KR101969526B1 - 악성 종양 전이 억제용 의약 - Google Patents

Abstract

적어도 1종류의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제를 유효 성분으로서 함유하는, 악성 종양의 전이를 억제 또는 예방하기 위한 의약.

Description

악성 종양 전이 억제용 의약{MEDICINAL AGENT FOR INHIBITING METASTASIS OF MALIGNANT TUMOR}

본 발명은, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체(receptor) GC-A 및 GC-B 아고니스트로 대표되는 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제를 유효 성분으로 하는, 암을 포함하는 악성 종양의 전이 억제용 의약 조성물에 관한 것이다.

암으로 대표되는 악성 종양은 세포의 이상 증식에 따른 질환이며, 악성 종양으로서의 최대의 특징은 주변 조직으로의 침윤과 다른 장기로의 전이이다. 악성 종양 환자의 사인의 상당수는, 원발소(原發巢)의 증대가 아니라, 종양 세포의 원격 전이에 따른 다장기 부전인 것은 예로부터 알려져 있고, 악성 종양 전이의 제어는 최근에서도 달성되고 있지 않은, 암치료 전체에 있어서의 최대 중요 과제의 하나이다.

상피계 악성 종양(암)의 전이는, 상피간엽 전환(Epithelial to Mesenchymal Transition, 이하, "EMT"라고 함)에 의한 암 세포의 운동능 및 침윤능의 획득, 주변 조직으로의 침윤, 혈관이나 임파관으로의 이동과 침입, 원격 조직으로의 정착과 전이소의 형성 등, 다양한 생리 현상에 의해 일어나는 것으로 여겨지고 있으며, 최근에는 특히 EMT가 주목받고 있다. 정상적인 상피 조직에서는, 세포끼리 접착 분자를 통하여 긴밀하게 접합하여 조직을 형성하고 있지만, EMT는, 암의 악성화의 진행에 따라 세포끼리의 접착능이 없어져 유주능(遊走能)·운동능을 획득한 세포로 형질 전환하는 현상이다. EMT의 과정에서는, E-카드헤린의 발현이 감소하고, N-카드헤린의 발현이 항진되므로, N-카드헤린/E-카드헤린의 유전자 발현비가, EMT의 지표로 생각할 수 있다. 이 EMT에 의해 유주능·운동능을 획득한 암 세포는, 원발소에서 주변 조직으로의 침윤, 혈관이나 임파관으로의 침입이 가능해지므로, 암전이의 발단이 된다(비특허 문헌 1: Thomas R. Geiger et al., Biochim. Biophys. Acta., 2009년, 293-308페이지). 또한, 상피계 이외의 악성 종양(육종 등)에 있어서도, 악성화하여, 운동능·침윤능을 획득한 종양 세포가, 혈관 등에 침입하고, 원격 조직의 혈관 내피로의 정착, 조직 내로의 침윤을 거쳐, 전이소가 형성되게 된다. 이와 같이, 악성 종양의 전이는, 종양 세포의 증식과는 완전히 다른 메카니즘에 의해 진행하는 것이며, 기존의 살세포 효과나 세포 증식 억제 활성을 가지는 약제로는 충분히 억제할 수 없다. 또한, 이들 약제에는, 일반적으로 정상 조직으로의 악영향이 있으므로, 장기간 투여한 경우에는 심각한 부작용의 문제가 있다. 악성 종양 전이의 제어에는, 통상 장기간의 투여가 필요하므로, 전이를 억제하기 위한, 안정성이 높은 약제의 발견·개발이 요구되고 있다.

세포 내의 cGMP는, 생체의 시그널 전달을 중개하는 세컨드 메신저로서 널리 알려져 있고, 특히 혈관 평활근의 제어에 있어서 많이 연구되고 있다. 혈관 평활근 세포의 세포내 cGMP의 상승은, 평활근을 이완시켜, 혈압이 낮추는 것이 일반적으로 알려져 있고, 이와 같은 작용을 가지는 약제의 대표적인 것으로서, 나트륨 이뇨 펩티드를 예로 들 수 있다.

나트륨 이뇨 펩티드와 같은 펩티드에는, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(ANP), 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드(BNP) 및 C형 나트륨 이뇨 펩티드(CNP)가 있으며, 이들 펩티드는, 세포 내에 구아닐레이트 시클라제 도메인을 가지는 막관통형(膜貫通型) 수용체와 특이적으로 결합하여, 세포 내의 cGMP를 상승시킴으로써 다양한 생리 활성을 발현하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 수용체로서는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A(별명: NPR-A)와 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B(별명: NPR-B)의 2종류가 있으며, ANP와 BNP는 GC-A에, CNP는 GC-B에 각각 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 2: Silver MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens., 2006년, 15권, 14-21 페이지).

ANP는, 심방 세포에서 생산되고 분비되는 아미노산 28개로 이루어지고 환상 구조를 가지는 펩티드이며, 신장에서는 이뇨 작용을 나타내고, 혈관에서는 혈관 평활근을 이완·확장한다. ANP는, 또한 레닌·안지오텐신·알도스테론계 및 바소프레신에 대하여 길항적으로 작용한다. 이들은, 종합적으로 혈압의 저하나 체액량의 저감 등을 통해 심장의 부담을 경감시키는 방향으로 작용한다. BNP는, 뇌로부터 발견된 아미노산 32개로 이루어지고 환상 구조를 가지는 펩티드이지만, 그 후의 연구에 의해 뇌보다 주로 심근 세포에서 생산·분비되고 있는 것으로 판명되었고, ANP와 동일한 작용을 가진다. ANP와 BNP는, GC-A에 특이적으로 결합하며, cGMP의 생산을 촉진하여 전술한 작용을 발현한다(비특허 문헌 3: Yoshibayashi M. et al, Eur. J. Endocrinol., 1996년, 135권, 265-268 페이지). 실제로, ANP는 울혈성 심부전 등에 있어서 심방 팽만압의 상승에 따라 분비가 촉진되고, 전술한 작용에 의해 울혈성 심부전 등의 증상을 경감시키는 기능을 하고 있으므로, 사람ANP(hANP)는 일본에서 급성 심부전 치료약으로서 임상에서 사용되고 있다. 또한, BNP도 심부전 환자에 있어서 분비가 항진되어 전술한 작용에 의해 심부전에 따른 여러 증상을 완화시키는 기능을 하고 있으므로, 사람 BNP(hBNP)는 미국 등에서 급성 심부전 치료약으로서 인가되어 있다.

ANP나 BNP는, 이뇨 작용, 혈관 확장 작용 등의 혈압 조정 작용 이외에도 다양한 생리 활성을 가지는 것으로 알려져 있으며, 예를 들면, 세균 감염에 의해 일어나는 염증이나 그에 따른 내피 보호 기능 부전에 대한 ANP의 작용(예를 들면, 비특허 문헌 4: Xung J., et al, J. appl. Physiol.(2011년), 110권, 1호, 213-224 페이지, 등)이 보고되어 있다. 악성 종양에 대해서는, ANP가, 실험적으로 암 세포의 증식을 억제하는 효과에 대하여 Vesely et al로부터 복수의 보고가 있다(예를 들면, 비특허 문헌 5(Vesely BA et al, Eur J Clin Invest.(2005), 35권, 60-69 페이지) 등). 이들 보고에서는, ANP뿐만 아니라, Long Acting Natriuretic Peptide, Vessel Dilator 및 Kalliuretic Peptide 등, 그 아미노산 서열로부터는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A에 결합하는 것으로 생각하기 어려운 펩티드가, ANP와 동일하거나, 그 이상으로 강한 암 세포 증식 억제 활성을 가지는 것으로 보고되어 있고, 또한, BNP는 이와 같은 증식 억제 작용을 나타내지 않는다고 보고되어 있다. 이와 같은 사실에 의해, 전술한 연구자들이 보고하는 ANP의 암 세포 증식 억제 작용은 GC-A에 대한 아고니스트 활성에 따른 것은 아닌 것으로 여겨진다. 또한, Vesely et al의 보고를 포함해도, ANP나 BNP의 종양 세포의 전이에 관련된 작용에 대해서는 알려져 있지 않다.

CNP는, 돼지의 뇌 내로부터 발견된 생리 활성 펩티드이며, 포유류의 체내에는, 22개의 아미노산으로 이루어지는 CNP-22와, 그 N 말단측이 연장하여, 53개의 아미노산으로 이루어지는 CNP-53이 존재 하는 것으로 알려져 있다. CNP는, 당초에는 뇌신경 펩티드로서 기능하고 있는 것으로 여겨졌지만, 그 후의 연구에 의해 말초에도 존재 하는 것이 판명되어, 뼈의 성장 과정에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되어 있다. 지금까지, CNP는, 주로 성장판의 연골 조직에 있어서 연골 세포의 분화나 증식을 제어하고 있는 것으로 확인되어 있고, 연골 무형성증을 비롯한 저신장증의 치료약으로서의 가능성이 기대되고 있다. CNP는, 뼈·연골 이외에서도 다양한 생리 활성이 알려져 있고, 혈관에 대해서는, 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하거나, 혈관 내피 세포의 증식을 촉진하는 등의 작용이 알려져 있다. 그러나, 악성 종양의 전이에 대한 CNP의 작용에 대해서는 알려져 있지 않다.

또한, 그 외의 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 약제로서 시트르산 실데나필과 같은 cGMP의 분해 효소인 포스포디에스테라아제(PDE) 5의 저해제, 니트로글리세린과 같은 NO 공급제, 아르기닌과 같은 eNOS 기질(基質), ANP나 BNP를 분해하는 중성 엔도펩티다아제(NEP)의 저해제 등이 알려져 있다. 또한, 소화관에 있어서 작용이 알려져 있는 구아닐레이트 시클라제 C(GC-C)의 아고니스트인 구아닐린, 유로구아닐린 등도 세포 내의 cGMP 농도를 상승시킨다. 이들 약제도, 염증 반응, 알레르기 반응을 포함한 다양한 생리 현상과 관련되어 있는 것으로 알려져 있고, 최근에는, 종양 세포의 제어에 관련되어 있는 것에 대한 보고도 몇 개가 있지만, 혈관 내피 세포에 작용하여, 실제 생리적 조건 하에서 종양 세포의 전이를 억제하는 것에 대해서는 알려져 있지 않다. 예를 들면, 실데나필은, 악성 종양에 대하여 억제 효과가 있다는 보고(예를 들면, 비특허 문헌 6: Das et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(2010년), 107권, 42호,18202-18207 페이지, 등)도 있고, 또한 종양 세포의 증식 및 전이에 대하여 영향을 미치지 않는다는 보고(예를 들면, 비특허 문헌 7: Dian C. N., et al, Journal of. Urology(2003년), 170권(3),994-997 페이지)도 있다. GC-C에 대해서는, 결장 직장암 세포에 있어서의 발현 항진이나 암 세포에 의한 MMP9 생산에 관련된 것(예를 들면, 비특허 문헌 8: Lubbe W. J., et al, Cancer Res.(2009년), 69권, 8호,3529-3536 페이지) 등이 알려져 있다. NO에 대해서는, LPS 처리된 단엽(單葉) 랫 후모세혈관 정맥에 대한 종양 세포의 접착을 저해하는 것에 대한 보고(비특허 문헌 9: Kong L., et al, Clin Exp. Metastasis (1996년), 14권, 3호, 335-343 페이지)가 있지만, 이는 LPS와 같은 강한 염증 유도제를 사용한 실험이며, 실제 종양 전이에 있어서의 생리 현상과는 동떨어진 것으로 여겨진다. 또한, 그 후 수십년간 이를 추종한 보고는 이루어지지 않고 있으며, 생리적인 종양 전이에 대한 작용에 대해서는 불분명하다.

그러나, 혈관 내피 세포에 작용하여 종양의 전이를 억제하는 것에 대해서는 알려져 있지 않다.

Thomas R. Geiger et al., Biochim. Biophys. Acta., 2009년, 293-308 페이지 Silver MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens., 2006년, 15권, 14-21 페이지 Yoshibayashi M. et al, Eur. J. Endocrinol., 1996년, 135권, 265-268 페이지 Xung J., et al, J. appl. Physiol.(2011년), 110권, 1호, 213-224 페이지 Vesely BA et al, Eur J Clin Invest.(2005), 35권, 60-69 페이지 Das et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(2010년), 107권, 42호, 18202-18207 페이지 Dian C. N., et al, Journal of. Urology(2003년), 170권(3), 994-997 페이지 Lubbe W. J., et al, Cancer Res.(2009년), 69권, 8호, 3529-3536 페이지 Kong L., et al, Clin Exp. Metastasis(1996년), 14권, 3호, 335-343 페이지

본 발명은, 암을 비롯한 악성 종양의 전이를 억제하기 위한, 안정성이 높은 의약을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 암의 전이를 억제할 수 있는 약제에 대하여 검토를 거듭한 결과, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트가, 암 세포의 EMT를 억제하고, 또한 암 세포의 유주능, 운동능, 침윤능 등 전이에 관련한 세포 활성의 획득을 억제하는 작용을 가지는 것과, 암 세포 특이적으로 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 것, 또한 숙주 측의 인자인 혈관 내피 세포에 작용함으로써, 암의 착상 전이를 억제하는 것 등을 발견하였다. 또한, 암 환자의 암 절제 방법에 있어서, 혈압이 변동하지 않는 저용량의 hANP를 수술후 3일간 투여한 환자군에 있어서 암의 재발이 현저하게 억제된 것을 실제 암환자에 있어서의 임상 연구에서 발견하였다. 또한, 종양 세포의 마우스 꼬리정맥 주입 전이 시험에 있어서, GC-A를 발현하는 종양 세포뿐만 아니라, B6 멜라노마와 같은 GC-A를 발현하지 않는 종양 세포의 전이에 대해서도, GC-A 아고니스트의 투여에 의해 현저한 종양 전이 억제 효과가 확인되었다. 또한, 내피 조직 특이적으로 GC-A 유전자를 녹아웃시킨 마우스를 사용한 동일한 전이 시험에서는, 야생형 마우스에 비해 현저한 종양 전이의 증대가 확인되었고, 반대로 GC-A 유전자를 내피 세포에서 과잉 발현시킨 마우스를 사용한 동일한 전이 시험에서는, 야생형 마우스에 비해 현저한 종양 전이의 억제가 확인되었고, 내피 조직에 발현하는 GC-A를 통한 시그널이, 종양 세포의 전이에 있어서 중추적 역할을 행하는 것으로 시사되었다. 또한, 동일한 전이 시험에 대하여, CNP와 같은 GC-B 아고니스트, 시트르산 실데나필과 같은 PDE5 저해제 등, GC-A 이외의 메카니즘에 의해 세포내 cGMP를 상승시키는 약제를 투여해도, 현저한 전이 억제 효과가 관찰되었다. 이러한 지견에 따라, 더욱 연구를 거듭하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트는, GC-A를 발현하는 종양 세포에 대해서는, 종양 세포에 직접 작용하여 EMT를 비롯한 유주능 및 침윤능을 억제함으로써 전이를 억제하는 효과(직접 효과)를 나타낸다. 이뿐만 아니라, GC-A 아고니스트, GC-B 아고니스트나 PDE5 저해제와 같이, 세포내 cGMP의 상승에 의한 시그널 전달을 일으키는 물질이 혈관이나 임파관의 내피 세포에 작용함으로써, 종양 세포에 있어서의 GC-A 발현의 유무에 관계없이 종양 세포의 혈관 내피로의 접착·침윤이 저해되어 종양의 전이를 억제하는 효과(간접 효과)도 가진다. 내피 세포에는 통상 GC-A, GC-B가 발현하고 있으므로, 이 간접 효과는 종양의 종류에 관계없이, 종양 전이를 억제할 수 있다.

본 발명은, 하기 발명을 제공한다.

본 발명은, 적어도 1종류의 혈관 내피의 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 약제(「혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제」라고 함)(예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트)를 유효 성분으로서 함유하는, 암 등의 악성 종양의 전이를 억제 또는 예방하기 위한 의약에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 암 등의 악성 종양의 전이 제어가 필요한 환자에 대하여, 적어도 1종류의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제(예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암 등의 악성 종양의 전이를 예방 또는 억제하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 나아가서는 암 등의 악성 종양의 전이의 예방 또는 억제에 있어서의 사용을 위한, 적어도 1종류의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제(예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트)에 관한 것이다.

본 발명이 제공하는 의약, 치료 방법 등(이하, 「의약 등」이라고 함)에 있어서, 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제는, 바람직하게는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트, GC-C 아고니스트, NEP 저해제, PDE5 저해제, NO 공급제, eNOS 활성화제, cGMP 아날로그 등으로서, 혈관 내피 세포에 작용하여 그 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 활성을 가지는 물질이다. 보다 바람직하게는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트, NEP 저해제 또는 PDE5 저해제이며, 더욱 바람직하게는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트이다. 본 발명의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제는, 적어도 혈관 또는 임파관의 내피 세포에 작용하여, 그 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 활성을 가지는 것이지만, 바람직하게는, 생체에 투여될 경우에 말초 혈관의 내피 세포의 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 것이다.

본 발명이 제공하는 의약 등에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트는, 하기 (a1) 내지 (a6)으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 약리적으로 허용되는 염이며, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 물질;

(a1) 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, (a2) 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드, (a1) 또는 (a2)의 활성 단편을 포함하는 물질, (a4) (a1) 내지 (a3) 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는, 부가된 변이체, (a5) (a1) 내지 (a4) 중 어느 하나의 유도체, 및 (a6) (a1) 내지 (a5) 중 어느 하나의 변형체인 것이 바람직하다.

여기서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트의 더욱 바람직한 태양으로서, 하기의 것 등을 각각 예로 들 수 있다.

(a1) 심방성 나트륨 이뇨 펩티드로서는, 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 것이 바람직하다. 또한, (a2) 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드로서는, 서열 목록의 서열 번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드인 것이 바람직하다. (a3) 활성 단편은, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가지는 펩티드이며, 보다 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2의 7번 내지 27번의 아미노산 서열, 서열 번호 3 또는 4의 10번 내지 30번의 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 번호 5의 23번 내지 43번의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이다. (a4) 변이체는, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산의 1개소∼수 개소에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것이며, 보다 바람직하게는, (i) 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 1번 내지 6번 및 28번 중 어느 1 개소∼수 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, (ii) 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 서열의 1 내지 9번, 31번 및 32번의 어느 1 개소∼수 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, 또는 (iii) 서열 번호 5의 아미노산 서열의 1번 내지 22번, 44번 및 45번 중 어느 1 개소∼수 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드이다. (a5) 유도체는, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 전술한 (a3) 활성 단편을 포함하는 것이며, 보다 바람직하게는, 면역 글로블린 Fc 부분, 혈청 알부민, 및 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열 중 적어도 1개를 추가로 포함하는 것이다. (a6) 변형체는, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 1개에 있어서, 화학적으로 변형(chemically modification)되어 있는 것이며, 보다 바람직하게는, PEG, PVA 등의 제약상(製藥上) 사용되는 고분자 폴리머를 결합시킴으로써 화학적으로 변형된 것이다.

