ES2218543T3 - Procedimiento y preparacion para la administracion de insulina por via pulmonar. - Google Patents

Abstract

LA ADMINISTRACION SISTEMICA DE INSULINA A UN MAMIFERO SE REALIZA MEDIANTE LA INHALACION DEL POLVO SECO DE INSULINA. SE HA DESCRITO QUE EL POLVO SECO DE INSULINA SE ABSORBE RAPIDAMENTE A TRAVES DE LAS REGIONES ALVEOLARES DE LOS PULMONES.

Description

Procedimiento y preparación para la administración de insulina por vía pulmonar.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención tiene que ver, en general, a métodos y composiciones para la liberación respiratoria de insulina a pacientes diabéticos. Más particularmente, la presente invención se refiere a la liberación pulmonar de preparaciones de insulina en polvo desecado para la rápida absorción sistémica a través de los pulmones.

La insulina es una hormona polipeptídica de 50 aminoácidos que tiene un peso molecular de aproximadamente 6.000, la cual es producida en las células \beta pancreáticas de individuos normales (no diabéticos). La insulina es necesaria para regular el metabolismo de carbohidratos, reduciendo los niveles de glucosa en sangre, y una deficiencia sistémica origina la diabetes. La supervivencia de los pacientes diabéticos depende de la administración frecuente y a largo plazo de insulina para mantener niveles aceptables de glucosa en sangre.

La insulina es muy frecuentemente administrada mediante inyección subcutánea, típicamente en el abdomen o muslos superiores. Para mantener niveles aceptables de glucosa en sangre, a menudo es necesario inyectar insulina al menos una o dos veces al día, con inyecciones complementarias de insulina de acción rápida, siendo administrada cuando sea necesario. El tratamiento agresivo de la diabetes puede requerir incluso inyecciones más frecuentes, cuando el paciente supervise fielmente los niveles de glucosa en sangre utilizando equipos diagnósticos domésticos. La presente invención tiene que ver concretamente con la administración de insulinas de acción rápida que sean capaces de proporcionar valores máximos de insulina en suero antes de una hora, y mínimos de glucosa antes de 90 minutos.

La administración de insulina por inyección es indeseable por varios aspectos. En primer lugar, muchos pacientes encuentran difícil y gravoso inyectarse ellos mismos, tan frecuentemente como sea necesario, para mantener niveles aceptables de glucosa en sangre. Tal reticencia puede conducir a una no conformidad, la cual, en la mayoría de los casos graves, puede ser amenazadora de la vida. Además, la absorción sistémica de insulina a partir de la inyección subcutánea es relativamente lenta, necesitando frecuentemente de 45 a 90 minutos, incluso cuando se emplean formulaciones de insulina de acción rápida. De este modo, ha sido un objetivo durante mucho tiempo el proporcionar formulaciones de insulina y vías de administración alternativas que eviten la necesidad de la autoinyección, y que puedan proporcionar una rápida disponibilidad sistémica de la insulina.

Se han propuesto diversas rutas alternativas de administración de insulina, incluyendo la intranasal, la intrarrectal, y la intravaginal.

Aunque estas técnicas evitan la incomodidad y la escasa conformidad asociadas con la inyección subcutánea, cada una padece de sus propias limitaciones. La intrarrectal y la intravaginal son incómodas, molestas, y la última no está disponible para la población entera de diabéticos. La liberación intranasal sería práctica y probablemente menos desagradable que la inyección, pero requiere el empleo de "intensificadores de penetración", potencialmente tóxicos, para efectuar el paso de la insulina a través de la mucosa nasal, la cual se caracteriza por una capa epitelial gruesa que es resistente al paso de macromoléculas. De interés particular para la presente invención es la liberación pulmonar de insulina donde un paciente inhala una formulación de insulina y sucede la absorción sistémica a través de la fina capa de células epiteliales en las regiones alveolares del pulmón. Tal liberación pulmonar de insulina parece proporcionar una disponibilidad sistémica más rápida de lo que lo hace la inyección subcutánea, y evita el empleo de una aguja. La liberación pulmonar de insulina, sin embargo, tiene aún que lograr una amplia aceptación. Hasta ahora, la liberación pulmonar ha sido muchísimas veces llevada a cabo mediante la nebulización de formulaciones líquidas de insulina, necesitando el empleo de molestos nebulizadores de líquidos. Además, los aerosoles formados por tales nebulizadores tienen una concentración muy baja de insulina, necesitando un gran número de inhalaciones para suministrar una dosis adecuada. La concentración de insulina está limitada debido a la baja solubilidad de la insulina en soluciones acuosas apropiadas. En algunos casos, se pueden necesitar tantas como 80 o más respiraciones para lograr una dosis adecuada, dando como resultado un tiempo de administración de 10 a 20 minutos o más.

Sería conveniente proporcionar métodos y composiciones perfeccionados para la liberación pulmonar de insulina. Sería particularmente deseable si tales métodos y composiciones fueran suficientemente apropiados para permitir la autoadministración incluso lejos del hogar, y fuesen capaces de liberar la dosis total deseada con un relativamente bajo numero de respiraciones, preferentemente menos de diez. Tales métodos y composiciones deberían proporcionar también una rápida absorción sistémica de la insulina, alcanzando preferentemente un valor máximo en suero antes de 45 minutos o menos, y unos mínimos resultantes de glucosa antes de aproximadamente una hora o menos. Tales formulaciones de acción rápida serán apropiadas, preferentemente, para su uso en protocolos de tratamiento agresivo donde se puede reducir o eliminar la inyección de insulina de acción intermedia y de largo plazo. Las composiciones de la presente invención deberían ser también estables, constando preferentemente de una formulación en polvo seco concentrada.

