JP2006515579A - ナトリウム排泄増加性化合物、結合体、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年11月26日付けで出願された米国仮出願出願番号60/429,151に基づいており、また優先権を主張するものであり、その内容全体を引用してここに組入れる。
本発明は、NIH Grant #R43HL074529−01により支持されている研究プロジェクトの下に政府の支持をもってなされた。米国政府は、この特許に一定の権利を有する。
本発明は、ナトリウム排泄増加性化合物結合体(natriuretic compoud conjugate)および種々のナトリウム排泄増加性化合物、ならびに充血性心臓病およびこの疾患に関連する状態の処置におけるこれらの使用に関する。一例として、本発明による組成物は医薬として活性なナトリウム排泄増加薬およびプロドラッグを提供し、これらは経口、鼻、静脈内または皮下投与に適する製剤として使用することができる。本発明はまた、ナトリウム排泄増加性化合物結合体の製造方法、およびこれらを含有する組成物、ならびにこれらの結合体および化合物の使用方法を提供する。一例として、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、NPR−A結合部分、少なくとも1個の修飾部分結合部位を含有するナトリウム排泄増加性ペプチドを包含し、また修飾部分結合部位に結合される少なくとも1個の修飾部分を含有する。或る態様において、この化合物結合体は、天然ナトリウム排泄増加性ペプチドの薬理学的活性を保有し、また増強された特性、例えば改良された生体利用性、タンパク質分解活性に対する増強された耐性、および/または血流中で延長された活性を有する。別の態様において、この化合物結合体は加水分解性プロドラッグとして提供され、このプロドラッグは天然ナトリウム排泄増加性ペプチドに比較し、プロドラッグ形態で減少された薬理学的活性を有するが、このプロドラッグはインビボで加水分解されると、活性ナトリウム排泄増加性化合物を放出することができる。
心臓血管系疾病は、性別または民族に関係なく米国における主導的死亡原因を構成する。これらの病気の中で、充血性心不全症(CHF)は広く増加し続けている唯一の疾病である(MassieおよびShah、1997;PackerおよびCohn、1999)。アメリカン心臓協会(American Heart Association)によれば、1979年から1999年までに、多くの病院が病院からの退院数およびCHFによる死亡数の両方がほぼ2.5倍に増加している。現時点で、約5百万人のアメリカ人がCHFを有するものと診断されており、また年間約550,000人に新しい介護が生じている(American Heart Association,2001)。この生命を脅かす状態は、多大の経済的衝撃を随伴する。実際に、単独で最大の医療出費が存在する(Kayser,2002)。CHFを処置するための直接的および間接的経費は$56百万ほど高いものと推定されている(Hussar,2002)。HF処置のための病院の経費は、全部の形態の複合癌にかかわる経費の2倍よりも多い(O′ConnellおよびBristow,1994)。
本発明は広義には、変異形態および修飾形態の数種の天然産生ナトリウム排泄増加性ペプチド、タンパク質、類縁体およびこれらのナトリウム排泄増加性ペプチドの化学的結合体を包含し、これらは、それらの天然産生対応物質に優る利点を有する。一例として、これらの利点の一つは、タンパク質分解性分解に対する増大した耐性、血流中における改善された存続時間、および/または細胞膜障壁を横切る改善された横断能力を包含する。
別段の定義がなされていないかぎり、本明細書で使用されている全部の技術的および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者によって共通して理解される意味と同一の意味を有する。本明細書の本発明の説明で使用されている用語は、特定の態様を説明するためのものであって、本発明を制限しようとするものではない。読者に都合がよいように、ヘッダーを使用するが、これもまた、本発明を制限しようとするものではない。本明細書に記載の全部の刊行物、特許出願、特許およびその他の引用文献は、それらのブランド名によってここに引用されているいずれの商品名の医薬を包括的挿入するものとして、それら全体を引用してここに組入れる。
A=ala=アラニン nle=ノルロイシン
R=arg=アルギニン cha=シクロヘキシルアラニン
N=asn=アスパラギン A*=har=ヘモアルギニン
D=asp=アスパラギン酸 orn=オルニチン
C=cyc=システイン pen=ペニシラミン
Q=gln=グルタミン phg=フェニルグリシン
E=glu=グルタミン酸 mpa=メルカプトプロピオン酸
G=gly=グリシン a=ala*=Dアラニン
H=hrs=ヒスチジン C*=ヘモシステイン
I=ile=イソロイシン
L=leu=ロイシン
K=lys=リジン
M=met=メチオニン
F=phe=フェニルアラニン
P=pro=プロリン
S=ser=セリン
T=thr=スレオニン
W=trp=トリブトファン
Y=tyr=チロシン
V=val=バリン
本発明の或る態様に従うナトリウム排泄増加性化合物結合体は、ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターA結合性部分(NPR−A)、少なくとも1個の修飾部分結合部位および少なくとも1個の上記修飾部分結合部位に結合している修飾部分を含有するナトリウム排泄増加性化合物を包含する。上記ナトリウム排泄増加性化合物に結合体の一部として結合されている修飾部分によって、このナトリウム排泄増加性化合物結合体は本明細書に記載の修飾部分を含有していない天然ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、変更された親水性物性を有することができる。例として、また制限するものではないものとして、また本明細書にさらに充分に記載されているように、この修飾部分はいずれか種々の大きさ、形状、置換および配置の形態をとることができる。
本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体は、ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプター、例えばNPR−Aのための結合部位、およびそこに修飾部分をカプリングさせるための結合部位を有するナトリウム排泄増加性化合物を含有する。
ナトリウム排泄増加性化合物は天然ナトリウム排泄増加性ペプチド、例えばいずれかの種、例えばヒト、イヌおよびラットからの、例えばANP、BNP、CNPまたはDNPのアミノ酸配列を有することができる。好適天然ナトリウム排泄増加性ペプチドはヒトBNP、ラットBNP、イヌBNPまたはhANPである。天然配列はまた、プロ−ナトリウム排泄増加性ペプチドおよびプレ−プロペプチドを包含することができる。
ナトリウム排泄増加性化合物はまた、天然ナトリウム排泄増加性ペプチドの生物学的活性類縁体(ナトリウム排泄増加性類縁体)であることができる。一例として、生物学的活性類縁体は、元の化合物の生物学的活性を消失しない切断(truncation)、欠失、挿入、置換、置き換え、側鎖エクステンション、および融合タンパク質またはこれらの組合せを有する天然ナトリウム排泄増加性化合物であることができる。好ましくは、この類縁体は天然または人工NPR−A結合部分を含有し、またNPR−A結合にかかわる活性を部分的にまたは全体的に保有する。
CFGRXMDRISSSSGLGC(配列番号:2)
(ここで、X1はリジンであり、X2は1〜4個のアミノ酸である)。X2は、S、SS、SSS、SSSS、K、KS、KSSまたはKSSSであることができる。KがX2として、またはX2の配列の一部として含有されている場合、修飾部分結合部位である。
X1−CFGRX3MDRISSSSGLGC−X2(配列番号: )
X1MVQGSGC1FGRX2MDRISSSSGLGC2X3(配列番号: )
(ここで、X1、X2およびX3はそれぞれ、LysおよびLys以外のアミノ酸からなる群から独立して選択され、およびX1、X2およびX3の少なくとも1個はLysであり、およびX1、X2およびX3の少なくとも1個はLys以外のアミノ酸である;および
C1およびC2はシステインであり、ジスルフィド結合によってカプリングさせることができる)。未結合ペプチド類縁体はまた、本発明の態様であることは明白である。
CFGRX1MDRISSSSGLGCX2(配列番号: )
(ここで、X1およびX2の少なくとも一方は、修飾部分にカプリングされている修飾部分結合部位を含有するアミノ酸であり、他方はいずれか別のアミノ酸または未結合Lysである)。一態様において、X1はその側鎖で修飾部分にカプリングされているLysであり、およびX2は別種のアミノ酸、例えばGlyまたはArgである。別様に、X2はその側鎖で修飾部分にカプリングされているLysであり、およびX1は別種のアミノ酸、例えばGly、Argまたはリジン以外のアミノ酸である。別の態様において、X1はその側鎖で修飾部分にカプリングされているLysであり、およびX2は未結合Lysである。別様に、X2はその側鎖で修飾部分にカプリングされているLysであり、およびX1は未結合Lysである。未結合ペプチドがまた、本発明の態様であることは明白である。
ナトリウム排泄増加性化合物はまた、2個または3個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を順に有する、および場合により、各ナトリウム排泄増加性化合物単位間にスペーサー配列を含有するマルチペプチドであることもできる。これらの化合物はまた、場合により、ナトリウム排泄増加性化合物の末端のどちらか、または両方にリーダーおよび/またはエクステンション配列を含有することができる。例えば、例として、また制限するものではないとして、また制限を伴わないものとして、各マルチペプチドの構造および/または式は、下記構造を有することができる:NP−[NP]n;NP−[スペーサー−NP]n;リーダー−[スペーサー−NP]n;リーダー−[スペーサー−NP]n−エクステンション、
NP−[NP]n;
NP−[スペーサー−NP]n;
リーダー−NP−[NP]n;
リーダー−NP−[スペーサー−NP]n;
リーダー−[スペーサー−NP]n;
リーダー−[スペーサー−NP]n−エクステンション;
リーダー−NP−[スペーサー−NP]n−エクステンション;
nは、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であることができる;
NPは、ナトリウム排泄増加性ペプチドまたはナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体である;
修飾部分は、ナトリウム排泄増加性化合物、例えばBNPペプチド化合物を修飾する部分であり、本明細書に記載の望ましい性質を化合物に付与する。一例として、修飾部分は種々の環境(例えば、GI器官、および/または血流)におけるナトリウム排泄増加性化合物の分解速度を減少させることができ、これによりこのような環境において、修飾部分が存在しない場合における分解に比較し、修飾形態のナトリウム排泄増加性化合物は分解量が少ない。好適修飾部分は、ナトリウム排泄増加性化合物が親のナトリウム排泄増加性化合物の生物学的活性を治療的に重大なパーセンテージで保有することを可能にするものである。
ナトリウム排泄増加性化合物に結合し、親のナトリウム排泄増加性化合物の安定性、溶解性および/または生物学的活性が変更されている本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体を形成する多くの部分が存在する。例は、親水性ポリマーまたはオリゴマー、両親媒性ポリマーまたはオリゴマー、および親油性ポリマーまたはオリゴマーを包含する。
親水性部分は、当業者に理解されているように種々の親水性部分であることができ、これらに制限されないものとして、ポリアルキレングリコール部分、別種の親水性ポリマー、糖部分、ポリソルベート部分、およびその組合せを包含する。
ポリアルキレングリコールは、反復するアルキレングリコール単位を有する化合物である。或る態様において、この単位は全部が同一である(例えば、ポリエチレングコールまたはポリプロピレングリコール)。別の態様において、このアルキレン単位は、相違している(例えば、ポリエチレン−プロピレングリコール、またはプルロニクス(PLURONICS)(登録商品名))。これらのポリマーは、ランダムコポリマー(例えば、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとが共重合している場合)、または分枝鎖状またはグラフトコポリマーであることができる。
本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物は、当業者にとって公知のように、糖部分を含有することができる。一般に、糖部分は、少なくとも1個のサッカロース基の炭水化物生成物である。代表的糖部分は、これらに制限されないものとして、グリセロール基、モノ−、ジ−、トリ−およびオリゴサッカライド、およびポリサッカライド、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロース、およびポリサッカライドガムを包含する。特定のモノサッカライドは、C6およびそれ以上(好ましくは、C6〜C8)の糖、例えばグルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、およびセドヘプタロースを包含する;ジ−およびトリ−サッカライドは、2個または3個のモノサッカライド単位を有する分子(好ましくは、C5〜C8)、例えばスクロース、セロビオース、マルトース、ラクトース、およびラフィノースを包含する。糖部分を用いる結合は、米国特許5,681,811、同5,438,040および同5,359,030に記載されている(これらの全記載を引用してここに組入れる)。
ポリソルベート部分は、当業者に理解されているように、種々のポリソルベートであることができ、制限するものではないものとして、ソルビタンエステルおよびポリオキシエチレンにより誘導体化されたポリソルベートを包含する。ポリソルベート部分を使用する結合体は米国特許5,681,811、同5,438,040および同5,359,030に記載されており、これらの全記載を引用してここに組入れる。
或る態様において、生体適合性水溶性ポリカチオン性部分を使用することができる。生体適合性水溶性ポリカチオン性部分は、例えば側鎖基として結合しているプロトン化ヘテロ環を有するいずれかのポリマーを包含する。「水溶性」は、ポリマー全体が水性溶液、例えば緩衝された塩類溶液または共溶媒として添加された少量の有機溶媒を含有する緩衝された塩類溶液に20〜37℃の温度で溶解することを意味する。或る態様において、このポリマーそれ自体は、水性溶液それ自体に充分に溶解しないが、水溶性ポリマー、例えばPEG鎖をグラフトすることによって溶液にされる。この例は、ポリマー幹鎖またはポリマー側鎖のどちらかにアミン基を有するポリアミン、例えばポリ−L−Lys、およびポリ(D−Lys)、ポリ(オルニチン)、ポリ(Arg)およびポリ(ヒスチジン)を包含する天然または合成アミノ酸の陽電荷に帯電させた別種のポリアミノ酸またはアミノ酸混合物、ならびに非ペプチドポリアミン、例えばポリ(アミノスチレン)ポリ(アミノアクリレート)、ポリ(N−メチルアミノアクリレート)、ポリ(N−エチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N−ジメチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N−ジエチルアミノアクリレート)、ポリ(アミノメタアクリレート)、ポリ(N−メチルアミノメタアクリレート)、ポリ(N−エチルアミノメタアクリレート)、ポリ(N,N−ジメチルアミノメタアクリレート)、ポリ(N,N−ジメチルアミノメタアクリレート)、ポリ(エチレンイミン)、四級アミンのポリマー、例えばポリ(N,N,N−トリメチルアミノアクリレート)、ポリ(メチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド)、および天然または合成ポリサッカライド、例えばキトサン(chitosan)を包含する。
別種の親水性ポリマーもまた、使用することができる。この例は、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、例えばポリ(オキシエチル化グリセロール)、ポリ(オキシエチル化ソルビトール)、およびポリ(オキシエチル化グルコース);ポリ(ビニルアルコール)(“PVA”);デキストラン;炭水化物ベースポリマーなどを包含する。これらのポリマーは、直鎖状または分枝鎖状の上記ポリマーのモノマーを基材とするホモポリマー、もしくはランダムまたはブロックコポリマーおよびターポリマーであることができる。