또한, 본 발명에서 제공하는 의약 등에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트는, 항GC-A 항체일 수도 있다. 이와 같은 항GC-A 항체는, GC-A에 특이적으로 결합하고, 또한 GC-A에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 것을 사용할 수도 있다. 이와 같은 항체로서는, 폴리클로날 항체라도 되고, 모노클로날 항체라도 되지만, 바람직하게는, 사람화 모노클로날 항GC-A 항체, 또는 사람형 모노클로날 항GC-A 항체이다.

본 발명에서 제공하는 의약 등에 있어서는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트는, 하기 (b1) 내지 (b5)로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 약리적으로 허용되는 염이며, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 물질;

(b1) C형 나트륨 이뇨 펩티드, (b2) (b1)의 활성 단편을 포함하는 물질, (b3) (b1) 또는 (b2)의 아미노산 서열에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는, 부가된 변이체, (b4) (b1) 내지 (b3) 중 어느 하나의 유도체, 및 (b5) (b1) 내지 (b4) 중 어느 하나의 변형체인 것이 바람직하다.

여기서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트의 보다 바람직한 태양으로서, 하기의 것 등을 각각 예로 들 수 있다.

(b1) C형 나트륨 이뇨 펩티드는, 서열 목록의 서열 번호 7(hCNP-22), 서열 번호 8(hCNP-53), 서열 번호 9(닭 유래 CNP) 또는 서열 번호 10(개구리 유래 CNP)에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. (b2) 활성 단편은, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 11의 아미노산 서열을 가지는 것, 보다 바람직하게는, 활성 단편이 서열 목록의 서열 번호 7의 6번 내지 22번의 아미노산 서열(hCNP6-22)로 이루어지는 것이다. (b3) 변이체는, 서열 목록의 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 11로 표시된 아미노산 이외의 아미노산의 1 개소∼수 개소에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 것, 보다 바람직하게는 변이체가 (i) 서열 번호 7, 9 또는 10의 아미노산 서열의 1번 내지 5번 중 어느 1 개소∼수 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드, 또는 (ii) 서열 번호 8의 아미노산 서열의 1번 내지 36번 중 어느 1 개소∼수 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 펩티드이다. (b4) 유도체는, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 7 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것이나, 면역 글로블린 Fc 부분, 혈청 알부민, 및 그렐린의 C 말단 유래의 부분 서열 중 적어도 1개를 추가로 포함하는 것이다. (b5) 변형체는, 바람직하게는 서열 목록의 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 11로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 1개에 있어서, 화학적으로 변형되어 있는 것, 보다 바람직하게는 변형체가 제약상 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 변형된 것이다.

또한, 본 발명에서 제공하는 의약 등에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트는, 항GC-B 항체라도 된다. 이와 같은 항GC-B 항체는, GC-B에 특이적으로 결합하고, GC-B에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 것을 채용할 수도 있다. 이와 같은 항체로서는, 폴리클로날 항체라도 되고, 모노클로날 항체라도 되지만, 바람직하게는 사람화 모노클로날 항GC-B 항체, 또는 사람형 모노클로날 항GC-B 항체이다.

본 발명의 의약 등에 사용되는 PDE5 저해제로서는, 실데나필, 바르데나필, 타달라필, 우데나필, 미로데나필 등 많은 화합물이나, 이들의 약리학상 허용되는 염을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 시트르산 실데나필, 염산 바르데나필, 또는 타달라필이다.

또한, 본 발명에서 제공하는 의약 등에 있어서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 등의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제는, 환자의 혈압, 심박수 또는 뇨량 중 적어도 1항목을 크게 변동시키지 않는 정도의 용량으로 조절하여 투여할 수 있으며, 그 용량으로서는, 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 또는 GC-B 아고니스트에 있어서, 0.1 μg/kg/분 이하의 계속 투여이며, 바람직하게는 0.05 μg/kg/분 이하의 계속 투여이며, 보다 바람직하게는 0.025 μg/kg/분 이하의 계속 투여를 채용할 수 있다. 계속 투여의 경우의 투여 기간은, 통상 1일 이상이며, 바람직하게는 1 내지 몇일간이다.

또한, 본 발명에서 제공하는 의약 등은, 악성 종양의 절제 수술을 받는 환자에 대하여, 상기 수술에 대응한 기간(예를 들면, 상기 절제 수술 전날부터 수술후 몇일간) 투여되도록 한 형태로 이용될 수 있다. 이 경우의 투여 방법으로서 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 또는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 0.1 μg/kg/분 이하에서, 수술 전부터 수술후 일정 기간의 계속 투여이며, 바람직하게는 서열 번호 1 내지 5, 7 내지 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 0.05 μg/kg/분 이하의 용량으로, 종양 절제 수술 전부터 수술후 일정 기간(바람직하게는, 5일간 이하) 계속적으로 투여하는 것이며, 보다 바람직하게는, 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를, 0.025 μg/kg/분의 용량으로, 종양 절제 수술 전부터 수술후 3일간 계속적으로 투여하는 것이다.

또한, 본 발명에서 제공하는 의약 등에 있어서, 유효 성분으로서 2종류 이상의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제가 조합되어 투여(단일 제제로 배합되어도 되고, 별개로 제제화된 것을 동시에 또는 상이한 시기에 투여되어도 됨)하는 태양도 포함한다. 이와 같은 조합에 있어서, 바람직하게는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 또는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트와, PDE5 저해제 또는 NO 공급제의 조합이며, 보다 바람직하게는, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 7 또는 서열 번호 7의 아미노산 번호 6 내지 22로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드와 실데나필의 조합이다.

또한, 본 발명은, 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제(예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트)의 투여에 의해, 환자의 체내에 있어서의 혈관 내피 세포에 작용하여, 종양 세포의 혈관 내피 조직으로의 접착 및 침윤의 저해를 억제하는 약리 작용을 나타내는 의약 또는 치료 방법 등을 제공한다.

또한, 본 발명에서 제공하는 의약은, 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제로서 나트륨 이뇨 펩티드 GC-A 아고니스트를 함유하고, 상피계 악성 종양의 우려가 있는 대상(바람직하게는, 종양 세포에 있어서 GC-A가 발현하고 있는 대상)에 투여되는 것을 특징으로 하는 의약도 제공한다. 이 경우에, 혈관 내피에 대한 작용뿐만 아니라, GC-A를 발현하는 종양 세포에 대하여 종양 세포의 전이능 획득을 억제하는 약리 작용을 나타내므로 상승(相乘) 효과를 기대할 수 있다. 이와 같은 종양 세포에 대한 약리 작용으로서는, 암 세포의 EMT의 억제, 암 세포의 유주능 획득의 저해, 암 세포의 운동능 획득의 저해, 암 세포의 침윤의 억제 및 암 세포 특이적인 아포토시스 유도로부터 선택되는 적어도 하나이며, 복수의 작용을 나타내는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 등의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제를 유효 성분으로 하는 악성 종양의 전이를 억제 또는 예방하기 위한 의약은, 임파관 또는 혈관의 내피 세포에 작용하여, 종양 세포의 혈관 내피로의 접착, 침윤을 억제함으로써, 종양의 종류를 불문하고 전이를 억제 또는 예방 가능하다는 우수한 효과가 있다. 특히, 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제로서 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 함유하는 의약에 대해서는, GC-A를 발현하는 종양 세포에 대하여 EMT, 유주 활성, 침윤 활성 등의 전이와 관련된 각 과정을 억제하는 효과를 나타내고, 악성 종양의 전이를 복수의 단계에서 억제 가능한 특별 효과를 얻을 수 있다. 이와 같은 본 발명의 우수한 효과에 의해, 악성 종양의 전이나 종양 절제 방법에 의한 치료 후의 재발의 예방뿐만 아니라, 절제가 곤란한 악성 종양의 전이도 효과적으로 억제, 예방할 수 있다. 또한, hANP, hBNP, 실데나필 등은, 이미 임상에서 많은 환자에게 투여되어 안전성이 확인되고 있으므로, 본 발명에서 제공하는 의약은, 부작용의 리스크가 적고, 또한 우수한 종양 전이 억제 작용을 가지는 의약이 된다.

도 1은, A549 세포에 대한 나트륨 이뇨 펩티드(hANP(●), hBNP(▼), hCNP(○) 자극에 의한 세포내 cGMP 레벨의 변동을 나타내는 그래프이다. 그래프의 각 점에 있어서의 예의 수는, n=5∼7이다.
도 2는, 각 농도의 hANP(도 2의 A), hBNP(도 2의 B), hCNP(도 2의 C) 존재 하 및 비존재 하에서의 A549 세포의 증식 상황을, 배양 48시간까지 살아있는 세포 수에 의해 나타낸 그래프이다. 각 나트륨 이뇨 펩티드의 농도는, 컨트롤(0 M)(○), 1×10^-9 M(●), 1×10^-8 M(△), 1×10^-7 M(□) 및 1×10^-6 M(▼)이다. 그래프의 각 점에 있어서의 예의 수는, n=10∼12이다.
도 3은, 1μM의 hANP 존재 하(도 3의 C) 및 비존재 하(도 3의 B)에서의 TGF-β1 자극에 의한 A549 세포의 형태 변화를 나타낸 현미경 사진이다(도 3의 A: 무자극의 A549 세포(컨트롤), 도 3의 B: TGF-β1(1 ng/ml), 도 3의 C: hANP(1μM)＋TGF-β1(1 ng/ml).
도 4는, A549 세포를, 1μM의 hANP 존재 하 및 비존재 하에서, 각각 0.25, 0.5 및 1.0 ng/ml TGF-β1으로 자극했을 때의, EMT의 지표가 되는 각 인자(각각 도 4의 A: VEGF-A, 도 4의 B: E-cadherin, 도 4의 C: N-cadherin, 도 4의 D: PDGF-B, 도 4의 E: TNF-α 및 도 4의 F: IL-6)의 유전자 발현에 대하여, mRNA 레벨로 나타낸 그래프이다. 그래프 중, 가로 축은 TGF-β1의 농도를 나타내고, 세로 축은, mRNA 레벨을 나타낸다. 또한, 그래프 중, 1μM의 hANP 비존재 하에서의 각 유전자의 발현은, 회색 바에 의해, hANP 존재 하에서의 각 유전자의 발현은, 흑색 바에 의해, 각각 표시된다.
도 5는, A549 세포를, 1μM의 hANP 존재 하 및 비존재 하에서, 각각 0.25, 0.5 및 1.0 ng/ml TGF-β1으로 자극했을 때의, E-Cadherin과 N-Cadherin의 발현 비율(N-Cad/E-Cad)을 나타낸 그래프이다. 그래프의 가로 축은 TGF-β1의 농도를 나타내고, 세로 축은, E-Cadherin과 N-Cadherin의 발현 비율(N-Cad/E-Cad)을 나타낸다. 1μM의 hANP 비존재 하에서의 E-Cadherin과 N-Cadherin의 발현 비율(N-Cad/E-Cad)은, 회색 바에 의해, hANP 존재 하에서의 E-Cadherin과 N-Cadherin의 발현 비율(N-Cad/E-Cad)은, 흑색 바에 의해, 각각 표시된다.
도 6의 A 및 도 6의 B는, 유주 야기 물질로서 TGF-β1을 사용한 Boyden Chamber Assay에 있어서, hANP의 존재 하 및 비존재 하에 있어서의, A549 세포의 유주능을 나타낸 도면이다. 도 6의 A는, 각 군에 있어서의, 어세이 20시간 후의 셀컬쳐인서트(cell culture insert) 하면의 세포 현미경 사진이다(도 6의 A의 a: 컨트롤군, 도 6의 A의 b: TGF-β1군, 도 6의 A의 c:TGF-β1 ＋ hANP군). 도 6의 B는, 각 군에 있어서의, 어세이 20시간 후의 셀컬쳐인서트 하면에 부착된 세포수를 나타내는 그래프이다.
도 7은, 창상 치유 어세이(Wound Healing Assay)에 있어서의 부상당한 직후의 디쉬의 상처 부분의 현미경 사진(도 7의 A), 및 컨트롤군(도 7의 B), TGF-β1군(도 7의 C) 및 TGF-β1 ＋ hANP군(도 7의 D) 각 군의, 부상당한 24시간 후의 디쉬의 상처 부분의 현미경 사진이다.
도 8은, 창상 치유 어세이에 있어서의 컨트롤군, TGF-β1군 및 TGF-β1 ＋ hANP군 각 군의 상부 24시간 후의 이동율을 나타내는 그래프이다.
도 9의 A 및 도 9의 B는, 유주 야기 물질로서 TGF-β1을 사용하고, 상층에 마트리겔(Matrigel) 층을 형성한 Boyden Chamber Assay에 있어서, hANP의 존재 하 및 비존재 하에 있어서의, A549 세포의 침윤능을 나타낸다. 도 9의 A는, 각 군에 있어서의, 어세이 40시간 후의 셀컬쳐인서트 하면의 세포의 현미경 사진이다(도 9의 A의 a: 컨트롤군, 도 9의 A의 b: TGF-β1군, 도 9의 A의 c: TGF-β1 ＋ hANP군). 도 9의 B는, 각 군에 있어서의, 어세이 40시간 후의 셀컬쳐인서트 하면에 부착된 세포수를 나타내는 그래프이다.
도 10은, 각종 암 세포(도 10의 A: A549 세포, 도 10의 B: H460 세포, 도 10의 C: H520 세포, 도 10의 D: H358 세포)에 대한, hANP의 농도(1, 5, 10 μM)에 의존한 아포토시스 유도를 나타내는 그래프이다.
도 11은, 시스플라틴의 각 농도에 있어서의 1μM의 hANP에 의한, 각종 암 세포(도 11의 A: A549 세포, 도 11의 B: H460 세포, 도 11의 C: H520 세포, 도 11의 D: H358 세포)에 대한 아포토시스 유도를 나타내는 그래프이다. 그래프의 가로 축은 시스플라틴의 농도를 나타낸다. 각 그래프 중, 회색은 시스플라틴(CDDP) 단독군, 흑은 1μM의 hANP군이다.
도 12는, 시스플라틴의 각 농도에 있어서의 10μM의 hANP에 의한, 각종 암 세포(도 12의 A: A549 세포, 도 12의 B: H460 세포, 도 12의 C: H520 세포, 도 12의 D: H358 세포)에 대한 아포토시스 유도를 나타내는 그래프이다. 그래프의 가로 축은 시스플라틴의 농도를 나타낸다. 각 그래프 중, 회색은 시스플라틴(CDDP) 단독군, 흑은 10μM의 hANP군이다.
도 13은, 포화 배양한 HUVEC 세포의 세포간 접착에 대한 VEGF, 및 hANP의 작용을 나타내는 현미경 사진이다(도 13의 좌측 위: 컨트롤, 우측 위: VEGF를 첨가한 HUVEC 세포, 좌측 아래: hANP를 첨가한 HUVEC 세포, 우측 아래: VEGF 및 hANP를 첨가한 HUVEC 세포). 도 13 중, 원 또는 타원형으로 염색(회색(실제 컬러 사진에서는 청색))된 개소는, Topro3에 의해 염색된 세포핵이다. 세포 외연(外緣) 부근에 띠형으로 염색된 개소(세포핵 이외의 띠형 염색 부분: 회색(실제 컬러 사진에서는녹색))는, 면역 염색된 VE-cadherin이며, 세포간 접착의 상황을 나타낸다.
도 14는, 폐암 절제술 환자의, 컨트롤군 및 hANP군에 있어서의, 수술후 조기(2년 이내) 무재발 생존율(누적 생존율)을 Kaplan-Meier법(중단 변수로서 암의 재발을 채용)에 의해 해석한 결과를, 암의 진행도별(도 14의 A: 1A기(Stage 1A), 도 14의 B: 1B기(Stage 1B), 도 14의 C: 2기(Stage 2), 도 14의 D: 3기(Stage 3))로 나타내는 그래프이다. 평균 관찰 기간은, hANP군: 21.8개월, 컨트롤군: 22.0개월이다. 도 14의 A, 도 14의 B, 도 14의 C 및 도 14의 D 중, ●, ■, ▲ 및 ◆은 각각, 컨트롤군을 나타낸다. 그래프 상에 플롯이 표시되지 않은 것은, 사망, 재발 등의 이벤트가 발생하지 않은 것을 의미한다.
도 15는, hANP 투여군(○)(n=23) 및 컨트롤군(●)(n=21)의, 암 절제술 전부터 수술후 4일까지의, 확장기 혈압(도 15의 A), 수축기 혈압(도 15의 B), 심박수(도 15의 C) 및 뇨량(도 15의 D)을 각각 나타내는 그래프이다.
도 16은, 형광 라벨한 A549 세포의 마우스 미정맥(尾靜脈) 주입 전이 시험에 있어서의 종양 세포 주입 8주일 후의 폐의 형광 현미경 사진이다. 도 16의 A는 컨트롤군(생리 식염수 28일간 투여)의 사진이며, 도 16의 B는 ANP 투여군(hANP: 0.5μg/kg/분, 28일간 투여)의 사진이다.
도 17은, GFP 라벨한 A549 세포의 마우스 미정맥 주입 전이 시험에 있어서의 종양 세포 주입 8주일 후의 폐로의 전이에 의해 형성된 결절(結節)수를 나타내는 그래프이다. 세로 축은, 폐에 형성된 결절수를 나타낸다. 좌측 바는, 컨트롤군(생리 식염수 28일간 투여)이며, 우측 바는 ANP 투여군(hANP: 0.5μg/kg/분, 28일간 투여)이다.
도 18은, 마우스 멜라노마 B16-F10 세포의 마우스 미정맥 주입 전이 시험에 있어서의 종양 세포 주입 2주일 후의 폐의 현미경 사진이다. 검은 부분은 전이 한 멜라노마에 의해 형성된 결절(전이소)이다. 도 18의 A는 컨트롤군(생리 식염수)의 사진이며, 도 18의 B는, ANP 투여군(hANP: 0.5μg/kg/분 )의 사진이다.
도 19는, 마우스 멜라노마 B16-F10 세포의 마우스 미정맥 주입 전이 시험에 있어서의 종양 세포 주입 2주일 후의 폐로의 전이에 의해 형성된 결절수를 나타내는 그래프이다. 세로 축은, 1개체당 폐에 형성된 결절수를 나타낸다. 각 바는, 좌측으로부터 우측으로, 컨트롤군(생리 식염수 투여), ANP 투여군(hANP: 0.5μg/kg/분, 계속 투여), BNP 투여군(마우스 BNP: 0.5μg/kg/분, 계속 투여), CNP 투여군(hCNP-22: 2.5μg/kg/분, 계속 투여) 및 실데나필 투여군(시트르산 실데나필: 20 mg/kg, 복강내 투여)을 나타내고 있다.
도 20은, 마우스 멜라노마 B16-F10 세포의, GC-A 녹아웃 마우스에 대한 미정맥 주입 전이 시험에 있어서의 종양 세포 주입 2주일 후의 폐로의 전이에 의해 형성된 결절수를 나타내는 그래프이다. 세로 축은, 1개체당 폐에 형성된 결절수를 나타낸다. 좌측 바는 야생형 마우스, 중앙의 바는, 전신성 GC-A 녹아웃 마우스, 우측 바는 내피 특이적 GC-A 녹아웃 마우스의 결과를 나타낸다.
도 21은, 마우스 멜라노마 B16-F10 세포의, 혈관 내피 특이적 GC-A 과잉 발현 마우스로의 미정맥 주입 시험에 있어서의 종양 세포 주입 2주일 후의 폐로의 전이에 의해 형성된 결절수를 나타내는 그래프이다. 세로 축은, 1개체당 폐에 형성된 결절수를 나타낸다. 우측 바는 혈관 내피 특이적 GC-A 과잉 발현 마우스, 좌측 바는 야생형의 결과를 나타낸다.

<혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제>

본 발명에 있어서, 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제란, 적어도, 생체 내의 임파관이나 혈관의 내피 세포에 작용하여, 그 세포내 cGMP 농도를 상승에 기인하는 시그널 전달을 항진하는 활성(세포내 cGMP 증강 활성이라고 함)을 가지는 약제를 의미한다. 혈관 내피 세포의 cGMP는 혈중에도 방출되므로, 생체 내에 있어서, 이 증강 활성은, 혈관 내피 세포 내뿐만 아니라 혈중 cGMP 농도의 상승으로서도 관찰할 수 있다. 세포 내의 cGMP는, 구아닐레이트 시클라제(GC, GC로서는, GC-A나 GC-B와 같은 막관통 수용체형과 가용형(sGC)이 있음)에 의해 생산되므로, GC의 활성화를 일으키는 것에 의해 상승한다. 또한, 세포 내의 cGMP는 포스포디에스테라아제5(phosphodiesterase 5, (PDE5))에 의해 분해되므로, 예를 들면, 실데나필과 같은 PDE5 저해제를 작용시킴으로써도 세포내 cGMP 농도의 상승이 일어난다. 또한, 외래성 cGMP나 그 아날로그가 추가되는 것에 의해서도, 세포내 cGMP 농도 상승을 개재한 시그널이 항진될 수 있다. 본 발명에 있어서의 세포내 cGMP 증강 활성이란, 직접적, 또는 간접적으로, 세포내 cGMP 농도의 상승을 통한 시그널 전달을 항진하는 활성이면, 그 메카니즘에 대해서는 묻지 않지만, GC-A의 활성화, GC-B의 활성화 및 PDE5의 저해인 것이 바람직하고, GC-A의 활성화 작용이 더욱 바람직하다.

막 관통 수용체형의 GC로서는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B가 혈관 내피 세포에 있어서 발현이 확인되어 있다. 그러므로, 이들에 대한 아고니스트인 ANP나 CNP 등의 나트륨 이뇨 펩티드가, 본 발명의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제로서 사용될 수 있다. 특히, GC-A 아고니스트는, 혈관 내피로의 작용뿐만 아니라, 종양 세포에 GC-A가 발현하는 상피계의 악성 종양에 대해서는, 종양 세포의 EMT, 유주 활성 등을 억제하는 활성을 가지고 있고, 상피계 악성 종양에 대해서는, 양호한 전이 억제 작용을 발휘한다. 또한, 각종 나트륨 이뇨 펩티드는, NEP(Neutral endopeptidase)(NEP)에 의해 절단되어, 활성이 소실한다. 그러므로, NEP 저해제도 본 발명의 세포내 cGMP 증강제로서 사용될 수 있다.

또한, 주로 소화기관에 있어서의 작용이 알려져 있는 GC-C에 대한 아고니스트인 구아닐린, 유로구아닐린 등도 세포내 cGMP 증강 활성을 가지는 것으로 알려져 있다.

가용형 GC로서는, sGCα, sGCβ 등이 알려져 있지만, 이들은 NO(Nitric Oxide)에 의해 활성화된다. 그러므로, 니트로글리세린 등의 NO 공급제, 내피 세포에 발현하는 NO 생산 효소인 eNOS의 기질(아르기닌 등)이나 활성화제도, 본 발명의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제로서 사용할 수 있다.

종양 세포의 전이의 대부분은, 말초의 혈관이나 임파관의 내피 조직에 접착함으로써 달성된다. 그러므로, 본 발명의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제는, 생체에 투여되었을 때, 말초 혈관의 내피 세포에 있어서의 cGMP 농도를 상승시키는, 또는 말초의 피의 cGMP 농도를 상승시킬 수 있는 약제인 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제의 혈관 내피 세포에 대한 세포내 cGMP 증강 활성은, 본 발명의 지견에 따라 통상적인 방법을 채용하여 확인할 수 있다. 예를 들면, HUVEC와 같은 혈관 내피 유래 세포나 동물로부터 채취한 혈관 내피 조직의 배양액에, 피험 물질을 첨가하고, 일정 기간 배양한 후, 시판중인 cGMP 측정 키트(예를 들면, Cyclic GMP Assay kit(야마사사 제조)를 사용하여, 세포내 또는 배양액 중의 cGMP 농도를 측정한다. 그 결과를, 피험 물질 비첨가의 경우와 비교함으로써 cGMP 농도의 상승을 검출할 수 있다. 또한, 마우스 등의 실험 동물에 대하여 피험 물질을 투여하고, 혈액 중의 cGMP 농도를 측정하고, 동일 동물에 있어서의 투여 전의 혈중 cGMP 농도 또는 비투여군의 혈중 cGMP 농도와 비교하는 것에 의해서도, 혈관 내피 세포로의 세포내 cGMP 증강 활성을 측정할 수 있다.

본 발명에 사용되는 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제로서는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트, GC-C 아고니스트, NEP 저해제, PDE5 저해제, NO 공급제, eNOS 활성화제, cGMP 아날로그 등으로서, 혈관 내피 세포에 작용하여 그 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 활성을 가지는 것이면, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트, NEP 저해제 또는 PDE5 저해제이며, 더욱 바람직하게는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트이다.

<나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트>

본 발명에 있어서, 「나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트」란, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A(이하, 간단히 「GC-A」로 표기하는 경우도 있다.(Chinkers M, et al., Nature 338; 78-83, 1989))에 결합하고, 그 구아닐레이트 시클라제를 활성화하는 작용(이하, 「GC-A 아고니스트 활성」)을 가지는 물질을 의미하고, 본 명세서에 있어서는 간단히 「GC-A 아고니스트」로 표기하는 경우도 있다. 대표적인 GC-A 아고니스트로서는, 예를 들면, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(Atrial Natriuretic Peptide: ANP)나 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드(Brain Natriuretic Peptide: BNP)를 들 수 있다. 본 발명의 GC-A 아고니스트는, GC-A 아고니스트 활성을 가지는 것이면 특별히 한정되지 않고, ANP, BNP, 이들의 활성 단편 및 이들의 변이체, 이들의 유도체 및 이들의 변형체 등을 사용할 수 있다. 또한, ANP나 BNP는 구조상 공통성을 가지고 있지 않은 펩티드나 저분자 화합물이라도, GC-A 아고니스트 활성을 가지는 것이면, 본 발명의 GC-A 아고니스트에 포함된다.

본 발명에 있어서의 ANP로서는, 28개의 아미노산으로 이루어지는 사람 유래 ANP(SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY: 서열 번호 1), 랫 유래 ANP(SLRRSSCFGG RIDRIGAQSG LGCNSFRY: 서열 번호 2) 등을 예로 들 수 있다. 사람 유래 ANP에 대해서, Biochem. Biophys. Res. Commun., 118권, 131페이지, 1984년에 기재된 α-hANP가, 일반명 카페리티드(carperitide)로서 일본에서 제조 판매 승인을 취득하여, 판매(상품명: 한프, HANP)되고 있다. α-ANP는, 일반적으로는 Humanpro-ANP[99-126]로서도 알려져 있다.

본 발명에 있어서의 BNP로서는, 32개의 아미노산으로 이루어지는 사람 유래 BNP(SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH: 서열 번호 3), 돼지 유래 BNP(SPKTMRDSGC FGRRLDRIGS LSGLGCNVLR RY: 서열 번호 4), 랫 유래 BNP(SQDSAFRIQE RLRNSKMAHS SSCFGQKIDR IGAVSRLGCD GLRLF: 서열 번호 5) 등을 예시할 수 있다. 사람 BNP는 일반명 네시리티드(nesiritide)로서 미국 등에서 약사 승인(pharmaceutical approval)을 받아, 상품명: 나트레코르(Natrecor)로서 판매되고 있다.

또한, 각종 ANP 및 BNP에 있어서, 서열 중에 포함되는 2개의 Cys 잔기 사이의 디술피드 결합에 의해 형성되는 링 구조(예를 들면, hANP에서는, 서열 번호 1의 7번 Cys와 23번 Cys의 사이에서 디술피드 결합하여 링 구조를 형성, hBNP에서는, 서열 번호 3의 10번 Cys와 26번 Cys의 사이에서 디술피드 결합하여 링 구조를 형성)에 포함되는 17개의 아미노산으로 이루어지는 서열 및 그 C 말단에 계속되는 아미노산 서열에 있어서, Cys -Phe -Gly -Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Asp -Arg -Ile -Xaa5 -Xaa6 -Xaa7 -Xaa8 -Xaa9 -Leu -Gly -Cys -Xaa10 -Xaa11 -Xaa12 -Arg(여기서, Xaa3은 Met, Leu 또는 Ile)(서열 번호 6, 이하 「링 구조 서열 A」라고 함)가, 각종 펩티드 사이에서 양호하게 보존되어 있고, 수용체의 결합과 활성 발현에 중요한 것으로 여겨지고 있다(Silver, MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.(2006), 15, p14-21, A. Calderone, Minerva Endocrinol.(2004), 29, p.113-127).

<나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트>

본 발명에 있어서, 「나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트」란, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B(간단히 「GC-B」로 표기하는 경우도 있음(Suga S., et al., Endocrinology(1992), 130(1), p.229-239)에 결합하고, 그 구아닐레이트 시클라제를 활성화하는 작용(이하, 「GC-B 아고니스트 활성」)을 가지는 물질을 의미하고, 본 명세서에 있어서는 간단히 「GC-B 아고니스트」로 표기되는 경우도 있다. 대표적인 GC-B 아고니스트로서는, 예를 들면, C형 나트륨 이뇨 펩티드(C-type Natriuretic Peptide: CNP)를 들 수 있다. 본 발명의 GC-B 아고니스트는, GC-B 아고니스트 활성을 가지는 물질이면 특별히 한정되지 않고, CNP, 그 활성 단편, 이들의 변이체, 이들의 유도체 및 이들의 변형체 등을 사용할 수 있다. 또한, CNP는 구조상의 공통성을 가지고 있지 않은 펩티드나 저분자 화합물이라도, GC-B 아고니스트 활성을 가지는 것이면, 본 발명의 아고니스트에 포함된다.

본 발명에 있어서의 CNP로서는, 22개의 아미노산으로 이루어지는 사람 유래 CNP-22(GLSKGCFGLK LDRIGSMSGL GC: 서열 번호 7, 본 명세서에서, hCNP-22라고도 함, 돼지 및 랫 등 포유류에서는 공통의 아미노산 서열을 가짐), 53개의 아미노산으로 이루어지는 사람 유래 CNP-53(DLRVDTKSRA AWARLLQEHP NARKYKGANK KGLSKGCFGL KLDRIGSMSG LGC: 서열 번호 8, 본 명세서에서, hCNP-53라고도 함), 닭 유래 CNP(GLSRSCFGVK LDRIGSMSGL GC: 서열 번호 9), 개구리 유래 CNP(GYSRGCFGVK LDRIGAFSGL GC: 서열 번호 10) 등을 예로 들 수 있다.

각종 CNP에 있어서, 서열 중에 포함되는 2개의 Cys 잔기 사이의 디술피드 결합에 의해 형성되는 링 구조(예를 들면, hCNP-22에서는, 서열 번호 7의 6번 Cys와 22번 Cys의 사이에서 디술피드 결합하여 링 구조를 형성)가 GC-B 수용체로의 결합과 활성 발현에 중요한 것으로 여겨지고 있다(Furuya, M. Et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(1992), 183, No3, p.964-969, Silver, MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.(2006), 15, p14-21, A. Calderone, Minerva Endocrinol.(2004), 29, p.113-127). Furuya et al의 보고에 의하면, 링 구조만으로 이루어지는 펩티드인 hCNP6-22(서열 번호 7의 아미노산 번호 6 내지 22로 이루어지는 펩티드)나 링 구조의 N 말단과 C 말단에 각각 ANP의 N 말단측, C 말단측의 서열을 부가해도, hCNP-22와 대략 동일한 정도의 GC-B 아고니스트 활성을 나타내는 것과, hCNP-22의 9번 Leu와 10번 Lys에 변이를 가지는 펩티드에서는 활성이 감약(減弱)하지만, 그 이외의 부위(예를 들면, 17번 Ser, 18번 Met)에 변이를 가지는 펩티드나 hANP의 10 내지 12번의 아미노산 서열을 대응하는 hCNP-22의 서열인 Leu-Lys-Leu(서열 번호 7의 9번 내지 11번)로 치환한 펩티드는, hCNP-22와 대략 동일한 정도의 GC-B 아고니스트 활성을 나타내는 것 등이 보고되고 있다. 이들 지견으로부터, GC-B 아고니스트 활성에 중요한 링 구조의 아미노산 서열은, Cys -Phe -Gly -Leu -Lys -Leu -Asp -Arg -Ile -Gly -Xaa1 -Xaa2 -Ser -Gly -Leu -Gly -Cys(여기서, Xaa1은, Ser 또는 Ala, Xaa2는 Met, Phe 또는 Glu를 나타냄: 서열 번호 11)이며, 이하에서, 이 서열을 「링 구조 서열 B」라고 한다.

본 발명에 있어서, 생물 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질의 「활성 단편」이란, 상기 펩티드 또는 단백질의 생물 활성과 관련된 부위로 이루어지고, 또한 상기 펩티드 또는 단백질이 가지는 생물 활성 중 적어도 일부를 유지하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서의 ANP 또는 BNP의 활성 단편으로서, 전술한 GC-A에 결합하고, 그 구아닐레이트 시클라제를 활성화하는 작용을 가지는 펩티드를 사용할 수 있다. 이와 같은 활성 단편으로서는, 전술한 링 구조 서열 A(서열 번호 6의 아미노산 서열)를 가지는 펩티드, 바람직하게는 링 구조 서열 A(서열 번호 6의 아미노산 서열)로 이루어지는 펩티드를 예로 들 수 있다. 그 구체예로서는, 서열 번호 1 또는 2의 7 내지 27번에 기재된 아미노산 서열, 서열 번호 3 또는 4의 10 내지 30번에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 5의 23 내지 43번에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않고, 링 구조 서열 A를 가지고, GC-A 아고니스트 활성을 가지는 것은, 본 발명의 ANP 또는 BNP의 활성 단편으로서 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 CNP의 활성 단편으로서, 예를 들면, 서열 번호 7 내지 10중 어느 하나의 아미노산 서열 중 적어도 일부 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GC-B 아고니스트 활성을 가지는 펩티드를 사용할 수 있다. 이와 같은 활성 단편으로서는, 전술한 링 구조 서열 B(서열 번호 11의 아미노산 서열)를 가지는 펩티드, 바람직하게는 링 구조 서열 B(서열 번호 11의 아미노산 서열)로 이루어지는 펩티드를 예로 들 수 있으며, 그 구체예로서는, hCNP6-22, 서열 번호 7, 9 또는 10의 아미노산 서열의 1번 내지 5번에 있어서, 1번을 포함하는, 연속하는 아미노산이 일부 또는 모두 결손된 펩티드, 서열 번호 8의 아미노산 서열의 1번 내지 36번에 있어서, 1번을 포함하는, 연속하는 아미노산이 일부 또는 모두 결손된 펩티드 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않고, 링 구조 서열 B를 가지고, GC-B 아고니스트 활성을 가지는 것은, 본 발명의 CNP의 활성 단편으로서 채용할 수 있다.

본 발명의 GC-A 아고니스트 및 GC-B 아고니스트로서는, 전술한 활성 단편 그자체를 채용할 수도 있고, 또한, 활성 단편의 N 말단, C 말단 또는 그 양쪽에 1개 내지 복수의 아미노산이 부가된 펩티드(활성 단편의 유도체)라도, 원하는 아고니스트 활성을 유지한다면, 채용할 수 있다. 이와 같은 펩티드로서는, hCNP6-22의 N 말단, C 말단 및 그 양쪽에, ANP의 C 말단, 및 N 말단으로부터 유래하는 서열을 부가한 펩티드(Furuya, M. Et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(1992), 183, No 3, p.964-969) 등을 예로 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 생물 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질의 「변이체」란, 상기 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열의 한 개소∼수 개소에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는, 부가(이하, 「치환 등」이라고 함)된 것이며, 또한 상기 펩티드 또는 단백질이 가지는 생물 활성 중 적어도 일부를 유지하는 것을 의미한다. 「수 개소」란, 통상 3개소 정도, 바람직하게는 2개소 정도이다. 「수개」란, 통상 10개 정도, 바람직하게는 5개 정도, 보다 바람직하게는 3개 정도, 더욱 바람직하게는 2개 정도이다. 복수 개소에서 치환 등이 행해지는 경우에는, 치환, 결실, 삽입 및 부가의 어느 하나라도 되고, 2가지 이상이 조합되어 있어도 된다. 또한, 치환 등이 행해지는 아미노산은, 천연에 존재하는 아미노산이라도 되고, 그 아실화체 등의 변형물이라도 되고, 인공적으로 합성된 아미노산 유사체라도 된다. 또한, 치환 등이 행해지는 부위는, 바탕이 되는 펩티드 또는 단백질의 활성의 일부가 유지된다면, 어느 부위를 선택해도 되지만, 상기 바탕이 되는 펩티드 또는 단백질의 활성 부위 또는 수용체 결합 부위, 그 외의 개소에서 치환 등이 행해진 것이 바람직하다. ANP나 BNP의 변이체로서는, GC-A 아고니스트 활성이 유지된다면, 원하는 부위에 있어서 치환 등이 행해진 것을 채용할 수 있지만, 바람직하게는, 전술한 링 구조 서열 A가 유지되고, 그 이외의 부위에서 치환 등이 행해진 펩티드를 예로 들 수 있다.

