JP4272510B2 - ポリアルキレングリコールを含むカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物、その使用、およびその製造方法 - Google Patents

ポリアルキレングリコールを含むカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物、その使用、およびその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、薬剤−オリゴマー抱合体、および、より詳細には、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体に関する。
カルシトニンは、半減期の短い天然型ホルモンであり、（細胞表面上のカルシトニンに対するレセプターを介して）破骨細胞に直接的に作用すると考えられている。この作用は、破骨細胞による骨吸収を直接的に阻害することができ、これは低カルシウム血性および／または低リン酸血性血清作用をもたらすことができる。カルシトニンは、骨粗鬆症およびぺージェット病を含むがそれらに限定されない様々な骨疾患を治療する際に有用な可能性がある。
骨粗鬆症は、骨組織は正常に無機質化しているが、骨量が減少していて骨梁の構造的完全性が損なわれている骨の疾患である。皮質骨はますます多孔性に、そしてより薄くなる。これは、骨を弱くさせて骨折の可能性を高める。米合衆国では、閉経後女性の約２１％が骨粗鬆症（低骨密度）を有し、そして約１６％が骨折を経験している。８０歳を超える女性では、約４０％は股関節、脊椎、腕または骨盤の骨折を経験している。高齢の男性および女性の集団は増え続けているので、このため骨粗鬆症を有する人の数は増加し続けている。
カルシトニンを皮下注射として投与すると骨密度における有意な改善が生じることが証明されている。しかしながら、注射部位疼痛、潮紅および悪心を含む高い副作用発生率が報告されており、これらはこの薬剤の使用を制限する可能性がある。
骨のぺージェット病は、原因不明の代謝性骨疾患であり、通常は高齢者が罹患する。この疾患は骨の不規則な形成の増加を引き起こすが、それは身体内の古い骨を溶解させて新しい骨と取り替える役目を担っている骨細胞が制御不能となるからである。長期間にわたって変形した新しい骨は、より大きくかつ弱くなり、そして正常な骨より多数の血管を有する。正常な骨とは相違して、この構造は不規則であり、その結果として弱くなるので、これは軽傷を被った場合でさえ骨折し易くさせる。
その極めて軽度の形態では、この疾患は症状を示さない。より重度の症例では、疼痛が強度になることがある。この疾患の過酷な進行は骨の曲がりを引き起こし、頭蓋骨のサイズが大きくなり、脊椎は湾曲することがある。骨が大きくなるにつれて、骨はすぐ側の神経への圧力を引き起こし、筋衰弱を生じさせる可能性がある。重度の頭蓋骨拡大の症例では、この圧力は難聴、視力疾患、めまい、耳鳴を生じさせることがある。
カルシトニンは、ぺージェット病のような骨格リモデリング増加の疾患を治療することに有効な可能性がある。ぺージェット病を治療する際に、カルシトニンの連用は症状の長期的減少をもたらす。しかしながら、カルシトニン投与の副作用には、悪心、手の腫脹、蕁麻疹、および腸痙攣が含まれることがある。
様々な参考文献は、カルシトニンのようなポリペプチドとポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール含有ポリマーの多分散混合物とをコンジュゲートすることを提案している。例えば、Ｅｋｗｕｒｉｂｅへ付与された米国特許第５，３５９，０３０号は、カルシトニンのようなポリペプチドとポリエチレングリコール修飾糖脂質ポリマーの多分散混合物およびポリエチレングリコール修飾脂肪酸ポリマーの多分散混合物とをコンジュゲートすることを提案している。各組み合わせの結果として生じたポリマーの数平均分子量は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲内にあるのが好ましい。
Ｅｋｗｕｒｉｂｅに記載されたポリマー混合物と抱合体の多分散性は、おそらくポリマー合成において多分散ポリエチレングリコールを使用した結果であると思われる。ＰＥＧは、典型的には酸化エチレンの塩基触媒による開環重合によって生成される。この反応は、触媒として水酸化カリウムを用いて、エチレングリコールへ酸化エチレンを添加することによって開始される。このプロセスは、所定の分子量範囲内の数平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーの多分散混合物を生じさせる。例えば、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社によって販売されるＰＥＧ製品は、ＰＥＧ ４００（Ｍn ３８０〜４２０）；ＰＥＧ １，０００（Ｍn ９５０〜１，０５０）；ＰＥＧ １，５００（Ｍn １，４００〜１，６００）；およびＰＥＧ ２，０００（Ｍn １，９００〜２，２００）のような多分散混合物で提供されている。
望ましいのは、オリゴマーがポリエチレングリコールを含むカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の非多分散混合物を提供することである。
思いがけずに、本発明の実施形態によるポリエチレングリコールを含むカルシトニン−オリゴマー抱合体の混合物は、血清中カルシウム濃度を１０％、１５％または２０％以上さえ低下させることができることが発見された。さらに、本発明の実施形態によるポリエチレングリコールを含むカルシトニン−オリゴマー抱合体の混合物は、コンジュゲートされていない（non-conjugated）カルシトニンより腸消化のインビトロモデルを生き残ることに有効な可能性がある。さらにその上、本発明の実施形態によるポリエチレングリコールを含むカルシトニン−オリゴマー抱合体の混合物は、コンジュゲートされていないカルシトニンより高いバイオアベイラビリティを示す可能性がある。
本発明の実施形態によると、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を各々が含む抱合体の実質的に単分散の混合物が提供される。ポリエチレングリコール部分は、好ましくは少なくとも２個、３個、または４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、そして最も好ましくは、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーは、好ましくは親油性部分をさらに含む。カルシトニン薬剤は、好ましくはサケカルシトニンである。オリゴマーは、好ましくはサケカルシトニンのＬｙｓ11およびＬｙｓ18で結合されている。抱合体は、好ましくは抱合体が水溶性で生体膜に浸透できるように、両親媒性で平衡状態にある。
本発明の実施形態によると、各抱合体が、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分へカルボン酸部分に遠位で共有結合されたオクタン酸を含む第１オリゴマーのカルボン酸部分へサケカルシトニンのＬｙｓ11で共有結合され、そして少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分へカルボン酸部分の遠位で共有結合されたオクタン酸を含む第２オリゴマーのカルボン酸部分へサケカルシトニンのＬｙｓ18で共有結合されたサケカルシトニンを含む、抱合体の実質的に単分散の混合物が提供される。
本発明のさらにまた別の実施形態によると、各抱合体が、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を含む抱合体の実質的に単分散の混合物が提供され、そしてこの混合物は被験体における血清中カルシウム濃度を少なくとも５％低下させることができる。
本発明のさらに別の実施形態によると、各抱合体が、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を含む抱合体の実質的に単分散の混合物が提供され、そしてこの混合物はオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解への抵抗性に比較して、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有している。
本発明のさらにまた別の実施形態によると、各抱合体が、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を含む抱合体の実質的に単分散の混合物が提供され、そしてこの混合物はオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より高い生体有効性を有している。
本発明のさらになお別の実施形態によると、各抱合体が、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を含む抱合体の混合物が提供され、そしてこの混合物は約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有している。
本発明のさらになお別の実施形態によると、各抱合体が、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を含む抱合体の混合物が提供され、そしてこの混合物は下記の約１０，０００より大きい分散係数（ＤＣ）を有する。
Figure 0004272510
 式中：
ｎは、サンプル中の様々な分子の数であり、
Ｎiは、該サンプル中のｉ番目の分子の数であり、
Ｍiは、ｉ番目の分子の質量である。
本発明の他の実施形態によると、各抱合体がオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を含む、そして同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する抱合体の混合物が提供される。
本発明のさらに別の実施形態によると、各抱合体が同一の分子量および次の式を有する抱合体の混合物が提供される。
Figure 0004272510
 式中：
Ｂは、結合部分であり、
Ｌは連結基であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ”は独立して選択されたスペーサー基であり、
Ｒは親油性基そしてＲ’はポリアルキレングリコール基である、またはＲ’は親油性基そしてＲはポリアルキレンオキサイド基であり、
Ｔは末端基であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは独立して０または１であり、
ｐは、１からカルシトニン薬剤上の求核性残基数までの整数である。
本発明の抱合体混合物を含む医薬組成物ならびに有効量のそのような医薬組成物を投与することにより、そのような治療を必要とする被験体において骨粗鬆症を治療する方法もまた提供される。さらに、そのような抱合体混合物を合成する方法が提供される。
本発明の実施形態によるカルシトニン−オリゴマー抱合体混合物は、血清中カルシウム濃度を２０％以上低下させる可能性がある。さらにその上、そのような抱合体は、コンジュゲートされていないカルシトニンと比較して、腸酵素による分解の低下を提供する、および／またはバイオアベイラビリティの上昇を提供する可能性がある。
ここで、本明細書に記載した好ましい実施形態を参照して本発明を説明する。しかしながら、これらの実施形態は本発明を例示するためであり、請求の範囲によって規定された本発明の範囲を限定すると解釈すべきではないことが理解されなければならない。
本明細書で使用する用語「非多分散」は、Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号に記載された多分散混合物とは対照的な分散度を有する化合物の混合物を記載するために使用される。
本明細書で使用する用語「実質的に単分散」は、混合物中の化合物の少なくとも約９５％が同一の分子量を有する化合物の混合物を記載するために使用される。
本明細書で使用する用語「単分散」は、混合物中の化合物の約１００％が同一の分子量を有する化合物の混合物を記載するために使用される。
本明細書で使用する用語「実質的に純粋な単分散」は、混合物中の化合物の少なくとも約９５％が同一の分子量を有し、そして同一の分子構造を有する化合物の混合物を記載するために使用される。したがって、実質的に純粋な単分散混合物は実質的に単分散混合物であるが、実質的に単分散混合物は必ずしも実質的に純粋な単分散混合物ではない。
本明細書で使用する用語「純粋な単分散」は、混合物中の化合物の約１００％が同一の分子量を有し、そして同一の分子構造を有する化合物の混合物を説明するために使用される。したがって、純粋な単分散混合物は単分散混合物であるが、単分散混合物は必ずしも純粋な単分散混合物ではない。
本明細書で使用する用語「重量平均分子量」は、混合物中の所定の分子に対する重量フラクションに混合物中の各分子に対する分子の質量を掛けた積の合計と規定されている。「重量平均分子量」は、記号Ｍwによって表される。
本明細書で使用する用語「数平均分子量」は、混合物の総重量を混合物中の分子数で割ったものと規定されており、記号Ｍnによって表される。
本明細書で使用する用語「分散係数」（ＤＣ）は次の式によって規定される。
Figure 0004272510
 式中：
ｎは、サンプル中の様々な分子の数であり、
Ｎiは、サンプル中のｉ番目の分子の数であり、
Ｍiは、ｉ番目の分子の質量である。
本明細書で使用する用語「被験体内変動」は、被験体に同一量の所定の薬剤または医薬製剤を異なる時間に投与したときに同一被験体内で発生する活性における変動を意味する。
本明細書で使用する用語「被験体間変動」は、各被験体に同一量の所定の薬剤または医薬製剤を投与したときに２人または３人以上の被験体間の活性における変動を意味する。
本明細書で使用する用語「生体有効性」は、薬剤または薬剤抱合体がインビボで１以上の所望のレセプターと相互作用する能力を意味する。
本明細書で使用する用語「カルシトニン薬剤」は、カルシトニンの生物学的活性の全部または一部を有する薬剤を意味する。
本明細書で使用する用語「カルシトニン」は、天然、合成、または遺伝子工学由来により提供されたニワトリカルシトニン、ウナギカルシトニン、ヒトカルシトニン、ブタカルシトニン、ラットカルシトニンまたはサケカルシトニンを意味する。
本明細書で使用する用語「カルシトニン類似体」は、カルシトニンの活性の一部または全部を保持しながら１以上のアミノ酸が置換されているカルシトニンを意味する。類似体は、上付き文字としての置換の位置とその後に続くカルシトニンの説明を用いて置換アミノ酸を注記することによって記載される。例えば、「Ｐｒｏ2カルシトニン、ヒト」は、典型的にはヒトカルシトニン分子の第２位で見いだされるグリシンがプロリンと置換されていることを意味する。
カルシトニン類似体は、当業者には理解されるように、様々な手段によって入手できる。例えば、一定のアミノ酸は、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造との相互結合能力の感知できる消失を伴わずに、カルシトニン構造内の他のアミノ酸と置換することができる。カルシトニンの相互作用能力および性質がその生物学的機能能力を規定するので、アミノ酸配列において一定のアミノ酸配列置換を行うことができるが、それでもなお同様の特性を備えるポリペプチドが残る。
そのような置換を行う際には、アミノ酸のハイドロパシー指標を考慮に入れることができる。ポリペプチドに相互作用的生物学的機能を付与する際のアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性は、一般に当分野で理解されている。アミノ酸の相対疎水親水性の特性は結果として生じたポリペプチドの第２構造に寄与し、これが順にポリペプチドと、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原等のような他の分子との相互作用を規定することは容認されている。各アミノ酸には、その疎水性および荷電特性に基づいて、次のようにハイドロパシー指標が指定されている。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。当業者には理解されるように、一定のアミノ酸は類似のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、それでもまだ類似の生物学的活性を備えるポリペプチドを生じさせる、すなわちまだ生物学的機能が等価のポリペプチドを入手することができる。そのような変更を加える際に、そのハイドロパシー指標が相互の±２以内であるアミノ酸置換が好ましく、そのハイドロパシー指標が相互の±１以内であるアミノ酸置換が特に好ましく、そしてそのハイドロパシー指標が相互の±０．５以内であるアミノ酸置換がさらにいっそう特に好ましい。
さらにまた、当分野では同様のアミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的に行うことができることも理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所平均親水性がそのタンパク質の生物学的特性と相関することを提供している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、次の親水性値がアミノ酸残基に指定されている。アルギニン（＋３．０）；リシン（±３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。当業者には理解されるように、アミノ酸は類似の親水性値を有する他の置換と置換することができ、さらに生物学的に等価の、そして特に免疫学的に等価のポリペプチドを入手することができる。そのような変更では、その親水性値が相互の±２以内であるアミノ酸置換が好ましく、その親水性値が相互の±１以内であるアミノ酸置換が特に好ましく、そしてその親水性値が相互の±０．５以内であるアミノ酸置換がさらにいっそう特に好ましい。
上記で概要を説明したように、このためアミノ酸置換は一般的に、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等のようなアミノ酸側鎖置換基の相対類似性に基づく。様々な上記の特徴を考慮に入れた代表的置換（すなわち、ポリペプチドの生物学的活性を有意に変化させることなく置換することができるアミノ酸）は、当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。
本明細書で使用する用語「カルシトニンフラグメント」は、カルシトニンの活性の一部または全部を保持している、カルシトニン中で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを意味する。
本明細書で使用する用語「カルシトニンフラグメント類似体」は、カルシトニンの活性の一部または全部を保持しながらセグメント内の１以上のアミノ酸が置換されている、カルシトニン分子中で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを意味する。
本明細書で使用する用語「ＰＥＧ」は、直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールポリマーを意味しており、そしてポリエチレングリコールのモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）を含む。用語「ＰＥＧサブユニット」およびポリエチレングリコールサブユニットは、単一ポリエチレングリコールユニット、すなわち−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−を意味する。
本明細書で使用する用語「親油性」は、脂質中に溶解する能力、および／または生体膜に浸透する、生体膜と相互作用する、および／または生体膜を横断する能力を意味しており、そして用語「親油性部分」または「親油性」は、親油性である、および／または他の化学物質に付着したときにそのような化学物質の親油性を増加させる部分を意味する。親油性部分の例には、アルキル、脂肪酸、脂肪酸のエステル、コレステリル、アダマンチル等が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用する用語「低級アルキル」は、１個〜５個の炭素原子を有する置換または非置換アルキル部分を意味する。
本明細書で使用する用語「高級アルキル」は、６個以上の炭素原子を有する置換または非置換アルキル部分を意味する。
本発明の実施形態では、実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物が提供される。単分散混合物中の各カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体には、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤が含まれる。好ましくは、混合物中の抱合体の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％が同一の分子量を有する。より好ましくは、混合物は単分散混合物である。いっそうより好ましくは、混合物は実質的に純粋な単分散混合物である。さらにより好ましくは、混合物中の抱合体の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％が同一の分子量を有し、そして同一分子構造を有する。より好ましくは、混合物は純粋な単分散混合物である。
カルシトニン薬剤は、好ましくはカルシトニンである。より好ましくは、カルシトニン薬剤はサケカルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬剤は、例えばカルシトニン前駆体ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニンフラグメント、およびカルシトニンフラグメント類似体を含む当業者に知られている様々なカルシトニン薬剤から選択できることが理解されなければならない。カルシトニン前駆体ペプチドには、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−プロＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン開裂ペプチド）、ヒトが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニン類似体は、上記のようにカルシトニン中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。カルシトニンフラグメントには、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニンフラグメント類似体は、上記のようにカルシトニンフラグメント中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリエチレングリコール部分を含む様々なオリゴマーであってよい。好ましくは、オリゴマーのポリエチレングリコール部分は少なくとも２個、３個または４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリエチレングリコール部分は、少なくとも５個または６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、そして最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、追加の親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分を含むがそれらに限定されない１以上の部分を含んでいてよい。オリゴマー内の様々な部分は、加水分解可能な結合または加水分解可能でない結合のどちらかによって相互に共有結合されている。
オリゴマーは、糖類、ポリアルキレンオキサイド類、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマー類を含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性部分（すなわち、ポリエチレングリコール部分に追加される部分）をさらに含んでいてよい。ポリエチレングリコールがポリアルキレンオキサイドであるとき、追加の親水性部分はポリエチレングリコール部分であってよい。隣接ポリエチレングリコール部分は、それらがエーテル結合によって結合されている場合は同一部分と見なされるであろう。例えば、次の部分
Figure 0004272510
 は、６つのポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール部分である。この部分がオリゴマー内の唯一の親水性部分である場合は、オリゴマーは追加の親水性部分を含んでいないであろう。隣接ポリエチレングリコール部分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合されている場合は異なる部分と見なされるであろう。例えば、部分
Figure 0004272510
 は、４つのポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分および２つのポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性部分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーはポリエチレングリコール部分を含むが、追加の親水性部分を含んでいない。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上の親油性部分をさらに含んでいてよい。親油性部分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖アルキル部分である、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合は、それは１〜２８個の炭素原子を有する直鎖、飽和もしくは不飽和アルキル部分であるのが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合は、それは好ましくは２〜１８個の炭素原子を有する直鎖、飽和もしくは不飽和である天然脂肪酸部分である。より好ましくは、脂肪酸部分は３〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４個、５個または６個の炭素原子を有する。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上のスペーサー部分をさらに含んでいてよい。スペーサー部分は、例えば、親油性部分から親水性部分を分離するため、カルシトニン薬剤から親油性部分もしくは親水性部分を分離するため、第２親水性部分もしくは親油性部分から第１親水性部分もしくは親油性部分を分離するため、またはリンカー部分から親水性部分もしくは親油性部分を分離するために使用できる。スペーサー部分は、好ましくは糖、コレステロールおよびグリセリン部分からなる群から選択される。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、オリゴマーをカルシトニン薬剤と結合させるために使用される１以上のリンカー部分をさらに含んでいてよい。リンカー部分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸部分からなる群から選択される。
オリゴマーは、カルシトニン薬剤に結合されていないオリゴマーの１以上の端部で１以上の末端部分をさらに含んでいてよい。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキルもしくは低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルもしくはメトキシである。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であるが、当業者には理解されるように、末端部分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない様々な部分であってよいと理解されなければならない。
オリゴマーは、好ましくはカルシトニン薬剤に共有結合されている。一部の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能な結合（例、エステル結合もしくはカーボネート結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能な結合は、プロドラッグとして作用するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供することができる。例えば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、抱合体にはカルシトニン薬剤の主要作用機序を通して身体へ作用を及ぼす能力が欠如している）ある例では、活性薬を提供するために１以上のオリゴマーがそれらの各カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体から開裂されるように所定期間にわたってカルシトニン薬剤を投与することで、加水分解可能な結合は徐放性作用もしくは制御放出性作用を提供することができる。他の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能でない結合（例、カルバメート結合、アミド結合、もしくはエーテル結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能でない結合の使用は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が長時間、好ましくは少なくとも２時間にわたり血流中で循環させることが所望の場合には好ましいことがある。オリゴマーがカルシトニン薬剤に共有結合されている場合は、当業者には理解されるように、オリゴマーは、オリゴマーをカルシトニン薬剤と共有結合させるために使用される１以上の結合部分をさらに含んでいる。結合部分は、好ましくは共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第２級アミン部分からなる群から選択される。オリゴマー上の２つ以上の部分は、カルシトニン薬剤に共有結合されていてよい。
オリゴマーは好ましくはカルシトニン薬剤に共有結合されるが、オリゴマーは、カルシトニン薬剤に非共有結合的に結合して、非共有結合的にコンジュゲートされた（conjugated）カルシトニン薬剤−オリゴマー複合体を形成してもよいことが理解されなければならない。当業者には理解されるように、非共有結合的な結合には水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセル封入もしくはリポソーム封入が含まれるが、それらに限定されない。本発明の実施形態によると、オリゴマーは、当業者には理解されるように、選択された方法で非共有結合的なコンジュゲートのための能力を付与するため（例、水素結合能力を付与するため）に、適切に構築、修飾および／または適切に官能化されていてもよい。本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体を含むがそれらに限定されない様々な化合物を用いて誘導体化されていてもよい。結果として生じるオリゴマーは、薬剤分子、医薬生成物、および／または医薬賦形剤と非共有結合する（複合体を形成する）ことができる。結果として生じる複合体は、好ましくは平衡状態の（balanced）親油性と親水性とを有する。本発明のさらにまた別の実施形態によると、オリゴマーはアミドおよび／またはアルキルアミンを用いて誘導体化されていてもよい。適切な酸性条件下では、結果として生じるオリゴマーは、薬剤分子、医薬生成物、および／または医薬賦形剤とともに非共有結合的にコンジュゲートされた複合体を形成することができる。そのような複合体形成の結果として生じる生成物は、好ましくは平衡状態の親油性と親水性とを有する。
