JP4318546B2 - インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法、ならびにプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートおよびその合成方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その開示の全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする2001年9月7日に出願された米国特許仮出願第60/318,197号の利益を主張する。
本発明は、インスリンコンジュゲート、そのようなコンジュゲートの合成方法、およびそれを用いた糖尿病を含む疾患の治療方法に関する。
Aは活性化可能な成分であり、
Lはリンカー成分であり、
G、G’およびG’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Rは親油性成分でありR’はポリアルキレングリコール成分である、またはR’は親油性成分でありRはポリアルキレングリコール成分であり、
Tは末端成分であり、
j、k、mおよびnは個別に0または1である。
当業者には理解されるような様々な活性化可能な成分であってよい。
Aは−C(O)−OH、C(S)−OH、−C(S)−SH、−OH、−SH、またはNH2であり、
Xは、酸素原子、またはAが−OHであるときにXが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Yは、エステル、エーテル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合部分であり、そして好ましくはエーテル結合部分であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
Aは、−C(O)−OH、C(S)−OH、−C(S)−SH、−OH、−SH、またはNH2であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
Aは活性化可能な成分であり、
Lはリンカー成分であり、
G、G’およびG’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Rは親油性成分でありR’はポリアルキレングリコール成分である、またはR’は親油性成分でありRはポリアルキレングリコール成分であり、
Tは末端成分であり、
j、k、mおよびnは個別に0または1である。
Aは−C(O)−OH、C(S)−OH、−C(S)−SH、−OH、−SH、またはNH2であり、
Xは、酸素原子、またはAが−OHであるときにXが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Yは、エステル、エーテル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合成分であり、そして好ましくはエーテル結合成分であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
Aは、−C(O)−OH、C(S)−OH、−C(S)−SH、−OH、−SH、またはNH2であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
Aは活性化可能な成分であり、
Lはリンカー成分であり、
G、G’およびG’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Rは親油性成分でありR’はポリアルキレングリコール成分である、またはR’は親油性成分でありRはポリアルキレングリコール成分であり、
Tは末端成分であり、
j、k、mおよびnは個別に0または1である。
Aは−C(O)−OH、C(S)−OH、−C(S)−SH、−OH、−SH、またはNH2であり、
Xは、酸素原子、またはAが−OHであるときにXが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Yは、エステル、エーテル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合成分であり、そして好ましくはエーテル結合成分であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
Aは−C(O)−OH、C(S)−OH、−C(S)−SH、−OH、−SH、またはNH2であり、
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、または22個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、6、7、8、または9個の下限と、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の上限との間、およびさらにより好ましくは3、4、5、6、または7個の下限と、6、7、8、9、または10個の上限との間であり、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の下限と、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個の上限との間、より好ましくは2、3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の上限との間、いっそうより好ましくは3、4、5、または6個の下限と、5、6、7、8、9、10、11、または12個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは4、5、または6個の下限と、6、7、または8個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは7個であり、
