBL No. de Acesso S5361 (S. typhimurium)), uma glicosiltransferase (Swiss-Prot No. de Acesso P25740 (E. coli ), uma β12,-glicosiltransferase (rfaJ)(Swiss-Prot No. de Acesso P27129 (E. coli) e Swiss- Prot No. de Acesso P19817 (S. typhimurium) e uma β1,2-N- acetilglicosaminiltransferase(rfaK) (EMBL No. de Acesso UOOO39 (E. coli ). Outras glicosiltransferases para as quais são conhecidas seqüências de aminoácidos incluem aquelas que são codificados por óperons tais como rfaB que foram caracterizados em organismos tais como Klebsiella pneumoniae, E. coli, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica, Yersnia enterocolitica, Mycobacterium leprosum e o óperon rhl de Pseudomonas aeruginosa.
[00955] Também adequadas para serem empregadas na presente invenção são glicosiltransferases que estão implicadas na produção de estruturas que contêm lacto-N- neotetraose, D-galactosil-β-1,4-N-acetil-D-glicosaminil-β- 1,3-galactosil-β-1,4-D-glicose, e a seqüência de trissacarídeos do grupo sangüíneo Pk, D-galactosil-a-1,4-D- galactosil-β-1,4-D-glicose, que foram identificados nos LOS dos patógenos mucosais Neisseria gonnorhoeae e N. meningitidis (Scholten e outros, J. Med. Microbiol. 41: 236-243 (1994)). Os genes de N. meningitidis e N. gonorrhoeae que codificam as glicosiltransferases implicadas na biossíntese destas estruturas foram identificados a partir dos imunótipos L3 e L1 de N. meningitidis (Jennings e outros, Mol. Microbiol. 18:729-740 (1995)) e o mutante F62 de N-gonorrhoeae (Gatshlich, J. Exp. Med. 180: 2181-2190 (1994)). Em N. meningitidis, um locus consistindo de três genes, IgtA, IgtB e IgtE codifica as enzimas glicosiltransferase necessárias para a adição dos últimos três açúcares na cadeia de lacto-N-neotetraose (Wakarchuk e outros, J. Biol. Chem. 271: 19166-73 (1996)). Recentemente foi demonstrada a atividade enzimática do produto dos genes IgtB e IgtA, proporcionando a primeira evidência direta para a sua função proposta de glicosiltransferase (Wakarchuk e outros, J. Biol. Chem. 271 (45): 28271-276 (1996)). Em N. gonorrhoeae, há dois genes adicionais, IgtD que acrescenta β=-D-GalNAc à posição 3 da galactose terminal da estrutura de lacto-N-neotetraose e IgtC que acrescenta um a-D-Gal terminal ao elemento lactose de um LOS truncado, criando assim a estrutura do antígeno do grupo de sangue Pk (Gotshlich (1994) supra). Em N. meningitidis, um imunótipo separado L1 também expressa o antígeno do grupo sangüíneo Pk e demonstrou que porta um gene IgtC (Jennings e outros, (1995), supra). A glicosiltransferase de Neisseria e genes associados são também descritos na USPN 5.545.553 (Gotschlich). Os genes para α1,2-fucosiltransferase e α1,3-fucosiltransferase provenientes de Helicobacter pylori também foram caracterizados (Martin e outros, J. Biol. Chem. 272: 21349-21356 (1997)). Também úteis na presente invenção são as glicosiltransferases de Campylobacter jejuni (vide, Taniguchi e outros, 2002, Handbook of glycosyltransferases and related genes, Springer, Tokyo). B. Sulfotransferases
[00956] A invenção também propõe processos para a produção de peptídeos que incluem moléculas sulfatadas incluindo, por exemplo, polissacarídeos sulfatados, tais como heparina, sulfato de heparan, carrageneno e compostos correlatos. As sulfotransferases adequadas incluem, por exemplo, condroitin-6-sulfotransferase (cDNA de galinha descrito por Fukuta e outros, J. Biol. Chem. 270: 18575-18580 (1995); Gen Bank No. de Acesso D49915), glicosamino- glicano N-acetil-glicosamino N-desacetilase/N- sulfotransferase 1 (Dixon e outros, Genomics 26: 239-241 (1995); UL18918) e glicosaminoglicano N-acetilglicosamina N-desacetilase/N-sulfotransferase 2 (cDNA murino descrito em Orellana e outros, J. Biol. Chem. 269: 2270-2276 (1994) e Eriksson e outros, J. Biol. Chem. 269: 10438-10443 (1994); cDNA descrito em GenBank No de Acesso U2304). C. Glicosiltransferases Ligadas a Células
[00957] Em uma outra modalidade, as enzimas utilizadas no processo da invenção são glicosiltransferases ligadas a células. Embora muitas glicosiltransferases solúveis sejam conhecidas (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.032.519), as glicosiltransferases se encontram na forma ligada a membrana quando associadas com células. Muitas das enzimas ligadas as membranas estudadas até agora são consideradas como sendo proteínas intrínsecas; isto é, elas não são liberadas das membranas por sonicação e exigem o emprego de detergentes para serem solubilizadas. As glicosiltransferases de superfície foram identificadas nas superfícies de células de vertebrados e de invertebrados, e foi também reconhecido o fato de que estas transferases de superfície conservam sua atividade catalítica em condições fisiológicas. No entanto a função mais reconhecida das glicosiltransferases das superfícies celulares é a de reconhecimento intercelular (Roth, 1990, Molecular Approaches to Supracellular Phenomena.)
[00958] Já foram desenvolvidos processos para alterar as glicosiltransferases expressas por células. Larsen e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989), por exemplo, descrevem uma abordagem genética para isolar seqüências clonadas de cDNA que determinam a expressão de estruturas de oligossacarídeos da superfície celular e suas glicosiltransferases cognatas. Uma coletânea de cDNA gerada a partir de mRNA isolado de uma linhagem de células murinas que se sabe que expressam UDP-galactose:.β.-D-galactosil- 1,4-N-acetil-D-glicosaminida α-1,3-galactosiltransferase foi transfectada em células COS-1. As células transfectadas foram então cultivadas e foi testada a sua atividade de α 1-3 galactosiltransferase.
[00959] Francisco e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2713-2717 (1992), descrevem um processo para se ancorar a β-lactamase à superfície externa de E. coli. Uma fusão de três partes, consistindo em: (i) uma seqüência de sinal de uma proteína de membrana externa, (ii) uma seção abrangendo a membrana de uma proteína de membrana externa, e (iii) uma seqüência completa de β-lactamase madura, é produzida resultando em uma molécula ativa de β-lactamase ligada a superfície. No entanto, o processo Francisco é limitado a sistemas de células procarióticas somente e conforme reconhecido pelos autores, exige a fusão de três partes completa para um funcionamento adequado. D. Enzimas de Fusão
[00960] Em outras modalidades exemplares, os processos da invenção utilizam peptídeos de fusão que têm mais de uma atividade enzimática que é implicada na síntese de um conjugado desejado de glicopeptídeo. Os peptídeos de fusão podem ser compostos em um domínio cataliticamente ativo de uma glicosiltransferase, por exemplo, que é ligado a um domínio cataliticamente ativo de uma enzima acessória. O domínio catalítico de enzima acessória pode catalisar, por exemplo, uma etapa na formação de um açúcar de nucleotídeo que é um doador para a glicosiltransferase ou que catalisa uma reação implicada em um ciclo de glicosiltransferase. Um polinucleotídeo que codifica uma glicosiltransferase, por exemplo, pode ser ligado, no quadro, a um polinucleotídeo que codifica uma enzima implicada na síntese de açúcar de nucleotídeo. O peptídeo de fusão resultante pode então catalisar não somente a síntese do açúcar de nucleotídeo, como também a transferência da porção açúcar à molécula aceitadora. O peptídeo de fusão pode consistir em enzimas de dois ou mais ciclos ligadas em uma seqüência de nucleotídeo expressável. Em outras modalidades o peptídeo de fusão inclui os domínios cataliticamente ativos de duas ou mais glicosiltransferases. Vide, por exemplo, a patente U.S. 5.641.668. Os glicopeptídeos modificados da presente invenção podem ser facilmente projetados e fabricados utilizando-se diversos peptídeos de fusão adequados (vide, por exemplo, pedido de patente PCT/CA98/01180, que foi publicado como WO 99/31224 em 24 de junho de 1999. E. Enzimas Imobilizadas
[00961] Além das enzimas ligadas as células, a presente invenção também propõe o emprego de enzimas que estão imobilizadas sobre um suporte sólido e/ou solúvel. Em uma modalidade exemplar, é proposta uma glicosiltransferase que é conjugada a um PEG por meio de um ligante glicosila intacto de acordo com os processos da invenção. O conjugado PEG-ligante-enzima é opcionalmente ligado a um suporte sólido. O emprego de enzimas sobre suporte sólido nos processos da invenção simplifica a preparação da mistura de reação e a purificação do produto de reação, e também permite a recuperação fácil da enzima. O conjugado de glicosiltransferase é utilizado nos processos da invenção. Outras combinações de enzimas e suportes ocorrerá aos versados na técnica. F. Mutagênese de Glicosiltransferases
[00962] As formas inéditas de glicosiltransferases, sialiltransferases, sulfotransferases e qualquer outra enzima usada no processo da invenção podem ser criadas usando-se qualquer um dos processos descritos anteriormente, assim como outros conhecidos dos técnicos. É especialmente interesse as transferases com uma especificidade alterada de aceitadora e/ou de doadora. Também são interessantes enzimas com taxas de conversão mais altas e um grau mais alto de estabilidade, dentre outro.
[00963] As técnicas de mutagênese se projeto racional podem ser usadas quando a seqüência do peptídeo é conhecida. Como as seqüências assim como muitas das estruturas terciárias das transferases e das glicosidases empregadas na invenção são conhecidas, estas enzimas são ideais para o projeto racional de mutantes. O sítio catalítico da enzima, por exemplo, pode ser submetido a mutação para alterar a especificidade de doador e/ou aceitador da enzima.
[00964] Os dados estruturais terciários extensos das glicosiltransferases e das glicosidase hidrolases também tornam estas enzimas ideais para mutações que abrangem trocas de domínio. As glicosiltransferases e as glicosidase hidrolases são enzimas modulares (vide, Bourne e Henrissat, 2001, Current Opinion in Structural Biology 11: 593-600). As glicosiltransferases se dividem em duas famílias com base na sua estrutura: GT-A e GT-B. As glicosiltransferases da família GT-A compreendem dois domínios dissimilares, um implicado na ligação de nucleotídeos e o outro na ligação ao aceitador. Assim, poder-se-ia convenientemente fundir a seqüência de DNA que codifica o domínio de um gene em quadro com um domínio proveniente de um segundo gene para criar um novo gene que codifica uma proteína com uma nova especificidade de aceitador/doador. Tais trocas de domínios poderiam incluir adicionalmente os módulos de carboidrato e outros domínios acessórios.
[00965] As técnicas de mutação aleatória e/ou de evolução direcionada, conforme descrito acima, podem também ser usadas para se criar formas inéditas das glicosiltransferases e glicosidases usadas na invenção. IV. Sistemas de Expressão in vitro e in vivo A. Células para a Produção de Glicopeptídeos
[00966] A ação de glicosiltransferases é vital para a glicosilação de peptídeos, assim, a diferença na expressão de um conjunto de glicosiltransferases em qualquer tipo de célula dado afeta o padrão de glicosilação em qualquer peptídeo dado produzido naquela célula. Para uma revisão de glicosilação de peptídeos dependente de célula hospedeira, vide Kabata e Takasaki, "Structure and Buiosynthesis of Cell Surface Carbohydrates," em Cell Surface Carbohydrates and Cell Development, 1991, pp. 1-24, Eds. Minoru Fukuda, CRC Press, Boca Raton, FL.
[00967] De acordo com a presente descrição, o tipo de célula em que o peptídeo é produzido é relevante somente no tocante ao grau de remodelação necessário para se gerar um peptídeo que tenha a glicosilação desejada. O número e a seqüência de reações de digestão enzimática, por exemplo, e o número e seqüência de reações sintéticas enzimáticas que são necessárias in vitro para gerar um peptídeo que tenha a glicosilação desejada variará dependendo da estrutura do glicano sobre o peptídeo produzido por um tipo específico de célula. Embora a invenção não deva de nenhum modo ser interpretada como sendo limitada à produção de peptídeos provenientes de qualquer tipo específico de célula, inclusive de qualquer tipo de célula descrito no presente, será agora apresentada uma discussão de diversos sistemas de células que estabelece a potência da presente invenção e a sua independência do tipo de célula em que os peptídeos são gerados.
[00968] Em geral, e para se expressar um peptídeo a partir de um ácido nucléico que o codifica, o ácido nucléico deve ser incorporado a um cassete de expressão, compreendendo um elemento promotor, um elemento terminador, e a seqüência de codificação do peptídeo ligada de modo operável entre os dois. O cassete de expressão é então ligado de modo operável para dentro de um vetor. Para tal fim, podem ser empregados adaptadores e ligantes para ligar os fragmentos de nucleotídeos ou outras manipulações podem ser usadas para se prover sítios de restrição convenientes, remoção de nucleotídeos supérfluos, remoção de sítios de restrição e semelhantes. Para tal fim, a mutagênese in vitro, a reparação de primers, restrição, desnaturação, re- substituições, tais como transições e transversões podem estar implicadas. Um vetor de vaivém tem os elementos genéticos necessários para a replicação em uma célula. Alguns vetores podem ser replicados somente em procariontes, ou podem ser replicados tanto em procariontes como em eucariontes. Tal vetor de expressão de plasmídeo será conservado em um ou mais sistemas de replicação, de preferência em dois sistemas de replicação, que permite a manutenção estável no interior de uma célula hospedeira de levedura para fins de expressão, e no interior de uma hospedeira procariótica para fins de clonagem. Muitos vetores com diversas características estão agora disponíveis no comércio. Os vetores são geralmente plasmídeos ou fagos, mas podem também ser cosmídios ou mini-cromossomas. É conveniente que muitos vetores disponíveis no comércio tenham o promotor e terminador do cassete de expressão já presentes, e um sítio de ligantes múltiplos onde possa ser inserida a seqüência de codificação para o peptídeo interesse. O vetor de vaivém contendo o cassete de expressão é então transformado em E. coli onde ele é replicado durante a divisão celular para gerar um preparado de vetor que é suficiente para transformar as células hospedeiras do sistema de expressão escolhido. A metodologia acima é conhecida dos versados na técnica, e protocolos a serem seguidos podem ser encontrados em Sambrook e outros (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York).
[00969] O vetor, uma vez purificado das células em que foi amplificado é então transformado nas células do sistema de expressão. O protocolo para a transformação dependia do tipo da célula e da natureza do vetor. Os transformantes são cultivados em um meio nutriente adequado, e nos casos em que é apropriado, mantido a pressão seletiva para assegurar a retenção do DNA endógeno. Nos casos em que a expressão é induzível, permite-se o crescimento da levedura hospedeira para produzir um alto grau de densidade de células, induzindo-se então a expressão. O peptídeo heterólogo maduro segregado pode ser coletado por qualquer meio convencional e purificado por cromatografia, eletroforese, diálise, extração solvente-solvente, e semelhantes.
[00970] As técnicas de clonagem molecular são conhecidas na técnica. Além disso as técnicas para o procedimento da clonagem molecular podem ser encontradas em Sambrook e outros (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York); Glover e outros, (1985, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II); Gait e outros, (1985, Oligonucleotide Synthesis); Hames e Higgins (1985, Nucleic Acid Hybridization); Hames e Higgins (1984, Transcription and Translation); Freshney e outros, (1986, Animal Cell Culture); Perbal, (1986, Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press); Perbal, (1984, A Practical Guide To Molecular Clining); Ausubel e outros (2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). B. Fungos e Leveduras
[00971] Os peptídeos produzidos em leveduras são glicosilados e as estruturas de glicanos presentes sobre eles são principalmente estruturas de alto teor de manose. No caso de N-glicanos, as estruturas de glicanos produzidas em leveduras podem conter até nove ou mais resíduos de manose que podem ou não conter açúcares adicionais acrescentados a eles. Um exemplo do tipo de glicano nos peptídeos produzidos por células de levedura é mostrado na Figura 5, lado esquerdo. Independentemente do número de resíduos de manose e do tipo e complexidade de açúcares adicionais acrescentados a eles, os N-glicanos como componentes de peptídeos produzidos em células de levedura compreendem uma estrutura de núcleo de trimanosila conforme mostrado na Figura 5. Quando a estrutura de glicano sobre um peptídeo produzido por uma célula de levedura é uma alta estrutura de manose, é um procedimento simples para o perito a remoção, in vitro, e com o emprego de enzimas manosidase disponíveis, de todos os resíduos de manose da molécula exceto aqueles que constituem o núcleo de trimanosila do glicano, gerando deste modo um peptídeo que tem uma estrutura elementar de núcleo de trimanosila ligada a ele. Agora, empregando-se as técnicas da área e de posse da presente descrição, é simples se acrescentar enzimaticamente, in vitro, porções adicionais de açúcar à estrutura elementar de núcleo de trimanosila, para gerar um peptídeo que tem a estrutura de glicano desejada ligada a ele. De modo análogo, quando o peptídeo produzido pela célula de levedura compreende uma estrutura de alto teor de manose além de outros açúcares complexos ligados a ele, é simples se clivar fora enzimaticamente todos os açúcares adicionais, inclusive os resíduos excedentes de manose, para se chegar à estrutura elementar de núcleo de trimanosila. Uma vez produzida a estrutura elementar de núcleo de trimanosila, é possível a geração do peptídeo que tem a glicosilação desejada, seguindo-se as instruções providas no presente documento.
[00972] "Leveduras" designa leveduras asco-esporógenas (Endomycetales), basídio-esporógenas, e leveduras pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). As leveduras asco-esporógenas são dividas em duas famílias, de Spermophthoraceae e de Saccharomycetaceae. Esta última é constituída por quatro subfamílias, Schizosaccharomycoideae (o gênero Schizosaccharomyces, por exemplo), Nadsonioideae, Lipomycoideae e Saccharomycoideae (os gêneros Pichia, Kluyveromyces e Saccharomyces, por exemplo). As leveduras basídio-esporógenas incluem os gêneros Leucosporidium rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium e Filobasidiella. As leveduras que pertencem aos Fungi Imperfecti são divididas em duas famílias, Sporobolomycetaceae (os gêneros Sporobolomyces, Bullera, por exemplo), e Cryptococcaceae (o gênero Candida, por exemplo). São especialmente interessantes para a presente invenção as espécies dentro dos gêneros Saccharomyces, Pichia, Aspergillus, Trichoderma, Kluyveromyces, especialmente K. lactis e K. drosophilum, Candida, Hansenula, Schizpsaccaromyces, Yarrowia e Chrysoporium. Como a classificação da levedura pode se alterar no futuro, para os fins da presente invenção, leveduras serão definidas conforme descrito em Skinner e outros, eds. 1980) Biology and Activities of yeast (Soc. App. Bacteriol. Symp. Serie No. 9).
[00973] Além do exposto acima, presume-se que os versados na técnica estão familiarizados com a biologia de leveduras e com a manipulação da genética de leveduras. Vide, por exemplo, Bacila e outros, eds. (1978, Biochemistry and Genetics of Yeast, Academic Press, Nova York); e Rose e Harrison (1987, The Yeasts (2a edição) Academic press, London). Os processos de introdução de DNA exógeno em hospedeiras de leveduras são conhecidos na técnica. Há uma ampla variedade de processos para a transformação de leveduras. A transformação de esferoplastos é descrita por Hinnen e outros (1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1919-1933); Beggs (1978, Nature 275 (5676); 104-109); e Stinchcomb e outros, (EPO Publication No. 45.573; incorporada ao presente documento a título de referência). Becker e Gaurante (1991, Methods Enzymol. 194: 182-187) instruem sobre eletroporação. Gietz e outros (2002, Methods Enzymol. 350: 87-96) e Mount e outros (1996, Methods Mol. Biol. 53: 139-145) instruem sobre acetato de lítio. Para uma revisão de sistemas de transformação de leveduras diferentes de Saccharomyces, vide Wang e outros (Crit. Rev. Biotechnol. 2001: 21(3): 177-218). Para procedimentos gerais sobre engenharia genética de leveduras, vide Barr e outros, (1989, Yeast genetic engeneering, Butterworths, Boston).
[00974] Além de células de leveduras e de fungos do tipo nativo, há também cepas de leveduras e de fungos que sofreram mutação e/ou foram selecionadas para aumentar o nível de expressão do gene exógeno, e a pureza, o processamento pós tradução do peptídeo resultante, e a recuperação e pureza do peptídeo maduro. A expressão de um peptídeo exógeno pode também ser dirigida à via secretora da célula, conforme ilustrado pela expressão de insulina (vide Kjeldsen, 2000, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 277-286, e as referências citadas ali). Em geral, para se fazer com que o peptídeo exógeno seja segregado a partir da célula de levedura, podem ser usados sinais de secreção derivados de genes de levedura, tais como os dos genes da toxina exterminadora (Stark e Boyd, 1986, EMBO J. 5: 1995-2002) ou do feromônio alfa (kurjan e Herskowitz, 1982, Cell 30:933; Brake e outros, 1988, Yeast 4: S436).
[00975] No tocante a fungos filamentosos em geral, os processos de manipulação genética podem ser encontrados em Kinghorn e Turner (1992, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Nova York). As instruções sobre os vetores adequados podem ser encontradas em Martinelli e Kinghorn (1994, Aspergillus: 50 years, Elsevier, Amsterdam). 1. Saccharomyces
[00976] Em Saccharomyces, os vetores de levedura adequados para serem empregados na produção de um peptídeo incluem YRp7 (Struhl e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach e outros, Gene 8: 121133, 1979), vetores POT (Kawasaki e outros, patente U.S. No. 4.931.373, que é incorporada ao presente documento a título de referência), pJDB249 e pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104-108, 1978) e seus derivados. Os promotores preferidos para serem usados em leveduras incluem promotores para a expressão do gene glicolítico da levedura (Hitzeman e outros, J. Biol. Chem. 255: 12073-12080, 1980; Alber e Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, patente U.S. No. 4.599.311) ou dos genes de álcool desidrogenase (Young e outros, em Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender e outros, (eds), p. 355, Plenum Nova York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983) e o promotor ADH2-4c (Russell e outros, Nature 304: 62-654, 1983; Irani e Kilgore, pedido de patente U.S. No. de Série 07/784.653, CA 1.304.020 e EP 284.044, que são incorporadas ao presente documento a título de referência). As unidades de expressão podem também incluir um terminador de transcrição. Um terminador preferido de transcrição é o terminador TPII (Alber e Kawasaki, ibid.).
[00977] Exemplos de tais vetores de vaivém levedura- bactérias incluem Yep24 (Botstein e outros (1979) Gene: 17-24; pC1 (Brake e outros (2984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646) e Yrp17 (Stnichomb e outros (1982) J. Mol. Biol. 158: 157). Além disso um vetor de expressão de plasmídeo pode ser um plasmídeo de um número grande ou pequeno de cópias, variando em geral o número de cópias de aproximadamente 1 a aproximadamente 200. No caso de vetores de levedura com grande numero de cópias haverá pelo menos 10, de preferência pelo menos 20 e habitualmente não excedendo aproximadamente 150 cópias do vetor em uma única hospedeira. Dependendo do peptídeo heterólogo selecionado, pode ser desejável ou um vetor de grande ou de pequeno numero de cópias, dependendo do efeito do vetor e do peptídeo recombinante sobre a hospedeira. Vide, por exemplo, Brake e outros (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646. As construções de DNA da presente invenção podem também ser integradas a um genoma de levedura por um vetor de integração. Exemplos de tais vetores são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Botstein e outros (1979) Gene 8:17-24.
[00978] A seleção de hospedeiras de leveduras ou de outros microorganismos adequados para se colocar em prática a presente invenção está dentro da habilidade dos versados na técnica. São especialmente interessantes as espécies de Saccharomyces, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis e S. oviformis. Quando se selecionam células de hospedeira de leveduras para a expressão de um peptídeo desejado, células hospedeiras adequadas podem incluir as que apresentam, entre outras características, boa capacidade de secreção, baixa atividade proteolítica e um vigor geral. As leveduras e outros microorganismos são geralmente disponíveis de uma variedade de fontes, incluindo o Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, Universidade de Califórnia, Berkeley, Calif; e a American Type Culture Collection, Manassas VA. Para uma revisão vide Strathern e outros, eds. (1981, The Molecular Biology of the Yeast Sccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Os processos de introdução de DNA exógeno em hospedeiras de leveduras são bem conhecidos na técnica. 2. Pichia
[00979] O emprego de Pichia methanolica como uma célula hospedeira para a produção de peptídeos recombinantes é descrito nos Pedidos PCT WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, e WO 98/02565. As moléculas de DNA para serem empregadas na transformação de P. methanolica são habitualmente preparadas como plasmídeos circulares de dois filamentos, que são de preferência linearizados antes da transformação. Para a produção de peptídeos em P. methanlica, é preferível que o promotor e o terminador no plasmídeo sejam o de um gene de P. methanolica, tal como o gene de utilização de álcool de P. methanolica (AUG1 ou AUG2). Outros promotores úteis incluem os genes de diidróxi-acetona sintase (DHAS), formiato desidrogenase (FMD) e catalase (CAT), assim como os descritos na patente U.S. No. 5.252.726. Para facilitar a integração do DNA no cromossoma da hospedeira, é preferível se ter o segmento integral de expressão do plasmídeo flanqueado nas duas extremidades por seqüências de DNA da hospedeira. Um marcador selecionável preferido par ser usado em Pichia methanolica é um gene ADE2 de P. methanolica, que codifica a fosforibosil-5-amino-imidazol carboxilase (AIRC; EC 4.1.1.21) que permite que células hospedeiras ade2 cresçam na ausência de adenina. Para processos industriais de grande escala, onde é desejável se reduzir ao mínimo o emprego de metanol, as células hospedeiras em que ambos os genes de utilização de metanol (AUG1 e AUG2) são apagados e são preferidos. Para a produção de peptídeos segregados, as células hospedeiras com deficiência de genes de protease vacuolar (PEP4 e PRB1) são as preferidas. A eletroporação é usada para facilitar a introdução de um plasmídeo contendo DNA que codifica um peptídeo de interesse para dentro de células de P. methanolica. É preferível se transformar células de P. methanolica por eletroporação empregando-se um campo elétrico pulsado de decomposição exponencial com uma intensidade de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, de preferência de aproximadamente 3,75 kV/cm e uma constante de tempo (t) de 1 a 40 milissegundos, sendo o mais preferível de aproximadamente 20 milissegundos. Para uma revisão do emprego de Pichia pastoris para a produção em grande escala de fragmentos de anticorpos, Vide Fischer e outros, (1999, Biotechnol. Appl. Biochem. 30 (Pt 2): 117-120). 3. Aspergillus
[00980] Os processos de se expressar peptídeos em Aspergillus spp. são bem conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, os descritos em Carrez e outros, 199, Gene 94: 147-154; Contreras, 1991, Bio/Technology 9: 378-381; Yelton e outros, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474; Tilburn e outros, 1983, Gene 26: 205-221; Kelly e Hynes, 1985, EMBO J. 4: 475-479; Ballance e outros, 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 112: 284-289; Buxton e outros, 1985.Gene 37: 207-214, e Patente U.S. 4.935.349, incorporados ao presente documento a título de referência. Exemplos de promotores úteis em Aspergillus são encontrados na patente U.S. 5.252.726. Cepas de Aspergillus úteis para a expressão de peptídeos são encontradas na Patente U.S. 4.935.349. A produção comercial de peptídeos exógenos é disponível de Novoenzymes para Aspergillus niger e Aspergillus oryzae. 4. Trichoderma
[00981] Trichoderma tem determinadas vantagens em relação a outras espécies de células hospedeiras recombinantes para a expressão dos peptídeos desejados. Este organismo é fácil de se criar em grandes quantidades e tem a capacidade de se glicosilar e de segregar eficientemente com alto rendimento de peptídeos de mamíferos recombinantes para dentro do meio, tornando relativamente fácil o isolamento do peptídeo. Além disso, o padrão de glicosilação sobre peptídeos expresso apresenta uma maior semelhança aos peptídeos humanos do que peptídeos expressos em outros sistemas. No entanto, ainda há diferenças nas estruturas de glicanos nos peptídeos expressos a partir destas células. Os resíduos de ácido siálico terminal, por exemplo, são importantes para a função terapêutica de um peptídeo em um sistema de mamífero, uma vez que a presença destas porções na extremidade da estrutura de glicano impede a eliminação do peptídeo da corrente sangüínea de mamíferos. Acredita-se que o mecanismo por trás da meia vida biológica maior das moléculas sialiladas resida no seu grau menor de reconhecimento por lectinas (Drickamer, 1988, J. Biol. Chem. 263: 9557-9560). No entanto em geral as células fúngicas não acrescentam resíduos de ácido siálico terminal a glicanos sobre peptídeos e os peptídeos sintetizados em células fúngicas são, portanto, asiálicas. De acordo com a presente invenção, esta deficiência pode ser remediada empregando-se processos da presente invenção de remodelagem de glicano in vitro descritos detalhadamente no presente.
[00982] As espécies de Trichoderma úteis como hospedeiras para a produção de peptídeos a serem remodelados, incluem T. reesei, tais como QM6a, ALKO2442 ou CBS383.78 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, PO Box 273, 3740 AG Baarn, Países Baixos, ou ATCC 13631 (American Type Culture Collection, Manassas VA, 10852, USA, tipo); T. viride (tal como CBS189.79 (det. W. Gams); T. longibrachiatum, tal como CBS816.68 (tipo); T. pseudokoningii (tal como MULC19358; Mycotheque de l'Université Catholique de Louvain); T. saturnisporum CBS330.70 (tipo); T. harzianum CBS316.31 (DET. W. Gams); T. virgatum (T.pseudokoningii) ATCC24961. O mais preferível é que a hospedeira seja T. reesei e mais preferível que seja de cepas QM9414 (ATCC 269212), RUT-C-30 (ATCC 56765) e de mutantes extremamente produtivos de T. reesei tais como VTT-D-79125, que deriva de QM9414 (Nevalainen, Technical Research Centre of Finland Publications 26 (1985), Espoo, Finlândia).
[00983] A transformação de Trichoderma com DNA é conduzida empregando-se qualquer técnica conhecida, inclusive de acordo com as instruções contidas na patente européia No. EP0244234, Harkki (1989, Bio/Technology 7: 596-60) e Uusitalo (1991, J. Biotech. 17:35-50). A cultura de Trichoderma é sustentada por experiência extensa anterior em técnicas de fermentação em escala industrial; vide Finkelstein, 1992, Biotechnology of Filamentous Fungi: Technology and Products, Butterworth-Heinemann, publishers, Stoneham, Mass, por exemplo. 5. Kluyveromyces
[00984] As leveduras que pertencem ao gênero Kluyveromyces vem sendo usadas como organismos hospedeiros para a produção de peptídeos recombinantes. Os peptídeos produzidos por este gênero de levedura s/ao, especificamente, quimosina (patente européia 96.430), taumatina (patente européia 96.910), albumina, interleucina-1 β, TPA, TIMP (patente européia 361 991) e derivados de albumina que têm uma função terapêutica (patente européia 413 622). As espécies de interesse específico no gênero Kluyveromyces incluem K. lactis.
[00985] Os processos de expressão de peptídeos recombinantes em Kluyveromyces ssp. são bem conhecidos na técnica. Os vetores para a expressão e secreção de peptídeos recombinantes humanos em Kluyveromyces são conhecidos na técnica (Yeh, J. Cel. Biochem. Suppl. 14C:68, Abst. H402; Fleer, 1990, Yeast 6 (Edição Especial) 2449) assim como os procedimentos para a transformação e expressão de peptídeos recombinantes (Ito e outros, 1983, J. Bacteriol. 153: 163-168; van den Berg, 1990, Bio/Technology 8: 135-139; patente U.S. No. 5.633.146, WO8304050A1, EP009691, EP0241435, EP0301670, EP0361991, todos os documentos integralmente incorporados ao presente documento a título de referência). Para uma revisão de manipulação genética de plasmídeos de DNA linear de Kluyveromyces lactis por direcionamento genético e por rearranjo de plasmídeos, vide Schaffrath e outros (1999, FEMS Microbiol. Lett. 178 (2): 201-210). 6. Chrysoporium
[00986] O gênero fúngico Chrysoporium tem sido usado recentemente para expressar peptídeos recombinantes exógenos. Uma descrição dos procedimentos pelos quais os versados na técnica podem utilizar Chrysoporium para expressão de peptídeos exógenos se encontra em WO 00/20555 (incorporada ao presente documento a título de referência integralmente). As espécies especialmente adequadas para o sistema de expressão incluem, sem limitação, C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. fastidium, C. filiforme. C. gerogiae, C. globiferum, C. globiferum, var. articulatum, C. globiferum var. niveum, C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium, var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium. C. merdarium var. roseum, C. minor, C. pannicola. C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. peodomerderium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undulatum, C. vallenarense, C. vespertilium, e C. zonatum. 7. Outros
[00987] Os processos para a transformação de Schwanniomyces são descritos na patente européia 394 538. Os processos para a transformação de Acremonium chrysogenum são descritos pela patente U.S. 5.162.228. Os processos para a transformação de Neurospora são descritos pela patente U.S. 4.486.533. Também é conhecido um sistema de expressão especificamente para Schizosaccharomyces pombe (patente européia 385 391). Processos gerais para a expressão de peptídeos em levedura de fissão, Schizosaccharomyees pombe podem ser encontrados em GigaHama e Kumagai (1997, Foreign gene expression in fission yeast: Schizosaccharomyces pombe, Springer, Berlin). C. Sistemas de Mamíferos
[00988] Conforme discutido acima, as células de mamíferos tipicamente produzem uma mistura heterogênea de estruturas de N-glicanos que variam no tocante ao número e arranjo de açúcares adicionais fixados ao núcleo de trimanosila. Tipicamente, as células de mamíferos produzem peptídeos que têm uma estrutura de glicanos complexa, tal como a mostrada na Figura 4, lado direito. Empregando-se os processos da presente invenção, um peptídeo produzido em uma célula de mamífero pode ser remodelado in vitro para gerar um peptídeo que tem uma glicosilação desejado identificando-se primeiro a estrutura primária de glicano, e determinando-se então quais os açúcares que devem ser removidos a fim de se remodelar a estrutura de glicano. Conforme discutido no presente, os açúcares a serem removidos determinam quais as enzimas de clivagem que serão usadas e assim, as etapas precisas do processo de remodelagem variarão dependendo da estrutura primária de glicano usada como o substrato inicial. Um esquema de amostra para a remodelagem de uma estrutura de glicano habitualmente produzido em células de mamíferos é mostrado na Figura 3. A via biossintética de N-glicanos em células de mamíferos foi bem caracterizada (resenhada em Moremen, 1994, Glycobiology 4: 113-125). Muitas das enzimas necessárias para a síntese dos glicanos já foram identificadas, e as linhagens de células mutantes com deficiência desta via enzimática foram isoladas incluindo as linhagens de células ovarianas do hamster chinês (CHO) Lec23 (com deficiência de alfa-glicosidase I) e Lec18 (GlcNAc-TVIII inéditas). O padrão de glicosilação dos peptídeos produzidos por estas células mutantes é alterado em relação às células CHO normais. Conforme discutido no presente, os defeitos de glicosilação nestas células e em outras mutantes podem ser explorados para os fins de se produzir um peptídeo que carece de uma estrutura complexa de glicano. Os peptídeos produzidos por células Lec23, por exemplo, carecem de resíduos de ácido siálico e, portanto, necessitam de menos manipulação enzimática a fim de reduzir a estrutura de glicanos a um núcleo elementar de trimanosila ou a Man3GlcNAc4. Portanto, os peptídeos produzidos nestas células podem servir como substratos preferidos para a remodelagem de glicanos. Os versados na técnica poderiam isolar ou identificar outras linhas de células com deficiência de glicosilação com base em processos conhecido, o processo descrito em Stanley e outros, 1990, Somatic Cell Mol. Genet., 16: 211-223, por exemplo. O emprego de linhagens de células com deficiência de glicosilação, tanto as identificadas como as que ainda não foram identificadas, é incluído na invenção com o fim de gerar substratos de peptídeos preferidos para os processos de remodelagem descritos no presente.
[00989] Os vetores de expressão úteis para a expressão de peptídeos exógenos em células de mamíferos são numerosos, e são bem conhecidos dos versados na técnica. Muitos vetores de expressão de mamíferos são agora disponíveis no comércio de companhias que incluem Novagen, Ine (Madison, WI), Gene Therapy Systems (San Diego, CA), Promega (Madison, WI), ClonTech Inc. (pala Alto, CA), e Stratagene (La Jolla, CA), dentre outras.
[00990] Há diversas linhagens de células de mamíferos que são especialmente aptas para expressar peptídeos exógenos. As linhagens de células de mamíferos tipicamente se originam de células tumorais extraídas de mamíferos que foram imortalizadas, isto é, em cultura elas podem se replicar essencialmente indefinidamente. Estas linhagens de células incluem, sem limitação, CHO (ovarianas de hamster chinês, tais como CHO-Kl; ATCC No. CCL 61) e suas variantes, NSO (mieloma murino), BNK, BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), BHK (ATCC No. CRL 1632), Per.C6TM (células humanas imortalizadas, Crueell N.V., Leiden, Países Baixos), COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), HEK 293, células H murinas, linhagens de células T linfóides, células BW5147 e MDCK (rim canino Madin-Darby), HeLa (humano), A549 (carcinoma pulmonar humano), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham e outros, 1977, Gen. Virol. 36:59-72), BGMK (rim de Macaco Buffalo Green), Hep-2 (carcinoma epidermóide de laringe humano), LLCMK2 (rim de Macaco African Green), McCoy, NCI-H292 (tubo de carcinoma mucoepidermóide pulmonar humano), RD (rabdomiossarcoma), Vero (rim de Macaco African Green), HEL (pulmão embrionário humano), Pulmão Fetal Humano, MRC5 (pulmão embrionário humano), MRHF (prepúcio humano), e WI-38 (pulmão embrionário humano). Em alguns casos, as células em que o peptídeo terapêutico é expressão podem ser células derivadas do paciente a ser tratado ou elas podem ser derivadas de um outro mamífero relacionado ou não. As células fibroblastos, por exemplo podem ser isoladas do tecido da pele do mamífero e cultivadas e transformadas in vitro. Esta tecnologia é disponível no comércio de Transkaryotic Therapies, Inc. (Cambridge, MA). Praticamente todas as linhagens de células usadas atualmente são disponíveis de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e de Bio Whittaker (Walkersville, Maryland).
[00991] As células de mamíferos podem ser transformadas com DNA empregando-se qualquer uma de diversas técnicas que são conhecidas dos versados na técnica. Tais técnicas incluem, sem limitação, transformação de fosfato de cálcio (Chen e Okayama, 1988 ; Graham e van der Eb, 1973; Corsaro e Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7: 603), transfecção de dietilaminoetil(DEAE)-dextrano (Fujita e outros, 1986; Lopata e outros, 1984; Selden e outros, 19-86,), eletroporação (Neumann e outros, 1982, ; Porter, 1988; Potter e outros, 1984,; Wong e Neuman, 1982), transfecção de reagente de lipídio catiônico (Elroy-Stein e Moss, 1990; Feigner e outros, 1987; Rose e outros, 1991; Whitt e outros, 1990; Hawley-Ne1son e outros, 1993, Focus 15: 73; Ciccarone e outros, 1993, Focus 15:80), retroviral (Cepko e outros, 1984; Miller e Baltimore, 1986; Pear e outros, 1993; Austin e Cepko, 1990; Bodine e outros, 1991; Fekete e Cepko, 1993; Lemischka e outros, 1986; Turner e outros, 1990; Williams e outros, 1984; Miller e Rosman, 1989, BioTechniques 7: 980-90; Wang e Finer, 1996, Nature Med. 2:714-6), polibreno (Chaney e outros, 1986; Kawai e Nisrnzawa, 1984), microinjeção (Capecchi, 1980), e fusão de protoplastos (Rassoulzadegan e outros, 1982; Sandri-Goldin e outros, 1981; Schaffer, 1980), dentre outros. In general, vide Sambrook e outros (2001, Mo1ecular Cloning: A Laboratory Manual, Co1d Spring Harbor Laboratory, New York) e Ausube1 e outros (2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) para técnicas de transformação.
[00992] Recentemente o sistema de baculovírus, popular para a transformação de células de insetos, foi adaptado para a transformação estável de células de mamíferos (vide, para a resenha, Koat e Condreay, 2002, Trends Biotechnol. 20: 173-180, e as referências citadas nele). A produção de peptídeos recombinantes em células cultivadas de mamíferos é descrita, por exemplo, nas patentes U.S. 4.713.339.4.784.950; 4.579.821; e 4.656.134. Diversas companhias oferecem os serviços de transformação e cultura de células de mamíferos, incluindo-se Cell Trends, Inc. (Middletown, MD). As técnicas para a cultura de células de mamíferos são bem conhecidas na técnica, e se encontram ainda em Hauser e outros (1997, Mammalian Cell Biotechnologv. Walter de Gruyer, Inc., Hawthome, NY), e Sambrook e outros (2001, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor e referências citadas nele. D. Insetos
[00993] As células de insetos e especialmente, células cultivadas de insetos, expressam peptídeos que têm estruturas de glicanos ligados por N que são raramente sialiladas e geralmente compreendem resíduos de manose que podem ou não ter resíduos de fucose adicionais afixados a elas. Exemplos dos tipos de estruturas de glicanos presentes em peptídeos produzidos em células cultivadas de insetos são mostradas na Figura 7 e nos glicanos de manose seus.