２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をカルシトニン薬剤に結合してもよい。複数あるオリゴマーは、好ましくは同一である。しかしながら、複数あるオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数あるオリゴマーの一部が同一で、一部が相違していてもよい。複数のオリゴマーがカルシトニン薬剤に結合される場合は、１以上のオリゴマーを加水分解可能な結合によりカルシトニン薬剤に結合させ、そして１以上のオリゴマーを加水分解可能でない結合によりカルシトニン薬剤に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーをカルシトニン薬剤に結合されているすべての結合が加水分解可能であってもよいが、しかし、例えば１以上のオリゴマーが本体における加水分解によってカルシトニン薬剤から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが本体における加水分解によってカルシトニン薬剤から緩徐に除去されるように、様々な程度の加水分解性を有していてよい。
オリゴマーは、求核性ヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがそれらに限定されないカルシトニン薬剤の様々な求核性残基でカルシトニン薬剤に結合されていてもよい。カルシトニン薬剤がポリペプチドである場合は、ポリペプチドの例えばセリンおよび／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見いだされ、例えばヒスチジンおよび／またはリシン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見いだされることがある。オリゴマーがカルシトニンポリペプチドの１以上のＮ−末端に結合されている場合は、この結合は好ましくは第２級アミンを形成する。カルシトニン薬剤がサケカルシトニンである場合は、例えばオリゴマーはＬｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ−末端のアミノ官能基を含むサケカルシトニンのアミノ官能基に結合されていてもよい。１以上のオリゴマーがサケカルシトニンに結合されていてよいが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合されているジコンジュゲートされたサケカルシトニンについては、例えば向上した血清中カルシウム濃度低下能力のようなより高い生体有効性が観察される。
本発明の実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、様々な方法によって合成することができる。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールからなるオリゴマーの実質的に単分散の混合物は、オリゴマーの実質的に単分散の混合物を得るのに十分な条件下で、カルボン酸の実質的に単分散の混合物をポリエチレングリコールの実質的に単分散の混合物と接触させることによって合成される。実質的に単分散の混合物のオリゴマーは、その後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供するために、それらがカルシトニン薬剤と反応することができるように活性化される。オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するための合成経路の１つの実施形態は、図３に示し、下記の実施例１１〜１８に記載した。オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するための合成経路のまた別の実施形態は、図４に示し、下記の実施例１９〜２４に記載した。オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するための合成経路のさらにまた別の実施形態は、図５に示し、下記の実施例２５〜２９に記載した。オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するための合成経路のさらにまた別の実施形態は、図６に示し、下記の実施例３０〜３１に記載した。オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するための合成経路のまた別の実施形態は、図７に示し、下記の実施例３２〜３７に記載した。オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するための合成経路のさらにまた別の実施形態は、図８に示し、下記の実施例３８に記載した。オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するための合成経路のさらにまた別の実施形態は、図９に示し、下記の実施例３９に記載した。オリゴマーの実質的に単分散の混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図１０に示し、下記の実施例４０に記載した。
活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で、カルシトニン薬剤の実質的に単分散の混合物と反応させてもよい。好ましい合成については、下記の実施例４１に記載した。当業者には理解されるように、反応条件（例、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物とカルシトニン薬剤の実質的に単分散の混合物との反応の結果として生じるカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物が実質的に単分散の混合物であるように制御することができる。例えば、リシンのアミノ官能基でのコンジュゲートは、反応溶液のｐＨをリシンのｐＫa未満に維持することによって抑制することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、例えばモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のような実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物を提供するために、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離することができる。特定の単離された抱合体のコンジュゲートの程度（例、単離分子がモノ抱合体、ジ抱合体、またはトリ抱合体のいずれであるか）は、当業者には理解されるように、質量分析法を含むがそれに限定されない様々な方法を利用して決定および／または検証することができる。特定の抱合体の構造（例、オリゴマーがサケカルシトニンモノ抱合体のＬｙｓ11、Ｌｙｓ18またはＮ−末端のいずれにあるか）は、当業者には理解されるように、配列解析、ペプチドマッピング、選択的な酵素分解、および／またはエンドペプチダーゼ開裂を含むがそれらに限定されない様々な技術を利用して決定および／または検証することができる。
当業者には理解されるように、カルシトニン薬剤上の１以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬剤を例えばＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、もしくはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）のような適切なブロッキング試薬と反応させることによってブロックすることができる。このプロセスは、例えば、カルシトニン薬剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ−末端でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、全部の求核性残基がコンジュゲートされてはいない抱合体）を形成するのが所望の場合に好ましいことがある。そのようなブロッキング後、ブロックされたカルシトニン薬剤の実質的に単分散の混合物は、１以上の求核性残基に結合されたオリゴマーを有し、そして他の求核性残基に結合されたブロッキング部分を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、活性化オリゴマーの実質的に単分散の混合物と反応させてもよい。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体は、当業者には理解されるように、脱ブロッキングすることができる。必要であれば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、その後実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物を提供するために、上記で記載したように分離することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、脱ブロッキングの前に分離することができる。
本発明の実施形態による実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、好ましくは従来型の混合物の特性と比較して向上した特性を有する。例えば、実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、好ましくは血清中カルシウム濃度を少なくとも５％低下させることができる。好ましくは、抱合体の混合物は、血清中カルシウム濃度を少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％もしくは１４％低下させることができる。より好ましくは、抱合体の混合物は、血清中カルシウム濃度を少なくとも１５％、１６％、１７％、１８％もしくは１９％低下させることができ、そして最も好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも２０％低下させることができる。
別の実施例として、実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤のキモトリプシンおよび／またはトリプシン各々による分解に対する抵抗性と比較して、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。キモトリプシンまたはトリプシンに対する抵抗性は、試験される分子が下記の実施例５１で略述した手法を使用して適切な酵素中で消化させられたときに残っている百分率に一致する。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１５％大きい、そして最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい、そして、最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約３０％大きい。
さらにまた別の実施例では、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマー抱合体混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より高い生体有効性を有する。特定化合物の生体有効性は、その曲線下面積（ＡＵＣ）値に一致する。好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約５％高い。より好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約１０％高い。
さらにまた別の実施例として、実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、好ましくは実質的に単分散の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性より大きいインビボ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ ＆ Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，「現代高分子化学（ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」，３９４−４０２（第２版，１９９１）に記載されているように、ゲル透過クロマトグラフィーのようなサイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらにまた別の実施例として、実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、好ましくは実質的に単分散の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性より大きいインビトロ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマー抱合体混合物は、好ましくは実質的に単分散の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の単分散混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較して、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらにまた別の実施例として、実質的に単分散のカルシトニン−オリゴマー抱合体混合物は、好ましくは実質的に単分散の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験体間変動より低い被験体間変動を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。被験体間変動は、当業者には理解されるように、様々な方法によって測定することができる。被験体間変動は、好ましくは次のように計算する。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（すなわち用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験体について決定する。全被験体についての平均ＡＵＣは、各被験体のＡＵＣを合計し、この合計を被験体の数で割ることによって決定する。その後、被験体のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値を、各被験体について決定する。入手した差の絶対値を合計して、被験体間変動を表す数値を得る。低い数値は低い被験体間変動を表し、高い数値は高い被験体間変動を表す。
本発明の実施形態による実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、２つもしくは３つ以上の上記の向上した特性を有する。より好ましくは、本発明の実施形態による実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、２つもしくは３つ以上の上記の向上した特性を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による実質的に単分散のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体混合物は、４つもしくは５つ以上の上記の向上した特性を有する。
本発明のさらにまた別の実施形態では、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する抱合体の混合物が提供される。混合物中の各抱合体には、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤が含まれる。標準偏差は、好ましくは約１４ダルトン未満であり、より好ましくは約１１ダルトン未満である。分子量分布は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ ＆ Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，「現代高分子化学（ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」，３９４−４０２（第２版，１９９１）に記載されているように、ゲル透過クロマトグラフィーのようなサイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない当業者に知られている方法によって決定できる。分子量分布の標準偏差はその後、当業者には理解されるように、統計的方法によって決定できる。
カルシトニン薬剤は、好ましくはカルシトニンである。より好ましくは、カルシトニン薬剤はサケカルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬剤は、例えばカルシトニン前駆体ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニンフラグメント、およびカルシトニンフラグメント類似体を含む当業者に知られている様々なカルシトニン薬剤から選択できることが理解されなければならない。カルシトニン前駆体ペプチドには、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−プロＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン開裂ペプチド）、ヒトが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニン類似体は、上記のようにカルシトニン中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。カルシトニンフラグメントには、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニンフラグメント類似体は、上記のようにカルシトニンフラグメント中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリエチレングリコール部分を含む様々なオリゴマーであってよい。好ましくは、オリゴマーのポリエチレングリコール部分は少なくとも２個、３個または４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリエチレングリコール部分は、少なくとも５個または６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、そして最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。
オリゴマーは、追加の親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるであろう１以上の部分を含んでいてよい。オリゴマー内の様々な部分は、加水分解可能な結合または加水分解可能でない結合のどちらかによって相互に共有結合されている。
オリゴマーは、糖類、ポリアルキレンオキサイド類、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマー類を含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性部分（すなわち、ポリエチレングリコール部分に追加される部分）をさらに含んでいてよい。ポリエチレングリコールがポリアルキレンオキサイドであるとき、追加の親水性部分はポリエチレングリコール部分であってよい。隣接ポリエチレングリコール部分は、それらがエーテル結合によって結合されている場合は同一部分と見なされるであろう。例えば、次の部分
Figure 0004272510
 は、６つのポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール部分である。この部分がオリゴマー内の唯一の親水性部分である場合は、オリゴマーは追加の親水性部分を含んでいないであろう。隣接ポリエチレングリコール部分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合されている場合は異なる部分と見なされるであろう。例えば、次の部分
Figure 0004272510
 は、４つのポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分および２つのポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性部分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーはポリエチレングリコール部分を含むが、追加の親水性部分を含んでいない。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上の親油性部分をさらに含んでいてよい。親油性部分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖アルキル部分である、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合は、それは１〜２８個の炭素原子を有する直鎖、飽和もしくは不飽和アルキル部分であるのが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合は、それは２〜１８個の炭素原子を有する直鎖、飽和もしくは不飽和である天然脂肪酸部分であるのが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４、５もしくは６個の炭素原子を有する。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上のスペーサー部分をさらに含んでいてもよい。スペーサー部分は、例えば、親油性部分から親水性部分を分離するため、カルシトニン薬剤から親油性部分もしくは親水性部分を分離するため、第２親水性部分もしくは親油性部分から第１親水性部分もしくは親油性部分を分離するため、またはリンカー部分から親水性部分もしくは親油性部分を分離するために使用できる。スペーサー部分は、好ましくは糖、コレステロールおよびグリセリン部分からなる群から選択される。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、オリゴマーをカルシトニン薬剤と結合させるために使用される１以上のリンカー部分をさらに含んでいてよい。リンカー部分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸部分からなる群から選択される。
オリゴマーは、カルシトニン薬剤に結合されていないオリゴマーの１以上の端部で１以上の末端部分をさらに含んでいてよい。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキルもしくは低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルもしくはメトキシである。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であるが、当業者には理解されるように、末端部分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない様々な部分であってよいと理解されなければならない。
オリゴマーは、好ましくはカルシトニン薬剤に共有結合されている。一部の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能な結合（例、エステル結合もしくはカーボネート結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能な結合は、プロドラッグとして作用するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供することができる。例えば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、抱合体にはカルシトニン薬剤の主要作用機序を通して身体へ作用を及ぼす能力が欠如している）ある例では、活性薬を提供するために１以上のオリゴマーがそれらの各カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体から開裂されるように所定期間にわたってカルシトニン薬剤を投与することで、加水分解可能な結合は徐放性作用もしくは制御放出性作用を提供することができる。他の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能でない結合（例、カルバメート結合、アミド結合、もしくはエーテル結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能でない結合の使用は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が長時間、好ましくは少なくとも２時間にわたり血流中で循環させることが所望である場合には好ましいことがある。オリゴマーがカルシトニン薬剤に共有結合されている場合は、当業者には理解されるように、オリゴマーは、オリゴマーをカルシトニン薬剤と共有結合させるために使用される１以上の結合部分をさらに含んでいる。結合部分は、好ましくは共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第２級アミン部分からなる群から選択される。オリゴマー上の２つ以上の部分は、カルシトニン薬剤に共有結合されていてもよい。
オリゴマーは好ましくはカルシトニン薬剤に共有結合されているが、オリゴマーは非共有結合的にコンジュゲートされたカルシトニン薬剤−オリゴマー複合体を形成するためにカルシトニン薬剤に非共有結合されていてもよいことが理解されなければならない。当業者には理解されるように、非共有結合には水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセル封入もしくはリポソーム封入が含まれるが、それらに限定されない。本発明の実施形態によると、オリゴマーは、当業者には理解されるように、選択された方法で非共有結合的なコンジュゲートのための能力を付与するため（例、水素結合能力を付与するため）に、適切に構築、修飾および／または適切に官能化されていてもよい。本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体を含むがそれらに限定されない様々な化合物を用いて誘導体化されていてもよい。結果として生じるオリゴマーは、薬剤分子、医薬生成物、および／または医薬賦形剤と非共有結合する（複合体を形成する）ことができる。結果として生じる複合体は、好ましくは平衡状態の親油性と親水性とを有する。本発明のさらにまた別の実施形態によると、オリゴマーはアミンおよび／またはアルキルアミンを用いて誘導体化されていてもよい。適切な酸性条件下では、結果として生じるオリゴマーは、薬剤分子、医薬生成物、および／または医薬賦形剤とともに非共有結合的にコンジュゲートされた複合体を形成することができる。そのような複合体形成の結果として生じる生成物は、好ましくは平衡状態の親油性と親水性とを有する。
２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）が、カルシトニン薬剤に結合されていてもよい。複数あるオリゴマーは、好ましくは同一である。しかしながら、複数のオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数のオリゴマーの一部が同一で、一部が相違していてもよい。複数のオリゴマーをカルシトニン薬剤に結合させる場合は、１以上のオリゴマーを加水分解可能な結合によりカルシトニン薬剤に結合させ、そして１以上のオリゴマーを加水分解可能でない結合によりカルシトニン薬剤に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーをカルシトニン薬剤に結合しているすべての結合が加水分解可能であってもよいが、しかし、例えば１以上のオリゴマーが本体における加水分解によってカルシトニン薬剤から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが本体における加水分解によってカルシトニン薬剤から緩徐に除去されるように、様々な程度の加水分解性を有していてよい。
オリゴマーは、求核性ヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがそれらに限定されないカルシトニン薬剤の様々な求核性残基でカルシトニン薬剤に結合されていてもよい。カルシトニン薬剤がポリペプチドである場合は、ポリペプチドの例えばセリンおよび／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見いだされ、例えばヒスチジンおよび／またはリシン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見いだされることがある。オリゴマーがカルシトニンポリペプチドの１以上のＮ−末端に結合されている場合は、この結合は好ましくは第２級アミンを形成する。カルシトニン薬剤がサケカルシトニンである場合は、例えばオリゴマーはＬｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ−末端のアミノ官能基を含むサケカルシトニンのアミノ官能基に結合されていてもよい。１以上のオリゴマーがサケカルシトニンに結合されていてもよいが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合されているジコンジュゲートされたサケカルシトニンについては、例えば向上した血清中カルシウム濃度低下能力のようなより高い生体有効性が観察される。