2. Descripción de la técnica anterior

La liberación respiratoria de soluciones acuosas de insulina aerosolizadas está descrita en algunas referencias, empezando con Gänsslen (1925) Klin. Wochenschr. 4: 71, e incluyendo Laube y col. (1993) JAMA 269: 2.106-21-9; Elliott y col. (1987) Aust. Paediatr. J. 23: 293-297; Wigley y col. (1971) Diabetes 20: 552-556. Corthorpe y col. (1992) Pharm Res 9: 764-768; Govinda (1959) Indian J. Physiol. Pharmacol. 3: 161-167; Hastings y col. (1992) J. Appl. Physiol. 73: 1.310-1.316; Liu y col. (1993) JAMA 269: 2.106-2.109; Nagano y col. (1985) Jikeikai Med. J. 32: 503-506; Sakr (1992) Int. J. Phar. 86: 1-7; y Yoshida y col. (1987) Clin. Res. 35: 160-166. La liberación pulmonar de medicamentos en polvo seco tales como insulina, en un vehículo soporte de partículas grandes, está descrito en la Patente U.S. Nº 5.254.330. En Lee y Sciara (1976) J. Pharm. Sci. 65: 567-572 se describe un inhalador de dosis medida (IDM) para liberar insulina cristalina suspendida en un propelente. En la Patente U.S. Nº 5.320.094 se describe un IDM para liberar insulina en un espaciador para regular la velocidad de flujo de inhalación. La administración intrabronquial de insulina recombinante está descrita brevemente en Schlüter y col. (Abstract) (1984) Diabetes 33: 75A y Köhler y col. (1987) Atemw. Lungenkrkh. 13: 230-232. La liberación intranasal y respiratoria de diversos polipéptidos, incluyendo la insulina, en presencia de un intensificador, están descritas en la Patente U.S. Nº 5.011.678 y Nagai y col. (1984) J. Contr. Rel. 1: 15-22. La liberación intranasal de insulina en presencia de intensificadores y/o contenida en formulaciones de liberación controlada está descrita en la Patente U.S. N^{os} 5.204.108, 4.294.829, y 4.153.689; las Solicitudes PCT WO 93/02712, WO 91/02545, WO 90/09780, y WO 88/04556; Patente británica 1.527.605; Rydén y Edman (1992) Int. J. Pharm. 83: 1-10; y Björk y Edman (1988) Int. J. Pharm. 47: 233-238. La preparación y estabilidad de la insulina amorfa fueron descritas por Rigsbee y Pikal en la American Association of Pharmaceutical Sciences (AAPS), 14-18 de noviembre de 1993, Lake Buena Vista, Florida. En la solicitud de patente europea 520 748 se describen métodos para secar por pulverización fármacos polipeptídicos, polinucleotídicos y otros lábiles, en un soporte que forma una estructura amorfa que estabiliza el fármaco.

Sumario de la invención

Según la presente invención, los métodos y composiciones para la aerosolización y liberación sistémica de insulina a un huésped mamífero, particularmente un paciente humano que padece de diabetes, proporcionan una rápida absorción dentro de la circulación sanguínea mientras se evita la inyección subcutánea. En particular, los métodos de la presente invención confían en la liberación pulmonar de insulina en forma de un polvo seco. Sorprendentemente, se ha descubierto que polvos de insulina secos inhalados se depositan en las regiones alveolares del pulmón y se absorben rápidamente, a través de las células epiteliales de la región alveolar, dentro de la circulación sanguínea. De este modo, la liberación pulmonar de polvos de insulina puede ser una alternativa eficaz a la administración mediante inyección subcutánea.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona insulina como polvo seco, por lo general, pero no necesariamente, en estado sustancialmente amorfo y se dispersa en el aire u otra corriente gaseosa fisiológicamente admisible, para formar un aerosol. El aerosol es capturado en una cámara que tiene una boquilla, donde está disponible para una posterior inhalación por el paciente. Opcionalmente, la insulina en polvo seco se combina con un soporte en polvo seco farmacéuticamente admisible, como se describe más detalladamente abajo. Preferentemente, el polvo de insulina se compone de partículas que tienen un diámetro inferior a 10 \mum, más preferentemente inferior a 7'5 \mum, y muy preferentemente por debajo de 5 \mum, estando por lo general en el intervalo de 0'1 \mum a 5 \mum. Sorprendentemente, se ha descubierto que las composiciones de insulina en polvo seco de la presente invención son absorbidas en el pulmón sin el empleo de intensificadores de penetración tales como esos necesarios para la absorción a través de la mucosa nasal y el tracto respiratorio superior.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona composiciones de insulina constando esencialmente de insulina en polvo seco que tiene un tamaño de partícula promedio por debajo de 10 \mum, la cual puede ser combinada con soportes farmacéuticos en polvo seco. La composición de insulina está preferentemente libre de intensificadores de penetración y consta de partículas que tienen un diámetro inferior a 10 \mum, preferentemente inferior a 7'5 \mum, y muy preferentemente por debajo de 5 \mum, estando por lo general en el intervalo de 0'1 \mum a 5 \mum. Por regla general, el polvo seco de insulina tendrá del 5% al 99% en peso de insulina en la composición, más generalmente del 15% al 80%, en un soporte farmacéuticamente admisible, por lo general un carbohidrato, una sal orgánica, un aminoácido, péptido, o proteína, como se describe más detalladamente más abajo.

En un tercer aspecto de la presente invención, se preparan polvos secos de insulina disolviendo insulina en un tampón acuoso para formar una solución, y secando por pulverización la solución para producir partículas sustancialmente amorfas que tienen un tamaño de partícula inferior a 10 \mum, preferentemente inferior a 7'5 \mum, y muy preferentemente por debajo de 5 \mum, estando por lo general en el intervalo de 0'1 \mum a 5 \mum. Opcionalmente, también se disuelve el soporte farmacéutico en el tampón, para formar una solución homogénea, en donde el secado por pulverización de la solución produce partículas individuales constando de insulina, tampón soporte, y cualquier otro componente que estuviera presente en la solución. Preferentemente, el soporte es un carbohidrato, una sal orgánica, un aminoácido, péptido, o proteína que produce una estructura sustancialmente amorfa en el secado por pulverización. El soporte amorfo puede ser vítreo o gomoso, e intensifica la estabilidad de la insulina durante el almacenamiento. Ventajosamente, tales formulaciones estabilizadas son también capaces de liberar insulina eficazmente en la corriente sanguínea, en la inhalación hacia las regiones alveolares de los pulmones.

