JP2004534783A - ポリアルキレングリコールを含む成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

抱合体の混合物であって、前記混合物中の各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合している成長ホルモン剤を含む混合物が開示される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤−オリゴマー抱合体（conjugate）類に関し、および特に成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモンは、成長ホルモンが欠乏した小児の代償療法に使用されてきた。成長ホルモンについては、火傷、外科手術、および吸収不良などのいくつかの異化状態の治療の補助剤としての研究も行われている。カルシウムイオンの保持および骨形成に対する成長ホルモンの正の効果も、骨粗鬆症および非治癒性骨折の治療に有用となりうる。
【０００３】
成長ホルモンは、筋肉注射または皮下注射によって投与することができる。これらの方法の中では、自己投与が容易となるので皮下注射が好ましくなりうる。しかし、これらの方法は両方とも、特に小児の場合に、注射による投与に関連しうる心理学的および／または身体的外傷が原因で最適ではない場合がある。
【０００４】
タンパク質やポリペプチドなどの医薬的に活性な分子が、ポリエチレングリコールの多分散混合物、またはポリエチレングリコール含有ポリマーの多分散混合物と結合されて、薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物が得られている。たとえば、エクウリベ（Ｅｋｗｕｒｉｂｅ）に付与された米国特許第５，３５９，０３０号明細書では、ソマトスタチン、ソマトトロピンおよび／またはソマトメジンなどのポリペプチドを、多分散ポリエチレングリコール修飾糖脂質ポリマーおよび多分散ポリエチレングリコール修飾脂肪酸ポリマーと結合させることが提案されている。それぞれの組み合わせによって得られる多分散ポリマーの数平均分子量は、好ましくは約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲内となる。
【０００５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、通常、塩基触媒を使用したエチレンオキシドの開環重合によって生成される。この反応は、エチレンオキシドを触媒としての水酸化カリウムとともにエチレングリコールに加えることによって開始される。この方法によって、所定の分子量範囲内の数平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーの多分散混合物が得られる。たとえば、ウィスコンシン州ミルウォーキーの（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のシグマーアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって販売されるＰＥＧ製品はＰＥＧ４００（Ｍ_n３８０〜４２０）、ＰＥＧ１，０００（Ｍ_n９５０〜１，０５０）、ＰＥＧ１，５００（Ｍ_n１，４００〜１，６００）、およびＰＥＧ２，０００（Ｍ_n１，９００−２，２００）などの多分散混合物として提供されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
オリゴマーがポリアルキレングリコールを含む場合には、成長ホルモン−オリゴマー抱合体の非多分散混合物が提供されることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の実施形態によるポリアルキレングリコールを含む成長ホルモン−オリゴマー抱合体の混合物は、本発明による混合物と同じ数平均分子量を有する類似の抱合体の多分散混合物よりもインビボ活性が高くなりうる。このように活性が高くなくことによって、必要とされる投与量が減少しうる。さらに、本発明の実施形態によるポリアルキレングリコールを含む成長ホルモン−オリゴマー抱合体の混合物は、腸内消化のインビトロモデルでの耐久性に関して、類似の抱合体の多分散混合物よりも有効となりうる。さらに、本発明の実施形態によるポリアルキレングリコールを含む成長ホルモン−オリゴマー抱合体の混合物は、類似の抱合体の多分散混合物よりも被験者間変動が少なくなりうる。
【０００８】
本発明の実施形態によると、実質的に単分散の抱合体の混合物であって、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーに結合した成長ホルモン剤を各抱合体が含む混合物が提供される。ポリアルキレングリコール部分は、好ましくは少なくとも２個、３個、または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有し、最も好ましくは少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール部分は好ましくはポリプロピレングリコールである。本発明のオリゴマーは、好ましくは親油性部分をさらに含む。上記成長ホルモン剤は好ましくはヒト成長ホルモンである。本発明のオリゴマーは、ヒト成長ホルモンのアミノ基と共有結合していることが好ましい。抱合体が水溶性となり生体膜を透過できるようになるため、本発明の抱合体は両親媒性の平衡の状態にある（balanced）ことが好ましい。本発明のオリゴマーは、加水分解可能でない結合によって薬剤と共有結合する第１のポリアルキレングリコール部分と、加水分解可能な結合によって第１のポリアルキレングリコール部分と共有結合する第２のポリアルキレングリコール部分とを含みうる。本発明の混合物は、好ましくは単分散混合物であり、最も好ましくは純粋な単分散の混合物である。
【０００９】
本発明の別の実施形態によると、実質的に単分散の抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、前記混合物が、前記実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性よりも高いインビボ活性を有する混合物が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態によると、実質的に単分散の抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、前記混合物が、前記実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性よりも高いインビトロ活性を有する混合物が提供される。
【００１１】
本発明の別の実施形態によると、実質的に単分散の抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、前記混合物が、前記実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した場合に、キモトリプシンに対する分解に対する増加した抵抗性を有する混合物が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態によると、実質的に単分散の抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、前記混合物が、前記実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験者間変動よりも小さな被験者間変動を有する混合物が提供される。
【００１３】
本発明の別の実施形態によると、抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、前記混合物が、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する混合物が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態によると、抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、前記混合物が１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有し、ここで
【数１】

（式中、ｎは、試料中の種類の異なる分子の数であり、Ｎ_iは、該試料中のｉ番目の分子の数であり、Ｍ_iは、該ｉ番目の分子の質量である）である混合物が提供される。
【００１５】
本発明の別の実施形態によると、抱合体の混合物であって、各抱合体が、オリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、さらに各抱合体が同数のポリアルキレングリコールサブユニットを有する混合物が提供される。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態によると、抱合体の混合物であって、各抱合体が、同じ分子量を有し、さらに式：
【化１】

（式中、Ｂは結合部分であり、Ｌはリンカー部分であり、Ｇ、Ｇ’、およびＧ’’は、独立して選択されるスペーサー部分であり、Ｒは親油性部分であってＲ’はポリアルキレングリコール部分であるか、あるいはＲ’は親油性部分であってＲはポリアルキレングリコール部分であり、Ｔは末端部分であり、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｍ、およびｎは独立して０または１であり、但し、Ｒがポリアルキレングリコール部分である場合はｍが１となり、およびＲ’がポリアルキレングリコール部分である場合はｎが１となり、および、ｐは、１から、前記成長ホルモン剤上の求核性残基の数までの整数である）を有する混合物が提供される。
【００１７】
種々の実施形態の混合物を合成する方法も、本発明によって提供される。
【００１８】
本発明の抱合体混合物を含む医薬組成物も提供される。有効量のこのような医薬組成物を投与することによって、成長ホルモン欠乏症の治療を、そのような治療を必要とする被験者に対して実施する方法も提供される。
【００１９】
前述の種々の実施形態による抱合体の混合物の有効量を動物に投与することによる、動物の成長速度を加速する方法も提供される。
【００２０】
本発明の実施形態による成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体混合物は、従来の多分散成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体混合物と比較した場合に、インビボ活性の増加および／または被験者間変動の減少および／またはキモトリプシンによる分解の減少が実現されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本明細書に記載される好ましい実施形態を参照して本発明を説明する。しかしながら、これらの実施形態は本発明を説明することが目的であって、請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するために構成されたものではないことを理解されたい。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「非多分散」は、エクウリベに付与された米国特許第５，３５９，０３０に記載される多分散混合物とは対照的な分散性を有する化合物の混合物を表現するために使用される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に単分散」は、混合物中の化合物の少なくとも約９５％が同じ分子量を有する化合物の混合物を表現するために使用される。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「単分散」は、混合物中の化合物の約１００％が同じ分子量を有する化合物の混合物を表現するために使用される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に純粋な単分散」は、混合物中の化合物の少なくとも約９５％が同じ分子量を有し同じ分子構造を有する化合物の混合物を表現するために使用される。したがって、実質的に純粋な単分散の混合物は、実質的に単分散の混合物であるが、実質的に単分散混合物は必ずしも実質的に純粋な単分散混合物であるとは限らない。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「純粋な単分散」は、混合物中の化合物の約１００％が同じ分子量を有し、同じ分子構造を有する化合物の混合物を表現するために使用される。したがって、純粋な単分散混合物は単分散混合物であるが、単分散混合物は必ずしも純粋な単分散混合物であるとは限らない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「重量平均分子量」は、混合物中の所与の分子の重量分率と混合物中の各分子の分子量との質量の合計として定義される。「重量平均分子量」は記号Ｍ_wで表される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「数平均分子量」は混合物の全重量を混合物中の分子数で割ったものとして定義され、記号Ｍ_nで表される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「分散係数」（ＤＣ）は、
【数２】

（式中、
ｎは、試料中の種類の異なる分子の数であり、
Ｎ_iは、該試料中のｉ番目の分子の数であり、
Ｍ_iは、該i番目の分子の質量である）
で定義される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「被験者内変動」は、同じ投与量の薬剤または医薬組成物を異なる時点で被験者に投与した場合に、同じ被験者内で発生する活性の変動を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「被験者間変動」は、同じ投与量の所与の薬剤または医薬製剤を各被験者に投与した場合の、２名以上の被験者の間の活性の変動を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「成長ホルモン剤」は、成長ホルモンペプチドの生物活性のすべてまたは一部を有する薬剤を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「成長ホルモンペプチド」は、ヒト成長ホルモン、ヒト成長ホルモン放出ホルモン、動物成長ホルモン、または動物成長ホルモン放出ホルモンを意味し、これらはいずれも天然、合成、または遺伝子的に設計された供給源から提供されうる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「成長ホルモンペプチド類似体」は、１以上のアミノ酸が置換されているが、成長ホルモンペプチドの活性の一部またはすべてが維持されている成長ホルモンペプチドを意味する。この類似体は、上付き文字で置換位置が示された置換アミノ酸が表記され、その後に成長ホルモンの説明を続けることによって記載される。たとえば、「Ｐｒｏ⁴¹成長ホルモン，ヒト」は、ヒト成長ホルモン分子の４１番目の位置に通常見られるアミノ酸がプロリンで置換されていることを意味する。
【００３４】
成長ホルモン類似体は、当業者にはよく知られている種々の手段によって入手することができる。たとえば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などの構造を有する相互作用結合能力を大きく損なうことなく、成長ホルモン構造中のあるアミノ酸を別のアミノ酸で置換することができる。成長ホルモンの相互作用能力および性質がその生物機能的活性を規定するので、あるアミノ酸配列の置換がそのアミノ酸配列中で起こるが、それにもかかわらずポリペプチドは同様の性質を維持しうる。
【００３５】
このような置換を行う場合、アミノ酸のハイドロパシーインデックス（hydropathic index）を考慮してよい。相互作用的生物学的機能をポリペプチドに付与することに関して、アミノ酸のハイドロパシーインデックスの重要性は一般に当分野で理解されている。アミノ酸の相対的ハイドロパシーは、結果として得られるポリペプチドの２次構造に寄与し、これによってポリペプチドと、たとえば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などの他の分子との相互作用が規定されることが認められている。アミノ酸の疎水性と電荷特性に基づいて、各アミノ酸のハイドロパシーインデックスが以下のように割り当てられている。イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）。当業者には理解されているが、あるアミノ酸を、同様のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する別のアミノ酸で置換しても、同様の生物活性を有するポリペプチドが得られる、すなわち生物学的機能が同等のポリペプチドが得られる場合がある。このような置換を行う場合、ハイドロパシーインデックスが互いに±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、互いに±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、互いに±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
【００３６】
同様のアミノ酸の置換は、親水性を基準にして効率的に実施できることも当分野で知られている。米国特許第４，５５４，１０１号明細書には、隣接するアミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の局所的な最大平均親水性が、そのタンパク質の生物学的性質と相関があることが記載されている。米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳細に記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リジン（±３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セイン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。当業者には理解されているが、アミノ酸を同様の親水性値を有する別のアミノ酸で置換して、なお生物学的に同等、特に免疫学的に同等のポリペプチドを得ることができる。このような置換では、互いの親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、互いに±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、互いに±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
【００３７】
したがって上記の概略のように、アミノ酸の置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、たとえば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて行われる。前述の種々の特性を考慮した代表的な置換（すなわち、そのポリペプチドの生物活性を顕著に変化させることなく交換可能なアミノ酸）は当業者にはよく知られており、そのようなものとしては、たとえば、アルギニンとリジン、グルタメートとアスパルテート、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、ならびにバリンとロイシンとイソロイシンが挙げられる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「成長ホルモンペプチドフラグメント」は、成長ホルモンポリペプチドの活性の一部またはすべてを維持する、成長ホルモン中に見られるアミノ酸配列のセグメントを意味する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「成長ホルモンペプチドフラグメント類似体」は、セグメント中の１以上のアミノ酸が置換されているが成長ホルモンポリペプチドの活性の一部またはすべては維持されている、成長ホルモンペプチド中に見られるアミノ酸配列のセグメントを意味する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「ポリアルキレングリコール」は、直鎖または分岐のポリアルキレングリコールポリマーを意味する。用語「ポリアルキレングリコールサブユニット」は、１つのポリアルキレングリコール単位を意味する。たとえば、ポリエチレングリコールサブユニットは−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）−である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「親油性」は、脂質に溶解する能力、および／または生体膜に対して浸透し、相互作用し、および／または横切る能力を意味し、用語「親油性部分」または「親油性分子」は、親油性である部分、および／または別の化学物質と結合してそのような化学物質の親油性を増大させる部分を意味する。親油性部分の例としては、アルキル、脂肪酸、脂肪酸エステル、コレステリル、アダマンチルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「低級アルキル」は、１〜５個の炭素原子を有する置換または未置換のアルキル部分を意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「高級アルキル」は、６個以上の炭素原子を有する置換または未置換のアルキル部分を意味する。
【００４４】
本発明の実施形態では、実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物が提供される。本発明の単分散混合物中の各成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体は、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含む。好ましくは、本発明の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の抱合体が同じ分子量を有する。より好ましくは、本発明の混合物は単分散混合物である。さらにより好ましくは、本発明の混合物は実質的に純粋な単分散混合物である。さらにより好ましくは、本発明の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の抱合体が同じ分子量を有し同じ分子構造を有する。最も好ましくは、本発明の混合物は純粋な単分散混合物である。
【００４５】
上記の成長ホルモン剤は、好ましくはヒト成長ホルモンである。しかし、成長ホルモン剤は、たとえば、成長ホルモンペプチド、成長ホルモンペプチド類似体、成長ホルモンペプチドフラグメント、および成長ホルモンペプチドフラグメント類似体などの当業者に公知の種々の成長ホルモン剤から選択してよいことを理解すべきである。成長ホルモンペプチドとしては、成長ホルモン，ヒト（ｈＧＨ）、成長ホルモン，ブタ、成長ホルモン，ウシ、成長ホルモン，ニワトリ、成長ホルモン，ラット、成長ホルモン，マウス、成長ホルモン，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ヒト、成長ホルモン前放出因子（ｐｒｏ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ），ヒト、成長ホルモン放出因子，マウス、成長ホルモン放出因子，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ラット、成長ホルモン放出因子，ウシ、成長ホルモン放出因子，ブタ、および成長ホルモン放出因子，ニワトリが挙げられるが、これらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチド類似体は、成長ホルモンペプチド中の１以上のアミノ酸が置換されることによって前述のように得られてもよい。成長ホルモンペプチドフラグメントとしては、成長ホルモン１−４３，ヒト、成長ホルモン６−１３、成長ホルモン放出因子１−３７，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子３０−４４，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ラット、ヘキサレリン（hexarelin）（成長ホルモン放出ヘキサペプチド）、および成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒトが挙げられるがこれらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチドフラグメント類似体としては、［Ｄ−Ａｌａ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒト、［Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ¹，Ｄ−Ａｒｇ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド、［Ｈｉｓ¹，Ｎｌｅ²⁷］−成長ホルモン放出因子１−３２，アミド、成長ホルモン放出ペプチド−６（［Ｈｉｓ¹，Ｌｙｓ⁶］−ＧＨＲＰ）、および［Ｄ−Ｌｙｓ³］−ＧＨＲＰ−６が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知のポリアルキレングリコール部分を含む種々のオリゴマーであってよい。好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも２個、３個、または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも５個または６個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。最も好ましくは、本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、好ましくは、ポリエチレングリコール部分、ポリプロピレングリコール部分、またはポリブチレングリコール部分などの低級アルキルポリアルキレングリコール部分である。ポリアルキレングリコール部分は、より好ましくは、均一な構造を有するポリプロピレングリコール部分である。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール部分は、
【化２】

である。この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖中の各酸素原子と隣接するメチル置換炭素原子を１つのみ有すると説明することができる。このような均一なポリプロピレングリコール部分は、親油性と親水性の両方を示す場合があり、したがって親油性ポリマー部分を使用せずに、両親媒性の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を得るために有用となりうる。さらに、ポリプロピレングリコール部分の第２級アルコール部分と成長ホルモン剤とを結合させることによって、腸などに見られるトリプシンやキモトリプシンなどの酵素による分解に対する抵抗性が向上した成長ホルモン剤（たとえば、ヒト成長ホルモン）を得ることが可能となる。
【００４７】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコールは、これから説明する図１１〜１３に記載されるように合成されることが好ましい。図１１に示されるように、１，２−プロパンジオール５３を、第１級アルコールブロッキング試薬と反応させると、第２級アルコール延長モノマー５４が得られる。この第１級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第１級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドやｔ−ブチルジメチルシリルクロリドなどのシリルクロリド化合物、およびＡｃ₂Ｏなどのエステル化試薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第１級アルコールブロッキング試薬は、第２級アルコールと実質的に非反応性である第１級アルコールブロッキング試薬であり、たとえばｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドまたはｔ−ブチルジメチルシリルクロリドである。第２級アルコール延長モノマー（５４）を塩化メタンスルホニル（ＭｅＳＯ₂Ｃｌ）と反応させると、第１級延長アルコールモノマーメシレート５５を得ることができる。
【００４８】
あるいは、第２級アルコール延長モノマー５４を、第２級アルコールブロッキング試薬と反応させて、化合物５６を得ることができる。第２級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第２級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、塩化ベンジルが挙げられるが、これに限定されるものではない。化合物５６は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬と反応させて、ブロッキング部分Ｂ₁を除去し、第１級アルコール延長モノマー５７を得ることができる。Ｂ₁脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング試薬から選択してよい。エステルを形成することによって第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬は塩基（たとえば、炭酸カリウム）などの脱エステル化試薬である。シリルクロリドを使用して第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬はフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）が好ましい。第１級アルコール延長モノマー５７を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を得ることができる。
【００４９】
第１級アルコール延長モノマー５４と第２級アルコール延長モノマー５７は、以下のようにキャップすることができる。第２級アルコール延長モノマー５４は、キャッピング試薬と反応させて化合物５９を得ることができる。キャッピング試薬は当業者に公知の種々のキャッピング試薬であってよく、たとえば、塩化メチルなどのハロゲン化アルキルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。化合物５９を、前述のＢ₁脱ブロッキング剤と反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマー６０を得ることができる。第１級アルコールキャッピングモノマー６０を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコールキャッピングモノマーメシレート６１を得ることができる。第１級アルコール延長モノマー５７を、キャッピング試薬と反応させると、化合物６２を得ることができる。このキャッピング試薬は、前述の種々のキャッピング試薬であってよい。化合物６２を、Ｂ₂脱ブロッキング試薬と反応させてブロッキング部分Ｂ₂を除去すると、第２級アルコールキャッピングモノマー６３を得ることができる。Ｂ₂脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング剤であってよく、たとえば、パラジウム／活性炭触媒の存在下でのＨ₂が挙げられるが、これに限定されるものではない。第２級アルコールキャッピングモノマーを塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマーメシレート６４を得ることができる。図１１に示される実施形態ではキャッピングモノマーの合成が示されているが、キャッピングポリマーを得るために同様の反応を実施してもよいことを理解されたい。
【００５０】
一般に、鎖延長は、第１級アルコール延長モノマー５７などの第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５などの第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、種々の均一なポリプロピレン鎖を得ることによって行うことができるし、あるいは第２級アルコール延長モノマー５４などの第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８などの第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させることによって行うこともできる。
【００５１】
たとえば、図１３では、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５を、第１級アルコール延長モノマー５７と反応させると、ダイマー化合物６５が得られる。あるいは、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を、第２級アルコール延長モノマー５４と反応させて、ダイマー化合物６５を得ることもできる。ダイマー化合物６５上のＢ₁ブロッキング部分は、前述のＢ₁脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第１級アルコール延長ダイマー６６を得ることができる。第１級アルコール延長ダイマー６６を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を得ることができる。あるいは、ダイマー化合物６５上のＢ₂ブロッキング部分は、前述のＢ₂脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第２級アルコール延長ダイマー６９を得ることができる。第２級アルコール延長ダイマー６９を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を得ることができる。
【００５２】
当業者であれば理解しているように、鎖延長法を繰り返して種々の他の鎖長を得ることができる。たとえば、図１３に示されるように、第１級アルコール延長ダイマー６６を、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０と反応させて、テトラマー化合物７２を得ることができる。図１３にさらに示されるように、一般的な鎖延長反応図式では、第１級アルコール延長モノマーまたはポリマー７３を、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレート７４と反応させることで、均一なポリプロピレンポリマー７５が得られる。ｍおよびｎの値はそれぞれ０〜１０００以上の範囲となりうる。好ましくは、ｍおよびｎはそれぞれが０〜５０である。図１３に示される実施形態は、第１級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーを第１級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートと反応させることを示しているが、第２級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーおよび第２級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートを使用して同様の反応を実施してもよいことは理解できるであろう。
【００５３】
第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第１級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第１級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を、第１級アルコールキャッピングモノマー６０と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー７１が得られる。当業者は理解しているように、Ｂ₁ブロッキング部分を除去することができ、その結果得られるキャップされた第１級アルコール延長トリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー７１の鎖を延長することができる。
【００５４】
第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第２級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第２級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を、第２級アルコールキャッピングモノマー６３と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー６８が得られる。前述のようにＢ₂ブロッキング部分は除去することができ、それによって得られるキャップされた第２級アルコール延長トリマーを、第２級アルコール延長マーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー６８の鎖を延長することができる。図１２に示される合成は、トリマーを得るためのダイマーとキャッピングモノマーの反応を示しているが、キャッピング法は、均一なポリプロピレングリコール部分の合成の任意の時点で実施することができるし、あるいはキャップされていない均一なポリプロピレングリコール部分を得ることもできることを理解されたい。図１２に示される実施形態は、キャッピングモノマーを使用した合成によるポリブチレンオリゴマーのキャッピングを示しているが、本発明のポリブチレンオリゴマーは、図１１に関して前述したキャッピング試薬を使用して直接キャップしてもよい（すなわち、キャッピングモノマーを付加しない）ことを理解されたい。
【００５５】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコール部分は、成長ホルモン剤、カルボン酸などの親油性部分、および／または種々の他の部分と、ポリエチレングリコール部分に関して本明細書で説明した方法が挙げられるが、これには限定されない当業者に公知の種々の方法によって結合させてよい。
【００５６】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上の他の部分を含んでよく、そのような部分としては、親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のオリゴマー中の種々の部分は、加水分解可能な結合または加水分解可能でない結合のいずれかによって互いに共有結合する。
【００５７】
本発明のオリゴマーは、糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーなどの１以上の親水性部分をさらに含んでよいが、これらには限定されない。隣接するポリアルキレングリコール部分は、エーテル結合によって結合し同じアルキル構造を有するのであれば、同じ部分であると見なす。たとえば、部分
−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−
は６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する１つのポリエチレングリコール部分である。隣接するポリアルキレングリコール部分は、エーテル結合以外の結合で結合している場合、または異なるアルキル構造を有する場合には、異なる部分であるとみなす。たとえば、部分
【化３】

