KR20060034216A - 응고 인자의 흡입에 의한 혈우병 치료 - Google Patents

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로버트 지. 스카우브
앤드류 제이. 도르네르
데이비드 케이. 공
제인 이. 하스테드트
찬드라 에이. 웨브
제임스 씨. 주니어. 케이쓰
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넥타르 테라퓨틱스
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Abstract

응고 인자의 흡입에 의한 혈우병 치료. 건성 분말 인자 IX는 4 ㎛ 이하의 중량 평균 공기동력학적 직경으로 분무화되며, 적어도 90% 단량체 함량, 적어도 80% 활성 수준, 10% 이하의 수분을 보유한다. 상기 에어로졸은 폐에 천천히 깊게 흡입되고, 이후 최대로 방출된다.
혈우병

Description

응고 인자의 흡입에 의한 혈우병 치료{Hemophilia Treatment by Inhalation of Coagulation Factors}
본 발명은 응고 인자의 흡입에 의한 혈우병 치료에 관한다.
전세계적으로 대략 450,000명의 환자가 “혈우병”으로 알려져 있는 출혈성 질환을 안고 살아가고 있다. 혈우병은 혈액에서 한가지이상 응고 인자의 결핍으로 발병하는데, 이들 응고 인자의 결핍은 장기적인 출혈을 유발한다. 가벼운 타박상도 내부 출혈을 유발할 수 있다. 심한 경우에, 내부 출혈은 명확한 원인 없이 시작되어, 관절과 조직으로 확산될 수 있다. 일반적으로, 부종과 내부 통증이 발생하는데, 혈우병 환자는 평생동안 이런 고통에 시달리게 된다. 3가지 유형의 혈우병이 존재하는데, 이들 각각은 응고 캐스케이드에서 상이한 단백질의 돌연변이에 기인한다.
혈우병 A(고전적 혈우병)는 혈우병의 가장 일반적인 유형이며, 선천성 인자 결핍 환자의 대략 80%에서 발병한다. 이는 X 크로모좀에서 운반되는 DNA 결함에 의해 발병하고, 인자 VIII의 결핍을 유발한다. 적절한 수준의 인자 VIII를 생산하는 데에는 하나의 정상적인 X 크로모좀이 필요하다. 이런 이유로, 거의 모든 환자가 남성이다. 대부분의 경우에 이런 결함성 유전자는 여러 세대에 걸쳐 전달되지만, 대략 20%의 경우에는 결함이 자발적 돌연변이에 의해 발생한다.
혈우병 B(크리스마스 병)는 혈우병 증례의 12% 내지 15%를 차지하고, 응고 인자 IX의 결핍에 의해 발병한다. 혈우병 A와 유사하게, 혈우병 B는 X 크로모좀상의 유전된 결함에 연관되고, 일반적으로 보균자 모체의 남아에게 영향을 준다.
인자 XI 결핍은 선천성 인자-결핍 상태 환자의 2% 내지 5%를 차지한다. 이는 응고 인자 XI의 결핍에 의해 발병하지만, 혈우병 A와 B와 달리, X 크로모좀 이외의 크로모좀에서 유전되고 남아와 여아 모두에게 전달될 수 있다. 본 윌렌브랜드 병(Von Willenbrand Disease)은 남성과 여성 모두에서 우성인 다른 형태의 혈우병이다. 드물긴 하지만 다른 인자, 예를 들면, 인자 V, X, XIII가 결핍되는 형태 역시 일부 존재한다.
이들 혈우병 환자에 대한 현재의 치료법은 출혈, 또는 출혈 현상에 대한 “수요(on-demand)”를 예방하기 위하여 예방적으로 제공되는 응고 인자의 정맥내(IV) 투여로 구성된다. 치료는 병원이나 가정에서 수행될 수 있지만, 정맥 접근을 확립하는 능력의 부재는 어떤 장소에서든 치료를 매우 어렵게 할 수 있다. 응고 인자의 혈관외(extravascular) 투여는 이런 어려움을 우회할 수 있다. 피하(SC), 근육내(IM), 복강내(IP) 투여 경로는 치료 수준을 달성하지만, 전달에 전형적으로 주사기가 필요하다(1).
흡입 요법은 치료 수준이 기도로부터 전신 순환계로 도달할 수 있다면, 응고 인자에 대한 “주사-없는”투여 경로를 제공하게 된다. 호흡기는 위장관에서 단백분해에 저항할 수 없는 단백질 또는 펩티드의 전신 전달을 위하여, 또는 IV, SC, IM 또는 IP 경로에 대한 대안으로서 매력적인 경로이다. 혈우병의 치료에서, 기도는 여러 이점을 제공한다. 첫째, 흡입에 의해 투여된 응고 인자가 폐 상피와 전신 순환계 사이에 상대적으로 짧은 거리를 이동한다. 둘째, 작아진 기도와 폐포(alveoli)가 고도 투과성과 흡수성 막으로 구성된 대규모 표면적을 보유한다. 셋째, 폐포가 거대 혈관상(vascular bed)을 보유하는데, 이를 통하여 분당 수 ℓ의 혈액이 유동한다. 넷째, 폐가 상대적으로 낮은 효소 활성과 기도 점막을 보유하고, 폐포의 얇은 표면활성제 수층이 고농도의 프로테아제 저해물질을 함유한다(2). 이런 환경은 단백질의 분해 가능성을 감소시키고, F.IX, F.VIII, F.XI와 같은 단백질이 전신 순환계로 이동하는 동안 분해로부터 적어도 부분적으로 보호될 수 있도록 한다(2, 3).
기도 내에서 에어로졸 단백질의 침착 부위를 정의하는데 가장 중요한 모수는 에어로졸의 입자 특성이다. 에어로졸 액적(droplet)의 행태는 이들의 “중량 평균 공기동력학적 직경”(mass median aerodynamic diameter, MMAD)에 좌우되는데, 상기 직경은 입자 크기, 형태, 밀도, 전하의 함수이다. 기도 내에서 모든 속도 역시 중요한 속성이다.
입자의 MMAD의 엄격한 조절은 기도의 원하는 영역 내에서 에어로졸 침착과 체류의 재현성을 담보한다. 폐 전체에 충분한 분산은 1 내지 5 ㎛의 공기동력학적 직경을 갖는 입자를 요한다. 매우 작은 입자(<1 ㎛)는 정상적인 평상 호흡(normal tidal breathing) 동안 배출된다. 3 ㎛ 입자는 폐포 영역을 표적하고, 6 ㎛ 이상의 입자는 구강인두(oropharynx)에 침착된다.
대부분의 질환에서 최적 관리는 치료 화합물의 정확한 투약을 요한다. 폐 약물 투여는 전달 장치에 엄격한 요구 조건을 강제하는데, 그 이유는 분말 또는 액적의 입자 크기가 전달 부위에 상당한 영향을 주고, 따라서 폐로부터 약물의 흡수 수준에 영향을 주기 때문이다.
폐 약물 전달을 위하여 현재 가용한 대부분의 장치는 예로써 천식에서 공기 전달 통로에서 약물의 국소 효과를 달성하기 위하여 개발되었다. 이들 장치는 분무기, 계량된-분량 흡입기(MDI), 건조-분말 흡입기(DPI) 등이다.
생물의약품의 투여에 흡입 분무기의 이용은 많은 단점을 안고 있다. 이들 약물은 수용액에서 매우 불안정하고, 쉽게 가수분해된다. 이에 더하여, 분무화 과정은 화합물에 높은 전단력을 가하여 단백질 변성을 초래할 수 있다. 이는 생성된 액적의 99%가 저장소로 재순환되어 차기 투약동안 분무화된다는 점에서, 특히 문제가 된다(6). 게다가, 분무기에 의해 생성된 액적은 이질성인데, 이는 하부 기도로의 약물 전달이 불량하다. MDI에서 단백질 용액을 분무화하는데 이용되는 추진제(클로로플루오르카르본 및 하이드로플루오르알칸) 역시 단백질 변성의 원인이 될 수 있다.
분무기와 MDI에 대한 유망한 대안은 DPI인데, 이는 건조 형태로 단백질을 전달한다. MDI와 유사하게, 현재 승인된 대부분의 DPI는 천식과 만성 폐쇄성 폐 질환에 대한 국소 작용 약물, 예를 들면, 항-천식제의 폐 약물 투여용으로 제조된다.
흡입 투여 경로에 의한 전신 치료에서 많은 노력이 당뇨병에 집중되고 있다. 최근까지, 연구자들은 비침입성으로 전달된 인슐린이 현실적인 임상적 방식을 제공 하기에는 생체이용효율이 너무 낮다고 생각하였다. 하지만, 여러 증거에서 흡입된 인슐린은 주사된 인슐린에 대한 효과적이고 잘-관용되는 비침입성 대안으로 제안되었으며, 인슐린의 흡입 요법이 3기 임상 시험중에 있다.