예를 들면, ANP의 변이체는, GC-A 아고니스트 활성을 가진다면, 예를 들면, 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열 중의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해져도 되지만, 바람직하게는, 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 6번 및 28번의 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이다. 또한, BNP의 변이체는, GC-A 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해져 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 3 또는 4에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 9번, 31번 및 32번의 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것, 또는 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열의 1번 내지 22번, 44번 및 45번 중 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 펩티드 등이다.

ANP의 변이체의 구체예로서는, 예를 들면, hANP의 12번의 Met가 Ile로 치환된 랫 α-rANP(Biochem. Biophys. Res. Commun., 121권, 585페이지, 1984년), N 말단의 Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser가 결실된 hANP 등을 들 수 있다. 이와 같은 ANP 또는 BNP 변이체로서는, 예를 들면, Medicinal Research Review, 10권, 115페이지, 1990년에 기재되어 있는 일련의 펩티드 등이 있다. 또한, 아미노산 서열의 1개 내지 복수의 아미노산이 결실되고, 또한 아미노산 서열의 1개 내지 복수의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 예로서는, 예를 들면, 15 아미노산 잔기로 이루어지는 mini-ANP(Science, 270권, 1657페이지, 1995년) 등이 있다.

또한, CNP의 변이체로서는, GC-B 아고니스트 활성이 유지된다면, 원하는 부위에 있어서 치환 등이 행해진 것을 채용할 수 있지만, 바람직하게는, 전술한 링 구조 서열 B가 유지되고, 그 이외의 부위에서 치환 등이 행해진 펩티드를 예로 들 수 있다. 구체적인 CNP의 변이체로서는, GC-B 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 7 내지 10에 기재된 아미노산 서열 중의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해져 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 중의 서열 번호 11로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 7, 9 또는 10에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 5번의 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것, 또는 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열의 1 내지 36번의 어느 1개소∼수 개소에서 1개∼수개의 아미노산이 치환 등이 행해진 것이다.

CNP의 변이체의 구체예로서는, hCNP-22의 17번과 18번에 변이를 가지는 펩티드가 hCNP-22와 동등한 GC-B 아고니스트 활성을 가지는 것, 이와 같은 변이체의 링 구조 부분의 N 말단과 C 말단을 hANP 유래의 서열로 치환한 변이체의 유도체에서도 hCNP-22의 활성의 90% 정도의 GC-B 아고니스트 활성을 나타내는 것, hCNP-22의 9번 내지 11번 중 어느 1개소에 변이를 가지는 펩티드가 hCNP-22의 50% 이상의 GC-B 아고니스트 활성을 나타내는 것, hCNP-22의 10번과 11번의 양쪽에 변이를 가지는 펩티드가 hCNP-22의 40% 이상의 GC-B 아고니스트 활성을 가지는 것 등이 보고되어 있다(Furuya, M. Et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(1992), 183, No 3, p.964-969). 또한, 다른 문헌에서는, hCNP-22의 각종 변이체가, GC-B 아고니스트 활성을 유지하는 것과, 나아가서는 그 중에는 CNP의 분해 효소인 중성 엔도펩티다아제(NEP)에 의한 절단에 대한 내성을 가지는 것 등에 대하여 기재되어 있다(WO2009/067639호 팜플렛). 또한, 다른 hCNP-22의 유도체로서 CD-NP가 알려져 있다. 이는 hCNP-22의 C 말단에 뱀독 유래의 나트륨 이뇨 펩티드인 DNP (dendroapsis natriuretic peptide)의 C 말단 서열이 부여된 펩티드이며, GC-A 아고니스트 활성과 GC-B 아고니스트 활성의 양쪽을 유지하는 것으로서 알려져 있다(Deborah et al., J. Biol. Chem.,(2008), Vol. 289, No.50, pp.35003-35009).

본 발명에 있어서, 생물 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질의 「유도체」란, 상기 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 포함하고, 또 다른 펩티드 또는 단백질이 부가된 융합 펩티드이며, 또한 상기 생리 활성 펩티드 또는 단백질이 가지는 생물 활성 중 적어도 일부를 유지하는 융합 펩티드를 의미한다. 이와 같은 생물 활성(본 발명에 있어서는, GC-A 또는 GC-B에 결합하고, 그 구아닐레이트 시클라제를 활성화하는 작용) 중 적어도 일부를 가지는 융합 펩티드를, 생리 활성 펩티드의 유도체라고도 한다. 본 발명의 유도체에 있어서, 바탕이 되는 생리 활성 펩티드 또는 단백질의, C 말단 또는 N 말단의 한쪽에 부가 펩티드가 융합되어 있어도 되고, C 말단 및 N 말단의 양쪽에 부가 펩티드가 융합된 것이라도 된다. 부가되는 펩티드로서는, 특별히 한정되지 않지만, 그 펩티드 자신이 생리 활성을 가지지 않는 것이 바람직하다. 또한, 부가 펩티드는 직접 결합하고 있어도 되고, 1개∼수개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 통하여 결합하고 있어도 된다. 링커 서열로서는, 다양한 것이 알려져 있지만, Gly, Ser 등을 많이 포함하는 것이 바람직하게 사용된다. 이와 같은 부가 펩티드로서는, 면역 글로블린(바람직하게는 IgG)의 Fc 부위, 혈청 알부민, 그렐린의 C 말단측 서열 등을 예로 들 수 있다(예를 들면, ANP를 면역 글로블린의 Fc 부위와 결합시킨 융합 단백질(미국 특허 공개 US2010-0310561 등 참조), GLP-1을 혈청 알부민과 결합시킨 융합 단백질(국제 특허 공개 WO2002/046227 등 참조). 본 발명의 GC-A 아고니스트로서 사용되는 유도체로서는, ANP 또는 BNP의 유도체, ANP 또는 BNP의 활성 단편의 유도체, ANP 또는 BNP의 변이체의 유도체 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 hANP의 유도체 및 hBNP의 유도체이다. 본 발명의 GC-B 아고니스트로서 사용되는 유도체로서는, CNP의 유도체, CNP의 활성 단편의 유도체, CNP의 변이체의 유도체 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 hCNP-22의 유도체, hCNP-53의 유도체 또는 hCNP6-22의 유도체이다.

GC-A 아고니스트로서 채용되는 유도체의 예로서는, 예를 들면, ANP를 면역 글로블린의 Fc 부위와 결합시킨 융합 단백질(미국 특허 공개 US2010-0310561 등 참조)이 ANP의 생물 활성을 유지한 채, 혈중 체류성이 개선되는 것으로 알려져 있다. 또한, ANP 및 BNP의 각종 유도체로서는, 예를 들면, Medicinal Research Review, 10권, 115페이지, 1990년에 기재되어 있는 일련의 펩티드가 있다.

또한, ANP나 CNP의 유도체의 구체예로서, 국제 특허 공개 WO2009/142307호 공보(대응 미국 특허 공개 US2010-305031호 공보)에 개시된 각종 ANP 유도체, CNP 유도체 등을 들 수 있다. 여기서는, ANP, CNP, 모치린 등의 생리 활성 펩티드에, 그렐린의 C 말단으로부터 유래하는 부분 서열을 부가한 유도체에 있어서, 원(元) 펩티드의 생리 활성을 유지한 채, 혈중 체류성이 개선된 것으로 보고되어 있다. 이 보고에서는, hANP의 N 말단 또는 C 말단의 어느 한쪽 및 이들 양쪽에 그렐린의 C 말단 유래의 부분 펩티드를 부가한 다양한 유도체 모두에, GC-A 아고니스트 활성이 유지되고, 그 혈중 반감기가 연장되었다. 또한, hCNP6-22의 N 말단 또는 C 말단의 어느 한쪽 및 이들 양쪽에 그렐린의 C 말단 유래의 부분 펩티드를 부가한 다양한 유도체 모두에, GC-B 아고니스트 활성이 유지되고, 그 혈중 반감기가 연장되었다.

또한, CNP 또는 그 활성 단편의 유도체의 다른예로서, hCNP-22의 C 말단에 ANP의 C 말단 부분이 부가된 펩티드나, hCNP6-22의 N 말단 및 C 말단에 ANP의 N 말단 부분 및 C 말단 부분이 부가된 펩티드(CNP 활성 단편의 유도체)에 있어서도, CNP-22와 같은 정도의 GC-B 아고니스트 활성이 유지되고 있다(Furuya, M. Et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(1992), 183, No3, p.964-969). 또한, 다른 문헌에 있어서, hCNP-22 및 hCNP-53의 각종 유도체가, GC-B 아고니스트 활성을 유지하고, 그 중의 복수의 유도체가 NEP 분해 내성을 가지는 것 등에 대하여 기재되어 있다(WO2009/067639호 팜플렛).

이들 기존의 나트륨 이뇨 펩티드의 유도체는, 본 발명의 GC-A 아고니스트 및/또는 GC-B 아고니스트로서 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 생물 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질의 「변형체」란, 상기 펩티드 또는 단백질에 포함되는 아미노산의 1개소 내지 수 개소가, 다른 화학물질과의 화학 반응에 의해 변형된 것으로, 또한 상기 펩티드 또는 단백질이 가지는 생물 활성 중 적어도 일부를 유지하는 것을 의미한다. 변형되는 부위는, 바탕이 되는 펩티드 또는 단백질의 활성을 유지한다면, 어느 부위를 선택해도 된다. 예를 들면, 폴리머와 같은 어느 정도 큰 화학 물질을 부가하는 변형에서는, 펩티드 또는 단백질의 활성 부위, 또는 수용체 결합 부위 이외의 개소에 있어서 변형되는 것이 바람직하다. 또한, 분해 효소에 의한 절단을 방지하기 위한 변형의 경우, 상기 절단을 받는 개소가 변형된 것도 채용할 수 있다.

화학적 변형의 방법으로서는, 다양한 방법이 알려져 있지만, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA) 등 제약 기술에 있어서 이용되는(약리적으로 사용되는) 고분자 폴리머를 부가하는 방법이나, Lys 잔기 등의 측쇄의 아미노기에 링커가 되는 화합물을 부가시키고, 이를 통해 다른 단백질 등(예를 들면, 혈청 알부민)과 결합시키는 방법 등이 알려져 있지만, 이들로 한정되지 않고, 다양한 방법을 채용할 수 있다. 또한, 다양한 생리 활성 펩티드의 변형체의 제조 방법에 대해서는, 예를 들면, 미국 특허 공개 US2009-0175821호 등을 참고하여, 적절하게 제작할 수 있다. 변형체는, 바람직하게는 제약상 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 변형된 것이다.

예를 들면, ANP의 변형체는, GC-A 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열 중의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 변형되어 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 6으로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 1개에 있어서, 화학적으로 변형되어 있는 것이다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 변형된 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 1 내지 6번 및 28번 중 어느 1개소∼수 개소에서 변형된 것이다. 또한, BNP의 변이체는, GC-A 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 변형되어 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 목록의 서열 번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열을 포함하고, 그 서열 번호 6으로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 1개에 있어서, 화학적으로 변형되어 있는 것이다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열 중의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 변형된 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 서열의 1 내지 9번, 31번 및 32번 중 어느 1개소∼수 개소에서 변형된 것, 또는 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열의 1번 내지 22번, 44번 및 45번 중 어느 1개소∼수 개소에서 변형된 것이다. 또한, 전술한 ANP 또는 BNP의 활성 단편, 변이체 및 이들의 유도체의 변형체도 본 발명에 포함된다. 이와 같은 각종 변형체도 GC-A 아고니스트 활성을 유지한다면, 본 발명에 사용할 수 있다.

이와 같은 GC-A 아고니스트로서 채용될 수 있는 변형체의 구체예로서는, 예를 들면, hBNP, 그 변이체 및 그 활성 단편에, PEG, PVA 등의 친수성 폴리머나 알킬기, 아릴기 등의 탄화수소기로 대표되는 소수성기가 결합된 각종 변형체에 있어서, GC-A 아고니스트 활성을 유지하는 것으로 알려져 있다(미국 특허 USP7, 662,773호 등 참조).

ANP 또는 BNP와 GC-A 수용체와의 결합은, ANP 및 BNP의 링 구조와 그 C 말단 테일 부분이 중요하며, 특히 그 N 말단부에 다른 서열 또는 물질이 결합한 유도체나 변형체는, 그 부가 펩티드나 변형물이 링 구조에 영향을 미치는 경우가 적고, GC-A 수용체와의 결합을 저해하지 않고 GC-A 아고니스트 활성을 유지하게 된다. 이는, 전술한 많은 문헌에 의해 실증되고 있다.

또한, CNP의 변형체는, GC-B 아고니스트 활성을 가진다면, 서열 번호 7 내지 10중 어느 하나의 아미노산 서열 중의 원하는 1개∼복수의 개소에 있어서 변형되어 있어도 되지만, 바람직하게는, 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열 중의 서열 번호 11로 표시된 아미노산 이외의 아미노산에 있어서 1개소∼수 개소에서 변형된 것이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 7, 9 또는 10의 아미노산 서열의 1 내지 5번의 어느 1개소∼수 개소에서 변형된 것이다. 또한, 효소 NEP에 의한 절단에 대한 내성을 부여하는 변형의 경우에는, 각종 CNP 펩티드에 포함되는, 링 구조 서열 B에 있어서 서열 번호 11의 1번 Cys와 2번 Phe의 사이에서 절단되는 것이 알려져 있으므로, 이 사이의 결합을 변형할 수도 있다.

또한, 전술한 CNP의 활성 단편, 변이체 및 이들의 유도체의 변형체도 본 발명에 포함된다. 이와 같은 각종 변형체도 GC-B 아고니스트 활성을 유지한다면, 본 발명에 사용할 수 있다.

이와 같은 CNP, 그 활성 단편, 이들 변이체 및 이들의 유도체의 변형체의 구체예로서는, 예를 들면, WO2009/067639호 팜플렛에 있어서, hCNP-22 및 hCNP-53에 PEG 등의 각종 친수성 폴리머를 결합시킨 변형체나, hCNP-22에 있어서 NEP에 의한 절단 부위인 Cys6-Phe7의 펩티드 결합이 (-CH₂-NH-)나 (-C(=O)-N(R)-: R은, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기 등의 저급 알킬기를 나타냄) 등의 위(僞) 펩티드 결합에 치환된 변형체의 복수개가, GC-B 아고니스트 활성을 유지하고, 또한, 그 대부분이 hCNP-22보다 개선된 혈중 체류성을 가지는 것으로 개시되어 있다. 또한, 다양한 생리 활성 펩티드의 변형체의 제조 방법에 대하여는, 예를 들면, 미국 특허 공개 US2009-0175821호 등을 참고하여, 적절하게 제작할 수 있다.

CNP와 GC-B 수용체와의 결합은, CNP의 링 구조가 중요하며, 특히 그 C 말단 및/또는 N 말단부에 다른 서열 또는 물질이 결합한 유도체나 변형체는, 그 부가 펩티드나 변형물이 링 구조에 영향을 미치는 경우가 적고, GC-B 수용체와의 결합을 저해하지 않고 GC-B 아고니스트 활성을 유지하게 된다. 이는, 전술한 많은 문헌에 의해 실증되고 있다.

상기 ANP, BNP 및 CNP, 이들의 활성 단편, 이들의 변이체, 이들의 유도체 및 이들의 변형체는, 천연의 세포 또는 조직으로부터 채취된 것이라도 되고, 유전자 공학적, 세포 공학적인 방법을 이용하여 생산한 것이라도 되며, 화학적으로 합성한 것이라도 되고, 또한 이들을 효소 처리나 화학 처리하여 아미노산 잔기를 변형 또는 아미노산 서열의 일부를 제거한 것이라도 된다. 이와 같은 제조는, 본 명세서에 기재된 문헌을 참고하여, 통상적인 방법에 따라 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명의 GC-A 아고니스트 또는 GC-B 아고니스트로서는, 단일 물질 중에 GC-A 아고니스트와 GC-B 아고니스트로서의 양쪽 성질을 겸비하는 물질(본 발명에서는, 「양 활성 물질」이라고도 함)을 사용할 수도 있다. 이와 같은 양 활성 물질로서는, GC-A 아고니스트 활성과 GC-B 아고니스트 활성의 양쪽을 유지하는 물질이면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 물질로서는, 예를 들면, 링 구조 서열 A(서열 번호 6)와 링 구조 서열 B(서열 번호 11)의 양쪽을 동일 분자 중에 포함하는 물질(예를 들면, 양쪽의 서열을 포함하는 융합 펩티드나, 양쪽의 서열로 이루어지는 펩티드가 링커 화합물을 통하여 연결된 변형체 등)이나, 링 구조 서열 A와 링 구조 서열 B의 특징을 융합하여 겸비하는 아미노산 서열을 포함하는 물질 등이 있다. 이와 같은, 양 활성 물질의 구체예로서는, CD-NP가 알려져 있다. 이것은 hCNP-22의 C 말단에 뱀독 유래의 나트륨 이뇨 펩티드인 DNP(dendroapsis natriuretic peptide)의 C 말단 서열이 부여된 펩티드이며, GC-A 아고니스트 활성과 GC-B 아고니스트 활성의 양쪽을 유지하는 것으로서 알려져 있다(Deborah et al., J. Biol. Chem.,(2008), Vol. 289, No.50, pp.35003-35009). 또한, 다른예로서는, hANP(서열 번호 1)의 9번 내지 11번을, Leu- Lys- Lue로 치환한 펩티드에 있어서, GC-A 아고니스트 활성과 GC-B-아고니스트 활성의 양쪽이 유지되고 있다(Furuya, M. Et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(1992), 183, No3, p.964-969).