Rは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、sec−ブチル、tert−ブチル、2−メチルブチル、tert−ペンチル、2−メチル−ペンチル、3−メチルペンチル、2−エチルヘキシル、2−プロピルペンチル、ビニル、アリル、1−ブテニル、2−ブテニル、エチニル、1−プロピニル、および2−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、またはtert−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはC1〜C3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
ヘキサエチレングリコールモノベンジルエーテル(1)。水4mLに3.99g(100mmol)のNaOHを溶解させて調製した水酸化ナトリウム水溶液を単分散ヘキサエチレングリコール(28.175g,25mL,100mmol)へ緩徐に添加した。塩化ベンジル(3.9g,30.8mmol,3.54mL)を添加し、この反応混合液を攪拌しながら100℃へ18時間加熱した。この反応混合液をその後冷却し、食塩液(250mL)により希釈し、塩化メチレン(200mL×2)により抽出した。結合した有機層を食塩液により1回洗浄し、Na2SO4の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で暗褐色油へ濃縮した。粗生成物混合液をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチルから9/1の酢酸エチル/メタノールへの勾配溶離)により精製して、黄色油として、8.099g(70%)の単分散化合物1を入手した。
トリエチレングリコールモノメチルエーテルのメシレート(9)。氷浴中で0℃に冷却したCH2Cl2の溶液(100mL)に、単分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル(25g,0.15mol)を添加した。その後、トリエチルアミン(29.5mL,0.22mol)を添加し、この溶液を0℃で15分間攪拌し、この後、メタンスルホニルクロリド(20mLのCH2Cl2に溶解させた13.8mL,0.18mol)を滴下法で添加した。この反応混合液を0℃で30分間攪拌し、室温へ加温するに任せ、その後2時間攪拌した。粗反応混合液をセライト(〜200mLのCH2Cl2で洗浄)に通して濾過し、その後、H2O(300mL)、5%のNaHCO3(300mL)、H2O(300mL)、飽和NaCl(300mL)を用いて洗浄し、MgS04で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。確実に乾燥させるためにこの油を〜2時間真空ライン上に置き、黄色油として単分散化合物9を得た(29.15g,収率80%)。
10−ヒドロキシデカノエート(15)。エタノール(100mL)中の単分散10−ヒドロキシデカン酸(5.0g,26.5mmol)の溶液にH2SO4(0.43mL,8.8mmol)を添加し、この反応液を攪拌しながら3時間環流するように加熱した。粗反応混合液を室温に冷却し、H2O(100mL)、飽和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)を用いて洗浄しMgSO4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させて透明な油として単分散化合物15を得た(6.9g,収率98%)。
C18(PEG6)オリゴマー(20)の合成。単分散ステアロイルクロリド(0.7g,2.31mmol)をベンゼン中の単分散PEG6(5g,17.7mmol)およびピリジン(0.97g,12.4mmol)の混合液へ緩徐に添加した。この反応混合液を数時間(〜5時間)攪拌した。この反応の後に、展開剤として酢酸エチル/メタノールを使用するTLCを実施した。この反応混合液を水で洗浄し、MgSO4の上方で乾燥させ、濃縮させて、真空により乾燥させた。FAB MSにより精製単分散化合物20を分析した。m/e 549/M+H。
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル(23)。単分散テトラエチレングリコール(19.4g,0.10mmol)の油にNaOHの溶液(4.0mL中の4.0g)を添加し、この反応混合液を15分間攪拌した。塩化ベンジル(3.54mL,30.8mmol)を添加し、この反応混合液を100℃へ加熱し、一晩攪拌した。この反応混合液を室温へ冷却し、飽和NaCl(250mL)により希釈し、CH2Cl2(2×200mL)により洗浄した。有機層を結合し、飽和NaClにより洗浄し、MgSO4で乾燥し、クロマトグラフィー(シリカ、酢酸エチル)にかけると、黄色油として単分散化合物23(6.21g、収率71%)が得られた。
20%のホスゲン(100mL,約18.7g,189mmolのホスゲン)を含有するトルエンの溶液をN2大気下で0℃に冷却した。単分散mTEG(トリエチレングリコール、モノメチルエーテル、7.8g,47.5mmol)を25mLの無水酢酸エチル中に溶解させ、冷却したホスゲン溶液に添加した。この混合液を0℃で1時間攪拌し、室温へ加温するに任せ、その後さらに2時間半攪拌した。残留しているホスゲン、酢酸エチルおよびトルエンを真空蒸留により除去して、透明な油性残留物として単分散mTEGクロロホルメートを残した。
単分散パルミチン酸無水物(5g;10mmol)を無水THF(20mL)中に溶解させ、室温で撹拌した。この撹拌溶液に、3モル過剰のピリジンを添加し、さらに単分散トリエチレングリコール(1.4mL)を添加した。この反応混合液を1時間撹拌した(反応の進行は、TLC;酢酸エチル−クロロホルム;3:7により監視した)。反応の終了時にTHFを除去し、生成物を10%のH2SO4酸と混合し、酢酸エチルを用いて抽出した(3×30mL)。結合抽出物は、水、食塩液を用いて連続的に洗浄し、MgSO4の上方を通して乾燥させ、蒸発させて単分散のパルミテート−TEGオリゴマーを得た。
単分散の活性化されたヘキサエチレングリコールモノメチルエーテルは、上記の実施例14に記載の単分散トリエチレングリコールと同様に調製した。トルエン溶液中の20%ホスゲン(35mL,6.66g,67.4mmolのホスゲン)は氷/塩水浴中のN2大気下で冷却した。単分散ヘキサエチレングリコール(1.85mL,2.0g,6.74mmol)を5mLの無水EtOAc中へ溶解させ、シリンジによりホスゲン溶液へ添加した。この反応混合液を1時間氷浴中で撹拌し続け、除去し、さらに室温で2.5時間撹拌した。ホスゲン、EtOAcおよびトルエンを真空蒸留により除去して、透明な油性残留物として単分散のメチルヘキサエチレングリコールクロロホルメートを残した。