或る種の親水性ポリマーは、強力に有用な生体接着性物性を有するように見える。このようなポリマーの例は、例えばMathiowitz等に対する米国特許No.6,197,346に記載されている。これらのカルボキシル基含有ポリマー(例えば、ポリ(アクリル酸))は、生体接着性物性を示し、また本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物と容易に結合する。分解するとカルボン酸基を露呈する生体腐食性ポリマー、例えばポリ(ラクチド−コ−グリコライド)、ポリアンハイドライド、およびポリオルトエステルはまた、生体接着性ポリマーである。これらのポリマーは胃腸器官へのナトリウム排泄増加性化合物の放出に使用することができる。ポリマーが分解すると、これらはカルボン酸基を露呈することができ、これにより胃腸器官に強力に接着できるようになる。これらはまた、ナトリウム排泄増加性化合物結合体の放出にも役目を果たすことができる。
或る態様において、修飾部分は親油性部分を包含する。この親油性部分は、当業者に理解されているように、種々の親油性部分であることができ、これらに制限されないものとして、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アリールアルキル基、アルキルアリール基、脂肪酸基、アダマンタンチルおよびコレステリル、ならびに親油性ポリマーおよび/またはオリゴマーを包含する。
或る態様において、修飾部分は両親媒性基を包含する。かなりのポリマーおよびオリゴマーは両親媒性である。これらはしばしば、親水性基および親油性基を含有するブロックコポリマー、分枝鎖状ポリマーまたはグラフトポリマーであり、直鎖状、分枝鎖状またはグラフトポリマーまたはコポリマーなどのオリゴマーおよび/またはポリマーの形態であることができる。
修飾部分は、1個または2個以上の直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコール基および/または1個または2個以上の直鎖状または分枝鎖状の置換または未置換アルキル基を含有する直鎖状または分枝鎖状ポリマー分子であることができる。しかしながら、或る態様において、この修飾部分は特に、アルキル基からなるものではなく、また別の態様において、この修飾部分は特に、アルカン基からなるものではない。ポリアルキレングリコール基は、或る態様において、ポリアルキレングリコール付属単位2〜25個、さらに好ましくは2〜20個、理想的には2〜15個を含有する。このポリアルキレングリコール基は、或る態様において、PEGを包含する。アルキル基は、或る態様において、好ましくは炭素原子2〜20個、さらに好ましくは2〜15個、さらに好ましくは2〜10個を有する。アルキル基は好ましくしは、アルカン分子である。
式中、各Cは、独立して選択され、m個の炭素を有するアルキル基であり、およびmは1〜20、好ましくは2〜15、さらに好ましくは2〜10であり;および各PAGは独立して選択され、n個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびnは2〜25、好ましくは2〜18、さらに好ましくは2〜16であり;各Xは独立して選択され、PAGをCにカプリングさせる結合基、好ましくは−C−、−O−、−C(O)−、−NH−、−NHC(O)−、または−C(O)NH−である。式Iおよび式IIIの場合、および或る態様において、Cm−X基は存在しておらず、またPAGn基は末端に−OH基または−OCH3基を有する。一例として、PAGは、付属単位1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個または20個を有するメトキシ末端またはヒドロキシ末端PEGであることができる。
或る態様において、修飾部分は塩形成性部分を含有する。この塩形成性部分は、当業者に理解されているように、種々の適当な塩形成性部分であることができ、これらに制限されないものとして、カルボキシレートまたはアンモニウムを包含する。或る態様において、修飾部分が塩形成性部分を含有する場合、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、塩形態で提供される。これらの態様において、ナトリウム排泄増加性化合物結合体は、当業者に理解されているように、適当な医薬として許容される対向イオンを随伴する。このようなイオンは、これらに制限されないものとして、塩素、臭素、ヨウ素、ホスフェート、アセテート、カーボネート、スルフェート、トシレートおよびメシレートなどの陰イオン、またはナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウムおよびアンモニウムなどの陽イオンを包含する。
本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物結合体に比較し、相違するレベルの生物学的活性を有することができる。或る態様において、ナトリウム排泄増加性化合物は、或る程度の、または全部の未修飾状態の活性を保有するが、修飾部分との結合の程度、分子中の結合部位の選択および修飾部分の選択のような因子の観点から、インビボ分解に対して低い感受性を有し、従って、増大した血漿半減期を有する。一例として、本発明によるナトリウム排泄増加性化合物は、当該ナトリウム排泄増加性化合物構造の1、2、3、4、5または6以上の部位を、この部位における修飾部分の会合を促進するのに適する相当する結合部位で修飾部分を含有するように修飾することができる(すなわち、修飾部分結合)。一例として、このような適当な結合部位はアミノ酸残基、例えばLysアミノ酸を含有することができる。
合成の具体例は以下に示す例で説明する。反応条件(例えば、モル比、溶媒混合物および/またはpH)は、公知原則に従い制御することができる。一例として、Lysのアミノ官能性基における結合は、反応溶液のpHをLysのpKa以下に維持することによって抑制することができる。
本明細書に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体を含有する医薬組成物を調製することができる。このような組成物は代表的に、医薬上で許容される担体と組合わされているか、または担体中に混合されている修飾ナトリウム排泄増加性化合物を含有する。この担体は当該医薬組成物中のいずれか別の成分に適合でき、また患者に対し有害であってはならないという観点から許容されるものでなければならない。担体は固体または液体、もしくはその両方であることができ、また単位剤型製剤として、例えば錠剤として、プロドラッグを用いて調剤すると好ましく、このような単位剤型製剤は、ナトリウム排泄増加性化合物結合体を約0.01または0.5重量%から約95重量%または99重量%までの量で含有する。医薬組成物は、これらに制限されないものとして、1種または2種以上の補助成分を包含する諸成分を混合することを包含する調剤学で周知の技術のいずれかによって調製することができる。
本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体および医薬製剤は、未修飾(未結合)生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、1種または2種以上の改善された特性を示す。修飾部分の付与は当該ナトリウム排泄増加性化合物を種々の環境(例えば、胃腸器官(GT器官))における分解から防御することができ、従って、このような環境において、修飾部分の不存在下に分解される未修飾形態の分解に比較し、分解は少ない。特に、本発明による或る修飾形態は全身的循環系中に医薬として許容される量の生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物が最終的に付与されるような用量で経口投与することができる。すなわち、充分な量のナトリウム排泄増加性化合物がGI器官で生き残ることができ、ナトリウム排泄増加性化合物がcGMPの産生の引き金となるのに充分な医薬活性量で全身に存在するように血流中に入ることが可能にされる。好ましくは、この修飾部分の付加は、経口投与された場合、経口投与された未結合ナトリウム排泄増加性化合物の血流中への放出に比較し、経口投与された未結合ナトリウム排泄増加性化合物の血流中への放出を改善する。さらに好ましいこととして、経口投与されたナトリウム排泄増加性化合物結合体の活性化合物の血流中への放出の改善は、経口投与された未結合の親のナトリウム排泄増加性化合物である活性化合物の血流中への放出の少なくとも2倍である。さらにまた好ましいこととして、経口投与されたナトリウム排泄増加性化合物結合体である活性化合物の血流中への放出の改善は、経口投与された未修飾(未結合)生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物である活性化合物の血流中への放出の少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、または500倍である。従って、本発明によるナトリウム排泄増加性化合物結合体の投与は、未修飾生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、生物学的活性ナトリウム排泄増加性化合物のより大きい生体利用性をもたらすことができる。経口経路の投与は、別種のCHF治療が随伴する病院経費を減少させることができ、および/またはhBNPの初期段階および慢性CHF、ならびに急性CHFを包含するCHFに対する治療的使用を拡大することができる。
血管拡張薬−動脈および静脈を膨張させ、血流を増加させる。
イノトロッピック薬−心臓筋肉の収縮力を増加させる。
強心性医薬−心臓の収縮力を増加させ、また心拍数を減少させる。
アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬−血管収縮性アンギオテンシンIIの、その合成の最終段階における産生を抑制する。
カルシウムチャンネル遮断薬−カルシウム流入を抑制し、血管および平滑筋弛緩をもたらす。
ニトレート−平滑筋を弛緩させ、静脈および動脈を拡張させる。
ベータ−遮断薬−カテコールアミンの作用をブロックし、心臓に対するストレスを少なくし、収縮力および収縮速度を低下させる。
本発明によるナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体は、天然ペプチドが随伴する心臓血管系、腎臓および/または内分泌系に対する効果を誘発させることができる。細胞に基づく分析法を使用し、結合体がヒトナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターAの熟達したアゴニストであり、cGMPの適度の産生を導くことを証明することができる。生化学的分析法を使用し、結合体が望ましい生体利用性を提供することを証明することができる。確立されたイヌモデルにおいて、先導的結合体を試験することができる。所望の候補薬物をラットおよびイヌにおいて詳細な薬物動態学的、薬理学的、および毒性学的試験に付すことができる。本発明の態様に従うBNP結合体は初期段階、慢性および急性心不全症の処置に有用である。
この化合物において、PAGはn個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびnは2〜25であり;XはOまたはNであり;および各oは独立して選択され、1〜15である。別様に、PEG、mおよびXは、式IIについて上記されているとおりである。
式中、PAGはn個の付属単位を有するポリアルキレングリコール分子であり、およびnは2〜25であり;XはOまたはNであり;および各oは独立して選択され、1〜15である。別様に、PEG、mおよびXは、式IIについて上記されているとおりである。
式中、各Cは、独立して選択され、m個の炭素を有するアルキル基であり、およびmは1〜20であり;および各PAGは独立して選択され、n個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、およびnは2〜25であり;各Xは独立して選択され、結合基であり;およびoは1〜15である。別様に、C、m、PEG、Xおよびnは、式IIIについて上記されているとおりである。
式中、各Cは、独立して選択され、m個の炭素を有するアルキル基であり、およびmは1〜20であり;および各PAGは独立して選択され、n個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、およびnは2〜25であり;各Xは独立して選択され、結合部分であり;およびoは1〜15である。別様に、C、m、PEG、Xおよびnは、式IIIについて上記されているとおりである。
(式中、C、m、X、PEGおよびnは式Iについて上記されているとおりである)
で表わされる化合物の製造方法が提供される。
Cm−X−PAGn−OH
で表わされる化合物を、塩基および溶媒の存在下に、式:
で表わされる化合物と反応させ、生成物「a」:
を生成し、この生成物を、ルイス酸および溶媒の存在下に、式:
Cm−X−PAGn−OH
で表わされる化合物と反応させ、式:
で表わされる化合物を生成する工程を包含するものとして説明することができる(上記各式において、C、m、X、PAGおよびnは式Iについて上記されているとおりである)。Clは別のハロゲン、例えばBrにより置き換えることができる。一例として、塩基はまた、NaHに特定することができ、また溶媒はテトラヒドロフランに特定することができる。この方法に用いられるルイス酸はまた、BF3OEt2に特定することができる。
(式中、oは式Iについて上記に定義されているとおりである)
で表わされる化合物を、溶媒中で、式:
HO−PAGn−X
(式中、Xは−NHまたは−OHである)
で表わされる化合物と反応させ、式:
(式中、PAG、n、Xおよびoは式IIについて上記に定義されているとおりである)
で表わされる化合物を生成する工程を包含する。
(式中、PAG、n、Xおよびoは式IIについて上記に定義されているとおりである)
を、活性化剤、例えばジスクシンイミジルカーボネート、パラニトロクロロホーメート、ホスゲンおよびN−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化する工程を包含するものとして説明することができる。
(式中、oは式IIIについて上記に定義されているとおりである)
で表わされる化合物と反応させる工程を包含するものとして説明することができる。この方法の好適態様において、塩基はK2CO3であり、および溶媒は水性および/または有機溶媒である。
下記例は、本発明の代表的典型を示すものである。下記例の或る態様は、本発明の実施に最良典型の証明に見出される技術および方法を用いて説明される。本記載および本発明が関連する技術における公知一般レベルの観点から、当業者にとって、下記例が例示しようとするのみのものであり、また本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変化、修正および変更を採用することができることは明白である。
ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、I(0.202g、0.4mmol)をアセトニトリル(5ml)に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート(DSC、0.157g、0.6mmol)を添加した。次いで、トリエチルアミン(0.12g、1.2mmol)を滴下添加し、10分後、反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜16時間の撹拌後、粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和NaHCO3(10ml)に溶解し、酢酸エチル(2x20ml)により洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、次いで蒸発乾燥させた。この粗製生成混合物を、カラムクロマトグラフイにより精製し(シリカ、EtOAc/メタノール、10:1)、標題の化合物II 0.258g(81%)を油状物として得た。ESI MS:m/e 648.84(M+H)+。
四塩化炭素100ml中の2−ヘキシル−デカン酸I(10gm、38.9mmol)の溶液に、チオニルクロライド(5.5gm、46.6mmol)を30分かけて滴下添加した。添加完了後、この反応混合物を3時間にわたり還流させた。反応が完了した後、四塩化炭素を蒸留により分離し、この反応混合物を濃縮し、粗製酸クロライドを得た。この粗製酸クロライドを分別蒸留により精製し、IIを清明な液体として得た(10.1gm、91%)。ESI MS:m/e 275.87(M+H)+。