인슐린은 단일 유전자로부터 기원하는 알파와 베타 아단위로 구성된다. 생리조건하에 고유 인슐린이 대략 31.2-32.8 KD의 헥사머로 존재하긴 하지만, 기능성 재조합 효소는 대략 5.9-6.9 KD이다. 이런 이유로, 인슐린은 매우 작은 단백질인데, 이는 흡입 전달에서 인슐린의 성공을 설명한다. 흡입 요법으로 전달되는 다른 대사 호르몬 역시 소형이다: 칼시토닌(35KD), HGH(22 KD), TSH 알파(13 KD), TSH 베타(15-16 KD), FSH(36 KD), 소파모트스타틴(2 KD). 헤파린(20 KD) 역시 항-응고제로서 흡입 전달을 검사하였다. 생체이용효율의 정도는 크기 이외에, 폐에서 가수분해 효소에 대한 치료 단백질의 취약성에도 좌우된다. 대형 분자는 성공적으로 분무화시키고 전달하고 흡입하는데 있어 어려움으로 인하여 흡입 요법에 관한 연구가 거의 진행되지 않았다.
현재까지, 응고 단백질은 대형 크기 및 용액에서 극도의 불안정성으로 인하여 폐 전달에 성공한 사례가 없다. 당화된 인자 IX는 55 KD이고, 인자 VIII은 200 KD이고, 인자 XI는 140-150 KD이기 때문에, 이들 단백질은 상기한 단백질보다 훨신 크다. Gupta(29)는 응고 인자의 폐 전달을 시도하였지만, 분무화동안 인간 인자 IX가 변성되는 것을 발견하고, 이런 현상이 분무기에 의해 강제되는 전단력 또는 상기 과정 동안 발생된 대형 공기물계면(air water interface)에 기인한다고 가정하였다.
본원에 기술된 발명 때까지, 인자 IX와 같은 대형의 민감한 단백질의 분무화와 폐 시스템으로 전달에 성공한 사례는 없다. 더 나아가, 현재까지, 흡입 요법으로 혈우병을 성공적으로 치료한 사례는 없다.
본 발명의 요약
본 발명은 분무화된 인자 IX(F.IX)로 혈우병을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 분무화된 F.IX는 2 내지 4 ㎛의 중량 평균 공기동력학적 직경(MMAD), 적어도 50%의 3.3 ㎛ 미만 미세 입자 분획 비율(FPF%<3.3 ㎛)을 보유하고; 적어도 80% 단량성 단백질이며, 여기서 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도 80%이고; 20%(wt/wt) 미만의 수분을 보유하는 건조 분말이다; 에어로졸은 천천히 최대로 흡입하여 F.IX를 심부 폐 조직에 침착시키고, 이후 최대 배출한다.
흡입된 F.IX는 흡입 투여이후 일정 기간동안 폐에 체류하는 보이기 때문에, 상기 방법은 출혈 현상에 앞서 혈우병성 출혈의 예방적 치료에도 적용된다. 따라서, F.IX의 주 간격 또는 2주 간격 적용은 잔류 효과(depot effect)를 유도하여, 투여이후 2-4일 시점에도 출혈을 예방할 만큼 충분한 F.IX가 잔류하게 된다. 따라서, 주 간격 또는 2주 간격 적용은 예방적이다.
바람직한 구체예에서, MMAD는 2 내지 5 ㎛, 2.8 내지 3.6 ㎛, 또는 3-3.5 ㎛이고, FPF%<3.3 ㎛은 적어도 60% 또는 64%이고, 단량체 함량은 적어도 95% 또는 97%이다. 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도 85%, 바람직하게는 90 또는 95%이다. 수분 함량은 10 또는 5% 정도로 낮다. 더욱 바람직한 방법에서, F.IX는 알코올 없이 분무화되는데, 그 이유는 스프레이 건조된 분말의 장기 보관에 알코올이 부정적인 영향을 주는 것으로 생각되기 때문이다. 또한, 재조합 F.IX의 이용이 선호된다.
바람직한 구체예에서, 표면 활성 이중- 또는 삼중-펩티드가 부형제로 이용된다. 본 발명에 이용되는 이중-루이실 보유 삼중펩티드는 화학식, X-Y-Z를 보유하는 삼중펩티드인데, 여기서 적어도 X와 Y 또는 X와 Z는 루이실 잔기이다. 이중- 또는 삼중-루이신 부형제가 특히 바람직한데, 여기서 이중- 또는 삼중-루이신/F.IX 비율은 대략 0.5-1.5wt/wt 또는 45/40 wt/wt이다.
분무화된 F.IX의 조성물 및 미세 건조 F.IX를 포함하는 블리스터 팩 역시 본 발명의 범주에 속한다.
“단일 아미노산” 또는 펩티드의 아미노산 성분으로 존재하는 “루이신”은 라세미 혼합물, 또는 D- 또는 L-형태뿐만 아니라 루이신의 변형된 형태(즉, 루이신의 하나이상 원자가 다른 원자 또는 기능기로 치환된 형태)인 아미노산 루이신을 의미하는데, 여기서 변형된 아미노산 또는 펩티드의 분산-강화 효과는 변형되지 않은 물질의 분산-강화 효과와 별다른 차이가 없다.
“이중펩티드”는 2개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 의미한다. “삼중펩티드”는 3개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 의미한다.
“표면 활성” 물질은 표면 활성(예로써, 표면 장력측정법(surface tensiometry)으로 측정됨)을 보유하고, 용해되는 액체의 표면 장력을 감소시키는 능력으로 특성화되는 물질이다. 액체와 다른 상 사이의 계면과 연관된 표면 장력은 표면 분자가 내향 유인을 보이는 액체의 특성이다.
“건조 분말”은 특정 제형에 따라, 전형적으로 대략 20% 미만의 수분, 바람직하게는 대략 10% 미만의 수분, 더욱 바람직하게는 대략 5-6%의 수분, 가장 바람직하게는 대략 3% 미만의 수분을 함유하는 분말 조성물이다.
“폐 전달에 적합한” 건조 분말은 (i) 흡입 장치에 의해 쉽게 분산되고 (ii) 개체에 흡입되어 입자의 일부가 폐에 도달할 수 있는 고체를 함유하는 조성물을 의미한다. 이런 분말은 “흡입가능”한 것으로 간주된다. “분무화된” 입자는 가스 흐름으로 분산될 때, 입자의 적어도 일부가 환자에 의해 흡입되고 이들 입자의 일부가 폐에 도달할 만큼 충분한 시간동안 가스에서 부유 상태로 잔류하는 입자이다.
도 1. 정맥내 또는 기관지내 제공된 rF.IX의 단일 투약이후 혈우병 B 개에서 F.IX 활성. IV 제공된 rF.IX(200 IU/㎏)는 F.IX 활성에서 즉각적인 이상성 반응을 유도하였다. IT 제공된 rF.IX(200 또는 1000 IU/㎏)는 개시가 지연되어 8시부터 검출가능한 F.IX 활성 수준을 유도하였다. F.IX 활성은 IV 투약과 양 IT 투약에서 적어도 72시간동안 검출되었다. 200과 1000 IU/㎏ IT 투여는 200 IU/㎏ IV 투여에서 달성되는 것보다 낮은 유사한 치료 수준을 달성하였다. 각 데이터 지점은 2마리 개로부터 데이터를 나타내는 IV 군에서 18시 시점을 제외하고, 3마리 개로부터 계산된 평균± 표준 편차를 나타낸다.
도 2. 정맥내 또는 기관지내 제공된 rF.IX의 단일 투약이후 혈우병 B 개에서 F.IX 항원. 상기 F.IX 항원은 검출 기간이 좀더 짧아 보인다는 점을 제외하고, 도 1에 도시된 활성 분석 결과를 본질적으로 반영한다. 이런 짧아진 지속 기간은 아마도 상기 분석의 감도에 기인한다.
도 3. 혈우병 B 개에 200 IU/㎏ 또는 1000 IU/㎏의 기관지내 투여이후 흡수된 rF.IX의 누적 총량. 200 IU/㎏과 1000 IU/㎏ IT 투약군에서 시간에 따라 흡수된 누적량은 유사하게 나타난다. 흡수된 rF.IX의 총량은 200 IU/㎏과 1000 IU/㎏ IT 군에서 각각 대략 21 IU/㎏과 37 IU/㎏이다. 이들 데이터는 두 투약군 사이에 흡수량에서 비-비례적 증가와 일치한다(도 4 참조).
도 4. 200 IU/㎏ 또는 1000 IU/㎏을 기관지내 섭취한 혈우병 B 개에 투여된 전체 용량의 비율로서 흡수된 rF.IX의 누적량. 해체 분석(deconvolution assay)으로 계산된 흡수된 총량의 비율은 200 IU/㎏과 1000 IU/㎏ 투약군에서 각각 대략 10.2%와 3.7%이었다.
도 5. Naive 혈우병 B 개에서 rF.IX 흡입이후 APTT 단축.
도 6. Naive 혈우병 B 개에서 rF.IX 흡입이후 WBCT 단축.
도 7. 흡입으로 rF.IX(50 IU/㎏)를 섭취한 토렐라이제이션(tolerization)된 혈우병 B 개(n=3)에서 평균 보정된 rF.IX 항원 농도 시간 곡선.
도 8. 항원 검사에 의한 측정에서, 토렐라이제이션된 혈우병 개(n=4)에서 흡입이후 흡수된 rF.IX의 누적량. 개는 C22(위쪽 라인 4), C20(라인 3), C25(라인 2), C26(아래쪽 라인 1)이다.