Será evidente una comprensión adicional de la naturaleza y ventajas de la invención mediante referencia a las partes restantes de la especificación y dibujos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una ilustración esquemática de un sistema para aerosolizar una dosis de insulina según el método de la presente invención.

La Fig. 2 es una ilustración esquemática de un paciente inhalando una dosis aerosolizada de insulina a partir del sistema de la Fig. 1.

Las Figs. 3A y 3B son gráficos que ilustran la absorción de insulina humana recombinante en ratas, y la respuesta de glucosa resultante a continuación de la aerosolización de tres diferentes formulaciones en polvo seco. Cada punto representa el valor medio de tres ratas distintas. A tiempo cero, se conectó el generador de aerosol en polvo seco. La aerosolización terminó a los 5 minutos, 14 minutos, y 20 minutos para los polvos de 87% de insulina/citrato, 20% de insulina-manitol/citrato, y 20% de insulina-rafinosa/citrato, respectivamente. Los animales ayunaron durante la noche.

Las Figs. 4A y 4B son gráficos que ilustran los perfiles medios tiempo-concentración de insulina y glucosa en suero respectivamente, comparando las administraciones en aerosol y subcutánea en monos Cynomolgus. El valor medio para los tres monos está reportado para el grupo de aerosol, y el valor medio para cuatro monos está reportado para el grupo subcutáneo.

La Fig. 5A es un gráfico que ilustra la concentración media de insulina con el tiempo para inyección subcutánea (\circ) y para inhalación de tres bocanadas (\bullet) en humanos.

La Fig. 5B muestra la concentración media de glucosa correspondiente a las concentraciones de insulina de la Fig. 5A.

La Fig. 6A es un gráfico que ilustra la concentración de insulina en suero con el tiempo, como resultado de una inyección subcutánea (\circ) y de tres bocanadas de administración por aerosol (\bullet) en humanos.

La Fig. 6B es un gráfico que ilustra los niveles de glucosa en suero correspondientes a los niveles de insulina en la Fig. 6A.

Las Figs. 7A y 7B proporcionan una comparación de la variabilidad intersujetos de los niveles de insulina (7A) y de glucosa (7B) en suero para administración subcutánea (\circ) y administración por aerosol (\bullet).

Las Figs. 8A, 8B, y 8C muestran cromatogramas RP-HPLC de una insulina humana. La Fig. 8A es un cromatograma de un patrón de insulina realzado en ClH 10mM a 25ºC, mostrando insulina humana elucionando a 23'87 minutos y desamido insulina elucionando a 30'47 minutos. La Fig. 8B muestra un cromatograma similar de un patrón de insulina humana. La Fig. 8C muestra un cromatograma similar de una formulación de insulina secada por pulverización, reconstituida, preparada según la presente invención.

La Fig. 9 muestra un espectro ultravioleta de una formulación de insulina antes y después de secar por pulverización. No se observó dispersión de luz en el espectro visible, indicando que la insulina no se agregó durante el proceso de secado por pulverización.

Descripción detallada de formas de realización específicas

Según la presente invención, se proporciona insulina como polvo seco. Mediante "polvo seco" se quiere decir que el contenido en humedad del polvo está por debajo de aproximadamente el 10% en peso, por lo general por debajo de aproximadamente el 5% en peso, y estando preferentemente por debajo de aproximadamente el 3% en peso. Mediante "polvo" se quiere decir que la insulina consta de macropartículas de fluencia suave que tienen un tamaño seleccionado para permitir la penetración entro de los alvéolos de los pulmones, siendo preferentemente inferiores a 10 \mum de diámetro, preferentemente inferiores a 7'5 \mum, y muy preferentemente inferiores a 5 \mum, y estando por lo general en el intervalo de 0'1 \mum a 5 \mum de diámetro.

La presente invención está basada en al menos en parte de la observación inesperada de que las insulinas en polvo seco son fácilmente y rápidamente absorbidas a través de los pulmones del huésped. Fue sorprendente que las insulinas en polvo seco pudiesen alcanzar la región alveolar de los pulmones, ya que se sabe que fármacos hidrosolubles tales como las partículas de insulina son higroscópicos. Ver, por ejemplo, Byron, ed., Respiratory Drug Delivery, CRC Press, Boca Ratón (1990), pág, 150. De este modo, se habría esperado que ya que las partículas pasaban a través de las vías respiratorias del pulmón (el cual tiene una humedad relativa superior al 99% a 37ºC), las partículas individuales tendrían una tendencia a absorber agua y crecer hasta un tamaño de partícula efectivo mayor que el límite superior de 10 \mum de la presente invención. Si una fracción sustancial de las partículas de insulina fuesen mayores que el intervalo de tamaño objetivo, se supondría que las partículas se depositarían dentro de las vías aéreas centrales de los pulmones antes que en la región alveolar, limitando de este modo la liberación y posterior absorción sistémica. Además, la capa de fluido sobre las células epiteliales de los pulmones es muy delgada, por lo general una fracción del diámetro de los polvos de insulina a ser liberados. De este modo, antes de la presente invención era impredecible si las partículas secas de insulina se disolverían en la deposición dentro de las regiones alveolares de los pulmones. Sorprendentemente, los polvos secos de insulina son capaces, aparentemente, de penetrar dentro de las regiones alveolares de los pulmones y disolverse una vez que se han depositado dentro de la región alveolar del pulmón. Luego, la insulina disuelta es capaz de atravesar las células epiteliales hacia la circulación.

Actualmente se cree que la absorción eficaz de insulina resulta de una rápida disolución en la ultrafina capa (<0'1 \mum) de fluido del revestimiento alveolar. Así, las partículas de la presente invención tienen un tamaño medio que es 10 a 50 veces mayor que la capa de fluido del pulmón, haciendo inesperado que las partículas se disuelvan y la insulina sistemáticamente absorbida de una manera rápida. En efecto, como se muestra en la sección Experimental más adelante, las formulaciones secas de insulina de la presente invención pueden proporcionar valores máximos de insulina y mínimos de glucosa en suero aún más rápido que los proporcionados por la inyección subcutánea, la cual es actualmente la forma más común de administración. Sin embargo, no es necesario un entendimiento del mecanismo preciso para practicar la presente invención como se describió aquí.