は、４つのポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分と、２つのポリエチレングリコールサブユニットとを有する親水性部分とになる。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーはポリアルキレングリコール部分を含むが、親水性部分をさらに含むことはない。
【００５８】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上の親油性部分をさらに含んでよい。親油性部分は好ましくは、飽和または不飽和で線状または分岐状のアルキル部分、あるいは飽和または不飽和で線状または分岐状の脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合、その親油性部分は１個〜２８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２個〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、その脂肪酸部分は２個〜１８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和の天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３個〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４個、５個、または６個の炭素原子を有する。
【００５９】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上のスペーサー部分をさらに含んでもよい。スペーサー部分は、たとえば、親水性部分を親油性部分から分離するため、親油性部分または親水性部分を成長ホルモン剤から分離するため、第１の親水性または親油性部分を第２の親水性または親油性部分から分離するため、あるいは親水性部分または親油性部分をリンカー部分から分離するために使用してよい。スペーサー部分は好ましくは、糖部分、コレステロール部分、およびグリセリン部分からなる群より選択される。
【００６０】
本発明のオリゴマーは、オリゴマーを成長ホルモン剤と結合させるために使用される当業者に公知の１以上のリンカー部分をさらに含んでもよい。リンカー部分は好ましくは、アルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択される。
【００６１】
本発明のオリゴマーは、成長ホルモン剤と結合していないオリゴマーの１以上の末端における１以上の末端部分をさらに含んでよい。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキル部分または低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であるが、末端部分は、糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸などが挙げられるが、これらには限定されない当業者に公知の種々の部分であってよいことは理解できるであろう。
【００６２】
本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と共有結合することが好ましい。ある実施形態では、加水分解可能な結合（たとえば、エステル結合または炭酸結合）を使用して、成長ホルモン剤をオリゴマーと結合させる。加水分解可能な結合によって、プロドラッグとして機能する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる場合がある。ある場合、たとえば、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、抱合体は、成長ホルモン剤の主要な作用機序を介して身体に影響する能力を欠いている）場合などでは、加水分解可能な結合によって、持続放出または制御放出効果が得られることがあり、１以上のオリゴマーがそれぞれの成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体から開裂して有効薬剤が得られる所与の時間のあいだ成長ホルモン剤が投与されうる。別の実施形態では、成長ホルモン剤は、加水分解可能でない結合（たとえば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を使用して、オリゴマーと結合させる。成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を長時間、好ましくは少なくとも２時間、血流中で循環させることができると望ましい場合には、加水分解可能でない結合の使用が好ましくなりうる。本発明のオリゴマーが成長ホルモン剤と共有結合する場合、そのオリゴマーは、オリゴマーを成長ホルモン剤と共有結合させるために使用される当業者に公知の１以上の結合部分をさらに含む。結合部分は好ましくは、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分、および第２級アミン部分からなる群より選択される。オリゴマー上の２つ以上の部分が、成長ホルモン剤と共有結合してもよい。
【００６３】
本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と共有結合することが好ましいが、本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と非共有結合的に結合して、非共有結合的に結合した成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を形成してもよいことを理解されたい。当業者には理解されているように、非共有結合としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセルまたはリポソームカプセル化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の実施形態によると、選択された方法で非共有結合的に結合させるための能力を付与するために（たとえば、水素結合能力を付与するために）、当業者に公知のようにオリゴマーは適宜構成され、修飾され、および／または適切に官能化されうる。本発明の別の実施形態によると、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体などが挙げられるが、これらには限定されない種々の化合物でオリゴマーを誘導体化してよい。その結果、得られるオリゴマーは、薬剤分子、医薬品、および／または医薬賦形剤と非共有結合的に結合（複合体（complex））させることができる。それによって得られる複合体は、親油性と親水性の平衡の状態にあることが好ましい。さらに別の本発明の実施形態によると、オリゴマーをアミンおよび／またはアルキルアミンで誘導体化してよい。好適な酸性条件下では、結果として得られるオリゴマーは、薬剤分子、医薬品、および／または医薬賦形剤と非共有結合的に結合した複合体を形成することができる。このような複合体化（complexation）によって得られる生成物は、親油性と親水性の平衡の状態にあることが好ましい。
【００６４】
２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）を成長ホルモン剤に結合させてもよい。複数のオリゴマーは同じものであることが好ましい。しかし、複数のオリゴマーは互いに異なっていてもよいし、あるいは複数のオリゴマーの一部が同じものであり、一部が異なっていてもよいことを理解されたい。複数のオリゴマーが成長ホルモン剤と結合する場合、１以上のオリゴマーと成長ホルモン剤が加水分解可能な結合によって結合し、１以上のオリゴマーと成長ホルモン剤が加水分解可能でない結合によって結合することが好ましい。あるいは、複数のオリゴマーと成長ホルモン剤の結合がすべて加水分解可能であるが、たとえば、１以上のオリゴマーは体内での加水分解によって急速に成長ホルモン剤から分離し、１以上のオリゴマーは体内での加水分解によってゆっくりと成長ホルモン剤から離れるように、程度の異なる加水分解性を有してもよい。
【００６５】
本発明のオリゴマーは、求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基などが挙げられるが、これらには限定されない薬剤の種々の求核性残基で成長ホルモン剤と結合させてよい。求核性ヒドロキシル基は、たとえば、セリンおよび／またはチロシン残基に見ることができ、求核性アミノ基は、たとえば、ヒスチジンおよび／またはリジン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端に見ることができる。オリゴマーが成長ホルモンポリペプチドの１以上のＮ末端と結合する場合、結合によって第２級アミンが形成されることが好ましい。成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンである場合、たとえば、オリゴマーはＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、および／またはＬｙｓ¹⁷²のアミノ基と結合してよい。
【００６６】
本発明の実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、種々の方法によって合成することができる。たとえば、カルボン酸とポリエチレングリコールとからなるオリゴマーの実質的に単分散の混合物は、カルボン酸の実質的に単分散の混合物と、ポリエチレングリコールの実質的に単分散の混合物とを、オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るのに十分な条件下で接触させることによって合成される。次に、この実質的に単分散の混合物のオリゴマーを、成長ホルモン剤と反応できるように活性化させて、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる。活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るための合成経路の一実施形態が図３に示されており、後出の実施例１１〜１８で説明されている。活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図４に示されており、後出の実施例１９〜２４で説明されている。活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図５に示されており、後出の実施例２５〜２９で説明されている。活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るための合成経路のさらにまた別の実施形態が図６に示されており、後出の実施例３０〜３１で説明されている。活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図７に示されており、後出の実施例３２〜３７で説明されている。活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図８に示されており、後出の実施例３８で説明されている。活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図９に示されており、後出の実施例３９で説明されている。活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図１０に示されており、後出の実施例４０で説明されている。
【００６７】
活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物は、成長ホルモン剤の実質的に単分散の混合物と、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で反応させることができる。代表的な合成は、後出の実施例４０〜４２で説明する。当業者であれば理解できることであるが、反応条件（たとえば、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物と、成長ホルモン剤の実質的に単分散の混合物との反応の結果得られる成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物が、実質的に単分散の混合物となるように制御することができる。たとえば、リジンのアミノ基における結合は、リジンのｐＫ_aよりも反応溶液のｐＨを低く維持することによって抑制することができる。あるいは、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、たとえばＨＰＬＣを使用して分離および単離することによって、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体、たとえば、実質的に単分散の、モノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体の混合物を得ることができる。個々の単離された抱合体の結合の程度（たとえば、単離された分子がモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体のいずれであるか）は、質量分析などが挙げられるが、これらには限定されない当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。個々の抱合体の構造（たとえば、ヒト成長ホルモンのモノ抱合体Ｐｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、またはＬｙｓ¹⁷²のいずれの位置にオリゴマーが存在するか）は、配列分析、ペプチドマッピング、選択的酵素開裂、および／またはエンドペプチダーゼ開裂などが挙げられるが、これらには限定されない当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。
【００６８】
当業者には理解できるであろうが、成長ホルモン剤上の１以上の反応部位は、たとえば、成長ホルモン剤を、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの好適なブロッキング試薬と反応させることによってブロックしてもよい。たとえば、成長ホルモン剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ末端の１以上でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、すべての求核性残基が結合しているわけでない抱合体）が望ましい場合には、この方法が好ましいこともある。このようなブロッキング後に、ブロックされた成長ホルモン剤の実質的に単分散の混合物を、活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物と反応させて、１以上の求核性残基と結合したオリゴマーを有し、別の求核性残基と結合したブロッキング部分を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。この結合反応の後、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体は、当業者に公知のように脱ブロックすることができる。必要であれば、続いて成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を前述のように分離することによって、実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。あるいは、脱ブロック前に成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を分離してもよい。
【００６９】
本発明の実施形態による実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、従来の混合物と比較した場合に改善された性質を有することが好ましい。たとえば、実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性よりも高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、実質的に単分散の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、種々の方法で測定することができ、たとえば、Ｈ．Ｒ．アルコック（Ａｌｌｃｏｃｋ）およびＦ．Ｗ．ランプ（Ｌａｍｐｅ）の「最新ポリマー化学」（ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）３９４−４０２（第２版、１９９１年）に記載されているようなゲル浸透クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
別の例として、実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性よりも高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、実質的に単分散の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これには限定されない種々の方法で測定できる。個々の混合物のインビトロ活性は、当業者に公知の種々の方法によって測定してよい。好ましくはインビトロ活性は、カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のモレキュラー・デバイシズ・コーポレーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より市販されるサイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）（登録商標）マイクロフィジオメーター（Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定される。このマイクロフィジオメーターは、トランスフェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（登録商標）（マサチューセッツ州アクトンのカミング（Ｃｏｍｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））中の培養細胞に加えられる薬剤に対する応答の細胞外酸性化速度の微小な変化を監視する。この応答は、研究対象の分子の活性に比例する。
【００７１】
さらに別の例として、実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した場合に、キモトリプシンに対する分解に対する増加した抵抗性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、実質的に単分散の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらには限定されない種々の方法で測定できる。
【００７２】
さらに別の例として、実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、該実質的に単分散の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験者間変動よりも小さな被験者間変動を有する。当業者には公知であるが、実質的に単分散の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらには限定されない種々の方法で測定できる。被験者間変動は、当業者に公知の種々の方法によって測定することができる。被験者間変動は好ましくは以下のように計算される。用量反応曲線の下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験者の場合で求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者数で割ることによって、すべての被験者の平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの間の差の絶対値を各被験者について求める。得られた差の絶対値を次に合計することで、被験者間変動を表す値が得られる。値が小さいほど被験者間変動が小さいことを表しており、値が大きいほど被験者間変動が大きいことを表している。
【００７３】
本発明の実施形態による実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による実質的に単分散の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の４つすべてを有する。
【００７４】
本発明によるさらに別の実施形態では、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する抱合体の混合物が提供される。本発明の混合物の各抱合体は、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含む。標準偏差は好ましくは約１４ダルトン未満であり、より好ましくは約１１ダルトン未満である。分子量分布は当業者に公知の方法によって測定することができ、たとえば、Ｈ．Ｒ．アルコックおよびＦ．Ｗ．ランプの「最新ポリマー化学」３９４−４０２（第２版、１９９１年）に記載されるようなゲル浸透クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できるが、これらに限定されるものではない。次に分子量分布の標準偏差は当業者に公知の統計学的方法によって求めることができる。
【００７５】
本発明の成長ホルモン剤は、好ましくはヒト成長ホルモンである。しかし、成長ホルモン剤は、たとえば、成長ホルモンペプチド、成長ホルモンペプチド類似体、成長ホルモンペプチドフラグメント、および成長ホルモンペプチドフラグメント類似体などの当業者に公知の種々の成長ホルモン剤から選択してよいことを理解すべきである。成長ホルモンペプチドとしては、成長ホルモン，ヒト（ｈＧＨ）、成長ホルモン，ブタ、成長ホルモン，ウシ、成長ホルモン，ニワトリ、成長ホルモン，ラット、成長ホルモン，マウス、成長ホルモン，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ヒト、成長ホルモン前放出因子，ヒト、成長ホルモン放出因子，マウス、成長ホルモン放出因子，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ラット、成長ホルモン放出因子，ウシ、成長ホルモン放出因子，ブタ、および成長ホルモン放出因子，ニワトリが挙げられるが、これらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチド類似体は、成長ホルモンペプチド中の１以上のアミノ酸が置換されることによって前述のように得られてもよい。成長ホルモンペプチドフラグメントとしては、成長ホルモン１−４３，ヒト、成長ホルモン６−１３、成長ホルモン放出因子１−３７，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子３０−４４，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ラット、ヘキサレリン（成長ホルモン放出ヘキサペプチド）、および成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒトが挙げられるがこれらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチドフラグメント類似体としては、［Ｄ−Ａｌａ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒト、［Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ¹，Ｄ−Ａｒｇ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド、［Ｈｉｓ¹，Ｎｌｅ²⁷］−成長ホルモン放出因子１−３２，アミド、成長ホルモン放出ペプチド−６（［Ｈｉｓ¹，Ｌｙｓ⁶］−ＧＨＲＰ）、および［Ｄ−Ｌｙｓ³］−ＧＨＲＰ−６が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知のポリアルキレングリコール部分を含む種々のオリゴマーであってよい。好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも２個、３個、または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも５個または６個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。最も好ましくは、本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、好ましくは、ポリエチレングリコール部分、ポリプロピレングリコール部分、またはポリブチレングリコール部分などの低級アルキルポリアルキレングリコール部分である。ポリアルキレングリコール部分は、より好ましくは、均一な構造を有するポリプロピレングリコール部分である。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール部分は
【化４】

である。この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖中の各酸素原子と隣接するメチル置換炭素原子を１つのみ有すると説明することができる。このような均一なポリプロピレングリコール部分は、親油性と親水性の両方を示す場合があり、したがって親油性ポリマー部分を使用せずに両親媒性の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を得るために有用となりうる。さらに、ポリプロピレングリコール部分の第２級アルコール部分と成長ホルモン剤とを結合させることによって、腸などに見られるトリプシンやキモトリプシンなどの酵素による分解に対する抵抗性が向上した成長ホルモン剤（たとえば、ヒト成長ホルモン）を得ることが可能となる。
【００７７】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコールは、これから説明する図１１〜１３に記載されるように合成されることが好ましい。図１１に示されるように、１，２−プロパンジオール５３を、第１級アルコールブロッキング試薬と反応させると、第２級アルコール延長モノマー５４が得られる。この第１級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第１級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドやｔ−ブチルジメチルシリルクロリドなどのシリルクロリド化合物、およびＡｃ₂Ｏなどのエステル化試薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第１級アルコールブロッキング試薬は、第２級アルコールと実質的に非反応性である第１級アルコールブロッキング試薬であり、たとえばｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドまたはｔ−ブチルジメチルシリルクロリドである。第２級アルコール延長モノマー（５４）を塩化メタンスルホニル（ＭｅＳＯ₂Ｃｌ）と反応させると、第１級延長アルコールモノマーメシレート５５を得ることができる。
【００７８】
あるいは、第２級アルコール延長モノマー５４を、第２級アルコールブロッキング試薬と反応させて、化合物５６を得ることができる。第２級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第２級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、塩化ベンジルが挙げられるが、これに限定されるものではない。化合物５６は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬と反応させて、ブロッキング部分Ｂ₁を除去し、第１級アルコール延長モノマー５７を得ることができる。Ｂ₁脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング試薬から選択してよい。エステルを形成することによって第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬は塩基（たとえば、炭酸カリウム）などの脱エステル化試薬である。シリルクロリドを使用して第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬はフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）が好ましい。第１級アルコール延長モノマー５７を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を得ることができる。
【００７９】
第１級アルコール延長モノマー５４と第２級アルコール延長モノマー５７は、以下のようにキャップすることができる。第２級アルコール延長モノマー５４は、キャッピング試薬と反応させて化合物５９を得ることができる。キャッピング試薬は当業者に公知の種々のキャッピング試薬であってよく、たとえば、塩化メチルなどのハロゲン化アルキルが挙げられるが、これに限定されるものではない。化合物５９を、前述のＢ₁脱ブロッキング剤と反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマー６０を得ることができる。第１級アルコールキャッピングモノマー６０を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコールキャッピングモノマーメシレート６１を得ることができる。第１級アルコール延長モノマー５７を、キャッピング試薬と反応させると、化合物６２を得ることができる。このキャッピング試薬は、前述の種々のキャッピング試薬であってよい。化合物６２を、Ｂ₂脱ブロッキング試薬と反応させてブロッキング部分Ｂ₂を除去すると、第２級アルコールキャッピングモノマー６３を得ることができる。Ｂ₂脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング剤であってよく、たとえば、パラジウム／活性炭触媒の存在下でのＨ₂が挙げられるが、これに限定されるものではない。第２級アルコールキャッピングモノマーを塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマーメシレート６４を得ることができる。図１１に示される実施形態ではキャッピングモノマーの合成が示されているが、キャッピングポリマーを得るために同様の反応を実施してもよいことを理解されたい。
【００８０】
一般に、鎖延長は、第１級アルコール延長モノマー５７などの第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５などの第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、種々の均一なポリプロピレン鎖を得ることによって行うことができるし、あるいは第２級アルコール延長モノマー５４などの第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８などの第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させることによって行うこともできる。
【００８１】
たとえば、図１３では、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５を、第１級アルコール延長モノマー５７と反応させると、ダイマー化合物６５が得られる。あるいは、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を、第２級アルコール延長モノマー５４と反応させて、ダイマー化合物６５を得ることもできる。ダイマー化合物６５上のＢ₁ブロッキング部分は、前述のＢ₁脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第１級アルコール延長ダイマー６６を得ることができる。第１級アルコール延長ダイマー６６を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を得ることができる。あるいは、ダイマー化合物６５上のＢ₂ブロッキング部分は、前述のＢ₂脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第２級アルコール延長ダイマー６９を得ることができる。第２級アルコール延長ダイマー６９を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を得ることができる。
【００８２】
当業者であれば理解しているように、鎖延長法を繰り返して種々の他の鎖長を得ることができる。たとえば、図１３に示されるように、第１級アルコール延長ダイマー６６を、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０と反応させて、テトラマー化合物７２を得ることができる。図１３にさらに示されるように、一般的な鎖延長反応図式では、第１級アルコール延長モノマーまたはポリマー７３を、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレート７４と反応させることで、均一なポリプロピレンポリマー７５が得られる。ｍおよびｎの値はそれぞれ０〜１０００以上の範囲となりうる。好ましくは、ｍおよびｎはそれぞれが０〜５０である。図１３に示される実施形態は、第１級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーを第１級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートと反応させることを示しているが、第２級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーおよび第２級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートを使用して同様の反応を実施してもよいことは理解できるであろう。
【００８３】
第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第１級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第１級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を、第１級アルコールキャッピングモノマー６０と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー７１が得られる。当業者は理解しているように、Ｂ₁ブロッキング部分を除去することができ、その結果得られるキャップされた第１級アルコール延長トリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー７１の鎖を延長することができる。
【００８４】
第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第２級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第２級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を、第２級アルコールキャッピングモノマー６３と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー６８が得られる。前述のようにＢ₂ブロッキング部分は除去することができ、それによって得られるキャップされた第２級アルコール延長トリマーを、第２級アルコール延長マーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー６８の鎖を延長することができる。図１２に示される合成は、トリマーを得るためのダイマーとキャッピングモノマーの反応を示しているが、キャッピング法は、均一なポリプロピレングリコール部分の合成における任意の時点で実施することができるし、あるいはキャップされていない均一なポリプロピレングリコール部分を得ることもできることを理解されたい。図１２に示される実施形態は、キャッピングモノマーを使用した合成によるポリブチレンオリゴマーのキャッピングを示しているが、本発明のポリブチレンオリゴマーは、図１１に関して前述したキャッピング試薬を使用して直接キャップしてもよい（すなわち、キャッピングモノマーを付加しない）ことを理解されたい。
【００８５】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコール部分は、成長ホルモン剤、カルボン酸などの親油性部分、および／または種々の他の部分と、ポリエチレングリコール部分に関して本明細書で説明した方法などが挙げられるが、これらには限定されない当業者に公知の種々の方法によって結合させてよい。
【００８６】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上の他の部分を含んでよく、そのような部分としては、親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のオリゴマー中の種々の部分は、加水分解可能な結合または加水分解可能でない結合のいずれかによって互いに共有結合する。
【００８７】
本発明のオリゴマーは、糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーなどが挙げられるが、これらには限定されない１以上の親水性部分をさらに含んでよい。隣接するポリアルキレングリコール部分は、エーテル結合によって結合し、それらが同じアルキル構造を有するのであれば、同じ部分であると見なす。たとえば、部分
−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−
は６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する１つのポリエチレングリコール部分である。隣接するポリアルキレングリコール部分は、エーテル結合以外の結合で結合している場合、または異なるアルキル構造を有する場合には、異なる部分であると見なす。たとえば、部分
【化５】