[00994] A expressão mediada por baculovírus em células de insetos foi especialmente bem estabelecida para a produção de peptídeos recombinantes (Altmann e outros, 1999, Glycoconjugate J.16: 109-123). No tocante ao dobramento do peptídeo e ao processamento pós-tradução, as células de insetos são superadas somente por linhagens de células de mamíferos. No entanto, conforme observado acima a N-glicosilação de peptídeos em células de insetos difere em muitos sentidos da N-glicosilação em células de mamíferos especialmente pelo fato das células de insetos freqüentemente gerarem estruturas de glicanos truncadas que compreendem oligossacarídeos contendo somente três ou mesmo somente dois resíduos de manose às vezes. Estas estruturas podem ser adicionalmente substituídas com resíduos de fucose.
[00995] De acordo com a presente invenção, um peptídeo produzido em uma célula de inseto pode ser remodelado in vitro para gerar um peptídeo com gicosilação desejada removendo-se opcionalmente primeiro qualquer resíduo de fucose substituído empregando-se uma enzima fucosidase adequadas. Nos casos em que o peptídeo compreende uma estrutura elementar de núcleo de trimanosila depois da remoção dos resíduos de fucose, então tudo que é necessário é a adição in vitro de açúcares adequados à estrutura do núcleo de trimanosila para gerar um peptídeo que tem a glicosilação desejada. Nos casos em que o peptídeo poderia conter somente dois resíduos de manose na estrutura de glicano depois da remoção de qualquer resíduo de fucose, um terceiro resíduo de manose pode ser adicionado utilizando- se uma enzima manosiltransferase e uma molécula doadora adequada tal como GDP-manose, sendo em seguida adicionados os resíduos adequados para gerar um peptídeo que tem a glicosilação desejada.
[00996] Os protocolos para o emprego de baculovírus para transformar células de insetos são bem conhecidos dos versados na técnica. Diversos livros foram publicados que propõem os procedimentos para a utilização do sistema de baculovírus para expressar peptídeos em células de insetos. Estes livros incluem, sem limitação, Richardson (Baculovirus Expression Protoco1s, 1998, Methods in Mo1ecular Bio1ogy, Vol. 39, Humana Pr), O'Reilly e outros (1994, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Dniv Press), e King e Possee (1992, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall). Além disso, há também publicações tais como Lucklow (1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-572) e Miller (1993, Curr. Opin. Genet. Dev. 3:97-101).
[00997] Muitas patentes também foram concedidas relacionadas a sistemas para a expressão baculoviral de proteínas exógenas. Estas patentes incluem, sem limitação patente U.S. No. 6.210.966 (Culture medium for insect cells 1acking glutamine an contains ammonium salt), Patente U.S. 6.090.584 (Use of BVACs (BaculoVirus Artificial Chromosomes) to produce recombinant peptides), Patente U.S. 5.871.986 (Use of a baculovirus to express a recombinant nuc1eic acid in a mammalian cell), Patente U.S. 5.759.809 (Methods of expressing peptides in insect cells and methods of ki1ling insects), Patente U.S. 5.753.220 (Cysteine protease gene defective baculovirus, process for its production, and process for the production of economic peptide by using the same), Patente U.S. 5,750,383 (Baculovirus cloning system), Patente U.S. 5.731.182 (Non-mammalian DNA virus to express a recombinant nuc1eic acid in a mammalian cell), Patente U.S. 5.728.580 (Methods and culture media for inducing sing1e cell suspension in insect cell 1ines), Patente U.S. 5.583.023 (Modified baculovirus, its preparation process and its application as a gene expression vector), Patente U.S. 5.571.709 (Modified baculovirus and baculovirus expression vectors), Patente U.S. 5.521.299 (Oligonuc1eotides for detection of baculovirus infection), Patente U.S. 5.516.657 (Baculovirus vectors for expression of secretory and membrane-bound peptides), Patente U.S. 5.475.090 (Gene encoding a peptide which enhances virus infection of host insects), Patente U.S. 5.472.858 (Production of recombinant peptides in insect larvae), Patente U.S. 5.348.886 (Method of producing recombinant eukaryotic viruses in bacteria), Patente U.S. 5.322.774 (Prokaryotic leader sequence in recombinant baculovirus expression system), Patente U.S. 5.278.050 (Method to improve the efficiency of processing and secretion of recombinant genes in insect systems), Patente U.S. 5.244.805 (Baculovirus expression vectors), Patente U.S. 5.229.293 (Recombinant baculovirus), Patente U.S. 5.194.376 (Baculovirus expression system capable of producing recombinant peptides at high levels), Patente U.S. 5.179.007 (Method and vector for the purification of recombinant peptides), Patente U.S. 5.169.784 (Baculovirus dual promoter expression vector), Patente U.S. 5.162.222 (Use of baculovirus early promoters for expression of recombinant nucleic acids in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses), Patente U.S. 5.155.037 (Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of recombinant nuc1eic acids in insect systems), Patente U.S. 5.147.788 (Baculovirus vectors and methods of use), Patente U.S. 5.110.729 (Method of producing peptides using baculoviros vectors in cultured cells), Patente U.S. 5.077.214 (Use of baculovirus early promoters for expression of recombinant genes in stably transformed insect cells), Patente U.S. 5.023.328 (Lepidopteran AKH signa1 sequence), e Patentes U.S. 4.879.236 e 4.745.051 (Method for producing a recombinant baculovirus expression vector). Todas as patentes citadas acima são integralmente incorporadas ao presente documento a título de referência.
[00998] As linhagens de células de insetos de diversas origens de espécies diferentes estão sendo atualmente usadas para a expressão de peptídeos, e estas linhagens são bem conhecidas dos versados na técnica. As linhagens de células de insetos que interessam incluem, sem limitação células de insetos dípteros e lepidópteros em geral, Sf9 e variantes suas (Spodoptera frugiperda), Estigemme acres, Trichoplusia ni, Bombyx mori, Malacosoma disstri, linhagens Kc1 e SL2 de drosófilas, dentre outras, e mosquito. E. Plantas
[00999] As células vegetais como produtores de peptídeos apresentam uma série diferente de problemas. Embora os glicanos ligados por N produzidos em plantas compreendam uma estrutura de núcleo de trimanosila, esta estrutura de pentassacarídeo pode compreender diversos açúcares adicionais diferentes conforme se pode ver na Figura 6. Em um caso, por exemplo, a estrutura de núcleo de trimanosila é substituída por um resíduo de xilose ligada em β1,2 e um resíduo de fucose ligado em α1,3. Além disso, as células vegetais podem também produzir uma estrutura Mman5GlcNAc2. Os peptídeos produzidos em células vegetais são freqüentemente extremamente antigênico como resultado da presença da xilose de α1,3 fucose no núcleo na estrutura do glicano, e são facilmente eliminadas da corrente sangüínea quando introduzidas em um mamífero devido à ausência de resíduos terminais de ácido siálico. Portanto, a não ser que estes peptídeos sejam remodelados empregando- se os processos proposto no presente, eles são geralmente considerados como inadequados como agentes terapêuticos em mamíferos. Embora se tenha constatado que alguns anticorpos monoclonais expressos em células vegetais fossem não imunogênicos em camundongos, é provável que as cadeias de glicano não fossem imunogênicas pois elas estavam enterradas na região Fc nestes anticorpos (Chargelegue e outros, 2000, Transgenic Re. 9(3): 187-194).
[001000] Seguindo-se as instruções fornecidas no presente, agora é possível se gerar um peptídeo produzido em uma célula vegetal em que um número maior de estruturas de glicano presentes sobre ela compreendem uma estrutura elementar de núcleo de trimanosila, ou uma estrutura Man3GlcNAc4. Isto se consegue clivando-se fora quaisquer açúcares adicionais in vitro empregando-se uma combinação de glicosidases adequadas, inclusive fucosidases, até que se chegue à estrutura elementar de núcleo de trimanosila ou de Man3GlcNAc4. Estas reações de clivagem devem também incluir a remoção de quaisquer resíduos de fucose ou de xilose das estruturas a fim de reduzir a antigenicidade do peptídeo final quando introduzidas em um mamífero. As células vegetais que tenham mutações que inibem a adição de resíduos de fucose e xilose à estrutura de núcleo de trimanosila são conhecidas na técnica (von Schaewen e outros, 1993, Plant Physiology 102: 1109-1118). O emprego destas células para se produzir peptídeos que têm glicanos que carecem de fucose e xilose é contemplado pela invenção. Depois da produção do núcleo elementar de trimanosila ou da estrutura de Man3GlcNAc4, os açúcares adicionais podem então ser acrescentados a ela chegando-se a um peptídeo que tem a glicosilação desejada que é, portanto, adequado para uso terapêutico em um mamífero.
[001001] As plantas transgênicas são consideradas por muitos como sendo o sistema de expressão preferido para os peptídeos farmacêuticos. Potencialmente, as plantas podem proporcionar uma fonte mais barata de peptídeos recombinantes. Foi estimado que os custos de produção de peptídeos recombinantes em plantas poderiam ser de 10 a 50 vezes mais baixos do que da produção do mesmo peptídeo em E. coli. Embora haja ligeiras diferenças no uso de códons em plantas quando se comparam com animais, estas podem ser compensadas ajustando-se as seqüências de DNA recombinante (vide, Kusnadi e outros, 1997, Biotechnol. Bioeng. 56: 473 484; Khoudi e outros, 1999, Biotechnol. Bioeng. 135-143; Hood e outros, 1999, Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147). Além disso, a síntese de peptídeos, sua secreção e modificação pós tradução são muito semelhantes em plantas e animais, com diferenças insignificantes na glicosilação das plantas (vide Fischer e outros, 2000, J. Biol. Regul. Homest. Agents 14: 83-92). Portanto, os produtos de plantas transgênicas têm uma menor probabilidade de estarem contaminadas por patógenos animais, toxinas microbianas e seqüências oncogênicas.
[001002] A expressão de peptídeos recombinantes em células vegetais é bem conhecida na técnica. Além das plantas transgênicas, os peptídeos podem também ser produzidos em culturas de células de plantas transgênicas (Lee e outros, 1997, Mol. Cell. 7: 783-787), e em plantas não transgênicas inoculadas com vírus de plantas recombinantes. Diversos livros foram publicados que descrevem os protocolos para a transformação genética de células vegetais: Potrykus (1995, Gene transfer to plants, Springer, New York), nickoloff (1995, Plant cell electroporatiqn and electrofusion protocols, humana press, Totowa, New York) e Draper (1988, plant genetic transformation, Oxford Press, Boston).
[001003] Diversos processos são atualmente usados para transformar de modo estável células vegetais com material genético recombinante. Estes processos incluem, sem limitação, transformação de Agrobacterium (Bechto1d e Pelletier, 1998; Escudero e Hohn, 1997; Hansen e Chilton, 1999; Touraev e outros, 1997), biolística (microprojectiles) (Finer e cols., 1999; Hansen and Chilton, 1999; Shilito, 1999), eletroporação de protoplastos (Fromm e outros, 1985, Ou-Lee e outros, 1986; Rhodes e outros, 1988; Saunders e outros, 1989; Trick e outros, 1997), tratamento com polietileno glicol (Sbilito, 1999; Trick e outros, 1997), microinjeção in planta (Leduc e outros, 1996; Zhou e outros, 1983), impregnação de sementes (Trick e outros, 1997), raio laser (1996), whiskers de carbida de silício (Thompson e outros, 1995; pedido de Patente U.S. 20020100077, integralmente incorporados ao presente documento a título de referência).
[001004] Muitos tipos de plantas se prestam a transformação e expressão de peptídeos exógenos. As plantas que são especialmente interessantes para expressar os peptídeos a serem usados no processo de remodelagem da invenção incluem, sem limitação, Arabidopsis thalliana, colza (Brassica spp.; Ruiz e Blumwald, 2002, Planta 214: 965-969)), soja (Glycille max), girassol (Helianthus unnuus), óleo de palmeira (Elaeis guineeis), amendoim (amendoim, Arachis hypogaea; Deng e outros, 2001, Cell. Res. 11: 156-160), coco (Cocus nucifera), mamona (Ricinus communis), cardamo (Carthamus tinctorius), mostarda (Brassica spp. e Sinapis alba), coentro (Coriandrum sativum), abobrinha (Cucurbita maxima; Spencer e Snow, 2001, Heredity 86 (Pt 6): 694-702), linhaça/linho (Linum usitatissimum; Lamblin e outros, 2001, Physio1 Plant 112: 223-232), castanha do Pará (Bertholletia excelsa), jojoba (Simmondsia chinensis), milho (Zea mays; Hood e outros, 1999, Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147; Hood e outros, 1997, Mol. Breed. 3: 291-306; Petolino e outros, 2000, Transgenic Research 9: 1-9), alfafa (Khoudi e outros, 1999, Biotechnol. Bioeng. 64: 135-143), tabaco (Nicotiana tabacum; Wright e outros, Transgenic Res. 10: 177-181; Frigerio e outros, 2000, P1ant Physiol. 123: 1483-1493; Cramer e outros, 1996, Ann. New York Acad. Sei. 792: 62-8- 71; Cabanes-Maebeteau e outros, 1999, G1ycobiology 9: 365-372; Ruggiero e outros, 2000, FEBS Lett. 469: 132-136), canola (Eai e outros, 2001, Biotecbnol. Prog. 17: 168-174; Zbang e outros, 2000, J. Anim. Sci. 78: 2868-2878)), batata inglesa (Taeket e outros, 1998, J. Infect. Dis. 182: 302-305; Riebter e outros, 2000, Nat. Biotechnol. 18: 11671171; Cbong e outros, 2000, Transgenic Res. 9: 71-78), alfafa (Wigdorovitz e outros, 1999, Virology 255: 347-353), ervilha (Pisum sativum; Perrin e outros, 2000, Mol. Breed. 6: 345352), arroz (Oryza sativa; Stoger et aI., 2000, Plant Mol. Biol. 42: 583-590), algodão (Gossypium hirsutum; Kornyeyev e outros, 2001, Pbysiol Plant 113: 323-331), cevada (Hordeum vulgare; Petersen e outros, 2002, P1ant Mol Biol. 49: 45-58); trigo (Triticum spp.; Pellegrineschi e outros, 2002, Genome 45: 421-430) e feijão (Vicia spp.; Saalbacb e outros, 1994, Mol. Gen. Genet. 242: 226-236).
[001005] Se a expressão do ácido nucléico recombinante for desejada em uma planta integral e não nas células cultivadas, as células vegetais são primeiro transformadas com o DNA que codifica o peptídeo, regenerando-se em seguida a planta. Isto abrange procedimentos de cultura tecidual que são tipicamente otimizadas para cada espécie vegetal. Os protocolos para se regenerar plantas já são bem conhecidos na técnica para muitas espécies. Além disso, os protocolos para outras espécies podem ser desenvolvidos pelos versados na técnica empregando-se uma experimentação de rotina. São disponíveis numerosos manuais de laboratório que descrevem procedimentos para a regeneração vegetal, incluindo, sem limitação Smith (2000, Plant tissue culture: tecbniques and experiments, Academic Press, San Diego), Bhojwani e Razdan (1996, Plant tissue cu1ture: theory and practice, Elsevier Science Pub., Amsterdam), Islam (1996, Plant tissue culture, Oxford & IBH Pub. Co., Nova Delhi, Índia), Dodds e Roberts (1995, Experiments in plant tissue culture, New York: Cambridge University Press, Cambridge, Inglaterra), Bhojwani (Plant tissue culture: applications and limitations, Elsevier, Amsterdam, 1990), Trigiano e Gray (2000, Plant tissue culture concepts and laboratory exercises, CRC Press, Boca Raton, Fla), e Lindsey (1991, Plant tissue culture manual: fundamentals and applications, Kluwer Academic, Boston).
[001006] Embora a purificação de peptídeos recombinantes a partir de plantas possa ser potencialmente dispendiosa, diversos sistemas foram desenvolvidos para reduzir estes custos. Um processo dirige o peptídeo sintetizado ao endosperma da semente do qual ele pode ser facilmente extraído (Wright e outros, 2001, Transgenic Res. 10: 177-181, Guda e outros, 2000, Plant Cell Res. 19: 257-262; e patente U.S. No. 5.767.379, que é integralmente incorporada ao presente documento a título de referência). Uma abordagem alternativa consiste na co-extração do peptídeo recombinante com produtos vegetais convencionais tais como amido, farinha ou óleo. Na colza de sementes oleaginosas, um peptídeo de fusão de oleosina-hurudina quando expresso na planta, se liga ao corpo oleoso da semente e pode ser extraído da semente da planta juntamente com o óleo (Parmenter, 1995, Plant Mal. Biol. 29: 11671180; Patentes U.S. 5.650.554, 5.792.922, 5.948.682 e 6.288.304, e o pedido de Patente U.S. 2002/0037303, todos incorporados ao presente documento a título de referência). Como uma alternativa a esta abordagem, a oleosina é fundida a um peptídeo que tem afinidade para o peptídeo co-expresso exógeno de interesse (patente U.S. 5.856.452, integralmente incorporada ao presente documento a título de referência).
[001007] A expressão de peptídeos recombinantes em plastídeos vegetais, tais como cloroplastos, gera peptídeos que não têm nenhuma estrutura de glicano ligada a eles, tal como ocorre nos procariontes. No entanto o rendimento de tais peptídeos é extremamente maior quando expressos nestas organelas de células vegetais, e, portanto, este tipo de sistema de expressão pode ter vantagens sobre outros sistemas. Para uma revisão geral na tecnologia para a expressão em plastídios de peptídeos exógenos em plantas superiores, vide Hager and Beck (2000, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 302-310, e referências citadas nele). A expressão de plastídeos foi especialmente bem-sucedida em tabaco (vide, por exemplo, Staub e outros, 2000, Nat. Biotechnol. 18: 333-338). F. Animais transgênicos
[001008] A introdução de um DNA recombinante no ovo fertilizado de um animal (um mamífero, por exemplo), pode ser efetuada utilizando-se qualquer número de técnicas padrão em tecnologia de animais transgênicos. Vide, por exemplo, Hogan e outros, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986; e a Patente U.S. 5.811.634, que é integralmente incorporada ao presente documento a título de referência. O mais comum é a introdução do DNA recombinante no embrião por meio de microinjeção pronuclear (Gordon e cols., 1980, PNAS 77: 7380-7384; Gordon e Ruddle, 1981, Science 214: 1244-1246; Brinster e outros, 1981, Ce1l 27: 223-231; Costantini e Lacy, 1981, Nature 294: 92-94). A microinjeção tem a vantagem de ser aplicável a uma ampla variedade de espécies. Os embriões de pré-implantação podem também ser transformados com retrovírus (Jaenisch e Mintz, 1974, Proc. Natl. Aead. Sci. D.S.A. 71: 1250-1254; Jaenisch e outros, 1976, Hamatol. Bluttransfus. 19: 341-356; Stub1mann et al, 1984, Proe. Natl. Aead. Sei. U.S.A. 81: 71517155). A transformação mediada retroviral tem a vantagem de adicionar cópias individuais do ácido nucléico recombinante à célula, mas ela produz um alto grau de mosaicismo. Mais recentemente, vêm sendo usadas técnicas mediadas por células tronco embrionárias (Gossler e outros, 1986, Proc. Natl. Aead. Sei. U.S.A.. 83: 9065-9069), transferência de segmentos cromossômicos integrais (Lavitrano e outros, 1989, Ce1l 57: 717-723), e transfecção de gameta em conjunto com fertilização in vitro (Lavitrano e outros, 1989, Ce1l 57: 717-723) também foram usadas. Diversos livros de procedimentos laboratoriais foram publicados descrevendo estas técnicas: Cid-Arregui e García-Carraneá (1998, Mieroinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols, Springer, Berlin), Clarke (2002, Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ), e Pinkert (1994, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, San Diego).
[001009] Uma vez que o DNA recombinante se encontra introduzido no ovo, o ovo é incubado durante um curto período de tempo e é então transferido para um animal pseudoprenhe da mesma espécie da qual foi obtido o ovo (Hogan e outros, supra). No caso de mamíferos, tipicamente injetam-se 125 ovos por experimento, aproximadamente dois terços dos quais sobreviverão ao procedimento. Vinte ovos viáveis são transferidos para um mamífero pseudoprenhe, quatro a dez dos quais se desenvolverão em progênie viva. Tipicamente 10-30% da progênie (no caso de camundongos) portam o DNA recombinante.
[001010] Embora o animal integral possa ser usado como um sistema de expressão para os peptídeos da invenção, em uma modalidade preferida, o peptídeo exógeno se acumula nos produtos do animal, dos quais ele pode ser coletado sem dano ao animal. Em modalidades preferidas, o peptídeo exógeno se acumula no leite, ovos, pelo, sangue e urina.
[001011] Se o peptídeo recombinante estiver destinado a se acumular no leite do animal, os mamíferos adequados são ruminantes, ungulados, mamíferos domesticados e animais leiteiros. Os animais especialmente preferidos são caprinos, ovinos, camelos, bovinos, porcinos, eqüinos, bois e lhamas. Os processos de se gerar vacas transgênicas que acumulam um peptídeo recombinante no seu leite são bem conhecidos: vide Newton (1999, J. Immunol. Methods 231: 159-167), Ebert e outros (1991, Biotechnology 9: 835-838), e Patentes U.S. 6.210.736, 5.849.992, 5.843.705, 5.827.690, 6.222.094, todas incorporadas ao presente documento a título de referência integralmente. A geração de mamíferos transgênicos que produzem um peptídeo recombinante desejado é disponível no comércio de GTC Biotherapeutics, Framingham, MA.
[001012] Se o peptídeo recombinante for destinado a ser acumulado em ovos, as aves adequadas incluem, sem limitação, galinhas, gansos e perus. Outros animais de interesse incluem, mas sem limitação, outras espécies de aves, peixes, répteis e anfíbios. A introdução de DNA recombinante em uma galinha por transformação retroviral é bem conhecida na técnica: Thoraval e outros (1995, Transgenic Research 4: 369-376), Bosselman e outros, (1989, Science 243: 533-535), Petropoulos e outros (1992, J. Virol. 66: 3391-3397), Patente U.S. 5.162.215, integralmente incorporada ao presente documento a título de referência. A transformação bem sucedida de galinhas com DNA recombinante também foi obtido nos casos em que o DNA é introduzido nas células blastodermais e as células blastodermais deste modo transfectadas são introduzidas no embrião: Brazolot e outros (1991, Mol. Reprod. Dev. 30: 304-312), Fraser, e cols. (1993, Int J. Dev. Biol. 37: 381-385), e Petitte e outros (1990, Development 108: 185-189). Uma tecnologia de alto rendimento foi desenvolvida para se verificar se uma galinha transgênica expressa o peptídeo desejado (Harvey e outros, 2002, Poult. Sci. 81: 202-212, Patente U.S. 6.423.488, integralmente incorporada ao presente documento a título de referência). Empregando-se a transformação retroviral de galinha com um DNA recombinante beta-lactamase exógena se acumulou na clara de ovo da galinha (Harvey e outros, 2002, Nat. Biotechnol. 20(4): 396-399). A produção das galinhas que produziam peptídeos exógenos no ovo é disponível no comércio de AviGenics, Inc., Athens GA. G. Bactérias
[001013] Os peptídeos expressos de modo recombinante produzidos em bactérias não são geralmente glicosilados. No entanto, os sistemas de bactérias capazes de glicosilar peptídeos estão se tornando evidentes e, portanto, é provável que peptídeos recombinantes glicosilados possam ser produzidos em bactérias no futuro.
[001014] Numerosos sistemas de expressão bacterianos são conhecidos na técnica. As espécies bacterianas preferidas incluem, sem limitação, E. coli e espécies de Bacillus. A expressão de peptídeos recombinantes em E. coli é bem conhecida na técnica. Os protocolos para a expressão à base de E. coli se encontram no pedido de Patente U.S. 20020064835, nas Patentes U.S. 6.245.539, 5.606.031, 5.420.027, 5.151.511, e RE33.653, dentre outras. Os processos que transformam bactérias incluem, sem limitação, de cloreto de cálcio (Cohen e outros, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114, Hanahan, 1983, J, Mol. Biol. 166:557-580, Mandel e Higa, 1970, J. Mol. Biol. 53: 159162) e eletroporação (Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), e os descritos em Sambrook e outros, 2001 (supra). Para uma revisão de protocolos laboratoriais sobre a transformação microbiana e sistemas de expressão, vide Saunders e Saunders (1987, Microbial Genetics Applied to Biotechnology: Principles and Techniques of Gene Transfer and Manipulation, Croom Helm, Londres), Pübler (1993, Genetic Engineering of Microorganisms, Weinheim, Nova York), Lee e outros, (1999, Metabolic Engineering, Marcel Dekker, Nova York), Adolph (1996, Microbial Genome Methods, CRC Press, Boca Raton), e Birren e Lai (1996, Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press, San Diego)
[001015] Para uma revisão geral sobre a literatura para a expressão de peptídeos em E. coli vide Balbas (2001, Mol. Biotechnol. 19: 251-267). Diversas companhias agora oferecem cepas bacterianas selecionadas para a expressão de peptídeos de mamíferos, tais como as cepas RosettaTM de E. coli (Novagen, Inc., Madison, WI; com uma expressão aumentada de códons eucarióticos que não são normalmente usados em células bacterianas e com um aumento da formação de pontes dissulfeto). H. Engenharia celular
[001016] Será evidente com a leitura da descrição da presente invenção que, quanto mais uniforme for o material de partida produzido por uma célula, tanto mais eficiente será a geração in vitro de grandes quantidades de peptídeos que têm a glicosilação desejada. Assim, a engenharia genética de células hospedeiras para produzir peptídeos glicosilados uniformemente como material de partida para as reações enzimáticas in vitro descritas no presente, proporciona uma vantagem significativa quando comparada com o emprego de um material de partida de peptídeos que tem um conjunto heterogêneo de estruturas de glicanos ligadas a ele. Um material de partida de peptídeo preferido para ser usado na presente invenção consiste em um peptídeo que tem moléculas primariamente de glicanos que consistem unicamente em uma estrutura elementar de núcleo de trimanosila. Um outro material de partida preferido é Man3GlcNAc4. Depois do processo de remodelagem, os peptídeos preferidos darão origem a uma quantidade muito grande de peptídeos que têm a glicosilação desejada, aumentando deste modo a eficácia clínica. No entanto, outros materiais de partida de glicanos são também adequados para serem usados nos processos descritos no presente, uma vez que glicanos de alto teor de manose, por exemplo, podem ser facilmente reduzidos in vitro a estruturas elementares de núcleo de trimanosila empregando- se uma série de manosidases. Conforme descrito em outra parte no presente, outros materiais de partida de glicanos podem também ser usados, desde que seja possível se clivar fora todas as porções desnecessárias de açúcar de modo que seja gerada a estrutura elementar de núcleo de trimanosila ou Man3GlcNAc4. Assim, a finalidade de se usar células geneticamente construídas para a produção dos peptídeos da presente invenção consiste em se gerar peptídeos que tem uma estrutura de glicanos a mais uniforme possível ligada a eles, podendo a estrutura de glicano ser remodelada in vitro para gerar um peptídeo que tem a glicosilação desejada. Isto resultará em uma redução dramática nos custos de produção destes peptídeos. Como os glicopeptídeos produzidos empregando-se esta metodologia predominantemente terão a mesma estrutura de glicano ligada a N, o protocolo de modificação pós-produção pode ser padronizado e otimizado para produzir uma consistência maior de batelada a batelada do produto final. Como resultado, os produtos finais de cadeia completa podem ser menos heterogêneos do que os atualmente disponíveis. Os produtos terão uma meia vida biológica e uma bioatividade melhoradas em comparação com as dos produtos da técnica anterior. Alternativamente, se for desejado, a invenção pode ser usada para se introduzir uma heterogeneidade limitada e específica, escolhendo-se condições de reação, por exemplo, que resultam em uma adição diferencial de porções de açúcar.
[001017] É preferível, embora não seja uma exigência rígida, que a célula geneticamente construída seja uma que produza peptídeos que tenham estruturas de glicanos constituídas principalmente por uma estrutura elementar de núcleo de trimanosila ou Man3GlcNAc4. No mínimo, a proporção destas estruturas preferidas produzidas pelas células geneticamente construídas deve ser suficiente para resultar em um peptídeo que tenha a glicosilação desejada depois do protocolo de remodelagem.
[001018] Em geral, qualquer tipo de células eucarióticas pode ser modificado para se tornar uma célula hospedeira da presente invenção. Em primeiro lugar o padrão de glicosilação tanto dos glicopeptídeos endógenos como dos recombinantes produzidos pelos organismos é determinado a fim de se identificar adições/deleções adequadas das atividades enzimáticas que resultam na produção dos glicopeptídeos de núcleo de trimanosila elementar ou de glicopeptídeos Man3GlcNAc4. Isto tipicamente acarretará atividades de deleção que empregam glicopeptídeos de trimanosila como substratos para uma reação de glicosiltransferase e atividades enzimáticas de inserção que degradam os glicanos ligados a N mais complexos para produzir cadeias mais curtas. Além disso, as células geneticamente construídas podem produzir glicanos com alto teor de manose, que podem ser clivados por manosidase para produzir as estruturas desejadas de glicanos de partida. A manosidase pode ser ativa in vivo na célula (isto é, a célula pode ser geneticamente construída para produzi-las) ou então elas podem ser usadas in vitro nas reações após a produção.
[001019] As técnicas para a modificação genética de células hospedeiras para alterar o perfil de glicosilação dos peptídeos expressos são bem conhecidas. Vide, por exemplo, Altmann e outros (1999, Glycoconjugate J. 16: 109-123), Ailor e outros (2000, Glycobiology 10(8): 837-847), Jarvis e outros, (In vitrogen Conference, March, 1999, resumo), Hollister and Jarvis, (2001, Glycobiology 11(1): 1-9), e Palacpac e outros, (1999, PNAS USA 96: 4697), Jarvis e outros, (1998. Curr. Opin. Biotechnol. 9:528-533), Gerngross (Publicação de Patente U.S. 20020137134), que descrevem técnicas para se "mamiferizar-se" sistemas de expressão de células de insetos ou vegetais com genes de glicosiltransferase.
[001020] Também existem técnicas para se alterar geneticamente o perfil de glicosilação dos peptídeos expressos em E. coli. Construiu-se E. coli com diversas glicosiltransferases a partir das bactérias Neisseria meningitidis e Azorhizobium para produzir oligossacarídeos in vivo (Bettler e outros, 1999, Glycoconj. J. 16: 205 212). Uma E. coli que tenha sido geneticamente construída para sobre-expressar o gene IgtA de β1,3-N-acetil- glicoaminiltransferase de Neisseria meningitidis glicolisará com eficiência a lactose exógena (Priem e outros, 2002, Glycobiology 12:235-240).
[001021] As células fúngicas também foram geneticamente modificadas para produzir glicosiltransferases exógenas (Yoshida e outros, 1999, Glycobiology, 9(1):53-58; Kalsner e outros, 1995, Glycoconj. J. 12:360-370; Schwientek e Ernst, 1994, Gene 145(2):299-303; Chiba e outros, 1995, Biochem J. 308:405- 409).
[001022] Assim, em um aspecto a presente invenção propõe uma célula que glicosila uma população de glicopeptídeos, de tal modo que, uma proporção de glicopeptídeos assim produzida tenha uma estrutura de núcleo de trimanosila elementar ou uma estrutura Man3GlcNAc4. É preferível que a célula produza um peptídeo que tenha uma estrutura de glicano constituída unicamente de um núcleo de trimanosila elementar. No mínimo, a proporção de peptídeos que têm um núcleo de trimanosila elementar ou uma estrutura Man3GlcNAc4 é suficiente para produzir peptídeos que tenham uma glicosilação desejada depois do processo de remodelagem. A célula tem nela introduzida uma ou mais unidades de expressão de ácidos nucléicos heterólogos, cada uma das quais pode compreender uma ou mais seqüências de ácidos nucléicos que codificam um ou mais peptídeos de interesse. A forma natural do glicopeptídeo de interesse pode compreender um ou mais glicanos complexos ligados a N ou pode consistir simplesmente em um glicano de alto teor de manose.
[001023] A célula pode ser de qualquer tipo de célula e é de preferência uma célula eucariótica. A célula pode ser uma célula de mamífero tal como humana, murina, de rato, de coelho, de hamster ou uma célula de outro tipo de mamífero. Quando a célula é uma célula de mamífero, a célula de mamífero pode ser derivada de um mamífero não humano transgênico ou estar contida nele, codificando a célula no mamífero o glicopeptídeo desejado e uma variedade de enzimas glicosilantes e glicosidases que são necessárias para a produção das moléculas de glicopeptídeos desejadas. Além disso, a célula pode ser uma célula fúngica, de preferência, uma célula de levedura, ou então a célula pode ser uma célula de inseto ou vegetal. De modo análogo, quando a célula e uma célula vegetal, a célula vegetal pode ser derivada de uma planta transgênica ou estar contida nela, codificando a planta o glicopeptídeo desejado e uma variedade de enzimas glicosilantes e glicosidases que são necessárias para a produção das moléculas de glicopeptídeos desejadas.
[001024] Em algumas modalidades a célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica expressando uma ou mais enzimas glicosiltransferases heterólogas e/ou uma ou mais enzimas glicosidase heterólogas, resultando a expressão de um glicopeptídeo recombinante na célula hospedeira na produção de um glicopeptídeo recombinante com um núcleo de trimanosila elementar como a estrutura primária de glicano ligada a ele.
[001025] Em algumas modalidades, a enzima glicosiltransferase heteróloga útil na célula pode ser selecionada de um grupo que consiste em qualquer enzima glicosiltransferase conhecida incluída, por exemplo, na lista de Famílias das Glicosiltranferases diponível em Taniguchi e outros, (2002, Handbook of Glycosyltransferases and related Genes, Springer, Nova York).
[001026] Em outras modalidades, a enzima glicosilase heteróloga pode ser selecionado de um grupo que consiste em manosidase 1, manosidase 2, manosidase 3 e outras manosidases, incluindo, sem limitação, manosidases microbianas. Uma descrição adicional referente a enzimas úteis na presente invenção é dada em outra parte do presente documento.
[001027] Em outras modalidades ainda, a célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica em que uma ou mais enzimas glicosiltransferases endógenas e/ou uma ou mais enzimas glicosidases endógenas foram inativadas, de um modo tal que a expressão de um glicopeptídeo recombinante na célula hospedeira resulta na produção de um glicopeptídeo recombinante que tem um núcleo elementar de trimanosila como a estrutura primária de glicano ligada a ele.
[001028] Em modalidades adicionais, a célula hospedeira pode expressar enzimas glicosiltransferases heterólogas e/ou enzimas glicosidases, sendo simultaneamente inativadas uma ou mais enzimas glicosiltransferases endógenas e/ou enzimas glicosidases. As enzimas glicosiltransferases endógenas e/ou enzimas glicosidases podem ser inativadas empregando-se qualquer técnica conhecidas dos versados na técnica incluindo, sem limitação, a técnica anti-senso e técnicas abrangendo a inserção de ácidos nucléicos no genoma da célula hospedeira. Em algumas modalidades, as enzimas podem ser selecionadas de um grupo que consiste em GnT-I, uma seleção de manosidases, xilosil-transferase, α1,3 fucosiltransferase nuclear, serina/treonina O- manosiltransferases e semelhantes.
[001029] Alternativamente, pode ser explorado um sistema de expressão que glicosila de modo natural os peptídeos, de modo tal que os glicanos ligados a N são predominantemente do tipo de núcleo de trimanosila, ou do tipo Man3GlcNAc4. Um exemplo de um tipo de célula que produz o núcleo de trimanosila consiste em células Sf9. Outros tais sistema de expressão podem ser identificados por análise de glicopeptídeos que são expressos de modo natural ou recombinante em células e selecionando-se aqueles que apresentam as características de glicosilação desejadas. A invenção deve ser interpretada como incluindo toda e qualquer tal célula para a produção dos peptídeos da presente invenção. V. Purificação de Peptídeos Remodelados com Glicanos e/ou Glicoconjugados
[001030] Se a glicoproteína modificada for produzida intracelularmente ou segregada, como uma primeira etapa, os resíduos em partículas, quer de células hospedeiras quer fragmentos de lise, são removidos, por centrifugação ou ultrafiltração, por exemplo; opcionalmente, a proteína pode ser concentrada com um filtro de concentração de proteínas disponível no comércio, seguindo-se da separação da variante de peptídeo de outras impurezas por uma ou mais etapas selecionadas dentre cromatografia por imuno- afinidade, fracionamento de coluna de troca de íons (sobre dietilamino-etila (DEAE) ou sobre matrizes contendo grupamentos carbóxi-metila ou sulfo-propila), cromatografia sobre Azul-Sefarose, CM Azul-Sefarose, MONO-Q, MONO-S, lentilha-lectina-Sefarose, WGA Sefarose, Con A-Sefarose, Éter Toyopearl, Butil Toyopearl, Fenil Toyopearl, ou proteína A Sefarose, cromatografia SDS-PAGE, cromatografia sobre sílica, cromato-focalização, HPLC (RP-HPLC) de fase reversa, filtração por gel, empregando-se, por exemplo, peneiras moleculares de Sephadex ou cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia em colunas que se ligam seletivamente ao peptídeo, e etanol, pH ou precipitação de sulfato de amônio, filtração por membrana e diversas técnicas.
[001031] Os peptídeos modificados produzidos em cultura são geralmente isolados por extração inicial de células, enzimas, etc., seguindo-se de uma ou mais etapas de concentração, extração de sal, troca de íons aquosos, ou de cromatografia de exclusão por tamanho. Além disso, a glicoproteína modificada pode ser purificada por cromatografia de afinidade. Em seguida pode-se empregar HPLC para as etapas finais de purificação.
[001032] Um inibidor de protease, tal como fenil metil sulfonil fluoreto, por exemplo, (PMSF) pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir a proteólise e podem se incluir antibióticos para impedir o crescimento de contaminantes adventícios.
[001033] Em uma outra modalidade, sobrenadantes de sistemas que produzem o peptídeo modificado da invenção são primeiro concentrados empregando-se um filtro de concentração de proteína disponível no comércio, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon, por exemplo. Depois da etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz adequada de purificação. Uma matriz de afinidade adequada pode compreender, por exemplo, um ligante para o peptídeo, uma molécula de lectina ou de anticorpo ligada a um suporte adequado. Alternativamente, pode ser empregada uma resina de troca de ânions, uma matriz ou substrato que tenha grupamentos DEAE pendentes. As matrizes adequadas incluem acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos habitualmente empregados na purificação de proteínas. Alternativamente, pode ser empregada uma etapa de troca de cátions. Os trocadores de cátions adequados incluem diversas matrizes insolúveis compreendendo grupamentos sulfopropila ou carbóxi-metila. Os grupamentos sulfopropila são especialmente preferidos.
[001034] Em seguida podem ser empregadas uma ou mais etapas de RP-HPLC empregando-se meios de RP-HPLC hidrófobos, gel de sílica com grupamentos metila pendentes ou outros alifáticos, para purificar ainda mais a composição variante de peptídeos. Algumas das etapas de purificação acima ou todas elas, em diversas combinações, podem também ser empregadas para produzir uma glicoproteína modificada homogênea.
