MXPA06013810A - Compuestos natriureticos, conjugados y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Se describen en la presente invencion los compuestos natriureticos modificados y conjugados de los mismos; en particular, se proporcionan las formas conjugadas de hBNP las cuales incluyen por lo menos una porcion de modificacion unida a las mismas; los conjugados del compuesto nutriuretico modificado retiene actividad para estimular la produccion de cGMP, unir al receptor NPR-A, y en algunas modalidades una vida media mejorada en circulacion en comparacion con los compuestos natriureticos de contraparte no modificados; las formas oral, parenteral, enteral, subcutanea, pulmonar e intravenosa de los compuestos y conjugados puede prepararse como tratamientos y/o terapias para condiciones del corazon particularmente insuficiencia cardiaca congestiva; tambien se describen las porciones de modificacion que comprenden estructuras oligomericas que tienen una variedad de longitudes y configuraciones; tambien se describen los analogos del compuesto natriuretico, que tienen una secuencia aminoacido que es diferente a la secuencia nativa.

Description

COMPUESTOS NATRIURETICOS, CONJUGADOS Y USOS DE LOS MISMOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud se basa en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con número de serie 60/574,436, presentada el 26 de mayo de 2004, pendiente, titulada "NATRIURETIC COMPOUNDS, CONJUGATES, AND USES THEREOF" y reclama prioridad a la misma. La descripción completa de cada una de estas solicitudes se incorpora aquí por referencia en su totalidad, y el beneficio de la fecha de presentación de cada una de estas solicitudes de patente es por lo tanto reclamada aquí para todos los propósitos que son legalmente servidos por dicha reclamación.

DECLARACIÓN DE SOPORTE GUBERNAMENTAL La presente invención se hizo con soporte gubernamental bajo un proyecto de investigación soportado por la Concesión de NIH #1 R43 HL074529-01. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere de campo de conjugados de compuesto natriurético y compuestos natriuréticos de variante, y usos de estos en el tratamiento de enfermedad cardiaca congestiva y condiciones relacionadas con esta condición. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención proveen un agente natriurético farmacológicamente activo y por fármaco que se puede usar en una formulación adecuada para administración oral, nasal, intravenosa o subcutánea. La invención también provee métodos de preparación de conjugados de compuesto natriurético, compuestos y formulaciones que los contienen, así como métodos para usar estos conjugados y compuestos. A manera de ejemplo, los conjugados de compuesto natriurético comprenden un péptido natriurético que incluye un motivo de unión a NPR-A, por lo menos un sitio de conjugación de porción modificadora y también incluyen por lo menos una porción modificadora unida al sitio de conjugación de la porción modificadora. En algunas modalidades, los conjugados de compuesto tienen actividad farmacológica retenida del péptido natriurético nativo y tienen características mejoradas, tales como biodisponibilidad mejorada, resistencia mejorada a actividad protiolítica y/o actividad prolongada en el torrente sanguíneo. En otras modalidades, los conjugados de compuestos se proveen como profármacos hidrolizables que pueden tener actividad farmacológica reducida en la forma de profármaco en relación con el péptido natriurético nativo, y bajo hidrólisis de profármaco in vivo, un compuesto natriurético activo es liberado. La presente invención también se relaciona con el campo de péptidos y proteínas recombinantes, así como métodos para preparar estos péptidos y proteínas recombinantes. En particular, aquí se describen análogos de péptidos y proteínas natriuréticos. Los compuestos natriuréticos análogos de la invención se pueden describir en algunas modalidades como teniendo una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un aminoácido sustituido en relación con las especies nativas del péptido natriurético correspondiente. En algunas modalidades, los compuestos natriuréticos análogos de la invención se pueden describir como teniendo una actividad farmacológica de formas nativas de péptidos natriuréticos de tipo de cerebro (BNP), especialmente BNP humano (hBNP), urodilatin, péptido natriurético de cerebro de canino (cBNP), péptido natriurético auricular (ANP), especialmente ANP humano (hANP), péptido natriurético de dendroaspis (DNP), o péptido natriurético de tipo C (CNP), particularmente CNP humano (hCNP).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades cardiovasculares constituyen la causa principal de muerte en los Estados Unidos independientemente del género o etnia. De estas enfermedades, la insuficiencia cardiaca congestiva (CHF) es la única que está aumentando en frecuencia (Massie y Shah 1997; Packer y Cohn 1999). De acuerdo con la American Heart Association (Asociación Norteamericana del Corazón), el número de altas del hospital y el número de muertes debidas a CHF se elevaron ambas a aproximadamente 2.5 veces en1979 a 1999. Actualmente, aproximadamente 5 millones de estadounidenses han sido diagnosticados con CHF, y aproximadamente 550,000 nuevos casos ocurren anualmente (American Herat Association 2001 ). La condición amenazante de la vida va acompañada por gran impacto financiero. De hecho, es el gasto individual más grande de Medicare (Kayser 2002). Los costos directos e indirectos para tratar CHF se han estimado tan alto como 56 mil millones de dólares (Hussar 2002). Los gastos de hospital para el tratamiento de HF son más del doble que para todas formas de cáncer combinadas (O'Connell y Bristol 1994). CHF es una causa común de muerte, va acompañado por los costos indirectos altos para el tratamiento, y tiene una tasa de mortalidad alta. Una vez que a un paciente se le ha diagnosticado CHF, la tasa de mortalidad en un año es de aproximadamente 20% (American Herat Association 2001 ). La probabilidad de readmisión de la misma condición es muy alta, y varios estudios de readmisión se han realizado recientemente (Chin y Goldman 1997; Krumholz, Parent et al. 1998; Krumhoiz, Chen et al. 2000). Las tasas de readmisión en exceso de 35% dentro de un año de diagnóstico son típicas (Tsuchihashi, Tsutsuí et al. 2001). Dicha frecuencia recurrente da por resultado visitas de cuidado de emergencia múltiples y hospitalizaciones de pacientes internos (Krumholz, Parent et al. 1997). Las hospitalizaciones múltiples y la terapéutica inadecuada definen la situación actual enfrentada por los que padecen de CHF. Un estudio aleatorizado reciente indicó que la intervención basada en el hogar puede reducir potencialmente retrazo de readmisión, prolongar la supervivencia y mejorar la calidad de vida de los pacientes con CHF (Stewart, Marley et al. 1999). En un estudio independiente que se enfoca a factores socioeconómicos, Tsuchihashi, et. al. concluyó que tanto pacientes externos como el cuidado basado en el hogar son necesarios a fin de reducir la tasa de mortalidad y reducir los costos globales asociados con CHF (Tsuchihashi, Tsutsui et al. 2001 ). Claramente, nuevas terapias con aplicación amplia que se pueden usar sobre una base de pacientes externos son desesperadamente necesarias en este mercado en crecimiento. El péptido natriurético de tipo de cerebro (BNP) es uno de una familia de péptidos que están implicados en homeostasis cardiovascular, renal y endocrina. Se descubrió en 1988 (Sudoh, Kangawa et al. 1988), casi una década después del descubrimiento del péptido natriurético auricular (ANP). Aunque primero se aisló del cerebro de porcino, se conoce por su actividad en receptores en músculo liso vascular y células endoteliales. BNP es un péptido endógeno producido por el corazón. Es primero producido como prepro-BNP y es subsecuentemente acortado dos veces a la forma activa, un péptido de 32 aminoácidos con un enlace de disulfuro. Como se ilustra en la figura 1 , BNP se une al receptor de péptido natriurético A (NPR-A), una proteína de unión a membrana sobre la superficie celular. El evento de unión dispara la síntesis de GMPc en el citosol por guanilato ciclasa. Es a través de este mensajero secundario que BNP logra los efectos cardiovasculares, renales y endocrinos con los cuales está asociado. La regulación de BNP se logra por varios medios diferentes. Las moléculas de BNP que se unen a NPR-A y estimulan la producción de GMPc son removidas de la circulación, pero hay otros medios por los cuales BNP es eliminado sin inducir una respuesta. El medio más común de remoción es a través de la unión al receptor de aclaración, receptor de péptido natriurético C (NPR-C). Al unirse a NPR-C, el péptido es asimilado en la célula y digerido enzimátícamente. El siguiente medio importante de aclaramiento es la degradación por endopeptidasa neutra (NEP), que es una enzima unida a membrana sobre la superficie celular. Finalmente, BNP es removido a un grado pequeño por filtración renal. Bajo condiciones normales, BNP es producido en cantidades bajas en las aurículas y ventrículos. Sin embargo, cuando los ventrículos son estirados durante la descompensación cardiaca, la cantidad de BNP que se produce incrementa en gran medida. Aunque las aurículas aún están implicadas, los ventrículos se vuelven principal sitio de producción. El corazón produce BNP en respuesta a un estiramiento de los ventrículos que ocurre durante la compensación en el inicio de CHF. Los efectos de BNP incluyen natriuresis, diuresis, vasodilatación y una reducción de presión sanguínea díastólica. Estos efectos se llevan a cabo a través de las acciones de un mensajero secundario, monofosfato de guanosina cíclico (GMPc). La producción de GMPc es disparada cuando BNP interactúa con el receptor de péptido natriurético A (NPR-A) que es un receptor unido a membrana localizado en la superficie de las células endoteliales en los vasos sanguíneos, riñones y pulmones. La concentración en el plasma de BNP incrementa con la severidad incrementada de CHF. A pesar de este incremento, los efectos benéficos de BNP son mitigados en CHF severo, elevando la posibilidad de un estado de deficiencia relativo en CHF manifiesto. Por lo tanto, ya sea la cantidad de BNP que el corazón puede producir es superada o pre-pro BNP no es adecuadamente convertido en forma activa, reduciendo así sus acciones benéficas. Debido a su producción temprana en el inicio de la enfermedad cardiaca, BNP se ha vuelto importante como un marcador de diagnóstico para detectar a pacientes que están en alto riesgo de desarrollar CHF (Yamamoto, Burnett et al. 1996; McDonagh, Robb et al. 1998; Richards, Nicholls et al. 1998; Nagoya, Nishikimi et al. 2000; Hawai, Hata et al. 2001 ; Maisel, Krishnaswamy et al. 2002; McNairy, Gardetto et al. 2002). BNP funciona ara aliviar descompensación cardiaca de varias maneras. Como el nombre lo implica, BNP conduce a la excreción de sodio y un incremento en producción de orina, que reduce congestión. También funciona como un vasodilatador, los efectos del cual son incrementados por varias otras acciones. Muy notables de estas funciones son los papeles que juega BNP en la interferencia del sistema de renina-angíotensina-aldosterona (RAAS). Conduce a la inhibición de renina, que es una enzima clave en la generación del péptido vasoconstrictor angiotensina. Inhibe el sobrecrecimíento de células epiteliales que revisten el tejido vascular, que al quedar sin ser verificado puede reducir en gran medida el flujo sanguíneo. Una forma final en que funciona BNP para aliviar la descompensación es sus efectos lusitrópicos. Mejora la relajación miocárdica de los ventrículos dando por resultado una disminución en la presión sanguínea díastólica. Existen limitaciones prácticas en el uso de péptidos como fármacos. La proteólisis, tanto en el intestino como en el torrente sanguíneo, es una barrera importante al uso de péptidos como terapéuticos. Otra dificultad encontrada con péptidos no endógenos es la inmunogenicidad. Como resultado de estos problemas, el enfoque de la industria farmacéutica ha sido crear moléculas no peptídicas pequeñas usando química medicinal. Aunque este enfoque se ha cumplido con éxito, es costoso, consume tiempo y está plagado de incertidumbre en términos de farmacocinétíca y toxicidad. Además, la identificación de moléculas orgánicas pequeñas con actividad agonista en receptores peptídicos ha probado ser excepcionalmente desafiante. Aunque el uso de proteínas de "PEGiladas" está bien establecido hasta la fecha, se ha confinado para uso inyectable. La presente invención provee conjugados de polipéptidos oralmente establecidos, tales como péptido natriurético de tipo de cerebro humano (hBNP). Específicamente, la presente invención provee conjugados que comprenden PAG enlazado a péptidos y proteínas terapéuticos en una formulación en el tratamiento de insuficiencia cardiaca congestiva. Estas preparaciones entonces funcionan para proteger al hBNP contra enzimas proteolíticas, y por lo tanto permite el uso efectivo de este agente como un agonista de receptor de péptido natriurétíco humano A. Como resultado de esta actividad agonística, hay una producción incrementade de GMPc. En agosto de 2001 , hBNP (péptido nativo) fue aprobado por la FDA bajo el nombre comercial Natrecor® (Nesiritide) para el tratamiento de insuficiencia cardiaca congestiva aguda. Natrecor® fue el primer fármaco aprobado para el tratamiento de CHF en aproximadamente doce años. Se administra por infusión continua intravenosa durante un período de 48 horas. Puesto que el fármaco es costoso y requiere hospitalización, Natrecor® es usado únicamente para los casos más agudos. A pesar de este gasto e inconveniencia, Natrecor® se puede considerar menos costoso que algunas otras terapias al reducir la cantidad de tiempo que pasa los pacientes en unidad de cuidado intensivo. Actualmente, casi 5 millones de estadounidenses tienen CHF y aproximadamente 650,000 nuevos casos se reportan cada año (American Herat Association 2001 ). Actualmente, los costos directos para el tratamiento de CHF son por arriba de 20 mil millones de dólares (American Heart Associatíon 2001 ). Con los procedimientos de diagnóstico ahora disponibles para detectar el inicio de insuficiencia cardiaca antes de que ocurra daño cardiaco, existe una gran necesidad de un fármaco con utilidad expandida que se pueda usar en un paciente externo o que se utilice con base en el hogar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención comprende ampliamente formas variadas y modificadas de varios péptidos, proteínas, análogos y conjugados químicos natriuréticos que ocurren naturalmente de estos péptidos natriuréticos que poseen una o más ventajas sobre sus contrapartes que ocurren naturalmente. A manera de ejemplo, algunas de estas ventajas incluyen un incremento en la resistencia a degradación proteolítica, un tiempo de persistencia mejorado en el torrente sanguíneo y/o una capacidad mejorada para atravesar barreras en la membrana celular. Los conjugados de compuesto natriurético de conformidad con algunas modalidades de la presente invención comprenden un compuesto natriurético que incluye un motivo de unión a receptor de proteína natríurética A (un NPR-A), por lo menos un sitio de conjugación de porción modificadora, y por lo menos una porción modificadora unida al sitio de conjugación de porción modificadora. En virtud de la porción modificadora unida al compuesto natriurético como parte del conjugado, el conjugado de compuesto natriurétíco puede tener características hidrofílicas modificadas en relación con el compuesto natriurético nativo que no incluye una porción modificadora como se describe aquí. A manera de ejemplo y no de limitación, y como se describe en forma más completa aquí, la porción modificadora puede adoptar en forma de un oligómero de cualquier variedad de tamaños, formas, sustituciones y configuraciones.