は、４つのポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分と、２つのポリエチレングリコールサブユニットとを有する親水性部分とである。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーはポリアルキレングリコール部分を含むが、親水性部分をさらに含むことはない。
【００８８】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上の親油性部分をさらに含んでよい。親油性部分は好ましくは、飽和または不飽和で、線状または分岐状のアルキル部分、あるいは飽和または不飽和で線状または分岐状の脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合、その親油性部分は１〜２８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２個〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、その脂肪酸部分は２個〜１８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和の天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４個、５個、または６個の炭素原子を有する。
【００８９】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上のスペーサー部分をさらに含んでもよい。スペーサー部分は、たとえば、親水性部分を親油性部分から分離するため、親油性部分または親水性部分を成長ホルモン剤から分離するため、第１の親水性または親油性部分を第２の親水性または親油性部分から分離するため、あるいは親水性部分または親油性部分をリンカー部分から分離するために使用してよい。スペーサー部分は好ましくは、糖部分、コレステロール部分、およびグリセリン部分からなる群より選択される。
【００９０】
本発明のオリゴマーは、オリゴマーを成長ホルモン剤と結合させるために使用される当業者に公知の１以上のリンカー部分をさらに含んでもよい。リンカー部分は好ましくは、アルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択される。
【００９１】
本発明のオリゴマーは、成長ホルモン剤と結合していないオリゴマーの１以上の末端において１以上の末端部分をさらに含んでよい。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキル部分または低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であるが、末端部分は、糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸などが挙げられるが、これらには限定されない当業者に公知の種々の部分であってよいことは理解できるであろう。
【００９２】
本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と共有結合することが好ましい。ある実施形態では、加水分解可能な結合（たとえば、エステル結合または炭酸結合）を使用して成長ホルモン剤をオリゴマーと結合させる。加水分解可能な結合によって、プロドラッグとして機能する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる場合がある。ある場合、たとえば、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、抱合体が、成長ホルモン剤の主要な作用機序を介して身体に影響する能力を欠いている）場合などでは、加水分解可能な結合によって、持続放出または制御放出効果が得られることがあり、１以上のオリゴマーがそれぞれの成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体から開裂して有効薬剤が得られる所与の時間のあいだ成長ホルモン剤が投与されうる。別の実施形態では、成長ホルモン剤は、加水分解可能でない結合（たとえば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を使用してオリゴマーと結合させる。成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を長時間、好ましくは少なくとも２時間、血流中で循環させることが望ましい場合には、加水分解可能でない結合の使用が好ましくなりうる。本発明のオリゴマーが成長ホルモン剤と共有結合する場合、そのオリゴマーは、オリゴマーを成長ホルモン剤と共有結合させるために使用される当業者に公知の１以上の結合部分をさらに含む。結合部分は好ましくは、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分、および第２級アミン部分からなる群より選択される。オリゴマー上の２つ以上の部分が、成長ホルモン剤と共有結合してもよい。
【００９３】
本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と共有結合することが好ましいが、本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と非共有結合的に結合して、非共有結合的に結合した成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を形成してもよいことを理解されたい。当業者には理解されているように、非共有結合としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセルまたはリポソームカプセル化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の実施形態によると、選択された方法で非共有結合の能力を付与するために（たとえば、水素結合能力を付与するために）、当業者に公知のようにオリゴマーは適宜構成され、修飾され、および／または適切に官能基化されうる。本発明の別の実施形態によると、限定するものではないが、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体などの種々の化合物でオリゴマーを誘導体化してよい。その結果、得られるオリゴマーは、薬剤分子、医薬品、および／または医薬賦形剤と非共有結合的に結合（複合体化）させることができる。それによって得られる複合体は、親油性と親水性の平衡の状態にあることが好ましい。さらに別の本発明の実施形態によると、オリゴマーをアミンおよび／またはアルキルアミンで誘導体化してよい。好適な酸性条件下では、結果として得られるオリゴマーは、薬剤分子、医薬品、および／または医薬賦形剤と非共有結合的に結合した複合体を形成することができる。このような複合体化によって得られる生成物は、親油性と親水性の平衡の状態にあることが好ましい。
【００９４】
２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）を成長ホルモン剤に結合させてもよい。複数のオリゴマーは同じものであることが好ましい。しかし、複数のオリゴマーは互いに異なっていてもよいし、あるいは複数のオリゴマーの一部が同じものであり、一部が異なっていてもよいことを理解されたい。複数のオリゴマーが成長ホルモン剤と結合する場合、１以上のオリゴマーと成長ホルモン剤が加水分解可能な結合によって結合し、１以上のオリゴマーと成長ホルモン剤が加水分解可能でない結合によって結合することが好ましい。あるいは、複数のオリゴマーと成長ホルモン剤の結合がすべて加水分解可能であるが、たとえば、１以上のオリゴマーは体内での加水分解によって急速に成長ホルモン剤から移動し、１以上のオリゴマーは体内での加水分解によってゆっくりと成長ホルモン剤から移動するように、異なる程度の加水分解性を有してもよい。
【００９５】
本発明のオリゴマーは、求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基などが挙げられるが、これらには限定されない薬剤の種々の求核性残基で成長ホルモン剤と結合させてよい。求核性ヒドロキシル基は、たとえば、セリンおよび／またはチロシン残基にみられ、求核性アミノ基は、たとえば、ヒスチジンおよび／またはリジン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端にみられる。オリゴマーが成長ホルモンポリペプチドの１以上のＮ末端と結合する場合、結合によって第２級アミンが形成されることが好ましい。成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンである場合、たとえば、オリゴマーはＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、および／またはＬｙｓ¹⁷²のアミノ基と結合してよい。
【００９６】
約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、種々の方法によって合成することができる。たとえば、カルボン酸とポリエチレングリコールとからなる約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有するオリゴマーの混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有するカルボン酸の混合物を、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有するポリエチレングリコールの混合物と、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有するオリゴマーの混合物を得るのに十分な条件下で接触させることによって合成される。次に、この約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する混合物のオリゴマーを、成長ホルモン剤と反応できるように活性化させて、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる。約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の一実施形態が図３に示されており、後出の実施例１１〜１８で説明されている。約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図４に示されており、後出の実施例１９〜２４で説明されている。約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図５に示されており、後出の実施例２５〜２９で説明されている。約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図６に示されており、後出の実施例３０〜３１で説明されている。約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図７に示されており、後出の実施例３２〜３７で説明されている。約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図８に示されており、後出の実施例３８で説明されている。約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図９に示されており、後出の実施例３９で説明されている。約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図１０に示されており、後出の実施例４０で説明されている。
【００９７】
約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤の混合物と、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で反応させる。代表的な合成は、後出の実施例４０〜４２で説明する。当業者であれば理解できることであるが、反応条件（たとえば、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物と、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤の混合物との反応の結果得られる成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物が、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する混合物となるように制御することができる。たとえば、リジンのアミノ基における結合は、リジンのｐＫ_aよりも反応溶液のｐＨを低く維持することによって抑制することができる。あるいは、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、たとえばＨＰＬＣを使用して分離および単離することによって、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体、たとえばモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体の混合物を得ることができる。個々の単離された抱合体の結合の程度（たとえば、単離された分子がモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体のいずれであるか）は、限定するものではないが質量分析などの当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。個々の抱合体の構造（たとえば、ヒト成長ホルモンのモノ抱合体のＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、またはＬｙｓ¹⁷²のいずれの位置にオリゴマーが存在するか）は、配列分析、ペプチドマッピング、選択的酵素開裂、および／またはエンドペプチダーゼ開裂などが挙げられるが、これらには限定されない当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。
【００９８】
当業者には理解できるであろうが、成長ホルモン剤上の１以上の反応部位は、たとえば、成長ホルモン剤を、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの好適なブロッキング試薬と反応させることによってブロックしてもよい。たとえば、成長ホルモン剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ末端の１以上で１以上のオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、すべての求核性残基が結合しているわけでない抱合体）が望ましい場合には、この方法が好ましいこともある。このようなブロッキング後に、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有するブロックされた成長ホルモン剤の混合物を、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物と反応させて、１以上の求核性残基と結合したオリゴマーを有し、別の求核性残基と結合したブロッキング部分を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。この結合反応の後、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体は、当業者に公知のように脱ブロックすることができる。必要であれば、続いて成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を前述のように分離することによって、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。あるいは、脱ブロック前に成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を分離してもよい。
【００９９】
本発明の実施形態による約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、従来の混合物と比較した場合に改善された性質を有することが好ましい。たとえば、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性よりも高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、種々の方法で測定することができる。たとえば、Ｈ．Ｒ．アルコックおよびＦ．Ｗ．ランプの「最新ポリマー化学」３９４−４０２（第２版、１９９１年）に記載されるようなゲル浸透クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
別の例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性よりも高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。
【０１０１】
個々の混合物のインビトロ活性は、当業者に公知の種々の方法によって測定してよい。好ましくはインビトロ活性は、カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイシズ・コーポレーションより市販されるサイトセンサー（登録商標）マイクロフィジオメーターを使用して測定される。このマイクロフィジオメーターは、トランスウェル中の培養細胞に加えられる薬剤に対する応答の細胞外酸性化速度の微小な変化を監視する。この応答は、研究対象の分子の活性に比例する。
【０１０２】
さらに別の例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した場合に、キモトリプシンに対する分解に対する増加した抵抗性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これには限定されない種々の方法で測定できる。
【０１０３】
さらに別の例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験者間変動よりも小さな被験者間変動を有する。当業者には公知であるが、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これには限定されない種々の方法で測定できる。被験者間変動は、当業者に公知の種々の方法によって測定することができる。被験者間変動は好ましくは以下のように計算される。用量反応曲線の下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験者の場合で求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者数で割ることによって、すべての被験者の平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの間の差の絶対値を各被験者について求める。得られた差の絶対値を次に合計することで、被験者間変動を表す値が得られる。値が小さいほど被験者間変動が小さいことを表しており、値が大きいほど被験者間変動が大きいことを表している。
【０１０４】
本発明の実施形態による約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の４つすべてを有する。
【０１０５】
本発明のさらに別の実施形態によると、抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、前記混合物が１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有し、
【数３】

（式中、
ｎは、試料中の種類の異なる分子の数であり、
Ｎ_iは、該試料中のｉ番目の分子の数であり、
Ｍ_iは、該ｉ番目の分子の質量である）
である混合物が提供される。本発明の抱合体の混合物は、好ましくは１００，０００を超える分散係数を有する。より好ましくは、本発明の抱合体混合物の分散係数は５００，０００を超え、最も好ましくは，分散係数は１０，０００，０００を超える。変量ｎ、Ｎ_i、およびＭ_iは、実施例４４で後述する方法などが挙げられるが、これに限定されない当業者に公知の種々の方法によって決定することができる。
【０１０６】
本発明の成長ホルモン剤は好ましくはヒト成長ホルモンである。しかし、成長ホルモン剤は、たとえば、成長ホルモンペプチド、成長ホルモンペプチド類似体、成長ホルモンペプチドフラグメント、および成長ホルモンペプチドフラグメント類似体などの当業者に公知の種々の成長ホルモン剤から選択してよいことを理解すべきである。成長ホルモンペプチドとしては、成長ホルモン，ヒト（ｈＧＨ）、成長ホルモン，ブタ、成長ホルモン，ウシ、成長ホルモン，ニワトリ、成長ホルモン，ラット、成長ホルモン，マウス、成長ホルモン，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ヒト、成長ホルモン前放出因子，ヒト、成長ホルモン放出因子，マウス、成長ホルモン放出因子，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ラット、成長ホルモン放出因子，ウシ、成長ホルモン放出因子，ブタ、および成長ホルモン放出因子，ニワトリが挙げられるが、これらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチド類似体は、成長ホルモンペプチド中の１以上のアミノ酸が置換されることによって前述のように得られてもよい。成長ホルモンペプチドフラグメントとしては、成長ホルモン１−４３，ヒト、成長ホルモン６−１３、成長ホルモン放出因子１−３７，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子３０−４４，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ラット、ヘキサレリン（成長ホルモン放出ヘキサペプチド）、および成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒトが挙げられるがこれらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチドフラグメント類似体としては、［Ｄ−Ａｌａ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒト、［Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ¹，Ｄ−Ａｒｇ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド、［Ｈｉｓ¹，Ｎｌｅ²⁷］−成長ホルモン放出因子１−３２，アミド、成長ホルモン放出ペプチド−６（［Ｈｉｓ¹，Ｌｙｓ⁶］−ＧＨＲＰ）、および［Ｄ−Ｌｙｓ³］−ＧＨＲＰ−６が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０７】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知のポリアルキレングリコール部分を含む種々のオリゴマーであってよい。好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも２個、３個、または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも５または６個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。最も好ましくは、本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、好ましくは、ポリエチレングリコール部分、ポリプロピレングリコール部分、またはポリブチレングリコール部分などの低級アルキルポリアルキレングリコール部分である。ポリアルキレングリコール部分は、より好ましくは、均一な構造を有するポリプロピレングリコール部分である。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール部分は、
【化６】

である。この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖中の各酸素原子と隣接するメチル置換炭素原子を１つのみ有すると説明することができる。このような均一なポリプロピレングリコール部分は、親油性と親水性の両方を示す場合があり、したがって親油性ポリマー部分を使用せずに両親媒性成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を得るために有用となりうる。さらに、ポリプロピレングリコール部分の第２級アルコール部分と成長ホルモン剤とを結合させることによって、腸などに見られるトリプシンやキモトリプシンなどの酵素による分解に対する抵抗性が向上した成長ホルモン剤（たとえば、ヒト成長ホルモン）を得ることが可能となる。
【０１０８】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコールは、これから説明する図１１〜１３に記載されるように合成されることが好ましい。図１１に示されるように、１，２−プロパンジオール５３を、第１級アルコールブロッキング試薬と反応させると、第２級アルコール延長モノマー５４が得られる。この第１級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第１級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドやｔ−ブチルジメチルシリルクロリドなどのシリルクロリド化合物、およびＡｃ₂Ｏなどのエステル化試薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第１級アルコールブロッキング試薬は、第２級アルコールと実質的に非反応性である第１級アルコールブロッキング試薬であり、たとえばｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドまたはｔ−ブチルジメチルシリルクロリドである。第２級アルコール延長モノマー（５４）を塩化メタンスルホニル（ＭｅＳＯ₂Ｃｌ）と反応させると、第１級延長アルコールモノマーメシレート５５を得ることができる。
【０１０９】
あるいは、第２級アルコール延長モノマー５４を、第２級アルコールブロッキング試薬と反応させて、化合物５６を得ることができる。第２級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第２級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、塩化ベンジルが挙げられるが、これに限定されるものではない。化合物５６は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬と反応させて、ブロッキング部分Ｂ₁を除去し、第１級アルコール延長モノマー５７を得ることができる。Ｂ₁脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング試薬から選択してよい。エステルを形成することによって第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬は塩基（たとえば、炭酸カリウム）などの脱エステル化試薬である。シリルクロリドを使用して第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬はフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）が好ましい。第１級アルコール延長モノマー５７を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を得ることができる。
【０１１０】
第１級アルコール延長モノマー５４と第２級アルコール延長モノマー５７は、以下のようにキャップすることができる。第２級アルコール延長モノマー５４は、キャッピング試薬と反応させて化合物５９を得ることができる。キャッピング試薬は当業者に公知の種々のキャッピング試薬であってよく、たとえば、塩化メチルなどのハロゲン化アルキルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。化合物５９を、前述のＢ₁脱ブロッキング剤と反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマー６０を得ることができる。第１級アルコールキャッピングモノマー６０を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコールキャッピングモノマーメシレート６１を得ることができる。第１級アルコール延長モノマー５７を、キャッピング試薬と反応させると、化合物６２を得ることができる。このキャッピング試薬は、前述の種々のキャッピング試薬であってよい。化合物６２を、Ｂ₂脱ブロッキング試薬と反応させてブロッキング部分Ｂ₂を除去すると、第２級アルコールキャッピングモノマー６３を得ることができる。Ｂ₂脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング剤であってよく、たとえば、パラジウム／活性炭触媒の存在下でのＨ₂が挙げられるが、これに限定されるものではない。第２級アルコールキャッピングモノマーを塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマーメシレート６４を得ることができる。図１１に示される実施形態ではキャッピングモノマーの合成が示されているが、キャッピングポリマーを得るために同様の反応を実施してもよいことを理解されたい。
【０１１１】
一般に、鎖延長は、第１級アルコール延長モノマー５７などの第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５などの第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、種々の均一なポリプロピレン鎖を得ることによって行うことができるし、あるいは第２級アルコール延長モノマー５４などの第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８などの第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させることによって行うこともできる。
【０１１２】
たとえば、図１３では、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５を、第１級アルコール延長モノマー５７と反応させると、ダイマー化合物６５が得られる。あるいは、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を、第２級アルコール延長モノマー５４と反応させて、ダイマー化合物６５を得ることもできる。ダイマー化合物６５上のＢ₁ブロッキング部分は、前述のＢ₁脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第１級アルコール延長ダイマー６６を得ることができる。第１級アルコール延長ダイマー６６を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を得ることができる。あるいは、ダイマー化合物６５上のＢ₂ブロッキング部分は、前述のＢ₂脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第２級アルコール延長ダイマー６９を得ることができる。第２級アルコール延長ダイマー６９を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を得ることができる。
【０１１３】
当業者であれば理解しているように、鎖延長法を繰り返して種々の他の鎖長を得ることができる。たとえば、図１３に示されるように、第１級アルコール延長ダイマー６６を、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０と反応させて、テトラマー化合物７２を得ることができる。図１３にさらに示されるように、一般的な鎖延長反応図式では、第１級アルコール延長モノマーまたはポリマー７３を、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレート７４と反応させることで、均一なポリプロピレンポリマー７５が得られる。ｍおよびｎの値はそれぞれ０〜１０００以上の範囲となりうる。好ましくは、ｍおよびｎはそれぞれが０〜５０である。図１３に示される実施形態は、第１級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーを第１級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートと反応させることを示しているが、第２級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーおよび第２級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートを使用して同様の反応を実施してもよいことは理解できるであろう。
【０１１４】
第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第１級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第１級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を、第１級アルコールキャッピングモノマー６０と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー７１が得られる。当業者は理解しているように、Ｂ₁ブロッキング部分を除去することができ、その結果得られるキャップされた第１級アルコール延長トリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー７１の鎖を延長することができる。
【０１１５】
第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第２級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第２級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を、第２級アルコールキャッピングモノマー６３と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー６８が得られる。前述のようにＢ₂ブロッキング部分は除去することができ、それによって得られるキャップされた第２級アルコール延長トリマーを、第２級アルコール延長マーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー６８の鎖を延長することができる。図１２に示される合成は、トリマーを得るためのダイマーとキャッピングモノマーの反応を示しているが、キャッピング法は、均一なポリプロピレングリコール部分の合成の任意の時点で実施することができるし、あるいはキャップされていない均一なポリプロピレングリコール部分を得ることもできることを理解されたい。図１２に示される実施形態は、キャッピングモノマーを使用した合成によるポリブチレンオリゴマーのキャッピングを示しているが、本発明のポリブチレンオリゴマーは、図１１に関して前述したキャッピング試薬を使用して直接キャップしてもよい（すなわち、キャッピングモノマーを付加しない）ことを理解されたい。
【０１１６】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコール部分は、成長ホルモン剤、カルボン酸などの親油性部分、および／または種々の他の部分と、ポリエチレングリコール部分に関して本明細書で説明した方法などが挙げられるが、これらには限定されない当業者に公知の種々の方法によって結合させてよい。
【０１１７】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上の他の部分を含んでよく、そのような部分としては、親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のオリゴマー中の種々の部分は、加水分解可能な結合または加水分解可能でない結合のいずれかによって互いに共有結合する。
【０１１８】
本発明のオリゴマーは、糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーなど挙げられるが、これらには限定されない１以上の親水性部分をさらに含んでよい。隣接するポリアルキレングリコール部分は、エーテル結合によって結合し同じアルキル構造を有するのであれば、同じ部分であると見なす。たとえば、部分
−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する１つのポリエチレングリコール部分である。隣接するポリアルキレングリコール部分は、エーテル結合以外の結合で結合している場合、または異なるアルキル構造を有する場合には、異なる部分であると見なす。たとえば、部分
【化７】

は、４つのポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分と、２つのポリエチレングリコールサブユニットとを有する親水性部分とになる。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーはポリアルキレングリコール部分を含むが、親水性部分をさらに含むことはない。
【０１１９】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上の親油性部分をさらに含んでよい。親油性部分は好ましくは、飽和または不飽和で線状または分岐状のアルキル部分、あるいは飽和または不飽和で線状または分岐状の脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合、その親油性部分は１個〜２８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２個〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、その脂肪酸部分は２個〜１８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和の天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３個〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４個、５個、または６個の炭素原子を有する。
【０１２０】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上のスペーサー部分をさらに含んでもよい。スペーサー部分は、たとえば、親水性部分を親油性部分から分離するため、親油性部分または親水性部分を成長ホルモン剤から分離するため、第１の親水性または親油性部分を第２の親水性または親油性部分から分離するため、あるいは親水性部分または親油性部分をリンカー部分から分離するために使用してよい。スペーサー部分は好ましくは、糖部分、コレステロール部分、およびグリセリン部分からなる群より選択される。
【０１２１】
本発明のオリゴマーは、オリゴマーを成長ホルモン剤と結合させるために使用される当業者に公知の１以上のリンカー部分をさらに含んでもよい。リンカー部分は好ましくは、アルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択される。
【０１２２】
本発明のオリゴマーは、成長ホルモン剤と結合していないオリゴマーの１以上の末端における１以上の末端部分をさらに含んでよい。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキル部分または低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であるが、末端部分は、限定するものではないが糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸などの当業者に公知の種々の部分であってよいことは理解できるであろう。
【０１２３】
本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と共有結合することが好ましい。ある実施形態では、加水分解可能な結合（たとえば、エステル結合または炭酸結合）を使用して成長ホルモン剤をオリゴマーと結合させる。加水分解可能な結合によって、プロドラッグとして機能する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる場合がある。ある場合、たとえば、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、成長ホルモン剤の主要な作用機序を介して身体に影響する能力を抱合体が欠いている）場合などでは、加水分解可能な結合によって、持続放出または制御放出効果が得られることがあり、１以上のオリゴマーがそれぞれの成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体から開裂して有効薬剤が得られる所与の時間のあいだ成長ホルモン剤が投与されうる。別の実施形態では、成長ホルモン剤は、加水分解可能でない結合（たとえば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を使用してオリゴマーと結合させる。成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を長時間、好ましくは少なくとも２時間、血流中で循環させることが望ましい場合には、加水分解可能でない結合の使用が好ましくなりうる。本発明のオリゴマーが成長ホルモン剤と共有結合する場合、そのオリゴマーは、オリゴマーを成長ホルモン剤と共有結合させるために使用される当業者に公知の１以上の結合部分をさらに含む。結合部分は好ましくは、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分、および第２級アミン部分からなる群より選択される。オリゴマー上の２つ以上の部分が、成長ホルモン剤と共有結合してもよい。
【０１２４】
本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と共有結合することが好ましいが、本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と非共有結合的に結合して、非共有結合的に結合した成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を形成してもよいことを理解されたい。当業者には理解されているように、非共有結合としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセルまたはリポソームカプセル化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の実施形態によると、選択された方法で非共有結合的に結合させるための能力を付与するために（たとえば、水素結合能力を付与するために）、当業者に公知のようにオリゴマーは適宜構成され、修飾され、および／または適切に官能化されうる。本発明の別の実施形態によると、限定するものではないが、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体などの種々の化合物でオリゴマーを誘導体化してよい。その結果得られるオリゴマーは、薬剤分子、医薬品、および／または医薬賦形剤と非共有結合的に結合（複合体化）させることができる。それによって得られる複合体は、親油性と親水性の平衡の状態にあることが好ましい。さらに別の本発明の実施形態によると、オリゴマーをアミンおよび／またはアルキルアミンで誘導体化してよい。好適な酸性条件下では、結果として得られるオリゴマーは、薬剤分子、医薬品、および／または医薬賦形剤と非共有結合的に結合した複合体を形成することができる。このような複合体化によって得られる生成物は、親油性と親水性の平衡の状態にあることが好ましい。
【０１２５】
２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）を成長ホルモン剤に結合させてもよい。複数のオリゴマーは同じものであることが好ましい。しかし、複数のオリゴマーは互いに異なっていてもよいし、あるいは複数のオリゴマーの一部が同じものであり、一部が異なっていてもよいことを理解されたい。複数のオリゴマーが成長ホルモン剤と結合する場合、１以上のオリゴマーと成長ホルモン剤が加水分解可能な結合によって結合し、１以上のオリゴマーと成長ホルモン剤が加水分解可能でない結合によって結合すると好ましくなりうる。あるいは、複数のオリゴマーと成長ホルモン剤の結合がすべて加水分解可能であるが、たとえば、１以上のオリゴマーは体内での加水分解によって急速に成長ホルモン剤から分離し、１以上のオリゴマーは体内での加水分解によってゆっくりと成長ホルモン剤から離れるように、異なる程度の加水分解性を有してもよい。
【０１２６】
本発明のオリゴマーは、求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基などが挙げられるが、これらには限定されない薬剤の種々の求核性残基で成長ホルモン剤と結合させてよい。求核性ヒドロキシル基は、たとえば、セリンおよび／またはチロシン残基に見ることができ、求核性アミノ基は、たとえば、ヒスチジンおよび／またはリジン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端に見ることができる。オリゴマーが成長ホルモンポリペプチドの１以上のＮ末端と結合する場合、結合によって第２級アミンが形成されることが好ましい。成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンである場合、たとえば、オリゴマーはＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、および／またはＬｙｓ¹⁷²のアミノ基と結合してよい。
【０１２７】
１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、種々の方法によって合成することができる。たとえば、カルボン酸とポリエチレングリコールとからなる１０，０００を超える分散係数を有するオリゴマーの混合物は、１０，０００を超える分散係数を有するカルボン酸の混合物を、１０，０００を超える分散係数を有するポリエチレングリコールの混合物と、１０，０００を超える分散係数を有するオリゴマーの混合物を得るのに十分な条件下で接触させることによって合成される。次に、この１０，０００を超える分散係数を有する混合物のオリゴマーを、成長ホルモン剤と反応できるように活性化させて、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる。１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の一実施形態が図３に示されており、後出の実施例１１〜１８で説明されている。１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図４に示されており、後出の実施例１９〜２４で説明されている。１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図５に示されており、後出の実施例２５〜２９で説明されている。１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図６に示されており、後出の実施例３０〜３１で説明されている。１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図７に示されており、後出の実施例３２〜３７で説明されている。１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図８に示されており、後出の実施例３８で説明されている。１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図９に示されており、後出の実施例３９で説明されている。１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図１０に示されており、後出の実施例４０で説明されている。
【０１２８】
１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物は、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤の混合物と、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で反応させる。代表的な合成は、後出の実施例４０〜４２で説明する。当業者であれば理解できることであるが、反応条件（たとえば、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物と、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤の混合物との反応の結果得られる成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物が、１０，０００を超える分散係数を有する混合物となるように制御することができる。たとえば、リジンのアミノ基における結合は、リジンのｐＫ_aよりも反応溶液のｐＨを低く維持することによって抑制することができる。あるいは、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、たとえばＨＰＬＣを使用して分離および単離することによって、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体、たとえばモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体の混合物を得ることができる。個々の単離された抱合体の結合の程度（たとえば、単離された分子がモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体のいずれであるか）は、限定するものではないが質量分析などの当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。個々の抱合体の構造（たとえば、ヒト成長ホルモンのモノ抱合体のＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、またはＬｙｓ¹⁷²のいずれの位置にオリゴマーが存在するか）は、限定するものではないが配列分析、ペプチドマッピング、選択的酵素開裂、および／またはエンドペプチダーゼ開裂などの当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。
【０１２９】
当業者には理解できるであろうが、成長ホルモン剤上の１以上の反応部位は、たとえば、成長ホルモン剤を、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの好適なブロッキング試薬と反応させることによってブロックしてもよい。たとえば、成長ホルモン剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ末端の１以上でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、すべての求核性残基が結合しているわけでない抱合体）が望ましい場合には、この方法が好ましいこともある。このようなブロッキング後に、１０，０００を超える分散係数を有するブロックされた成長ホルモン剤の混合物を、１０，０００を超える分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物と反応させて、１以上の求核性残基と結合したオリゴマーを有し、別の求核性残基と結合したブロッキング部分を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。この結合反応の後、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体は、当業者に公知のように脱ブロックすることができる。必要であれば、続いて成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を前述のように分離することによって、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。あるいは、脱ブロック前に成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を分離してもよい。
【０１３０】
本発明の実施形態による１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、従来の混合物と比較した場合に改善された性質を有することが好ましい。たとえば、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性よりも高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、種々の方法で測定することができ、たとえば、Ｈ．Ｒ．アルコックおよびＦ．Ｗ．ランプの「最新ポリマー化学」３９４−４０２（第２版、１９９１年）に記載されるようなゲル浸透クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できるが、これらに限定されるものではない。
【０１３１】
別の例として、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性よりも高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。
【０１３２】
個々の混合物のインビトロ活性は、当業者に公知の種々の方法によって測定してよい。好ましくはインビトロ活性は、カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイシズ・コーポレーションより市販されるサイトセンサー（登録商標）マイクロフィジオメーターを使用して測定される。このマイクロフィジオメーターは、トランスウェル中の培養細胞に加えられる薬剤に対する応答の細胞外酸性化速度の微小な変化を監視する。この応答は、研究対象の分子の活性に比例する。
【０１３３】
さらに別の例として、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した場合に、キモトリプシンに対する分解に対する増加した抵抗性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。
【０１３４】
さらに別の例として、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験者間変動よりも小さな被験者間変動を有する。当業者には公知であるが、１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。被験者間変動は、当業者に公知の種々の方法によって測定することができる。被験者間変動は好ましくは以下のように計算される。用量反応曲線の下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験者の場合で求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者数で割ることによって、すべての被験者の平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの間の差の絶対値を各被験者について求める。得られた差の絶対値を次に合計することで、被験者間変動を表す値が得られる。値が小さいほど被験者間変動が小さいことを表しており、値が大きいほど被験者間変動が大きいことを表している。
【０１３５】
本発明の実施形態による１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による１０，０００を超える分散係数を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の４つすべてを有する。
【０１３６】
本発明の別の実施形態によると、抱合体の混合物であって、各抱合体が、オリゴマーと結合した成長ホルモン剤を含み、さらに同数のポリアルキレングリコールサブユニットを有する混合物が提供される。
【０１３７】
本発明の成長ホルモン剤は好ましくはヒト成長ホルモンである。しかし、成長ホルモン剤は、たとえば、成長ホルモンペプチド、成長ホルモンペプチド類似体、成長ホルモンペプチドフラグメント、および成長ホルモンペプチドフラグメント類似体などの当業者に公知の種々の成長ホルモン剤から選択してよいことを理解すべきである。成長ホルモンペプチドとしては、成長ホルモン，ヒト（ｈＧＨ）、成長ホルモン，ブタ、成長ホルモン，ウシ、成長ホルモン，ニワトリ、成長ホルモン，ラット、成長ホルモン，マウス、成長ホルモン，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ヒト、成長ホルモン前放出因子，ヒト、成長ホルモン放出因子，マウス、成長ホルモン放出因子，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ラット、成長ホルモン放出因子，ウシ、成長ホルモン放出因子，ブタ、および成長ホルモン放出因子，ニワトリが挙げられるが、これらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチド類似体は、成長ホルモンペプチド中の１以上のアミノ酸が置換されることによって前述のように得られてもよい。成長ホルモンペプチドフラグメントとしては、成長ホルモン１−４３，ヒト、成長ホルモン６−１３、成長ホルモン放出因子１−３７，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子３０−４４，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ラット、ヘキサレリン（成長ホルモン放出ヘキサペプチド）、および成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒトが挙げられるがこれらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチドフラグメント類似体としては、［Ｄ−Ａｌａ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒト、［Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ¹，Ｄ−Ａｒｇ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド、［Ｈｉｓ¹，Ｎｌｅ²⁷］−成長ホルモン放出因子１−３２，アミド、成長ホルモン放出ペプチド−６（［Ｈｉｓ¹，Ｌｙｓ⁶］−ＧＨＲＰ）、および［Ｄ−Ｌｙｓ³］−ＧＨＲＰ−６が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３８】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知のポリアルキレングリコール部分を含む種々のオリゴマーであってよい。好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも２、３、または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも５または６個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。最も好ましくは、本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、好ましくは、ポリエチレングリコール部分、ポリプロピレングリコール部分、またはポリブチレングリコール部分などの低級アルキルポリアルキレングリコール部分である。ポリアルキレングリコール部分は、より好ましくは、均一な構造を有するポリプロピレングリコール部分である。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール部分は
【化８】