또한, 본 발명의 GC-A 아고니스트 및 GC-B 아고니스트는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 또는 GC-B에 대한 항체이며, 또한 각각의 수용체에 대한 아고니스트 활성을 가지는 것을 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 「항체」란, 대상이 되는 항원(GC-A 또는 GC-B)과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 결합 활성을 유지하는 단편(결합 단편, 예를 들면, Fab 프래그먼트(fragment) 등). 또한, 본 발명의 항체로서는, 항혈청, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일쇄 항체, 사람형 항체, 사람 항체, 이들 중 어느 하나의 활성 단편 등을 예로 들 수 있다. 이들 항체는, 면역원이 되는 수용체 전체 또는 그 때 방해 도메인을 면역원으로서 사용하여, 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 사람화 항체에 대해서는, 예를 들면, WO91/009968호 등의 기재를 참조할 수 있고, 사람형 항체에 대하여는, 예를 들면, WO92/03918호, WO94/25585호 등의 기재를 참조할 수 있으며, 또한 다양한 주지 기술을 채용할 수 있다. 또한, 제조된 항체에 대하여, 후술하는 방법에 의해 GC-A 아고니스트 활성 또는 GC-B 아고니스트 활성을 측정하는 것에 의해, 원하는 활성을 가지는 항체를 선발할 수 있다.

본 발명의 GC-A 아고니스트로서 사용되는 항GC-A 항체는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A에 특이적으로 결합하고, 또한 GC-A 아고니스트 활성을 가지는 항체 또는 그 결합 단편이며, 바람직하게는, 모노클로날 항체인 항GC-A 모노클로날 항체이며, 보다 바람직하게는 사람화 항GC-A 항체 또는 사람형 항체인 항GC-A 항체이다.

또한, 본 발명의 GC-B 아고니스트로서 사용되는 항GC-B 항체는, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B에 특이적으로 결합하고, 또한 GC-B 아고니스트 활성을 가지는 항체 또는 그 결합 단편이며, 바람직하게는, 모노클로날 항체인 항GC-B 항체이며, 보다 바람직하게는 사람화 항체인 항GC-B 항체 또는 사람형 항체인 항GC-B 항체이다.

어떤 물질이, GC-A 아고니스트 활성을 가지는지의 여부에 대해서는, 당업자이면 종래 알려져 있는 방법에 의해 용이하게 측정을 실시할 수 있다. 구체적으로는, GC-A(Chinkers M, et al., Nature 338; 78-83, 1989)를 강제 발현시킨 배양 세포에 물질을 첨가하고, 세포내 cGMP 레벨을 측정함으로써 가능하게 된다. GC-A 아고니스트 활성의 일부가 유지된다는 것은, 동일한 시험계를 사용하여, GC-A 아고니스트 물질과 ANP 또는 BNP(상기 아고니스트 물질이 ANP 또는 BNP의 서열을 참고로 하여 제작된 것인 경우에는, 상기 참고로 한 펩티드)를 나란히 두고 GC-A 아고니스트 활성을 측정한 경우에, cGMP 상승 활성의 피크가, 적어도 ANP 또는 BNP가 나타내는 cGMP 상승 활성 피크의 약 10% 이상을 유지하는 것을 통상 의미하지만, 바람직하게는 약 30% 이상을 유지하는 것이며, 보다 바람직하게는 약 50% 이상을 유지하는 것이며, 더욱 바람직하게는 약 70% 이상을 유지하는 것을 의미한다.

어떤 물질이, GC-B 아고니스트 활성을 가지는지의 여부에 대해서는, 당업자이면 종래 알려져 있는 방법에 의해 용이하게 측정을 실시할 수 있다. 구체적으로는, GC-B(Chinkers M, etal., Nature 338; 78-83, 1989)를 강제 발현시킨 배양 세포에 물질을 첨가하고, 세포내 cGMP 레벨을 측정함으로써 가능하게 된다. GC-B 아고니스트 활성의 일부가 유지된다는 것은, 동일한 시험계를 사용하여, GC-B 아고니스트 물질과 CNP를 배열하여 GC-B 아고니스트 활성을 측정한 경우에, cGMP 상승 활성의 피크가, 적어도 CNP가 나타내는 cGMP 상승 활성 피크의 약 10%를 유지하는 것을 통상 의미하지만, 바람직하게는 약 30% 이상을 유지하는 것이며, 보다 바람직하게는 약 50% 이상을 유지하는 것이며, 더욱 바람직하게는 약 70% 이상을 유지하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 GC-A 아고니스트 활성 또는 GC-B 아고니스트 활성에 있어서, 상기 방법으로 피크에 있어서 활성의 상승이 크게 없어도, 생체에 투여한 경우의 활성 지속 시간이 긴 것은, 본 발명에 사용할 수 있다. 이와 같은 평가를 위해서는, 동물에 대하여 피험 물질을 투여하고, 혈중의 cGMP 농도를 경시적으로 측정한다. 얻어진 데이터에 대하여, X축 2시간, Y축에 cGMP 농도를 플롯팅한 그래프를 작성하고, 그 선의 아래의 면적(AUC)을, ANP나 CNP 등의 대조 물질과 비교하여 평가할 수 있다. 이 평가 방법에 있어서 활성을 유지한다는 것은, 대조 물질과 비교하여, 통상 약 10% 이상을 유지하는 것을 의미하지만, 바람직하게는 약 30% 이상을 유지하는 것이며, 보다 바람직하게는 약 50% 이상을 유지하는 것이며, 더욱 바람직하게는 약 70% 이상을 유지하는 것을 의미한다.

또한, 이와 같은 평가계에 대하여, 저분자 화합물을 첨가하고, cGMP 생산능이 향상되도록 한 화합물이면, 나트륨 이뇨 펩티드와 공통되는 구조를 가지고 있지 않은 것(예를 들면, 저분자 화합물)이라도, GC-A 아고니스트 또는 GC-B 아고니스트로서 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명의 GC-A 아고니스트로서 바람직한 것은, ANP, BNP, 그 링 구조 서열 A를 가지는 활성 단편, 또는 그 링 구조 서열 A 이외에서 치환 등이 행해진 변이체, 이들의 유도체 또는 변형체이며, 보다 바람직하게는 hANP, hBNP, 이들의 유도체 또는 이들 변형체이며, 더욱 바람직하게는, hANP 또는 hBNP이다.

본 발명의 GC-B 아고니스트로서 바람직한 것은, CNP, 그 링 구조 서열 B를 가지는 활성 단편, 또는 그 링 구조 서열 B 이외에서 치환 등이 행해진 변이체, 이들의 유도체 또는 변형체이며, 보다 바람직하게는 hCNP-22, hCNP-53, 그 활성 단편인 hCNP6-22, 이들의 유도체 또는 이들의 변형체이며, 또한 보다 바람직하게는, hCNP-22, hCNP-53 또는 hCNP6-22이다.

<NEP 저해제>

본 발명에 사용되는 NEP 저해제로서는, NEP에 의한 전술한 바와 같은 나트륨 이뇨 펩티드의 천연형의 절단을 억제하는 활성을 가지는 것이면, 특별히 한정되지 않고 사용할 수 있으며, 많은 문헌에서 소개되고 있다(예를 들면, Cuculi, E et al.(Expert Opinn Investig Drugs)(2011), 20(4), pp.457-463), Matthew I. et al.(Br. J. Clin. Pharmacol.(2004), 57(1), pp.27-36). 본 발명의 목적에 있어서, NEP 저해제로서 NEP 선택적 저해제라도 된다. 본 발명의 NEP 저해제로서, sampatrilat, sinorphan, omapatrilat, Gemopatrilat, Fasidotril, Mixanpril, Z-13752A, MDI-100240 등이 바람직하다. 이들 약제는, 상기 참고 문헌(그 인용 문헌을 포함함)의 기재 및 주지의 기술에 의해, 제조 및 제제화할 수 있다.

<PDE5 저해제>

본 발명에 사용되는 PDE5 저해제로서는, 혈관 내피 세포에 작용하여, PDE5 효소에 의한 cGMP의 분해를 저해하는 활성을 가지는 물질이면, 특별히 한정되지 않고, 공지된 다양한 약제를 채용할 수 있다(예를 들면, M. P. Govannoni, et al.(Curr. Med. Chem.(2010) 17, pp. 2564-2587) 등 참조). 바람직하게는, 실데나필(sildenafil), 바르데나필(vardenafil), 타달라필(tadalafil), 우데나필(udenafil), 미로데나필(mirodenafil), SLx-2101, 로데나필(lodenafil), Lodenafil carbonate, Exisulind 등, 및 이들의 유도체, 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염이며, 보다 바람직하게는, 실데나필, 바르데나필, 타달라필, 우데나필, 미로데나필 또는 이들의 약리학상 허용되는 염이며, 더욱 바람직하게는, 시트르산실데나필, 염산 바르데나필, 타달라필, 우데나필 또는 미로데나필이며, 가장 바람직하게는, 시트르산실데나필이다. 이들 약제는, 상기 참고 문헌(그 인용 문헌을 포함함)의 기재 및 주지의 기술에 의해, 제조 및 제제화할 수 있다.

<GC-C 아고니스트>

본 발명에 사용되는 GC-C 아고니스트로서는, GC-C에 결합하여, 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 활성을 가지는 것이면 특별히 한정되지 않고, 공지의 다양한 물질을 사용할 수 있다(예를 들면, Potter L. R. (Pharmacology & Therapeutics (2011), 130(1), pp.71-82) 등). 예를 들면, 본 발명에 사용되는 GC-C 아고니스트로서는, ST(Heat Stable Enterotoxin)나 그 유연 물질(reelated substance), 구아닐린(guanylin), 유로구아닐린(uroguanylin) 등의 펩티드, 그 활성 단편, 이들의 변이체, 이들의 유도체 또는 변형체 등이 있으며, 바람직하게는, 리나클로티드(linaclotide), 구아닐린 또는 유로구아닐린이다. 이들 약제는, 상기 참고 문헌(그 인용 문헌을 포함함)의 기재 및 주지의 기술에 의해, 제조 및 제제화할 수 있다.

<NO 공급제>

본 발명에 사용되는 NO 공급제란, 그 자체 또는 그 분해물, 대사물이 NO 구조를 가지고, NO를 방출하는 물질이며, 본 기술 분야에 있어서는 다양한 NO 공급제가 알려져 있으며(예를 들면, (J. Clin. Hypertens.(2006), No.12, vol.8, suppl.4, pp.40-52) 등 참조), 예를 들면, NO 가스, 질산약, Sydnomine 등이 있다. Sydnomine으로서는, 예를 들면, molsidomine이나 그 활성 대사물인 linsidomine 등이 있다. 이들에 대해서는, 예를 들면, R. P. Mason, et al(J. Clin Hypertens.(2006), 8(Sppl. S12), pp.40-52) 등에 기재되어 있으며, 이들 문헌(그 인용 문헌을 포함함)의 기재 및 주지의 기술에 의해 제조, 제제화 등을 행할 수 있다.

<eNOS 활성화제>

본 발명의 eNOS 활성화제는, NOS(Nitric Oxide Synthase)의 기질 또는 상기 효소의 활성을 향상시키는 약제이면, 특별히 한정되지 않고 다양한 것을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 L-아르기닌이다. NOS는, L-아르기닌으로부터 NO를 생산하는 효소이며, 혈관 내피에는, 내피형 NOS(eNOS)가 항상적(恒常的)으로 발현하고 있다. 그러므로, eNOS의 기질인 L-아르기닌의 혈중 농도를 높임으로써, NO 생산이 항진(亢進)되어, 혈관 내피 세포에 있어서 세포내 cGMP 농도의 상승이 일어난다.

<cGMP 또는 그 아날로그>

본 발명에 사용되는 cGMP 아날로그는, cGMP의 화학 구조(guanosine 3',5'-cyclic monophosphate)에 화학적 변형을 행한 물질로서, cGMP 의존성 프로테인키나제를 활성화하는 작용을 가지는 물질이며, 공지의 문헌(예를 들면, Corbin J. D., et al.(J. Biol. Chem.(1986), 261(3), pp.1208-1214) 등)에 기재된 다양한 것을 채용할 수 있지만, 바람직하게는, 8-bromo cGMP(8-bromoguanosine 3',5'-cyclic monophosphate)이다.

본 발명에 있어서, 「의약」이란, 규정된 유효 성분을 함유하고, 규정된 약리 작용의 발현을 위해 이용되는 의약품을 의미하고, 그 형태, 조성, 투여 방법 등에는 한정되지 않는다. 본 발명의 의약의 실시형태로서는, 그 유효 성분이, 단일의 제품으로서 제품화되어도 되고, 복수의 제품을 조합시켜 사용함으로써 본 발명이 달성되도록 한 태양도 포함한다.

본 발명에 있어서 「유효 성분」이란, 의약품에 포함되는 조성의 하나이며, 상기 의약품이 목적으로 하는 약리 작용 중 적어도 일부 작용을 가지는 조성을 의미한다. 의약품에 대한 함유량/함유 비율은 특별히 한정되지 않으며, 상기 성분이 가지는 약리 작용의 정도에 의존하여, 다양한 비율로 배합될 수 있다.

본 발명에 따른 의약에 있어서 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질은, 전술한 GC-A 아고니스트 등의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강 활성을 가지는 물질의 약학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 hANP, hBNP, hCNP-22, hCNP-53, hCNP6-22 또는 실데나필의 약학적으로 허용되는 염이라도 된다. 즉, 본 발명에 있어서는, 전술한 물질의, 무기산, 예를 들면, 염산, 황산, 인산, 또는 유기산, 예를 들면, 포름산, 아세트산, 부티르산, 숙신산, 시트르산 등의 산부가 염을, 유효 성분으로서 사용할 수도 있다. 또는, 본 발명에 있어서는, 전술한 물질의, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘 등의 금속염, 유기 염기에 의한 염의 형태를 유효 성분으로서 사용할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 의약 조성물은, 그 유효 성분에 따른 물질의 유리형(遊離型)으로 만들 수도 있고, 또는 그 의약적으로 허용할 수 있는 염이라도 된다. 실데나필의 염으로서도 가장 바람직한 것은, 시트르산염이다.

본 발명에 따른 의약 등의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염은, 공지의 약리학적으로 허용할 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 의약 조성물로 만들고, 의약에 일반적으로 사용되고 있는 투여 방법, 즉 경구 투여 방법, 또는 경점막 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여 또는 피하 투여 등의 비경구 투여 방법에 따라 개체에 투여하는 것이 바람직하다.

유효 성분이 펩티드성 물질인 경우, 소화관 내에서 쉽게 분해되지 않는 제제, 예를 들면, 활성 성분인 펩티드를 리보솜 중에 포용(包容)한 마이크로 캡슐제로서 경구 투여할 수도 있다. 또한, 직장(直腸), 비내(鼻內), 설하(舌下) 등의 소화관 이외의 점막으로부터 흡수하는 투여 방법도 가능하다. 이 경우에는 좌제(坐劑), 점비(点鼻) 스프레이, 흡입약, 설하정(舌下錠)과 같은 형태로 개체에 투여할 수 있다. 또한, 덱스트란 등의 다당류, 폴리아민, PEG 등으로 대표되는 생분해성 고분자를 캐리어로 한 각종 방출 제어 제제, 지속화 제제 등을 채용함으로써, 펩티드의 혈중 체류성을 개선시킨 제제도, 본 발명에 있어서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 의약의 유효 성분으로서 이용할 수 있는 물질의 투여량은, 질환의 종류, 개체(환자)의 연령, 체중, 증상의 정도 및 투여 경로 등에 따라 상이하지만, 일반적으로, 1종류의 유효 성분에 대하여 1일당 합계 투여량의 상한으로서는, 예를 들면, 약 100 mg/kg 이하이며, 바람직하게는 약 50 mg/kg 이하이며, 더욱 바람직하게는 1 mg/kg 이하이다. 또한, 1종류의 유효 성분에 대하여 1일당 합계 투여량의 하한으로서는, 예를 들면, 약 0.1μg/kg 이상이며, 바람직하게는 0.5μg/kg 이상이며, 더욱 바람직하게는, 1μg/kg 이상이다.

본 발명에 따른 약제(의약 조성물)의 투여 빈도는, 사용하는 유효 성분, 투여 경로, 및 처치(處置)하는 특정 질환에 의해서도 변동한다. 예를 들면, 나트륨 이뇨 펩티드를 경구 투여하는 경우, 1일당 4회 이하의 투여 횟수로 처방하는 것이 바람직하고, 또한 비경구 투여, 예를 들면, 정맥내 투여하는 경우에는, 주입펌프(infusion pump), 카테터(catheter) 등을 이용하여 지속적으로 투여하는 것이 바람직하다.

ANP나 BNP 등의 펩티드 또는 이들의 염을 투여하는 경우에는, 예를 들면, 동결건조 제제를 주사용수에 혼합하여 미량 수액 펌프(그것이 없는 경우에는, 소아용 미량 수액 세트) 등을 사용하여 연속 투여(계속 투여라고도 함)하면 된다. 연속 투여하는 경우의 투여 기간으로서는, 수 시간∼몇일간(예를 들면, 3∼14 일간(바람직하게는, 3∼7일간) 정도)이다. 이 경우의 투여량의 유효 성분으로서의 상한은, 각 유효 성분에 대하여 예를 들면, 약 50μg/kg/분(1일당, 약 72 mg/kg) 이하의 농도를 적절하게 채용할 수 있고, 약 5μg/kg/분(1일당, 약 7.2 mg/kg) 이하라도 되고, 바람직하게는 약 0.5μg/kg/분(1일당, 720μg/kg) 이하이며, 보다 바람직하게는 약 0.2μg/kg/분 이하이며, 더욱 바람직하게는 약 0.1μg/kg/분 이하이며, 가장 바람직하게는 약 0.05μg/kg/분 이하이다. 또한, 하한으로서는, 약 0.0001μg/kg/분(1일당 약 0.144μg/kg) 이상이며, 바람직하게는 약 0.001μg/kg/분(1일당 1.44μg/kg) 이상이다. 구체적인 투여 방법으로서는, 예를 들면, 3일간 이상(바람직하게는, 3 내지 4 일간), 약 0.025μg/kg/분을 채용할 수 있으며, 이 경우의 1일당 투여량은, 유효 성분으로서 약 36μg/kg이 된다.

