JP5749155B2 - プロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログ - Google Patents

プロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログ Download PDF

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Description

本発明は、プロテアーゼに対する耐性を示す新規のアシル化インスリンアナログ、このようなインスリンアナログの調製方法、本発明のインスリンアナログを含有するインスリン調製物、及びこれらのインスリンアナログを使用する真性糖尿病の処置方法に関する。
真性糖尿病は、グルコースを利用する能力が部分的又は完全に喪失している代謝性疾患である。全人口の約５％が糖尿病に罹患しており、疾患は流行となる割合に近づいている。１９２０年代にインスリンが導入されて以来、真性糖尿病の処置を改善するための、絶え間ない努力がなされている。糖尿病に罹患している人々は、数十年以上、長期間にわたる処置を受けているために、安全で簡便であり、生活の質を改善するインスリン製剤が深刻に必要とされている。
経口経路は、薬剤投与で最も幅広く使用されている経路であり、特に長期治療を受けている患者に、一般に非常によく受け入れられている。しかしながら、治療用ペプチド又はタンパク質の投与は、胃腸(ＧＩ)管及び腸管粘膜での酵素的分解、薬剤排出ポンプ、腸粘膜からの不十分で変動する吸収、並びに肝臓での初回通過代謝等のいくつかの障壁のために、多くの場合、好ましい経口投与よりも、非経口投与に限定されている。
通常、インスリン製剤は、皮下注射により投与される。しかしながら、他の経路、例えば経口又は肺による投与は、患者のコンプライアンス、安全性及び簡便性のために有利である。商業的に入手可能なインスリン製剤のいくつかは、作用発現が速いことで特徴付けられ、他の製剤は、作用発現は比較的遅いが、程度の差はあるが、長時間にわたる作用性を示す。様々な作用期間(作用プロファイル)を有する非常に多様なインスリンが市場に存在することは、糖尿病患者にとって非常に重要である。簡潔に述べると、インスリンは、速効型、中間型又は遅効型に分類することができる。
国際公開第２００８／０３４８８１号は、少なくとも２のアミノ酸が親水性アミノ酸で置換されているある種のインスリンアナログに関するもので、ここで、そのインスリンアナログはアシル化されていない。
欧州特許出願公開第２００８／０６０７３３号及び欧州特許出願公開第２００８／０６０７３３号は、ある種のアシル化インスリンアナログに関するもので、ここで、そのインスリンアナログは、Ａ２１アミノ酸にＣ末端が結合したアミノ酸又はペプチドを有する伸長部を含む。
欧州特許出願公開第２００８／０６０７３４号は、アシル部分が親インスリンに結合しているある種のアシル化インスリンに関するもので、そのアシル部分はアミノ酸を含むアルキレングリコールの繰り返し単位を含む。
発明の態様
この発明の態様は、経口投与された場合に、血糖値の満足な制御をもたらしうるインスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、経口投与された場合に、グルコースレベルを長時間低下可能なインスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、経口投与された場合に、グルコースレベルを長時間低下可能な基礎インスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、経口投与された場合に、１日に３回投与した後、血糖値を満足に制御可能な基礎インスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、経口投与された場合に、１日に２回投与した後、血糖値を満足に制御可能な基礎インスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、経口投与された場合に、１日に１回投与した後、血糖値を満足に制御可能な基礎インスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、親水性である基礎インスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、ヒトインスリンよりも親水性である基礎インスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、ここに記載する相対的疎水性(ｋ'ｒｅｌ)により測定される場合、ヒトインスリンよりも疎水性ではない基礎インスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、ここに記載する相対的疎水性(ｋ'ｒｅｌ)により測定される場合、同様のアシル部分でアシル化された、同様のプロテアーゼ安定していない親インスリンよりも疎水性ではない基礎インスリンアナログを提供することに関する。本発明の基礎インスリンアナログのｋ'ｒｅｌは、好ましくは５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは２未満、より好ましくは１未満、より好ましくは０．８未満、より好ましくは０．６未満、より好ましくは０．５未満、より好ましくは０．４未満、より好ましくは０．３未満、より好ましくは０．２未満、より好ましくは０．１未満である。
この発明の他の態様は、経口投与された場合に、満足のいく生物学的利用能を有する基礎インスリンアナログを提供することに関する。同様の投与量で与えられる、プロテアーゼ安定化変異を有さない同様のアシル化インスリンの生物学的利用能と比較して、この発明の好ましい化合物の生物学的利用能は、プロテアーゼ安定していない比較体よりも、少なくとも１０％、好ましくは２０％、好ましくは２５％、好ましくは３０％、好ましくは３５％、好ましくは４０％、好ましくは４５％、好ましくは５０％、好ましくは５５％、好ましくは６０％、好ましくは６５％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは１００％高い。
この発明の他の態様は、経口投与された場合に、満足のいく生物学的利用能を有する基礎インスリンアナログを提供することに関する。この発明の好ましい化合物の生物学的利用能は、(静脈投与に対して)少なくとも０．３％、好ましくは＞０．５％、好ましくは＞１％、好ましくは＞１．５％、好ましくは＞２％、好ましくは＞２．５％、好ましくは＞３％、好ましくは＞３．５％、好ましくは＞４％、好ましくは＞５％、好ましくは＞６％、好ましくは＞７％、好ましくは＞８％、好ましくは＞９％、好ましくは＞１０％である。
この発明の他の態様は、静脈内注入により投与された場合に、満足のいく効力を有する基礎インスリンアナログを提供することに関する。ヒトインスリンの効力と比較して、本発明の好ましいプロテアーゼ安定化インスリンアナログの効力は、好ましくは＞５％、好ましくは＞１０％、好ましくは＞２０％、好ましくは＞３０％、好ましくは＞４０％、好ましくは＞５０％、好ましくは＞７５％、及び好ましくは＞１００％である。
この発明の他の態様は、肺投与された場合に、血糖値を満足に制御可能なインスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、肺投与された場合に、比較的ゆっくりと作用発現し、及び／又は程度の差はあるが長時間作用しつつ、血糖値を満足に制御可能なインスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、肺投与された後、満足のいく程度に長時間作用するインスリンアナログを提供することに関する。同様の投与量で与えられる、プロテアーゼ安定化変異を有さない同様のアシル化インスリンと比較して、この発明の好ましい化合物の作用時間は、比較体よりも、少なくとも１０％、好ましくは２０％、好ましくは２５％、好ましくは３０％、好ましくは３５％、好ましくは４０％、好ましくは４５％、好ましくは５０％、好ましくは５５％、好ましくは６０％、好ましくは６５％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは１００％、好ましくは１００％以上長い。作用時間は、血糖が抑制される時間、又は例えばｔ１／２又はＭＲＴ(平均滞留時間)等の関連薬物動態学的特性の測定により、決定することができる。
この発明の他の態様は、満足のいく肺生物学的利用能を有するインスリンアナログを提供することに関する。ヒトインスリンの生物学的利用能と比較して、又は同様の投与量で与えられるプロテアーゼ安定化変異を有さない同様のアシル化インスリンと比較して、この発明の好ましい化合物の生物学的利用能は、比較体よりも、少なくとも１０％、好ましくは２０％、好ましくは２５％、好ましくは３０％、好ましくは３５％、好ましくは４０％、好ましくは４５％、好ましくは５０％、好ましくは５５％、好ましくは６０％、好ましくは６５％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは１００％、好ましくは１００％以上高い。
この発明の他の態様は、増加した見かけのインビボ効力を有するインスリンアナログを提供することに関する。
この発明の他の態様は、経口生物学的利用能を有し、長時間作用するインスリンを提供することに関する。
この発明の他の態様は、ヒトインスリンの安定性と比較して、増加したタンパク質分解安定性を有するインスリンアナログを提供することに関する。ヒトインスリンと比較して、この発明の好ましい化合物のタンパク質分解安定性は、２倍、好ましくは３倍、好ましくは３、好ましくは４、好ましくは５、好ましくは６、好ましくは７、好ましくは８、好ましくは９、好ましくは１０、好ましくは１２、好ましくは１４、好ましくは１６、好ましくは１８、好ましくは２０、好ましくは２５、好ましくは２５倍以上安定している。タンパク質分解安定性は、タンパク質分解酵素、例えばここに記載の腸酵素の抽出物(の混合物)にインスリンを暴露することにより測定することができる。
この発明の目的は、従来技術の少なくとも一の不具合を克服又は改善し、又は有用な代替物を提供することにある。
＜定義＞
ここで、インスリンなる用語は、自然に生じるインスリン、例えばヒトインスリン、並びにそのインスリンアナログをカバーする。ヒトインスリンは、それぞれ２１及び３０のアミノ酸残基を有し、２つのシステインジスルフィド架橋により互いに連結している、いわゆるＡ及びＢ鎖といった２つのポリペプチド鎖からなる。
ここで、アミノ酸残基なる用語は、水素原子がアミノ基から除去された、及び／又はヒドロキシ基がカルボキシ基から除去された、及び／又は水素原子がメルカプト基から除去されたアミノ酸をカバーする。不正確ではあるが、アミノ酸残基をアミノ酸と言う場合がある。
ここで、疎水性アミノ酸は、自然に生じるアミノ酸であるトリプトファン(Ｔｒｐ、Ｗ)、フェニルアラニン(Ｐｈｅ、Ｆ)、バリン(Ｖａｌ、Ｖ)、イソロイシン(Ｉｌｅ、Ｉ)、ロイシン(Ｌｅｕ、Ｌ)及びチロシン(Ｔｙｒ、Ｙ)と理解される(()内に１文字及び３文字略語を付与)。
ここで、親水性アミノ酸は、上述した疎水性アミノ酸ではない天然のアミノ酸であると理解される。一実施態様において、本発明の親水性の酸は：グルタミン酸(Ｇｌｕ、Ｅ)、アスパラギン酸(Ａｓｐ、Ｄ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ、Ｈ)、グルタミン(Ｇｌｎ、Ｑ)、アスパラギン(Ａｓｎ、Ｎ)、セリン(Ｓｅｒ、Ｓ)、スレオニン(Ｔｈｒ、Ｔ)、プロリン(Ｐｒｏ、Ｐ)、グリシン(Ｇｌｙ、Ｇ)、リジン(Ｌｙｓ、Ｋ)及びアルギニン(Ａｒｇ、Ｒ)からなる群から選択される。さらなる実施態様において、本発明の親水性アミノ酸は：グルタミン酸(Ｇｌｕ、Ｅ)、アスパラギン酸(Ａｓｐ、Ｄ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ、Ｈ)、グルタミン(Ｇｌｎ、Ｑ)、アスパラギン(Ａｓｎ、Ｎ)、リジン(Ｌｙｓ、Ｋ)及びアルギニン(Ａｒｇ、Ｒ)からなる群から選択される。
ここで、インスリンアナログなる用語は、天然インスリン中に生じる一又は複数のアミノ酸残基を欠失及び／又は置換する(置き換える)ことにより、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基を付加することにより、例えばヒトインスリン等の自然に生じるインスリンの構造体から形式上誘導可能な分子構造体を有するポリペプチドをカバーする。付加及び／又は置換されたアミノ酸残基は、コード性アミノ酸残基又は他の自然に生じるアミノ酸残基又は純粋に合成されたアミノ酸残基のいずれかとすることができる。好ましい実施態様において、インスリンアナログは、ヒトインスリンと比較して、２又はそれ以上の変異を有する。
ここで、プロテアーゼ安定化インスリンなる用語は、付加されたアシル部分を有さないインスリンを意味する。前記プロテアーゼ安定化インスリンは、プロテアーゼによる分解に対して、改善された安定性を有する。
ここで、親インスリンなる用語は、付加されたアシル部分を有さず、プロテアーゼによる分解に対する安定性を改善するための変異がなされていないインスリンを意味する。前記親インスリンは、場合によってはヒトインスリンに対して変異している。よって、親インスリンは、上述したインスリンアナログでもある。ここで、親インスリン及びプロテアーゼ安定していないインスリンなる用語は、同様の化合物をカバーする。
ここで、変異なる用語は、アミノ酸配列における任意の変化をカバーする(コード性アミノ酸の挿入及び置換、並びに欠失)。
ここで、ヒトインスリンのＡ鎖のアナログ及びＢ鎖のアナログなる用語は、それぞれ、ヒトインスリンのＡ及びＢ鎖に対し、Ａ及びＢアミノ酸鎖の一又は複数の置換、欠失及び／又は伸長(付加)を有する、ヒトインスリンのＡ及びＢ鎖をカバーする。
ここで、Ａ１、Ａ２、Ａ３等の用語は、それぞれ、(Ｎ末端から数えて)インスリンのＡ鎖の位置１、２及び３を示す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３等の用語は、それぞれ、(Ｎ末端から数えて)インスリンのＢ鎖の位置１、２及び３を示す。アミノ酸用の１文字コードを使用すると、Ａ２１Ａ、Ａ２１Ｇ及びＡ２１Ｑ等の用語は、Ａ２１位にあるアミノ酸が、それぞれＡ、Ｇ及びＱであることを示す。アミノ酸用の３文字コードを使用すると、対応する表現は、それぞれＡｌａＡ２１、ＧｌｙＡ２１及びＧｌｎＡ２１となる。
ここで、Ａ(０)又はＢ(０)なる用語は、それぞれＡ又はＢ鎖において、Ａ１又はＢ１位のＮ末端よりに隣接した位置を示す。Ａ(−１)又はＢ(−１)なる用語は、それぞれＡ(０)又はＢ(０)に対してＮ末端よりの第１のアミノ酸の位置を示す。よって、Ａ(−２)及びＢ(−２)は、それぞれＡ(−１)及びＢ(−１)に対してＮ末端よりの位置を示し、Ａ(−３)及びＢ(−３)は、それぞれＡ(−２)及びＢ(−２)に対してＮ末端寄りの位置を示す。
ここで、ｄｅｓＢ２９及びｄｅｓＢ３０等の用語は、それぞれＢ２９又はＢ３０アミノ酸残基を欠く、インスリンアナログを示す。
「速効型インスリン」なる用語は、通常の又は定型的なヒトインスリンよりも作用発生が速いインスリンをカバーする。
ここで、「長時間作用するインスリン」なる用語、又は「基礎インスリン」なる用語は、通常の又は定型的なヒトインスリンよりも作用の持続期間が長いインスリンをカバーする。好ましくは、作用時間は５時間以上、又は８時間、特に少なくとも９時間である。好ましくは、基礎インスリンは少なくとも１０時間の作用時間を有する。基礎インスリンはよって約８〜２４時間の範囲、好ましくは約９〜約１５時間の範囲の作用時間を有しうる。
インスリンアナログ、インスリン及びＡ及びＢ鎖における位置の番号付けは、親化合物がそのために使用される番号を有するヒトインスリンであるようになされる。
ここで、「アシル化インスリン」なる用語は、プロテアーゼ安定化インスリンに、リンカーを介して一又は複数のアシル部分が結合することによる、インスリンの修飾をカバーする。
インスリン活性を有するアシル化インスリンとは、ラット、ウサギ、又はブタモデルであってよい、適切な動物モデルにおいて測定して、例えば静脈内又は皮下投与によって適切に投与した後、哺乳動物の血糖を低下させる能力、又はインスリンレセプター結合親和性を有する、アシル化インスリンを意味する。
ここで、アルキルなる用語は、飽和した、分枝状又は直鎖状の炭化水素基をカバーする。
ここで、アルコキシなる用語は、基「アルキル-Ｏ-」をカバーする。代表例はメトキシ、エトキシ、プロポキシ(例えば、１-プロポキシ及び２-プロポキシ)、ブトキシ(例えば、１-ブトキシ、２-ブトキシ、及び２-メチル-２-プロポキシ)、ペントキシ(１-ペントキシ及び２-ペントキシ)、ヘキソキシ(１-ヘキソキシ及び３-ヘキソキシ)等である。
ここで、アルキレンなる用語は、１〜１２の炭素原子を有する、飽和した、分枝状又は直鎖状の二価の炭化水素基をカバーする。代表例には、限定されるものではないが、メチレン；１,２-エチレン；１,３-プロピレン；１,２-プロピレン；１,３-ブチレン；１,４-ブチレン；１,４-ペンチレン；１,５-ペンチレン；１,５-ヘキシレン；１,６-ヘキシレン等が含まれる。
ここで、「中性の直鎖状アミノ酸」なる用語はカバーする。中性の直鎖状アミノ酸の非限定的例である。
ここで、「環状アミノ酸」なる用語はカバーする。環状アミノ酸の非限定的例である。
ここで、「酸性アミノ酸」なる用語はカバーする。酸性アミノ酸の非限定的例である。
ここで、「脂肪酸」なる用語は、少なくとも２の炭素原子を有し、飽和又は不飽和であり、直鎖状又は分枝状で脂肪族のカルボン酸をカバーする。脂肪酸の非限定的例は、ミリスチン酸、パルミチン酸、及びステアリン酸である。
ここで、脂肪二酸とは、少なくとも２の炭素原子を有し、飽和又は不飽和である直鎖状又は分枝状で脂肪族のジカルボン酸をカバーする。脂肪二酸の非限定的例は、コハク酸、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、トリデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸、及びエイコサン二酸である。
インスリンの命名は次の原則に従う：名称は、ヒトインスリンに対する変異及び修飾(アシル化)として付与される。アシル部分の命名について、命名はＩＵＰＡＣ命名法に従い実施され、他の場合はペプチド命名法に従う。例えば、アシル部分：
Figure 0005749155
の命名は「オクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ」、又は「１７-カルボキシヘプタデカノイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ」とすることができ、ここで、
ＯＥＧは、アミノ酸ＮＨ２(ＣＨ２)２Ｏ(ＣＨ２)２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈの略語であり、
γＧｌｕは、アミノ酸ガンマグルタミン酸の略語である。
アミノ酸についての他の略語は、例えば：
ＰＥＧ３はＮＨ２((ＣＨ２)２Ｏ)４ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
ＰＥＧ７はＮＨ２((ＣＨ２)２Ｏ)８ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈである。
例えば、実施例９のインスリン(以下に付与する配列／構造)は「Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ，Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ)，ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン」と命名され、ヒトインスリンにおけるＡ１４位のアミノ酸ＹはＥに変異され、ヒトインスリンにおけるＢ２５位のアミノ酸ＦはＨに変異され、ヒトインスリンにおけるＢ２９位のアミノ酸Ｋは、残基オクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧによりＮεを示す、Ｂ２９のリジン残基のイプシロン窒素のアシル化により修飾され、ヒトインスリンにおけるＢ３０位のアミノ酸Ｔは欠失していることが示される。以下の式の星印は、当該問題の残基が、ヒトインスリンと比較して異なっている(すなわち変異している)ことを示す。この出願にわたって、本発明の好ましいインスリンの式及び名称の双方を、以下に与える。
Figure 0005749155
ここで、「化学的安定性」及び「高い化学的安定性」なる用語は、所望の製剤において、本発明のインスリンが、化学的十分に安定していることを意味する。化学的分解生成物は、最終製剤の有効期間を損なわないような量でのみ形成される。化学的分解生成物には、脱アミド生成物、イソ-アスパルテート形成、二量体形成、ラセミ化生成物、脱水過程において生じた生成物などが含まれる。化学的安定性は、古いサンプル又は製剤のＨＰＬＣ分析により測定されてよい。
ここで、「高い物理的安定性」なる用語は、フィブリル化傾向がヒトインスリンの５０％未満であることをカバーする。フィブリル化は、付与された条件で線維形成が開始する前のラグタイムにより記載されてよい。
インスリンレセプター及びＩＧＦ-１レセプター親和性を有するポリペプチドは、適当な結合アッセイにおいてインスリンレセプター及びＩＧＦ-１レセプターと相互作用可能なポリペプチドである。このようなレセプターアッセイは、当該分野でよく知られており、実施例にさらに記載されている。本アシル化インスリンは、ＩＧＦ-１レセプターに結合しないか、又は該レセプターに対し、さらに低い親和性しか有さない。より厳密には、この発明のアシル化インスリンは、ヒトインスリンと実質的同程度又はそれ以下のＩＧＦ-１レセプターに対する親和性を有しているであろう。
ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な」なる用語は、通常の製薬用途に適している、すなわち患者に重大な有害事象を引き起こさないことを意味する。
ここで使用される場合、処置及び処置するといった用語は、病気、疾患又は病状に抗する目的で、患者を管理及びケアすることを意味する。本用語は、病気、疾患又は病状の進行の遅延化、症候群及び合併症の緩和又は軽減、及び／又は病気、疾患又は病状の治癒又は除去を意味している。処置される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
ここで使用される場合、病気の処置なる用語は、病気、病状又は疾患を発症した患者の管理及びケアを意味する。処置の目的は、病気、病状又は疾患に抗することである。処置には、病気、病状又は疾患の除去又は制御、並びに病気、病状又は疾患に関連する症候群又は合併症を緩和するために、活性化合物を投与することを含む。
ここで使用される場合、病気の予防なる用語は、病気の臨床的発症の前に、病気を発症する危険性を、個々に管理及びケアすることと定義される。予防の目的は、病気、病状又は疾患の発症に抗することであり、症候群又は合併症の発症を予防又は遅延化、及び関連する病気、病状又は疾患の発症を予防又は遅延化させるために、活性化合物を投与することを含む。
ここで使用される場合、有効量なる用語は、処置しない場合と比較して、効果的に患者を処置するのに十分な用量を意味する。
ＰＯＴは、分裂酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、ＴＰＩ１は出芽酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
リーダーとは、プレ-ペプチド(シグナルペプチド)及びプロ-ペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
シグナルペプチドなる用語は、タンパク質の前駆体において、Ｎ末端配列として存在するプレ-ペプチドを意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパク質が小胞体への転位置を容易できることである。もちろん、シグナルペプチドはこのプロセス中に通常は切断される。シグナルペプチドはタンパク質を生成する酵母生物体に対して異種又は同族であってもよい。この発明のＤＮＡコンストラクトを用いて使用され得る多くのシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド、又は任意の機能的アナログ(Egel-Mitaniら、(1990) YEAST 6:127-137及び米国特許第5726038号)、及びＭＦα１遺伝子のα-因子シグナル(Thorner(1981)、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathernら編, pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY、及び米国特許第４８７０００号)が含まれる。
ここで、「プロペプチド」なる用語は、その機能が、小胞体からゴルジ体へ、さらには培養媒体への分泌のための分泌小胞への、発現ポリペプチドの指向を可能にすることであるポリペプチド配列をカバーする(すなわち、ポリペプチドは、酵母細胞のペリプラズム空間に、細胞壁又は少なくとも細胞膜を介して出て行く)。プロ-ペプチドは酵母α-因子プロ-ペプチドであってよく、米国特許第４５４６０８２号及び同第４８７０００８号を参照。またプロ-ペプチドは、天然には見出されないプロ-ペプチドであると言われている、合成プロ-ペプチドであってよい。適切な合成プロ-ペプチドは米国特許第５３９５９２２号；同第５７９５７４６号；同第５１６２４９８号及び国際公開第９８／３２８６７号に開示されているものである。好ましくは、プロ-ペプチドは、Ｌｙｓ-Ａｒｇ配列又はその任意の機能的アナログ等、Ｃ末端にエンドペプチダーゼプロセシング部位を有するであろう。
明確に示さない限りは、ここに記載したアミノ酸はＬアミノ酸である。さらに、他に特定しない限りは、ペプチドのアミノ酸配列の左又は右末端は、それぞれＮ及びＣ末端である。
(特異的な変異により)タンパク質分解に対して安定しており、Ｂ２９-リジンでアシル化しているインスリンは、効果的かつ持続的に作用し、肺又は経口的に投与可能な持続的インスリンとしての高い可能性を有することが見出されている。アシル化により血清アルブミンに結合し、従って持続化する。さらに、経口投与した後、本発明のアシル化インスリンは、タンパク質分解に対して安定していない同様のアシル化インスリンと比較して、インスリンレセプター親和性がかなり低下している。インスリンが内在しており、レセプター活性化において分解するため、本発明のアルブミン結合インスリンのインスリンレセプター親和性におけるこの低減が、循環におけるアシル化インスリンの持続性に寄与する。よって、本発明のインスリンのクリアランスが低減する。例えば、ここに記載した高インスリン血糖正常値クランプで測定される場合、インスリンレセプター親和性の低減によっても、おそらく作用強度の低下は引き起こされないであろう。しかして、高アルブミン結合親和性及び低インスリンレセプター親和性を組合せることは、インスリン(基礎インスリン)の作用時間を長くするのに有用である。さらに、経口投与した後、これらのアシル化インスリンは、タンパク質分解に対して安定していない、同様の公知のアシル化インスリンよりも高い生物学的利用能を有する。よって、これらのアシル化インスリンアナログは、経口投与にとって有益である。同様に、肺投与後、これらのプロテアーゼ安定化アシル化インスリンは、タンパク質分解に対して安定していない、同様の公知のアシル化インスリンよりも高い見掛け作用強度及び／又は生物学的利用能を示す。またさらに、これらのプロテアーゼ安定化アシル化インスリンは、哺乳動物の肺に投与された場合、長時間にわたって作用するプロファイルを示す。よって、これらのアシル化インスリンアナログは、肺投与にとって有益である。
タンパク質分解に対して安定している上述のインスリンは、ここではプロテアーゼ安定化インスリンと称される。
プロテアーゼ安定化インスリン分子は、明細書の詳細な部分に説明されているように、ヒトインスリンに対して、限定された数の自然に生じるアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基で置換されたものである。
一実施態様において、この発明はアシル化インスリンに関し、ここでプロテアーゼ安定化インスリンアナログは、次の欠失又は置換の一又は複数において、ヒトインスリンから逸脱している：Ａ１８位においてＱ、Ａ２１位においてＡ、Ｇ又はＱ、Ｂ１位においてＧ又はＱ、又はＢ１位においてアミノ酸残基なし、Ｂ３位においてＱ、Ｓ又はＴ、又はＢ３位においてアミノ酸残基なし、Ｂ１３位においてＱ、Ｂ２７位においてアミノ酸残基なし、Ｂ２８位においてＤ、Ｅ又はＲ、Ｂ３０位においてアミノ酸残基なし。
さらなる態様において、この発明は、この発明のアシル化インスリン、及び適切なアジュバント及び添加剤、例えば安定化、防腐又は等張化に適した一又は複数の薬剤、特に亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールを含有する製薬用調製物に関する。本製剤の亜鉛含量は、インスリン６分子当たり０から約６個の亜鉛原子でありうる。製薬用調製物のｐＨ値は約４から約８．５の間、約４から約５の間、又は約６．５から約７．５の間でありうる。
さらなる実施態様において、この発明は、哺乳動物の血糖値を低減するため、特に糖尿病を処置するための製剤としての、アシル化インスリンの使用に関する。
さらなる態様において、この発明は、哺乳動物の血糖値を低減する、特に糖尿病を処置する製薬用調製物を調製するための、アシル化インスリンの使用に関する。
さらなる実施態様において、この発明は、このような処置を必要とする患者に、この発明のアシル化インスリンを治療的活性用量投与することにより、哺乳動物の血糖値を低減する方法に関する。
この発明のさらなる態様では、アシル化インスリンは、任意の適切な比で一又は複数のさらなる活性物質と併用されて投与される。かかるさらなる活性剤は、ヒトインスリン、速効型インスリンアナログ、抗糖尿病剤、抗脂質異常症剤、抗肥満剤、抗高血圧剤、及び糖尿病から生じるか糖尿病に関連する合併症の治療剤から選択されうる。
一実施態様において、２つの活性成分は、混合製薬用調製物として投与される。他の実施態様において、２つの成分は、同時に又は逐次、別個に投与される。
一実施態様では、この発明のアシル化インスリンは、速効型ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログと共に投与されてよい。かかる速効型インスリンアナログは、Ｂ２８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基がＬｙｓ又はＰｒｏであるようなもの、ｄｅｓ(Ｂ２８-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７)ヒトインスリン又はｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、及びＢ３位のアミノ酸残基がＬｙｓであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであるアナログである。この発明のアシル化インスリンと速効型ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログは、約１０％の速効型ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログに対して、約９０％のアシル化インスリン；好ましくは約３０％の速効型ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログに対して、約７０％のアシル化インスリン；さらに好ましくは約５０％の速効型ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログに対して、約５０％のアシル化インスリンの割合で混合することができる(％は重量パーセンテージである)。
この発明のアシル化インスリンは、抗糖尿病剤と共に、併用処置に使用されてもよい。
抗糖尿病剤には、インスリン、国際公開第９８／０８８７１号、国際公開第９９／４３７０６号、米国特許第５４２４２８６号、国際公開第００／０９６６６号、国際公開第２００６／０９７５３７号、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６１７５５号、及びＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６１８３０号に記載されたＧＬＰ-１(１-３７)(グルカゴン様ペプチド-１)、ＧＬＰ-２、エキセンディン-４(１-３９)、そのインスリン分泌促進断片、そのインスリン分泌促進アナログ、及びそのインスリン分泌促進誘導体が含まれる。ＧＬＰ-１(１-３７)のインスリン分泌促進断片は、全配列がＧＬＰ-１(１-３７)の配列に見出すことができ、少なくとも一つの末端アミノ酸が欠失されているインスリン分泌促進ペプチドである。
この発明のアシル化インスリンは、またチアゾリジンジオン、メトホルミンのような経口抗糖尿病剤、及び経口治処置のための他の２型糖尿病製薬用調製物と共に、併用処置に使用してもよい。
さらに、この発明のアシル化インスリンは、一又は複数の抗肥満剤又は食欲調節剤と併用されて投与されてもよい。
一実施態様において、この発明は、この発明のアシル化インスリン、及び適切なアジュバント及び添加剤、例えば安定化、防腐又は等張化に適した一又は複数の薬剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール又はマンニトールを含有する肺用の製薬用調製物に関する。
食事制限及び／又は運動、一又は複数の上述の化合物、場合によっては一又は複数の他の活性物質と、アシル化インスリンとの任意の適切な組合せがこの発明の範囲内であると考えられると理解されるべきである。
一晩絶食させた雄ウィスターラットにおける先行技術の化合物の経口効果を示す。 一晩絶食させた雄ウィスターラットにおける本発明の化合物の経口効果を示す。 一晩絶食させた雄ウィスターラットにおける本発明の化合物の経口効果を示す。 一晩絶食させた雄ウィスターラットにおける本発明の化合物の経口効果を示す。 一晩絶食させた雄ウィスターラットにおける本発明の化合物の経口効果を示す。 一晩絶食させた雄ウィスターラットにおける本発明の化合物の経口効果を示す。 一晩絶食させた雄ウィスターラットにおける本発明の化合物の経口効果を示す。 一晩絶食させた雄ィスターラットにおける本発明の化合物の経口効果を示す。 従来技術のプロテアーゼ耐性のないインスリン(実施例１８３)である以外は同様であるものと比較した本発明のインスリン(実施例９)の気管内滴下注入からの、血糖低減効果と血漿インスリン濃度を示す。 従来技術のプロテアーゼ耐性のないインスリン(実施例１８３)である以外は同様であるものと比較した本発明のインスリン(実施例９)の気管内滴下注入からの、血糖低減効果と血漿インスリン濃度を示す。 図１０及び１１は、同じインスリンであるが、プロテアーゼ安定化Ａ１４Ｅ及びＢ２５Ｈ変異のないもの（先行技術のインスリン）と比較した実施例９のインスリンの薬物動態プロファイルを示す。データは同じ実験からのものであり、図１０は最初の２５０分のデータを示す。 図１１は完全な２４時間（１４４０分）の時間過程を示す。
インスリンの安定性及び溶解性は、現在のインスリン療法にとって、根本にある重要な側面である。この発明は、安定した、アシル化インスリンアナログを提供することにより、これらの問題点に取り組むものであり、ここでアシル化より、分子の可動性が低減し、附随してフィブリル化傾向が低下し、ｐＨ降下域が制限又は変更される。
この発明のアシル化インスリンは、例えばヒトインスリン及びアシル化ヒトインスリンと比較して、相対的に高い生物学的利用能であるために、特に肺又は経口投与を意図している。さらに、アシル化インスリンは、持続性インスリン活性を有しているであろう。
上述したように、タンパク質分解に対して安定したインスリンは、ここではプロテアーゼ安定化インスリンと称される。この発明のアシル化インスリンは、ここで記載したようにアシル化されている、前記プロテアーゼ安定化インスリンである。
前記プロテアーゼ安定化インスリンは、ここでは親インスリン又はプロテアーゼ安定していないインスリンと称されるインスリン化合物から誘導される。
一実施態様において、親インスリンは：ａ）ヒトインスリン；ｂ）Ｂ２８位にあるアミノ酸残基がＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、Ｂ２９位にあるアミノ酸残基がＬｙｓ又はＰｒｏであり、場合によってはＢ３０位にあるアミノ酸残基が欠失している、ヒトインスリンのインスリンアナログ；ｃ）ｄｅｓ(Ｂ２８-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７)ヒトインスリン、又はｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンであるインスリンアナログ；ｄ）Ｂ３位にあるアミノ酸残基がＬｙｓであり、Ｂ２９位にあるアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐである、ヒトインスリンのインスリンアナログ；ｅ）Ａ２１位にあるアミノ酸残基がＧｌｙであり、２つのアルギニン残基でＣ末端がさらに伸長している、ヒトインスリンのインスリンアナログ；ｆ）Ｂ３０位にあるアミノ酸残基がスレオニンメチルエステルで置換されているインスリン誘導体；及びｇ）ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンのＢ２９位にあるリジンのＮε位に、テトラデカノイル鎖が結合したインスリン誘導体からなる群から選択される。これらの群のそれぞれは特定の実施態様である。
他の実施態様において、親インスリンは：ヒトインスリン；ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン；ＡｓｐＢ２８,ＤｅｓＢ３０ヒトインスリン；ＬｙｓＢ３,ＧｌｕＢ２９ヒトインスリン；ＬｙｓＢ２８,ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン；ＧｌｙＡ２１,ＡｒｇＢ３１,ＡｒｇＢ３２ヒトインスリン；及びｄｅｓＢ３０,ＡｒｇＢ３１,ＡｒｇＢ３２ヒトインスリンからなる群から選択される。
特に、プロテアーゼ安定化インスリンは、親インスリンに対して、Ａ及び／又はＢ鎖が２又はそれ以上変異しているインスリン分子である。驚くべきことに、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位の内部又は近接近した２又はそれ以上の疎水性アミノ酸を、親水性アミノ酸で置換することにより、親インスリンに対してタンパク質分解的により安定したインスリンアナログ(すなわちプロテアーゼ安定化インスリン)が得られることが見出された。広範囲の態様において、プロテアーゼ安定化インスリンはインスリンアナログであり、ここで少なくとも２の疎水性アミノ酸は、親インスリンに対して、親水性アミノ酸で置換されており、置換が、親インスリンの２又はそれ以上のプロテアーゼ切断部位の内部又は近接して存在し、このようなインスリンアナログは、場合によっては一又は複数の付加的な変異をさらに含む。
他の実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、
・Ａ１２位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり、及び／又はＡ１３位のアミノ酸がＨｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり、及び／又はＡ１４位のアミノ酸がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＨｉｓであり、及び／又はＡ１５位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び
・Ｂ２４位のアミノ酸がＨｉｓであり、及び／又はＢ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、及び／又はＢ２６位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ又はＴｈｒであり、及び／又はＢ２７位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ又はＡｒｇであり、及び／又はＢ２８位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ又はＡｓｐであり;
場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含む、インスリンアナログである。
他の実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、Ｂ２７での変異と組合せて、場合によっては他の変異と組合せて、Ｂ２５Ｈ又はＢ２５Ｎ変異を含むアナログである。
他の実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、Ｂ２７での変異と組合せて、場合によっては他の変異と組合せて、Ｂ２５Ｈ又はＢ２５Ｎ変異を含むアナログである。Ｂ２７位での変異は、例えばＧｌｕ又はＡｓｐとすることができる。
Ｂ２５及びＢ２７変異を双方とも有する、これらのプロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログは、有利な特性を有する。
他の実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、次の式１のＡ鎖アミノ酸配列：
ＸａａＡ(−２)-ＸａａＡ(−１)-ＸａａＡ０-Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１
式(１)(配列番号：１)
次の式２のＢ鎖アミノ酸配列：
ＸａａＢ(−２)-ＸａａＢ(−１)-ＸａａＢ０-ＸａａＢ１-ＸａａＢ２-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-ＸａａＢ２５-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０-ＸａａＢ３１-ＸａａＢ３２
式(２)(配列番号：２)
[ここで、
ＸａａＡ(−２)は存在しないか、又はＧｌｙであり；
ＸａａＡ(−１)は存在しないか、又はＰｒｏであり；
ＸａａＡ０は存在しないか、又はＰｒｏであり；
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され；
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され；
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され；
ＸａａＢ(−２)は存在しないか、又はＧｌｙであり；
ＸａａＢ(−１)は存在しないか、又はＰｒｏであり；
ＸａａＢ０は存在しないか、又はＰｒｏであり；
ＸａａＢ１は存在しないか、又は独立してＰｈｅ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ２は存在しないか、又はＶａｌであり；
ＸａａＢ３は存在しないか、又は独立してＡｓｎ及びＧｌｎから選択され；
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され；
ＸａａＢ２５は独立して、Ａｓｎ、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され；
ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；
ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；
ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ、Ａｒｇ及びＧｌｎから選択され；好ましくはＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され；
ＸａａＢ３０は存在しないか、又はＴｈｒであり；
ＸａａＢ３１は存在しないか、又はＬｅｕであり；
ＸａａＢ３２は存在しないか、又はＧｌｕであり；
場合によっては、Ｃ末端はアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列は、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインはジスルフィド架橋により結合している]
を含むインスリンアナログである。
他の実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、次の式３のＡ鎖アミノ酸配列：
Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１
式(３)(配列番号：３)
及び次の式４のＢ鎖アミノ酸配列：
ＸａａＢ１-Ｖａｌ-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-Ｈｉｓ-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０
式(４)(配列番号：４)
[ここで、
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され；
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され；
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ、及びＧｌｎから選択され；
ＸａａＢ１は独立して、Ｐｈｅ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ３は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され；
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され；
ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；
ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；
ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；
ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ、Ａｒｇ及びＧｌｎから選択され、ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり;
場合によっては、Ｃ末端はアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列は、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインはジスルフィド架橋により結合している]
を含むインスリンアナログである。
他の実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンはインスリン誘導体であり、ここで、
ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１４は独立して、Ａｓｐ、Ｈｉｓ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ、及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ１は独立して、Ｐｈｅ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ３は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２５は独立して、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、及びＨｉｓから選択され;