約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、様々な方法によって合成することができる。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールから構成される約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するオリゴマーの混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するオリゴマーの混合物を得るのに十分な条件下で、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルボン酸の混合物と約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するポリエチレングリコールの混合物とを接触させることによって合成される。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するオリゴマーの混合物は、その後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供するために、それらがカルシトニン薬剤と反応することができるように活性化される。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１つの実施形態は、図３に示し、下記の実施例１１〜実施例１８に記載した。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図４に示し、下記の実施例１９〜実施例２４に記載した。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図５に示し、下記の実施例２５〜実施例２９に記載した。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図６に示し、下記の実施例３０〜実施例３１に記載した。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図７に示し、下記の実施例３２〜実施例３７に記載した。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図８に示し、下記の実施例３８に記載した。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図９に示し、下記の実施例３９に記載した。約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図１０に示し、下記の実施例４０に記載した。
約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤の混合物と反応させる。好ましい合成については、下記の実施例４１に記載した。当業者には理解されるように、反応条件（例、選択されたモル比、溶媒混合液および／またはｐＨ）は、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物と約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤の混合物との反応の結果として生じるカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物が、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する混合物であるように制御することができる。例えば、リシンのアミノ官能基でのコンジュゲートは反応溶液のｐＨをリシンのｐＫa未満に維持することによって抑制することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する例えばモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のようなカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離することができる。特定の単離された抱合体のコンジュゲートの程度（例、単離分子がモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のいずれであるか）は、当業者には理解されるように、質量分析法を含むがそれに限定されない様々な技術を利用して決定および／または検証することができる。特定の抱合体の構造（例、オリゴマーがサケカルシトニンモノ抱合体のＬｙｓ11、Ｌｙｓ18またはＮ−末端のいずれにあるか）は、当業者には理解されるように、配列解析、ペプチドマッピング、選択的な酵素分解、および／またはエンドペプチダーゼ開裂を含むがそれに限定されない様々な技術を利用して決定する、および／または検証することができる。
当業者には理解されるように、カルシトニン薬剤上の１以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬剤を例えばＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、もしくはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）のような適切なブロッキング試薬と反応させることによってブロックすることができる。このプロセスは、例えば、カルシトニン薬剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ−末端でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、全部の求核性残基がコンジュゲートされてはいない抱合体）を形成するのが所望の場合に好ましいことがある。そのようなブロッキング後、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するブロックされたカルシトニン薬剤の混合物は、１以上の求核性残基に結合されたオリゴマーを有し、そして他の求核性残基に結合されたブロッキング部分を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する活性化オリゴマーの混合物と反応させてもよい。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体は、当業者には理解されるように、脱ブロックすることができる。必要であれば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物はその後、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、上記のように分離することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、脱ブロッキングの前に分離することができる。
本発明の実施形態による約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、従来型混合物の特性と比較したときに、好ましくは向上した特性を有する。例えば、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは血清中カルシウム濃度を少なくとも５％低下させることができる。好ましくは、抱合体の混合物は、血清中カルシウム濃度を少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％もしくは１４％低下させることができる。より好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも１５％、１６％、１７％、１８％もしくは１９％低下させることができ、そして最も好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも２０％低下させることができる。
別の実施例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤のキモトリプシンおよび／またはトリプシン各々による分解に対する抵抗性と比較して、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。キモトリプシンまたはトリプシンに対する抵抗性は、下記の実施例５１で略述した手法に類似する手法を使用して試験される分子を適切な酵素中で消化させたときに残っている百分率に一致する。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１５％大きい、そして最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい、そして、最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約３０％大きい。
さらに別の実施例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より高い生体有効性を有する。特定化合物の生体有効性は、その曲線下面積（ＡＵＣ）値に一致する。好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約５％高い。より好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約１０％高い。
さらに別の実施例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ ＆ Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，「現代高分子化学（ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」，３９４−４（第２版，１９９１）に記載されているように、ゲル透過クロマトグラフィーのようなサイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
別の実施例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する抵抗性に比較して、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験体間変動より低い被験体間変動を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。被験体間変動は、当業者には理解されるように、様々な方法によって入手できる。被験体間変動は、好ましくは次のように計算する。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（すなわち用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験体について決定する。全被験体についての平均ＡＵＣは、各被験体のＡＵＣを合計し、この合計を被験体の数で割ることによって決定する。その後、被験体のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値を、各被験体について決定する。入手した差の絶対値を合計して、被験体間変動を表す数値を得る。低い数値は低い被験体間変動を表し、高い数値は高い被験体間変動を表す。
本発明の実施形態による約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは２つもしくは３つ以上の上記の向上した特性を有する。より好ましくは、本発明の実施形態による約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、３つもしくは４つ以上の上記の向上した特性を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、４つもしくは５つ以上の上記の向上した特性を有する。
本発明のさらに別の実施形態によると、各抱合体が、ポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を含む抱合体の混合物が提供され、そしてこの混合物は約１０，０００より大きい分散係数（ＤＣ）を有する。
Figure 0004272510
 式中：
ｎは、サンプル中の様々な分子の数であり、
Ｎiは、サンプル中のｉ番目の分子の数であり、
Ｍiは、ｉ番目の分子の質量である。
抱合体の混合物は、好ましくは１００，０００より大きい分散係数を有する。より好ましくは、抱合体の混合物は、５００，０００より大きい分散係数を有する。そして、最も好ましくは、分散係数は１０，０００，０００である。変数ｎ、Ｎｉ、およびＭｉは、当業者には理解されるように、下記の実施例４９に記載した方法を含むがそれらに限定されない様々な方法によって決定できる。
カルシトニン薬剤は、好ましくはカルシトニンである。より好ましくは、カルシトニン薬剤はサケカルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬剤は、例えばカルシトニン前駆体ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニンフラグメント、およびカルシトニンフラグメント類似体を含む当業者によく知られている様々なカルシトニン薬剤から選択できることが理解されなければならない。カルシトニン前駆体ペプチドには、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−プロＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン開裂ペプチド）、ヒトが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニン類似体は、上記のようにカルシトニン中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。カルシトニンフラグメントには、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニンフラグメント類似体は、上記のようにカルシトニンフラグメント中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリエチレングリコール部分を含む様々なオリゴマーであってよい。好ましくは、オリゴマーのポリエチレングリコール部分は少なくとも２個、３個または４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリエチレングリコール部分は、少なくとも５個または６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、そして最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。
オリゴマーは、追加の親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるであろう１以上の部分を含んでいてよい。オリゴマー内の様々な部分は、加水分解可能な結合または加水分解可能でない結合のどちらかによって相互に共有結合されている。
オリゴマーは、糖類、ポリアルキレンオキサイド類、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマー類を含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性部分（すなわち、ポリエチレングリコール部分に追加される部分）をさらに含んでいてよい。ポリエチレングリコールがポリアルキレンオキサイドであるとき、追加の親水性部分はポリエチレングリコール部分であってよい。隣接ポリエチレングリコール部分は、それらがエーテル結合によって結合されている場合は同一部分と見なされるであろう。例えば、この部分
Figure 0004272510
 は、６つのポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール部分である。この部分がオリゴマー内の唯一の親水性部分である場合は、オリゴマーは追加の親水性部分を含んでいないであろう。隣接ポリエチレングリコール部分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合されている場合は異なる部分と見なされるであろう。例えばこの部分
Figure 0004272510
 は、４つのポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分および２つのポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性部分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーはポリエチレングリコール部分を含むが、追加の親水性部分を含んでいない。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上の親油性部分をさらに含んでいてよい。親油性部分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖アルキル部分である、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合は、それは１〜２８個の炭素原子を有する直鎖、飽和もしくは不飽和アルキル部分であるのが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合は、それは２〜１８個の炭素原子を有する直鎖、飽和もしくは不飽和である天然脂肪酸部分であるのが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４、５もしくは６個の炭素原子を有する。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上のスペーサー部分をさらに含んでいてよい。スペーサー部分は、例えば、親油性部分から親水性部分を分離するため、カルシトニン薬剤から親油性部分もしくは親水性部分を分離するため、第２親水性部分もしくは親油性部分から第１親水性部分もしくは親油性部分を分離するため、またはリンカー部分から親水性部分もしくは親油性部分を分離するために使用できる。スペーサー部分は、好ましくは糖、コレステロールおよびグリセリン部分からなる群から選択される。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、オリゴマーをカルシトニン薬剤と結合させるために使用される１以上のリンカー部分をさらに含んでいてよい。リンカー部分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸部分からなる群から選択される。
オリゴマーは、カルシトニン薬剤に結合されていないオリゴマーの１以上の端部で１以上の末端部分をさらに含んでいてよい。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキルもしくは低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルもしくはメトキシである。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であるが、当業者には理解されるように、末端部分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない様々な部分であってよいと理解されなければならない。
オリゴマーは、好ましくはカルシトニン薬剤に共有結合されている。一部の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能な結合（例、エステルもしくはカーボネート結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能な結合は、プロドラッグとして作用するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供することができる。例えば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、抱合体にはカルシトニン薬剤の主要作用機序を通して身体へ作用を及ぼす能力が欠如している）ある例では、活性薬を提供するために１以上のオリゴマーがそれらの各カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体から開裂されるように所定期間にわたってカルシトニン薬剤を投与することで、加水分解可能な結合は徐放性作用もしくは制御放出性作用を提供することができる。他の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能でない結合（例、カルバメート結合、アミド結合、もしくはエーテル結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能でない結合の使用は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が長時間、好ましくは少なくとも２時間にわたり血流中で循環させることが所望の場合には好ましいことがある。オリゴマーがカルシトニン薬剤に共有結合されている場合は、当業者には理解されるように、オリゴマーは、オリゴマーをカルシトニン薬剤と共有結合させるために使用される１以上の結合部分をさらに含んでいる。結合部分は、好ましくは共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第２級アミン部分からなる群から選択される。オリゴマー上の２つ以上の部分は、カルシトニン薬剤に共有結合されていてよい。
オリゴマーは好ましくはカルシトニン薬剤に共有結合されているが、オリゴマーは非共有結合的にコンジュゲートされたカルシトニン薬剤−オリゴマー複合体を形成するためにカルシトニン薬剤に非共有結合されていてもよいことが理解されなければならない。当業者には理解されるように、非共有結合には水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセル封入もしくはリポソーム封入が含まれるが、それらに限定されない。本発明の実施形態によると、オリゴマーは、当業者には理解されるように、選択された方法で非共有結合的なコンジュゲートのための能力を付与するため（例、水素結合能力を付与するため）に、適切に構築、修飾および／または適切に官能化されていてもよい。本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体を含むがそれらに限定されない様々な化合物を用いて誘導体化されていてもよい。結果として生じるオリゴマーは、薬剤分子、医薬生成物、および／または医薬賦形剤と非共有結合する（複合体を形成する）ことができる。結果として生じる複合体は、好ましくは平衡状態の親油性と親水性とを有する。本発明のさらにまた別の実施形態によると、オリゴマーはアミンおよび／またはアルキルアミンを用いて誘導体化されていてもよい。適切な酸性条件下では、結果として生じるオリゴマーは、薬剤分子、医薬生成物、および／または医薬賦形剤とともに非共有結合的にコンジュゲートされた複合体を形成することができる。そのような複合体形成の結果として生じる生成物は、好ましくは平衡状態の親油性と親水性とを有する。
２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）は、カルシトニン薬剤に結合されていてもよい。複数あるオリゴマーは、好ましくは同一である。しかしながら、複数あるオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数あるオリゴマーの一部が同一で、一部が相違していてもよい。複数のオリゴマーがカルシトニン薬剤に結合される場合は、１以上のオリゴマーを加水分解可能な結合によりカルシトニン薬剤に結合させ、そして１以上のオリゴマーを加水分解可能でない結合によりカルシトニン薬剤に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーをカルシトニン薬剤に結合しているすべての結合が加水分解可能であってよいが、しかし、例えば１以上のオリゴマーが本体における加水分解によってカルシトニン薬剤から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが本体における加水分解によってカルシトニン薬剤から緩徐に除去されるように、様々な程度の加水分解性を有していてもよい。
オリゴマーは、求核性ヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがそれらに限定されないカルシトニン薬剤の様々な求核性残基でカルシトニン薬剤に結合されていてもよい。カルシトニン薬剤がポリペプチドである場合は、ポリペプチドの例えばセリンおよび／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見いだされ、例えばヒスチジンおよび／またはリシン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見いだされることがある。オリゴマーがカルシトニンポリペプチドの１以上のＮ−末端に結合されている場合は、この結合は好ましくは第２級アミンを形成する。カルシトニン薬剤がサケカルシトニンである場合は、例えばオリゴマーはＬｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ−末端のアミノ官能基を含むサケカルシトニンのアミノ官能基に結合されていてもよい。１以上のオリゴマーがサケカルシトニンに結合されていてもよいが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合されているジコンジュゲートされたサケカルシトニンについては、例えば向上した血清中カルシウム濃度低下能力のようなより高い生体有効性が観察される。
１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、様々な方法によって合成することができる。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールから構成される１０，０００より大きい分散係数を有するオリゴマーの混合物は、１０，０００より大きい分散係数を有するオリゴマーの混合物を得るのに十分な条件下で、１０，０００より大きい分散係数を有するカルボン酸の混合物を１０，０００より大きい分散係数を有するポリエチレングリコールの混合物と接触させることによって合成される。１０，０００より大きい分散係数を有する混合物のオリゴマーは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供するために、それらがカルシトニン薬剤と反応することができるように活性化される。１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１つの実施形態は、図３に示し、下記の実施例１１〜実施例１８に記載した。１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図４に示し、下記の実施例１９〜実施例２４に記載した。１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図５に示し、下記の実施例２５〜実施例２９に記載した。１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図６に示し、下記の実施例３０〜実施例３１に記載した。１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図７に示し、下記の実施例３２〜実施例３７に記載した。１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図８に示し、下記の実施例３８に記載した。１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図９に示し、下記の実施例３９に記載した。１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図１０に示し、下記の実施例４０に記載した。
１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で、１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤の混合物と反応させる。好ましい合成については、下記の実施例４１に記載した。当業者には理解されるように、反応条件（例、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物と１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤の混合物との反応の結果として生じるカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物が１０，０００より大きい分散係数を有する混合物であるように制御することができる。例えば、リシンのアミノ官能基でのコンジュゲートは、反応溶液のｐＨをリシンのｐＫa未満に維持することによって抑制することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、例えばモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のような１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離することができる。特定の単離された抱合体のコンジュゲートの程度（例、単離分子がモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のいずれであるか）は、当業者には理解されるように、質量分析法を含むがそれに限定されない様々な技術を利用して決定および／または検証することができる。特定の抱合体の構造（例、オリゴマーがサケカルシトニンモノ抱合体のＬｙｓ11、Ｌｙｓ18またはＮ−末端のいずれにあるか）は、当業者には理解されるように、配列解析、ペプチドマッピング、選択的な酵素分解、および／またはエンドペプチダーゼ開裂を含むがそれに限定されない様々な技術を利用して決定および／または検証することができる。
当業者には理解されるように、カルシトニン薬剤上の１以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬剤を例えばＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、もしくはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）のような適切なブロッキング試薬と反応させることによってブロックすることができる。このプロセスは、例えば、カルシトニン薬剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ−末端でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、全部の求核性残基がコンジュゲートされてはいない抱合体）を形成するのが所望の場合に好ましいことがある。そのようなブロッキング後、１０，０００より大きい分散係数を有するブロックされたカルシトニン薬剤の混合物は、１以上の求核性残基に結合されたオリゴマーを有し、そして他の求核性残基に結合されたブロッキング部分を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、１０，０００より大きい分散係数を有する活性化オリゴマーの混合物と反応させてもよい。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体は、当業者には理解されるように、脱ブロックすることができる。必要であれば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、その後１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、上記で記載したように分離することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、脱ブロッキングの前に分離することができる。
本発明の実施形態による１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは従来型混合物の特性と比較して向上した特性を有する。例えば、１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは血清中カルシウム濃度を少なくとも５％低下させることができる。好ましくは、抱合体の混合物は、血清中カルシウム濃度を少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％もしくは１４％低下させることができる。より好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも１５％、１６％、１７％、１８％もしくは１９％低下させることができ、そして最も好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも２０％低下させることができる。