である。この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖中の各酸素原子と隣接するメチル置換炭素原子を１つのみ有すると説明することができる。このような均一なポリプロピレングリコール部分は、親油性と親水性の両方を示す場合があり、したがって親油性ポリマー部分を使用せずに両親媒性成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を得るために有用となりうる。さらに、ポリプロピレングリコール部分の第２級アルコール部分と成長ホルモン剤とを結合させることによって、腸などに見られるトリプシンやキモトリプシンなどの酵素による分解に対する抵抗性が向上した成長ホルモン剤（たとえば、ヒト成長ホルモン）を得ることが可能となる。
【０１３９】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコールは、これから説明する図１１〜１３に記載されるように合成されることが好ましい。図１１に示されるように、１，２−プロパンジオール５３を、第１級アルコールブロッキング試薬と反応させると、第２級アルコール延長モノマー５４が得られる。この第１級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第１級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドやｔ−ブチルジメチルシリルクロリドなどのシリルクロリド化合物、およびＡｃ₂Ｏなどのエステル化試薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第１級アルコールブロッキング試薬は、第２級アルコールと実質的に非反応性である第１級アルコールブロッキング試薬であり、たとえばｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドまたはｔ−ブチルジメチルシリルクロリドである。第２級アルコール延長モノマー（５４）を塩化メタンスルホニル（ＭｅＳＯ₂Ｃｌ）と反応させると、第１級延長アルコールモノマーメシレート５５を得ることができる。
【０１４０】
あるいは、第２級アルコール延長モノマー５４を、第２級アルコールブロッキング試薬と反応させて、化合物５６を得ることができる。第２級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第２級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、塩化ベンジルが挙げられるが、これに限定されるものではない。化合物５６は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬と反応させて、ブロッキング部分Ｂ₁を除去し、第１級アルコール延長モノマー５７を得ることができる。Ｂ₁脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング試薬から選択してよい。エステルを形成することによって第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬は塩基（たとえば、炭酸カリウム）などの脱エステル化試薬である。シリルクロリドを使用して第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬はフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）が好ましい。第１級アルコール延長モノマー５７を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を得ることができる。
【０１４１】
第１級アルコール延長モノマー５４と第２級アルコール延長モノマー５７は、以下のようにキャップすることができる。第２級アルコール延長モノマー５４は、キャッピング試薬と反応させて化合物５９を得ることができる。キャッピング試薬は当業者に公知の種々のキャッピング試薬であってよく、たとえば、塩化メチルなどのハロゲン化アルキルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。化合物５９を、前述のＢ₁脱ブロッキング剤と反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマー６０を得ることができる。第１級アルコールキャッピングモノマー６０を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコールキャッピングモノマーメシレート６１を得ることができる。第１級アルコール延長モノマー５７を、キャッピング試薬と反応させると、化合物６２を得ることができる。このキャッピング試薬は、前述の種々のキャッピング試薬であってよい。化合物６２を、Ｂ₂脱ブロッキング試薬と反応させてブロッキング部分Ｂ₂を除去すると、第２級アルコールキャッピングモノマー６３を得ることができる。Ｂ₂脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング剤であってよく、たとえば、パラジウム／活性炭触媒の存在下でのＨ₂が挙げられるが、これに限定されるものではない。第２級アルコールキャッピングモノマーを塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマーメシレート６４を得ることができる。図１１に示される実施形態ではキャッピングモノマーの合成が示されているが、キャッピングポリマーを得るために同様の反応を実施してもよいことを理解されたい。
【０１４２】
一般に、鎖延長は、第１級アルコール延長モノマー５７などの第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５などの第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、種々の均一なポリプロピレン鎖を得ることによって行うことができるし、あるいは第２級アルコール延長モノマー５４などの第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８などの第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させることによって行うこともできる。
【０１４３】
たとえば、図１３では、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５を、第１級アルコール延長モノマー５７と反応させると、ダイマー化合物６５が得られる。あるいは、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を、第２級アルコール延長モノマー５４と反応させて、ダイマー化合物６５を得ることもできる。ダイマー化合物６５上のＢ₁ブロッキング部分は、前述のＢ₁脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第１級アルコール延長ダイマー６６を得ることができる。第１級アルコール延長ダイマー６６を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を得ることができる。あるいは、ダイマー化合物６５上のＢ₂ブロッキング部分は、前述のＢ₂脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第２級アルコール延長ダイマー６９を得ることができる。第２級アルコール延長ダイマー６９を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を得ることができる。
【０１４４】
当業者であれば理解しているように、鎖延長法を繰り返して種々の他の鎖長を得ることができる。たとえば、図１３に示されるように、第１級アルコール延長ダイマー６６を、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０と反応させて、テトラマー化合物７２を得ることができる。図１３にさらに示されるように、一般的な鎖延長反応図式では、第１級アルコール延長モノマーまたはポリマー７３を、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレート７４と反応させることで、均一なポリプロピレンポリマー７５が得られる。ｍおよびｎの値はそれぞれ０〜１０００以上の範囲となりうる。好ましくは、ｍおよびｎはそれぞれが０〜５０である。図１３に示される実施形態は、第１級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーを第１級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートと反応させることを示しているが、第２級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーおよび第２級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートを使用して同様の反応を実施してもよいことは理解できるであろう。
【０１４５】
第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第１級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第１級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を、第１級アルコールキャッピングモノマー６０と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー７１が得られる。当業者は理解しているように、Ｂ₁ブロッキング部分を除去することができ、その結果得られるキャップされた第１級アルコール延長トリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー７１の鎖を延長することができる。
【０１４６】
第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第２級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第２級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を、第２級アルコールキャッピングモノマー６３と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー６８が得られる。前述のようにＢ₂ブロッキング部分は除去することができ、それによって得られるキャップされた第２級アルコール延長トリマーを、第２級アルコール延長マーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー６８の鎖を延長することができる。図１２に示される合成は、トリマーを得るためのダイマーとキャッピングモノマーの反応を示しているが、キャッピング法は、均一なポリプロピレングリコール部分の合成の任意の時点で実施することができるし、あるいはキャップされていない均一なポリプロピレングリコール部分を得ることもできることを理解されたい。図１２に示される実施形態は、キャッピングモノマーを使用した合成によるポリブチレンオリゴマーのキャッピングを示しているが、本発明のポリブチレンオリゴマーは、図１１に関して前述したキャッピング試薬を使用して直接キャップしてもよい（すなわち、キャッピングモノマーを付加しない）ことを理解されたい。
【０１４７】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコール部分は、成長ホルモン剤、カルボン酸などの親油性部分、および／または種々の他の部分と、限定するものではないがポリエチレングリコール部分に関して本明細書で説明した方法などの当業者に公知の種々の方法によって結合させてよい。
【０１４８】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上の他の部分を含んでよく、そのような部分としては、親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のオリゴマー中の種々の部分は、加水分解可能な結合または加水分解可能でない結合のいずれかによって互いに共有結合する。
【０１４９】
本発明のオリゴマーは、糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーなどが挙げられるが、これらには限定されない１以上の親水性部分をさらに含んでよい。隣接するポリアルキレングリコール部分は、エーテル結合によって結合し同じアルキル構造を有するのであれば、同じ部分であると見なす。たとえば、部分、
−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−Ｏ−Ｃ₂Ｈ₄−
は６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する１つのポリエチレングリコール部分である。隣接するポリアルキレングリコール部分は、エーテル結合以外の結合で結合している場合、または異なるアルキル構造を有する場合には、異なる部分であると見なす。たとえば、部分
【化９】

は、４つのポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分と、２つのポリエチレングリコールサブユニットとを有する親水性部分とである。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーはポリアルキレングリコール部分を含むが、親水性部分をさらに含むことはない。
【０１５０】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上の親油性部分をさらに含んでよい。親油性部分は好ましくは、飽和または不飽和で線状または分岐状のアルキル部分、あるいは飽和または不飽和で線状または分岐状の脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合、その親油性部分は１個〜２８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２個〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、その脂肪酸部分は２個〜１８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和の天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３個〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４個、５個、または６個の炭素原子を有する。
【０１５１】
本発明のオリゴマーは、当業者に公知の１以上のスペーサー部分をさらに含んでもよい。スペーサー部分は、たとえば、親水性部分を親油性部分から分離するため、親油性部分または親水性部分を成長ホルモン剤から分離するため、第１の親水性または親油性部分を第２の親水性または親油性部分から分離するため、あるいは親水性部分または親油性部分をリンカー部分から分離するために使用してよい。スペーサー部分は好ましくは、糖部分、コレステロール部分、およびグリセリン部分からなる群より選択される。
【０１５２】
本発明のオリゴマーは、オリゴマーを成長ホルモン剤と結合させるために使用される当業者に公知の１以上のリンカー部分をさらに含んでもよい。リンカー部分は好ましくは、アルキル部分および脂肪酸部分からなる群より選択される。
【０１５３】
本発明のオリゴマーは、成長ホルモン剤と結合していないオリゴマーの１以上の末端における１以上の末端部分をさらに含んでよい。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキル部分または低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であるが、末端部分は、限定するものではないが糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸などの当業者に公知の種々の部分であってよいことは理解できるであろう。
【０１５４】
本発明のオリゴマーは、成長ホルモン剤と共有結合することが好ましい。ある実施形態では、加水分解可能な結合（たとえば、エステル結合または炭酸結合）を使用して成長ホルモン剤をオリゴマーと結合させる。加水分解可能な結合によって、プロドラッグとして機能する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる場合がある。ある場合、たとえば、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、成長ホルモン剤の主要な作用機序を介して身体に影響する能力を抱合体が欠いている）場合などでは、加水分解可能な結合によって、持続放出または制御放出効果が得られることがあり、１以上のオリゴマーがそれぞれの成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体から開裂して有効薬剤が得られる所与の時間のあいだ成長ホルモン剤が投与されうる。別の実施形態では、成長ホルモン剤は、加水分解可能でない結合（たとえば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を使用してオリゴマーと結合させる。成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を長時間、好ましくは少なくとも２時間、血流中で循環させることが望ましい場合には、加水分解可能でない結合の使用が好ましくなりうる。本発明のオリゴマーが成長ホルモン剤と共有結合する場合、そのオリゴマーは、オリゴマーを成長ホルモン剤と共有結合させるために使用される当業者に公知の１以上の結合部分をさらに含む。結合部分は好ましくは、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分、および第２級アミン部分からなる群より選択される。オリゴマー上の２つ以上の部分が、成長ホルモン剤と共有結合してもよい。
【０１５５】
本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と共有結合することが好ましいが、本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と非共有結合的に結合して、非共有結合的に結合した成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を形成してもよいことを理解されたい。当業者には理解されているように、非共有結合としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセルまたはリポソームカプセル化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の実施形態によると、選択された方法で非共有結合的に結合させる能力を付与するために（たとえば、水素結合能力を付与するために）、当業者に公知のようにオリゴマーは適宜構成され、修飾され、および／または適切に官能化されうる。本発明の別の実施形態によると、限定するものではないが、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体などの種々の化合物でオリゴマーを誘導体化してよい。その結果得られるオリゴマーは、薬剤分子、医薬品、および／または医薬賦形剤と非共有結合的に結合（複合体化）させることができる。それによって得られる複合体は、親油性と親水性の平衡の状態にあることが好ましい。さらに別の本発明の実施形態によると、オリゴマーをアミンおよび／またはアルキルアミンで誘導体化してよい。好適な酸性条件下では、結果として得られるオリゴマーは、薬剤分子、医薬品、および／または医薬賦形剤と非共有結合的に結合した複合体を形成することができる。このような複合体化によって得られる生成物は、親油性と親水性の平衡の状態にあることが好ましい。
【０１５６】
２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）を成長ホルモン剤に結合させてもよい。複数のオリゴマーは同じものであることが好ましい。しかし、複数のオリゴマーは互いに異なっていてもよいし、あるいは複数のオリゴマーの一部が同じものであり、一部が異なっていてもよいことを理解されたい。複数のオリゴマーが成長ホルモン剤と結合する場合、１以上のオリゴマーと成長ホルモン剤が加水分解可能な結合によって結合し、１以上のオリゴマーと成長ホルモン剤が加水分解可能でない結合によって結合することが好ましい。あるいは、複数のオリゴマーと成長ホルモン剤の結合がすべて加水分解可能であるが、たとえば、１以上のオリゴマーは体内での加水分解によって急速に成長ホルモン剤から分離し、１以上のオリゴマーは体内での加水分解によってゆっくりと成長ホルモン剤から離れるように、異なる程度の加水分解性を有してもよい。
【０１５７】
本発明のオリゴマーは、求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基などが挙げられるが、これらには限定されない薬剤の種々の求核性残基で成長ホルモン剤と結合させてよい。求核性ヒドロキシル基は、たとえば、セリンおよび／またはチロシン残基に見ることができ、および求核性アミノ基は、たとえば、ヒスチジンおよび／またはリジン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端に見ることができる。オリゴマーが成長ホルモンポリペプチドの１以上のＮ末端と結合する場合、結合によって第２級アミンが形成されることが好ましい。成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンである場合、たとえば、オリゴマーはＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、および／またはＬｙｓ¹⁷²のアミノ基と結合してよい。
【０１５８】
混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、種々の方法によって合成することができる。たとえば、カルボン酸とポリエチレングリコールとからなる混合物であって、混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有するオリゴマーの混合物は、カルボン酸の混合物を、ポリエチレングリコールの混合物であって、混合物中の各ポリエチレングリコール分子が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する混合物と、オリゴマーの混合物であって、混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する混合物を得るのに十分な条件下で接触させることによって合成される。次に、この混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する混合物のオリゴマーを、成長ホルモン剤と反応できるように活性化させて、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の一実施形態が図３に示されており、後出の実施例１１〜１８で説明されている。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図４に示されており、後出の実施例１９〜２４で説明されている。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図５に示されており、後出の実施例２５〜２９で説明されている。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図６に示されており、後出の実施例３０〜３１で説明されている。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図７に示されており、後出の実施例３２〜３７で説明されている。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図８に示されており、後出の実施例３８で説明されている。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図９に示されており、後出の実施例３９で説明されている。混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図１０に示されており、後出の実施例４０で説明されている。
【０１５９】
混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物は、成長ホルモン剤の混合物と、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で反応させる。代表的な合成は、後出の実施例４０〜４２で説明する。当業者であれば理解できることであるが、反応条件（たとえば、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物と、成長ホルモン剤の混合物との反応の結果得られる成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物が、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する抱合体の混合物となるように制御することができる。たとえば、リジンのアミノ基における結合は、リジンのｐＫ_aよりも反応溶液のｐＨを低く維持することによって抑制することができる。あるいは、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、たとえばＨＰＬＣを使用して分離および単離することによって、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体、たとえばモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体の混合物を得ることができる。個々の単離された抱合体の結合の程度（たとえば、単離された分子がモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体のいずれであるか）は、限定するものではないが質量分析などの当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。個々の抱合体の構造（たとえば、ヒト成長ホルモンのモノ抱合体のＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、またはＬｙｓ¹⁷²のいずれの位置にオリゴマーが存在するか）は、限定するものではないが配列分析、ペプチドマッピング、選択的酵素開裂、および／またはエンドペプチダーゼ開裂などの当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。
【０１６０】
当業者には理解できるであろうが、成長ホルモン剤上の１以上の反応部位は、たとえば、成長ホルモン剤を、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの好適なブロッキング試薬と反応させることによってブロックしてもよい。たとえば、成長ホルモン剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ末端の１以上でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、すべての求核性残基が結合しているわけでない抱合体）が望ましい場合には、この方法が好ましいこともある。このようなブロッキング後に、ブロックされた成長ホルモン剤の混合物を、混合物中の各オリゴマーが同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物と反応させて、１以上の求核性残基と結合したオリゴマーを有し、別の求核性残基と結合したブロッキング部分を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。この結合反応の後、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体は、当業者に公知のように脱ブロックすることができる。必要であれば、続いて成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を前述のように分離することによって、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。あるいは、脱ブロック前に成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を分離してもよい。
【０１６１】
本発明の実施形態による、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、従来の混合物と比較した場合に改善された性質を有することが好ましい。たとえば、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性よりも高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、種々の方法で測定することができ、たとえば、Ｈ．Ｒ．アルコックおよびＦ．Ｗ．ランプの「最新ポリマー化学」３９４−４０２（第２版、１９９１年）に記載されるようなゲル浸透クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できるが、これらに限定されるものではない。
【０１６２】
別の例として、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性よりも高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。
【０１６３】
個々の混合物のインビトロ活性は、当業者に公知の種々の方法によって測定してよい。好ましくはインビトロ活性は、カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイシズ・コーポレーションより市販されるサイトセンサー（登録商標）マイクロフィジオメーターを使用して測定される。このマイクロフィジオメーターは、トランスウェル中の培養細胞に加えられる薬剤に対する応答の細胞外酸性化速度の微小な変化を監視する。この応答は、研究対象の分子の活性に比例する。
【０１６４】
さらに別の例として、本発明のさらに別の実施形態による、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した場合に、キモトリプシンに対する分解に対する増加した抵抗性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。
【０１６５】
さらに別の例として、本発明のさらに別の実施形態による、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験者間変動よりも小さな被験者間変動を有する。当業者には公知であるが、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。被験者間変動は、当業者に公知の種々の方法によって測定することができる。被験者間変動は好ましくは以下のように計算される。用量反応曲線の下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験者の場合で求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者数で割ることによって、すべての被験者の平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの間の差の絶対値を各被験者について求める。得られた差の絶対値を次に合計することで、被験者間変動を表す値が得られる。値が小さいほど被験者間変動が小さいことを表しており、値が大きいほど被験者間変動が大きいことを表している。
【０１６６】
本発明の実施形態による、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による、混合物中の各抱合体が同数のポリエチレングリコールサブユニットを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の４つすべてを有する。
【０１６７】
本発明のさらに別の実施形態によると、抱合体の混合物であって、各抱合体が、同じ分子量を有し、さらに式：
【化１０】