본 발명에 따른 구체예의 설명
본 발명은 인간 재조합 인자 IX에 관하여 예시한다. 하지만, 본 발명에서 획득된 지식은 대형 응고 인자, 예를 들면, F.VIII과 F.XI의 분무화에도 적용된다. 이들 인자는 F.IX보다 더욱 크며, 흡입 요법에 의한 투여가 더욱 어렵다. 하지만, 이들의 절두된 기능성 단편을 투여하는 것은 가능하다.
본 발명은 3.5 ㎛ 미만의 MMAD, 0.50 이상의 FPF, 95% 이상의 단량체 함량을 보유하는 건조 분무화된 응고 인자 분말의 흡입 요법으로 혈우병을 치료하는 방법을 제시한다.
실시예 1: 액체 인자 IX의 기관내 투여를 통한 혈우병의 치료
개념의 정립을 위하여, 혈우병 B 개 모델에 액체 인간 재조합 인자 IX(rF.IX)를 기관지내(IT) 침착시켰다. 액체 IT rF.IX가 생체이용효율을 보이면, 동일 모델 시스템에서 상기 단백질의 분무화된 건조 분말을 검사한다.
혈우병 B 개: University of North Carolina in Chapel Hill의 Francis Owen Blood Research Laboratory에서 폐쇄군(closed colony)으로부터 혈우병 B 개를 본 연구에 이용하였다. 이들 개에서 원인성 분자 결함은 인자 IX 분자의 촉매 도메인에서 미스센스 점 돌연변이(뉴클레오티드 1477에서 G → A)인데, 이는 순환 F.IX의 완전 부재를 유발한다(6). 이런 계통의 혈우병 B 개는 기능 검사에서 검출가능한 F.IX 활성 및 ELISA 또는 면역블랏에 의한 항원을 보유하지 않는다(7,8). 모든 동물은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(National Institutes of Health publication No. 85-23)에 따라 처리하였다. Institutional Animal Care and Use Committee는 모든 실험을 승인하였다.
인간 재조합 인자 IX(rF.IX): rF.IX는 기존 문헌(9-11)에 기술된 바와 같이, Genetics Institute, Inc., Andover, MA.(now Wyeth)에 의해 제조되었다. 상기 제조물은 12,500 IU/㎖의 F.IX 활성 및 대략 39 ㎎/㎖의 단백질 농도로 농축되었다. rF.IX는 투여 때까지 운반제 제형 완충액에서 -80℃에 보관하였다.
시험관내 실험: 9마리의 혈우병 B 개는 3가지 군에 무작위로 지정하였다: 200 IU/㎏(n = 3) 또는 1000 IU/㎏(n = 3) 기관지내 투여, 또는 200 IU/㎏ 정맥내 주입(n = 3). rF.IX가 기관지내 투여된 개는 프로포폴 또는 메데토미딘 하이드로클로라이드로 진정시키고, 필요한 경우에 과정동안 이소플루란(노즈 콘(nose cone)을 통하여 2-4%)로 마취의 수술면(surgical plane) 아래에 유지시켰다. 기관지내(IT) 투약을 위하여, 내시경을 좌측 또는 우측 기관세지(bronchial tree)에 삽입하였다. 7 French(~ 2 ㎜ 직경) 삼중 루멘 폐 동맥 카테터를 내시경 유도하에 적절한 기관지에 삽입하였다. 용량(1 ㎖ 용적)은 우측과 좌측 기관지에 균등하게 분배하고 대략 2분간 주입하였다. rF.IX 주입이후, 카테터는 2 ㎖의 0.9 % 염수를 흘러 보냈다. 비교 실험에서, 정맥내(IV) 용량을 2-3분간 요측피정맥(cephalic vein)에 일시 주사하였다.
샘플링 프로토콜: 혈액 샘플은 아래의 시점에서 rF.IX의 투여 전후에 채취하였다: 0, 5, 15, 30분 및 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 72시간. 전혈은 정맥천자(venipuncture)로 채혈하고, 4% 구연산나트륨에서 1:8 항응고제:전혈의 최종 농도로 수집하였다. 혈장은 준비하고 분석 때까지 -80℃에서 동결하였다. 항-F.IX 항 체 역가를 위한 혈청 샘플은 rF.IX 투여이전 및 투여이후 5, 10, 15, 28일 시점에 채취하였다. 전혈 응고 시간을 수행하기 위한 전혈은 처리 2시간후에, 각 군에서 선택된 개로부터 수득하였다. 전혈구 검사(complete blood count, CBC)는 rF.IX 처리이전 및 처리이후 48-72시간 시점에 개에서 수행하였다. 흉부 방사선사진은 IT 군의 개에서 동일 시점에서 획득하였다. 연구 종결 시점에서, 개들은 과량의 펜토발비톨로 죽이고 부검을 수행하였다.
전혈 응고 시간(WBCT): WBCT는 기존 문헌(7,13-15)에 기술된 바와 같이 수행하였다. WBCT는 전형적으로, Chapel Hill 콜로니의 처리되지 않은 혈우병 B 개에서 50분 이상이다(14,15). 상기 콜로니의 정상적인 건강한 개에서 WBCT에 대한 참고 범위는 8 내지 12분이다. WBCT는 IT 군으로부터 선택된 3마리 개에서 처리이후 2시간 시점에 측정하였다. 이는 200 IU/㎏ IT 투여된 1마리 개에서 23.5분으로 단축되었고, 1000 IU/㎏ IT 투여된 2마리 개중에서 1마리에서 21.5분으로 단축되었다. IV 군의 전체 3마리 개에서 WBCT는 처리이후 2시간 시점에서 분석하는 경우에 9.5분으로 보정되었다.
F.IX 활성: F.IX 응고 활성은 Multi-Discrete Analyzer 180(MDA-180, ORGANON TEKNIKA™, Durham, NC)에서 변형된 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(Activated Partial Thromboblastin Time, APTT) 검사를 이용하여 측정하였다(4). 대조 표준은 1 IU의 rF.IX를 함유하는 1 ㎖의 합쳐진 F.IX-결핍성 개 혈장으로부터 준비된 희석액으로 구성되었다.
F.IX 활성(도 1)은 rF.IX의 주입이전에는 개에서 검출되지 않았다. IT 투여 이후, F.IX 활성은 주입이후 8시간 시점에 검출되었고 72시간 시점에도 여전히 측정되었다. 두 IT 용량 사이에 혈장 수준에서 차이는 거의 관찰되지 않았다. rF.IX의 정맥내 투여는 이전 연구(4)에서 보고된 바와 같이 즉각적인 이상성 반응을 유도하였다. F.IX 활성은 주입이후 5분에서부터 72시간 시점까지 검출되었고, 최대 활성은 IV 투여에 의해 도달되었다.
F.IX 항원 농도: F.IX 항원 농도는 이중 단클론 항체 샌드위치 효소 결합된 면역흡착 검사(ELISA)를 이용하여 측정하였다(12). 본 연구에서 ELISA의 하한은 ~38 ng/㎖이었다. 한계 미만의 모든 수치는 1 ng/㎖ 이하로 추정하였다.
F.IX 항원 농도(도 2)는 3가지 모든 군에서, F.IX 활성에서 관찰되는 바와 유사한 패턴을 따랐다. F.IX 항원은 IV 군에서 첫 번째 혈액 샘플(5분)에서 검출되었지만 양 IT 군에서는 8시 때까지 검출되지 않았다. 예상된 바와 같이, 최대 검출가능 항원 농도는 IV 군에서 관찰되었다.
약력학적 분석: 약력학적 분석은 IV와 IT 군에 대한 활성 시간 데이터에서 수행하였다. 2가지 구획 모델(WinNonlin, PHARSIGHT CORP.™, Mountain View CA)은 IV 데이터를 최적으로 설명하고(모델 8), 지연 시간(lag time)을 포함하는 1 구획 모델은 IT 데이터를 최적으로 설명한다(모델 4). 또한, 흡수 속도와 크기를 이해하기 위하여 이들 데이터에 수치 해체 분석을 수행하였다(16).
IV 군에 대한 두 IT 군을 비교하는 표 1에서는 최대 평균 최고 혈장 농도 (Cmax)가 IV 투여이후에 나타난다는 것을 보여준다(157.3± 29.3 IU/dl). 200 IU/㎏과 1000 IU/㎏ IT 군에서 Cmax에 대한 평균값은 각각 4.7± 0.5 IU/dl과 6.5± 0.5 IU/dl이었다. IV 투여이후 전체 노출(곡선하 영역; AUC0-∞)은 2716 +/- 164 IU/dLxhr이었다. 대조적으로, IT 투여이후 전체 노출은 200 IU/㎏과 1000 IU/㎏ IT 군에서 각각 306 +/- 20.8 IU/ dLxhr과 666 +/- 127 IU/dLxhr이었다. 평균 T1/2는 IV, 200 IU/㎏ IT, 1000 IU/㎏ IT 군에서 각각 24.2 ± 10.7, 30.7 ± 5.3, 46.4 ± 29.2시간이었다.