別の実施例として、１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤のキモトリプシンおよび／またはトリプシン各々による分解に対する抵抗性と比較して、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。キモトリプシンまたはトリプシンに対する抵抗性は、下記の実施例５１で略述した手法に類似する手法を使用して試験される分子を適切な酵素中で消化させたときに残っている百分率に一致する。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１５％大きい、そして最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい。そして、最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約３０％大きい。
さらにまた別の実施例では、１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より高い生体有効性を有する。特定化合物の生体有効性は、その曲線下面積（ＡＵＣ）値に一致する。好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約５％高い。より好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約１０％高い。
さらに別の実施例として、１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ ＆ Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，「現代高分子化学（ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」，３９４−４０２（第２版，１９９１）に記載されているように、ゲル透過クロマトグラフィーのようなサイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない様々な方法によって測定できる。
別の実施例として、１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する抵抗性に比較したときに、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験体間変動より低い被験体間変動を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。被験体間変動は、当業者には理解されるように、様々な方法によって入手できる。被験体間変動は、好ましくは次のように計算する。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（すなわち用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験体について決定する。全被験体についての平均ＡＵＣは、各被験体のＡＵＣを合計し、この合計を被験体の数で割ることによって決定する。その後、被験体のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値を、各被験体について決定する。入手した差の絶対値を合計して、被験体間変動を表す数値を得る。低い数値は低い被験体間変動を表し、高い数値は高い被験体間変動を表す。
本発明の実施形態による１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは２つもしくは３つ以上の上記の向上した特性を有する。より好ましくは、本発明の実施形態による１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、３つもしくは４つ以上の上記の向上した特性を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による１０，０００より大きい分散係数を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、４つもしくは５つ以上の上記の向上した特性を有する。
本発明の他の実施形態によると、各抱合体が、オリゴマーに結合されたカルシトニン薬剤を含む、そして同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する抱合体の混合物が提供される。
カルシトニン薬剤は、好ましくはカルシトニンである。より好ましくは、カルシトニン薬剤はサケカルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬剤は、例えばカルシトニン前駆体ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニンフラグメント、およびカルシトニンフラグメント類似体を含む当業者によく知られている様々なカルシトニン薬剤から選択できることが理解されなければならない。カルシトニン前駆体ペプチドには、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−プロＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン開裂ペプチド）、ヒトが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニン類似体は、上記のようにカルシトニン中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。カルシトニンフラグメントには、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニンフラグメント類似体は、上記のようにカルシトニンフラグメント中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリエチレングリコール部分を含む様々なオリゴマーであってよい。好ましくは、オリゴマーのポリエチレングリコール部分は少なくとも２個、３個または４個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリエチレングリコール部分は、少なくとも５個または６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する、そして最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有する。
オリゴマーは、追加の親水性部分、親油性部分、スペーサー部分、リンカー部分、および末端部分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるであろう１以上の部分を含んでいてよい。オリゴマー内の様々な部分は、加水分解可能な結合または加水分解可能でない結合のどちらかによって相互に共有結合されている。
オリゴマーは、糖類、ポリアルキレンオキサイド類、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマー類を含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性部分（すなわち、ポリエチレングリコール部分に追加される部分）をさらに含んでいてよい。ポリエチレングリコールがポリアルキレンオキサイドであるとき、追加の親水性部分はポリエチレングリコール部分であってよい。隣接ポリエチレングリコール部分は、それらがエーテル結合によって結合されている場合は同一部分と見なされるであろう。例えば、部分
Figure 0004272510
 は、６つのポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール部分である。この部分がオリゴマー内の唯一の親水性部分である場合は、オリゴマーは追加の親水性部分を含んでいないであろう。隣接ポリエチレングリコール部分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合されている場合は異なる部分と見なされるであろう。例えば、部分
Figure 0004272510
 は、４つのポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分および２つのポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性部分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーはポリエチレングリコール部分を含むが、追加の親水性部分を含んでいない。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上の親油性部分をさらに含んでいてよい。親油性部分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖アルキル部分である、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合は、それは１〜２８個の炭素原子を有する直鎖、飽和もしくは不飽和アルキル部分であるのが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合は、それは２〜１８個の炭素原子を有する直鎖、飽和もしくは不飽和である天然脂肪酸部分であるのが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４個、５個もしくは６個の炭素原子を有する。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上のスペーサー部分をさらに含んでいてよい。スペーサー部分は、例えば、親油性部分から親水性部分を分離するため、カルシトニン薬剤から親油性部分もしくは親水性部分を分離するため、第２親水性部分もしくは親油性部分から第１親水性部分もしくは親油性部分を分離するため、またはリンカー部分から親水性部分もしくは親油性部分を分離するために使用できる。スペーサー部分は、好ましくは糖、コレステロールおよびグリセリン部分からなる群から選択される。
オリゴマーは、当業者には理解されるように、オリゴマーをカルシトニン薬剤と結合させるために使用される１以上のリンカー部分をさらに含んでいてよい。リンカー部分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸部分からなる群から選択される。
オリゴマーは、カルシトニン薬剤に結合されていないオリゴマーの１以上の端部で１以上の末端部分をさらに含んでいてよい。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であり、より好ましくは低級アルキルもしくは低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルもしくはメトキシである。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であるが、当業者には理解されるように、末端部分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない様々な部分であってよいと理解されなければならない。
オリゴマーは、好ましくはカルシトニン薬剤に共有結合されている。一部の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能な結合（例、エステル結合もしくはカーボネート結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能な結合は、プロドラッグとして作用するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供することができる。例えば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、抱合体にはカルシトニン薬剤の主要作用機序を通して身体へ作用を及ぼす能力が欠如している）ある例では、活性薬を提供するために１以上のオリゴマーがそれらの各カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体から開裂されるように所定期間にわたってカルシトニン薬剤を投与することで、加水分解可能な結合は徐放性作用もしくは制御放出性作用を提供することができる。他の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能でない結合（例、カルバメート結合、アミド結合、もしくはエーテル結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能でない結合の使用は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が長時間、好ましくは少なくとも２時間にわたり血流中で循環させることが所望の場合には好ましいことがある。オリゴマーがカルシトニン薬剤に共有結合されている場合は、当業者には理解されるように、オリゴマーは、オリゴマーをカルシトニン薬剤と共有結合させるために使用される１以上の結合部分をさらに含んでいる。結合部分は、好ましくは共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第２級アミン部分からなる群から選択される。オリゴマー上の２つ以上の部分は、カルシトニン薬剤に共有結合されていてよい。
オリゴマーは好ましくはカルシトニン薬剤に共有結合されているが、オリゴマーは非共有結合的にコンジュゲートされたカルシトニン薬剤−オリゴマー複合体を形成するためにカルシトニン薬剤に非共有結合されていてもよいことが理解されなければならない。当業者には理解されるように、非共有結合には水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、およびミセル封入もしくはリポソーム封入が含まれるが、それらに限定されない。本発明の実施形態によると、オリゴマーは、当業者には理解されるように、選択された方法で非共有結合的なコンジュゲートのための能力を付与するため（例、水素結合能力を付与するため）に、適切に構築、修飾および／または適切に官能化されていてもよい。本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、胆汁酸、胆汁酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸誘導体、サリチル酸、サリチル酸誘導体、アミノサリチル酸、およびアミノサリチル酸誘導体を含むがそれらに限定されない様々な化合物を用いて誘導体化されていてもよい。結果として生じるオリゴマーは、薬剤分子、医薬生成物、および／または医薬賦形剤と非共有結合する（複合体を形成する）ことができる。結果として生じる複合体は、好ましくは平衡状態の親油性と親水性とを有する。本発明のさらにまた別の実施形態によると、オリゴマーはアミンおよび／またはアルキルアミンを用いて誘導体化されていてもよい。適切な酸性条件下では、結果として生じるオリゴマーは、薬剤分子、医薬生成物、および／または医薬賦形剤とともに非共有結合的にコンジュゲートされた複合体を形成することができる。そのような複合体形成の結果として生じる生成物は、好ましくは平衡状態の親油性と親水性とを有する。
２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）は、カルシトニン薬剤に結合されていてもよい。複数のオリゴマーは、好ましくは同一である。しかしながら、複数あるオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数のオリゴマーの一部が同一で、一部が相違していてもよい。複数のオリゴマーがカルシトニン薬剤に結合される場合は、１以上のオリゴマーを加水分解可能な結合によりカルシトニン薬剤に結合させ、そして１以上のオリゴマーを加水分解可能でない結合によりカルシトニン薬剤に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーをカルシトニン薬剤に結合しているすべての結合が加水分解可能であってよいが、しかし、例えば１以上のオリゴマーが本体における加水分解によってカルシトニン薬剤から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが本体における加水分解によってカルシトニン薬剤から緩徐に除去されるように、様々な程度の加水分解性を有していてもよい。
オリゴマーは、求核性ヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがそれらに限定されないカルシトニン薬剤の様々な求核性残基でカルシトニン薬剤に結合されていてもよい。カルシトニン薬剤がポリペプチドである場合は、ポリペプチドの例えばセリンおよび／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見いだされ、例えばヒスチジンおよび／またはリシン残基、および／またはポリペプチドの１以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見いだされることがある。オリゴマーがカルシトニンポリペプチドの１以上のＮ−末端に結合されている場合は、この結合は好ましくは第２級アミンを形成する。カルシトニン薬剤がサケカルシトニンである場合は、例えばオリゴマーはＬｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ−末端のアミノ官能基を含むサケカルシトニンのアミノ官能基に結合されていてもよい。１以上のオリゴマーがサケカルシトニンに結合されていてもよいが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合されているジコンジュゲートされたサケカルシトニンについては、例えば向上した血清中カルシウム濃度低下能力のようなより高い生体有効性が観察される。
混合物中の各抱合体が同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、様々な方法によって合成することができる。例えば、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルボン酸およびポリエチレングリコールから構成される混合物は、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する混合物を得るのに十分な条件下で、カルボン酸の混合物と混合物中の各ポリエチレングリコールサブユニットが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコールの混合物とを接触させることによって合成する。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する混合物のオリゴマーは、その後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供するために、それらがカルシトニン薬剤と反応することができるように活性化される。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１つの実施形態は、図３に示し、下記の実施例１１〜実施例１８に記載した。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１つの実施形態は、図４に示し、下記の実施例１９〜実施例２４に記載した。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１つの実施形態は、図５に示し、下記の実施例２５〜実施例２９に記載した。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図６に示し、下記の実施例３０〜実施例３１に記載した。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１つの実施形態は、図７に示し、下記の実施例３２〜実施例３７に記載した。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図８に示し、下記の実施例３８に記載した。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図９に示し、下記の実施例３９に記載した。混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図１０に示し、下記の実施例４０に記載した。
混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で、カルシトニン薬剤の混合物と反応させる。好ましい合成については、下記の実施例４１に記載した。当業者には理解されるように、反応条件（例、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物とカルシトニン薬剤の混合物との反応の結果として生じるカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物が、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する抱合体の混合物であるように制御することができる。例えば、リシンのアミノ官能基でのコンジュゲートは、反応溶液のｐＨをリシンのｐＫa未満に維持することによって抑制することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、例えばモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のような同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離することができる。特定の単離された抱合体のコンジュゲートの程度（例、単離分子がモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のいずれであるか）は、当業者には理解されるように、質量分析法を含むがそれに限定されない様々な技術を利用して決定および／または検証することができる。特定の抱合体の構造（例、オリゴマーがサケカルシトニンモノ抱合体のＬｙｓ11、Ｌｙｓ18またはＮ−末端のいずれにあるか）は、当業者には理解されるように、配列解析、ペプチドマッピング、選択的な酵素分解、および／またはエンドペプチダーゼ開裂を含むがそれに限定されない様々な技術を利用して決定および／または検証することができる。
当業者には理解されるように、カルシトニン薬剤上の１以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬剤を例えばＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、もしくはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）のような適切なブロッキング試薬と反応させることによってブロックすることができる。このプロセスは、例えば、カルシトニン薬剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ−末端でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、全部の求核性残基がコンジュゲートされてはいない抱合体）を形成するのが所望の場合に好ましいことがある。そのようなブロッキング後、ブロックされたカルシトニン薬剤の混合物は、１以上の求核性残基に結合されたオリゴマーを有し、そして他の求核性残基に結合されたブロッキング部分を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有する活性化オリゴマーの混合物と反応させてもよい。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体は、当業者には理解されるように、脱ブロックすることができる。必要であれば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、その後混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、上記で記載したように分離することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、脱ブロッキングの前に分離することができる。
本発明の実施形態による混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは従来型混合物の特性と比較して向上した特性を有する。例えば、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは血清中カルシウム濃度を少なくとも５％低下させることができる。好ましくは、抱合体の混合物は、血清中カルシウム濃度を少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％もしくは１４％低下させることができる。より好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも１５％、１６％、１７％、１８％もしくは１９％低下させることができ、そして最も好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも２０％低下させることができる。
別の実施例として、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤のキモトリプシンおよび／またはトリプシン各々による分解に対する抵抗性と比較して、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。キモトリプシンまたはトリプシンに対する抵抗性は、下記の実施例５１で略述した手法に類似する手法を使用して試験される分子を適切な酵素中で消化させたときに残っている百分率に一致する。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１５％大きい、そして最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい、そして、最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約３０％大きい。
さらにまた別の実施例として、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より高い生体有効性を有する。特定化合物の生体有効性は、その曲線下面積（ＡＵＣ）値に一致する。好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約５％高い。より好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約１０％高い。
さらに別の実施例として、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ ＆ Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，「現代高分子化学（ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」，３９４−４０２（第２版，１９９１）に記載されているように、ゲル透過クロマトグラフィーのようなサイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは混合物中の各オリゴマーが同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較したときに、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、混合物中の各抱合体が同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは混合物中の各抱合体が同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験体間変動より低い被験体間変動を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。被験体間変動は、当業者には理解されるように、様々な方法によって入手できる。被験体間変動は、好ましくは次のように計算する。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（すなわち用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験体について決定する。全被験体についての平均ＡＵＣは、各被験体のＡＵＣを合計し、この合計を被験体の数で割ることによって決定する。その後、被験体のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値を、各被験体について決定する。入手した差の絶対値を合計して、被験体間変動を表す数値を得る。低い数値は低い被験体間変動を表し、高い数値は高い被験体間変動を表す。
本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは２つもしくは３つ以上の上記の向上した特性を有する。より好ましくは、本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、３つもしくは４つ以上の上記の向上した特性を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同一数のポリエチレングリコールサブユニットを有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、４つもしくは５つ以上の上記の向上した特性を有する。
本発明のさらに別の実施形態によると、各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有する抱合体の混合物が提供される。
Figure 0004272510
 式中：
Ｂは、結合部分であり、
Ｌはリンカー部分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ”は独立して選択されたスペーサー部分であり、
Ｒは親油性部分およびＲ’はポリアルキレングリコール部分である、またはＲ’は親油性部分およびＲはポリアルキレングリコール部分であり、
Ｔは末端部分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは独立して０もしくは１であり、
ｐは、１からカルシトニン薬剤上の求核性残基数までの整数である。