[001035] O peptídeo modificado da invenção resultando de uma fermentação em grande escala pode ser purificado por processos análogos aos descritos por Urdal e outros, J. Chromatog. 296: 171 (1984). Esta referência descreve duas etapas de RP-HPLC em seqüência para a purificação de IL-2 humano recombinante sobre uma coluna de HPLC preparatório. Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas tais como cromatografia de afinidade, para a purificação da glicoproteína modificada. VI. Peptídeos Preferidos e os Ácidos nucléicos que Codificam os Peptídeos Preferidos
[001036] A presente invenção inclui ácidos nucléicos isolados que codificam diversos peptídeos e proteínas e moléculas análogos ou seus fragmentos. Tais peptídeos incluem, sem limitação, fator estimulador humano de colônia de granulócitos (G-CSF), interferon alfa humano (IFN-alfa), interferon beta humano (IFN-beta), Fator VII humano (Fator VII), Fator IX humano (Fator IX), hormônio humano estimulador de folículos (FSH), eritropoietina humana (EPO), fator estimulador de colônia de granulócitos/macrófagos humano (GM-CSF), interferon gama (IFN-gama), inibidor de alfa-1-protease humano (também conhecido como alfa-1-antitripsina ou inibidor de alfa-1- tripsina; A-1-PI), glico-cerebrosidase, ativador do tipo tecidual humano (TPA), interleucina-2 humana (IL-2), Fator VIII humano (Fator VIII), um receptor de fator de necrose de tumor de 75 kDa fundido a uma porção Fc da imunoglobulina IgG humana conhecido no comércio como ENBRELTM ou ETANERCEPTTM (TNFR quimérico), uroquinase humana (uroquinase), um fragmento Fab do anticorpo monoclonal quimérico humano/murino que se liga especificamente glicoproteína IIb/IIIa e o receptor alfav beta3 de vitronectina, conhecido comercialmente como REOPROTM ou ABCIXIMAB (anti-glico proteína IIb/IIIa), um anticorpo monoclonal quimérico murino/humano que se liga especificamente a HER2 humano conhecido no comércio como HERCEPTINTM (anti-HER2) quimérico), um anticorpos quimérico humano/murino que se liga especificamente ao sítio antigênico A ou à proteína F do vírus sincicial respiratório disponível no comércio como SYNAGISTM ou PALIVIZUMAB (anti-RSV) quimérico), um anticorpo monoclonal quimérico humano/murino que se liga especificamente a CD20 nas células B humanas, conhecido no comércio como RITUXANTM ou RITUXAMAB (anti-CD20 quimérico), DNase recombinante humana (DNase), um anticorpo monoclonal quimérico humano/murino que se liga especificamente ao fator de necrose de tumor humano, conhecido no comércio como REMICADETM ou INFLIXIMAB (anti-TNF quimérico), insulina humana, o antígeno de superfície de um vírus de hepatite B (subtipo adw; HBsAg) e o hormônio de crescimento humano (HGH), e semelhantes.
[001037] O ácido nucléico isolado da invenção deve ser interpretado como incluindo uma seqüência de RNA ou de DNA que codifica qualquer um dos peptídeos identificados acima da invenção, e qualquer forma modificada deles, incluindo- se modificações químicas do DNA ou do RNA que tornem a seqüência de nucleotídeos mais estável quando ela está isenta de células ou quando ela está associada a uma célula. Como um exemplo sem limitação, os oligonucleotídeos que contêm pelo menos uma modificação fosforotioato são conhecidos como conferindo ao oligonucleotídeo uma maior resistência a nucleases. Exemplos específicos de oligonucleotídeos incluem aqueles que contêm fosforotioato, fosfotriéster, metil fosfonato, ligações alquílicas ou ciclo-alquílicas de cadeia curta entre açúcares, ou ligações heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta entre açúcares ("esqueleto"). Além disso, podem também ser usados os oligonucleotídeos que têm estruturas de esqueleto morfolino (Patente U.S. 5.034.506) ou estruturas de esqueleto de poliamida (Nielsen e outros, 1991, Science 254: 1497).
[001038] As modificações químicas de nucleotídeos podem também ser usadas para aumentar a eficiência com que uma seqüência de nucleotídeos é absorvida por uma célula ou a eficiência com que ela é expressa em uma célula. Toda e qualquer combinação de modificações das seqüências de nucleotídeos é contemplada na presente invenção.
[001039] A presente invenção não deve ser interpretada como sendo limitada unicamente às seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos descritas no presente. Conforme descrito mais detalhadamente em outro ponto do presente, uma vez da posse da presente invenção, torna-se facilmente evidente aos versados na técnica que outros ácidos nucléicos que codificam os peptídeos da presente invenção podem ser obtidos seguindo-se os procedimentos descritos no presente (mutagênese direcionada a sítio, por exemplo, mutações por deslocamento de quadro, e semelhantes) e os procedimentos que são conhecidos na técnica.
[001040] Também incluídos são ácidos nucléicos isolados que codificam os fragmentos de peptídeos, conservando os fragmentos de peptídeos a atividade biológica desejada do peptídeo. Além disso, embora sejam descritos no presente ácidos nucléicos exemplares que codificam peptídeos preferidos em relação com ID DE SEQ NOs específicas, a invenção não deve ser absolutamente interpretada como estando limitada a qualquer ácido nucléico específico descrito no presente. Pelo contrário, a presente invenção deve ser interpretada como incluindo toda e qualquer molécula de ácido nucléico que tenha uma porcentagem de identidade suficiente com as seqüências descritas no presente, de modo tal que estes ácidos nucléicos também codifiquem um peptídeo que tenha a atividade biológica desejada descrita no presente. Também contemplados são ácidos nucléicos isolados que são mais curtos do que os ácidos nucléicos de comprimento total, sendo conservada a atividade biológica do peptídeo codificado por eles. Os processos para se determinar a porcentagem de identidade entre um ácido nucléico e outro são descritos no presente em outro ponto assim como ensaios para a determinação da atividade biológica de qualquer peptídeo específico preferido.
[001041] Além disso, conforme descrito em outro ponto no presente, qualquer outro número de procedimentos pode ser usado para a geração de derivados, mutantes ou formas variantes dos peptídeos da presente invenção, empregando-se a metodologia de DNA recombinante bem conhecida na técnica, tal como, por exemplo, a descrita em Sambrook e outros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York) e Ausubel e outros (1997, Current protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nova York). Os procedimentos para a introdução de alterações de aminoácidos em um peptídeo ou polipeptídeo por alteração da seqüência de DNA que codifica o peptídeo são conhecidos na técnica e são também descritos em Sambrook e outros (1989, acima); Ausubel e outros (1997, acima).
[001042] A invenção inclui um ácido nucléico que codifica um G-CSF, IFN-alfa, IFN-beta, Fator VII, Fator IX, FSH, EPO, GM-CSF, IFN-gama, A-1-PI, glicocerebrosidase, TPA, IL-2, Fator VIII, TNFR quimérico, uroquinase, anti- glicoproteína IIb/IIa quimérica, anti-HER2 quimérico, anti- RSV quimérico, anti-CD20 quimérico, DNAse, anti-TNF humano, insulina humana HBsAg, e HGH, estando um ácido nucléico que codifica um peptídeo etiqueta ligado por covalência a ele. Isto é, a invenção abrange um ácido nucléico quimérico, estando a seqüência de ácidos nucléicos que codifica o peptídeo etiqueta ligada por covalência ao ácido nucléico que codifica um peptídeo da presente invenção. Tais peptídeos etiquetas são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP), myc, myc- piruvato quinase (myc-PK), His6, proteína que se liga a maltose (MB-) um polipeptídeo etiqueta de hemaglutinina do vírus da influenza, um polipeptídeo etiqueta sinalizador (FLAG) e um polipeptídeo etiqueta glutatione-S-transferase (GST). No entanto, a invenção não deve ser absolutamente interpretada como estando limitada aos ácidos nucléicos que codificam os peptídeos etiquetas relacionados acima. Pelo contrário, qualquer seqüência de ácidos nucléicos que codifica um peptídeo que possa funcionar de um modo substancialmente análogo ao destes peptídeos etiquetas deve ser interpretada como estando incluída na presente invenção.
[001043] O ácido nucléico que compreende um ácido nucléico que codifica um peptídeo etiqueta pode ser usado para localizar um peptídeo da presente invenção no interior de uma célula, um tecido e/ou em um organismo integral (tal como em um embrião de mamífero, por exemplo), para detectar um peptídeo da presente invenção segregado de uma célula, e para estudar o(s) papel(éis) do peptídeo em uma célula. Além disso, a adição de um peptídeo etiqueta facilita o isolamento e a purificação do peptídeo "etiquetado" de modo tal que os peptídeos da invenção possam ser produzidos e purificados facilmente.
[001044] A invenção inclui os seguintes peptídeos isolado preferidos: G-CSF, IFN-alfa, IFN-beta, Fator VII, Fator IX, FSH, EPO, GM-CSF, IFN-gama, A-1-PI, glicocerebrosidase, TPA, IL-2-, Fator VIII, TNFR quimérico, uroquinase, anti-glicoproteína IIb/IIIa quimérica, anti- HER2 quimérica, anti-RSV quimérico, anti-CD20 quimérico, DNase, anti-TNF quimérico, insulina humana, HBsAg e HGH.
[001045] A presente invenção deve também ser interpretada como abrangendo "derivados", "mutantes" e "variantes" dos peptídeos da invenção (ou do DNA que os codifica) sendo tais derivados, mutantes e variantes peptídeos que sofreram uma alteração em um ou mais aminoácidos (ou quando se refere à seqüência de nucleotídeos codificando os mesmo, sofreram uma alteração em um ou mais pares base), de modo tal que o peptídeo resultante (ou o DNA) não é idêntico às das seqüências relacionadas no presente, mas tem a mesma propriedade biológica como os peptídeos descritos no presente, pelo fato do peptídeo ter propriedades biológicas/bioquímicas de G-CSF, IFN-alfa, IFN-beta, Fator VII, Fator IX, FSH, EPO, GM-CSF, IFN-gama, A-1-PI, glicocerebrosidase, TPA, IL-2-, Fator VIII, TNFR quimérico, uroquinase, anti-glicoproteína IIb/IIIa quimérica, anti-HER2 quimérica, anti-RSV quimérico, anti-CD20 quimérico, DNase, anti-TNF quimérico, insulina humana, HBsAg, e HGH.
[001046] São ainda incluídos fragmentos de peptídeos que conservam a atividade biológica desejado do peptídeo independentemente do comprimento do peptídeo. Os versados na técnica são perfeitamente capazes de isolar formas menores do que o comprimento total de qualquer dos peptídeos úteis na invenção, e de determinar, empregando-se os testes propostos no presente, quais os fragmentos isolados que conservaram uma atividade biológica desejada e são, portanto, os peptídeos úteis na invenção.
[001047] Uma propriedade biológica de uma proteína da presente invenção deve ser interpretada como incluindo, mas sem limitação, a capacidade dos versados na técnica de funcionar no teste biológico e nos ambientes descritos no presente, tais como na redução da inflamação, obtenção de uma resposta imune, coagulação sangüínea, aumento da produção hematopoiética, inibição de protease, modulação do sistema imune, ligação a um antígeno, crescimento, alívio de tratamento de uma doença, clivagem de DNA e semelhantes.
A. G-CSF
[001048] A presente invenção abrange um processo para a modificação da estrutura de glicanos em G-CSF. O G-CSF é conhecido na técnica como uma citocina produzida por células T ativadas, macrófagos, células endoteliais e fibroblastos estromais. G-CSF atua principalmente sobre a medula óssea para aumentar a produção de leucócitos inflamatórios, e funciona ainda como um hormônio endócrino para iniciar a reposição de neutrófilos consumidos durante as funções inflamatórias. G-CSF também tem aplicações clínicas na reposição de medula óssea depois de quimioterapia.
[001049] Embora G-CSF tenha mostrado que é um composto importante e útil para aplicações terapêuticas em mamíferos, especialmente em seres humanos, os processos da presente invenção para a produção de G-CSF a partir de células recombinantes resultam em um produto que tem uma vida biológica relativamente curta, um padrão de glicosilação sem precisão que poderia potencialmente levar a imunogenicidade, perda de função e uma necessidade maior tanto de doses maiores como mais freqüentes a fim de se obter o mesmo efeito, e semelhantes.
[001050] G-CSF foi isolado e clonado, sendo suas seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos apresentadas como ID DE SEQ NO:1 e ID DE SEQ NO:2, respectivamente (Figura 52A e 52B, respectivamente). A presente invenção abrange um processo para a modificação de G-CSF, especialmente por ele se referir à capacidade de G-CSF para funcionar como uma molécula biológica potente e funcional. O técnico perito, quando equipado com a descrição da presente invenção e as instruções nela contida,, compreenderá prontamente que a presente invenção propõe composições e processos para a modificação de G-CSF.
[001051] A presente invenção abrange ainda as variantes de G-CSF, conforme é bem conhecido na técnica. Como exemplo, mas sem nenhuma intenção de limitação à presente invenção, uma variante de G-CSF foi descrita na Patente U.S. 6.166.183, em que é descrito um G-CSF compreendendo o complemento natural de resíduos de lisina e, além disso, ainda ligado a uma ou duas moléculas de polietileno glicol. Além disso, as Patentes U.S. 6.004.548, 5.580.755, 5.582.823 e 5.676.941 descrevem uma variante de G-CSF em que um ou mais dos resíduos de cisteína na posição 17, 36, 42, 64 e 74 são substituídos por alanina ou alternativamente por serina. A Patente U.S. 5.416.195 descreve uma molécula de G-CSF em que a cisteína na posição 17, o ácido aspártico na posição 27, e as serinas nas posições 65 e 66 são substituídas por serina, serina, prolina e prolina, respectivamente. Outras variantes são bem conhecidas na técnica e são descrias na Patente U.S. 5.399.345, por exemplo.
[001052] A expressão e atividade de uma molécula modificada de G-CSF da presente invenção podem ser testadas usando-se processos conhecidos na técnica, e conforme descrito, por exemplo, na Patente U.S. 4.810.643. Como um exemplo, a atividade pode ser medida empregando-se ensaios de absorção de timidina rádio-rotulada. Resumindo, a medula óssea humana proveniente de doadores sadios é submetida a uma redução de densidade com Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ) e as células de baixa densidade são suspensas em meio de Iscove (GIBCO, La Jolla, CA) contendo soro fetal bovino a 10%, glutamina e antibióticos. Aproximadamente 2 x 104 células de medula óssea humana são incubadas ou com o meio de controle ou com o G-CSF ou com o da presente invenção em placas de fundo chato de 96 cavidades a aproximadamente 37°C em CO2 a 5% em ar durante aproximadamente 2 dias. As culturas são então pulsadas durante aproximadamente 4 horas com 0,5 μCi/cavidade de 3H- timidina (New England Nuclear, Boston, Mass), e a absorção é medida do modo descrito, por exemplo, em Ventua e outros (1983, Blood 61: 781). Um aumento da incorporação de 3H- timidina às células da medula óssea humana em comparação com células de medula óssea tratada com um composto de controle é uma indicação de um composto de G-CSF ativo e viável.
B. IFN alfa e IFN beta
[001053] A presente invenção ainda abrange um processo para a remodelagem e modificação de IFN alfa e IFN beta. ING alfa é parte de uma família de aproximadamente vinte peptídeos tendo aproximadamente 18kDa de peso. IFN alfa e IFN beta, conhecidos coletivamente como interferons do Tipo I, ligam-se ao mesmo receptor celular e obtém respostas análogas. IFNs do tipo I inibem a replicação viral, aumentam o potencial lítico de células NK, modulam a expressão de moléculas do MHC e inibem a proliferação celular, dentre outras coisas. O IFN do tipo I foi usado como uma terapia para infecções virais, especialmente vírus da hepatite e como uma terapia para esclerose múltipla.
[001054] As composições atuais de IFN do Tipo I são, conforme descrito acima, compostos úteis tanto para a modulação de respostas imunológicas aberrante como para a terapia para uma variedade de doenças. No entanto, elas são prejudicadas por uma potência e função reduzida e por uma meia vida limitada no corpo em comparação com citocinas naturais compreendendo o complemento natural de glicosilação.
[001055] As seqüências prototípicas de nucleotídeos e de aminoácidos para IFN alfa são apresentadas no presente documento como ID DE SEQ NO:3 e ID DE SEQ NO:4, respectivamente (Figura 53A e 53B, respectivamente). IFN beta compreende um único produto genético de aproximadamente 20 kDa, sendo as suas seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos apresentadas como ID DE SEQ NO: 5 e ID DE SEQ NO: 6 (Figura 54A e 54B, respectivamente). A presente invenção não é limitada às seqüências de nucleotídeos e aminoácidos no presente documento. Os versados na técnica observarão prontamente que muitas variantes de IFN alfa existem tanto na natureza como em forma de derivados construídos. De modo análogo, IFN beta vem sendo modificado na tentativa de se obter um perfil terapêutico mais benéfico. Exemplos de IFNs do Tipo I modificados são bem conhecidos na técnica (vide a Tabela 8) e são descritos, por exemplo, na Patente U.S. 6.323.006 em que a tirosina é substituída por cicsteína-60, Patentes U.S. 4.7373.462, 4.588.585, 5.545.723, e 6.127.332 em que é descrito um IFN beta com uma substituição de uma variedade de aminoácidos. Além disso, as Patentes U.S. 4.966.843, 5.376.567, 5.795.779 descrevem IFN alfa-61 e IFN-alfa-76. As Patentes U.S. 4.748.233 e 4.695.543 descrevem IFN alfa gx-1, ao passo que a Patente U.S. 4.975.276 descreve IFN alfa-54. Além disso, as Patentes U.S. 4.695.623, 4.897.471, 5.661.009 e 5.541.293 todas descrevem uma seqüência IFN alfa de consenso para representar todas as variantes conhecidas na data do depósito. Embora esta lista de IFNs do Tipo I e de suas variantes não pretende absolutamente ser exaustiva, os versados na técnica prontamente observarão que a presente invenção abrange moléculas IFN beta e IFN alfa, derivados e variantes seus conhecidos ou a serem descobertos no futuro. Tabela 8. Isoformas de Interferon-α
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[001056] Os processos para a expressão de IFN em células recombinantes são bem conhecidos na técnica, e são fáceis de serem conduzidos, empregando-se técnicas descritas, por exemplo, na Patente U.S. 4.966.843, e em Sambrook e outros (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York) e Ausubel e outros (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nova York).
[001057] Os testes para se determinar a atividade biológica de um IFN de Tipo I modificado pela presente invenção serão do conhecimento dos versados na técnica. O ensaio descrito em Rubinstein e outros (1981, Journal of Virology 37: 755-758), por exemplo, é habitualmente usado para se determinar o efeito de um IFN do Tipo I pela medição dos efeitos citopáticos da infecção viral em uma população de células. Este processo é somente um de muitos conhecidos na técnica de se testar a função biológica de um IFN do tipo I.
C. Fator Vila
[001058] A presente invenção abrange ainda um processo para a remodelagem e modificação do Fator Vii. A via de coagulação sangüínea é uma reação complexa compreendendo muitos eventos. Um evento intermediário nesta via é o Fator Vii, uma proenzima que participa na via extrínseca de coagulação sangüínea por conversão (depois da sua ativação em Fator Viia) do Fator X em Xa na presença de fator tecidual e de íons de cálcio. O Fator Xa por sua vez converte a protrombina em trombina na presença do Fator Va, de íons cálcio e de fosfolipídio. A ativação do Fator X em Fator Xa é um evento compartilhado tanto pela via de coagulação sangüínea intrínseca como extrínseca, e, portanto, o Fator Viia pode ser usado para o tratamento de pacientes com deficiências ou inibidores de Fator Viii. Há evidência que sugere que o Fator VIIa possa ter participação na via intrínseca também, aumentando assim a proeminência e a importância do papel do Fator VII na coagulação sangüínea.
[001059] O Fator VII é uma glicoproteína de uma única cadeia com um peso molecular de aproximadamente 50 kDa. Sob esta forma, o fator circula no sangue em forma de zimógeno inativo. A ativação do Fator VII em VIIa pode ser catalisada por diversas proteases plasmáticas diferentes, tais como o Fator XIIa. A ativação do Fator VII resulta na formação de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve mantidas juntas por pelo menos uma ligação dissulfeto. Além disso, as moléculas modificadas do Fator VII que não podem ser convertidas no Fator VIIa foram descritas e são úteis como remédios anti-coagulante, como é o caso nos coágulos sangüíneos, trombose e semelhantes. Dada a importância do Fator VII na via de coagulação sangüínea, e o seu emprego como um tratamento tanto para níveis aumentados como diminuídos de coagulação, deduz-se que a molécula que tem uma meia via biológica mais prolongada, um aumento na potência e em geral um perfil terapêutico mais análogo ao Fator VII do tipo nativo tal como ele é sintetizado e segregado em um ser humano sadio, seria benéfico e útil como um tratamento para os distúrbios da coagulação sangüínea.
[001060] O Fator VII foi clonado e seqüenciado, e as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos estão apresentadas no presente como ID DE SEQ NO: 7 e ID DE SEQ NO: 8 (Figura 55A e 55B, respectivamente). A presente invenção não deve ser de nenhum modo interpretada como sendo limitada às seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos do Fator VII apresentadas no presente. Variantes do Fator VII são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 4.784.950 e na 5.580.560, em que lisina-38, lisina-32, arginina-290, arginina-341, isoleucina-42, tirosina 278, e tirosina-332 é substituída por uma variedade de aminoácidos. Além disso as Patentes U.S. 5.861.374, 6.039.944, 5.833.982, 5.788.965, 6.183.743, 5.997.864 e 5.817.788 descrevem variantes do Fator VII que não são clivadas para formar o Fator VIIa. Os versados na técnica observarão que o via de coagulação sangüínea e o papel do Fator VII nela são bem conhecidos, e, portanto, muitas variantes, tanto as que ocorrem na natureza como as construídas, conforme descrito acima, são incluídas na presente invenção.
[001061] Os processos para a expressão e a determinação da atividade do Fator VII são bem conhecidas na técnica, e são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 4.784.950. Resumindo, a expressão do Fator VII, ou de suas variantes, pode ser obtida em uma variedade de sistemas tanto procarióticos como eucarióticos, incluindo em células de E. coli, células CHO, células BHK, células de insetos empregando-se um sistema de expressão de baculovírus, sendo todos eles conhecidos na técnica.
[001062] Os ensaios para a atividade de um Fator VII modificado perparado de acordo com os processos da pesente invenção podem ser realizados usando processos bem conhecidos na técnica. Como um exemplo não limitante, Quick e outros (Hemorragic Disease and Thrombosis, 2nd ed., Leat Febiger, Philadelphia, 1966), descreve um ensaio de coagulação de um estágio útil para determinar a atividade biológica de uma molécula de Fator VII, preparada de acordo com os processos da presnte invenção.
D. Fator IX
[001063] A presente invenção abrange ainda um processo para remodelagem e/ou modificação do Fator IX. Conforme descrito acima, o Fator IX é vital na cascata de coagulação sanguínea. Uma deficiência de Fator IX no corpo caracteriza um tipo de hemofilia (tipo B). O tratamento desta doença é geralmente limitado à transfusão intravenosa de concentrados protéicos de plasma humano do Fator IX. No entanto, além das desvantagens práticas de tempo e de despesas, a transfusão de concentrados sangüíneos abrange o risco de transmissão de hepatite viral, síndrome de deficiência imune adquirida ou de doenças tromboembólicas no paciente.
[001064] Embora o Fator IX tenha mostrado ser um composto importante e útil para aplicações terapêuticas, os processos da presente invenção para a produção do Fator IX a partir de células recombinantes (Patente U.S. 4.770.999) resultam em um produto com uma vida biológica muito curta, um padrão de glicosilação sem precisão, o que poderia levar potencialmente a imunogenicidade, perda de função, uma necessidade maior de doses tanto maiores como mais freqüentes a fim de se atingir o mesmo efeito e problemas semelhantes.
[001065] As sequências de ácidos nucléicos e de aminoácidos do Fator IX são apresentadas no presente como ID DE SEQ NO: 9 e ID DE SEQ NO: 10 (figuras 56A e 56B, respectivamente). A presente invenção não é de modo nenhum limitada às seqüências apresentadas no presente. As variantes do Fator IX são conhecidas na técnica, assim como é descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. 4.770.999, 5.521.070 em que uma tirosina é substituída por uma alanina na primeira posição, na Patente U.S. 6.037.452, em que o Fator XI é ligado a um grupo óxido de alquileno e na Patente U.S. 6.046.380, em que o DNA que codifica o Fator IX é modificado pelo menos em um sítio de emenda. Conforme demonstrado no presente, as variantes do Fator IX são conhecidas na técnica e a presente descrição abrange aquelas variantes que são conhecidas ou a serem desenvolvidas ou descobertas no futuro.
[001066] Os processos para a determinação da atividade de um Fator IX modificado preparado de acordo com os processos da presente invenção podem ser conduzidos empregando-se os processos descritos acima, ou, ainda, empregando-se processos conhecidos na técnica, tal como um ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada de um estágio, conforme descrito, por exemplo, em Biggs (1972, Human Blood Coagulation Haemostasis and Thrombosis (Ed. 1), Oxford, Blackwell, Scientific, pg. 614). Resumindo, para se testar a atividade biológica de uma molécula de Fator IX desenvolvida de acordo com os processos da presente invenção, o teste pode ser conduzido com volumes iguais de reagente de tromboplastina parcial ativada, plasma deficiente no Fator IX isolado de um paciente com hemofilia B, utilizando-se técnicas de flebotomia estéril bem conhecidas na técnica, e plasma combinado normal como padrão, ou a amostra. Neste ensaio, uma unidade de atividade é definida como sendo a quantidade presente em um mililitro de plasma normal combinado. Além disso um ensaio para se estar a atividade biológica baseado na capacidade do Fator IX de reduzir o tempo de coagulação do plasma de pacientes com deficiência de Fator IX a níveis normais pode ser conduzido do modo descrito, por exemplo, em Proctor e Rapaport (1961, Amer. J. Clin. Path. 36: 212).
E. FSH
[001067] A presente invenção inclui ainda um processo para a remodelagem e/ou modificação de FSH. A função reprodutora humana é controlada em parte por uma família de hormônios glicoprotéicos heterodiméricos humanos que têm em comum uma subunidade alfa de glicoproteína de 92 aminoácidos, mas que diferem nas suas subunidades beta específicas a hormônios. A família inclui o hormônio estimulador de folículos (FSH), o hormônio luteinizante (LH), o hormônio estimulador de tireóide ou tirotropina (TSH) e a gonadotropina coriônica humana (hCG). O FSH e LH humanos são usados terapeuticamente para regular diversos aspectos do metabolismo pertinentes à reprodução no ser humano do sexo feminino. O FSH parcialmente purificado da urina, por exemplo, é usado clinicamente para estimular a maturação folicular em mulheres anovulantes com síndrome anovulatório ou com deficiência de fase lútea. O hormônio luteinizante (LH) e FSH são usados em combinação para estimular o desenvolvimento de folículos ovarianos para a fertilização in vitro. O papel de FSH no ciclo de reprodução é suficientemente conhecido para permitir o seu emprego terapêutico, mas encontraram-se dificuldades devidas, em parte à heterogeneidade e impureza do preparado a partir de fontes nativas. Esta heterogeneidade é devida a variações no padrão de glicosilação.
[001068] O FSH é uma ferramenta valiosa tanto na fertilização in vitro, como na estimulação de fertilização in vivo, mas conforme foi citado acima, sua eficácia clínica vem sendo prejudicada pela inconsistência na glicosilação da proteína. Portanto, parece evidente que um processo para a remodelagem de FASH será de grande benefício para as ciências da reprodução.
[001069] FSH já foi clonado e seqüenciado, sendo suas seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos apresentadas no presente como ID DE SEQ NO: 11, e ID DE SEQ NO: 12, respectivamente (subunidade alfa) e ID DE SEQ NO: 13 e ID DE SEQ NO: 14, respectivamente (subunidade beta) (figura 57A e 57B, respectivamente). Os versados na técnica observarão prontamente que a presente invenção não se limita às seqüências descritas no presente, uma vez que variantes de FSH são conhecidas na técnica. Como um exemplo não limitante, a Patente U.S. 5.639.640 descreve a subunidade beta compreendendo duas seqüências diferentes de aminoácidos e a Patente U.S. 5.338.835 descreve uma subunidade beta compreendendo uma seqüência de aminoácidos adicional de aproximadamente vinte e sete aminoácidos derivados da subunidade beta da gonadotropina coriônica humana. Portanto, a presente invenção compreende variantes de FSH, tanto naturais como construídas pelo homem, todas bem conhecidas na técnica.
[001070] Os processos de expressão de FSH em células, tanto procarióticas como eucarióticas, são bem conhecidos na técnica e descritos abundantemente na literatura (Patentes U.S. 4.840.896, 4.923.805, 5.156.957). Além disso, são bem conhecidos na técnica processos para a avaliação da atividade biológica de uma molécula de FSH remodelado da presente invenção e são descritos, por exemplo, na Patente U.S. 4.589.402, em que é descrito processos para a determinação do efeito de FSH sobre a fertilidade, a produção de óvulos e taxas de gestação tanto em primatas não humanos como em pacientes humanos.
F. EPO
[001071] A presente invenção compreende ainda um processo de remodelagem e/ou modificação de EPO. EPO é uma glicoproteína ácida tendo aproximadamente 34 kDa e pode ocorrer em três formas naturais: alfa, beta e asialo. As formas alfa e beta diferem ligeiramente em componentes carboidrato, mas têm a mesma potência, atividade biológica e peso molecular. A forma asialo é uma forma alfa ou beta com um ácido siálico terminal removido. EPO se encontra presente a concentrações muito baixas no plasma, quando o corpo se encontra num estado saudável em que os tecidos recebem uma quantidade suficiente de oxigenação do número existente de eritrócitos. Esta concentração normal é suficiente para estimular a reposição de eritrócitos que se perdem normalmente através do envelhecimento. A quantidade de eritropoietina na circulação é aumentada em condições de hipoxia quando o transporte de oxigênio pelas células sangüíneas na circulação é reduzido. A hipoxia pode ser causada pela perda de grandes quantidades de sangue por hemorragia, pela destruição de eritrócitos por exposição a radiação, pela redução na absorção de oxigênio devida a grandes altitudes ou por uma inconsciência prolongada, ou por diversas formas de anemia. Portanto, EPO é um componente útil para a reposição de eritrócitos depois de terapia de radiação, anemia e outras condições perigosas para a vida.
[001072] Devido à importância de EPO como auxiliar na recuperação de uma variedade de doenças e distúrbios, a presente invenção é útil para a produção de EPO em conjunto com um componente sacarídeo natural e, portanto, mais efetivo. EPO, conforme ela é atualmente sintetizada, carece do complemento de glicosilação completo e deve, portanto, ser administrada com maior freqüência e a doses maiores devido a sua vida curta no corpo.
[001073] EPO já foi clonada e seqüenciada, estando as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos presentes no presente como ID DE SEQ NO: 15 e ID DE SEQ NO: 16, respectivamente (figura 58A e 58B, respectivamente). Os versados na técnica prontamente observarão que as seqüências apresentadas no presente são somente um exemplo das seqüências que codificam e compreendem EPO. Como exemplo, a Patente U.S. 6.187.564 descreve uma proteína de fusão que compreende a seqüência de aminoácidos de dois ou mais peptídeos de EPO, as Patentes U.S. 6.048.971 e 5.614.184 descrevem moléculas de EPO mutantes que têm substituições de aminoácidos nas posições 101, 103, 104 e 108. A Patente U.S. 5.106.954 descreve uma molécula truncada de EPO e a Patente U.S. 5.888.772 descreve um análogo de EPO com substituições nas posições 33, 139 e 166. Portanto, os versados na técnica observarão que a presente invenção abrange EPO e derivados e variantes de EPO conforme eles estão bem documentados na literatura e na técnica como um todo.
[001074] Além disso, os processos de expressão de EPO em uma célula são conhecidos na técnica. Conforme exemplificado nas Patentes U.S. 4.703.008, 5.688.679 e 6.376.218, dentre outras, EPO pode ser expressa em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos. Os processos para se testar a atividade biológica de EPO são também bem conhecidos na técnica. Como um exemplo, o ensaio de Krystal (Krystal, 1983, Exp. Hematol. 11: 649-660) pode ser empregado para se determinar a atividade de EPO preparada de acordo com os processos da presente invenção. Resumindo, o ensaio mede o efeito da eritropoietina sobre células esplênicas murinas intactas. Os camundongos são tratados com fenil-hidrazina para estimular a produção de células progenitoras de eritrócitos que respondem a eritropoietina. Depois do tratamento, os baços são removidos, as células esplênicas intactas são isoladas e incubadas com diversas quantidades de eritropoietina do tipo nativo ou de proteínas de eritropoietina descritas no presente documento. Depois de uma incubação de um dia para o outro, acrescentou-se 3H-timidina e mediu-se a sua incorporação ao DNA celular. A quantidade de incorporação de 3H-timidina é indicativa da produção de eritrócitos estimulada por eritropoietina pela interação de eritropoietina com o seu receptor celular. A concentração da proteína de eritropoietina da presente invenção, assim como a concentração da eritropoietina do tipo nativo é quantificada por processos de rádio-imuno-ensaios competitivos conhecidos na técnica. As atividades específicas são calculadas em forma de unidades internacionais medidas no ensaio de Krystal divididas pelos microgramas conforme medidos em forma de proteína imuno- precipitável por rádio-imuno-ensaio.
G. GM-CSF
[001075] A presente invenção abrange um processo para a modificação de GM-CSF. GM-CSF é bem conhecido na técnica como uma citocina produzida por células T ativadas, macrófagos, células epiteliais e fibroblastos estromais. GM-CSF atua principalmente na medula óssea para aumentar a produção de leucócitos inflamatórios, e funciona ainda como um hormônio endócrino para iniciar a reposição de neutrófilos consumidos durante as funções inflamatórias. Além disso GM-CSF é um fator ativador de macrófagos e promove a diferenciação de células de Lagerhans em células dendríticas. Como G-CSF, GM-CSF também tem aplicações clínicas na reposição de medula óssea depois de quimioterapia.
[001076] Embora G-CSF tenha mostrado ser um composto importante e útil para aplicações terapêuticas, os processos da presente invenção para a produção de G-CSF a partir de células recombinantes resulta em um produto com uma vida biológica bastante curta, um padrão de glicosilação sem precisão que poderia levar potencialmente a imunogenicidade, perda de função, uma necessidade maior tanto para doses maiores como mais freqüentes a fim de atingir o mesmo efeito e semelhantes.
[001077] GM-CSF já foi isolado e clonado, sendo suas seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos apresentadas como ID DE SEQ NO: 17 e ID DE SEQ NO: 18, respectivamente (figura 59A e 59B, respectivamente). A presente invenção abrange um processo para a modificação de GM-CSF, especialmente na medida em que se refere à capacidade de GM-CSF de funcionar como uma molécula biológica potente e funcional. O técnico versado, quando equipado com a descrição da presente invenção e as instruções nela contidas, compreenderá prontamente que a presente invenção propõe composições e processos para a modificação de GM- CSF.
[001078] A presente invenção abrange ainda variantes de GM-CSF, conforme são conhecidas na técnica. Como um exemplo, mas de modo algum como uma limitação à presente invenção, uma variante de GM-CSF foi descrita em WO 86/06358, em que a proteína é modificada para uma estrutura quaternária alternativa. Além disso, a Patente U.S. 6.287.557 descreve uma seqüência de ácidos nucléicos de GM- CSF ligadas no genoma de um vírus do herpes para aplicações de terapia genética. Adicionalmente, a publicação de Patente Européia No. 0288809 (correspondendo à publicação de Patente PCT No. WO 87/02060) descreve uma proteína de fusão compreendendo IL-2 e GM-CSF. A seqüência de IL-2 pode se encontrar em qualquer uma das extremidades de terminal N ou C do GM-CSF, de modo que depois da clivagem ácida da proteína de fusão pode ser gerado um GM-CSF que tem modificações na seqüência em qualquer um dos terminais N ou C. Portanto, os derivados, mutantes e variantes de GM-CSF são conhecidos na técnica e são abrangidos pelos processos da presente invenção.
[001079] A expressão e a atividade de uma molécula de GM-CSF modificada da presente invenção podem ser testadas usando-se processos conhecidos na técnica, e conforme descritos, por exemplo, na Patente U.S. 4.810.643. Como um exemplo, a atividade pode ser medida empregando-se ensaios de absorção de timidina rádio-rotulada. Resumindo, a medula óssea humana proveniente de doadores sadios é submetida a uma redução da densidade com Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ), e as células de baixa densidade são suspensas em meio Iscove (GIBCO, La Jolla, CA) contendo soro fetal bovino a 10%, glutamina e antibióticos. Aproximadamente 2 x 104 células de medula óssea humanas são incubadas ou com o meio de controle ou com GM-CSF ou a presente invenção em placas de fundo chato de 96 cavidades a aproximadamente 37°C em CO2 a 5% em ar durante aproximadamente 2 dias. Faz-se então as culturas pulsarem durante aproximadamente 4 horas com 0,5 μCi/cavidade de 3H- timidina (New England Nuclear, Boston, Mass) e a absorção é medida do modo descrito, por exemplo, em Ventua e outros (1983, Blood 61: 781). Um aumento na incorporação de 3H- timidina às células de medula óssea humanas em comparação com células de medula óssea tratadas com o composto de controle é uma indicação de um composto de GM-CSF ativo e viável.
H - Gama-IFN
[001080] É um objetivo da presente invenção abranger um processo de modificação e/ou remodelagem de gama-IFN. Gama-IFN, também conhecido como interferon do Tipo II, ao contrário do IFN alfa e IFN beta, é uma glicoproteína homodimérica compreendendo duas subunidades tendo aproximadamente 21-24 kDa. A variações de tamanhos é devida a padrões variáveis de glicosilação, geralmente não replicados quando reproduzidos de modo recombinante em diversas etapas conhecidas na técnica. Gama-IFN é um ativador potente de macrófagos, aumenta a expressão da molécula de classe I de MHC, e até um certo ponto, um agente estimulador da molécula de classe I de MHC. Além disso, gama-IFN promove a diferenciação de células T e a comutação de isótopos em células B. gama-IFN é também bem documentado como um estimulador de neutrófilos, células NK, e respostas de anticorpos que levam a eliminação mediada por fagócitos. gama-IFN foi proposto como um tratamento a ser usado em conjunto com infecção por patógenos intracelulares, tais como de tuberculose e leishamaniose, e também como um agente terapêutico anti-proliferativo, útil em condições em que a principal característica é uma proliferação celular anormal, como em diversos cânceres e outras neoplasias.
[001081] Gama-IFN apresentou uma atividade imunológica potente, mas devido a variações na glicosilação a partir de sistemas atualmente usados para expressar gama-IFN, a potência, eficácia, meia-vida biológica, e outros fatores importantes de um agente terapêutico foram na melhor das circunstâncias variáveis. A presente invenção abrange processos para corrigir tal defeito crucial.
[001082] As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de gama-IFN são apresentadas no presente com ID DE SEQ NO: 19 e ID DE SEQ NO: 20, respectivamente (figura 60A e 60B, respectivamente). Será prontamente compreendido que as seqüências apresentadas no presente não limitam de nenhum modo a presente invenção. Pelo contrário, variantes, derivados e mutantes de gama-IFN são bem conhecidos do versado na técnica. Como exemplo, a Patente U.S. 6.083.724 descreve um gama-IFN recombinante de ave e a Patente U.S. 5.770.191 descreve variantes de terminal C de gama-IFN humano. Além disso, a Patente U.S. 4.758.656 descreve derivados novos de gama-IFN e processos de sintetizá-los em diversos sistemas de expressão. Portanto, a presente invenção não se limitará às seqüências de gama-IFN descritas em outro ponto no presente, mas abrangerá todos os derivados, variantes, muteínas e semelhantes, bem conhecidos na técnica.
[001083] Os sistemas de expressão de gama-IFN são também conhecidos na técnica, incluindo sistemas procariótico e eucariótico assim como preparados de células vegetais e de insetos, processos que são conhecidos dos versados na técnica. Como um exemplo, a Patente U.S. 4.758.656, descreve um sistema para expressar derivado de gama-IFN em E. coli, ao passo que a Patente U.S. 4.889.803 descreve um sistema de expressão que emprega células ovarianas de hamster chinês e um promotor SV40.
[001084] Os testes para a atividade biológica de um gama-IFN remodelado preparado de acordo com os processos descritos no presente serão bem conhecidos dos versados na técnica. Ensaios biológicos para a expressão de gama-IFN podem ser encontrados, por exemplo, na Patente U.S. 5.807.744. Resumindo, gama-IFN é acrescentado a culturas de células CD34++CD38- (100 células por cavidade) estimuladas por combinações de citocina para induzir a proliferação de células CD34++CD38- tais como IL-3, ligante de c-kit e ou IL-1, IL-6 ou G-CSF. A proliferação celular e a geração de células formadoras de colônias secundárias serão profundamente inibidas em um modo dependente de dose, com uma inibição praticamente completa ocorrendo com 5000 U/mililitro de gama-IFN. Como um teste confirmatório ao efeito inibidor de gama-IFN, a adição de anticorpos a gama- IFN pode ser conduzida como um controle.
I. Inibidor de alfa-Protease (α-antitripsina)
[001085] A presente invenção inclui ainda um processo para a remodelagem de inibidor de alfa-protease (A-1-PI, α- 1-antitripsina ou inibidor de α-1-tripsina), também conhecido como alfa-antitripsina. A-1-PI é uma glicoproteína com um peso molecular de 53 kDa. A-1-PI representa um papel no controle da destruição de tecido por proteases de serina endógenas, e é o mais pronunciado inibidor de serina protease no plasma sangüíneo. Mais especificamente A-1-PI inibe diversas elastases incluindo a elastase de neutrófilos. A elastase é a protease que decompõe tecidos e pode ser especialmente problemática quando a sua atividade é desregulada no tecido pulmonar. Esta protease funciona decompondo proteínas exógenas. No entanto, quando API não está presente em quantidades suficientes para regular a atividade da elastase, a elastase decompõe tecido pulmonar. Com o tempo isto resulta em dano crônico ao tecido pulmonar e enfisema. Na verdade, uma deficiência genética de A-1-PI mostrou estar associada com o desenvolvimento prematuro de enfisema pulmonar. A reposição de A-1-PI foi empregada com sucesso para o tratamento desta forma de enfisema. Além disso, uma deficiência de A-1-PI pode também contribuir para o agravamento de outras doenças tais como fibrose cística e artrite, em que os leucócitos se deslocam para o pulmão ou para s juntas para combater a infecção.