표 1. rF.IX의 IT 또는 IV 투여이후 약력학적 분석
군 Cmax Tmax T1/2 AUC 생체이용효율 %
200 IU/㎏ IT 4.7 ± 0.5 21.1 ± 3.4 30.7 ± 5.3 306 ± 20.8 11.3 ± 0.8
1000 IU/㎏ IT 6.5 ± 0.5 30.0 ± 6.3 46.4 ± 29.2 666 ± 127 4.9 ± 1.1
200 IU/㎏ IV 157.3 ± 29.3 -- 24.2 ± 10.7 2,716 ± 164 --
반감기는 F.IX 항원 곡선(도 2)보다 F.IX 활성 곡선(도 1)에서 더욱 긴 것으로 생각된다. 하지만, 이들 샘플은 동시에 제조되었다. F.IX ELISA는 38 ng/㎖의 민감도 역치(threshold sensitivity)를 보유하는 것으로 확인되었다. 활성 검사가 ELISA보다 더욱 민감하기 때문에, 활성 검사가 F.IX 제거의 더욱 정확한 표현이다. 최대 농도에 이르는 시간(Tmax, hours)은 두 IT 용량에서 유사하였다(각각, 21.1 ± 3.4와 30.0 ± 6.3). IT 투여이후 생체이용효율은 200 IU/㎏ IT 군에서 11.3% 및 1000 IU/㎏ IT 군에서 4.9%이었다.
도 3에 도시된 200 IU/㎏과 1000 IU/㎏ IT 투약군에서 시간에 따라 흡수된 누적량은 2가지 용량에 대한 흡수 속도가 유사하다는 것을 암시하는데, 그 이유는 이들 두 곡선의 기울기가 유사하기 때문이다. 하지만, 흡수된 총량은 이들 두 용량에서 상이하였다. 200 IU/㎏ IT 투약군에서 흡수된 총량은 대략 21 IU/㎏이었고, 1000 IU/㎏ IT 투약군에서 흡수된 총량은 대략 37 IU/㎏이었다. 이런 이유로, 이들 두 투약군 사이에 흡수량에서 비-비례적 증가가 존재하였다.
이런 결과는 도 4에서도 관찰된다. 해체 분석(deconvolution assay)으로 계산된 흡수된 총량의 비율은 200 IU/㎏과 1000 IU/㎏ 투약군에서 각각 대략 10.2%와 3.7%이었다. 이들 데이터는 AUC0-∞의 비교에 의해 이들 두 군에 대한 생체이용효율 수치(200 IU/㎏과 1000 IU/㎏ 투약군에 대하여 각각 대략 10.2%와 3.7%)와 유사하다.
항-인간 F.IX 항체 분석: 처리된 개로부터 얻은 개 혈청에서 항-인간 F.IX 항체의 역가는 개 항-인간 F.IX IgG 항체에 특이적인 ELISA를 이용하여 측정하였다(12). 소정의 개에 대한 항체 역가는 네거티브 대조에 비하여 흡광도(OD) 신호에서 2배 증가를 유도하는 혈장 샘플 희석도로 임의로 정의된다. 본 검사의 민감도 역치는 25 임의 단위(arbitrary unit)이다.
성체 혈우병 B 개는 통상적으로, 인간 F.IX에 대한 항체를 생성한다. 항-인간 F.IX 항체 역가는 투여이후 10일 시점에 양 IT 군의 모든 개에서 검출되었다(표 2). IV 군의 3마리 개 중에서 2마리는 상기와 동일한 시점에서 검출가능한 항체 역가를 보유하였다. 항-인간 F.IX 항체 역가는 15일 시점에 모든 개에서 검출되었고, 28일간의 전체 연구 기간동안 지속되었다.
표 2. rF.IX의 IT와 IV 투여이후 항-인간 F.IX 항체 역가
Day 200 IU/㎏ IT 200 IU/㎏ IT 200 IU/㎏ IT 1000 IU/㎏ IT 1000 IU/㎏ IT 1000 IU/㎏ IT 200 IU/㎏ IV 200 IU/㎏ IV 200 IU/㎏ IV
pre <25 <25 <25 <25 <25 54 74 <25 <25
5 <25 <25 <25 335 <25 <25 <25 <25 <25
10 79 623 617 6265 357 5841 1124 <25 120
15 86 1076 408 11,109 775 12,600 1546 230 1502
28 <25 365 327 5258 141 2058 1213 1429 --
임상 프로필과 면역 반응: 농축된 rF.IX의 기관지내 투여는 이전에 시도된 바가 없다. 이런 이유로, 이들 개는 임의의 부작용을 임상적으로 모니터하였다. 200 IU/㎏ IT를 섭취한 개 또는 rF.IX IV를 섭취한 개에서는 기침이 관찰되지 않았다. 1000 IU/㎏ IT를 섭취한 개에서는 주입이후 대략 45분 내지 1시간 시점에 경미하고 일시적인 기침이 관찰되었지만, 1시간 이상 지속되지 않았다. 이들 동물의 청진에서 비정상적인 폐 소리는 관찰되지 않았다. 처리 전후에, 양 IT 투약군으로부터 흉부 방사선사진에서 기도 또는 폐 연조직(lung parenchyma)의 외형에서 변화는 검출되지 않았다. 처리이전 및 처리이후 48시간 또는 72시간 시점에, CBC는 3가지 처리군 모두에서 주목할 만한 변화가 관찰되지 않았다. 처리 1개월후에 수행된 부검에서, 기관지 또는 폐 연조직에서 현저하게 비정상적인 결과는 관찰되지 않았다.
실시예 2: 인자 IX의 분무화
액체 rF.IX의 기관지내 투여가 안전하고 유효한 것으로 입증되었기 때문에, 이후 rF.IX의 분무화를 시도하였다. 재조합 인간 인자 IX는 당화되지 않는 경우에 47 kD이고, 당화되는 경우에 55 kD인 당단백질이다. 현재의 제약학적 제형은 냉동 건조된 분말인데, 그 이유는 액체 F.IX가 불안정하기 때문이다. 분말 제형조차도 대기 수준의 수분에 노출되는 경우에 산화와 분해에 취약하다. 이런 이유로, 예상되는 불안정성을 최소화하기 위하여 건조 분말 분무화 제형이 선택되었다.
rF.IX 분말의 표적 에어로졸 특성은 50% 이상의 초기 방출량(Emitted Dose, ED) 수치, 3.5 ㎛ 미만의 중량 평균 공기동력학적 직경(MMAD), 0.50 이상의 미세 입자 분획(FPF <3.3 ㎛)이었다. 화학적으로, 물리학적으로 안정한 분말은 4주동안 블리스터 포장에서 40℃/0% 상대 습도에 노출이후, 최초 스프레이 건조 용액 특성에 비하여 5% 미만의 순도 손실; 표적 범위 내에서 형태, ED, MMAD, FPF에 가시적인 변화 없음; 입자 크기 분포에서 변화 없음을 나타내는 분말로서 규정된다.
제형: 연구 1과 연구 2를 위한 rF.IX 용액은 Genetics Institute에 의해, 각각 12와 2.26 ㎎/㎖의 농도로 10mM 히스티딘, 260mM 글리신, 1% 수크로오스, 0.005% 폴리솔베이트-80, pH 6.8에서 조제되었다. 용액은 1.25 mM 구연산나트륨, pH 6을 포함하는 AMICON™(MILLIPORE™) 단위를 통하여 투석여과(diafiltration)하였다. 투석여과에 이용된 완충액의 총 용적은 최초 용액 용적의 대략 4 내지 5배이었다. 최종 일차 저장 용액농도는 UV에 의한 측정에서, 연구 1에서 12 ㎎/㎖, 연구 2에서 11.5 ㎎/㎖이었다. 제형은 물에 담긴 0.5% 전체 고체를 이용하여 표 3에 기술된 바와 같이 제조하였다.
표 3a. 연구 1 제형(고체 단독 wt/wt%)
Lot # *rF.IX g-rF.IX NaCitrate 삼중-루이신 루이신 수크로오스 아연 EtOH
8 79.3 92.6 7.4 0 0 0 0 0
9 70.7 82.6 7.4 10 0 0 0 0
10 45.0 52.6 7.4 0 40 0 0 0
11 76.1 89.0 7.4 0 0 3.7 0 0
12 76.5 89.5 7.4 0 0 0 3.2 0
13** - - - - - - - -
* 1.17 당화된/비당화된 rF.IX의 비율을 추정하여 당화된 rF.IX(g-rF.IX)의 중량으로부터 산정된 rF.IX의 중량.
** 순수한: 10mM 히스티딘/ 260 mM 글리신/ 1% 수크로오스/ 0.005% Tween 80
표 3b. 연구 2 제형(고체 단독 wt/wt%)
Lot # *rF.IX g-rF.IX NaCitrate 삼중-루이신 루이신 수크로오스 아연 EtOH
3 79.3 92.6 7.4 0 0 0 0 0
4 78.7 92.0 7.4 0 0 0 0 0.05
5 27.9 32.6 7.4 0 60 0 0 0
6 45.0 52.6 7.4 40 0 0 0 0
7 79.3 92.6 7.4 0 0 0 0 0
표면 장력 측정은 KRUSS K12 PROCESSOR TENSIOMETER™을 이용하여 대기 조건에서 수행하였다. 참고물로서 이용된 물은 72.5 mN/m에서 측정하였다. 용액은 분말 가공에 앞서 분석하였다. 용액의 pH는 ORION™ 모델 720A pH 계량기를 이용하여 스프레이 건조 직전에 실온에서 점검하였다. pH 7.0과 10.0 표준에서 2 포인트 조정(2 point calibration)을 수행하였다. 결과는 표 4에 제시한다.