Las composiciones preferidas según la presente invención estarán sustancialmente libres de intensificadores de penetración. "Intensificadores de penetración" son compuestos tensoactivos que favorecen la penetración de insulina (u otros fármacos) a través de una membrana o revestimiento mucoso, y se proponen para su uso en formulaciones intranasales, intrarrectales, e intravaginales de fármacos. Los intensificadores de penetración ejemplares incluyen sales biliares, por ejemplo, taurocolato, glicocolato y desoxicolato; fusidatos, por ejemplo, taurodehidrofusidato; y detergentes biocompatibles, por ejemplo, Tweens, Laureth-9, y otros. Sin embargo, el empleo de intensificadores de penetración en formulaciones para los pulmones es, generalmente, indeseable porque la barrera sanguínea epitelial en el pulmón puede ser adversamente afectada por tales compuestos tensoactivos. Sorprendentemente, se ha descubierto que las composiciones de insulina en polvo seco de la presente invención son rápidamente absorbidas en los pulmones, sin la necesidad de emplear intensificadores de penetración.

Polvos secos de insulina, apropiados para su uso en la presente invención, incluyen insulinas amorfas, insulinas cristalinas, y mezclas de ambas insulinas amorfas y cristalinas. Las insulinas en polvo seco se preparan, preferentemente, mediante secado por pulverización bajo condiciones que produzcan un polvo, sustancialmente amorfo, que tenga un tamaño de partícula dentro del intervalo dicho arriba. Alternativamente, se podrían preparar insulinas amorfas mediante liofilización (secado por congelación), secado al vacío, o secado por evaporación de una solución de insulina apropiada bajo condiciones para producir la estructura amorfa. La insulina amorfa así producida puede ser luego molida o molturada para producir partículas dentro del intervalo de tamaño deseado. Las insulinas en polvo seco cristalinas pueden ser formadas por molturación o molienda por chorro de la insulina cristalina a granel. El método preferido para formar polvos de insulina constando de macropartículas en el intervalo de tamaño deseado es el secado por pulverización, donde insulina pura a granel (por lo general en forma cristalina) es disuelta en primer lugar en un tampón acuoso fisiológicamente admisible, típicamente un tampón de citrato que tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 2 a 9. La insulina se disuelve a una concentración del 0'01% en peso al 1% en peso, por lo general del 0'1% al 0'2%. Después, las soluciones pueden ser secadas por pulverización en un equipo de secado por pulverización convencional de proveedores comerciales tales como Buchi, Niro, y otros, produciendo un producto en macropartículas sustancialmente amorfo.

Los polvos secos de insulina pueden constar, esencialmente, de partículas de insulina dentro del intervalo de tamaño requerido y estar sustancialmente libres de cualquier otro componente biológicamente activo, soportes farmacéuticos, y otros. Tales formulaciones "puras" pueden incluir componentes secundarios, tales como conservantes, presentes en cantidades bajas, típicamente por debajo del 10% en peso y, por lo general, por debajo del 5% en peso. Utilizando tales formulaciones puras, se puede reducir sustancialmente el número de inhalaciones necesarias para dosis incluso altas, a menudo a únicamente una sola respiración.

Los polvos de insulina de la presente invención pueden ser combinados opcionalmente con soportes o excipientes farmacéuticos que sean adecuados para administración respiratoria y pulmonar. Tales soportes pueden servir simplemente como agentes aumentadores de volumen cuando se desee reducir la concentración de insulina en el polvo que se va a liberar a un paciente, pero también pueden servir para aumentar la estabilidad de las composiciones de insulina y mejorar la dispersabilidad del polvo dentro de un dispositivo para dispersión de polvos y proporcionar una liberación más eficaz y reproducible de la insulina, y para mejorar las características de manipulación de la insulina tales como fluidez y consistencia para facilitar la fabricación y llenado del polvo.

Las materias soporte apropiadas pueden estar en forma de un polvo amorfo, un polvo cristalino, o una combinación de polvos amorfo y cristalino. Las materias apropiadas incluyen (a) carbohidratos, por ejemplo, monosacáridos tales como fructosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y otros; disacáridos tales como lactosa, trehalosa, celobiosa, y otros; ciclodextrinas tales como 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina; y polisacáridos tales como rafinosa, maltodextrinas, dextranos, y otros; (b) aminoácidos tales como glicina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, lisina, y otros; (c) sales orgánicas preparadas a partir de ácidos y bases orgánicos, tales como citrato sódico, ascorbato sódico, gluconato magnésico, gluconato sódico, clorhidrato de trometamina, y otras; (d) péptidos y proteínas tales como aspartamo, albúmina de suero humano, gelatina, y otros; (e) alditoles tales como manitol, xilitol, y otros. Un grupo preferido de soportes incluye lactosa, trehalosa, rafinosa, maltodextrinas, glicina, citrato sódico, clorhidrato de trometamina, albúmina de suero humano, y manitol.

Tales materias soporte pueden ser combinadas con la insulina antes de secar por pulverización, esto es, añadiendo la materia soporte a la solución tampón que se prepara para secar por pulverización. De esa manera, la materia soporte será formada simultáneamente como parte de las partículas de insulina. Típicamente, cuando se forma el soporte mediante secado por pulverización junto con la insulina, la insulina estará presente en cada partícula individual en un porcentaje en peso en el intervalo del 5% al 95%, preferentemente del 20% al 80%. El resto de la partícula será materia soporte principalmente (típicamente siendo el 5% al 95%, por lo general siendo el 20% al 80% en peso), pero también incluirá tampón(s) y puede incluir otros componentes como se describió antes. Se ha descubierto que la presencia de materia soporte en las partículas que se liberan en la región alveolar del pulmón (esto es, esas en el intervalo de tamaño requerido por debajo de 10 \mum) no interfiere significativamente con la absorción sistémica de insulina.