8−メトキシ−1−(メチルスルホニル)オキシ−3,6−ジオキサオクタン(29)。無水ジクロロメタン(50mL)中の単分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル分子(4.00mL,4.19g,25.5mmol)およびトリエチルアミン(4.26mL,3.09g,30.6mmol)を氷浴中で冷やし、窒素大気下に置いた。無水ジクロロメタン(20mL)中のメタンスルホニルクロリド(2.37mL,3.51g,30.6mmol)の溶液を添加用漏斗から滴下法で添加した。塩化物添加の完了10分後に、反応混合液を氷浴から除去し、室温になるに任せた。この混合物をさらに1時間撹拌し、その時点のTLC(溶離剤として15%のMeOHとともにCHC13を使用して)は、残留しているトリエチレングリコールモノメチルエーテルを示さなかった。
20−メトキシ−1−(メチルスルホニル)オキシ−3,9,12,15,18−ヘキサオキサエイコサン(31)。単分散化合物31は、上記の実施例9において29について記載したように化合物30およびメタンスルホニルクロリドから定量的収率で油として入手した;Rf 0.4(酢酸エチル:アセトニトリル=1:5);MS m/z C17H37O10に対する計算値433.21(M++1)、実測値433.469。
組み換えプロインスリンIのコンジュゲーション。組み換えプロインスリンI(分子量10,642ダルトン)は、ブラジルのベロホリゾンテ所在のBiobras社から入手した。プロインスリンIの2.32×10-3mmol部分を10mLのDMSO中に溶解させた。この溶液に324μLのトリエチルアミンを添加した。結果として生じた溶液を5分間撹拌し、その後、アセトニトリル中の活性化メチルへプタエチレングリコール((PEG7)−ヘキシルオリゴマー)の溶液(9.30×10-3mmol)を添加した。コンジュゲーション(アシル化)反応の進行はHPLCにより監視した。反応が完了したように見えたとき、3.54mLの5%トリフルオロ酢酸水溶液の添加により反応を停止させた。この反応混合液をその後処理し、pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中へ移した。生成物の混合液であるオリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンIのHPLCプロファイルは図11に示した。
逆相HPLCを使用して、実施例11(a)に記載したコンジュゲーション反応から入手した生成物混合物からの主要生成物を単離した。HPLCカラム(内径1.0cm×長さ25cm)へペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販で入手できるC18固定相を充填し、その後HPLCシステム内へ組み込んだ。このシステムを、5mL/minの流量で送達した72%の移動相A(0.1%トリフルオロ酢酸を含むH2O)および28%の移動相B(0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル)を含む混合物である溶離緩衝液を用いて平衡化した。pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中の生成物混合物の溶液を逆相カラムへ適用し、生成物を分離し、溶離液は以下のように溶離用緩衝液のアセトニトリル成分(移動相B)を増加させた勾配を使用して溶出した。
60分間にわたり28%〜30%移動相B、その後
30分間にわたり30%〜32%移動相B、その後
40分間にわたり32%〜36%移動相B。
フラクションを収集し、HPLCにより個別に分析して、その中に含まれる生成物の同一性および純度を決定した。4種の生成物(モノコンジュゲート−A(「プロインスリンIモノコンジュゲート−A」)、モノコンジュゲート−B(「プロインスリンIモノコンジュゲート−B」)、ジコンジュゲート(「プロインスリンIジコンジュゲート」)およびトリコンジュゲート(「プロインスリンIトリコンジュゲート」)の1つを含有する共通フラクションをプールし、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。HPLC(図14)および質量スペクトル分析を使用して、各単離物の同一性および純度を決定した。
実施例12に記載した方法を使用して単離した各コンジュゲート(プロインスリンIモノA、モノB、ジ、またはトリ)をpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中に溶解させ、分析用HPLCを使用して結果として生じた溶液のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液(TPCK処理;ウシ膵臓から)は、pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼBの溶液(ブタ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。粗混合物(1mmol)は、その後トリプシン(1.39×10-3mmol)およびカルボキシペプチダーゼB(4.56×10-4mmol/mL)と反応させた。30分後、この反応はアセトニトリル中の1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。各反応からの生成物混合液を処理し、HPLCによって分析した。標準物質の保持時間に比較したHPLC保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物の同一性および純度を決定した(表1)。