[001086] Portanto, A-1-PI poderia ser, pensa-se, usada para o tratamento de doenças em que o desequilíbrio entre inibidor e protease(s), especialmente a neutrófilo elastase esteja causando o avanço do estado mórbido. A atividade antiviral foi também atribuída a A-1-PI. Levando-se em conta tal fato, deduz-se que a presente invenção seja útil para a produção de A-1-PI que é segura, efetiva e potente na atmosfera sempre em modificação dos pulmões.
[001087] A-1-PI foi clonada e seqüenciada e é apresentada em ID DE SEQ NO: 21 e ID DE SEQ NO: 22 (figura 61A e 61B, respectivamente). Será observado pelos versados na técnica, que existem variantes naturais e construídas de A-1-PI, e estas são abrangidas pela presente invenção. Como exemplo, a Patente U.S. 5.723.316 descreve derivados de A- 1-PI que têm substituições de aminoácidos nas posições 356-361 e que compreende ainda uma extensão de terminal N de aproximadamente três aminoácidos. A Patente U.S. 5.674.708 descreve análogos de A-1-PI com substituições de aminoácidos na posição 358 na seqüência principal de aminoácidos. Os versados na técnica perceberão prontamente que a presente invenção abrange variantes, derivados e mutantes de A-1-PI conhecido ou a serem descobertos.
[001088] Os processos para a expressão e determinação e atividade de uma A-1-PI remodelada produzida de acordo com os processos da presente invenção são conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, na Patente U.S. 5.674.708 e Patente U.S. 5.723.316. Resumindo, a atividade biológica pode ser determinada empregando-se testes para a atividade de antiquimotripsina por medição da inibição da hidrólise catalisada por quimotripsina do substrato N-suc- Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida (0,1 ml de uma solução a 10 mM em DMSO a 90%), como descrito, por exemplo, em DelMar e outros (1979, Anal. Biochem. 99: 316). Um ensaio típico de quimotripsina contém, em 1,0 mililitro: 100 mM de tampão Tris-Cl, pH 8,3, 0,005 % (v/v) de Triton X-100 quimotripsina pancreática bovina (18 kmmol) e A-1-PI da presente invenção. A mistura de teste é previamente incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos, acrescentou-se o substrato (0,01 ml de uma solução a 10 mM em DMSO a 9 %) e determina-se a atividade da quimotripsina restante pela taxa de alteração de absorvência a 1410 nm causada pela liberação p-nitroanilina. As medições de absorvência ótica são conduzidas a 25°C empregando-se um espectrofotômetro dotado com um compartimento para amostras com a temperatura controlada.
J. Glicocerebrosidase
[001089] A invenção descrita no presente documento inclui ainda um processo para a modificação de glicocerebrosidase. A glicocerebrosidase é uma enzima de glicoproteína lisossômica que catalisa a hidrólise da glicocerebrosidase de glicolipídio em glicose e ceramida. As variantes de glicocerebrosidases são vendidas no comércio como CerezymeTM e CeredaseTM, e é um produto terapêutico aprovado para o tratamento da doença de Gaucher. CeredaseTM é uma forma derivada placental de glicocerebrosidase com estruturas ligadas a N completas. CerezymeTM é uma variante recombinante de glicocerebrosidase que tem 497 aminoácidos de comprimento e é expressa em células CHO. Os 4 glicanos ligados a N de Cerezyme foram modificados para terminar no núcleo de trimanose.
[001090] A glicocerebrosidase é atualmente produzida em culturas de células de mamíferos recombinantes, e reflete, portanto, os padrões de glicosilação dessas células, geralmente células de roedores tais como células ovarianas de hamster chinês e células de rim de filhote de hamster, que diferem drasticamente das dos padrões de glicosilação humana, levando, dentre outras coisas, a imunogenicidade e a perda de potência.
[001091] As sequências de ácidos nucléicos e de aminoácidos de glicocerebrosidase são apresentadas no presente documento como ID DE SEQ NO: 23 e 24 (figuras 62A e 62B, respectivamente). No entanto, como será observado pelos versados na técnica, as seqüências representadas no presente documento são protótipos de seqüências que não limitam a invenção. Na verdade, as variantes de glicocerebrosidase são bem conhecidas e são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 6.015.703, onde é descrita uma produção aumentada de análogos e variantes de glicocerebrosidases. Além disso, a Patente U.S. 6.087.131 descreve a clonagem e o seqüenciamento de uma outra variante de glicocerebrosidase. É a intenção da presente invenção abranger estes e outros derivados, variantes, e mutantes conhecidos ou a serem descobertos no futuro.
[001092] Os processos para a expressão de glicocerebrosidase são bem conhecidos na técnica empregando-se técnicas padrão e são descritos detalhadamente na Patente U.S. 6.015.703, por exemplo. Os testes para a eficácia biológica de uma molécula de glicocerebrosidase preparada de acordo com os processos da presente invenção são também bem conhecidos na técnica e o modelo murino da doença de Gaucher para a avaliação e emprego de uma terapêutica de glicocerebrosidase é descrito em Marshall e outros (2002, Mol. Ther. 6:179), por exemplo.
K.TPA
[001093] A presente invenção abrange ainda um processo para a remodelagem do ativador de tipo de tecido (TPA). TPA ativa o plasminogênio para formar plasmina que dissolve a fibrina, o principal componente do substrato protéico do trombo. Os preparados de TPA foram desenvolvidos como agentes trombolíticos com uma seletividade muito elevada para o trombo no tratamento trombolítico para trombose que produz o enfarte do miocárdio e o enfarte cerebral.
[001094] Além disso, foram produzidos diversos TPAs por engenharia genética com a finalidade de se obter uma afinidade maior a fibrina e uma meia-vida mais longa no sangue do que o TPA natural. Os TPA modificados produzidos a partir de procariontes são não glicosilados ao contrário do TPA natural. Os TPA são proteínas que são geralmente extremamente difíceis de se solubilizar em água. Mais especificamente, os TPA modificados são mais difíceis de se solubilizar em água do que TPA natural, tornando muito difícil a preparação de TPAs modificados. Os TPAs modificados são, portanto, difíceis de se dissolvem em água no momento da administração a um paciente. NO entanto, os TPAs modificados têm muitas vantagens tais como uma maior afinidade para fibrina e uma meia-vida mais longa no sangue. É objetivo da presente invenção se aumentar a solubilidade dos TPAs modificados.
[001095] As seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos de TPA são apresentadas no presente documento como ID DE SEQ NO: 25 e ID DE SEQ NO: 26, respectivamente (figuras 63A e 63B, respectivamente). Conforme descrito acima, as variantes de TPA foram construída e usadas em aplicações terapêuticas. A Patente U.S. 5.770.425, por exemplo, descreveu variantes de TPA em que o domínio de fibrina foi parcial ou totalmente apagado. Além disso, a Patente U.S. 5.736.134 descreve TPA em que são descritas modificações a um aminoácido na posição 276. Os versados na técnica, quando equipados com a presente descrição e as instruções nela contidas, prontamente perceberão que a presente invenção compreende as seqüências de TPA apresentadas no presente documento, assim como variantes bem conhecidas aos versados na técnica.
[001096] A expressão de TPA a partir de uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica o mesmo é conhecida na técnica e é descrita detalhadamente na Patente U.S. 5.753.486, por exemplo. Os ensaios para se determinar as propriedades biológicas de uma molécula de TPA preparada de acordo com os processos da presente invenção são também conhecidos na técnica. Resumindo, uma molécula de TPA sintetizada do modo descrito em outra parte no presente documento pode ter testada a sua capacidade de produzir a lise da fibrina na presença de concentrações saturantes de plasminogênio, de acordo com o processo de Carlsen e outros (1988, Anal. Biochem. 168: 428). O ensaio de lise de coágulos in vitro mede a atividade de ativadores do tipo de tecido por turbidimetria empregando-se um analisador de microcentrifugação. Uma mistura de trombina e TPA é centrifugada para dentro de uma mistura de fibrinogênio e plasminogênio para iniciar a formação de coágulos e a subseqüente dissolução do coágulo. O perfil resultante do tempo por absorvência é analisado para se determinar o ponto final do ensaio. As atividades das variantes de TPA são comparadas a uma curva padrão de TPA. O tampão usado em todo o ensaio é fosfato de sódio a 0,06M, pH 7,4 contendo 0,01% de TWEEN 80 e 0,01% (peso/volume) de azida de sódio. A azida se encontra a uma concentração de aproximadamente 33 unidades/ml. O fibrinogênio (a 2,0 mg/ml de proteína coagulável) é resfriado sobre gelo úmido para precipitar a fibronectina, filtrando-se em seguida por gravidade. O Glu- plasminogênio se encontra a uma concentração de 1mg /ml. A temperatura da câmara do analisador é ajustada para 37°C. O carregador é ajustado para dispensar 20 microlitros de TPA (aproximadamente 500 nanogramas/mililitro até aproximadamente 1,5 microgramas por mililitro) como a amostra para a curva padrão ou 20 microlitros de TPAs variante a uma concentração que produza lise nos limites da curva padrão. Vinte microlitros de trombina como o reagente secundário e 200 microlitros de uma mistura de fibrinogênio:plasminogênio a 50:1 (v/v)como o reagente primário. O programa absorvência/tempo é usado com um tempo de incubação de 5 min, filtro de 340 nanômetro e leituras a intervalos de 90 segundos.
L-IL-2
[001097] A presente invenção abrange ainda um processo para a remodelagem e modificação de IL-2. A IL-2 é um fator de crescimento principal de linfócitos T e aumenta as respostas imunes humorais e celulares por estímulo de células citotóxicas T CD8 e de células NK. IL-2 é, portanto, crucial nos mecanismos de defesa contra tumores e infecções virais. IL-2 é também empregado na terapia contra melanoma metastático e adenocarcinoma renal, e vem sendo usado nos testes clínicos em muitas formas de câncer. Além disso, IL-2 vem sendo também usado em pacientes infectados com HIV onde ele leva a um aumento significativo de contagens de CD4.
[001098] Devido ao sucesso que IL-2 demonstrou no gerenciamento e no tratamento de doenças letais tais como diversos cânceres e aids, os processos da presente invenção seriam úteis para o desenvolvimento de uma molécula IL-2 que tem uma meia vida biológica mais longa, uma potência maior e em geral um perfil terapêutico mais semelhante à IL-2 do tipo nativo, tal como ela é segregada e sintetizada no ser humano sadio.
[001099] IL-2 foi clonada e seqüenciada e as seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos são apresentadas no presente documento como ID DE SEQ NO: 27 e ID DE SEQ NO: 28 (figuras 64A e 64B, respectivamente). A presente invenção não deve ser interpretada absolutamente como estando limitada às seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de IL-2 apresentadas no presente documento. As variantes de IL-2 são descritas na Patente U.S. 6.348.193, por exemplo, em que a asparagina substitui arginina na posição 88, e na Patente U.S. 5.206.344, em que é descrito um polímero compreendendo variantes de Il-2 com diversas substituições de aminoácidos. A presente invenção abrange estas variantes de IL-2 e outras bem conhecidas na técnica.
[001100] Os processos para a expressão e para a determinação da atividade de IL-2 são bem conhecidos na técnica, e são descritos na Patente U.S. 5.417.970, por exemplo. Resumindo, a expressão de IL-2 ou de suas variantes pode ser obtida de uma variedade de sistemas tanto procarióticos como eucarióticos, incluindo de E. coli, células CHO, células BHK, células de insetos empregando-se um sistema de expressão de baculovírus, todos eles bem conhecidos na técnica.
[001101] Testes para a atividade de uma IL-2 modificada preparada de acordo com os processos da presente invenção podem ser conduzidos do seguinte modo. Linfócitos do sangue periférico podem ser separados dos eritrócitos e dos granulócitos por centrifugação em um gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) por um processo descrito em A. Boyum e outros (Methods in Enzymology, 1984, Vol. 108, página 88, Academic Press, Inc.) O linfócitos são subseqüentemente lavados aproximadamente três vezes em meio de cultura que consiste em RPMI 1640 (Gibco-BRL, La Jolla, CA) acrescido de 10 % de soro humano AB (CTS Purpan, Toulouse, França) inativado por calor (1 hora a 56°C), 2 mM de piruvato de sódio, 5 mM de HEPES, 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina e 0,25 μg/ml de anfotericina B (meio completo). As células adesivas (monócitos e macrófagos) são eliminadas por aderência ao plástico e o restante das células é suspenso no meio completo a uma concentração de aproximadamente 5 a 10 x 105 células por mililitro e semeadas em frascos de cultura a uma densidade de aproximadamente 1-2 x 105 células por centímetro quadrado. Os frascos são então incubados a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5 % durante 1 h aproximadamente, quando então os linfócitos não adesivos são recuperados por aspiração depois de uma leve agitação dos frascos de cultura.
[001102] Os linfócitos não adesivos são lavados uma vez e cultivados a uma concentração de aproximadamente 105 células por mililitro em meio completo na presença da IL-2 da presente invenção durante um período de aproximadamente 48 horas em uma incubadora conforme descrito acima. As células são então lavadas uma vez.
[001103] A atividade citotóxica das células é avaliada depois de aproximadamente 4 horas de contato com células alvo da linhagem de linfóides T humanos C8166-45/C63 (células HT1) resistente a citotoxicidade das células NK, conforme descrito por Salahuddin e outros (1983, Virology 129: 51-64; 1984, Science; 223, 703-707). 6 x 105 células HT1 são rádio-etiquetadas com aproximadamente 200 μCi de 51Cr (cromato de sódio, Amersham, Arlington Heights, IL) a 37°C durante aproximadamente 1 hora em meio completo sem soro, sendo então lavada diversas vezes. As células alvo e as células efetivas são distribuídas em placas de microtitulação de fundo redondo com relações variáveis de células efetivas para células alvo (50:1, 10:1, 1:1). As placas de microtitulação são centrifugadas e, depois de incubação do modo descrito acima, o sobrenadante de cada cavidade é recuperado e a radioatividade é medida empregando-se um contador gama. A citotoxicidade é determinada a partir da quantidade de 51Cr liberada pelas células alvo mortas. A citotoxicidade não específica é determinada a partir da quantidade de radioatividade espontaneamente liberada das células alvo na ausência de células efetivas.
[001104] O presente processo é somente um de muitos bem conhecidos na técnica de medição da citotoxicidade de células efetoras e não deve ser interpretado como limitando a presente invenção.
M. Fator VIII
[001105] A invenção abrange ainda um processo para a remodelagem e modificação do Fator VIII. Conforme já descrito para o Fator VII e o Fator IX, o Fator VIII é um componente crítico da via de coagulação sangüínea. O Fator VIII humano (fator anti-hemofílico; FVIII:C) é uma proteína plasmática humana consistindo em 2 peptídeos (peso molecular de cadeia leve de 80 kDa e peso molecular de cadeia pesada variável de 90 a 220 kDa, dependendo do estado de glicosilação). Ele é um co-fator essencial na via de coagulação e é necessário para a conversão do Fator X na sua forma ativa (Fator Xa). O Fator VIII circula no plasma como um complexo não covalente com o Fator de Willibrand (também conhecido como FVIII:RP), um dímero de um peptídeo de 2050 aa (veja a Patente U.S. 6.307.032). As concentrações sangüíneas do Fator VIII abaixo de 20% da normal produzem um distúrbio hemorrágico designado hemofilia A. Os níveis sangüíneos do Fator VIII inferiores a 1% resultam em um distúrbio grade hemorrágico, sendo a hemorragia espontânea das juntas o seu sintoma mais comum.
[001106] Tal como acontece com os demais fatores de coagulação sangüínea, o Fator VIII é um produto terapêutico com um grande potencial para o tratamento de diversos distúrbios hemorrágicos, tais como a hemofilia A e hemofilia B. Devido à glicosilação da cadeia pesada, os processos atuais para a preparação do Fator VIII a partir de células recombinantes resulta em um produto que não é tão efetivo como o Fator VIII natural. Os processos de purificação do plasma humano resultam em uma composição bruta que é menos efetiva e mais difícil de ser preparada do que o t VIII recombinante. A presente invenção busca melhorar esta situação.
[001107] As seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos do Fator VIII são apresentadas no presente como ID DE SEQ NO: 29 e ID DE SEQ NO: 30, respectivamente (figuras 65A e 65B, respectivamente). A técnica está cheia de variantes do Fator VIII, conforme descrito, por exemplo, na Patente U.S. 5.668.108, em que o ácido aspártico na posição 1241 é substituído por um ácido glutâmico com as alterações correspondentes dos ácidos nucléicos também. A Patente U.S. 5.149.637 descreve uma variante do Fator VIII compreendendo a fração de terminal C tanto glicosilada como não glicosilada, e a Patente U.S. 5.661.008 descreve uma variante do Fator VIII compreendendo os aminoácidos 1-740 ligados a aminoácidos 1649 a 2332 por 3 resíduos de aminoácidos pelo menos. Portanto, variantes, derivados e modificações e complexos do Fator VIII são bem conhecidos na técnica e são abrangidos pela presente invenção.
[001108] Os sistemas de expressão para a produção do Fator VIII são bem conhecidos na técnica e incluem células procarióticas e eucarióticas, conforme exemplificado na Patente U.S. 5.63.150, 5.804.420 e 5.22.250.
[001109] Para se determinar a atividade biológica de uma molécula de Fator VIII sintetizada de acordo com os processos da presente invenção, o versado na técnica reconhecerá que os testes descritos no presente para a avaliação do Fator VII e do Fator IX são aplicáveis ao Fator VIII.
N. Uroquinase
[001110] A presente invenção também inclui um processo para a remodelagem e/ou modificação de uroquinase. A uroquinase é uma serina protease que ativa o plasminogênio em plasmina. A proteína é sintetizada em uma variedade de tecidos que incluem o endotélio e o rim, e é excretada em quantidades mínimas na urina. A uroquinase purificada existe em duas formas ativas, uma forma de alto peso molecular (HUK; aproximadamente 50 kDa) e uma forma de baixo peso molecular (LUK; aproximadamente 30 kDa). LUK mostrou ser derivada de HUK por uma proteólise depois de lisina 135, liberando os primeiros 135 aminoácidos de HUK. A instrução convencional sustenta que HUK ou LUK devem ser convertidos em formas proteoliticamente ativas pela hidrólise proteolítica de um precursor de uma só cadeia, também denominado pro-uroquinase, entre lisina 158 e isoleucina 159 para gerar uma forma ativada de duas cadeias (que continua a correspondem tanto a HUK como a LUK). As espécies de uroquinase proteoliticamente ativas resultando deste corte hidrolítico contém duas cadeias de aminoácidos mantidas ligadas entre si por uma única ligação dissulfeto. As duas cadeias formadas pelo corte de ativação são denominadas cadeias A ou A1 (HUK ou LUK), respectivamente) e a cadeia B compreende o domínio de protease da molécula.
[001111] A uroquinase mostrou ser um agente trombolítico efetivo. No entanto, como ela é produzida na natureza em quantidades mínimas o custo da enzima é alto para uma dosagem efetiva. A uroquinase foi produzida em cultura de células recombinantes, e o DNA que codifica a uroquinase e conhecido juntamente com vetores e microorganismos hospedeiros adequados. As composições da presente invenção compreendendo uroquinase e os processos para a produção recombinante de uroquinase são prejudicados por um produto que tem padrões de glicosilação deficientes, e dados os eventos de clivagem proteolíticos complexos que cercam a ativação de uroquinase, esta glicosilação aberrante leva a um produto menos efetivo e menos potente.
[001112] As seqüências dos nucleotídeos que codificam a cadeia de aminoácidos primária de uroquinase são descritas na ID DE SEQ NO: 33 e ID DE SEQ NO: 34 (figuras 66A e 66B, respectivamente). As variantes da uroquinase são bem conhecidas na técnica, e, portanto, a presente invenção não é limitada às seqüências apresentadas no presente documento. Na verdade, os versados na técnica prontamente perceberão que as variantes descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5.219.569, 5.648.253 e 4.892.826 existem como porções funções e são, portanto, abrangidas pela presente invenção.
[001113] A expressão e a avaliação de uma molécula de uroquinase preparada de acordo com os processos da presente invenção são também bem conhecidos na técnica. Como um exemplo não limitante, a expressão de uroquinase em diversos sistemas é descrita detalhadamente na Patente U.S. 5.219.569. Um ensaio para a determinação da atividade e funcionalidade de uma uroquinase preparada de acordo com os processos apresentados no presente documento são descritos em toda a literatura e são análogos aos testes para outros ensaios relacionados com plasminogênio e fibrina descritos em todas outras referências. Um exemplo de um ensaio para a determinação da atividade de uma molécula de uroquinase sintetizada do modo descrito no presente pode ser conforme descrito em Ploug e outros (1957, Biochim. Biophys. Acta 24: 278-282), por exemplo, empregando-se placas de fibrina compreendendo 1,2% de agarose, 4,1 mg/ml de fibrinogênio humano, 0,3 unidades/ml de trombina e 0,5 μg/ml de inibidor de tripsina de soja.
O. DNase Humana
[001114] A presente invenção abrange ainda um processo para a remodelagem e/ou modificação de DNase recombinante humana. A DNase humana I foi testada como um agente terapêutico e mostrou diminuir a viscosidade do muco de fibrose cística in vitro. Foi também determinado que o muco purulento contém aproximadamente 10-13 mg/ml de DNA, um polímero iônico que se prediz que afeta as propriedades reológicas dos fluidos nas vias aéreas. Conseqüentemente, foi testada a DNase I pancreática humana, uma enzima que degrada DNA, como um agente mucolítico muitos anos atrás, mas não entrou na prática clínica, devido a efeitos colaterais induzidos por antigenicidade e/ou pelas proteases contaminantes. A DNase humana recombinante vem sendo atualmente usada como um agente terapêutico para aliviar os sintomas de doenças tais como fibrose cística.
[001115] Tal como ocorre com a DNase derivada de fontes bovinas, a DNase humana apresenta alguns problemas, principalmente devido à eficácia reduzida devido à glicosilação imprópria conferida pelos sistemas de expressão de mamíferos atualmente empregados. A presente invenção descreve um processo para a remodelagem de DNase, levando a uma maior eficácia e a melhores resultados terapêuticos.
[001116] As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de DNase humana são apresentadas no presente documento como ID DE SEQ NO: 39 e ID DE SEQ NO: 40 (figuras 67A e 67B, respectivamente). Variantes do peptídeo compreendendo DNase são conhecidas na técnica. Como um exemplo, a Patente U.S. 6.348.343 descreve uma DNase humana com uma multiplicidade de substituições de aminoácidos em toda a estrutura primária. Além disso, a Patente U.S. 6.391.607 descreve uma variante hiperativa de DNase com múltiplas substituições de aminoácidos nas posições 9, 14, 74, 75 e 205. Os exemplos da presente invenção e outros bem conhecidos na técnica ou a serem descobertos no futuro são abrangidos pela presente invenção.
[001117] Os sistemas de expressão para a produção de um peptídeo de DNase são bem conhecidos dos versados na técnica e foram descritos em sistemas procarióticos e eucarióticos. A publicação de patente PCT No.WO 90/07572 descreve estes processos com consideráveis detalhes.
[001118] Os testes para a determinação da atividade biológica de uma molécula de DNase desenvolvida de acordo com os processos da presente invenção são bem conhecidos. Como um exemplo, de nenhum modo limitantes da presente invenção, é apresentado no presente documento um ensaio para se determinar a atividade hidrolítica de DNA de DNase I humana. Resumindo dois ensaios de digestão por plasmídeos diferentes são usados. O primeiro ensaio (“ensaio de digestão de DNA super enrolado) mede a conversão do DNA de plasmídeo de dois filamentos super enrolado nas formas relaxada (abreviada), linear e degradada. Mais especificamente DNase preparada de acordo com os processos da presente invenção é acrescentada a 160 microlitros de uma solução que compreende 25 microgramas por mililitro ou de DNA de plasmídeo superenrolado ou DNA de plasmídeo linearizado digerido por EcoRI em 25 mM de HEPES,pH 7,1, 100 μg/ml de albumina sérica bovina, 1 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl e as amostras são incubadas à temperatura ambiente. A ocasiões diferentes, removem-se alíquotas das misturas de reação e extinguem-se com a adição de EDTA a 25 mM, juntamente com xileno cianol, azul de bromofenol e glicerol. A integridade do DNA de plasmídeo nas amostras extintas é analisada por eletroforese das amostras sobre géis de agarose. Depois da eletroforese, os géis são tingidos com uma solução de brometo de etídio e o DNA é visualizado por luz ultravioleta. As quantidades relativas de formas superenrolada, relaxada e linear do DNA de plasmídeo são determinadas fazendo-se a varredura dos géis com um formador de imagens fluorescente (tal como o Modelo 575 FluorImager de Molecular Dynamics) e quantificando-se a quantidade de DNA nas faixas do gel que correspondem às diferentes formas.
P. Insulina
[001119] A invenção inclui ainda um processo para a remodelagem de insulina. A insulina é bem conhecida como o tratamento mais efetivo para o diabete do tipo I em que as células de ilhotas beta do pâncreas não produzem insulina para a regulagem dos níveis sangüíneos de glicose. As ramificações do diabete e a glicose sangüínea descontrolada incluem problemas circulatórios e dos pés, e cegueira, sem se mencionar uma variedade de outras complicações que ou resultam do diabete ou são exacerbadas por ele.
[001120] Antes da clonagem e do seqüenciamento da insulina humana, era usada a insulina porcina como um tratamento para o diabete. A insulina é agora produzida de modo recombinante, mas a seqüência curta de 51 aminoácidos da molécula madura é uma estrutura complexa compreendendo uma multiplicidade de ligações sulfeto. Os processos atuais para se produzir de modo recombinante a insulina resultam em um produto que carece de similaridade com a proteína nativa tal como produzida em pacientes sadios não diabéticos. A presente invenção busca superar tal falha.
[001121] As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da insulina humana são ilustradas nas ID DE SEQ NO: 43 e ID DE SEQ NO: 44, respectivamente (figuras 68A e 68B, respectivamente). As variantes de insulina são abundantes na técnica. A Patente U.S. 6.337.194 descreve análogos de proteína de fusão da insulina, a Patente U.S. 6.323.311 descreve derivados de insulina que compreendem um anidrido cíclico de um ácido dicarboxílico e a Patente U.S. 6.251.856 descreve um derivado de insulina que compreende uma multiplicidade de substituições de aminoácidos e um grupo lipófilo. Os versados na técnica observarão que os exemplos abaixo de derivados de insulina não devem ser considerados de modo nenhum exaustivos, mas simplesmente representam uma pequena amostra dos conhecidos na técnica. Portanto a presente invenção compreende derivados de insulina conhecidos ou a serem descobertos.
[001122] Os sistemas de expressão para a produção de insulina são bem conhecidos na técnica e podem ser obtidos empregando-se técnicas de biologia molecular conforme descritos, por exemplo, em Sambrook e outros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York).
[001123] Os testes para se determinar a funcionalidade de uma molécula de insulina preparada de acordo com os processos da presente invenção são também bem conhecidos na técnica. Um modelo in vivo de depressão glicosídica, por exemplo, pode ser usado para se avaliar a atividade biológica da insulina sintetizada empregando-se os processos da presente invenção. Útil para tal fim é um modelo do rato. Os animais são deixados em jejum de um dia para o outro (16 horas) antes do experimento, sendo então anestesiado por via intraperitoneal por administração de pentobarbital de sódio ou de outro anestésico adequado tal como cetamina. Cada animal recebe uma injeção i.v. (veia da cauda) do derivado de insulina específico (20 μg/ml/kg). As amostras de sangue são tiradas da veia jugular 15 e 5 minutos antes da injeção e 15, 30, 60, 90, 120, 180 e 240 minutos depois da injeção. Os níveis sangüíneos de glicose são medidos com um monitor de glicose sangüínea, disponível de uma variedade de fornecedores comerciais.
Q. Vacinas para Hepatite B (HBsAg)
[001124] A presente invenção compreende ainda um processo para a remodelagem do antígeno usado nas vacinas de hepatite B (HBsAg ou sAg de Hepatite B). HBsAg é um antígeno de superfície da proteína S de hepatite B produzido recombinantemente, e é usado para se obter uma resposta imune ao vírus da hepatite B, um vírus cada vez mais perigoso que resulta, dentre outras coisas em doença hepática que inclui cirrose e carcinoma, e resulta em mais de 1 milhão de morte em todo o mundo anualmente. Atualmente a vacina HBsAg é administrada três vezes durante um intervalo de seis meses para obter uma resposta imune protetora e neutralizante.
[001125] HBsAg é atualmente produzido em linhagens de levedura e, portanto, reflete os padrões de glicosilação nativas a um fungo. A presente invenção proporciona um processo para remodelar HBsAg, resultando, dentre outras coisas, em uma imunogenicidade melhorada, anticorpos com uma melhor afinidade para o vírus e semelhantes.
[001126] As seqüências de proteína S provenientes de uma cadeia de ácidos nucléicos e de aminoácidos primários de um vírus da Hepatite B (HBsAg) são apresentadas como ID DE SEQ NO: 45 e ID DE SEQ NO: 46 (figuras 69A e 69B, respectivamente). O nucleotídeo tem 1203 bases de comprimento O aminoácido tem 400 resíduos de comprimento. Os últimos 226 resíduos de aminoácidos constituem o S- antígeno pequeno que é usado na vacina GlaxoSmithKline e na vacina Merck. Cinqüenta e cinco aminoácidos a montante do S-antígeno pequeno se encontra o códon de início Pre-S. As regiões PreS + S constituem o antígeno S médio, que é usado na vacina Aventis Pasteur. Contando-se a partir do primeiro códon de início até o códon de início de Pre-S tem-se o resto da proteína S, que é denominada proteína S grande. Isto é somente um exemplo se HBsAg empregado em vacinas, sendo outros subtipos bem conhecidos conforme exemplificado nos Números de Acesso de GenBank: AF415222, AF 415221, AF415440, E AF415 219. As seqüências apresentadas no presente são somente exemplos de HBsAg conhecidos na técnica. Antígenos análogos foram isolados de outras cepas do vírus da hepatite B e podem ter sido ou avaliados para a antigenicidade e potencial como candidatos para vacina. A presente invenção, portanto, abrange os antígenos de superfície da proteína S da vacina de hepatite B conhecidos ou a serem descobertos.
[001127] A expressão de um HBsAg em um sistema de expressão é procedimento de rotina para os versados na técnica e é descrito, por exemplo, na Patente U.S. 5.851.823. Ensaios para se testar a imunogenicidade de uma vacina são bem conhecidos na técnica e compreendem diversos testes para a produção de anticorpos neutralizantes e empregam técnicas tais como ELISA, ensaios de neutralização, Western blots, imunoprecipitação e semelhantes. Resumindo, é descrito um ELISA sanduíche para a detecção de anticorpos anti-HBsAg efetivos. O ensaio Enzygnost HBsAg (Aventis Behring, King of Prussia, PA) é usado para tais processos. As cavidades são revestidas com anti-HBs. Plasma sérico ou proteína purificada e controles adequados são acrescentados às cavidades, incubando-se. Depois de lavagem, faz-se reagir anticorpos a HBsAg rotulados com peroxidase com os determinantes antigênicos restantes. Os anticorpos ligados a enzima não ligados são removidos por lavagem e a atividade da enzima sobre a fase sólida é determinada por processos bem conhecidos na técnica. A reação enzimaticamente catalisada de peróxido de hidrogênio e cromogênio é interrompida acrescentando-se ácido sulfúrico diluído. A intensidade de cor é proporcional á concentração de HBsAg da amostra e é obtido por comparação fotométrica da intensidade de cor das amostras desconhecidas com as intensidades de cor dos soros de controle positivo e negativo apensos.
R. Hormônio do Crescimento Humano
[001128] A presente invenção abrange ainda um processo para a remodelagem do hormônio do crescimento humano (HGH). A isoforma de HGH que é secretada na pituitária humana, consiste em 191 aminoácidos e tem um peso molecular de aproximadamente 21.500. A isoforma de HGH que é produzida na placenta é uma forma glicosilada. HGH participa em muito da regulação do crescimento e desenvolvimento normais humanos, inclusive do crescimento linear (somatogênese), lactação, ativação de macrófagos, e efeitos semelhantes a insulina e diabetogênico, dentre outros.
[001129] HGH é um hormônio complexo e os seus efeitos são variados como resultado de interações com diversos receptores celulares. Embora composições compreendendo HGH tenham sido usadas em circunstâncias clínicas, especialmente para o trt do nanismo, a eficácia é limitada pela estrutura de glicosilação de HGH produzido recombinantemente.
[001130] As seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de HGH são apresentadas em outro ponto do presente documento como ID DE SEQ NO: 47 e ID DE SEQ NO: 48 (figuras 70A e 70B, respectivamente). O versado na técnica perceberá que variantes, derivados e mutantes de HGH são bem conhecidos. Exemplos podem ser encontrados na Patente U.S. número 6.143.523, em que são substituídos resíduos de aminoácidos nas posições 10, 14, 18, 21, 167, 171, 174, 176 e 179, e na Patente U.S. número 5.962.411 descreve variantes por junção de HGH. A presente invenção abrange estas variantes de HGHg conhecidas na técnica ou a serem descobertas.
[001131] Os processos para a expressão de HGH em células recombinantes são descritos, por exemplo, na Patente U.S. 5.795.745. Os processos para a expressão de HGH em inter alia, em procariontes, eucariontes, em sistemas de células de insetos, em plantas e em sistemas de tradução in vitro são bem conhecidos na técnica.
[001132] Uma molécula de HGH produzida empregando-se os processos da presente invenção podem ter a sua atividade testada empregando-se uma variedade de processos conhecidos dos versados na técnica. A Patente U.S. 5.734.024, por exemplo, descreve um processo para se determinar a funcionalidade biológica de um HGH expresso.
S. Anticorpos
[001133] A presente invenção compreende ainda um método para a remodelagem de diversos preparados de anticorpos quiméricos, incluindo TNFR quimérico, anti- glicoproteína IIb/IIIa quiméricas; anti-HER2 quimérico, anti-RSV quimérico, anti-CD20 quimérico, e anti-TNF quimérico. Os preparados de anticorpos quiméricos compreendeM uma porção Fc humana proveniente de um anticorpo IgG e regiões variáveis de um anticorpo monoclonal específico para um antígeno. Outros preparados compreendem um receptor, o receptor de TNF de 75 kDa, fundido a uma porção Fc de IgG humano. Estas moléculas incluem ainda fragmentos Fab compreendendo cadeias leves e pesadas provenientes de seres humanos e de camundongos. Um TNFR quimérico é útil no tratamento de doenças inflamatórias, tais como artrite reumatóide. A anti- glicoproteína IIb/IIIa quimérica é útil no tratamento de anomalias cardíacas, coagulação sangüínea e perturbações da função das plaquetas. Um anti-HER2 quimérico é útil com um tratamento para o câncer da mama, o anti-RSV quimérico é útil para o tratamento do vírus sincicial respiratório, o anti-CD20 quimérico é útil para o tratamento de linfoma não de Hodgkin e o anti-TNF quimérico é usado para o tratamento da doença de Crohn.
[001134] Embora estes anticorpos quiméricos tenham provado serem úteis no gerenciamento de diversas doenças, a administração tem que ser bastante freqüente e a doses bastante altas devido a uma meia vida relativamente curta de uma proteína recombinante produzida em células de roedores. Embora uma maioria de anticorpos quiméricos seja humana, e, portanto, consideradas como “próprias” pelo sistema imune, elas são degradadas e destruídas devido aos padrões de glicosilação não nativos. A presente invenção propõe a solução para este problema, aumentando em muito a eficácia destes medicamentos novos. Anticorpos e Processos da sua Geração
[001135] O termo “anticorpo”, conforme empregado aqui, se refere a uma molécula de imunoglobulina que é capaz de se ligar especificamente a um epítopo específico sobre um antígeno. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunoreativas de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos são tipicamente tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. Os anticorpos na presente invenção podem existir em uma variedade de formas que incluem, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, assim como anticorpos de cadeia simples e anticorpos humanizados (Harlow e outros, 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow e outros, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova York; Houston e outros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird e outros, 1988, Science 242: 423-426).
[001136] O termo “anticorpo sintético”, conforme empregado no presente documento, significa um anticorpo que é gerado empregando-se a tecnologia de DNA recombinante, tal como um anticorpo expresso por um bacteriófago conforme descrito no presente. O termo deve também ser interpretado como significando um anticorpo que tenha sido gerado pela síntese de uma molécula de DNA que codifica o anticorpo e expressando a molécula de DNA um peptídeo de anticorpo, ou uma seqüência de aminoácidos que especifica o anticorpo, tendo sido o DNA ou a seqüência de aminoácidos obtida empregando-se tecnologia sintética de DNA ou de seqüência de aminoácidos que é disponível e bem conhecida na técnica.
[001137] Os anticorpos monoclonais dirigidos contra peptídeos de comprimento total ou fragmentos de peptídeo podem ser preparados empregando-se procedimentos de preparação conhecidos de anticorpos monoclonais conhecidos, tais como os descritos, por exemplo, em Harlow e outros (1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) e em Tuszynski e outros (1988, Blood, 72: 109 115). Podem-se também sintetizar quantidades do peptídeo desejado empregando-se tecnologia de síntese química. Alternativamente o DNA que codifica o peptídeo desejado pode ser clonado e expresso a partir de uma seqüência promotora adequada em células adequadas para a geração de grandes quantidades de peptídeo. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o peptídeo são gerados as partir de camundongos imunizados com o peptídeo empregando-se procedimentos padrão conforme referenciado no presente.
[001138] O ácido nucléico que codifica o anticorpo monoclonal obtido empregando-se os procedimentos descritos no presente podem ser clonados e seqüenciados empregando-se tecnologia que é disponível na técnica e é descrita, por exemplo, em Wright e outros (1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4): 125-168) e as referências citadas nele. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ser “humanizado”, empregando-se a tecnologia descrita em Wright e outros, (supra) e nas referências citadas nele, e em Gu e outros, (1997, Thrombosis and Hemotocyst 77(4): 755-759).
[001139] Para se gerar uma coletânea de anticorpos de fago, obtém-se primeiro uma coletânea de cDNA a partir de mRNA que é isolado de células, tais como de hibridoma, que expressam o peptídeo que se deseja expressar na superfície do fago, tal como do anticorpo desejado. São produzidas cópias de cDNA do mRNA empregando-se transcriptase reversa. Os cDNA que especificam os fragmentos de imunoglobulina específicos são obtidos por PCR e o DNA resultante é clonado em um vetor adequado de bacteriófago para se gerar uma coletânea de DNA de bacteriófagos compreendendo genes de imunoglobulina que especificam o DNA. Os procedimentos para se produzir uma coletânea de bacteriófagos compreendendo DNA heterólogo são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sambrook e Russell (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
[001140] Os bacteriófagos que codificam o anticorpo desejado, podem ser construídos de modo tal que o peptídeo seja disposto na sua superfície de um modo tal que ele seja disponível para ligação ao seu peptídeo de ligação correspondente, tal como a um antígeno contra o qual o anticorpo é dirigido. Assim, quando o bacteriófago que expressa um anticorpo específico é incubado na presença de uma célula que expressa o antígeno correspondente, o bacteriófago se ligará à célula. O bacteriófago que não expressa o anticorpo não se ligará à célula. Tais técnicas de "panning" são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em Wright e outros (supra.
[001141] Os processos tais como os descritos acima, foram desenvolvidos para a produção de anticorpos humanos empregando-se a disposição sobe bacteriófagos M13 (Burton e outros, 1994, Adv. Immunol. 57: 191-280). Essencialmente, uma coletânea de cDNA é gerada a partir de mRNA obtido de uma população de células produtoras de anticorpos. O mRNA codifica genes de imunoglobulina rearranjados e assim, o cDNA codifica os mesmos. O cDNA amplificado é clonado para dentro de vetores de expressão M13 criando-se uma coletânea de fago que expressa fragmentos de anticorpos humanos na sua superfície. Os fagos que apresentam o anticorpo de interesse são selecionados por ligação a antígeno e são propagados em bactérias para produzir a imunoglobulina humana solúvel. Assim, ao contrário do que ocorre com a síntese convencional de anticorpos monoclonais, este procedimento imortaliza DNA que codifica a imunoglobulina humana e não as células que expressam a imunoglobulina humana. Remodelagem de Glicanos das Moléculas de Anticorpo
[001142] A glicosilação específica de uma classe de peptídeos, mais exatamente de imunoglobulinas, tem um efeito especialmente importante sobre a atividade biológica destes peptídeos. A invenção não deve ser interpretada como sendo limitada somente a imunoglobulinas da classe de IgG, mas deve também ser interpretada como incluindo imunoglobulinas das classes de IgA, IgE e IgM de anticorpos.
[001143] Além disso, a invenção não deve ser interpretada como sendo limitada unicamente a qualquer tipo de estrutura tradicional de anticorpo. Pelo contrário, a invenção deve ser considerada como incluindo todos os tipos de moléculas de anticorpo, incluindo, por exemplo, fragmentos de anticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados etc.