Alternativamente, los soportes pueden ser preparados por separado en forma de un polvo seco y combinados mezclando con la insulina en polvo seco. Los soportes en polvo, preparados por separado, serán por lo general cristalinos (para evitar la absorción de agua), pero en algunos casos podrían ser amorfos o mezclas de cristalinos y amorfos. Se puede seleccionar el tamaño de las partículas del soporte para mejorar la fluencia del polvo de insulina, estando típicamente en el intervalo de 25 \mum a 100 \mum. En este intervalo de tamaño, las partículas del soporte generalmente no penetrarán dentro de la región alveolar del pulmón, y a menudo se separarán de la insulina en el dispositivo de liberación, antes de la inhalación. De este modo, las partículas que penetren dentro de la región alveolar del pulmón constarán, esencialmente, de insulina y tampón. Una materia soporte preferida es manitol cristalino teniendo un tamaño en el intervalo mencionado anteriormente.

Los polvos secos de insulina de la presente invención también se pueden combinar con otros componentes activos. Por ejemplo, puede ser conveniente combinar pequeñas cantidades de amilina, o análogos activos de amilina, en los polvos de insulina para mejorar el tratamiento de la diabetes. La amilina es una hormona que se secreta con la insulina, a partir de las células \beta pancreáticas, en individuos normales (no diabéticos). Se cree que la amilina modula la actividad de la insulina in vivo, y se ha propuesto que la administración simultánea de amilina con insulina podría mejorar el control de glucosa en sangre. Combinando amilina en polvo seco con insulina en las composiciones de la presente invención se proporcionará un producto particularmente conveniente para conseguir tal administración simultánea. La amilina se puede combinar con insulina desde el 0'1% en peso hasta el 10% en peso (basado en el peso total de insulina en una dosis), preferentemente desde el 0'5% en peso hasta el 2'5% en peso. La amilina está disponible a partir de proveedores comerciales tales como Amylin Corporation, San Diego, California, y puede ser formulada fácilmente en las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, la amilina puede ser disuelta en soluciones acuosas u otras apropiadas junto con la insulina, y soportes opcionales, y la solución secada por pulverización para producir el producto en polvo.

Las composiciones de insulina en polvo seco de la presente invención son aerosolizadas, preferentemente, mediante dispersión en una corriente fluyente de aire u otro gas fisiológicamente admisible, de una manera convencional. Un sistema apropiado para tal dispersión está descrito en la solicitud copendiente Nº de Serie 07/910.048, la cual ha sido publicada como WO 93/00951, las revelaciones íntegras de la cual están incorporadas aquí como referencia. Aludiendo aquí a la Fig. 1, se introduce polvo seco de insulina de fluencia suave dentro de una corriente de aire o gas a alta velocidad, y la dispersión resultante se introduce en una cámara de retención 10. La cámara de retención 10 incluye una boquilla 12 en el extremo puesto al punto de entrada de la dispersión de polvo en aire. El volumen de la cámara 10 es suficientemente grande para capturar la dosis deseada, y opcionalmente puede tener deflectores y/o válvulas de paso único para favorecer la contención. Después de que una dosis de polvo de insulina haya sido capturada en la cámara 10, un paciente P (Fig. 2) inhala en la boquilla 12 para arrastrar la dispersión aerosolizada hacia dentro de sus pulmones. A medida que el paciente P inhala, el aire de composición es introducido a través de un orificio de entrada 14 de aire orientado tangencialmente, por lo que el aire fluye en un modelo vortical para arrastrar la insulina aerosolizada desde la cámara hacia el interior de los pulmones del paciente. El volumen de la cámara y la dosis aerosolizada son tales que un paciente es capaz de inhalar completamente la dosis entera de insulina aerosolizada seguida por aire suficiente para asegurar que la insulina alcance las regiones alveolares inferiores del pulmón.

Tales polvos de insulina aerosolizados son particularmente útiles, en lugar de inyecciones subcutáneas de insulina de acción rápida, en el tratamiento de la diabetes y de deficiencias de insulina afines. Sorprendentemente, se ha descubierto que la administración en aerosol de insulina en polvo seco produce una absorción de insulina y una respuesta de la glucosa significativamente más rápidas que las que se logran mediante inyección subcutánea. De este modo, los métodos y composiciones de la presente invención serán particularmente valiosos en los protocolos de tratamiento donde un paciente supervise frecuentemente los niveles de glucosa en sangre y administre insulina cuando necesite para mantener una concentración objetivo en suero, pero también será útil siempre que se requiera la administración sistémica de insulina. El paciente puede lograr una dosificación deseada inhalando una cantidad adecuada de insulina, como se acaba de describir. La eficacia de la liberación sistémica de insulina vía el método acabado de describir estará, típicamente, en el intervalo desde aproximadamente el 15% al 30%, con dosis individuales (en una base por inhalación), estando típicamente en el intervalo desde unos 0'5 mg hasta 10 mg. Por lo general, la dosis total de insulina deseada durante una única administración respiratoria estará en el intervalo desde aproximadamente 0'5 mg hasta 15 mg. De este modo, la dosis deseada puede ser eficaz para el paciente que tome de 1 respiración a 4 respiraciones.

Los ejemplos siguientes son ofrecidos a modo de ilustración, no como limitación.

Experimental Materiales y métodos Materiales

Se obtuvo insulina-zinc humana cristalina, 26'3 Unidades/mg (Lilly, Lote nº 784KK2) de Eli Lilly and Company, Indianápolis, IN, y se descubrió que era >99% pura, como se midió mediante RP-HPLC. Se obtuvo manitol USP de Roquette Corporation (Gurnee, IL). Se compró rafinosa de Pfanstiehl Laboratories (Waukegan, IL). Se obtuvieron citrato sódico dihidrato USP, ACS y ácido cítrico monohidrato USP de J.T. Baker (Phillipsburg, NJ).