En algunos casos, el conjugado de compuesto natriurético se caracteriza por lo menos en parte por su resistencia incrementada a degradación enzimátíca, tal como proteólisis, en relación con la forma no conjugada correspondiente del compuesto natriurético nativo. Estos conjugados de compuesto pueden ser además caracterizados por un porcentaje terapéuticamente significativo retenido de actividad biológica, tal como actividad estimulante del GMPc, en relación con el compuesto natriurético no conjugado correspondiente. La actividad estimulante de GMPc retenida es típicamente por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 95%, o incluso mayor que 99% o 100% de la actividad de GMPc de una forma no conjugada del péptido natriurético como se mide in vitro. Otros ejemplos de características mejoradas de los conjugados de compuesto natriurético de la invención que tienen una porción modificadora, en relación con el compuesto natriurético no modificado (no conjugado), incluyen capacidad mejorada del compuesto natriurético para pasar a través del tracto gastrointestinal y entrada al torrente sanguíneo; el carácter hidrofílico, carácter hidrofóbico o carácter anfifáticos mejorados del compuesto natriurético; solubilidad mejorada del compuesto natriurético en ambientes acuosos o solventes orgánicos; capacidad mejorada del compuesto natriurético para atravesar membranas celulares; capacidad mejorada del compuesto natriurético para atravesar la barrera hematocerebral; capacidad mejorada del compuesto natriurético para dirigirse a un cierto receptor, célula, tejido u órgano; y un perfil farmacocinética mejorado del compuesto natriurético. En una modalidad preferida, la degradación del componente de agente biológicamente activo del compuesto natriurético es menor que la degradación del compuesto natriurético biológicamente activo no modificado (no conjugado) a un pH de aproximadamente 2 durante menos de aproximadamente 2 horas. El componente de compuesto natriurético del compuesto natriurético puede ser, por ejemplo, estable como un componente de los conjugados del compuesto natriurético que el compuesto natriurético no conjugado en presencia de plasma, proteasas, homogenado de hígado, condiciones acidas y/o condiciones básicas. Los conjugados de péptido natriurético de la invención pueden inducir los efectos antihípertensivo, cardiovascular, renal y/o endocrino que son asociadas con el péptido nativo. En algunas modalidades, las modificaciones del péptido natriurético protegerá al péptido, tal como hBNP, contra proteólisis y facilitará el suministro hacia la circulación sistémíca a través de la pared del intestino, dando por resultado natriuresis, diuresis y/o vaso dilatación. Los conjugados de péptido natriurético de la invención por lo tanto pueden ser suministrados efectivamente como una formulación oral (en lugar de una infusión intravenosa continua durante días en el hospital). Esa ventaja se espera que reduzca los costos de hospitalización asociados con otras terapias de CHF al permitir la autoadministración, que hasta ahora no ha sido posible, y se espera expandir el uso terapéutico de péptido natriurético especialmente hBNP, para incluir CHF de etapa temprana (v.gr., clase 1 ) y crónico así como CHF agudo. Una modalidad preferida de la presente invención es un conjugado de péptido no inmunogénico que tiene consistencia incrementada de enzimas degradativas y es adecuado para suministro oral y transporte a través del epitelio intestinal. La invención también provee varios métodos para la preparación de los conjugados de compuesto natriurético. Estas porciones modificadoras, por ejemplo, pueden adoptar la forma de PAG lineal y ramificado u otra estructura polimérica. 6. Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual está dirigido la invención. La terminología usada en la descripción de la invención aquí es para los propósitos de describir modalidades particulares únicamente y no pretende ser limitante de la invención. Los encabezados se usan para conveniencia del lector y tampoco pretenden ser limitantes de la invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí se incorporan aquí por referencia en su totalidad, como son los insertos de paquete de cualesquiera fármacos de marca referenciados aquí por sus nombres de marca. Se pretende que las formas singulares "un", "una", "el" y "la", incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

Como se usa en la especificación y las reivindicaciones expuestas aquí, los siguientes términos tienen los significados indicados: "Aminoácido" se define aquí como cualquier aminoácido que ocurre naturalmente, artificial o sintético en cualquiera de sus formas estereoisoméricas L o D, a menos que se especifique otra cosa. El término "residuo" se usa intercambiablemente con el término "aminoácido" y a menudo se designa como que tiene una posición particular en una secuencia dada de aminoácidos. Todas las abreviaturas de aminoácidos usadas en esta descripción son aquellas aceptadas por la oficina de patentes y marcas de los Estados Unidos como se dispone en 37 C.F.R. § 1.822(b). Las siguientes designaciones de aminoácidos de una letra se usan en la descripción de la presente invención. Xaa se usa para designar un aminoácido no conocido o no designado. Los enteros arriba de los residuos específicos de la estructura provista aquí definen el número de posición del residuo. El número de residuo se usa junto con una nomenclatura de aminoácido de una letra descrito más adelante, para designar el residuo al cual se hace una sustitución en los análogos de péptido natriurético de, por ejemplo, hBNP y ANP. Por lo tanto, por ejemplo, cuando un hBNP mutante es sintetizado en el cual la arginína (R) reemplaza a la lisína (K) en el número de posición de residuo 3 del hBNP del tipo silvestre, se usa la nomenclatura "BNPK3R" o "hBNP(1-32)K3R". Sustituciones múltiples se designan de la misma manera con una coma que separa cada sustitución como se ilustra a continuación. El término "hBNP(1-32)K3R, K14R, K27R" designa un hBNP mutante triple que tiene la secuencia de hBNP definida anteriormente con el uso de arginina en vez de lisina en la posición 3 (es decir K3R), la sustitución de lisina por arginina en la posición de residuo 14 (es decir K14R), y la sustitución de lisina por arginina en la posición 27 (es decir K27R). Otros mutantes se definen de una manera análoga. El término "hBNP(1-32)K3R, K14R" designa un mutante doble que tiene la lisina reemplazada por arginina en el residuo 3 y 14 de hBNP. A=ala= alanina L=leu= leucina nle= norleucina R=arg= arginina K=lys= lisina cha= ciclohexilalanina N=asn= asparagina M=met= metionina A*=har= hemoarginina D=asp= ácido aspártico F=phe= fenilalanina orn = ornitina C=cys= cisteína P=pro= prolina pen = penicilamina Q=gln= glutamina S=ser= serina Phg= fenilglicina E=glu=ácido glutámíco T=thr= treonina mpa = ácido mercapto- propionico G=gly= glicina W=trp = triptofano a =ala* =D alanina H=his= histidina Y=tyr= tirosina C*= hemocisteína I=ile= ¡soleucina V=val=valina "Anfifílico" significa la capacidad para disolverse tanto en agua y lípidos y/o que tiene características hidrofílicas y lipofílicas, y los términos "porción anfifílica" y "anfifilo"signífica una porción que es anfifílíca y/o que, cuando se une a un fármaco de polipéptido o no polipéptido, incrementa el carácter anfifílico del conjugado resultante, v.gr., oligómero de PEG-ácido graso, oligómero de azúcar-ácido graso. "Biológicamente activo" se refiere a un agente que tiene actividad terapéutica o farmacológica, tal como un agonista, agonista parcial o antagonista. "Cantidad efectiva", como se provee aquí, se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente para proveer el efecto terapéutico deseado. Como se indicará más adelante, la cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro dependiendo de la edad, condición general del sujeto, la severidad de la condición que se está tratando, el agente biológicamente activo particular administrado y similares. Una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por el experto en la técnica por referencia a los textos y literatura pertinentes y/o usando experimentación de rutina. "Hidrolizable" se refiere a enlaces moleculares que son sujetos a hidrólisis bajo condiciones fisiológicas. "Hidrofílico" significa la capacidad para disolverse en agua, y el término "porción hidrofílica" o "hidrófilo" se refiere a una porción que es hidrofílica y/o que cuando se une a otra entidad química, incrementa el carácter hidrofílico de dicha entidad química. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a azúcares y porciones de polialquileno tales como polietilenglicol.

"Lipofílico" significa que tiene una afinidad para grasas, tales como compuestos químicos que se acumulan en grasa y tejidos grasos, la capacidad para disolverse en lípidos y/o la capacidad para penetrar, interactuar con y/o atravesar membranas biológicas, y el término, "porción lipofílica" o "lipófilo" significa una porción que es lipofílica y/o que, cuando se une a otra entidad química, incrementa el carácter lipofílico de dicha entidad química. "Alquilo inferior" se refiere a porciones alquilo sustituidas o no sustituidas que tienen 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de carbono. "Monodisperso" se refiere a una mezcla de compuestos en donde aproximadamente 100% de compuestos en la mezcla tiene el mismo peso molecular. "Farmacéuticamente aceptable" con respecto a un componente, tal como una sal, vehículo, excipiente o díluyente de una composición de conformidad con la presente invención es un componente que es compatible con los otros ingredientes de la composición, en los cuales se puede combinar con los conjugados del compuesto natriurétíco de la presente invención sin eliminar la actividad biológica del agente biológicamente activo y es adecuado para usarse con sujetos como se provee aquí sin efectos colaterales adversos (tales como toxicidad, irritación y respuesta alérgica). Efectos colaterales son "inadecuado" cuando su riesgo supera el beneficio provisto por la composición farmacéutica. Ejemplos de componentes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, cualesquiera vehículos farmacéuticos estándares tales como soluciones salinas reguladas en su pH con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión en aceite/agua, mícroemulsíones y varios tipos de agentes humectantes. "Polialquilenglicol" o PAG se refiere a polímeros de polialquilenglicol lineales o ramificados tales como polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG), y polibutilenglicol (PEG), y combinaciones de los mismos (v.gr., polímeros lineales o ramificados que incluyen combinaciones de dos o más subunidades PAG diferentes tales como dos o más unidades PAG diferentes seleccionadas de subunidades PEG, PPG, PPG y PBG) e incluye el éter monoalquílico del polialquilenglicol. En una modalidad particular, el polialquilenglicol es polietilenglicol o "PEG". El término "subunidad de PEG" se refiere a una sola unidad de polietilenglicol, es decir, (CH2CH2O)-. El término "subunidad de PPG" se refiere a una sola unidad de polipropilenglicol, es decir, -(CH2CH2CH2O)-. El término "subunidad de PBG" se refiere a una sola unidad de polipropílenglicol, es decir, -(CH2CH2CH2CH2O)-. Las subunidades PAG también pueden incluir cadenas laterales de alquilo, tales como cadenas laterales de metilo, etilo o propilo. "Profármaco" se refiere a un agente biológicamente activo que ha sido químicamente derivado como tal, al administrarse a un sujeto, el profármaco es metabolizado para producir el agente biológicamente activo. "Tratar" o "tratamiento" se refiere a cualquier tipo de tratamiento que imparte un beneficio a un sujeto que padece una enfermedad o malestar, incluyendo mejora en la condición del sujeto (v.gr., en uno o más síntomas), retraso en el progreso de la condición, prevención o retraso del inicio de la enfermedad o malestar, mejora en la funcionalidad fisiológica normal, etc.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 - Ilustra el modo de acción y la regulación de BNP. Figura 2 - Un esquema representativo para activación y conjugación de oligómero siguiendo una estrategia de conjugación de tres clases. Clase 1 - las porciones modificadoras son no hidrolízables, Clase 2 -las porciones modificadoras son microPAGiladas, y Clase 3 - las porciones modificadoras son completamente hidrolisables. Figura 3 - Producción por GMP cíclico de células HAEC como una función de concentración de hBNP o conjugado de hBNP (m = Nativo, Á = BN-002, T = BN-021 , *> = BN-0022, • = BN-024) Figura 4 - Digestión con tripsina de BNP y conjugado de BNP (- •- = Tiempo (min) vs % BN D1 , - ••• = Tiempo (min) vs % BND2, Y = Tiempo (min) vs % BND2, T = Tiempo (min) vs % BN034 D1 , m = Tiempo (min) vs % BN034 D2) Figura 5 - Niveles de plasma de conjugados de hBNP en varios tiempos después de la dosificación oral en ratas, (m = BN-002, A = BN-021 , = BN-022, • = BN-024). Figura 6 - Cromatograma que muestra una corrida preparativa para BN-54.