ＸａａＢ２６は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２７は独立して、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、及びＧｌｕから選択され;
ＸａａＢ２８は独立して、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され;
ＸａａＢ２９は独立して、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され;
ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり;
場合によっては、Ｃ末端はアミドとして誘導体化されていてもよく；
ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列は、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインはジスルフィド架橋により結合している。
プロテアーゼ安定化インスリンの他の実施態様を以下に記載する。
「プロテアーゼ」又は「プロテアーゼ酵素」は、タンパク質及びペプチドを分解し、ヒトの体の種々の組織、胃(ペプシン)、腸内腔(キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ等)、又はＧＩ管の粘膜表面(アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ等)、肝臓(インスリン分解酵素、カテプシンＤ等)、及び他の組織に見出される消化酵素である。
ここでタンパク質分解的に安定したインスリンアナログ(プロテアーゼ安定化インスリンとも称される)とは、一又は複数のプロテアーゼで、ヒトインスリンよりもゆっくりと分解するインスリンアナログとして理解される。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、一又は複数のプロテアーゼで、親インスリンよりもゆっくりと分解する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは：ペプシン(例えば、イソ型のペプシンＡ、ペプシンＢ、ペプシンＣ及び／又はペプシンＦ)、キモトリプシン(例えば、イソ型のキモトリプシンＡ、キモトリプシンＢ及び／又はキモトリプシンＣ)、トリプシン、インスリン分解酵素(ＩＤＥ)、エラスターゼ(例えば、イソ型の膵エラスターゼＩ及び／又はＩＩ)、カルボキシペプチダーゼ(例えば、イソ型のカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＡ２、及び／又はカルボキシペプチダーゼＢ)、アミノペプチダーゼ、カテプシンＤ、及びラット、ブタ又はヒトから誘導される腸抽出物に存在する他の酵素からなる群から選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している。
一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは：キモトリプシン、トリプシン、インスリン分解酵素(ＩＤＥ)、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びカテプシンＤからなる群から選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは：キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ及びＩＤＥからなる群から選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは：キモトリプシン及びカルボキシペプチダーゼから選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している。
Ｔ1/2は、キモトリプシン、ペプシン及び／又はカルボキシペプチダーゼＡ等のプロテアーゼ酵素に対する、プロテアーゼ安定化インスリンのタンパク質分解安定性を測定する場合に、実施例に記載するように測定されてよい。本発明の一実施態様において、Ｔ1/2はヒトインスリンに対して増加している。さらなる実施態様において、Ｔ1/2は親インスリンに対して増加している。さらなる実施態様において、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも２倍に増加している。さらなる実施態様において、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも３倍に増加している。さらなる実施態様において、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも４倍に増加している。さらなる実施態様において、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも５倍に増加している。さらなる実施態様において、Ｔ1/2は親インスリンの少なくとも１０倍に増加している。
タンパク質分解安定性を測定するための他の方法は、比較体、例えばヒトインスリンに対する相対的安定性を測定することである。相対的安定性はＴ1/2／Ｔ1/2(比較体)として定義され、ここでＴ1/2及びＴ1/2(比較体)は、分解アッセイにおける、アナログ及び比較体それぞれの半減期である。実施例の部分においては、ラットの十二指腸から抽出された酵素混合物に対する、本発明の選択されたインスリンの相対的安定性が付与されている(ヒトインスリン、並びにアシル化していないプロテアーゼ耐性インスリンに対して)。
プロテアーゼ切断部位(ここでは、プロテアーゼ部位とも記載する)は、プロテアーゼにより認識されるアミノ酸残基、及び／又はそのペプチド結合がプロテアーゼにより切断されるアミノ酸残基として理解される。プロテアーゼ切断部位は、ＨＰＬＣ、ＭＳ又はＬＣ-ＭＳ分析により切断「ホットスポット」を決定する、及び／又はプロテアーゼ切断部位を決定するための、プロテアーゼ酵素の酵素特異性に基づいた予測により、決定されてよい。当業者であれば、例えば、Handbook of Proteolytical Enzymes, 第2版, Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woesner, J.F編, Elsevier Academic Press 2004に記載されているように、酵素特異性に基いた、プロテアーゼ切断部位の決定の方法を知っているであろう。例えばキモトリプシンは、芳香族残基(Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＬｅｕ)にＰｒｏが続かないように、ペプチド結合のＣ末端を切断すると予測されている。同様に、トリプシンは、塩基性残基Ｌｙｓ又はＡｒｇにＰｒｏが続かないように、ペプチド結合のＣ末端を切断すると予想されており、エラスターゼは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ又はＳｅｒに対し、残基Ｃ末端を切断すると予想されており、カルボキシペプチダーゼＡは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＰｒｏを除く、任意のＣ末端アミノ酸を除去するであろう。インスリン分解酵素(ＩＤＥ)は、ヒトインスリンのＢ９−１０、Ｂ１０−１１、Ｂ１３−１４、Ｂ１４−１５、Ｂ２４−２５、Ｂ２５−２６、Ａ１３−１４及びＡ１４−１５の後続位を決断すると予想されている。
プロテアーゼ切断部位の「内部又は近接近した」アミノ酸置換なる用語は、プロテアーゼ切断部位が決定された親インスリンの位置の内部又は近接近したアミノ酸の置換を示すために、ここで使用される。一実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位の内部又は近接近した２又はそれ以上の疎水性アミノ酸が置換されており、ここで、該疎水性アミノ酸は親水性アミノ酸で置換されている。さらなる実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位の内部の２又はそれ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換されている。さらなる実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位の隣に位置する、２又はそれ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換されている。さらなる実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位から２つのアミノ酸分離れて位置する２又はそれ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換されている。さらなる実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位から３つのアミノ酸分離れて位置する２又はそれ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換されている。さらなる実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位から４つのアミノ酸分離れて位置する２又はそれ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換されている。さらなる実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位の内部又はこれから１、２又は３つのアミノ酸分離れて位置する２又はそれ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換されている。さらなる実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位の内部又はこれから１又は２つのアミノ酸分離れて位置する２又はそれ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換されている。さらなる実施態様において、インスリンにおける２又はそれ以上のプロテアーゼ部位の内部又は隣に位置する２又はそれ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換されている。
プロテアーゼ安定化インスリンは、親インスリンの正味荷電とは異なる正味荷電を有していてもよい。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの正味荷電は、親インスリンの正味荷電よりもさらに正である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの正味荷電は、親インスリンの正味荷電よりもさらに負である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の正の正味荷電は、水溶液で測定して０．５〜５である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の正の正味荷電は１〜５である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の正の正味荷電は１〜４である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の正の正味荷電は１〜３である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の正の正味荷電は２〜３である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の負の正味荷電は、水溶液で測定して−０．５〜−５である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の負の正味荷電は−１〜−５である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の負の正味荷電は−１〜−４である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の負の正味荷電は−１〜−３である。一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンの平均の負の正味荷電は−２〜−３である。
一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ３-９で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ４-８．５で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ４-８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ４．５−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ５−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ５．５−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ６−８で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。
一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ２−４で、ヒトインスリンよりも増加した溶解度を有する。
一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ３−９で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ４−８．５で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ４−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ４．５−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ５−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ５．５−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ６−８で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。
一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、ｐＨ２−４で、親インスリンよりも増加した溶解度を有する。
「付与されたｐＨで増加した溶解度」とは、親インスリンと比較して、高濃度のプロテアーゼ安定化インスリンが、溶液のｐＨで水又はバッファー溶液に溶解していることを意味する。溶液に含有されるインスリンが溶解しているかどうかを測定する方法は、当該技術で公知である。
一実施態様においては、溶液を３００００ｇで２０分、遠心分離にかけ、ついで上清のインスリン濃度をＲＰ-ＨＰＬＣにより測定してもよい。この濃度が、組成物を作製するときに通常使用されるインスリン濃度に等しいか、実験誤差の範囲内であるならば、インスリンは本発明の組成物に十分溶解している。他の実施態様において、本発明の組成物におけるインスリンの溶解度は、簡単には、組成物を収容する容器を、眼で観察することにより測定することができる。溶液が、目で見て透明であり、粒子状物質が懸濁していないか、又は容器の側面／底に沈殿していないならば、インスリンは溶解している。
プロテアーゼ安定化インスリンは、測定時に比較して、親インスリンよりも増加した見かけ作用強度及び／又は生物学的利用能を有している。
インスリンのインビトロ作用強度を測定するための標準的なアッセイは、当業者に公知であり、とりわけ(１)インスリンの相対的作用強度が、ラットの肝臓細胞膜分画等、細胞膜に存在するインスリンレセプターに特異的に結合する１２５Ｉ-インスリンの５０％が置き換えられるのに必要なインスリンアナログに対するインスリンの比率として定義される、インスリンラジオレセプターアッセイ；(２)インスリンの相対的作用強度が、有機抽出可能物(例えば脂質)への[３-３Ｈ]グルコースの最大転換率の５０％に達するのに必要なインスリンアナログに対するインスリンの比率として定義される、ラットの脂肪細胞などを用いて実施される、脂質生成アッセイ；(３)インスリンアナログの相対的作用強度が、グルコース-１-[１４Ｃ]の[１４ＣＯ２]への最大転換率の５０％に達するためのインスリンアナログに対するインスリンの比率として定義される、単離された脂肪細胞におけるグルコース酸化アッセイ；(４)特定の抗インスリン抗体への結合において、インスリン又はインスリンアナログが１２５Ｉ-インスリンと競合することにより有効性を測定する、インスリンアナログの免疫原性を測定可能なインスリンラジオイムノアッセイ；及び(５)特定のインスリン抗体を有するＥＬＩＳＡアッセイ等、動物の血漿サンプルにおける、抗体へのインスリン又はインスリンアナログの結合性を測定する他のアッセイが含まれる。
増加した見かけインビトロ作用強度は、同様の用量で付与される、プロテアーゼ安定した変異を有さない同様のインスリンと、当該問題のインスリンの、時間プロファイルに対する血糖を比較することにより、推定／可視化することができる。本発明のインスリンは比較体に対して、増加した血糖低下効果を有するであろう。
インスリン生物学的利用能を測定するための標準的なアッセイは、当業者に公知であり、とりわけ、同種の肺又は経口及び静脈内(i.v.)に投与された、当該問題のインスリンの濃度についての、曲線下の相対的面積(ＡＵＣ)の測定が含まれる。血液(血漿)サンプルにおけるインスリン濃度の定量は、例えば抗体アッセイ(ＥＬＩＳＡ)又は質量分析を使用して実施することができる。肺投与はいくつかの手段より実施することができる。例えば、インスリンは、ラットには点滴、又はブタには乾燥パウダーの吹送により投与することができる。
プロテアーゼ安定化インスリンは、場合によっては、親水性アミノ酸で、一又は複数の疎水性アミノ酸をさらに置換してもよい、さらなるプロテアーゼ部位について分析されてもよい。プロテアーゼ安定化インスリンは、親インスリン、第１の修飾されたインスリンと比較して、プロテアーゼ部位において少なくとも２の親水性酸を有し、第１の修飾されたインスリンの新規のプロテアーゼ部位に少なくとも一のアミノ酸置換をさらに有するインスリンアナログであってよく、ここで少なくとも一の疎水性アミノ酸は少なくとも一の親水性アミノ酸で置換されている。
便宜上、以下、丸括弧中の通常の３文字コード及び１文字コードを有するコード可能な天然のアミノ酸の名称である：グリシン(Ｇｌｙ及びＧ)、プロリン(Ｐｒｏ及びＰ)、アラニン(Ａｌａ及びＡ)、バリン(Ｖａｌ及びＶ)、ロイシン(Ｌｅｕ及びＬ)、イソロイシン(Ｉｌｅ及びＩ)、メチオニン(Ｍｅｔ及びＭ)、システイン(Ｃｙｓ及びＣ)、フェニルアラニン(Ｐｈｅ及びＦ)、チロシン(Ｔｙｒ及びＹ)、トリプトファン(Ｔｒｐ及びＷ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ及びＨ)、リジン(Ｌｙｓ及びＫ)、アルギニン(Ａｒｇ及びＲ)、グルタミン(Ｇｌｎ及びＱ)、アスパラギン(Ａｓｎ及びＮ)、グルタミン酸(Ｇｌｕ及びＥ)、アスパラギン酸(Ａｓｐ及びＤ)、セリン(Ｓｅｒ及びＳ)及びスレオニン(Ｔｈｒ及びＴ)。もし、タイピングミスのために、通常使用されているコードから逸脱しているならば、通常使用されるコードを適用する。この発明のインスリンに存在するアミノ酸は、好ましくは核酸によりコード可能なアミノ酸である。一実施態様において、インスリン又はインスリンアナログは、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及び／又はＰｒｏで置換されており、及び／又はＧｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及び／又はＰｒｏが、インスリン又はインスリンアナログに付加されている。一実施態様において、インスリン又はインスリンアナログは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及び／又はＡｒｇで置換されており、及び／又はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及び／又はＡｒｇが、インスリン又はインスリンアナログに付加されている。
一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、次の化合物：Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｄ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｄ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｄ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｄ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓｂ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｄ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｄ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｄ,ｄｅｓＢ３０９ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｄ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ(−１
)Ｐ,Ａ(０)Ｐ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ(−１)Ｐ,Ｂ(０)Ｐ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ(−１)Ｐ,Ａ(０)Ｐ,Ａ１４Ｅ,Ｂ(−１)Ｐ,Ｂ(０)Ｐ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ３０Ｔ,Ｂ３１Ｌ,Ｂ３２Ｅヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１０Ｐ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１０Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｈ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｈ,Ｂ１０Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ１０Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ１８Ｑ,Ｂ３Ｑ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２４Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ１８Ｑ,Ａ２１Ｑ,Ｂ３Ｑ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ１８Ｑ,Ａ２１Ｑ,Ｂ３Ｑ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ１８Ｑ,Ｂ３Ｑ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｎ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｎ,Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ(−２)Ｇ,Ａ(−１)Ｐ,Ａ(０)Ｐ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ(−２)Ｇ,Ｂ(−１)Ｐ,Ｂ(０)Ｐ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ(−２)Ｇ,Ａ(−１)Ｐ,Ａ(０)Ｐ,Ａ１４Ｅ,Ｂ(−２)Ｇ,Ｂ(−１)Ｐ,Ｂ(０)Ｐ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２７Ｒ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｒ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｔ,Ｂ２７Ｒ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ１８Ｑ,Ｂ３Ｑ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｅ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１２Ｅ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１５Ｅ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１２Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１５Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｄ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｎ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｄ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｑ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｋ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｐ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｓ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｔ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｒ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｎ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｄ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｑ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｅ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｇ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｋ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｐ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｓ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１３Ｔ,Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｒ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｄ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｑ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｒ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｎ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｄ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｑ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ８Ｈ,Ｂ１０Ｄ,Ｂ２５Ｈヒトインスリン；及びＡ８Ｈ,Ａ１４Ｅ,Ｂ１０Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンからなる群から選択され；この実施態様では、場合によってはＡ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；及びＢ２５Ｎ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンが含まれ得る。
好ましい実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、次の化合物：Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、及びＡ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンからなる群から選択される。
好ましい実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、上述した任意の群から選択され、ｄｅｓＢ２７変異をさらに有する。
好ましい実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、次の化合物：Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、及びＢ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンからなる群から選択される。
一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、上述した任意の群から選択され、化学的安定性を改善するためにＡ２１及び／又はＢ３位に次の変異：Ａ２１Ｇ,ｄｅｓＡ２１,Ｂ３Ｑ，又はＢ３Ｇをさらに含む。
好ましい実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、次のプロテアーゼ安定化インスリン：Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン及びＡ２１Ｇ,Ｂ２５Ｎ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンから選択され、好ましくは次のプロテアーゼ安定化インスリン：Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、及び Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｎ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンから選択される。
好ましい実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、Ｂ２９位において、Ｂ２９Ｋのイプシロン窒素位置でアシル化されている。
好ましい実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、Ａ１位において、Ａ１のアルファ窒素位置でアシル化されている。
好ましい実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンは、Ａ１位において、Ａ１のアルファ窒素位置でアシル化されており、プロテアーゼ安定化インスリンはＢ２９Ｒ変異を含む。
プロテアーゼ安定化インスリンは、例えば米国特許第6,500,645号に開示されたようなよく知られた技術によって適当な宿主細胞中で当該インスリンをコードするＤＮＡ配列を発現させることによって生成される。プロテアーゼ安定化インスリンは、直接又はＢ鎖にＮ末端伸長を有する前駆体分子として発現される。このＮ末端伸長は直接発現される産物の収率を増大させる機能を有している場合があり、１５アミノ酸残基長まででありうる。Ｎ末端伸長は培養ブロスからの単離後にインビトロで切断するためであり、従ってＢ１の隣に切断部位を有している。この発明に適したタイプのＮ末端伸長は米国特許第5,395,922号及び欧州特許出願公開第765,395A号に開示されている。
プロテアーゼ安定化インスリンをコードするポリヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage等 (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869に記載されているホスホアミダイト(phosphoamidite)法、又はMatthes等 (1984) EMBO Journal 3:801-805に記載されている方法によって、合成的に調製することができる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成器において合成され、精製され、二本鎖にされ、ライゲーションされて、合成ＤＮＡコンストラクトが形成される。ＤＮＡコンストラクトを調製する現在の好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)による。
ポリヌクレオチド配列は、混合ゲノム、ｃＤＮＡ、及び合成由来であってもよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列を、Ａ鎖及びＢ鎖をコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列に結合させた後、よく知られた手順に従って相同組換えのために所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入し、又は好ましくは適当なオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって所望の配列を生産することによって、所定部位でＤＮＡ配列を修飾してもよい。
組換え法は、典型的には、選択された微生物又は宿主細胞中で複製可能であり、プロテアーゼ安定化インスリンをコードするポリヌクレオチド配列を担持するベクターを使用してなされる。組換えベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクター、染色体複製とは独立した複製、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でありうる。ベクターは自己複製を確実にする任意の手段を含みうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。さらに、トランスポゾン、又は宿主細胞のゲノムに導入されるために、全ＤＮＡを含有する単一のベクター又はプラスミド、又は２つ又はそれ以上のベクター又はプラスミドが使用されてもよい。ベクターは直鎖又は閉環状プラスミドであってよく、宿主細胞のゲノムへのベクターの安定した組込、又はゲノムとは独立した細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメント(類)を、好ましくは含有する。
組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。ベクターを酵母中で複製させることができる配列の例は酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製起点である。
ベクターは、形質転換細胞の選択を容易にする一又は複数の選択可能マーカーを含みうる。選択可能マーカーは、その産物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属、原栄養体、栄養要求体等に対する耐性を提供する遺伝子である。細菌性選択可能マーカーの例は、Bacillus subtilis又は Bacillus licheniformis由来のｄａｌ遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を付与するマーカーである。糸状菌宿主細胞における使用に適切なマーカーには、ａｍｄＳ(アセタミダーゼ)、ａｒｇＢ(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、ｐｙｒＧ(オロチジン-５'-ホスファートデカルボキシラーゼ)及びｔｒｐＣ(アントラニル酸シンターゼ)が含まれる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。酵母によく適した選択可能マーカーは分裂酵母ＴＰＩ遺伝子(Russell (1985) Gene 40:125-130)である。
ベクター中において、ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーター配列に作用可能に結合している。プロモーターは、変異、切断、及びハイブリッドプロモーターを含む選択宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞に相同か又は異種性である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
細菌宿主細胞における転写を指向するのに適切なプロモーターの例は、大腸菌ｌａｃオペロン、ストレプトマイセス・セリカラーアガラーゼ(agarase)遺伝子(ｄａｇＡ)、枯草菌レバンスクラーゼ(levansucrase)遺伝子(ｓａｃＢ)、バチルス・リケニホルミスアルファ-アミラーゼ遺伝子(ａｍｙＬ)、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトゲンアミラーゼ遺伝子(ａｍｙＭ)、バチルス・アミロリケファシエンスアルファ-アミラーゼ遺伝子(ａｍｙＱ)、及びバチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子(ｐｅｎＰ)から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞における転写を指向するのに適切なプロモーターの例は、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロコウジカビ中性アルファ-アミラーゼ、及びクロコウジカビ酸安定性アルファ-アミラーゼの遺伝子から得られるプロモーターである。酵母宿主では、有用なプロモーターは、出芽酵母Ｍａ１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
プロテアーゼ安定化インスリンをコードするポリヌクレオチド配列は、典型的には適切なターミネーターに作用可能に連結しているであろう。酵母において、適切なターミネーターはＴＰＩターミネーター(Alber等 (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)である。
プロテアーゼ安定化インスリンをコードするポリヌクレオチド配列、プロモーター及びターミネーターをそれぞれライゲーションし、選択宿主での複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている。ベクターは、まずこの発明のインスリンをコードする全ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを調製し、続いて適切な発現ベクターにこのフラグメントを挿入するか、又は個々のエレメント(例えば、シグナル、プロ-ペプチド、連結ペプチド、Ａ及びＢ鎖)についての遺伝的情報を含むＤＮＡフラグメントを挿入し、続いてライゲーションすることにより構築されると理解されるであろう。
プロテアーゼ安定化インスリンをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを、ベクターが染色体組み込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入する。「宿主細胞」なる用語は、複製中に生じる変異のために、親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞は、単細胞生物、例えば原核生物、又は非単細胞生物、例えば真核生物であってよい。有用な単細胞は細菌細胞、例えば限定されるものではないが、バチルス細胞、ストレプトマイセス細胞を含むグラム陽性菌、又はグラム陰性菌、例えば大腸菌及びシュードモナス属である。真核細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞であってよい。一実施態様において、宿主細胞は酵母細胞である。酵母生物は、培養で、本発明の単鎖インスリンを多量に生産する任意の適切な酵母生物でありうる。適切な酵母生物の例は、酵母種出芽酵母、サッカロマイセス・クルイベリ(kluyveri)、分裂酵母、サッカロマイセス・ウバルム(uvarum)、クルイベロマイセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・クルイベリ、ヤロウイア・リポリティカ(lipolytica)、カンジダ種、トルラ酵母、カンジダ・カカオイ(cacaoi)、ゲオトリクム種、及びゲオトリクム・フェルメンタンス(fermentans)から選択される株である。
酵母細胞の形質転換は、例えば原形質体形成に続く形質転換によりそれ自体知られている方式でなされうる。細胞を培養するのに使用される培地は酵母生物を増殖させるのに適した任意の従来からの培地であってよい。分泌されるインスリンは、その有意な割合が正しくプロセシングされた形態で培地中に存在するが、遠心分離、濾過による培地からの酵母細胞の分離、又はイオン交換マトリックス又は逆相吸収マトリックスによるインスリン前駆体の捕捉、例えば硫酸アンモニウムのような塩による上清又は濾液のタンパク質性成分の沈殿と、続く例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のような様々なクロマトグラフィー法による精製を含む、従来からの手順により培地から回収されうる。
好ましくは、この発明のアシル化インスリンは、プロテアーゼ安定化インスリン分子のリジンアミノ酸残基に結合した唯一のアシル化基を有し、一置換されている。
一実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンに結合したアシル部分は、次の一般式：
Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ- （Ｉ）
[上式中、ｎは０又は１〜３の範囲の整数であり；ｍは０又は１〜１０の範囲の整数であり；ｐは０又は１〜１０の範囲の整数であり；Ａｃｙは約８〜約２４の炭素原子を有する脂肪酸又は脂肪二酸であり；ＡＡ１は中性の直鎖状又は環状のアミノ酸残基であり；ＡＡ２は酸性アミノ酸残基であり；ＡＡ３は中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり；式中にＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３が現れる順序は、独立して交換可能であり；ＡＡ２は式において数回存在可能であり(例えば、Ａｃｙ-ＡＡ２-ＡＡ３２-ＡＡ２-)；ＡＡ２は式において、独立して(異なって)数回存在可能であり(例えば、Ａｃｙ-ＡＡ２-ＡＡ３２-ＡＡ２-)；ＡＡ１、ＡＡ２及び／又はＡＡ３の結合は、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３のそれぞれから水素原子又はヒドロキシル基(水)を除去することにより形式的に得ることができるアミド(ペプチド)結合であり；プロテアーゼ安定化インスリンへの結合が、式(Ｉ)のアシル部分にあるＡＡ１、ＡＡ２、又はＡＡ３残基から、又は式(Ｉ)の部分に存在するＡＡ２残基の側鎖(類)の一つからのものとすることができる]
を有する。
他の実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンに結合するアシル部分は、一般式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-(Ｉ)を有するものであり、ここでＡＡ１はＧｌｙ、Ｄ-又はＬ-Ａｌａ、βＡｌａ、４-アミノ酪酸、５-アミノ吉草酸、６-アミノヘキサン酸、Ｄ-又はＬ-Ｇｌｕ-α-アミド、Ｄ-又はＬ-Ｇｌｕ-γ-アミド、Ｄ-又はＬ-Ａｓｐ-α-アミド、Ｄ-又はＬ-Ａｓｐ-β-アミド、又は式：
Figure 0005749155
の一つの基から選択され、ここで水素原子及び／又はヒドロキシル基は除去されており、ｑは０、１、２、３又は４であり、この実施態様において、ＡＡ１は７-アミノヘプタン酸又は８-アミノオクタン酸であってよい。
他の実施態様において、プロテアーゼ安定化インスリンに結合するアシル部分は、一般式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-(Ｉ)を有するものであり、ここでＡＡ１は上述にて定めたものであり、ＡＡ２は、Ｌ-又はＤ-Ｇｌｕ、Ｌ-又はＤ-Ａｓｐ、Ｌ-又はＤ-ホモＧｌｕ、又は次の式：
Figure 0005749155
のいずれかから選択され、ここで水素原子及び／又はヒドロキシル基は除去されており、矢印は、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３のアミノ基又はプロテアーゼ安定化インスリンのアミノ基に対する結合点を示す。
一実施態様において、ＡＡ１と称される中性の環状アミノ酸残基は、飽和した６員の炭素環を含み、場合によっては窒素ヘテロ原子を含むアミノ酸であり、好ましくは該環はシクロヘキサン環又はピリジン環である。好ましくは、この中性の環状アミノ酸の分子量は、約１００〜約２００Ｄａの範囲内になる。
ＡＡ２と称される酸性アミノ酸残基は、２つのカルボン酸基と１つの第１級又は第２級アミノ基を有する、約２００Ｄａまでの分子量を有するアミノ酸である。また、ＡＡ２と称される酸性アミノ酸は、１つのカルボン酸基と１つの第１級又は第２級スルホンアミド基を有する、約２５０Ｄａまでの分子量を有するアミノ酸である。
ＡＡ３と称される中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基は、一端にカルボン酸官能性、他端にアミノ基官能性を有する、アルキレングリコール部分、場合によってはオリゴ-又はポリアルキレングリコール部分である。