エタノール(300ml)中の単分散16−ブロモ−ヘキサデカン酸(15.3g、45mmol)の溶液に、H2SO4(1.5ml、31.25mmol)を添加し、次いで反応混合物を48時間にわたり撹拌した。この粗製反応混合物を水で稀釈し、次いでジクロロメタン(2x300ml)により抽出した。この有機層を次いで、H2O(300ml)、飽和NaHCO3(2x300ml)、H2O(300ml)により洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、次いで蒸発乾燥させ、オフホワイト色固形物II(16.03g、収率98%)を得た。
単分散mPEG−C12−酸I(500mg、0.78mmol)を無水メチレンクロライド20ml中に溶解し、次いで無水メチレンクロライド中のN−ヒドロキシスクシンイミド(160mg、1.39mmol)および1−エチル−3−(3′−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・HCl(EDCH・HCl、233mg、1.390mmol)の溶液を添加した。この反応混合物を24時間にわたり撹拌し、次いで1N HCl、水により洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、濾過し、次いで濃縮した。この粗製生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し(シリカ、勾配溶出:CHCl3中2〜5%メタノール)、単分散活性化MPEG7−C16 VIを清明な油状物として得た(370mg、62%)。
単分散分枝鎖状MPEG1 I(200mg、2.63mmol)をアセトニトリル(20ml)に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート(DSC、II、1.00g、3.94mmol)を添加した。次いで、トリエチリアミン(0.399g、3.94mmol)を滴下添加し、10分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜16時間にわたり撹拌した後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いでNaHCO3(20ml)に溶解し、酢酸エチル(2x50ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイ(シリカ、EtOAc/MeOH、10:1)に付し、固形物IIIを得た(0.346g、収率60%)。ESI MS:m/e 218.09(M+H)+。
単分散分枝鎖状C6−PEG1 I(100mg、0.625mmol)をアセトニトリル(10ml)に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート(DSC、II、0.240g、0.936mmol)を添加した。次いで、トリエチルアミン(0.095g、0.936mmol)を滴下添加し、10分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜16時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和NaHCO3(10ml)に溶解し、酢酸エチル(2x20ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、EtOAc/MeOH、10:1)、オフホワイト色固形物IIIを得た(0.146g、収率78%)。ESI MS:m/e 302.29(M+H)+。
単分散分枝鎖状MPEG2 I(470mg、3.91mmol)をアセトニトリル(20ml)に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート(DSC、II、1.50g、5.87mmol)を添加した。次いで、トリエチルアミン(0.594g、5.87mmol)を滴下添加し、10分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜16時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和NaHCO3(20ml)に溶解し、酢酸エチル(2x50ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、EtOAc/MeOH、10:1)、固形物IIIを得た(0.632g、収率62%)。ESI MS:m/e 262.23(M+H)+。
単分散分枝鎖状C12−PEG2 I(200mg、0.69mmol)をアセトニトリル(10ml)に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート(DSC、II、0.265g、1.035mmol)を添加した。次いで、トリエチルアミン(0.104g、1.035mmol)を滴下添加し、10分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜16時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和NaHCO3(10ml)に溶解し、酢酸エチル(2x20ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、EtOAc/MeOH、10:1)、油状物IIIを得た(0.247g、収率83%)。ESI MS:m/e 430.50(M+H)+。
単分散分枝鎖状MPEG3 I(200mg、1.21mmol)をアセトニトリル(20ml)に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート(DSC、II、0.468g、1.82mmol)を添加した。次いで、トリエチルアミン(0.184g、1.82mmol)を滴下添加し、10分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜16時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和NaHCO3(20ml)に溶解し、酢酸エチル(2x50ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、EtOAc/MeOH、10:1)、固形物IIIを得た(0.206g、収率55%)。ESI MS:m/e 306.11(M+H)+。
単分散分枝鎖状C6−PEG3 I(200mg、0.80mmol)をアセトニトリル(20ml)に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート(DSC、II、0.309g、1.209mmol)を添加した。次いで、トリエチルアミン(0.122g、1.209mmol)を滴下添加し、10分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜16時間の撹拌後、この粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和NaHCO3(10ml)に溶解し、酢酸エチル(2x20ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、EtOAc/MeOH、10:1)、油状物IIIを得た(0.203g、収率64%)。ESI MS:m/e 390.40(M+H)+。
カリウム tert−ブトキシド(3.64g、32.4mmol)をTHF250ml中に溶解した。THF10ml中のMPEG6アルコール(9.58g、32.3mmol)を添加した。この溶液を2時間にわたり撹拌した。市販エチル6−ヒドロキシ−ヘキサノエートから製造されたメシレート(7.0g、29.4mmol)をTHF15mlに溶解し、次いでPEG溶液に添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。反応をMeOH25mlにより停止させ、次いでセライトの短いパッドに通して濾過した。この濾過液を減圧濃縮し、この残留物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し(EtOAc/2%MeOH)、Iを3.19g(25%)の量で得た。ESI MS:m/e 461.07(M+Na)+。
MPEG6アルコール(10.0g、33.7mmol)を乾燥CH2Cl2 40mlに溶解し、生成する溶液を氷浴中で0℃に冷却させた。TEA(5.64ml、40.5mmol)を添加し、次いでメタンスルホニルクロライド3.13ml(40.5mmol)を滴下添加した。この反応混合物を0℃において30分間にわたり撹拌し、次いで氷浴から分離し、室温に戻し、次いで一夜にわたり撹拌した。この反応混合物を追加のCH2Cl2により稀釈し、次いで飽和NaHCO3および水により洗浄した。この有機層をMgSO4上で乾燥させ、次いで減圧濃縮し、MPEG6メシレート、I 12.4g(98%)を得た。
本例は、本発明によるオリゴマー状分子を活性化できる方法を説明するものである。
アルキル−PEG−OH、I(0.4mmol、1当量)をアセトニトリル(5ml)に溶解し、次いでジスクシンイミジルカーボネート(DSC、0.6mmol、1.5当量)を添加した。次いで、トリエチルアミン(1.2mmol、1.5当量)を滴下添加し、10分後、この反応混合物は清明になった。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。〜16時間の撹拌後、粗製反応混合物を蒸発乾燥させ、次いで飽和NaHCO3(10ml)に溶解し、酢酸エチル(2x20ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、EtOAc/MeOH、10:1)、活性化オリゴマーIIを得た。
MPEG−アルキル−酸I(0.544mmol、1.0当量)を無水メチレンクロライド15mlに溶解し、次いで無水メチレンクロライド中のN−ヒドロキシスクシンイミド(0.816mmol、1.5当量)および1−エチル−3−(3′−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・HCl(EDCl・HCl、0.816mmol、1.5当量)の溶液を添加した。この反応混合物を数時間にわたり撹拌し、次いで1N HCl、水により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、次いで濃縮した。この粗製生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し(シリカ、勾配溶出:CHCl3中2〜5%メタノール)、活性化MPEG−アルキル−酸、IIを得た。
1. テトラエチレングリコールモノメチルエーテル(14.0g、67mmol)をテトラヒドロフラン(90ml)に溶解し、次いでNaH(1.77g、74mmol)を少しづつ添加し、この反応混合物を2時間にわたり撹拌した。次いで、エピクロロヒドリン(26.3ml、0.34mol)を滴下添加し、この反応混合物を室温で48時間にわたり撹拌した。この粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、次いでCH2Cl2(250ml)により洗浄した。この濾液をH2O(2x250ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル)、1を清明な油状物として得た(10.15g、収率57%)。
2. テトラエチレングリコールモノメチルエーテル(7.96g、0.038mol)および1(10.l、0.038mol)をCH2Cl2(100ml)に溶解し、次いでBF3・OEt2(0.48ml、0.0038mol)を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をCH2Cl2(200ml)で稀釈し、飽和NaHCO3(300ml)、H2O(300ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル/MeOH、10:1)、2を清明な油状物として得た(4.5g、収率25%)。
3. 4−ニトロクロロホーメート(2.87g、14.3mmol)および2(4.5g、9.5mmol)をCH2Cl2(45ml)に溶解した。10分間の撹拌後、TEA(2.1ml、15mmol)を添加し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をCH2Cl2(130ml)により稀釈し、1M HCl(175ml)、H2O(175ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル/MeOH、15:1)、3を帯黄色油状物として得た(2.38g、収率40%)。
4. 6−アミノカプロン酸(0.126g、0.96mmol)およびK2CO3(0.221g、1.6mmol)をH2O(DL、5ml)に溶解した。次いで、3(0.5g、0.8mmol)をTHF(0.7ml)に溶解し、次いで滴下添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をH2O(20ml)により稀釈し、HClによりpH〜1に酸性化し、CH2Cl2(2x25ml)で洗浄し、この有機層を乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、CHCl3/MeOH、15:1)、4を清明な油状物として得た(0.428g、収率85%)。
5. 方法IIを用いる活性化:4(0.40g、0.64mmol)、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.088g、0.77mmol)、EDCI(0.160g、0.83mmol)およびCH2Cl2(5ml)。カラムクロマトグラフイ(シリカ、酢酸エチル/MeOH、10:1)に付し、5を清明な油状物として得た(0.320g、収率69%)。
1. トリエチレングリコール(30g、0.2mol)をNaOHの溶液(H2O 8ml中8g)に溶解し、次いで10分間にわたり撹拌した。次いで、ベンジルクロライド(7ml、0.062mol)を添加し、この反応混合物を100℃に加熱し、次いで一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物を飽和NaCl(500ml)により稀釈し、CH2Cl2(2x400ml)で洗浄し、この有機層を乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル−酢酸エチル/MeOH、10:1)、1を帯黄色油状物として得た(9.87g、収率67%)。
2. CH2Cl2(50ml)中の1(9.87g、0.041mol)の溶液に、TEA(7.1ml、0.054mol)を添加した。この溶液を次いで、氷浴中で0℃に冷却させ、次いでCH2Cl2(10ml)に溶解したメタンスルホニルクロライド(3.9ml、0.049mol)を滴下添加した。この反応混合物を0℃において0.5時間、次いで室温で4時間、撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、CH2Cl2(100ml)により洗浄し、この濾液を飽和NaHCO3(150ml)、H2O(150ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させ、2を黄色油状物として得た(11.06g、収率85%)。
3. テトラエチレングリコール(7.32g、0.038mol)をテトラヒドロフラン(140ml)に溶解し、次いでNaHを0.5時間かけて少しづつ添加し、次いでこの反応混合物をさらに1時間にわたり撹拌した。次いで、2(6.0g、0.019mol)をCH2Cl2(20ml)に溶解し、滴下添加し、次いでこの反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、CH2Cl2(100ml)により洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成する油状物をCH2Cl2(150ml)に溶解し、H2O(150ml)、飽和NaHCO3(150ml)、H2O(150ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル/MeOH、10:1)、3を黄色油状物として得た(3.83g、収率49%)。
4. 2と同様の方法で製造した:ヘキサノール(6.2ml、0.05mol)、メタンスルホニルクロライド(4.6ml、0.058mol)、TEA(8.6ml、0.065mol)、およびCH2Cl2(60ml)、4を黄色油状物として得た(7.8g、収率86%)。