표 4: pH와 표면 장력(mN/m)
연구 1 연구 2
Lot # pH 표면 장력 Lot #PH 표면 장력
8 6.1 33.37 3 6.4 46.64
9 6.1 32.76 4 6.4 44.33
10 6.1 35.03 5 6.4 49.30
11 6.1 33.40 6 6.4 47.64
12 5.6 32.44 7 6.4 45.79
13 6.8 37.28
분무화: 11가지 형식은 변형된 사이클론, 분무장치 노즐, 파워 컬렉션 용기가 구비된 Buchi 190 Mini Spray Dryer(BRINKMAN™)로 스프레이 건조시켰다. Buchi 스프레이 건조기의 분무장치는 연구 1의 경우에 60 psi와 연구 2의 경우에 40 psi로 설정된 압축 건조 공기로 작동시켰다. Buchi로의 액체 유속은 양 연구에서 5 ㎖/min이었다. 출구 온도는 연구 1에서 70℃ 및 연구 2에서 60℃로 설정되었다. Buchi를 통한 전체 기류는 17.8 scfm이었다. 배치 크기는 675 내지 1,350 ㎎이었고, 수율은 11개 로트(lot)에서 20 내지 67%이었다. 이용된 수집기는 1/2 인치 또는 1 인치이었고, 봉규산 유리(borosilicate glass)로 구성되었다.
블리스터 팩: 분말은 숙련된 인원에 의해 수동으로 충전되었다. 분말은 5% 미만의 상대 습도를 보유하는 글로브박스(glovebox)로 이전하였다. 이용된 블리스터 형태는 P3.05 PVC 블리스터이었다. 분말, 7.5 ± 0.15 ㎎을 각 블리스터에 충전하고, 리드스탁(lidstock)을 상부에 위치시키고, 블리스터 팩을 밀봉하였다. 밀봉 온도는 171℃(± 5℃)이고, 드웰 시간(dwell time)은 1초이었다. 이후, 블리스터 팩은 장치에 적합되도록 절단하였다.
안정성 검사: 최초 조건 및 조절된 온도와 상대 습도에서 2-3주간 보관이후 에어로졸, 열적, 물리적, 화학적 검사를 수행하였다. 분말 제형은 PVC 블리스터 팩에 충전하고, 방출량, 입자 크기 분포, 열 분석을 평가하였다. 화학적 특성화와 주사 전자 검경(SEM)은 최초 조건에서 벌크 에어로졸 약물 분말에서 수행하였다. 모든 분말은 5% 미만의 상대 습도를 보유하는 습도 조절된 글로브 박스에서 조작하였었다.
가속된 보관 조건: 연구 1 제형을 위한 벌크 에어로졸 약물 분말은 건조시키고 2-8℃, 40℃(0% RH), 25℃(0, 33, 75% RH)에서 보관하였다. 연구 2 제형을 위한 벌크 에어로졸 약물 분말은 2가지 온도(25℃, 40℃) 및 양 온도 조건에 대한 2가지 상대 습도 조건(0, 75%)에 보관하였다.
벌크 에어로졸 약물 분말은 글로브 박스에서 봉규산 유리 바이알에 칭량하였다. 0% RH 안정성 샘플의 경우에, 바이알은 뚜껑을 덮고, 건조제를 포함하는 호일 겉포장 주머니에 위치시키고, 열 밀봉하고, 이후 온도 조절된 챔버에서 보관하였다. 습도 조절된 안정성 샘플의 경우에, 바이알은 뚜껑을 개방하고, 적절한 온도에서 습도 조절된 챔버에 보관하였다. 샘플은 2-3주후 UV, SDS-PAGE, SE-HPLC, SEM으로 분석하였다.
에어로졸 검사: U.S. Patent No. 6,257,233에 기술된 장치를 이용하여 모든 에어로졸 검사를 수행하였다. 상기 장치는 먼저 블리스터 팩을 장치에 삽입하고, 장치 핸들을 잡아당기고, 이후 장치에 압력을 가하는 핸들을 풀어 챔버를 압박함으로써 원동된다. 버턴을 누름으로써 작동된 상기 장치는 블리스터 팩을 들어올리고, 이를 천공하고, 분말을 장치의 챔버에 분산시켜 에어로졸 연무를 형성한다. 모든 충전된 블리스터 팩은 에어로졸 검사에 사용 때까지 건조 상자에 보관하였다.
방출량: 에어로졸은 장치의 챔버의 홀더에 위치된 유리 섬유 필터에 수집된다. 방출량 비율(ED%)을 측정하기 위하여, 블리스터 팩은 상기 장치를 이용하여 에어로졸로서 분산시키고, 분말 샘플은 자동 타이머에 의해 조절되는 2.5초간 30 L/min의 기류 속도로 챔버로부터 에어로졸을 흡인함으로써 미리-칭량된 유리 섬유 필터(GELMAN™, 47 ㎜ 직경)에 수집된다. 이런 샘플링 패턴은 환자의 느리고 깊은 호흡을 모의한다. ED%는 필터에 수집된 분말의 중량을 블리스터 팩에서 분말의 중량으로 나눔으로써 산정하였다. 보고된 각 결과는 10회 측정의 평균 ± 표준 편차이었다(표 5).
입자 크기: 8-단계(9.0, 5.8, 4.7, 3.3, 2.1, 1.1, 0.7, 0.4 ㎛ 구멍 크기) 캐스케이드 충격장치(ANDERSEN CASCADE IMPACTOR™)를 이용하여 입자 크기 분포를 측정하였다. 각 측정치는 5 ㎎ 충전 중량(fill weight)의 5 블리스터 팩을 장치에서 분산시킴으로써 획득하였다. 진공은 자동 타이머에 의해 조절되는 2.5초간 28.5 L/min의 조정된 기류 속도로 충격장치를 통하여 달성되었다(표 5). MMAD는 캐스케이드 충격에 의한 분무화된 분말의 공기역학적 입자 크기 분포의 중간점 또는 평균이다. FPF%<3.3㎛ 역시 캐스케이드 충격 장치를 이용하여 획득하였다. 미세 입자 분획%<3.3m은 분당 1입방 피트(cfm)(28.3 L/min)의 유속으로 작동되는 Andersen 충격 장치의 3단계 아래 전체량이다. 모든 단계에서 수집된 전체량으로 나누어진 단계 4, 5, 6, 7, 8로부터 합친 양은 보고된 수치이다.
표 5a. 최초 및 3주 보관 시점에서 연구 1 에어로졸 검사
최초 3주 보관
t = 0 40℃/75% RH
Lot # ED ± *RSD(%) MMAD (㎛) FPF (% < 3.3 ㎛) ED ± RSD(%)
8 21.0 ± 15 % 5.0 18 22.9 ± 5 %
9 36.6 ± 9 % 3.4 48 35.2 ± 10 %
10 62.2 ± 9 % 3.3 50 51.0 ± 8 %
11 13.6 ± 10 % 3.7 43 16.1 ± 9 %
12 19.7 ± 15 % 3.4 48 25.0 ± 14 %
13 19.4 ± 12 % 3.4 49 23.0 ± 24 %
*RSD = 표준 편차/평균 X 100
표 5b. 최초 및 2주 보관 시점에서 연구 2 에어로졸 검사
최초 2주
t = 0 25℃/75% RH 40℃/75% RH
Lot # ED ± RSD (%) MMAD (㎛) FPF (% < 3.3 ㎛) ED ± RSD (%) MMAD (㎛) FPF (% < 3.3 ㎛) ED ± RSD (%) MMAD (㎛) FPF (% < 3.3 ㎛)
3 57.3 ± 5 % 3.4 49 n/a n/a n/a 49.7 ± 5 % n/a n/a
4 62.2 ± 6 % 4.2 36 n/a n/a n/a 53.9 ± 6 % 4.2 37
5 77.9 ± 3 % 2.8 60 n/a n/a n/a 68.0 ± 6 % 2.4 73
6 89.0 ± 5 % 2.9 58 90.4 ± 10 % 2.7 64 80.7 ± 7 % 2.9 60
7 50.1 ± 1 % 3.5 44 52.4 ± 12 % 3.8 40 46.8 ± 9 % 3.6 42
형태: 주사 전자 검경을 이용하여 스프레이 건조된 분말에 대한 최초 형태 정보를 획득하고 안정화이후 형태 변화를 평가하였다. 모든 샘플은 5% 미만의 상대 습도를 보유하는 글로브박스에서 준비하였다. 샘플은 알루미늄 SEM 돌출부에서 이중-면 카르본 테이프(carbon tape)의 상부에 적재된 실리콘 와이퍼에 올려놓았다. 이후, 적재된 분말은 금:팔라듐을 포함하는 Denton 스퍼터 도포기에서 60-90초동안 75 mTorr와 38 mA로 스퍼터-도포하였다. 이는 대략 150Å의 코팅 두께를 산출한다. 영상은 영상 조성물에 대한 이차 전자를 포획하는 Everhart-Thornley 검출기를 이용한 높은 진공 방식으로 작동되는 Philips XL30 ESEM으로 촬영하였다. 가속 전압(accelerating voltage)은 LaB6 공급원을 이용하여 3 내지 10kV이었다. 작업 거리는 대략 5 ㎛이다.