ここで、アルキレングリコール部分なる用語は、モノ-アルキレングリコール部分、並びにオリゴ-アルキレングリコール部分をカバーする。モノ-及びオリゴアルキレングリコール類は、モノ-及びオリゴエチレングリコールベース、モノ-及びオリゴプロピレングリコールベース、及びモノ-及びオリゴブチレングリコールベースの鎖、すなわち繰り返し単位-ＣＨ２ＣＨ２Ｏ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ-又は-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ-をベースにした鎖を含む。アルキレングリコール部分は単分散(明確に定義された長さ／分子量を有する)である。モノアルキレングリコール部分は、各末端に異なる基を有する-ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ-、-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ-又は-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ-を含む。
ここで記載したように、式(Ｉ)を有するアシル部分にＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３が現れる順序(Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-)は、独立して交換可能である。その結果、式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-はまた、同様の部分、例えばＡｃｙ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ３ｐ-、式Ａｃｙ-ＡＡ２-ＡＡ３ｎ-ＡＡ２-、及び式Ａｃｙ-ＡＡ３ｐ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ１ｎ-もカバーするものであり、ここでＡｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐは、ここで定めたものである。
ここで記載したように、部分Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２及び／又はＡＡ３間の結合は、それらが形式的に構築されている親化合物からの水の除去によるアミド結合(ペプチド結合)の形成(-ＣＯＮＨ-)から形式的に得られる。これは、式(Ｉ)のアシル部分(Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-、ここで、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐは、ここで定めたものである)について完全な式を得るためには、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２及びＡＡ３の用語に対して与えられた化合物を形式的にとり、それらから水素及び／又はヒドロキシルを除去し、形式的に、そのようにして得られた遊離端にそのようにして得られた構築ブロックを結合させなければならないことを意味する。
この発明のアシル化インスリンアナログ中に存在し得る式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-のアシル部分の非限定的な特定の例は、次の通りである：
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式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-のアシル部分の上述した任意の非限定的な特定の例は、こインスリンアナログの上述した非限定的な特定の例のいずれかに存在するリジン残基のイプシロンアミノ基に結合可能であり、よってこの発明のアシル化インスリンアナログのさらなる特定の例が付与される。
式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-のアシル部分の上述した任意の非限定的な特定の例は、インスリンアナログの上述した非限定的な特定の例のいずれかに存在するＡ１残基のアルファアミノ基に結合可能であり、よってこの発明のアシル化インスリンアナログのさらなる特定の例が付与される。
プロテアーゼ安定化インスリンは、インスリンのリジン残基又はＮ末端位置に、式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-の所望の基を導入することにより、この発明のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンに転換させることができる。式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-の所望の基は、任意の簡便な方法で導入可能であり、このようなアナログについての先行技術に、多くの方法が開示されている。さらなる詳細はここの実施例により明らかになる。
一実施態様において、本発明は、欧州特許出願公開第07114387号に記載の化合物、すなわちアシル部分が親インスリンに結合しているアシル化インスリンに関連しておらず、ここで該アシル部分は、アミノ酸を含有するアルキレングリコールの繰り返し単位を含み、親インスリンには唯一のリジン残基(Ｋ及びＬｙｓ)が存在する。
(薬学的組成物)
この発明のアシル化インスリンは、皮下、鼻、経口又は肺に投与されてよい。
皮下投与用として、この発明のアシル化インスリンは、公知のインスリンの製剤と同じように処方される。さらに、皮下投与用として、この発明のアシル化インスリンは、公知のインスリンの投与と同じように投与され、医者はこの手順に通じている。
この発明のアシル化インスリンは、循環インスリンレベルを増加させ、及び／又は循環グルコースレベルを低下させるのに効果的な用量で、吸入により投与されてよい。このような投与は、糖尿病又は高血糖症等の疾患を処置するのに効果的である。インスリンの効果的な投与を達成するには、この発明のアシル化インスリンを、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ以上の吸入量で投与することが必要である。治療的有効量は、インスリンレベル、血糖値、患者の身体コンディション、患者の肺の状態等を含む要因を考慮し、博識な実施者により決定することができる。
この発明のアシル化インスリンは、吸収の遅延化、及び／又はその全身クリアランスの低減を達成するために、吸入により送達されてもよい。同様の粒子径及び同様の肺沈着レベルで比較される場合、典型的には、種々の吸入装置により、同様の薬物動態が提供される。
この発明のアシル化インスリンは、吸入による治療剤の投与について、当該技術で公知の任意の様々な吸入装置により送達され得る。これらの装置には、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥パウダー発生器、、スプレー等が含まれる。好ましくは、このアシル化インスリンは、乾燥パウダー吸入器又はスプレーにより送達される。この発明のアシル化インスリンを投与するための吸入装置には、いくつかの所望される特徴がある。例えば、吸入装置による送達には、有利には信頼性、再現性及び正確性がある。良好な呼吸性のためには、吸入装置は、小粒子又はエアゾール、例えば約１０μｍ、例えば約１-５μｍ未満のものを送達すべきである。この発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置のいくつかの特定の例は、TurbohalerＴＭ(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、SpirosＴＭ吸入器(Dura)、吸入治療用に市販されている装置、AERxＴＭ(Aradigm)、Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量噴霧式吸入器(Glaxo)、Spinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。
当業者は、この発明のアシル化インスリンの処方、送達される製剤の量、及び単一用量の投与の持続時間は、使用される吸入装置の種類に依存することを認識しているであろう。ネブライザー等、いくつかのエアゾール送達システムにとって、投与頻度及びシステムが稼働している時間の長さは、主として、エアゾール中のアシル化インスリンの濃度に依存するであろう。例えば、投与時間が短いと、ネブライザー溶液においては、より高い濃度のアシル化インスリンを使用することができる。定量噴霧式吸入器等の装置は、高濃度のエアゾールを生成することができ、所望の量のアシル化インスリンの送達を、より短い時間で作動させることができる。パウダー吸入器等の装置は、付与された充填量の薬剤が装置から排出されるまで、活性剤を送達させる。この種の吸入器において、付与されたパウダー量における、この発明のアシル化インスリンのインスリン量により、一回の投与で送達される用量が決定される。
吸入装置で送達される製剤における、この発明のアシル化インスリンの粒子径は、肺、好ましくは気道下部及び肺胞内においてなされる、インスリンの能力に関して重要である。好ましくは、この発明のアシル化インスリンは、送達されるアシル化インスリンの少なくとも約１０％、好ましくは約１０％〜２０％、又はそれ以上が肺に沈着するように処方される。口呼吸するヒトにとって、肺沈着の最大効率は、約２μｍ〜約３μｍの粒子径で得られることが知られている。粒子径が約５μｍ以上になると、肺沈着はかなり低減する。粒子径が約１μｍ以下であると、肺沈着の低下が引き起こされ、治療に有効な十分な量の粒子を送達することが困難になる。よって、吸入器により送達されるアシル化インスリンの粒子は、好ましくは約１０μｍ未満、より好ましくは約１μｍ〜５μｍの範囲の粒子径を有する。アシル化インスリンの処方は、選択された吸入装置において所望される粒子径が生じるように選択される。
乾燥パウダーとしての投与に有利には、この発明のアシル化インスリンは、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの粒子径を有する微粒子型に調製される。より好ましい粒子径は、患者の肺の肺胞に送達するのに効果的なものである。好ましくは、乾燥パウダーは、多くの粒子が所望する範囲のサイズを有するように生成された粒子から、ほとんどなる。有利には、乾燥パウダーの少なくとも５０％が、約１０μｍ未満の直径を有する粒子から作製される。このような処方は、この発明のアシル化インスリン及び他の所望する成分を含有する溶液を、噴霧乾燥、製粉、又は臨界点濃縮することにより達成可能である。また、本発明に有用な粒子を作製するのに適切な他の方法も、当該技術で公知である。
粒子は、通常、容器中で乾燥パウダー製剤から分離され、ついで運搬気流を介して患者の肺に移送される。典型的には。現在の乾燥パウダー吸入器において、固形物を破壊する力は、単に、患者の吸入により提供される。他の種類の吸入器においては、患者の吸入により生じる気流が、粒子を凝集させない推進モーターを駆動させる。
乾燥パウダー吸入器から投与されるこの発明のアシル化インスリンの製剤は、典型的には、誘導体を含有する微細に分割された乾燥パウダーを含むが、パウダーは、さらに増量剤、担体、賦形剤、他の添加剤等をさらに含むことができる。例えば特定のパウダー吸入器から送達させるのに必要なパウダーを希釈するため、処方のプロセシングを容易にするため、製剤に有利なパウダー性を付与するため、吸入装置からのパウダーの分散を容易にするため、製剤を安定させるため(例えば、酸化防止剤又はバッファー)、製剤に味を付与するため等に、添加剤をアシル化インスリンの乾燥パウダー製剤に含有させることができる。有利には、添加剤は患者の気道に悪影響を与えないものである。アシル化インスリンは分子レベルで添加剤と混合することができ、又は固体状製剤は添加剤の粒子と混合して、又はこれでコーティングされた、アシル化インスリンの粒子を含有することができる。典型的な添加剤には、単糖類、二糖類、及び多糖類；糖アルコール類及び他のポリオール類、例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール(lactitol)、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン、又はそれらの組合せ；界面活性剤、例えばソルビトール類、ジホスファチジルコリン、又はレシチン等が含まれる。典型的には、添加剤、例えば増量剤は、上述した目的に対して有効な量、多くの場合は製剤の重量に対して約５０％〜約９０％の量で存在している。インスリンアナログタンパク質等の、タンパク質の製剤について、当該技術で公知の添加剤も、本製剤に含めることができる。
この発明のアシル化インスリンを含むスプレーは、アシル化インスリンの懸濁液又は溶液を、加圧下にて、強いてノズルを通過させることにより生成させることができる。ノズルサイズ及び構造、適用圧力、及び液体供給速度は、所望する出量及び粒子径が達成されるように選択することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィード部に接続された電場により、電気スプレーを製造することができる。有利には、スプレーにより送達されるインスリンコンジュゲートの粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの範囲の粒子径を有する。
スプレーを用いて使用するのに適したこの発明のアシル化インスリンの製剤は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり、約１ｍｇ〜約５０００ｍｇのアシル化インスリン濃度で、水溶液中にアシル化インスリンを含有している。選択されるアシル化インスリン及び医者に公知の他の要因に応じて、溶液１ｍｌ当たりのアシル化インスリンの上限は、例えば４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１２０、１００又は５０ｍｇの以下であってよい。製剤は、賦形剤、バッファー、等張剤、防腐剤、界面活性剤、好ましくは亜鉛等の薬剤を含有することができる。また製剤は、賦形剤、又はアシル化インスリンを安定化させるための薬剤、例えばバッファー、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物をさらに含有可能である。インスリンコンジュゲートの処方に有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。アシル化インスリンの処方に有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等が含まれる。またアシル化インスリン製剤は、エアゾールの形成において、溶液の噴霧化により生じるインスリンコンジュゲートの表面誘起凝集を低減又は防止可能な界面活性剤を、さらに含有することができる。種々の従来からの界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール類、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルを使用することもできる。量は、一般的には、製剤の重量に対して約０．００１〜約４％の範囲である。
この発明のアシル化インスリンを含有する薬学的組成物は、このような処置が必要な患者に非経口的に投与されてよい。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射することにより実施されてよい。または、非経口投与は、輸液ポンプにより実施することもできる。
この発明のアシル化インスリンの注射用組成物は、所望する最終生成物が得られるように、適切であるならば、成分を溶解及び混合することを含む、製薬工業の従来からの技術を使用して調製することができる。よって、一手順に従えば、アシル化インスリンは、調製される組成物の最終容量よりも幾分少ない量の水に溶解される。必要に応じて、亜鉛、等張剤、防腐剤及び／又はバッファーが添加され、必要ならば、塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム水等の塩基を使用して、溶液のｐＨ値が調節される。最後に、溶液の容量は、所望の濃度の成分が付与されるように、水を用いて調節される。
この発明のさらなる実施態様において、バッファーは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シタラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーのそれぞれ一つは、この発明の別の実施態様を構成する。
この発明のさらなる実施態様において、製剤は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチメロサール(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３-(４-クロロフェノキシ)-１,２-プロパンジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択され得る、薬学的に許容可能な防腐剤をさらに含有する。この発明のさらなる実施態様において、防腐剤は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、防腐剤は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、防腐剤は約５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、防腐剤は約１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の防腐剤各自は、この発明の別の態様を構成する。薬学的組成物に防腐剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が挙げられる。
この発明のさらなる実施態様において、製剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、又はスレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、又は１,３-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る等張剤をさらに含有する。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用してもよい。一実施態様において、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様において、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、この発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、限定されて固定されるものではない。一実施態様において、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。この発明のさらなる実施態様において、等張剤は約１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、等張剤は約１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、等張剤は約８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、等張剤は約２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張剤各自は、この発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物に等張剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が挙げられる。
典型的な等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチルスルホン及びグリセロールであり、典型的な防腐剤は、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ(４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。
この発明のアシル化インスリンの鼻投与用の組成物は、例えば、欧州特許出願公開第272,097号に記載されているようにして調製されてよい。
この発明のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する経口調製物は、それ自体公知の方式で調製可能である。簡便に経口投与可能であり、この発明のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン含有する調製物を作製する一方法は、国際公開第2008/145728号に記載されている方法に類似した手順を使用してなされる。
この発明のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する経口調製物を調製する他の方法は、この発明のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン(ａ)、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン用の少なくとも一の極性有機溶媒(ｂ)、少なくとも一の脂質親和性成分(ｃ)、及び場合によっては界面活性剤(ｄ)、及び／又は少なくとも一の固体状の親水性成分(ｅ)を含有する、水分を含有しない、液状又は半固体状の薬学的組成物を調製することである。これは油性溶液の形態とすることができる。また、少なくとも一の固体状の親水性成分(ｄ)は少なくとも一の固体状の親水性ポリマーである。また、少なくとも一の固体状の親水性組成物を含有する薬学的組成物は、少なくとも８のＨＬＢ値を有する界面活性剤を含有しておらず、すなわち、少なくとも８のＨＬＢ値を有する界面活性剤は、組成物には存在しない。
例えば、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する薬学的組成物は、水分を含有しない油性溶液及び／又はＳＥＤＤＳ又はＳＭＥＤＤＳ薬学的組成物であってよい。
また前記薬学的組成物は、自己乳化薬剤送達システム(ここではＳＥＤＤＳと称される)である。
薬学的組成物の極性有機溶媒中のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが高溶解度であるために、前記薬学的組成物に必要な極性有機溶媒の全量は比較的少量とでき、カプセル物質と薬学的組成物との融和性が改善される。
薬学的組成物は、脂質親和性成分、界面活性剤、及び極性有機溶媒、場合によっては固体状の親水性成分(ｅ)を含有する担体を含んでいてよい。固体状の親水性成分が存在する場合、脂質親和性成分及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも一の成分は液状又は半固体状である。液状の親水性成分(ｅ)が存在する場合は、脂質親和性成分と界面活性剤の双方とも固体状であってよい。例えば、界面活性剤は液状又は半固体状である。一態様において、固体状の親水性成分が存在する。
ここで使用される場合、「担体」なる用語は、体液中、又は生体膜を通過する、治療的に活性な水溶性ポリペプチドを運ぶ薬学的に許容可能なビヒクルを称する。担体は、脂質親和性成分及び極性有機溶媒、場合によっては固体状の親水性成分及び／又は界面活性剤を含有する。担体は、分散又は希釈されて、水性媒体、例えば水、水を含有する流体、又は哺乳動物中のインビボ媒体、例えば胃腸管の胃液と接触した場合に、エマルション又はコロイド状構造を自発的に生成可能である。コロイド状構造は、ドメイン、小滴、ミセル、混合ミセル、小胞体及びナノ粒子を含む、固体状又は液状粒子とすることができる。
例えば、薬学的組成物が水性媒体と接触した場合、エマルション、例えばマイクロエマルションが自発的に形成される。特に、エマルション又はマイクロエマルションは、送達システムが経口的に摂取される場合、哺乳動物の消化管で形成される。上述した成分に加えて、自発的に分散する予備濃縮体は、場合によっては他の賦形剤、例えばバッファー、ｐＨ調節剤、安定剤、及びこのような製薬用途に適していると当業者に認知されている他のアジュバントをさらに含有することもできる。
ここで使用される場合、「水分を含有しない」なる用語は、薬学的組成物の調製中、水分が添加されない組成物を称する。薬学的組成物中のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン及び／又は一又は複数の賦形剤は、薬学的組成物の調製前に、それと結合した少量の水分を含有し得る。例えば、水分を含有しない薬学的組成物は、１０％ｗ／ｗ未満の水分、例えば５％ｗ／ｗ未満の水分、例えば４％ｗ／ｗ未満の水分、例えば３％ｗ／ｗ未満の水分、例えば２％ｗ／ｗ未満の水分、例えば１％ｗ／ｗ未満の水分を含有する。
ここで使用される場合、「マイクロエマルション予備濃縮体」なる用語は、経口投与後に、水又は胃腸液等の水性媒体において、自発的にマイクロエマルション、例えば水中油型マイクロエマルションを形成する組成物を意味する。組成物は、例えば１：５、１：１０、１：５０、１：１００又はそれ以上の希釈度で、水性媒体への希釈時に自己乳化する。
プロテアーゼ安定化アシル化インスリンは高溶解度であるため、ＳＥＤＤＳにおける極性有機溶媒の全量を低く維持することができ、一方ではカプセル物質と製剤との融和性が改善され、他方では組成物にさらなる設計空間が付与される。
薬学的組成物は、脂質親和性成分、及び極性の有機成分を含有する。薬剤送達システムの成分は、任意の相対量で存在可能である。例えば、薬剤送達システムは、担体の組成物の重量に対して、４０％までの極性有機成分を、例えば３０％、２０％、１５％又は１０％未満含有可能である。他の態様において、薬剤送達システムは、担体の全組成の、５〜４０重量％の極性有機溶媒を含有する。さらなる態様において、薬剤送達システムは、担体の全組成の、１０〜３０重量％の極性有機溶媒を含有する。
薬学的組成物は、非パウダー状組成物の形態、すなわち半固体状又は液状の形態であってよい。
ここで使用される場合、「液状」なる用語は、室温(「ＲＴ」)で液体状態であり、例えば２０℃以下の融点を有する成分又は組成物を意味する。ここで使用される場合、室温(ＲＴ)は約２０-２５℃である。
ここで使用される場合、「半固体状」なる用語は、室温で液状ではなく、例えば室温〜約４０℃の融点を有する成分又は組成物を意味する。半固体状では、物質が固体及び液体の双方の状態の品質及び／又は特性を有することができる。ここで使用される場合、「固める」なる用語は、固体状又は半固体状のものを作製することを意味する。
半固体状又は液状組成物の例は、油、溶液、液状又は半固体状のＳＭＥＤＤＳ及び液状又は半固体状のＳＥＤＤＳ等の形態の薬学的組成物である。
「ＳＭＥＤＤＳ」(自己マイクロ乳化薬剤送達システムの略語)は、ここでは、ＧＩ管において遭遇するであろう、ゆっくりとした攪拌及び消化運動の条件下、水性媒体に暴露された場合に、水中油型マイクロエマルションを急速に形成する、親水性成分、界面活性剤、場合によっては共界面活性剤及び薬剤の等方混合物として定義される。
「ＳＥＤＤＳ」(自己乳化薬剤送達システムの略語)は、ここでは、ＧＩ管において遭遇するであろう、ゆっくりとした攪拌及び消化運動の条件下、水性媒体に暴露された場合に、微細な水中油型エマルションを自発的に形成する、親水性成分、界面活性剤、場合によっては共界面活性剤及び薬剤の混合物として定義される。
ここで使用される場合、「マイクロエマルション」なる用語は、その成分が水性媒体と接触した場合に、自発的又は実質的に自発的に形成される、透明又は半透明、わずかに不透明、乳白色、非不透明又は実質的に非不透明なコロイド状分散液を称する。
ここで使用される場合、「エマルション」なる用語は、その成分が水性媒体と接触した場合に、自発的又は実質的に自発的に形成される、わずかに不透明、乳白色、又は不透明なコロイド状分散液を称する。
マイクロエマルションは熱力学的に安定しており、例えばMALVERN ZETASIZER Nano ZSを使用する標準的な光散乱技術により測定した場合に、約５００ｎｍ未満、例えば約４００ｎｍ未満又は３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満で、約２-４ｎｍ以上の平均直径を有する、例えば固体状又は液状(例えば、液状の脂質粒子又は小滴)の均質に分散した粒子又はドメインを含有する。ここで使用される場合、「ドメインサイズ」なる用語は、反復散乱単位を称し、例えば小角Ｘ線により測定可能である。一態様において、ドメインサイズは４００ｎｍより小さく、別の態様においては３００ｎｍより小さく、さらに別の態様では２００ｎｍより小さい。
ここで使用される場合、予備濃縮体に対して称される際の「自発的に分散」なる用語は、水性媒体で希釈された場合、例えば１０秒程の短い時間、単に手で振盪させることにより、組成物の成分を水性媒体と接触させた場合、マイクロエマルション、エマルション及び他のコロイド状システムを生成可能な組成物を称する。一態様において、本発明の自発的に分散可能な濃縮体はＳＥＤＤＳ又はＳＭＥＤＤＳである。
ここで使用される場合、「脂質親和性成分」なる用語は、水よりも油と融和性のある物質、材料、又は成分を称する。脂質親和性を有する物質は、水には不溶又はほとんど不溶であるが、油又は他の無極性溶媒には容易に溶解する。「脂質親和性成分」なる用語は、一又は複数の脂質親和性物質を含有可能である。多くの脂質親和性物質が自発的に分散する予備濃縮体の脂質親和性相を構成し、例えば水中油型エマルション又はマイクロエマルションの油相を形成する。室温では、脂質親和性成分及び自発的に分散した予備濃縮体の脂質親和性相は、固体状、半固体状又は液状であってよい。例えば固体状の脂質親和性成分は、ペースト、顆粒形態、パウダー又はフレークとして存在可能である。１以上の賦形剤が脂質親和性成分を含有する場合、脂質親和性成分は液状、固体状又は双方の混合物とすることができる。
一態様において、脂質親和性成分は少なくとも２０％ｗ／ｗの量で、薬学的組成物に存在している。さらなる態様において、脂質親和性成分は、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％ｗ／ｗの量で存在している。例えば、脂質親和性成分は、組成物の約５重量％〜約９０重量％、例えば約１５重量％〜約６０重量％、例えば約２０重量％〜約４０重量％で存在していてよい。固体状の脂質親和性組成物、すなわち室温で固体状又は半固体状の脂質親和性組成物には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：
１．Sasol Germany (Witten, Germany)からWITEPSOL HI5として商業的に入手可能な、モノ-、ジ-及びトリグリセリド類の混合物、例えば水素化ココ-グリセリド類(融点(m.p.)、約３３．５℃〜約３７℃]; 脂肪酸トリグリセリド類の例 例えば、Ｃ１０-Ｃ２２脂肪酸トリグリセリド類には天然の水素化油、例えば植物性油が含まれる;
２．エステル、例えばGattefosse Corp. (Paramus, NJ)からMONOSTEOL(融点、約３３℃〜約３６℃)として商業的に入手可能なプロピレングリコール(ＰＧ)ステアラート、Gattefosse Corp.からHYDRINE(約４４．５℃ 〜約４８．５℃の融点)として入手可能なジエチレングリコールパルミトステアラート；
３．Gelucire 33/01、又はGattefosse Corp.からLABRAFIL M2130 CSとして商業的に入手可能なポリグリコシル化した飽和グリセリド類、例えば水素化パーム油／パーム核油ＰＥＧ-６エステル(融点、約３０．５℃〜約３８℃) ;
４．脂肪アルコール類、例えばCognis Corp. (Cincinnati, OH)からLANETTE 14として商業的に入手可能なミリスチルアルコール(融点、約39℃)；脂肪酸と脂肪アルコールとのエステル、例えばパルミチン酸セチル(融点、約５０℃)；例えば、約４３℃の融点を有する、Uniqema (New Castle, Delaware)からARLAMOL ISMLの商品名で商業的に入手可能なモノラウリン酸イソソルバイド(isosorbid monolaurate)；
５．約３３℃の融点を有し、例えばUniqemaからBRlJ 52として商業的に入手可能なポリオキシエチレン(２)セチルエーテル、又は約４３℃の融点を有し、例えばUniqemaからBRIJ 72として商業的に入手可能なポリオキシエチレン(２)ステアリルエーテルを含む、ＰＥＧ-脂肪アルコールエーテル
６．ソルビタンエステル、例えばそれぞれ約４３℃〜４８℃、又は約５３℃〜５７℃、及び４１℃ 〜５４℃の融点を有し、例えばUniqemaからSPAN 40又はSPAN 60として商業的に入手可能な例えばソルビタン脂肪酸エステル、例えば、モノパルミチン酸ソルビタン又はモノステアリン酸ソルビタン；
７．グリセリルモノ-Ｃ６-Ｃ１４-脂肪酸エステル。これらは、植物性油でグリセロールをエステル化し、続いて分子蒸溜することにより得られる。モノグリセリド類には、限定されるものではないが、対称(すなわち、β-モノグリセリド類)並びに非対称モノグリセリド類(α-モノグリセリド類)の双方が含まれる。またそれらには、均一なグリセリド類 (ここで、脂肪酸構成成分は主として単一の脂肪酸からなる)、並びに混合グリセリド類(すなわち、 脂肪酸構成成分は種々の脂肪酸からなる)の双方が含まれる。脂肪酸構成成分は、例えば、約Ｃ８-Ｃ１４.の鎖長さを有する、飽和又は不飽和の双方の脂肪酸を含む。特に適切なものは、モノラウリン酸グリセシル、例えばSasol North America (Houston, TX)からIMWITOR 312として商業的に入手可能なもの(融点、約５６-約６０℃)、例えばSasolからIMWITOR 928として商業的に入手可能なもの(融点、約３３℃-３７℃)；IMWITOR 370として商業的に入手可能なクエン酸モノグリセリル(融点、約５９〜約６３℃)；又は例えばSasolからIMWITOR 900として商業的に入手可能なモノステアリン酸グリセリル；又は例えばSasolからIMWITOR 960として商業的に入手可能な自己乳化したモノステアリン酸グリセリル(融点、約５６℃-６１℃)である。
液状の脂質親和性成分、すなわち室温で液状の脂質親和性成分の例には、限定されるものではないが、次のものが含まれる：
１．モノ-、ジ-及びトリグリセリド類、例えばAbitec Corp. (Columbus, OH)からCAPMUL MCMとして商業的に入手可能な、中程度の鎖のモノ-及びジグリセリド類、カプリル酸／カプリン酸グリセリル；
２．グリセリルモノ-又はジ脂肪酸エステル、例えばＣ６-Ｃ１８、例えばＣ６-Ｃ１６、例えばＣ８-Ｃ１０、例えばＣ８脂肪酸のもの、又はそのアセチル化誘導体、例えばEastman Chemicals (Kingsport, TN)のMYVACET 9-45又は9-08、もしくはSasolのIMWITOR 308又は312；
３．プロピレングリコールモノ-又はジ-脂肪酸エステル、例えばＣ８-Ｃ２０、例えばＣ８-Ｃ１２の脂肪酸のもの、例えばAbitec Corp.のLAUROGLYCOL 90、SEFSOL 218、又はCAPRYOL 90又はCAPMUL PG-8(カプリル酸プロピレングリコールと同様)；
４．油、例えばベニバナ油、ゴマ油、アルモンド油、ピーナッツ油、パーム油、小麦胚芽油、トウモロコシ油、ヒマシ油、ココナツ油、綿実油、大豆油、オリブ油、及び鉱物性油；
５．脂肪酸又はアルコール類、例えばＣ８-Ｃ２０で飽和した、又は一又は二不飽和のもの、例えばオレイン酸、オレイルアルコール、リノール酸、カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸、テトラデカノール、ドデカノール、デカノール；
６．中程度の鎖の脂肪酸トリグリセリド類、例えばＣ８-Ｃ１２のもの、例えばMIGLYOL 812、又は長鎖の, or long chain 脂肪酸 トリグリセリド類、例えば、vegetable oils;
７．エステル転移したエトキシル化植物性油、例えばGattefosse CorpからLABRAFIL M2125 CSとして商業的に入手可能なもの；
８．脂肪酸と第１級アルコールのエステル化化合物、例えばＣ８-Ｃ２０脂肪酸とＣ２-Ｃ３アルコールとのもの、例えばNikko Chemicals (Tokyo, Japan)からのNIKKOL VF-Eとして商業的に入手可能なリノール酸エチル、酪酸エチル、カプリル酸エチル、オレイン酸、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及びカプリル酸エチル；
９．精油、又は植物にその独特のにおいを付与する任意のクラスの植物性油、例えばスペアミント油、丁子油、レモン油、及びペパーミント油；
１０．精油のフラクション又は成分、例えばメントール、カルバクロール、及びチモール；
１１．合成油、例えばトリアセチン、トリブチリン；
１２．クエン酸トリエチル、クエン酸トリエチルアセチル、クエン酸トリブチル、クエン酸トリブチルアセチル；
１３．ポリグリセロール脂肪酸エステル、例えばモノオレイン酸ジグリセリル、例えばNikko ChemicalsのDGMO-C、DGMO- 90、DGDO；
１４．ソルビタンエステル、例えばソルビタン脂肪酸エステル、例えばUniqemaからSPAN 20として商業的に入手可能なモノラウリン酸ソルビタン；
１５．リン脂質、例えばアルキル-Ｏ-リン脂質、ホスファチジン酸ジアシル、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジ-Ｏ-アルキルホスファチジン酸、Ｌ-アルファ-リゾホスファチジルコリン(ＬＰＣ)、Ｌ-アルファ-リゾホスファチジルエタノールアミン(ＬＰＥ)、Ｌ-アルファ-リゾホスファチジルグリセロール(ＬＰＧ)、Ｌ-アルファ-リゾホスファチジルイノシトール(ＬＰＩ)、Ｌ-アルファ-ホスファチジン酸(ＰＡ)、Ｌ-アルファ-ホスファチジルコリン(ＰＣ)、Ｌ-アルファ-ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥ)、Ｌ-アルファ-ホスファチジルグリセロール(ＰＧ)、カルジオリピン(ＣＬ)、Ｌ-アルファ-ホスファチジルイノシトール(ＰＩ)、Ｌ-アルファ-ホスファチジルセリン(ＰＳ)、リゾ-ホスファチジルコリン、リゾ-ホスファチジルグリセロール、ｓｎ-グリセロホスホリルコリンで、 LARODANから商業的に入手可能なもの、又はLipoid GmbHから商業的に入手可能な大豆リン脂質(Lipoid S100)。
例えば、脂質親和性成分はモノ-、ジ-、及びトリグリセリド類からなる群から選択される一又は複数のものである。一態様において、脂質親和性成分はモノ-及びグリセリド類からなる群から選択される一又は複数のものである。さらなる態様において、脂質親和性成分は、Capmul MCM又はCapmul PG-8である。またさらなる態様において、脂質親和性成分はCapmul PG-8である。
一態様において、「極性有機溶媒」なる用語は、Ｏ-Ｈ又はＮ-Ｈ結合を有する、親水性で水混和性の炭素含有溶媒、又はその混合物である「プロトン性の極性有機溶媒」を称する。極性は溶媒の比誘電率又は双極子モーメントに反映される。溶媒の極性は、溶解する化合物の種類、混和している他の溶媒又は液状化合物に応じて決定される。典型的には、極性有機溶媒は極性化合物を溶解させ、無極性溶媒は無極性化合物を溶解させ：「同類のものが同類のものを溶解する」。無機塩(例えば塩化ナトリウム)等、強い極性化合物は、超極性溶媒にのみ溶解する。
極性有機溶媒は、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンが、他の溶媒よりも、極性有機溶媒においてより良好な溶解度を示す溶媒から選択され得る。
よって、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンは、水分を含有しない薬学的に許容可能な極性有機溶媒、例えばプロピレングリコール、グリセロール及びＰＥＧ２００に高程度で溶解可能である。例えば、少なくとも２０％(ｗ／ｗ)のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが、水分を含有しない薬学的に許容可能な極性有機溶媒に溶解し、すなわち、極性有機溶媒に２０％ｗ／ｗのプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを添加した場合に、透明な溶液が得られる。他の態様において、少なくとも２５％、３０％、４０％又は５０％(ｗ／ｗ)のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが、水分を含有しない薬学的に許容可能な極性有機溶媒に溶解する。
よって、極性有機溶媒は、Ｏ-Ｈ又はＮ-Ｈ結合を有する、親水性で水混和性の炭素含有溶媒、又はその混合物を称してよい。極性は溶媒の比誘電率又は双極子モーメントに反映される。溶媒の極性は、溶解する化合物の種類、混和している他の溶媒又は液状化合物に応じて決定される。典型的には、極性溶媒は極性化合物を溶解させ、無極性溶媒は無極性化合物を溶解させ：「同類のものが同類のものを溶解する」。無機塩(例えば塩化ナトリウム)等、強い極性化合物は、超極性溶媒にのみ溶解する。
例えば、極性有機溶媒は、２０以上、好ましくは２０-５０の範囲の比誘電率を有する溶媒である。種々の極性有機溶媒の例を、参照として、水と共に表１に列挙する。
表１．選択された極性有機溶媒及び参考としての水の比誘電率(静的誘電率)(Handbook of Chemistry and Physics, CMC Press, 比誘電率は、静電場、又は緩和が生じない比較的低頻度で測定される)
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本文中、１,２-プロパンジオールとプロピレングリコールは交換可能に使用される。本文中、プロパントリオールとグリセロールは交換可能に使用される。本文中、エタンジオールとエチレングリコールは交換可能に使用される。
例えば、極性有機溶媒は、ポリオール類からなる群から選択される。ここで使用される場合「ポリオール」なる用語は、複数のヒドロキシル基を有する化学化合物を称する。
一態様において、極性有機溶媒は、ジオール類及びトリオール類からなる群から選択される。ここで使用される場合「ジオール」なる用語は、２つのヒドロキシル基を有する化学化合物を称する。ここで使用される場合「トリオール」なる用語は、３つのヒドロキシル基を有する化学化合物を称する。
例えば、極性有機溶媒は、グリセロール(プロパントリオール)、エタンジオール(エチレングリコール)、１,３-プロパンジオール、メタノール、１,４-ブタンジオール、１,３-ブタンジオール、プロピレングリコール(１,２-プロパンジオール)、エタノール、及びイソプロパノール、又はそれらの混合物からなる群から選択される。他にも、極性有機溶媒はプロピレングリコール及びグリセロールからなる群から選択される。グリセロールは高用量であっても生体融合性があり、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンに対して高い溶媒キャパシティを有する。また、極性有機溶媒はプロピレングリコール及びエチレングリコールからなる群から選択される。これらの極性有機溶媒は低粘度であり、中程度の用量で生体融合性があり、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンに対して非常に高い極性有機溶媒キャパシティを有する。
極性有機溶媒は、メイラード反応等、溶解したポリペプチドの化学的劣化を最小にするために、例えばアルデヒド類、ケトン類及び他の還元不純物が低含有量である、高純度のものであることが好ましい。ポリペプチドの劣化を低下させるために、ポリオール等の極性有機溶媒(類)を含有する製剤に、グリシルグリシン及びエチレンジアミン等のスカベンジャー分子を添加してもよく、さらなる還元不純物の形成率を低下させるために、酸化防止剤を添加することもできる。
本発明の一態様において、極性有機溶媒は、１-５０％ｗ／ｗ、例えば５-４０％ｗ／ｗ、例えば５-３０％ｗ／ｗの量で、薬学的組成物に存在している。また、極性有機溶媒は、１０-３０％ｗ／ｗ、例えば１０-２５％ｗ／ｗ、例えば約２０％ｗ／ｗ、又は約１５％ｗ／ｗの量で存在している。
例えば、極性有機溶媒はプロピレングリコールであり、１-５０％ｗ／ｗ、例えば５-４０％ｗ／ｗ、例えば１０-３０％ｗ／ｗ、例えば１０-２５％ｗ／ｗ、例えば約１０-２０％ｗ／ｗ、例えば約２０％ｗ／ｗ、又は約１５％ｗ／ｗの量で、薬学的組成物に存在している。
例えば、極性有機溶媒は、グリセロール、プロピレングリコール及びそれらの混合物からなる群から選択される。
固体状の親水性成分は、薬学的組成物が室温で固体状又は半固体状であるようにする、又はそれを補助するために、薬学的組成物に添加されてもよい。親水性成分は１以上の賦形剤を含有可能である。１以上の賦形剤が親水性成分を含有している場合、親水性成分は、液体、固形物又は双方の混合物であってよい。
固体状の親水性成分が存在する場合、薬学的組成物は、約１重量％〜約２５重量％、例えば約２重量％〜約２０重量％、例えば約３重量％〜約１５重量％、例えば約４重量％〜約１０重量％の固体状の親水性成分を含有してよい。
親水性成分の例はＰＥＧであり、これは、一般にＨ(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎＯＨに一致し、ｎがポリマーの平均分子量と相関する、エチレンオキシドのポリマーである。
薬学的組成物を調製するのに有用なＰＥＧの種類は、物質の状態、すなわち物質が、室温及び圧力で、固体状又は液状で存在しているかどうかにより、分類することができる。ここで使用される場合、「固体状ＰＥＧ」とは、物質が室温及び圧力で固体状であるような分子量を有するＰＥＧを称する。例えば１０００〜１００００の範囲の分子量を有するＰＥＧは、固体状ＰＥＧである。このようなＰＥＧには、限定されるものではないが、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５５０、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００又はＰＥＧ８０００が含まれる。特に有用な固体状ＰＥＧは、１４５０〜８０００の分子量をものである。固体状ＰＥＧとして特に有用なものは、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ８０００、及びその誘導体及び混合物である。種々の分子量のＰＥＧが、Dow Chemicals (Danbury, CT)からCARBOWAX SENTRYシリーズとして商業的に入手可能である。さらに、固体状ＰＥＧは結晶構造又はポリマーマトリックスを有しており、鎖長さと末端基以外はＰＥＧと同様の構造を有するポリエチレンオキシド(「ＰＥＯ」)も適している。種々の等級のＰＥＯが、Dow ChemicalsからPOLYOXとして商業的に入手可能である。ＰＥＯは、例えば約１０００００〜７００００００の範囲の分子量を有する。親水性成分はＰＥＧ、ＰＥＯ、及び上述した任意の組合せを含有可能である。
親水性成分は、場合によっては低級アルカノール、例えばエタノールを含むことができる。エタノールの使用は必須ではないのだが、それにより、担体中のポリペプチドの溶解性が改善され、保存性が改善され、及び／又は薬剤沈殿の危険性が低減する。
他の例示的な態様において、担体の親水性成分は、単一の親水性成分、例えば固体状ＰＥＧ、特にＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びＰＥＧ８０００からなる。この例示的態様において、マイクロエマルションの親水性相は単一の親水性物質からなる。例えば、担体がＰＥＧ３３５０を含有している場合、担体は、他の親水性物質、例えば低級アルカノール(低級アルキルはＣ１-Ｃ４である）、特にエタノール；又は水を含有しない。
さらなる別の例示的態様において、担体の親水性成分は固体状ＰＥＧの混合物からなる。例えば、親水性成分は、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ８０００、それらの誘導体及び任意の組合せ及び混合物を含有する。