Producción de los polvos

Los polvos de insulina fueron fabricados disolviendo insulina cristalina a granel en tampón de citrato sódico conteniendo excipiente (manitol o rafinosa, o ninguno) para dar una concentración final en sólidos de 7'5 mg/ml y un pH de 6'7 \pm 0'3. El desecador por pulverización fue manejado con una temperatura de entrada entre 110ºC y 120ºC, y una velocidad de alimentación de líquido de 5 ml/minuto, produciendo una temperatura de salida entre 70ºC y 80ºC. Después, las soluciones fueron filtradas a través de un filtro de 0'22 \mum y secadas por pulverización en un Desecador por Pulverización Buche, para formar un fino polvo amorfo blanco. Los polvos resultantes fueron almacenados en recipientes tapados herméticamente, en un entorno seco (<10% HR).

Análisis de los polvos

Se midió la distribución granulométrica de los polvos mediante sedimentación centrífuga de líquidos, en un Analizador Granulométrico Horiba CAPA-700, a continuación de la dispersión de los polvos en Sedisperse A-11 (Micromeritics, Norcross, GA). El contenido de humedad de los polvos fue medido mediante la técnica de Karl Fischer utilizando un Medidor de Humedad Mitsubishi CA-06.

Se midió la integridad de la insulina antes y después de procesar el polvo, frente a un estándar de referencia de insulina humana, redisolviendo porciones pesadas de polvo en agua destilada y comparando la solución redisuelta con la solución original puesta dentro del desecador por pulverización. El tiempo de retención y el área del pico mediante RP-HPLC se utilizaron para determinar si la molécula de insulina había sido modificada o degradada químicamente en el proceso. Se utilizó la absorbancia UV para determinar la concentración de insulina (a 278 nm) y la presencia o ausencia de agregados insolubles (a 400 nm). Además, se midieron los pHs de las soluciones de partida y reconstituidas. La naturaleza amorfa del polvo de insulina fue confirmada mediante microscopía con luz polarizante.

Exposiciones de ratas a aerosoles

Se condujeron experimentos en ratas en una cámara de exposición a aerosoles. Durante la noche ayunaron ratas hembra (280-300 g). Los animales (21-24/experimento) fueron colocados en tubos de Plexiglás e instalados en una cámara de exposición a aerosoles de morro único, de 48 orificios (In-Tox Products, Alburquerque, NM). El flujo de aire hacia la zona de respiración fue mantenido a 7'2-9'8 litros/minuto y extraído por vacío para que hubiera una leve presión negativa (\sim1'5 cm de H_{2}O) en la cámara, como se midió mediante un manómetro magnehélico. Los tiempos de exposición al aerosol fueron entre 5-20 minutos dependiendo de cuanto polvo se alimentó dentro de la cámara. Los polvos fueron alimentados a mano dentro de una pequeña boquilla Venturi que dispersaba las partículas de polvo para formar una fina nube de aerosol. La boquilla Venturi fue manejada a una presión superior a 5 psig, y el flujo fue fijado en 7'2 l/minuto hasta 9'8 l/minuto. La boquilla Venturi estaba encajada en el fondo de una cámara de dispersión (750 ml) de Plexiglás transparente, la cual pasaba directamente el aerosol dentro de una cámara de exposición de morro único.

Calibración de la cámara de aerosol para ratas

La concentración del polvo en la zona de respiración fue medida tomando muestras múltiples reguladas del filtro en la zona de respiración, con soportes para filtro In-Tox, a un flujo de vacío de 2 litros/minuto. La cámara fue calibrada con y sin animales. La masa de polvo fue determinada gravimétricamente. El tamaño de partícula de los polvos en la zona de respiración fue medido con un impactor en cascada (In-Tox Products) colocado en un agujero de respiración, y manejado a un flujo de 2 litros/minuto. En cada fase se determinó gravimétricamente la masa de polvo.

Cada ensayo del polvo utilizó 21-24 ratas y las exposiciones al aerosol duraron 5-20 minutos. Se mataron tres ratas a tiempo 0 y luego a los \sim7, 15, 30, 60, 90, 120, 180, y 240 minutos después de la terminación de la exposición al aerosol. Los animales fueron anestesiados, abiertos sus abdómenes, y de la aorta ventral se extrajo una gran muestra de sangre. Luego, se mataron los animales por dislocación cervical.

Se dejó que la sangre coagulase a temperatura ambiente durante 30 minutos, y luego se centrifugó durante 20 minutos a 3.500 rpm en tubos separadores de suero. El suero fue analizado inmediatamente o congelado a -80ºC hasta su análisis. Tan pronto como fue posible (0-7 minutos) después de la terminación de la dosificación de aerosol, se mataron 3 ratas, se extrajo su sangre y se lavaron sus pulmones por inyección con seis aclarados de 5 ml de salino tamponado con fosfato (PBS). La cantidad de insulina en la muestra de lavado combinada fue utilizada como dosis de aerosol para la rata en los cálculos de biodisponibilidad.

Sistema de exposición a primates

Para los estudios de aerosoles en primates (3-4 animales/grupo) se utilizaron monos Cynomolgus macho de la estirpe Macaca fascicularis (2-5 kg) (Charles River Primates, Inc.), capturados en estado salvaje. Los animales fueron inyectados subcutáneamente con Humulin (Eli Lilly, Indianápolis, Indiana) o expuestos a un aerosol en polvo de insulina. Cada animal fue colocado en una unidad de exposición de cabezal único, para proporcionar un suministro reciente de la atmósfera de ensayo a una adecuada velocidad de flujo (7 l/minuto) y suministrar las necesidades mínimas de oxígeno del animal. Los animales estaban constreñidos en un aparato parecido a un asiento que los colocaba en una posición sentada vertical. Las capuchas eran transparentes, permitiendo a los animales una completa visualización de su entorno. Se puso un catéter de soporte en la pierna para que se pudieran tomar muestras de sangre en cualquier momento. Los monos estuvieron totalmente despiertos durante el procedimiento entero y parecían tranquilos. La sangre de primate fue tratada igual que la de rata (ver arriba).