나트륨 이뇨 펩티드는, 전술한 바와 같이 혈관을 이완·확장하여 혈압을 저하시키는 작용을 가지므로, 악성 종양의 전이의 예방 및/또는 치료에 있어서는, 혈압을 필요 이상으로 저하시키지 않는 속도로 투여하는 것이 바람직하고, 투여시 및 투여 직후에는 혈압을 모니터링하는 것이 바람직하다. 또한, 이 경우의 hANP 등의 투여 기간은, 통상은 1일 이상이다. 이 기간 동안, 계속 투여하는 것이 바람직하고, 이 경우의 투여 기간으로서는 통상 1일 이상이며, 바람직하게는 몇일간이며, 보다 바람직하게는 1일 이상 5일간 이하이다. 장기간에 걸쳐 악성 종양을 제어하는 경우, 상기 투여 방법을 적절하게 반복하거나 환자의 상태에 따라 투여량이나 투여 기간을 적절하게 변경할 수 있다.

또한, 본 발명의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제의 투여량으로서는, 투여를 받은 대상의 말초 혈관의 내피 세포에 대하여 세포내 cGMP 농도를 상승시키거나, 또는 말초 혈액 중의 cGMP 농도를 상승시키는 정도의 용량, 용법이 선택되는 것이 바람직하다. 이와 같은, 용량·용법은, 환자의 말초혈을 채취하여, cGMP 농도를 모니터링함으로써, 적절하게 선택할 수 있다.

구체적으로 ANP를 정맥에 투여하는 경우에는, 예를 들면, ANP의 1000μg(예를 들면, 한프 주사용(hANP for injection) 1000, 다이이치산쿄(주) 제조)을 주사용수 10 mL에 용해시키고, "체중×0.06 mL/시간"의 속도(0.1μg/kg/분 또는 그 이하의 투여 속도)로 투여하는 것이 바람직하다. 투여 속도는, 상기 속도로 한정되지 않으며, 병세에 따라, 0.2μg/kg/분 이하의 속도(바람직하게는, 약 0.01μg/kg/분 이상)로, 혈압이나 심박수를 모니터링하면서 적절하게 조정하는 것이 바람직하다. 특히, hANP를, 0.025μg/kg/분의 용량으로 3 또는 4일간 계속 투여해도, 혈압, 심박 등의 체액 상태를 크게 변동시키지 않는 것이 확인되어 있어, 이 용량 용법을 채용하는 것이 바람직하다.

BNP를 정맥에 투여하는 경우에는, 예를 들면, hBNP를 약 0.01μg/kg/분으로 연속 투여하는 것이 바람직하고, 또한 그 투여 개시 전에 약 2μg/kg의 hBNP의 볼러스(bolus) 투여를 조합한 투여 방법을 채용할 수도 있다. 이 경우에도, 혈압을 필요 이상으로 저하시키지 않는 속도로 투여하는 것이 바람직하고, 투여시 및 투여 직후에는 혈압을 모니터링하는 것을 추천한다. ANP나 BNP가 상기 투여 속도에서 혈압이나 심박수 등에 큰 영향을 미치지 않는 경우에는, 투여 속도를 더 높일 수도 있다. 그리고, 그 외의 ANP 또는 BNP의 활성 단편, 변이체, 유도체 또는 변이체 등에 대해서는, 그 활성과 지속성을 고려하여, 투여 속도를 결정하면 된다.

천연형의 펩티드(hANP, hBNP, hCNP-22 등)이 아니라, ANP, BNP, CNP 등의 활성 단편, 변이체, 유도체, 변형체 등을 사용하는 경우, 그 활성의 강도, 체내에 있어서의 지속성, 분자량 등, 그 물질의 특징을 고려하여, 투여량, 투여 방법, 투여 속도, 투여 빈도 등을 적절하게 결정할 수 있다. 또한, hANP, hBNP, CNP(hCNP-22, hCNP-53) 등의 유효 성분에 대하여, 방출 제어 제제 기술이나 지속화 제제 기술, 펩티드가 분해되기 어렵게 하는 각종 변이체, 유도체 또는 변형체 등을 채용함으로써, 연속 투여나 볼러스 투여로 한정되지 않고, 보다 환자에게 부담이 적은 투여 방법, 투여 빈도 등의 선택이 가능하게 된다.

투여 시기로서는, 환자에게 암이 발견된 후라면, 언제라도 투여될 수 있지만, 통상의 전이 억제의 관점에서 계속적으로, 또는 일정 기간의 간격을 두고 정기적으로 투여되는 것이 바람직하다. 또한, 암의 절제 수술을 행하는 경우, 수술중부터 수술 후 몇일간 투여함으로써, 암의 재발을 현저하게 억제할 수 있다.

본 발명은, 악성 종양의 전이를 억제하는 것을 목적으로 하는 것이지만, 그 대상 환자는, 통상적으로 악성 종양의 환자이다. 대상 환자는, 다른 기초 질환이 없는 암환자일 수도 있고, 또한, 예를 들면, 심부전 리스크가 높은 악성 종양 환자일 수도 있다. 악성 종양의 종류는, 특별히 한정되지 않으며, 모든 종류의 악성 종양 환자에 대하여 투여될 수 있다. 이와 같은 악성 종양으로서는, 예를 들면, 암과 같은 상피계 악성 종양, 육종(肉腫)과 같은 비상피계 악성 종양, 멜라노마 등, 다양한 종류의 악성 종양이 있다. 본 발명의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제는, 혈관 내피에 작용하여, 모든 종양 세포의 전이에 공통되는 프로세스인, 종양 세포의 임파관 또는 혈관 내피로의 접착, 침윤을 억제하므로, 종양의 종류에 관계없이, 모든 악성 종양의 전이를 억제하는 효과(간접 효과)를 발휘하는 것으로 여겨진다. 그러므로, GC-A를 발현하지 않는 종양 세포가 악성화하여, 혈관이나 임파관에 침입하더라도, 이 간접 효과에 의해 혈관 내피 세포로의 접착 조직으로 침윤하지 못하고, 전이가 저해된다. 이와 같은 작용은, 종양 세포에 GC-A가 발현하고 있는 폐암 유래 세포주 A549나 H460뿐만 아니라, GC-A가 발현하지 않고, 강한 전이능을 가지는 멜라노마 세포에 대해서도 마우스 미정맥 주입 전이 모델에 있어서, GC-A 아고니스트를 비롯하여 GC-B 아고니스트나 PDE5 저해제의 투여에 의해, 종양 세포가 각 장기로 전이되는 것을 현저하게 억제된 것에 의해 증명된다. 또한, 내피 조직 특이적으로 GC-A를 녹아웃시킨 마우스에서는, 동일한 멜라노마 미정맥 주입 전이 시험에 있어서, 야생형 마우스와 비교하여 현저한 전이의 증대가 확인되었고, 또한 내피 조직 특이적으로 GC-A를 과잉 발현시킨 마우스에서는, 야생형 마우스와 비교하여 현저한 전이의 억제가 확인되었다. GC-A 녹아웃 마우스에서는, 통상 종양이 전이하지 않는 심장에 있어서도 멜라노마의 전이가 확인되었으므로, 세포내 cGMP를 증강하는 시그널 중에서도, 특히 GC-A를 통한 시그널이, 종양 세포의 내피 조직으로의 접착·침윤을 저해하는 것으로 여겨진다.

또한, 원발성 종양일 수도 있고, 전이성 종양일 수도 있다. 원발성 종양의 경우, 암 절제술과 병행하여 투여하는 것이 바람직하다. 전이성 종양의 경우 제거 수술이 가능하면, 마찬가지로 수술과 병행하여 수술 중부터 몇일간 투여되는 것이 바람직하다. 제거가 곤란하거나, 또는 장기로의 전이가 의심되는 경우에는, 정기적으로 투여함으로써, 전이를 제어하는 것이 바람직하다.

또한, 상피계 악성 종양과 같이, 종양 세포에 있어서 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A가 발현하고 있는 악성 종양 환자에 대해서는, GC-A 아고니스트의 투여에 의해, EMT의 억제를 비롯한 직접 효과와 혈관 내피로의 접착, 침윤을 저해하는 것에 의한 전이 억제와 같은 간접 효과의 양쪽에 의해, 전이를 다면적으로 억제할 수 있으므로, 더욱 양호한 전이 억제 효과를 기대할 수 있다. 이와 같은 악성 종양으로서는, 예를 들면, 폐암, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 골종양, 뇌종양 등이 있다. 이와 같은 본 발명의 의약의 투여에 의해, 종양 세포 자체의 전이능 획득도 억제할 수 있는 투여 대상을 선별하는 데 있어서는, 투여 전에 종양 조직을 채취하고, 세포에 있어서의 GC-A의 발현을 확인하여, 수용체의 발현이 확인된 환자에 대하여 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명의 의약 등은, 유효 성분으로서 2종류 이상의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제가 조합되어 사용되는, 악성 종양의 전이를 예방 또는 억제하는 방법, 이를 위한 투여 방법 및/또는, 이와 같은 방법에서 사용되는 의약도 포함한다. 복수의 유효 성분 또는 약제가 「조합되어 투여되는 의약」이란, 상기 유효 성분 또는 약제가 조합되어 투여되는 것을 상정(想定)한 의약이다.

본 발명에 있어서, 복수의 유효 성분 또는 약제가 「조합되어 투여되는」이란, 어느 일정 기간에 있어서, 피투여 대상이, 조합되는 모든 유효 성분 또는 약제를 그 체내에 도입하는 것을 의미한다. 모든 유효 성분이 단일 제제 중에 포함된 제제(이른바, 배합제)로서 투여될 수도 있고, 또한 각각의 유효 성분이 따로따로 제제화되어 이들 모두가 따로따로 투여(이른바, 병용 투여)될 수도 있다. 따로따로 제제화되는 경우, 그 투여 시기는 특별히 한정되지 않으며, 동시에 투여될 수도 있고, 시간을 두고 상이한 시간에, 또는 상이한 날에, 투여될 수도 있다. 복수의 유효 성분이, 각각 상이한 시간 또는 날에 투여되는 경우, 유효 성분의 투여의 순번은 특별히 한정되지 않는다. 통상, 각각의 제제는, 각각의 투여 방법에 따라 투여되므로 이들의 투여 횟수는, 동일 횟수가 되는 경우도 있고, 상이한 횟수로 되는 경우도 있다. 또한, 각각의 유효 성분이 따로따로 제제화되는 경우, 각 제제의 투여 방법(투여 경로)은 동일할 수도 있고, 상이한 투여 방법(투여 경로)으로 투여될 수도 있다. 또한, 모든 유효 성분이 동시에 체내에 존재할 필요는 없으며, 어느 일정 기간(예를 들면, 1개월간, 바람직하게는 1주간, 보다 바람직하게는 몇일간, 더욱 바람직하게는 1일간) 사이에, 모든 유효 성분이 체내에 받아들여지고 있으면 되며, 하나의 유효 성분 투여 시에 다른 유효 성분이 체내로부터 소실되어 있어도 된다.

본 발명의 의약 등에 있어서, 유효 성분으로서 2종류 이상의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제가 조합되어 투여되는 경우의 조합을 예시하면, 적어도 1종류의 GC-A 아고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 경우, 또한 GC-B 아고니스트, NEP 저해제, PDE5 저해제, NO 공급제, eNOS 활성화제, GC-C 아고니스트 및 cGMP 아날로그로부터 선택되는 적어도 하나를 조합할 수 있으며, GC-B 아고니스트, NEP 저해제, PDE5 저해제, 및 NO 공급제로부터 선택되는 적어도 하나를 조합하는 것이 바람직하며, GC-B 아고니스트 또는 PDE5 저해제를 조합하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 적어도 1종류의 GC-B 아고니스트를 유효 성분으로서 채용하는 경우, 또한 NEP 저해제, PDE5 저해제, NO 공급제, eNOS 활성화제, GC-C 아고니스트 및 cGMP 아날로그로부터 선택되는 적어도 하나를 조합할 수 있으며, NEP 저해제, PDE5 저해제, 및 NO 공급제로부터 선택되는 적어도 하나를 조합하는 것이 바람직하고, NEP 저해제 또는 PDE5 저해제를 조합하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 적어도 1종류의 PDE5 저해제를 유효 성분으로서 채용하는 경우, 또한 NEP 저해제, NO 공급제, eNOS 활성화제, GC-C 아고니스트 및 cGMP 아날로그로부터 선택되는 적어도 하나를 조합할 수 있고, NEP 저해제, 및 NO 공급제로부터 선택되는 적어도 하나를 조합하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 의약은, 다른 통상적으로 사용되는 항종양제 중 적어도 하나와 병용하는 것에 의해, 효율적으로 악성 종양의 치료를 행할 수 있고, 본 발명은 이와 같은 다른 항종양제와의 병용 요법도 제공한다. 본 발명의 의약은, 종양 세포의 전이나 침윤을 제어할 수 있으므로, 다른 항종양제에 의한 치료 중에 병행하여 적절하게 투여함으로써, 상기 항종양제에 의한 치료 효율을 높이는 것 및 치료 예후를 개선할 수 있을 것으로 기대된다. 병용되는 항종양제로서는, 예를 들면, 알킬화제, 대사 길항제, 항종양 항생 물질, 항종양성 식물 성분, BRM(생물학적 응답성 제어 물질), 호르몬, 비타민, 항종양성 항체, 분자 표적약, 그 외의 항종양제 등이 있다.

보다 구체적으로, 알킬화제로서는, 예를 들면, 니트로겐 무스타드, 니트로겐 무스타드 N-옥시드 또는 클로람부실(chlorambucil) 등의 알킬화제; 카르보쿠온(carboquone) 또는 티오테파 등의 아지리딘계 알킬화제; 디브로모만니톨 또는 디브로모둘시톨 등의 에폭시드계 알킬화제; 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 세무스틴, 니무스틴하이드로클로라이드, 스트렙토조신(streptozocin), 클로로조토신(chlorozotocin) 또는 라니무스틴 등의 니트로소우레아계 알킬화제; 부설판(busulfan), 토실산 임프로설판 또는 다카르바진(dacarbazine) 등이 있다.

각종 대사 길항제로서는, 예를 들면, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌 또는 티오이노신 등의 퓨린 대사 길항제; 플루오로우라실, 테가푸르(tegafur), 테가푸르·우라실, 카르모푸르, 독시플루리딘, 브록스우리딘, 시타라빈 또는 에노시타빈 등의 피리미딘 대사 길항제; 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 트리메트렉세이트 등의 엽산 대사 길항제 등이 있다.

항종양성 항생 물질로서는, 예를 들면, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 페플로마이신, 다우노루비신(daunorubicin), 아크랄루비신(aclarubicin), 독소루비신(doxorubicin), 피라루비신, THP-아드리아마이신, 4'-에피독소루비신 또는 에피루비신 등의 안트라사이클린계 항생 물질 항종양제; 크로모마이신 A3 또는 악티노마이신 D 등이 있다.

항종양성 식물 성분으로서는, 예를 들면, 빈데신, 빈크리스틴 또는 빈브라스틴 등의 빈카알칼로이드(vinca alkaloid)류; 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀 등의 탁산(taxane)류; 또는 에토포시드 또는 테니포시드 등의 에피포도필로톡신류가 있다.

BRM으로서는, 예를 들면, 종양 괴사 인자 또는 인도메타신 등이 있다.

호르몬으로서는, 예를 들면, 하이드로코르티존, 덱사메타존, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프라스테론, 베타메타존, 트리암시놀론, 옥시메트론, 난드롤론, 메테놀론, 프스페스트롤(fosfestrol), 에티닐에스트라디올, 클로르마디논(chlormadinone) 또는 메드록시프로게스테론 등이 있다.

비타민으로서는, 예를 들면, 비타민 C 또는 비타민 A 등이 있다. 항종양성 항체, 분자 표적약으로서는, 트라스트주맙(trastuzumab), 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 니모투주맙(nimotuzumab), 데노수맙, 베바시주맙, 인플릭시맙, 메실산 이마티니브, 게피티니브, 엘로티니브, 수니티니브, 라파티니브, 소라페니브 등이 있다.

그 외의 항종양제로서는, 예를 들면, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥사리플라틴, 타목시펜, 캄프토테신, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 멜팔란, L-아스파라기나아제, 아세글라톤, 시조피란(sizofiran), 피시바닐, 프로카르바진, 피포브로만(pipoburoman), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 하이드록시우레아, 우베니멕스 또는 크레스틴 등이 있다.

본 발명에 있어서, 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제에 더하여, 다른 항종양제를 조합하여 투여하는 경우, 1종류 또는 2종류 이상의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제 및 다른 항종양제는, 단일 제제 중에 함유되어 있어도 되고, 각각 상이한 제제의 유효 성분으로서 함유되어 있어도 된다. 1종류 또는 2종류 이상의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제 및 다른 항종양제를 투여하는 순서 등도 특별히 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 의약은 키트로서 제공될 수 있다. 적어도 1종류의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제를 함유하는 악성 종양의 전이의 억제 또는 예방을 위한 키트로서는, ANP, BNP나 CNP 등의 나트륨 이뇨 펩티드 또는 이들의 염을 동결 건조 제제로 만들어 봉입(封入)한 병(vial)과 그것을 용해하기 위한 주사용수를 조합하여 키트로로 만든 것 등을 예로 들 수 있고, 또한 용해·투여에 사용하는 주사용 시린지를 이들에 조합할 수도 있고, 또한 미량 수액 펌프나 소아용 미량 수액 세트를 조합할 수도 있다. 또한, 유효 성분으로서 2종류 이상의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제를 조합하여 사용하는 경우, 각 유효 성분을 포함하는 병, 정제 등이 조합되어 키트화되어 있어도 된다.

또한, 본 발명의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제가, 나트륨 이뇨 펩티드 등의 펩티드성 물질인 경우, 이것을 코딩하는 유전자 도입에 의해 환자의 체내에서, 상기 펩티드를 발현시키는 것에 의한 유전자 치료를 행할 수도 있다.

ANP의 유전자로서는, 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자(예를 들면, Science, 226권, 1206페이지, 1984년에 기재되어 있는 것)를 사용하면 된다. 또한, BNP의 유전자로서는, 서열 번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자(예를 들면, Biochem.Biophys.Res.Commun., 165권, 650페이지, 1989년에 기재되어 있는 것)를 사용하면 된다. 또한, CNP의 유전자로서는, 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자(예를 들면, Biochem.Biophys.Res.Commun., 165권, 650페이지, 1989년에 기재되어 있는 것)를 사용하면 된다. 전술한 유전자를 사용하여 치료를 행하는 경우에는, RNA 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스 또는 인공 벡터를 벡터로서 사용하여, 근육 주사나 국소 주사에 의해 유전자를 도입하면 된다. 또한, 전술한 바와 같은 벡터를 사용하지 않고, 플라스미드의 형태로 유전자를 도입할 수도 있다. 구체적인 유전자 치료의 방법에 대해서는, 실험 의학, 12권, 303페이지, 1994년에 기재된 방법 또는 거기에서 인용되고 있는 문헌의 방법 등을 사용하면 된다.