成長ホルモン剤
（式中、
Ｂは結合部分であり、
Ｌはリンカー部分であり、
Ｇ、Ｇ’、およびＧ’’は、独立して選択されるスペーサー部分であり、
Ｒは親油性部分でありＲ’はポリアルキレングリコール部分であるか、あるいはＲ’は親油性部分でありＲはポリアルキレングリコール部分であり、
Ｔは末端部分であり、
ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｍ、およびｎは独立して０または１であり、但し、Ｒがポリアルキレングリコール部分である場合はｍが１となり、Ｒ’がポリアルキレングリコール部分である場合はｎが１となり、および
ｐは、１から、前記成長ホルモン剤上の求核性残基の数までの整数である）を有する混合物が提供される。
【０１６８】
本発明の成長ホルモン剤は好ましくはヒト成長ホルモンである。しかし、成長ホルモン剤は、たとえば、成長ホルモンペプチド、成長ホルモンペプチド類似体、成長ホルモンペプチドフラグメント、および成長ホルモンペプチドフラグメント類似体などの当業者に公知の種々の成長ホルモン剤から選択してよいことを理解すべきである。成長ホルモンペプチドとしては、成長ホルモン，ヒト（ｈＧＨ）、成長ホルモン，ブタ、成長ホルモン，ウシ、成長ホルモン，ニワトリ、成長ホルモン，ラット、成長ホルモン，マウス、成長ホルモン，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ヒト、成長ホルモン前放出因子，ヒト、成長ホルモン放出因子，マウス、成長ホルモン放出因子，ヒツジ、成長ホルモン放出因子，ラット、成長ホルモン放出因子，ウシ、成長ホルモン放出因子，ブタ、および成長ホルモン放出因子，ニワトリが挙げられるが、これらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチド類似体は、成長ホルモンペプチド中の１以上のアミノ酸が置換されることによって前述のように得られてもよい。成長ホルモンペプチドフラグメントとしては、成長ホルモン１−４３，ヒト、成長ホルモン６−１３、成長ホルモン放出因子１−３７，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，ヒト、成長ホルモン放出因子１−４０，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子３０−４４，アミド，ヒト、成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ラット、ヘキサレリン（成長ホルモン放出ヘキサペプチド）、および成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒトが挙げられるがこれらに限定されるものではない。成長ホルモンペプチドフラグメント類似体としては、［Ｄ−Ａｌａ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド，ヒト、［Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ¹，Ｄ−Ａｒｇ²］−成長ホルモン放出因子１−２９，アミド、［Ｈｉｓ¹，Ｎｌｅ²⁷］−成長ホルモン放出因子１−３２，アミド、成長ホルモン放出ペプチド−６（［Ｈｉｓ¹，Ｌｙｓ⁶］−ＧＨＲＰ）、および［Ｄ−Ｌｙｓ³］−ＧＨＲＰ−６が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６９】
本発明のこれらの実施形態によると、ＲまたはＲ’はポリアルキレン部分である。好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも２個、３個、または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも５個または６個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。最も好ましくは、本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。本発明のオリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、好ましくは、ポリエチレングリコール部分、ポリプロピレングリコール部分、またはポリブチレングリコール部分などの低級アルキルポリアルキレングリコール部分である。ポリアルキレングリコール部分は、より好ましくは、均一な構造を有するポリプロピレングリコール部分である。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール部分は
【化１１】

である。この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖中の各酸素原子と隣接するメチル置換炭素原子を１つのみ有すると説明することができる。このような均一なポリプロピレングリコール部分は、親油性と親水性の両方を示す場合があり、したがって親油性ポリマー部分を使用せずに（すなわち、ｍ＋ｎの合計が１）両親媒性成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を得るために有用となりうる。さらに、ポリプロピレングリコール部分の第２級アルコール部分と成長ホルモン剤とを結合させることによって、例えば腸などに見られるトリプシンやキモトリプシンなどの酵素による分解に対する抵抗性が向上した成長ホルモン剤（たとえば、ヒト成長ホルモン）を得ることが可能となる。
【０１７０】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコールは、これから説明する図１１〜１３に記載されるように合成されることが好ましい。図１１に示されるように、１，２−プロパンジオール５３を、第１級アルコールブロッキング試薬と反応させると、第２級アルコール延長モノマー５４が得られる。この第１級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第１級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドやｔ−ブチルジメチルシリルクロリドなどのシリルクロリド化合物、およびＡｃ₂Ｏなどのエステル化試薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第１級アルコールブロッキング試薬は、第２級アルコールと実質的に非反応性である第１級アルコールブロッキング試薬であり、たとえばｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドまたはｔ−ブチルジメチルシリルクロリドである。第２級アルコール延長モノマー（５４）を塩化メタンスルホニル（ＭｅＳＯ₂Ｃｌ）と反応させると、第１級延長アルコールモノマーメシレート５５を得ることができる。
【０１７１】
あるいは、第２級アルコール延長モノマー５４を、第２級アルコールブロッキング試薬と反応させて、化合物５６を得ることができる。第２級アルコールブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の第２級アルコールブロッキング試薬であってよく、たとえば、塩化ベンジルが挙げられるが、これに限定されるものではない。化合物５６は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬と反応させて、ブロッキング部分Ｂ₁を除去し、第１級アルコール延長モノマー５７を得ることができる。Ｂ₁脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング試薬から選択してよい。エステルを形成することによって第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬は塩基（たとえば、炭酸カリウム）などの脱エステル化試薬である。シリルクロリドを使用して第１級アルコールがブロックされている場合は、Ｂ₁脱ブロッキング試薬はフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）が好ましい。第１級アルコール延長モノマー５７を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を得ることができる。
【０１７２】
第１級アルコール延長モノマー５４と第２級アルコール延長モノマー５７は、以下のようにキャップすることができる。第２級アルコール延長モノマー５４は、キャッピング試薬と反応させて化合物５９を得ることができる。キャッピング試薬は当業者に公知の種々のキャッピング試薬であってよく、塩化メチルなどのハロゲン化アルキルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。化合物５９を、前述のＢ₁脱ブロッキング剤と反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマー６０を得ることができる。第１級アルコールキャッピングモノマー６０を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコールキャッピングモノマーメシレート６１を得ることができる。第１級アルコール延長モノマー５７を、キャッピング試薬と反応させると、化合物６２を得ることができる。このキャッピング試薬は、前述の種々のキャッピング試薬であってよい。化合物６２を、Ｂ₂脱ブロッキング試薬と反応させてブロッキング部分Ｂ₂を除去すると、第２級アルコールキャッピングモノマー６３を得ることができる。Ｂ₂脱ブロッキング試薬は、当業者に公知の種々の脱ブロッキング剤であってよく、たとえば、パラジウム／活性炭触媒の存在下でのＨ₂が挙げられるが、これに限定されるものではない。第２級アルコールキャッピングモノマーを塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコールキャッピングモノマーメシレート６４を得ることができる。図１１に示される実施形態ではキャッピングモノマーの合成が示されているが、キャッピングポリマーを得るために同様の反応を実施してもよいことを理解されたい。
【０１７３】
一般に、鎖延長は、第１級アルコール延長モノマー５７などの第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５などの第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、種々の均一なポリプロピレン鎖を得ることによって行うことができるし、あるいは第２級アルコール延長モノマー５４などの第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーを、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８などの第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させることによって行うこともできる。
【０１７４】
たとえば、図１３では、第１級アルコール延長モノマーメシレート５５を、第１級アルコール延長モノマー５７と反応させると、ダイマー化合物６５が得られる。あるいは、第２級アルコール延長モノマーメシレート５８を、第２級アルコール延長モノマー５４と反応させて、ダイマー化合物６５を得ることもできる。ダイマー化合物６５上のＢ₁ブロッキング部分は、前述のＢ₁脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第１級アルコール延長ダイマー６６を得ることができる。第１級アルコール延長ダイマー６６を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を得ることができる。あるいは、ダイマー化合物６５上のＢ₂ブロッキング部分は、前述のＢ₂脱ブロッキング試薬を使用して除去して、第２級アルコール延長ダイマー６９を得ることができる。第２級アルコール延長ダイマー６９を、塩化メタンスルホニルと反応させると、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を得ることができる。
【０１７５】
当業者であれば理解しているように、鎖延長法を繰り返して種々の他の鎖長を得ることができる。たとえば、図１３に示されるように、第１級アルコール延長ダイマー６６を、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０と反応させて、テトラマー化合物７２を得ることができる。図１３にさらに示されるように、一般的な鎖延長反応図式では、第１級アルコール延長モノマーまたはポリマー７３を、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレート７４と反応させることで、均一なポリプロピレンポリマー７５が得られる。ｍおよびｎの値はそれぞれ０〜１０００以上の範囲となりうる。好ましくは、ｍおよびｎはそれぞれが０〜５０である。図１３に示される実施形態は、第１級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーを第１級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートと反応させることを示しているが、第２級アルコール延長モノマーおよび／またはポリマーおよび第２級アルコール延長モノマーメシレートおよび／またはポリマーメシレートを使用して同様の反応を実施してもよいことは理解できるであろう。
【０１７６】
第１級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第１級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第１級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第１級アルコール延長ダイマーメシレート７０を、第１級アルコールキャッピングモノマー６０と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー７１が得られる。当業者は理解しているように、Ｂ₁ブロッキング部分を除去することができ、その結果得られるキャップされた第１級アルコール延長トリマーを、第１級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー７１の鎖を延長することができる。
【０１７７】
第２級アルコール延長モノマーまたはポリマーの末端、あるいは第２級アルコール延長モノマーメシレートまたはポリマーメシレートの末端を、それぞれ第２級アルコールキャッピングモノマーメシレートまたはポリマーメシレート、あるいは第２級アルコールキャッピングモノマーまたはポリマーと反応させて、キャップされた均一なポリプロピレン鎖を得ることができる。たとえば、図１２に示されるように、第２級アルコール延長ダイマーメシレート６７を、第２級アルコールキャッピングモノマー６３と反応させると、キャップ／ブロックされた第１級アルコール延長トリマー６８が得られる。前述のようにＢ₂ブロッキング部分は除去することができ、それによって得られるキャップされた第２級アルコール延長トリマーを、第２級アルコール延長マーメシレートと反応させて、キャップされたトリマー６８の鎖を延長することができる。図１２に示される合成は、トリマーを得るためのダイマーとキャッピングモノマーの反応を示しているが、キャッピング法は、均一なポリプロピレングリコール部分の合成の任意の時点で実施することができるし、あるいはキャップされていない均一なポリプロピレングリコール部分を得ることもできることを理解されたい。図１２に示される実施形態は、キャッピングモノマーを使用した合成によるポリブチレンオリゴマーのキャッピングを示しているが、本発明のポリブチレンオリゴマーは、図１１に関して前述したキャッピング試薬を使用して直接キャップしてもよい（すなわち、キャッピングモノマーを付加しない）ことを理解されたい。
【０１７８】
本発明の実施形態による均一なポリプロピレングリコール部分は、成長ホルモン剤、カルボン酸などの親油性部分、および／または種々の他の部分と、限定するものではないがポリエチレングリコール部分に関して本明細書で説明した方法などの当業者に公知の種々の方法によって結合させてよい。
【０１７９】
本発明のこれらの実施形態によると、ＲまたはＲ’は当業者に公知の親油性部分である。親油性部分は好ましくは、飽和または不飽和で線状または分岐状のアルキル部分、あるいは飽和または不飽和で線状または分岐状の脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合、その親油性部分は１〜２８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和のアルキル部分であることが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合、その脂肪酸部分は２〜１８個の炭素原子を有する線状で飽和または不飽和の天然脂肪酸部分であることが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４個、５個、または６個の炭素原子を有する。
【０１８０】
本発明のこれらの実施形態によると、スペーサー部分Ｇ、Ｇ’、およびＧ’’は当業者に公知のスペーサー部分である。スペーサー部分は好ましくは、糖部分、コレステロール部分、およびグリセリン部分からなる群より選択される。好ましくは、これらの実施形態のオリゴマーはスペーサー部分を含まない（すなわち、ｉ、ｊ、およびｋが好ましくは０である）。
【０１８１】
本発明のこれらの実施形態によると、当業者には公知のように、リンカー部分Ｌは、オリゴマーを成長ホルモン剤と結合させるために使用してよい。リンカー部分は好ましくは、アルキルおよび脂肪酸からなる群より選択される。
【０１８２】
本発明のこれらの実施形態によると、末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキル部分または低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルまたはメトキシである。末端部分は好ましくはアルキル部分またはアルコキシ部分であるが、末端部分は、限定するものではないが糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸などの当業者に公知の種々の部分であってよいことは理解できるであろう。
【０１８３】
本発明のこれらの実施形態によると、式Ａの構造の括弧部分で表される本発明のオリゴマーは成長ホルモン剤と共有結合する。ある実施形態では、加水分解可能な結合（たとえば、エステル結合または炭酸結合）を使用して成長ホルモン剤をオリゴマーと結合させる。加水分解可能な結合によって、プロドラッグとして機能する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる場合がある。ある場合、たとえば、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、成長ホルモン剤の主要な作用機序を介して身体に影響する能力を抱合体が欠いている）場合などでは、加水分解可能な結合によって、持続放出または制御放出効果が得られることがあり、１以上のオリゴマーがそれぞれの成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体から開裂して有効薬剤が得られる所与の時間のあいだ成長ホルモン剤が投与されうる。別の実施形態では、成長ホルモン剤は、加水分解可能でない結合（たとえば、カルバメート結合、アミド結合、またはエーテル結合）を使用してオリゴマーと結合させる。成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体を長時間、好ましくは少なくとも２時間、血流中で循環させることができると望ましい場合には、加水分解可能でない結合の使用が好ましくなりうる。結合部分は、オリゴマーを成長ホルモン剤と共有結合させるために使用することができる当業者に公知の種々の結合部分であってよい。結合部分は好ましくは、共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分、および第２級アミン部分からなる群より選択される。
【０１８４】
変量ｐは、１から、成長ホルモン剤上の求核性残基の数までの整数である。ｐが２以上である場合、２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）が薬剤と結合する。本発明のこれらの実施形態によると、複数のオリゴマーは同じものである。
【０１８５】
本発明のオリゴマーは、限定するものではないが求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基などの薬剤の種々の求核性残基で成長ホルモン剤と結合させてよい。求核性ヒドロキシル基は、たとえば、セリンおよび／またはチロシン残基に見ることができ、求核性アミノ基は、たとえば、ヒスチジンおよび／またはリジン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端に見ることができる。オリゴマーが成長ホルモンポリペプチドの１以上のＮ末端と結合する場合、結合によって第２級アミンが形成されることが好ましい。成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンである場合、たとえば、オリゴマーはＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、および／またはＬｙｓ¹⁷²のアミノ基と結合してよい。
【０１８６】
混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し式Ａの構造を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、種々の方法によって合成することができる。たとえば、カルボン酸とポリエチレングリコールとからなるオリゴマーの混合物は、カルボン酸の混合物を、ポリエチレングリコールの混合物と、オリゴマーの混合物を得るのに十分な条件下で接触させることによって合成される。次にこの混合物のオリゴマーを、成長ホルモン剤と反応できるように活性化させて、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体が得られる。各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の一実施形態が図３に示されており、後出の実施例１１〜１８で説明されている。各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図４に示されており、後出の実施例１９〜２４で説明されている。各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図５に示されており、後出の実施例２５〜２９で説明されている。各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図６に示されており、後出の実施例３０〜３１で説明されている。各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図７に示されており、後出の実施例３２〜３７で説明されている。各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図８に示されており、後出の実施例３８で説明されている。各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路のさらに別の実施形態が図９に示されており、後出の実施例３９で説明されている。各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を得るための合成経路の別の実施形態が図１０に示されており、後出の実施例４０で説明されている。
【０１８７】
各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物は、混合物中の各剤が同じ分子量を有する成長ホルモン剤の混合物と、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で反応させる。代表的な合成は、後出の実施例４０〜４２で説明する。当業者であれば理解できることであるが、反応条件（たとえば、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物と、成長ホルモン剤の混合物との反応の結果得られる成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物が、各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する抱合体の混合物となるように制御することができる。たとえば、リジンのアミノ基における結合は、リジンのｐＫ_aよりも反応溶液のｐＨを低く維持することによって抑制することができる。あるいは、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、たとえばＨＰＬＣを使用して分離および単離することによって、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体、たとえばモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体の混合物を得ることができる。個々の単離された抱合体の結合の程度（たとえば、単離された分子がモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体のいずれであるか）は、限定するものではないが質量分析などの当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。個々の抱合体の構造（たとえば、ヒト成長ホルモンのモノ抱合体のＰｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、またはＬｙｓ¹⁷²のいずれの位置にオリゴマーが存在するか）は、限定するものではないが配列分析、ペプチドマッピング、選択的酵素開裂、および／またはエンドペプチダーゼ開裂などの当業者に公知の種々の技術を使用して測定および／または確認することができる。
【０１８８】
当業者には理解できるであろうが、成長ホルモン剤上の１以上の反応部位は、たとえば、成長ホルモン剤を、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、またはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）などの好適なブロッキング試薬と反応させることによってブロックしてもよい。たとえば、成長ホルモン剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ末端の１以上でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、すべての求核性残基が結合しているわけでない抱合体）が望ましい場合には、この方法が好ましいこともある。このようなブロッキング後に、ブロックされた成長ホルモン剤の混合物を、混合物中の各オリゴマーが同じ分子量を有し式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物と反応させて、１以上の求核性残基と結合したオリゴマーを有し、別の求核性残基と結合したブロッキング部分を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。この結合反応の後、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体は、当業者に公知のように脱ブロックすることができる。必要であれば、続いて成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を前述のように分離することによって、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を得ることができる。あるいは、脱ブロック前に成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を分離してもよい。
【０１８９】
本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、従来の混合物と比較した場合に改善された性質を有することが好ましい。たとえば、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性よりも高いインビボ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、種々の方法で測定することができ、たとえば、Ｈ．Ｒ．アルコックおよびＦ．Ｗ．ランプの「最新ポリマー化学」３９４−４０２（第２版、１９９１年）に記載されるようなゲル浸透クロマトグラフィーなどのサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できるが、これらに限定されるものではない。
【０１９０】
別の例として、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、この混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性よりも高いインビトロ活性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。
【０１９１】
個々の混合物のインビトロ活性は、当業者に公知の種々の方法によって測定してよい。好ましくはインビトロ活性は、カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイシズ・コーポレーションより市販されるサイトセンサー（登録商標）マイクロフィジオメーターを使用して測定される。このマイクロフィジオメーターは、トランスウェル中の培養細胞に加えられる薬剤に対する応答の細胞外酸性化速度の微小な変化を監視する。この応答は、研究対象の分子の活性に比例する。
【０１９２】
さらに別の例として、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した場合に、キモトリプシンに対する分解に対する増加した抵抗性を有することが好ましい。当業者には公知であるが、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。
【０１９３】
さらに別の例として、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と同じ数平均分子量を有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験者間変動よりも小さな被験者間変動を有する。当業者には公知であるが、混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の数平均分子量および多分散混合物の数平均分子量は、限定するものではないがサイズ排除クロマトグラフィーなどの種々の方法で測定できる。被験者間変動は、当業者に公知の種々の方法によって測定することができる。被験者間変動は好ましくは以下のように計算される。用量反応曲線の下の面積（ＡＵＣ）（すなわち、用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験者の場合で求める。各被験者のＡＵＣを合計し、その合計を被験者数で割ることによって、すべての被験者の平均のＡＵＣを求める。次に、被験者のＡＵＣと平均ＡＵＣとの間の差の絶対値を各被験者について求める。得られた差の絶対値を次に合計することで、被験者間変動を表す値が得られる。値が小さいほど被験者間変動が小さいことを表しており、値が大きいほど被験者間変動が大きいことを表している。
【０１９４】
本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の２つ以上を有することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の３つ以上を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同じ分子量を有し構造式Ａを有する成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、前述の改善された性質の４つすべてを有する。
【０１９５】
本発明の実施形態による抱合体混合物を含む医薬組成物も提供される。上述の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、投与するために、公知の技術に従って医薬担体中に処方してよい。たとえば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）の「調剤の科学および実践」（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）（第９版、１９９５年）を参照されたい。本発明の実施形態による医薬組成物の製造では、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物は、通常、特に医薬的に許容可能な担体と混合される。当然ながらこの担体は、医薬組成物中の他のすべての成分と適合性であり患者に対して有害ではないという意味で許容される必要がある。この担体は、固体または液体のいずれであってもよいし、またはその両方であってもよく、約０．０１または０．５重量％〜約９５重量％または９９重量％の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を含みうる錠剤などの単位投与剤形として、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体とともに調剤されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、成分を混合し、任意選択的に１種類以上の副成分を混合することを含むが、これらには限定されない任意の公知の製薬技術で調製することができる。
【０１９６】
本発明の実施形態による医薬組成物は、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入（たとえば、エアロゾルによって）、口腔内（たとえば、舌下）、経膣、非経口投与（たとえば、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹膜内、脳内、動脈内、または静脈内）、局所投与（すなわち、皮膚と、気道面を含む粘膜面との両方）、および経皮投与に好適なものを含むが、所与の場合において最も好適な経路は、治療される状態の性質および重篤度、ならびに使用される個々の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の性質に依存する。
【０１９７】
経口投与に好適な医薬組成物は、カプセル剤、カシェ剤、ロゼンジ、または錠剤などの分離した単位で存在してよく、それぞれが、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の所定量を、粉末または顆粒として、水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油または油中水型エマルジョンとして含有する。このような製剤は、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と、好適な担体（前述の１種類以上の副成分を含んでもよい）とを関連させるステップを含む、あらゆる好適な製剤方法によって調製してよい。一般に、本発明の実施形態による医薬組成物は、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合を、液体または微粉砕固体担体あるいはその両方と均質かつ密接に混合し、続いて必要であれば、得られた混合物を成型することによって調製される。たとえば、錠剤は、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物と任意に１種類以上の副成分とを含有する粉末または顆粒を圧縮または成型することによって調製してよい。圧縮錠剤は、バインダー、滑沢剤、不活性希釈剤、および／または、界面活性／分散剤と任意に混合した粉末または顆粒などの易流動性形態の本発明の混合物を好適な装置で圧縮することによって調製してよい。成型錠剤は、不活性液体バインダーで湿らせた粉末化合物を好適な装置で成型することによって作製してよい。
【０１９８】
口腔内（舌下）投与に好適な医薬組成物としては、通常はショ糖とアラビアゴムまたはトラガカントゴムである、風味が付いた基剤中に成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を含むトローチ剤、ならびにゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアラビアゴムなどである不活性基剤中に成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を含む香錠が挙げられる。
【０１９９】
非経口投与に好適な本発明の実施形態による医薬組成物は、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の滅菌された水性および非水性注射液を含み、これらの製剤は、意図する受容者の血液に対して等張性であることが好ましい。これらの製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および意図する受容者の血液に対して組成物を等張性にする溶質を含んでよい。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含んでよい。本発明の組成物は、密封アンプルおよびビンなどの単位投与または複数回投与用の容器中で提供してもよく、滅菌液体担体、たとえば、食塩水または注射用水を使用直前に加えるだけでよい凍結乾燥条件で保存してもよい。即時注射液および懸濁液は、前述の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。たとえば、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を含む安定な滅菌注射組成物を密封容器中に単位投与剤形で提供することができる。凍結乾燥した形態の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物が提供され、これは好適な医薬的に許容可能な担体を使用して再構成して、被験者への注射に好適な液体組成物を得ることができる。通常、単位投与剤形は、約１０ｍｇ〜約１０ｇの成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体混合物を含む。成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物が実質的に水不溶性である場合、生理学的に許容される乳化剤の十分な量を使用して、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を水性担体中に乳化させてもよい。このような有用な乳化剤の１つはホスファチジルコリンである。
【０２００】
直腸投与に好適な医薬組成物は、好ましくは単位投与坐剤として提供される。これらは、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物を、カカオバターなどの１種類以上の従来の固体担体と混合し、得られた混合物を次に成型することによって調製することができる。
【０２０１】
皮膚への局所適用に好適な医薬組成物は好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、パスタ剤、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油剤の形態をとる。使用してもよい担体としては、石油ゼリー、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮吸収促進剤、およびこれらの２種類以上の組み合わせが挙げられる。
【０２０２】
経皮投与に好適な医薬組成物は、受容者の表皮と長時間密接な接触を維持するのに適合した分離型パッチとして提供されてもよい。経皮投与に好適な組成物は、イオン導入によって送達されてもよく（たとえばファーマシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３（６）：３１８（１９８６）を参照されたい）、通常は成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の水溶液に任意に緩衝剤を加えた形態をとる。好適な製剤は、クエン酸またはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１〜０．２Ｍの有効成分を含有する。
【０２０３】
有効量のこのような医薬組成物を投与することによる、成長ホルモン欠乏症の治療をそのような治療を必要とする被験者に対して実施する方法も提供される。成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の有効量、本発明の範囲内でのその使用は、混合物ごと、患者ごとによってある程度変動し、患者の年齢や症状、および送達経路などの要因に依存する。このような投与量は、当業者に公知の日常的な薬理学的手順に従って求めることができる。一般的な発案では、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量が治療に有効となり、すべての重量は、成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体の混合物の重量を基準にして計算される。より多量における毒性の問題から、最大約１０ｍｇ／ｋｇまでのより少ない量に静脈投与では制限されることがあり、このすべての重量は有効成分の重量を基準にして計算される。経口投与では約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量が使用されうる。通常、筋肉注射では約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの投与量が使用されうる。投与頻度は、通常は１日当たり１、２、または３回となるか、あるいは症状に応じて調節される。あるいは、本発明の薬剤−オリゴマー抱合体は、持続点滴によって投与してもよい。治療期間は、治療される成長ホルモン欠乏症の種類に依存する。
【０２０４】
動物の成長速度を加速させる方法は、前述の種々の実施形態による抱合体混合物の有効量を動物に投与することを含む。当然ながら、成長ホルモンの有効量は、投与される動物に依存し、当業者によって決定することができる。
【０２０５】
本発明の実施形態による抱合体混合物を合成する方法も提供される。以下の合成経路の実施形態は実質的に単分散の混合物の合成に関するものであるが、同様の合成経路を、本発明の実施形態による他の成長ホルモン剤−オリゴマー抱合体混合物の合成に使用することができる。
【０２０６】
ポリエチレングリコール部分を含むポリマーの実質的に単分散の混合物は、反応１：
【化１２】