一態様において、担体は一又は複数の界面活性剤、すなわち場合によっては界面活性剤の混合物；又は界面張力を低下させる界面活性剤を含有する。界面活性剤は、副生成物、又はその調製における未反応の出発生成物を含有する複合混合物であってよく、例えば、ポリオキシエチル化により作製された界面活性剤は、ＰＥＧ等の他の副生成物を含有してよい。界面活性剤又は界面活性剤類は、少なくとも８の親水性-脂質親和性バランス(ＨＬＢ)を有する。例えば、界面活性剤は８-３０、例えば１２-３０、１２-２０又は１３-１５の平均ＨＬＢ値を有してよい。界面活性剤は液状、半固体状又は固体状であってよい。
ここで使用される場合「界面活性剤」なる用語は、表面及び界面、例えば液体-空気、液体-液体、液体-容器、又は液体-任意の固体に吸着可能な任意の物質、特に洗浄剤を称する。界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリソルバート、例えばポリソルバート２０、ポロキサマー、例えばポロキサマー１８８及びポロキサマー４０７、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化された誘導体(トゥイーン類(tweens)、例えばトゥイーン-２０又はトゥイーン８０)、モノグリセリド類又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド類又はそのポリオキシエチレン誘導体、グリセロール、コール酸又はその誘導体、レシチン類、アルコール類及びリン脂質、グリセロリン脂質(レシチン類、ケファリン類、ホスファチジルセリン)、グリセロ糖脂質(ガラクトピラノシド)、スフィンゴリン脂質(スフィンゴミエリン)、及びスフィンゴ糖脂質(セラミド類、ガングリオシド類)、ＤＳＳ(ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号[５７７-１１-７])、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号[１２８-４９-４])、ドキュセートカリウム、ＣＡＳ登録番号[７４９１-０９-０])、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)、ホスファチジン酸ジパルミトイル、カプリル酸ナトリウム、胆汁酸及びその塩、及びグリシン又はタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホナート、アニオン性(アルキルアリール-スルホナート類)の一価の界面活性剤、パルミトイル-リゾホスファチジル-Ｌ-セリン、リゾリン脂質(例えば、エタノールアミン、コリン、セリン又はスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファートエステル)、リゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)-誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン及び極性頭部基の修飾体、コリン類、エタノールアミン類、ホスファチジン酸、セリン類、スレオニン類、グリセロール、イノシトール、及び正に帯電したＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン、及びリゾホスファチジルスレオニン、双性イオン性界面活性剤(例えば、Ｎ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、ドデシルホスホコリン、ミリストイルリゾホスファチジルコリン、鶏卵リゾレシチン)、カチオン性界面活性剤(第４級アンモニウム塩基)(例えばセチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド)、非イオン性界面活性剤(例えば、アルキルグルコシド類、例えばドデシル-β-Ｄ-グルコピラノシド、ドデシル-β-Ｄ-マルトシド、テトラデシル-β-Ｄ-グルコピラノシド、デシル-β-Ｄ-マルトシド、ドデシル-β-Ｄ-マルトシド、テトラデシル-β-Ｄ-マルトシド、ヘキサデシル-β-Ｄ-マルトシド、デシル-β-Ｄ-マルトトリオシド、ドデシル-β-Ｄ-マルトトリオシド、テトラデシル-β-Ｄ-マルトトリオシド、ヘキサデシル-β-Ｄ-マルトトリオシド、ｎ-ドデシル-スクロース、ｎ-デシル-スクロース、脂肪アルコールエトキシラート(例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばオクタエチレングリコールモノトリデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル)、ブロックコポリマー、例えばポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドのブロックコポリマー(Pluronics／Tetronics、Triton X-100)、エトキシル化ソルビタンアルカノアート類の界面活性剤(例えば、トゥイーン-４０、トゥイーン８０、Brij-35)、フシジン酸誘導体(例えばタウロ-ジヒドロフジシン酸ナトリウム等)、長鎖脂肪酸及びそれらのＣ８-Ｃ２０塩(例えばオレイン酸及びカプリル酸)、アシルカルニチン類及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮ-アシル化誘導体、リジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含有するジペプチドのＮ-アシル化誘導体、中性アミノ酸と２つの帯電したアミノ酸の任意の組合せを含有するトリペプチドのＮ-アシル化誘導体から選択されてよく、又は界面活性剤は、イミダゾリン誘導体又はそれらの混合物の群から選択されてもよい。
固体状の界面活性剤の例には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：
１．天然又は硬化ヒマシ油とエチレンオキシドの反応生成物。天然又は硬化ヒマシ油は、約１：３５〜約１：６０のモル比で、エチレンオキシドと反応させてよく、場合によっては、生成物からＰＥＧ成分が除去される。種々のこのような界面活性剤は商業的に入手可能であり、例えばBASF Corp. (Mt. Olive, NJ)のCREMOPHORシリーズ、例えば約５０-６０の鹸化値を有し、約１未満の酸価、水分含有量、すなわち約２％未満のフィッシャー、約１．４５３-１．４５７のｎＤ ６０、及び約１４-１６のＨＬＢを有するＰＥＧ４０硬化ヒマシ油であるCREMOPHOR RH 40である。
２．ポリオキシエチレンステアリン酸エステルを含むポリオキシエチレン脂肪酸エステル、例えばUniqemaからのMYRシリーズ、特に融点約４７℃を有するMYRJ 53。
MYRJシリーズの特定の化合物は、例えば約４７℃の融点を有するMYRJ 53、及びMYRJ 52として入手可能なＰＥＧ-４０-ステアラートである。
３．トゥイーン６０等、Uniqemaのトゥイーンシリーズを含むソルビタン誘導体；
４．ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンのコポリマー及びブロックコポリマー又はポロキサマー、例えばBASFのPluronic F127, Pluronic F68；
５．ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばＣ１２-Ｃ１８のアルコールのポリオキシエチレングリコール、例えばポリオキシル１０-又は２０-セチルエーテル又はポリオキシル２３-ラウリルエーテル、又は２０-オレイルエーテル、又はポリオキシル１０-、２０-又は１００-ステアリルエーテルで、UniqemaからBRlJシリーズとして公知であり、商業的に入手可能なもの。BRIJシリーズの特に有用な生成物は、BRIJ 58；BRIJ 76；BRIJ 78；BRIJ 35、すなわちポリオキシル２３ラウリルエーテル；及びBRIJ 98、すなわちポリオキシル２０オレイルエーテルである。これらの生成物は約３２℃ 〜約４３℃の融点を有する。
６．融点約３６℃を有し、Eastman Chemical Co.から入手可能な水溶性のトコフェリルＰＥＧコハク酸エステル、例えばTPGS、特にビタミンＥ TPGS。
７．５-３５[ＣＨ２-ＣＨ，-Ｏ]単位、例えば２０-３０単位を有するＰＥＧステロールエーテル、例えばChemron(Paso Robles, CA)のSOLULAN C24(Choleth-24及びCetheth-24)；使用され得る同様の生成物は、公知であり、Nikko ChemicalsからNIKKOL BPS-30(ポリエトキシル化３０フィトステロール)及びNIKKOL BPSH-25(ポリエトキシル化２５フィトスタノール)として商業的に入手可能なものである。
８．例えば４-１０の範囲のグリセロール単位、又は４、６又は１０グリセロール単位を有するポリグリセロール脂肪酸エステル。例えば、特に適しているのは、デカ-/ヘキサ-/テトラグリセリルモノステアラート、例えばNikko ChemicalsのDECAGLYN、HEXAGLYN及びTETRGLYNである。
９．アルキレンポリオールエーテル又はエステル、例えば、それぞれGELUCIRE 44/14及びGELUCIRE 50/13である、ラウロイルマクロゴール-３２グリセリド類及び／又はステアロイルマクロゴール-３２グリセリド類；
１０．飽和したＣ１０ないしＣ２２、例えばＣ１８の置換された、例えばヒドロキシ脂肪酸のポリオキシエチレンモノエステル；例えば１２ヒドロキシステアリン酸ＰＥＧエステル、特に約６００-９００ＰＥＧのもの、例えば660 Daltons MW、例えばBASF(Ludwigshafen, 20 Germany)のSOLUTOL HS 15。BASFのテクニカルリーフレットMEF 151E (1986)に従えば、SOLUTOL HS 15は、約７０重量％のポリエトキシル化１２-ヒドロキシステアリン酸、及び約３０重量％のエステル化していないポリエチレングリコール成分を含有する。それは、９０〜１１０の水素化値、５３〜６３の鹸化値、及び最大１の酸価、０．５重量％の最大水分含有量を有する。
１１．ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン-アルキルエーテル、例えば、Ｃ１２-Ｃ１８エーテルのポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン-エーテル、例えばNikko ChemicalsからNIKKOL PBC 34として商業的に入手可能な、ポリオキシエチレン-２０-ポリオキシプロピレン-４-セチルエーテル；
１２．UniqemaからATLAS G 1821、Nikko ChemicalsからNIKKOCDS-6000Pの商品名で商業的に入手可能なポリエトキシル化ジステアラート；
１３．レシチン類、例えばLipoid GmbH(Ludwigshafen, Germany)からLIPOID S75として商業的に入手可能な大豆リン脂質、又はNattermann Phospholipid (Cologne, Germany)からPHOSPHOLIPON 90として商業的に入手可能な卵リン脂質。
液状の界面活性剤の例には、限定されるものではないが、ソルビタン誘導体、例えばトゥイーン２０、トゥイーン４０及びトゥイーン８０、SYNPERONIC L44、及びポリオキシル１０-オレイルエーテルで、全てUniqemaから入手可能なもの、及びポリオキシエチレン含有界面活性剤、例えば、ＰＥＧ-８カプリル酸／カプリン酸グリセリド類(例えば、Gattefosseから入手可能なLabrasol)が含まれる。
本発明の組成物は、約０〜約９５重量％、例えば約５重量％〜約８０重量％、例えば約１０重量％〜約７０重量％、例えば約２０重量％〜約６０重量％、例えば約３０重量％〜約５０重量％の界面活性剤を含有してよい。
一態様において、界面活性剤は、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンのコポリマー又はブロックコポリマー又はポロキサマー、例えばBASFのPluronic F127、Pluronic F68である。
一態様において、界面活性剤はポロキサマーである。さらなる態様において、界面活性剤はポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、及びポロキサマー４０７とポロキサマー１１８の混合物からなる群から選択される。
一態様において、界面活性剤はポリオキシエチレン含有界面活性剤、例えばＰＥＧ-８カプリル酸／カプリン酸グリセリド類(例えば、Gattefosseから入手可能なLabrasol)である。
一態様において、界面活性剤はラウロイルポリオキシルグリセリド(例えば、Gattefosseから入手可能なGelucire 44/14)である。
一態様において、界面活性剤はBASFのCremophor RH40である。
ある態様において、薬学的組成物は、薬学的組成物に一般的に見出されるさらなる賦形剤を含有してよく、このような賦形剤の例には、限定されるものではないが、酸化防止剤、抗菌剤、酵素インヒビター、安定剤、防腐剤、香料、甘味料、及び参照としてここに導入される、Handbook of Pharmaceutical Excipients, Roweら, 第4'h版, Pharmaceutical Press (2003)に記載の他の成分が含まれる。
これらの付加的な賦形剤は、全薬学的組成物の約０．０５-５重量％の量で存在し得る。酸化防止剤、抗菌剤、酵素インヒビター、安定剤又は防腐剤は、典型的には、全薬学的組成物の約０．０５-１重量％までで提供される。甘味料又は香料は、典型的には、全薬学的組成物の約２．５又は５重量％までで提供される。
酸化防止剤の例には、限定されるものではないが、アスコルビン酸又はその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、ブチルヒドロキシアニソール及びブチルヒドロキシトルエンが含まれる。
一態様において、組成物はバッファーを含有する。ここで使用される場合「バッファー」なる用語は、経時的、そうでなければ化学反応の故に生じるであろう、組成物のｐＨが変化する傾向を低減させる、薬学的組成物中の化学化合物を称する。バッファーには、化学物質、例えばリン酸ナトリウム、トリス、グリシン、及びクエン酸ナトリウムが含まれる。
ここで使用される場合「防腐剤」なる用語は、微生物活性(成長及び代謝)を防止又は遅延化させるために、薬学的組成物に添加される化学化合物を称する。薬学的に許容可能な防腐剤の例は、フェノール、ｍ-クレゾール、及びフェノールとｍ-クレゾールの混合物である。
ここで使用される場合「安定剤」なる用語は、ペプチドを安定するために、すなわちこのような組成物の保存期間及び／又は使用期間を増加させるために、ペプチドを含有する薬学的組成物に添加される化学物質を称する。製薬用製剤に使用される安定剤の例は、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、グリシルグリシン、エチレンジアミン、シタラート、ＥＤＴＡ、亜鉛、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、及び界面活性剤及び酸化防止剤、特にα-トコフェロール及びｌ-アスコルビン酸である。
さらなる態様において、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する薬学的組成物を調製するための方法は、薬剤、極性有機溶媒を含む担体、脂質親和性成分、場合によっては界面活性剤及び／又は親水性成分を、念入りに混合する工程を含む。例えば、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンと担体を、例えば約２０℃〜約８０℃まで加熱することにより液状化させ、ついで、室温まで冷却することにより固化させることができる。
極性有機溶媒を含む担体、脂質親和性成分、及び場合によっては界面活性剤及び／又は親水性成分と、誘導体化されたインスリンペプチドとを念入りに混合する前、担体は別に調製することができる。また、担体の１、２又はそれ以上の成分が、ポリペプチドと混合可能である。
プロテアーゼ安定化アシル化インスリンは極性有機溶媒に溶解し、ついで、液状成分、場合によっては界面活性剤と混合可能となる。
また、薬学的組成物、例えばプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有するＳＥＤＤＳ又はＳＭＥＤＤＳ(カプセル、例えば腸溶性コーティングカプセル、ソフトカプセル、腸溶性ソフトカプセル)を調製するための方法は、次の工程：
(ａ)極性有機溶媒に誘導体化インスリンペプチドを溶解させ、
(ｂ)脂質親和性成分、界面活性剤、場合によっては親水性成分を混合する；
ことを含む。
例えば、薬学的組成物を調製するための方法は、低い温度(例えば、室温又は室温以下)で実施される。
薬学的組成物を調製する場合、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンは、例えば以下の方法を使用して、極性有機溶媒に溶解されてもよい：
ａ）場合によっては賦形剤を含有する、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンの水溶液を提供し、
ｂ）ｐＨ値を、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンのｐＩより、１単位、又は２単位、又は２．５ｐＨ単位以上又は以下のの標的ｐＨ値に調節し、
ｃ）従来からの乾燥技術、例えば凍結-及び噴霧乾燥により、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンから水分を除去(脱水)し、
ｄ）例えば攪拌、回転又は他の混合方法により、極性非水性媒体に、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンを混合及び溶解させ、
ｅ）場合によっては、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンの非水性溶液を濾過又は遠心分離し、溶解していない無機塩を除去し、
ｆ）場合によっては、例えば固形乾燥剤の添加又は真空乾燥により、残留していた水分を除去する。
例えば、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンは、以下の方法により、極性有機溶媒に溶解される：
ａ）場合によっては安定剤、例えば亜鉛及びグリシルグリシンを含有する、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンの水溶液を提供し、
ｂ）例えば、非揮発性塩基又は酸、特に塩酸又は水酸化ナトリウムを溶液に添加することにより、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンのｐＩより、１単位、又は２単位、又は２．５ｐＨ単位以上又は以下のｐＨ値に調節し、
ｃ）従来からの乾燥技術、例えば凍結-及び噴霧乾燥により、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンから水分を除去(脱水)し、
ｄ）例えば攪拌、回転又は他の混合方法により、極性非水性媒体に、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンを混合及び溶解させ、
ｅ）場合によっては、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンの非水性溶液を濾過又は遠心分離し、溶解していない無機塩を除去し、
ｆ）場合によっては、例えば固体状乾燥剤の添加又は真空乾燥により、残留していた水分を除去する。
「揮発性塩基」とは、室温で６５Ｐａ以上の蒸気圧を有する塩基、又は室温で６５Ｐａ以上の蒸気圧を有する塩基を含む水性共沸混合物等、加熱及び／又は減圧時に、ある程度蒸発するであろう塩基を意味する。揮発性塩基の例は、水酸化アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、第２級アミン類、第３級アミン類、アリールアミン類、脂肪族アミン類又は重炭酸アンモニウム又は組合せである。例えば、揮発性塩基は、重炭酸塩、炭酸塩、アンモニア、ヒドラジン、又は有機塩基、例えば低級脂肪族アミン類、特にトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン類、トリエタノールアミン、及びそれらの塩であってよい。さらに、揮発性塩基は、水酸化アンモニウム、エチルアミン又はメチルアミン又はそれらの組合せであってよい。
「揮発性酸」とは、室温で６５Ｐａ以上の蒸気圧を有する酸、又は室温で６５Ｐａ以上の蒸気圧を有する酸を含む水性共沸混合物等、加熱及び／又は減圧時に、ある程度蒸発するであろう酸を意味する。揮発性酸の例は、炭酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、及び酪酸である。
ここに記載するような「非揮発性塩基」とは、室温で６５Ｐａ以下の蒸気圧を有する塩基等、加熱時に蒸発しない又は一部のみが蒸発する塩基を意味する。非揮発性塩基は、アルカリ金属塩、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属の水酸化物、及びアミノ酸、又はその組合せからなる群から選択可能である。非揮発性塩基の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、及び酸化カルシウムである。
ここに記載するような「非揮発性酸」とは、室温で６５Ｐａ以下の蒸気圧を有する酸等、加熱時に蒸発しない又は一部のみが蒸発する酸を意味する。非揮発性酸の例は、塩酸、リン酸及び硫酸である。
プロテアーゼ安定化アシル化インスリンは、組成物の約４０重量％まで、例えば約２０重量％まで、又は組成物の約０．０１重量％から、例えば約０．１重量％からで、又は約０．０１重量％〜約２０重量％、又は約１重量％〜２０重量％、又は約１重量％〜１０重量％の量で存在し得る。しかしながら、特定のレベルのポリペプチドの選択は、極性有機溶媒におけるポリペプチドの溶解度、又は場合によっては使用される親水性成分又は界面活性剤、投与方式、大きさ、及び患者の状態を含む、製薬分野においてよく知られている要因に従いなされるであろう。
例えば、製薬用製剤は、０．１％ｗ／ｗ〜３０％ｗ／ｗの濃度で、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する。
各単位用量は、適切には、０．１ｍｇ〜３００ｍｇのプロテアーゼ安定化アシル化インスリンポリペプチド、例えば、約０．１ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、例えば５ｍｇ〜３００ｍｇのプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有するであろう。例えば、各単位用量は、１０ｍｇ〜３００ｍｇ、例えば１０ｍｇ〜１００ｍｇ、又は２０ｍｇ〜３００ｍｇ、例えば２０ｍｇ〜１００ｍｇのプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する。このような単位用量は、特定の目的の治療に応じて、１日に１-５回投与するのが適切である。
プロテアーゼ安定化アシル化インスリンは、極性有機溶媒における溶解度を改善するために、極性有機溶媒に溶解させる前に、最適にされたｐＨである。
「最適にされたｐＨ」なる用語を使用する場合、ここではプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが、水溶液において、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンのｐＩから少なくとも一の１ｐＨ単位の標的ｐＨで脱水されることを意味する。よって、標的ｐＨは、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンの等電点から１ｐＨ単位以上、上である。また、標的ｐＨは、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンの等電点から１ｐＨ単位以上、下である。しかして、標的ｐＨは、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンのｐＩより、１．５ｐＨ単位以上、例えば２．０ｐＨ単位以上、例えば２．５ｐＨ単位以上、上又は下である。
プロテアーゼ安定化アシル化インスリンに関連してここで使用される場合、「脱水」なる用語は、水溶液から乾燥され、誘導体化されたプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを称する。ここで使用される場合、「標的ｐＨ」なる用語は、脱水されたプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが、約４０ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で、純水に再水和された場合に確立されるであろう水溶液のｐＨを称する。標的ｐＨは、乾燥によりプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが回収される、プロテアーゼ安定化アシル化インスリンの水溶液のｐＨと、典型的には同一である。しかしながら、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン溶液が揮発性の酸又は塩基を含有しているならば、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン溶液のｐＨは標的ｐＨと同一ではない。プロテアーゼ安定化アシル化インスリンのｐＨ履歴は、極性有機溶媒に溶解可能なプロテアーゼ安定化アシル化インスリンの量に対する決定因子となるであろうことが見出されている。
ここで使用される場合「ポリペプチドのｐＩ」なる用語は、ポリペプチドの等電点を称する。
ここで使用される場合「等電点」なる用語は、ペプチド等の高分子の全体的な正味荷電が０であるｐＨ値を意味する。ペプチドにはいくつかの荷電基が存在してよく、等電点においては、これら全ての荷電の合計が０になる。等電点を超えたｐＨでは、ペプチドの全体的な正味荷電は負であるのに対し、等電点以下のｐＨ値では、ペプチドの全体的な正味荷電は正となるであろう。
タンパク質のｐＩは、等電点電気泳動等、電気泳動技術により実験的に決定することができる：
ｐＨ勾配は、非対流培地、例えばポリアクリルアミドゲルにおいて確立される。タンパク質がシステムに導入されると、適用される電場の影響下、ゲルを通過して移動する。正に荷電したタンパク質は陰極に移動するであろう。最終的に、移動したタンパク質は、正味電荷が０であり、焦点が合ったと言われるｐＨ勾配の所定の点に到達する。これがタンパク質の等電ｐＨ(ｐＩ)である。ついで、タンパク質はゲルに固定され、染色される。ついで、公知のｐＩ値を有するマーカー分子に対して、ゲル上のタンパク質の位置を比較することにより、タンパク質のｐＩを決定することができる。
付与されたｐＨ値におけるタンパク質の正味荷電は、従来からの方法により、当業者により理論的に推定されるであろう。本質的に、タンパク質の正味荷電は、タンパク質中の荷電アミノ酸：アスパラタート(β-カルボキシル基)、グルタマート(δ-カルボキシル基)、システイン(チオール基)、チロシン(フェノール基)、ヒスチジン(イミダゾール側鎖)、リジン(ε-アンモニウム基)及びアルギニン(グアニジニウム基)の分数電荷の合計に等価である。さらに、タンパク質末端基(α-ＮＨ２及びα-ＣＯＯＨ)の電荷も考慮すべきである。イオン化基の分数電荷は固有のｐＫａ値から算出することができる。
プロテアーゼ安定化アシル化インスリンの乾燥、すなわち脱水は、任意の従来からの乾燥方法、例えば噴霧-、凍結-、真空-、オープン(open)-及び接触乾燥により実施することができる。例えば、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン溶液は噴霧乾燥され、実験部分に記載されているような乾燥試験における損失により算出／測定されて(重量測定)、約１０％以下、例えば約８％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下の水分含有量となる。
例えば、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン、噴霧乾燥又は凍結乾燥される。
この発明のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する組成物は、インスリンに対して敏感な状態の処置に使用することができる。例えば、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症で、重症を負ったヒト及び大手術を受けたヒトに時折見られるようなものの処置に使用することができる。任意の患者に対する適量レベルは、使用される特定のインスリン誘導体の有効性、年齢、体重、身体活動、患者の食習慣、他の薬剤との組合せの可能性、及び処置される状態の重篤度を含む種々の要因に依存する。この発明のアシル化インスリンの毎日の投与量は、公知のインスリン組成物と同様にして、当業者により、個々の患者に対して決定されることが推奨される。
(この発明の好ましい特徴)
この発明の特徴は以下の通りである：
１．プロテアーゼ安定化アシル化インスリンであって、プロテアーゼ安定化インスリンがプロテアーゼ安定していないインスリン(親インスリン)から形式的になり、ここで少なくとも一の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換がプロテアーゼ安定していないインスリン(親インスリン)の一又は複数のプロテアーゼ切断部位の内部又は近接して存在し、このようなプロテアーゼ安定化インスリンが、場合によっては一又は複数の付加的な変異をさらに有していてもよく、但し安定したインスリンにはただ一つのリジン残基があり、アシル部分がプロテアーゼ安定化インスリンのＮ末端位置又はリジン残基に結合している、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２．プロテアーゼ安定化アシル化インスリンであって、プロテアーゼ安定化インスリンがプロテアーゼ安定していないインスリン(親インスリン)から形式的になり、ここで少なくとも２の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換がプロテアーゼ安定していないインスリン(親インスリン)の２又は複数のプロテアーゼ切断部位の内部又は近接して存在し、このようなプロテアーゼ安定化インスリンが、場合によっては一又は複数の付加的な変異をさらに有していてもよく、但し安定したインスリンにはただ一つのリジン残基があり、アシル部分がプロテアーゼ安定化インスリンのリジン残基に結合している、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３．プロテアーゼ安定化アシル化インスリンであって、プロテアーゼ安定化インスリンがプロテアーゼ安定していないインスリン(親インスリン)から形式的になり、ここで少なくとも２の疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されており、該置換がプロテアーゼ安定していないインスリン(親インスリン)の２又は複数のプロテアーゼ切断部位の内部又は近接して存在し、このようなプロテアーゼ安定化インスリンが、場合によっては一又は複数の付加的な変異をさらに有していてもよく、但し安定したインスリンにはただ一つのリジン残基があり、アシル部分がプロテアーゼ安定化インスリンのＮ末端位置又はリジン残基に結合している、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４．プロテアーゼ安定化インスリンが、アシル化親インスリンに対して増加した溶解度を有している、先行する任意の項のアシル化インスリン。
５．インスリンのＢ鎖が親インスリンに対して少なくとも一の変異を有している、可能な限り先行する項のいずれか１項のアシル化インスリン。
６．インスリンのＢ鎖が親インスリンに対して、１、２又は３で、それ以上ではない変異を有している、可能な限り先行する項のアシル化インスリン。
７．プロテアーゼ安定化インスリンのＡ鎖が、ヒトインスリンのＡ鎖と同一である、可能な限り先行する項のいずれか１項のアシル化インスリン。
８．親インスリンに対して、インスリンのＡ鎖が少なくとも一の変異を有しており、インスリンのＢ鎖が少なくとも一の変異を有している、可能な限り先行する項のいずれか１項のアシル化インスリン。
９．親インスリンに対して、インスリンのＡ鎖が少なくとも２の変異を有しており、インスリンのＢ鎖が少なくとも一の変異を有している、可能な限り先行する項のいずれか１項のアシル化インスリン。
１０．インスリンが、第１の修飾されプロテアーゼ安定されたインスリンのプロテアーゼ部位に、少なくとも一のアミノ酸置換をさらに有し、該少なくとも一のアミノ酸置換が、少なくとも一の疎水性アミノ酸が少なくとも一の親水性アミノ酸で置換されているものである、可能な限り先行する項のいずれか１項のアシル化インスリン。
１１．Ａ１２位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び／又はＡ１３位のアミノ酸がＨｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり；及び／又はＡ１４位のアミノ酸がＴｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＨｉｓであり；及び／又はＡ１５位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり；及びＢ２４位のアミノ酸がＨｉｓであり；及び／又はＢ２５位のアミノ酸がＨｉｓ又はＡｓｎであり；及び／又はＢ２６位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ又はＴｈｒであり；及び／又はＢ２７位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＡｒｇであり；及び／又はＢ２８位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり;場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含む、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
１２．Ａ１２位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び／又はＡ１３位のアミノ酸がＨｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり；及び／又はＡ１４位のアミノ酸がＴｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＨｉｓであり；及び／又はＡ１５位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び／又はＢ１６位のアミノ酸がＴｙｒ、Ｈｉｓ又はＧｌｕであり；及び／又はＢ２４位のアミノ酸がＨｉｓであり；及び／又はＢ２５位のアミノ酸がＨｉｓ又はＡｓｎであり；及び／又はＢ２６位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ又はＴｈｒであり；及び／又はＢ２７位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｒｇであるか、又は欠失しており；及び／又はＢ２８位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐであるか、又は存在せず(欠失しており)；及び／又はＢ２９のアミノ酸がＬｙｓ、Ａｒｇであるか、又は存在せず(欠失しており)；場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含み、好ましくはＡ１２位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり；及び／又はＡ１３位のアミノ酸がＨｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり；及び／又はＡ１４位のアミノ酸がＴｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＨｉｓであり；及び／又はＡ１５位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり； 及びＢ２４位のアミノ酸がＨｉｓであり；及び／又はＢ２５位のアミノ酸がＨｉｓ又はＡｓｎであり；及び／又はＢ２６位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ又はＴｈｒであり；及び／又はＢ２７のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＡｒｇであり；及び／又はＢ２８位のアミノ酸がＨｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｓｐであり；場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含む、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
１３．Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓ又はＡｓｎであり、場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含む、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
１４．Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓ又はＡｓｎであり、Ｂ３０位のアミノ酸が欠失している、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
１５．Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ１６位のアミノ酸がＨｉｓ又はＧｌｕであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、Ｂ３０位のアミノ酸が欠失している、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
１６．Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ、Ａｓｐ又はＨｉｓであり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、Ｂ３０位のアミノ酸が欠失している、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
１７．Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり、Ｂ２８位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり、場合によっては、Ｂ３０位にアミノ酸残基が存在しない、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
１８．一又は複数の付加的な変異が：Ａ８Ｈｉｓ、Ａ１８Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｙ、Ｂ１Ｇｌｕ、Ｂ１Ｇｌｎ、Ｂ３Ｇｌｎ、Ｂ１０Ｐｒｏ、Ｂ１４Ｔｈｒ、Ｂ１６Ｇｌｕ、Ｂ１７Ｓｅｒ、Ｂ２６Ａｓｐ、Ｂ２７Ｇｌｕ、Ｂ２７Ａｓｐ、Ｂ２８Ａｓｐ、Ｂ２８Ｇｌｕ、及びｄｅｓＢ３０からなる群から選択される、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン
１９．付加的な変異がｄｅｓＢ３０である、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２０．Ａ１４がＧｌｕである、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２１．Ｂ２５がＡｓｎである、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２２．Ｂ２５がＨｉｓである、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２３．Ｂ２５がＡｓｎであり、Ｂ２７がＧｌｕ又はＡｓｐである、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２４．Ｂ２５がＡｓｎであり、Ｂ２７がＧｌｕである、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２５．親タンパク質に対して、一又は複数のプロテアーゼ酵素への増加した安定性を示す、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２６．親タンパク質に対して、２又はそれ以上のプロテアーゼ酵素への増加した安定性を示す、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２７．親インスリンが、ａ)ヒトインスリン；ｂ)Ｂ２８位にあるアミノ酸残基がＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、Ｂ２９位にあるアミノ酸残基がＬｙｓ又はＰｒｏであり、場合によってはＢ３０位にあるアミノ酸残基が欠失している、ヒトインスリンのインスリンアナログ；ｃ)ｄｅｓ(Ｂ２６-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７-３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２８-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２９-Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓ(Ｂ２７)ヒトインスリン、又はｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン;ｄ)Ｂ３位にあるアミノ酸残基がＬｙｓであり、Ｂ２９位にあるアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐである、ヒトインスリンのインスリンアナログ；ｅ)Ａ２１位のアミノ酸残基がＧｌｙであり、２つのＡｒｇ残基でＣ末端がさらに伸長しているヒトインスリンのインスリンアナログ；及びｆ)Ｂ３０位にあるアミノ酸残基がスレオニンメチルエステルで置換されているインスリン誘導体；及びｇ）ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンのＢ２９位にあるリジンのＮε位に、テトラデカノイル鎖が結合したインスリン誘導体からなる群から選択される、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２８．一又は複数の付加的な変異が、インスリンの化学的安定性を高めるように選択される、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