実施例12に記載した方法を使用して単離した各コンジュゲート(プロインスリンIモノA、モノB、ジ、またはトリ)をpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をHPLCにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液(TPCK処理;ウシ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。各コンジュゲート(300mmol)は、その後トリプシン(1mmol)と反応させた。20分後、この反応はアセトニトリル中の1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。この反応の生成物を単離し、HPLC保持時間および質量スペクトル分析によって分析して同一性を決定した。予測される生成物は表2に示すインスリン(Arg31)またはLysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンである。
pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中のLysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン(Arg31)(300mmol)(実施例14から)を含有する反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼBの溶液(ブタ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼB(1mmol)をこの反応混合液に添加した。この反応を15時間持続させ、アセトニトリル中の1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。各反応の予測生成物は表3に示す。
(a)組み換えプロインスリンIIのコンジュゲーション。組み換えプロインスリンII(分子量11,133ダルトン)は日本の茨城県所在の伊藤ハム食品社から入手した。組み換えプロインスリンIIは、各々にリジン残基が欠けているリーダーペプチドおよびCペプチドを有していた。組み換えプロインスリンIIの2.55×10-3mmol部分を10mLのDMSO中に溶解させた。この溶液に355μLのトリエチルアミンを添加した。結果として生じた溶液を5分間撹拌し、その後、アセトニトリル中の活性化メチルポリエチレングリコール((PEGn)−ヘキシルオリゴマー)(n=7±3またはn=7)の溶液(5.10×10-3mmol)を添加した。反応の進行はHPLCにより監視した。反応が完了したように見えた後、3.7mLの5%トリフルオロ酢酸水溶液の添加により反応を停止させた。この反応混合液をその後処理し、pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中へ移した。オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンII生成物混合物のHPLCプロファイルは図2に示した。
実施例16(a)からの生成物混合液のTris−HCl溶液をHPLCにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液(TPCK処理;ウシ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼBの溶液(ブタ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。生成物混合物(0.399μmol/mL)はその後トリプシン(5.57×10-4μmol/mL)およびカルボキシペプチダーゼB(1.82×10-4μmol/mL)と反応させた。30分後、この反応はアセトニトリル中の550μLの1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物はHPLC保持時間(既知の参照標準物質の保持時間に比較して)および質量スペクトル分析により同定した。こうしてインスリン(23%)およびLysB29−ヘキシル−PEGn−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン(60%)およびその他(17%)を入手した(図9〜10)。
実施例16(a)に記載したコンジュゲーション反応からの各主要生成物は逆相HPLCを使用して単離した。ポリペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販で入手できるC18固定相をカラム(内径1.0cm×長さ25cm)に充填し、その後、HPLCシステム内へ組み込んだ。このシステムを、5mL/minの流量で送達した75%移動相A(0.1%のトリフルオロ酢酸を含むH2O)および25%移動相B(0.1%のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル)を含む混合物である溶離緩衝液を用いて平衡化した。実施例16(a)からの生成物混合物のTris−HCl溶液をカラムに適用し、主要生成物を分離し、溶離緩衝液の組成が25%移動相Bから35%移動相Bへ120間にわたり変更された勾配溶離を使用して溶出した。収集したフラクションをHPLCにより個別に分析して、その中に含まれる生成物の同一性および純度を決定した。各生成物の共通フラクション(プロインスリンIIモノコンジュゲート(「プロインスリンIIモノ」)およびジコンジュゲート(「プロインスリンIIジ」)をプールし、ロータリーエバポレーションにより溶媒を除去した。各生成物の同一性および純度はHPLCおよび質量スペクトル分析によって決定した(図2〜4)。
実施例17に記載した方法を使用して単離した各プロインスリンIIコンジュゲート(プロインスリンIIモノ、ジ、またはトリ)をpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中に溶解させ、その溶液のアリコートをHPLCにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液(TPCK処理;ウシ膵臓から)は、pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼBの溶液(ブタ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。コンジュゲート(0.127μmol/mL)はその後トリプシン(1.77×10-4μmol/mL)およびカルボキシペプチダーゼB(5.77×10-5μmol/mL)と反応させた。30分後、この反応はアセトニトリル中の250μLの1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物の単離およびその後の標準物質に対するHPLC保持時間および質量スペクトル分析による同定によれば、インスリンまたはB−29アシル化インスリン−ヘキシル−PEG7が反応において産生したことがわかった。各反応の生成物および収率は表4に示す。