に示されるようにして得られる。
【０２０７】
Ｒ¹はＨまたは親油性部分である。好ましくは、Ｒ¹は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、芳香族部分、脂肪酸部分、脂肪酸エステル部分、コレステリル、またはアダマンチルである。より好ましくは、Ｒ¹は、Ｈ、低級アルキル、または芳香族部分である。最も好ましくはＲ¹は、Ｈ、メチル、またはベンジルである。
【０２０８】
式Ｉにおいて、ｎは１〜２５である。好ましくはｎは１〜６である。
【０２０９】
Ｘ⁺は陽イオンである。好ましくは、Ｘ⁺は、ＰＥＧ上のヒドロキシル部分をイオン化可能な強塩基などの化合物中の陽イオンである。陽イオンの例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、およびタリウムイオンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２１０】
Ｒ²はＨまたは親油性部分である。好ましくは、Ｒ²は、線状または分岐状のアルキル、アリールアルキル、芳香族部分、脂肪酸部分、または脂肪酸エステル部分である。より好ましくは、Ｒ²は、低級アルキル、ベンジル、１〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸部分、または１〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸エステル部分である。最も好ましくはＲ²は、メチル、１〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸部分、または１〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸のエチルエステル部分である。
【０２１１】
式ＩＩにおいて、ｍは１〜２５である。好ましくはｍは１〜６である。
【０２１２】
Ｍｓはメシレート部分（すなわち、ＣＨ₃Ｓ（Ｏ₂）−）である。
【０２１３】
反応１に示されるように、式Ｉの構造を有する化合物の混合物を、式ＩＩの構造を有する化合物の反応物と反応させると、ポリエチレングリコール部分を含み式ＩＩＩの構造を有するポリマーの混合物が得られる。式Ｉの構造を有する化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式Ｉの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量であり、より好ましくは、式Ｉの化合物の混合物は単分散混合物である。式ＩＩの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＩＩの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量であり、より好ましくは、式ＩＩの化合物の混合物は単分散混合物である。式ＩＩＩの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量である。より好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物は単分散混合物である。
【０２１４】
反応１は、好ましくは約０℃〜約４０℃の間で実施され、より好ましくは約１５℃〜約３５℃の間で実施され、最も好ましくは室温（約２５℃）で実施される。
【０２１５】
反応１は、当業者に公知の種々の時間で実施してよい。反応１は、好ましくは約０．２５時間、０．５時間、または０．７５時間から、約２時間、４時間、８時間の間の時間実施される。
【０２１６】
好ましくは、反応１は、限定するものではないが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン、Ｎ−メチルピロリジノン、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、１，２−ジクロロベンゼン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、またはそれら混合物などの非プロトン性溶媒中で実施される。より好ましくは、溶媒はＤＭＦ、ＤＭＡ、またはトルエンである。
【０２１７】
式Ｉの化合物の式ＩＩの化合物に対するモル比は好ましくは約１：１を超える。より好ましくは、このモル比は少なくとも約２：１である。化合物Ｉを過剰にすることによって、式ＩＩの化合物の実質的にすべてを反応させることができ、これによって後述する式ＩＩＩの化合物の回収が容易となる。
【０２１８】
式Ｉの化合物は反応２：
【化１３】

に示すように調製されることが好ましい。
【０２１９】
Ｒ¹およびＸ⁺は前述の通りであり、式ＩＶの化合物の混合物は実質的に単分散であり、好ましくは、式ＩＶの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量であり、より好ましくは式ＩＶの化合物の混合物は単分散混合物である。
【０２２０】
式ＩＶの化合物のＰＥＧ部分上のヒドロキシル部分をイオン化することができる種々の混合物は当業者に公知である。ヒドロキシル部分をイオン化することができる化合物は、好ましくは強塩基である。より好ましくは、ヒドロキシル部分をイオン化することができる化合物は、水素化ナトリウム、水素化カリウム、ナトリウムｔ−ブトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、ブチルリチウム（ＢｕＬｉ）、およびリチウムジイソプロピルアミンからなる群より選択される。ヒドロキシル部分をイオン化することができる化合物は、より好ましくは水素化ナトリウムである。
【０２２１】
式ＩＶの化合物のＰＥＧ部分上のヒドロキシル部分をイオン化することができる化合物の、式ＩＶの化合物に対するモル比は、好ましくは少なくとも約１：１であり、より好ましくは少なくとも約２：１である。ヒドロキシル部分をイオン化することができる化合物を過剰にすることによって、式ＩＶの化合物の実質的にすべてが反応して式Ｉの化合物が得られる。したがって、式ＩＶの化合物と式Ｉの化合物の両方が反応生成混合物に存在すると発生しうる分離の問題を回避することができる。
【０２２２】
反応２は、好ましくは約０℃〜約４０℃の間で実施され、より好ましくは約０℃〜約３５℃の間で実施され、最も好ましくは約０℃〜室温（約２５℃）の間で実施される。
【０２２３】
反応２は、当業者に公知の種々の時間で実施してよい。反応２は、好ましくは約０．２５時間、０．５時間、または０．７５時間から、約２時間、４時間、８時間の間の時間実施される。
【０２２４】
好ましくは、反応２は、限定するものではないが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、１，２−ジクロロベンゼン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、またはそれら混合物などの非プロトン性溶媒中で実施される。より好ましくは、溶媒はＤＭＦ、ジクロロメタン、またはトルエンである。
【０２２５】
式ＩＩの化合物は、好ましくは反応３：
【化１４】

に示すように調製される。
【０２２６】
Ｒ²およびＭｓは前述の通りであり、式Ｖの化合物は、式Ｖの化合物の実質的に単分散の混合物として存在し、好ましくは、式Ｖの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量であり、より好ましくは、式Ｖの混合物は単分散混合物である。
【０２２７】
Ｑはハロゲン化物であり、好ましくは塩化物またはフッ化物である。
【０２２８】
ＣＨ₃Ｓ（Ｏ₂）Ｑはハロゲン化メタンスルホニルである。このハロゲン化メタンスルホニルは、好ましくは塩化メタンスルホニルまたはフッ化メタンスルホニルである。より好ましくは、ハロゲン化メタンスルホニルは塩化メタンスルホニルである。
【０２２９】
ハロゲン化メタンスルホニルの式Ｖの化合物に対するモル比は、好ましくは約１：１を超え、より好ましくは少なくとも約２：１である。ハロゲン化メタンスルホニルを過剰にすることによって、式Ｖの化合物の実質的にすべてが反応して式ＩＩの化合物が得られる。したがって、式Ｖの化合物と式ＩＩの化合物の両方が反応生成混合物に存在すると発生しうる分離の問題を回避することができる。
【０２３０】
反応３は、好ましくは約−１０℃〜約４０℃の間で実施され、より好ましくは約０℃〜約３５℃の間で実施され、最も好ましくは約０℃〜室温（約２５℃）の間で実施される。
【０２３１】
反応３は、当業者に公知の種々の時間で実施してよい。反応３は、好ましくは約０．２５時間、０．５時間、または０．７５時間から、約２時間、４時間、８時間の間の時間実施される。
【０２３２】
好ましくは、反応３は、モノメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノイソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、モノ−ｎ−ブチルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、モノシクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、またはそれらの混合物などが挙げられるが、これらには限定されない脂肪族アミンの存在下で実施される。より好ましくは、脂肪族アミンは、トリエチルアミンなどの第３級アミンである。
【０２３３】
当業者には公知であるが、種々の式Ｖの化合物の実質的に単分散の混合物は市販されている。たとえば、Ｒ²がＨまたはメチルである場合、式Ｖの化合物はそれぞれＰＥＧまたはｍＰＥＧの化合物であり、これらはウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、スイスのフルカ（Ｆｌｕｋａ）、および／またはオレゴン州ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）のＴＣＩアメリカ（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ）より市販されている。
【０２３４】
Ｒ²が、たとえば、高級アルキル、脂肪酸、脂肪酸エステル、コレステリル、またはアダマンチルなどの親油性部分である場合、式Ｖの化合物は当業者に公知の種々の方法によって得ることができる。式Ｖの化合物は以下の方法：
【化１５】

【化１６】

で得られることが好ましい。
【０２３５】
Ｒ²は親油性部分であり、好ましくは高級アルキル、脂肪酸エステル、コレステリル、またはアダマンチルであり、より好ましくは脂肪酸の低級アルキルエステルであり、最も好ましくは１個〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸のエチルエステルである。
【０２３６】
Ｒ³はＨ、ベンジル、トリチル、テトラヒドロピラン、または当業者に公知の別のアルコール保護基である。
【０２３７】
Ｘ₂ ⁺は、Ｘ⁺に関して前述した陽イオンである。
【０２３８】
ｍの値は前述の通りである。
【０２３９】
反応４に関して、式ＶＩの化合物の混合物は、式ＶＩＩの化合物の混合物と、反応１に関して前述した反応条件と同様の反応条件で反応させる。式ＶＩの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＶＩの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量である。より好ましくは、式ＶＩの化合物の混合物は、単分散混合物である。式ＶＩＩの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＶＩＩの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量である。より好ましくは、式ＶＩＩの化合物の混合物は、単分散混合物である。
【０２４０】
反応５に関して、当業者に公知の種々の方法によって、式ＶＩＩＩの化合物を加水分解させて、Ｒ³部分をアルコールに転化させることができる。Ｒ³がベンジルまたはトリチルである場合、当業者に公知のパラジウム−チャコール触媒の存在下でＨ₂を使用して加水分解を行うことが好ましい。当然ながら、Ｒ³がＨである場合には反応５は必要ない。
【０２４１】
式ＶＩの化合物は市販されている場合があるし、あるいは反応３に関して前述したようにして得られる場合もある。式ＶＩＩの化合物は、反応２に関して前述したようにして得ることができる。
【０２４２】
ＰＥＧ部分を含み上記式ＩＩＩの構造を有するポリマーの実質的に単分散の混合物は、ＰＥＧ鎖を延長するために、ＰＥＧ部分を含む他の実質的に単分散のポリマーとさらに反応させることができる。たとえば、以下の図式：
【化１７】