２９．一又は複数の付加的な変異が、Ａ１８Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｎ、Ａ２１Ｇｌｙ及びＢ３Ｇｌｎからなる群から選択される、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３０．次の式１、すなわち：ＸａａＡ(−２)-ＸａａＡ(−１)-ＸａａＡ０-Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１(配列番号：１)のＡ鎖アミノ酸配列、及び次の式２、すなわち：ＸａａＢ(−２)-ＸａａＢ(−１)-ＸａａＢ０-ＸａａＢ１-ＸａａＢ２-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-ＸａａＢ２５-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０-ＸａａＢ３１-ＸａａＢ３２(配列番号：２)のＢ鎖アミノ酸配列を含み、該式において、ＸａａＡ(−２)は存在しないか又はＧｌｙであり；ＸａａＡ(−１)は存在しないか又はＰｒｏであり；ＸａａＡ０は存在しないか又はＰｒｏであり；ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され；ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＢ(−２)は存在しないか又はＧｌｙであり；ＸａａＢ(−１)は存在しないか又はＰｒｏであり；ＸａａＢ０は存在しないか又はＰｒｏであり；ＸａａＢ１は存在しないか、又は独立してＰｈｅ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ２は存在しないか又はＶａｌであり；ＸａａＢ３は存在しないか、又は独立してＡｓｎ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され；ＸａａＢ２５は独立して、Ｐｈｅ、Ａｓｎ及びＨｉｓから選択され；ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり；ＸａａＢ３１は存在しないか又はＬｅｕであり；ＸａａＢ３２は存在しないか又はＧｌｕであり；場合によっては、Ｃ末端はアミドとして誘導体化されていてもよく；ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列は、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインはジスルフィド架橋により結合しており、場合によってはＡ鎖アミノ酸配列のＮ末端は、３-７のアミノ酸を含有するアミノ酸配列により、Ｂ鎖アミノ酸配列のＣ末端に結合して、単鎖インスリン分子を形成してよく、場合によってはＢ鎖のＮ末端は１-１０のアミノ酸で伸長しており；ＸａａＡ８がＴｈｒであり、ＸａａＡ１２がＳｅｒであり、ＸａａＡ１３がＬｅｕであり、ＸａａＡ１４がＴｙｒであるならば、ＸａａＡ１５はＧｌｕ又はＡｓｐであり；及びＸａａＢ２４がＰｈｅであり、ＸａａＢ２５がＰｈｅであり、ＸａａＢ２６がＴｙｒであり、ＸａａＢ２７がＴｈｒであり、ＸａａＢ２８がＰｒｏであるならば、ＸａａＢ２９はＧｌｎである、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３１．次の式３、すなわち：Ｇｌｙ-Ｉｌｅ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ｇｌｎ-Ｃｙｓ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ８-Ｓｅｒ-Ｉｌｅ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ１２-ＸａａＡ１３-ＸａａＡ１４-ＸａａＡ１５-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-ＸａａＡ１８-Ｔｙｒ-Ｃｙｓ-ＸａａＡ２１(配列番号：３)のＡ鎖アミノ酸配列、及び次の式４、すなわち：ＸａａＢ１-Ｖａｌ-ＸａａＢ３-ＸａａＢ４-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒ-ＸａａＢ１０-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｌｅｕ-ＸａａＢ１６-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-ＸａａＢ２４-Ｈｉｓ-ＸａａＢ２６-ＸａａＢ２７-ＸａａＢ２８-ＸａａＢ２９-ＸａａＢ３０(配列番号：４)のＢ鎖アミノ酸配列を含み、該式において、ＸａａＡ８は独立してＴｈｒ及びＨｉｓから選択され；ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ、及びＧｌｎから選択され；ＸａａＢ１は独立して、Ｐｈｅ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ３は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され；ＸａａＢ２５は独立して、Ｐｈｅ、Ａｓｎ及びＨｉｓから選択され；ＸａａＢ２６は存在しないか、又は独立してＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；ＸａａＢ２７は存在しないか、又は独立してＴｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ２８は存在しないか、又は独立してＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；ＸａａＢ２９は存在しないか、又は独立してＬｙｓ及びＧｌｎから選択され;ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり;場合によっては、Ｃ末端はアミドとして誘導体化されていてもよく；ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列は、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインはジスルフィド架橋により結合している、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３２．ＸａａＡ８は独立して、Ｔｈｒ及びＨｉｓから選択され；ＸａａＡ１２は独立して、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１３は独立して、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１４は独立して、Ｔｒｙ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１５は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＡ１８は独立して、Ａｓｎ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＡ２１は独立して、Ａｓｎ、及びＧｌｎから選択され；ＸａａＢ１は独立して、Ｐｈｅ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ３は独立して、Ａｓｎ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＢ４は独立して、Ｇｌｎ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ１０は独立して、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ１６は独立して、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ２４は独立して、Ｐｈｅ及びＨｉｓから選択され；ＸａａＢ２５は独立して、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、及びＨｉｓから選択され；ＸａａＢ２６は独立して、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；ＸａａＢ２７は独立して、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、及びＧｌｕから選択され；ＸａａＢ２８は独立して、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ及びＡｓｐから選択され；ＸａａＢ２９は独立して、Ｌｙｓ及びＧｌｎから選択され；ＸａａＢ３０は存在しないか又はＴｈｒであり；場合によっては、Ｃ末端はアミドとして誘導体化されていてもよく；ここで、Ａ鎖アミノ酸配列及びＢ鎖アミノ酸配列は、Ａ鎖の７位にあるシステインとＢ鎖の７位にあるシステインとの間、及びＡ鎖の２０位にあるシステインとＢ鎖の１９位にあるシステインとの間でジスルフィド架橋により結合しており、Ａ鎖の６及び１１位にあるシステインはジスルフィド架橋により結合している、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３３．プロテアーゼ安定化インスリンにおいて、Ａ１４位のアミノ酸がＧｌｕ又はＨｉｓ(すなわち、１文字コードではＥ及びＨ)であり、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓであり、場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含み、アシル部分が、Ｂ２９位にあるリジン残基のεアミノ酸に結合している、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３４．プロテアーゼ安定化インスリンにおいて、Ｂ２５位のアミノ酸がＨｉｓ又はＡｓｎであり、Ｂ２７位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり、場合によっては、一又は複数の次の付加的な変異：Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅ／Ｄ、Ｂ１Ｅ／Ｄ、Ｂ２８Ｅ／Ｄ、及びｄｅｓＢ３０をさらに含み、アシル部分が、Ｂ２９位にあるリジン残基のεアミノ酸に結合している、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３５．プロテアーゼ安定化インスリンにおいて、Ａ１４位のアミノ酸がＴｙｒ、Ｇｌｕ又はＨｉｓ(すなわち、１文字コードではＹ、Ｅ及びＨ)であり、Ｂ２５位のアミノ酸がＡｓｎであり、Ｂ２７位のアミノ酸がＧｌｕ又はＡｓｐであり、場合によっては、一又は複数の付加的な変異をさらに含み、アシル部分が、Ｂ２９位にあるリジン残基のεアミノ酸に結合している、プロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３６．プロテアーゼ安定化インスリンがＡ１４Ｅ変異を有する、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３７．プロテアーゼ安定化インスリンにおいて、Ｂ２５位の変異とは別に、先行する項に記載のＡ１４位のみに変異が存在する、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３８．プロテアーゼ安定化インスリンがＡ１４Ｈ変異を含む、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
３９．プロテアーゼ安定化インスリンアナログがｄｅｓＢ３０変異を含む、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４０．プロテアーゼ安定化インスリン内部の一又は複数の付加的な変異が、Ａ(−１)Ｐ、Ａ(０)Ｐ、Ａ８Ｈ、Ａ２１Ｇ、Ｂ(−１)Ｐ、Ｂ(０)Ｐ、Ｂ１Ｅ、Ｂ１Ｑ、Ｂ１６Ｅ、Ｂ２６Ｄ、Ｂ２７Ｅ、Ｂ２８Ｄ、ｄｅｓＢ３０、Ｂ３１Ｌ、及びＢ３２Ｅからなる群から選択される、可能な限り先行する項のいずれかのプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４１．Ａ１４位及びＢ２５位における変異とは別に、プロテアーゼ安定化インスリンが、先行する項に記載の唯一の変異を有する、可能な限り先行する項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４２．Ａ１４位及びＢ２５位における変異とは別に、プロテアーゼ安定化インスリンが、２つを除き(すなわち第４０項に記載)、上述した項に記載の正確には２つの変異を有する、最後の一つ以外(すなわち、第４１項を除く)の、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４３．Ａ１４位及びＢ２５位における変異とは別に、プロテアーゼ安定化インスリンが、２つを除き(すなわち第２５項に記載)、先行する項に記載の正確には３つの変異を有する、最後の２つ以外(すなわち、第４１項及び第４２項を除く)の、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４４．Ａ１４位及びＢ２５位における変異とは別に、唯一の付加的な変異がｄｅｓＢ３０である、最後の２つ以外(すなわち、第４１項及び第４２項を除く)の、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４５．プロテアーゼ安定化インスリンのＡ鎖にあるＣ末端アミノ酸残基がＡ２１アミノ酸残基である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４６．プロテアーゼ安定化インスリンが、Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ１８Ｌ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｄ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ１６Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｋ,ｄｅｓＢ２８,ｄｅｓＢ２９,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ａ１４Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、及びＡ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンからなる群から選択される、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４７．プロテアーゼ安定化インスリンに結合したアシル部分が、一般式Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-（Ｉ）を有し、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐが上述したものである、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４８．Ａｃｙが脂肪酸、好ましくはミリスチン酸又はステアリン酸、より好ましくはミリスチン酸である、可能な限り先行する項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
４９．Ａｃｙが脂肪二酸、好ましくは脂肪(α,ω)二酸、より好ましくはヘプタデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、ノナデカン二酸、ドコサン二酸、エイコサン二酸である、最後の１つを除き、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５０．Ａｃｙが、ω-(テトラゾール-５-イル)-脂肪酸、好ましくは１５-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)ペンタデカン酸、１６-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)ヘキサデカン酸、１７-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)ヘプタデカン酸、１８-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)オクタデカン酸、又は１９-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)ノナデカン酸である、最後の１つを除き、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５１．ＡＡ１がトラネキサム酸又はグリシンである、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５２．ＡＡ１がトラネキサム酸である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５３．ｎが０又は１である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５４．ｎが０である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５５．ｎが１である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５６．ＡＡ２が、γＧｌｕ、αＧｌｕ、βＡｓｐ、αＡｓｐ、γ-Ｄ-Ｇｌｕ、α-Ｄ-Ｇｌｕ、β-Ｄ-Ａｓｐ、α-Ｄ-Ａｓｐ、又は次の式：
Figure 0005749155
のアミノ酸であり、該式において、矢印は、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３のアミノ基、又はＢ２９リジン残基のε-アミノ基、又はプロテアーゼ安定化インスリンのＮ末端位置に対する結合点を示す、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５７．ＡＡ２が、γＧｌｕ、βＡｓｐ、γ-Ｄ-Ｇｌｕ、β-Ｄ-Ａｓｐ、α-Ｄ-Ａｓｐ、又は次の式：
Figure 0005749155
のアミノ酸であり、該式において、矢印は、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３のアミノ基、又はＢ２９リジン残基のε-アミノ基、又はプロテアーゼ安定化インスリンのＮ末端位置に対する結合点を示す、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５８．ＡＡ２が、γＧｌｕ、γ-Ｄ-Ｇｌｕ、又は次の式：
Figure 0005749155
のアミノ酸であり、該式において、矢印は、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３のアミノ基、又はＢ２９リジン残基のε-アミノ基、又はプロテアーゼ安定化インスリンのＮ末端位置に対する結合点を示す、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
５９．ｍが０、１、２、３、４、５又は６である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６０．ｍが０、１、２、３又は４である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６１．ｍが４である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６２．ｍが３である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６３．ｍが２である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６４．ｍが１である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６５．ｍが０である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６６．ＡＡ３が次の式：
Figure 0005749155
の任意のものから選択される、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６７．ｒが１、３、５又は７である、先行する項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６８．ｒが１である、先行する項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
６９．ｒが３である、先行する項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７０．ｒが５である、先行する項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７１．ｒが７である、先行する項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７２．ｐが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である、可能な限り先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７３．ｐが０、１、２、３又は４である、先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７４．ｐが０、１又は２である、先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７５．ｐが０又は２である、先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７６．ｐが０である、先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７７．ｐが２である、先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリン。
７９．この明細書、例えば特定の実施例、特に以下の実施例１の任意の一つに記載されている化合物の任意の一つである、先行する生成物の項のいずれか１項の化合物。
８０．この明細書に特に記載されている任意のプロテアーゼ安定化インスリンに結合する、この明細書に特に記載されているアシル部分の特定の例の任意の一つである、先行する生成物の項のいずれか１項の化合物。
８１．糖尿病を処置する薬学的組成物の調製のための、先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
８２．糖尿病を処置するために肺投与可能な薬学的組成物の調製のための、先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
８３．糖尿病を処置するために肺投与可能で、長時間の作用効果を付与する薬学的組成物の調製のための、先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
８４．糖尿病を処置するために肺投与可能なパウダー状薬学的組成物の調製のための、先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
８５．糖尿病を処置するために肺投与可能な液状薬学的組成物の調製のための、先行する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
８６．糖尿病を処置するために経口投与可能な薬学的組成物の調製のための、生成する生成物の項のいずれか１項の化合物の使用。
８７．先行する生成物の項のいずれか１項の化合物を治療的有効量、それを必要とする被験者に投与することを含む、糖尿病の処置方法。
８８．ヒトインスリン、並びに先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する組成物。
８９．インスリンアスパルト、並びに先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する組成物。
９０．インスリンリスプロ、並びに先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する組成物。
９１．インスリングルリシン、並びに先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを含有する組成物。
９２．薬学的に許容可能な担体と、インスリンアナログに関連する先行する項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化インスリンを生物活性量含有する薬学的組成物。
９３．インスリンアナログに関連する上述した項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化インスリン、又は上述した項のいずれか１項の薬学的組成物を被験者に投与することを含む、被験者の高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、Ｘ症候群、又は脂質代謝異常を処置、予防又は緩和する方法。
９４．高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、Ｘ症候群、又は脂質代謝異常を処置又は予防する製薬用製剤を調製するための、インスリンアナログに関する上述した項のいずれか１項のプロテアーゼ安定化インスリンの治療的有効量の使用。
９５．糖尿病の処置方法であって、該方法が、先行する生成物の項のいずれか１項のアシル化インスリンを治療的有効量、それを必要とする被験者に投与することを含む方法。
場合によっては、一又は複数の以下の請求項と、ここに記載の一又は複数の項とを組合せることで、さらなる項が得られ、本発明は該項と請求項の全ての可能な組合せに関する。
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決してこの発明を限定するものと解すべきではない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単にこの発明をより明らかに例証することを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。文献のここでの記載は、それらが従来技術を構成することを承認するものではない。
ここで、「含有する」なる単語は、広義には「含む」、「有する」又は「包含する」を意味すると解釈される(ＥＰＯガイドラインＣ４.１３)。
この発明は、適用される法律に容認される場合、ここに付加される請求項に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。
次の実施例は例証する方法を提供するものであって、限定するものではない。
ここで使用される略語は次の通りである：βＡｌａはベータ-アラニルであり、Ａｏｃは８-アミノオクタン酸であり、ｔＢｕはtert-ブチルであり、ＤＣＭはジクロロメタンであり、ＤＩＣはジイソプロピルカルボジイミドであり、ＤＩＰＥＡ＝ＤＩＥＡはＮ,Ｎ-ｄイソプロピルエチルアミンであり、ＤＭＦはＮ,Ｎ-ｄメチルホルムアミドであり、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドであり、ＥｔＯＡｃは酢酸エチルであり、Ｆｍｏｃは９-フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、γＧｌｕはガンマＬ-グルタミルであり、ＨＣｌは塩酸であり、ＨＯＢｔは１-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＮＭＰはＮ-メチルピロリドンであり、ＭｅＣＮはアセトニトリルであり、ＯＥＧは[２-(２-アミノエトキシ)エトキシ]メチルカルボニルであり、Ｓｕはスクシンイミジル-１-イル＝２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルであり、ＯＳｕはスクシンイミジル-１-イルオキシ＝２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシであり、ＲＰＣは逆相クロマトグラフィーであり、ＲＴは室温であり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＴＮＢＳは２,４,６-トリニトロベンゼンスルホン酸であり、トリスはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンであり、ＴＳＴＵはＯ-(Ｎ-スクシンイミジル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラートである。
以下の実施例及び一般的手順は、明細書及び合成スキームにおいて同定される中間化合物及び最終生成物について言及する。本発明の化合物の調製は、以下の実施例を使用して詳細に記載されるが、記載された化学反応は、本発明の化合物を調製するための一般的な適用性に関して開示するものである。時折、反応は、本発明の開示されている範囲内に含まれる各化合物に対して、記載されたように適用されない場合もある。ここで生じる化合物は、当業者に容易に認識されるであろう。これらの場合、反応は当業者に公知に従来からの修飾法により、すなわち干渉基を適切に保護することにより、他の従来からの試薬を変えることにより、又は反応条件を常套的に改変することにより成功裏に実施することができる。また、ここに開示されている他の反応、又は他の従来的なものが、本発明の対応する化合物の調製に適用されるであろう。全ての調製方法において、全ての出発物質は公知であるか、又は公知の出発物質から容易に調製されてもよい。全ての温度は摂氏で説明されており、そうでない場合は示しており、全ての部及びパーセンテージは、収率に関しては重量であり、全ての部は、溶媒及び溶離液に関して容量である。
本発明の化合物は、当該分野で典型的な次の手順の一又は複数を使用することにより精製することができる。これらの手順は、必要ならば、勾配、ｐＨ、塩、濃度、流量、カラム等に関して修正することができる。当該問題のインスリン等の不純物プロファイル、溶解度等の要因に応じて、これらの修正は容易に認識可能であり、また当業者によってなされるであろう。
酸性ＨＰＬＣ又は脱塩後は、化合物は純粋フラクションの凍結乾燥によって分離される。
中性ＨＰＬＣ又はアニオン交換クロマトグラフィー後は、化合物を脱塩し、等電ｐＨで沈殿させ、又は酸性ＨＰＬＣで精製される。
典型的な精製手順：
ＨＰＬＣシステムは次のものからなるGilsonシステムである：モデル２１５液体ハンドラー、モデル322-H2ポンプ及びモデル155 ＵＶ検出器。検出は典型的には２１０ｎｍ及び２８０ｎｍである。
Akta精製FPLCシステム(Amersham Biosciences)は次のものからなる：モデルP-900ポンプ、モデル UV-900 ＵＶ検出器、モデルpH/C-900 pH及び伝導度検出器、モデルFrac-950フラクション収集器。ＵＶ検出は典型的には２１４ｎｍ、２５４ｎｍ及び２７６ｎｍである。
酸性ＨＰＬＣ:
カラム: Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4
流量： ８ｍｌ/分
バッファー Ａ: アセトニトリルに０．１％のＴＦＡ
バッファー Ｂ: 水に０．１％ＴＦＡ
勾配: ０．０−５．０分： １０％Ａ
５．００−３０．０分： １０％Ａから９０％Ａ
３０．０−３５．０分： ９０％Ａ
３５．０−４０．０分： １００％Ａ
中性ＨＰＬＣ：
カラム： Phenomenex, Jupiter，C4 ５μｍ ２５０ｘ１０．００ｍｍ ３００Ａ
流量： ６ｍｌ／分
バッファーＡ： ５ｍＭのトリス、７．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ＝７．３、
２０％のＣＨ３ＣＮ
バッファーＢ： ６０％のＣＨ３ＣＮ、４０％の水
勾配： ０-５分： １０％のＢ
５-３５分：１０-６０％のＢ
３５-３９分：６０％のＢ
３９-４０分：７０％のＢ
４０-４３．５分：７０％のＢ
アニオン交換クロマトグラフィー：
カラム： Ressource Q，１ｍｌ
流量： ６ｍｌ／分
バッファーＡ： ０．０９％のＮＨ４ＨＣＯ３、０．２５％のＮＨ４ＯＡｃ、
４２．５％のエタノール ｐＨ８．４
バッファーＢ： ０．０９％のＮＨ４ＨＣＯ３、２．５％のＮＨ４ＯＡｃ、
４２．５％のエタノール ｐＨ８．４
勾配： ３０カラム体積の間、１００％Ａから１００％Ｂ
脱塩：
カラム： HiPrep 26/10
流量： １０ｍｌ／分、６カラム体積
バッファー １０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３
一般式(ＩＩ)のアシル化試薬の固相合成における一般的手順：
(ＩＩ)：Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-Ａｃｔ
ここで、Ａｃｙ、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ及びｐは、上述にて定めたものであり、Ａｃｔは、例えばＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＯＳｕ)、又は１-ヒドロキシベンゾトリアゾール等、活性エステルの離脱基であり、ここで、アシル部分のＡｃｙ及びＡＡ２部分にあるカルボン酸は、tert-ブチルエステルとして保護されている。
本発明の一般式(ＩＩ)の化合物は、固相ペプチド合成の分野において当業者によく知られている手順を使用し、固体状支持体において合成可能である。この手順は、ポリスチレン-２-クロロトリチルクロリド樹脂にＦｍｏｃ保護されたアミノ酸を結合させることを含む。結合は、例えば、第３級アミン、特にトリエチルアミン又はＮ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンの存在下、遊離のＮ-保護されたアミノ酸を使用することにより達成可能である(以下参照)。このアミノ酸のＣ末端(樹脂に結合)は、本発明の親インスリンに結合する合成配列の端部に存在する。樹脂へのＦｍｏｃアミノ酸の結合後、例えば第２級アミン類、特にピペリジン又はジエチルアミンを使用し、Ｆｍｏｃ基を脱保護し、続いて、別の(又は同様の)Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸をカップリングさせ、脱保護する。モノ-tert-ブチル保護された脂肪(α,ω)二酸、例えばヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸、又はエイコサン二酸のモノ-tert-ブチルエステルをカップリングさせることにより、合成配列を終結させる。樹脂からの化合物の切断は、希釈された酸、例えば０．５-５％のＴＦＡ／ＤＣＭ(ジクロロメタンにトリフルオロ酢酸)、酢酸(例えば、ＤＣＭに１０％、又はＨＯＡｃ／トリフルオロエタノール／ＤＣＭ １：１：８)、又はヘカフルオロイソプロパノールがＤＣＭに入ったものを使用して達成される(例えば、「Organic Synthesis on Solid Phase」, F.Z. Dorwald, Wiley-VCH, 2000. ISBN 3-527-29950-5, 「Peptides: Chemistry and Biology」, N. Sewald & H.-D. Jakubke, Wiley-VCH, 2002, ISBN 3-527-30405-3又は「The Combinatorial Cheemistry Catalog」 1999, Novabiochem AG、及びここに引用された文献を参照)。このことは、カルボン酸保護基として化合物に存在するtert-ブチルエステルが脱保護されないことで確実となる。最終的に、Ｃ末端カルボキシ基(樹脂からは遊離)が活性化され、例えばＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＯＳｕ)として、本発明の親インスリンへの結合におけるカップリング試薬として、直接又は精製後に使用される。この手順を実施例９に例証する。
また、上述した一般式(ＩＩ)のアシル化試薬は、以下に記載する溶液相合成により、調製することができる。
モノ-tert-ブチル保護された脂肪二酸、例えばヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸又はエイコサン二酸のモノ-tert-ブチルエステルは、以下に記載する ＯＳｕ-エステルとして、又は当業者に公知の任意の他の活性化エステル、例えばＨＯＢｔ-又はＨＯＡｔ-エステルとして、活性化されている。この活性エステルは、適切な塩基、例えばＤＩＰＥＡ又はトリエチルアミンの存在下、適切な溶媒、例えばＴＨＦ、ＤＭＦ、ＮＭＰ(又は溶媒混合物)において、アミノ酸ＡＡ１、モノ-tert-ブチル保護されたＡＡ２、又はＡＡ３の一つとカップリングさせる。例えば、抽出手順又はクロマトグラフィー手順により、中間体が単離される。得られた中間体は、再度活性化され(上述に記載)、上述したアミノ酸ＡＡ１、モノ-tert-ブチル保護されたＡＡ２、又はＡＡ３の一つとカップリングさせる。この手順は,所望の保護された中間体Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-ＯＨが得られるまで繰り返される。次々に活性化され、一般式(ＩＩ)Ａｃｙ-ＡＡ１ｎ-ＡＡ２ｍ-ＡＡ３ｐ-Ａｃｔのアシル化試薬が提供される。この手順を実施例２１に例証する。
上述した任意の方法により調製されたアシル化試薬は、ＯＳｕエステルとして、活性化後に(tert-ブチル)脱保護されてもよい。このことは、ＯＳｕ-活性化tert-ブチル保護されたアシル化試薬のＴＦＡ処理により実施することができる。任意のプロテアーゼ安定化インスリンのアシル化後、本発明の脱保護されプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが得られる。これを、例えば以下の実施例１６に例証する。
上述した任意の方法により調製された試薬が、ＯＳｕエステルとして、活性化後に(tert-ブチル)脱保護されない場合、任意のプロテアーゼ安定化インスリンをアシル化することで、対応する本発明のtert-ブチル保護されプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが提供される。本発明の脱保護されプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを得るためには、保護されたインスリンを脱保護することである。このことはＴＦＡ処理により実施可能で、本発明の脱保護されプロテアーゼ安定化アシル化インスリンが提供される。これを、例えば以下の実施例１及び２に例証する。
インスリンのリジン残基のアシル化(イプシロン位)が所望されている場合、アシル化 はアルカリ性ｐＨ(例えば、ｐＨ１０、１０．５又は１１)で実施される。これを、例えば以下の実施例１及び２に例証する。
インスリンのＡ鎖Ｎ末端位(Ａ１)アシル化が所望されている場合、アシル化は中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７、７．５、８又は８．５)で実施される。これを、例えば以下の実施例３８及び４４に例証する。
この発明のプロテアーゼ安定化アシル化インスリンを調製するための一般的手順(Ａ)
一般的手順(Ａ)を最初の実施例に例証する。
実施例１、一般的手順(Ａ)；
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε-ヘキサデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(５００ｍｇ)を、１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３水(５ｍＬ)に溶解させ、１ＮのＮａＯＨを用い、ｐＨを１０．５に調節した。ヘキサデカン二酸 tert-ブチルエステル Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルをアセトニトリル(１０Ｗ／Ｖ％)に溶解させ、インスリン溶液を添加し、沈殿を回避するために温タップ下でゆっくりと加熱し、室温で３０分放置した。混合物を凍結乾燥させた。固形物を氷冷された９５％のトリフルオロ酢酸(５％の水分を含有)に溶解させ、氷上に３０分保持した。混合物を真空で濃縮し、ジクロロメタンから再蒸発させた。残留物を水に溶解させ、ｐＨを中性(６-７)に調節し、混合物を凍結乾燥させた。
得られたインスリンを、１５ｍＭのトリス、５０ｖ／ｖ％のエタノール、ｐＨ７．５(酢酸)に１５〜３００ｍＭの酢酸アンモニウム勾配を用いて溶出させる、Source 15Qの２１ｍｌカラムにおけるイオン交換クロマトグラフィーを数回実行することにより精製した。純粋なフラクションの最終的な脱塩を、０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡ、５０ｖ／ｖ％のエタノールを用いて等張的に溶出させる、ＲＰＣの３ｍＬカラムにおいて実施した。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝１４８３．２(Ｍ＋４)／４。算出値：１４８３．５。
実施例２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε-オクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(２ｇ)を、１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３水(１０ｍＬ)に溶解させ、ＤＭＳＯ(４ｍＬ)を添加した。１ＮのＮａＯＨ、tert-ブチルオクタデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯｔＢｕ(国際公開第2005/012347号に記載されたようにして調製)を用い、ｐＨを１０．５に調節した。１００ｍＭ超のＮａ２ＣＯ３水(２０ｍＬ)、続いてＴＨＦ(２０ｍＬ)を添加した。１．５時間後、数滴のメチルアミンを添加し、続いて、酢酸を用いて、混合物を酸性化させた。調製用ＨＰＬＣを用いて混合物を精製し、凍結乾燥させると、ジ-tert-ブチルエステルとして表題のインスリンが提供された。これをジクロロメタン及びトリフルオロ酢酸 １：１(５０ｍＬ)に溶解させた。混合物を２時間放置し、真空で濃縮した。少量の水とアセトニトリルを添加した後、混合物を調製用ＨＰＬＣにより精製した。純粋なフラクションを凍結乾燥させた。これにより、３１３ｍｇの表題のインスリンが提供された。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６０８９(Ｍ＋１)。算出値：６０８９。
実施例３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、エイコサン二酸から出発し、エイコサン二酸 モノ-tert-ブチルエステル及びtert-ブチルイコサンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯｔＢｕを介して、上述に記載したように、同様に調製した。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１２０(Ｍ＋１)。算出値：６１１７。
実施例４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε３-カルボキシ-５-オクタデカンジオイルアミノベンゾイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、５-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタ-デカノイルアミノ)イソフタル酸 モノ-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル(国際公開第2006/082204号に記載されたようにして調製)から出発して、上述に記載したように、同様に調製した。
ＬＣ-ＭＳ：１５３１(Ｍ＋４)、Ｍｗ ６１２４(デコンボリューションされた)。算出値：１５３１(Ｍ＋４)、６１２２。
実施例５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε-Ｎ-オクタデカンジオイル-Ｎ-(２-カルボキシエチル)グリシル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、tert-ブチルオクタデカンジオイル-Ｎ-(２-(tert-ブトキシカルボニル)エチル)-Ｇｌｙ-ＯＳｕ(国際公開第２００５／０１２３４７号に記載されたようにして調製)から出発して、上述に記載したように、同様に調製した。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：１５２２．５２(Ｍ＋４)。算出値：１５２３。
実施例６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε(Ｎ-オクタデカンジオイル-Ｎ-カルボキシメチル)-ベータ-アラニル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、tert-ブチルオクタデカンジオイル-Ｎ-(tert-ブトキシカルボニルメチル)-βＡｌａ-ＯＳｕ(国際公開第２００５／０１２３４７号に記載されたようにして調製)から出発して、上述に記載したように、同様に調製した。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６０８８(Ｍ＋１)。算出値：６０８９。
実施例７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε４-([４-({１９-カルボキシノナデカノイルアミノ}メチル)トランス-シクロヘキサン-カルボニル]-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、２-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジ-オキソピロリジン-１-イル)エステルから出発して、上述に記載したように、同様に調製した。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：６２６０。算出値：６２５５。
２-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)-ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステルの調製：
１．tert-ブチルエイコサン二酸のＯＳｕ活性化
tert-ブチルイコサン二酸(５．０ｇ)を、ＴＨＦ(５０ｍｌ)及びＤＭＦ(３０ｍｌ)に溶解させた。ＴＳＴＵ(４．５３ｇ)及びＤＩＰＥＡ(２．６５ｍｌ)を添加した。混合物を３日間攪拌し、ついで真空で濃縮した。固体状残留物をアセトニトリルから再結晶化させ、白色の結晶性化合物としてイコサン二酸 tert-ブチルエステル Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(５．５２ｇ、８９％)を得た。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：４４０ [Ｍ-５６(＝tert-Ｂｕ)]
２．トラネキサム酸のカップリング
ＴＨＦ(１００ｍｌ)にイコサン二酸 tert-ブチルエステル Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(５．５２ｇ)が入った溶液に、トラネキサム酸(１．７５ｇ)を添加した。沈殿物を得た。ＤＭＦ(７５ｍｌ)、水(２５ｍｌ)及びＤＭＳＯ(５０ｍｌ)及び数滴のＤＩＰＥＡを添加することにより、溶液を得る試みは成功しなかった。懸濁液を一晩攪拌した。混合物を真空で濃縮した。固体状残留物にＴＨＦを添加し、沈殿物を濾過した。濾液を濃縮し、固体状残留物をアセトニトリルにおいて再結晶化させ、白色の結晶性化合物として４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸(５．５６ｇ、９３％)を得た。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：５３８(Ｍ＋１)。
３．４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸のＯＳｕ活性化
ＴＨＦ(１００ｍｌ)に４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸(５．５６ｇ)が入った溶液に、アセトニトリル(２５ｍｌ)にＴＳＴＵ(３．４２ｇ)が入った溶液を添加した。一晩攪拌した後、混合物を真空で濃縮した。固体状残留物をアセトニトリルから再結晶化させ、４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸 ２,５-ジ-オキソピロリジン-１-イルエステル(５．７６ｇ、８８％)を得た。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：６３５(Ｍ＋１)。
４．Ｈ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕのカップリング及びＯＳｕ活性化
ＴＨＦ(１５０ｍｌ)に４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボン酸 ２,５-ジ-オキソピロリジン-１-イルエステルが入った溶液に、水(２５ｍｌ)及び数滴のＤＩＰＥＡにＨ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ(１．８４ｇ)が入った溶液を添加した。混合物を一晩攪拌し、ついで真空で濃縮した。残留物を温(６０℃)ＴＨＦに溶解させ、濾過した。冷濾液に１５０ｍｌまでのＴＨＦを添加し、アセトニトリル(２５ｍＬ)にＴＳＴＵ(２．９８ｇ)が溶解したものを添加した。２０分攪拌した後、混合物を濃縮した。残留物をアセトニトリルから再結晶化させ、白色の固形物である２-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル(６．８ｇ、９２％)を得た。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：８２０(Ｍ＋１)。
実施例８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘプタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、ヘプタデカン二酸から出発し、ヘプタデカン二酸 モノ-tert-ブチルエステル及びtert-ブチルヘプタデカンジオイル-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯＳｕ)-ＯｔＢｕ(国際公開第2006/082204号に記載されたようにして調製)を介して、上述に記載したように、同様に調製した。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：１５１９(Ｍ＋４)。算出値：１５１９。
実施例９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
一晩絶食させた雄のウィスターラットにおけるこの化合物の経口効果を、以下の図２ａ及び図２ｂに付与する。
このインスリンを、１７-((Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-{２-[２-({２-[２-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニルメトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ヘプタデカン酸 tert-ブチルエステル(別の名称：tert-ブチルオクタデカンジオイル-Ｇｌｕ(ＯＥＧ-ＯＥＧ-ＯＳｕ)-ＯｔＢＵ)から出発し、上述に記載したように、同様に調製した。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：１５９６(Ｍ＋４)。算出値：１５９６。