로트 4(에탄올에 녹인 순수한 제형)를 제외한 모든 분말은 안정성 프로토콜에 기술된 온도와 RH 조건에서 2-3주간 보관이후 형태에서 별다른 변화를 보이지 않았다. 에탄올 분말은 40℃, 75% RH에서 형태 변화를 보였다. 가속된 보관 조건에서, 에탄올 제형은 최초에 비하여 더욱 수축되었고 상당한 단편화를 보였다.
잔류 용제: 스프레이 건조이후 분말에서 잔류 용제 함량은 TA INSTRUMENTS™(New Castle, DE) TGA를 이용한 TGA로 측정하였다. 대략 3 ㎎의 분말은 5% 미만의 상대 습도를 보유하는 글로브박스에서 밀봉된 알루미늄 팬에 포장하였다. 분석에 앞서, 팬은 핀으로 천공하고 장치에 적하하였다. 이용된 방법은 실온에서 175℃로 10℃/min이었다(표 6).
표 6a: 연구 1 용제 함량(wt%)
최초 3주 보관
Lot # t = 0 2-8℃ 25℃/0%RH 25℃/33%RH 25℃/75%RH 40℃/75%RH
8 1.8 2.6 3.7 4.4 9.5 4.2
9 1.7 3.1 2.8 4.6 14.1 3.6
10 1.6 2.6 2.1 3.7 9.5 2.6
11 2.0 3.3 3.1 5.7 11.8 4.1
12 1.8 3.3 2.5 3.9 11.8 3.9
13 3.6 n/a n/a n/a n/a n/a
표 6b. 연구 2 용제 함량(wt%)
최초 2주 보관
Lot # t = 0 25℃/0% RH 25℃/75% RH 40℃/0% RH 40℃/75% RH
3 7.1 n/a n/a n/a n/a
4 3.9 4.9 25.2 6.2 12.7
5 4.2 3.3 13.5 4.0 4.8
6 3.2 4.2 10.6 7.1 n/a
7 3.8 n/a 25.6 4.7 14.2
단백질 안정성: 샘플에서 응집과 분해를 분석하기 위하여 여러 기술이 이용되었다. 가용성 응집체는 SE-HPLC로 정량적으로 측정하였다. HPLC는 WATERS™시스템, Alliance 모델 2690이었다. 상기 크로마토그래피 시스템에는 용제 전달 시스템, 광다이오드 어레이 검출기, 온도 조절된 자동 시료 주입기, 데이터 관리 시스템이 구비되었다. 이동상은 50 mM 인산나트륨 및 pH 7.0으로 조정된 150 mM 염화나트륨으로 구성되었고, 1 ㎖/min으로 등용리하게 이동하였다. 칼럼은 가드 칼럼(guard column)을 포함하는 TosoHaas™ TSK G3000SWXL 칼럼(7.8 x 300 ㎜, 5 ㎛ 구멍 크기)이었다. 샘플은 재구성하거나, 또는 물을 이용하여 1 ㎎의 rF.IX 펩티드/㎖ 농도로 희석하였다. 샘플은 주입 때까지 5℃에 보관하였다. 크로마토그램은 추출하고 214 nm에서 가공하였다. 스프레이 건조에 앞서, 조제된 용액의 단량체 함량 비율은 상응하는 재구성된 에어로졸 약물 분말과 비교하였다.
UV 분광 분석을 이용하여 샘플에서 탁도(응집/침전)를 평가하였다. 측정은 HITACHI™U-3000, 이중 광선 분광계에서 수행하였다. 장치 모수는 300 nm/min의 주사 속도; 1.0 nm 슬릿 폭(slit width); 400 nm 내지 200 nm의 주사 범위로 설정되었다. 샘플은 미립자 물질을 시각적으로 검사하였다. 불용성 응집체는 UV로 용액의 탁도를 측정함으로써 정량적으로 확인하였다. 산란을 보정하기 위한 선형 회귀는 350, 375, 400 nm에서 흡광도 수치로부터 수행하였다. 광 산란에 대하여 보정된 λmax에서 흡광도는 회귀선 방정식으로부터 추정하였다. 불용성 응집체 비율은 방정식 1에 도시된 바와 같이 λmax 보정되지 않은 흡광도로 나누어진 광 산란에 대하여 보정된 흡광도의 비율이다:
불용성 응집체 % = Absλmax(보정된 광 산란)/Absλmax(보정되지 않은 광 산란)
5% 미만의 불용성 응집은 제형 안정성의 척도 기준으로 설정되었다. 샘플은 재구성하거나, 또는 물을 이용하여 0.1 ㎎의 rF.IX 펩티드/㎖ 농도로 희석하였다.
스프레이 건조 이전(pre-SD)과 이후에 모든 용액 샘플은 미립자 물질의 가시적 징후를 보이지 않거나 5% 미만의 불용성 응집체를 보유하였다. 온도와 습도 안정성에 위치된 연구 1과 연구 2에서 모든 샘플은 미립자 또는 검출가능 불용성 응집체의 가시적인 징후를 보이지 않았다. 모든 배치에서 5% 미만의 불용성 응집체가 방정식 1에 의해 산정되었다. 이런 이유로, 표 7은 SE-HPLC 단독으로 획득된 데이터이다.
표 7a. 연구 1 단량체 함량 %
Lot # pre-SD 2-8℃ 25℃/0%RH 25℃/33%RH 25℃/75%RH
/ / t = 0 3 wk t = 0 3 wk t = 0 3 wk t = 0 3 wk
8 99.0 98.7 98.6 98.7 98.1 98.7 97.1 98.7 96.6
9 99.1 96.1 95.2 96.1 94.7 96.1 87.8 96.1 93.7
10 99.2 98.4 97.2 98.4 94.5 98.4 96.3 98.4 93.6
11 99.1 96.3 95.2 96.3 98.2 96.3 97.3 96.3 96.6
12 97.87 97.7 96.7 97.7 95.7 97.7 95.0 97.7 93.3
13 83.0 80.7 n/a 80.7 n/a 80.7 n/a 80.7 n/a
표 7b. 연구 2 단량체 함량 %
Lot # pre-SD 25℃/0%RH 25℃/75%RH 40℃/0%RH 40℃/75%RH
t = 0 2 wk t = 0 2 wk t = 0 2 wk t = 0 2 wk
3 97.9 97.6 n/a 97.6 94.7 97.6 96.7 97.6 n/a
4 97.6 94.8 94.6 94.8 91.4 94.8 93.3 94.8 72.4
5 97.6 94.7 94.1 94.7 72.0 94.7 89.5 94.7 61.4
6 97.7 96.9 97.1 96.9 90.4 96.9 96.3 96.9 76.3
7 97.9 97.6 97.7 97.6 97.7 97.6 96.7 97.6 71.4
가용성 응집체와 분해는 SDS-PAGE로 정량적으로 측정하였다. NOVEX™ 프리-캐스트(pre-cast) 4-20% 트리스-글리신 겔은 NOVEX XCELL II™ 전기영동 미니-셀에서 이동시켰다. 샘플은 재구성하거나, 또는 물을 이용하여 0.1 ㎎의 rF.IX 펩티드/㎖ 농도로 희석하였다. 1 ㎍ 하중의 단백질을 각 레인에 전달하기 위하여 환원과 비-환원 조건하에 용액을 제조하였다. 감소된 샘플은 2-멀캡토에탄올로 처리하였다. 겔은 겔 정면이 바닥에 도달할 때까지(대략 1.5시간), 125V, 25mA per/겔로 이동시켰다. 증가된 민감성을 위하여 NOVEX SILVER XPRESS™ 염색 키트를 이용한 은 염색 검출이 수행되었다. 환원과 비-환원 겔은 2주, 25℃ 및 2주, 40℃의 안정성 시점에서 연구 1과 연구 2 대표 제형으로부터 얻은 샘플을 이용하여 제조하였다. 이들 겔을 이동시키는 의도는 5 ㎍ 단백질 하중으로 레인을 과부하시켜 1 ㎍ 단백질 하중에서 관찰되지 않은 희미한 밴드를 검출하는 것이다.
스프레이 건조이전 조제된 용액 및 재구성된 에어로졸 약물 분말 사이에 겔 프로필에서 변화는 관찰되지 않았다(데이터 제시하지 않음). 겔에서 rF.IX의 모든 샘플과 대조의 단량체 밴드는 보고된 수치보다 높은 분자량(대략 65 kDa)에서 이동하였고 넓게 확산되는 것으로 보인다. 이는 당화되고 겔 전체에 rF.IX의 이동에 영향을 주는 단백질에 기인하는 것으로 생각된다. 단량체 밴드 이외에, rF.IXa와 c-말단 펩티드에 기인하는 다른 밴드가 존재하였다. 하지만, 스프레이 건조이전 조제된 용액과 재구성된 에어로졸 약물 분말 사이에 차이는 관찰되지 않았다.
요약: 2차 스크리닝 실험에서 낮은 분무화 압력을 선택한 이후, rF.IX 분말 제형의 에어로졸 성능은 계획된 목적을 충족시켰는데, 삼중루이신 제형이 가장 우수한 성능을 발휘하였다. 방출량은 57, 62, 78, 89, 50%이고, 에어로졸 MMAD 수치는 3.4, 4.2, 2.8, 2.9, 3.5 ㎛인데, 순수한 rF.IX, 구연산염에서 rF.IX에 5% 에탄올, 구연산염에서 rF.IX에 60% 루이신, 구연산염에서 rF.IX에 40% 삼중루이신, 37℃로 가열된 순수한 rF.IX에 대한 3.3 ㎛ 미만은 각각 49, 36, 60, 58, 44%이었다.