カルシトニン薬剤は、好ましくはカルシトニンである。より好ましくは、カルシトニン薬剤はサケカルシトニンである。しかしながら、カルシトニン薬剤は、例えばカルシトニン前駆体ペプチド、カルシトニン、カルシトニン類似体、カルシトニンフラグメント、およびカルシトニンフラグメント類似体を含む当業者に知られている様々なカルシトニン薬剤から選択できることが理解されなければならない。カルシトニン前駆体ペプチドには、カタカルシン（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）、およびＮ−プロＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン開裂ペプチド）、ヒトが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニン類似体は、上記のようにカルシトニン中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。カルシトニンフラグメントには、カルシトニン１−７、ヒト；およびカルシトニン８−３２、サケが含まれるがそれらに限定されない。カルシトニンフラグメント類似体は、上記のようにカルシトニンフラグメント中の１以上のアミノ酸の置換によって提供することができる。
本発明のこれらの実施形態によると、オリゴマーのポリアルキレングリコール部分は、好ましくは少なくとも２個、３個または４個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。より好ましくは、ポリアルキレングリコール部分は、少なくとも５個または６個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する、そして最も好ましくは、ポリエチレングリコール部分は、少なくとも７つのポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール部分は、好ましくはポリエチレングリコール部分、ポリプロピレングリコール部分、もしくはポリブチレングリコール部分のような低級ポリアルキレングリコール部分である。より好ましくは、ポリアルキレングリコール部分はポリエチレングリコール部分またはポリプロピレングリコール部分である。最も好ましくは、ポリアルキレングリコール部分はポリエチレングリコール部分である。ポリアルキレングリコール部分がポリプロピレングリコール部分である場合は、その部分は好ましくは一様な（すなわち、非ランダム）構造を有する。一様な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール部分は次の通りである。
Figure 0004272510
 この一様なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖中の各酸素原子に隣接する唯一のメチル置換炭素原子を有すると記載することができる。そのような一様なポリプロピレングリコール部分は、親油性および親水性の両方の特徴を示すことができ、したがって親水性ポリマー部分を使用せずに両親媒性カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供する際に有用な可能性がある。さらにその上、ポリプロピレングリコール部分の第２級アルコール部分とカルシトニン薬剤とを結合することは、例えば腸内で見いだされるトリプシンおよびキモトリプシンのような酵素によって惹起される分解に対する向上した抵抗性を備えるカルシトニン薬剤（例、サケカルシトニン）を提供することができる。
本発明の実施形態による一様なポリプロピレングリコールは、好ましくはここで記載する図１１〜図１３に示した通りに合成する。図１１に示した通りに、１，２−プロパンジオール５３は第２級アルコール伸長モノマー５４を提供するために第１級アルコールブロッキング試薬と反応させる。第１級アルコールブロッキング試薬は、当業者には理解されるように、例えばｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドおよびｔ−ブチルジメチルシリルクロリドのようなシリルクロリド化合物、および例えばＡｃ2Ｏのようなエステル化試薬を含むがそれらに限定されない様々な第１級アルコールブロッキング試薬であってよい。好ましくは、第１級アルコールブロッキング試薬は例えばｔ−ブチルジフェニルシリルクロリドもしくはｔ−ブチルジメチルシリルクロリドのような第２級アルコールと実質的に非反応性である第１級アルコールブロッキング試薬である。第２級アルコール伸長モノマー（５４）は、第１級アルコール伸長モノマーメシレート５５を提供するために、メタンスルホニルクロリド（ＭｅＳＯ2Ｃｌ）と反応させてもよい。
あるいはまた、第２級アルコール伸長モノマー５４は、化合物５６を提供するために、第２級アルコールブロッキング試薬と反応させてもよい。第２級アルコールブロッキング試薬は、当業者には理解されるように、ベンジルクロリドを含むがそれらに限定されない様々な第２級アルコールブロッキング試薬によって決定できる。化合物５６は、ブロッキング部分Ｂ1を取り除き、そして第１級アルコール伸長モノマー５７を提供するためにＢ1脱ブロッキング試薬と反応させてもよい。Ｂ1脱ブロッキング試薬は、当業者には理解されるように、様々な脱ブロッキング試薬から選択できる。第１級アルコールがエステルを形成することによってブロックされている場合は、Ｂ1脱ブロッキング試薬は例えば塩基（例、炭酸カリウム）のような脱エステル化試薬である。第１級アルコールがシリルクロリドを使用してブロックされている場合は、Ｂ1脱ブロッキング試薬は好ましくはフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）である。第１級アルコール伸長モノマー５７は、第２級アルコール伸長モノマーメシレート５８を提供するために、メタンスルホニルクロリドと反応させてもよい。
第１級アルコール伸長モノマー５４および第２級アルコール伸長モノマー５７は次のようにキャッピングすることができる。第２級アルコール伸長モノマー５４は、化合物５９を提供するために、キャッピング試薬と反応させてもよい。キャッピング試薬は、当業者には理解されるように、例えばメチルクロリドのようなハロゲン化アルキルを含むがそれらに限定されない様々なキャッピング試薬であってよい。化合物５９は、第１級アルコールキャッピングモノマー６０を提供するために、上記のようにＢ1脱ブロッキング試薬と反応させてもよい。第１級アルコールキャッピングモノマー６０は、第２級アルコールキャッピングモノマーメシレート６１を提供するために、メタンスルホニルクロリドと反応させてもよい。第１級アルコール伸長モノマー５７は、化合物６２を提供するために、キャッピング試薬と反応させてもよい。キャッピング試薬は、上記のように様々なキャッピング試薬であってよい。化合物６２は、ブロッキング部分Ｂ2を取り除き、そして第２級アルコールキャッピングモノマー６３を提供するためにＢ2脱ブロッキング試薬と反応させてもよい。第Ｂ2脱ブロッキング試薬は、当業者には理解されるように、パラジウム／活性炭触媒の存在下で、Ｈ2を含むがそれに限定されない様々な脱ブロッキング試薬であってよい。第２級アルコールキャッピングモノマーは、第１級アルコールキャッピングモノマーメシレート６４を提供するために、メタンスルホニルクロリドと反応させてもよい。図１１に示した実施形態はキャッピングモノマーの合成を示しているが、キャッピングポリマーを提供するために類似の反応を実施できることが理解されなければならない。
一般に、鎖伸長は、様々な一様なポリプロピレン鎖を提供するために第１級アルコール伸長モノマー５７のような第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーと第１級アルコール伸長モノマーメシレート５５のような第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーメシレートとを反応させることによって、または第２級アルコール伸長モノマー５４のような第２級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーと第２級アルコール伸長モノマーメシレート５８のような第２級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーメシレートとを反応させることによって達成できる。
例えば、図１３では、第１級アルコール伸長モノマーメシレート５５は、ダイマー化合物６５を提供するために、第１級アルコール伸長モノマー５７と反応させる。あるいはまた、第２級アルコール伸長モノマーメシレート５８が、ダイマー化合物６５を提供するために、第２級アルコール伸長モノマー５４と反応させられてもよい。ダイマー化合物６５上のＢ1ブロッキング部分は、第１級アルコール伸長ダイマー６６を提供するために、上記のようにＢ1脱ブロッキング試薬を使用して除去されていてもよい。第１級アルコール伸長ダイマー６６は、第２級アルコール伸長ダイマーメシレート６７を提供するために、メタンスルホニルクロリドと反応させてもよい。あるいはまた、ダイマー化合物６５上のＢ2ブロッキング部分が、第２級アルコール伸長ダイマー６９を提供するために、上記のようにＢ2脱ブロッキング試薬を使用して除去されていてもよい。第２級アルコール伸長ダイマー６９は、第１級アルコール伸長ダイマーメシレート７０を提供するために、メタンスルホニルクロリドと反応させてもよい。
当業者には理解されるように、鎖伸長プロセスは様々な他の鎖長を達成するために繰り返すことができる。例えば、図１３に示したように、第１級アルコール伸長ダイマー６６は、テトラマー化合物７２を提供するために、第１級アルコール伸長ダイマーメシレート７０と反応させる。図１３にさらに示したように、一般鎖伸長反応スキームには、一様なポリプロピレンポリマー７５を提供するために、第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマー７３と第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーメシレート７４とを反応させるステップが含まれる。ｍおよびｎの数値は、各々０〜１，０００以上の範囲であってよい。好ましくは、ｍおよびｎは各々０〜５０である。図１３に示した実施形態は、第１級アルコール伸長モノマーおよび／またはポリマーが第１級アルコール伸長モノマーおよび／またはポリマーメシレートと反応させられているのを示しているが、第２級アルコール伸長モノマーおよび／またはポリマーと第２級アルコール伸長モノマーおよび／またはポリマーメシレートとを使用して類似の反応を実施できることが理解されなければならない。
第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーの一端または第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーメシレートの一端は、キャッピングされた一様なポリプロピレン鎖を提供するために、各々第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーメシレートまたは第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーと反応させてもよい。例えば、図１２に示したように、第１級アルコール伸長ダイマーメシレート７０が、キャッピング／ブロックされた第１級アルコール伸長トリマー７１を提供するために、第１級アルコールキャッピングモノマー６０と反応させる。当業者には理解されるように、Ｂ1ブロッキング部分を取り除いて、結果として生じたキャッピングされた第１級アルコール伸長トリマーは、キャッピングされたトリマー７１の鎖を伸長させるために第１級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーメシレートと反応させてもよい。
第２級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーの一端または第２級アルコール伸長モノマーもしくはポリマーメシレートの一端は、キャッピングされた一様なポリプロピレン鎖を提供するために、各々第２級アルコールキャッピングモノマーもしくはポリマーメシレートまたは第２級アルコールキャッピングモノマーもしくはポリマーと反応させてもよい。例えば、図１２に示したように、第２級アルコール伸長ダイマーメシレート６７が、キャッピング／ブロックされた第１級アルコール伸長トリマー６８を提供するために、第２級アルコールキャッピングモノマー６３と反応させる。Ｂ2ブロッキング部分を上記のように取り除いて、結果として生じたキャッピングされた第２級アルコール伸長トリマーは、キャッピングされたトリマー６８の鎖を伸長させるために第２級アルコール伸長モノマーメシレートと反応させてもよい。図１２に示した合成はトリマーを提供するためのダイマーとキャッピングモノマーとの反応を示しているが、一様なポリプロピレングリコール部分の合成におけるいずれかの時点にキャッピングプロセスが実施されていてもよい、あるいはまたキャッピングされていない一様なポリプロピレングリコール部分が提供されていてもよいことが理解されなければならない。図１２に示した実施形態はキャッピングモノマーとの合成によるポリブチレンオリゴマーのキャッピングを示しているが、本発明のポリブチレンオリゴマーは図１１において上記で記載したキャッピング試薬を使用して直接に（すなわち、キャッピングモノマーの添加を行わずに）キャッピングされていてもよいことが理解されなければならない。
本発明の実施形態による一様なポリプロピレングリコール部分は、ポリエチレングリコール部分に関して本明細書に記載したものを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な方法によってカルシトニン薬剤、カルボン酸のような親油性部分、および／またはその他の部分に結合されていてもよい。
本発明の実施形態によると、親油性部分は、当業者には理解されるような親油性部分である。親油性部分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖アルキル部分である、または飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝鎖脂肪酸部分である。親油性部分がアルキル部分である場合は、それは１〜２８個の炭素原子を有する直鎖の飽和もしくは不飽和アルキル部分であるのが好ましい。より好ましくは、アルキル部分は２〜１２個の炭素原子を有する。親油性部分が脂肪酸部分である場合は、それは２〜１８個の炭素原子を有する直鎖の飽和もしくは不飽和である天然脂肪酸部分であるのが好ましい。より好ましくは、脂肪酸部分は３個〜１４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸部分は少なくとも４個、５個もしくは６個の炭素原子を有する。
本発明の実施形態によると、スペーサー部分、Ｇ、Ｇ’およびＧ”は、当業者には理解されるようなスペーサー部分である。スペーサー部分は、好ましくは糖、コレステロールおよびグリセリン部分からなる群から選択される。好ましくは、これらの実施形態のオリゴマーにはスペーサー部分は含まれない（すなわち、ｋ、ｍおよびｎは０であることが好ましい）。
本発明のこれらの実施形態によると、リンカー部分、Ｌは、当業者には理解されるようにオリゴマーと薬剤とを結合させるために使用することができる。リンカー部分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸部分からなる群から選択される。
本発明のこれらの実施形態によると、末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であり、そしてより好ましくは低級アルキルもしくは低級アルコキシ部分である。最も好ましくは、末端部分はメチルもしくはメトキシである。末端部分は、好ましくはアルキルもしくはアルコキシ部分であるが、当業者には理解されるように、末端部分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない様々な部分であってよいと理解されなければならない。
本発明のこれらの実施形態によると、式Ａの構造の括弧で囲まれた部分によって表されるオリゴマーは、カルシトニン薬剤に共有結合されている。一部の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能な結合（例、エステル結合もしくはカーボネート結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能な結合は、プロドラッグとして作用するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供することができる。例えば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が不活性である（すなわち、抱合体にはカルシトニン薬剤の主要作用機序を通して身体へ作用を及ぼす能力が欠如している）ある例では、活性薬を提供するために１以上のオリゴマーがそれらの各カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体から開裂されるように所定期間にわたってカルシトニン薬剤を投与することで、加水分解可能な結合は徐放性作用もしくは制御放出性作用を提供することができる。他の実施形態では、カルシトニン薬剤は加水分解可能でない結合（例、カルバメート結合、アミド結合、もしくはエーテル結合）を利用してオリゴマーに結合されている。加水分解可能でない結合の使用は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体が長時間、好ましくは少なくとも２時間にわたり血流中で循環させることが所望の場合に好ましいことがある。結合部分、Ｂは、当業者には理解されるように、オリゴマーをカルシトニン薬剤と共有結合させるために使用できる様々な結合部分であってよい。結合部分は、好ましくは共有結合、エステル部分、カーボネート部分、カルバメート部分、アミド部分および第２級アミン部分からなる群から選択される。
変数ｐは、１からカルシトニン薬剤上の求核性残基数までの整数である。ｐが２以上であるときは、２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）が、該薬剤に結合されている。本発明のこれらの実施形態によると、複数であるオリゴマーは同一である。複数のオリゴマーが薬剤に結合させられる場合は、１以上のオリゴマーを加水分解可能な結合により該薬剤に結合させ、そして１以上のオリゴマーを加水分解可能でない結合により該薬剤に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーを該薬剤に結合しているすべての結合が加水分解可能であってよいが、しかし、例えば１以上のオリゴマーが本体における加水分解によって該薬剤から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが本体における加水分解によって該薬剤から緩徐に除去されるように、様々な程度の加水分解性を有していてもよい。カルシトニン薬剤がサケカルシトニンであるときは、ｐは１もしくは２であるのが好ましく、そして２であるのがより好ましい。
オリゴマーは、求核性ヒドロキシル官能基および／またはアミノ官能基を含むがそれらに限定されないカルシトニン薬剤の様々な求核性残基でカルシトニン薬剤に結合されていてもよい。カルシトニン薬剤がポリペプチドである場合は、ポリペプチドの例えばセリンおよび／またはチロシン残基で求核性ヒドロキシル官能基が見いだされ、例えばヒスチジンおよび／またはリシン残基、および／または１以上のＮ−末端で求核性アミノ官能基が見いだされることがある。オリゴマーがカルシトニンポリペプチドの１以上のＮ−末端に結合されている場合は、この結合は好ましくは第２級アミンを形成する。カルシトニン薬剤がサケカルシトニンである場合は、例えばオリゴマーはＬｙｓ11、Ｌｙｓ18および／またはＮ−末端のアミノ官能基を含むサケカルシトニンのアミノ官能基に結合されていてもよい。１以上のオリゴマーがサケカルシトニンに結合されていてもよいが、オリゴマーがＬｙｓ11およびＬｙｓ18のアミノ官能基に結合されているジコンジュゲートされたサケカルシトニンについては、例えば向上した血清中カルシウム濃度低下能力のようなより高い生体有効性が観察される。
混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、様々な方法によって合成することができる。例えば、カルボン酸およびポリエチレングリコールからなるオリゴマーの混合物は、オリゴマーの混合物を得るのに十分な条件下で、カルボン酸の混合物をポリエチレングリコールの混合物と接触させることによって合成される。混合物のオリゴマーは、その後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体を提供するために、それらがカルシトニン薬剤と反応することができるように活性化される。各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の１つの実施形態は、図３に示し、下記の実施例１１〜実施例１８に記載した。各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図４に示し、下記の実施例１９〜実施例２４に記載した。各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のまた別の実施形態は、図５に示し、下記の実施例２５〜実施例２９に記載した。各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図６に示し、下記の実施例３０〜実施例３１に記載した。各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図７に示し、下記の実施例３２〜実施例３７に記載した。各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のまた別の実施形態は、図８に示し、下記の実施例３８に記載した。各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路のさらに別の実施形態は、図９に示し、下記の実施例３９に記載した。各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物を提供するための合成経路の別の実施形態は、図１０に示し、下記の実施例４０に記載した。
各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を得るのに十分な条件下で、混合物中の各薬剤が同一の分子量を有するカルシトニン薬剤の混合物と反応させる。好ましい合成については、下記の実施例４１に記載した。当業者には理解されるように、反応条件（例、選択されたモル比、溶媒混合物および／またはｐＨ）は、各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物とカルシトニン薬剤の混合物との反応の結果として生じるカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物が、各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有する抱合体の混合物であるように制御することができる。例えば、リシンのアミノ官能基でのコンジュゲートは、反応溶液のｐＨをリシンのｐＫa未満に維持することによって抑制することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、混合物中の各抱合体が同一数の分子量を有し、そして式Ａの構造を有する例えばモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のようなカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、例えばＨＰＬＣを利用して分離および単離することができる。特定の単離された抱合体のコンジュゲートの程度（例、単離分子がモノ抱合体、ジ抱合体、もしくはトリ抱合体のいずれであるか）は、当業者には理解されるように、質量分析法を含むがそれに限定されない様々な技術を利用して決定および／または検証することができる。特定の抱合体の構造（例、オリゴマーがサケカルシトニンモノ抱合体のＬｙｓ11、Ｌｙｓ18またはＮ−末端のいずれにあるか）は、当業者には理解されるように、配列解析、ペプチドマッピング、選択的な酵素分解、および／またはエンドペプチダーゼ開裂を含むがそれに限定されない様々な技術を利用して決定および／または検証することができる。
当業者には理解されるように、カルシトニン薬剤上の１以上の反応部位は、例えば、カルシトニン薬剤を例えばＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、もしくはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）（Ｎ−ＦＭＯＣ）のような適切なブロッキング試薬と反応させることによってブロックすることができる。このプロセスは、例えば、カルシトニン薬剤がポリペプチドであり、ポリペプチドのＮ−末端でオリゴマーを有する不飽和抱合体（すなわち、全部の求核性残基がコンジュゲートされてはいない抱合体）を形成することが所望の場合に好ましいことがある。このようなブロッキング後、ブロックされたカルシトニン薬剤の混合物は、１以上の求核性残基に結合したオリゴマーを有し、そして他の求核性残基に結合したブロッキング部分を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、混合物中の各オリゴマーが同一の分子量を有し、そして式Ａのオリゴマーの構造を有する活性化オリゴマーの混合物と反応させてもよい。コンジュゲーション反応後、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体は、当業者には理解されるように、脱ブロックすることができる。必要であれば、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、その後混合物中の各オリゴマーが同一数の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を提供するために、上記で記載したように分離することができる。あるいはまた、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、脱ブロッキングの前に分離することができる。
本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは従来型混合物の特性と比較して向上した特性を有する。例えば、混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは血清中カルシウム濃度を少なくとも５％低下させることができる。好ましくは、抱合体の混合物は、血清中カルシウム濃度を少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％もしくは１４％低下させることができる。より好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも１５％、１６％、１７％、１８％もしくは１９％低下させることができ、そして最も好ましくは、抱合体の混合物は血清中カルシウム濃度を少なくとも２０％低下させることができる。
別の実施例として、混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤のキモトリプシンおよび／またはトリプシン各々による分解に対する抵抗性と比較して、キモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。キモトリプシンまたはトリプシンに対する抵抗性は、下記の実施例５１で略述した手法に類似する手法を使用して試験される分子を適切な酵素中で消化させたときに残っている百分率に一致する。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１５％大きい、そして最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のキモトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい。好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約１０％大きい。より好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約２０％大きい、そして、最も好ましくは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性は、オリゴマーとコンジュゲートされていないカルシトニン薬剤の混合物のトリプシンによる分解に対する抵抗性より約３０％大きい。
さらにまた別の実施例として、混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくはオリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より高い生体有効性を有する。特定化合物の生体有効性は、その曲線下面積（ＡＵＣ）値に一致する。好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約５％高い。より好ましくは、混合物の生体有効性は、オリゴマーに結合されていないカルシトニン薬剤の生体有効性より約１０％高い。
さらに別の実施例として、混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビボ活性より高いインビボ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、例えばＨ．Ｒ．Ａｌｌｃｏｃｋ ＆ Ｆ．Ｗ．Ｌａｍｐｅ，「現代高分子化学（ＣＯＮＴＥＭＰＯＲＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」，３９４−４０２（第２版，１９９１）に記載されているようにゲル透過クロマトグラフィーのようなサイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない様々な方法によって測定できる。
別の実施例として、混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のインビトロ活性より高いインビトロ活性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれには限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物のキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対するキモトリプシンおよび／またはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。
さらに別の実施例として、混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と同一の数平均分子量を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の多分散混合物の被験体間変動より低い被験体間変動を有する。当業者には理解されるように、混合物の数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーを含むがそれに限定されない様々な方法によって測定できる。被験体間変動は、当業者には理解されるように、様々な方法によって入手できる。被験体間変動は、好ましくは次のように計算する。用量反応曲線下面積（ＡＵＣ）（すなわち用量反応曲線とベースライン値との間の面積）を各被験体について決定する。全被験体についての平均ＡＵＣは、各被験体のＡＵＣを合計し、この合計を被験体の数で割ることによって決定する。その後、被験体のＡＵＣと平均ＡＵＣとの差の絶対値を、各被験体について決定する。入手した差の絶対値を合計して、被験体間変動を表す数値を得る。低い数値は低い被験体間変動を表し、高い数値は高い被験体間変動を表す。