[001144] Uma molécula de imunoglobulina típica compreende uma porção efetora e uma porção de ligação a antígeno. Para uma resenha de imunoglobulinas, vide Harlow e outros, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova York, e Harlow e outros, 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. A porção efetora da molécula de imunoglobulina reside na porção Fc da molécula e é responsável em parte pela ligação eficiente da imunoglobulina ao seu receptor celular cognato. Uma glicosilação inadequada de moléculas de imunoglobulina especialmente no domínio CH2 da porção Fc da molécula, afeta a atividade biológica da imunoglobulina.
[001145] Mais especificamente no tocante à imunoglobulina IgG, a função efetora de IgG é governada em grande parte pelo fato do IgG conter ou não um resíduo de N-ascetilglicosamina (GlcNAc) ligado na posição 4-O da manose ramificada do núcleo de trimanosila do N-glicano em Asparagina (Asn) 297 no domínio CH2 da molécula de IgG. Este resíduo é conhecido como “GlcNAc bissecante”. A finalidade de se acrescentar GlcNac às cadeias de N-glicano de uma molécula IgG natural ou recombinante ou uma construção quimérica contendo Fc de IgG é a de otimizar a função efetora imune de Fc da porção Fc da molécula. Tais funções efetoras podem incluir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e quaisquer outros efeitos biológicos que exigem a ligação eficiente a receptores FcyR e a ligação ao componente C1 do complemento. A importância de GlcNAc bissecante para se obter o máximo de função efetora imune das moléculas de IgG já foi descrita (Lifely e outros, 1995, Glycobiology 5 (8): 813-822; Jeffris e outros, 1990, Biochem. J. 268 (3): 529-537).
[001146] Os glicanos encontrados no sítio de N- glicosilação em Asn 297 no domínio CH2 de moléculas de IgG foram caracterizados estruturalmente para moléculas de IgG encontradas em circulação em plasma sangüíneo humano e de animais, IgG produzido por células de mieloma, células de hibridoma e em uma variedade de linhagens de células imortalizadas de mamíferos e de insetos. Em todos os casos, o N-glicano ou é uma cadeia de alto teor de manose ou uma cadeia biantenária completa (Man3, GlcNAc 4, Ga2, NeuAc2, Fuc1) ou variavelmente incompleta com GlcNAc bissecante ou sem ele (Raju e outros, 2000, Glycobiology 10(5): 477-486; Jeffris e outros, 1998, Immunological. Rev. 163L59-76; Lerouge e outros, 1998, Plant Mol. Biol. 38: 31-48; James et a., 1995, Biotechnology 13: 592-596).
[001147] A presente invenção propõe uma molécula de imunoglobulina glicosilada sob medida in vitro. A molécula de imunoglobulina pode ser qualquer molécula de imunoglobulina, incluindo, sem limitação, um anticorpo monoclonal, um anticorpo sintético, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e semelhantes. Processos específicos de geração de moléculas de anticorpos e a sua caracterização são descritos em um outro ponto do presente documento. É preferível que a imunoglobulina seja IgG, sendo mais preferível que IgG seja uma IgG humana ou humanizada, sendo a mais preferível IgG1.
[001148] A presente invenção contempla especificamente o emprego de β 1,4-manosil-glicopeptídeo β 1,4-N- acetilglicosaminil-transferase, GnTIII:EC2.4.1.144 como um reagente in vitro para ligar glicosidicamente N- acetilglicosamina (GlcNAc) sobre a posição 4-O da manose ramificada do núcleo de trimanosila do N-glicano na Asn 297 no domínio CH2 de uma molécula de IgG. No entanto, será deduzido da descrição proposta que a invenção não deve ser considerada como incluindo unicamente o emprego desta enzima para fornecer uma GlcNAc bissecante a uma molécula de imunoglobulina. Pelo contrário, foi descoberto que é possível se modular o padrão de glicosilação de uma molécula de anticorpo de modo tal que a molécula de anticorpo tenha uma atividade biológica aumentada, isto é, a função efetora, além de uma intensificação potencial de outras propriedades, tais como estabilidade, e semelhantes.
[001149] É fornecido pela presente invenção um processo geral para a remoção de moléculas de fucose de glicano ligado por N de Asn(297) com o fim de melhorar a ligação a Fc-gamaRIIIA e de uma maior citotoxicidade celular dependente de anticorpo (veja, Shields e outros, 2002, J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). O processo acarreta fazer-se a molécula de anticorpo entrar em contato com uma fucosidase adequada para a ligação da(s) molécula(s) de fucose sobre o(s) glicano(s) do anticorpo. Alternativamente, o anticorpo recombinante pode ser expresso em células que realmente expressam fucosiltransferases tais como a variante Lec13 de células CHO. A remoção de fucose do(s) glicano(s) do anticorpo pode ser efetuada isoladamente, ou em conjunto com outros processos para remodelar os glicanos, tal como por adição de um GlcNAc bissecante. A expressão de anticorpos em células que carecem de GnT-I pode também resultar em glicanos de Fc que carecem de fucose do núcleo, o que pode ser ainda modificado pela presente invenção.
[001150] É fornecido na presente invenção um processo geral para a introdução de um GlcNAc bissecante com a finalidade de se intensificar a função efetora imune de Fc em qualquer preparado de moléculas de IgG contendo oligossacarídeos ligados a N no domínio CH2, tipicamente em Asn 297. O processo exige que a população de moléculas de IgG seja colocada em um estado de glicosilação tal, que a cadeia de glicano se torne um aceitador para GnT-III. Isto se consegue de qualquer um de três modos: 1) por seleção ou manipulação genética de um sistema de expressão de hospedeiro que segrega IgG com cadeias de N-glicano que são substratos para GnT-III; 2) por tratamento de uma população de glicoformas de IgG com exoglicosidases, de modo tal, que a(s) estrutura(s) de glicano que permanecer(em) depois do tratamento com exoglicosidase sejam) um aceitador para GnT- III; 3) por alguma combinação de seleção de hospedeiro e tratamento com exoglicosidase, tal como em 1) e 2) acima acrescida de adições sucessivas de GlcNAc por GnT-I e GnT- II para criar um aceitador para GnT-III.
[001151] A IgG obtida do plasma de galinha, por exemplo, contém principalmente cadeias de alto teor de mano e exigiria uma digestão com uma ou mais α-manosidases para criar um substrato para a adição de GlcNAc à ramificação α1,3 manose do núcleo de trimanosila por GnT-I. Este substrato poderia ser o núcleo de trimanosila elementar, Man3GlcNAc2. O tratamento desta estrutura de núcleo em seqüência com GnT-I seguido de GnT-II seguido de GnT-III empregando-se UDP-GlcNAc como um doador de açúcar criaria Man3GlcNAc5 conforme mostrado na figura 2. Opcionalmente, esta estrutura pode então ser estendida por tratamento com β 1,4 galactosiltransferase. Se for necessário, o oligossacarídeo galactosilado pode ainda ser estendido empregando-se α 2,3- ou α 2,6-sialiltransferase, para se obter uma estrutura completada biantenária. Empregando este processo, as cadeias de glicanos biantenárias podem ser remodeladas conforme necessário para a função ótima do efetor imune de Fc de qualquer IgG terapêutico em desenvolvimento (figura 4).
[001152] Alternativamente, as moléculas de IgG encontradas no plasma da maior parte de animais ou de IgG que é segregado como um produto recombinante pela maioria das células de animais ou por animais transgênicos inclui tipicamente um espectro de glicoformas biantenárias incluindo formas completas (NeuAc2, Gal2, GlcNAc4, Man3, ±Fuc1) (figura 4) e variavelmente incompletas com GlcNAc bissecante ou sem ele (Raju e outros, 2000, Glycobiology 10(5): 477-486; Jeffris e outros, 1998, Immunological Rev. 163: 59-76). Para se assegurar que GlcNAc bissecante se encontra presente na população integral de moléculas de imunoglobulina deste modo produzidas, a mistura de moléculas pode ser tratada com as seguintes exoglicosidases, sucessivamente ou em uma mistura: neuraminidase, β-galactosidase, β-glicosaminidase, α- fucosidase. O núcleo de trimanosila resultante pode então ser remodelado usando-se glicosiltransferases conforme observado acima.
[001153] Além disso, já foi caracterizada a IgG segregada por animais transgênicos ou armazenada como “corpos de plantas” por plantas transgênicas. Uma molécula de IgG produzida me uma planta transgênica tendo N-glicanos que contêm xilose ligada a β1,2 e/ou fucose ligada a α1,3 pode ser tratada com exoglicosidases para remover esses resíduos, além das exoglicosidase descritas acima a fim de criar o núcleo de trimanosila ou uma estrutura Man3 GlcNAc 4, e são então tratadas como glicosiltransferases para remodelar o N-glicano conforme descrito acima.
[001154] O principal aspecto novo da presente invenção consiste na aplicação de glicosiltransferases adequadas com tratamento prévio com exoglicosidases ou sem ele, aplicado na seqüência correta para otimizar a função de efetor do anticorpo. Em uma modalidade exemplar, um GlcNAc bissecante é introduzido nos glicanos de moléculas de IgG ou de outras construções quiméricas de Fc de IgG em que GlcNAc bissecante é exigido. Em uma outra modalidade exemplar, a fucose do núcleo é removida dos glicanos das moléculas de IgG ou de outras construções quiméricas de Fc de IgG. Proteína de fusão de receptor de TNF-Fc de IgG
[001155] As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos do receptor de TNF humano de 75 kDa são apresentadas no presente documento como ID DE SEQ NO: 31 e ID DE SEQ NO: 32, respectivamente (figuras 71A e 71B, respectivamente). As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis leve e pesada do anti-HER2 quimérico são apresentadas com ID DE SEQ NO: 35 e ID DE SEQ NO: 36, respectivamente (figuras 72A e 72B, respectivamente). As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis leve e pesada de anti-RSV quimérica são apresentadas como ID DE SEQ NO: 38 e ID DE SEQ NO: 37, respectivamente (figuras 73A e 73B, respectivamente). As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis não humanas de anti-TNF são apresentadas no presente como ID DE SEQ NO: 41 e ID DE SEQ NO: 42 respectivamente (figuras 74A e 74B, respectivamente). As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos da porção Fc de IgG humana são apresentadas como ID DE SEQ NO: 49 e ID DE SEQ NO: 50 (figuras 75A e 75B, respectivamente). MAb Anti-Glicoproteína IIb/IIIa
[001156] As seqüências de aminoácidos de regiões variáveis do anticorpo murino anti-glicoproteína IIb/IIIa são apresentadas em ID DE SEQ NO: 52 (cadeia leve variável madura murina, figura 76) e ID DE SEQ NO: 54 (cadeia pesada variável madura murina, figura 77). Estas seqüências murinas podem ser combinadas com seqüências de aminoácidos de IgG humana ID DE SEQ NO: 51 (cadeia leve variável madura humana, figura 78), ID DE SEQ NO: 53 (cadeia pesada variável madura humana, figura 79), ID DE SEQ NO: 55 (cadeia leve humana, figura 80) e ID DE SEQ NO: 56 (cadeia pesada humana, figura 81) de acordo com os procedimentos encontrados na Patente U.S. número 5.777.085 para criar um anticorpo anti-glicoproteína IIb/IIIa murino humanizado quimérico. Outros anticorpos humanizados anti-glicoproteína IIb/IIIa são encontrados na Patente U.S. número 5.877.006. Uma linhagem de células que expressam o Mab 7E3 anti- glicoproteína IIb/IIIa pode ser obtido comercialmente de ATCC (Manassas, VA) como No. de acesso HB-8832. MAb anti-CD20
[001157] As seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de um anticorpo quimérico anti-CD20 são apresentadas como ID DE SEQ NO: 59 (seqüência de ácidos nucléicos de cadeia leve de região variável murina, figura 82A), ID DE SEQ NO: 60 (seqüência de aminoácidos de cadeia leve de região variável murina, figura 82B), ID DE SEQ NO: 61 (seqüência de ácidos nucléicos de cadeia pesada de região variável murina, figura 83A), e ID DE SEQ NO: 62 (seqüência de aminoácidos de cadeia pesada de região variável murina, figura 83B). A fim de se humanizar um anticorpo murino, TCAE 8 (ID DE SEQ NO: 57, figura 84-A- 84E) que contém os domínios constantes leve e pesado de IgG humana podem ser usados convenientemente. Clonando-se a região variável murina acima que codifica DNA para dentro do vetor TCAE u de acordo com as instruções dadas na Patente U.S. 5.736.137, é criado um vetor (ID DE SEQ NO: 58, figura 85A-85E) que, quando transformado em uma linhagem de células de mamíferos expressa um anticorpo quimérico anti-CD20. Outros anticorpos humanizados anti- CD20 são encontrados na Patente U.S. número 6.120.767. Uma linhagem de células que expressa o MAb C273 anti-CD20 pode ser obtida de ATCC (Manassas, VA) como o No. de Acesso HB- 9303.
[001158] Os versados na técnica prontamente observarão que as seqüências apresentadas no presente documento não são exaustivas, mas somente exemplos de regiões variáveis, receptores e outras porções de ligação de anticorpos quiméricos. Além disso, os processos para a construção de anticorpos quiméricos ou “humanizados” são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente U.S. 6.329.511 e na Patente U.S. 6.210.671, por exemplo. Em conjunto com a presente descrição e processos conhecidos na técnica, os versados na técnica reconhecerão que a presente invenção não é limitada às seqüências descritas no presente.
[001159] A expressão de um anticorpo quimérico é em conhecida na técnica e é descrita detalhadamente na Patente U.S. 6.329.511, por exemplo. Os sistemas de expressão podem ser procarióticos, eucarióticos e semelhantes. Além disso a expressão de anticorpos quiméricos em células de insetos empregando-se um sistema de expressão de baculovírus é descrita em Putlitz e outros (1990, Bio/Technology 8: 651-4). Além disso, os processos de expressão de um ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão ou quimérica são bem conhecidos na técnica e são descritos em Sambrook et a. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York) e Ausubel e outros (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nova York), por exemplo.
[001160] A determinação da função e da atividade biológica de um anticorpo quimérico produzido de acordo com os processos da presente invenção é uma operação também básica para os versados na técnica. Os processos para se determinar a afinidade de um anticorpo por testes de competição são descritos detalhadamente em Berzofsky (J.A. Berzofsky e I.J. Berkower, 1984, in Fundamental Immunology (ed. W. E. Paul), Raven Press (Nova York), 595). Resumindo, a afinidade do anticorpo quimérico é comparada com a de um anticorpo monoclonal do qual ele deriva empregando-se um anticorpo monoclonal rádio-iodado. VII. Composições Farmacêuticas
[001161] Em um outro aspecto, a invenção propõe uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica inclui um diluente aceitável do ponto de vista farmacêutico e um conjugado covalente entre um polímero hidrossolúvel que não ocorre na natureza, porção terapêutica ou biomolécula e um peptídeo glicosilado ou não glicosilado. O polímero, porção terapêutica ou biomolécula é conjugado ao peptídeo por meio de um grupo de ligação glicosila intacto entreposto entre o peptídeo e o polímero, porção terapêutica ou biomolécula e ligado por covalência aos dois.
[001162] As composições farmacêuticas da invenção são adequadas para serem usadas em uma variedade de sistemas de fornecimento de medicamento. Os preparados adequados para serem usados na presente invenção se encontram em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadélfia, PA, 17a. ed. (1985). Para uma resenha breve de processos para o fornecimento de medicamento, vide Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).
[001163] As composições farmacêuticas podem ser preparadas para qualquer modo adequado de administração, incluindo a administração tópica, oral, nasal, intravenosa, intracranial, intraperitonial, subcutânea ou intramuscular, por exemplo. Para a administração parenteral, tal como por injeção subcutânea, o veículo compreende de preferência, água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para a administração oral, qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose carbonato de magnésio pode ser empregado. Micro-esferas biodegradáveis (tal como de polilactato poliglicolato) podem também ser empregadas como veículos para as composições farmacêuticas da presente invenção. As micro-esferas biodegradáveis adequadas são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 4.897.268 e 5.075.109.
[001164] Habitualmente, as composições farmacêuticas são administradas por via parenteral, por via intravenosa, por exemplo, assim, a invenção propõe composições para a administração parenteral que compreendem o composto dissolvido ou suspenso em um veículo aceitável, de preferência um veículo aquoso, tal como água, água tamponada, solução salina, PBS e semelhantes. As composições podem conter substanciais auxiliares aceitáveis do ponto de vista farmacêutico conforme exigido para se aproximar a condições fisiológicas, tais como agentes de ajuste de pH e de tampão, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes, detergentes e semelhantes.
[001165] Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais ou podem se esterilizadas por filtração. As soluções aquosas resultantes podem ser acondicionadas para uso conforme estão, ou liofilizadas, sendo o preparado liofilizado combinado com um veículo aquoso estéril antes da administração. O pH dos preparados se encontrará tipicamente entre 3 e 11, sendo mais preferível entre 5 e 9, e o mais preferível de 7 a 8.
[001166] Em algumas modalidades, os peptídeos da invenção podem ser incorporados a lipossomas formados de lipídios padrão formadores de vesículas. Uma variedade de processos encontra-se disponível para a preparação de lipossomas, conforme descrito em Szoka e outros, Ann Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980); Patentes U.S. 4.235.871, 4.501.728 e 4.837.0128, por exemplo. O direcionamento de lipossomas empregando-se uma variedade de agentes de direcionamento (tais como sialil galactosídeos da invenção) é bem conhecido na técnica (veja, por exemplo, Patente U.S. 4.957.773 e 4.603.044).
[001167] Processos padrão para o acoplamento de agentes de direcionamento a lipossomas podem ser usados. Estes processos geralmente abrangem a incorporação a lipossomas de componentes lipídios, tais como fosfatidiletanolamina, que podem ser ativados para fixação dos agentes de direcionamento ou compostos lipófilos derivados tais como peptídeos derivados de lipídios da invenção.
[001168] Os mecanismos de direcionamento geralmente exigem que os agentes de direcionamento estejam posicionados na superfície do lipossoma de um modo tal, que as porções alvo estejam disponíveis para a interação com o alvo, um receptor de superfície celular, por exemplo. Os carboidratos da invenção podem ser ligados a uma molécula de lipídios antes do lipossoma se formar empregando-se processos conhecidos dos versados na técnica (alquilação ou acilação do grupamento hidroxila, por exemplo, presente no carboidrato com um haleto de alquila de cadeia longa ou com um ácido graxo, respectivamente). Alternativamente, o lipossoma pode ser projetado de tal modo que uma porção conectora é primeiro incorporada à membrana no momento da formação da membrana. A porção conectora deve ter uma porção lipófila, que é firmemente engastada e ancorada na membrana. Ela deve também ter uma porção reativa, que seja disponível quimicamente na superfície aquosa do lipossoma. A porção reativa é selecionada de modo tal, que ela será adequada quimicamente para formar uma ligação química estável com o agente de direcionamento ou carboidrato, que é acrescentado mais tarde. Em alguns casos é possível se ligar diretamente o agente de direcionamento à molécula conectora, mas na maioria dos casos é mais adequado se empregar uma terceira molécula para agir como uma ponte química, ligando deste modo a molécula conectora que se encontra dentro da membrana com o agente de direcionamento ou carboidrato que é estendido, nas três dimensões para fora da superfície da vesícula. As faixas de dosagem para a administração dos peptídeos da invenção são aquelas grandes suficientemente para produzir o efeito desejado em que os sintomas da resposta imune apresentam algum grau de supressão. A dosagem não deve ser tão grande que produza efeitos colaterais adversos. Geralmente a dosagem variará com a idade, condição, sexo e extensão da doença no animal e pode ser determinada pelos versado na técnica. A dosagem pode ser justada pelo clínico individual no caso de qualquer contra-indicação.
[001169] Podem ser empregados processos farmacêuticos adicionais para controlar a duração da ação. Os preparados de liberação controlada podem ser preparados usando-se polímeros para conjugar, complexar ou adsorver o peptídeo. O fornecimento controlado pode ser exercido pela seleção de macromoléculas adequadas (de poliésteres, poliamino- carbóxi-metil celulose e sulfato de protamina, por exemplo), e da concentração de macromoléculas assim como dos processos de incorporação a fim de controlar a liberação. Um outro processo possível para se controlar a duração de ação por preparados de liberação controlada consiste na incorporação do peptídeo a partículas de um material polimérico tal como poliésteres, poliamino ácidos, hidrogéis, poli(ácido lático) ou copolímeros de etileno e acetato e vinila.
[001170] A fim de se proteger os peptídeos contra a ligação com as proteínas do plasma, é preferível que os peptídeos estejam aprisionados em microcápsulas preparadas, por técnicas de co-acervação por polimerização interfacial, tais como, por exemplo, microcápsulas de hidróxi- metilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metil-metacrilato), respectivamente, ou em sistemas de fornecimento coloidal de medicamento, tais como lipossomas, micro-esferas de albumina, micro-emulsões, nano partículas, e nanocápsulas, por exemplo ou em macro- emulsões. Tais instruções são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (16a. Ed., A. Oslo, ed. Mack, Easton, Pa, 1980).
[001171] Os peptídeos da presente invenção são bem adequados para serem usados em sistemas de fornecimento de medicamento direcionáveis tais como em polímeros sintéticos ou naturais na forma de complexos macromoleculares, nanocápsulas, micro-esferas, ou contas, e em sistemas à base de lipídios incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas, lipossomas e eritrócitos re- lacrados. Estes sistemas são conhecidos coletivamente como sistemas coloidais de fornecimento de medicamento. Tipicamente, tais partículas coloidais contendo os peptídeos dispersos têm aproximadamente 50 nm - 2 μm de diâmetro. As dimensões das partículas coloidais permitem que elas sejam administradas por via intravenosa, por injeção, por exemplo, ou em forma de um aerossol. Os materiais usados na preparação de sistemas coloidais são tipicamente esterilizáveis por esterilização por filtração, não tóxicos e biodegradáveis, tais como albumina, etil celulose, caseína, gelatina, lecitina, fosfolipídios e óleo de soja. Os sistemas coloidais poliméricos são preparados por um processo semelhante ao de co-acervação de micro- encapsulação.
[001172] Em uma modalidade exemplar, os peptídeos são componentes de um lipossoma, usados como um sistema de fornecimento direcionado. Quando os fosfolipídios são suavemente dispersos em meio aquoso, eles intumescem, se hidratam e formam espontaneamente vesículas de duas camadas concêntricas multilamelares com camadas de meio aquoso separando as camadas de lipídios. Tias sistemas são geralmente denominados de lipossomas multilamelares ou vesículas multilamilares (MLVs) e têm diâmetros que variam de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 4 μm. quando os MLVs são submetidos a ultra-som, formam-se pequenas vesículas unilamelares (SUVS) com diametros que variam de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, que contêm uma solução aquosa no núcleo da SUV.
[001173] Exemplos de lipídios úteis na produção de lipossomas incluem compostos de fosfatidila, tais como, fosfatidilglicerol, foafatidilcolina, foasfatidilserina e fosfatidiletanolamina. Especialmente úteis são os diacilfosfatidilgliceróis, em que a porção lipídio contém de 14-18 átomos de carbono, especialmente de 16-18 átomos de carbono, e são saturados. Os fosfolipídios ilustrativos incluem fosfatidilcolina do ovo, dipalmitoilfosfatidil colina e diestearoilfosfatidil colina.
[001174] Na preparação de lipossomas contendo os peptídeos da invenção, devem ser consideradas tais variáveis como a eficiência do encapsulamento dos peptídeos, estabilidade do peptídeo, homogeneidade e dimensões da população resultante de lipossomas, relação peptídeo a lipídio, instabilidade de permeabilidade do preparado e aceitabilidade farmacêutica do preparado. Szoka e outros, Annual Review of Biophysics and Bioengineering, 9i: 467 (1980; Deamer e outros, em LIPOSOMES, Marcel Dekker, Nova York, 1983, 27; Hope e outros, Chem. Phys. Lipids, 40: 89 (1986)).
[001175] O sistema de fornecimento direcionado contendo os peptídeos da presente invenção pode ser administrado de uma variedade de modos a um hospedeiro, especialmente um hospedeiro mamífero, tal como por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitonial, intravascular, topicamente, intracavital, transdérmica, intranasal e por inalação. A concentração dos peptídeos variará dependendo da aplicação específica, da natureza da doença, da freqüência da administração ou semelhantes. O peptídeo encapsulado no sistema de fornecimento direcionado pode ser fornecido em um preparado que compreende outros compostos que sejam adequados e um meio aquoso aceitável do ponto de vista fisiológico, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, por exemplo, ou semelhantes.
[001176] Os compostos preparados por processos da invenção podem também encontrar emprego como reagentes de diagnóstico. Os compostos rotulados, por exemplo, podem ser usados para localizar áreas de inflamação ou metástase tumoral em um paciente sob suspeita de ter uma inflamação. Para tal fim, os compostos podem ser rotulados com 125I, 14C ou trítio.
Exemplos Experimentais
[001177] A invenção será agora descrita fazendo-se referência aos Exemplos abaixo. Estes Exemplos são providos com a finalidade de ilustração somente e a invenção não deve ser absolutamente interpretada como sendo limitada a estes Exemplos, e deve ser interpretada como abrangendo toda e qualquer variação que se torne evidente como resultado das instruções dadas aqui. A. Glicosilação
[001178] Os materiais e métodos usados nos experimentos apresentados neste Exemplo serão agora descritos. 1 . Sialilação e Fucosilação de TP10
[001179] Este exemplo apresenta a preparação de TP10 com porções de sialil Lewis X e a análise da atividade biológica melhorada.
[001180] A interrupção do fluxo sangüíneo ao cérebro, mesmo durante um período breve de temo, pode desencadear eventos inflamatórios no interior da massa microvascular cerebral que pode exacerbar o dano ao tecido cerebral. O dano a tecido que se acumula é amplificado pela ativação tanto da cascata de inflamação como de coagulação. Em um modelo murino de derrame cerebral, uma expressão aumentada de P-selectina e de ICAM-1 promove o recrutamento de leucócitos. sCR1 é uma forma recombinante do domínio extracelular do Receptor-1 de Complemento (CR-1). sCR-1 é um inibidor potente de ativação de complemento. sCR1sLex (CD20) é uma forma alternadamente glicosilada de sCR1 que é alternadamente glicosilada para apresentar o antígeno LewisX sialilado. Anteriormente foi constatado que sCR- 1sLeX que era expresso e glicosilado in vivo em células Lec11 CHO construídas se localizava corretamente nos microvasos isquêmicos cerebrais e nos neurônios que expressavam C1q, inibindo deste modo o acúmulo de neutrófilos e de plaquetas e reduzindo os volumes do enfarte cerebral (Huang e outros, 1999, Science 285: 595 599) . No presente exemplo, sCR1sLeX que foi preparado in vitro por remodelagem de glicanos, apresentou uma atividade biológica aumentada, análoga à de sCRsLeX glicosilado in vivo.
[001181] O peptídeo TP10 foi expresso em células DUK B11 CHO. Esta linhagem de células CHO produz o peptídeo TP10 com a glicosilação típica de célula CHO, com muitos glicanos mas não todos, capeados com ácido siálico.
[001182] Sialilação de 66 mg de TP10. TP10 (2,5 mg/ml), CMPSA (5 mM) e ST3Gal1 (0,1U/ml) foram incubados a 32°C em 50 mM de Tris, 0,15 M de NaCl, 0,05% de azida sódica, ph 7,2 durante 48 horas. Acrescentou-se ácido siálico CMPS rádio-rotulado a uma alíquota pequena para monitorar a incorporação. TP10 foi separado do açúcar de nucleotídeo por SEC HPLC. As amostras analisadas depois de 24 horas e 48 horas demonstraram que a reação foi completada depois de 24 horas. A mistura de reação foi então congelada. Os produtos de reação foram submetidos a análise de Eletroforese de Carboidrato Assistida por Fluorforo (FACE®; Glyco, Inc. NOvato, CA)(Figura 86).
[001183] Estudos farmacocinéticos . Ratos foram comprados com uma cânula da veia jugular. 10 mg/kg de peptídeo TP10 pré-sialilação ou pós-sialilação foram administrados por injeção na veia da cauda a três ratos para cada tratamento (n = 3). Quatorze amostras de sangue foram tiradas de 0 a 50 horas. A concentração no sangue do peptídeo TP10 pós sialilação era superior à de TP10 pré- sialilação em todos os pontos de tempo depois da hora 0 (Figura 87). A adição de ácido siálico dobrou a área embaixo da curva de concentração plasmática-tempo (AUC) da curva farmacocinética em comparação com o material de partida (Figura 88).
[001184] Fucosilação do TP10 sialilado. 10 ml (25 mg de TP10) da mistura de sialilação acima foram descongelados a acrescentou-se GDP-fucose até 5 mM, MnCl2 até 5 mM, e FTVI (fucosiltransferase VI) até 0,05 U/ml. A reação foi incubada a 32°C durante 48 horas. Os produtos de reação foram submetidos a análise de Eletroforese de Carboidrato Assistida por Flúorforo (FACE®; Glyko, Inc, Novato CA)(Figura 89). A uma pequena alíquota, acrescentou-se GDP- fucose rádio-rotulada para monitorar a incorporação de TP10 foi separado do açúcar de nucleotídeo por SEC HPLC. As amostras foram analisadas após 24 horas e 48 horas demonstraram que a reação foi completada após 24 horas. Um ensaio in vitro medindo a ligação a E-selectina indica que a adição de fucose pode produzir um ligante biologicamente ativo de E-selectina (Figura 90). 2 . Sialilação de Glicoproteínas Recombinantes
[001185] Este exemplo expõe a preparação de formas sialiladas de diversos peptídeos recombinantes.
[001186] Sialilação de Glicoproteínas Recombinantes Empregando ST3Gal III. Diversas glicoproteínas foram examinadas para se verificar a sua capacidade de serem sialiladas por ST3Gal III recombinante de rato. Para cada uma destas glicoproteínas, a sialilação será uma etapa valiosa de processo no desenvolvimento de glicoproteínas respectivas como produtos comerciais.
[001187] Condições de Reação. As condições de reação eram conforme resumidas na Tabela 9. As reações de sialiltransferase foram conduzidas durante 24 horas a uma temperatura entre a ambiente e 37°C. A extensão de sialilação foi estabelecida determinando-se a quantidade de 14C-NeuAc incorporada aos oligossacarídeos ligados a glicoproteína. Vide tabela 9 quanto as condições de reação para cada proteína.
Figure img0079
1 ”Ci clo” se refere à geração de CMP NeuAc “in situ ” enzimaticamente usando-se condições padrão conforme descritas na especificação (20 mM de NeuAc e 2 mM de CMP) . O tampão foi HEPES a 0,1 M, pH 7,5.
[001188] Os resultados apresentados na tabela 10 demonstram que uma extensão notável de sialilação foi obtida em todos os casos, apesar de baixos níveis de enzima usados. Essencialmente, foi obtida uma sialilação completa, com base na estimativa da galactose terminal disponível A Tabela 10 mostra os resultados das reações de sialilação. A quantidade de enzima usada por mg de proteína (mU/mg) como uma base de comparação para os diversos estudos. Em diversos dos exemplos mostrados somente 7-13 mU de ST3Gal III por mg de proteína foram necessários para produzir uma sialilação essencialmente completa depois de 24 horas. Tabela 10. Resultados Analíticos
Figure img0080
1 Teor de Gal terminal (exposto) nos oligossacarídeos ligados a N determinado pelo fornecedor ou a partir de valores da literatura (fetuína, asialo-AAAT). rotulados por filtração de gel. 3 % Rxn se refere a % completa da reação com base no teor de Gal terminal como um máximo teórico. 4 Antitrombina III. 5 α1 Antitripsina
[001189] Estes resultados contrastam nitidamente com os relatados em estudos detalhados com ST6Gal I em que menos de 50 mU/mg de proteína resultaram em menos de 50% de sialilação e 1070 mU/mg de proteína resultaram em uma sialilação de aproximadamente 85-90% em 24 horas. Paulson e outros (1977) J. Biol.Chem. 252 2363-2371; Paulson e outros (1978) J. Biol. Chem. 253: 5617-5624. Um estudo de α2,3 e α2,6 sialil-transferases de rato por um outro grupo revelou que uma sialilação completa de asialo-AGP exigia concentrações de enzimas de 150-250 mU/mg de proteína (Weinstein e outros (1982) J. Biol. Chem. 257: 13845 13853). Estes estudos anteriores tomados em conjunto sugeriam que a sialil-transferase ST6Gal I exige uma quantidade acima de 50 mU/mg e até 150 mU/mg para atingir uma sialilação completa
[001190] Este Exemplo demonstra que a sialilação de glicoproteínas recombinantes empregando-se a sialil- transferase ST3 Gal III exigia uma quantidade muito menor de enzima do que era esperado. Para uma reação da escala de um quilograma, seriam necessárias aproximadamente 7.000 unidades de sialil-transferase ST3 Gal III em vez de 100.000-150.000 unidades que estudos anteriores indicavam. ?A purificação destas enzimas de fontes naturais é proibitiva com rendimentos de somente 1-10 unidades para uma preparação em grande escala depois de um trabalho de 1- 2 meses. Pressupondo-se que tanto a sialil-transferase ST6Gal I como a ST3Gal III são produzidas como sialil- transferases recombinantes, com níveis iguais de expressão das duas enzimas obtidos, seria necessária uma escala de fermentação 14-21 vezes maior (ou mais) para a sialil- transferase ST6Gal I em relação a sialil-transferase ST3Gal III. Para a sialil-transferase ST6Gal I foram relatados níveis de expressão de 0,3 U/l em levedura (Borsig e outros (1995) Biochm. Biophys. Res. Commun. 210: 14-20). Os níveis de expressão de 1000 U/litro da sialil-transferase ST3 Gal II foram obtidos em Aspergillus niger. A níveis atuais de expressão seria necessária uma fermentação de 300-450.000 litros de levedura para produzir uma quantidade suficiente de enzima para a sialilação de 1 kg de glicoproteína empregando-se a sialil-transferase ST6Gal I. Por outro lado, seriam necessários menos de 10 litros de fermentação de Aspergillus niger para a sialilação de 1 kg de glicoproteína empregando-se sialil-transferase ST3 Gal III. Assim, a capacidade de fermentação necessária para se produzir a sialil-transferase ST3 Gal III para uma reação de sialilação em grande escala seria de 10-100 vezes menor do que a necessária para se produzir ST6 Gal I; o custo de produção da sialil-transferase seria reduzido proporcionalmente. 3. Fucosilação para Criar Sialil Lewis X
[001191] Este exemplo apresenta a preparação de Ativador de Plasminogênio do Tipo De tecido (TPA) com antígeno sialil Lewis X ligado a N.
[001192] Sialilação. O TPA expresso em células de mamíferos freqüentemente conterão uma predominância de glicanos terminando em ácido siálico, mas para se assegurar uma sialilação completa seria benéfico se conduzir primeiro uma sialilação in vitro. O TPA em um tampão adequado (de preferência com um pH entre 5,5 e 9, solução salina tamponada com Tris, por exemplo, pH 7,2) é incubado com ácido siálico CMP e sialil-transferase durante um tempo suficiente para converter quaisquer glicanos desprovidos de ácido siálico em espécies sialiladas. As condições típicas seriam 1 mg/ml de TPA, 3 mM de ácido siálico CMP, 0,02 U/ml de ST3Gal3, 32°C durante 24 horas. O crescimento microbiano pode ser interrompido ou pela esterilização por filtração ou pela inclusão de azida sódica a 0,02%. A concentração de TPA se encontra de preferência na faixa de 0,1 mg/ml até o limite de solubilidade do peptídeo. A concentração de CMP- SA deve ser suficiente para haver excesso sobre os sítios disponíveis e poderia variar de 50 μM até 50 mM e a temperatura de 2 °C até 40 °C. O tempo necessário para a reação completa dependerá da temperatura, das quantidades relativas de enzima para substrato aceitador, da concentração do substrato doador, e do pH. Outras sialil- transferases que podem ser capazes de acrescentar o ácido siálico na ligação 2,3 incluem ST3Gal4; também podem ser usadas transferases microbianas.
[001193] Fucosilação. As condições típicas para a fucosilação seriam 1 mg/ml de TPA, 3mM de GDP-fucose, 0,02 U/ml de FTVI, 5 mM de MnCl2, 32°C durante 24 H em solução salina tamponada com Tris. O crescimento microbiano pode ser interrompido ou por esterilização por filtração ou pela inclusão de azida sódica a 0,02%. A concentração de TPA é muito preferida na faixa de 0,1 mg/ml até o limite de solubilidade do peptídeo. A concentração de GDP-fucose deve ser suficiente para que haja um excesso sobre os sítios disponíveis e pode variar de 60 μM até 50 μM, e a temperatura de 2°C até 40°C. O tempo necessário para a reação completa dependerá da temperatura, das proporções relativas da enzima para o substrato aceitador, da concentração do substrato doador e do pH. Outras fucosiltransferases que podem ser capazes de produzir sialil Lewis x incluem FTVII, FTV, FTIII, assim como transferases microbianas. 4. Aparamento da Estrutura de Núcleo de Alto Teor de Manose para Trimanose: Ativador de Plasminogênio do Tipo de Tecido Produzido em CHO
[001194] Este exemplo descreve a preparação do Ativador de Plasminogênio do tipo de tecido com um núcleo de trimanose por desbaste de um glicano de alto teor de manose.
[001195] O ativador de plasminogênio do tipo de tecido (TPA) é atualmente produzido em células Ovarianas de Hamster Chinês (CHO) e contém um baixo teor de oligossacarídeos ligado a N de alto teor de manose. As manoses podem ser desbastadas empregando-se uma variedade de manosidases específicas. A primeira etapa é se gerar Man5GlcNAc2(Fuc0-l) a partir de Man9GlcNAc2(Fuc0-1). Isto se faz empregando-se manosidase I. Em seguida ou GlcNAcT1 (GlcNAc transferase 1) é usada para produzir GlcNAc1ManSGlcNAc2(Fuc0-l) ou emprega-se Manosidase III para produzir Man3GlcNAc2(Fuc0-1). A partir de Man3GlcNAc2(Fuc0-l), pode ser produzido GlcNAc1Man3GlcNAc2(Fuc0-l) empregando-se GlcNAcT1 ou a partir de GlcNAclMan5GlcNAc2(Fuc0-l), pode se produzir GlcNAc1Man3GlcNAc2(Fuc0-1) empregando-se Manosidase II. GlcNAcIMan3GlcNAc2(Fuc0-l) é então convertido em GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc0-l) empregando-se GlcNAcTransferase TII (GlcNAcTII). Os dois resíduos terminais GlcNAc são então galactosilados empregando-se GalTI e em seguida sialilados com SA-PEG empregando-se ST3GalIII
[001196] Ao contrário, TPA pode ser produzido em sistemas de levedura ou fungais. Um processamento análogo seria necessário para material derivado de fungos. 5. Adição de GlcNAc a EPO
[001197] Este exemplo descreve a adição de um resíduo GlcNAc a um núcleo de tri-manosila
[001198] Adição de GlcNAc a EPO. EPO foi expressa em células SF-9 de insetos e purificada (Protein Sciences, Meriden, CT). Uma conversão de 100% a partir da glicoforma de tri-manosila de EPO no “núcleo de tri-manosila + 2 GlcNAc” (Peak 1, P1 na Figura 9) foi obtida em 24 horas de incubação a 32 °C com 100 mU/ml de GlcNAcT-I e 100 mU/ml de GlcNAcT-I nas seguintes concentrações finais de reação: 100 mM MES pH 6,5, ou l00 mM Tris pH 7,5 5 mM UDP-GlcNAc 20 mM MnCl2 100 mU/ml GlcNAcT-I 100 mU/ml GlcNAcT-II 1 mg/ml EPO (purificada, expressa em células SF9 adquiridas de Protein Sciences).
[001199] Análise de glicoformas. Este ensaio é uma ligeira modificação de K.R. Anumula e S.T. Dhume Glycobiology 8 (1998) 658-69. Os N-glicanos liberados por N-glicanase (PNGase) foram rotulados de modo redutor com ácido antranílico. Os N-glicanos aminados de modo redutor foram injetados em uma amino coluna Shodex Asahipak NH2P-50 4D (4,6 mm x 150 mm). Dois solventes foram usados para a separação: A) ácido acético a 5% (v/v), tetraidrofurano a 1%, e trietilamina a 3prc em água, e B) ácido acético a 2prc e tetraidrofurano a 1prc em acetonitrila. A coluna foi então eluída isocraticamente com 70 % de B durante 2,5 minutos, e em seguida por um gradiente linear durante um período de 97,5 minutos variando de 70 a 5 % de B e uma eluição isocrática final com 5 % de B durante 15 minutos. Os picos eluídos foram detectados empregando-se detecção por fluorescência com uma excitação de 230 nm e comprimentos de onde de emissão de 420 nm.