Figura 7, 8 y 9 - Cromatogramas representativos para los diferentes lotes de BN054, incluyendo el estándar de BNP asociado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los conjugados de compuesto natriurético de conformidad con algunas modalidades de la presente invención comprenden un compuesto natriurético que incluye un motivo de unión de receptor de péptido natriurético A (NPR-A), por lo menos un sitio de conjugación de porción modificadora, y por lo menos una porción modificadora unida al sitio de conjugación de porción modificadora. En virtud de la porción modificadora unida al compuesto natriurético como parte del conjugado, el conjugado de compuesto natriurético puede tener características hidrofílicas relacionadas modificadas con el compuesto natriurético nativo que no incluye una porción modificadora como se describe aquí. A manera de ejemplo y no de limitación, y no como se describe en forma más completa aquí, la porción modificadora puede adoptar la forma de un oligómero de cualquier variedad de tamaños, formas, sustituciones y configuraciones. 8.1 Compuesto natriurético Los conjugados de compuesto natriurético de la invención incluyen un compuesto natriurético que incluye un sitio de unión para un receptor de péptido natriurético, tal como NPR-A, así como un sitio de conjugación para acoplar una porción modificadora al mismo. 8.1.1 Péptido natriurético nativo El compuesto natriurético puede tener tener la secuencia de aminoácidos de un péptido natriurético nativo tal como ANP, BNP, CNP o DNP, urodilatin, de cualquiera de una variedad de especies, tales como humana, canina y ratas. Los péptidos natriuréticos preferidos son BNP humano, BNP de rata, BNP canino o hANP. También se pretende que las secuencias nativas incluyan péptidos y pre-pro péptidos pro-natriuréticos. 8.1.2 Análogos de compuesto natriurético El compuesto natriurético también puede ser un análogo biológicamente activo de un péptido natriurético nativo (un análogo natriurético). Por ejemplo, un análogo biológicamente activo puede ser un compuesto natriurético nativo con truncaciones, deleciones, inserciones, sustituciones, reemplazos, extensiones de cadena lateral y proteínas de fusión, o combinaciones de las anteriores que no eliminan la actividad biológica del compuesto original. Preferiblemente, el análogo incluirá un motivo de unión de NPR-A nativo o artificial y retendrá algo o toda la actividad para NPR-A de unión. Los análogos de polipéptido natriurético se pueden obtener de varios medios. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos en la estructura de péptido natriurético nativo sin eliminar la capacidad de unión interactiva. En algunos casos, como se ha descrito en la técnica, dichas modificaciones han dado por resultado una afinidad incrementada para NPR-A, en relación con NPR-C, el receptor de aclaramiento, dando por resultado una vida media prolongada. Preferiblemente, el análogo incluirá un motivo de unión de molécula natriurética, tal como un motivo de unión de NPR-A. El péptido natriurético puede ser, por ejemplo, definido por la secuencia: CFGRXMDRISSSSGLGC (SEQ ID NO 1 ), en donde X es un compuesto, tal como un residuo de aminoácido, incluyendo un sitio de conjugación de porción modificadora. X en algunas modalidades comprende un aminoácido al cual se puede unir una porción modificadora. Por ejemplo, X puede comprender el aminoácido LYs o Cys al cual se puede unir una porción modificadora. En otra modalidad, X puede ser otro distinto de lisina; en estas modalidades, el péptido no conjugado también es un aspecto de la invención en donde X es arginina u otro aminoácido distinto a la lisina al cual se puede crear un sitio de conjugación. Una estructura alternativa para estas modalidades es: CFGRX1MDRIX2GLGC (SEQ ID NO. 2), en donde X1 es lisína, X2 es uno a cuatro aminoácidos. X2 puede ser S, SS, SSS, SSSS (SEQ ID NO. 3), K, KS, KSS, o KSSS (SEQ ID NO. 4). En donde K se incluye como X2 o parte de las secuencias de X2, un sitio de conjugación de porción modificadora. El compuesto natriurétíco puede tener, por ejemplo, la estructura: X1-CFGRX3MDRISSSSGLGC-X2 (SEQ ID NO. 5), en donde por lo menos uno de X1 y X2 está presente, X1 es un péptido de 1 a 10 aminoácidos, en donde X2 es un péptido de 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6 aminoácidos, y en donde X3 es otro distinto de lisina, tal como arginina. Por ejemplo, X1 puede incluir todo un fragmento C-terminal de la secuencia 1-10 residuos de aminoácidos del N-terminal de hBNP. En una modalidad, X1 incluye SPZ1MVQGSG- (SEQ ID NO: . 6), SPZ1MVQG (SEQ ID NO. 7), SPZ1MVQ (SEQ ID NO. 8), SPZ1MV (SEQ ID NO. 9), SPZ1M (SEQ ID NO. 10), SPZ1, PZ1MVQGSG (SEQ ID NO. 11 ), Z1MVQGSG (SEQ ID NO. 12), en donde Z1 es lisína o arginina. En donde Z1 es lisina, se provee un sitio de conjugación de porción modificadora. En otra modalidad, X2 incluye todo o un fragmento N-terminal de la secuencia de 1-6 residuos de aminoácido del C-terminal de hBNP. En una modalidad, X2 es la secuencia Z2VLRRH (SEQ. ID. NO: . 13), Z2VLRR (SEQ. ID. NO:. 14), Z2VLR (SEQ. ID. NO: . 15), Z2VL, K, R, RVLRR (SEQ. ID. NO:. 16), RVLR (SEQ. ID. NO: . 17), RVL, RV, or R, en donde Z2 puede ser lisina o arginina. En donde Z2 es lisina, reprovee un sitio de conjugación de porción modificadora. En donde Z1 es lisína, Z2 puede ser otro distinto de lisina, y en donde Z2 es lisina, Z1 puede ser otro distinto de lisina. Alternativamente, X1 y X2 puede ser cualquier secuencia de aminoácidos de cola N-termínal y C-terminal obtenida a partir de cualquier péptido natriurético. En algunas modalidades, una secuencia de cola N- terminal y/o C-terminal está presente y no es específicamente la secuencia de cola N-terminal y C-terminal de hBNP o cualquier fragmento de la misma. Se apreciará que el compuesto natriurétíco no conjugado también es un aspecto de la invención. En una modalidad, el compuesto natriurético análogo comprende una secuencia de aminoácidos: X MVQGSGC1FGRX MDRISSSSGLGC2X3 (SEQ ID NO. 18), en donde X1, X2 y X3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de Lys y aminoácidos distintos de Lys, y en donde por lo menos uno de X1, X2 y X3 es Lys y por lo menos uno de X1, X2 y X3 es un aminoácido distinto de Lys; y C1 y C2 son cisternas y pueden ser acopladas por un enlace de disulfuro. Se apreciará que el análogo de péptido no conjugado es también un aspecto de la invención. En una modalidad, por lo menos uno de X1 X2 y X3 es Arg. En otra modalidad X1 es Lys, X2 es Arg y X3 es Arg. Esta modalidad también puede incluir una secuencia de aminoácidos como se describe aquí, N-terminal a X1 y C-terminal a X3. Por ejemplo, la secuencia de cola N-terminal, cuando está presente, puede ser S- o SP-, y la cola C-terminal, cuando está presente, puede ser -VLRRH (SEQ ID NO. 19), -VLRR (SEQ ID NO. 19), -VLR, -VL, o -V. En algunas modalidades, la secuencia de cola N-terminal y/o C-terminal está presente y es específicamente una cola no N-terminal y C-terminal de hBNP o un fragmento de la misma.

En otras modalidades, el análogo de péptido natriurético incluye una secuencia de aminoácidos: CFGRX1MDRISSSSGLGCX2 (SEQ ID NO:. 20), en donde por lo menos X1 y X2 es un aminoácido que comprende un sitio de conjugación de porción modificadora acoplado a la porción modificadora y el otro es cualquier otro aminoácido o una Lys no conjugada.

En una modalidad, X1 es Lys acoplada en su cadena lateral a la porción modificadora y X2 es otro aminoácido, por ejemplo Gly o Arg.