本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、好ましくは２つもしくは３つ以上の上記の向上した特性を有する。より好ましくは、本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、３つもしくは４つ以上の上記の向上した特性を有する。最も好ましくは、本発明の実施形態による混合物中の各抱合体が同一の分子量を有し、そして式Ａの構造を有するカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、４つもしくは５つ以上の上記の向上した特性を有する。
本発明の実施形態による抱合体混合物を含む医薬組成物もまた提供される。上記で記載したカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、既知の技術により医薬担体に入れて投与するために調製できる。例えば、「レミントン、製薬の科学および実践、第９版、１９９５年（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（９ｔｈ Ｅｄ．１９９５））」を参照されたい。本発明の実施形態による医薬組成物の製造においては、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は典型的には、特に医薬的に許容可能な担体と混合される。担体は、医薬組成物中のあらゆる他の成分と適合するという意味において許容できなければならず、そして患者にとって有害であってはならない。担体は、固体もしくは液体、またはその両方であってよく、そして好ましくは例えば錠剤のような単位用量製剤としてのカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を用いて調製されるが、これはカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物の重量で約０．０１％もしくは０．５％〜約９５％もしくは９９％含んでいてよい。医薬組成物は、任意で１以上の補助成分を含めて、構成成分を混合することを含むがそれに限定されない周知のいずれかの製薬技術によって調製できる。
本発明の実施形態による医薬組成物には、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入投与（例、エーロゾルを介して）、口内（例、舌下）投与、膣投与、非経口投与（例、皮下投与、筋内投与、皮内投与、関節内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、脳内投与、動脈内投与、もしくは静脈内投与）、局所投与（すなわち、気道表面を含む皮膚表面および粘膜表面の両方）および経皮投与が含まれるが、いずれか所定の症例において最も適切な経路は治療されている状態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物の性質に依存するであろう。
経口投与のために適切な医薬組成物は、各々が散剤もしくは顆粒剤として；水溶液もしくは非水溶液中の液剤もしくは懸濁剤として；または水中油型もしくは油中水型乳剤として規定量のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を含有する例えばカプセル剤、カシェ剤、トローチ剤、もしくは錠剤のような個別単位で提示することができる。このような製剤は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物と適切な担体（上記のような１以上の補助成分を含有することができる）を結び付けるステップを含むいずれか適切な製薬方法によって調製できる。一般に、本発明の実施形態による医薬組成物は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を液体もしくは微細に粉砕した固体担体、またはその両方と一様かつ密接に混合し、そして必要であれば、結果として生じた混合物を成形することよって調製される。例えば、錠剤は、任意で１以上の補助成分と一緒に、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を含有する散剤もしくは顆粒剤を圧縮もしくは成型することによって調製できる。圧縮錠剤は、適切な機械で、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または界面活性剤／分散剤と混合された散剤もしくは顆粒剤のような易流動性形にある混合物を圧縮することによって調製できる。成型錠剤は、不活性液状結合剤で湿潤させた粉末状化合物を適切な機械で成型することによって製造できる。
口内（舌下）投与のために適した医薬組成物には、通常は蔗糖およびアカシアもしくはトラガカントである風味を付けた基剤中にカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を含むトローチ剤、および例えばゼラチンおよびグリセリンもしくは蔗糖およびアカシアのような不活性基剤中にカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を含む香錠が含まれる。
非経口投与のために適切な本発明の実施形態による医薬組成物は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物の無菌の水溶性注射液もしくは非水溶性注射液を含むが、これらの製剤は好ましくは予定されるレシピエントの血液と等張性である。これらの製剤は、組成物を予定されるレシピエントの血液と等張性にさせる抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含むことができる。水性および非水性の無菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含むことができる。組成物は、例えば密封アンプルおよびバイアルのような単回投与もしくは複数回投与容器で提示することができる、そして例えば使用直前に生理食塩液もしくは注射水のような無菌液状担体の添加だけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時注射液および懸濁液は、上記に記載した種類の無菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製できる。例えば、密封容器中の単回投与形態にあるカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を含む注射可能な安定性無菌組成物を提供できる。カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物は、それを被験体に注射するために適切な液状組成物を形成するために適切な医薬的に許容可能な担体を用いて復元することのできる凍結乾燥物の形状で提供される。単位用量は、典型的には約１０ｍｇ〜約１０ｇのカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を含む。カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物が実質的に非水溶性である場合は、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を水性担体中に乳化させるために十分な量で生理学的に許容される十分量の乳化剤を使用することができる。１つのそのような有用な乳化剤はホスファチジルコリンである。
直腸投与のために適切な医薬組成物は、好ましくは単位用量座剤として提示される。これらは、カルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を例えばカカオ脂のような１以上の従来型固形担体と混合し、そしてその後結果として生じた混合物を成形することよって調製することができる。
皮膚への局所投与のために適切な医薬組成物は、好ましくは軟膏、クリーム剤、ローション剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エーロゾル剤もしくは油剤の形状を取る。使用できる担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮吸収増強剤、およびそれらの２つもしくは３つ以上の組み合せが含まれる。
経皮的投与のために適切な医薬組成物は、長期間に渡りレシピエントの皮膚と密接な接触を維持するために適した個別のパッチとして提示することができる。経皮的投与のために適した組成物は、さらにイオントフォレーシス（例えば、「製薬学研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３（６）：３１８（１９８６）」を参照）によって送達することができ、典型的にはカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物の任意緩衝水溶液の形状を取る。適切な製剤は、クエン酸もしくはｂｉｓ／ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含有し、さらに０．１〜０．２Ｍの有効成分を含有する。
有効量のこのような医薬組成物を投与することによりこのような治療を必要とする被験体における骨疾患を治療する方法もまた提供される。骨疾患は、過度の破骨細胞性骨吸収および／または高カルシウム血性血清作用を特徴とする。本発明の方法によって治療および／または予防することのできる骨疾患には、骨粗鬆症、ページェット病、および低カルシウム血症が含まれるが、それらに限定されない。
有効量のいずれかのカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物、本発明の範囲内にあるその使用は、混合物毎に、そして患者毎にいくらかは変化し、そして患者の年齢および状態ならびに送達経路のような要素に依存するであろう。このような用量は、当業者には知られている日常的な薬理学的方法によって決定できる。一般的提案として、全重量をカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物の重量に基づいて計算したときに、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇは治療有効性を有するであろう。より高レベルでの毒物性に関する懸念は、全重量を有効基剤の重量に基づいて計算したときに、静脈内用量を例えば約１０ｍｇ／ｋｇまでのような低いレベルへ制限することがある。経口投与のためには約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまでの用量を使用できる。典型的には、筋内投与のためには約０．５ｍｇ／５ｍｇ／ｋｇまでの用量を使用できる。投与頻度は、通常は１日当たり１、２、もしくは３回、またはその状態を管理するための必要に合わせる。あるいはまた、薬剤−オリゴマー抱合体は持続性注入によって投与されていてもよい。治療期間は、治療されている骨疾患のタイプに依存し、そして患者が生きている全期間にわたってよい。
本発明の実施形態による抱合体混合物を合成する方法もまた提供される。次の合成経路の実施形態は単分散混合物の合成に向けられているが、類似の合成経路をして本発明の実施形態による他のカルシトニン薬剤−オリゴマー抱合体の混合物を合成することができる。
ポリエチレングリコール部分を含むポリマーの実質的に単分散の混合物は次の反応１に示したように提供される。
Figure 0004272510
Ｒ1はＨもしくは親油性部分である。Ｒ1は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、芳香族部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分のエステル、コレステリル、もしくはアダマンチルであるのが好ましい。Ｒ1は、Ｈ、低級アルキル、もしくは芳香族部分であるのがより好ましい。Ｒ1は、Ｈ、メチル、もしくはベンジルであるのが最も好ましい。
式Ｉでは、ｎは１〜２５である。好ましくは、ｎは１〜６である。
Ｘ+は陽性イオンである。好ましくは、Ｘ+は、ＰＥＧ上のヒドロキシル部分をイオン化することのできる例えば強塩基のような化合物中のいずれかの陽性イオンである。陽性イオンの例には、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、およびタリウムイオンが含まれるが、それらに限定されない。
Ｒ2はＨもしくは親油性部分である。Ｒ2は、直鎖もしくは分枝鎖アルキル、アリールアルキル、芳香族部分、脂肪酸部分、もしくは脂肪酸部分のエステルであるのが好ましい。Ｒ2は、低級アルキル、ベンジル、１〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸部分、もしくは１〜２４個の炭素原子を有する脂肪酸部分のエステルであるのがより好ましい。Ｒ2は、メチル、１〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸部分、もしくは１〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸部分のエステルであるのが最も好ましい。
式ＩＩでは、ｍは１〜２５である。好ましくは、ｍは１〜６である。
Ｍｓは、メシレート部分（すなわち、ＣＨ3Ｓ（Ｏ2）−）である。
反応式１で例示したように、式Ｉの構造を有する化合物の混合物は、ポリエチレングリコール部分を含み、そして式ＩＩＩの構造を有するポリマーの混合物を提供するために、式ＩＩの構造を有する化合物の混合物と反応させる。式Ｉの構造を有する化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式Ｉの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％が同一の分子量を有し、そしてより好ましくは、式Ｉの化合物の混合物は単分散混合物である。式ＩＩの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＩＩの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％は同一の分子量を有し、そしてより好ましくは、式ＩＩの化合物の混合物は単分散混合物である。式ＩＩＩの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％は同一の分子量を有する。より好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物は、単分散混合物である。
反応１は、約０℃〜約４０℃で実施されるのが好ましく、約１５℃〜約３５℃で実施されるのがより好ましく、そして室温（およそ２５℃）で実施されるのが最も好ましい。
反応１は、当業者には理解されるように、様々な期間にわたり実施されていてもよい。反応１は、好ましくは約０．２５時間、０．５時間もしくは０．７５時間および約２、４もしくは８時間にわたり実施される。
反応１は、好ましくは例えばＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、テトラヒドロフラン（ＴＫＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン、Ｎ−メチルピロリジノン、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、１，２−ジクロロベンゼン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、またはそれらの混合物を含むがそれらに限定されない非プロトン性溶媒中で実施される。より好ましくは、溶媒はＤＭＦ、ＤＭＡもしくはトルエンである。
式Ｉの化合物対式ＩＩの化合物のモル比は、約１：１より大きいのが好ましい。より好ましくは、モル比は少なくとも約２：１である。過剰な式Ｉの化合物を提供することによって、式ＩＩの化合物の実質的に全部が反応させられことを保証でき、これは下記のような式ＩＩＩの化合物の回収に役立つ可能性がある。
式Ｉの化合物は、好ましくは次の反応２に示したように調製する。
Figure 0004272510
Ｒ1およびＸ+は上記の通りであり、そして式ＩＶの化合物の混合物は実質的に単分散の混合物であり、好ましくは、式ＩＶの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％は同一の分子量を有する。より好ましくは、式ＩＶの化合物の混合物は、単分散混合物である。
式ＩＶの化合物のＰＥＧ部分上のヒドロキシル部分をイオン化できる様々な化合物は、当業者には理解されるであろう。ヒドロキシル部分をイオン化できる化合物は、強塩基であるのが好ましい。より好ましくは、ヒドロキシル部分をイオン化できる化合物は、水素化ナトリウム、水素化カリウム、ｔ−ナトリウムブトキシド、ｔ−カリウムブトキシド、ブチルリチウム（ＢｕＬｉ）、およびリチウムジイソプロピルアミンからなる群から選択される。ヒドロキシル部分をイオン化できる化合物は、水素化ナトリウムであるのがより好ましい。
式ＩＶの化合物のＰＥＧ部分上のヒドロキシル部分をイオン化できる化合物対式ＩＶの化合物のモル比は、少なくとも約１：１であるのが好ましく、そして少なくとも約２：１であるのがより好ましい。過剰なヒドロキシル部分をイオン化できる化合物を提供することによって、式Ｉの化合物を提供するために式ＩＶの化合物の実質的に全部が反応させることが保証される。したがって、式ＩＶの化合物および式Ｉの化合物の両方が反応生成物混合物中に存在する場合に発生する可能性がある分離の困難は回避できる。
反応２は、約０℃〜約４０℃で実施されるのが好ましく、約０℃〜約３５℃で実施されるのがより好ましく、そして約０℃〜室温（およそ２５℃）で実施されるのが最も好ましい。
反応２は、当業者には理解されるように、様々な期間にわたり実施されていてもよい。反応２は、好ましくは約０．２５、０．５もしくは０．７５時間および約２、４もしくは８時間にわたり実施される。
反応２は、好ましくは例えばＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、１，２−ジクロロベンゼン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、もしくはそれらの混合物を含むがそれらに限定されない非プロトン性溶媒中で実施される。より好ましくは、溶媒はＤＭＦ、ジクロロメタンもしくはトルエンである。
式ＩＩの化合物は、好ましくは次の反応３に示したように調製する。
Figure 0004272510
Ｒ2およびＭｓは上記の通りであり、そして式Ｖの化合物は式Ｖの化合物の実質的に単分散の混合物として提示される。好ましくは、式Ｖの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６、９７、９８もしくは９９％は同一の分子量を有する。および、より好ましくは、式Ｖの化合物の混合物は、単分散混合物である。
Ｑはハロゲン化物、好ましくは塩化物もしくはフッ化物である。
ＣＨ3Ｓ（Ｏ2）Ｑは、ハロゲン化メタンスルホニルである。ハロゲン化メタンスルホニルは、塩化メタンスルホニルもしくはフッ化メタンスルホニルであるのが好ましい。より好ましくは、ハロゲン化メタンスルホニルは塩化メタンスルホニルである。
ハロゲン化メタンスルホニル対式Ｖの化合物のモル比は、好ましくは約１：１であり、そしてより好ましくは少なくとも約２：１である。過剰なハロゲン化メタンスルホニルを提供することによって、式ＩＩの化合物を提供するために式Ｖの化合物の実質的に全部が反応させることが保証される。したがって、式Ｖの化合物および式ＩＩの化合物の両方が反応生成物混合物中に存在する場合に発生する可能性がある分離の困難は回避できる。
反応３は、約−１０℃〜約４０℃で実施されるのが好ましく、約０℃〜約３５℃で実施されるのがより好ましく、そして０℃〜室温（およそ２５℃）で実施されるのが最も好ましい。
反応３は、当業者には理解されるように、様々な期間にわたり実施されていてもよい。反応３は、好ましくは約０．２５時間、０．５時間もしくは０．７５時間および約２、４時間もしくは８時間にわたり実施される。
反応３は、モノメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノイソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、モノ−ｎ−ブチルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、モノシクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、もしくはそれらの混合物を含むがそれらに限定されない脂肪族アミンの存在下で実施されるのが好ましい。より好ましくは、脂肪族アミンはトリエチルアミンのような第３級アミンである。
当業者には理解されるように、様々な式Ｖの化合物の実質的に単分散の混合物は市販で入手できる。例えばＲ2はＨもしくはメチルであるとき、式Ｖの化合物は、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在のアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社；スイスのフルカ（Ｆｌｕｋａ）社、および／またはオレゴン州ポートランド所在のＴＣＩアメリカ社から市販で入手できる各々ＰＥＧもしくはｍＰＥＧ化合物である。
Ｒ2が例えば高級アルキル、脂肪酸、脂肪酸部分のエステル、コレステリル、もしくはアダマンチルのような親油性部分である場合は、式Ｖの化合物は当業者には理解されるような様々な方法によって提供できる。式Ｖの化合物は、好ましくは次のように提供される。
Figure 0004272510
Figure 0004272510
Ｒ2は、親油性部分であり、好ましくは高級アルキル、脂肪酸エステル、コレステリル、もしくはアダマンチルであり、より好ましくは脂肪酸の低級アルキルエステルであり、そして最も好ましくは１〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸のエチルエステルである。
Ｒ3は、当業者には理解されるように、Ｈ、ベンジル、トリチル、テトラヒドロピラン、もしくはその他のアルコール保護基である。
Ｘ2 +は、Ｘ+に関して上記に記載したように陽性イオンである。
ｍの数値は上記に記載した通りである。
反応４に関して、式ＶＩの化合物の混合物は、反応１を参照しながら記載した条件に類似する反応条件下で、式ＶＩＩの化合物の混合物と反応させる。式ＶＩの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＶＩの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％は同一の分子量を有する。より好ましくは、式ＶＩの化合物の混合物は、単分散混合物である。式ＶＩＩの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式ＶＩの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％は同一の分子量を有する。より好ましくは、式ＶＩＩの化合物の混合物は、単分散混合物である。
反応５に関して、式ＶＩＩＩの化合物は、当業者には理解されるように様々な方法によってＲ3部分をアルコールへ転換させるために加水分解することができる。Ｒ3がベンジルもしくはトリチルである場合、加水分解は、当業者に理解されるようにパラジウム炭触媒の存在下でＨ2を利用して実施されるのが好ましい。当然ながら、Ｒ3がＨである場合、反応５は不要である。
式ＶＩの化合物は市販で入手できる、または反応３を参照しながら上記で記載した通りに提供できる。式ＶＩＩの化合物は、反応２を参照しながら上記で記載した通りに提供できる。
ＰＥＧ部分を含み、上記の式ＩＩＩの構造を有するポリマーの実質的に単分散の混合物は、ＰＥＧ鎖を伸長させるためにＰＥＧ部分を含む他の実質的に単分散の混合物とさらに反応させることができる。例えば、次のスキームを使用できる。
Figure 0004272510
Figure 0004272510
Ｍｓ、ｍおよびｎは反応１を参照しながら上記に記載した通りであり、ｐはｎおよびｍに類似する、そしてＸ2 +は、反応１を参照しながら上記に記載した通りにＸ+に類似する。Ｑは、反応３を参照しながら上記に記載した通りである。Ｒ2は、反応１を参照しながら上記に記載した通りであり、好ましくは低級アルキルである。Ｒ1はＨである。反応６は、反応３を参照しながら上記に記載した方法に類似する方法で実施される。反応７は、反応１を参照しながら上記に記載した方法に類似する方法で実施される。好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％が同一の分子量を有し、そしてより好ましくは、式ＩＩＩの化合物の混合物は単分散混合物である。式Ｘの化合物の混合物は、実質的に単分散の混合物である。好ましくは、式Ｘの化合物の混合物中の化合物の少なくとも約９６％、９７％、９８％もしくは９９％は同一の分子量を有し、そしてより好ましくは、式Ｘの化合物の混合物は単分散混合物である。
本発明の実施形態によるプロセスは図１に示したスキームにより例示したが、それについてこれから説明する。実質的単分散ポリエチレングリコール含有オリゴマーの合成は、実質的単分散ポリエチレングリコールのモノベンジルエーテル（１）の調製から開始する。過剰の市販で入手できる実質的単分散ポリエチレングリコールを、Ｃｏｕｄｅｒｔら（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１６（１）：１９−２６（１９８６））に記載された通りに水酸化ナトリウム水溶液の存在下で塩化ベンジルと反応させる。その後ＮａＨの添加によって１のナトリウム塩を調製し、そしてこのナトリウム塩はヒドロキシアルカノール酸のエステル（２）から合成されたメシレートと反応させる。メシレートの置換の生成物（３）は、アルコール（４）を入手するために接触水素添加を介して脱ベンジル化される。このアルコールのメシレート（５）は、塩化メタンスルホニルの添加によって調製でき、実質的に単分散のポリエチレングリコール誘導体のモノメチルエーテルのナトリウム塩との反応において求電子物質として使用でき、それによって伸長したエステル（６）を入手するために、オリゴマーのポリエチレングリコール部分が所望の長さへ伸長させられる。このエステルは塩基水溶液中の酸（７）へ加水分解させて、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応によって活性化エステル（８）へ転換させることができる。図１に示したオリゴマーはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化させられるが、本発明のオリゴマーを活性化させるためには、例えばパラ−ニトロフェニルクロロホルメート、フェニルクロロホルメート、３，４−フェニルジクロロホルメート、および３，４−フェニルジクロロホルメートのような活性フェニルクロロホルメート；トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｉｏｎ）；およびアセタール形成を含むがそれらに限定されない様々な他の試薬を使用できることが理解されなければならない。
さらに図１を参照すると、ｑは１〜２４である。好ましくは、ｑは１〜１８であり、そしてｑはより好ましくは４〜１６である。Ｒ4は、カルボン酸を提供するために加水分解を受けることのできる部分であり、Ｒ4は、低級アルキルであるのが好ましく、そしてエチルであるのがより好ましい。変数ｎおよびｍは、反応１を参照しながら上記に記載した通りである。
本明細書に記載した方法で使用したすべての出発原料は、市販で入手できる、または市販で入手できる出発原料を使用して当分野で知られている方法によって調製できる。
ここで、本発明を以下の実施例を参照しながら説明する。これらの実施例は本発明の態様を例示するためのものであり、請求項によって規定された本発明の範囲を限定しないと解釈されなければならない。
［実施例］
［実施例１〜１０］
実施例１〜１０における反応は、他に特に明記していない限り、マグネチックスターラーを使用して窒素下で実施した。「ワークアップ（Ｗｏｒｋ−ｕｐ）」とは、有機溶媒を用いての抽出、飽和ＮａＣｌ溶液を用いての有機相の洗浄、乾燥（ＭｇＳＯ4）、および蒸発（ロータリー・エバポレーター）を意味する。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル６０°Ｆ―２５４が事前に塗布されたメルク（Ｍｅｒｃｋ）社製ガラスプレートを用いて実施し、ヨウ素蒸気によりスポットを可視化した。すべての質量スペクトルは、コロラド州所在のコロラド州立大学高分子資源（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）によって測定され、ｍ／ｚ、（相対強度）の大きさで報告された。元素分析および融点測定は、テネシー州ノックスビル所在のガルブレイス・ラボラトリーズ（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社によって実施された。実施例１〜実施例１０は、図２に示したスキームを参照する。
［８−メトキシ−ｌ−（メチルスルホニル）オキシ−３，６−ジオキサオクタン（９）］
無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の非多分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル分子（４．００ｍＬ，４．１９ｇ，２５．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４２６ｍＬ，３．０９ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴中で冷却し、窒素雰囲気下に置いた。無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の塩化メタンスルホニル（２．３７ｍＬ，３．５１ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加用漏斗から滴下法で加えた。塩化物添加の完了１０分後、この反応混合液を氷浴から取り出し、室温になるのに任せた。この混合液をさらに１時間撹拌したが、その時点でＴＬＣ（溶出剤として１５％のＭｅＯＨを含むＣＨＣｌ3）でトリエチレングリコールモノメチルエーテルの残留は証明されなかった。
この反応混合液を別のジクロロメタン７５ｍＬを用いて希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3、水および食塩液を用いて連続的に洗浄した。この有機相をＮａＨＳＯ4の上方を通して乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して透明油として化合物９の非多分散混合物（５．３１ｇ，８６％）を得た。
［エチレングリコールモノメチルエーテル（１０）（ｍ＝４，５，６）］