このインスリンを調製するための構築用成分を、以下に記載されるようにして調製した。
Figure 0005749155
出発樹脂：２-クロロトリチル樹脂、１．６０ｍｍｏｌ／ｇ
１．０ｇの樹脂を、ＤＣＭ(１０ｍｌ)において３０分、膨張させた。
１．Ｆｍｏｃ-８-アミノ-３,６-ジオキサオクタン酸を用いたアシル化：
０．３９ｇ(０．６３当量、１．０ｍｍｏｌ)のＦｍｏｃ-８-アミノ-３,６-ジオキサオクタン酸(Ｆｍｏｃ-ＯＥＧ-ＯＨ)をＤＣＭ(１５ｍｌ)に溶解させ、樹脂に添加した。Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＥＡ)(０．４４ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ)を滴下した。反応混合物を３０分ボルテックスし、ついでメタノール(２ｍｌ)を添加し、混合物をさらに１５分ボルテックスした。樹脂を濾過し、ＮＭＰ(２ｘ８ｍｌ)及びＤＣＭ(８ｘ８ｍｌ)で洗浄した。
２０％のピペリジン／ＮＭＰ(８ｍｌ)を添加し、１０分放置し、もう一度繰り返した。濾過し、ＮＭＰ(２ｘ８ｍｌ)、ＤＣＭ(３ｘ８ｍｌ)、及びＮＭＰ(５ｘ８ｍｌ)で洗浄した。正のＴＮＢＳテストにより赤色の樹脂が得られた。
２．Ｆｍｏｃ-８-アミノ-３,６-ジオキサオクタン酸を用いたアシル化：
０．７８ｇ(２当量、２．０ｍｍｏｌ)のＦｍｏｃ-８-アミノ-３,６-ジオキサオクタン酸を、ＮＭＰ／ＤＣＭ １：１(１０ｍｌ)に溶解させた。０．２８ｇ(２．２当量、２．４ｍｍｏｌ)のＨＯＳｕ、続いて０．３７ｍｌ(２．２当量、２．４ｍｍｏｌ)ＤＩＣを添加した。反応混合物１時間放置し、ついで樹脂に添加し、最終的に０．４０７ｍｌ(２．２当量)のＤＩＥＡを添加した。混合物を１６時間ボルテックスし、濾過し、ＮＭＰ(２ｘ８ｍｌ)、ＤＣＭ(３ｘ８ｍｌ)、及びＮＭＰ(５ｘ８ｍｌ)で洗浄した。正のＴＮＢＳテストにより無色の樹脂が得られた。
２０％のピペリジン／ＮＭＰ(１０ｍｌ)を添加し、１０分放置し、もう一度繰り返した。濾過し、ＮＭＰ(２ｘ８ｍｌ)、ＤＣＭ(３ｘ８ｍｌ)、及びＮＭＰ(５ｘ８ｍｌ)で洗浄した。正のＴＮＢＳテストにより赤色の樹脂が得られた。
Ｆｍｏｃ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕを用いたアシル化：
０．８６ｇ(２当量、２．０ｍｍｏｌ)のＦｍｏｃ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕを、ＮＭＰ／ＤＣＭ１：１(１０ｍｌ)に溶解させた。０．３２ｇ(２．２当量、２．４ｍｍｏｌ)のＨＯＢＴ、続いて０．３７ｍｌ(２．２当量、２．４ｍｍｏｌ)のＤＩＣを添加した。反応混合物を２０分放置し、ついで樹脂に移し、最終的に０．４０７ｍｌ(２．２当量)のＤＩＥＡを添加した。混合物を１６時間ボルテックスし、濾過し、ＮＭＰ(２ｘ８ｍｌ)、ＤＣＭ(３ｘ８ｍｌ)、及びＮＭＰ(５ｘ８ｍｌ)で洗浄した。正のＴＮＢＳテストにより無色の樹脂が得られた。
２０％のピペリジン／ＮＭＰ(１０ｍｌ)を添加し、１０分放置し、もう一度繰り返した。濾過し、ＮＭＰ(２ｘ８ｍｌ)、ＤＣＭ(３ｘ８ｍｌ)、及びＮＭＰ(５ｘ８ｍｌ)で洗浄した。正のＴＮＢＳテストにより赤色の樹脂が得られた。
オクタデカン二酸モノtert-ブチルエステルを用いたアシル化：
０．７５ｇ(２当量、２．０ｍｍｏｌ)のオクタデカン二酸モノtert-ブチルエステル を、ＮＭＰ／ＤＣＭ １：１(１０ｍｌ)に溶解させた。０．３２ｇ(２．２当量、２．４ｍｍｏｌ)のＨＯＢＴ、続いて０．３７ｍｌ(２．２当量、２．４ｍｍｏｌ)のＤＩＣを添加した。反応混合物を２０分放置し、ついで樹脂に移し、最終的に０．４１ｍｌ(２．２当量)のＤＩＥＡを添加した。混合物を１６時間ボルテックスし、濾過し、ＮＭＰ(２ｘ８ｍｌ)、ＤＣＭ(３ｘ８ｍｌ)、及びＮＭＰ(５ｘ８ｍｌ)で洗浄した。
ＴＦＡを用いた切断：
８ｍｌの５％ＴＦＡ／ＤＣＭを樹脂に添加し、反応混合物を２時間ボルテックスし、濾過し、濾液を収集した。５％超のＴＦＡ／ＤＣＭ(８ｍｌ)を樹脂に添加し、混合物を１０分ボルテックスし、濾過し、樹脂をＤＣＭ(２ｘ１０ｍｌ)で洗浄した。組合せた濾液を洗浄し、約８００μｌのＤＩＥＡを使用して、ｐＨを塩基性に調節した。真空で混合物を蒸発させ、油(３．５ｇ)が提供された。ジエチルエーテル(３０ｍｌ)を添加し、デカントにより溶解しなかった油を分離し、真空で蒸発させた。これにより、油として、１．１ｇの１７-{(Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-[２-(２-{[２-(２-カルボキシメトキシエトキシ)エチルカルバモイル]メトキシ}エトキシ)エチルカルバミル]プロピルカルバモイル}ヘプタデカン酸 tert-ブチルエステル(別の名称：tert-ブチルオクタデカンジオイル-Ｇｌｕ(ＯＥＧ-ＯＥＧ-ＯＨ)-ＯＴＢＵ)が提供された。
ＬＣ-ＭＳ(Sciex100 API)：ｍ／ｚ＝８４６．６(Ｍ＋１)＋。
ＯＳｕ-活性化：
上述したtert-ブチルオクタデカンジオイル-Ｇｌｕ(ＯＥＧ-ＯＥＧ-ＯＨ)-ＯｔＢＵ(０．６３ｇ)をＴＨＦ(３５ｍｌ)に溶解させた。ＤＩＥＡ(０．２５５ｍｌ、２当量)、続いてＴＳＴＵ(０．４５ｇ、２当量)を添加し、混合物を室温で１６時間攪拌した。混合物を酢酸エチル(２５０ｍｌ)とＮａＨＳＯ４(３ｘ１００ｍｌ)との間に分配させた。有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、真空で濃縮したところ、油として、０．６５ｇの１７-((Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-{２-[２-({２-[２-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニルメトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ヘプタデカン酸 tert-ブチルエステル(別の名称：tert-ブチルオクタデカンジオイル-Ｇｌｕ(ＯＥＧ-ＯＥＧ-ＯＳｕ)-ＯｔＢｕ)が提供された。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝９４３．４(Ｍ＋１)。
実施例１０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεミリストイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、１-テトラデカノイル-ピロリジン-２,５-ジオンから出発し、上述に記載したように、同様に調製した。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝５８７３．６。算出値：５８７２．９。
実施例１１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、(Ｓ)-２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 ５-tert-ブチルエステル１-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステルから出発して、上述に記載したように、同様に調製した。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６２４２．５。算出値：６２４５．２。
(Ｓ)-２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 ５-tert-ブチルエステル １-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステルの調製
１．(Ｓ)-２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル
ＴＨＦ(１００ｍｌ)に(Ｓ)-２-(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル(国際公開第2005/012347号に記載されたようにして調製)(４．１ｇ)が入った溶液に、水(２０ｍｌ)にＨ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ(１．４７ｇ)が入った溶液を添加した。ＤＩＰＥＡを用いて、ｐＨを８に調節した。１．５時間攪拌した後、混合物を濃縮した。残留物をＤＣＭから再結晶化させ、白色の固形物として表題の化合物(２．８１ｇ、６１％)を得た。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝７６９(Ｍ＋１)。
(Ｓ)-２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 ５-tert-ブチルエステル １-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル
アセトニトリル(８０ｍｌ)に(Ｓ)-２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル(２．８１ｇ)が入った溶液に、アセトニトリル(２０ｍｌ)にＴＳＴＵ(１．３２ｇ)が入った溶液を添加した。ＤＩＰＥＡを用いて、ｐＨを８に調節した。１．５時間攪拌した後、混合物を濃縮した。残留物をアセトニトリルから再結晶化させ、表題の化合物(１．７ｇ、５４％)を得た。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝８６６．４(Ｍ＋１)。
実施例１２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε４-([４-({１９-カルボキシノナデカノイルアミノ}メチル)トランス-シクロヘキサンカルボニル]-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
このインスリンを、２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステルから出発して、上述に記載したように、同様に調製した。
ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：６３８６(Ｍ＋１)。算出値：６３８４。
２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステルの調製
１．２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル
ＴＨＦ(１００ｍｌ)に２-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル(５．０ｇ)が入った溶液に、水(２５ｍｌ)にＨ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ(１．３６ｇ)が入った溶液を添加した。一晩攪拌した後、混合物を真空で濃縮した。残留物を水から沈殿させ、濾過し、真空で乾燥させ、表題の化合物(４．６３ｇ、８４％)を得た。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝７４０(Ｍ-３ｘ５６、３ｘｔ-Ｂｕの損失)。
２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル
ＴＨＦ(１５０ｍｌ)に２-[４-tert-ブトキシカルボニル-４-({４-[(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル(４．６ｇ)が入った溶液に、ＴＳＴＵ(１．６８ｇ)を添加した。ＤＩＰＥＡ(０．９７ｍｌ)を添加した。一晩攪拌した後、混合物を真空で濃縮した。残留物をアセトニトリルから結晶化させたところ、固形物として表題の化合物(４．４ｇ、８７％)が提供された。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝８３７(Ｍ-３ｘ５６、３ｘｔ-Ｂｕの損失)。
実施例１３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
一晩絶食させた雄ウィスターラットにおけるこの化合物の経口効果を、以下の図７に付与する。
ＬＣ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５５５(Ｍ＋４)／４。
実施例１４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１１８
実施例１５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＰＥＧ７),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６５１０
実施例１６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
一晩絶食させた雄のウィスターラットにおけるこの化合物の経口効果を、以下の図３に付与する。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６４０７
この実施例用の中間アシル化試薬を以下に記載するようにして調製した。
工程１：１９-{(Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-[２-(２-{[２-(２-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ノナデカン酸 tert-ブチルエステル
Figure 0005749155
エタノール(４０ｍｌ)に、２-(１９-tert-ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル(２．５０ｇ(国際公開第2005/012347号に記載されたように同様に調製)及び[２-(２-{２-[２-(２-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]酢酸(１．４７ｇ、別の名称：８-アミノ-３,６-ジオキサオクタン酸ダイマー、IRIS BiotechgmbH, Cat. No. PEG1221)が入った溶液に、ＤＩＰＥＡ(１．２６ｍｌ)を添加した。混合物を室温で一晩攪拌し、真空で濃縮した。残留物に０．１ＮのＨＣｌ水(１５０ｍｌ)及び酢酸エチル(２００ｍｌ)を添加した。相分離させ、水相を酢酸エチル(１００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を水とブラインで洗浄し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、真空で濃縮し、放置時に結晶化する油を得た。収率９６％(３．１ｇ)。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝８７４．４９。
工程２：１９-((Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-{２-[２-({２-[２-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ノナデカン酸 tert-ブチルエステル：
Figure 0005749155
アセトニトリル(５０ｍｌ)に１９-{(Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-[２-(２-{[２-(２-カルボキシメトキシエトキシ)エチルカルバモイル]-メトキシ}エトキシ)エチルカルバモイル]プロピルカルバモイル}ノナデカン酸 tert-ブチルエステル(３．１ｇ)が入った溶液に、ＴＳＴＵ(１．３９ｇ)及びＤＩＰＥＡ(０．９１ｍｌ)を添加した。混合物を室温で一晩攪拌し、ついで真空で濃縮した。残留物に０．１ＮのＨＣｌ水(１００ｍｌ)及び酢酸エチル(２００ｍｌ)を添加した。相分離させ、水相を酢酸エチル(５０ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を水とブラインで洗浄し、乾燥させ(硫酸マグネシウム)、真空で濃縮し、油を得た。収率９９％(３．４ｇ)。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：９７１．８。
工程３：１９-((Ｓ)-１-カルボキシ-３-{２-[２-({２-[２-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニルメトキシ)エトキシ]エチル-カルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ノナデカン酸：
Figure 0005749155
１９-((Ｓ)-１-tert-ブトキシカルボニル-３-{２-[２-({２-[２-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニルメトキシ)エトキシ]エチル-カルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ノナデカン酸 tert-ブチルエステル(３．４ｇ)を、ＴＦＡ(７５ｍｌ)において４５分攪拌し、ついで真空で濃縮した。残留物をトルエンで３回濃縮し、固形物を得た。残留物を２-プロパノールにおいて結晶化させ、濾過し、結晶性化合物を得た。収率８０％(２．４ｇ)。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ：８５９．４４。
オクタデカン二酸フラグメントを用いた同様のアシル化試薬(例えば、実施例２６及び他の実施例で使用)は、同様にして調製することができる。
実施例１７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-(３-(２-{２-[２-(２-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)-ピロピオニル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１６２６(Ｍ＋４)
実施例１８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６３４８
実施例１９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６０６２
実施例２０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘプタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５９２(Ｍ＋４)
実施例２１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１６２０(Ｍ＋４)
この中間アシル化試薬オクタデカンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ-γＧｌｕ-γＧｌｕ-ＯＳｕ(残存するカルボン酸において、保護基としてtert-ブチルエステルを用いる)を、以下に記載するようにして調製した。
オクタデカン二酸tert-ブチルエステル ２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル
Figure 0005749155
オクタデカン二酸 モノ-tert-ブチルエステル(４．２ｇ、０．０１１ ｍｏｌ)をＴＨＦ(２０ｍｌ)に溶解させ、アセトニトリル(２０ｍｌ)にＴＳＴＵ(４ｇ、０．０１３ｍｏｌ)が入ったものを添加し、ＤＩＰＥＡを滴下して、溶液のｐＨを８に調節した。混合物を室温で４時間攪拌し、ついで、ＨＣｌ(２Ｍ)を用いてｐＨ３に酸性化させ、真空で蒸発させた。ついで、残留した油を酢酸エチルとＨＣｌ(０．１Ｍ)との間に分配させた。有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、濾過し、所定の乾燥度になるまで真空で蒸発させた。これにより、さらなる精製をすることなく、次の工程で使用可能な油として、５．２ｇのオクタデカン二酸 tert-ブチルエステル ２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステルが提供された。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝４６８(Ｍ＋１)及び４１２(Ｍ＋１-ｔＢｕ)。
(Ｓ)-２-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)-ペンタン二酸１-tert-ブチルエステル
Figure 0005749155
オクタデカン二酸 tert-ブチルエステル ２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(７ｇ、０．０１５ｍｏｌ)をＴＨＦ(８０ｍｌ)に溶解させ、Ｎａ２ＣＯ３(０．１Ｍ、４０ｍＬ)にＨ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ(３．７ｇ、０．０１６５ｍｏｌ)が入った溶液に添加した。混合物を室温で一晩攪拌し、ついで、ＨＣｌ(２Ｍ)を用いてｐＨ３に酸性化させ、真空で蒸発させた。ついで、残留物を酢酸エチルとＨＣｌ(０．１Ｍ)との間に分配させた。有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、濾過し、所定の乾燥度になるまで真空で蒸発させた。アセトニトリル(３０ｍＬ)の添加で白色沈殿物が形成し、濾過により単離し、乾燥させたところ、３．７５ｇの(Ｓ)-２-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステルが提供された。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝５５６(Ｍ＋１)。
アセトニトリル濾液の蒸発により、さらに２．６ｇの生成物が単離された。
(Ｓ)-２-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ペンタン二酸１-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル
Figure 0005749155
(Ｓ)-２-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル(３ｇ、０．００５ｍｏｌ)をＴＨＦ(１００ｍｌ)に溶解させ、アセトニトリル(３０ｍＬ)にＴＳＴＵ(１．７８ｇ、０．００６ｍｏｌ)が入った溶液に添加した。ＤＩＰＥＡを滴下して、ｐＨを８に調節した。混合物を室温で１時間攪拌し、ついで、ＨＣｌ(２Ｍ)を用いてｐＨ３に酸性化させ、真空で蒸発させた。ついで、残留した油を酢酸エチルとＨＣｌ(０．１Ｍ)との間に分配させた。有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、濾過し、所定の乾燥度になるまで真空で蒸発させた。これにより、白色固形物(２．７５ｇ)の(Ｓ)-２-(１７-tert-ブトキシカルボニル-ヘプタデカノイルアミノ)-ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステルが提供された。ＬＣＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝６５３(Ｍ＋１)。
(Ｓ)-２-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸１-tert-ブチルエステル
Figure 0005749155
(Ｓ)-２-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イル)エステル(０．５ｇ、０．７６６ｍｍｏｌ)をアセトニトリル(２０ｍＬ)に溶解させた。この溶液を、水(３０ｍＬ)にＨ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ(０．１７１ｇ、０．８４ｍｏｌ)が入った溶液に添加し、ＤＩＰＥＡを用いて、ｐＨを１０に調節した。混合物を室温で１５分攪拌し、ついで、ＨＣｌ(２Ｍ)を用いてｐＨ７に酸性化させ、真空で蒸発させた。残留物を酢酸エチルとＨＣｌ(０．１Ｍ)との間に分配させた。有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、濾過し、所定の乾燥度になるまで真空で蒸発させた。これにより、油として、(Ｓ)-２-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシ-カルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステルが提供された。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝７４１(Ｍ＋１)。
(Ｓ)-２-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]-ペンタン二酸５-tert-ブチルエステル１-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル
Figure 0005749155
(Ｓ)-２-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]-ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル(８ｇ、１０．７９ｍｍｏｌ)をアセトニトリル(４０ｍＬ)に溶解させ、アセトニトリル(４０ｍＬ)にＴＳＴＵ(３．８９ｇ、１２．９５ｍｍｏｌ)が入った溶液を添加した。ＤＩＰＥＡを滴下することにより、ｐＨを８に調節した。混合物を室温で１時間攪拌し、ついで、ＨＣｌ(２Ｍ)を用いてｐＨ３に酸性化させ、真空で蒸発させた。これにより油が得られ、ついで酢酸エチルとＨＣｌ(０．１Ｍ)との間に分配した。有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、濾過し、所定の乾燥度になるまで真空で蒸発させた。これにより、油として、８．２ｇの(Ｓ)-２-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]ペンタン二酸 ５-tert-ブチルエステル １-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステルが提供された。
(Ｓ)-２-{(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニル-ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル
Figure 0005749155
(Ｓ)-２-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]-ペンタン二酸 ５-tert-ブチルエステル １-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル(４ｇ、４．７７ｍｍｏｌ)をアセトニトリル(３０ｍｌ)に溶解させ、Ｎａ２ＣＯ３(０．１Ｍ、２０ｍＬ)にＨ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ(１．０７ｇ、５．２５ｍｏｌ)が入った溶液に添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、ついで、ＨＣｌ(２Ｍ)を用いてｐＨ７に中性化させ、真空で蒸発させた。ついで、残留した油を酢酸エチルとＨＣｌ(０．１Ｍ)との間に分配させた。有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、濾過し、所定の乾燥度になるまで真空で蒸発させた。残留物(４ｇ)をアセトニトリルに溶解させ、活性炭で処理した。濾過し、所定の乾燥度になるまで蒸発させ、真空で一晩乾燥させた後に、結晶性固形物として、２．８ｇの(Ｓ)-２-{(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシ-カルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステルを得た。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝９２７(Ｍ＋１)。
(Ｓ)-２-((Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-{(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)-ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル
Figure 0005749155
(Ｓ)-２-{(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイル-アミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル(２．８ｇ、３．０２ｍｍｏｌ)を、上述した同様の方法を使用し、ＴＳＴＵ(１．０ｇ、３．３２５ｍｍｏｌ)を用いて活性化させ、粗(Ｓ)-２-{(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}-ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル ５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステルを得た。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝１０２４(Ｍ＋１)。
１．３ｇのこの化合物アセトニトリル(４０ｍＬ)に溶解させ、水(３０ｍＬ)にＨ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ(０．２８ｇ、１．３９ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加し、ＤＩＰＥＡを用いて、ｐＨを９．３に調節した。混合物を室温で２時間攪拌し、ついで、ＨＣｌ(２Ｍ)を用いてｐＨ７に中性化させ、ほとんど乾燥するまで、真空で蒸発させた。残留物を水で処理し、白色の沈殿物を得、濾過した。真空で一晩乾燥させた後、 少量の出発物質を含有する、１．１ｇの(Ｓ)-２-((Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-{(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリル¬アミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステルが単離された。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝１１１１．９(Ｍ＋１)。
(Ｓ)-２-((Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-{(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)-ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル-５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イル)エステル
Figure 0005749155
(Ｓ)-２-((Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-{(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-[(Ｓ)-４-tert-ブトキシカルボニル-４-(１７-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]ブチリルアミノ}ブチリルアミノ)ペンタン二酸 １-tert-ブチルエステル(０．１ｇ、０．０９ｍｍｏｌ)を、活性化のための同様の方法を使用し、室温で１時間、アセトニトリル溶液において、ＴＳＴＵ(２９．８ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ)を用いて活性化させ、上述したように進行させた。これにより、さらに精製することなく、インスリンのアシル化用として使用可能な１００ｍｇの粗活性生成物が提供された。ＬＣ-ＭＳ(エレクトロスプレー)：ｍ／ｚ＝１２０８(Ｍ＋１)。
実施例２２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６３７３
実施例２３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６４０７
実施例２４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
一晩絶食させた雄のウィスターラットにおけるこの化合物の経口効果を、以下の図６に付与する。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１８８
実施例２５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
一晩絶食させた雄のウィスターラットにおけるこの化合物の経口効果を、以下の図４に付与する。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６３５２
実施例２６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６３４５
実施例２７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
一晩絶食させた雄のウィスターラットにおけるこの化合物の経口効果を、以下の図５に付与する。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６０４１
実施例２８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５９８(Ｍ＋４)
実施例２９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６０２８
実施例３０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５８１(Ｍ＋４)
実施例３１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４８４(Ｍ＋４)
実施例３２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５４８(Ｍ＋４)
実施例３３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎ(ｅｐｓ)エイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５９６(Ｍ＋４)
実施例３４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-ＯＥＧ-γＧｌｕ−γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５９２(Ｍ＋４)
実施例３５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ１８Ｌ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６４０５
実施例３６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ１８Ｌ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６３７７
実施例３７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６４３３
実施例３８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０インスリン(５００ｍｇ、８８μｍｏｌ) を０．１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８(５ｍｌ)に溶解させ、ω-カルボキシヘプタデカノイル-γ-Ｌ-グルタミル-ＯＥＧ-ＯＥＧ-ＯＳｕ(６５ｍｇ、８８μｍｏｌ)をＴＨＦ／ＭｅＣＮ １：１(５ｍｌ)に溶解させ、インスリン溶液に添加した。３０分後、２Ｍのメチルアミン水(０．５ｍＬ)を添加することにより、反応をクエンチした。溶媒を真空で蒸発させ、固形物を少量の水／ＭｅＣＮに溶解させた。Ｃ１８カラム、バッファーＡ：水中に０．１％のＴＦＡ、バッファーＢ：ＭｅＣＮに０．１％のＴＦＡ、勾配３０-５５％のバッファーＢ、４５分超のＲＰ-ＨＰＬＣにより、主要生成物のピークを単離した。生成物のフラクションを真空で部分的に蒸発させ、凍結乾燥させたところ、５９ｍｇの生成物(１０％)が提供された。ＬＣ-ＭＳ分析：Ｍ４＋＝１６０２．７、算出値１６０２．６。２工程の標準的アミノ酸配列分析はＦ-Ｖを示し、Ａ１でのアシル化が確認された。
実施例３９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｆ(Ｎαオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
この化合物を、上述した実施例(実施例３８)の副生成物として単離した。ＬＣＭＳ分析：Ｍ４＋＝１６０２．５、算出値１６０２．６。２工程の標準的アミノ酸配列分析はＧ-Ｉを示し、Ｂ１でのアシル化が確認された。
実施例４０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５２３(Ｍ＋４)
この化合物を、アシル化試薬としてω-カルボキシペンタデカノイル-γ-Ｌ-グルタミル(ＯＳｕ)を使用し、上述したＡ１アシル化(実施例３８)と同様にして調製した。生成物はＬＣＭＳ：Ｍ４＋＝１５２３．２、算出値１５２３．０を示した。２工程の標準的アミノ酸配列分析はＦ-Ｖを示し、Ａ１でのアシル化が確認された。
実施例４１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-Ａｂｕ-Ａｂｕ-Ａｂｕ-Ａｂｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１２８６(Ｍ＋５)
この実施例のアシル化試薬は、Ｆｍｏｃ保護された４-アミノ酪酸を２-クロロトリチル樹脂に結合させることから出発し、ついで脱保護し、実施例９に記載したように、３以上の単位のＦｍｏｃ保護された４-アミノ酪酸、Ｆｍｏｃ-Ｇｌｕ-ＯｔＢｕ及びオクタデカン二酸 モノ-tert-ブチルエステルを逐次結合させる、実施例９で調製された試薬を用い、同様にして調製した。
実施例４２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎαエイコサンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝５９８７
実施例４３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎα４-[１６-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５３０(Ｍ＋４)
中間アシル化試薬の調製：
Figure 0005749155
４-[１６-(１Ｈ-テトラゾール-５-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタン酸(５００ｍｇ、国際公開第2006/005667号に記載されたようにして調製)をエタノール(２０ｍｌ)に溶解させ、ＴＳＴＵ(３８１ｍｇ)及びＤＩＰＥＡ(５４２μｌ)を添加し、得られた混合物を室温で１６時間攪拌した。混合物を真空で濃縮し、残留物を０．２５ＭのＨＣｌと共に攪拌した。固形物を濾過により単離し、水で洗浄し、真空で乾燥させたところ、５８０ｍｇ(９１％)のアシル化試薬が提供された。
アシル化試薬：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(５００ｍｇ)を０．１Ｍの炭酸ナトリウム水(１０ｍＬ)及びエタノール(４ｍＬ)に溶解させた。１ＮのＮａＯＨを用いて、ｐＨを１０．８に調節した。上述したアシル化試薬(１０１ｍｇ)をＴＨＦ(２ｍＬ)に溶解させ、エタノール(２ｍＬ)を、１０分の間隔で２回に分けて添加した。得られた混合物をゆっくりと１時間攪拌し、水(５０ｍＬ)で希釈した。ｐＨ５．５になるまで１ＮのＨＣｌを添加することにより、得られたインスリンを沈殿させた。遠心分離により沈殿物を単離し、ＨＰＬＣにより精製した。純粋なフラクションをプールし、凍結乾燥させた。
実施例４４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６３２１
実施例４５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１３０
実施例４６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ２８,ｄｅｓＢ２９,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１８１
実施例４７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε(５-エイコサンジオイルアミノイソフタル酸)),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１５０
実施例４８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝５９５９
実施例４９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５９８(Ｍ＋４)
実施例５０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６２１６
実施例５１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５５９(Ｍ＋４)
実施例５２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６２７８
実施例５３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-Ａｏｃ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１２６
実施例５４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６０５５(デコンボリューションされた)
実施例５５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６２２０(デコンボリューションされた)
実施例５６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６１０１
実施例５７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝６２７７
実施例５８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５１６(Ｍ＋４)
実施例５９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαオクタデカンジオイル),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４９８(Ｍ＋４)
実施例６０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５２３(Ｍ＋４)
実施例６１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ２８,ｄｅｓＢ２９,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ＝６２０８
実施例６２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
ＥＳ-ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５８７(Ｍ＋４)
以下の実施例のアシル化インスリンも、同様に調製されてよい。
実施例６３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例６４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例６５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例６６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例６７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεドコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例６８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεドコサンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例６９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε(Ｎ-イコサンジオイル-Ｎ-カルボキシメチル)-βＡｌａ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε３-[２-(２-{２-[２-(１７-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)-エトキシ]プロピオニル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε３-[２-(２-{２-[２-(１９-カルボキシノナデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-(３-(２-{２-[２-(２-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)-プロピオニル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-(３-(２-{２-[２-(２-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)-プロピオニル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεイコサンジオイル-γＧｌｕ-(３-(２-{２-[２-(２-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)-プロピオニル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε４-([４-({１７-カルボキシノナデカノイルアミノ}メチル)トランス-シクロヘキサンカルボニル]-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε４-([４-({１７-カルボキシヘプタデカノイルアミノ}メチル)トランス-シクロヘキサン-カルボニル]-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例７９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例８９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例９９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１００、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１０９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｄ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２８Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１４、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１５、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１６、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１７、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１８、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１１９、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２０、一般的手順(Ａ)：
Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２１、一般的手順(Ａ)：
Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２２、一般的手順(Ａ)：
Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２３、一般的手順(Ａ)：
Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２４、一般的手順(Ａ)：
Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２５、一般的手順(Ａ)：
Ａ８Ｈ,Ｂ２５Ｎ,Ｂ２７Ｅ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε(Ｎ-イコサンジオイル-Ｎ-カルボキシメチル)-βＡｌａ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε(Ｎ-オクタデカンジオイル-Ｎ-カルボキシメチル)-βＡｌａ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎε(Ｎ-ヘキサデカンジオイル-Ｎ-カルボキシメチル)-βＡｌａ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１２９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-２-[(３-{２-[２-(３-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピル-カルバモイル)メトキシ]アセチル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
[(３-{２-[２-(３-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)メトキシ]酢酸を、記載されたようにして調製してよく(Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114)、ω-(tert-ブチル-カルボキシ-ヘプタデカノイル-γ-Ｌ-グルタミル(ＯＳｕ)-ＯｔＢｕと反応させる。ＴＳＴＵを使用し、生成物を活性化させ、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．５において、Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンにカップリングさせることで、生成物を得てもよい。
実施例１３０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-２-[(３-{２-[２-(３-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)メトキシ]アセチル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
[(３-{２-[２-(３-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)メトキシ]酢酸を、記載されたようにして調製してよく(Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114)、ω-(tert-ブチル-カルボキシ-ノナデカノイル-γ-Ｌ-グルタミル(ＯＳｕ)-ＯｔＢｕと反応させる。ＴＳＴＵを使用し、生成物を活性化させ、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．５において、Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンにカップリングさせることで、生成物を得てもよい。
実施例１３１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-２-[(３-{２-[２-(３-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)メトキシ]アセチル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
[(３-{２-[２-(３-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)メトキシ]酢酸を、記載されたようにして調製してよく(Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114)、ω-(tert-ブチル-カルボキシ-ヘプタデカノイル-γ-Ｌ-グルタミル(ＯＳｕ)-ＯｔＢｕと反応させる。ＴＳＴＵを使用し、生成物を活性化させ、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．５において、Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンにカップリングさせることで、生成物を得てもよい。
実施例１３２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-２-[(３-{２-[２-(３-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)メトキシ]アセチル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
[(３-{２-[２-(３-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)メトキシ]酢酸を、記載されたようにして調製してよく(Eur. J. Med. Chem. 2007, 42, 114)、ω-(tert-ブチル-カルボキシ-ノナデカノイル-γ-Ｌ-グルタミル(ＯＳｕ)-ＯｔＢｕと反応させる。ＴＳＴＵを使用し、生成物を活性化させ、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．５において、Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンにカップリングさせることで、生成物を得てもよい。
実施例１３３、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１３４、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１３５、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１３６、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１３７、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１３８、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１３９、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４０、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４１、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４２、一般的手順(Ａ)：
Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４３、一般的手順(Ａ)：
Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４４、一般的手順(Ａ)：
Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４５、一般的手順(Ａ)：
Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４６、一般的手順(Ａ)：
Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４７、一般的手順(Ａ)：
Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４８、一般的手順(Ａ)：
Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１４９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１５９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２１Ｇ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６８、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１６９、一般的手順(Ａ)：
Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７０、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７１、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαエイコサンジオイル-γＧｌｕ),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７２、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７３、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαエイコサンジオイル-γＧｌｕ),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７４、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαオクタデカンジオイル),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７５、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαエイコサンジオイル),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７６、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαオクタデカンジオイル),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７７、一般的手順(Ａ)：
Ａ１Ｇ(Ｎαエイコサンジオイル),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２６Ｇ,Ｂ２７Ｇ,Ｂ２８Ｇ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
Figure 0005749155
実施例１７８、本発明の選択されたインスリン誘導体のインスリンレセプター親和性
ヒトインスリンレセプターについての、この発明のアシル化インスリンアナログの親和性は、ＳＰＡアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより測定される。ＳＰＡ-ＰＶＴ抗体-結合ビーズ、抗-マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号 PRNQ0017)を、２５ｍｌの結合バッファー(１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２５％のトゥイーン-２０)と混合する。単一のPackard Optiplate(Packard No.6005190)用の試薬混合物は、２．４μｌの１：１５０００に希釈された精製組換えヒトインスリンレセプター(エクソン１１を有する又は有さない)、１００μｌの試薬混合物当たり５０００ｃｐｍに相当するＡ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-ヒトインスリンの所定量の保存溶液、１２μｌの１：１０００に希釈されたＦ１２抗体、３ｍｌのＳＰＡ-ビーズ、全体を１２ｍｌにする結合バッファーからなる。ついで、全体で１００μｌの試薬混合物を、Packard Optiplateの各ウェルに添加し、インスリン誘導体の希釈シリーズを、適切なサンプルからOptiplateにおいて作製する。ついで、ゆっくりと振盪させつつ、サンプルを１６時間インキュベートする。ついで、１分間遠心分離することにより相分離させ、プレートをトップカウンターで計測する。GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego、CA)における非線状回帰アルゴリズムを使用し、結合データを適合させ、ヒトインスリンの親和性に対する親和性を表した(パーセンテージ(％))。
また、関連アッセイを使用してもよく、ここで結合バッファーは、生理的条件を模倣するために、４．５％のＨＳＡを含有する。
本発明の選択されたインスリンのインスリンレセプター親和性：
Figure 0005749155
実施例１７９、本発明のインスリン誘導体の疎水性度
インシュリン誘導体の疎水性は、等張条件下で逆相ＨＰＬＣを実施することにより見出される。インシュリン誘導体の溶出時間を、同様の条件下で公知の疎水性度を有する他の誘導体、又はヒトインスリン(ここではＨＩと称する)と比較する。疎水性度ｋ'ｒｅｌは：ｋ'ｒｅｌｄｅｒｉｖ＝((ｔｄｅｒｉｖ−ｔ０)／(ｔｒｅｆ−ｔ０))＊ｋ'ｒｅｌｒｅｆとして算出される。参照としてＨＩを使用：ｋ'ｒｅｌｒｅｆ＝ｋ'ｒｅｌＨＩ＝１。ＨＰＬＣシステムのボイド時間、ｔ０は、５μｌの０．１ｍＭ ＮａＮＯ３を注入することにより測定される。実施条件：
カラム： Lichrosorb RP-C18、５μｍ、４ｘ２５０ｍｍ
バッファーＡ：０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３、１０ｖｏｌ％のＣＨ３ＣＮ
バッファーＢ：５０ｖｏｌ％のＣＨ３ＣＮ
注入容量：５μｌ
実施時間：最大で６０分
最初の勾配を流した後、誘導体及び参照(例えばＨＩ)を流す等張レベルを選択し、等張条件下にある誘導体及び参照の溶出時間を、上述した等式に使用し、ｋ'ｒｅｌｄｅｒｉｖを算出する。
Figure 0005749155
実施例１８０、ラットへのインスリン誘導体の肺送達：
プロトコル：
試験用物質は、滴下法により、肺に投与されるであろう。簡潔に述べると、雄のウィスターラット(約２５０ｇ)を、６．６ｍｌ／ｋｇの皮下プライミング用量として付与され、３０分間隔での、３．３ｍｌ／ｋｇの保持用量の皮下投与が３回続く、約６０ｍｌのフェンタニル／デヒドロデンズペリドール／-ドルミカムにて麻酔する。麻酔誘導の１０分後、基本サンプルを尾静脈(ｔ＝−２０分)から得、続いてテスト用物質の投与直前(ｔ＝０)、基本サンプルを得る。ｔ＝０において、テスト用物質を一方の肺に、気管内部的に投与する。丸くなった端部を有する特定のカニューレを、２００μｌの空気とテスト用物質(１ｍｇ／ｋｇ)を含有するシリンジに搭載する。開口部を介して、カニューレを気管に導入し、-二分枝部を丁度通過するように、主気管支の一方に送る。挿入中、頸部を外側から触診し、気管内部の位置を確認する。シリンジの内容物を注射し、２秒中断する。その後、カニューレをゆっくりと引き抜く。テスト中(４又は８時間までの血液サンプル)、ラットは麻酔がかかったままであり、実験後、安楽死させる。
図８及び９は、従来技術のプロテアーゼ耐性のないインスリン(実施例１８３)である以外は同様であるものと比較した、本発明のインスリン(実施例９)の気管内滴下注入からの、血糖低減効果と血漿インスリン濃度を示す。
実施例１８１、ミニブタへのインスリン誘導体の肺送達：
プロトコル：
静脈注射及び血液サンプリングのための中心静脈カテーテルを、ブタに装着させた。肺実験の前、ブタを絶食させ、すなわち投与の前日、午後の食餌からleftoversを、食餌の約１時間後に移し、当日はブタに餌を与えなかった。カテーテルの開存性を、１０ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加する生理食塩水を用いた実験の前にチェックする。
肺投与後、低血糖症の予防のための静脈注射を用意すべきであり、すなわち４-５のシリンジ(２０ｍｌ)に使用準備が整った滅菌２０％グルコースを充填する。低血糖症の診断はグルコメーター(glucometer)(Glucogard X-meter)における血糖測定及び臨床的徴候に基づく。処置は、５０-１００ｍｌの２０％グルコース(１０-２０ｇのグルコース)のゆっくりとした静脈注射からなる。影響が出る前の５-１０分超、グルコースをフラクションに付与する。
実験の最初(２４時間)は、ブタを絶食させるが、水には自由に近づけるようにしておく。１６時間後、血液サンプル用カテーテルを、５０００ＩＵ／ｍｌのヘパリンで閉塞させ、ポケットに配し、ブタを解放する。血液サンプルの２４時間後、ブタに、２倍配給量の食物とリンゴを与える。２４時間〜４８時間は、ブタは絶食させない。
化合物及び肺投与
肺投与用のパウダー
実験の前日、インスリンパウダーを、乾燥パウダー装置(PennCenturyＴＭ Model DP-4、特別仕様のブタ用装置)の８つの別々のパウダーチャンバーに計量する。投与まで、温度と湿度制御がされた研究室において、周囲をアルミホイルで包んだ容器にて、乾燥物質状態に保持することにより、全てのチャンバーを光及び湿度から保護し続ける。
同様のパウダー保持性が予期されるように、最も最近の個々の動物の体重に基づき、送達装置に、２５ｎｍｏｌ／ｋｇの前負荷をかけた。
充填用量＝(パウダー重量＋(装置とパウダーの重量−装置の重量))／２
麻酔
Domitor(登録商標) Vet inj.(メデトミジン１ｍｇ／ｍｌ)、０．１５ｍｌ／１０ｋｇ＝０．４ｍｌ／ブタの静脈注射により、ブタを落ち着かせる。
直後に、十分深い麻酔が得られるまで、Rapinovet Vet. inj.(プロポフォール １０ｍｇ／ｍｌ)を、ゆっくりと静脈注射する。一般的に２-３ｍｌ／１０ｋｇで十分であるが、挿管が可能になるまでの時間、１-２ｍｌを補足することが必要となるかもしれない。０．５ｍｌ／ブタのアトロピンを筋肉内注射することで、挿管の５分前での仕事最小化が可能となる。
挿管のため、わずかに上方が上がった腹部位置にブタを配し、局部麻酔Xylocaine(登録商標)kutanspray(リドカイン １０ｍｇ／投与)を喉頭蓋にスプレーし、喉頭鏡検査と８．０ｍｍサイズ(ID)の使い捨てチューブを使用して、ブタに挿管する。チューブの２つの部分を、互いにしっかりと圧する。
肺投与中の装置位置
肺投与中のPennCenturyＴＭ装置の位置は、気管内チューブの末端の丁度外側とすべきであり、これは挿管前の装置を測定すべきである(この測定時、連結Ｌピースを記憶する)。投与中、PennCenturyＴＭ装置の先端は、葉頭蓋右部まで行く気管支の丁度下の気管中に位置させなければならず、これは気管支鏡で確認する。
人工呼吸
呼吸数を１０／分に、呼吸深さを２５０ｍｌ／呼吸に設定する。投薬のタイミングを最適にするために人工呼吸器に「ベビー」バッグを取り付ける。麻酔装置を、Ｌピースを介して気管内チューブに連結されるフィルターに接続する。PennCenturyTM装置をＬピースを通して導入し、これにより、投薬中の呼吸深さ及び呼吸数が制御可能になる。
投薬法
PennCenturyTM装置は上述の通りに位置させなければならない。ブタには、調節可能なPennCentury空気ポンプ(モデルAP-1)を使用して手動投与によってPennCenturyTM装置が（一匹ずつ）投薬される。全用量が確実に投与されるようにするために８回の連続した呼吸器推進吸入中に８の空気スプレー（空気ポンプを４ｍＬ）を各ブタに与える。スプレーの間に房を穏やかにたたいて装置への粉末の付着を避ける。新しい移送チューブを各ブタに対して使用する。吸入に関連したタイミングは非常に重要であり、空気スプレーは吸入のまさに最初に与えられなければならない（開始では５０ｍＬの吸入を目標とする）。
Domitorの効果に対抗するために、Antisedan(登録商標)Vet inj.(アチパメゾール５ｍｇ／ｍｌ)を、投薬直後に筋肉内注射（０．４ｍｌ／ブタ）として注射し、ブタをその檻に戻し、麻酔から覚まさせる。
保持分析
放出された投薬は房の全内容でなければならず、投薬後に装置を残留粉末と共に再び計量し、保持された粉末を、９ｍｌの０．０１ＮのＨＣｌ ｍｅｄ ０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０抽出バッファーを用いて抽出し、分析に送る。
採血
投薬後、血液試料を次の時点で中心静脈カテーテルから採取する：
−１０，０，１０，２０，４０，６０，９０，１２０，１５０，１８０，２４０（４時間），３００（５時間），３６０（６時間），８時間，１０時間，１２時間，１４時間，１６時間，２４時間，３２時間及び４８時間。
試料を三方活栓で採取する；廃棄血液は動物に注入して戻す。試料サイズは、ＥＤＴＡで被覆されたチューブに集めた０．８ｍｌの血液である。各血液採取後に、カテーテルに５ｍｌの滅菌した０．９％のＮａＣｌを１０ＩＵ／ｍｌのヘパリンと共に流す。チューブを最小８回、穏やかに傾斜させ、血液と抗凝固薬（ＥＤＴＡ）の混合を十分にし、一分後にそれを濡れた氷上に位置させる。採取から１時間以内にチューブを３０００ｒｐｍ及び４℃で１０分間スパンさせる。試料を、ピペッティングまで湿った氷上に保存する。
実験後のカテーテルの閉鎖
滅菌生理食塩水（１０ｍｌ中１ｇのアンピシリン＝１００ｍｇ／ｍｌ）に溶解させたアンピシリン（１０ｍｇ／ｋｇ＝０．１ｍｌ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍｌ溶液）での単一の静脈内処置を、採血に使用したカテーテルを介して与える。両カテーテルに、１０Ｕ／ｍｌの濃度までヘパリンを加えた滅菌した０．９％ＮａＣｌの４−５ｍｌを流す。カテーテルを、ラテックス注入膜を備えた新しいルアーロックで閉塞させる。４−５ｍｌの滅菌した０．９％のＮａＣｌを膜を通して注入する。最後に、０．８ｍｌのヘパリン，５０００ＩＵ／ｍｌをロックとしてカテーテルを通して注射する。凝固リスクの増加と共にカテーテル中での細菌の増殖を避けるために無菌技術が必要とされる。
血液試料の分析
１０μｌの血漿を、Biosen自動アナライザーでの血漿中グルコース濃度の測定のために５００μｌのＥＢＩＯバッファー溶液中にピペットでとる。
ＰＫパラメータを計算するためにイムノアッセイによって外因性インスリンについて血漿試料をまたアッセイする。
上記のプロトコルに従ってのミニブタへの実施例９のインスリンの経肺投与：
図１０及び１１は、同じインスリンであるが、プロテアーゼ安定化Ａ１４Ｅ及びＢ２５Ｈ変異のないもの（先行技術のインスリン）と比較した実施例９のインスリンの薬物動態プロファイルを示す。データは同じ実験からのものであり、図１０は最初の２５０分のデータを示し、図１１は完全な２４時間（１４４０分）の時間過程を示す。
同じインスリンであるが、プロテアーゼ安定化Ａ１４Ｅ及びＢ２５Ｈ変異のないもの（先行技術のインスリン）と比較した実施例９のインスリンの薬物動態データ。データは同じ実験からのもので、静脈内投与に対する半減期（Ｔ1/2）及び生物学的利用能（Ｆｉｔ）である：
Figure 0005749155
実施例１８２
十二指腸管腔酵素を使用するインスリンアナログの分解
ＳＰＤラットからの（十二指腸管腔内容物の濾過によって調製した）十二指腸管腔酵素を使用するインスリンアナログの分解。該アッセイは、インスリンアナログ及び標準物に対して１６ウェルが利用できる９６ウェルプレート（２ｍｌ）においてロボットによって実施される。インスリンアナログ〜１５μＭを、３７℃で１００ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ＝７．４中で十二指腸酵素と共にインキュベートし、試料を１、１５、３０、６０、１２０及び２４０分後に採取し、ＴＦＡの添加により反応をクエンチさせる。各時点でのインタクトなインスリンアナログをＲＰ−ＨＰＬＣにより決定する。分解半減期はデータの指数適合により決定し、各アッセイにおいて基準インスリン、Ａ１４Ｅ，Ｅ２５Ｈ，ｄｅｓＢヒトインスリン又はヒトインスリンに対して決定した半減期に対して正規化する。分解のために加える酵素の量は、基準インスリンの分解に対する半減期が６０及び１８０分の間となるようなものとする。結果は、ラット十二指腸におけるインスリンアナログの分解半減期を同じ実験からの基準インスリンの分解半減期で割ったもの（相対分解速度）として与える。
Figure 0005749155
ラット薬物動態：
静脈内ラットＰＫ：
麻酔したラットに様々な用量でインスリンアナログを静脈内(i.v.)投与し、用いられた化合物の血漿中濃度を、４時間又はさらに長い投与後における特定の間隔でイムノアッセイ又は質量スペクトルを使用して測定する。ついで、薬物動態パラメータが、WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)を使用して計算される。
およそ２００グラムの重さの非絶食雄ウィスターラット(Taconic)を使用する。
体重を測定し、ラットをついでHypnorm/Dormicum(各化合物は別個に滅菌水で１：１に希釈し、ついで混合する；実験の日に新鮮に調製する)で麻酔する。麻酔は、２ｍｌ／ｋｇのHypnorm/Doricum混合物の皮下投与で開始し、３０分間隔で１ｍｌ／ｋｇの２回の維持用量の皮下投与、４５分間隔で１ｍｌ／ｋｇの２回の維持用量の皮下投与が続く。ラットを軽く麻酔された状態にずっと維持するために必要ならば、１−２ｍｌ／ｋｇの更なる用量の皮下投与がなされる。計量と初期の麻酔は、ラットが部屋を移動することによる動物のストレスを避けるためにラット保持室において実施される。
経口ラットＰＫ：
経管栄養：
意識あるラットにインスリンアナログを経口投与する。用いられた化合物の血漿中濃度並びに血糖変化を、投与後４−６時間の間、特定の間隔で測定する。ついで、薬物動態パラメータが、WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)を使用して計算される。
２５０−３００ｇの重さのスプラーグドーリー雄ラット(Taconic)を〜１８時間絶食させ、試験化合物又はビヒクルを経口投与する。
経口経管栄養投与に使用される製剤の組成は次の通りである（重量％）：
４５％のプロピレングリコール(Merck)
３３％のCapmul MCM C10 (Abitec)
１１％のポロキサマー407 (BASF)
１１％のポリエチレングリコール3350 Ultra (Fluka)
添加されるインスリンの量がCapmul MCM C10、ポロキサマー407及びPEG 3350から均等に引かれ、プロピレングリコールの量を薬剤負荷とは独立して４５％に維持するためにプロピレングリコールからは引かれない。
中性インスリン（ｐＨ７．４から凍結乾燥）を穏やかに撹拌しながら室温でプロピレングリコールに溶解させる。インスリン及びインスリンの量に応じて、プロピレングリコールに溶解させるのに数時間かかりうる。得られた溶液は透明でなければならない。他の添加剤，Capmul，ポロキサマー及びPEG3350を混合し、５８℃で融解させ、また透明で僅かに黄色がかった溶液にならなければならない。ついで、インスリンプロピレングリコール溶液を３５℃まで温め、溶かした添加剤を磁気攪拌下で少しずつ加える。得られる混合物は透明で均一に３５℃でなければならず、冷蔵庫に保存後に半固体状になる。調製後、ＳＥＤＤＳ組成物を固化させるために５℃まで冷却する。
全血糖濃度の決定のための血液試料を、尾部先端の毛細血管の穿刺によりヘパリン処置した１０ｍｌの毛細管に集める。血糖濃度を、Biosen自動アナライザー(EKF Diagnostic Gmbh, Germany)を使用してグルコースオキシダーゼ法によって５００ｍｌ分析バッファーでの希釈後に測定する。平均血糖濃度経過(平均±ＳＥＭ)を各化合物に対して作成する。
血漿中インスリン濃度の決定のために試料を集める。１００ｍｌの血液試料を、ＥＤＴＡを含む冷却チューブ中に抜き取る。試料を、遠心分離（７０００ｒｐｍ、４℃、５分）まで氷上に維持し、血漿をMicronicチューブ中にピペットで移し、ついでアッセイまで２０℃で凍結させる。インスリンアナログの血漿中濃度を、個々のアナログに対して適切と考えられ又は検証されているイムノアッセイを使用してAssay及びTechnology部において測定する。
血液試料を、投薬後、ｔ＝−１０（血糖のみ）、ｔ＝−１（投薬直前）及び４−６時間の間、特定の間隔で抜き取る。
小腸内注射：
麻酔ラットにインスリンアナログを小腸内（空腸中）投与する。用いられた化合物の血漿中濃度並びに血糖変化を、投薬後４時間又はそれ以上の間、特定の間隔で測定する。ついで、薬物動態パラメータが、WinNonLin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)を使用して計算される。
〜１８時間の間、絶食させた２５０−３００ｇの重さの雄スプラーグドーリーラット(Taconic)を、プライミング用量として皮下でのHypnorm-Dormicum(0.079mg/mlのクエン酸フェンタニル、2.5mg/mlのフルアニソン及び1.25mg/mlのミダゾラム)２ｍｌ／ｋｇをプライミング用量として（物質投薬を試験する前の−６０分の時点まで）、２０分後に１ｍｌ／ｋｇ、ついで４０分毎に１ｍｌ／ｋｇを使用して麻酔する。
小腸内注射モデルで試験されるインスリンは、上記の経管栄養モデルに対して処方されたようにして処方される。
麻酔したラットを、３７℃で安定化した恒温ブランケットに位置させる。２０ｃｍのポリエチレンカテーテルを取り付けた１ｍｌシリンジにインスリン製剤又はビヒクルを満たす。４−５ｃｍの正中切開が腹壁になされる。腸壁の貫通により盲腸から〜５０ｃｍの中-空腸中にカテーテルが穏やかに挿入される。腸内容物が存在する場合、適用部位は±１０ｃｍ移動される。カテーテル先端を腸セグメントの管腔内のおよそ２ｃｍに配し、結紮術を使用しないで固定する。腸を腹腔内に注意して置き換え、腹壁及び皮膚を、各層に自動クリップで閉塞する。時間０で、ラットにカテーテルを介して０．４ｍｌ／ｋｇの試験化合物又はビヒクルを投与する。
全血糖濃度の決定のための血液試料を、尾部先端の毛細血管の穿刺によりヘパリン処置した１０ｍｌの毛細管に集める。血糖濃度を、Biosen自動アナライザー(EKF Diagnostic Gmbh, Germany)を使用してグルコースオキシダーゼ法によって５００ｍｌ分析バッファーでの希釈後に測定する。平均血糖濃度経過(平均±ＳＥＭ)を各化合物に対して作成する。
血漿中インスリン濃度の決定のために試料を集める。１００ｍｌの血液試料を、ＥＤＴＡを含む冷却チューブ中に抜き取る。試料を、遠心分離（７０００ｒｐｍ、４℃、５分）まで氷上に維持し、血漿をMicronicチューブ中にピペットで移し、ついでアッセイまで２０℃で凍結させる。インスリンアナログの血漿中濃度を、個々のアナログに対して適切と考えられ又は検証されているイムノアッセイで測定する。
血液試料を、投薬後、ｔ＝−１０（血糖のみ）、ｔ＝−１（投薬直前）及び４時間又はそれ以上の間、特定の間隔で抜き取る。
Figure 0005749155
ラット薬物動態：
本発明の選択されたアシル化インスリンの（上述のような）経口投与後の血糖対時間プロファイルを以下に示す：
実施例１８３
先行技術のインスリン、つまり
Figure 0005749155
に対する一晩絶食させた雄のウィスターラットの経口効果
Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは以下の図１に示す。
実施例１８４
ヒトインスリンに対する本発明のアシル化インスリンアナログの効能
実験日に２３８−３８３ｇの重さであるスプラーグドーリー雄ラットをクランプ実験に使用する。ラットは制御された雰囲気条件下で給餌に自由に接近でき、クランプ実験前に一晩（３ｐｍから）絶食させられる。
実験プロトコル：
ラットを外科手技の少なくとも１週間前に動物施設において順応させる。クランプ実験のおよそ１週間前にハロタン麻酔下で頸静脈 (注入のため)及び頸動脈 (採血のため)中にTygonカテーテルを挿入し、露出させ、頸部の後ろに固定する。手術後にラットにStreptocilin vet. (Boehringer Ingelheim；０．１５ｍｌ／ラット、筋肉内)を投与し、回復期間中、動物エアユニット（２５℃）に配する。無痛覚とするために、麻酔中にアノルフィン(Anorphin)(０．０６ｍｇ／ラット、皮下)を投与し、麻酔から十分に回復させた(２−３時間)後、再び２日に１回、リマダイル(Rimadyl)(１．５ｍｇ／ｋｇ、皮下)を投与する。
実験日の７ａｍに一晩(前日の３ｐｍから)絶食させたラットを計量し、サンプリング用シリンジ及び注入システム(Harvard 22 Basicポンプ，Harvard，及びPerfectum Hypodermicガラスシリンジ，Aldrich)につなぎ、ついで個々のクランプ用ゲージに配し、実験開始前の約４５分、そこで休ませる。全実験中、それらの通常の寝具上をラットは自由に動くことができ、飲料水に自由に接近することができる。血漿血糖値を１０分間隔で測定した３０分の基底期間後、試験されるインスリン誘導体及びヒトインスリン(ラット当たり１回の投与レベル、投与レベル当たりｎ＝６−７)を、３００分、一定速度で注入する(静脈内)。場合によっては、試験されるインスリン誘導体のプライミングボーラス注入が血漿中の定常状態レベルに直ぐに達しせしめるために投与される。プライミングボーラス注入の用量は薬物動態専門家によって静脈内ボーラス薬物動態から得られる熟練のクリアランスデータに基づいて計算することができる。血漿血糖値は１０分間隔でずっと測定され、正常血糖を維持するために、２０％水性グルコースの注入が調節される。再懸濁させた赤血球の試料を各ラットからプール化し、頸動脈カテーテルを介して約１／２ｍｌ容量を戻した。
各実験日において、試験される個々のインスリン誘導体の溶液及びヒトインスリン溶液の試料を、クランプ実験の前及び終了時に取り出し、ペプチドの濃度をＨＰＬＣにより確認する。ラットインスリン及びＣ-ペプチド、並びに試験されるインスリン誘導体及びヒトインスリンの血漿濃度を、研究の前及び終了の時点で測定する。ペントバルビタール過剰投与を使用し、実験の終了時にラットを殺す。
＜配列表＞
配列番号５−１１は上記特定の実施例に示された本発明の化合物中に存在するＡ鎖の配列であり、配列番号１２−２９は上記特定の実施例に示された本発明の化合物中に存在するＢ鎖の配列である。

Claims (21)

  1. プロテアーゼ安定化インスリンの位置Ｂ２９のリジン残基にアシル部分が結合した、アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであって、
    前記プロテアーゼ安定化インスリンは、Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、及びＡ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンから選択され、
    前記アシル部分は、
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    からなる群から選択される、アシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  2. ヒトインスリンに比較して増大した溶解度を有する、請求項１に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  3. ｐＨ３−９において、ヒトインスリンに比較して増大した溶解度を有する、請求項１に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  4. 親インスリンに比較して、１又は複数のプロテアーゼ酵素に対する増大した安定性を示すアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであって、前記親インスリンは付加されたアシル部分を有さず、プロテアーゼによる分解に対する安定性を改善するための変異がなされていないインスリンである、請求項１から３の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  5. 親インスリンに比較して、２又はそれ以上のプロテアーゼ酵素に対する増大した安定性を示すアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであって、前記親インスリンは付加されたアシル部分を有さず、プロテアーゼによる分解に対する安定性を改善するための変異がなされていないインスリンである、請求項１から４の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  6. プロテアーゼ安定化インスリンは、キモトリプシン、トリプシン、インスリン分解酵素(ＩＤＥ)、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びカテプシンＤからなる群から選択される一又は複数の酵素による分解に対して安定している、請求項１から５の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  7. Ｔ１／２が、ヒトインスリンに比較して増加している、請求項１から６の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  8. Ｔ１／２が、親インスリンに比較して増加しているアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであって、前記親インスリンは付加されたアシル部分を有さず、プロテアーゼによる分解に対する安定性を改善するための変異がなされていないインスリンである、請求項１から７の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  9. Ｔ１／２が、親インスリンに比較して少なくとも２倍に増加しているアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであって、前記親インスリンは付加されたアシル部分を有さず、プロテアーゼによる分解に対する安定性を改善するための変異がなされていないインスリンである、請求項１から８の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  10. Ｔ１／２が、親インスリンに比較して少なくとも３倍に増加しているアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンであって、前記親インスリンは付加されたアシル部分を有さず、プロテアーゼによる分解に対する安定性を改善するための変異がなされていないインスリンである、請求項１から９の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  11. Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘプタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘプタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；及び
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
    からなる群から選択されるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  12. Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；及び
    Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεヘキサデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
    からなる群から選択されるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  13. Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；及び
    Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
    からなる群から選択されるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  14. Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル−γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンであるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  15. Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンであるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  16. Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ-ＯＥＧ-ＯＥＧ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンであるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  17. Ａ１４Ｅ,Ｂ１６Ｈ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｋ(Ｎεエイコサンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンであるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  18. Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２９Ｋ(Ｎεオクタデカンジオイル-γＧｌｕ),ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンであるアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン。
  19. 請求項１から１８の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリン及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
  20. 高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、又は１型糖尿病を治療又は予防するための医薬であって、請求項１から１８の何れか一項に記載のアシル化されたプロテアーゼ安定化インスリンを含む医薬。
  21. 薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含む、請求項２０に記載の医薬。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015147781A (ja) * 2008-03-18 2015-08-20 ノボ・ノルデイスク・エー／エス プロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログ
US9481721B2 (en) 2012-04-11 2016-11-01 Novo Nordisk A/S Insulin formulations
US10265385B2 (en) 2016-12-16 2019-04-23 Novo Nordisk A/S Insulin containing pharmaceutical compositions

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2371361T3 (es) 2005-12-28 2011-12-30 Novo Nordisk A/S Composiciones que comprenden una insulina acilada y zinc y método de producción de dichas composiciones.
EP2074141B1 (en) 2006-09-22 2016-08-10 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
EP2152245B1 (en) 2007-04-30 2015-12-02 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
JP2011504871A (ja) * 2007-06-01 2011-02-17 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 固体又は半固体担体中にペプチド薬剤を含む自然に分散可能なプレコンセントレイト
US9260502B2 (en) * 2008-03-14 2016-02-16 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
WO2010066636A1 (en) * 2008-12-09 2010-06-17 Novo Nordisk A/S Novel insulin analogues
JP2013504610A (ja) 2009-09-16 2013-02-07 ノヴォ ノルディスク アー／エス インスリンを含む安定な非水性液体医薬組成物
BR112012016853A2 (pt) * 2010-01-12 2017-10-17 Novo Nordisk As "composições farmacêuticas para administração oral de peptídeos de insulina".