Alternativamente, X2 es Lys acoplado en su cadena lateral a la porción modificadora y X1 es otro aminoácido, por ejemplo Gly, Arg, o un aminoácido distinto a la lisina. En otra modalidad, X1 es Lys acoplado en su cadena lateral a la porción modificadora y X2 es Lys no conjugada. Alternativamente, X2 es Lys acoplada en su cadena lateral a la porción modificadora y X1 es una Lys no conjugada. Se apreciará que el péptido no conjugado también es un aspecto de la invención. Virtualmente cualquier péptído natriurético puede ser modificado de conformidad con la presente invención. A manera de ejemplo péptido/proteínas que son candidatos adecuados para modificación se describen en PCTUS0217667, que se incorpora específicamente aquí por referencia. BNP, por ejemplo, incluye residuos de Lys en la secuencia nativa que preferiblemente sirven como los sitios de conjugación para el oligómero. En algunas modalidades de la presente invención en las cuales BNP es el péptido nativo, puede ser deseable remover cualesquiera sitios de conjugación de la región de unión del péptido o eliminar un sitio de unión. En donde se desea que un oligólmero no se una a ningún residuo de Lys particular de la secuencia de péptido, la Lys puede ser reemplazada por otro aminoácido tal como arginina. Por ejemplo, la conjugación con oligómeros no hidrolizables en esta región puede ser perjudicial para la actividad, aunque los solicitantes han descubierto sorprendentemente que la conjugación en Lys14 da por resultado en una cantidad significativa de actividad retenida. Por lo tanto, puede ser deseable reemplazar dichos sitios de conjugación con aminoácidos que tengan propiedades químicas similares pero que no sean fácilmente conjugados. Por ejemplo, en la secuencia de hBNP, la Lys14 puede ser sustituida con Arg, y de esta manera favorecer la conjugación del péptido en la Lys3 de la secuencia de péptido para BNP nativo. Las sustituciones de aminoácidos se pueden seleccionar al reemplazar Lys con un aminoácido que no sea fácilmente conjugable. En algunos casos puede ser deseable añadir un sitio adicional para conjugación. Por ejemplo, en algunas modalidades, un residuo de aminoácido positivamente cargado es reemplazado con un residuo de Lys, por ejemplo, en el péptido ANP (secuencia nativa), Arg27 puede ser reemplazado por Lys. Las mutaciones para añadir un sitio de conjugación se pueden seleccionar de modo que la mutación y la conjugación no eliminen la actividad del conjugado de péptido resultante, y en particular su afinidad para NPR-A. En otra modalidad, el compuesto natriurético se define como la secuencia de aminoácido hBNP nativa con uno o más residuos de Lys insertados dentro de la secuencia de hBNP y/o añadidos en el extremo de la secuencia de hBNP, y/o uno o más residuos de Lys nativos deletados o reemplazados con sustituciones conservativas. Preferiblemente, dicha sustitución o inserción es una o más de las secuencias de aminoácidos de cola del péptido natriurético. El sitio de conjugación en algunas modalidades puede ser insertado, reemplazado o añadido en o cerca de la cola N-termmal, v.gr., una inserción o sustitución dentro de la secuencia de aminoácidos de cola N-terminal, preferiblemente en el N-terminal, o ubicado 1 ,2, 3, 4 ó d aminoácidos del N-terminal, o alternativamente, ubicado 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ó 9 aminoácidos en la dirección N-terminal del Cys N-terminal que forma una parte del puente de Cys que crea el bucle. En una modalidad preferida, el compuesto natriurético es definido como la secuencia de hBNP nativa con una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste de Lys3?Arg, Lys?4-»Arg, Arg3o?Lys, y Lys27?-Arg, en donde una o más mutaciones no eliminan la actividad biológica del compuesto de péptido natriurétíco. Además de más de una modalidad de modificación, tal como un oligómero, puede mejorar la estabilidad de enzima y/o incrementar la absorción. Muchos de los análogos de péptido natriurético incluirán el componente de bucle de un péptido natriurético nativo, tal como Cys?0-Cys26 de hBNP en el cual Cys10 y Cys2ß son acoplados por una unión de disulfuro formando así un bucle. En algunos casos, el bucle puede incluir sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos que difieren de las secuencias nativas, siempre que dichas sustituciones, deleciones, y/o ¡nsersiones no eliminen la actividad de las secuencias nativas. Ejemplos de dichas secuencias de bucle alteradas se pueden encontrar en Schoenfelda et al., "Mutations in B-type péptido natriurético mediating receptor-A selectivity", FEBS letters 414 (1998) 263-267, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad, describe variantes de BNP que unen preferencialmente al receptor de péptido natriurético A (NPR-A) comparado con el receptor-C (NPR-C). (Patente de E.U.A. 6,525,022 y patente de E.U.A. 6,028,055). Como un ejemplo, el bucle natriurétíco puede incluir un bucle nativo que tiene una o más sustituciones conservativas que no eliminan la actividad natriurétíca del bucle, v.gr., en algunos casos ese bucle tendrá la secuencia del bucle nativo (v.gr., el bucle nativo de hBNP) y tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones conservativas. En otra modalidad el bucle es acortado al remover un conjunto de aminoácidos que no elimina la actividad biológica. En otra modalidad, el péptido análogo incluye el bucle Cys10-Cys26 de hBNP en el cual Lys14 es reemplazado por Gly o Arg. En otra modalidad, el componente SSSS (SEQ ID NO. 3) del bucle es alterado o deletado. Además de los bucles o análogos del péptido natriurético de los bucles nativos pueden incluir una cola N-terminal y/o una cola C-terminal, tal como las colas de péptidos natriuréticos nativos, v.gr., hBNP?-9 y hBNP27-32-Las colas son aminoácidos individuales o péptidos que no eliminan la actividad biológica. En algunos casos, las colas pueden incluir sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos que difieren de las secuencias nativas, siempre que dichas sustituciones, deleciones y/o inserciones no eliminen la actividad benéfica de las secuencias nativas. En una modalidad la cola o colas se basan en secuencias nativas, pero truncadas por uno o más aminoácidos. Por ejemplo, la cola N-terminal, cuando está presente, se puede seleccionar de los siguientes segmentos de hBNP 8-9, 7-9, 6-9; 5-9, 4-9, 3-9, 2-9, y 1-9; y cualquiera de los segmentos anteriores en los cuales uno o más residuos de Lys es reemplazado por un residuo de Gly o Arg. De manera similar, una cola C-terminal, cuando está presente, se puede seleccionar de: segmentos de hBNP 27-28, 27-29, 27-30, 27-31 , y 27-32; y cualquiera de los segmentos hBNP anteriores en donde uno o más residuos de Lys reemplazado por un residuo Glly o Arg. Ejemplos de péptidos natriuréticos de bucle mas cola preferidos incluyen segmento 1-29 de hBNP; segmento de 1-26 de hBNP; y cualquiera de los segmentos de hBNP anteriores en los cuales uno o más residuos de Lys son reemplazados por un Gly o Arg. Además de los análogos anteriores, una amplia variedad de análogos adecuados para usarse en la invención se han descrito en la técnica. Por ejemplo, la patente de E.U.A. 5,114,923, expedida el 19 de mayo de 1992, cuya descripción se incorpora aquí en su totalidad, describe un péptido que tiene una actividad natriurética de la fórmula R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-lle-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2 (SEQ ID NO. 21 ) en donde R1 se selecciona de (H); Gly-; Ser-Gly-; Gly-Ser-Gly-; Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO. 22); Val-Gln-Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 23); Met-Val-GIn-Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 24); Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 25); Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO. 26); Ser-Pro-Lys-Met-Val-GIn-Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 27); y R3-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-(SEQ ID NO. 28) en donde R3 es la secuencia de 102 aminoácidos de las posiciones 1-99 para la proteína humana o la porción C-terminal de la misma, y R2 es (OH), NH2, NHR' o en donde la porción modificadora' y la porción modificadora" son independientemente alquilo inferior (1-4C) o R2 es Lys; Lys-Val; Lys-Val-Leu; Lys-Val-Leu-Arg (SEQ ID NO. 29); Lys-Val-Leu-Arg-Arg (SEQ ID NO. 30); Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (SEQ ID NO. 31 ); o las amidas (NH2, NHR' o NR' la porción modificadora") de la misma. La patente de E.U.A. 4,904,763, expedida el 2 de febrero de 1990, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad, también describe análogos de péptido natriulético adecuados para usarse en la presente invención, tales como X-Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg He Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His-OH (SEQ ID NO. 32) ,en donde X es H, H-Gly-Ser-Gly-, o H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO. 33). La patente de E.U.A. 4,904,763, expedida el 27 de febrero de 1990 (cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad) describe otros análogos de péptido natriurético adecuados para usarse en la presente invención, incluyendo X-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-lle-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Y (SEQ ID NO. 34) (en donde las 2 cisteínas están conectadas en puente por un enlace de disulfuro) en donde X es H o H-Asp-Ser.-Gly- e Y denota -Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr-OH (SEQ ID NO. 35), - Asn-Val-Leu-Arg-Arg-OH (SEQ ID NO. 36), -Asn-Val-Leu-Arg-Tyr-OH (SEQ ID NO. 37), -Asn-Val-Leu-Arg-OH (SEQ ID NO. 38), -Asn-Val-Leu-OH (SEQ ID NO. 39) o Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH (SEQ ID NO. 40) o una sal de los mismos. Otro conjunto de análogos adecuados para usarse se describen en la publicación del PCT No. WO8912069, publicada el 14 de diciembre de 1989. Un conjunto adicional de análogos de péptido natriuréticos para usarse en la presente invención se describe en la publicación de patente de E.U.A. No. 20030109430, publicada el 12 de junio de 2003, cuya descripción se describe aquí por referencia en su totalidad. Esta publicación describe un péptido que tiene actividad natriurética de la fórmula RYCys-Phe-Gly-Arg-Arg/Lys-Leu/Met-Asp-Arg-lle-Lys-Met-Gly/Ser-Ser-Leu/Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2 (SEQ ID NO. 41 ), en donde R1 se selecciona del grupo que consiste de: (H); Gly-; Ser-Gly-; Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-; Arg/His/GIn-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 42); Met Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 43); Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 44); Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 45); Pro-Lys-Thr/Met-MetA al-Arg/His/GIn-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 46); Ser-Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 47); o una secuencia de 10 a 109 aminoácidos de la secuencia hacia el extremo 5' nativa para BNP porcino, canino o humano, o una combinación de los mismos; R2 es (OH); NH2, o NR'R" en donde R' y R" son independientemente alquilo inferior (en este caso, 1-4C) o es Asn/Lys; Asn/Lys-Val; Asn/Lys-Val-Leu; Asn/Lys-Val-Leu-Arg (SEQ ID NO. 48); Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys (SEQ ID NO. 49); Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys-Tyr/His (SEQ ID NO. 50); o las amidas (NH2 o NR'R") de los mismos, con la condición de que si la fórmula es RYCys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-lle-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2 (SEQ ID NO. 51 ), y R1 es Asp-Ser-Gly-, R2 no puede ser Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr (SEQ ID NO. 52). Otro conjunto de análogos se describe en Scios, patente europea EP0542863B1 , expedida el 26 de noviembre de 1997, que describe una proteína de fusión que comprende de N-terminal a C-terminal: una proteína portadora de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 kDa que no contiene residuos Glu o secuencias de Asp-Gly como un sitio de digestión de Staph V8; una digestión de V8 que comprende un residuo de Glu o una secuencia de Asp-Gly ubicada en el C-terminal de dicho portador; y un péptido que no contiene un sitio de digestión de Staph V8 fusionado a dicho sitio de digestión; en donde la proteína de fusión presenta un pl de aproximadamente 8.0 o mayor. La patente también describe el uso de un líder