5. テトラヒドロフラン(160ml)中の3(5.45g、0.13mol)の溶液に、カリウムtert−ブトキシド(1.60g、0.0144mol)を添加し、この反応混合物を1.5時間にわたり撹拌した。次いでテトラヒドロフラン(20ml)に溶解した4(2.59g、0.0144mol)を滴下添加し、この反応混合物を一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、CH2Cl2で洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成する油状物を酢酸エチル(150ml)に溶解し、H2O(2x150ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル)、5を帯黄色油状物として得た(2.40g、収率36%)。
6. 酢酸エチル(16ml)中の5(2.4g、4.8mmol)の溶液に、活性炭上パラジウム10重量%(1.0g)を添加し、この反応容器を隔壁で密封した。H2を含有するバルーンを、針により隔壁内に導入し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、酢酸エチルにより洗浄し、次いで蒸発乾燥させ、6(1.61g、収率82%)を清明な油状物として得た。
7. ホスゲン溶液(トルエン中20%ホスゲン15ml)を−10℃に冷却し、次いでトルエン(5ml)に溶解した6(1.60g、3.9mmol)を滴下添加した。この反応混合物を−10℃で0.5時間、次いで室温で4時間、撹拌した。ホスゲンおよびトルエンを次いで、留去し、生成した油状物を減圧乾燥させ、7を帯黄色油状物として得た。
8. 方法IIを用いる活性化:7(1.65g、0.79mmol)、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.437g、3.8mmol)、TEA(2.7ml、3.8mmol)、およびCH2Cl2(10ml)。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル/MeOH、15:1)、8(1.06g、収率57%)を清明な油状物として得た。
1. 例9.15に示されている方法と同一の方法で製造した:ヘキサノール(18ml、0.15mol)、メタンスルホニルクロライド(12.3ml、0.16mol)、TEA(25ml、0.18mol)、およびCH2Cl2(180ml)。1(23.1g、収率85%)を黄色油状物として得た。
2. テトラエチレングリコール(50.5g、0.26mol)をテトラヒドロフラン(350ml)に溶解し、カリウムtert−ブトキシド(29.2g、0.26mol)を0.5時間かけて少しづつ添加した。この反応混合物をさらに1時間にわたり撹拌し、次いでTHF(50ml)に溶解した1(23.0g、0.13mol)を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、CH2Cl2で洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成した油状物をCH2Cl2(300ml)に溶解し、H2O(2x300ml)により洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル)、2(18.51g、収率51%)を清明な油状物として得た。
3. テトラヒドロフラン(60ml)中の2(10.0g、36mmol)の溶液に、NaH(0.95g、40mmol)を少しづつ添加し、この反応混合物を0.5時間にわたり撹拌した。次いでエピクロロヒドリン(14.1ml、0.34mol)を滴下添加し、この反応混合物を室温で48時間にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、CH2Cl2で洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成した油状物をCH2Cl2(200ml)に溶解し、飽和NaCl(200ml)、飽和NaHCO3(200ml)、H2O(200ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル/ヘキサン、10:1)、3(5.46g、収率45%)を清明な油状物として得た。
4. CH2Cl2(50ml)中の2(4.54g、16mmol)および3(5.46g、16mmol)の溶液に、BF3・OEt2(0.48ml、0.0038mol)を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をCH2Cl2(50ml)により稀釈し、飽和NaHCO3(100ml)、H2O(100ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル−酢酸エチル/MeOH、10:1)、4(2.40g、収率24%)を清明な油状物として得た。
5. 4−ニトロクロロホーメート(1.18g、5.8mmol)および4(2.4g、3.9mmol)をCH2Cl2(25ml)に溶解した。10分の撹拌後、TEA(0.89ml、6.4mmol)を添加し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をCH2Cl2(75ml)により稀釈し、1M HCl(100ml)、H2O(100ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル)、5(1.04g、収率34%)を帯黄色油状物として得た。
6. 6−アミノカプロン酸(0.157g、1.2mmol)およびK2CO3(0.276g、2.0mmol)をH2O(DI、8ml)に溶解した。次いで、5(0.80g、1.0mmol)をTHF(1.0ml)に溶解し、次いで滴下添加した。3を添加し、次いでエタノール(2ml)を添加すると油状小滴物が生成された。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をH2O(30ml)により稀釈し、HClによりpH〜1に酸性化し、CH2Cl2(2x35ml)で洗浄し、その有機層を乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル/MeOH、20:1)、6(0.720g、収率46%)を清明な油状物として得た。
7. 方法IIを用いる活性化:6(0.356g、0.46mmol)、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.063g、0.55mmol)、EDCI(0.115g、0.6mmol)、およびCH2Cl2(3ml)。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル)、7(0.180g、収率45%)を清明な油状物として得た。
1. 例9.15に示されている方法と同一の方法で製造した:エチル6−ヒドロキシヘキサノエート(8.0g、0.05mol)、メタンスルホニルクロライド(4.6ml、0.06mol)、TEA(10ml、0.072mol)およびCH2Cl2(32ml)。1(11.15g、収率93%)を黄色油状物として得た。
2. テトラエチレングリコール(19.1g、0.098mol)をテトラヒドロフラン(190ml)に溶解し、次いでNaH(1.69g、0.071mol)を0.5時間かけて少しづつ添加した。この反応混合物をさらに1時間にわたり撹拌し、次いでテトラヒドロフラン(10ml)に溶解した1(23.0g、0.13mol)を添加した。この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をセライトに通して濾過し、CH2Cl2で洗浄し、次いで蒸発乾燥させた。生成した油状物をCH2Cl2(200ml)に溶解し、飽和NaCl(200ml)、H2O(200ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル/MeOH、25:1)、2(1.60g、収率10%)を清明な油状物として得た。
3. 1M NaOH(6ml)中の2(1.60g、4.7mmol)の溶液を室温で2時間にわたり撹拌した。この粗製反応混合物を飽和NaCl(24ml)により稀釈し、pH〜2に酸性化し、CH2Cl2(2x30ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させ、3(1.08g、収率73%)を清明な油状物として得た。
4. 2,3,4,6−テトラ−O−ピバロイル−β−D−ガラクトスピラノシルアミン(0.836g、1.6mmol)および3(0.50g、1.6mmol)をCH2Cl2(8ml)に溶解した。次いで、EDCI(0.368g、1.92mmol)を添加し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。一夜の撹拌後、反応は不完全であり、従ってEDCI(0.368g、1.92mmol)を添加し、この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌した。粗製反応混合物をCH2Cl2(22ml)により稀釈し、1M HCl(30ml)、H2O(30ml)、飽和NaCl(30ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、次いで蒸発乾燥させた。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル/MeOH)、4(0.397g、収率31%)を粘性油状物として得た。
5. 方法Iを用いる活性化:4(0.397g、0.50mmol)、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.063g、0.60mmol)、TEA(0.10ml、0.75mmol)、およびアセトニトリル(4ml)。カラムクロマトグラフイに付し(シリカ、酢酸エチル)、5(0.256g、収率56%)を粘性油状物として得た。
本例はほとんど全部のクラスのオリゴマー部分、特に非加水分解性オリゴマー、ミクロペジル化オリゴマーおよび加水分解性オリゴマーを含有する修飾ナトリウム排泄増殖性化合物結合体を提供する本発明の有用性を証明するものである。
非加水分解性オリゴマー(クラス1)を用いる30種以上の結合体を合成した。このクラスの結合体の場合、投与される医薬物質はレセプターとして作用する物質である。換言すれば、オリゴマーおよびそのペプチドへの結合は投与時点からクリアランス時点まで一体性を保有した。ペプチドマッピング実験はhBNPのオリゴマーが結合する部位を明らかにした。反応に添加されるオリゴマーの量を変えることによって、生成物分布を示すことができる。見出された優勢モノ結合体は、Lys3で結合していた;この優勢結合体はLys3およびLys4で結合しているオリゴマーを含有していた。反応条件を変更することによって、トリ結合体および/またはテトラ結合体を独占的生成物として形成することができた。トリ結合体は、オリゴマーがLys3、Lys14およびLys27で結合していることを特徴としていた。テトラ結合体はN−末端に四つ目の結合を付加していた。最初に、利用できる全部のモノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−結合体をインビトロ活性試験用に単離した。この活性データに基づき、クラス1オリゴマーを用いた場合、Lys3モノ結合体を目標にした。
Lys14およびLys27がBNPの結合タンパク質に存在しており(またはBNPの結合タンパク質に隣接しており)、これらの部位のミクロペグ(micropeg)結合体は当該ペプチドをさらに充分に結合させることができ、また活性を依然として保有することから、ミクロペジル化オリゴマー(クラス2)を用いる8種の結合体を理論に基づき合成した。両親媒性オリゴマーは消化器官を一体のまま通過し、十二指腸上部における吸収を強化する。循環系に入ると、アルキル部分が分離される。従って、レセプターに到達する時点で、より小さいオリゴマーが循環するペプチドに結合される。このクラスのトリ−およびテトラ−結合体を、アルキル基の分離前および分離後の両方で合成した。アルキル基が分離された後でさえも、これらの結合体は治療的に有意な程度の活性を保有していたが、3個または4個の部位でBNPに結合している小さいPEG単位を活性について測定した(データは次項に示されている)。
充分に加水分解性であるオリゴマー(クラス3)を用いる8種の結合体を合成した。このクラスの結合体の場合、これらの結合体は消化器官を一体のまま通過した。結合体が吸収されると、オリゴマーが分離され、天然ペプチドが循環系に放出される。第二クラスと同様に、これらの結合体は、結合に必要である領域内で結合が生じる場合、有用である。しかしながら、ミクロペジル化結合体が依然として、活性ではない状況では、この第三クラスの結合体は、オリゴマーがレセプター結合を干渉する可能性を有することは完全に明白である。モノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−結合体をこのクラスのオリゴマーから製造した。トリおよびテトラ結合体の活性は低かった。2種の結合体を試験した。
保有されている薬理学的活性、強化された細胞膜透過性、および/またはタンパク質分解耐性を備えたいずれか多くの種々の生体活性ナトリウム排泄増加性ペプチド結合体を構築するために、本発明による結合技術は、かなり多くの相違するナトリウム排泄増加性ペプチドおよびこれらのペプチドの類縁体とともに使用することができるものと予測される。本明細書の数種の例に記載のhBNPに加えて、これらの候補ペプチドは、リストの一部として、ペプチド、ペプチド断片および完全ペプチドを包含し、また複数−構築物を生物的に均等なペプチド/タンパク質の下記組合せから製造し、および/または単離した。態様で製造された構築物およびその同類置換構築物は本発明の範囲内に包含され、また充血性心不全の処置について本明細書に定義されているとおりに少なくとも1個の修飾部分を用いて結合されている、これらの構築物を含有する医薬組成物は本発明の範囲内に包含される。これらのペプチドは修飾性結合部分に従う構造を有する。
TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFX1Y(配列番号: )
アミノ酸Tは修飾部分結合部位を表わす。上記配列において、X1はリジンであるか、またはアルギニン以外のアミノ酸である。X1がリジンである場合、第二の修飾部分結合部位が付与される。
イヌBNPはしばしば、結合体の製造において天然の利点を提供する。そのループ領域には、結合部位は存在しない。結合部位はN−およびC−末端テイルに存在する。これらの特徴は活性を実質的に失うことなく結合を可能にする。これはまた、生成物のより少ない分布を導き、より高い収率およびより容易な精製をもたらす。
SPX1MMHX2GGCFGRRLDRIGSLSGLGCNVLRX3Y(配列番号: )
X1、X2およびX3のアミノ酸部位は修飾部分結合部位を提供する。この中性ペプチドにおいて、ペプチドの3個の部位全部を修飾部分との結合に利用することができる。そのループ領域はアミノ酸10(C)〜アミノ酸26(C)に特定される。位置3、14または27に存在するアミノ酸のいずれか2個または3個はLys以外、例えばArgにより置換することができる。
EVX1YDPCFGHX2IDRINHVSNLGCPSLRDPRPNAPSTSA(配列番号: )
X1およびX2のアミノ酸部位は修飾部分結合部位である。この例において、X1およびX2は両方ともに、アミノ酸Lysである。或る態様において、X1はArgであり、およびX2はArgである。そのN−末端はまた、結合部位である。好ましくは、X1がリジンである場合、X2はアルギニン(またはリジン以外)である。場合により、このペプチドはN−末端に追加の結合部位を有する。
GLSK1GCFGLK2LDRIGSMSGLGC(配列番号: )
K1およびK2のアミノ酸部位は修飾部分結合部位である。この例において、K1およびK2は両方ともに、アミノ酸Lysである。しかしながら、このペプチドの類縁体は、ペプチドのこれらの位置のどちらか、または両方に追加の結合部位を含有することができる。場合により、このペプチドはN−末端に追加の結合部位を有することができる。
SLRRSSCFGGRXDRIGAQSGLGCNSFRY(配列番号: )
この例において、XはMet(M)またはIle(L)であり、この場合、修飾部分結合部位はN−末端に存在し、またはRをKにより置き換え、修飾部分部位を付与することができる。
BNPの血管弛緩性、ナトリウム排泄増加性および利尿性物性は、二次メッセンジャー、環状GMP(cGMP)に帰因する。cGMPの製造は、BNPが内皮細胞の表面上でナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターA(NPR−A)に結合する場合に活性化される酵素であるグアニレートシクラーゼによって達成される。非加水分解性(クラス1)オリゴマーまたはミクロペジル化(クラス2)オリゴマーのどちらかと結合している結合体のナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターA(NPR−A)を発現するヒト大動脈内皮細胞(HAEC)の産生を刺激する能力を評価した。ミクロペジル化クラスの場合、結合体はアルキル部分を結合させて、または結合させずに試験した。充分に加水分解性のオリゴマー(クラス3)との結合体はこの分析では試験しなかった。この理由は、最終的に循環系に放出される化合物が天然ペプチドであることにある。