実施例17からの各コンジュゲート(プロインスリンIIモノ、ジ、またはトリ)をpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をHPLCにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液(TPCK処理;ウシ膵臓から)は、pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。各コンジュゲート(0.127μmol)はその後トリプシン(4.23×10-4μmol/mL)と反応させた。20分後、この反応はアセトニトリル中の250μLの1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物の単離は、その後HPLC保持時間および質量スペクトル分析によって同定し、インスリン(Arg31)またはLysB29−ヘキシル−PEG−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン(Arg31)が反応において産生したことがわかった。各反応の生成物および収率は表5に示す。
実施例19からのLysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン(Arg31)(3.10×10-5mmol)の反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼBの溶液(ブタ膵臓から)は、pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼB(1.03×10-7)をこの反応混合液に添加した。この反応を15時間持続させ、アセトニトリル中の1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。処理後、反応の生成物をHPLCによって分析した。同一性を決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。プロインスリンIIモノコンジュゲートの反応からインスリン(23%)およびLysB29−ヘキシル−PEGn−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン(60%)(図5、7〜8)を得た。プロインスリンIIジコンジュゲート反応の予測生成物は表6に示す。
(a)天然ヒトプロインスリンのコンジュゲーション。天然ヒトプロインスリン(Sigma Chemical社)(3.20×10-4mmol)を5mLのDMSOに溶解させた。この溶液に45μLのトリエチルアミンを添加した。この溶液を5分間撹拌し、その後アセトニトリル中の活性化PEG7−ヘキシルオリゴマー(6.4×10-4mmol)の溶液を添加した。プロインスリンが消費される(またはプロインスリンの濃度がもはや減少しない)ことをHPLC解析が示すように反応が進行した後、この反応は0.5mLの5%トリフルオロ酢酸水溶液の添加により停止させた。この反応混合液をその後処理し、pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中へ移した。
実施例11(a)に記載したコンジュゲーション反応から入手した各主要生成物は逆相HPLCを使用して単離した。カラム(内径1.0cm×長さ25cm)へポリペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販で入手できるC18固定相を充填し、その後HPLCシステム内へ組み込んだ。このシステムを、75%移動相A(0.1%トリフルオロ酢酸を含むH2O)および25%移動相B(0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル)の混合物を含む溶離緩衝液を用いて平衡化した。実施例21(a)からの生成物混合物のTris−HCl溶液をカラムに適用し、主要生成物を分離し、アセトニトリルのパーセンテージが120間にわたり25%〜35%へ変更させられた勾配溶離を使用して溶出した。フラクションを収集し、HPLCにより分析して、その中に含まれる生成物の同一性および純度を決定した。各生成物の共通フラクションをプールし、そしてロータリーエバポレーションにより溶媒を除去した。各生成物の同一性および純度はHPLCおよび質量分析法によって決定した。予測生成物は、2つのヒトプロインスリンモノコンジュゲート、1つのヒトプロインスリンジコンジュゲートおよび1つのヒトプロインスリントリコンジュゲートからなる。
実施例22に記載した方法を使用して入手した各コンジュゲートをpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をHPLCにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液(TPCK処理;ウシ膵臓から)は、pH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼBの溶液(ブタ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。粗混合物(1モル等量)はその後トリプシン(1.39×10-3モル等量)およびカルボキシペプチダーゼB(4.56×10-4モル等量)と反応させた。30分後、この反応をアセトニトリル中の1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、HPLCにより解析した。同一性を決定するためには保持時間(標準物質に対して)および質量スペクトル分析を使用した。反応の予測生成物はインスリンまたはLysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンである。