[001200] Nestas condições, o núcleo de trimanosila tinha um tempo de retenção de 22,3 minutos, e o produto da reação de GnT tinha um tempo de retenção de 26,3 minutos. O material de partida era exclusivamente núcleo de trimanosila com GlcNAc nuclear (Figura 91). 6. Remodelagem de N-glicanos de Alto Teor de Manose em N-Glicanos Híbridos e Complexos; RNase Pancreática Bovina
[001201] Este exemplo descreve a preparação de RNase pancreática bovina com N-glicanos complexos ou híbridos. Os glicanos ligados as N de alto teor de manose da RNase são enzimaticamente digeridos e elaborados ainda mais para criar glicanos ligados a N híbridos. Além disso, os glicanos ligados a N de alto teor de manose da RNase são enzimaticamente digeridos e elaborados para criar glicanos ligados a N complexos.
[001202] As estruturas de alto teor de manose de oligossacarídeos ligados a N em glicopeptídeos podem ser modificadas em formas complexas ou híbridas, com o emprego de uma combinação de α-manosidases e glicosiltransferases. Este exemplo resume os resultados de tais esforços empregando um simples N-Glicano como um substrato modelo.
[001203] A ribonuclease B (RNase B) purificada de pâncreas bovino (Sigma) é um glicopeptídeo consistindo em 124 resíduos de aminoácidos. Ela tem um único sítio de N- glicosilação potencial modificado com estruturas de alto teor de manose. Devido a sua simplicidade e peso molecular baixo (13,7 kDa a 15,5 kDa), a ribonuclease B é um bom candidato para demonstrar a viabilidade da remodelagem de N-Glicano de estruturas de alto teor de manose em oligossacarídeos ligados a N híbridos ou complexos. O espectro MALDI-TOF de RNase B e o perfil HPLC para os oligossacarídeos clivados de RNase B por N-glicanase (Figura 92) indicaram que, ao contrário de uma pequena porção de peptídeo não modificado, a maior parte dos sítios de N-glicosilação do peptídeo são modificados com oligossacarídeos de alto teor de manose consistindo em 5 a 9 resíduos de manose.
[001204] Conversão de N-Glicanos de Alto Teor de Manose em N-Glicanos Híbridos. N-Glicanos de alto teor de manose foram convertidos em N Glicanos híbridos empregando-se a combinação de α1,2-manosidase, GlcNAcT-I (β-1,2-N-acetil glicosaminil transferase), GalT-I (β1,4- galactosi-transferase) e α2,3-sialil-transferase/ou α2,6- sialil-transferase, conforme mostrado na Figura 93.
[001205] Como um exemplo, as estruturas de alto teor de manos em RNase B foram convertidas com sucesso em estruturas híbridas.
[001206] Man5GlcNac2-R foi obtido de Man5-9GlcNAc2-R catalisado por uma única α1,2-manosidase clonada de Trichoderma reesei (Figura 94). A RNaseB (1 g, aproximadamente 67 μmol) foi incubada a 30°C durante 45 horas com 15 mU da α1,2-manosidase recombinante de T.reesei em tampão MES (50 mM,, pH 6,5) em um volume total de 10 ml. As estruturas da proteína Man6-9GlcNAc2 foram convertidas com sucesso na proteína Man5GlcNAc2 com grande eficiência pela manosidase recombinante.
[001207] Alternativamente, Man5GlcNAc2-R foi obtido a partir de Man5-9GlcNAc2-R catalisado por uma única α 1,2- manosidase purificada a partir de Aspergillus saitoi (Figura 95). RNase B (40 μg, aproximadamente 2,7 nmol) foi incubada a 37 °C durante 42,5 h com 25 μU da α 1,2- manosidase de A. saitoi comercial (Glyko ou CalBioChem)em tampão NaOAC (100 mM, ph 5,0), em um volume total de 20 μl. As estruturas da proteína Man6-9GlcNAc2 foram convertidas com sucesso em proteína Man5GlcNAc2 pela manosidase disponível no comércio. No entanto, um novo pico correspondendo à proteína GlcNAc aparece no espectro, indicando a contaminação possível de endoglicosidase H na preparação. Embora diversas alfa-manosidases de mamíferos fossem necessárias para se conseguir esta etapa, a α 1,2- manosidase fúngica foi muito eficiente na remoção de todos os resíduos de manose ligada em α 1,2.
[001208] GlcNAc T-I em seguida adicionou um resíduo de GlcNAc ao Man5GlcNAc2-R (Figura 96). A mistura de reação depois da reação de α 1,2-manosidase de T.reesei contendo RNase B (600 μg, aproximadamente 40 nmol) foi incubada com GlcNAcT-I recombinante não purificado (34 mU) em tampão MES (50 mM, ph 6,5) contendo MnCl2 (20 mM) e UDP-GlcNAc (5 mM, em um volume total de 400 μl, a 37 °C durante 42 horas. Um resíduo de GlcNAc foi quantitativamente acrescentado à proteína Man5GlcNAc2 pelo GlcNAc T-I recombinante.
[001209] Um resíduo de Gal foi então acrescentado empregando-se GalT-1 (Figura 97). A mistura de reação depois da reação de GnT-I contendo RNase B (120 μg, aproximadamente 8 nmol) foi incubada a 37 °C durante 20 horas com 3,3 mU do GalT-1 recombinante em tampão Tris-HCl (100 mM, ph 7,3) contendo UDP-Gal (7,5 mM) e MnCl2 (20 mM0 em um volume total de 100 μl, Um resíduo de Gal foi acrescentado a aproximadamente 98prc de GlcNAc-proteína Man5GlcNAc2 pelo GalT-1 recombinante.
[001210] A etapa seguinte foi a adição de um ácido siálico empregando-se uma α2,3-sialiltransferase ou uma α 2,6-sialil transferase (Figura 98). Como um exemplo ST3 Gal III, uma α 2,3-sialil-transferase foi usada. A mistura de reação depois da reação de GalT-1 contendo RNase B (13 μg, aproximadamente 0,87 nmol) foi incubada a 37 °C durante 16 horas com 8,9 mU de ST3 Gal III em tampão de Tris-HCl (100 mM, ph 7,3) contendo CMP-ácido siálico (5 mM) e MnCl2 (20 mM) em um volume total de 20 μl. Um resíduo de ácido siálico foi acrescentado a aproximadamente 90% da proteína Gal-GlcNAc- Man5GlcNAc2 pelo ST3 Gal III recombinante empregando-se CMP-SA como o doador. O rendimento pode ser ainda mais melhorado ajustando-se as condições de reação.
[001211] Para fins de conveniência, nenhuma etapa de purificação ou diálise oi exigida depois de cada reação descrita acima. O que é mais interessante é que GalT-1 e ST3 Gal III podem ser combinados em uma reação de um recipiente. Rendimentos análogos foram obtidos quando comparados com reações separadas. A mistura de reação depois da reação de GlcNAc T-I contendo RNase B (60 μg, aproximadamente 4 nmol) foi incubada a 37 °C durante 20 horas com 1,7 mU de GalT-1 recombinante 9,8 mU de ST3 Gal III recombinante em tampão de tris-HCl (100 mM, ph 7,3) contendo UDP-Gal (7,5 mM), CMP-ácido siálico (5 mM) e MnCl2 (20 mM) em um volume total de 60 μl.
[001212] Conforme mostrado nas Figura 99, SA-PEG (10 kDa) foi acrescentado com sucesso a RNaseB. A mistura de reação depois da reação de GalT-1 contendo RNase B (6,7 μg, aproximadamente 0,45 nmol) foi submetida a diálise contra H20 durante 1 hora à temperatura ambiente e incubada a 37 °C durante 15,5 horas com 5 mU do ST3 Gal III recombinante em tampão Tris-HCl (50 mM, ph 7,3) contendo CMP-SA-PEG (10 kDa) (0,25 mM)e MnCl2 (20 mM) em um volume total de 20 μl, Os resíduos de ácido siálico modificado por PEG foram acrescentados com sucesso a peptídeo de Gal-GlcNAc- Man5GlcNAc2 pelo ST3 Gal III recombinante. O rendimento pode ser ainda mais melhorado pelo ajuste das condições de reação.
[001213] Conversão de N-Glicanos de Alto Teor de Manose em N-Glicanos Complexos. Para se obter esta conversão, é obtido um intermediário de GlcNAc β 1,2 Man3GlcNAc2. Conforme mostrado na Figura 100, há pelo menos quatro vias viáveis para se conduzir a reação a partir de peptídeo de Man5GlcNAc2 até este intermediário:
[001214] Rota I: O peptídeo Man5GlcNAc2 produzido pela α 1,2-manosidase fúngica é um substrato de GlcNAc transferase I (GlcNAc T-1 enzima 2 de) que acrescenta um GlcNAc. Os resíduos de manose terminal ligados em α 1,3 e em α 1,6 do peptídeo GlcNAc Man5GlcNAc2 é removido por α manosidase II de Golgi (enzima 5 de ManII). Esta via é uma parte do trajeto natural para o processamento de oligossacarídeos ligados em N conduzido em organismos superiores.
[001215] Rota II: Dois resíduos de manose são primeiro removidos por uma α-manosidase (enzima 6), em seguida um GlcNAc é acrescentado por GlcNAc T-I (enzima 2). Além do seu aceitador natural Man5GlcNAc2-R, GlcNAc T-I pode também reconhecer Man3GlcNAc2-R como o seu substrato e acrescentar um GlcNAc à estrutura de núcleo de manose para formar o peptídeo GlcNAc Man3GlcNAc2.
[001216] Rota III: A manose ligada em α 1,6 é removida por uma manosidase α 1,6, seguindo-se da adição de GlcNAc por GlcNAc T-I e remoção da manose terminal ligada em α 1,3 por uma α 1,3-manosidase. A partir dos dados experimentais obtidos, GlcNAcT-I pode reconhecer o peptídeo Man4GlcNAc2 como um aceitador e acrescentar um resíduo de GlcNAc para formar o peptídeo GlcNAcMan4GlcNAc2.
[001217] Rota IV: Tal como na Via III, a manose ligada em α 1,3 é removida por uma α 1,3-manosidase, seguindo-se de reação de GlcNAcT-I. Em seguida a manose terminal ligada em α 1,6 pode ser removida por uma α 1,6 manosidase.
[001218] Depois da função de GlcNAcT-I (responsável pela adição de GlcNAc ligada em β1,2 à α 1,3 manose no núcleo de manose) e de GlcNAc T-II (responsável pela adição de um segundo GlcNAc ligado em β 1,2 à α 1,6 manose no núcleo de manose), o peptídeo GlcNAc2 Man3GlcNAc2 pode ser processado por GalT-1 e sialil-transferase para formar os N-Glicanos complexos bi-antenários. Outras GlcNAc transferases tais como GlcNAc T-IV, GlcNAc T-V e/ou GlcNAc T-VI (Figura 100 e Figura 101) podem também glicosilar o peptídeo GlcNAc2 Man3GlcNAc2. Uma glicosilação adicional pelo GalT-1 e pelas sialil-transferases formará N-glicanos complexos multi-antenários. A enzima GlcNAc T-III catalisa a inserção de um GlcNAc bissecante, impedindo deste modo as ações de ManII, GlcNAc T-II, GlcNAc T-IV e GlcNAc T-V. 7. Preparação de EPO com glicanos complexos multi- antenários
[001219] Este exemplo apresenta a preparação de EPO biantenário PEGilado, e EPO triantenário sialilado a partir de EPO expresso em células de insetos.
[001220] A eritropoietina humana recombinante (rhEPO) a partir do sistema de expressão de baculovírus/Sf9 (Protein Sciences Crop., Meriden, CT) foi submetida a análise de glicanos e os glicanos resultantes mostraram ser principalmente do núcleo trimanosila com fucose nuclear, com uma pequena porcentagem de glicanos também tendo um único GlcNAc (EPO 1).
[001221] Adição de N-acetilglicosamina com GnT-I e GnT-II. Dois lotes de rhEPO (1 mg/ml) foram incubados com GnT-I e GnT-II, UDP-GlcNAc a 5 mM, MnCl2 a 20 mM e azida sódica a 0,02% em 100 mM de MES pH 6,5 a 32°C durante 24 horas. O lote A continha 20 mg de EPO e 10 mU/ml de GnT-I e 60 mU/ml de GnT-II. O lote B continha 41 mg de EPO e 41 mU/ml de GnT-I + 50 mU/ml de GnT-II. Depois da reação, extraiu-se o sal da amostra por filtração por gel (colunas PD10, Pharmacia LKB Biotechnology INc., Piscataway, NJ).
[001222] Glicanos de EPO Analisados por Levantamento do Perfil por 2AA HPLC. Este ensaio é uma ligeira modificação de Anumula e Dhume, Glycobiology 8 (1998) 685-69. Os N-glicanos redutivamente aminados foram injetados em uma coluna Shodex Asahipak NH2P-50 4D amino (4,6 mm x 150 mm). Dois solventes foram usados para a separação, A) ácido acético a 5% (v/v), tetraidrofurano a 1% e trietilamina a 3% em água e B) ácido acético a 2% e tetraidrofurano a 1prc em acetonitrila. A coluna foi então eluída isocraticamente com 70% de B durante 2,5 minutos, seguindo-se de um gradiente linear durante um período de 100 minutos indo de 70 a 5% de B e uma eluição isocrática final com 5% de B durante 20 minutos. Os picos eluídos foram detectados empregando-se detecção de fluorescência com uma excitação de 230 nm e comprimento de onda de emissão de 420 nm. Os glicanos ligados com N não sialilados incidem na faixa de LC de 23-34 minutos, os mono-sialilados na de 34-42 minutos, os di-sialilados na de 45-52 minutos, os tri- sialilados na de 55-65 minutos, e os tetra-sialilados na de 68-78 minutos.
[001223] O levantamento do perfil dos glicanos por 2AA HPLC revelou que o lote A foi convertido em 92% em uma estrutura biantenária com dois GlcNAcs (o restante tendo um único GlcNAc. O lote B apresentou uma conversão de 97% no produto desejado (Figura 102A e 102B)).
[001224] Introdução de uma Terceira Ramificação Antenária como GnT-V. EPO (1 mg/ml do lote B) proveniente do produto das reações de GnT-I e GnT-II, depois do sal extraído nas colunas PD-10 e da concentração subseqüente, foi incubado com 10 mU/ml de GnT-V e 5 mM de UDP-GlcNAc em 100 mM de MES ph 6,5 contendo 5 mM de MnCl2 e 0,02% de azida sódica a 32°C durante 24 horas. A análise por 2AA HPLC demonstrou que a conversão ocorreu com uma eficiência de 92% (Figura 103).
[001225] Depois da extração do sal (PD-10) e concentração, acrescentou-se galactose com rGalT1: EPO (1 mg/ml) foi incubada com 0,1 U/ml de GalT1, 5 mM de UDP- galactose, 5 mM de MnCl2 a 32°C durante 24 horas.
[001226] Análise MALDI de N-glicanos Redutivamente Aminados a partir de EPO. Uma pequena alíquota da PNGase liberou os N-glicanos de EPO que tinha sido rotulado redutivamente com ácido antranílico e submetido a diálise durante 45 min num filtro de membrana MF-Millipore (poro de 0,025 μm, 47 mm dia), que estava flutuando sobre a água. A alíquota submetida a diálise foi secada em um "speedvac", redissolvida em uma pequena quantidade de água, e misturada com uma solução de ácido 2,5-diidróxi-benzóico (10 g/l) dissolvido em água/acetonitrila (50:50. A mistura foi secada sobre o alvo e analisada empregando-se o espectrômetro de massa DE-Pro-MALDI-TOF da Applied Biosystems operado em um modo linear/íon negativo. Os oligossacarídeos foram atribuídos com base na relação massa-carga observada e na literatura precedente.
[001227] A análise dos glicanos liberados por MALDI mostrou que a galactose foi acrescentada quantitivamente a todos os sítios disponíveis (Figura 104). A EPO galactosilada proveniente do processo acima foi então purificada por filtração por gel em uma coluna Superdex 1.6/60 em 50 mM de Tris, 0,15 M de NaCl, pH 6.
[001228] Sialilação. Depois da concentração e extração do sal (PD-10), incubaram-se 10 mg de EPO galactosilada (1 mg/ml) com ST3Gal3 (0,05 U/ml) e CMP-SA (3 mM) em 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, ph 7,2 contendo 0,02% de azida sódica. Uma alíquota separada continha CMP-SA rádio- rotulada. O rótulo resultante incorporado e o rótulo livre foram separados por cromatografia de exclusão isocrática por tamanho/HPLC a 0,5 ml/min em MeOH a 45%, TFA a 0,1% (coluna de 7,8 mm x 30 cm, tamanho de partícula 5 μm, TSK G2000SWXL, Toso Haas, Ansys Technologies, Lake Fores, CA). Empregando-se este procedimento foram incorporados 12 % das contagens (360 micromolar, EPO a 33 micromolar, ou aproximadamente 10,9 moles/mole). Teoricamente (3 sítios ligados a N triantenário) é uma incorporação de aproximadamente 9 moles/mole. Estas correspondem dentro dos limites do processo. Em uma ração idêntica com ST6Gal1 em vez de ST3 Gal3, 5,7 % do rádio-rótulo foram incorporados à EPO galactosilada, ou aproximadamente 48% em comparação com ST3 Gal3. 8. GlicoPEGilação 8. Preparação de CMP-SA-PEG
[001229] Este exemplo descreve a preparação de CMP-SA- PEG
[001230] Preparação de 2- (Benzilóxi-Carboxamido) - Glicil-,Amido-2-Desóxi-D-:manopiranose . Éster de N-benzilóxi- carbonil-glicil-N-hidróxi-succinimida (3,125 g, 10,2 mmol) foi acrescentado a uma solução contendo D-manosamina-HCl (2 g, 9,3 mmol) e trietilamina (1,42 ml, 10,2 mmol) dissolvidos em MeOH (10 ml) e H20 (6 ml). Agitou-se a reação à temperatura ambiente durante 16 horas e concentrou-se empregando-se rotoevaporação. A cromatografia (sílica, 10% MeOH/CH2Cl2) resultou em 1,71 g(50% de rendimento) do produto em forma de um sólido branco: Rf = 0,62 (sílica; CHCl3:MeOH:H2O, 6/4/1); lH NMR (CD3OD, 500 MHz) δ 3,24-3,27 (m, 2H), 3,44 (t, 1H), 3,55 (t, 1H), 3,63-3,66 (m, 1H), 3,76-3,90 (m, 6H), 3,91 (s, 2H), 4,0 (dd, 2H), 4,28 (d, 1H, J = 4,4),4,41 (d, 1H, J = 3,2), 5,03 (s, 1H), 5,10 (m, 3H), 7,29-7,38(m, 10H).
[001231] Preparação de 5- (N-Benziloxi- Carboxamido)Glicil-Amido-3,5-Didesóxi-D-Glicero-D-Galacto- 2-Nonulo-Piranosuronato. 2-(N-Benzilóxi-carboxamido) g1icilamido-2-desóxi-D-manopiranose (1,59 g, 4,3 mmol) foi dissolvida em uma solução de HEPES a 0,1 M (12 ml, pH 7,5) e piruvato de sódio (4,73 g, 43 mmol). Ácido neuramínico aldolase (540 U de enzima em 45 ml de uma solução tamponada com fosfato a 10 mM, NaCl a 0,1 M a pH 6,9) e a mistura de reação foram aquecidos até 37°C durante 24 horas. A mistura de reação foi então centrifugada e o sobrenadante foi cromatografado (sílica C18, gradiente de H2O (100%) até 30% MeOH/água). Combinaram-se frações adequadas, concentraram- se e cromatografou-se o resíduo (sílica, gradiente de 10% MeOH/CH2Cl2 a CH2Cl2/MeOH/H20 a 6/4/1). Foram coletadas frações adequadas, concentradas e o resíduo foi ressuspenso em água. Depois de se secar por congelamento, obteve-se o produto (1,67 g, 87% de rendimento) em forma de um sólido branco: Rf = 0,26 (sílica, CHCl3/MeOH/H2O a 6/4/1); 1H NMR (D20, 500 MHz) δ 1,82 (t, 1H), 2,20 (m, 1H), 3,49 (d, 1H), 3,59 (dd, 1H), 3,67-3,86 (m, 2H), 3,87(s, 2H), 8,89-4,05 (m, 3H), 5,16 (s, 2H), 7,45 (m, 5H).
[001232] Preparação de 5-Glicilamido-3,5-Didesóxi-D- Glicero-D-Galacto-2Nonulo-Piranosuronato. 5-(N- Benziloxicarboxamido) glicilamido-3,5-didesóxi-D-glicero-D- galacto-2-nonulo-piranosuronato (1,66 g, 3,6 mmol) foi dissolvido em 20 ml de água/metanol a 50%. O frasco foi repetidamente evacuado e colocado sob argônio sendo então acrescentado Pd/C a 10% (0,225 g). Depois de evacuação repetida, acrescentou-se hidrogênio (aproximadamente 1 atm) ao frasco e a mistura de reação foi agitada durante 18 horas. A mistura de reação foi filtrada através de celite, concentrada por evaporação rotativa e secada por congelamento para resultar em 1,24 g (100% de rendimento) do produto em forma de um sólido branco: Rf : 0,25 (sílica, IPA/H2O/NH2OH a 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 1,83 (t, 1H, J = 9,9), 2,23 (dd, 1H, J = 12,9, 4,69), 3,51-3,70 (m, 2H), 3,61 (s, 2H), 3,75-3,84 (m, 2H), 3,95-4,06 (m, 3H).
[001233] Preparação de citidino-5’-monofosforil-[5-(N- fluorenil-met0xi-carboxamido)glicilamido-3,5—dides0xi-β-D- glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato]. Uma solução contendo 5-glicilamido-3,5-didesóxi-D-glicero-D-galacto-2- nonulopiranosuronato (0,55 g, 1,70 mmol) dissolvido em 20 ml de H2O foi acrescentado a uma solução de Tris (1,38 g, 11,8 mmol), 1 M de MgCl2 (1,1 ml) e BSA (55 mg). O pH da solução foi ajustado para 8,8 com 1M de NaOH (2 ml) e acrescentou-se CTP—2Na+ (2,23 g, 4,2 mmol). O pH da mistura de reação foi controlado com um controlador de pH que forneceu NaOH a 1 M à medida que era necessário para manter o pH 8,8. A proteína de fusão (sialiltransferase/CMP-ácido neuramínico sintetase) foi acrescentada à solução e agitou- se a mistura de reação à temperatura ambiente. Depois de dois dias, uma quantidade adicional de proteína de fusão foi acrescentada e a reação foi agitada durante outras 40 horas. A mistura de reação foi precipitada em EtOH e o precipitado foi lavado 5 vezes com EtOH frio, resultando em 2,3 gramas de um sólido branco. Aproximadamente 1,0 g do produto bruto foi dissolvido em 1,4 dioxano (4 ml), H2O (4 ml e NaHCO3 saturado (3 ml) e uma solução de FMOC-Cl (308 mg, 1,2 mmol) dissolvida em 2 ml de dioxano foi acrescentada gota a gota. Depois de se agitar durante 16 horas à temperatura ambiente, a mistura de reação foi concentrada até aproximadamente 6 ml por evaporação rotativa e purificado empregando-se cromatografia (sílica C18, gradiente 100% H2O até 30% MeOH/H2O). Combinaram-se frações adequadas e concentraram-se. O resíduo foi dissolvido e água e secado por congelamento, resultando em 253 mg de um sólido branco. Rf = 0,50 (sílica, IPA//NH40H a 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 1,64 (dt, 1H, J = 12,0, 6,0), 2,50 (dd, 1H, J = 13,2, 4,9), 3,38 (d, J = 9,67, 1H), 3,60 (dd, J = 11,65, 6,64, 1H), 3,79 (d, J = 4,11, 1H), 3,87 (dd, J = 12,24, 1,0, 1H), 3,97 (m, 2H), 4,07 (td, J = 10,75, 4,84, 1H), 4,17 (dd, J = 10,68, 1,0, 1H), 4,25 (s, 2H), 4,32 (t, J = 4,4, 1H), 4,37 (t, J = 5,8 1H), 4,6, 4,7 (m, obscurecido pelo pico de solvente), 5,95 (d, J = 4, 1H), 6,03 (d, J = 7,4, 1H), 7,43-7,53 (m, 3H), 7,74 (m, 2H), 7,94 (q, J = 7, 3H). MS (ES); Calculado para C35H42N5O18P ([M-H]-), 851,7; encontrado 850,0.
[001234] Preparação de citidino-5’-monofosforil-(S- glicilamido-3,5-dideoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulo- piranosuronato). Diisopropilamina (83 μl, 0,587 μmol) foi acrescentada a uma solução de citidino-5’-monofosforil-[5- (N-fluorenil-met0xicarboxamido)glicilamido-3,5-didesoxi-β- D-glicero-D-galacto-2-nonulo-piranosuronato] (100 mg, 0,117 mmol) dissolvida em água (3 ml) e metanol (1 ml). A mistura de reação foi agitada durante 16 horas à temperatura ambiente, sendo o metanol da reação removido da mistura de reação por evaporação rotativa. A mistura de reação bruta foi filtrada através de uma coluna de gel de sílica C18 empregando-se água e coletou-se o efluente e secou-se por congelamento para resultar (87 mg, 100%) no produto em forma de um sólido branco: Rf = 0,21 (sílica, IPA/H2O/NH40H a 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 1,66 (td, 1H, J = 5,3), 2,50 (dd, 1H, J = 13,2, 4,6), 3,43 (d, J = 9,58, 1H), 3,63 (dd, J = 11,9, 6,44, 1H), 3,88 (dd, J = 11,8, 1,0, 1H), 3,95 (td, J= 9,0, 2,3, 1H), 4,10 (t, J = 10,42, 1H), 4,12 (td, J = 10,34, 4,66, 1H), 4,18 (d, J = 10,36, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,31 (t, J = 4,64, 1H), 4,35 (1, 1H), 6,00 (d, J = 4,37, 1H), 6,13 (d, J = 7,71, 1H), 7,98 (d, J = 7,64, 1H), MS/ES); Calculado para C21H32N5OllP ([M-H]-), 629,47; encontrado 627,9.
[001235] Preparação de Citidino-5’-Monofosforil-[5-(N- Metóxi-Polioxietileno- (10 KDa) -3-Oxipropionamido) - Glicilamido-3,5-Di-Desóxi-P-D-Glicero-D-Galacto-2-Nonulo- Piranosuronato]. Hexaflúorfosfato de benziltriazol-1-ilóxi- tris(dimetilamino)-fosfônio (BOP, 21 mg, 48 μmol) foi acrescentado a uma solução do ácido metóxi-polióxi-etileno- (peso molecular médio de 1 KDa)-3-óxi-propiônico (48 mg, 48 μmol) dissolvido em DMF anidro (700 μl) e trietilamina (13 μl, 95 μmol). Depois de 30 minutos, foi acrescentada uma solução contendo citidino-5’-monofosforil-(5-g1icilamido- 3,5-didesóxi-3-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato) (30 mg, 48 μmol), água (400 μl) e trietilamina (13 μl, 95 μmol). Esta solução foi agitada durante 20 min. à temperatura ambiente, sendo então cromatografada (sílica C18, gradiente de metanol/água). Coletaram-se frações adequadas, concentraram-se e o resíduo foi dissolvido em água e secado por congelamento, resultando em 40 mg (50% de rendimento) de um sólido branco: Rf = 0,36 (sílica, IPA/H2O/NH2OH a 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 1,66 (td, 1H, J = 5,3), 2,50 (dd, 1H, J = 13,2, 4,6), 2,64 (t, J = 5,99, 3H) 3,43 (d, J = 9,58, 1H), 3,63 (m, 1H), 3,71 (s, 70H), 3,79 (m, obscurecido por um pico de 3,71), 3,82 (t, J = 6,19, 1H) 3,88 (dd, J = 11,8, 1,0, 1H), 3,95 (td, J= 9,0, 2,3, 1H), 3,98 (t, J= 5,06, IH), 4,12 (td, J = 10,34, 4,66, 1H), 4,18 (d, J = 10,36, 1H), 4,23 (d, J = 4,85, 2H), 4,31 (t, J = 4,64, 1H), 4,35 (t, 1H), 6,00 (d, J = 4,55, 1H), 6,13 (d, J = 7,56, 1H), 7,98 (d, J = 7,54, 1H), MS (MALDI), observar [M-H]; 1594,5, 1638,5, 1682,4, 1726,4, 1770,3, 1814,4, 1858,2, 1881,5, 1903,5, 1947,3.
[001236] Preparação de Citidino-5’-Monofosforil-[5-(N- Metóxi-Polioxi-Etileno- (10 KDa) -Oxicarboxamido) - Glicilamido-3,5-Di-Desóxi-P-D-Glicero-D-Galacto-2- Nonulopiranosuronato]. Citidino-5’-monofosforil-(5- glicilamido-3,5-didesóxi-P-Dglicero-D-galacto-2-nonulo- piranosuronato) (2,5 mg, 4 μmol) e água (180 μmol) foram acrescentados a uma solução de éster de (metóxi-polióxi- etileno-(l0 KDa, peso molecular médio)-oxicarbonil(N- oxibenzotriazol) (40 mg, 4 μmol) em DMF anidro (800 μml) contendo trietilamina (1,1 μl, 8 μmol) e a mistura de reação foi agitada durante 1 horas à temperatura ambiente. A mistura de reação foi então diluída com água (8 ml) e foi purificada por cromatografia por contagem de cintilações de fase reversa (sílica C18, gradiente de metanol/água). Combinaram-se frações adequadas, concentraram-se, sendo o resíduo dissolvido em água e secado por congelamento resultando em 20 mg (rendimento de 46%) do produto em forma de um sólido branco: Rf: 0,35 (sílica, IPA/H2O/NH40H a 7/2/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 1,66 (td, 1H), 2,50 (dd, 1H), 2,64 (t, 3H) 3,55-3,7 (m, obscurecido pelo pico 3,71), 3,71 (s, 488H), 3,72-4,0 (m, obscurecido pelo pico 3,71), 4,23 (m, 3H), 4,31 (t, 1H), 4,35 (t, 1H), 6,00 (d, J = 4.77, 1 H), 6,12 (d, J = 7,52, 1H), 7,98 (d, J = 7,89, 1H), MS (MALDI), observado [M- CMP+Na]; 10780. 9. GlicoPEGilação de FSH Humano Derivado de Pituitária
[001237] Este exemplo ilustra a montagem de um conjugado da invenção. O Hormônio Folículo Estimulante (FSH) é desialilado e em seguida conjugado com CMP-(ácido siálico)-PEG.
[001238] Desialilação do Hormônio Folículo Estimulante. O Hormônio Folículo Estimulante (FSH) (Human Pituitary, Calbiochem. Cat No. 869001), 1 mg, foi dissolvido em 500 μg em Tris-HCl a 50 mM pH 7,4, NaCl a 0,15 M, CaCl2 5 mM. Esta solução, 375 μl, foi transferida para um pequeno tubo plástico e a ele foram acrescentados 263 mU de Neuraminidase II (Vibrio cholerae). A mistura de reação foi agitada gentilmente durante 15 horas a 32 °C. Acrescentou-se a mistura de reação ao conjugado de ácido N- (p-aminofenil)oxâmico-agarose, 600 μml, pré equilibrado com Tris-HCl a 50 mM pH 7,4, NaCl a 150 mM e NaN3 a 0,05 %, e girou-se gentilmente durante 6,5 horas a 4°C. A suspensão foi centrifugada durante 2 minutos a 14.000 rpm e o sobrenadante foi coletado. As contas foram lavadas 5 vezes com 0,5 ml do tampão e todos os sobrenadantes foram combinados. A solução enzimática foi submetida a diálise (7000 MWCO) durante 15 horas a 4°C com 2 l de uma solução contendo Tris a 50 mM-HCl pH 7,4, NaCl a 1 M, NaN3 a 0,05 % e em seguida duas vezes durante 4 horas a 4°C para dentro de Tris a 50 mM-HCl, pH 7,4, NaCl a 1 M, NaN3 a 0,05 %. A solução foi concentrada até 2 μg/μl por Speed Vac e armazenada a -20 °C. As amostras de reação foram analisadas por géis de IEF (pH 3-7) (Invitrogen)(figura 105).
[001239] Preparação de SA-FSH Derivado de Pituitária Humana e PEG-SA-Hormônio Folículo Estimulante. FSH desialilado (100 μg, 50 μl) e CMP-ácido siálico ou CMP-SA- PEG (1 kDa ou 10 kDa) (0,05 μmol) foram dissolvidos em 13,5 μl de H2O (com o pH ajustado para 8 com NaOH) em tubos plásticos de 0,5 ml. Os tubos foram submetidos a ciclone rapidamente e acrescentaram-se 40 mU de ST3Gal3 (36,5 μl) (volume total de 100 μl). Os tubos foram submetidos a ciclone novamente e sacudidos gentilmente durante 24 horas a 32°C. As reações foram interrompidas resfriando-se até - 80°C. As amostras de reação de 15 μg foram analisadas por SDS-PAGE (figura 106), géis IEF (figura 107) e MALDI-TOF. O FSH nativo foi analisado por SDS-PAGE (figura 108).
[001240] Análise por SDS PAE e Géis IEF de Produtos de Reação. Géis de 1 mm de Tris-Glicina a 8-16 % de Novex para a análise por SDS PAGE foram adquiridos de Invitrogen. Amostras de 7,5 μl (15 μg) de reação de FSH foram diluídas com 5 μl de Tris a 50 mM-HCl, pH 7,4, NaCl a 150 mM, tampão de NaN3 a 0,05%, misturadas com 15 μl de tampão de carregamento de amostras e 1 μl de μ-mercapto-etanol a 9 M e aqueceu-se durante 6 minutos a 85°C. Os géis foram utilizados conforme instruções de Invitrogen e tingidos com Corante Azul Coloidal (Invitrogen).
[001241] As amostras de FSH (15 μg) foram diluídas com 5 μl de tampão Tris e misturadas com 15 μl de tampão de carreGamento de amostras (Figura 105). As amostras foram então aplicadas a Géis de Focalização Isoelétrica (pH 3-7) (Invitrogen) (figura 108). Os géis foram usados e fixados conforme instruções por Invitrogen e em seguida tingidos com Corante Azul Coloidal. 10. GlicoPEGilação de FSH Recombinante Produto de Modo Recombinante em Células CHO
[001242] Este exemplo ilustra a montagem de um conjugado da invenção. FSH desialilado foi conjugado com CMP-(ácido siálico)-PEG.
[001243] Preparação de Asialo-Hormônio Folículo Estimulante Recombinante. O Hormônio Folículo Estimulante recombinante (rFSH) produzido a partir de CHO foi usado nestes estudos. As 7.,500 IU de Gonal-F foram dissolvidos em 8 ml de água. A solução de FSH foi submetida a diálise em Tris a 50 mM -HCl pH 7,4, NaCl a 0,15 M, CaCl2 a 5 mM e concentrada até 500 μl em um filtro centrífugo Centricon Plus 20. Uma porção desta solução (40 μl) (~0,8 mg de FSH) foi transferida para um pequeno tubo plástico e a ela foram acrescentadas 275 mU de Neuraminidase II (Vibrio cholerae). A mistura de reação foi misturada durante 16 horas as 32°C. A mistura de reação foi acrescentada a um conjugado pré- lavado de ácido N-(p-aminofenil)oxâmico-agarose (800 μl) e suavemente girada durante 24 horas a 4°C. A mistura foi centrifugada a 10.000 rpm e o sobrenadante foi coletado. As contas foram lavadas 3 vezes com 0,6 ml de tampão Tris- EDTA, uma vez com 0,4 ml de tampão Tris -EDTA e uma vez com 0,2 ml do tampão Tri-EDTA, combinando-se todos os sobrenadantes. O sobrenadante foi submetido a diálise a 4 °C contra 2 l de Tris a 50 mM-HCl pH 7,4, NaCl a 1M, NaN3 a 0,05 %, e então duas vezes mais contra Tris a 50 mM-HCl pH 7,4, NaCl a 1M, NaN3 a 0,05 %. A solução dialisada foi então concentrada ate 420 μl em um filtro de centrifugação Centricon Plus 20 e armazenada a -20 °C.
[001244] Amostras de rFSH nativo e desialilado foram analisadas por SDS-PAGE e IEF (Figura 109). Géis de 1 mm de Tris-Glicina 8-16 % da Novex foram adquiridos de Invitrogen. As amostras (7,5 μl, 15 μg) foram diluídas com 5 μl de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl a 150 mM, tampão de NaN3 a 0,05 %, misturadas com 15 μl de tampão de carregamento de amostras e 1 μl de β-mercapto-etanol a 9 M e aqueceu-se durante 6 minutos a 85°C. Os géis foram utilizados conforme instruções de Invitrogen e tingidos com Corante Azul Coloidal (Invitrogen). Os Géis de Focalização Isoelétrica (ph 3-7) foram adquiridos de Invitrogen. As amostras (7,5 μl, 15 μg) foram diluídas com 5 μl de tampão Tris e misturadas com 15 μl de tampão de carregamento de amostras. Os géis foram carregados, utilizados e fixados conforme instruções de Invitrogen. Os géis foram tingidos com Corante Azul Coloidal. As amostras do FSH nativo e do desialilado foram também submetidas a diálise contra água e analisadas por MALDI-TOF.
[001245] Sialil-PEGilação do Hormônio Folículo Estimulante Recombinante. FSH desialilado (100 μg, 54 μl) e CMP-SA-PEG (1 kDa ou 10 kDa) (0,05 μmol) foram dissolvidos em 28 μl de Tris a 50 mM -HCl, NaCl a 0,15 M, NaN3 a 0,05 %, ph 7,2 em tubos plásticos de 0,5 ml. Os tubos foram submetidos rapidamente a ciclone e acrescentaram-se 20 mU de ST3 Gal3 (volume total 100 μl). Os tubos foram novamente submetidos a ciclone, misturados suavemente durante 24 horas a 32 °C e as reações forram extintas por congelamento a -80 °C. As amostras desta reação foram analisadas do modo descrito acima por géis SDS-PAGE (Figura 110), géis IEF (figura 111) e MALDI-TOF MS.
[001246] MALDI foi também conduzido no rFSH PEGilado. Durante a ionização, SA-PEG é eliminado da estrutura de N- glicano da glicoproteína. FSN nativo produziu um pico a 13928; AS-rFSH (13282); r-FSH resialilado(13332); PEG100- rFSH (13515; 14960 (1); 16455 (2); 17796 (3); 19321 (4)); e PEG 10000 (23560 (1); 24790 (2); 45670 (3); and 56760 (4)). 11. Estudo Farmacocinético de FSH GlicoPEGilado
[001247] Este exemplo apresenta o teste das propriedades farmacocinéticas do Hormônio Folículo Estimulante (FSH) preparado de acordo com os processos da invenção quando comparado com o FSH não PEGilado.
[001248] FSH, FSH-SA-PEG (1 kDa) e FSH-SA-PEG (10 kDa) foram rádio-iodados empregando-se condições padrão (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL) e preparados em solução salina tamponada com fosfato contendo BSA a 0,1 % Depois da diluição tampão de fosfato até uma concentração adequada, cada uma das proteínas de FSH de teste (0,4 μg cada) foi injetada por via intravenosa em ratos fêmeas Sprague Dawley (peso corporal de 250-300 g) e extraiu-se sangue a pontos no tempo de 0 a 80 horas. A radioatividade nas amostras de sangue foi analisada empregando-se um contador gama e a farmacocinética foi analisada empregando-se processos padrão (Figura 112). FSH foi eliminado do sangue muito mais rapidamente do que FSH- PEG (1 kDa), que, por sua vez, foi eliminado um pouco mais rapidamente do que FSH-PEG (10 kDa). 12. Bioensaio para peptídeos de FSH
[001249] Este exemplo apresenta um bioensaio para a atividade de Hormônio Folículo Estimulante (FSH) com base em células Sertoli cultivadas. Este ensaio é útil para a determinação da bioatividade de FSH depois da remodelagem dos glicanos, incluindo a glicoconjugação.
[001250] Este ensaio baseia-se na relação dose- resposta que existe entre a quantidade de estradiol produzido quando FSH, mas não hormônio luteinizante (LH), é acrescentado a células Sertoli cultivadas obtidas de ratos velhos imaturos. A testosterona exógena é convertida em 17 β-estradiol na presença de FSH.
[001251] Ratos Sprague-Dawley de sete a 10 dias de idade foram usados para se obter células Sertoli. Depois do sacrifício, os testículos foram descapsulados e o tecido foi disperso por incubação em colagenase (1 mg/ml), tripsina (1 mg/ml), hialuronidase (1 mg/ml) e DNases (5 μg/ml) durante 5 a 10 min. Os fragmentos de túbulos sedimentaram-se no fundo do frasco e foram lavados com PBS (1 x). Os fragmentos de túbulos foram reincubados durante 20 min com um meio contendo as mesmas enzimas: colagenase (1 mg/ml), tripsina (1 mg/ml), hialuronidase (1 mg/ml) e DNases (5 μg/ml).