연구 2에서, 에탄올과 루이신 제형 각각은 미리-스프레이 건조된 용액과 최초 재구성된 에어로졸 약물 분말을 비교하는 경우에, 단량체 함량이 3% 하락하였다. 연구 2의 다른 제형에서, 미리-스프레이 건조된 용액에 비교된 최초 재구성된 에어로졸 약물 분말에서 변화는 관찰되지 않았다. 2주 안전성 연구에 기초하여, SE-HPLC 측정에서 습도가 화학적 안전성에 가장 많은 영향을 주었다. UV 검사에서, 불용성 응집은 모든 배치에서 관찰되지 않았다. SDS-PAGE에서, 추가의 가용성 응집체 또는 분해 밴드는 관찰되지 않았다. 선택된 제형의 응고 활성은 스프레이 건조에 의해 약화되지 않았다. F.IX 검사에서, 스프레이 건조이후 활성은 스프레이 건조이전 활성의 평균 80-90%이었는데, 최고의 제형은 95% 이상의 활성을 보였다.
에탄올(로트 4) 스프레이 건조된 분말은 SEM으로 관찰하는 경우에 형태학적 변화를 보인 유일한 제형이었다. 40C/75% RH에서 2주 안정성에서, 에탄올 제형은 더욱 수축되었고 분열된 단편을 보유하였다. 동일한 보관 조건에 노출된 다른 분말에서는 별다른 형태학적 변화가 관찰되지 않았다. 상기 데이터는 폐 전달에 적합한 건조 F.IX가 알코올에 의해 스프레이 건조되지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 3: 생체내 생체이용효율 검사
앞선 두 연구는 1) 유효 수준의 액체 rF.IX가 기관지내 표면을 통하여 전신으로 전달될 수 있고, 2) 건조 분말 rF.IX가 효소 활성과 안정성을 유지하면서 성공적으로 분무화될 수 있다는 것을 입증하였다. 이후의 실험에서는 생체내 개 모델에서 제형 6(삼중-루이신 부형제)을 이용하여 rF.IX의 생체이용효율을 검사하였다.
본 연구의 목적은 인간 인자 IX에 미리 토렐라이제이션된 혈우병 B 개에서 경구 흡입이후 인간 인자 IX의 약동학적, 약력학적 모수를 결정하는 것이었다. 본 연구로부터 획득된 데이터는 정맥내 주입으로 인간 인자 IX를 투여하는 후속 연구로부터 획득된 데이터와 비교한다. 측정된 모수는 1) 전혈 응고 시간(WBCT), 2) F.IX 항원(F.IX:Ag), 3) 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT), 4) F.IX 활성, 5) ELISA에 의한 F.IX 항체, 6) Bethesda 저해물질 검사 등이다.
투약: Chapel Hill 콜로니(실시예 1 참조)의 5마리의 혈우병 개가 본 연구에 이용되었다. 이용된 5마리 개 중에서, 4마리는 인간 F.IX 토렐라이제이션된 혈우병 개이고 예방 조치(월요일과 목요일에 82 IU/㎏ SC)를 받았다. 2마리 개는 흡입에 의한 1일 투약 대신에 마지막 분량(목요일)을 섭취하지 않았다. 1마리 개는 rF.IX를 섭취하지 않았다.
개 모델에서 에어로졸 전달을 평가하기 위하여, U.S. Patent No. 6,257,233에 기술된 바와 같이 변형된 장치를 이용하였다. 간단히 말하면, 조절기, HEPA 필터, 일련의 밸브를 통하여 압축 공기(~5 psi)로 공기를 제공하였다. 퍼스널 컴퓨터(PC)로 전체 시스템에서 공기의 유동을 조절하였다. 공기는 상기한 바와 같이 변형된 장치에 전달되고, 커프스를 통하여 유지된 ET 튜브를 통하여 개들의 폐에 전달되었다. 릴리프 밸브는 너무 많은 공기가 전달되는 것을 예방하고, U-압력계는 전달된 공기의 압력을 모니터하였다.
컴퓨터를 이용하여 압축 공기의 공지된 용적(~800 ㎖)과 유속을 조절하였다. 압축 공기를 이용하여 기관 튜브(endotracheal tube)를 통하여 에어로졸을 개에 전달하였다. 이런 시스템에 의해 발생된 용적은 마취된 10 ㎏ 개의 폐 역학에 기초하였다. 마취된 개의 전체 최대 폐 용적은 대략 1400 ㎖이고, 평균 전달 일시 주사는 800 ㎖이었다.
카테터는 아래의 절차에 따라 연구 당일에 개에 배치하였다. 전신 마취를 위하여, 동물들은 Thiopental Na를 이용하여 진정시켰다. 이들 동물은 관을 삽입하고, 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 마취를 유지시켰다(호흡 보조로 2-4% 흡입됨). 이들 동물에서 심장 박동; 호흡 속도; 혈압; 안검(palpebral), 각막(corneal), 철수 반사(withdrawal reflex)의 존재 또는 부재를 평가하였다. 국소 마취와 진정을 요하는 절차를 위하여, 개에 메디토미딘(meditomidine), 밸리움(valium), 부톨판올 타르트레이트(butorphanol tartrate), 또는 프로포폴(propofol) 또는 유사한 진통제/진정제를 투여하였다.
이들 개는 2% 이소플루란 & 산소를 이용하여 1-4분동안 과환기(hyperventilation)시켰다. 이는 대략 3분간의 일시 호흡 정지(apnea)를 유도하였다. 일시 호흡 정지 동안, 개들은 에어로졸 장치에 연결하고 상기 시스템을 통하여 800 ㎖ 공기를 일시 제공하였다. 상기 시스템의 에어로졸 전달은 레이저, 인-라인 필터 및 개의 폐를 모의하는 풍선을 이용하여 미리-특성화시켰다. 대부분의 에어로졸은 600 ㎖로 일시 전달되는 것으로 결론되었다.
비교를 위하여, 동일한 샘플링과 분석 프로토콜에서 유사한 용량으로 재조합 인간 F.IX를 개에게 정맥내 주입하였다. 상기 프로토콜은 흡입 연구 완결이후 적어도 28일 시점에 시작하였다. 이들 개들 모두 특성화의 일환으로, 유사한 IV 일시 주사가 이전에 투여되었다.
표 8. 군 지정
군 번호 검사 물품 투여 경로 동물의 개체수와 성별 효과량a rF.IX UI/㎏ 작동당 블리스터의 수 작동 횟수 블리스터의 총수/개
1 인자 IX OI 2M & 2F 50 3 2 6
a효과량은 전달 효율에 따라 변할 수 있다.
용량: 재조합 인간 인자 IX는 중량으로 7.5 ㎎의 분말을 함유하는 블리스터 팩으로 제공되는데, 여기서 3.95 ㎎은 당단백질이고, 0.55 ㎎은 NaCitrate이고, 3.0 ㎎은 부형제(삼중-루이신), pH 6.4이다. 각 7.5 ㎎ 블리스터는 대략 5 ㎎의 분말을 전달한다. 특이적인 활성은 대략 300 unit/㎎ 단백질이다. 매 1.0 ㎎의 당단백질마다, 85.5%는 단백질이고, 나머지는 당 부분이다.
샘플 수집: 혈액은 아래에 기재된 시점에 경정맥(jugular vein) 또는 요측피정맥(cephalic vein)으로부터 수집하였다. 인자 IX 항원과 APTT의 혈장 농도를 측정하기 위하여, 혈액 샘플(3.0 ㎖)은 아래의 시점에서 3.8% 구연산염 포함 튜브에 수집하였다: 투약 직전 및 투약이후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 28, 32, 48, 72, 96시간. 항-인간 인자 IX 항체의 형성과 농도를 측정하기 위하여 4주 연속동안 매주, 투약이전 및 월요일 피하 투약 직전에 추가의 혈액 샘플을 수집하였다.
혈장은 4℃에서 15분동안 4500 rpm으로 원심분리함으로써 분리하였다. 혈청은 실온에서 15분동안 3000 rpm으로 원심분리함으로써 분리하였다. 혈장은 12x75 ㎜ 폴리프로필렌 동결바이알에 적어도 3가지 분량으로 분할하였다. 모든 혈장/혈청 함유 튜브는 필요 때까지 대략 -80℃에 동결시켰다.
데이터 분석: 인자 IX의 혈장 농도의 약력학적 분석을 수행하여 최대 혈장 농도(Cmax); 최대 혈장 농도에 도달하는 시간(Tmax); 혈장 농도 아래 영역 vs. 시간 곡선(AUC); 겉보기 제거 반감기(t1/2)와 같은 모수를 측정하였다. 분석은 WINNONLIN PROFESSIONAL 2.0™(SCIENTIFIC CONSULTING™, Apex, NC) 검증된 컴퓨터 프로그램 또는 등가물을 이용하여 수행하였다. 이에 더하여, APTT의 혈장 농도와 항체 농도는 시간에 대하여 도면으로 작성하였다.