El sistema de exposición a aerosol para primates incluía un monitor de respiración que permitía la cuantificación de la cantidad de aire inhalado por cada mono. Este valor, asociado con mediciones de la concentración de insulina en el aire inspirado, permitió el cálculo de exactamente cuanta insulina fue inhalada por cada animal.

Pruebas en humanos

Se administró subcutáneamente insulina a 24 sujetos humanos normales, así como mediante inhalación de polvos de insulina secos aerosolizados. Cada inyección subcutánea constaba de 10'4 U de Humulin R, 100 U/ml (Eli Lilly, Indianápolis, Indiana). Los polvos de insulina secos eran amorfos y preparados por secado por pulverización como se describió antes, con un 20% en peso de excipiente manitol. Las dosis (5 mg) del polvo de insulina seco fueron dispersadas en una corriente de aire a alta velocidad para producir un fino aerosol que fue capturado en una cámara. Cada sujeto inhaló el polvo del aerosol tomando una respiración lenta y profunda de cada bolo o "bocanada" de aerosol. El polvo fue administrado en tres bocanadas (para una dosificación de 31'9 U). Se determinaron los niveles de insulina y glucosa en suero con el tiempo, como se describe abajo.

Ensayos en suero

Se determinaron los niveles de insulina en suero en ratas, primates, y humanos utilizando juegos de radioinmunoensayo Coat-A-Count para insulina humana (Diagnostic Products Corporation, Los Ángeles, CA). Se aplicaron curvas patrón con cada lote de muestras. La sensibilidad del ensayo fue aproximadamente 43 pg/ml. La variabilidad interna del ensayo (%CV) es <5%. Los ensayos de glucosa fueron realizados por California Veterinary Diagnostics, Inc. en West Sacramento, CA, utilizando el Glucose/HK Reagent System Pack para el Analizador 747 de Boehringer Mannheim/Hitachi. La variabilidad interna del ensayo (%CV) es <3%.

En los experimentos con ratas, se calcularon las biodisponibilidades relativas del aerosol comparando el área de la insulina inmunorreactiva (IRI) ajustada a la dosis, bajo la curva (AUC) del perfil de concentración-tiempo, con la obtenida a partir de la inyección subcutánea. En ratas, la masa de insulina total de lavado fue utilizada como la dosis de aerosol. Alguna insulina se absorbe antes de que los pulmones puedan ser lavados, de manera que la dosis estimada mediante esta técnica es probablemente una insignificante infravaloración de la dosis total depositada. No se hicieron correcciones para esta supuesta pérdida.

En los experimentos con monos, se calcularon las biodisponibilidades relativas de manera similar a las de las ratas arriba, excepto que, en lugar de utilizar como dosis de aerosol insulina del pulmón lavado, se utilizó la cantidad total de insulina inhalada. En las ratas, solamente la materia depositada en los pulmones, no la insulina depositada en los conductos nasales y garganta, fue incluida en la estimación de la dosis. En los monos, en la estimación de la dosis se incluyó toda la insulina que penetró en los animales.

Resultados de la absorción de insulina en ratas

Todos los polvos de insulina utilizados en los estudios en animales tenían tamaños de partícula (diámetros medios de masa) oscilando entre 1-3 \mum, y contenidos en humedad <3%. La pureza en insulina de los polvos, medida mediante RP-HPLC, fue >97%. En la Fig. 8C se muestran cromatogramas representativos de la formulación de insulina al 20%. Los polvos produjeron una solución transparente en la reconstitución con agua pura, con un valor de absorbancia en el ultravioleta <0'01 a 400 nm, y un pH de 6'7 \pm 0'3. En la Fig. 9 se muestran espectros ultravioletas (UV) representativos para la formulación de insulina al 20%.

Las tres formulaciones en polvo de insulina siguientes fueron ensayadas en ratas como aerosoles en la cámara de exposición In-Tox de 48 orificios.

1. 87'9% de insulina; 11'5% de citrato sódico; 0'6% de ácido cítrico.

2. 20% de insulina; 66% de manitol; 12'4% de citrato sódico; 0'6% de ácido cítrico.

3. 20% de insulina; 66% de rafinosa; 12'4% de citrato sódico; 0'6% de ácido cítrico.

La Tabla 1 lista las mediciones clave en los tres diferentes estudios de exposición en ratas, incluyendo las caracterizaciones del aerosol en las condiciones de funcionamiento de la zona y cámara de respiración. Una fracción del polvo alimentado dentro de la boquilla Venturi alcanzó las zonas de respiración de las ratas (34%-67%) debido a las pérdidas en las paredes por el empotramiento y dispersión incompleta del polvo durante la alimentación del polvo. Sin embargo, el tamaño de partícula del aerosol en la zona de respiración era el ideal para la deposición pulmonar (1'3-1'9 \mum), y era algo más pequeño que el tamaño de partícula de la formulación original (2'0-2'8 \mum) debido a la pérdida selectiva de las partículas mayores en la cámara de exposición al animal.

TABLA 1 Mediciones de la exposición de aerosol en ratas

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La Tabla 2 muestra los resultados de insulina y glucosa en suero en ratas a partir de los tres aerosoles y un estudio SC. Las Figs. 3A y 3B muestran los perfiles concentración-tiempo de insulina inmunorreactiva (IRI) en suero y los perfiles concentración-tiempo de glucosa en suero para las tres formulaciones administradas mediante aerosol. La Tabla 3 presenta el t_{max} de la insulina y el t_{min} de la glucosa a partir de los diferentes estudios, así como la biodisponibilidad relativa del aerosol comparado con la inyección SC.

TABLA 2 Resultados de insulina y glucosa en suero en ratas

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TABLA 3 Una comparación de insulina en aerosol y subcutánea en animales

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Las tres formulaciones proporcionaron una rápida absorción de insulina hacia la circulación sistémica de las ratas (Figs. 3A y 3B). La biodisponibilidad y la respuesta de la glucosa fueron superiores para el polvo de 20% de insulina/manitol (Tabla 3), aunque sin realizar muchos experimentos replicados, es incierto si la diferencia fue significativa.