インビトロで活性であったナトリウム排泄増加性化合物を、種々のプロテアーゼ、例えばトリプシンおよびキモトリプシンの存在下におけるそれらの安定性について試験する。これらの化合物結合体のプロテアーゼに対する安定性は、トリプシンおよびキモトリプシンの存在下における化合物結合体の半減期によって評価することができる。すなわち、これらの分析で評価された数種の結合体は天然hBNPよりも長い半減期を有していた。例えば、図4を参照することができる。
インビトロで活性であった結合体を、ラットにおいて、それらの経口生体利用性について試験した。結合体を経口栄養胃管により胃腸器官に投与し、次いで血流中のhBNP結合体の存在を利用できる放射線免疫検定法を用いて評価した。hBNP検出用抗体は特異性であり、ラットとの交差反応性は1%よりも低い。従って、交差反応および内因性hBNPによる干渉は見出されなかった。
本例は、選択されたマルチ−結合形態の生体活性ペプチドの生成における本発明の有用性を証明するために示されている。一例として、この説明はヒトナトリウム排泄増加性ペプチド、hBNPのモノ−結合体、ジ−結合体およびトリ−結合体について記述する。
hBNPへの結合にかかわり使用された方法と同一の方法により、オリゴマーを結合させる。相違点の一つは、付加できる活性化オリゴマーがさらに多い点にある(1〜10当量;好ましくは3〜5当量)。
相違するサイズおよび化学組成を有する両親媒性オリゴマーを使用することによって、ペプチド結合体、例えばhBNP結合体の吸収および分配物性を変更することができる。結合体スクリーニングを使用し、どの結合体が天然ペプチドの活性を保有するか、また酵素に対して増大した耐性を示すかについて測定した。特徴(例えば、レセプターにおけるアゴニスト活性、タンパク質分解に対する耐性、および経口生体利用性)の望ましい組合せを有する結合体は、さらに大規模のインビボ試験用の先導的候補になる。
モノ結合hBNPは、このペプチドのLys3またはLys14、もしくはLys27またはN−末端部位を使用する。
方法I:モノ結合体の製造
h−BNP(1当量)をDMSOに溶解する(1ml/h−BNP35mg)。活性化オリゴマー(1.1当量)を少量のTHFに溶解し、次いでDMSO中のh−BNPの溶液に添加した。反応はHPLCにより監視した。HPLC監視用試料は、反応混合物50μLを採取し、次いでこれを0.1%TFA含有H2O 500μLで稀釈することによって調製した。反応は45分間かけて行った。反応混合物を直ちに精製しない場合、精製を行うことができるまで凍結させた。
h−BNP(1当量)をDMSOに溶解する(1ml/h−BNP35mg)。h−BNPが溶解された時点で、TEA(120当量)を添加し、この溶液を5分間、撹拌した。次いで、活性化オリゴマー(ジ結合体の場合は2.2当量、トリ結合体の場合は4当量、テトラ結合体の場合は5当量)を少量のTHFに溶解し、次いでDMSO中のh−BNPの溶液に添加した。反応はHPLCにより監視した。HPLC監視用試料は、反応混合物50μLを採取し、次いでこれを0.1%TFA含有H2O 500μLで稀釈することによって調製した。反応は45分間かけて行った。反応混合物を直ちに精製しない場合、精製を行うことができるまで凍結させた。
ジ結合体hBNPは、hBNPの部位Lys3およびLys14、またはLys3およびLys27を使用する。
トリ結合体hBNPは、部位Lys3、Lys14およびLys27を使用する。
本例は、本発明の実施に使用するための種々の形態を有する生体活性BNP様ペプチドおよびそのペプチド断片を提供する本発明の有用性を証明するものである。これら種々の形態または類縁体は、対応する天然ペプチド/タンパク質からの天然産生アミノ酸の場所に1種または2種以上の変異アミノ酸が存在することを特徴とするものである。
CFGRXMDRISSSSGLGC−(配列番号:1)
ここで、XはLys以外のアミノ酸であるか、またはXはArgまたはGlyである。
−SPRMVQGSG−CFGRKMDRISSSSGLGC−X2−(配列番号: )
ここで、X2は1〜10長さのアミノ酸、好ましくは1〜6長さのアミノ酸である。或る態様において、X2は、KVLRRH、KVLRR、KVLR、KVL、KV、K、RVLRRH、RVLRR、RVLR、RVL、RVまたはRである。
SPX1MVQGSG−CFGRX2MDRISSSSGLGC−X3VLRRH(配列番号: )
ここで、X1はLysであるか、またはLys以外のアミノ酸であり、X2はLys以外のアミノ酸であり、およびX3はLysであるか、またはLys以外のアミノ酸である。或る態様において、X1、X2およびX3は独立して、ArgまたはGlyである。別の態様において、X1はLysであり、X2およびX3は独立して、ArgまたはGlyである。好適態様において、X1、X2およびX3の少なくとも一つはLysである。
X1SPKMVQGSG−CFGRX2MDRISSSSGLGC−X3VLRRH−(配列番号: )
ここで、X1はC−末端修飾部位(Ser)であり、およびX2およびX3はLys以外のアミノ酸である。或る態様において、X2およびX3は独立して、ArgまたはGlyである。別の態様において、X2はArgであり、およびX3はLysである。
(全部が、そのテイルの一方または両方がループまで短縮されている)
X1−CFGRRMDRISSSSGLGC−X2(配列番号: )
ここで、X1は1〜10長さのアミノ酸、好ましくは1〜9長さのアミノ酸であり、およびX2は1〜10長さのアミノ酸、好ましくは1〜6長さのアミノ酸でる。X1は、SPKMVQGSGC、PKMVQGSGC、KMVQGSGC、MVQGSGC、VQGSGC、QGSGC、GSGC、SGC、GC、C、SPK、SPKM、SPKMV、SPKMVQ、SPKMVQ、KMVQ、KMV、KMVQG、KMVQGS、KMVQGSGまたはKMVQGSGCを包含することができる。X2はKVLRRH、KVLRR、KVLR、KVL、KV、K、RVLRRH、RVLRR、RVLR、RVL、RVまたはRを包含することができる。
SPX1MVQGSG−CFGRKMDRISSSSGLGC−KVL(配列番号: )
ここで、X1はArgであるか、またはLys以外のもう一種のアミノ酸である。
SPX1MVQGSG−CFGRKMDRISSSSGLGC(配列番号: )
ここで、X1はArgまたはGlyであるか、またはLys以外のもう一種のアミノ酸である。
X1−CFGRMDRISSSSGLGC−RVLRRH(配列番号: )
ここで、X1は1〜10長さのアミノ酸、好ましくは1〜9長さのアミノ酸である。X1は、SPKMVQGSGC、PKMVQGSGC、KMVQGSGC、MVQGSGC、VQGSGC、QGSGC、GSGC、SGC、GCまたはCを包含することができる。
−CFGRX1MDRIX2GLGC−(配列番号: )
ここで、X1はArgであるか、またはLys以外のアミノ酸であり、およびX2は1〜4アミノ酸である。或る態様において、X2は、SSSS、SSS、SS、S、KSSS、KSSまたはKSである。
SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCX1RH(配列番号: )
ここで、X1はArgであるか、またはLys以外のアミノ酸である。
SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCX1VLRRH(配列番号: )
ここで、X1はLysであるか、またはArg以外のアミノ酸である。
−SPKMVQGSG−CFGRKMDRISSSSGLGC−KVLRRH−X2(配列番号: )
ここで、X2は、Lys、CysまたはLys+Xaanであり、ここでnは1〜100、1〜50または1〜10であり、およびXaaは、独立して選択されるいずれかのアミノ酸または一群のアミノ酸であるか、または未知のアミノ酸である。
−CFGRX1MDRIX2GLGC−(配列番号: )
ここで、X1はArgであるか、またはLys以外のアミノ酸であり、およびX2は1〜4アミノ酸、例えばSSSS、SSS、SS、S、KSSS、KSSまたはKSである。
SPZ1MVQGSG−CFGRZ2MDRISSSSX1X2X3C
ここで、Z1はアルギニンであるか、またはリジン以外のアミノ酸であり、およびZ2はアルギニンであるか、またはリジン以外のアミノ酸であり、X1はGly、Met、Leu、Phe、Ileまたはその同類置換基であり、X2はGly、Argまたはその同類置換基であり、およびX3はGly、Argまたはその同類置換基である。この類縁体の別の態様において、Z1はリジンであり、およびZ2はアルキルニンであるか、またはLys以外のアミノ酸である。
KCFKGKNDRX1KX2QSGLX3C−NSFKY
ここで、X1はT、a、R、H、P、Eであり;X2はK、N−メチル、Arg、S、DまたはPであり;X3はArg、K、Y、F、S、P、Orm、Har、Har、p−アミジノフェニルAla、I、Gly以外の陽電荷を有するいずれか別のアミノ酸、またはTryである。
経口投与経路には大量のBNPペプチドの供給が必要である。BNPを供給するための合成手段に随伴する高価格および供給量の限界によって、結合されたBNPペプチドの製造には、組換え技術が好適であると思われる。結合体製造用のペプチドを供給するための組換え技術をここで説明する。
グリコシル化していない小型タンパク質(>10,000K)を発現することが知られており、また容易に単離できる可溶性形態を有する高発現組換え技術を目標として選択する。
ナトリウム排泄増加性化合物はまた、2個または3個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を順に有し、また任意に、ナトリウム排泄増加性化合物単位間にスペーサー配列を有するマルチ−ペプチドであることができ、その構築はまた、ナトリウム排泄増加性化合物のどちらかの末端または両末端にリーダー配列および/またはエクステンション配列を有することができる。一例として、このマルチペプチドをいずれか特定の構築に制限するものではないが、マルチペプチドは下記構造を有することができる:
NP−[スペーサー−NP]n;
リーダー−NP−[NP]n;
リーダー−NP−[スペーサー−NP]n;
リーダー−[スペーサー−NP]n;
リーダー−[スペーサー−NP]n−エクステンション;
リーダー−NP−[スペーサー−NP]n−エクステンション;
スペーサーは、例えばNP中に存在しない酵素分解部位であることができる(例えば、Asp−Asp−Ala−Gly−Glu);
プロ−BNP構築をBNP配列および追加の特別のアミノ酸を有する合成プロ−BNPモデルで評価する。この合成モデルはオリゴマーを結合させ、次いで特異的酵素による分解に付し、BNP−オリゴマー結合体の製造を追跡するものである。
リーダー配列[プロ部分(promoiety)]は、合成モデルに基づく特異的酵素分解配列を有する小型ペプチドを包含することができる。別の官能性アミノ酸配列をまた、リーダー/スペーサー配列に挿入することができ、これによりプロ−BNPタンパク質の精製を容易にすることができる。リーダー配列はまた、結合期間中の望ましくない修飾からN−末端を保護するプロ部分として作用することができ、また特異的酵素処理で分解させることができる。別の特徴をまた、リーダーペプチド配列に組入れることができ、これによりプロ−BNPとしての、またはプロ−BNPオリゴマー結合体としての単離を容易にすることができる。リーダーペプチドはまた、BNP配列のC−末端に付加することもできる。リーダーペプチドはまた、公知融合タンパク質の付加を可能にするようにデザインすることができる。
プロ−BNP発現
機能的に特異的なリーダー配列は、選択された組換え技術の発現遺伝子配列または発現カセット中に挿入するためのBNPのN−末端または/およびC−末端に付与される。構築物の一つにおいて、既知融合タンパク質の発現配列(Gaken等)をまた、発現遺伝子中に挿入することができる。確立された方法に従い、細胞で発現された遺伝子の充分の形質転換を監視することができる。正の形質転換(positive transgenic)された単離体を単離し、次いでデザインされたタンパク質の発現を評価するために増殖させることができる。発現されたタンパク質は精製することができ、次いで配列決定することができる。精製されたプロ−BNP構築物を次いで、評価することができる。選択された細胞系の特徴を確定し、将来の選択用途に選択することができる。
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼ−B分解スペーサーおよびHisタッグ付きリーダーペプチドを備えたプロ−ペンタペプチドBNP−1の構築
完全長さのプロ−ペンタペプチドBNP−1のコード配列は、次式に従い得ることができる:
リーダー−NP−[スペーサー−NP]n
ここで、スペーサーは、Arg−Arg−Asp−Ala−Glu−Asp−Pro−Argであり;
リーダーは、Glu−Gly−Asp−Arg−Argであり;
エクステンションは、(His)6−Glu−Gly−Asp−Arg−Argであり;
NPは、hBNPである。
この態様において、NPはトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼB酵素カクテルを用いて放出させることができる。
標準的分子生物学的技術を使用し、プロ−ペンタペプチドBNP−1のアミノ酸配列[(His)6−Glu−Gly−Asp−Arg−Arg.]−BNP−Arg−Arg−Asp−Ala−Glu−Asp−BNP−Arg−Arg−Asp−Ala−Glu−Asp−BNP−Arg−Arg−Asp−Ala−Glu−Asp−BNP−Arg−Arg−Asp−Ala−Glu−Asp−BNP]発現用プラスミドを構築する。このプラスミドは使用されるホスト細胞(例えば、E−コリ)用に最適化されたコドン(Codon)である。このマルチペプチド配列をコードするDNA断片を、ホストリーダー配列から出発して合成的に組立て、次いでその分解部位をBNP配列のHisタグの3′/5′の順序で付加する。この配列のcDNAをポリアクリルアミドゲルから標準的技術により精製する。このプラスミド構造は制限酵素分析により確認する。
プロ−ペンタペプチドBNP−1を発現するE−コリ細胞をプロ−ペンタペプチド生成に充分な栄養物質とともに培養する。(His)6タグ プロ−ペンタBNPを細胞破裂、引続く遠心分離、接面濾過(tangential filtration)/限外濾過、均質化および封入体の可溶化により細胞から収集する。
HiTrpキレート形成性(Ni2+)HPカラム(Amersham Bioscience)を用意し、このカラムを10カラム容量の蒸留水で洗浄し、保存溶液を除去し、金属イオン溶液(NiSO4、0.1M)を充填し、次いで蒸留水で洗浄し、未結合物を除去する。封入体可溶化後の濾過溶液を、このカラムに添加し、次いでこのカラムを10カラム容量のビディング緩衝液(biding buffer)(20mMホスフェート緩衝液、pH7.4、0.5M塩化ナトリウムおよび20mMイミダゾール含有)で洗浄する。溶出緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、pH7.4、0.5M塩化ナトリウムおよび0.5Mイミダゾール含有)を使用し、カラムを溶出し、次いで追加の2カラム容量の100%溶出緩衝液により溶出する。この方法は、カラムのNi2+親和性に対するキレート化により、(His)6タグペンタペプチドを細胞回収試料からの別の成分から精製する。このペンタペプチドの純度は、RP−HPLC法により>30%であることが分析される。
このペンタペプチドを次いで、C−18調整用HPLCにより>75%まで精製する。精製されたペンタペプチドをES/MS分析法により分析し、プロ−ペンタペプチドBNP−1の予想分子量(MW)にかかわるM+1イオンピークを得る。この物質のミクロ配列決定を使用し、当該マルチペプチドのアミノ酸配列を確認する。
(a)ペンタペプチドの結合
プロ−ペンタペプチドBNP−1(3.20x10−4mmol)をDMSO 5mlに溶解する。この溶液に、トリエチルアミン45μLを添加する。この溶液を5分間にわたり撹拌し、次いでエタノール中の活性化PEG7−ヘキシルオリゴマー(19.6x10−4mmol)を添加する。HPLC分析がプロ−ペンタペプチドの消費を示すまで反応を進行させ、次いでこの反応を50%水性酢酸溶液0.5mlの添加により停止させる。この反応混合物を次いで、処理し、次いで100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.6)中に交換する。この混合物の主要成分は、各BNP単位のLys3で結合されたマルチペプチドであると予想される。