N-terminal de 6 a 20 aminoácidos. Otros análogos de péptido natriurético adecuados para usarse en la presente invención se describen en Daiichi's, publicación de patente de E.U.A. No. 20020086843, publicada el 4 de julio de 2002 (cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad), que describe un polipéptido fisiológicamente activo X-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH (SEQ ID NO. 63) [en donde las 2 cisteínas están conectadas en puente] en donde X es H, H-Gly-Ser-GIy-, o H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly- (SEQ ID NO. 54). Al hacer dichas sustituciones, el índice hidropático de aminoácidos se puede considerar. La importancia del índice hidropático de aminoácidos en conferir función biológica interactiva en un polipéptido es generalmente entendido en la técnica. Se acepta que el carácter hidropátíco relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria del polipéptido resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas. A cada aminoácido se ha asignado un índice hidropático sobre la base de su carácter hidrofóbico y características de carga como sigue: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteíne/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparaginas (-3.5); Lys (-3.9); y Arg (-4.6). Como lo entenderán los expertos en la técnica, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hídropática similar y dan por resultado a un polipéptido con una actividad biológica similar, es decir, a un obtienen un poliéptido funcionalmente equivalente biológico. Al hacer dichos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2 unos de otros es preferida, aquellas que están dentro de ±1 unas de otras son particularmente preferidas, y aquellas dentro de ±O.d unas de otras son muy particularmente preferidas aun. Se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer de manera efectiva sobre la base de carácter hidrofílico. La patente de E.U.A. 4,554, 101 , cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad, provee que el carácter hidrofílico promedio local más grande de una proteína, como es regulado por el carácter hidrofílico de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de E.U.A. No. 4,564,101 , se han asignado los siguientes valores de carácter hidrofílico a los residuos de aminoácidos: Arg (+3.0); Lys (±3.0); aspartato (±3.0 ± 1 ); glutamato (±3.0 ± 1 ); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1 ); alanina (-0.5); hístidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.d); triptofano (-3.4). Como lo entienden los expertos en la técnica, un aminoácido puede sustituir a otro que tenga un valor de carácter hidrofílico similar y sin embargo obtener un polipéptido biológicamente equivalente y en particular un polipéptido inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de carácter hidrofílíco están dentro de ±2 uno de otro es preferido, aquellos que están dentro de ±1 unos de otros son particularmente preferidos, y aquellos están dentro de ±0.6 unos de otros son muy particularmente preferidos aun. Como se delineó, sustituciones/inserciones de aminoácidos se pueden basar en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su carácter hidrofóbico, carácter hidrofílíco, carga, tamaño y similares. Sustituciones ilustrativas (aminoácidos que pueden ser intercambiados sin alterar significativamente la actividad biológica del polipéptido) que toman en consideración algunas de las características anteriores son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, Arg y Lys; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Como lo entenderán los expertos en la técnica, análogos del péptido natriurético (v.gr., BNP) se pueden prepara mediante una variedad de técnicas de síntesis de péptido reconocidas incluyendo, pero sin limitarse a, métodos clásicos (solución), métodos de fase sólida, métodos semisintéticos, y métodos de ADN recombinante. 8.1.3 Multipéptido de BNP El compuesto natriurético también puede ser un multipéptido que tenga dos o más unidades de compuesto natriurético en secuencia y que incluya opcionalmente secuencias separadoras entre las unidades de compuesto natriurético. Los compuestos también pueden comprender opcíonalmente un líder y/o secuencia de extensión en cualquiera o en ambos extremos del compuesto de péptido natriurético. Por ejemplo, a manera de ejemplo y no de limitación y sin limitar la estructura y/o fórmula de cada multipéptido puede tener las siguientes estructuras: NP-[NP]n; NP-[Separador-NP]n; Líder-NP-[NP]n; Líder-NP-[Separador-NP]n; Líder-[Separador-NP]n; Líder-[Separador-NP]n-Extensión; Líder-NP-[Separador-NP]n-Extensión; en donde n puede ser, por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; NP es un péptido natriurético o análogo de péptido natriurétíco; El separador puede ser un residuo de aminoácido de residuos de aminoácidos que son digeribles por una enzima o un coctel de enzimas, preferiblemente un residuo de aminoácidos o secuencia de aminoácidos no presentes en NP (v.gr., Glu-Asp-Ala-Gly-Glu (SEQ ID NO. 55); Arg-Thr-Arg-Arg (SEQ ID NO. 56); Arg-X-Lys-Arg (SEQ ID NO. 57); Arg-Val; Asp-Lys; Lys-lle; Arg-Thr; Arg-lle). El líder puede ser por ejemplo un solo aminoácido, una secuencia de aminoácidos, un péptido (v.gr., péptido líder o péptido de señal), o una proteína; y líder se selecciona para bloquear el N-terminal de la conjugación, ayuda en la purificación del multipéptido (v.gr., (His)6-Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 58) - digerible por un coctel de enzimas: V8 proteasa (endoproteínasa Glu-C), (His)6-Ala-Asp-Arg-Thr-Arg-Arg- (SEQ ID NO. 59) o (His)6-Ala-Asp-Arg-X-Lys-Arg (SEQ ID NO. 60) en donde X puede ser cualquier aminoácido o (His)6-Ala-Asp-Arg-Glu-Arg-Arg (SEQ ID NO. 61 ) -digerido por Furin; (His)6-Ala-Asp-Arg-Val (SEQ ID NO. 62) - digerible por orocinasa; (Hís)6-Ala-Asp-Lys (SEQ ID NO. 63) o (His)6-Ala-Asp-Lys-lle (SEQ ID NO. 64) - digerible por enterocinasa; (His)6-Ala-Asp-Arg-Thr (SEQ ID NO. 65) o (His)6-Ala-Asp-Arg-lle- (SEQ ID NO. 66) digerible por el factor Xa o factor 10a), mejora la solubilidad y/o ayuda en la excreción de la célula (v.gr., Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 67)), y/o purificación (v.gr., (His)6-Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 68)); y el líder es preferiblemente digerible del multipéptido por digestión enzimática o química, preferiblemente por una enzima que no digiere al NP; el líder puede ser un péptido líder de un NP nativo; La extensión puede ser por ejemplo un solo aminoácido, una secuencia de aminoácidos, un péptido (v.gr., péptido líder o péptido de señal), o una proteína; y extensión se selecciona para bloquear el C-terminal de conjugación, ayuda en la purificación del multípéptido (v.gr., (His)6-Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 68)), mejora la solubilidad, y/o ayuda en la excreción de la célula, (v.gr., Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 67) - digerible por un coctel de enzima: V8 proteasa (endoproteinasa Glu-C) y endoproteinasa (Asp-N), Arg-Thr-Arg-Arg- (SEQ ID NO. 56) o Arg-X-Lys-Arg (SEQ ID NO. 57) en donde X puede ser cualquier aminoácido o Arg-Glu-Arg-Arg (SEQ ID NO. 69) -digerible por Furin; Arg-Val-digerible por coctel de enzimas urocinasa y carboxipeptida B; Asp-Lys o Lys-lle-digerible por enterocínasa; Arg-Thr o Arg-lle-digerible por el factor Xa o factor 10a); y extensión es preferiblemente digerible del multipéptido por digestión enzimática o química, preferiblemente por una enzima que no digeriría al NP. Sitios de digestión de enzima, tales como aquellos incluidos en el separados, o separando el líder y/o extensión del NP, se seleccionan preferiblemente de modo que una sola enzima o un coctel de enzimas digerirá todos los sitios de digestión. Por ejemplo, el sitio de digestión Arg-Thr-Arg-Arg (SEQ ID NO. 56) puede ser digerido por Furin. En una modalidad, el líder es (His)e-Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 68), la extensión es (His)6-Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 68), el separador es GluAla-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 70). Esta modalidad puede ser digerida por V8 proteasa (endoproteinasa Glu-C). El producto resultante es NP-Glu o conjugado de NP-Glu. En otra modalidad, el líder es (His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr-Arg-Arg (SEQ ID NO. 71 ) o Arg-X-Lys-Arg (SEQ ID NO. 72)) (en donde X puede ser cualquier aminoácido), la extensión es (Hís)e-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr-Arg-Arg (SEQ ID NO. 71 ) o Arg-X-Lys-Arg (SEQ ID NO. 72)) (en donde X puede ser cualquier aminoácido), y el separador es Arg-Thr-Arg-Arg (SEQ ID NO. 56) o Arg-X-Lys-Arg (SEQ ID NO. 57) (en donde X es cualquier aminoácido). Esta modalidad puede ser digerida por Furin. El producto resultante es NP o conjugado de NP. En otra modalidad, el líder es (His)6-Ala-Asp-Gly-Arg-Val (SEQ ID NO. 73), la extensión es (His)6-Ala-Asp-Gly-Arg-Val (SEQ ID NO. 73), y el separador es Arg-Val. Esta modalidad puede ser digerida por una Urocinasa/Carboxípeptidasa B. El producto resultante es NP o conjugado de NP. En otra modalidad, el líder es (His)6-Ala-Asp-Gly-(-Asp-Lys (SEQ ID NO. 74) o -Lys-lle (SEQ ID NO. 75)), la extensión es (His)6-Ala-Asp-Gly-(- Asp-Lys o -Lys-lle), y el separador es Asp-Lys o Lys-lle). Esta modalidad puede ser digerido por una enterocinasa. El producto resultante es NP o conjugado de NP. En otra modalidad, el líder es (His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr (SEQ ID NO. 76) o -Arg-lle (SEQ ID NO. 77)), la extensión es (His)6-Ala-Asp-Gly-(-Arg-Thr (SEQ ID NO. 76) o -Arg-lle (SEQ ID NO. 77)), y el separador es Arg-Thr o Arg-lle. Esta modalidad puede ser digerida por un coctel de enzimas de Factor Xa o Factor 10a/Carboxipeptidasa. El producto resultante es NP o conjugado de NP. En otra modalidad, el separador es Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp- Pro-Arg (SEQ ID NO. 78), el líder es Glu-Gly-Asp-Arg-Arg (SEQ ID NO. 79), y la extensión es (His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg (SEQ ID NO. 80). En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser linerado usando un coctel de enzimas tripsina y carboxipeptidasa B bajo condiciones controladas. En otra modalidad, el separador es Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp- Arg-Arg (SEQ ID NO. 81 ), el líder es Glu-Gly-Asp-Arg-Arg (SEQ ID NO. 82), la extensión es (His)6-AAA-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg (SEQ ID NO. 83), en donde AAA es una secuencia de aminoácidos de 3 a 40 residuo de aminoácido de longitud, preferiblemente 3-15. En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando un coctel de enzimas tripsina y carboxipeptídasa B bajo condiciones controladas. En otra modalidad, el separador es Arg-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg (SEQ ID NO. 84), el líder es Glu-Gly-Asp-Pro-Arg (SEQ ID NO. 85), y la extensión es (His)6-Glu-Gly-Asp-Pro-Arg (SEQ ID NO. 86). En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando un coctel de enzimas trombina y carboxipeptidasa B. En otra modalidad, el separador es Ala-Arg-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg (SEQ ID NO. 87), el líder es Glu-Gly-Asp-Pro-Arg (SEQ ID NO. 88), y la extensión es (His)6-Glu-Gly-Asp-Pro-Arg (SEQ ID NO. 89). En esta modalidad, the NP o conjugado de NP puede ser liberado usando un coctel de enzimas trombina y carboxipeptidasa A. En otra modalidad, el separador es Met-Met, el líder es Met-Met, y la extensión es (His)6-AAA-Met-Met (SEQ ID NO. 90), en donde AAA es cualquier secuencia de aminoácidos de 3 a 40 residuos de aminoácidos de longitud. En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando CNBr. En otra modalidad, el separador es Asp-Asp-Ala-Gly-Glu (SEQ ID NO. 91 ), el líder es Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 92), y la extensión es (His)6-Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 58). En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando un coctel de V8 proteasa (endoproteinasa Glu-C) y endoproteinasa Asp-N. En otra modalidad, el separador es Glu-Ala-Gly-Glu (SEQ ID NO. 93), el líder es Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 67), y la extensión es (His)6-Ala- Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 68). En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando a V8 proteasa (endoproteinasa Glu-C) para dar NP-Glu, un análogo de NP novedoso o un conjugado de NP Glu.