【化１８】

を使用してよい。
【０２４３】
Ｍｓ、ｍ、およびｎは、反応１に関して前述した通りであり、ｐはｎおよびｍと同様であり、Ｘ₂ ⁺は、反応１に関して前述したＸ⁺と同様である。Ｑは、反応３に関して前述した通りである。Ｒ²は反応１に関して前述した通りであり、好ましくは低級アルキルである。Ｒ¹はＨである。反応６は、反応３に関して前述した方法と同様の方法で実施することが好ましい。反応７は、反応１に関して前述した方法と同様の方法で実施することが好ましい。好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量であり、より好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物は単分散混合物である。式Ｘの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式Ｘの化合物の混合物中の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の化合物が同じ分子量であり、より好ましくは式Ｘの化合物の混合物は単分散混合物である。
【０２４４】
本発明の実施形態による方法は、これより説明する図１に示す図式に示されている。実質的に単分散のポリエチレングリコール含有オリゴマーの合成は、実質的に単分散ポリエチレングリコールのモノベンジルエーテル（１）を調製することによって開始する。コーダー（Ｃｏｕｄｅｒｔ）ら（シンセティック・コミュニケーションズ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），１６（１）：１９−２６（１９８６））に記載されるようにして、過剰の市販の実質的に単分散のポリエチレングリコールを、水酸化ナトリウム水溶液の存在下で塩化ベンジルと反応させる。次に、ＮａＨを加えることによって１のナトリウム塩を調製し、このナトリウム塩を、ヒドロキシアルカン酸のエステルから合成したメシレート（２）と反応させる。メシレートが置換した生成物（３）を、接触水素化によって脱ベンジル化して、アルコール（４）を得た。塩化メタンスルホニルを加えることによってこのアルコールのメシレート（５）を調製して、実質的に単分散ポリエチレングリコール誘導体のモノメチルエーテルのナトリウム塩との反応の求電子試薬として使用し、それによってオリゴマーのポリエチレングリコール部分を所望の長さまで延長し、延長したエステル（６）を得ることができる。このエステルを塩基水溶液中で酸（７）に加水分解し、カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応によって、活性化エステル（８）に転化させることができる。図１に示されるオリゴマーはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して活性化されるが、本発明のオリゴマーの活性化には種々の他の試薬を使用してよく、たとえば、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル、クロロギ酸フェニル、３，４−フェニルジクロロホルメート、および３，４−フェニルジクロロホルメートなどの活性化クロロギ酸フェニル、トレシル化、ならびにアセタール形成を使用できるが、これらに限定されるものではない。
【０２４５】
さらに図１を参照すると、ｑは１〜２４である。好ましくは、ｑは１〜１８であり、より好ましくはｑは４〜１６である。Ｒ⁴は、加水分解によってカルボン酸を得ることができる部分である。Ｒ⁴は、好ましくは低級アルキルであり、より好ましくはエチルである。変量ｎおよびｍは、反応１に関して前述した通りである。
【０２４６】
本明細書に記載の手順に使用されるすべての出発物質は、市販されているか、市販の出発物質を使用して当分野で公知の方法によって調製できるかのいずれかである。
【０２４７】
これより、以下の実施例を参照しながら本発明を説明する。これらの実施例は、本発明の態様を例示することが目的であって、請求項によって規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【０２４８】
［実施例］
［実施例１〜１０］
他に明記しない限り、実施例１〜１０の反応は、マグネチックスターラーを使用して窒素雰囲気下で実施した。「ワークアップ」は、有機溶媒で抽出し、有機相を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ₄）させ、蒸発（ロータリーエバポレーター）させることを意味する。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル６０°Ｆ−２５４があらかじめコーティングされたメルク（Ｍｅｒｃｋ）ガラス板を使用して行い、スポットはヨウ素蒸気で可視化した。すべての質量分析は、コロラド州のコロラド州立大学マクロモレキュラー・リソーシズ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣＯ）で測定し、単位ｍ／ｚ（相対強度）で報告している。元素分析および融点は、テネシー州ノックスビルのガルブレイス・ラボラトリーズ（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）が実施した。実施例１〜１０は、図２に示される図式を参照している。
【実施例１】
【０２４９】
［８−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６−ジオキサオクタン（９）］
非多分散のトリエチレングリコールモノメチルエーテル分子（４．００ｍｌ、４．１９ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（４．２６ｍｌ、３．０９ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）とを乾燥ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解した溶液を、氷浴で冷却し、窒素雰囲気下に置いた。塩化メタンスルホニル（２．３７ｍｌ、３．５１ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解した溶液を、添加漏斗から滴下した。塩化物の滴下終了から１０分後、反応混合物を氷浴から取り出し、室温まで上昇させた。この混合物をさらに１時間混合すると、ＴＬＣ（溶離液としてＣＨＣｌ₃に１５％ＭｅＯＨ）により、トリエチレングリコールモノメチルエーテルが残留していないことが示された。
【０２５０】
この反応混合物にさらに７５ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃、水、およびブラインで連続して洗浄した。得られた有機物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮すると、透明油として化合物９の非多分散混合物（５．３１ｇ、８６％）を得た。
【実施例２】
【０２５１】
［エチレングリコールモノメチルエーテル（１０）（ｍ＝４、５、６）］
非多分散化合物１１（３５．７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２５．７ｍｌ）に溶解し撹拌した溶液に、Ｎ₂雰囲気下で鉱油中の６０％ＮａＨ分散液を一度に加え、混合物を室温で１時間撹拌した。この塩１２に、非多分散メシレート９（２３．３６）を乾燥ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶解した溶液を一度に加え、その混合物を室温で３．５時間撹拌した。反応の進行はＴＬＣ（１２％のＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃）で監視した。得られた反応混合物を同量の１ＮのＨＣｌで希釈し、酢酸エチル（２０ｍｌ×２回）で抽出し、廃棄した。水溶液の抽出およびワークアップによって、非多分散ポリマー１０（収率８２〜８４％）を得た。
【実施例３】
【０２５２】
［３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサドコサノール（１０）（ｍ＝４）］
油；Ｒｆ０．４６（メタノール：クロロホルム＝３：２２）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ₁₅Ｈ₃₂Ｏ₈としての計算値３４０．２１（Ｍ⁺＋１）、測定値３４１．２。
【実施例４】
【０２５３】
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサペンタコサノール（１０）（ｍ＝５）］
油；Ｒｆ０．４３（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ₁₇Ｈ₃₆Ｏ₉としての計算値３８４．２４（Ｍ⁺＋１）、測定値３８５．３。
【実施例５】
【０２５４】
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサオクタコサノール（１０）（ｍ＝６）］
油；Ｒｆ０．４２（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ₁₉Ｈ₄₀Ｃ₁₀としての計算値４２８．２６（Ｍ⁺＋１）、測定値４２９．３。
【実施例６】
【０２５５】
［２０−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサエイコサン（１４）］
９に関して説明した方法と同様にして、アルコール１３（ｍ＝４）と塩化メタンスルホニルから定量的収量の非多分散化合物１４を油として得た；Ｒｆ０．４（酢酸エチル：アセトニトリル＝１：５）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ₁₇Ｈ₃₇Ｏ₁₀としての計算値４３３．２１（Ｍ⁺＋１）、測定値４３３．４６９。
【実施例７】
【０２５６】
［エチレングリコールモノメチルエーテル（１５）（ｍ＝３、４、５）］
化合物１０に関して前述した方法を使用して、ジオールから非多分散化合物１５を調製した。
【実施例８】
【０２５７】
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサヘンエイコサノール（１５）（ｍ＝３）］
油；Ｒｆ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ₂₁Ｈ₄₄Ｏ₁₁としての計算値４７２．２９（Ｍ⁺＋１）、測定値４７２．２９。
【実施例９】
【０２５８】
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンデカオキサテトラトリコサノール（１５）（ｍ＝４）］
油；Ｒｆ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ₂₃Ｈ₄₈Ｏ₁₂としての計算値５１６．３１（Ｍ⁺＋１）、測定値５１６．３１。
【実施例１０】
【０２５９】
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドコサオキサヘプタトリコサノール（１５）（ｍ＝５）］
油；Ｒｆ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ₂₅Ｈ₅₂Ｏ₁₃としての計算値５６０．６７（Ｍ⁺＋１）、測定値５６０．６７。
【０２６０】
実施例１１〜１８は、図３に示される図式を参照している。
【実施例１１】
【０２６１】
［ヘキサエチレングリコールモノベンジルエーテル（１６）］
３．９９ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＮａＯＨを４ｍｌの水に溶解して調製した水酸化ナトリウム水溶液を、非多分散ヘキサエチレングリコール（２８．１７５ｇ、２５ｍｌ、１００ｍｍｏｌ）にゆっくりと加えた。塩化ベンジル（３．９ｇ、３０．８ｍｍｏｌ、３．５４ｍｌ）を加え、その反応混合物を１００℃まで加熱し１８時間撹拌した。続いて反応混合物を冷却し、ブライン（２５０ｍｌ）で希釈して、塩化メチレン（２００ｍｌ×２回）で抽出した。その有機層を合わせたものを、ブラインで１回洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮して、暗褐色油を得た。この未精製の生成混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、グラジエント溶離：酢酸エチルから９／１の酢酸エチル／メタノール）で精製して、８．０９９ｇ（７０％）の非多分散１６を黄色油として得た。
【実施例１２】
【０２６２】
［６−メチルスルホニルオキシヘキサノエート（１７）］
非多分散６−ヒドロキシヘキサノエート（５０．７６ｍｌ、５０．４１ｇ、２２７ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（７５ｍｌ）に溶解した溶液を氷浴で冷却し、窒素雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（３４．４３ｍｌ、２４．９９ｇ、２４７ｍｍｏｌ）を加えた。塩化メタンスルホニル（１９．１５ｍｌ、２８．３ｇ、２４７ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（７５ｍｌ）に溶解した溶液を添加漏斗から滴下した。その混合物を３時間半撹拌し、氷欲を融解させながらゆっくりと室温まで上昇させた。混合物をシリカゲルでろ過し、そのろ液を、水、飽和ＮａＨＣＯ₃、水、およびブラインで続けて洗浄した。得られた有機物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮すると、淡黄色油が得られた。この未精製の生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１／１のヘキサン／酢酸エチル）を使用して最終的に精製して、非多分散生成物（４６．１３ｇ、８５％）を無色透明油として得た。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ２３９（Ｍ＋Ｈ）、１９３（Ｍ−Ｃ₂Ｈ₅Ｏ）。
【実施例１３】
【０２６３】
［６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（１８）］
水素化ナトリウム（３．２２５ｇ、または６０％の油分散液、８０．６ｍｍｏｌ）を８０ｍｌの無水トルエン中に懸濁させ、窒素雰囲気下に置き、氷浴で冷却した。非多分散アルコール１６（２７．３ｇ、７３．３ｍｍｏｌ）を８０ｍｌの乾燥トルエンに溶解した溶液を、上記ＮａＨ懸濁液に加えた。この混合物を０℃で３０分間撹拌し、室温まで戻し、さらに５時間撹拌し、この間に混合物は透明褐色溶液となった。非多分散メシレート１７（１９．２１ｇ、８０．６ｍｍｏｌ）を８０ｍｌの乾燥トルエンに溶解した溶液を、上記ＮａＨ／アルコール混合物に加え、混合した溶液を室温で３日間撹拌した。その反応混合物に５０ｍｌのメタノールを加えて反応を停止させ、塩基性アンモニアでろ過した。そのろ液を減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、グラジエント溶離：３／１の酢酸エチル／ヘキサンから酢酸エチル）で精製して、非多分散生成物を淡黄色油として得た（１６．５２ｇ、４４％）。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ５１５（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１４】
【０２６４】
［６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（１９）］
非多分散ベンジルエーテル１８（１．０３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのエタノールに溶解した。この溶液に、２７０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃを加え、その混合物を水素雰囲気下に置き、４時間撹拌すると、出発物質が完全に消失したことがＴＬＣによって示された。この反応混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）５４５でろ過して触媒を除去し、そのろ液を減圧濃縮して、非多分散の表題化合物を透明油として得た（０．６７ｇ、７９％）。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ４２５（Ｍ＋Ｈ）、４４７（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例１５】
【０２６５】
［６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メチルスルホニルエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（２０）］
非多分散アルコール１９（０．８３５ｇ、１．９７ｍｍｏｌ）を３．５ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解して、窒素雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（０．３０１ｍｌ、０．２１９ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を氷浴で冷却した。２分間後、塩化メタンスルホニル（０．１６ｍｌ、０．２４８ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で１５分間撹拌した後、室温で２時間撹拌した。その反応混合物をシリカゲルでろ過して塩化トリエチルアンモニウムを除去し、そのろ液を水、飽和ＮａＨＣＯ₃、水、およびブラインで連続して洗浄した。得られた有機物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮した。その残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、９／１の酢酸エチル／メタノール）で精製して、非多分散化合物２０を透明油として得た（０．８１９ｇ、８３％）。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ５０３（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例１６】
【０２６６】
［６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸エチルエステル（２１）］
ＮａＨ（８８ｍｇの６０％油分散液、２．２ｍｍｏｌ）を、Ｎ₂下で無水トルエン（３ｍｌ）中に懸濁させ、０℃に冷却した。トルエンとともに共沸蒸留しておいた非多分散ジエチレングリコールモノメチルエーテル（０．２６ｍｌ、０．２６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物を室温まで温め、４時間撹拌すると、濁った灰色の懸濁液が透明な黄色になり、続いて褐色になった。メシレート２０（０．５０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を２．５ｍｌの乾燥トルエンに溶解した溶液を加えた。室温で終夜撹拌した後、２ｍｌのメタノールを加えて反応を停止させ、その結果得られた溶液をシリカゲルでろ過した。そのろ液を減圧濃縮すると、そのＦＡＢ ＭＳはｍ／ｅ４９９（Ｍ＋Ｈ）、５２１（Ｍ＋Ｎａ）となった。分取クロマトグラフィー（シリカゲル、１９／３のクロロホルム／メタノール）でさらに精製して、非多分散生成物を透明黄色油として得た（０．３０２ｇ、５７％）。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ５２７（Ｍ＋Ｈ）、５４９（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例１７】
【０２６７】
［６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸（２２）］
非多分散エステル２１（０．２５ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、０．７１ｍｌの１ＮのＮａＯＨ中で１８時間撹拌した。１８時間後、その混合物減圧濃縮してアルコールを除去し、その残留物を別の水１０ｍｌに溶解した。得られた水溶液に２ＮのＨＣｌを加えてｐＨ２まで酸性化し、その生成物をジクロロメタン（３０ｍｌ×２回）で抽出した。それらの有機物を合わせたものを、次にブライン（２５ｍｌ×２）で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、減圧濃縮して、非多分散表題化合物を黄色油として得た（０．１４７ｇ、６２％）。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ４９９（Ｍ＋Ｈ）、５２１（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例１８】
【０２６８】
［６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（２３）］
非多分散の酸２２（０．２０９ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を４ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、この溶液を、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（５７．８ｍｇ、０．５０２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）（９８．０ｍｇ、０．５０２ｍｍｏｌ）が既に入れられた乾燥フラスコにＮ₂雰囲気下で移した。得られた溶液を室温で終夜撹拌し、シリカゲルでろ過して、過剰の試薬とＥＤＣから生成した尿素とを除去した。そのろ液を減圧濃縮して、非多分散生成物を暗黄色油として得た（０．２３５ｇ、９４％）。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ５９６（Ｍ＋Ｈ）、６１８（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２６９】
実施例１９〜２４は、図４に示される図式を参照している。
【実施例１９】
【０２７０】
［トリエチレングリコールモノメチルエーテルのメシレート（２４）］
氷浴で０℃に冷却したＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）の溶液に、非多分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル（２５ｇ、０．１５ｍｏｌ）を加えた。次に、トリエチルアミン（２９．５ｍｌ、０．２２ｍｏｌ）を加え、その溶液を０℃で１５分間撹拌した後、塩化メタンスルホニル（１３．８ｍｌ、０．１８ｍｏｌ、２０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解）をさらに滴下した。その反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、室温まで温めた後、２時間撹拌した。得られた未精製の反応混合物をセライトでろ過し（約２００ｍｌのＣＨ₂Ｃ₂で洗浄）、続いて、Ｈ₂Ｏ（３００ｍｌ）、５％のＮａＨＣＯ₃（３００ｍｌ）、Ｈ₂Ｏ（３００ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（３００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させて、乾燥するまで蒸発させた。得られた油を、次に減圧ラインに約２時間つないで確実に乾燥させて、非多分散の表題化合物を黄色油として得た（２９．１５ｇ、収率８０％）。
【実施例２０】
【０２７１】
［ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル（２５）］
非多分散テトラエチレングリコール（５１．５ｇ、０．２７ｍｏｌ）をＴＨＦ（１Ｌ）に溶解した溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１４．８ｇ、０．１３ｍｏｌ、少量ずつ３０分間かけて）加えた。その反応混合物を１時間撹拌した後、２４（２９．１５ｇ、０．１２ｍｏｌ）をＴＨＦ（９０ｍｌ）に溶解した溶液を滴下し、その反応混合物を終夜撹拌した。得られた未精製の反応混合物をセライトでろ過し（約２００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄）、乾燥するまで蒸発させた。得られた油を次にＨＣｌ（２５０ｍｌ、１Ｎ）に溶解し、酢酸エチル（２５０ｍｌ）で洗浄して、過剰の２４を除去した。残留する２４を除去するためにさらに酢酸エチル（１２５ｍｌ）で洗浄する必要が生じる場合もある。得られた水相は、水相から大部分の２５が除去されるまでＣＨ₂Ｃｌ₂（１２５ｍｌずつ）で繰り返し洗浄した。最初の抽出物は２４、２５、および２つ結合した副生成物を含んでおり、ＨＣｌ（１２５ｍｌ、１Ｎ）で抽出し戻すべきである。得られた有機層を合わせて、乾燥するまで蒸発させた。得られた油を次にＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）に溶解し、２５が除去されるまで繰り返しＨ₂Ｏ（５０ｍｌずつ）で洗浄した。これらの水性分画を集めると、全体積は５００ｍｌとなり、溶液が濁り始めるまでＮａＣｌを加え、続いてＣＨ₂Ｃｌ₂（５００ｍｌ×２回）で洗浄した。得られた有機相を集めて、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾燥させて、非多分散の表題化合物を油として得た（１６．９ｇ、収率４１％）。高純度にするためには１回以上精製ステップを繰り返すことが望ましい場合もある。
【実施例２１】
【０２７２】
［８−ブロモオクタノエート（8-Bromooctoanate）（２６）］
８−ブロモオクタン酸（５．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解した溶液に、Ｈ₂ＳＯ₄（０．３６ｍｌ、７．５ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を３時間撹拌しながら加熱還流した。得られた未精製反応混合物を室温まで冷却し、Ｈ₂Ｏ（１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ×２回）、Ｈ₂Ｏ（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発させて、透明油を得た（５．５ｇ、収率９８％）。
【実施例２２】
【０２７３】
［ＭＰＥＧ７−Ｃ８エステル（２７）の合成］
非多分散化合物２５（３．０ｇ、８．８ｍｍｏｌ）をエーテル（９０ｍｌ）に溶解した溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１．２ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を１時間撹拌した。続いて、非多分散化合物２６（２．４ｇ、９．６ｍｍｏｌ）をエーテル（１０ｍｌ）に溶解した溶液を滴下し、その反応混合物を終夜撹拌した。得られた未精製の反応混合物をセライトでろ過し（約２００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄）、乾燥するまで蒸発させた。得られた油を酢酸エチルに溶解し、Ｈ₂Ｏ（２００ｍｌ×２回）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチルから酢酸エチル／メタノール＝１０：１）を実施して、非多分散の表題化合物を透明油として得た（０．８４３ｇ、収率１９％）。
【実施例２３】
【０２７４】
［ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸（２８）］
非多分散化合物２７の油（０．７０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）に、１ＮのＮａＯＨ（２．０ｍｌ）を加え、その反応混合物を４時間撹拌した。その未精製反応混合物を濃縮し、酸性化（ｐＨ約２）し、ＮａＣｌで飽和させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ×２回）で洗浄した。得られた有機層を集め、飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾燥させて、非多分散表題化合物を透明油として得た（０．３５ｇ、収率５３％）。
【実施例２４】
【０２７５】
［ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸の活性化（２９）］
非多分散ｍＰＥＧ７−Ｃ８−酸２８（０．３１ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を３ｍｌの無水塩化メチレンに溶解し、次に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０７９ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ−ＨＣｌ（１３５．６ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレンに溶解した溶液を加えた。反応混合物を数時間撹拌した後、１ＮのＨＣｌ、水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。未精製材料をカラムクロマトグラフィーで精製し、濃縮して、非多分散表題化合物が透明油として得られ、これを減圧乾燥した。
実施例２５〜２９は、図５の図式を参照している。
【実施例２５】
【０２７６】
［１０−ヒドロキシデカノエート（３０）］
非多分散の１０−ヒドロキシデカン酸（５．０ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）をエタノール（１００ｍｌ）に溶解した溶液に、Ｈ₂ＳＯ₄（０．４３ｍｌ、８．８ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を撹拌しながら３時間加熱還流した。得られた未精製反応混合物を室温まで冷却し、Ｈ₂Ｏ（１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ×２）、Ｈ₂Ｏ（１００ｍｌ）、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、蒸発乾燥させて、非多分散表題化合物を透明油として得た（６．９ｇ、収率９８％）。
【実施例２６】
【０２７７】
［１０−ヒドロキシデカノエートのメシレート（３１）］
ＣＨ₂Ｃｌ₂（２７ｍｌ）の溶液に、非多分散１０−ヒドロキシデカノエート３０（５．６ｇ、２６ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で０℃に冷却した。次に、トリエチルアミン（５ｍｌ、３７ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を０℃で１５分間撹拌した。続いて、塩化メタンスルホニル（２．７ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（３ｍｌ）に溶解した溶液を加え、その反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、氷浴を取り外し、反応混合物を室温でさらに２時間撹拌した。その未精製反応混合物を、セライトでろ過し（８０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄）、そのろ液を、Ｈ₂Ｏ（１００ｍｌ）、５％ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ×２回）、Ｈ₂Ｏ（１００ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾燥させて、非多分散表題化合物を黄色油として得た（７．４２ｇ、収率９７％）。
【実施例２７】
【０２７８】
［ＭＰＥＧ₇−Ｃ₁₀エステル（３２）］
非多分散のヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル２５（２．５ｇ、７．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）に溶解した溶液に、水素化ナトリウム（０．１９４ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を１時間撹拌した。続いて、非多分散１０−ヒドロキシデカノエートのメシレート３１（２．４ｇ、８．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解した溶液を滴下し、その反応混合物を終夜撹拌した。その未精製反応混合物をセライトでろ過し（約２００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄）、蒸発乾燥させた。得られた油を酢酸エチルに溶解し、Ｈ₂Ｏ（２００ｍｌ×２）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾燥させ、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／メタノール＝１０：１）を実施し、さらにクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）を実施して、非多分散の表題化合物を透明油として得た（０．５７０ｇ、収率１５％）。
【実施例２８】
【０２７９】
［ＭＰＥＧ₇−Ｃ₁₀酸（３３）］
非多分散ｍＰＥＧ₇−Ｃ₁₀エステル３２の油（０．５７０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）に１ＮのＮａＯＨ（１．６ｍｌ）を加え、その反応混合物を終夜撹拌した。その未精製反応混合物を濃縮し、酸性化し（ｐＨ約２）、ＮａＣｌで飽和させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ×２回）で洗浄した。得られた有機層を合わせて、飽和ＮａＣｌ（５０ｍｌ×２回）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾燥させて、非多分散の表題化合物を透明油として得た（０．３４０ｇ、収率６２％）。
【実施例２９】
【０２８０】
［ＭＰＥＧ₇−Ｃ₁₀酸の活性化（３４）］
実施例２４で前述した手順と同様の手順を使用して、非多分散の酸３３を活性化させた。
実施例３０および３１は、図６に示される図式を参照している。
【実施例３０】
【０２８１】
［Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー（３６）の合成］
非多分散の塩化ステアロイル３５（０．７ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を、ＰＥＧ６（５ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）とピリジン（０．９７ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）をベンゼンと混合した混合物にゆっくりと加えた。その反応混合物を数時間（約５時間）撹拌した。酢酸エチル／メタノールを展開溶媒として使用したＴＬＣによって反応を追跡した。続いて、反応混合物を水洗し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濃縮し、減圧乾燥した。精製した非多分散化合物３６をＦＡＢＭＳで分析した：ｍ／ｅ５４９／Ｍ⁺Ｈ。
【実施例３１】
【０２８２】
［Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化］
非多分散Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化は２段階で実施した。
１）非多分散ステアロイル−ＰＥＧ６（３６）（０．８ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解し、ホスゲン溶液（１０ｍｌ、トルエン中２０％）を加え、氷浴で冷却した。この反応混合物を０℃で１時間撹拌した後、室温で３時間撹拌した。続いて、ホスゲンとトルエンを留去し、残った非多分散ステアロイルＰＥＧ６クロロホルメート３７をＰ₂Ｏ₅で終夜乾燥させた。
【０２８３】
２）非多分散ステアロイルＰＥＧ６クロロホルメート３６（０．７８ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１２８ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレンに溶解した溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＮＨＳの）を塩化メチレンに溶解した溶液を加えた。その反応混合物を１６時間撹拌した後、水洗し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、濃縮し、減圧乾燥して、非多分散の活性化Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー３８を得た。
【０２８４】
実施例３２〜３７は、図７に示される図式を参照している。
【実施例３２】
【０２８５】
［テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル（３９）］
非多分散テトラエチレングリコールの油（１９．４ｇ、０．１０ｍｏｌ）に、ＮａＯＨ溶液（４．０ｍｌ中４．０ｇ）を加え、その反応溶液を１５分間撹拌した。続いて、塩化ベンジル（３．５４ｍｌ、３０．８ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を１００℃まで加熱し、終夜撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、飽和ＮａＣｌ（２５０ｍｌ）で希釈し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ×２）で洗浄した。それらの有機相を集め、飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）を実施して、非多分散の表題化合物を黄色油として得た（６．２１ｇ、収率７１％）。
【実施例３３】
【０２８６】
［テトラエチレングリコールモノベンジルエーテルのメシレート（４０）］
ＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍｌ）の溶液に、非多分散のテトラエチレングリコールモノベンジルエーテル３９（６．２１ｇ、２２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で０℃に冷却した。続いて、トリエチルアミン（３．２ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を０℃で１５分間撹拌した。次に、塩化メタンスルホニル（１．７ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（２ｍｌ）に溶解した溶液を加え、その反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、氷浴を除去し、反応混合物を室温でさらに２時間撹拌した。得られた未精製反応混合物をセライトでろ過し（８０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄）、そのろ液を、Ｈ₂Ｏ（１００ｍｌ）、５％ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ×２）、Ｈ₂Ｏ（１００ｍｌ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させた。それによって得られた黄色油について、シリカ含有活性炭のパッド（１０ｇ）上でクロマトグラフィーを実施して、非多分散の表題化合物を透明油として得た（７．１０ｇ、収率８９％）。
【実施例３４】
【０２８７】
［オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル（４１）］
水素化ナトリウム（０．４３ｇ、１８ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフラン（１４０ｍｌ）の溶液に、非多分散テトラエチレングリコール（３．５ｇ、１８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解した溶液を滴下し、その反応混合物を１時間撹拌した。次に、非多分散テトラエチレングリコールモノベンジルエーテルのメシレート４０（６．０ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に溶解した溶液を滴下し、その反応混合物を終夜撹拌した。得られた未精製反応混合物をセライトでろ過し（２５０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄）、そのろ液をＨ₂Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾燥させた。それによって得られた油について、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／メタノール＝１０：１）を実施し、さらにクロマトグラフィー（シリカ、クロロホルム／メタノール＝２５：１）を実施して非多分散の表題化合物を透明油として得た（２．６２ｇ、収率３４％）。
【実施例３５】
【０２８８】
［ステアレートＰＥＧ８−ベンジル（４３）の合成］
非多分散オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル４１（０．９９８ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）およびピリジン（１６３．９ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）の溶液を冷却して撹拌したものに、非多分散塩化ステアロイル４２（６２７．７ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）をベンゼンに溶解した溶液を加えた。その反応混合物を終夜（１８時間）撹拌した。翌日、反応混合物を水洗し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濃縮し、減圧乾燥した。次に、その未精製生成物について、１０％メタノール／９０％クロロホルムを使用するフラッシュシリカゲルカラムによるクロマトグラフィーを実施した。生成物を含有する分画を集め、濃縮し、減圧乾燥して、非多分散の表題化合物を得た。
【実施例３６】
【０２８９】
［ステアレートＰＥＧ８−ベンジルの加水分解］
非多分散ステアレートＰＥＧ８−ベンジル４３（０．８５４ｇ、１．１３８ｍｍｏｌ）のメタノール溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％）（活性炭上にパラジウムが１０重量％）を加えた。水素雰囲気下で反応混合物を終夜（１８時間）撹拌した。次に、その溶液をろ過し、濃縮し、１０％メタノール／９０％クロロホルムを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、Ｒ_f＝０．６の分画を回収し、濃縮し、乾燥させて、非多分散の酸４４を得た。
【実施例３７】
【０２９０】
［Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマーの活性化］
前述の実施例３１のステアレート−ＰＥＧ６の場合に記載したように、非多分散ステアレート−ＰＥＧ８オリゴマーの２段階活性化を実施して、非多分散活性化Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマー４５を得た。
【実施例３８】
【０２９１】
［活性化されたトリエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成］
以下の説明は、図８に示される図式を参照している。２０％のホスゲンを含有するトルエン溶液（１００ｍｌ、約１８．７ｇ、１８９ｍｍｏｌのホスゲン）をＮ₂雰囲気下で０℃まで冷却した。非多分散ｍＴＥＧ（トリエチレングリコールモノメチルエーテル、７．８ｇ、４７．５ｍｍｏｌ）を２５ｍｌの無水酢酸エチルに溶解し、さきほどの冷却したホスゲン溶液に加えた。この混合物を０℃で１時間撹拌した後、室温まで温め、さらに２時間半撹拌した。減圧留去により残留するホスゲン、酢酸エチル、およびトルエンを除去すると、非多分散ｍＴＥＧクロロホルメート４６が透明油状残留物として残った。
【０２９２】
この非多分散残留物４６を５０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、これにＴＥＡ（トリエチルアミン、６．６２ｍｌ、４７．５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、５．８ｇ、５０．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を乾燥雰囲気下、室温で２０時間撹拌すると、大量の白色沈殿が現れた。混合物をろ過して沈殿物を除去し、減圧濃縮した。得られた油４７をジクロロメタンに溶解し、冷脱イオン水で２回洗浄し、１ＮのＨＣｌで２回洗浄し、さらにブラインで１回洗浄した。得られた有機物をＭｇＳＯ₄で乾燥し、ろ過し、濃縮して、非多分散の表題化合物を透明淡黄色油として得た。必要であれば、ＮＨＳエステルは、溶離液としてＥｔＯＡｃを使用するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製してもよい。
【実施例３９】
【０２９３】
［活性化されたパルミテート−ＴＥＧオリゴマーの合成］
以下の説明は、図９に示される図式を参照している。非多分散無水パルミチン酸（５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌した。この撹拌を続ける溶液に、３ｍｏｌ過剰のピリジンを加えた後、非多分散トリエチレングリコール（１．４ｍｌ）を加えた。この反応混合物を１時間撹拌した（反応の進行はＴＬＣ；酢酸エチル−クロロホルム＝３：７で監視した）。反応終了後、ＴＨＦを除去し、生成物を１０％のＨ₂ＳＯ₄酸と混合し、酢酸エチル（３０ｍｌ×３）で抽出した。集めた抽出物を、水、ブラインで続けて洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発させて、非多分散生成物４８を得た。Ｎ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（約１０ｍｌ）に溶解した溶液を、非多分散生成物４８（１ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解した溶液に撹拌しながら加えた。水素化ナトリウム（３ｍｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと加えた。その反応混合物を数時間（たとえば、５時間）撹拌した。ジエチルエーテルを加えて、活性化オリゴマーを沈殿させた。この方法を３回繰り返して、最後に生成物を乾燥させた。
【実施例４０】
【０２９４】
［活性化されたヘキサエチレングリコールモノメチルオリゴマーを有するヒト成長ホルモン−オリゴマー抱合体の合成］
以下の説明は、図１０に示される図式を参照している。非多分散活性化ヘキサエチレングリコールモノメチルエーテルを、前述の実施例３８の非多分散トリエチレングリコールの場合と同様にして調製した。２０％ホスゲンのトルエン溶液（３５ｍｌ、６．６６ｇ、６７．４ｍｍｏｌのホスゲン）を、Ｎ₂雰囲気下、氷／塩水浴で冷却した。非多分散ヘキサエチレングリコール５０（１．８５ｍｌ、２．０ｇ、６．７４ｍｍｏｌ）を５ｍｌの無水ＥｔＯＡｃに溶解し、これをシリンジでホスゲン溶液に加えた。その反応混合物を氷浴中で１時間撹拌した後、氷浴から取り出して、室温でさらに２．５時間撹拌した。減圧蒸留によってホスゲン、ＥｔＯＡｃ、およびトルエンを除去すると、非多分散化合物５１が透明油状残留物として残った。
【０２９５】
非多分散残留物５１を２０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、乾燥不活性雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（０．９４ｍｌ、０．６８ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を加え、次にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、０．８２ｇ、７．１ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を室温で１８時間撹拌した。その混合物をシリカゲルでろ過して白色沈殿物を除去し、減圧濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解し、冷水で２回、１ＮのＨＣｌで２回、そしてブラインで１回洗浄した。その有機物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。最後にフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ）で精製して、ＵＶ活性非多分散ＮＨＳエステル５２を得た。
【０２９６】
マサチューセッツ州ランドルフ（Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のセロノ（Ｓｅｒｏｎｏ）より商品名Ｓａｉｚｅｎ（商標）で入手可能なヒト成長ホルモン（ソマトロピン（ｒＤＮＡ起源）、注射用）をＤＭＳＯに溶解し、ｈＧＨ濃度が０．５８ｍｍｏｌとなるようにした。ＴＥＡ（２７８当量）を加え、その溶液を約１０分間撹拌した。２当量、５当量、または３０当量の非多分散活性化ヘキサエチレングリコール５２を、活性化オリゴマーを乾燥ＴＨＦに溶解した０．２Ｍ溶液から加えた。反応混合物を、室温で４５分間〜１時間撹拌した。各反応混合物の少量の試料に、６００μｌの０．１％ＴＦＡ水溶液を加えて反応を停止させた。２ポリマー当量および５ポリマー当量の反応混合物と、未結合ｈＧＨとのＨＰＬＣの比較を図１４に示している。３０ポリマー当量反応のＨＰＬＣ分析は図１５に示している。
【０２９７】
質量分析の抱合体の試料は、逆相Ｃ₁₈カラムと水／アセトニトリルグラジエントを使用した分析用ＨＰＬＣで精製した。２当量反応混合物のピーク全体を回収し、濃縮し、ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して分析した。この材料の質量スペクトルから、モノ結合、ジ結合、トリ結合、およびテトラ結合ｈＧＨと一部残存する未反応ｈＧＨ（図１６）の存在が明らかとなった。５当量の反応混合物は、図１７に示される極性に従っておおまかに精製した。濃縮分画のＭＡＬＤＩ質量スペクトル（図１８、図１９、および図２０）から、滞留時間とともにタンパク質の結合量が増加することが分かった。図２１の分画Ｅのエレクトロスプレー質量スペクトルから、ヘキサ結合ｈＧＨの存在が確認された。３０ポリマー当量反応混合物のピーク全体を回収し、濃縮した。図２２のエレクトロスプレー質量分析から、デカ結合またはより高次のコンジュゲートされた材料が示された。
【０２９８】
実施例１８、２４、２９、３１、または３７の活性化オリゴマーにｈＧＨを結合させるためには同様の手順が使用される。
【実施例４１】
【０２９９】
［活性化されたパルミテート−ＴＥＧオリゴマーを有するヒト成長ホルモン−オリゴマー抱合体の合成］
実施例３９の活性化ポリマーを使用して、前述の実施例４１と同様の手順を実施した。結合の進行は、２０μｌの結合反応混合物をビンに採取し、１００μｌの０．１％ＴＦＡ−水−ＩＰＡ（１：１）で希釈してＨＰＬＣによりチェックし、その結果は図２３に示される。２時間後、０．１％のＴＦＡ−水を加えて反応を停止させた。結合生成物は分取ＨＰＬＣで精製した。
【実施例４２】
【０３００】
［活性化されたＴＥＧオリゴマーを有するヒト成長ホルモン−オリゴマー抱合体の合成］
マサチューセッツ州ランドルフのセロノより商品名Ｓａｉｚｅｎ（商標）で入手可能なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（ソマトロピン（ｒＤＮＡ起源）、注射用）１当量をＤＭＳＯ（１ｍｇ／１２５μｍ）に溶解し、室温で２〜４分間撹拌した。２当量のＴＥＡを加えた後、ＴＨＦに溶解した実施例３９の活性化オリゴマー２当量を加えた。２時間後、０．１％ＴＦＡ−水を加えて反応を停止させた。結合生成物は、図２４に示すように分取ＨＰＬＣで精製した。
【０３０１】
５当量のＴＥＡおよび５当量の実施例３９の活性化オリゴマーを使用して同様の手順を使用した。結合生成物は、図２５に示すようにＣ１８カラムを使用した分取ＨＰＬＣで精製した。移動相および溶離時間は以下の通りである。
【表１】