一定量の例2(a)からの生成混合物のトリス−HCl溶液をHPLCにより分析し、その中のポリペプチド濃度を測定する。トリプシン(TPCK処理されている;ウシ膵臓から)の溶液を100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.6)中で調製する。カルボキシペプチダーゼB(ウシ膵臓から)の溶液を100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.6)中で調製する。
例2(b)に記載の結合反応から得られる各主要成分を、逆相HPLCを用いて単離する。カラム(直径1.0cm.x長さ25cm.)に、ポリペプチドおよびタンパク質の分割に有用であることが知られている市販C18固定相を充填し、次いでHPLC系と組合せる。この系を、75%移動相A(0.1%トリフルオロ酢酸含有H2O)および25%移動相B(0.1%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル)の混合物からなる溶出緩衝液により平衡化する。例21(a)からの生成混合物のトリス−HCl溶液をカラムに適用し、主要成分を分離し、次いでアセトニトリル成分のパーセンテージを25%から55%に増量する勾配溶出を用い溶出する。フラクションを集め、次いでHPLCにより分析し、その中の生成物を同定し、および純度を測定する。各生成物の共通フラクシヨンを集め、溶媒を回転蒸発により分離する。各生成物ピークを同定し、および純度をHPLCおよび質量スペクトル分析により決定する。予想生成物は、3マルチペプチドモノ結合体(各BNP単位のLys3またはLys14またはLys27のいずれかで結合)、3マルチペプチドジ結合体(Lys3およびLys14、またはLys14およびLys27、またはLys27およびLys3で結合)、1マルチペプチドトリ結合体(Lys3、Lys14およびLys27で結合)および1マルチペプチドテトラ結合体(リーダーペプチドのN−末端、Lys3、Lys14およびLys27で結合)からなる。
例3に記載の方法を用いて得られる結合体、モノ結合Lys3−ヘキシル−PEG7−オリゴマープロ−ペンタペプチドBNP−1を100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.6)に溶解させ、生成する溶液をHPLCにより分析し、その中のポリペプチド濃度を測定する。トリプシン(TPCK処理されている;ウシ膵臓から)の溶液を100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.6)中で調製する。カルボキシペプチダーゼB(ウシ膵臓から)の溶液を100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.6)中で調製する。粗製混合物(1mol当量)を次いで、トリプシン(1.39x10−3mol当量)およびカルボキシペプチダーゼB(4.56x10−4mol当量)と反応させる。30分後、反応をアセトニトリル中の1%トリフルオロ酢酸により停止させる。生成物を処理し、次いでHPLCにより分析する。保持時間(対照標準の保持時間に対する)および質量スペクトル分析を使用し、同定し、確認する。この反応の予想生成物は、使用される各結合体にそれぞれ対応する。一例として、モノ結合Lys3−ヘキシル−PEG7−オリゴマー−結合プロ−ペンタペプチドBNP−1は、Lys3−ヘキシル−PEG7−オリゴマー−結合BNPおよびデスArg−His Lys3−ヘキシル−PEG7−オリゴマー結合BNPである。
Claims (181)
- (a)(i)ナトリウム排泄増加性分子NPR−A結合部位、および
(ii)少なくとも1個の修飾部分結合部位
を含有する生物学的に活性なナトリウム排泄増加性化合物;および
(b)上記修飾部分結合部位に結合されている少なくとも1個の修飾部分;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に対する酵素による分解に比較して増大した耐性、増大した循環半減期、増加した生体利用性、および延長された効果持続性からなる群から選択される1種または2種以上の利点を示す、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較し、治療的に格別の割合でcGMP刺激活性を保有することをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のcGMP刺激活性の少なくとも30%を保有することをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のcGMP刺激活性の少なくとも50%を保有することをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のcGMP刺激活性の少なくとも70%を保有することをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のcGMP刺激活性の少なくとも90%を保有することをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親水性であることをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに両親媒性であることをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性であることをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がアルキル基からなるものではない、請求項9に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりも大きいプロテアーゼ分解耐性であることをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が下記配列を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体:
A1PX1MVQGSGCFGRX2MDRISSSSGLGCX3VLR(配列番号: )
(ここで、
A1は、ナトリウム排泄増加性ペプチドに天然で存在するアミノ酸または一連のアミノ酸であり、
X1、X2およびX3は、Lys、ArgおよびGlyからなる群から独立して選択され、およびX1、X2およびX3の少なくとも1個はLysである)。 - ナトリウム排泄増加性化合物が、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド、動脈ナトリウム排泄増加性ペプチド、C−型ナトリウム排泄増加性ペプチドまたはデンドロアスピス(dendroaspis)ナトリウム排泄増加性ペプチドのペプチドまたは生物学的に活性なペプチドセグメントを含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が、
(a)アミノ酸配列:
X1−C1FGRX2MDRISSSSGLGC2−X3(配列番号: )
(ここで、
X1は、存在していてもよく、また存在する場合、1〜10個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、
X2は、Gly、ArgまたはLysであり、および
X3は、存在していてもよく、また存在する場合、1〜10個のアミノ酸を有するアミノ酸配列である)、
(b)ループを形成するためのC1−C2間のジスルフィド結合、
を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - X1がArgまたはGlyである、請求項14に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- X1が下記群から選択される、請求項14に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体:
(a)Lys;
(b)Gly;
(c)Arg;
(d)SG−(配列番号: )、GSG−(配列番号: )、QGSG−(配列番号: )、VQGSG−(配列番号: )、MVQGSG−(配列番号: )、PKMVQGSG−(配列番号: )、およびSPKMVQGSG−(配列番号: );
(e)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を含有する(d)のhBNPセグメント;
(f)GlyのLysへの置換およびArgのLysへの置換からなる群から選択される置換を含有する(d)のhBNPセグメント;
(g)挿入Lysを含有する(d)のhBNPセグメント;
(h)ナトリウム排泄増加性ペプチドのN−末端テイルのC−末端セグメントおよびN−末端テイル;
(i)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を含有する(h)のC−末端セグメントおよびN−末端テイル;
(j)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を含有する(h)のC−末端セグメントおよびN−末端テイル;
(k)挿入Lysを含有する(h)のC−末端セグメントおよびN−末端テイル。 - X3が下記群から選択される、請求項14に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体:
(a)Lys;
(b)Gly;
(c)Arg;
(d)hBNPセグメント KV(配列番号: )、KVL(配列番号: )、KVLR(配列番号: )、KVLRR(配列番号: )、およびKVLRRH(配列番号: );および
(e)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を含有する(d)のhBNPセグメント;
(f)GlyのLysへの置換およびArgのLysへの置換からなる群から選択される置換を含有する(d)のhBNPセグメント;
(g)挿入Lysを含有する(d)のhBNPセグメント;
(h)ナトリウム排泄増加性ペプチドのN−末端セグメントおよびC−末端テイル;
(i)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を含有する(h)のC−末端テイルのN−末端セグメントおよびC−末端テイル;
(j)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を包含する(h)のC−末端テイルのN−末端セグメントおよびC−末端テイル;
(k)挿入Lysを含有する(h)のC−末端テイルのN−末端セグメントおよびC−末端テイル。 - ナトリウム排泄増加性化合物が、
(a)SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL(配列番号: );
(b)SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGC(配列番号: );および
(c)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を含有するセグメント(a)または(b);
からなる群から選択される配列を含有する、請求項14に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - X1がhBNPのN−末端から1〜9個のアミノ酸残基配列を含有する、請求項14に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- X1が、SPX3MVQGSG(配列番号: )を含有し、およびX2が修飾部分結合部位を有する、請求項14に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- X3が、hBNPのC−末端から1〜6個のアミノ酸残基配列を含有する、請求項14に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- X3が、KVLRRH(配列番号: )、KVLRR(配列番号: )、KVLR(配列番号: )、KVL、KVまたはKを含有する、請求項14に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が、Lys3Arg、Lys14Arg、Arg30Lys、Lys27ArgおよびArg31Lysからなる群から選択される1種または2種以上の変異を有する天然hBNP配列(配列番号: )を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が1個または2個以上の挿入または欠失を有する天然hBNP配列(配列番号: )を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が天然hBNPアミノ酸配列(配列番号: )およびN−末端またはC−末端Lysを含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- (a)ナトリウム排泄増加性化合物をコードする2種または3種以上のアミノ酸配列を含有するマルチペプチドを含有し;
(b)任意に、各セットまたは隣接ナトリウム排泄増加性化合物をコードする配列間にスペーサー配列を含有し;
(c)任意に、マルチペプチドのどちらかの末端または両末端にエクステンションを有し、このエクステンションは1個または2個以上のアミノ酸を含有する;
ことをさらに特徴とする、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - ナトリウム排泄増加性ペプチド単位がそれぞれ、hBNP(配列番号: )またはその生物学的に活性な類縁体、セグメントまたはセグメント類縁体を包含する、請求項26に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が天然BNPからなる、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が天然hBNPからなる、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が天然ANPからなる、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物がイヌBNPからなる、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物がウロジラチン(urodilatin)からなる、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物がDNPからなる、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物が下記アミノ酸配列を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体:
X1MVQGSGCFGRX2MDRISSSSGLGCX3(配列番号: )
(ここで、X1、X2およびX3はそれぞれ、Lys、GlyおよびArgからなる群から独立して選択され、ただしX1、X2およびX3の少なくとも1個はArgまたはGlyである)。 - 配列が、
(a)SPK、PKおよびKからなる群から選択されるエクステンション、X1へのN−末端、;および/または
(b)−VLRRH(配列番号: )、−VLRR(配列番号: )、−VLR、−VLおよび−Vからなる群から選択されるエクステンション、X3へのC−末端;
を含有する、請求項34に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体 - X1がLysであり、X2がArgであり、およびX3がArgである、請求項34に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体
- ナトリウム排泄増加性化合物が下記アミノ酸配列を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体:
CFGRX1MDRISSSSGLGCX2(配列番号: )
(ここで、X1およびX2は、修飾部分にカプリングされている修飾部分結合部位を含有する)。 - X1が修飾部分にカプリングされているLysを含有する、請求項37に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- X2が修飾部分にカプリングされているLysを含有する、請求項37に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分結合部位が、天然または非天然アミノ酸側鎖、ナトリウム排泄増加性化合物のN−末端およびナトリウム排泄増加性化合物のC−末端からなる群から選択される部分を包含する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分結合部位が、Lys側鎖である、請求項40に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 請求項37に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体が1個のみの修飾部分を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- (a)ナトリウム排泄増加性化合物がhBNPのLys3〜Cys26セグメントおよびこのセグメントのCys10をCys26にカプリングするジスルフィド結合を含有し(配列番号: );