実施例22に記載の入手した各コンジュゲートをpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をHPLCにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液(TPCK処理;ウシ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。コンジュゲート(300モル等量)はその後トリプシン(1モル等量)と反応させた。20分後、この反応はアセトニトリル中の1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、HPLCにより解析した。同一性を決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。この反応の予測生成物はインスリン(Arg31)またはLysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン(Arg31)である。
実施例24からのLysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン(Arg31)(300mmol)の反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼBの溶液(ブタ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼB(1mmol)をこの反応混合液に添加した。この反応を15時間持続させ、アセトニトリル中の1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、HPLCにより解析した。同一性を決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。予測生成物はインスリンまたはLysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンである。
実施例11からの実験データの分析は、LysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンおよびLys−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたCペプチドは(a)プロインスリン原料上に存在する全リジン残基のε−アミノ基をアシル化するステップと、および(b)結果として生じる完全なオリゴマーをコンジュゲートしたプロインスリンをトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼBから作製した酵素反応混液を用いて開裂させるステップと、によって高い収率および純度で入手できることを指示した。この仮説の実験による確証は下記の通りに実施した。
実施例16(a)からの生成物混合液のTris−HCl溶液のアリコートをHPLCにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液(TPCK処理;ウシ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼBの溶液(ブタ膵臓から)はpH7.6の100mM Tris−HCl緩衝液中で調製した。実施例16(a)からの生成物混合物(0.424μmol/mL)はその後トリプシン(5.97×10-4μmol/mL)およびカルボキシペプチダーゼB(1.93×10-4μmol/mL)と反応させた。30分後、この反応はアセトニトリル中の1.58mLの1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物はHPLC保持時間(既知の参照標準物質の保持時間に比較して)および質量スペクトル分析により同定した。存在する唯一のインスリンコンジュゲートであるLysB29−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンは、ほぼ95%収率で入手されると予測される。Lys1−ヘキシル−PEG7−オリゴマーをコンジュゲートしたCペプチドもまた、近い量的収率で入手した。
Claims (30)
- インスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートの合成方法であって、
プロインスリンポリペプチドをオリゴマーと接触させるステップと、ここで、A鎖のN末端とB鎖のC末端とはペプチド結合を介して連結Cペプチドに結合されており、B鎖のN末端はリーダーペプチドに結合されており、前記ペプチド結合は酵素的に切断されてインスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートを産生することができるものであり、前記オリゴマーは親水性成分と親油性成分を含み、前記プロインスリンポリペプチドと前記オリゴマーは前記プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分のリジン残基へ前記オリゴマーが結合するのに十分な条件下で結合されてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートを提供し、
前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートのインスリンポリペプチドのA鎖及びB鎖から連結Cペプチド及びリーダーペプチドが切断されてインスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートが得られるステップと
を含む方法。 - 前記プロインスリンポリペプチドと前記オリゴマーとを接触させるステップが、
前記オリゴマーと活性化剤とを、前記プロインスリンポリペプチド上の求核性基に結合することができる活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、
前記活性化されたオリゴマーと前記プロインスリンポリペプチドとを、前記プロインスリンポリペプチド−モノオリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと
を含む請求項1に記載の方法。 - 前記オリゴマーと前記活性化剤とを接触させるステップと、前記活性化されたオリゴマーと前記プロインスリンポリペプチドとを接触させるステップとがインサイチューで実施される請求項2に記載の方法。
- 前記活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比が4:1より大きい請求項2に記載の方法。
- 前記連結Cペプチドはリジン残基を欠いている、請求項1に記載の方法。
- 前記連結Cペプチドが第1端に末端アミノ酸残基を有しており、前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートからの前記連結Cペプチドの切断が、前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第1酵素とを、末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、
前記末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第2酵素とを、前記インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと
を含む請求項1に記載の方法。 - 前記末端アミノ酸残基がアルギニン残基である請求項6に記載の方法。
- 前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第1酵素とを接触させるステップと、前記末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第2酵素とを接触させるステップとが、同時に生ずる請求項6に記載の方法。
- 前記第1酵素と前記第2酵素とが、前記第1酵素と前記第2酵素とを含む混合液で提供される請求項8に記載の方法。
- 前記第1酵素がトリプシンであり、前記第2酵素がカルボキシペプチダーゼBである請求項6に記載の方法。
- 前記リーダーペプチドにリジン残基が欠けている請求項10に記載の方法。
- 前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから前記連結Cペプチドを切断するステップが、前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、前記連結CペプチドとインスリンポリペプチドのA鎖及びB鎖の間の結合を切断することができる1以上の酵素とを、前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートから連結Cペプチドを切断するのに十分な条件下で接触させるステップを含む請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上の酵素が、トリプシン、カルボキシペプチダーゼB、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項12に記載の方法。
- 前記オリゴマーが式I:
Lは、アルキル成分および脂肪酸成分からなる群から選択されるリンカー成分であり、
G、G’およびG’’は、各々スペーサー部分であって、糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分からなる群から個別に選択され、
Rは親油性成分であってR’はポリアルキレングリコール成分であるか、またはR’は親油性成分であってRはポリアルキレングリコール成分であり、
Tは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分からなる群から選択される末端成分であり、
j、k、mおよびnは個別に0または1である)
の構造を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 前記インスリンポリペプチドがヒトインスリンである請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴマーが、前記インスリンのB29位でリジンに結合している請求項19に記載の方法。
- 前記インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが、両親媒性で平衡している請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴマーは単分散の混合物として存在している請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの収率が75%より大きい請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- プロインスリンポリペプチド及びオリゴマーを含むプロインスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートであって、前記プロインスリンポリペプチドはインスリンポリペプチドのA鎖とB鎖を含み、B鎖のC末端とA鎖のN末端とは連結Cペプチドを介して連結されており、B鎖のN末端はペプチド結合によりリーダーペプチドに結合されており、前記オリゴマーは前記プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分のリジン残基に結合した親水性成分と親油性成分を含み、前記親水性成分は少なくとも一つのポリアルキレングリコール成分を含む、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲート。
- 前記C連結ペプチドのリジン残基を欠いている請求項24に記載のコンジュゲート。
- 前記インスリンポリペプチドがヒトインスリンである請求項24または25に記載のコンジュゲート。
- 前記オリゴマーが前記プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に該インスリンポリペプチドのリジン残基で結合している請求項24または25に記載のコンジュゲート。
- 前記インスリンポリペプチドはインスリンであり、前記リジン残基がインスリンのB29位にある請求項24または25に記載のコンジュゲート。
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