回収した分画は凍結乾燥して、白色の粉末にした。化合物の質量分析は図２６および２７に示されている。
【０３０２】
９当量のＴＥＡおよび９当量の実施例３９の活性化オリゴマーを使用して同様の手順を使用した。結合生成物は、図２８に示すようにＣ１８カラムを使用した分取ＨＰＬＣで精製した。
【実施例４３】
【０３０３】
［ヒト成長ホルモン−オリゴマー抱合体混合物の分散係数の決定］
ヒト成長ホルモン−オリゴマー抱合体の混合物の分散係数は以下のように決定される。例えば実施例４０で前述したようにして、ヒト成長ホルモン−オリゴマー抱合体の混合物を提供する。混合物の第１の試料は、ＨＰＬＣで精製して、試料中の種々のヒト成長ホルモン−オリゴマー抱合体を分離し、単離する。単離された各分画が、抱合体の純粋な単分散混合物を含み、「ｎ」が採取した分画数に等しいと過程する。混合物は、モノ抱合体、ジ抱合体、トリ抱合体、テトラ抱合体、ペンタ抱合体、ヘキサ抱合体、ヘプタ抱合体、オクタ抱合体、および／またはノナ抱合体などの１種類以上の抱合体を含みうる。混合物の単離された各分画は質量分析によって分析されて、その分画の質量が求められ、それによって単離された各分画が結合の程度で分類され、試料中の各抱合体の変量「Ｍ」の値が求められる。
【０３０４】
混合物の第２の試料はＨＰＬＣで分析されて、ＨＰＬＣトレースが得られる。モル吸光率が結合によって変化しないと仮定すると、混合物中の個々の抱合体の重量％は、ＨＰＬＣトレースの全ピークの下の全面積に対するパーセンテージとしての、個々の抱合体に対応するＨＰＬＣトレース下のピーク面積として与えられる。試料を回収し、凍結乾燥して、乾燥状態の試料のｇ重量が求められる。試料のｇ重量に、試料中の各成分の重量％を掛けると、試料中の各抱合体のｇ重量が求められる。特定の抱合体（ｉ番目の抱合体）について変量「Ｎ_i」は、試料中の特定の抱合体のｇ重量を特定の抱合体の分子量で割り、それによって得られた商にアボガドロ数（６．０２２０５×１０²³ｍｏｌ^-1）を掛けると（Ｍ_iは前述のように求められる）、試料中の特定の抱合体の分子数Ｎ_iが求められる。続いて、分散係数は、ｎ、各抱合体で求めたＭ_i、および各抱合体で求めたＮ_iを使用して計算される。
【実施例４４】
【０３０５】
以下のように分析を行った。
細胞培養：すでに説明したように、完全長のヒトＧＨＲを発現している安定クローンを２９３細胞で作製し（ヒト腎臓胚細胞株）、２９３ＧＨＲと命名した。
【０３０６】
転写アッセイ：これらは最少ＴＫプロモーターとルシフェラーゼに融合したＳｔａｔ５−結合要素（ＬＨＲＥ）を有するレポーターが一過性にトランスフェクションされた２９３ＧＨＲ細胞で実施した。β−ガラクトシダーゼ発現ベクターをトランスフェクション対照として共トランスフェクションし、ルシフェラーゼ値をβ−ガラクトシダーゼ活性について補正した。トランスフェクション後１６時間目に細胞を無血清培地に移し、ＧＨまたはアゴニストで６時間処理した。ルシフェラーゼ活性は、反復実験間の比較を可能にするための特異的実験内でＧＨにより刺激された最大活性の％として報告される。ＧＨにより刺激された最大活性はＧＨにより刺激された重複誘導、即ち非刺激状態の細胞の補正ルシフェラーゼ値で割ったＧＨ刺激細胞内の補正ルシフェラーゼ値である。アッセイの結果は図２９および３０に示され、ゲノトロピンはヒト成長ホルモン（標準物質、本発明の一部ではない）であり、ＧＨ−００２は２当量のｍＴＥＧ抱合体、ＧＨ−００３は５当量のｍＴＥＧ抱合体、ＧＨ−００４は５当量のｍＴＥＧ抱合体、Ｐｒｏｔ ｈＧＨはヒト成長ホルモン（標準物質、本発明の一部ではない）、およびｈＧＨ−ＴＥＧは９当量のｍＴＥＧ抱合体である。
【０３０７】
本明細書では、代表的な好ましい本発明の実施形態を開示してきており、特定の用語が使用されているが、これらは一般的および説明的な意味でのみ使用されており、請求項によって示される本発明の範囲を限定することを目的としたものではない。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１】本発明の実施形態によるポリエチレングリコール部分と脂肪酸部分とを含む活性化ポリマーの混合物を合成するための一般的な図式を示している。
【図２】本発明の実施形態によるｍＰＥＧの混合物を合成するための図式を示している。
【図３】本発明の実施形態による活性化されたｍＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマーの混合物を合成するための図式を示している。
【図４】本発明の実施形態による活性化されたｍＰＥＧ７−オクチルオリゴマーの混合物を合成するための図式を示している。
【図５】本発明の実施形態による活性化されたＰＥＧ−デシルオリゴマーの混合物を合成するための図式を示している。
【図６】本発明の実施形態による活性化されたステアレート−ＰＥＧ６オリゴマーの混合物を合成するための図式を示している。
【図７】本発明の実施形態による活性化されたステアレート−ＰＥＧ８オリゴマーの混合物を合成するための図式を示している。
【図８】本発明の実施形態による活性化されたＰＥＧ３オリゴマーの混合物を合成するために図式を示している。
【図９】本発明の実施形態による活性化されたパルミテート−ＰＥＧ３オリゴマーの混合物を合成するために図式を示している。
【図１０】本発明の実施形態により活性化されたＰＥＧ６オリゴマーの混合物を合成し、ヒト成長ホルモンをその活性化されたＰＥＧ６オリゴマーと結合させるための図式を示している。
【図１１】本発明の実施形態による種々のプロピレングリコールモノマーを合成するための図式を示している。
【図１２】本発明の実施形態による種々のプロピレングリコールポリマーを合成するための図式を示している。
【図１３】本発明の実施形態による種々のプロピレングリコールポリマーを合成するための図式を示している。
【図１４】２当量の活性化されたＭＰＥＧ６オリゴマーおよび５当量の活性化されたＭＰＥＧ６オリゴマーを使用した図１０に示す結合反応のＨＰＬＣトレース（ＨＰＬＣグラジエント：３０分間で、５０％から９０％のアセトニトリル）である。
【図１５】３０当量の活性化されたＭＰＥＧ６オリゴマーを使用した図１０に示す結合反応のＨＰＬＣトレース（２０分間で、ＨＰＬＣグラジエント：０％から９５％のアセトニトリル）である。
【図１６】２当量の活性化されたＭＰＥＧ６オリゴマーを使用した図１０に示す結合反応のＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図１７】５当量の活性化されたＭＰＥＧ６オリゴマーを使用した図１０に示す結合反応の生成物の部分精製を示すＨＰＬＣトレース（３０分間で、ＨＰＬＣグラジエント：５０％から７０％のアセトニトリル）である。
【図１８】図１７に示す部分精製における分画ＢのＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図１９】図１７に示す部分精製における分画ＣのＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図２０】図１７に示す部分精製における分画ＤおよびＥのＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図２１】図１７に示す部分精製における分画Ｅのエレクトロスプレースペクトルである。
【図２２】３０当量の活性化されたＭＰＥＧ６オリゴマーを使用した図１０に示す結合反応の反応混合物のエレクトロスプレースペクトルである。
【図２３】ヒト成長ホルモンと図９の活性化されたオリゴマーの結合反応のＨＰＬＣトレースである。
【図２４】１当量のヒト成長ホルモンと２当量の図９の活性化されたオリゴマーとを使用した結合反応のＨＰＬＣトレースである。
【図２５】１当量のヒト成長ホルモンと５当量の図８の活性化されたオリゴマーとを使用した結合反応のＨＰＬＣトレースである。
【図２６】図２５の結合のＨＰＬＣトレースのピークの左半分に対応する分画のＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図２７】図２５の結合のＨＰＬＣトレースのピークの右半分に対応する分画のＭＡＬＤＩスペクトルである。
【図２８】１当量のヒト成長ホルモンと９当量の図８の活性化されたオリゴマーとを使用した結合反応のＨＰＬＣトレースである。
【図２９】本発明の実施形態による成長ホルモン抱合体混合物のルシフェラーゼアッセイによって測定した活性と、比較の目的でのみ提供され本発明の一部を構成するものではないヒト成長ホルモン標準物質の活性との比較を示す棒グラフを示している。
【図３０】本発明の実施形態による成長ホルモン抱合体混合物のルシフェラーゼアッセイによって測定した活性と、比較の目的でのみ提供され本発明の一部を構成するものではないヒト成長ホルモン標準物質の活性との比較を示す棒グラフを示している。

Claims (67)

1. ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーに結合している成長ホルモン剤をそれぞれが含む抱合体の混合物であって、該混合物が約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する混合物。
2. 前記分子量分布の標準偏差が約１４ダルトン未満である請求項１に記載の混合物。
3. 前記分子量分布の標準偏差が約１１ダルトン未満である請求項１に記載の混合物。
4. 前記ポリアルキレングリコール部分が、少なくとも２個、３個、または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する請求項１に記載の混合物。
5. 前記ポリアルキレングリコール部分が、少なくとも５個または６個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する請求項１に記載の混合物。
6. 前記ポリアルキレングリコール部分が、少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する請求項１に記載の混合物。
7. 前記ポリアルキレングリコール部分がポリプロピレングリコール部分である請求項６に記載の混合物。
8. 前記ポリプロピレングリコールが均一である請求項７に記載の混合物。
9. 前記成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンである請求項１に記載の混合物。
10. 前記オリゴマーが、前記ヒト成長ホルモンのアミノ基に共有結合している請求項９に記載の混合物。
11. 前記アミノ基が、Ｐｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、およびＬｙｓ¹⁷²からなる群より選択される前記ヒト成長ホルモンのアミノ酸残基に存在する請求項１０に記載の混合物。
12. 前記抱合体が複数のオリゴマーを含む請求項９に記載の混合物。
13. 前記ポリアルキレングリコール部分がポリプロピレングリコール部分である請求項１に記載の混合物。
14. 前記ポリプロピレングリコール部分が均一である請求項１３に記載の混合物。
15. 前記オリゴマーが均一なポリプロピレングリコール部分からなり、前記抱合体のそれぞれが両親媒的に平衡の状態にあるため、各抱合体は水溶性であり、生体膜を貫通することができる請求項１に記載の混合物。
16. 前記成長ホルモン剤が前記オリゴマーと共有結合している請求項１に記載の混合物。
17. 前記成長ホルモン剤が加水分解可能な結合によって前記オリゴマーと共有結合している請求項１６に記載の混合物。
18. 前記成長ホルモン剤が前記ポリアルキレングリコール部分と共有結合している請求項１に記載の混合物。
19. 前記オリゴマーが、前記ポリアルキレングリコール部分と共有結合している親油性部分をさらに含む請求項１８に記載の混合物。
20. 前記オリゴマーが親油性部分をさらに含む請求項１に記載の混合物。
21. 前記成長ホルモン剤が前記親油性部分と共有結合している請求項２０に記載の混合物。
22. 前記抱合体が複数のオリゴマーを含む請求項１に記載の混合物。
23. 前記複数のオリゴマー中の各オリゴマーが同一である請求項２２に記載の混合物。
24. 前記オリゴマーが、加水分解可能でない結合によって前記成長ホルモン剤と共有結合している第１のポリアルキレングリコール部分と、加水分解可能な結合によって該第１のポリアルキレングリコール部分と共有結合している第２のポリアルキレングリコール部分とを含む請求項１に記載の混合物。
25. 前記オリゴマーが、前記第２のポリアルキレングリコール部分と共有結合している親油性部分をさらに含む請求項２４に記載の混合物。
26. 前記抱合体のそれぞれが両親媒的に平衡の状態にあるため、各抱合体は水溶性であり、生体膜を貫通することができる請求項１に記載の混合物。
27. 請求項１に記載の混合物と、
    医薬的に許容可能な担体と
    を含む医薬組成物。
28. 成長ホルモン欠乏症の治療が必要な被験者における、成長ホルモン欠乏症の治療方法であって、
    ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合している成長ホルモン剤をそれぞれ含む抱合体の混合物の有効量を、成長ホルモン欠乏症を治療すべき患者に投与するステップを含み、該混合物が、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する方法。
29. 動物の成長速度を加速する方法であって、
    ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合している成長ホルモン剤をそれぞれ含む抱合体の混合物の、該動物の成長速度を加速するのに十分な量を、該動物に投与するステップを含み、該混合物が、約２２ダルトン未満の標準偏差を有する分子量分布を有する方法。
30. 実質的に単分散の抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリアルキレングリコール部分を含むオリゴマーと結合している成長ホルモン剤を含む混合物。
31. 前記ポリアルキレングリコール部分が少なくとも２個、３個、または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する請求項３０に記載の混合物。
32. 前記ポリアルキレングリコール部分が少なくとも５個または６個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する請求項３０に記載の混合物。
33. 前記ポリアルキレングリコール部分が少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する請求項３０に記載の混合物。
34. 前記混合物中の前記抱合体の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％が同じ分子量を有する請求項３０に記載の混合物。
35. 前記混合物が単分散混合物である請求項３０に記載の混合物。
36. 前記混合物が実質的に純粋な単分散混合物である請求項３０に記載の混合物。
37. 前記混合物中の前記抱合体の少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％が同じ分子量を有し、同じ分子構造を有する請求項３０に記載の混合物。
38. 前記混合物が純粋な単分散混合物である請求項３０に記載の混合物。
39. 前記ポリアルキレングリコール部分が均一なポリプロピレン部分である請求項３０に記載の混合物。
40. 実質的に単分散の抱合体の混合物であって、各抱合体が、少なくとも７個のポリプロピレングリコールサブユニットを有する均一なポリプロピレングリコール部分を含むオリゴマーと共有結合しているヒト成長ホルモンを含む混合物。
41. 前記オリゴマーが、少なくとも７個のポリプロピレングリコールサブユニットを有する均一なポリプロピレングリコール部分からなり、各抱合体が両親媒的に平衡の状態にあるため、各抱合体は水溶性であり、生体膜を貫通することができる請求項４０に記載の混合物。
42. ポリアルキレングリコール部分を有するポリマーと結合している成長ホルモン剤をそれぞれが含む抱合体の混合物であって、該混合物が１０，０００を超える分散係数（ＤＣ）を有し、
    

    

    （式中、
    ｎは、試料中の種類の異なる分子の数であり、
    Ｎ_iは、該試料中のｉ番目の分子の数であり、
    Ｍ_iは、該ｉ番目の分子の質量である）である混合物。
43. 前記分散係数が１００，０００を超える請求項４２に記載の混合物。
44. 前記分散係数が５００，０００を超える請求項４２に記載の混合物。
45. 前記成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンである請求項４２に記載の混合物。
46. 前記ポリアルキレングリコール部分がポリプロピレングリコール部分である請求項４２に記載の混合物。
47. 前記ポリプロピレングリコール部分が均一である請求項４２に記載の混合物。
48. 前記ポリアルキレングリコール部分が少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する請求項４２に記載の混合物。
49. 抱合体の混合物であって、
    各抱合体が、オリゴマーと結合している成長ホルモン剤を含み、
    各抱合体が、同数のポリアルキレングリコールサブユニットを有する混合物。
50. 前記成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンである請求項４９に記載の混合物。
51. 前記ポリアルキレングリコール部分がポリプロピレングリコール部分である請求項４９に記載の混合物。
52. 前記ポリプロピレングリコール部分が均一である請求項５１に記載の混合物。
53. 前記ポリアルキレングリコール部分が少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する請求項４９に記載の混合物。
54. 抱合体の混合物であって、各抱合体が同じ分子量を有し、同じ式：
    

    

    （式中、
    Ｂは結合部分であり、
    Ｌはリンカー部分であり、
    Ｇ、Ｇ’、およびＧ’’は、独立して選択されるスペーサー部分であり、
    Ｒは親油性部分であってＲ’はポリアルキレングリコール部分であるか、あるいはＲ’は親油性部分であってＲはポリアルキレングリコール部分であり、
    Ｔは末端部分であり、
    ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｍ、およびｎは独立して０または１であり、但し、Ｒがポリアルキレングリコール部分である場合はｍが１であり、Ｒ’がポリアルキレングリコール部分である場合はｎが１であり、
    ｐは、１から、前記成長ホルモン剤上の求核性残基の数までの整数である）を有する混合物。
55. 前記ポリアルキレングリコール基がポリプロピレングリコール部分である請求項５４に記載の混合物。
56. 前記ポリプロピレングリコール基が均一である請求項５５に記載の混合物。
57. ｉ、ｊ、ｋ、およびｎは０であり、
    Ｒは均一なポリプロピレングリコールであり、
    前記抱合体のそれぞれが両親媒的に平衡の状態にあるため、各抱合体は水溶性であり、生体膜を貫通することができる請求項５４に記載の混合物。
58. Ｒが、少なくとも７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有するポリアルキレングリコール部分である請求項５４に記載の混合物。
59. 実質的に単分散の抱合体の混合物であって、各抱合体が、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合している成長ホルモン剤を含む抱合体を合成する方法であって、
    式Ｉ：
    Ｒ¹（ＣＯＣ₂Ｈ₄）_m−Ｏ^-Ｘ⁺ （Ｉ）
    （式中、Ｒ¹はＨまたは親油性部分であり、ｍは１〜２５であり、Ｘ⁺は陽イオンである）
    の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を、式ＩＩ：
    Ｒ²（ＯＣ₂Ｈ₄）_n−ＯＭｓ （ＩＩ）
    （式中、Ｒ²はＨまたは親油性部分であり、ｎは１〜２５である）
    の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物と、式ＩＩＩ：
    Ｒ²（ＯＣ₂Ｈ₄）_m+n−ＯＲ¹ （ＩＩＩ）
    の構造を有するポリマーを含む実質的に単分散の混合物を生成するのに十分な条件下で反応させるステップと、
    前記式ＩＩＩのポリマーを含む実質的に単分散の混合物を活性化させて、成長ホルモン剤と反応可能な活性化ポリマーの実質的に単分散の混合物を生成するステップと、
    ｍ＋ｎ個のサブユニットを有するポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーと結合している成長ホルモン剤をそれぞれが含む実質的に単分散の抱合体の混合物を生成するのに十分な条件下で、前記活性化されたポリマーの実質的に単分散の混合物を、成長ホルモン剤の実質的に単分散の混合物と、反応させるステップと
    を含む方法。
60. Ｒ²が脂肪酸部分または脂肪酸エステル部分である請求項５９に記載の方法。
61. 前記脂肪酸部分または前記脂肪酸エステル部分が、少なくとも５個の炭素原子の長さのアルキル部分を含む請求項６０に記載の方法。
62. Ｒ¹がメチル基である請求項５９に記載の方法。
63. 式ＩＩ：
    Ｒ²（ＯＣ₂Ｈ₄）_n−ＯＭｓ （ＩＩ）
    の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を生成するのに十分な条件下で、
    式Ｖ：
    Ｒ²（ＯＣ₂Ｈ₄）_n−ＯＨ （Ｖ）
    の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を、ハロゲン化メタンスルホニルと反応させるステップをさらに含む請求項５９に記載の方法。
64. 式ＶＩＩＩ：
    Ｒ³（ＯＣ₂Ｈ₄）_m−ＯＲ² （ＶＩＩＩ）
    の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を生成するのに十分な条件下で、
    式ＶＩ：
    Ｒ²−ＯＭｓ （ＶＩ）
    （式中、Ｒ²は親油性部分である）の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を、
    式ＶＩＩ：
    Ｒ³（ＯＣ₂Ｈ₄）_m−Ｏ^-Ｘ₂ ⁺ （ＶＩＩ）
    （式中、Ｒ³はベンジル、トリチル、またはＴＨＰであり、Ｘ₂ ⁺は陽イオンである）の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物と反応させるステップと、
    式Ｖ：
    Ｒ²（ＯＣ₂Ｈ₄）_m−ＯＨ （Ｖ）
    の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を生成するのに十分な条件下で、
    前記式ＶＩＩＩの構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を反応させるステップと
    をさらに含む請求項６３に記載の方法。
65. 式Ｉ：
    Ｒ¹（ＯＣ₂Ｈ₄）_n−Ｏ^-Ｘ⁺ （Ｉ）
    の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を生成するのに十分な条件下で、
    式ＩＶ：
    Ｒ¹（ＯＣ₂Ｈ₄）_n−ＯＨ （ＩＶ）
    の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物を反応させるステップをさらに含む請求項５９に記載の方法。
66. 前記実質的に単分散の混合物を活性化させるステップが、前記式ＩＩＩのポリマーの実質的に単分散の混合物を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、成長ホルモン剤と反応可能な活性化ポリマーを得ることを含む請求項５９に記載の方法。
67. 前記成長ホルモン剤がヒト成長ホルモンであり、前記活性化ポリマーの実質的に単分散の混合物を、ヒト成長ホルモンの実質的に単分散の混合物と反応させるステップが、
    前記活性化ポリマーの実質的に単分散の混合物を、Ｐｈｅ¹、Ｌｙｓ³⁸、Ｌｙｓ⁴¹、Ｌｙｓ⁷⁰、Ｌｙｓ¹¹⁵、Ｌｙｓ¹⁴⁰、Ｌｙｓ¹⁴⁵、Ｌｙｓ¹⁵⁸、Ｌｙｓ¹⁶⁸、Ｌｙｓ¹⁷²、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される前記ヒト成長ホルモンのアミノ酸残基のアミノ基と反応させて、ｍ＋ｎ個のサブユニットを有するポリエチレングリコール部分を含む１以上のオリゴマーと結合しているヒト成長ホルモンをそれぞれが含む実質的に単分散の抱合体の混合物を得ることを含む、請求項５９に記載の方法。

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