(b)一個の修飾部分がLys3の部位でナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている(配列番号: );
請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - ナトリウム排泄増加性化合物が、hBNPのCys10〜Cys26セグメントおよびCys10〜Cys26をカプリングするジスルフィド結合を含有し、当該ナトリウム排泄増加性化合物結合体は当該セグメントのLys14に、そこにカプリングされている一個の修飾部分を有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物がhBNPのCys10〜Lys27セグメント(配列番号: )を含有し、当該ナトリウム排泄増加性化合物は当該セグメントのLys27において、そこにカプリングされている1個の修飾部分を有するモノ−結合体である、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物がhBNPのCys10〜His32セグメントおよび当該セグメントのCys10〜Cys26をカプリングするジスルフィド結合を含有し、当該ナトリウム排泄増加性化合物は当該セグメントのLys27において、そこにカプリングされている1個の修飾部分を有するモノ−結合体である、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ナトリウム排泄増加性化合物がhBNPのCys10〜Cys26セグメントおよび当該セグメントのCys10〜Cys26をカプリングするジスルフィド結合を含有し、当該ナトリウム排泄増加性化合物は当該化合物のN−末端において、そこにカプリングされている1個の修飾部分を有するモノ−結合体である、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- (a)ナトリウム排泄増加性化合物がhBNPアミノ酸配列からなり;および
(b)ナトリウム排泄増加性化合物結合体が、
(i)hBNPアミノ酸配列のLys3においてナトリウム排泄増加性ペプチドにカプリングされている修飾部分;および
(ii)hBNPアミノ酸配列のLys14においてナトリウム排泄増加性ペプチドにカプリングされている修飾部分;
を含有するジ−結合体である;
請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - (a)ナトリウム排泄増加性化合物がhBNPであり;および
(b)ナトリウム排泄増加性化合物結合体が、
(i)hBNPアミノ酸配列のLys3においてナトリウム排泄増加性ペプチドにカプリングされている修飾部分;および
(ii)hBNPアミノ酸配列のLys27においてナトリウム排泄増加性ペプチドにカプリングされている修飾部分;
を含有するジ−結合体である;
請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - ナトリウム排泄増加性化合物配列がN−末端テイルを含有し、および修飾部分が当該N−末端テイルに位置しているアミノ酸にカプリングされている、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- N−末端テイルがナトリウム排泄増加性ペプチドのN−末端テイルの天然配列またはナトリウム排泄増加性ペプチドのN−末端テイルのC−末端セグメントからなる、請求項50に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- mが1〜18である、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- mが1〜16である、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜20である、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜15である、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜10である、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 各Xが−C−、−O−、−C(O)−、−NH−、−NHC(O)−、および−C(O)NH−からなる群から独立して選択される、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性にする、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親水性にする、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに両親媒性にする、請求項52に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜20である、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜15である、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜10である、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 各oが独立して選択され、1〜13である、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 各oが独立して選択され、1〜9である、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 各oが独立して選択され、1〜6である、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 各Xが−O−である、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性にする、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親水性にする、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに両親媒性にする、請求項62に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- mが1〜18である、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- mが1〜16である、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜20である、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜15である、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- nが2〜10である、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- oが1〜13である、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- oが1〜9である、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- oが1〜6である、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 各Xが−C−、−O−、−C(O)−、−NH−、−NHC(O)−、および−C(O)NH−からなる群から独立して選択される、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性にする、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親水性にする、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに両親媒性にする、請求項73に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分が直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコール基を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がアルキル基にカプリングした糖基を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分が糖基をさらに含有する、請求項87に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ポリアルキレングリコール基がポリエチレングリコール基を包含する、請求項86に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ポリアルキレングリコール基が2〜25個のポリアルキレングリコール付属単位を有する、請求項86に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ポリアルキレングリコール基が2〜20個のポリアルキレングリコール付属単位を有する、請求項86に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ポリアルキレングリコール基が2〜15個のポリアルキレングリコール付属単位を有する、請求項86に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- ポリアルキレングリコール基が2〜10個のポリアルキレングリコール付属単位を有する、請求項86に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分が直鎖状または分枝鎖状アルキル基をさらに含有する、請求項86に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分が糖基をさらに含有する、請求項94に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- アルキル基が炭素1〜20個を有する、請求項94に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- アルキル基が炭素1〜18個を有する、請求項94に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- アルキル基が炭素1〜16個を有する、請求項94に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- アルキル基が、−C−、−O−、−C(O)−、−NH−、−NHC(O)−、および−C(O)NH−からなる群から選択されるリンカーによってポリアルキレングリコール基から分離されている、請求項94に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物を対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物よりもさらに親油性にする、請求項94に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がポリアルキレングリコール基をアルキル基にカプリングする結合を含有し、この結合はインビボで加水分解性である、請求項94に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコール部分およびナトリウム排泄増加性化合物に対して遠位にある部位でポリアルキレングリコール部分にカプリングされている直鎖状または分枝鎖状アルキル基を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている直鎖状または分枝鎖状アルキル部分およびナトリウム排泄増加性化合物に対して遠位にある部位でアルキル部分にカプリングされている直鎖状または分枝鎖状ポリアルキレングリコール基を含有する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分が表1のオリゴマー部分からなる群から選択される、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がインビボで加水分解可能である結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分が血液流中で加水分解可能である結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がインビボで非加水分解性である結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分が血液流中で非加水分解性である結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がエステル、カーボネート、カルバメート、アミド、エーテルおよびアミンからなる群から選択される結合によってナトリウム排泄増加性化合物にカプリングされている、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がインビボで加水分解可能であり、ペジル化(pegylated)ナトリウム排泄増加性化合物を生成する、請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 修飾部分がインビボで加水分解可能であり、1〜6個のPEG単位を有する1種または2種以上のPEG部分を含有するペジル化ナトリウム排泄増加性化合物を生成する、請求項110に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体。
- 請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体を含有する医薬製剤。
- 腸内、非経口、経口、皮下、舌下、口腔、鼻、静脈内および筋肉内からなる群から選択される供給経路用に処方されている、請求項112に記載の医薬製剤。
- 過剰レベルの細胞外液体を特徴とする状態の処置方法であって、その必要性を有する対象に医薬上で許容される量の請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体を投与することを包含する、上記方法。
- 状態が充血性心不全を包含する、請求項114に記載の方法。
- 状態が慢性充血性心不全を包含する、請求項114に記載の方法。
- 状態が急性充血性心不全を包含する、請求項114に記載の方法。
- ナトリウム排泄増加性化合物結合体が自己投与される、請求項114に記載の方法。
- ナトリウム排泄増加性化合物結合体が経口投与される、請求項114に記載の方法。
- ナトリウム排泄増加性化合物結合体が、腸内、非経口、経口、皮下、舌下、口腔、鼻、静脈内および筋肉内からなる群から選択される投与経路を経て投与される、請求項114に記載の方法。
- 状態が高血圧である、請求項114に記載の方法。
- 請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体の製造方法であって、
(a)2個または3個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を含有するナトリウム排泄増加性ペプチドマルチペプチドを結合させ;
(b)このナトリウム排泄増加性ペプチドマルチペプチドを分解させ、ナトリウム排泄増加性化合物結合体を生成し;
(c)この分解されたナトリウム排泄増加性化合物結合体を酸化し、ナトリウム排泄増加性化合物結合体中に1個または2個以上のジスルフィド結合を形成させる;
ことを包含する、上記製造方法。 - ナトリウム排泄増加性化合物が、hBNPのCys10〜Cys26(配列番号: )を含有し、および工程122(c)がCys10とCys26との間にジスルフィド結合を生成する、請求項122に記載の方法。
- 請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体の製造方法であって、