無水ＤＭＦ（２５．７ｍＬ）中の非多分散化合物１１（３５．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｎ2雰囲気下で鉱油中のＮａＨの６０％分散液を少しずつ加え、そしてこの混合物を室温で１時間撹拌した。この塩１２に無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中の非多分散メシレート９（２３．３６）の溶液を１部分で加え、この混合液を室温で３．５時間撹拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（１２％ ＣＨ3ＯＨ−ＣＨＣｌ3）によって監視した。この反応混合液を等量の１ＮのＨＣｌを用いて希釈し、そして酢酸エチル（２×２０ｍＬ）を用いて抽出して廃棄した。水溶液の抽出およびワークアップにより、非多分散ポリマー１０が得られた（収率８２〜８４％）。
［３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサドコサノール（１０）（ｍ＝４）］
油；Ｒｆ ０．４６（メタノール：クロロホルム＝３：２２）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ15Ｈ32Ｏ8に対する計算値３４０．２１（Ｍ+＋ｌ）、実測値３４１．２。
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサペンタコサノール（１０）（ｍ＝５）］
油；Ｒｆ ０．４３（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ17Ｈ36Ｏ9に対する計算値３８４．２４（Ｍ+＋ｌ）、実測値３８５．３。
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７−ノナオキサオクタコサノール（１０）（ｍ＝６）］
油；Ｒｆ ０．４２（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ19Ｈ40Ｏ10に対する計算値４２８．２６（Ｍ+＋ｌ）、実測値４２９．３。
［２０−メトキシ−ｌ−（メチルスルホニル）オキシ−３，６，１２，１５，１８−ヘキサオキサエイコサン（１４）］
非多分散化合物１４は、９について記載した通りにアルコール１３（ｍ＝４）および塩化メタンスルホニルから油として定量的収率で入手した；Ｒｆ ０．４（酢酸エチル：アセトニトリル＝１：５）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ17Ｈ37Ｏ10に対する計算値４３３．２１（Ｍ+＋ｌ）、実測値４３３．４６９。
［エチレングリコールモノメチルエーテル（１５）（ｍ＝３，４，５）］
非単分散化合物１５は、化合物１０について上記に記載した方法を使用することによりジオールから調製した。
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０−デカオキサヘンエイコサノール（１５）（ｍ＝３）］
油；Ｒｆ ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ21Ｈ44Ｏ11に対する計算値４７２．２９（Ｍ+＋ｌ）、実測値４７２．２９。
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−ウンエカオキサテトラトリコサノール（１５）（ｍ＝４）］
油；Ｒｆ ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ23Ｈ48Ｏ12に対する計算値５１６．３１（Ｍ+＋ｌ）、実測値５１６．３１。
［３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサヘプタトリコサノール（１５）（ｍ＝５）］
油；Ｒｆ ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ ｍ／ｚ Ｃ25Ｈ52Ｏ13に対する計算値５６０．６７（Ｍ+＋ｌ）、実測値５６０．６７。
実施例１１〜実施例１８は、図３に示したスキームを参照する。
［ヘキサエチレングリコールモノベンジルエーテル（１６）］
４ｍＬの水に３．９９ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＮａＯＨを溶解させることで調製した水酸化ナトリウム水溶液を非多分散ヘキサエチレングリコール（２８．１７５ｇ，２５ｍＬ，１００ｍｍｏｌ）へ緩徐に加えた。塩化ベンジル（３．９ｇ，３０．８ｍｍｏｌ，３．５４ｍＬ）を加え、この反応混合液を撹拌しながら１００℃へ１８時間加熱した。その後、この反応混合液を冷却し、食塩水（２５０ｍＬ）を用いて希釈し、そして塩化メチレンを用いて抽出した（２００ｍＬ×２）。結合した有機層を食塩液により１回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4の上方を通して乾燥させ、そして真空中で暗褐色油へ濃縮した。粗生成物混合物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、勾配溶離：酢酸エチレンから９／１酢酸エチル／メタノール）により精製すると、黄色油として８．０９９ｇ（７０％）の非単分散化合物１６が産生した。
［エチル６−メチルスルホニルオキシヘキサノエート（１７）］
無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の非多分散エチル６−ヒドロキシヘキサノエート（５０．７６ｍＬ，５０．４１ｇ，２２７ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴中で冷却し、窒素雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（３４．４３ｍＬ，２４．９９ｇ，２４７ｍｍｏｌ）を加えた。無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の塩化メタンスルホニル（１９．１５ｍＬ，２８．３ｇ，２４７ｍｍｏｌ）の溶液を添加用漏斗から滴下法で加えた。この混合液を３時間半撹拌し、氷浴が溶けるにしたがって緩徐に室温になるに任せた。この混合液をシリカゲルに通して濾過し、そして濾液を水、飽和ＮａＨＣＯ3、水および食塩液を用いて連続的に洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4の上方を通して有機相を乾燥させ、濾過し、そして真空中で浅黄色油へ濃縮した。粗生成物の最終精製は、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１／１のヘキサン／酢酸エチル）により達成し、透明な無色油として非単分散生成物（４６．１３ｇ，８５％）を得た。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ ２３９（Ｍ＋Ｈ），１９３（Ｍ−Ｃ2Ｈ5Ｏ）。
［６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（１８）］
水素化ナトリウム（３．２２５ｇもしくは６０％油分散液，８０．６ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの無水トルエン中に懸濁させ、窒素雰囲気下に置き、そして氷浴中で冷却した。８０ｍＬの無水トルエン中の非多分散アルコール１６（２７．３ｇ，７３．３ｍｍｏｌ）の溶液をＮａＨ懸濁液に加えた。この混合液を０℃で３０分間撹拌し、室温になるに任せ、さらに５時間撹拌したところ、その時間内に混合物は透明褐色溶液になった。８０ｍＬの無水トルエン中の非多分散メシレート１７（１９．２１ｇ，８０．６ｍｍｏｌ）をＮａＨ／アルコール混合液に加え、そして結合した溶液を室温で３日間撹拌した。この反応混合液を５０ｍＬのメタノールを用いて急冷し、塩基性アルミナを通して濾過した。この濾液を真空中で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、勾配溶離：３／１酢酸エチレン／ヘキサンから酢酸エチル）により精製すると、浅黄色油として非単分散生成物（１６．５２ｇ，４４％）が産生した。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ ５１５（Ｍ＋Ｈ）。
［６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（１９）］
非多分散ベンジルエーテル１８（１．０３ｇ，２．０ｍｍｏｌ）を２５ｍＬのエタノール中へ溶解させた。この溶液に２７０ｍｇの１０％のＰｄ／Ｃを加え、この混合液を水素雰囲気下に置き、４時間攪拌したところ、その時点でＴＬＣは出発原料の完全な消失を示した。この反応混合液をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）５４５に通して濾過して触媒を除去し、そして濾液を真空中で濃縮すると透明油として非多分散の標題化合物（０．６７ｇ，７９％）が産生した。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ ４２５（Ｍ＋Ｈ），４４７（Ｍ＋Ｎａ）。
［６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メチルスルホニルエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（２０）］
非多分散アルコール１９（０．８３５ｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を３５ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、窒素雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（０．３０１ｍＬ，０．２１９ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を加え、この混合液を氷浴中で冷却した。２分間後、塩化メタンスルホニル（０．１６ｍＬ，０．２４８ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合液を０℃で１５分間、その後室温で２時間攪拌した。この反応混合液をシリカゲルに通して濾過して塩化トリエチルアンモニウムを除去し、そして濾液を水、飽和ＮａＨＣＯ3、水および食塩液を用いて連続的に洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4の上方を通して乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、９／１酢酸エチル／メタノール）により精製して、透明油として非多分散化合物２０（０．８１９ｇ，８３％）を得た。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ ５０３（Ｍ＋Ｈ）。
［６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）ヘキサン酸エチルエステル（２１）］
ＮａＨ（８８ｍｇの６０％油中分散液，２．２ｍｍｏｌ）をＮ2雰囲気下で無水トルエン（３ｍＬ）中に懸濁させ、０℃へ冷却した。トルエンを用いた共沸蒸留を介して乾燥させた非多分散ジエチレングリコールモノメチルエーテル（０．２６ｍＬ，０２６ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合液が室温に加温するに任せ、４時間攪拌したところ、その間に濁った灰色の懸濁液は透明な黄色になり、その後褐色に変色した。２．５ｍＬの無水トルエン中のメシレート２０（０．５０ｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で一晩攪拌した後、２ｍＬのメタノールを添加することによりこの反応液を急冷し、結果として生じた溶液をシリカゲルに通して濾過した。濾液を真空中で濃縮した。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ ４９９（Ｍ＋Ｈ），５２１（Ｍ＋Ｎａ）。予備クロマトグラフィー（シリカゲル、１９／３クロロホルム／メタノール）による追加の精製で、透明黄色油として非多分散生成物（０．３０２ｇ，５７％）が得られた。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ ５２７（Ｍ＋Ｈ），５４９（Ｍ＋Ｎａ）。
［６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）ヘキサン酸（２２）］
非多分散エステル２１（０．２５ｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を０．７１ｍＬの１ＮのＮａＯＨ中で１８時間攪拌した。１８時間後、この混合液を真空中で濃縮してアルコールを除去し、残留物をさらに１０ｍＬの水に溶解させた。２ＮのＨＣｌを用いてこの水溶液をｐＨ２へ酸性化させ、その生成物をジクロロメタン中で抽出した（３０ｍＬｘ２）。その後、結合した有機相は食塩液を用いて洗浄し（２５ｍＬ×２）、Ｎａ2ＳＯ4の上方を通して乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると黄色油として非多分散の標題化合物（０．１４７ｇ，６２％）が産生した。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ ４９９（Ｍ＋Ｈ），５２１（Ｍ＋Ｎａ）。
［６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル−エステル（２３）］
非多分散酸２２（０．２０９ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を４ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、既にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（５７．８ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（ｌ−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド）（９８．０ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）を含有する乾燥したフラスコにＮ2雰囲気下で加えた。この溶液を室温で一晩攪拌し、シリカゲルに通して濾過して過剰な試薬およびＥＤＣから形成された尿素を除去した。この濾液を真空中で濃縮すると暗黄色油（０．２３５ｇ，９４％）として非多分散生成物が得られた。ＦＡＢ ＭＳ：ｍ／ｅ ５９６（Ｍ＋Ｈ），６１８（Ｍ＋Ｎａ）。
実施例１９〜実施例２４は、図４に示したスキームを参照する。
［トリエチレングリコールモノメチルエーテルのメシレート（２４）］
氷浴中で０℃に冷却したＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）の溶液に非多分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル（２５ｇ，０．１５ｍｏｌ）を加えた。その後、トリエチルアミン（２９．５ｍＬ，０．２２ｍｏｌ）を加え、この溶液を０℃で１５分間攪拌し、この後に滴下法で塩化メタンスルホニル（１３．８ｍＬ，０．１８ｍｏｌ，２０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解させた）を加えた。この反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、室温へ加温するに任せ、その後２時間攪拌した。この粗反応混合液をセライトに通して濾過し（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した）、その後Ｈ2Ｏ（３００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ3（３００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（３００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4の上方を通して乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。この油を、その後乾燥を保証するために〜２時間、真空ライン上に置き、黄色油として非多分散の標題化合物（２９．１５ｇ，収率８０％）を得た。
［ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル（２５）］
ＴＨＦ（１Ｌ）中の非多分散テトラエチレングリコール（５１．５ｇ，０．２７ｍｏｌ）の溶液へｔ−カリウムブトキシド（１４．８ｇ，０．１３ｍｏｌ，３０分間にわたり少しずつ）を加えた。この反応混合液を１時間攪拌し、その後ＴＨＦ（９０ｍＬ）中に溶解させた２４（２９．１５ｇ，０．１２ｍｏｌ）を滴下法で加え、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライトに通して濾過し（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した）、乾燥するまで蒸発させた。この油をその後ＨＣｌ（２５０ｍＬ，１Ｎ）中に溶解させ、過剰な２４を除去するために酢酸エチル（２５０ｍＬ）を用いて洗浄した。残っている２４を除去するために、酢酸エチル（１２５ｍＬ）による追加の洗浄が必要になることがある。２５の大部分が水性相から除去されるまで、ＣＨ2Ｃｌ2（容量１２５ｍＬ）を用いて水性相を繰り返し洗浄した。初回抽出では２４、２５および二重結合副生成物を含むであろうから、ＨＣｌ（１２５ｍＬ，１Ｎ）を用いて逆抽出しなければならない。有機層を結合し、乾燥するまで蒸発させた。生じた油をその後ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解させ、２５が除去されるまでＨ2Ｏ（容量、５０ｍＬ）を用いて繰り返し洗浄した。総容量が５００ｍＬになるように水性フラクションを結合し、この溶液が濁るまでＮａＣｌを加え、その後ＣＨ2Ｃｌ2（２×５００ｍＬ）を用いて洗浄した。有機層を結合し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させると、油として非多分散の標題化合物（１６．９ｇ，収率４１％）が得られた。高純度を保証するために１以上の精製ステップを繰り返すのが望ましいことがある。
［８−ブロモオクタネート（Bromooctoanate）（２６）］
エタノール（１００ｍＬ）中の８−ブロモオクタン酸（５．０ｇ，２２ｍｍｏｌ）の溶液にＨ2ＳＯ4（０．３６ｍＬ，７．５ｍｍｏｌ）を加え、この反応液を加熱して攪拌しながら３時間環流させた。この粗反応混合液を室温へ冷却し、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させると、透明油（５．５ｇ，収率９８％）が得られた。
［ＭＰＥＧ７−Ｃ８エステル（２７）の合成］
エーテル（９０ｍＬ）中の非多分散化合物２５（３．０ｇ，８．８ｍｍｏｌ）の溶液にｔ−カリウムブトキシド（１．２ｇ，９．６ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合液を１時間攪拌した。その後、エーテル（１０ｍＬ）中に溶解させた非多分散化合物２６（２．４ｇ，９．６ｍｍｏｌ）を滴下法で加え、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライトに通して濾過し（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した）、乾燥するまで蒸発させた。生じた油を酢酸エチル中に溶解させ、Ｈ2Ｏで洗浄し（２×２００ｍＬ）、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル対酢酸エチル／メタノール、１０：１）を実施して、透明油として非多分散の標題化合物（０．８４３ｇ，収率１９％）を得た。
［ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸（２８）］
非多分散化合物２７の油（０．７０ｇ，１．４ｍｍｏｌ）へ１ＮのＮａＯＨ（２．０ｍＬ）を加え、この反応混合液を４時間攪拌した。この粗反応混合液を濃縮し、酸性化し（ｐＨ〜２）、ＮａＣｌを用いて飽和させ、そしてＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）を用いて洗浄した。有機層を結合し、ＮａＣｌを用いて飽和させ、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させると、透明油として非多分散の標題化合物（０．３５ｇ，収率５３％）が得られた。
［ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸（２９）の活性化］
非多分散ｍＰＥＧ７−Ｃ８酸（２８）（０．３ｌｇ，０．６４ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水塩化メチレン中に溶解させ、無水塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０７９ｇ，０．６９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ−ＨＣｌ（１３５．６ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この反応液を数時間攪拌し、その後１ＮのＨＣｌ、水を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過して濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィーにより精製し、濃縮すると透明油として非多分散の標題化合物が得られたので、これを真空により乾燥させた。
実施例２５〜実施例２９は、図５に示したスキームを参照する。
［１０−ヒドロキシデカノエート（３０）］
エタノール（１００ｍＬ）中の非多分散１０−ヒドロキシデカン酸（５．０ｇ，２６．５ｍｍｏｌ）の溶液にＨ2ＳＯ4（０．４３ｍＬ，８．８ｍｍｏｌ）を加え、この反応液を加熱して攪拌しながら３時間還流させた。この粗反応混合液を室温へ冷却し、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させると、透明油として非多分散の標題化合物（６．９ｇ，収率９８％）が得られた。
［１０−ヒドロキシデカノエートのメシレート（３１）］
ＣＨ2Ｃｌ2（２７ｍＬ）の溶液に非多分散１０−ヒドロキシデカノエート３０（５．６ｇ，２６ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で０℃に冷却した。その後トリエチルアミン（５ｍＬ，３７ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合液を０℃で１５分間攪拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬ）中に溶解させた塩化メタンスルホニル（２．７ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、氷浴を取り除き、この反応液をさらに２時間、室温で攪拌した。この粗反応混合液をセライトに通して濾過（ＣＨ2Ｃｌ2、８０ｍＬを用いて洗浄）し、濾液をＨ2Ｏ（１００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させると黄色油として非多分散の標題化合物（７．４２ｇ，収率９７％）が得られた。
［ＭＰＥＧ7−Ｃ10エステル（３２）］
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の非多分散ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル２５（２．５ｇ，７．３ｍｍｏｌ）の溶液に水素化ナトリウム（０．１９４ｇ，８．１ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合液を１時間攪拌した。その後、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解させた非多分散１０−ヒドロキシデカノエートのメシレート３１（２．４ｇ，８．１ｍｍｏｌ）を滴下法で加え、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライトに通して濾過し（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した）、乾燥するまで蒸発させた。生じた油を酢酸エチル中に溶解させ、Ｈ2Ｏ（２×２００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させ、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／メタノール、１０：１）にかけ、そしてさらにクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）にかけると透明油として非多分散の標題化合物（０．５７０ｇ，収率１５％）が得られた。
［ＭＰＥＧ7−Ｃ10酸（３３）］
非多分散のｍＰＥＧ7−Ｃ10エステル３２の油（０．５７０ｇ，１．１ｍｍｏｌ）へ１ＮのＮａＯＨ（１．６ｍＬ）を加え、この反応混合液を一晩攪拌した。この粗反応混合液を濃縮し、酸性化し（ｐＨ〜２）、ＮａＣｌを用いて飽和させ、そしてＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）を用いて洗浄した。有機層を結合し、ＮａＣｌ（２×５０ｍＬ）を用いて飽和させ、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させると、透明油として非多分散の標題化合物（０．３４０ｇ，収率６２％）が得られた。
［ＭＰＥＧ7−Ｃ10酸（３４）の活性化］
非多分散酸３３は実施例２４で記載した方法に類似する方法を使用して活性化した。
実施例３０および実施例３１は、図６に示したスキームを参照する。
［Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー（３６）の合成］
非多分散塩化ステアロイル（０．７ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）をベンゼン中のＰＥＧ６（５ｇ，１７．７ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．９７ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）の混合液へ緩徐に加えた。この反応混合液を数時間（〜５）攪拌した。この反応の後に展開溶媒として酢酸エチル／メタノールを使用するＴＬＣを実施した。その後、この反応液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮して真空により乾燥させた。精製した非多分散化合物３６をＦＡＢ ＭＳにより解析した。ｍ／ｅ ５４９／Ｍ+Ｈ。
［Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化］
非多分散Ｃ１８（ＰＥＧ６）の活性化は次の２段階で実施した。
１）非多分散ステアロイル−ＰＥＧ６ ３６（０．８ｇ，１．４６ｍｍｏｌ）をトルエン中に溶解させ、ホスゲン液（１０ｍＬ，トルエン中で２０％）に加え、これを氷浴を用いて冷却した。この反応混合液を０℃で１時間攪拌し、その後室温で３時間攪拌した。蒸留によりホスゲンおよびトルエンを除去し、残っている非多分散ステアロイルＰＥＧ６クロロホルメート３７をＰ2Ｏ5で一晩乾燥させた。
２）無水塩化メチレン中の非多分散ステアロイルＰＥＧ６クロロホルメート３６（０．７８ｇ，１．２７ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１２８ｍｇ，１２７ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）溶液を加えた。この反応混合液を１６時間攪拌し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過紙、濃縮し、真空で乾燥させると非多分散活性化Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー３８が得られた。
実施例３２〜実施例３７は、図７に示したスキームを参照する。
［テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル（３９）］
非多分散テトラエチレングリコールの油（１９．４ｇ，０．１０ｍｏｌ）にＮａＯＨ（４．０ｍＬ中の４．０ｇ）の溶液を加え、この反応液を１５分間攪拌した。塩化ベンジル（３．５４ｍＬ，３０．８ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合液を１００℃へ加熱し、一晩攪拌した。この反応混合液を室温へ冷却させ、飽和ＮａＣｌ（２５０ｍＬ）を用いて希釈し、そしてＣＨ2Ｃｌ2（２×２００ｍＬ）を用いて洗浄した。有機層を結合し、飽和ＮａＣｌを用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）にかけると、黄色油として非多分散の標題化合物（６．２１ｇ，収率７１％）が得られた。
［テトラエチレングリコールモノベンジルエーテルのメシレート（４０）］
ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）の溶液に非多分散テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル３９（６．２１ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で０℃に冷却した。その後トリエチルアミン（３．２ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合液を０℃で１５分間攪拌した。その後ＣＨ2Ｃｌ2（２ｍＬ）中に溶解させた塩化メタンスルホニル（１．７ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を加え、この反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、氷浴を取り除き、この反応液をさらに２時間、室温で攪拌した。この粗反応混合液をセライトに通して濾過（８０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄）し、濾液を水（１００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。生じた黄色油を活性炭（１０ｇ）を含有するシリカのパッド上でクロマトグラフィーにかけると、透明油として非多分散の標題化合物（７．１０ｇ，収率８９％）が得られた。
［オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル（４１）］