F.IX 생물학적 정량: 인자 IX(F.IX) 응고제 활성은 개 F.IX 결핍성 기질 혈장을 이용한 변형된 1-단계 부분 트롬보플라스틴 시간 검사로 측정하였다. 정상 인간 참고 혈장은 5-10명의 정상 인간으로부터 풀(pool)로 구성된다. 검사 샘플은 수회 희석하고, 정상 곡선에서 동일 희석액과 비교하였다. 결과는 기준의 백분율로 기록한다.
APTT: APTT는 다량의 샘플을 신속하게 처리할 수 있는 ST4™ 응고 장치(DIAGNOSTICA STAGO™, Asnieres, France) 또는 MULTIPLE DISCRETE ANALYZER(MDA) 180™(ORGANON TEKNIKA™)으로 측정하였다. APTT가 ST4™ 응고 장치 또는 MDA 180™에서 측정되는 지에 상관없이, 대조와 반응물은 동일 유형이다. APTT 검사를 위하여, 혼합물은 동등 분량의 부분 트롬보플라스틴(AUTOMATED APTT™, ORGANON TEKNIKA™), 0.025 M CaCl2, 구연산화 검사 혈장으로 구성되었다.
결과는 도 5에 도시한다. APTT는 흡입이후 대략 100시간동안 90초에서 70-75초로 단축되었다. 이는 저용량 예방 반응의 전형이다.
WBCT: WBCT는 기존 문헌(7,13-15)에 기술된 바와 같이 수행하였다. WBCT는 전형적으로, Chapel Hill 콜로니의 처리되지 않은 혈우병 B 개에서 50분 이상이다(14,15). 상기 콜로니의 정상적인 건강한 개에서 WBCT에 대한 참고 범위는 8 내지 12분이다. 결과는 도 6에 도시한다. WBCT는 50+ 분에서 대략 10분으로 감소하였다.
Bethesda 저해물질 검사: 인자 IX에 대한 Bethesda 저해물질 검사는 Kasper 등(34, 35)에 의해 처음 보고된 절차의 Nijmegan 개량된 절차로 수행하였다. 간단히 말하면, 정상 대조의 50%의 잔류 인자 IX 활성을 보유하는 환자의 혈장은 ㎖당 저해물질의 1 Bethesda 단위(BU)로 정의된다. 낮은 역가(2BU)와 높은 역가(>5BU) 저해물질을 모두 검출하기 위하여, 적절한 스크리닝 희석액을 만들었다. 저해물질은 관찰되지 않았다(데이터 제시하지 않음).
인자 IX 항원: 항원 농도는 Genetics Institute에 의한 이중 단클론 항체 샌드위치 효소 결합된 면역흡착 검사(ELISA)를 이용하여 측정하였다.
실시예 4: 인자 VIII
인자 VIII 역시 혈우병 A의 치료에 중요하고, 인자 XI는 인자 XI 결핍의 치료에 중요하다. F.VIII 역시 인자 IX에서 앞서 기술된 바와 같이, 에어로졸 흡입 요법에 의해 전달될 수 있는 지를 확증하기 위한 실험을 계획한다. FVIII는 동일한 제형 및 연구 2의 방법을 이용하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 분무화시킨다.
본원에 언급된 모든 참고문헌은 순전히 참조로 한다:
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Claims (28)

  1. 혈우병을 치료하는 방법에 있어서, 아래와 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 인자 IX(F.IX)를 분무화시키고, 상기 분무화된 F.IX는
    i) 2 내지 4 ㎛의 중량 평균 공기동력학적 직경(MMAD), 적어도 50%의
    3.3 ㎛ 미만 미세 입자 분획 비율(FPF%<3.3 ㎛)을 보유하고; 적어도
    90% 단량성이며, 여기서 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도
    80%이고; 10%(wt/wt) 미만의 수분을 보유하는 건조 분말이다;
    b) 분무화된 F.IX를 흡입하여 분무화된 F.IX를 심부 폐 조직에 침착시키고,
    c) 이후 배출한다.
  2. 제 1항에 있어서, MMAD는 2.8 내지 3.6 ㎛이고, FPF%<3.3 ㎛는 적어도 60%이고, 단량체 함량은 적어도 95%이고, 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도 90%인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, MMAD는 3-3.5 ㎛이고, FPF%<3.3 ㎛는 적어도 64%이고, 단량체 함량은 적어도 97%이고, 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도 95%인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, F.IX는 알코올 없이 분무화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, F.IX는 재조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, F.IX는 삼중-루이신 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 삼중-루이신/F.IX 비율은 0.5-1.5wt/wt인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 혈우병을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분무화된 건조 인자 IX(F.IX)를 흡입하는 단계로 구성되고, 상기 분무화된 건조 F.IX는 표면 활성 이중- 또는 삼중-펩티드를 함유하고, b) 2.8-3.5 ㎛의 MMAD, c) 60% 이상의 FPF%<3.3 ㎛, d) 적어도 95%의 단량체 함량, e) 적어도 80%의 분무화이후 활성/분무화이전 활성, f) 10% 미만의 수분을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, MMAD는 3-3.5 ㎛이고, FPF%<3.3 ㎛는 적어도 64%이고, 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도 90%이고; 단량체 함량은 적어도 97%이고, 수 분 함량은 5% 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, F.IX는 알코올을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, F.IX는 재조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8항 내지 11항중 어느 한 항에 있어서, F.IX는 삼중-루이신 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 6항에 있어서, 삼중-루이신/F.IX 비율은 0.5-1.5wt/wt인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 혈우병 개시에 앞서 혈우병성 출혈을 예방하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 인자 IX(F.IX)를 분무화시키고, 상기 분무화된 F.IX는
    i) 2 내지 4 ㎛의 중량 평균 공기동력학적 직경(MMAD), 적어도 50%의
    3.3 ㎛ 미만 미세 입자 분획 비율(FPF%<3.3 ㎛)을 보유하고; 적어도
    90% 단량성이며, 여기서 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도
    80%이고; 10%(wt/wt) 미만의 수분을 보유하는 건조 분말이다;
    b) 분무화된 F.IX를 적어도 주1회 흡입하여 분무화된 F.IX를 폐에 침착시키 고,
    c) 이후 배출한다.
  15. 제 14항에 있어서, 흡입은 주2회 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 흡입은 매 2-3일마다 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 분무화가능 건조 F.IX 및 표면 활성 이중- 또는 삼중-펩티드 부형제를 함유하지만 에탄올을 함유하지 않는 조성물에 있어서, 분무화된 건조 F.IX는 2 내지 4 ㎛의 MMAD; 적어도 50%의 FPF%<3.3 ㎛; 적어도 50%의 방출량(ED); 적어도 95%의 단량체 함량, 여기서, 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도 80%이다; 10% 미만의 수분을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, MMAD는 2.8 내지 3.6 ㎛이고, ED는 적어도 60%이고, 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도 95%이고, FPF%<3.3 ㎛는 적어도 65%이고, 수분은 5% 미만인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 17항에 있어서, MMAD는 3 내지 3.5 ㎛이고, FPF%<3.3 ㎛는 적어도 64%이고, ED는 적어도 80%이고, 여기서 분무화이후 활성/분무화이전 활성은 적어도 95%이고, 단량체 함량은 적어도 97%이고, 수분 함량은 5% 미만인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. F.IX 및 표면 활성 이중- 또는 삼중-펩티드 부형제를 보유하지만 에탄올을 보유하지 않는 블리스터 팩에 있어서, 블리스터 팩은 방수이고, 적어도 90% 단량성이고 10%(wt/wt) 미만의 수분을 보유하는 F.IX를 보유하는 것을 특징으로 하는 블리스터 팩.
  21. 제 20항에 있어서, F.IX는 적어도 95% 단량성이고 5%(wt/wt) 미만의 수분을 보유하며, 부형제는 디레우실 또는 삼중-루이신인 것을 특징으로 하는 블리스터 팩.
  22. 제 20항에 있어서, F.IX는 적어도 97% 단량성이고 5%(wt/wt) 미만의 수분을 보유하며, 부형제는 삼중-루이신인 것을 특징으로 하는 블리스터 팩.
  23. 제 20항 내지 22항중 어느 한 항에 있어서, F.IX는 재조합 F.IX인 것을 특징으로 하는 블리스터 팩.
  24. 적어도 90% 단량성이고 10% 미만의 수분을 보유하는 생물학적 활성 재조합 인자 IX 및 표면 활성 이중- 또는 삼중-펩티드 부형제를 함유하지만 에탄올을 함유 하지 않는 건조 분말 F.IX.
  25. 제 24항에 있어서, 부형제는 삼중-루이신인 것을 특징으로 하는 건조 분말 F.IX.
  26. 제 25항에 있어서, 부형제에 대한 F.IX의 비율은 0.2-5.0/1인 것을 특징으로 하는 건조 분말 F.IX.
  27. 건조 분산가능 분말 및 50 wt% 당화된 F.IX, 40 wt% 삼중루이신, 10 wt% 완충물의 고체 내용물을 함유하는 조성물.
  28. 건조 분산가능 분말 및 40-60 wt% 당화된 F.IX, 40-60 wt% 삼중루이신, 0-10 wt% 완충물의 고체 내용물을 함유하는 조성물.
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