[001252] Os fragmentos de túbulos foram homogeneizados e dispostos em uma placa de 24 cavidades em um meio isento de sódio, foram dispersas 5 x 105 por cavidade. Depois de uma incubação de 48 horas a 37°C e 5 % de CO2, acrescentaram-se meio fresco às células. A composição do meio isento de soro: DMEM (1 vol), mistura de nutrientes F10 de Ham (1 vol), i sulina 1 μg/ml, Transferrina 5 μg/ml, EGF 10 ng/ml, T4 20 pg/ml, Hidrocortisona 10-8 M, ácido retinóico 10-6 M.
[001253] O experimento de estimulação consiste em uma incubação de 24 horas com FSH padrão ou com amostras a 37°C e 5% de CO2. O coeficiente intra-ensaio médio de variação é de 9% e o coeficiente inter-ensaios médio de variação é de 11%.
[001254] Foi usado o kit Elisa de 17B-estradiol DE2000 (R&D Systems, Minneapolis, MN) para quantificar o nível de estradiol depois da incubação com FSH, FSN-SA-PEG (1 kDa)e FSH-SA-PEG (10 kDa).
[001255] O procedimento foi o seguinte: 100 μl de Estradiol Padrão (fornecido com o kit e preparado conforme as instruções do kit) ou amostra foi disposta por conta- gotas em cavidades da placa(s) Elisa de 17B-estradiol; 50 μl de Conjugado 17B-estradiol (fornecido com o kit, preparado de acordo com as instruções do kit) foram acrescentados a cada cavidade; 50 μl de solução de Anticorpo 17B-estradiol (fornecida com o kit e preparada de acordo com as instruções do kit) foram acrescentados a cada cavidade; as placas foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente a 200 rpm; o líquido foi aspirado de cada cavidade; as cavidades foram lavadas 4 vezes empregando-se a solução de lavagem; todo o líquido foi removido das cavidades; 200 μl de substrato pNPP (fornecido com o kit e preparado de acordo com as instruções do kit) foram acrescentados a todas as cavidades e incubados durante 45 min.; 50 μl de solução de Interrupção (fornecida com o kit e preparada de acordo com as instruções do kit) foram acrescentadas e as placas foram lidas a 405 nm (Figura 113). Embora FSH-PEG (10 kDa) apresentaram uma modesta estimulação de células Sertoli, a 1 μg/ml, FSH-PEG (1 kDa) estimulou as células Sertoli até 50prc mais do que FSH não PEGilado. 13. GlicoPEGilação de Transferrina
[001256] Este exemplo apresenta a preparação de asialo-transferrina e a sua sialilação com PEG- CMP-ácido siálico
[001257] Preparação de Asialo-Transferrina. Holo- Transferrina derivada de seres humanos, (10 mg) foi dissolvida em 50 μl de NaOAc a 50 mM, CaCl2 a 5 mM, pH 5,5. A esta solução acrescentou-se 500 mU de Neuraminidase II (Vibrio cholerae) e a mistura de reação foi agitada suavemente durante 20,5 horas a 37 °C. A mistura de reação foi acrescentada ao conjugado pré-lavado de ácido N-(p- aminofenil)oxâmico-agarose (60 μl) e as contas lavadas foram suavemente giradas durante 24 horas a 4°C. A mistura foi centrifugada a 10.000 rpm e o sobrenadante foi coletado. A mistura de reação foi ajustada até EDTA a 5 mM pela adição de 100 μl de EDTA a 30 mM às contas lavadas, que foram suavemente iradas durante 20 oras a 4°C. A suspensão foi centrifugada durante 2 minutos a 10.000 rpm e o sobrenadante foi coletado. As contas foram lavadas 5 vezes com 0,35 ml de NaOAc a 50 mM, CaCl2 a 5 mM, EDTA a 5 mM, pH 5,5 e todos os sobrenadantes foram coletados. A solução de enzima foi submetida duas vezes a diálise a 4°C para dentro de Tris a 15 mM-HCl, NaCl a 1 M, pH 7,4. Removeram-se 0,3 ml da solução de transferrina (3,3 ml no total) e submeteu-se duas vezes a diálise contra água. O restante foi submetido a diálise duas vezes mais a 4°C contra solução salina tamponada com fosfato. A solução submetida a diálise foi armazenada a -20°C. As amostras de proteína foram analisadas por Eletroforese sobre IEF. As amostras (9 μl, 25 μg) foram diluídas com 16 μl de tampão Tris e misturadas com 25 μl do tampão de carregamento de amostras e aplicadas a Géis de Focalização Isoelétrica (pH 3-7). Os géis foram utilizados e fixados empregando-se procedimentos padrão. Os géis foram tingidos com Corante Azul Coloidal.
[001258] Sialil-PEGilação de Asialo-Transferrina . Transferrina desialilada (250 μg) e CMP-ácido siálico ou CMP-SA-PEG (1 kDa ou 10 kDa) (0,05 μmol) foram dissolvidos em 69 μl de Tris a 50 mM-HCl NaCl a 0,15 M, NaN3 a 0,05 %, pH 7,2 em tubos plásticos de 1,5 ml. Os tubos foram submetidos a ciclone rapidamente e acrescentaram-se 100 mU de ST3 Gal III (90 μl) (volume total de 250 μl). Os tubos foram novamente submetidos a ciclone e misturados suavemente durante 24 horas a 32°C. As reações foram extintas por congelamento a -80°C. Géis de 1 mm com Tris- Glicina a 8-16 % da Novex foram usados para a análise SDS- PAGE (figura 114). As amostras (25 μl, 25 μg) foram misturadas com 25 μl do tampão de carregamento de amostras e 0,4 μl de β-mercapto-etanol e aquecidas durante 6 minutos a 85 °C. Os géis foram usados, empregando-se condições padrão e tingidos com Corante Azul Coloidal. Os géis IEF foram também utilizados do modo descrito acima (Figura 115). As amostras foram também submetidas à diálise contra água e analisadas por MALDI-TOF.
[001259] Resultados. MALDI foi também executada. A transferrina nativa (78729); asialo-transferrina (78197); transferrina resialilada (79626/80703); com SA-PEG 1k (79037 (1); 80961 (2); 82535 (3); 84778 (4));com SA-PEG 5k (90003 (2); 96117 (3); 96117 (4)); com SA-PEG 10k (100336 (2); 111421 (3); 122510 (4)). 14. GlicoPEGilação do Fator VIIa Recombinante produzido em células BHK
[001260] Este exemplo apresenta a PEGilação do Fator VIIa recombinante produzido em células CHO.
[001261] Preparação de Asialo-Fator VIIa. O Fator VIIa recombinante foi produzido em células BHK (células renais de filhote de hamster). O Fator VIIa (14,2 mg) foi dissolvido a 1 mg/ml em solução tampão (pH 7,4, Tris a 0.05 M, NaCl a 0,15 M, CaCl2 a 0,001 M, NaN3 a 0,05%) e foi incubado com 300 mU/ml de conjugado de sialidase (Vibrio cholera)-agarose durante 3 dias a 32°C. Para se monitorar a reação uma pequena alíquota da reação foi diluída com o tampão adequado e um gel IEF utilizado de acordo com os procedimentos de Invitrogel (figura 116). A mistura foi centrifugada a 3.5000 rpm e o sobrenadante foi coletado. A resinas foi lavada três vezes (3 x 2 ml) com a solução tampão acima (pH 7,4, Tris a 0,05 M, NaCl a 0,15 M, NaN3 a 0,05%) e as lavagens combinadas foram concentradas em um Centricon-Plus-20. A solução restante foi trocada com tampão com Tris a 0,05 M (pH 7,4), NaCl a 0,15 M, NaN3 a 0,05% até um volume final de 14,4 ml.
[001262] Preparação do Fator VIIa-SA-PEG (1 kDa e 10 kDa). A solução de desialilação do Fator VIIa foi dividida em duas amostras iguais de 7,2 ml. A cada amostra acrescentou-se ou CMP-SA-5-PEG(1 kDa) (7,4 mg) ou CMP-SA-5- PEG(10 kDa) (7,4 mg). ST3Gal3 (1,58 U) foi acrescentado aos dois tubos e as misturas de reação foram incubadas a 32°C durante 96 horas. A reação foi monitorada por gel de SDS- PAGE, empregando-se reagentes e condições descritas por Invitrogen. Quando a reação estava completa, a mistura de reação foi purificada empregando-se coluna preparatória Toso Haas TSK-Gel-3000, empregando-se um tampão PBS (pH 7,1) e coletando-se frações com base em absorção de UV. As frações combinadas contendo o produto foram concentradas a 4°C nos filtros de centrifugação Centricon-Plus-20 (Millipore, Bedford, MA) e a solução concentrada novamente preparada rendendo 1,97 mg (ensaio de proteína do ácido biquinconínico, ensaio BCA, Sigma-Aldrich, St Louis MO) do Fator VIIa-PEG. O produto da reação foi analisado empregando-se análise de SDS-PAGE e IEF de acordo com os procedimentos e os reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras foram submetidas a diálise contra água e analisadas por MALDI-TOF. A figura 117 mostra os resultados MLDI para o Fator VIIa nativo. A figura 118 contém os resultados para o Fator VIIa PEGilado com PEG de 1 kDa onde o pico do Figura VIIa PEGilado com PEG de 1 kDa é evidente. A figura 119 contém os resultados MALDI para o Fator VIIa PEGilado com PEG de 10 kDa em que um pico para o Fator VIIa PEGilado com PEG de 10 kDa é evidente. A figura 120 ilustra a análise SDS-PAGE de todos os produtos de reação em que uma faixa para o Fator VIII-SA-PEG (10 kDa) é evidente. 15. GlicoPEGilação do Fator IX produzido em células CHO
[001263] Este exemplo apresenta a preparação de asialo Fator IX e a sua sialilação com PEG-CMP-ácido siálico.
[0012 64] Desialilação do rFator IX. Uma forma recombinante do Fator de Coagulação IX (rFator IX) foi produzida em células CHO. 6000 IU de rFator IX foram dissolvidas em um total de 12 ml de USP H2O. Esta solução foi transferida para um filtro de centrifugação Centricon Plus 20, PL-10 com outros 6 ml USP H2O A solução foi concentrada até 2 ml, sendo então diluída com 15 ml de Tris a 50 mM-HCl, pH 7,4, NaCl a 0,15 M, CaCl2 a 5 mM, NaN3 a 0,05 %, sendo então reconcentrada. A diluição/concentração foi repetida 4 vezes para alterar efetivamente o tampão até um volume final de 3,0 ml. Desta solução 2,9 ml (aproximadamente 29 mg do rFator IX) foram transferidos para um pequeno tubo plástico e a isto foram acrescentados 530 mU de conjugado de α 2-3,6,8-Neuraminidase-agarose (Vibrio cholerae, Calbiochem, 450 μl). A mistura de reação foi girada suavemente durante 26,5 horas a 32 °C. A mistura foi centrifugada durante 2 minutos a 20.000 rpm e o sobrenadante foi coletado. As contas de agarose (contendo neuraminidase) foram lavadas 6 vezes com 0,5 ml de Tris a 50 mM-HCl, pH 7,12, NaCl a 1 M, NaN3 a 0,05 %. As lavagens combinadas e os sobrenadantes foram centrifugados novamente durante 2 minutos a 10.000 rpm para se remover qualquer resina agarose residual. A solução de proteínas combinadas desialiladas foi diluída até 19 ml com o mesmo tampão e concentrada até ~2 ml em um filtro de centrifugação Centricon Plus 20 PL-10. A solução foi duas vezes diluída com 15 ml de Tris a 50 mM-HCl ph 7,4, NaCl a 0,15 M, NaN3 a 0,05 % e reconcentrada até 2 ml. A solução final desialilada de rFator IX foi diluída até um volume final de 3 ml (~10 mg/ml) com o Tampão Tris. As amostras do rFator IX nativo e do desialilado foram analisadas por Eletroforese IEF. Os Géis de Focalização Isoelétrica (pH 3-7) foram utilizados empregando-se amostras de 1,5 μl (15 μg) diluídas primeiro com 10 μl de tampão Tris e misturadas com 12 μl de tampão de carregamento de amostras. Os géis foram carregados, utilizados e fixados empregando-se procedimentos padrão. Os géis foram tingidos com o Corante Azul Coloidal (Figura 121) mostrando uma faixa para o Fator IX desialilado.
[001265] Preparação de PEG (1 kDa e 10 kDa)-SA-Fator IX. O rFator IX desialilado (29 mg, 3 ml) foi dividido em duas amostras de 1,5 ml (14,5 mg) em dois tubos de centrífuga de 15 ml. Cada solução foi diluída com 12,67 ml de Tris a 50 mM-HCl ph 7,4, NaCl a 0,15 M, NaN3 a 0,05 % e foi acrescentado ou CMP-SA-PEG-1k ou 10 k (7,25 μmol). Os tubos foram invertidos suavemente para se misturar e acrescentaram-se 2,9 U de ST3 Gal3 (326 μl) (volume total de 14,5 ml). Os tubos foram novamente invertidos e girados suavemente durante 65 horas a 32 °C. As reações foram extintas por congelamento a -20grc. Amostras de 10 μg das reações foram analisadas por SDS-PAGE As proteínas PEGiladas foram purificadas em uma coluna de HPLC Toso Haas Biosep G3000SW (21,5 x 30 cm, 13 μm) com Solução Salina Tamponada com Fosfato Dulbecco, pH 7,1 (Gibco), 6 ml/min. A reação e a purificação foram monitoradas empregando-se géis SDS-PAGE e IEF. Géis de 1 mm de Tris-Glicina 4-20 % de Novex foram carregados com amostras de 10 μl (10 μg) depois da diluição com 1 μl de Tris a 50 mM-HCl, pH 7,4, NaCl a 150 mM, tampão de NaN3 a 0,05 % e mistura com 12 μl de tampão de carregamento de amostras e 1 μl de DTT a 0,5 M e aqueceu-se durante 6 minutos a 85 °C. Os géis foram tingidos com Corante Azul Coloidal (Figura 122) mostrando uma faixa para PEG (1 kDa e 10 kDa)-SA-Fator IX. 16. Sialil-GlicoPEGilação Direta do Fator IX
[001266] Este exemplo apresenta a preparação de sialil-glicoPEGilação de peptídeos sem um tratamento anterior com sialidase. Neste caso, o Fator IX é o peptídeo exemplar.
[001267] Sialil-GlicoPEGilação (10 kDa) Direta do Fator IX. O Fator IX (1100IU) foi dissolvido em 5 ml de histidina a 20 mM, tampão de glicina a 520 mM contendo sacarose a 2 %, NaN3 a 0,05 % e polissorbato 80 a 0,01 %, ph 5,0. O CMP-SA-PEG (10 kDa) (27,8 mg, 3,5 μmol) foi então acrescentado a esta solução, inverteu-se suavemente a mistura de reação para misturar e acrescentou-se 1,4 U de ST3 Gal. A mistura de reação foi girada suavemente durante 19 horas a 32 °C, sendo então reação extinta por congelamento. A mistura de reação foi analisada por géis SDS-PAGE empregando-se condições de revelação e tingimento (Azul Coloidal) descritos por Invitrogen. Resumindo, as amostras (10 μL) foram misturadas com amostra de 12 μl carregando tampão e 2 μl 0,5 MDTT e aquecidas por 6 minutos a 85°C (figura 123, pranchas 8, 9 e 10). O produto foi purificado em uma coluna Superdex 200 10/20 (Amersham, Uppsala, Suécia) com Salmoura Tamponada de Fosfato Dulbecco, pH 7,1 (Gibco), 6 ml/minuto. A figura 123 contém uma faixa (prancha 5) de Fator-IX PEGilado purificado por HPLC. 17. Capeamento do Ácido Siálico do Fator IX GlicoPEGilado
[001268] Estes exemplos estabelecem o procedimento para capeamento do ácido siálico de peptídeos glicoPEGilados. Aqui, o Fator IX é o peptídeo exemplar.
[001269] Capeamento de Ácido Siálico de Gliganos Ligados em N e Ligados em O do Fator-IX-SA-PEG (10 KDa). r- Fator-IX-PEG purificado (10 KDa) (2,4 mg) foi concentrado em um filtro centrífugo Centricon® Plus 20 PL-10 (Millipore Corp., Bedford, MA) e o tampão foi mudado para 50 mM Tris- HCl pH 7,2, 0,15M NaCl, 0,05% NaN3 para um volume final de 1,85 ml. A solução de proteína foi diluída com 372 μl do mesmo tampão Tris e 7,4 mg CMP-SA (12 μmol) foram adicionados como um sólido. A solução foi invertida gentilmente para misturar e 0,1 U ST3Gal1 e 0,1 U ST3Gal3 foram adicionados. A mistura de reação foi girada gentilmente por 42 horas a 32°C.
[001270] Uma amostra de 10 μg da reação foi analisada por SDS-PAGE. Géis Novex Tris-Glicina 4-12% 1 mm foram realizados e manchados usando Azul Coloidal conforme descrito por Invitrogen. Em resumo, as amostras, 10 μl (10 μg) foram misturadas com 12 μl de tampão carregando amostra e 1 μl de 0,5 M DTT e aquecidas por 6 minutos a 85°C (figura 123, prancha 4). 18. GlicoPEGilação de Proteínas Expressas em Sistemas de Mamíferos ou Insetos: EPO, α Interferon e β Interferon
[001271] Este exemplo estabelece a preparação de peptídeos PEGilados que são expressos em sistemas de mamíferos e insetos.
[001272] Preparação do Aceitador de Sistemas de Expressão de Mamíferos. Os peptídeos a serem glicoPEGilados usando CMP-ácido siálico PEG precisam ter glicanos terminando em galactose. A maioria dos peptídeos dos sistemas de expressão dos mamíferos terão ácido siálico terminal que primeiro precisa ser removido.
[001273] Digestão de Sialidase. O peptídeo é desialilado usando uma sialidase. Um procedimento típico envolve incubação de uma solução de 1 mg/ml do peptídeo em salmoura tris-tamponada, pH 7,2 com 5 mM de CaCl2 adicionados, com 0,2 U/ml de dialidase imobilizada de Vibrio cholera (Calbiochem) a 32°C por 24 horas. O crescimento microbiano pode ser impedido tanto por filtração estéril ou inclusão de azido de sódio a 0,02%. A resina é então removida por centrifugação ou filtração e então lavada para recuperar o peptídeo aprisionado. Neste ponto, EDTA pode ser adicionado à solução para inibir qualquer sialidase que lixiviou da resina.
[001274] Preparação de Sistemas de Expressão de Inseto. EPO, alfa-interferon e beta-interferon podem também ser expressos em sistemas de não mamíferos tais como, leveduras, plantas ou células de inseto. Os peptídeos a serem glicoPEGilados usando CMP-ácido siálico PEG precisam ter glicanos terminando na galactose. A maior parte dos N- glicanos nos peptídeos expressos em células de inseto, por exemplo, são o núcleo trimanosila. Estes glicanos são primeiro construídos nos glicanos terminando em galactose antes de serem aceitadores para sialiltransferase.
[001275] Construção de Glicanos Aceitadores a partir do Núcleo de Trimanosila. Peptídeo (1 mg/ml) em salmoura tamponada Tris, pH 7,2, contendo 5 mM de MnCl2, 5 mM UDP- glcNAc, 0,05 U/ml GLCNACT I, 0,05 U/ml GLCNACT II, é incubado a 32°C por 24 horas ou até a reação estar substancialmente completa. O desenvolvimento microbiano pode ser impedido tanto por filtração estéril quanto inclusão de azido de sódio a 0,02%. Após troca de tampão para remover UDP e outras moléculas pequenas, UDP-galactose e MnCl2 são adicionados a 5 mM, galactosiltransferase é adicionada a 0,05 U/ml e é incubada a 32°C por 24 horas ou até a reação estar substancialmente completa. O desenvolvimento microbiano pode ser impedido tanto por filtração quanto inclusão de azido de sódio a 0,02%. Os peptídeos então estão prontos para glicoPEGilação.
[001276] Construção de glicanos ligados em O. Uma estratégia semelhante pode ser empregada para alfa interferon para produzir de forma enzimática o O-glicano Gal-GalNAc. Caso necessário, GalNAc ligado a serina ou treonina pode ser adicionado ao peptídeo usando transferases GalNAc de peptídeo apropriadas (por exemplo, GalNAc T1, GalNAc T2, T3, T4, etc.) e UDP-GalNAc. Também, casso necessário, a galactose pode ser adicionada usando galactosiltransferase e UDP-galactose.
[001277] GlicoPEGilação usando Sialiltransferase. Os glicopeptídeos (1 mg/ml) portando galactose terminal na salmoura tamponada com Tris + azido de sódio a 0,02% são incubados com CMP-SA- PEG (0,75 mM) e 0,4 U/ml sialiltransferase (ST3Gal3 ou ST3Gal4 para N-glicanos em EPO e beta interferon; ST3Gal4 ou ST3Gal1 para O-glicanos em alfa interferon) a 32°C por 24 horas. Outras transferases que podem trabalhar bem incluem 2,6 sialiltransferase de Photobacterium damsella. A concentração de peptídeo aceitador está mais preferivelmente na faixa de 0,1 mg/ml até o limite de solubilidade do peptídeo. A concentração de CMP-SA-PEG seria suficiente para exceder os sítios disponíveis, porém não alta de modo a causar problemas de solubilização de peptídeo devidos ao PEG e podem variar de 50 μM até 5 mM, e a temperatura pode variar de 2°C a 40°C. O tempo necessário para completar a reação dependeria da temperatura, as quantidades relativas da enzima para o substrato aceitador, a concentração de substrato doador e o pH. 19. GlicoPEGilação de EPO Produzida em Células de Inseto
[001278] Este exemplo estabelece a preparação de EPO biantenária PEGilada de EPO expressa em célula de inseto.
[001279] Eritropoietina humana recombinante (rhEPO) do sistema de baculovirus/expressão de Sf9 (Proteína Sciences Corp., Meriden, CT) foi submetido a análise de glicano e os glicanos resultantes foram mostrados como sendo primariamente o núcleo de trimanosila com fucose de núcleo, com uma pequena porcentagem de glicanos também possuindo um GlcNAc simples (figura 124).
[001280] Adição de N-acetilglicosamina com GnT-I e GnT-II. Dois lotes de rhEPO (1 mg/ml) foram incubados com GnT-I e GnT-II, 5 mM UDP-glcNAc, 20 mM MnCl2 e azido de sódio a 0,02% em 100 mM MES, pH 6,5 a 32°C por 24 horas. O lote A continha 20 mg de EPO e 100 mU/ml de GnT-I e 60 mU/ml de GnT-II. O lote B continha 41 mg de EPO e 41 mU/ml de GnTI + 50 um/ml GnT-II. Após a reação, a amostra foi desalinizada por filtração com gel Colunas PD10, Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ).
[001281] O glicano com perfil fornecido por 2AA HPLC revelou que o lote A foi convertido em 92% em uma estrutura biantenária com dois GlcNAcs (o restante possuindo um glcNAc simples. O lote B mostrou 97% de conversão no produto desejado (figuras 102A e 102B).
[001282] Galactosilação de EPO do Lote A. EPO (~16 mgs do lote A) foi tratada com GnTII para completar a adição de GlcNAc. A reação foi realizada em 50 mM Tris pH 7,2 contendo 150 mM de NaCl, EPO mg/ml, 1 mM de UDP-GlcNAc, 5 mM de MnCl2, azido de sódio a 0,02% e 0,02 U/ml de GnTII a 32°C por 4 horas. Então a galactosilação de EPO foi feita por adição de UDP-galactose a 3 mM e GalT1 para 0,5 U/ml e a incubação continuou a 32°C por 48 horas.
[001283] EPO galactosilada foi então purificada por filtração com gel em uma coluna Superdex 1,6/60 em 50 mM Tris, 0,15M NaCl, pH 6. A EPO contendo pico foi então analisada por 2AAHPLC. Com base nos dados de HPLC, ~85% dos glicanos contêm duas galactoses e ~15% dos glicanos não possuem qualquer galactose após reação de galactosilação.
[001284] Sialilação de EPO galactosilada. Sialilação de EPO galactosilado foi realizada em 10 mM de Tris pH contendo 150 mM de NaCl, 0,5 mg/ml EPO, 200 mU/ml de ST3Gal3 e tanto 0,5 mM de CMP-NAN ou CMP-NAN-PEG (1 KDa) ou CMP-NAN-PEG (10 KDa) por 48 horas a 32°C. Quase todos os glicanos que possuem dois resíduos de galactose foram completamente sialilados (2 ácidos siálicos/glicano) após reação de sialilação com CMP-NAN. Análise MALDI-TOF confirmou os dados de HPLC.
[001285] PEGilação de EPO Galactosilada. Para reações de PEGilação usando CMP-NAN-PEG (1 KDa) e CMP-NAN-PEG (10 KDa), uma alíquota da mistura de reação foi analisada por SDS-PAGE (figura 125). O peso molecular do peptídeo de EPO aumentou com a adição de cada açúcar e aumentou mais dramaticamente em peso molecular após as reações de PEGilação.
[001286] Bioensaio in vitro de EPO. O bioensaio de EPO in vitro (adaptado de Hammering e outros, 1996, J. Pharm. Biomed. Anal. 14: 1455-1469) baseia-se na resposta da linhagem de célula TF-1 aos múltiplos níveis de EPO. As células TF-1 fornecem um bom sistema para investigação da proliferação e diferenciação das células progenitoras mielóides. Esta linhagem de célula foi estabelecida por T. Kitamura e outros em outubro de 1987 a partir de amostra de aspiração de medula óssea heparinizada de um homem japonês de 35 anos de idade com pancitopenia grave. Estas amostras são completamente dependentes de Interleucina 3 ou fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF).
[001287] A linhagem de célula TF-1 (ATCC, Cat. Número CRL-2003) desenvolveu-se em RPMI + FBS 10% + GM-CSF (12 ng/ml) e incubou a 37°C com CO2 a 5%. As células estavam em suspensão em uma concentração de 5.000 células/ml do meio e 200 μl foram dispensados em uma placa de 96 poças. As células foram incubadas com várias concentrações de EPO (0,1 μg/ml a 10 μg/ml) por 48 horas. Um Ensaio de Viabilidade MTT foi então realizado por adição de 25 μl de MTT a 5 mg/ml (SIGMA M5655), incubando a placa a 37°C por 20 minutos a 4 horas, adicionando 100 μl de solução de isopropanol/HCl (100 ml de isopropanol + 333 μl de HCl 6N), leitura de OD a 570 nm, e 630 nm ou 690 nm e subtraindo as leituras em 630 nm ou 690 nm das leituras em 570 nm.
[001288] A figura 126 contém os resultados quando EPO sialilada e EPO glicoPEGilada com 1 kDa ou 10 KDa PEG foi submetida a um teste de bioatividade de EPO in vitro. A EPO glicoPEGilada com 1 kDa PEG tinha quase a mesma atividade que a EPO não glicoPEGilada quando ambas estavam a uma concentração de cerca de 5 μg/ml. A EPO glicoPEGilada com 10 kDa PEG tinha cerca de metade da atividade da EPO não glicoPEGilada quando ambas estavam a uma concentração de aproximadamente 5 μg/ml. 20. GlicoPEGilação de α Interferon Produzida em Células CHO
[001289] Preparação de Asialo-α Interferon. Alfa Interferon produzido das células CHO é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM CaCl2 e concentrado para 500 μl em um filtro centrífugo Centricon Plus 20. A solução é incubada com 300 mU/ml de Neuraminidase II (Vibrio Cholerae) por 16 horas a 32°C. Para monitorar a reação, uma pequena alíquota da reação é diluída com tampão apropriado e um gel IEF realizado. A mistura de reação é então adicionada ao conjugado N-(p- aminofenil)ácido oxâmico-agarose (800 μl/ml de volume de reação) pré-lavado e as contas lavadas gentilmente giradas por 24 horas a 4°C. A mistura é centrifugada a 10.000 rpm e o sobrenadante foi coletado. As contas são lavadas 3 vezes com tampão Tris-EDTA, uma vez com 0,4 ml de tampão Tris- EDTA e uma vez com 0,2 ml do tampão Tris-EDTA e todos os sobrenadantes foram agrupados. O sobrenadante é dialisado a 4°C contra 50 mM Tris - HCl pH 7,4, 1M NaCl, 0,05% NaNa e então duas vezes mais contra 50 mM Tris - HCl pH 7,4, 1M NaCl, 0,05% NaN3. A solução dialisada é então concentrada usando um filtro centrífugo Centricon Plus 20 e armazenada a -20°C. As condições para o gel IEF são operadas de acordo com os procedimentos e reagentes providos pela Invitrogen. As amostras de G-CSF nativo e desialilado são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001290] Preparação de Alfa-Interferon-(alfa 2,3)- Sialil-PEG. Alfa Interferon desialilado é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M de NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM de CMP-ácido siálico-PEG e 0,1 U/ml de ST3Gal1 a 32°C por 2 dias. Para monitorar a incorporação do ácido siálico-PEG, uma pequena alíquota da reação teve ligante CMP-SA-PEG-fluorescente adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é isolado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo fluorescente ao peptídeo é quantificada usando um detector fluorescente em linha. Após dois dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coleta de frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise de IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos pela Invitrogen. As amostras de alfa Interferon nativo e desialilado são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001291] Preparação de Alfa-Interferon-(alfa 2,8)- Sialil-PEG. Alfa Interferon produzido em CHO, que contém um glicano ligado em O sialilado alfa 2,3, é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM de CMP-ácido siálico-PEG e 0,1 U/ml de CST-II a 32°C por 2 dias. Para monitorar a incorporação do ácido siálico-PEG, uma pequena alíquota da reação teve ligante CMP-SA-PEG-fluorescente adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo fluorescente ao peptídeo é quantificada usando um detector fluorescente em linha. Após dois dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coleta de frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise de IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos pela Invitrogen. As amostras de alfa Interferon nativo e PEGilado são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001292] Preparação de Alfa-Interferon-(alfa 2,6)Sialil-PEG. Alfa Interferon contendo apenas GalNAc ligado em O foi dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM de CMP-ácido siálico-PEG e 0,1 U/ml de ST6GalNAcI ou II a 32°C por 2 dias. Para monitorar a incorporação do ácido siálico-PEG, uma pequena alíquota da reação teve ligante CMP-SA-PEG-fluorescente adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo fluorescente ao peptídeo é quantificada usando um detector fluorescente em linha. Após dois dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coleta de frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS- PAGE e análise de IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos pela Invitrogen. As amostras de alfa Interferon nativo e PEGilado são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS. 21. GlicoPEGilação de G-CSF Produzido em Células CHO
[001293] Preparação de Fator de Estimulação de Colônia de Asialo-Granulócito (G-CSF). G-CSF produzido nas células CHO é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM CaCl2 e concentrado para 500 μl em um filtro centrífugo Centricon Plus 20. A solução é incubada com 300 mU/ml de Neuraminidase II (Vibrio Cholerae) por 16 horas a 32°C. Para monitorar a reação, uma pequena alíquota da reação é diluída com tampão apropriado e um gel IEF realizado. A mistura de reação é então adicionada ao conjugado N-(p-aminofenil)ácido oxâmico- agarose (800 μl/ml de volume de reação) pré-lavado e as contas lavadas gentilmente giradas por 24 horas a 4°C. A mistura é centrifugada a 10.000 rpm e o sobrenadante foi coletado. As contas são lavadas 3 vezes com tampão Tris- EDTA, uma vez com 0,4 ml de tampão Tris-EDTA e uma vez com 0,2 ml do tampão Tris-EDTA e todos os sobrenadantes foram agrupados. O sobrenadante é dialisado a 4°C contra 50 mM Tris - HCl pH 7,4, 1M NaCl, 0,05% NaN3 e então duas vezes mais contra 50 mM Tris - HCl pH 7,4, 1M NaCl, 0,05% NaN3. A solução dialisada é então concentrada usando um filtro centrífugo Centricon Plus 20 e armazenada a -20°C. As condições para o gel IEF são operadas de acordo com os procedimentos e reagentes providos pela Invitrogen. As amostras de G-CSF nativo e desialilado são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001294] Preparação de G-CSF-(alfa 2,3)-Sialil-PEG. G- CSF desialilado é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris- HCl, 0,15 M de NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM de CMP-ácido siálico-PEG e 0,1 U/ml de ST3Gal1 a 32°C por 2 dias. Para monitorar a incorporação do ácido siálico-PEG, uma pequena alíquota da reação teve ligante CMP-SA-PEG-fluorescente adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é isolado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo fluorescente ao peptídeo é quantificada usando um detector fluorescente em linha. Após dois dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coleta de frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise de IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos pela Invitrogen. As amostras de G-CSF PEGilado e nativo são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001295] Preparação de G-CSF-(alfa 2,8)-Sialil-PEG. G- CSF produzido nas células CHO, que contém um glicano ligado em O sialilado alfa 2,3, é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM de CMP-ácido siálico-PEG e 0,1 U/ml de CST-II a 32°C por 2 dias. Para monitorar a incorporação do ácido siálico-PEG, uma pequena alíquota da reação teve ligante CMP-SA-PEG-fluorescente adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo fluorescente ao peptídeo é quantificada usando um detector fluorescente em linha. Após dois dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coleta de frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise de IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos pela Invitrogen. As amostras de alfa Interferon nativo e PEGilado são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001296] Preparação de G-CSF-(alfa 2,6)Sialil-PEG. G- CSF contendo apenas GalNAc ligado em O foi dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM de CMP-ácido siálico-PEG e 0,1 U/ml de ST6GalNAcI ou II a 32°C por 2 dias. Para monitorar a incorporação do ácido siálico-PEG, uma pequena alíquota da reação teve ligante CMP-SA-PEG-fluorescente adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo fluorescente ao peptídeo é quantificada usando um detector fluorescente em linha. Após dois dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coleta de frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise de IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos pela Invitrogen. As amostras de alfa Interferon nativo e PEGilado são dialisadas contra água e analisadas por MALDI- TOF MS. 22. GlicoPEGilação de G-CSF produzido em células CHO
[001297] Preparação de EPO-SA-PEG ligado em O (10 KDa). Asialo-EPO, produzida originalmente nas células CHO é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% de NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 5 mM CMP-SA e 0,1 U/ml de ST3Gal3 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação do ácido siálico nos glicanos ligados em N, uma pequena alíquota da reação teve CMP-SA-14C adicionado; o peptídeo é separado por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW usando água, e o produto detectado usando um detector de radiação. A solução restante é trocada com tampão com 0,05 M Tris (pH 7,2), 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3 para um volume final de 7,2 ml, até CMP-SA não mais ser detectado. O retentato é então ressuspenso em 0,05 M Tris (pH 7,2), 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3 a 2,5 mg/ml de proteína. A solução é incubada com 1 mM CMP-SA-PEG (10 KDa) e ST3Gal1, para glicosilar o sítio ligado em O, a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de ácido siálico-PEG, uma alíquota pequena da reação é separada por filtração de gel usando uma coluna analítica Toso Haas G3000SW eluindo com PBS, pH 7,0 e analisando por detecção de UV. Quando a reação estiver completa, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,0) coletando as frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise de IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos pela Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS. 23. GlicoPEGilação de um anticorpo
[001298] Este exemplo estabelece os procedimentos para PEGilar os glicanos ligados em O de uma molécula de anticorpo. Aqui, Enbrel™ é usado como um exemplo, contudo, um versado na técnica apreciará que este procedimento pode ser usado com muitas moléculas de anticorpo.
[001299] Preparação de Enbrel™-SA-PEG (10 KDa) . Enbrel™ (TNF-receptor-IgG1-quimera), tanto com glicanos ligados em O sialilados antes da PEGilação ou não, é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M de NaCl, 5 mM MnCl2, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 5 mM UDP-galactose e 0,1 U/ml de galactosiltransferase a 32°C por dois dias para capear os glicanos da região Fc com galactose. Para monitorar a incorporação de galactose, uma pequena alíquota da reação possui ligando 14C-galactose-UDP adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G2000SW em metanol e água. A incorporação do rótulo radioativo ao peptídeo é quantificada usando um detector de radiação em linha.
[001300] Quando a reação está completa, a solução é incubada com 1 mM CMP-ácido siálico-ligante-PEG (10 KDa) e 0,1 U/ml de ST3Gal3 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de ácido siálico-ligante-PEG, o peptídeo é separado por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). Quando a reação está completa, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas TSK-Gel-3000 empregando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção UV. As frações contendo produto são combinadas, concentradas, o tampão é trocado e então secas por congelamento. O produto da reação é analisado usando SDS- PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS. 24. GlicoPEGilação de anticorpo Remicade™
[001301] Este exemplo estabelece o procedimento para glicoPEGilar uma molécula de anticorpo recombinante por introdução de moléculas PEG aos glicanos da região Fc. Aqui, Remicade™ uma proteína de fusão de região TNF-R:IgG Fc, é o peptídeo exemplar.
[001302] Preparação de Remicade™-Gal-PEG (10 KDa) . Remicade™ é dissolvido em 2,5mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 5 mM MnCl2, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM UDP-galactose-PEG (10 KDa) e 0,1 U/ml de galactosiltransferase a 32°C por dois dias para introduzir PEG nos glicanos da região Fc. Para monitorar a incorporação de galactose, uma pequena alíquota da reação possui ligando 14C-galactose-UDP adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo radioativo ao peptídeo é quantificada usando um detector de radiação em linha.
[001303] Quando a reação está completa, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso HaasTSK-Gel-3000 empregando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção UV. As frações contendo produto são combinadas, concentradas, o tampão é trocado e então secas por congelamento. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI- TOF MS. 25. Geração e PEGilação de Estruturas de GlcNAc-ASN: TPA Produzido em Levedura
[001304] Este exemplo estabelece a preparação de estruturas GlcNAc-Asn PEGiladas em um peptídeo tal como TPA expresso em levedura.
[001305] Espera-se que a expressão da levedura resulte em um TPA que contém uma estrutura do tipo manan ligada em N. Esta proteína recombinante é primeiro tratada com endoglicosidase H para gerar estruturas GlcNAc nos resíduos de asparagina (Asn) no peptídeo.
[001306] As estruturas de GlcNAc-Asn no esqueleto de peptídeo/proteína são então modificadas com galactose ou galactose-PEG usando UDP-galactose ou UDP-galactose-6-PEG, respectivamente, e uma galactosiltransferase tal como GalTl. Em um caso, a galactose-PEG é o resíduo terminal. Em um segundo caso, a galactose é adicionalmente modificada com SA-PEG usando um doador CMP-SA-PEG e uma sialiltransferase tal como ST3GalIII. Em outra modalidade, as estruturas de GlcNAc-Asn no esqueleto de peptídeo/proteína podem ser galactosiladas e sialiladas conforme descrito acima, e então adicionalmente sialiladas usando CMP-SA-PEG e uma α 2,8-sialiltransferase tal como a enzima codificada pelo gene Campylobacter jejuni cst-II. 26. Geração e PEGilação de Estruturas GlcNAc-ASN: GM- CSF Produzida em Saccharomyces
[001307] Este exemplo estabelece a preparação de Ativador do tipo de tecido com PEGilado estruturas GlcNAc- Asn.
[001308] Espera-se que a GM-CSF recombinante expressa em levedura contenha 2 glicanos ligados em N e 2 ligandos ligados em O. Os glicanos ligados em N devem ser do tipo manan ramificado. Esta proteína recombinante é tratada com uma endoglicosidase do grupo consistindo em endoglicosidase H, endoglicosidase-F1, endoglicosidase-F2, endoglicosidase- F3, endoglicosidase-M tanto sozinhas quanto em combinação com manosidases I, II e III para gerar protuberâncias de GlcNAc nos resíduos de asparagina (Asn) no esqueleto de peptídeo/proteína.
[001309] As estruturas GlcNAc-Asn no esqueleto de peptídeo/proteína são então modificadas com galactose ou galactose-PEG usando UDP-galactose ou UDP-galactose-6-PEG, respectivamente, e uma galactosiltransferase tal como GalTl. Em um caso a galactose-PEG é o resíduo terminal. Em um segundo caso a galactose é adicionalmente modificada com SA-PEG usando um doador CMP-SA-PEG e uma sialiltransferase tal como ST3GalIII. Em outra modalidade as estruturas GlcNAc-Asn no esqueleto de peptídeo/proteína backbone podem ser galactosiladas e sialiladas conforme descrito acima, e então adicionalmente sialiladas usando CMP-SA-PEG e uma α 2,8-sialiltranferase tal como a enzima codificada pelo gene Campylobacter jejuni cst-II. C. Glico-Conjugação de Moléculas Pequenas 27. Síntese de CMP-SA-Levulinato
[001310] Este exemplo estabelece o procedimento para a síntese de CMP-SA-levulinato.