본 발명은 또한, 적어도 1종류의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제를 유효 성분으로서 함유하고, 이와는 상이한 종류의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제의 투여를 받고 있는 대상에 대하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 악성 종양 전이의 억제 또는 예방을 위한 의약, 및 1종류의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제의 유효량을, 이와는 다른 종류의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제에 의한 치료를 받고 있는 대상에 대하여 투여하는 것을 특징으로 하는 악성 종양의 전이의 억제 또는 예방 방법도 포함한다.

유효 성분인 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제, 및 이들의 투여 방법 등은, 전술한 의약 조성물과 동일하다. 이와 같은 용법에서의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제의 조합으로서는, 바람직하게는, GC-A 아고니스트 또는 GC-B 아고니스트와 PDE5 저해제의 조합이며, hANP, hCNP-22, hCNP6-22 또는 이들의 유도체와, 실데나필 또는 그 약리학적으로 허용되는 염의 조합인 것이 보다 바람직하고, hANP와 시트르산 실데나필의 조합인 것이 더욱 바람직하다.

[실시예]

이하에서, 실시예를 사용하여, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 실시예에 나타낸 것은, 본 발명의 실시형태의 일례이며, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에 있어서 사용되는 실험 재료의 입수 방법 및 조제 방법은 다음과 같다.

hANP, 및 hCNP는, 아스비오파마(주), hBNP는 펩티드 연구소(오사카)로부터, 각각 입수한 동결 건조품을, IBMX를 포함하는 생리 식염수로 용해하고, 이것을 적절하게 농도를 조절하여 IBMX의 최종 농도가 5×10^-4 M이 되도록 하여, 하기 실험에 사용하였다.

폐선암 유래 세포주 A549 세포는, ATCC(Manassas, VA)로부터 입수했다. 세포 배양은, 10% FCS를 포함하는 DMEM(Invitrogen사, Carlsbad, VA) 배양액을 사용하여, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 행하였다. 배양액량은, 6-웰 디쉬(well dish)에서는 1.5 ml, 24-웰 디쉬에서는 400 μl, 96-웰 디쉬에서는 150 μl로 하였다. 하기 실시예 중에서는, 특히 지정하지 않는 한 이 배양액 및 배양 조건을 채용하였다.

TGF-β1(Transforming growth factor β1)은, R＆D systems사(Minneapolis, MN)로부터 구입한 것을 사용하였고, 생리 식염수를 사용하여 적절하게 희석하여 하기 실험에 사용하였다.

<실시예 1> 암 세포에 대한 나트륨 이뇨 펩티드 자극에 의한 세포내 cGMP 레벨의 변동

A549 세포를, 24-웰 디쉬에 4×10⁴ cell/well로 가하여 배양하였고, 다음날 FCS free의 DMEM 배양액으로 교환하였다. 배양액 중에, hANP, hBNP 및 hCNP 용액(최종 농도: 1×10^-11 M로부터 1×10^-6 M의 10배 희석 계열, 컨트롤에는 동일한 양의 생리 식염수)를 첨가하고, 그 10분 후에 400μL의 냉각 70% 에탄올(0.1 N 염산 함유)을 가하여, 신속하게 초음파 처리하였다. 처리 후의 용액을 동결 건조하고, Cyclic GMP Assay kit(야마사사 제조)를 사용하여 cGMP 레벨을 측정하였다. cGMP 레벨의 측정 결과를 도 1에 나타내었다.

GC-A 아고니스트인 hANP와 hBNP는, A549 세포의 세포내 cGMP를 농도 의존적으로 항진시켰다. 한편, CG-B수용체 아고니스트에서, GC-A수용체에는 결합하지 않는 hCNP에서는, 이와 같은 항진은 관찰되지 않았다. 이러한 사실로부터, A549 세포에서는, GC-A 수용체로부터의 자극에 특이적으로 응답하여 시그널 전달이 일어나는 것이 나타났다.

<실시예 2> 나트륨 이뇨 펩티드의 A549 세포에 대한 증식 억제 효과

A549 세포를, 24-웰 디쉬에, 4×10⁴ cell/well로 더하여 배양하고, 다음날 FCS free의 DMEM 배양액으로 교환하였다. 배양액 중에, hANP, hBNP 및 hCNP 용액(최종 농도: 1×10^-9 M로부터 1×10^-6 M의 10배 희석 계열, 컨트롤에는 동일한 양의 생리 식염수)을 첨가하고, 24시간, 48시간 후에, 살아있는 세포수 측정 시약 SF(나카라이사 제조)를 사용하여 세포 증식 어세이(assay)를 행하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

A549 세포의 48시간 후까지의 세포수는, hANP, hBNP 및 hCNP 모두에 대하여, 가장 높은 1×10^-6 M의 농도에서도, 컨트롤에 비해 거의 변화가 없었다. Vesely et. al.의 보고에 의하면, ANP가 췌장암, 유방암 등으로부터 유래하는 각종 암 세포의 증식을 억제하는 효과가 있다고 하지만, 본 발명의 실시예의 시험계에서는, 1×10^-6 M(1μM)에서, 모든 나트륨 이뇨 펩티드가 암 세포의 증식에 대하여 영향을 미치지 않았다.

<실시예 3> TGF-β1에 의한 EMT 유도에 대한 hANP의 효과

A549 세포를, 6-웰 디쉬에, 1×10⁵ cell/well로 더하여 배양하였고, 다음날 FBS free의 DMEM의 배양액으로 교환하고, 24시간 배양한 것을, 하기 실험에 사용하였다.

ANP군(ANP 용액 첨가(최종 농도: 1μM) 및 컨트롤군(동일한 양의 생리 식염수 첨가)을 작성하고, 각각 첨가 2시간 후에 TGF-β1을 최종 농도가 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 및 2.0 ng/ml가 되도록 첨가하고, 24시간 후에 현미경 하에서 세포의 형태 변화를 관찰하여, 사진 촬영하였다(도 3).

그 후, TRIZOL total RNA isolation reagent(Invitrogen사)를 사용하여 total RNA를 회수하고, 역전사(逆轉寫) 효소를 사용하여 cDNA를 합성하고, 정량 RT-PCR법에 따라 E-cadherin, N-cadherin, VEGF-A, PDGF-B, TNF-α및 IL-6의 mRNA 레벨을 측정하였다. mRNA 레벨 측정의 결과를 도 4에 나타내었다. 또한, EMT에 있어서는, E-cadherin의 발현이 감소하고, N-cadherin의 발현이 항진하는 것이 알려져 있고, N-cadherin/E-cadherin의 발현 비율은, EMT의 정도를 나타내는 지표로서 유용한 것으로 여겨진다. 이 비율을 도 5에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 1 μM의 hANP(도 3의 C)는, TGF-β1 자극에 의해 유도된 EMT에 의한 세포의 형태 변화(도 3의 B와 같이 간엽계 성분과 동일하게 방추형(紡錘形)으로 변화함)를 현저하게 억제했다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, TGFβ1 자극으로 유도된 EMT에 의해 발현이 항진하는 성장 인자(VEGF-A, PDGF-B)나 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 유전자 발현을 현저하게 억제했다. 또한, TGF-β1 자극에 의한 N-cadherin의 발현 항진은 현저하게 억제되고, 동일한 자극에 의한 E-cadherin의 발현 감소가 저해되었다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 EMT의 중요한 지표인 N-cadherin/E-cadherin의 발현 비율은, 1 μM의 hANP 존재 하에서 현저하게 저하되었다. 또한, 폐대세포암 유래의 H460 세포를 사용한 동일한 시험에서도 마찬가지의 결과를 얻을 수 있었다.

이와 같이, hANP는, 1 μM의 농도에 있어서, 암의 전이의 계기가 되는 중요한 현상인 EMT를 현저하게 억제하는 효과를 나타낸다. 실시예 2에서 나타낸 바와 같이, hANP는, 이 암 세포에 대하여 1 μM에서는 증식에 대하여는 거의 영향을 미치지 않으므로, hANP는, 암의 증식에 대한 효과와는 완전히 상이한 메카니즘에 의해, 암 세포의 EMT를 억제하고 있는 것으로 여겨진다.

<실시예 4> A549 세포의 유주능(Boyden Chamber Assay)에 대한 hANP의 작용

A549 세포를, 6-웰 디쉬에, 1×10⁵ cell/well로 더하여 배양하고, 다음날 FBS free의 DMEM 배양액으로 교환하고, 24시간 배양한 것을, 컨트롤군, TGF-β1군 및 TGF-β1＋hANP군의 3군으로 나누어서 하기 실험에 사용하였다.

배양액에, TGFβ＋hANP군에는 hANP의 최종 농도가 1μM로 되도록 hANP 용액, 컨트롤군 및 TGF-β1군에는 동일한 양의 생리 식염수를 각각 첨가했다. 첨가하고나서 2시간 후에, Boyden chamber assay를 하기와 같이 행하였다.

6-웰 디쉬에, 각각, 컨트롤군에는 FBS free의 DMEM 배양액, TGF-β군에는 TGF-β1(최종 농도: 1 ng/ml)을 포함하는 동일 배양액, TGF-β1＋hANP군에는 hANP(최종 농도: 1 μM) 및 TGF-β1(최종 농도: 1 ng/ml)을 포함하는 동일 배양액을 1.5 mL 가하였다. 그 액면에, cell culture insert(8.0㎛ pore size, BD사 제조)를 두고, 그 위에 각 군의 A549 세포를 FBS free의 DMEM(TGF-β1＋ANP군에는, 최종 농도 1μM의 hANP를 첨가)에 현탁한 세포 현탁액 1.5 mL를 첨가하고, 배양했다. 20시간 후에, 각 군의 cell culture insert를 10% 포르말린으로 고정하고, 상면을 닦아, 하면만 헤마톡실린-에오진(H＆E) 염색을 행하였다. 현미경에 의해 insert의 하면에 부착된 A549 세포의 수를 관찰했다. 세포의 사진을 도 6의 A, 세포수의 그래프를 도 6의 B에 나타내었다. A549 세포의 유주능은, TGF-β1군에 있어서 현저하게 증가하였으나, 이 현상은 1μM의 hANP에 의해 현저하게 억제되었다. 또한, 대세포암 유래의 H460 세포를 사용한 동일한 시험에서도 마찬가지의 결과를 얻을 수 있었다.

<실시예 5> 암 세포의 운동능(Wound healing assay)에 대한 hANP의 작용

A549 세포를, 6-웰 디쉬에, 4×10⁵ cell/well로 더하여, 배양하고, 다음날 FBS free의 DMEM 배양액으로 교환하고, 24시간 배양 후에, 컨트롤군, TGF-β1군 및 TGF-β1＋hANP군의 3군으로 나누어 하기 실험에 사용하였다.

배양액에, TGFβ1＋hANP군에는 hANP의 최종 농도가 1μM로 되도록 hANP 용액, 컨트롤군 및 TGF-β1군에는 동일한 양의 생리 식염수를 각각 첨가했다. 2시간 후에 200μl용 피펫 칩에서 웰의 중앙부를 손상시켰다. 손상한 직후에 현미경 하에서 각 웹에 대하여 사진 촬영하였다(도 7의 A). 여기서, TGFβ＋hANP군 및 TGF-β1군에, 최종 농도 1 ng/ml가 되도록 TGFβ1을 첨가하고, 24시간 배양한 후, 다시 각 웰의 동일한 개소를 사진 촬영하고, 손상 직후와 24시간 배양 후의 손상 폭의 차이의 평균의 비율(이동율: % wounded area filled)를 하기 식에 의해 계산했다.

이동율(%)= (최초의 손상 폭 - 24시간 배양 후의 손상 폭)/(최초 손상 폭)×100

각 웰의 24시간 후의 손상 부분의 사진을 도 7에, 각 군의 이동율을 도 8에 나타내었다. A549 세포의 운동능은, TGF-β1 자극에 의해 항진되었지만, 1 μM의 hANP 존재 하에서는, 이 운동능의 항진이 현저하게 억제되어 있었다. 또한, 폐대 세포암 유래의 H460 세포를 사용한 동일한 시험에서도 마찬가지의 결과를 얻을 수 있었다.

<실시예 6> 암 세포의 침윤능에 대한 hANP의 작용

A549 세포를, 6-웰 디쉬에, 1×10⁵ cell/well로 더하여 배양하고, 다음날 FBS free의 DMEM의 배양액으로 교환하고, 24시간 배양한 것을, 컨트롤군, TGF-β1군 및 TGF-β1＋hANP군의 3군으로 나누어 하기 실험에 사용하였다.

배양액에, TGFβ1＋hANP군에는, 최종 농도가 1μM로 되도록 hANP 용액을, 컨트롤군 및 TGFβ1군에는 동일한 양의 생리 식염수를, 각각 첨가했다. 첨가로부터 2시간 후에, Boyden chamber assay를 하기와 같이 행하였다. cell culture insert(8.0㎛ pore size, BD사)는, 6-웰 디쉬에 있어서, 그 위에 0.5 μg/μl Matrigel액(PBS에 의해 조정) 300μl를 가하고, 12시간 풍건(風乾)시켜 작성한 Matrigel 코팅한 것을 사전에 준비했다.

6-웰 디쉬의 각 웰에, 컨트롤군에는 FBS free의 DMEM 배양액, TGF-β군에는 TGF-β1(최종 농도: 1 ng/ml)을 포함하는 동일 배양액, TGFβ1＋hANP군에는 hANP(최종 농도: 1 μM) 및 TGF-β1(최종 농도: 1 ng/ml)을 포함하는 동일 배양액을 1.5 mL씩 가하였다. 그 액면에 전술한 바와 같이 코팅한 cell culture insert를 탑재하고, 그 위에 각 군의 A549 세포를 FBS free의 DMEM(TGFβ1＋hANP군에는, 최종 농도 1 μM의 hANP를 첨가)에 현탁한 세포 현탁액 1.5 mL를 첨가하고, 배양했다.

40시간 배양 후에, 각 군의 cell culture insert를 10% 포르말린으로 고정하고, 상면을 닦고, 하면만 헤마톡실린-에오진(H＆E) 염색을 행하였다. 현미경에 의해 insert의 하면에 부착된 A549 세포의 수를 관찰했다. 이 세포의 사진을 도 9의 A, 세포수의 그래프를 도 9의 B에 나타내었다.

Matrigel층을 통한 세포 침윤은, TGF-β1군에 있어서 현저하게 증가하였으나, 이 세포 침윤은 1 μM의 hANP에 의해 현저하게 억제되었다. 또한, 폐대세포암 유래의 H460 세포를 사용한 동일한 시험에서도 마찬가지의 결과를 얻을 수 있었다.

<실시예 7> hANP의 암 세포로의 아포토시스(apoptosis) 유도 활성

A549 세포를, 96-웰 디쉬에, 1×10⁴ cell/well로 더하여 배양했다. 다음날 FBS free의 DMEM 배양액으로 교환하고, 24시간 배양 후에 하기 실험을 행하였다.

배양액 중에, hANP의 최종 농도가 각각 1, 5, 10μM로 되도록 희석 계열을 조제한 hANP 용액(컨트롤에는 동일한 양의 생리 식염수)을 첨가하고, 또한 2, 4, 6시간 후에, 동일한 농도로 동일한 양의 hANP 용액(컨트롤에는 생리 식염수)을 추가로 첨가했다(합계 4회의 첨가). 48시간 후에 트리판블루 염색을 사용한 세포의 viability(살아있는 세포/전체 세포)를 자동 세포수 계측기 Countess(등록상표)(Invitrogen사)에 의해 측정하였다. 또한, 폐대세포 암유래 H460 세포, 폐편평상피 암 세포 유래 H520 세포, 기관지 폐로 상피암 유래 H358 세포를 사용하여 동일한 시험을 행하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.

각종 암 세포의 살아있는 세포 수는, hANP의 농도 의존적으로 감소하고, hANP가 계속적으로 배양액 중에 존재하므로, 암 세포에 대하여 아포토시스를 유도하는 것이 나타났다.

<실시예 8> 암 세포의 아포토시스 유도에 있어서의 hANP와 시스플라틴의 병용 효과

시스플라틴은 시스플라틴주 「마르코」(상품명, 니치이코 파마)를 사용하였다.

A549 세포를, 96-웰 디쉬에, 1×10⁴ cell/well로 더하여 배양했다. 다음날 FBS free의 DMEM 배양액으로 교환하고, 24시간 배양 후에, 컨트롤군, 시스플라틴 단독군, 1μM hANP군, 시스플라틴＋1μM hANP군, 10μM hANP군, 시스플라틴＋10μM hANP군으로 나누어 하기 실험을 행하였다.

배양액 중에, hANP 첨가군에는, 최종 농도가 각각 1 μM, 10 μM로 되도록 조제한 hANP 용액, 컨트롤군, 시스플라틴 단독군에는, 동일한 양의 생리 식염수를 첨가했다. 또한, 시스플라틴 첨가군에는, 최종 농도가 각각 1, 5, 10, 20, 30μM로 되도록 희석 계열을 조제한 시스플라틴 용액(컨트롤군, hANP 단독군에는 동일한 양의 생리 식염수)을 첨가했다. 또한, 2, 4, 6시간 후에, 동일한 농도로 동일한 양의 hANP 용액(컨트롤 및 시스플라틴 단독군에는 생리 식염수)을 추가로 첨가했다(합계 4회의 hANP 첨가). 48시간 후에 트리판블루 염색을 사용한 세포의 viability(살아있는 세포/전체 세포)를 자동 세포수 계측기 Countess(등록상표)(Invitrogen사)에 의해 측정하였다. 또한, H460 세포, H520 세포, H358 세포를 사용하여 동일한 시험을 행하였다. hANP 농도 1 μM의 결과를 도 11, 10 μM의 결과를 도 12에 각각 나타내었다. hANP에 의한 암 세포에 대한 아포토시스 유도 활성은, 시스플라틴과 병용하는 것에 의해 증강되는 것이 나타났다.

<실시예 9> 암 세포의 혈관 내피 세포계로의 착상 시험

정상 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 다카라 바이오사로부터 구입하였다. 배지, 계대는 제품에 첨부된 문서의 지시에 따라 행하였다. 핵 염색은 TOPRO3(Invitrogen사로부터 구입), VE-cadherin의 면역 염색은 항VE-cadherin 항체(BD Biosciences사로부터 구입)를 사용하여 행하였다.