(a)2個または3個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を含有するマルチペプチドナトリウム排泄増加性化合物を製造し;
(b)このナトリウム排泄増加性ペプチドマルチペプチドを分解させ、ナトリウム排泄増加性ペプチド化合物を生成し;
(c)このナトリウム排泄増加性化合物を結合させ、ナトリウム排泄増加性化合物結合体を生成し;
(d)このナトリウム排泄増加性化合物結合体を酸化し、ナトリウム排泄増加性化合物結合体中に1個または2個以上のジスルフィド結合を形成させる;
ことを包含する、上記製造方法。 - ナトリウム排泄増加性化合物が、hBNPのCys10〜Cys26(配列番号: )を含有し、および工程122(c)がCys10とCys26との間にジスルフィド結合を生成する、請求項124に記載の方法。
- 請求項1に記載のナトリウム排泄増加性化合物結合体の製造方法であって、
(a)2個または3個以上のナトリウム排泄増加性化合物単位を含有するマルチペプチドナトリウム排泄増加性化合物を製造し;
(b)このナトリウム排泄増加性ペプチドマルチペプチドを分解させ、ナトリウム排泄増加性化合物を生成し;
(c)この分解されたナトリウム排泄増加性化合物を酸化し、ナトリウム排泄増加性化合物中に1個または2個以上のジスルフィド結合を形成し;次いで
(d)このナトリウム排泄増加性化合物を結合させる;
ことを包含する、上記製造方法。 - 修飾されたプロ−ポリナトリウム排泄増加性ペプチド結合体であって、
(a)修飾部分結合部位およびNPR−A結合部位を有する少なくとも1個のナトリウム排泄増加性ペプチド単位;
(b)少なくとも1個のナトリウム排泄増加性ペプチド単位の修飾部分結合部位に結合されている少なくとも1個の修飾部分;
(c)リーダー配列;および
(d)リーダー配列を第一のナトリウム排泄増加性ペプチド結合体にカプリングする酵素により分解可能なスペーサー;
を含有する、上記修飾されたプロ−ポリナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - 少なくとも1個の修飾部分結合部位、NPR−A結合領域および天然ナトリウム排泄増加性ペプチドアミノ酸配列に比較し、そこに置換されている少なくとも1個のLys残基を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体であって、上記置換Lys残基がアミノ酸修飾部分結合部位ではない、ナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- 1個または2個以上の置換Lys残基がLys3Gly、Lys3Arg、Lys14Gly、Lys14Arg、Lys27Gly、またはLys27Argからなる群から選択される置換を包含する、請求項128に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- 構造:
SPKMVQGSGCFGRX1MDRISSSSGLGCX2VLRRH(配列番号: )
(ここで、X1はLysであり、およびX2はLys以外であるか、またはX1はLysであり、およびX2はLys以外であるであるか、またはX1およびX2はLys以外である)
を含有する、請求項128に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - X1がLysであり、およびX2がArgまたはGlyであるか、またはX1がLysであり、およびX2がArgまたはGlyであるか、またはX1およびX2が独立して選択され、ArgまたはGlyである、請求項130に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- 構造:
CFGRX1MDRISSSSGX2GC(配列番号: )
(ここで、X1は結合部位を含有していないアミノ酸であり、およびX2は修飾部分結合部位を含有するアミノ酸である)
を含有する、ナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - X1がArgであり、およびX2がLysである、請求項132に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- 構造:
X1−CFGRX3MDRISSSSGLGC−X2(配列番号: )
(ここで、X1は1〜10個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、X2は1〜10個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、およびX3はLys以外である)
を有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - X3がArgまたはGlyである、請求項134に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- X1がSPY1MVQGSG(配列番号: )であり、ここでY1は修飾部分結合部位を含有する、請求項134に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- X1が、
(a)ナトリウム排泄増加性ペプチドのN−末端テイルおよびN−末端テイルのC−末端セグメント;
(b)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を包含する(a)のC−末端セグメントおよびN−末端テイル;
(c)GlyのLysへの置換およびArgのLysへの置換からなる群から選択される置換を包含する(a)のC−末端セグメントおよびN−末端テイル;
(d)挿入Lysを含有する(a)のC−末端セグメントおよびN−末端テイル;
からなる群から選択される、請求項134に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - X2がY2VLRRH(配列番号: )であり、ここでY2はLys以外である、請求項134に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- Y2がArgである、請求項138に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- X2が、
(a)ナトリウム排泄増加性ペプチドのC−末端テイルのN−末端セグメントおよびC−末端テイル;
(b)LysのGlyへの置換およびLysのArgへの置換からなる群から選択される置換を包含する137(a)のC−末端テイルのN−末端セグメントおよびC−末端テイル;
(c)GlyのLysへの置換およびArgのLysへの置換からなる群から選択される置換を包含する137(a)のC−末端テイルのN−末端セグメントおよびC−末端テイル;
(d)挿入Lysを含有する137(a)のC−末端テイルのN−末端セグメントおよびC−末端テイル;
からなる群から選択される、請求項134に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - 構造:
X1−CFGRX3MDRIGLGC−X2(配列番号: )
(ここで、X1は1〜9個のアミノ酸を有するペプチドであり、X2は1〜6個のアミノ酸を有するペプチドであり、およびX3はLys以外である)
を有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - X3がArgまたはGlyである、請求項140に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- X1がSPY1MVQGSG(配列番号: )であり、ここでY1は修飾部分結合部位を含有する、請求項142に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- X2がY2VLRRH(配列番号: )であり、ここでY2はLys以外である、請求項142に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- Y2がArgである、請求項144に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- X3がArgであり、X1が配列SPKMVQGSG(配列番号: )であり、およびX2が配列RVLである、請求項144に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- 構造:
X1−CFGRX3MDRIX4GLGC−X2
(ここで、
(a)X1は1〜10個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、
(b)X2は1〜10個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、
(c)X4は1〜4個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり、および
(d)X3はLys以外である)
を有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - X1も、またX2もどちらもナトリウム排泄増加性ペプチドに天然に存在する配列ではない、請求項147に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- X3がArgまたはGlyである、請求項147に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド。
- X1がSPY1MVQGSG(配列番号: )であり、ここでY1は修飾部分結合部位を含有する、請求項147に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド。
- X2がY2VLRRH(配列番号: )であり、ここでY2はLys以外である、請求項147に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- Y2がArgである、請求項151に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- Lys14ArgまたはLys14Glyの置換を含有するhBNP類縁体。
- Lys27ArgまたはLys27Glyの置換を含有するhBNP類縁体
- Lys3ArgまたはLys3Glyの置換を含有するhBNP類縁体。
- (a)(i)ナトリウム排泄増加性分子NPR−A結合部位;および
(ii)少なくとも1個の修飾部分結合部位;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物;および
(b)上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも1個の修飾部分;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較して、治療的に有意の割合のcGMP刺激活性を保有する、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - (a)(i)ナトリウム排泄増加性分子NPR−A結合部位;および
(ii)少なくとも1個の修飾部分結合部位;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物;および
(b)上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも1個の修飾部分;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物のcGMP刺激活性の少なくとも50%を保有する、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - (a)(i)ナトリウム排泄増加性分子NPR−A結合部位;および
(ii)少なくとも1個の修飾部分結合部位;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物;および
(b)上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも1個の修飾部分;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較して、さらに親水性である、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - (a)(i)ナトリウム排泄増加性分子NPR−A結合部位;および
(ii)少なくとも1個の修飾部分結合部位;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物;および
(b)上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも1個の修飾部分;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較して、さらに両親媒性である、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - (a)(i)ナトリウム排泄増加性分子NPR−A結合部位;および
(ii)少なくとも1個の修飾部分結合部位;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物;および
(b)上記修飾部分結合部位に結合した少なくとも1個の修飾部分;
を含有するナトリウム排泄増加性化合物結合体であって、
このナトリウム排泄増加性化合物結合体は、対応する未結合ナトリウム排泄増加性化合物に比較して、さらに親油性であり、ここで少なくとも1個の修飾部分はアルキル部分からなるものではない、上記ナトリウム排泄増加性化合物結合体。 - 式:
(式中、
各Cは独立して選択され、m個の炭素を有するアルキル基であり、mは1〜20であり;
各PAGは独立して選択され、n個の付属単位を有するポリアルキレングリコール基であり、nは2〜25であり;
各Xは独立して選択され、結合性部分である)
で表わされる化合物の製造方法であって、
(a)式:
Cm−X−PAGn−OH
で表わされる化合物を、式:
(式中、X2はハライドである)
で表わされる化合物と反応させ、ここで反応は塩基および溶媒の存在下に行い、
を生成し、次いで
(b)(a)の生成物を、ルイス酸および溶媒の存在下に、式:
Cm−X−PAGn−OH
で表わされる化合物と反応させ、
を生成させることを包含する、上記製造方法。 - 塩基がNaHであり、および溶媒がテトラヒドロフランである、請求項167に記載の方法。
- ルイス酸がBF3OEt2である、請求項167に記載の方法。
- 塩基がK2CO3であり、および溶媒が水性および/または有機溶媒である、請求項173に記載の方法。
- 構造:
SPX1MMHX2SGCFGRRLDRIGSLSGLGCNVLRX3Y
(ここで、X1はLys、ArgまたはHisであり、X2はLys、Arg、Hisであり、およびX3はArgまたはHisである)
を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - S残基で結合している修飾部分を含有する、請求項176に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- 構造:
SPZ1MVQGAG−CFGRZ2MDRISSSSX1X2X3C
(ここで、Z1はArgであるか、またはLys以外のアミノ酸であり、およびZ2はArgであるか、またはLys以外のアミノ酸であり、X1はGly、Met、Leu、Phe、Ileまたはその同類置換であり、X2はLeu、Trp、Tyr、Pheまたはその同類置換であり、およびX3はGlyおよびArgであるか、またはその同類置換である)
を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - Z1がLysであり、およびZ2がLys以外である、請求項178に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。
- 構造:
KCFKGKNDRX1KX2QSGLX3C−NSFKY
(ここで、X1はT、a、R、H、P、T、Eであり;X2はK、N−メチル、Arg、S、D、Pであり;X3はArg、K、Y、F、S、P、Orn、Har、p−アミジノフェニルAla、I、であるか、GlyまたはTry以外の陽電荷を有するいずれか別のアミノ酸である)
を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド類縁体。 - 1個または2個以上のLys残基がそこに結合している修飾部分を含有するナトリウム排泄増加性ペプチド結合体を包含することをさらに特徴とする、請求項178または180に記載のナトリウム排泄増加性ペプチド。
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