[001311] Preparação de 2-Levulinamido-2-Deóxi-D- Manopiranose. Isobutilcloroformato (100 μl, 0,77 mmol) foi adicionado gota a gota a uma solução de ácido levulínico (86 μl, 0,84 mmol), THF anidro (3 ml) e trietilamina (127 μl, 0,91 mmol). Esta solução foi agitada por 3 horas a temperatura ambiente e foi então adicionada gota a gota a uma solução contendo cloridrato de D-manosamina (151 mg, 0,7 mmol), trietilamina (127 μl, 0,91 mmol), THF (2 ml) e água (2 ml). A mistura de reação foi agitada 15 horas e então concentrada a secura por evaporação giratória. Cromatografia (sílica, gradiente de etapa de 5-15% MeOH/CH2Cl2) foi usada para isolar o produto rendendo 0,156 g (73% de rendimento) de um sólido branco: Rf = 0,41 (sílica, CHCla/MeOH/água 6/4/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 2,23 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,57 (td, J = 6,54, 3,68, 2H) 2,63 (t, J = 6,71, 2H), 2,86-2,90 (m, 4H), 3,42 (m,1H), 3,53 (t, J = 9,76, 1H), 3,64 (t, J = 9,43, 1H), 3,80-3,91 (m, 4H), 4,04 (dd,J = 9,79, 4,71, 1 H), 4,31 (dd, J = 4,63, 1,14, 1H), 4,45 (dd, J = 4,16, 1,13, 1H), 5,02 (d, J = 1,29, 1H), 5,11 (s, J = 1,30,1H), MS (ES); calculado para C11H19NO7, 277,27; encontrado [M+1] 277,9.
[001312] Preparação de 5-Levulinamido-3,5-Dideóxi-D- Glicero-D-Galacto-2- Nonulopiranosuronato. Piruvato de sódio (0,616 g, 5,6 mmol) e aldolase de ácido N- acetilneuramínico (50 U) foram adicionados a uma solução de 2-levulinamido-2-deóxi-D-manopiranose (0,156 g, 0,56 mmol) em 0,1 M HEPES (pH 7,5). A mistura de reação foi aquecida a 37°C por 20 horas e após isto congelada. A mistura de reação foi então filtrada através de C18 sílica, congelada e seca por congelamento. O sólido bruto foi purificado usando cromatografia de cintilação (sílica, primeiro usando 10-40% MeOH/CH2Cl2 e então CH2Cl2/MeOH/H2O 6/4/0,5). Frações apropriadas foram combinadas e concentradas rendendo 45 mg (80% de rendimento) de um sólido branco: Rf = 0,15 (sílica, CHCl3/MeOH/água 6/4/1); 1H NMR (D2O, 500 MHz) δ 1,82 (t, J = 11,9, 1H), 2,21 (dd, J = 13,76, 4,84, 1H), 2,23 (s, 3H), 2,57 (app q, J = 6,6, 2H), 2,86-2,95 (m, 2H), 3,15-3,18 (m, 1H), 3,28-3,61 (complexo, 1H), 3,60 (dd, J = 11,91, 6,66, 1H), 3,75 (td, J = 6, 65, 2,62, 1H), 3,84 (dd, J = 11,89, 2,65, 1H), 3,88-4,01 (complexo, 2H), 4,04 (td, J = 11,18, 4,67, 1H), MS (ES); calculado para Cl4H23NO10 365,33; encontrado([M-1]-), 363,97.
[001313] Preparação de Citidina-5'-Monofosforil-(5- Levulin amido-3,5-Dideóxi-p-D-Glicero-D-Galacto-2- Nonulopiranosuro nato) . 5-Levulinamido-3,5-dideóxi-D- glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato (50 mg, 137 (mol) foi dissolvido em 2 ml de 100 mM, tampão HEPES pH 7,5 e 1 M MnCl2 (300 (l, 300, (mol) foi adicionado. CTP-2Na+ (79 mg, 1,5 (mol) foi dissolvido em 5 ml de tampão HEPES e foi adicionado ao açúcar. A enzima de fusão de sintetase de sialiltransferase/CMP-ácido neuramínico (11 U) foi adicionada e a mistura de reação agitada a temperatura ambiente for 45 horas. A mistura de reação foi filtrada através de um filtro 10.000 MWCO e o filtrado que continha o produto de reação foi usado diretamente sem purificação adicional: Rf= 0,35 (sílica,IPA/água/NH4OH7/2/1). 28. Glicocerebrosidase-Manose-6-Fosfato Produzida em Células CHO
[001314] Este exemplo estabelece o procedimento para glicoconjugar manose-6-fosfato em um peptídeo produzido em células CHO tal como glicocerebrosidase.
[001315] Preparação de Asialo-Glicoceramidase . Glicocerebrosidase produzida em células CHO é dissolvida em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, e é incubada com 300 mU/ml de conjugado sialidase-agarose por 16 horas a 32°C. Para monitorar a reação uma pequena alíquota da reação é diluída com o tampão apropriado e um gel IEF e SDS-PAGE realizada de acordo com Procedimentos da Invitrogen. A mistura é centrifugada a 10,000 rpm e o sobrenadante é coletado. As contas são lavadas 3 vezes com Tampão Tris-EDTA, uma vez com 0,4 ml Tampão Tris-EDTA, e uma vez com 0,2 ml do tampão Tris-EDTA. Todos os sobrenadantes são agrupados. O sobrenadante é dialisado a 4°C contra 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 0,05% NaNa e então duas vezes mais contra 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 0,05% NaN3. A solução dialisada é então concentrada usando um Filtro centrífugo Centricon Plus 20. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001316] Preparação de Glicocerebrosidase-SA-Ligante- Manose-6-Fosfato(Procedimento 1) . A asialo- glicocerebrosidase de cima é dissolvida em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM CMP-ácido siálico-ligante-Man-6-fosfato e 0,1 U/ml de ST3Gal3 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de ácido siálico-ligante-Man-6-fosfato, uma pequena alíquota da reação teve CMP- ligando fluorescente SA-PEG adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas TSK-Gel-3000 empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação de rótulo fluorescente ao peptídeo é quantificada usando um no detector fluorescente em linha. Quando a reação está completa, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas TSK- Gel-3000 empregando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI- TOF MS.
[001317] Preparação de Glicocerebrosidase-SA-Ligante- Manose-6-Fosfato (Procedimento 2) . Glicocerebrosidase, produzida em CHO porém sialilada de modo incompleto é dissolvida em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM CMP-ácido siálico—ligante—Man—6—fosfato e 0,1 U/ml de ST3Gal3 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de ácido siálico-ligante-Man-6-fosfato, uma pequena alíquota da reação teve ligando CMP-SA-PEG-fluorescente adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas TSK- Gel-3000 empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação de rótulo fluorescente ao peptídeo é quantificada usando um detector fluorescente em linha. Quando a reação está completa, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas TSK-Gel-3000 usando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS. 29. Glicoconjugação de Mitramecina em um Anticorpo
[001318] Este exemplo estabelece o procedimentos para glicoconjugar uma pequena molécula, tal como mitramicina aos glicanos da região Fc de uma molécula de anticorpo produzida em células de mamíferos. Aqui, o anticorpo Herceptin™ é usado, porém um versado na técnica apreciará que o processo pode ser usado com muitos outros anticorpos.
[001319] Preparação de Herceptin™-Gal-Ligante- Mitramicina. Herceptin™ é dissolvida em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 5 mM MnCl2, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM UDP-galactose-ligante- mitramicina e 0,1 U/ml de galactosiltransferase a 32°C por dois dias para introduzir a mitramicina nos glicanos da região Fc. Para monitorar a incorporação de galactose, uma pequena alíquota da reação teve ligando 14C-galactose-UDP adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo radioativo ao peptídeo é quantificada usando um detector de radiação em linha.
[001320] Quando a reação está completa, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas TSK-Gel-3000 empregando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção UV. As frações contendo produto são combinadas, concentradas, o tampão é trocado e então secas por congelamento. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI- TOF MS. 30. Glicoconjugação de Geldanamicina em um Anticorpo
[001321] Este exemplo estabelece a glicoconjugação de uma pequena molécula, tal como geldanamicina, aos glicanos da região Fc de um anticorpo produzidos nas células CHO, tal como Rituxan™. Aqui, o anticorpo Rituxan™ é usado, porém um versado na técnica apreciará que o processo pode ser usado com muitos outros anticorpos.
[001322] Preparação de Rituxan™-Gal-Ligante- Geldanamicina. Rituxan™ é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM D. Glico-Conjugação de Peptídeos 31. Transferrina-GDNF Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 5 mM MnCl2, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM UDP-galactose-ligante- geldanamicina e 0,1 U/ml de galactosiltransferase a 32°C por dois dias para introduzir a geldanamicina nos glicanos da região Fc. Para monitorar a incorporação de galactose, uma pequena alíquota da reação possui ligando 14C- galactose-UDP adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo radioativo ao peptídeo é quantificada usando um detector de radiação em linha.
[001323] Quando a reação está completa, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas TSK-Gel-3000 empregando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção UV. As frações contendo produto são combinadas, concentradas, o tampão é trocado e então secas por congelamento. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI- TOF MS.
[001324] Este exemplo estabelece os procedimentos para a glicoconjugação de proteínas, e especificamente, transferrina é glicoconjugada ao GDNF. Transferrina-SA- Ligante-Gal-UDP é preparada da transferrina. Um resíduo de galactose é removido dos glicanos GNDF, e Transferrina-SA- Ligante-Gal-UDP é conjugada aos glicanos GNDF usando uma galactosiltransferase.
[001325] Preparação de Agalacto-GDNF. GDNF produzido em células NSO (células de mieloma de murino) é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, e é incubado com 300 mU/mL conjugado beta- galactosidase-agarose por 16 horas a 32°C. Para monitorar a reação uma pequena alíquota da reação é diluída com o tampão apropriado e um gel IEF realizado de acordo com procedimentos da Invitrogen. A mistura é centrifugada a 10.000 rpm e o sobrenadante é coletado. O sobrenadante é dialisado a 4°C contra 50 mM Tris-HC1 pH 7,4, 1 M NaCl, 0,05% NaN3 e então duas vezes mais contra 50 mM Tris-HC1 pH 7,4, 1 M NaCl, 0,05% NaN3. A solução dialisada é então concentrada usando um filtro centrífugo Centricon Plus 20 e armazenada a -20°C. As condições para o el IEF são operadas de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos pela Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001326] Preparação de Transferrina-SA-Ligante-Gal- UDP. Asialo-transferrina é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com CMP-ácido siálico-ligante-Gal-UDP (quantidade molar para adicionar 1 equivalente molar de açúcar de nucleotídeo para transferrina) e 0,1 U/mL de ST3Gal3 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de ácido siálico, uma pequena alíquota da reação possui ligando 14C- SA-UDP adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo radioativo ao peptídeo é quantificada usando um detector de radiação em linha.
[001327] A solução é incubada com 5 mM CMP-ácido siálico e 0,1 U/ml de ST3Gal3 (para capear quaisquer glicanos de transferrina não reagidos) a 32°C por dois dias. A incorporação ao peptídeo é quantificada usando um detector de radiação em linha. Após 2 dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI- TOF MS.
[001328] Preparação de Transferrina-SA-Ligante-Gal- GDNF. A transferrina-SA-Ligante-Gal-UDP preparada conforme descrito acima é dissolvida em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 5 mM MnCl2, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 2,5 mg/ml agalacto-GDNF e 0,1 U/ml de galactosiltransferase a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de galactose, uma pequena alíquota da reação possui ligando 14C-galactose-UDP adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). A incorporação do rótulo radioativo ao peptídeo é quantificada usando um detector de radiação em linha.
[001329] Quando a reação está completa, a solução é incubada com 5 mM UDP-Gal e 0,1 U/ml de galactosiltransferase (para capear quaisquer glicanos de transferrina não reagidos) a 32°C por dois dias seguido por adição de 5 mM CMP-SA e 0,1 U/ml de ST3Gal3. Após um adicional de 2 dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) coletando as frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS- PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOFMS. 32. Glicocerebrosidase-Transferrina
[001330] Este exemplo estabelece o procedimentos para a glicoconjugação de proteínas, e especificamente, a transferrina é glicoconjugada em glicocerebrosidase. As estruturas GlcNAc-ASN são criadas na glicoceraminidase, e Transferrina-SA,-Ligante-Gal-UDP é conjugada nas estruturas GNDF GlcNAc-ASN usando galactosiltransferase.
[001331] Preparação de GlcNAc-Glicocerebrosidase (Cerezyme™). Cerezyme™ (glicocerebrosidase) produzida em células CHO é dissolvida em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, e é incubada com 300 mU/ml de conjugado de Endo-H-agarose por 16 horas a 32°C. Para monitorar a reação uma pequena alíquota da reação é diluída com o tampão apropriado e um gel IEF e SDS-PAGE realizada de acordo com procedimentos da Invitrogen. A mistura é centrifugada a 10.000 rpm e o sobrenadante é coletado. As contas são lavadas 3 vezes com Tampão Tris-EDTA, uma vez com 0,4 ml Tampão Tris-EDTA e uma vez com 0,2 ml do tampão Tris-EDTA e todos os sobrenadantes são agrupados. O sobrenadante é dialisado a 4°C contra 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 0,05% NaN3 e então duas vezes mais contra 50 mM Tris-HC1 pH 7,4, 1 M NaCl, 0,05% NaN3. A solução dialisada é então concentrada usando um filtro centrífugo Centricon Plus 20. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001332] Preparação de Transferrina-SA-Ligante-Gal- Glicocerebrosidase. Transferrina-SA-Ligante-Gal-UDP do acima é dissolvida em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 5 mM MnCl2, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 2,5 mg/ml GlcNAc-glicocerebrosidasee 0,1 U/ml de galactosiltransferase a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação da glicocerebrosidase, o peptídeo é separado por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e o produto detectado por absorção UV. A mistura de reação é então purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) coleta das frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS- PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS. 33. EPO-Transferrina
[001333] Este exemplo estabelece os procedimentos para a glicoconjugação de proteínas em glicanos ligados em O, e especificamente, transferrina é glicoconjugada a EPO. O resíduo de ácido siálico é removido do glicano ligado em O da EPO e EPO-SA-ligante-SA-CMP é preparada. EPO-SA-ligante- SA-CMP é glicoconjugada a asialo-transferrina com ST3Gal3.
[001334] Preparação de Asialo-EPO Ligada em O. EPO (eritropoietina) produzida nas células CHO é dissolvida em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, e é incubada com 300 mU/ml conjugado de sialidase (Vibrio cholera)-agarose por 16 horas a 32°C. Para monitorar a reação uma pequena alíquota da reação é diluída com o tampão apropriado e um gel IEF realizado de acordo com procedimentos da Invitrogen. A mistura é centrifugada a 10.000 rpm e o sobrenadante é coletado. O sobrenadante é concentrado a uma concentração de EPO de cerca de 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 5 mM CMP-ácido siálico e 0,1 U/ml de ST3Gal3 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de ácido siálico, uma pequena alíquota da reação teve ligando CMP-SA-fluorescente adicionado; o rótulo incorporado no peptídeo é separado do rótulo livre por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1). Quando a reação está completa, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001335] Preparação de EPO-SA-Ligante-SA-CMP. Asialo- EPO ligada em O 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 1 mM CMP-ácido siálico-ligante-SA-CMP e 0,1 U/ml de ST3Gal1 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de ácido siálico- ligante-SA-CMP, o peptídeo é separado por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1).
[001336] Após 2 dias, a mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e coletando frações com base na absorção de UV. O produto da reação é analisado usando SDS- PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001337] Preparação de Transferrina-SA-Ligante-SA-EPO. EPO-SA-Ligante-SA-CMP do acima é dissolvida em 2,5mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 2,5 mg/ml asialo-transferrina e 0,1 U/ml de ST3Gal3 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de transferrina, o peptídeo é separado por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e o produto detectado por absorção UV. Quando a reação está completa, a solução é incubada com 5 mM CMP- SA e 0,1 U/ml de ST3Gal3 (para capear quaisquer glicanos de transferrina não reagidos) a 32°C por dois dias. A mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) coleta das frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS-PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI- TOF MS. 34. EPO-GDNF
[001338] Este exemplo estabelece os procedimentos para a glicoconjugação de proteínas, e especificamente, a preparação de EPO-SA-Ligante-SA-GDNF.
[001339] Preparação de EPO-SA-Ligante-SA-GDNF. EPO—SA- Ligante-SA-CMP do acima é dissolvido em 2,5 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% NaN3, pH 7,2. A solução é incubada com 2,5 mg/ml GDNF (produzida em NSO) e 0,1 U/ml de ST3Gal3 a 32°C por dois dias. Para monitorar a incorporação de GDNF, o peptídeo é separado por filtração de gel em uma coluna analítica Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) e o produto detectado por absorção UV. Quando a reação está completa, a solução é incubada com 5 mM CMP-SA e 0,1 U/ml de ST3Gal3 (para capear quaisquer glicanos GDNF) a 32°C por dois dias. A mistura de reação é purificada usando uma coluna preparatória Toso Haas G3000SW empregando tampão PBS (pH 7,1) coleta das frações com base na absorção UV. O produto da reação é analisado usando SDS- PAGE e análise IEF de acordo com os procedimentos e reagentes fornecidos por Invitrogen. As amostras são dialisadas contra água e analisadas por MALDI-TOF MS.
[001340] As revelações de cada patente, pedido de patente e publicação citadas aqui são incorporadas como referência em sua totalidade. Embora esta invenção tenha sido revelada com referência às modalidades específicas, fica claro que outras modalidades e variações desta invenção podem ser propostas por outros versados na técnica, sem com isto fugir do espírito e escopo da invenção. As reivindicações anexas destinam-se a incluir todas tais modalidades e variações equivalentes.

Claims (62)

1. Processo in vitro, isento de células, para a remodelagem de um peptídeo, caracteri zado pelo fato de possuir uma fórmula que é um elemento selecionado a partir de:
Figure img0081
em que AA é um resíduo de aminoácido de término ou interno do referido peptídeo; X1-X2 é um sacarídeo covalentemente ligado ao referido AA, em que X1 é um primeiro resíduo de glicosila; X2 é um segundo resíduo de glicosila covalentemente ligado a X1, em que X1 e X2 são selecionados de resíduos de monosacarila e oligosacarila; e u é um inteiro selecionado entre 0 e 1; referido processo compreendendo: (a) para um peptídeo de acordo com a Fórmula I; (i) remover X2 ou uma subunidade de sacarila do mesmo a partir do referido peptídeo, formando, dessa forma, um glicano truncado; e (ii) colocar em contato o referido glicano truncado com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila compreendendo um grupo de modificação sob condições apropriadas para transferir pelo menos um referido doador de glicosila compreendendo um grupo de modificação para o referido glicano truncado, remodelando, dessa forma, o referido peptídeo; ou (b) para um peptídeo de acordo com a Fórmula II; (1) colocar em contato o referido peptídeo com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila compreendendo um grupo de modificação sob condições apropriadas para transferir pelo menos um referido doador de glicosila compreendendo um grupo de modificação para o referido glicano truncado.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo possui a fórmula:
Figure img0082
em que Z é um elemento selecionado a partir de O, S, NH e um reticulador.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo possui a fórmula:
Figure img0083
em que X9 e X10 são resíduos de monosacarila ou oligosacarila independentemente selecionados; e m, n e f são inteiros selecionados entre 0 e 1.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo possui a fórmula:
Figure img0084
em que X11 e X12 são porções de glicosila independentemente selecionadas; e r e x são inteiros independentemente selecionados dentre 0 e 1.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que X11 e X12 são (manose)q, em que é selecionado dentre os inteiros entre 1 e 20, e quando q é três ou mais, (manose)q é selecionada a partir de estruturas lineares e ramificadas.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo possui a fórmula:
Figure img0085
em que X13, X14 e X15 são resíduos de glicosila selecionados independentemente; e g, h, i, j, k e p são independentemente selecionados dentre os inteiros 0 e 1, contanto que pelo menos um de g, h, i, j, k e p seja 1.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que: X14 e X15 são elementos independentemente selecionados de GlcNAc e Sia; e i e k são independentemente selecionados dentre os inteiros 0 e 1, contanto que pelo menos um de i e k seja 1, e se k for 1, g, h e j são 0.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo possui a fórmula:
Figure img0086
em que X16 é um elemento selecionado a partir de:
Figure img0087
em que s, u e i são independentemente selecionados dentre os inteiros 0 e 1.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida remoção utiliza uma glicosidase.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do referido grupo de modificação ser um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em um polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, um rótulo detectável, um grupo ligante reativo e uma porção alvo.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato do referido grupo de modificação ser um polímero solúvel em água.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato do referido polímero solúvel em água compreender poli(etileno glicol).
13. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido poli(etileno glicol) possui uma distribuição de peso molecular que é essencialmente homodispersa.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser selecionado a partir do grupo que consiste em fator de estimulação de colônia de granulócito, interferon-alfa, interferon-beta, Fator VIIa, Fator IX, hormônio de estimulação de folículo, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, proteína ativadora de plasminogênio de tecido, interleucina-2, Fator VIII, receptor de fator de necrose tumoral quimérico, uroquinase, anticorpo antiglicoproteína IIb/IIIa quimérico, anticorpo anti-HER2 quimérico, anticorpo anti-vírus sincicial respiratório quimérico, anticorpo anti-CD20 quimérico, DNase, anticorpo anti-fator de necrose tumoral quimérico, insulina humana, hepatite B sAg e hormônio de crescimento humano.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo possui a fórmula:
Figure img0088
em que X3, X4, X5, X6, X7 e X17 são resíduos de monosacarila ou oligosacarila independentemente selecionados; e a, b, c, d, e, e x são independentemente selecionados dos inteiros 0, 1 e 2, contanto que pelo menos um elemento selecionado de a, b, c, d, e, e x seja 1 ou 2; referido processo compreendendo: (a) remover pelo menos um dentre X3, X4, X5, X6, X7 ou X17, ou uma subunidade de sacarila do mesmo a partir do referido peptídeo, formando, dessa forma, um glicano truncado; e (b) colocar em contato o referido glicano truncado com pelo menos uma glicosiltransferase e pelo menos um doador de glicosila sob condições apropriadas para transferir pelo menos um referido doador de glicosila para o referido glicano truncado, remodelando, dessa forma, o referido peptídeo.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que, seguindo a etapa (a), referido peptídeo possui a fórmula:
Figure img0089
em que r, s e t são inteiros independentemente selecionados dentre 0 e 1.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida remoção da etapa (a) produz um glicano truncado no qual a, b, c, e, e x são cada um 0.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que X3, X5 e X7 são selecionados dentre o grupo que consiste em (manose)z e (manose)z-(X8)y, em que X8 é uma porção de glicosila selecionada a partir de mono- e oligo-sacarídeos; y é um inteiro selecionado dentre 0 e 1; e z é um inteiro entre 1 e 20, em que quando z é 3 ou mais, (manose)z é selecionada dentre estruturas lineares ou ramificadas.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que X4 é selecionado a partir do grupo que consiste em GlcNAc e xilose.
20. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que X3, X5 e X7 são (manose)u, em que u é selecionado dos inteiros entre 1 e 20 e quando u é 3 ou mais, (manose)u é selecionada a partir de estruturas lineares e ramificadas.
21. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos referidos doadores de glicosila compreende um grupo de modificação.
22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato do referido grupo de modificação ser um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em um polímero solúvel em água, uma porção terapêutica, um rótulo detectável, um grupo ligante reativo e uma porção alvo.
23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato do referido polímero solúvel em água compreender poli(etileno glicol).
24. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o referido poli(etileno glicol) possui uma distribuição de peso molecular que é essencialmente homodispersa.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser selecionado a partir do grupo que consiste em fator de estimulação de colônia de granulócito, interferon-alfa, interferon-beta, Fator VIIa, Fator IX, hormônio de estimulação de folículo, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, proteína ativadora de plasminogênio de tecido, interleucina-2, Fator VIII, receptor de fator de necrose tumoral quimérico, uroquinase, anticorpo antiglicoproteína IIb/IIIa quimérico, anticorpo anti-HER2 quimérico, anticorpo anti-vírus sincicial respiratório quimérico, anticorpo anti-CD20 quimérico, DNase, anticorpo anti-fator de necrose tumoral quimérico, insulina humana, hepatite B sAg e hormônio de crescimento humano.
26. Processo para formar um conjugado entre um peptídeo que é um elemento selecionado dentre um fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) e um peptídeo interleucina- 2 (IL-2) e um grupo de modificação, caracterizado pelo fato do referido grupo de modificação ser ligado covalentemente ao referido peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, referido peptídeo compreendendo um resíduo de glicosila possuindo a fórmula:
Figure img0090
em que a, b, c e e são elementos independentemente selecionados dentre 0 e 1; d é 0; e R é um elemento selecionado a partir do referido grupo de modificação, referido processo compreendendo: (a) colocar em contato o referido peptídeo com uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada, compreendendo uma porção de glicosila que é um substrato para a referida glicosiltransferase ligada covalentemente ao referido grupo de modificação, sob condições apropriadas para a formação do referido grupo de ligação glicosila intacto.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (b) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com uma sialidase sob condições apropriadas para remover ácido siálico do referido peptídeo.
28. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (c) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com uma galactosil transferase e um doador de galactose sob condições apropriadas para transferir a referida galactose para o referido peptídeo.
29. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (d) colocar em contato o produto da etapa (a) com uma porção que reage com o referido grupo de modificação, dessa forma formando um conjugado entre o referido grupo de ligação glicosila intacto e a referida porção.
30. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (e) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com N-acetilgalactosamina transferase e um doador GalNAc sob condições apropriadas para transferir GalNAc para o referido peptídeo.
31. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (f) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com endo-N-acetilgalactosaminidase, o qual opera sinteticamente, e um doador GalNAc sob condições apropriadas para transferir GalNAc para o referido peptídeo.
32. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato do referido grupo de modificação ser um elemento selecionado dentre um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
33. Processo para formar um conjugado entre um peptídeo e um grupo de modificação, caracterizado pelo fato de que o referido grupo de modificação é ligado covalentemente ao referido peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, referido peptídeo é um elemento selecionado a partir de interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, beta- glicosidase, ativador de plasminogênio de tecido, uroquinase, anti-fator de necrose tumoral alfa, DNAse recombinante, fusão de fator de necrose tumoral/IgG, anti-HER2 quimérico, anti-RSV F e anti-CD-20, o referido peptídeo compreendendo uma porção de glicosila que é um elemento selecionado a partir de:
Figure img0091
Figure img0092
em que a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u e z são elementos independentemente selecionados dentre 0 e 1; R é um elemento selecionado a partir do referido grupo de modificação, manose ou oligomanose; e R’ é um elemento selecionado de H, uma glicosila, um grupo de modificação ou um grupo glicoconjugado; (i) quando o referido peptídeo é um elemento selecionado a partir de interferon-beta, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, uroquinase e DNAse recombinante, a referida porção de glicosila tem uma estrutura de acordo com a Fórmula 1, quando o referido peptídeo é hormônio de estimulação de folículo, referida porção de glicosila tem uma estrutura de acordo com a Fórmula 2, quando o referido peptídeo é ativador de plasminogênio de tecido, referida porção de glicosila tem uma estrutura de acordo com a Fórmula 3, e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dentre os inteiros entre 0 e 6; (ii) quando o referido peptídeo é um elemento selecionado a partir de anti-CD-20, e anti-HER2 quimérico, referida porção de glicosila tem uma estrutura de acordo com a Fórmula 1, quando o referido peptídeo é um elemento selecionado a partir de fusão de fator de necrose tumoral/IgG, anti-RSV F, referida porção de glicosila tem uma estrutura de acordo com a Fórmula 4, e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dentre os inteiros entre 0 e 4; (iii) quando o referido peptídeo é um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, ativador de plasminogênio de tecido, uroquinase e DNAse recombinante, j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dentre os inteiros entre 0 e 100; (iv) quando o referido peptídeo é fusão de fator de necrose tumoral/IgG, j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dentre 0 e 1; (v) quando o referido peptídeo é anti-HER2 quimérico, j, k e l são elementos independentemente selecionados dentre 0 e 1; m é selecionado dentre os inteiros de 0 a 20; (vi) quando o referido peptídeo é um anti-fator de necrose tumoral alfa, j, k, l e m são elementos independentemente selecionados dentre 0 e 20; (vii) quando o referido peptídeo é um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, β-glicosidase, anti-HER2 quimérico, fusão de fator de necrose tumoral/IgG, anti-RSV F, anti-CD-20, uroquinase, anti-fator de necrose tumoral alfa e DNAse recombinante, n, v, w, x e y são 0; (viii) quando o referido peptídeo é um ativador de plasminogênio de tecido, v, w, x e y são independentemente selecionados dentre 0 e 1; referido processo compreendendo: (a) quando o referido peptídeo é um elemento selecionado a partir de hormônio de estimulação de folículo, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, uroquinase, anti-fator de necrose tumoral, DNAse recombinante, fusão de fator de necrose tumoral/IgG, anti-HER2 quimérico, anti-RSV F, e anti-CD-20, colocar em contato o referido peptídeo com um elemento selecionado dentre uma glicosiltransferase e um doador de glicosila modificada compreendendo um grupo de modificação que é ligado covalentemente a uma porção de glicosila que é um substrato para a referida glicosiltransferase, sob condições apropriadas para a formação do referido grupo de ligação glicosila intacto; ou quando o referido peptídeo é um interferon-beta, colocar em contato o referido peptídeo com um elemento selecionado dentre uma glicosiltransferase e uma trans- sialidase; e um doador de glicosila modificada, compreendendo um grupo de modificação o qual é ligado covalentemente a uma porção de glicosila que é um substrato para a referida glicosiltransferase, sob condições apropriadas para a formação do referido grupo de ligação glicosila intacto; ou quando o referido peptídeo é um interferon-gama, colocar em contato o referido peptídeo com um elemento selecionado dentre uma glicosiltransferase e uma galactosidase operando sinteticamente; e um doador de glicosila modificada o qual compreende um grupo de modificação que é ligado covalentemente a uma porção de glicosila que é um substrato para a referida glicosiltransferase, sob condições apropriadas para a formação do referido grupo de ligação glicosila intacto; ou quando o referido peptídeo é um ativador de plasminogênio de tecido, colocar em contato o referido peptídeo com um elemento selecionado dentre uma glicosiltransferase e uma glicosidase operando sinteticamente; e um doador de glicosila modificada compreendendo um grupo de modificação o qual é covalentemente ligado a uma porção de glicosila que é um substrato para a referida glicosiltransferase, sob condições apropriadas para a formação do referido grupo de ligação glicosila intacto.
34. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (b) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo, que é um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, ativador de plasminogênio de tecido, uroquinase e DNAse recombinante, com uma sialidase sob condições apropriadas para remover ácido siálico do referido peptídeo.
35. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (c) colocar em contato o produto da etapa (a), que é um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, inibidor de alfa- 1-protease, beta-glicosidase, ativador de plasminogênio de tecido, uroquinase e DNAse recombinante, com uma porção que reage com o referido grupo de modificação, formando, dessa forma, um conjugado entre o referido grupo de ligação glicosila intacto e a referida porção.
36. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (d) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo, que é um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, ativador de plasminogênio de tecido, uroquinase e DNAse recombinante, com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
37. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (e) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo, que é um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, inibidor de alfa-1-protease, beta-glicosidase, ativador de plasminogênio de tecido, anti-HER2, anti-fator de necrose tumoral alfa, fusão de fator de necrose tumoral/IgG, uroquinase e DNAse recombinante, com uma endoglicanase sob condições apropriadas para remover uma porção de glicosila do referido peptídeo.
38. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, beta-glicosidase, ativador de plasminogênio de tecido, inibidor de alfa-1-protease, uroquinase e DNAse recombinante, referido processo compreendendo ainda: (f) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com N-acetilglicosamina transferase e um doador GlcNAc sob condições apropriadas para transferir GlcNAc ao referido peptídeo.
39. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, interferon-gama, beta-glicosidase, anti-CD-20, anti-RSV F, anti-HER2, fusão de fator de necrose tumoral/IgG, anti-fator de necrose tumoral alfa, ativador de plasminogênio de tecido, uroquinase e DNAse recombinante, compreendendo ainda: (g) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com um galactosil transferase e um doador de galactose sob condições apropriadas para transferir galactose ao referido peptídeo.
40. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (h) antes da etapa (b), em que o referido peptídeo é um elemento selecionado dentre interferon-beta, hormônio de estimulação de folículo, anti-RSV F e anti-CD-20, colocar em contato o referido peptídeo com endoglicanase sob condições apropriadas para retirar uma porção de glicosila do referido peptídeo.
41. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado dentre interferon-beta, anti-CD-20 e inibidor de alfa-1-protease, compreendendo ainda: (1) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com uma manosidase sob condições apropriadas para remover manose do referido peptídeo.
42. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado dentre interferon-beta, interferon-gama, hormônio de estimulação de folículo, ativador de plasminogênio de tecido, uroquinase e DNAse recombinante, compreendendo ainda: (j) colocar em contato o produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico sob condições apropriadas para transferir ácido siálico ao referido produto.
43. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado dentre um ativador de plasminogênio de tecido e um inibidor de alfa-1-protease, compreendendo ainda: (k) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com um elemento selecionado dentre uma manosidase, uma xilosidase, uma hexosaminidase e combinações das mesmas sob condições para remover um resíduo de glicosila do referido peptídeo.
44. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do referido peptídeo FSH compreender ainda: (1) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo FSH com uma galactosidase sob condições apropriadas para remover galactose do referido peptídeo FSH.
45. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um anti-CD20 compreendendo ainda: glicosiltransferase, que é galactosiltransferase, e o referido doador de glicosila modificada, que é um doador de galactosil modificado.
46. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do referido grupo de modificação ser um elemento selecionado dentre um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
47. Processo para formar um conjugado entre um peptídeo e um grupo de modificação, caracterizado pelo fato de que o referido grupo de modificação é ligado covalentemente ao referido peptídeo através de um grupo de ligação glicosila intacto, o referido peptídeo é um elemento selecionado dentre interferon-alfa, fator VIIa, fator IX, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, fator VIII, anticorpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa, insulina, antígeno de superfície de hepatite B, hormônio de crescimento humano, referido peptídeo compreendendo uma porção de glicosila que é um elemento selecionado a partir de:
Figure img0093
Figure img0094
em que a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, aa, bb, cc, dd, ee, ff e gg são elementos independentemente selecionados dentre 0 e 1; v, w, x, y, e z são 0; (i) quando o referido peptídeo for interferon-alfa, a referida porção de glicosila possui uma estrutura de acordo com a Fórmula 1; (ii) quando o referido peptídeo for fator VIIa, a referida porção de glicosila possui uma estrutura de acordo com a Fórmula 2; (iii) quando referido peptídeo for um elemento selecionado dentre fator IX e eritropoietina, a referida porção de glicosila possui uma estrutura de acordo com a Fórmula 3; (iv) quando referido peptídeo for um elemento selecionado dentre anticorpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa, insulina e hormônio de crescimento humano, a referida porção de glicosila possui uma estrutura de acordo com a Fórmula 4; e (v) quando referido peptídeo for um elemento selecionado dentre fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, fator VIII e antígeno de superfície de hepatite B, a referida porção de glicosila possui uma estrutura de acordo com a Fórmula 5, quando o referido peptídeo for um elemento selecionado dentre interferon-alfa, fator VIIa, fator IX, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, fator VIII e antígeno de superfície de hepatite B, e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dentre os inteiros de 0 a 6, e quando o referido peptídeo for um elemento selecionado dentre eritropoietina, insulina, anti-glicoproteína IIb/IIIa e hormônio de crescimento humano, e, f, g e h são elementos independentemente selecionados dentre os inteiros de 0 a 4; quando o referido peptídeo for um elemento selecionado dentre interferon-alfa, fator VIIa, fator IX, eritropoietina, fator VIII, insulina, hormônio de crescimento humano, j, k, l, e m são elementos independentemente selecionados dentre os inteiros de 0 a 20; quando o referido peptídeo for selecionado dentre fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito e antígeno de superfície de hepatite B, j, k, l, e m são elementos independentemente selecionados dentre os inteiros de 0 a 100; quando o referido peptídeo for selecionado a partir de anti-glicoproteína IIb/IIIa e insulina, j, k, l, e m são independentemente selecionados dentre os inteiros 0 e 1; R’ é um elemento selecionado a partir de H, um resíduo de glicosila, um grupo de modificação e um glicoconjugado; R é um elemento selecionado a partir de um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose; e quando o referido peptídeo for um fator VIIa, R é um elemento selecionado a partir de um grupo de modificação, uma manose ou uma oligomanose, sialyl Lewisx e sialyl Lewisa, referido processo compreendendo: (a) quando referido peptídeo for um elemento selecionado dentre fator VIIa, fator VIII, fator IX, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, anticorpo monoclonal anti- glicoproteína IIb/IIIa, insulina, antígeno de superfície de hepatite B, hormônio de crescimento humano, colocar em contato o referido peptídeo com uma glicosil-transferase, e um doador de glicosila modificada compreendendo um grupo de modificação que é covalentemente ligado a uma porção de glicosila que é um substrato para a referida glicosil- transferase, sob condições apropriadas para a formação do referido grupo de ligação de glicosila intacto; ou quando o referido peptídeo for interferon-alfa, colocar em contato o referido peptídeo com um elemento selecionado dentre uma glicosiltransferase, uma endo- acetilgalactosaminidase, operando sinteticamente, e uma trans-sialidase; e um doador de glicosila modificada compreendendo um grupo de modificação que é covalentemente ligado a uma porção de glicosila que é um substrato para a referida glicosiltransferase, sob condições apropriadas para a formação do referido grupo de ligação glicosila intacto.
48. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (b) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo, que é um elemento selecionado dentre interferon- alfa, fator VIIa, fator IX, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, fator VIII, anticorpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa, insulina, antígeno de superfície de hepatite B e hormônio de crescimento humano, com uma sialidase sob condições apropriadas para remover ácido siálico do referido peptídeo.
49. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (c) colocar em contato o produto da etapa (a), que é um elemento selecionado dentre interferon-alfa, fator IX, eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, fator VIII, anticorpo monoclonal anti- glicoproteína IIb/IIIa e antígeno de superfície de hepatite B, com uma porção que reage com o referido grupo de modificação, formando, assim, um conjugado entre o referido grupo de ligação glicosila intacto e a referida porção.
50. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (d) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo, que é um elemento selecionado dentre um fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito e interferon- alfa, com uma combinação de uma glicosidase e uma sialidase.
51. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (e) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo, que é um elemento selecionado dentre interferon- alfa, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, fator VIII, anticorpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa, antígeno de superfície de hepatite B e hormônio de crescimento humano, com uma endoglicanase sob condições apropriadas para remover uma porção de glicosila do referido peptídeo.
52. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado dentre eritropoietina, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, fator VIII, anticorpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa, antígeno de superfície de hepatite B, interferon-alfa e insulina, referido processo compreendendo ainda: (f) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com N-acetilglicosamina transferase e um doador GlcNAc sob condições apropriadas para transferir GlcNAc ao referido peptídeo.
53. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado dentre interferon-alfa, fator VIIa, fator VIII, fator IX, eritropoietina, anticorpo monoclonal anti- glicoproteína IIb/IIIa, antígeno de superfície de hepatite B e hormônio de crescimento humano, compreendendo ainda: (g) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com um galactosil transferase e um doador de galactose sob condições apropriadas para transferir galactose ao referido peptídeo.
54. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de compreender ainda: (h) depois da etapa (g), colocar em contato o referido peptídeo, que é um elemento selecionado dentre fator VIII, fator IX, fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, eritropoietina, antígeno de superfície de hepatite B e anticorpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa, com ST3Gal3 e um doador de ácido siálico sob condições apropriadas para transferir uma porção de ácido siálico ao referido peptídeo.
55. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado a partir de um fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito, fator VIII, antígeno de superfície de hepatite B e interferon-alfa, compreendendo ainda: (1) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com uma manosidase sob condições apropriadas para remover manose do referido peptídeo.
56. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado a partir de fator VIIa, compreendendo ainda: (j) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com uma galactosidase sob condições apropriadas para remover galactose do referido peptídeo.
57. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado a partir de interferon-alfa, fator VIIa, fator VIII, fator IX, eritropoietina, anticorpo monoclonal anti- glicoproteína IIb/IIIa, insulina, antígeno de superfície de hepatite B e hormônio de crescimento humano, compreendendo ainda: (k) colocar em contato o produto da etapa (a) com uma sialiltransferase e um doador de ácido siálico sob condições apropriadas para transferir ácido siálico ao referido produto.
58. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um elemento selecionado dentre eritropoietina e anticorpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa, compreendendo ainda: (1) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com uma galactosidase operando sinteticamente sob condições apropriadas para adicionar galactose ao referido peptídeo.
59. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser insulina, compreendendo ainda: (m) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo com Endo-H sob condições apropriadas para remover uma porção de glicosila do referido peptídeo.
60. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser hormônio de crescimento humano, compreendendo ainda: (n) antes da etapa (a), colocar em contato o referido glicopeptídeo com uma galactosidase sob condições apropriadas para remover um resíduo de glicosila do referido glicopeptídeo.
61. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido peptídeo ser um antígeno de superfície de hepatite B, compreendendo ainda: (o) antes da etapa (a), colocar em contato o referido peptídeo que é um antígeno de superfície de hepatite B com uma galactosidase sob condições apropriadas para remover um resíduo de glicosila do referido peptídeo que é um antígeno de superfície de hepatite B.
62. Processo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato do referido grupo de modificação ser um elemento selecionado dentre um polímero, uma toxina, um radioisótopo, uma porção terapêutica e um glicoconjugado.
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