En otra modalidad, el separador es Glu-Glu, el líder es Glu-Gly-Asp-Ala (SEQ ID NO. 94) en el C-terminal y la extensión es Glu-Gly-Asp-Ala(His)6-Glu (SEQ ID NO. 95), en donde el C-terminal es enlazado con una pareja de fusión, una proteína de fusión apropiada, que puede ser, por ejemplo, digerible por enterocinasa. En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando una V8 proteasa (endoproteinasa Glu-C) para dar NP-Glu, un análogo de NP novedoso o un conjugado de NP Glu. En otra modalidad, el separador es Glu-Glu, el líder es Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 67) y la extensión es (His)6-Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 68) en donde el N-terminal es enlazado con una pareja de fusión, una proteína de fusión apropiada, que puede ser, por ejemplo, digerible por enterocinasa. En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando a V8 proteasa (endoproteinasa Glu-C) para dar NP-Glu, un análogo de NP novedoso o un conjugado de NP Glu. En otra modalidad, el separador es Glu-Glu, el líder es Glu-Gly- Asp-Ala-Glu (SEQ ID NO. 96) y la extensión es Glu-Gly-Asp-Ala-Glu (SEQ ID NO. 96), y el C-terminal es enlazado con una pareja de fusión, una proteína de fusión apropiada. En esta modalidad, the NP o conjugado de NP puede ser liberado usando una V8 proteasa (endoproteinasa Glu-C) para dar NP-Glu, un análogo de NP noveodos, o un conjugado de NP Glu. En otra modalidad, el separador es Glu-Glu, el líder es Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 67) y la extensión es Glu-(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu (SEQ ID NO. 97) en donde el N-terminal es enlazado con una pareja de fusión, una proteína de fusión apropiada. En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando una V8 proteasa (endoproteinasa Glu-C) para dar NP-Glu, un análogo de NP novedoso o un conjugado de NP Glu. 8.2 Porciones modificadoras Las porciones modificadoras son porciones que modifican al compuesto natriurético, tal como un compuesto de péptido BNP, y proveen el compuesto con propiedades deseadas como se describe aquí. Por ejemplo, la porción modificadora puede reducir la tasa de degradación del compuesto natriurético en varios ambientes (tales como el tracto gastrointestinal y/o el torrente sanguíneo), de tal manera que menos del compuesto natriurético es degradado en la forma modificada que sería degradada en ausencia de la porción modificadora en dichos ambientes. Las porciones modificadoras preferidas son aquellas que permiten al compuesto natriurétíco conjugarse para retener un porcentaje terapéuticamente significativo de la actividad biológica del compuesto natriurético progenitor. 8.2.1 Porciones que afectan la estabilidad, solubilidad v/o actividad biológica Existen numerosas porciones que pueden ser unidas al compuesto natriurético para formar los conjugados del compuesto natriurético que aquí se describen y modifican la estabilidad, solubilidad y/o actividad biológica del compuesto natriurético original. Ejemplos incluyen polímeros u oligómeros hidrofílicos, polímeros u olígómeros anfifílícos y polímeros u oligómeros lipofílicos. Los polímeros (u olígómeros de cadena más corta) pueden incluir enlaces débiles o degradables en sus estructuras de base. Por ejemplo, los polialquilenglicoles pueden incluir enlaces hidrolíticamente inestables, tales como láctido, glicólido, carbonato, éster, carbamato y similares, que son susceptibles a hidrólisis. Esto permite a los polímeros ser digeridos en fragmentos de peso molecular inferior. Ejemplos de dichos polímeros se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,153,211 de Hubbell et al. Polímeros y oligómeros hidrofílicos, anfifílicos y lipofílicos representativos se describen con más detalle más adelante. 8.2.2 Porciones hidrofílicas La porción hidrofílica puede ser varias porciones hidrofílicas como lo entenderán los expertos en la técnica que incluyen pero no se limitan a, porciones de polialquilenglicol, otros polímeros hidrofílícos, porciones de azúcar, porciones de polisorbato y combinaciones de los mismos. 8.2.2.1 Porciones de polialquilenglicol Los polialquilenglicoles son compuestos que repiten unidades de alquilenglicol. En algunas modalidades, las unidades son todas idénticas (v.gr., polietilenglicol o polipropilenglicol). En otras modalidades, las unidades alquileno son diferentes (v.gr., polietilen-co-propilenglícol, o PLURONICS®). Los polímeros pueden ser copolímeros aleatorios (por ejemplo, en donde el óxido de etileno y óxido de propileno son co-polimerizados) o copolímeros ramificados o de injerto. El políetilenglicol, o PEG, es un polietílenglicol preferido y es útil en aplicaciones biológicas porque tiene propiedades altamente deseables y es generalmente considerado como seguro (GRAS) por la Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Fármacos). PEG tiene la fórmula -(CH2CH20)n-, en donde n puede variar de aproximadamente 2 a aproximadamente 4000 o más. PEG típicamente es incoloro, inodoro, soluble en agua o miscíble con agua (dependiendo del peso molecular), estable al calor, químicamente inerte, hidrolíticamente estable y generalmente no tóxico. PEG es también biocompatible y típicamente no produce una respuesta inmune en el cuerpo. Las porciones de PEG preferidas de la invención incluyen un número de subunidades de PEG seleccionadas de los siguientes intervalos mostrados en orden de preferencia cada vez mayor: 2-50, 2-40, 2-30, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10. En ciertas modalidades, las porciones modificadoras incluirán 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 subunidades. El PEG puede ser monodisperso (v.gr., como fue anteriormente descrito or los solicitantes en las solicitudes de patente de E.U.A. Nos. 09/873,731 y 09/873,797, ambas presentadas el 4 de junio de 1001 cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad) o polidisperso como comúnmente son suministrados en el mercado. Por monodisperso se entiende que el polialquilenglicol puede tener un solo peso molecular, o un intervalo relativamente estrecho de pesos moleculares. Una ventaja de usar los polímeros de monodispersos de peso molecular relativamente bajo es que forman moléculas conjugadas fácilmente definidas que pueden facilitar la síntesis reproducible y la aprobación de la FDA. El PEG puede ser un polímero lineal con un grupo hidroxílo en cada término (antes de ser conjugado al resto del compuesto natriurético). El PEG también puede ser un alcoxi PEG, tal como metoxi-PEG (o mPEG), en donde un término es un grupo alcoxi relativamente inerte, mientras que el otro término es un grupo hidroxilo (que es acoplado al compuesto natriurético). El PEG también puede ser ramificado, que en una modalidad puede ser representado como R(-PEG-OH)m en el cual R representa un agente de núcleo central (típicamente polihídrico) tal como pentaeritritol o glicerol, y m representa el número de brazos. Cada rama puede ser diferente y puede ser terminada, por ejemplo, con éteres y/o esteres. El número de brazos m puede variar de tres a cien o más, y uno o más de los grupos hidroxilo terminales pueden ser acoplados al resto del compuesto natriurético, o de otra manera sujetos a modificación química. Otro PEG ramificado incluye aquellos representados por la fórmula (CH30-PEG-)pR-Z, en donde p es igual a 2 ó 3, R representa un núcleo central tal como Lys o glícerol, y Z representa un grupo tal como carboxilo que está sujeto a activación química preparada. Otra forma ramificada, el PEG colgante, tiene grupos reactivos, tales como carboxilos, a lo largo de la estructura de base de PEG más que, o además de el extremo de las cadenas de PEG. PEG bifurcado puede ser representado por la fórmula PEG(-LCHX2)n es otra forma de PEG ramificado, en donde L es un grupo enlazador y X es un grupo terminal activado. El polietilenglicol terminal o PEG representa o incluye todas las formas de PEG lineal o ramificado y el polialquilenglicol o PEG incluye todas las formas de PEG lineal o ramificado. 8.2.2.2 Porciones de azúcar Los compuestos natriuréticos descritos aquí pueden incluir porciones de azúcar, tal como lo conocen los expertos en la técnica. En general, la porción de azúcar es un producto de cargohidrato de por lo menos un grupo sacarosa. Porciones de azúcar representativas incluye, pero no se limitan a, porciones de glicerol, mono, di, tri y oligosacáridos, y polisacáridos tales como almidones, glicógeno, celulosa y gomas de polisacárido. Los monosacáridos específicos incluyen azúcares de C6 y superiores (preferiblemente de C6 a C8) tales como glucosa, fructosa, mañosa, galactosa, ribosa y sedoheptulosa; los di y tri sacáridos incluyen porciones que tienen dos o tres unidades de monosacárido (preferiblemente de C5 a C8) tal como sacarosa, celobiosa, maltosa, lactosa y rafinosa. Un ejemplo de una porción modificadora que incluye una porción de azúcar es la siguiente: La conjugación que usa porciones de azúcar se describe en las patentes de E.U.A. 5,681 ,811 , 5,438,040, y 5,359,030, cuya referencia se incorpora aquí por referencia en su totalidad. 8.2.2.3 Porciones de polisorbato La porción de polisorbato puede ser varias porciones de polisorbato como lo entenderán los expertos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a esteres de sorbitán y polisorbato deribado con polioxietileno. La conjugación que usa porciones de polisorbato se describe en las patentes de E.U.A. 5,681 ,811 , 5,438,040, y 5,369,030, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad. 8.2.2.4 Porciones policatiónicas solubles en agua biocompatibles En algunas modalidades, se pueden usar polímeros policatiónicos solubles en agua biocompatibles. Los polímeros policatiónicos solubles en agua biocompatibles incluyen, por ejemplo, cualquier polímero que tenga heterociclos protonados unidos como grupos colgantes. "Soluble en agua" significa que el polímero entero es soluble en soluciones acuosas, tales como solución salina regulada en su pH o solución salina regulada en su pH con cantidades pequeñas de solventes orgánicos añadidos como solventes, a una temperatura entre 20 y 37°C. En algunas modalidades, el polímero mismo no es suficientemente soluble en soluciones acuosas como tal sino que se lleva a solución injertando con polímeros solubles en agua tales como cadenas de PEG. Ejemplos incluyen poliaminas que tienen grupos amina ya sea en la estructura de base de polímero o las cadenas laterales de polímero, tales como poly-L-Lys y otros poliaminoácidos positivamente cargados de aminoácidos naturales o sintéticos o mezclas de aminoácidos, incluyendo poli(D-Lys), polí(ornitina), poli(Arg), y poli(histidina), y poliaminas no peptídicas tales como poli(aminoestireno), poli(aminoacrilato), poli (N-metil aminoacrilato), poIi(aminoacrilato de N-etilo), poli(aminoacrilato de N,N-dimetilo), poli(aminoacrilato de N,N-díetilo), poli(aminometacrilato), poli(amino-metacrilato de N-metilo), poli(aminometacrilato de N-etilo), poli(aminometacrilato de N,N-dimetilo), poli(aminometacrílato N,N-dietilo), poli(etileneimina), polímeros de aminas cuaternarias, tales como cloruro de poli(N,N,N-trimetilaminoacrilato), cloruro de poli(metacrilamidopropiltrimetilamonio), y polisacáridos naturales o sintéticos tales como quitosán. 8.2.2.5 Otras porciones hidrofílicas También se pueden usar otros polímeros hidrofílícos. Ejemplos incluyen polioles(polioxietilados) tales como glicerol poli(oxietilado), sorbitol poli(oxietilado) y glucosa poli(oxietilada); el alcohol poli( vinílico) ("PVA"); dextrano; polímeros basados en carbohidratos y similares. Los polímeros pueden ser homopolímeros o copolímeros interpolímeros aleatorios o de bloque basados en los monómeros de los polímeros anteriores, de cadena lineal o ramificada. Ejemplos específicos de polímeros adicionales adecuados incluyen pero no se limitan a poli(oxazolina), poli(acriloilmorfolina) difuncional ("PAcM"), y poli(vinilpirrolidona)("PVP"). PVP y poli(oxazolina) son polímeros bien conocidos en la técnica y su preparación debe ser fácilmente evidente para el experto en la técnica. PAcM y su síntesis y su uso se describen en las patentes de E.U.A. 6,629,384 y 6,631 ,322, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad. 8.2.3 Porciones polianiónicas bioadhesivas Ciertos polímeros hidrofílicos parecen tener propiedades bioadhesívas potencialmente útiles. Ejemplos de dichos polímeros se encuentran, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,197,346 de Mathowitz, et al. Aquellos polímeros que contienen grupos carboxílo (v.gr., ácido (poli acrílico)) presentan propiedades bioadhesivas, y también son fácilmente conjugados con compuestos natriuréticos aquí descritos. Polímeros rápidamente biodesgastables que exponen grupos ácido carboxílico a degradación, tales como poli(láctido-co-glicólido), polianhídrídos, y poliortoésteres, son también polímeros bioadhesivos. Estos polímeros se pueden usar para suministrar los compuestos natriuréticos al tracto gastrointestinal. A medida que los polímeros se degradan, pueden exponer grupos ácido carboxílico para permitirles adherirse fuertemente al tracto gastrointestinal y pueden añadirse en el suministro de los conjugados del compuesto natriurético. 8.2.4 Porciones lipofílicas En algunas modalidades, la porción modificadora comprende una porción lipofílica. La porción lipofílica puede ser varias porciones lipofílicas como lo entienden los expertos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a porciones alquilo, porciones alquenílo, porciones alquinilo, porciones arilo, porciones arilalquilo, porciones alquilarilo, porciones ácido graso, adamantantilo y colesterilo, así como pol'meros y/u oligómeros lipofílicos. La porción alquiilo puede ser una cadena de hidrocarburo saturada o insaturada, lineal, ramificada o cíclica. En algunas modalidades, la porción alquilo tiene por lo menos 1 , 2, 3, o más átomos de carbono. En otras modalidades, la porción alquilo es una porción alquilo lineal, saturada o insaturada que tiene entre 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 átomos de carbono. Ejemplos incluyen porciones alquilo lineal saturado tales como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, octadecilo, nonadecilo y eicosilo; porciones alquilo ramificadas, saturadas tales como isopropílo, sec-butilo, ferf-butilo, 2-metilbutilo, ferf-pentilo, 2-metil- pentilo, 3-metílpentilo, 2-etílhexilo, 2-propilpentilo; y porciones alquilo insaturadas derivadas de las porciones alquilo saturadas anteriores incluyendo, pero sin limitarse a, vinilo, alilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, etinilo, 1-propinilo, y 2-propinilo y porciones alquilo insaturadas derivadas de las porciones alquilo saturado anteriores incluyendo pero sin limitarse a vinílo, alilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, etinilo, 1 -propinilo, y 2-propinilo. En otras modalidades, la porción alquilo es una porción alquilo ¡nferior. En otras modalidades, la porción alquilo es una porción alquilo inferior de C-i a C3. En algunas modalidades, la porción modificadora específicamente no consiste de una porción alquilo, o específicamente no consiste de una porción alquilo inferior, o específicamente no consiste de una porción alcano, o específicamente no consiste de una poción alcano inferior. Los grupos alquilo pueden ser no sustituidos o sustituidos con uno o más sustituyentes, y dichos sustituyentes preferiblemente ya sea no interfieren con los métodos de síntesis de los conjugados o eliminan la actividad biológica de los conjugados. La funcionalidad potencialmente interferente puede ser adecuadamente bloqueada con un grupo protector para hacer la funcionalidad no interferente. Cada sustituyente puede ser opcionalmente sustituido con sustituyentes no interferentementes adicionales. El término "no interferente" caracteriza a los sustituyentes como que no afectan adversamente ninguna reacción que ha de ser realizada de acuerdo con el procedimiento de esta invención. La porción ácido graso pueden ser varias porciones ácido graso incluyendo porciones ácido graso naturales o sintéticas, saturadas o ¡nsaturadas, lineales o ramificadas. En algunas modalidades, la porción ácido graso tiene por lo menos 2, 3, 4 o más átomos de carbono. En otras modalidades, la porción ácido graso tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 ó 24 átomos de carbono. Cuando la porción modificadora es un anillo de arilo, el anillo puede ser funcionarizado con un grupo funcional nucleofílico (tal como OH, SH, o NHR') que es colocado de manera que puede reaccionar de una manera intramolecular con la porción carbamato y ayudar en su hidrólisis. En algunas modalidades, el grupo nucleofílico es protegido con un grupo protector capaz de ser hidrolizado o de otra manera degradado in vivo, siendo el resultado que cuando el grupo protector es desprotegido, la hidrólisis del conjugado y la liberación resultante del compuesto natriurético progenitor es facilitada. 8.2.5 Porciones anfifílicas En algunas modalidades, la porción modificadora incluye una porción anfifílica. Muchos polímeros y oligómeros son anfifílicos. Estos son a menudo co-polímeros de bloque, copolímeros ramificados o copolímeros de injerto que incluyen porciones hídrofílicas y lipofílicas, que pueden estar en forma de oligómeros o polímeros, tales como polímeros o copolímeros de cadena lineal, ramificada o de injerto. Los polímeros u oligómeros hidrofílicos descritos pueden incluir combinaciones de cualquiera de las porciones lipofílicas e hidrofílicas aquí descritas. Dichos polímeros u oligómeros típicamente incluyen por lo menos un grupo funcional reactivo, por ejemplo, halógeno, hidroxilo, amina, tiol, ácido sulfónico, ácido carboxílico, isocianato, epoxi, éster y similares, que a menudo están en el extremo Terminal del polímero. Estos grupos funcionales reactivos se pueden usar para unirse a un grupo alquiilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, o alquilarilo de cadena lineal o ramificada lipofílico o a un polímero u oligómero lipofílico, incrementando así el carácter lipofílico de los polímeros u oligómeros hidrofílicos (y haciéndolos así generalmente anfifílico). Los grupos lipofílicos pueden ser, por ejemplo, derivados de ácidos monocarboxílicos o dicarboxílicos, o en donde es apropiado, equivalentes reactivos de ácidos carboxílícos tales como anhídridos o cloruros ácidos. Ejemplos de precursores adecuados para los grupos lipofílicos son ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido isobutírico, ácido trimetilacético, ácido caproico, ácido caprílico, ácido heptanoico, ácido cáprico, ácido pelargónico, ácido laurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido behénico, ácido lígnocérico, ácido cerático, ácido monoetanoico, ácido isostearico, ácido isononanoico, ácido 2-etilhexanoico, ácido oleico, ácido ricinoleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido erúcico, ácido graso de soya, ácido graso de linaza, ácido graso de ricino deshidratado, ácido graso de aceite de madera, ácido graso de aceite de tung, ácido graso de girasol, ácido graso de cártamo, ácido acrílico, ácido metacrílico, anhídrido maleico, anhídrido ortoftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, ácido atípíco, ácido acelaico, ácido cebásico, anhídrido tetrahidroftálico, anhídrido hexahidroftálico, ácido succínico y ácidos carboxílicos de poliolefina. Los grupos lipofílicos terminales no necesariamente son equivalentes, es decir, los copolímeros resultantes pueden incluir grupos lipofílicos terminales que son los mismos o diferentes. Los grupos lipofílicos se pueden derivar de más de un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, aralquilo o alquilarilo mono funcionales o difuncionales como se definió antes. 8.2.5.1 Porciones modificadoras de PEG/alquilo La porción modificadora puede ser una porción polímérica lineal o ramificada que comprende una o más porciones polialquilenglicol lineal o ramificado y/o una o más porciones alquilo sustituido o no sustituido, lineal o ramificada. Sin embargo, en ciertas modalidades, la porción modificadora específicamente no consiste de una porción alquilo y en otras modalidades la porción modificadora específicamente no consiste de una porción alcano. Las porciones de polialquilenglicol en algunas modalidades incluye 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 2d subunidades de PAG, preferiblemente subunídades de PEG o PPG o combinaciones de las mismas. Las porciones alquilo son saturadas o insaturadas y son preferiblemente de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 átomos de carbono. Las porciones alquilo son preferiblemente son porciones alcano.