水素化ナトリウム（０．４３ｇ，１８ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフラン（１４０ｍＬ）の溶液に、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の非多分散テトラエチレングリコール（３．５ｇ，１８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下法で加え、その反応混合液を１時間攪拌した。その後、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解させた非多分散テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル４０のメシレート（６．０ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）を滴下法で加え、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライトを通して濾過（２５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄）し、濾液をＨ2Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。結果として生じた油はクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／メタノール、１０：１）にかけ、さらにクロマトグラフィー（シリカ、クロロホルム／メタノール、２５：１）を実施して、透明油として非多分散の標題化合物（２．６２ｇ，収率３４％）を得た。
［ステアリン酸ＰＥＧ８−ベンジル（４３）の合成］
非多分散オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル４１（０．９９８ｇ，２．０７ｍｍｏｌ）およびピリジン（１６３．９ｍｇ，２．０７ｍｍｏｌ）の攪拌冷却溶液にベンゼン中の非多分散塩化ステアロイル４２（６２７．７ｍｇ，２．０７ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合液を一晩（１８時間）攪拌した。翌日、この反応液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濃縮して真空により乾燥させた。その後、粗生成物を、１０％メタノール／９０％クロロホルムを使用してフラッシュシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有するフラクションを結合し、濃縮し、真空で乾燥させると非多分散の標題化合物が得られた。
［ステアリン酸−ＰＥＧ８−ベンジルの水素化分解］
非多分散ステアリン酸−ＰＥＧ８−Ｂｚｌ ４３（０．８５４ｇ，１．１３８ｍｍｏｌ）のメタノール液へＰｄ／Ｃ（１０％）（パラジウム、活性炭上で１０重量％）を加えた。この反応混合液を水素下で一晩（１８時間）攪拌した。その後、この溶液を濾過し、濃縮し、１０％メタノール／９０％クロロホルムを使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｒt＝０．６のフラクションを収集し、濃縮し、乾燥させると非多分散酸４４が得られた。
［Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマーの活性化］
非多分散活性化Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマー４５を得るために、非多分散ステアリン酸−ＰＥＧ８オリゴマーの２段階活性化を上記実施例３１におけるステアリン酸ＰＥＧ６について記載した通りに実施した。
［活性化されたトリエチレングリコールモノメチルオリゴマー類の合成］
以下の説明は、図８に示したスキームを参照する。２０％ホスゲンを含有するトルエン溶液（１００ｍＬ，約１８．７ｇ，１８９ｍｍｏｌのホスゲン）をＮ2雰囲気下で０℃へ冷却した。非多分散ｍＴＥＧ（トリエチレングリコール、モノメチルエーテル、７．８ｇ，４７．５ｍｏｌ）を２５ｍＬの無水酢酸エチル中に溶解させ、これを冷却したホスゲン溶液に加えた。この反応混合液を６℃で１時間攪拌し、室温へ加温するに任せ、その後さらに２時間半攪拌した。残っているホスゲン、酢酸エチルおよびトルエンは真空蒸留を介して取り除くと、透明油性残留物として非多分散ｍＴＥＧクロロホルメート４６が残された。
非多分散残留物４６を５０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、これにＴＥＡ（トリエチルアミン、６．６２ｍＬ，４７．５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、５．８ｇ、５０．４ｍｍｏｌ）を加えた。この混合液を室温の乾燥した雰囲気下で２０時間攪拌すると、その間に大量の白色沈降物が現れた。混合液を濾過してこの沈降物を除去し、真空中で濃縮した。結果として生じた油４７をジクロロメタン中に取り出し、低温脱イオン水を用いて２回、１ＮのＨＣｌを用いて２回、そして食塩液を用いて１回洗浄した。有機相はＭｇＳＯ4の上方を通して乾燥させ、濾過し、濃縮させると、透明な浅黄色油としての非多分散の標題化合物が得られた。必要であれば、ＮＨＳエステルは溶離剤としてＥｔＯＡｃを使用したシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製できよう。
［活性化されたパルミチン酸−ＴＥＧオリゴマーの合成］
以下の説明は、図９に示したスキームを参照する。非多分散パルミチン酸無水物（５ｇ；１０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解させ、室温で攪拌した。この攪拌溶液に、３モル過剰のピリジンを加え、その後に非多分散トリエチレングリコール（１．４ｍＬ）を加えた。この反応混合液を１時間攪拌した（反応の進行はＴＬＣ；酢酸エチル−クロロホルム；３：７により監視した）。反応の終了時に、ＴＨＦを除去し、生成物を１０％のＨ2ＳＯ4と混合し、酢酸エチルにより抽出した（３×３０ｍＬ）。結合した抽出物を水、食塩液を用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発させて非多分散生成物４８を得た。ＤＭＦ（〜１０ｍＬ）中のＮ−ジスクシンイミジルカルボネート（３ｍｍｏｌ）の溶液を、１０ｍＬの無水ＤＭＦ中の非多分散生成物４８（１ｍｍｏｌ）の溶液へ攪拌しながら加えた。水素化ナトリウム（３ｍｍｏｌ）をこの反応混合液に緩徐に加えた。この反応混合液を数時間（例、５時間）攪拌した。活性化オリゴマーを沈降させるためにジエチルエーテルを加えた。このプロセスを３回繰り返し、生成物を最終的に乾燥させた。
［活性化されたヘキサエチレングリコールモノメチルオリゴマー類の合成］
以下の説明は、図１０に示したスキームを参照する。非多分散活性化ヘキサエチレングリコールモノメチルエーテルは上記の実施例３９における非多分散トリエチレングリコールと同様に調製した。トルエン中の２０％ホスゲン溶液（３５ｍＬ，６．６６ｇ，６７．４ｍｍｏｌホスゲン）をＮ2雰囲気下の氷／塩水浴中で冷却した。非多分散ヘキサエチレングリコール５０（１．８５ｍＬ，２．０ｇ，６．７４ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水ＥｔＯＡｃ中に溶解させ、これをシリンジによりホスゲン溶液に加えた。この反応混合液を１時間、氷浴中で攪拌し続け、取り出し、さらに室温で２．５時間攪拌した。ホスゲン、ＥｔＯＡｃ、およびトルエンを真空蒸留を介して取り除くと、透明油性残留物として非多分散化合物５１が残された。
非多分散残留物５１を２０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、乾燥した不活性雰囲気下に置いた。トリエチルアミン（０．９４ｍＬ，０．６８ｇ，６．７ｍｍｏｌ）およびその後ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，０．８２ｇ，７．１ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの反応混合液を室温で１８時間攪拌した。シリカゲルを通してこの混合液を濾過して白色沈降物を除去し、真空中で濃縮した。残留物をジクロロメタン中に取り出し、冷水を用いて２回、１ＮのＨＣｌを用いて２回、そして食塩液を用いて１回洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4の上方を通して乾燥させ、濾過し、濃縮した。最終精製をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ）により実施すると、ＵＶ活性非多分散ＮＨＳエステル５２が得られた。
１５０ｍｇのサケカルシトニン（ＭＷ ３４３２，０．０４３ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水ＤＭＦ中に溶解させた。その後、ＴＥＡ（３５μＬ）および無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中の実施例２４の活性化オリゴマー（４２ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を１時間攪拌し、その後水中の２ｍＬの０．１％のＴＥＦを用いて急冷した。この反応の後にＨＰＬＣを実施した。その後この反応混合液を濃縮し、予備ＨＰＬＣ（ＲＣ Ｖｙｄａｃ Ｃ１８タンパク質およびペプチド，１×２５カラム，０．１％のＴＦＡを含む水／アセトニトリル，２８０ｎｍでの検出）により精製した。モノ抱合体およびジ抱合体に一致する２つのピークが単離された。サンプルはＭＡＬＤＩ−ＭＳにより定量解析した。ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、モノ抱合体についてのＭＳ：３８９７。ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、ジ抱合体についてのＭＳ：４３６１。
実施例４１の方法を使用して、サケカルシトニンを実施例２９の活性化オリゴマーとコンジュゲートさせた。ＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、モノ抱合体についてのＭＳ：３９２６。ＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、ジ抱合体についてのＭＳ：４４２０。
実施例４１の方法を使用して、サケカルシトニンを実施例３１の活性化オリゴマーとコンジュゲートさせた。ステアリン酸−ＰＥＧ６−ｓＣＴ、モノ抱合体についてのＭＳ：４００６。ステアリン酸−ＰＥＧ６−ｓＣＴ、ジ抱合体についてのＭＳ：４５８２。
実施例４１の方法を使用して、サケカルシトニンを実施例３７の活性化オリゴマーとコンジュゲートさせた。ステアリン酸−ＰＥＧ８−ｓＣＴ、モノ抱合体についてのＭＳ：４０９５。
実施例４１の方法を使用して、サケカルシトニンを実施例１８の活性化オリゴマーとコンジュゲートさせる。
実施例４１の方法を使用して、サケカルシトニンを実施例３８の活性化オリゴマーとコンジュゲートさせる。
実施例４１の方法を使用して、サケカルシトニンを実施例３９の活性化オリゴマーとコンジュゲートさせる。
実施例４１の方法を使用して、サケカルシトニンを実施例４０の活性化オリゴマーとコンジュゲートさせる。
［サケカルシトニン−オリゴマー抱合体の混合物についての分散係数の決定］
サケカルシトニン−オリゴマー抱合体の混合物についての分散係数は次のように決定する。サケカルシトニン−オリゴマー抱合体の混合物は、例えば実施例４１に記載したように用意する。この混合物の第１サンプルは、サンプル中の様々なサケカルシトニン−オリゴマー抱合体を分離し、単離するためにＨＰＬＣにより精製する。各単離フラクションが抱合体の純粋な単分散混合物を含有すると仮定すると、「ｎ」は収集されたフラクションの数に等しい。この混合物は、コンジュゲートの位置、抱合体の程度の順に記載されている次の抱合体の１以上を含む可能性がある。Ｌｙｓ11モノ抱合体；Ｌｙｓ18モノ抱合体；Ｎ−末端モノ抱合体；Ｌｙｓ11,18ジ抱合体；Ｌｙｓ11，Ｎ−末端ジ抱合体；Ｌｙｓ18，Ｎ−末端ジ抱合体；および／またはＬｙｓ11,18，Ｎ−末端トリ抱合体。フラクションの質量を決定するために、この混合物の各単離フラクションは、各単離フラクションをモノ抱合体、ジ抱合体もしくはトリ抱合体として分類することができ、サンプル中の各抱合体に対して可変の「Ｍi」に対する数値を提供する質量分析法により解析する。
混合物の第２サンプルは、ＨＰＬＣトレースを提供するためにＨＰＬＣで分析する。コンジュゲートの結果としてモル吸光係数は変化しないことを前提に、混合物中の特定の抱合体の重量％はＨＰＬＣトレースの全ピーク下の総面積の百分率としての特定の抱合体に一致するＨＰＬＣトレースのピーク下面積によって提供される。サンプルの無水状態でのグラム重量を決定するためには、サンプルを収集して乾燥するまで凍結乾燥させる。サンプルのグラム重量にサンプル中の各成分の重量％をかけると、サンプル中の各抱合体のグラム重量を決定できる。特定の抱合体（ｉ番目の抱合体）についての変数「Ｎi」は、サンプル中の特定の抱合体の分子数Ｎiを得るために、サンプル中の特定の抱合体のグラム重量を特定の抱合体の質量で割り、アボガドロ数（６．０２２０５×１０23ｍｏｌｅ-1）による指数、上記で決定したＭiをかけると決定される。分散係数は、その後ｎ、各抱合体について決定したＭiおよび各抱合体について決定したＮiを使用して計算する。
［Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）試験］
Ｔ−４７Ｄ細胞（乳腺管癌細胞系、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手）をランニング緩衝液（カリフォルニア州サニーベール所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから入手した低緩衝、血清フリー、重炭酸塩フリーＲＰＭＩ １６４０培地）中の１×１０7ｃｅｌｌ／ｍＬの密度で懸濁させた。およそ１００，０００ｃｅｌｌを１０μＬの液滴中のアガロース細胞捕捉培地中に固定化し、サイトセンサー・カプセルカップ内の２枚の厚さ３μｍのポリカーボネート膜の間に挟んだ。Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）マイクロフィジオメーター（微小生理機能測定器）上のセンサーチャンバー内に入れたサイトセンサー・カプセルカップをｐＨ感受性検出器の極めて近くに保持した。流動が停止する３０秒間の間隔を除いて、ランニング緩衝液を１００μＬ／分の速度で全細胞に行き渡るようにポンプで送り込み、センサーチャンバー内のランニング緩衝液の酸性化を測定した。酸性化率は２分間毎に測定した。センサーチャンバー内の温度は３７℃であった。細胞は、実験開始前２〜３時間はセンサーチャンバー内で平衡化させ、その間に基底酸性化率を監視した。その後、細胞を様々なｎＭ濃度のランニング緩衝液中で希釈した試験化合物（サケカルシトニンまたはオクチル−ジ−カルシトニン）に曝露させた。試験化合物への細胞の曝露は、合計２０分間の反復パターンで行った各２分間のポンプサイクルの最初の４０秒間に行った。これは細胞代謝におけるレセプター媒介性反応を引き出すための細胞の試験化合物への十分な曝露を許容し、その後に化合物を含有しないランニング緩衝液を約５０秒間流動させた。この方法は酸性化率を測定する前にセンサーチャンバー内から試験液（ランニング緩衝液単独よりわずかに低いｐＨを有していた）を洗い流した。したがって、酸性化率は完全に細胞活性の尺度であった。類似の方法を使用して、ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、モノ抱合体（オクチル−モノ）；ＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、モノ抱合体（デシル−モノ）；ＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ、ジ抱合体（デシル−ジ）；ステアリン酸−ＰＥＧ６−ｓＣＴ、モノ抱合体（ＰＥＧ６ Ｓｔ．モノ）；およびステアリン酸−ＰＥＧ８−ｓＣＴ、モノ抱合体（ＰＥＧＳ Ｓｔ．モノ）についてのデータを入手した。データは、各サイトセンサーチャンバーの酸性化率のグラフについて曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、同一実験条件下で実施した複数の実験から入手した平均ＡＵＣ測定値を示している図１４に示した棒グラフとしてプロットすることにすることにより化合物の相対活性について解析した。
［酵素安定性］
凍結乾燥粉末として供給された化合物をｐＨ７．４の１０ｍＭのリン酸緩衝液中に再懸濁させ、その後ＨＰＬＣによる濃度測定のために提出した。リン酸緩衝液を使用して、各特定の腸酵素の活性のために最適なｐＨを備える溶液を作製した。こうして調製した化合物のアリコートを１．７ｍＬ微量高速遠心管へ移し、３７℃水浴中で１５分間攪拌して化合物をその温度へ平衡化させた。１５分後、適切に濃縮した腸酵素２μＬを各遠心管へ加えて所望の最終濃度を達成した。キモトリプシンおよびトリプシンを１ｍＭのＨＣｌ中へ再懸濁させた。同様に、コントロールとしての化合物も２μＬの１ｍＭのＨＣｌを用いて処理した。添加の直後に、コントロール遠心管から１００μＬのサンプルを取り出し、２５μＬのキモトリプシン／トリプシン急冷液（１：１ １％ＴＦＡ：イソプロパノール）のどちらかを用いて急冷した。このサンプルはＴ＝０ｍｉｎとする。使用した腸酵素に依存する様々な時間間隔でサンプリング方法を繰り返す。キモトリプシンは１５分間、３０分間および６０分間のサンプルを有する。トリプシンは３０分間、６０分間、１２０分間および１８０分間のサンプルを有する。全時点が獲得されたら、観察された分解が温度もしくは緩衝液関連性ではないことを確認するために最終サンプルをコントロール遠心管から取り出す。キモトリプシンおよびトリプシンサンプルは、ＨＰＬＣバイアル内へ直接に採取してよい。ＲＰ−ＨＰＬＣ（アセトニトリル勾配）を使用して各サンプルについてＡＵＣを決定し、Ｔ＝０ｍｉｎコントロールに基づいて分解率（％）を計算する。結果は以下の表１〜４に示した。
Figure 0004272510
Figure 0004272510
Figure 0004272510
Figure 0004272510
［活性および被験体間変動］
体重２０〜２５ｇの雄性ＣＦ−１マウス（チャールスリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、ローリー、ＮＣ）をノベックス（Ｎｏｂｅｘ）社動物飼養場内の照明（１２：１２の明暗周期、午前６時からの照明）、温度（２１〜２３℃）、そして湿度（４０〜６０％の相対湿度）を調節した飼養室に収容した。動物には、実験動物用飼料（ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ社製）および水道水を自由に摂取させた。マウスは、実験当日前の４５〜７２時間に収容条件へ馴化させた。
マウスは、投与前に一晩絶食させたが、水は任意に与えた。マウスは各時点につき各群５匹ずつに無作為に分配し、本発明によるＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、ジ抱合体（オクチル−ジ）または比較目的のサケカルシトニン（ｓＣＴもしくはカルシトニン）の単回経口用量を投与した。経口用量は胃管栄養針（Ｐｏｐｐｅｒ＃１８、ハブから斜端まで５ｃｍ）を使用して１０ｍＬ／ｋｇで投与し、その後に０．２μｇ／ｍＬリン酸緩衝ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、ジ抱合体製剤を投与した。
Figure 0004272510
 緩衝製剤は、清潔な自重を計測したガラスビーカー内のリン酸緩衝液８０ｍＬを加えることにより調製した。攪拌しながら溶解するまでリン酸緩衝液へコール酸ナトリウムを緩徐に加えた。デオキシコール酸塩を加え、溶解するまで攪拌を持続した。２０μｇに等価のＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴ、ジ抱合体を加えた。最後に、最終重量１００ｇを達成するために残っているリン酸緩衝液を加えた。全実験において賦形剤コントロールのマウスを使用した。薬剤投与６０分後の単一時点を使用して用量反応曲線を構築した。これらの曲線は図１５〜図１８に示した。
適切な時点に、マウスにエーテル麻酔をかけ、大静脈を露出させ、２５ゲージ針を備えたシリンジを介して血液サンプルを入手した。血液アリコートを１時間にわたり２２℃で凝固させ、血清を除去し、清潔な容器内へピペットで移した。校正済みＶｉｔｒｏｓ ＤＴ６０ ＩＩ分析装置を使用して、各動物について全血清カルシウム濃度を測定した。
血清カルシウム濃度データをプロットし、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔソフトウェア（バージョン４．１）を使用してカーブフィッティングにより薬剤動態パラメータを決定した。平均値および標準偏差（もしくは標準誤差）を計算し、用量群間での作用差を決定するためにプロットした。様々の抱合体についての平均血清カルシウム濃度データは以下の表５に提供した。
Figure 0004272510
ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴならびにＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴ モノ抱合体およびジ抱合体のインビトロ活性とは匹敵しない可能性がある上記の実施例５０で決定したインビトロ活性にもかかわらず、ステアリン酸−ＰＥＧ６−ｓＣＴ、ジ抱合体、およびステアリン酸−ＰＥＧ８−ｓＣＴ、ジ抱合体は、ＰＥＧ７−オクチル−ｓＣＴおよびＰＥＧ７−デシル−ｓＣＴのモノ抱合体およびジ抱合体について観察されたインビボ活性と匹敵するインビボ活性を有すると思われる（上記の表５からのベースラインからのカルシウム低下率によって証明された）。特定理論によって結び付けることを望まなくとも、抱合体を含有するステアリン酸のインビボ活性における向上は、これらの抱合体が活性サケカルシトニンもしくは活性サケカルシトニン−ＰＥＧ抱合体を提供するためにインビボで加水分解を受けることを示している。
本明細書では、本発明の典型的に好ましい実施形態を開示して、そして特別の用語を使用してきたが、それらは一般的および説明的意味でのみ使用したもので、限定する目的で使用したものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲に記載されている。
本発明の実施形態によるポリエチレングリコール部分および脂肪酸部分を含む活性化されたポリマーの混合物を合成するための包括的スキームである。 本発明の実施形態によるｍＰＥＧの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による活性化ｍＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマーの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による活性化ｍＰＥＧ７−オクチルオリゴマーの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による活性化ｍＰＥＧ７−デシルオリゴマーの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による活性化ステアリン酸−ＰＥＧ６オリゴマーの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による活性化ステアリン酸−ＰＥＧ８オリゴマーの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による活性化ＰＥＧ３オリゴマーの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による活性化パルミチン酸塩−ＰＥＧ３オリゴマーの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による活性化ＰＥＧ６オリゴマーの混合物を合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による様々なプロピレングリコールモノマーを合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による様々なプロピレングリコールポリマーを合成するためのスキームである。 本発明の実施形態による様々なプロピレングリコールポリマーを合成するためのスキームである。 本発明の実施形態によるカルシトニン−オリゴマー抱合体の様々な混合物とコンジュゲートされていないカルシトニンとの平均ＡＵＣの比較を示した図であり、これは比較のためだけに提供したもので、本発明の一部を形成するものではない。 カルシトニンについての用量反応曲線と比較した本発明の実施形態によるｍＰＥＧ７−オクチル−カルシトニンジ抱合体の混合物についての用量反応曲線の図であり、これは比較のために提供したもので、本発明の一部ではない。 本発明の実施形態によるｍＰＥＧ７−オクチル−カルシトニンジ抱合体の混合物を経口投与した後の用量反応曲線の図である。 本発明の実施形態によるｍＰＥＧ７−オクチル−カルシトニンジ抱合体の混合物を皮下投与した後の用量反応曲線の図である。 サケカルシトニンを皮下投与した後の用量反応曲線の図であり、これは比較のために提供したもので、本発明の一部ではない。

Claims (17)

  1. 抱合体の単分散混合物であって、該抱合体の１００％が同一の分子量を有する混合物、
    抱合体の実質的に純粋な単分散混合物であって、該抱合体の少なくとも９５％が同一の分子量を有し、同一の分子構造を有する混合物、または
    抱合体の純粋な単分散混合物であって、該抱合体の１００％が同一の分子量を有し、そして同一の分子構造を有する混合物
    であって、
    前記抱合体が、第１オリゴマーと、第２オリゴマーとを含み、各オリゴマーがポリエチレングリコール部分を含み、各オリゴマーがカルシトニンに結合しており、該第１オリゴマーが該カルシトニンのＬｙｓ １１ のアミノ基に共有結合的に結合しており、該第２オリゴマーが該カルシトニンのＬｙｓ １８ のアミノ基に共有結合的に結合している、混合物。
  2. 前記ポリエチレングリコール部分が少なくとも２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する請求項１に記載の混合物。
  3. 前記ポリエチレングリコール部分の付加が、（ａ）血清中カルシウム濃度を少なくとも５％低下させる能力、（ｂ）オリゴマーに結合されていないカルシトニンのキモトリプシンまたはトリプシンによる分解に対する抵抗性と比較した、キモトリプシンまたはトリプシンによる分解に対する高い抵抗性、（ｃ）オリゴマーに結合されていないカルシトニンの生体有効性より高い生体有効性、及びこれらの組み合わせから選択される性質を提供する請求項１に記載の混合物。
  4. 前記カルシトニンが前記オリゴマーに、加水分解可能な結合、加水分解可能でない結合、またはそれらの両方により共有結合されている請求項１に記載の混合物。
  5. 前記カルシトニン薬剤が前記オリゴマーのポリエチレングリコール部分に共有結合されている請求項１に記載の混合物。
  6. 前記オリゴマーが親油性部分をさらに含む、及び／又は各オリゴマーが同一の分子構造を有する請求項１に記載の混合物。
  7. 前記カルシトニン及び／又はポリエチレングリコール部分が親油性部分に共有結合され
    ている請求項６記載の混合物。
  8. 請求項１に記載の混合物と
    医薬的に許容可能な担体と
    を含む医薬組成物。
  9. 前記第１オリゴマーと、前記第２オリゴマーとが、カルボン酸含有化合物をさらに含み、該化合物のカルボン酸末端が、前記Ｌｙｓ １１ 、及びＬｙｓ １８ にアミド結合として結合され、該カルボン酸含有化合物の他方の末端が、少なくとも７個のポリエチレングリコールサブユニットを有するメチル末端ポリエチレングリコール部分に共有結合的に結合されている、請求項１に記載の抱合体の実質的に単分散の混合物。
  10. 前記カルボン酸含有化合物が、オクタン酸である請求項９に記載の混合物。
  11. 過度の破骨細胞性骨吸収または低カルシウム血性血清作用を特徴とする骨疾患の治療のための医薬の調製のための、請求項１〜１０のいずれかに記載の抱合体の混合物の使用。
  12. 前記骨疾患が骨粗鬆症、ぺージェット病、または低カルシウム血症である請求項１１に記載の使用。
  13. 各抱合体が少なくとも４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニンを含む、抱合体の混合物であって、約２２ダルトン未満の標準偏差を伴う分子量分布を有する、請求項１に記載の混合物。
  14. 前記混合物が１０，０００より大きい分散係数（ＤＣ）：
    Figure 0004272510
    （式中：
    ｎは、サンプル中の異なる分子の数であり、
    Ｎｉは、サンプル中のｉ番目の分子の数であり、
    Ｍｉは、ｉ番目の分子の質量である）を有する、請求項１に記載の抱合体の混合物。
  15. 前記分散係数が１００，０００より大きい請求項１４に記載の抱合体の混合物。
  16. 各抱合体が同一の分子量を有し、各抱合体が次の式：
    Figure 0004272510
    （式中：
    Ｂは、結合部分であって、共有結合、エステル部分、カルボネート部分、アミド部分、及び第二級アミン部分から選択される結合部分であり、
    Ｌはリンカー部分であって、アルキル部分及び脂肪酸部分から選択されるリンカー部分であり、
    Ｇ、Ｇ’およびＧ”は独立して選択されたスペーサー部分であって、糖コレステロール部分及びグリセリン部分から選択されるスペーサー部分であり、
    Ｒは親油性部分およびＲ’はポリアルキレングリコール部分である、またはＲ’は親油性部分およびＲはポリアルキレングリコール部分であり、
    Ｔは末端部分であって、アルキル部分またはアルコキシ部分から選択される末端部分であり、
    ｊ、ｋ、ｍおよびｎは独立して０または１であり、
    ｐは、１からカルシトニン薬剤上の求核性残基数までの整数である）を有する、請求項１に記載の抱合体の混合物であって、
    該カルシトニン薬剤が、サケカルシトニンである、混合物。
  17. 各抱合体がポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーに結合されたカルシトニンを含む、請求項１に記載の抱合体の実質的に単分散の混合物を合成するプロセスであって、式Ｉ：
    Figure 0004272510
    （式中、Ｒ１はＨもしくは親油性部分であり、ｍは１〜２５であり、そしてＸ＋は陽イオンである）の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物と、式ＩＩ：
    Figure 0004272510
    （式中、Ｒ２はＨもしくは親油性部分であり、ｎは１〜２５である）の構造を有する化合物を含む実質的に単分散の混合物とを、式ＩＩＩ：
    Figure 0004272510
    の構造を有するポリマーを含む実質的に単分散の混合物を得るのに十分な条件下で反応させるステップと、
    式ＩＩＩのポリマーを含む実質的に単分散の混合物を活性化させて、カルシトニンと反応することのできる活性化されたポリマーの実質的に単分散の混合物を得るステップであって、該実質的に単分散の混合物を活性化するステップが、前記式ＩＩＩのポリマーの実質的に単分散の混合物を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させるステップを含む、ステップと、
    ｍ＋ｎ個のサブユニットを備えるポリエチレングリコール部分を含むオリゴマーにカルシトニンのＬｙｓ １１ 及びＬｙｓ １８ のアミノ官能基で結合されたカルシトニンを各々が含んでいる抱合体の実質的に単分散の混合物を得るのに十分な条件下で、該活性化されたポリマーの実質的に単分散の混合物と、カルシトニンとを反応させるステップと
    を含むプロセス。
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