Resultados en primates

Una dosis idéntica a la que se utilizó en la prueba en humanos (0'2 U/kg, \sim 27 \mug/mono) fue inyectada en cuatro monos para proporcionar los datos SC con los que comparar los resultados de aerosol (Figs. 4A y 4B). La Tabla 4 muestra los datos de exposición a aerosol en monos. La Tabla 5 muestra las insulinas y glucosas medias en suero para la exposición a aerosol y el estudio subcutáneo. La dosis en aerosol produjo una robusta respuesta (dosis alta) de la insulina y glucosa. La Fig. 4 muestra una comparación de los perfiles de insulina promedio en suero a partir de los dos aerosoles y un estudio SC. A partir de los AUCs de estos perfiles, se calculó que la biodisponibilidad relativa de la insulina en aerosol era del 12%.

TABLA 4 Datos de exposición a aerosol en monos

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Resultados en humanos

Abajo, en la Tabla 5, se exponen los resultados comparativos entre la liberación respiratoria y la inyección subcutánea. La liberación respiratoria en aerosol produjo una absorción más rápida (valor máximo a los 20 minutos) que la inyección (valor máximo a 60 minutos), con una respuesta de glucosa más rápida (mínimo a los 60 minutos) que con la inyección (mínimo a los 90 minutos). La reproducibilidad fue tan buena, sino mejor, con aerosol que con inyección en la respuesta de la insulina y glucosa. Las dosis para inyección fueron cuidadosamente ajustadas para el peso, las de aerosol no. La actividad biológica de la insulina en aerosol, basada la respuesta de la glucosa, con respecto a la inyección, fue del 28-36%. La biodisponibilidad de la insulina en aerosol, basada en el área bajo la curva de la insulina, con respecto a la inyección, fue del 22'8% para el grupo de 3 bocanadas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Resultados de insulina y glucosa en suero en humanos

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Los resultados de las pruebas en humanos están presentados además en las Figs. 5A-5B. La Fig. 5A muestra la insulina media en suero con el tiempo para inyección subcutánea (\circ), inhalación (3 bocanadas, \bullet). Los niveles medios de glucosa en suero están presentados, de manera similar, en la Fig. 5B. En las Figs. 6A y 6B, respectivamente, se muestran los valores máximos de insulina y mínimos de glucosa, mientras que en las Figs. 7A y 7B se presentan la variabilidad intersujetos en insulina y glucosa en suero, respectivamente.

Además, las inspiraciones poco profundas (respiración corriente) de los monos durante las exposiciones a aerosol no representan la maniobra de respiración óptima para deposición profunda en los pulmones. En humanos se observó una biodisponibilidad superior (Tabla 5), como se esperaba, cuando se utilizó la maniobra de respiración óptima y se tomaron los bolos de aerosol por inhalación oral antes que por inhalación nasal.

Aunque la invención anterior ha sido descrita con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo, con fines de claridad de comprensión, será obvio que se pueden practicar algunos cambios y modificaciones dentro del campo de aplicación de las reivindicaciones adjuntadas.

Claims (13)

1. Un método para aerosolizar una dosis de insulina, dicho método comprendiendo:

proporcionar insulina como polvo seco,

dispersar una cantidad del polvo seco en una corriente gaseosa para formar un aerosol; y

capturar el aerosol en una cámara que tiene una boquilla.

2. Un método como en la Reivindicación 1, en donde la insulina está sustancialmente libre de intensificadores de penetración.

3. Un método como en la Reivindicación 1, en donde la insulina está presente en un soporte en polvo seco a una concentración en peso en el intervalo de aproximadamente el 5% al 99%, en donde el soporte en polvo consta de un carbohidrato, sal orgánica, aminoácido, péptido o proteína.

4. Un método como en la Reivindicación 1, en donde el polvo seco de insulina consta de partículas que tienen un tamaño medio por debajo de 10 \mum.

5. Un método como en la Reivindicación 1, en donde el polvo seco consta de partículas individuales que incluyen insulina y una materia soporte, en donde la insulina está presente en las partículas individuales desde el 5% al 99% en peso.

6. Un método para preparar una composición estable en polvo seco de insulina, dicho método comprendiendo:

disolver la insulina en un tampón acuoso para formar una solución; y

secar por pulverización la solución para producir partículas sustancialmente amorfas que tienen un tamaño medio por debajo de 10 \mum.

7. Un método como en la Reivindicación 6, en donde la insulina se disuelve en un tampón acuoso conjuntamente con un soporte farmacéutico, en donde se produce un polvo seco que tiene insulina desde el 5% hasta el 99% en peso, presente en partículas individuales, al secar por pulverización y en donde el soporte farmacéutico es un carbohidrato seleccionado del grupo que se compone de manitol, rafinosa, lactosa, maltodextrina y trehalosa, una sal orgánica seleccionada del grupo que se compone de citrato sódico, gluconato sódico, acetato sódico y ascorbato sódico, un aminoácido, un péptido, o una proteína, el cual produce un polvo en el secado por pulverización.

8. Una composición de insulina para liberación pulmonar, dicha composición constando de partículas individuales que incluyen insulina en polvo amorfo, secado por pulverización, presente desde el 5% hasta el 99% en peso en una materia soporte farmacéutica, y tienen un tamaño por debajo de 10 \mum.

9. Una composición de insulina como en la Reivindicación 8, en donde la composición está sustancialmente libre de intensificadores de penetración.

10. Una composición de insulina como en la Reivindicación 8, en donde la materia soporte farmacéutica consta de un carbohidrato seleccionado del grupo que se compone de manitol, rafinosa, lactosa, maltodextrina y trehalosa, o de una sal orgánica seleccionada del grupo que se compone de citrato sódico, gluconato sódico, y ascorbato sódico.

11. Una composición de insulina como en la Reivindicación 8, constando esencialmente de insulina en polvo seco teniendo un tamaño medio de partícula por debajo de 10 \mum.

12. El empleo de insulina seca en la fabricación de un medicamento para liberación pulmonar.

13. El empleo como se reclamó en la Reivindicación 8, en donde la insulina está en forma de una composición de insulina como se definió en cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 11.