JP5826772B2 (ja) 2010-02-16 2015-12-02 ノヴォ ノルディスク アー／エス コンジュゲートタンパク質
WO2011161125A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives containing additional disulfide bonds
JP2013540771A (ja) * 2010-10-15 2013-11-07 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規ｎ末端修飾インスリン誘導体
BR112013010345A2 (pt) 2010-10-27 2017-07-25 Novo Nordisk As tratamento de diabetes melitus usando as injeções de insulina administradas com intervalos de variação da injeção
CN103370075A (zh) * 2011-02-15 2013-10-23 诺沃—诺迪斯克有限公司 长效il-1受体拮抗剂
US20140056953A1 (en) * 2011-04-14 2014-02-27 Novo Nordisk A/S Fatty acid acylated amino acids for oral peptide delivery
US9260503B2 (en) * 2011-06-15 2016-02-16 Novo Nordisk A/S Multi-substituted insulins
CN104364262A (zh) 2011-12-21 2015-02-18 诺沃—诺迪斯克有限公司 N末端修饰的胰岛素衍生物
US20150111820A1 (en) * 2012-07-09 2015-04-23 Novo Nordisk A/S Novel use of insulin derivatives
CN104884078B (zh) 2012-10-17 2017-06-20 诺和诺德股份有限公司 用于口服肽递送的脂肪酸酰化d‑氨基酸
WO2014077575A1 (ko) * 2012-11-13 2014-05-22 다인바이오 주식회사 덱에이 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물
CN103897053B (zh) * 2012-12-25 2019-01-15 深圳先进技术研究院 化学修饰的胸腺肽α1及其合成方法
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime
CN105246459A (zh) * 2013-05-30 2016-01-13 诺和诺德股份有限公司 治疗糖尿病的新的口服药用组合物
GB201315335D0 (en) 2013-08-29 2013-10-09 Of Singapore Amino diacids containing peptide modifiers
JP6499184B2 (ja) * 2013-10-07 2019-04-10 ノヴォ ノルディスク アー／エス インスリン類似体の新規な誘導体
EP3098235A4 (en) * 2014-01-20 2017-10-18 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-acting insulin and use thereof
AR099569A1 (es) * 2014-02-28 2016-08-03 Novo Nordisk As Derivados de insulina y los usos médicos de estos
EP3250225A1 (en) * 2015-01-29 2017-12-06 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition for oral insulin administration comprising a tablet core and a polyvinyl alcohol coating
AR105616A1 (es) * 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
JP2018531899A (ja) 2015-08-25 2018-11-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規インスリン誘導体及びその医学的使用
US20190010206A1 (en) * 2015-08-25 2019-01-10 Novo Nordisk A/S Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof
JP2018531900A (ja) * 2015-08-25 2018-11-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規インスリン誘導体及びその医学的使用
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
GB201607918D0 (en) 2016-05-06 2016-06-22 Arecor Ltd Novel formulations
JP7432361B2 (ja) * 2016-08-02 2024-02-16 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 ヒトインスリンまたはそのアナログのアシル化誘導体
US11396534B2 (en) * 2016-09-23 2022-07-26 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof
CN109891237B (zh) * 2016-10-24 2022-08-23 诺和诺德股份有限公司 胰岛素制剂的生物测定法
WO2018083335A1 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Novo Nordisk A/S Dchbs-active esters of peg compounds and their use
EP3604328A4 (en) 2017-03-23 2021-01-06 Hanmi Pharm. Co., Ltd. REDUCED INSULIN ANALOGUE COMPLEX FOR INSULIN RECEPTOR AND ITS USE
JOP20190273A1 (ar) * 2017-05-26 2019-11-24 Lilly Co Eli مركب إنسولين معالج بأسيل
CN108929383B (zh) * 2017-05-26 2021-10-15 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 重组Slit2D2(C386S)-HSA融合蛋白及其在预防和/或治疗肺部炎症中的应用
AU2018317810A1 (en) * 2017-08-17 2020-03-19 Novo Nordisk A/S Novel acylated insulin analogues and uses thereof
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
KR20200017078A (ko) 2018-08-08 2020-02-18 주식회사 대웅제약 지속형 인슐린 아날로그 및 그 복합체
TW202028229A (zh) 2018-10-05 2020-08-01 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 包含胰島素肽及ｅｇｆ（ａ）肽之雙功能化合物
KR20210102346A (ko) * 2018-12-11 2021-08-19 사노피 인슐린 콘쥬게이트
CN111606972B (zh) * 2019-01-30 2022-04-05 浙江省医学科学院 一种鳕鱼皮寡肽及其分离纯化和在制备ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂及抗Ⅱ型糖尿病药物中的应用
CN110041219B (zh) * 2019-05-09 2020-09-25 南京工业大学 一种索马鲁肽侧链的液相合成方法
EP4021919A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 antagonist compounds
CA3164136A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Sanofi A method of forming a conjugate of a sulfonamide and a polypeptide
EP4073097A1 (en) 2019-12-11 2022-10-19 Novo Nordisk A/S Novel insulin analogues and uses thereof
US20240025957A1 (en) * 2019-12-30 2024-01-25 Gan & Lee Pharmaceuticals Co., Ltd. Insulin Derivative
MX2022008139A (es) * 2019-12-30 2022-10-03 Gan & Lee Pharmaceuticals Co Ltd Compuestos de glp-1 de acción prolongada.
CA3174635A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Sanofi Peptides as selective gip receptor agonists
KR20230051583A (ko) 2020-08-19 2023-04-18 사노피 Crf2 수용체 작용제 및 치료에서의 이의 용도
WO2022090448A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Novo Nordisk A/S Novel acylating reagents
KR20220074813A (ko) * 2020-11-27 2022-06-03 ㈜ 디앤디파마텍 비오틴 모이어티, 지방산 모이어티 또는 이의 조합이 결합된 생리활성 물질 접합체
IL303023A (en) * 2020-11-27 2023-07-01 D& D Pharmatech Inc An oral formulation of a biologically active substance conjugate linked to a biotin unit, a fatty acid unit or a combination thereof
CN112679701B (zh) * 2020-12-28 2022-02-25 重庆宸安生物制药有限公司 一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途
KR20240013778A (ko) * 2021-05-24 2024-01-30 선샤인 레이크 파르마 컴퍼니 리미티드 신규한 아실화된 인슐린 유사체
WO2023012263A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Novo Nordisk A/S Solid oral peptide formulations
KR20240038025A (ko) * 2021-08-23 2024-03-22 일라이 릴리 앤드 캄파니 액체 상 합성을 위한 화합물 및 방법
CA3230915A1 (en) 2021-09-06 2023-03-09 Thomas Boehme New peptides as potent and selective gip receptor agonists
WO2023143458A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 甘李药业股份有限公司 酰化胰岛素
WO2023174370A1 (zh) * 2022-03-16 2023-09-21 北京拓界生物医药科技有限公司 人胰岛素类似物、其融合蛋白及医药用途
WO2024051787A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效酰化胰岛素衍生物及其应用

Family Cites Families (231)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US487000A (en) 1892-11-29 Shirt
US2832685A (en) 1952-05-24 1958-04-29 Crest Foods Co Inc Solubilization of milk proteins
GB894095A (en) 1960-02-08 1962-04-18 Tanaka Shoichi A therapeutic device for personal wear
US3528960A (en) 1968-10-07 1970-09-15 Lilly Co Eli N-carboxyaroyl insulins
US3719655A (en) 1969-12-05 1973-03-06 Lilly Co Eli Process for the crystallization of the ammonium and alkali metal salts in insulin
US3950517A (en) 1970-05-08 1976-04-13 National Research Development Corporation Insulin derivatives
US3869437A (en) 1970-05-08 1975-03-04 Nat Res Dev Mono-, di, and N{HD A1{B , N{HU B1{B , N{HU B29{B -tri-acylated insulin
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4033941A (en) 1975-12-17 1977-07-05 Eli Lilly And Company Process for purifying glucagon
GB1492997A (en) 1976-07-21 1977-11-23 Nat Res Dev Insulin derivatives
JPS6030650B2 (ja) 1979-10-26 1985-07-17 日本油脂株式会社 座薬基剤組成物
JPS5767548A (en) 1980-10-14 1982-04-24 Shionogi & Co Ltd Insulin analog and its preparation
NL193099C (nl) 1981-10-30 1998-11-03 Novo Industri As Gestabiliseerde insuline-oplossing.
US4546082A (en) 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4839341A (en) 1984-05-29 1989-06-13 Eli Lilly And Company Stabilized insulin formulations
DK347086D0 (da) 1986-07-21 1986-07-21 Novo Industri As Novel peptides
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
US4849227A (en) 1986-03-21 1989-07-18 Eurasiam Laboratories, Inc. Pharmaceutical compositions
PH23446A (en) 1986-10-20 1989-08-07 Novo Industri As Peptide preparations
NZ222907A (en) 1986-12-16 1990-08-28 Novo Industri As Preparation for intranasal administration containing a phospholipid absorption enhancing system
DK463887D0 (da) 1987-09-07 1987-09-07 Novo Industri As Gaerleader
US5266310A (en) 1987-09-17 1993-11-30 Boehringer Ingelheim International Gmbh Stabilization of therapeutically active proteins in pharmaceutical preparations
JPH01254699A (ja) 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
DK257988D0 (da) 1988-05-11 1988-05-11 Novo Industri As Nye peptider
KR900701842A (ko) 1988-07-20 1990-12-04 헨리 브뢰늄 인간 인슐린 동족체와 그를 포함하는 제제
KR0148748B1 (ko) 1988-09-16 1998-08-17 장 크라메르, 한스 루돌프 하우스 사이클로스포린을 함유하는 약학조성물
US5225323A (en) 1988-11-21 1993-07-06 Baylor College Of Medicine Human high-affinity neurotransmitter uptake system
US5716927A (en) 1988-12-23 1998-02-10 Novo Nordisk A/S Insulin analogs having a modified B-chain
HUT56857A (en) 1988-12-23 1991-10-28 Novo Nordisk As Human insulin analogues
DE3844211A1 (de) 1988-12-29 1990-07-05 Hoechst Ag Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
DK105489D0 (da) 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
US5514646A (en) 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
JPH04504858A (ja) 1989-04-20 1992-08-27 マウント　シナイ　スクール　オブ　メディスン　オブ　ザ　シティー　ユニバーシティー　オブ　ニューヨーク 肝臓特異性インシュリン類似体
CA1340994C (en) 1989-09-21 2000-05-16 Rudolf Edgar Dr. Falk Treatment of conditions and disease
WO1991003935A1 (en) 1989-09-22 1991-04-04 Tsi-Mason Research Institute Method and compositions for one-step cryopreservation of embryos
CA2027930C (en) 1989-10-19 1998-06-30 Tsuyoshi Miyazaki Polymer complexes of a sugar response type
US5179189A (en) 1990-01-19 1993-01-12 Nova Pharmaceutical Corporation Fatty acid terminated polyanhydrides
DK45590D0 (ja) 1990-02-21 1990-02-21 Novo Nordisk As
DK155690D0 (da) 1990-06-28 1990-06-28 Novo Nordisk As Nye peptider
DK158390D0 (da) 1990-07-02 1990-07-02 Novo Nordisk As Nye peptider
AU8091091A (en) 1990-07-26 1992-02-18 University Of Iowa Research Foundation, The Novel drug delivery systems for proteins and peptides using albumin as a carrier molecule
AU8546591A (en) 1990-09-13 1992-04-15 Smithkline Beecham Corporation Non-aqueous liquid oral suspensions
DK10191D0 (da) 1991-01-22 1991-01-22 Novo Nordisk As Hidtil ukendte peptider
US5336782A (en) 1991-04-24 1994-08-09 Kuraray Co., Ltd. Long chain carboxylic acid imide ester
WO1998017320A1 (en) 1991-07-03 1998-04-30 Hyal Pharmaceutical Corporation Use of hyaluronan in gene therapy
EP0597007B1 (en) 1991-07-26 1996-10-16 Smithkline Beecham Corporation W/o microemulsions
US5268453A (en) 1991-08-08 1993-12-07 Scios Inc. Tissue-selective insulin analogs
US5206219A (en) 1991-11-25 1993-04-27 Applied Analytical Industries, Inc. Oral compositions of proteinaceous medicaments
ZA928916B (en) 1991-11-26 1994-05-18 Lilly Co Eli Tri-arginine insulins
EP0547544B1 (de) * 1991-12-18 1997-03-12 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von insulinhaltigen Lösungen
WO1994008599A1 (en) 1992-10-14 1994-04-28 The Regents Of The University Of Colorado Ion-pairing of drugs for improved efficacy and delivery
JPH08502490A (ja) 1992-10-16 1996-03-19 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 組成物
WO1994008605A1 (en) 1992-10-16 1994-04-28 Smithkline Beecham Corporation Therapeutic microemulsions
EP0684834A4 (en) 1993-02-17 1996-09-25 Smithkline Beecham Corp MICROEMULSIONS CONTAINING THERAPEUTIC PEPTIDES.
JPH08507066A (ja) 1993-02-17 1996-07-30 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 治療用ペプチド含有のミクロエマルジョン
JP3698721B2 (ja) 1993-02-23 2005-09-21 ジェネンテク・インコーポレイテッド 有機溶媒を用いて処理したポリペプチドの賦形剤安定化
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5424286A (en) 1993-05-24 1995-06-13 Eng; John Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same
US5506203C1 (en) 1993-06-24 2001-02-06 Astra Ab Systemic administration of a therapeutic preparation
DK82893D0 (da) 1993-07-08 1993-07-08 Novo Nordisk As Peptid
US6869930B1 (en) 1993-09-17 2005-03-22 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
EP0792290B1 (en) 1993-09-17 2001-08-29 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
GB9323588D0 (en) 1993-11-16 1994-01-05 Cortecs Ltd Hydrophobic preparation
MX9603936A (es) 1994-03-07 1997-05-31 Inhale Therapeutic Syst Metodos y composiciones para el suministro pulmonar de insulina.
US5639642A (en) 1994-06-16 1997-06-17 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
US6500645B1 (en) 1994-06-17 2002-12-31 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
ZA954983B (en) 1994-06-17 1996-02-14 Novo Nordisk As N-terminally extended proteins expressed in yeast
US5646242A (en) 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
US5693609A (en) 1994-11-17 1997-12-02 Eli Lilly And Company Acylated insulin analogs
US6251856B1 (en) 1995-03-17 2001-06-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
CA2215694A1 (en) 1995-03-17 1996-09-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
US5824638A (en) 1995-05-22 1998-10-20 Shire Laboratories, Inc. Oral insulin delivery
US20010041786A1 (en) * 1995-06-07 2001-11-15 Mark L. Brader Stabilized acylated insulin formulations
WO1997002043A1 (en) 1995-06-30 1997-01-23 Novo Nordisk A/S Prevention of a disease having the characteristics of diabetes
US20030104981A1 (en) 1995-11-03 2003-06-05 Jelena Mandic Human insulin analogues
US6451970B1 (en) 1996-02-21 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
AU3255397A (en) 1996-07-05 1998-02-02 Novo Nordisk A/S Method for the production of precursors of insulin, precursors of insulin analogues, and insulin like peptides
EP0938502B1 (en) 1996-07-11 2004-10-06 Novo Nordisk A/S Selective acylation method
US5981489A (en) 1996-07-18 1999-11-09 Alza Corporation Non-aqueous protic peptide formulations
ATE264871T1 (de) 1996-07-26 2004-05-15 Aventis Pharma Gmbh Insulinderivate mit erhöhter zinkbindung
IL119029A0 (en) 1996-08-07 1996-11-14 Yeda Res & Dev Long-acting drugs and pharamaceutical compositions comprising them
UA72181C2 (uk) 1996-08-30 2005-02-15 Ново Нордіск А/С Похідна глюкагоноподібного пептиду-1 (варіанти), фармацевтична композиція та спосіб одержання лікувального засобу (варіанти), спосіб лікування діабету (варіанти) і ожиріння
AU5549998A (en) 1997-01-24 1998-08-18 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
DE29824679U1 (de) 1997-01-30 2002-03-28 Novartis Ag Pharmazeutische Zusammensetzungen
US5898067A (en) 1997-02-07 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Crystallization of proteins
US6310038B1 (en) 1997-03-20 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Pulmonary insulin crystals
ZA984697B (en) 1997-06-13 1999-12-01 Lilly Co Eli Stable insulin formulations.
CN1240718C (zh) 1997-10-24 2006-02-08 诺沃挪第克公司 人胰岛素衍生物的聚集体
CA2306877A1 (en) 1997-10-24 1999-05-06 Eli Lilly And Company Insoluble insulin compositions
ZA989744B (en) 1997-10-31 2000-04-26 Lilly Co Eli Method for administering acylated insulin.
CN1278737A (zh) 1997-11-12 2001-01-03 阿尔萨公司 减少多肽自结合的方法
US6531448B1 (en) 1997-12-23 2003-03-11 Eli Lilly And Company Insoluble compositions for controlling blood glucose
ATE466027T1 (de) 1998-02-27 2010-05-15 Novo Nordisk As Abkömmlinge von glp-1 analogen
CA2334859A1 (en) 1998-06-12 1999-12-23 Kings College London Insulin analogue
GB9814172D0 (en) 1998-06-30 1998-08-26 Andaris Ltd Formulation for inhalation
AU776514B2 (en) 1998-08-10 2004-09-09 General Hospital Corporation, The Differentiation of non-insulin producing cells into insulin producing cells by GLP-1 or exendin-4 and uses thereof
EP1107743B1 (en) 1998-08-25 2007-06-27 Advanced Inhalation Research, Inc. Stable spray-dried protein formulations
TW570805B (en) 1998-09-01 2004-01-11 Hoffmann La Roche Water-soluble pharmaceutical composition in an ionic complex
US7030083B2 (en) 1998-09-09 2006-04-18 University Of Washington Treatment of eclampsia and preeclampsia
WO2000023098A1 (en) 1998-10-16 2000-04-27 Novo Nordisk A/S Stable concentrated insulin preparations for pulmonary delivery
US6660715B2 (en) 1998-11-19 2003-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Nonaqueous solutions and suspensions of macromolecules for pulmonary delivery
US7425541B2 (en) 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
DE60000288T2 (de) 1999-01-26 2003-01-16 Lilly Co Eli Monodisperse formulierungen, die hexamere acylierte insulinanaloge enthalten
WO2000047203A1 (en) 1999-02-12 2000-08-17 Mqs, Inc. Formulation and system for intra-oral delivery of pharmaceutical agents
US6267985B1 (en) 1999-06-30 2001-07-31 Lipocine Inc. Clear oil-containing pharmaceutical compositions
WO2000061178A1 (en) 1999-04-13 2000-10-19 Inhale Therapeutics Systems, Inc. Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility
EP1173482A1 (en) 1999-04-27 2002-01-23 Eli Lilly And Company Insulin crystals for pulmonary administration
US6746853B1 (en) 1999-05-19 2004-06-08 Xencor, Inc. Proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes
WO2000069901A2 (en) 1999-05-19 2000-11-23 Xencor, Inc. Proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes
US6309633B1 (en) 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
WO2001000674A1 (en) 1999-06-29 2001-01-04 Eli Lilly And Company Insulin crystals for pulmonary administration
PT1242121E (pt) 1999-12-16 2005-05-31 Lilly Co Eli Composicoes polipeptidicas com estabilidade melhorada
AU2001220765A1 (en) 2000-01-24 2001-07-31 Medtronic Minimed, Inc. Mixed buffer system for stabilizing polypeptide formulations
WO2001072323A2 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Genentech, Inc. Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders
JP2003535106A (ja) 2000-06-02 2003-11-25 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ グルコース検知性インスリン誘導体からの、インスリンのグルコース依存性放出
CN1141974C (zh) 2000-06-07 2004-03-17 张昊 结肠定位释放的口服生物制剂
US6459965B1 (en) 2000-11-22 2002-10-01 Ge-Harris Railway Electronics, Llc Method for advanced communication-based vehicle control
KR100508695B1 (ko) 2001-02-13 2005-08-17 한국과학기술연구원 인슐린의 경구투여용 제형과 그의 제조방법
US7060675B2 (en) 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6867183B2 (en) 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6852694B2 (en) 2001-02-21 2005-02-08 Medtronic Minimed, Inc. Stabilized insulin formulations
CN1160122C (zh) 2001-04-20 2004-08-04 清华大学 一种制备口服胰岛素油相制剂的方法
CN1314445C (zh) 2001-05-21 2007-05-09 耐科塔医药公司 化学修饰胰岛素的肺部给药
US6858580B2 (en) 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
JP2004537580A (ja) 2001-08-10 2004-12-16 エピックス メディカル， インコーポレイテッド 延長された循環半減期を有するポリペプチド結合体
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
JP4318546B2 (ja) 2001-09-07 2009-08-26 バイオコン・リミテッド インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法、ならびにプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートおよびその合成方法
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7030082B2 (en) 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
WO2003048195A2 (en) 2001-12-02 2003-06-12 Novo Nordisk A/S Glucose dependant release of insulin from glucose sensing insulin derivatives
US7317000B2 (en) 2001-12-02 2008-01-08 Novo Nordisk A/S Glucose-dependent insulins
ATE424815T1 (de) 2001-12-03 2009-03-15 Dor Biopharma Inc Stabilisierte umkehr-mizellen-zusammensetzungen und ihre verwendung
AU2002314790A1 (en) 2001-12-05 2003-06-23 Dow Global Technologies Inc. Method for immobilizing a biologic in a polyurethane-hydrogel composition, a composition prepared from the method, and biomedical applications
AU2002346491A1 (en) 2001-12-19 2003-07-09 Eli Lilly And Company Crystalline compositions for controlling blood glucose
CZ2004710A3 (cs) 2001-12-20 2005-02-16 Eli Lilly And Company Inzulínová sloučenina s protrahovaným účinkem
UA46669C2 (uk) 2001-12-29 2005-12-15 Товариство З Обмеженою Відповідальністю "Мако" Спосіб приготування готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії
WO2003075950A1 (en) 2002-03-13 2003-09-18 Novo Nordisk A/S Minimising body weight gain in insulin treatment
AU2003218635A1 (en) 2002-05-07 2003-11-11 Novo Nordisk A/S Soluble formulations comprising insulin aspart and insulin detemir
ATE496064T1 (de) 2002-05-07 2011-02-15 Novo Nordisk As Lösliche formulierungen, die monomeres insulin und acyliertes insulin enthalten
US7601688B2 (en) 2002-06-13 2009-10-13 Biocon Limited Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
CN1165549C (zh) 2002-06-15 2004-09-08 江苏万邦生化医药股份有限公司 胰岛素的纯化方法
EP1545526A4 (en) 2002-09-17 2009-09-23 Merck & Co Inc ELIMINATION OF AN ALDEHYDE IMPURITY IN A REACTIVE POLYSTYRENE RESIN
US20040185068A1 (en) 2003-03-18 2004-09-23 Zhi-Jian Yu Self-emulsifying compositions, methods of use and preparation
ES2375056T3 (es) 2003-06-03 2012-02-24 Novo Nordisk A/S Composiciones pept�?dicas farmacéuticas estabilizadas.
WO2004105790A1 (en) 2003-06-03 2004-12-09 Novo Nordisk A/S Stabilized pharmaceutical peptide compositions
DE602004015980D1 (de) * 2003-06-17 2008-10-02 Sembiosys Genetics Inc Verfahren zur insulinproduktion in pflanzen
US20050054818A1 (en) 2003-07-02 2005-03-10 Brader Mark Laurence Crystalline compositions for controlling blood glucose
WO2005005477A2 (en) 2003-07-11 2005-01-20 Novo Nordisk A/S Stabilised insulin compositions
SI1648933T1 (sl) 2003-07-25 2010-01-29 Conjuchem Biotechnologies Inc Dolgo delujoäś inzulinski derivat in metoda zanj
EP2264065B1 (en) 2003-08-05 2017-03-08 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
US20060198819A1 (en) 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
EP1660047B1 (en) 2003-08-13 2013-11-27 Biocon Limited Micro-particle fatty acid salt solid dosage formulations for therapeutic agents
EP2932981B1 (en) 2003-09-19 2021-06-16 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of GLP-1
EP1687428A1 (en) * 2003-11-14 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Processes for making acylated insulin
US20050118206A1 (en) 2003-11-14 2005-06-02 Luk Andrew S. Surfactant-based gel as an injectable, sustained drug delivery vehicle
CN104826116A (zh) 2003-11-20 2015-08-12 诺沃挪第克公司 对于生产和用于注射装置中是最佳的含有丙二醇的肽制剂
WO2005058961A2 (en) 2003-12-12 2005-06-30 Amgen Inc. Antibodies specific for human galanin, and uses thereof
DE10358387A1 (de) 2003-12-13 2005-07-07 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Pulver enthaltend niedermolekulares Dextran und Verfahren zu deren Herstellung
WO2005092301A1 (en) 2004-03-26 2005-10-06 Universita' Degli Studi Di Parma Insulin highly respirable microparticles
WO2006097793A2 (en) 2004-04-15 2006-09-21 Chiasma, Ltd. Compositions capable of facilitating penetration across a biological barrier
EP1750756A2 (en) 2004-05-10 2007-02-14 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for enhanced mucosal delivery of parathyroid hormone
WO2006005667A2 (en) 2004-07-08 2006-01-19 Novo Nordisk A/S Polypeptide protracting tags comprising a tetrazole moiety
JP2008505866A (ja) 2004-07-09 2008-02-28 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ インスリンを含有する薬学的製剤
CA2910494C (en) 2004-07-19 2018-10-23 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
WO2006020580A2 (en) 2004-08-09 2006-02-23 Alios Biopharma Inc. Synthetic hyperglycosylated, protease-resistant polypeptide variants, oral formulations and methods of using the same
KR101306384B1 (ko) 2004-08-23 2013-09-09 맨카인드 코포레이션 약물 전달용 디케토피페라진염, 디케토모르포린염 또는디케토디옥산염
US20080020018A1 (en) 2004-09-27 2008-01-24 Joey Moodley Combination Products
ES2540754T3 (es) 2004-12-03 2015-07-13 Rhode Island Hospital Diagnóstico y tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer
US20090036353A1 (en) 2005-01-27 2009-02-05 Novo Nordisk A/S Insulin Derivatives Conjugated with Structurally Well Defined Branched Polymers
US8067362B2 (en) 2005-02-02 2011-11-29 Novo Nordisk As Insulin derivatives
US20080171695A1 (en) 2005-02-02 2008-07-17 Novo Nordisk A/S Insulin Derivatives
WO2006082245A1 (en) 2005-02-07 2006-08-10 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical preparations comprising insulin, zinc ions and a zinc-binding ligand
WO2006086856A1 (en) 2005-02-15 2006-08-24 Messadek, Jallal Combination therapeutic compositions and method of use
EP1863840A1 (en) 2005-03-18 2007-12-12 Novo Nordisk A/S Pegylated single-chain insulin
TWI362392B (en) 2005-03-18 2012-04-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
WO2006103657A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Dexcel Pharma Technologies Ltd. A solid composition for intra-oral delivery of insulin
ATE509634T1 (de) 2005-04-08 2011-06-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Pharmazeutische formulierungen mit incretin- peptid und aprotisch-polarem lösungsmittel
CN101180081B (zh) 2005-05-25 2015-08-26 诺沃-诺迪斯克有限公司 稳定的多肽制剂
WO2007006320A1 (en) 2005-07-12 2007-01-18 Sherine Hassan Abbas Helmy Drinkable oral insulin liquid and capsules
US20070086952A1 (en) 2005-09-29 2007-04-19 Biodel, Inc. Rapid Acting and Prolonged Acting Inhalable Insulin Preparations
JP4710533B2 (ja) 2005-10-07 2011-06-29 株式会社豊田自動織機 牽引車両のドローバー装置
CA2626357A1 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Intranasal administration of rapid acting insulin
ES2371361T3 (es) 2005-12-28 2011-12-30 Novo Nordisk A/S Composiciones que comprenden una insulina acilada y zinc y método de producción de dichas composiciones.
WO2007081824A2 (en) 2006-01-06 2007-07-19 Case Western Reserve University Fibrillation resistant proteins
EP1991575A1 (en) 2006-02-21 2008-11-19 Novo Nordisk A/S Single-chain insulin analogues and pharmaceutical formulations thereof
JP5202338B2 (ja) * 2006-02-27 2013-06-05 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 新規インシュリン誘導体
US20090099065A1 (en) 2006-03-13 2009-04-16 Novo Nordisk A/S Acylated Single Chain Insulin
WO2007104737A1 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Acylated single chain insulin
MX2008014061A (es) 2006-05-09 2008-11-14 Novo Nordisk As Derivado de insulina.
ES2553154T3 (es) 2006-05-09 2015-12-04 Novo Nordisk A/S Derivado de la insulina
CN101573133B (zh) * 2006-07-31 2014-08-27 诺沃-诺迪斯克有限公司 Peg化延长的胰岛素
EP2074141B1 (en) * 2006-09-22 2016-08-10 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
WO2008043033A2 (en) 2006-10-04 2008-04-10 Case Western Reserve University Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues
EP2152245B1 (en) 2007-04-30 2015-12-02 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
WO2008132229A2 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Novo Nordisk A/S Highly concentrated insulin solutions and compositions
JP2011504871A (ja) 2007-06-01 2011-02-17 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 固体又は半固体担体中にペプチド薬剤を含む自然に分散可能なプレコンセントレイト
EP2164458A1 (en) 2007-06-01 2010-03-24 Novo Nordisk A/S Stable non-aqueous pharmaceutical compositions
ES2744384T3 (es) 2007-06-13 2020-02-24 Novo Nordisk As Formulación farmacéutica que comprende un derivado de insulina
JP5688969B2 (ja) 2007-07-16 2015-03-25 ノボ・ノルデイスク・エー／エス プロテアーゼに対して安定しているペグ化インスリンアナログ
ES2558930T3 (es) 2007-08-13 2016-02-09 Novo Nordisk A/S Análogos de la insulina de acción rápida
EP2178910B1 (en) 2007-08-15 2014-10-08 Novo Nordisk A/S Insulins with an acyl moiety comprising repeating units of alkylene glycol containing amino acids
CA2695970A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Novo Nordisk A\S Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety
US20090087484A1 (en) 2007-09-28 2009-04-02 Alza Corporation Formulation and dosage form for increasing oral bioavailability of hydrophilic macromolecules
JP5241849B2 (ja) 2007-11-16 2013-07-17 ノボ・ノルデイスク・エー／エス インスリン及びインスリン分泌性ペプチドを含む薬学的組成物
US9260502B2 (en) * 2008-03-14 2016-02-16 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
EP2910571B1 (en) 2008-03-18 2016-10-05 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
US8993516B2 (en) 2008-04-14 2015-03-31 Case Western Reserve University Meal-time insulin analogues of enhanced stability
TWI451876B (zh) 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
RU2540922C2 (ru) 2008-10-30 2015-02-10 Ново Нордиск А/С Лечение сахарного диабета с использованием инъекций инсулина с частотой менее одного раза в день
JP2012510438A (ja) 2008-11-28 2012-05-10 ノヴォ・ノルディスク・アー／エス 誘導体化インスリンペプチドの経口投与に適した医薬組成物
WO2010066636A1 (en) 2008-12-09 2010-06-17 Novo Nordisk A/S Novel insulin analogues
JP2013504610A (ja) 2009-09-16 2013-02-07 ノヴォ ノルディスク アー／エス インスリンを含む安定な非水性液体医薬組成物
WO2011051486A2 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical solution of non covalently bound albumin and acylated insulin
EP2504368B1 (de) 2009-11-23 2014-01-08 Basf Se Verfahren zur herstellung wasserabsorbierender polymerpartikel mit verbesserter farbstabilität
BR112012016853A2 (pt) 2010-01-12 2017-10-17 Novo Nordisk As "composições farmacêuticas para administração oral de peptídeos de insulina".
EP2585484A1 (en) 2010-06-23 2013-05-01 Novo Nordisk A/S Insulin analogues containing additional disulfide bonds
WO2011161125A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives containing additional disulfide bonds
JP2013540771A (ja) 2010-10-15 2013-11-07 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規ｎ末端修飾インスリン誘導体
CN103249427A (zh) 2010-12-14 2013-08-14 诺沃—诺迪斯克有限公司 速效胰岛素联合长效胰岛素
US9260503B2 (en) 2011-06-15 2016-02-16 Novo Nordisk A/S Multi-substituted insulins
CN104364260B (zh) 2012-04-11 2017-02-22 诺和诺德股份有限公司 胰岛素制剂
US20150111820A1 (en) 2012-07-09 2015-04-23 Novo Nordisk A/S Novel use of insulin derivatives
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime
JP6499184B2 (ja) 2013-10-07 2019-04-10 ノヴォ ノルディスク アー／エス インスリン類似体の新規な誘導体
FR3013049B1 (fr) 2013-11-14 2015-11-13 You-Ping Chan Analogue de l'insuline glargine
US20170028031A1 (en) 2014-03-07 2017-02-02 Klavs Holger Jørgensen Novel fast acting insulin preparations
JO3624B1 (ar) 2014-05-08 2020-08-27 Lilly Co Eli تركيبات إنسولين سريعة المفعول
AR102869A1 (es) 2014-12-16 2017-03-29 Lilly Co Eli Composiciones de insulina de rápida acción
TWI700092B (zh) 2016-12-16 2020-08-01 丹麥商諾佛．儂迪克股份有限公司 含胰島素醫藥組成物

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015147781A (ja) * 2008-03-18 2015-08-20 ノボ・ノルデイスク・エー／エス プロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログ
JP2015147782A (ja) * 2008-03-18 2015-08-20 ノボ・ノルデイスク・エー／エス プロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログ
JP2015155421A (ja) * 2008-03-18 2015-08-27 ノボ・ノルデイスク・エー／エス プロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログ
US9688737B2 (en) 2008-03-18 2017-06-27 Novo Nordisk A/S Protease stabilized acylated insulin analogues
US10259856B2 (en) 2008-03-18 2019-04-16 Novo Nordisk A/S Protease stabilized acylated insulin analogues
US9481721B2 (en) 2012-04-11 2016-11-01 Novo Nordisk A/S Insulin formulations
US10265385B2 (en) 2016-12-16 2019-04-23 Novo Nordisk A/S Insulin containing pharmaceutical compositions
US10596231B2 (en) 2016-12-16 2020-03-24 Novo Nordisk A/S Insulin containing pharmaceutical compositions

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