La porción modificadora puede tener, por ejemplo, una fórmula: (fórmula I) en dondein cada C se selecciona independientemente y es una porción alquilo que tiene m carbonos y m es 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 1 d, 16, 17, 18, 19 ó 20; y cada PAG se selecciona independientemente y es una porción polialquilenglicol que tiene n subunidades y n es 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25; cada X se selecciona independientemente y es una porción de enlace que acopla PAG a C, y es preferiblemente -C-, -O-, -C(O)-, -C(0)0-, -OC(O)-, -NH-, -NHC(O)-, o -C(0)NH-. En algunas modalidades, la porción Cm-X está ausente, y la porción PAGn es terinada con un grupo bloqueador, tal como una porción -OH o una porción -OCH3. Por ejemplo, el PAG puede ser PEG methoxi-terminado o hidroxi-terminado, que tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 PEG subunidades. En una modalidad prefrida, la porción modificadora tiene una fórmula: (fórmula 1A) en dondein C, m, X y n son como se describió anteriormente para la fórmula I. Preferiblemente n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. X es preferiblemente 0, y m es preferiblemente 1. En otra modalidad preferida, la porción modificadora tiene una fórmula: (fórmula 1 B) en donde n es como se describió anteriomente para la fórmula I.

Preferiblemente n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. En otro aspecto, la porción modificadora puede tener una fórmula: (fórmula II) en donde PAG es una porción polialquilenglicol que tiene n subunidades y n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25; X es -O-, o -NH-; cada o se selecciona independientemente y es 0, 1,2, 3, 4, 5,6, 7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15. En otro aspecto, la porción modificadora puede tener una fórmula: (fórmula lll) en donde cada C se selecciona independientemente y es una porción alquilo que tiene m carbonos y m es 1 , 2, 3, 4, 5, 6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20; y cada PAG se selecciona independientemente y es una porción polialquílenglicol que tiene n subunidades y n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 26; cada X se selecciona independientemente y es una porción enlazada que acopla PAG a C, y es preferiblemente -C-, -O-, -C(O)-, -C(0)0-, -OC(O)-, -NH-, -NHC(O)-, o -C(0)NH-; o es 0, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 16. La porción Cm-X puede estar ausente, y la porción PAGn termina con una porción -OH o una porción -OCH3. Por ejemplo, el PAG puede ser metoxi-terminado o hidroxi-terminado PEG, que tiene 1,2,3, 4, d, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 1 d, 16, 17, 18, 19 o 20 subunidades.

En otro aspecto, la porción modificadora puede tener una fórmula: (fórmula IV) en donde cada C se selecciona independientemente y es una porción alquilo saturada o insaturada que tiene m carbonos y m es 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20; y cada PAG se selecciona independientemente y es una porción polialquilenglicol que tiene n subunidades y n es 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25; cada X se selecciona independientemente y es una porción enlazada que acopla PAG a C, y es preferiblemente -C-, -O-, -C(O)-, -C(0)0-, -OC(O)-, -NH-, -NHC(O)- o -C(0)NH-. Se apreciará que los oligómeros de las fórmulas I, IA, IB, II, lll y IV son por sí mismos aspectos de la invención. Los oligómeros se pueden proveer, por ejemplo, como alcoholes primarios o como oligómeros activados (véase la sección 8.7.1 por ejemplo), y se puede usar para conjugar compuestos biológicamente activos, otro distinto de BNP, tal como insulina, calcitonina, interferones, hormonas de crecimiento, etc. En otro aspecto, la porción modificadora puede tener una fórmula: (fórmula V) en donde cada R se selecciona independientemente y es cualquiera de las fórmulas I, II, lll o IV anteriores. En modalidades particularmente preferidas, la porción modificadora se selecciona de las siguientes: (cuando esta porción modificadora es acoplada a Lys3, de BNP humano como un monoconjugado, la porción resultante es referida como BN-054). En una modalidad preferida, la porción modificadora tiene la fórmula: o CmX(CH2CH20)n. .(OCH2CH2)nXCp (fórmula IA) en donde C, m, X y n son como se describió anteriormente para la fórmula I. En otra modalidad preferida, la porción modificadora tiene la fórmula: O H3CO(CH2CH20)n. -(OCH2CH2)nOCH3 (fórmula IB) en donde n es como se describió antes en la fórmula I. Las características farmacéuticas de carácter hidrofílico/lipofílico de los conjugados se puede variar ajustando el número de monómeros de PEG, el tipo y longitud de la cadena de alquilo, la naturaleza del enlace de PEG-péptido, y el número de sitios de conjugación. La naturaleza exacta del enlace de PEG-péptido se puede variar de tal manera que sea estable y/o sensible a hidrólisis a un pH fisiológico o en plasma. 8.2.6 Porciones formadoras de sal En algunas modalidades, la porción modificadora comprende una porción formadora de sal. La porción formadora de sal pueden ser varias porciones formadoras de sal adecuadas como lo entenderán los expertos en la técnica incluyendo pero sin limitarse a carboxilato y amonio. En algunas modalidades en donde la porción modificadora incluye una porción formadora de sal, el conjugado de compuesto natriurético se provee en forma de sal. En estas modalidades, el conjugado de compuesto natriurético está asociado con un contraion farmacéuticamente aceptable adecuado como lo entenderán los expertos en la técnica incluyendo pero sin limitarse a ¡ones negativos tales como cloro, bromo, yodo, fosfato, acetato, carbonato, sulfato, tosilato y mesilato, o iones positivos tales como sodio, potasio, calcio, litio y amonio. La porción modificadora puede incluir cualesquiera porciones hidrofílicas, porciones lipofílicas, porciones anfifílicas, porciones formadoras de sal y combinaciones de las mismas. En modalidades preferidas, la porción modificadora se selecciona del grupo que consiste de (CH2CH20)pCH3 en donde p es 0, 1 , 2, 3, 4, d, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20; (CH2)qCH3 en donde q es 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20; CH2CH2(OCH2CH2)rOH en donde r es 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20; C(CH2OH)3; CH(CH2OH)2; C(CH3)3; CH(CH3)2; CH2CH2(OCH2CH2)sC(0)(CH2)tCH3 en donde s es 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 y t es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20; y (CH2CH20)yC(0)(CH2)zCH3 en donde y es 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 y z es 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20. Los ejemplos anteriores de porciones modificadoras para propósitos específicos se pretenden como ilustrativos de la invención y no deben tomarse como limitantes de ninguna manera. Un experto en la técnica reconocerá que las porciones adecuadas para conjugación para lograr funcionalidad particular será posible dentro de los límites de los mecanismos de conjugación química descritos y reivindicados aquí. Por consiguiente, porciones adicionales se pueden seleccionar y usar de acuerdo con los principios de la invención como se describe aquí. 8.3 Estrategias de conjugación Los conjugados de compuesto natriurético de la invención pueden tener un nivel diferente de actividad biológica en relación con los conjugados de compuesto natriurético no conjugados correspondientes. En algunas modalidades, el compuesto natriurético retiene algo o toda ia actividad de la forma no modificada, pero en virtud de los factores tales como el grado de conjugación con porciones modificadoras, selección de sitios de conjugación en la molécula y selección de porciones modificadoras, es menos susceptible a degradación in vivo, y por lo tanto, tiene una vida media en el plasma incrementada. Por ejemplo, los compuestos natriuréticos de la invención pueden ser modificados para incluir una porción modificadora en uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sitios en la estructura de compuesto natriurético en sitios de unión apropiados (es decir, conjugación de porción modificadora) adecuados para facilitar la asociación de la porción modificadora en los mismos. A manera de ejemplo, dichos sitios de conjugación adecuados pueden comprender un residuo de aminoácido, tal como residuo de aminoácido Lys. En muchas modalidades, por ejemplo, el agente biológicamente activo funciona en parte uniéndose a un sitio activo en un receptor. A menudo, cuando un grupo funcional, tal como un residuo de aminoácido es modificado, el agente ya no se une más en el sitio activo. En el caso de BNP, por ejemplo, el péptido tiene una afinidad particular para unirse a NPR-A. Dependiendo del sitio en el cual la molécula natriurética es modificada para incluir el grupo de modificación, la afinidad que tiene el BNP para el receptor puede ser la misma o puede ser reducida. En algunas modalidades, los conjugados de compuesto natriurético tienen menos actividad que los conjugados de compuesto natriurético no conjugados nativos, pero retiene características mejoradas en relación con conjugados de compuesto natriurético no conjugados, tales como resistencia incrementada a proteólisis y vida media en el plasma o capacidad para cruzar una membrana celular. Se contempla que la actividad reducida puede ser preferida, por ejemplo, cuando es deseable la liberación a largo plazo del compuesto natriurético. En algunas modalidades, los conjugados de compuesto natriurético son monoconjugados. En otras modalidades, los conjugados de compuesto natriuréticos son multiconjugados tales como diconjugados, triconjugados, tetraconjugados, pentaconjugados y similares. El número de porciones modificadoras en el compuesto natriurético está limitado únicamente por el número de sitios de conjugación en el compuesto natriurético. En otras modalidades más, los conjugados de compuesto natriurético de la presente invención son una mezcla de conjugados de porción de mono, di, tri, tetra, y/o pentamodificación. Por ejemplo, en algunas modalidades, de compuesto natriurético biológicamente activo es hBNP, que incluye dentro de su secuencia de 32 aminoácidos nativos cuatro sitios de conjugación preferidos, incluyendo el N-terminal, Lys3, Lys14 y Lys27. El trabajo de los inventores apunta a mooconjugados conjugados en el N-terminal, Lys3, Lys14 o Lys27, y diconjugados en Lys3/Lys14 y Lys3/Lys27 como estrategias ampliamente preferidos para hBNP y péptidos natriuréticos relacionados y análogos. La porción modificadora es de preferencia covalentemente acoplada al compuesto natriurético. Más de una porción en la porción modificadora puede ser covalentemente acoplada al compuesto natriurético. El acoplamiento puede utilizar enlaces o mezclas hidrolizables o no hidrolizables de los dos (es decir, uniones diferentes en sitios de conjugación diferentes).