HUVEC 세포를 포화 상태까지 배양하고, 무혈청 배지로 교환한 후, VEGF 및 hANP의 존재 하 및 비존재 하에 있어서, 항VE-cadherin 항체를 사용한 면역 염색 및 핵염색을 행하고, VE-cadherin의 발현을 관찰했다. 각 조건 하에서의 염색의 상태를 도 13의 사진에 나타내었다.

VEGF 단독 존재 하에서는, VE-cadherin의 발현이 저하되었고, 세포의 간극이 생기는 현상이 관찰되었지만, VEGF＋hANP에서는 이 현상은 억제되었고, 컨트롤군과 동일한 정도의 긴밀한 세포 접착이 유지되어 있었다. 또한, 이 HUVEC 세포층 상에, A549 세포를 첨가한 바, VEGF 단독 존재 하에서는, A549 세포가 HUVEC 세포층의 아래로 들어가는 착상 현상이 관찰된 것에 비해, VEGF＋hANP(1μM)에서는 이 착상 현상이 억제되어 있었다.

이러한 사실로부터, hANP는, 암 세포가 혈관 내피 조직에 착상하고, 전이된 곳의 조직에 침윤하는 것을 억제하는 작용이 있는 것으로 여겨진다.

따라서, 이를 종합하면, hANP는 암 세포의 EMT를 억제함으로써 침윤, 전이능을 저하시키고, 또 암 세포 특이적으로 아포토시스를 유도하는 암 세포에 대한 직접 효과와, 착상하는 측인 혈관 내피 세포에 착상 억제 작용을 발휘하는 간접 효과를 가지는 것으로 여겨진다.

<실시예 10> 폐암 환자의 암 절제술 후의 hANP 투여에 의한 암재발 억제 효과

혈중 BNP 레벨이 30 pg/ml 이상인 폐암 환자의 암절제 방법에 있어서는, 수술후 합병증 리스크가 높은 것이 보고되어 있다. 본 시험에 있어서는, 폐암 환자의 암 절제술 전에 혈중 BNP 레벨을 측정하고, 30 pg/ml를 기준으로 그 이상의 환자의 일부 또는 주치의의 판단으로 수술후 합병증 리스크가 높은 것으로 판단된 환자를 hANP군(전체 52예, 암의 진행도 내역(1A기: 26예(50%), 1B기: 16예(23%), 2기: 7예(13%), 3기: 3예(6%))으로 하였다. 또한, 혈중 BNP 레벨에 관계없이 컨트롤군(287 증례, 암의 진행도 내역(1A기: 155예(54%), 1B기: 65예(23%), 2기: 35예(12%), 3기: 32예(11%))을 설정했다. hANP군은, 폐암 수술중으로부터 수술후 3일간, hANP(상품명: 한프 주사용 1000, 비(非)볼러스(bolus), 다이이치산쿄(주))를, 0.025 μg/kg/분의 용량이 되도록 조제하고, 지속적으로 투여했다. 수술전 및 수술후 4일간, 각 환자의, 혈압(수축기 및 확장기), 심박수 및 뇨량을 측정하였다(결과를 도 15에 나타냄).

수술 후 약 2년간, 환자의 암의 조기 재발 상황을 추적 조사했다. 환자는 1년마다 흉부 CT 검사, 두부 MRI 검사, 골(骨) 신티그래피, 또는 양전자 단층 촬영(PET) 검사를 시행하여, 재발의 유무에 관한 전신 체크를 행하였다. 각 군에 있어서의 암 무재발 생존율의 결과를 도 14에 나타내었다.

수술 후 2년간에 있어서의 암의 무재발 생존율은, 컨트롤군에서는 암의 진행 도에 따라 저하되었고, 1A기에 91.6%, 1B기에 73.4%, 2기에 48%, 3기에 29%였다. 한편, hANP군에서는, 암의 진행도에 관계없이, 암의 조기 재발이 확인되지 않았다. 또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, hANP의 0.025μg/kg/분과 같은 저용량 요법에 있어서는 환자의 혈압, 심박, 뇨량 등의 체액 상태에는 큰 변동은 확인되지 않았다. 이는, 이 투여량이면, 순환기계의 이상이 없는 환자에게 투여한 경우라도, hANP의 주약효에 기인하는 생체 변화가 문제가 되지 않을 정도인 것이 시사된다.

이러한 사실로부터, hANP의 저용량 요법은, 심부전 리스크를 가지는 암환자 뿐만아니라, 심부전 리스크가 없는 환자에 대해서도, 안전하며, 부작용이 적은 항전이 요법으로서 매우 유용한 것으로 나타났다.

<실시예 11> A549 세포의 EMT에 대한 각종 GC-A 아고니스트의 작용

실시예 3과 동일한 시험에 있어서, 피험 물질로서 hANP 대신여 hBNP(최종 농도: 1 μM), CD-NP(최종 농도:10 μM(Deborah et al., J. Biol. Chem.,(2008), Vol. 289, No.50, pp.35003-35009 참조), LKL-ANP(최종 농도: 1 μM(hANP의 10∼12위치의 아미노산이 LKL으로 치환된 변이체(Furuya, M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(1992), 183, No 3, p.964-969) 참조)를 사용한 시험을 행하였다. 그 결과, E-cad/Ncad의 값에 있어서, TGF-β로 유도되는 EMT의 억제율은, BNP에서 44.8%, CD-NP에서 37.7%, LKL-ANP에서 52.9%였다. 이와 같이, 각종 GC-A 아고니스트가, 종양 세포의 EMT를 억제하는 작용을 나타내고 있다.

<실시예 12> 마우스 미정맥 주입 전이 시험에 있어서의 A549 세포의 전이에 대한 hANP의 효과

마우스는 6주령의 수컷 Balb/c nu/nu마우스를 사용하였다(일본 SLC 가부시키가이샤로부터 구입).

Osmotic pump는 ALZET(Cupertino, CA)의 MODEL2004(28일간 투여용)를 사용하였다.

마우스의 등쪽 피하에, 0.9% 생리 식염수를 넣은 Osmotic pump를 삽입한 것을 컨트롤군으로 하였다. 마찬가지로, hANP를 0.5μg/kg/분의 투여량으로 투여하도록 조제된 Osmotic pump를 마우스의 피하에 삽입한 군을 ANP 투여군으로 하였다. Osmotic pump 삽입 후 다음날 종양 세포 현탁액의 주입을 행하였다.

종양 세포로서는, GFP(Green Fluorescent Protein) 라벨링된 A549 세포주(와코 순약공업 가부시키가이샤로부터 구입)를,10% FCS를 포함하는 RPMI1640(Life Technologies Corporation)에서 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양하고, 서브칸플루엔트(subconfluent)의 상태로 EDTA-trypsin 처리한 후, 원심분리하고, 1×10⁷ cells/mL가 되도록 serum free DMEM에 현탁하였다. 100 μL/body의 용량으로, 1×10⁶ 개의 A549 세포 현탁액을 마우스의 미정맥에 주입하였다. Osmotic pump에 의한 생리 식염수 또는 ANP의 투여는, 4주간으로 하고, 종양 세포 주입으로부터 8주 후의 폐 전이의 상태를 형광 현미경(Olympus OV100)에 의해 관찰했다(도 16). 또한, 형광 현미경 하에서 관찰된 마우스 1마리당의 폐 전이에 의해 형성된 결절수를 도 17의 그래프에 나타내었다.

도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이, hANP를 최초 4주간 투여함으로써, 암 세포의 전이가 현저하게 억제되었다.

또한, 종양 세포로서 H460 세포를 사용한 시험에서도, 마찬가지의 결과를 얻을 수 있었다.

<실시예 13> 마우스 미정맥 주입 전이 시험에 있어서의 멜라노마의 전이에 대한 각종 cGMP 증강제의 작용

마우스는 6주령의 수컷 C56BL/6N 마우스(일본 SLC 가부시키가이샤로부터 구입)를 사용하였다. 마우스 멜라노마 B16-F10는 ATCC로부터 구입하였고, 10% FCS를 포함하는 DMEM(Life Technologies Corporation)에서 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양하였고, 서브칸플루엔트의 상태에서 EDTA-trypsin 처리한 후, 원심분리하고, 5×10⁶ cells/mL가 되도록 serum free DMEM에 현탁하였다. 100 μL/mouse의 용량으로, 5×10⁵개의 멜라노마 세포 현탁액을 마우스의 미정맥로부터 주입하였다. Osmotic pump는 ALZET(Cupertino, CA)의 MODEL2002(14일간 투여용)를 사용하였다.

마우스의 등쪽 피하에, 0.9%의 생리 식염수를 넣은 Osmotic pump를 삽입한 것을 컨트롤군으로 하였다. 마찬가지로, ANP군에는 hANP를 0.5μg/kg/분의 투여량, BNP군에는 마우스 BNP를 0.5μg/kg/분의 투여량, CNP군에는 hCNP-22를 2.5μg/kg/분의 투여량으로, 각각 투여되도록 조제된 Osmotic pump를 마우스의 피하에 삽입하였다. 또한, 실데나필군에는, 시트르산 실데나필를 20 mg/kg의 용량으로, 하루 1회 복강내 투여했다. 투여 개시한 다음날에, 전술한 요령으로 종양 세포 현탁액의 주입을 행하고, 약제는 2주간 투여했다. 종양 세포 주입으로부터 2주일 후의 종양 세포의 폐 전이의 상태를 관찰하였고(도 18), 그 때 관찰된 마우스 1마리당의 폐 전이에 의한 결절수를 도 19의 그래프에 나타내었다.

도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, ANP군, BNP군, CNP군, 및 실데나필군 모두에 있어서, 컨트롤군에 비해 멜라노마의 폐 전이가 현저하게 억제되었다.

<실시예 14> GC-A녹아웃 마우스에 대한 멜라노마미정맥 주입 전이 시험

마우스로서 12주령의 수컷 GC-A 녹아웃(KO) 마우스(전신, 내피 조직 특이적 녹아웃, Tokudome T., Kishimoto I., Kangawa K., et al(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009; 29: 1516-21), Kishimoto I, Tokudome T, Nakao K, Kangawa K.(FEBS J. 2011; 278: 1830-41))를 사용하여, 실시예 13과 동일한 방법으로, (단, 멜라노마 B16-F10 세포 현탁액은, 2.5×10⁶ cells/mL가 되도록 조제하고, 100 μL/mouse의 용량(2.5×10⁵ celsl/mouse)으로 주입한) 마우스 멜라노마 세포의 폐 전이 시험을 행하였고, 2주일 후의 야생형, 전신 GC-AKO, 및 내피특이적 GC-A KO의 각 마우스의 폐에 전이된 멜라노마 세포에 의해 형성된 결절수를 도 20의 그래프에 나타내었다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 전신 GC-A KO 마우스와, 내피 조직 특이적 GC-A KO 마우스의 양쪽에 있어서, 야생형 마우스에 비해 멜라노마의 폐 전이가 현저하게 증가하였다.

<실시예 15> 내피 특이적 GC-A 과잉 발현 마우스에 대한 멜라노마 미정맥 주입 전이 시험

마우스로서 12주령의 수컷의 내피 조직 특이적 GC-A 과잉 발현 마우스(Zhun ML, et al(Cardiovasc Res. 2009; 84:292-9) 등을 참고하여 제작)를 사용하여, 실시예 13과 동일한 방법으로, (단, 멜라노마 B16-F10 세포 현탁액은, 1.0×10⁷ cells/mL가 되도록 조제하고, 100 μL/mouse의 용량(1.0×10⁶ celsl/mouse)으로 주입한) 미정맥 주입 전이 시험을 행하였고, 2주일 후의 야생형 및 GC-A 과잉 발현 마우스의 폐에 형성된 결절수를 도 21의 그래프에 나타내었다.

도 21에 나타낸 바와 같이, 내피 조직 특이적 GC-A 과잉 발현 마우스에서는, KO 마우스의 결과와는 반대로, 야생형 마우스에 비해 멜라노마의 폐 전이가 현저하게 억제되었다.

실시예 14 및 15의 결과로부터, 생체에 있어서 특히 내피 조직에 있어서의 GC-A를 통한 시그널 전달이 종양의 전이를 억제하는 기능이 있는 것이 강하게 시사되었다.

SEQUENCE LISTING <110> National cerebral and cardiovascular center Osaka University Daiichi Sankyo Company, Limited <120> A pharmaceutical composition for suppression of malignant tumor metastasis <130> D26F4083 <150> JP 2011-41263 <151> 2011-2-28 <160> 11 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 2 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Ile Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp 1 5 10 15 Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His 20 25 30 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 4 Ser Pro Lys Thr Met Arg Asp Ser Gly Cys Phe Gly Arg Arg Leu Asp 1 5 10 15 Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gly Leu Gly Cys Asn Val Leu Arg Arg Tyr 20 25 30 <210> 5 <211> 45 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 5 Ser Gln Asp Ser Ala Phe Arg Ile Gln Glu Arg Leu Arg Asn Ser Lys 1 5 10 15 Met Ala His Ser Ser Ser Cys Phe Gly Gln Lys Ile Asp Arg Ile Gly 20 25 30 Ala Val Ser Arg Leu Gly Cys Asp Gly Leu Arg Leu Phe 35 40 45 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ring structure sequence of ANPs and BNPs <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetic <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> Xaa can be Met, Leu or Ile <220> <221> misc_feature <222> (10)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetic <220> <221> misc_feature <222> (18)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetic <400> 6 Cys Phe Gly Xaa Xaa Xaa Asp Arg Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gly 1 5 10 15 Cys Xaa Xaa Xaa Arg 20 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 8 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly 20 25 30 Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 35 40 45 Ser Gly Leu Gly Cys 50 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 9 Gly Leu Ser Arg Ser Cys Phe Gly Val Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Rana sp. <400> 10 Gly Tyr Ser Arg Gly Cys Phe Gly Val Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ala 1 5 10 15 Phe Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ring structure sequence of CNP <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetics, preferably Ser or Ala <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or artificial amino acid mimetics, preferably Met, Phe or Glu <400> 11 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Xaa Xaa Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys

Claims (36)

1. 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제를 유효 성분으로서 함유하는, 악성 종양의 전이를 억제 또는 예방하기 위한 의약으로서,
   혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제로서, 혈관 내피 세포에 작용하여 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 활성을 가지는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트(agonist), 또는, 혈관 내피 세포에 작용하여 세포내 cGMP 농도를 상승시키는 활성을 가지는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 함유하고,
   나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트가, (a1) 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, (a2) 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드, 및 (a6) (a1) 및 (a2) 중 어느 하나의 변형체로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 약리적으로 허용되는 염이며, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 물질이며,
   상기 (a1) 심방성 나트륨 이뇨 펩티드가, 서열 목록의 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이고,
   상기 (a2) 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드가, 서열 목록의 서열 번호 3, 4 또는 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이고,
   상기 (a6) 변형체가, 서열 목록의 서열 번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그의 서열 번호 6으로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 1개에 있어서, 화학적으로 변형(chemically modification)되어 있으며,
   나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, (b1) C형 나트륨 이뇨 펩티드, 및 (b5) (b1)의 변형체로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 약리적으로 허용되는 염이며, 또한 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B에 대하여 아고니스트 활성을 가지는 물질이며,
   상기 (b1) C형 나트륨 이뇨 펩티드가, 서열 목록의 서열 번호 7, 8, 9 또는 10에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이고,
   상기 (b5) 변형체가, 서열 목록의 서열 번호 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 그의 서열 번호 11로 표시된 아미노산에 상당하는 것 이외의 아미노산 중 적어도 1개에 있어서, 화학적으로 변형되어 있는 것을 특징으로 하는, 의약.
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10. 제1항에 있어서,
    상기 (a6) 변형체가, 제약상(製藥上) 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 변형된 것인, 의약.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 제1항에 있어서,
    상기 (b5) 변형체가, 제약상 사용되는 고분자 폴리머를 부가함으로써 화학적으로 변형된 것인, 의약.
19. 제1항, 제10항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제가, 환자의 혈압, 심박수 또는 뇨량 중 적어도 1항목을 크게 변동시키지 않는 정도의 용량으로 투여되는, 의약.
20. 제19항에 있어서,
    혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제로서, 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 또는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 0.1 μg/kg/분 이하로, 1일 내지 몇일간 계속 투여되는, 의약.
21. 제19항에 있어서,
    투여 대상 환자가, 종양의 절제 수술을 받는 사람이며, 상기 절제 수술 전부터 수술 후 1일∼몇일간, 계속적으로 투여되는, 의약.
22. 제1항에 있어서,
    서열 번호 1 내지 5 및 7 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가, 0.05 μg/kg/분 이하의 용량으로, 종양 절제 수술 전부터 수술후 일정 기간 계속적으로 투여되는, 의약.
23. 제22항에 있어서,
    서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드가, 0.025 μg/kg/분의 용량으로, 종양 절제 수술중으로부터 수술후 3일간 계속적으로 투여되는, 의약.
24. 제1항에 있어서,
    유효 성분으로서 2종류 이상의 혈관 내피 세포 내 cGMP 증강제가 조합되는, 의약.
25. 제1항에 있어서,
    투여를 받은 환자에 있어서, 종양 세포의 혈관 내피 조직으로의 착상 및/또는 침윤의 저해가 일어나게 하는, 의약.
26. 제1항에 있어서,
    세포내 cGMP 증강제로서 적어도 1종류의 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트를 포함하고, 상피계 악성 종양의 우려가 있는 대상에 투여되고, 또한 투여를 받은 환자에 있어서, 종양 세포의 상피간엽 전환(EMT)의 억제, 종양 세포의 유주능(遊走能) 획득의 저해, 종양 세포의 운동능 획득의 저해, 종양 세포의 침윤의 억제, 종양 세포 특이적인 아포토시스(apoptosis) 유도 및 종양 세포의 혈관 내피 조직으로의 착상의 저해로부터 선택되는 적어도 1개의 약리 활성이 일어나게 하는, 의약.
27. 제1항에 있어서,
    악성 종양의 절제 수술을 받는 환자에 사용되는, 의약.
28. 제27항에 있어서,
    상기 환자가, 절제 수술 전일로부터 수술 후 몇일간 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 또는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 투여받는, 의약.
29. 제27항에 있어서,
    상기 환자가, 절제 수술 전일에 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트, 또는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트를 투여받는, 의약.
30. 제27항에 있어서,
    나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-A 아고니스트 또는 나트륨 이뇨 펩티드 수용체 GC-B 아고니스트가, 근육내 투여 또는 피하 투여에 의해 환자에게 투여되는, 의약.
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