En algunas modalidades, el compuesto natriurético es acoplado a la porción modificadora utilizando un enlace hidrolizable (v.gr., un enlace de éster, carbonato o carbamato). El uso de un acoplamiento hidrolizable proveerá un conjugado de compuesto natriurético que actúa como un profármaco. Un enfoque de profármaco puede ser deseable en donde el conjugado de porción modificadora de compuesto natriurético es inactivo (es decir, el conjugado carece de la capacidad para afectar el cuerpo a través del mecanismo de acción primario de compuesto natriurético), tal como cuando el sitio de conjugación de porción modificadora está en una región de unión de compuesto natriurético. El uso de un acoplamiento hidrolizable también puede proveer un efecto de liberación con el tiempo o de liberación controlada, administrando el compuesto natriurético durante un período dado a medida que una o más porciones modificadoras son diferidas de sus conjugados de porción modificadora de compuesto natriurético respectivo para proveer el fármaco activo. En otras modalidades, el compuesto natriurético es acoplado a la porción modificadora utilizando un enlace no hidrolizable (v.gr., un enlace de carbamato, amida o éter). El uso de un enlace no hidrolizable puede ser preferible cuando es deseable permitir que el conjugado de porción modificadora de compuesto natriurético circule en el torrente sanguíneo durante un período prolongado, preferiblemente por lo menos 2 horas. Los enlaces usados para acoplas covalentemente el compuesto natriurético a la porción modificadora de una manera no hidrolizable se selecciona típicamente del grupo que consiste de enlaces covalentes, porciones de éster, porciones de carbonato, porciones de carbamato, porciones de amida y porciones de amina secundaria. En otras modalidades más, se puede usar un enfoque de profármaco parcial, en el cual una porción de la porción modificadora es hidrolizada. Por ejemplo, la patente de E.U.A. 6,309,633 (cuya referencia se incorpora aquí en su totalidad) describe porciones modificadoras que comprenden componentes hidrofílicos y lipofílicos en los cuales los componentes lipofílicos hidrolizan in vivo para dar un conjugado microPAGilado. Más de una porción modificadora (es decir, una pluralidad de porciones modificadoras) se pueden acoplar al compuesto natriurético. Las porciones modificadoras en la pluralidad son preferiblemente las mismas. Sin embargo, cabe entender que las porciones modificadoras en la pluralidad pueden ser diferentes unas de otras, o alternativamente, algunas de las porciones modificadoras en la pluralidad pueden ser las mismas y algunas pueden ser diferentes. Cuando una pluralidad de porciones modificadoras son acopladas al compuesto natriurético, puede ser preferible acoplar una o más de las porciones modificadoras al compuesto natriurétíco con enlaces hidrolizables y acoplar una o más de las porciones modificadoras al compuesto natriurétíco con enlaces no hidrolizables. Alternativamente, todos los enlaces que acoplan la pluralidad de porciones modificadoras al compuesto natriurético pueden ser hidrolizables, pero tienen grados variables de hidrolizabilidad de tal manera que, por ejemplo, una o más de las porciones modificadoras pueden ser removidas rápidamente del compuesto natriurétíco por hidrólisis en el cuerpo y una o más de las porciones modificadoras son simplemente removidas del compuesto natriurético por hidrólisis en el cuerpo. La porción modificadora puede ser acoplada al compuesto natriurético en varios residuos nucleofílicos del fármaco incluyendo pero sin limitarse a funciones hidroxilo y/o funciones amino nucleofílicas. Las funciones hidroxilo nucleofílicas se pueden encontrar, por ejemplo, en residuos de serina y/o tirosina y las funciones amino nucleofílicas se pueden encontrar, por ejemplo, en histidina y/o residuos de Lys, y/o en uno o más N-terminal del polipéptido cuando una porción modificadora es acoplada al N-terminal del péptido natriurético, el acoplamiento preferiblemente forma una amina secundaria. 8.4 Síntesis de los conjugados Síntesis ilustrativas se describen en los ejemplos expuestos más adelante. Las condiciones de reacción (v.gr., relaciones molares seleccionadas, mezclas solventes y/o pH) pueden ser controlados de acuerdo con los principios conocidos. Por ejemplo, la conjugación en la funcionalidad amino de Lys puede ser suprimida manteniendo el pH de las solución de reacción por debajo de pKa de Lys. La mezcla de conjugados de compuesto natriurético puede ser separada y aislada y utilizando, por ejemplo, CLAR para proveer conjugados de compuesto natriurético, por ejemplo, mono, di, o tri conjugados. El grado de conjugación (v.gr., ya sea la molécula aislada es mono, di, o tri conjugada) de un conjugado aislado particular se puede determinar y/o verificar utilizando varias técnicas como lo entienden los expertos en la técnica incluyendo pero sin limitarse a espectroscopia de masa. La estructura de conjugado particular (v.gr., Lys3, Lys14, Lys27, o el N-terminal del monoconjugado de hBNP) se puede determinar y/o verificar utilizando varias técnicas como lo entienden los expertos en la técnica incluyendo pero sin limitarse a análisis de secuencia, mapeo de péptidos, digestión enzimática selectiva, y/o digestión con endopeptidasa. Uno o más de los sitios de reacción en el compuesto natriurético puede ser bloqueado, por ejemplo, haciendo reaccionar el compuesto natriurético con un reactivo de bloqueo adecuado tal como N-ter-butoxicarbonilo (t-BOC), o N-(9-fluorenilmetiloxicarbonílo) (N-FMOC). Este procedimiento se puede preparar, por ejemplo, cuando se desee formar un conjugado de compuesto natriurético insaturado (es decir, un conjugado en donde no todos los residuos nucleofílicos son conjugados) teniendo una porción modificadora en uno o más del N-terminal del polipéptido. Después de dicho bloqueo, la mezcla sustancialmente monodispersa de los compuestos natriuréticos bloqueados se puede hacer reaccionar con la mezcla sustancialmente monodispersa de porciones modificadoras activadas para proveer una mezcla de conjugados de compuesto natriurético que tienen porciones modificadoras acopladas a uno o más residuos nucleofílícos y que tienen porciones de bloqueo acopladas a los otros residuos nucleofílicos. Después de la reacción de conjugación, los conjugados de porción modificadora de compuesto natriurético pueden ser desbloqueados como lo entienden los expertos en la técnica. Si es necesario, la mezcla de conjugado de compuesto natriurético puede ser separada como se describió antes para proveer una mezcla de conjugado de compuesto natriurético. Alternativamente, la mezcla de conjugados de porción modificadora de compuesto natriurético puede ser separada antes del bloqueo. En un aspecto sorprendente de la invención, los inventores describieron que la síntesis de un conjugado de hBNP usando una porción de PEG-alquilo con la porción alquilo adyacente al compuesto natriurético (es decir, ubicada entre el compuesto natriurético y la porción de PEG) da por resultado la conjugación preferencial en el sitio de conjugación Lys3 altamente deseable. Por lo tanto, en un aspecto, la invención provee un método de conjugación preferencial de hBNP en Lys3 que comprende activar el componente de alquilo de un oligómero de PEG-alquilo y acoplar el oligómero de PEG-alquilo activado al hBNP. 8.5 Composiciones farmacéuticas Se pueden preparar composiciones farmacéuticas que incluyen los conjugados de compuesto natriurético aquí descritos. Dichas composiciones típicamente incluyen el compuesto natriurético modificado en combinación con, o en mezcla con, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El vehículo, desde luego, debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualesquiera otros ingredientes en la composición farmacéutica y no debe ser deletéreo en el paciente. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y preferiblemente se formula con el profármaco como una formulación de una dosis, por ejemplo, una tableta que puede contener de aproximadamente 0.01 o 0.5% a aproximadamente 95% o 99% en peso del conjugado del compuesto natriurético. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar por cualquiera de las técnicas bien conocidas de farmacia incluyendo pero sin limitarse a mezclar los componentes, incluyendo finalmente una o más ingredientes accesorios. Las composiciones farmacéuticas de conformidad con modalidades de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica, inhalación (v.gr., mediante un aerosol) bucal (v.gr., sublingual), vaginal, parenteral (v.gr, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial o intravenosa), tópica (es decir, tanto superficies de la piel como mucosa incluyendo superficies de vías aéreas) y administración transdérmica, aunque la vía más adecuada en cualquier caso dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que esté siendo tratada y de la naturaleza del profármaco particular que se esté usando. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral se pueden presentar en unidades discretas, tales como cápsulas, cachets, trociscos o tabletas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del profármaco; como un polvo o granulo; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. Estas formulaciones se pueden preparar medíante cualquier método adecuado de farmacia que incluya el paso de llevar a asociación el profármaco y vehículo adecuado (que puede contener uno o más ingredientes accesorios como se indicó anteriormente). En general, la composición farmacéutica de conformidad con modalidades de la presente invención se preparan mezclando uniformemente e íntimamente el profármaco con un vehículo líquido o sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, configurar la mezcla resultante. Por ejemplo, una tableta se puede preparar comprimiendo o moldeando polvos o granulos que contienen profármaco, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar comprimiendo, en una máquina adecuada, la mezcla en forma de flujo libre, tal como un polvo o granulos opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte y/o agente activo de superficie/dispersante. Tabletas moldeadas se pueden hacer moleando en una máquina adecuada, el compuesto en polvo humedecido con un aglutinante líquido inerte. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen trociscos que comprenden el profármaco en una base saborizada, generalmente sacarosa, acacia y tragacanto; y pastillas que comprenden el profármaco en una base inerte tal como gelatina y glicerina y sacarosa y acacia.

Las composiciones farmacéuticas de conformidad con modalidades de la presente invención adecuadas para administración parenteral comprenden soluciones de inyección acuosas y no acuosas estériles del profármaco, dichas preparaciones son preferiblemente isotónícas con la sangre del receptor destinado. Estas preparaciones pueden comprender antioxidantes, reguladores de pH, bacteriostáticos y solutos que hacen a la composición isotónica con la sangre del receptor destinado. Suspensiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las composiciones se pueden presentar en contenedores de dosis unitaria y dosis múltiples, por ejemplo ampolletas y frascos sellados, y se pueden almacenar en una condición secada por congelamiento (liofilizada) que requiere solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, solución salina o agua para inyección inmediatamente antes de usarse. Soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, granulos y tabletas estériles del tipo anteriormente descrito. Por ejemplo, una composición inyectable, estable, estéril que comprende un profármaco en una forma de dosis unitaria en un contenedor sellado se puede proveer. El profármaco se provee en forma de un liofilizado que es capaz de ser reconstituido con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para formar una composición líquida adecuada para inyección del mismo en un sujeto. La forma de dosis unitaria típicamente comprende de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 10 mg del profármaco. Cuando el profármaco es sustancialmente insoluble en agua, una cantidad suficiente de emulsionante que es fisiológicamente aceptable se puede utilizar en una cantidad suficiente para emulsionar el profármaco en un vehículo acuoso. Un agente emulsionante útil de este tipo es fosfatidil colina. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para aplicación tópica a la piel preferiblemente adoptan la forma de una pomada, crema, loción, pasta, gel, aspersión, aerosol o aceite. Los vehículos que se pueden usar incluyen jalea de petróleo, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, mejoradores transdérmicos y combinaciones de dos o más de los mismos. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración transdérmica pueden estar presentes como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período prolongado. Composiciones adecuadas para administración transdérmíca también pueden ser suministradas por iontoforesis (véase, por ejemplo, Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986) y típicamente adoptan la forma de una solución acuosa regulada en su pH opcionalmente del profármaco. Formulaicones adecuadas comprenden citrato o regulador de pH bis/tris (pH6) o etanol/agua y contienen de 0.1 a 0.2M de ingrediente activo. 8.6 Métodos de administración y tratamiento Los conjugados de compuesto natriurético y formulaciones farmacéuticas de la invención presentan una o más características mejoradas en relación con el compuesto natriurétíco biológicamente activo no modificado (no conjugado), la adición de la porción modificadora puede proteger el compuesto natriurético biológicamente activo, contra degradación en varios ambientes (tales como el tracto gastrointestinal (tracto Gl)), de tal manera que menos del mismo sea degradado en la forma más modificada en lo que se degradaría en ausencia de la porción modificadora en dichos ambientes. En particular, ciertas formas modificadas de la invención pueden ser administradas oralmente en una dosis que finalmente provee una cantidad farmacéuticamente aceptable del compuesto natriurético biológicamente activo en circulación sistémica. Es decir, una cantidad suficiente de compuesto natriurético puede sobrevivir al tracto Gl y entrar al torrente sanguíneo de tal manera que el compuesto natriurético biológicamente activo esté sistemáticamente presente en una cantidad farmacológicamente activa suficiente para disparar la producción de GMPc. Preferiblemente, la adición de la porción modificadora mejora en suministro de compuesto natriurético no conjugado oralmente administrado en el torrente sanguíneo bajo administración oral en relación con suministro de compuesto natriurético no conjugado oralmente administrado en el torrente sanguíneo. Muy preferiblemente, la mejora del suministro de compuesto activo en el torrente sanguíneo para conjugados de compuestos natriurético administrados oralmente es por lo menos 2 veces el suministro de compuesto natriurético biológicamente activo progenitor no conjugado administrado oralmente, en el torrente sanguíneo. Muy preferiblemente aun, la mejora del suministro de compuesto activo en el torrente sanguíneo para conjugado de compuesto natriurético administrado es por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, ó 500 veces el suministro de compuesto natriurético biológicamente activo no modificado (no conjugado) oralmente administrado, en el torrente sanguíneo. Por lo tanto, la administración de los conjugados de compuesto natriurétíco de la invención pueden proveer mayor biodisponibilidad del compuesto natriurético biológicamente activo en relación con la administración de compuesto natriurético biológicamente activo no modificado. Una vía oral de administración (en lugar de por infusión intravenosa continua durante días en un hospital) puede reducir los costos de hospitalización asociados con otras terapias de CHF y/o expandir el uso terapéutico de hBNP para incluir CHF de etapa temprana crónico así como CHF aguda. Por lo tanto, en un aspecto la invención provee un método para tratar una condición de enfermedad susceptible de tratamiento usando un compuesto de péptido natriurético al administrar a un sujeto que necesita el mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de compuesto natriurético de la invención. El conjugado de compuesto natriurético puede ser adecuadamente administrado por una variedad de vías, incluyendo por ejemplo, vías parenteral y enteral. Ejemplos de vías preferidas incluyen oral, subcutánea, sublingual, bucal, nasal, intravenosa e intramuscular. Se pueden usar varios enfoques en el uso de los presentes conjugados de compuesto natriurético para el tratamiento de insuficiencia cardiaca. Por ejemplo, se contempla que los conjugados de compuesto natriurético se pueden presentar como una monoterapia, preferiblemente en una forma de dosis oral sola. Alternativamente, los conjugados de compuesto natriurético se pueden usar junto con agentes terapéuticos más convencionales como parte de una terapia de combinación. Las categorías primarias de fármacos que se usan actualmente incluyen lo siguiente: Diuréticos - alivian la acumulación de fluido y extensión resultante del corazón asociado con CHF. Vasodilatadores - expanden arterias y venas, permitiendo el incremento del flujo sanguíneo. Agentes inotrópícos - incrementan la fuerza de contracción del músculo cardiaco. Drogas de digitales - incrementan la fuerza de contracción del corazón y reducen el ritmo cardiaco. Inhibidores de enzima convertidota de angíotensina (ACE) -inhiben la producción del vasoconstrictor angiotensina II en la última etapa de su síntesis. Bloqueadores de receptor de angiotensina (ARB's) - permiten que se produzca angíotensina, pero inhiben su actividad arterial. Bloqueadores de canales de calcio - inhiben el flujo entrante de calcio dando por resultado relajamiento vascular y de músculo liso. Nitratos - relaja los músculos lisos y dilata venas y arterias. Beta bloqueadores - bloquea la acción de catecolaminas, dando por resultado menos estrés sobre el corazón y reduce la fuerza y tasa de contracción. Algunas de las ventajas de los conjugados de compuesto natriurético se pueden considerar primero en relación con otros enfoques para tratar CHF y comparados con el uso actual del péptido natriurético en su forma no modificada, es decir continuamente infundído. Los conjugados de compuesto natriurético orales de la invención presentan propiedades natriuréticas y diuréticas que se puede esperar que alivien congestión a través de la eliminación de sodio y exceso de agua. Dichas funciones son presentadas actualmente con diuréticos y complementos de potasio. Los conjugados de compuesto natriurético de la invención se espera que posean propiedades relajantes vasculares y de miocardio que son actualmente efectuadas usando vasodilatadores, bloqueadores de canales de calcio y nitrato. Los conjugados de compuesto natriurétíco de la invención se espera que inhiban el sistema de renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) actualmente efectuado usando inhibidores de ACE y ARB's. Más aún, los conjugados de compuesto natriurético se espera que carezcan de los efectos negativos y riesgos de muerte súbita asociados con los fármacos inotrópicos y digitales. Los conjugados de compuestos natriurétícos pueden tener muchos, sino todos, los beneficios de varios grupos de fármacos cardiovasculares mientras tienen una cantidad reducida de o carecen de los efectos negativos de terapias convencionales. Los conjugados de compuesto natriurético de la invención también tiene ventajas sobre NATRECOR® (nesiritide, hecho por Scios, Inc., Sunnyvale, CA). Algunas de las ventajas se puede atribuir al perfil farmacocinética mejorada que proveen los oligómeros anfifílicos de conformidad con las modalidades de la presente invención. Por ejemplo, la resistencia a la degradación por proteasas (tal como NEP) puede conducir a una vida media circulante más larga en comparación con el péptido no mejorado. Una ventaja significativa puede resultar de la capacidad de BNP o ANP conjugado con dichos oligómeros para ser suministrado oralmente. Por ejemplo, NATRECOR® es dosificado mediante infusión continua durante 48 horas y porta un alto costo por dosis más costos de hospital. Un conjugado de hBNP oral de conformidad con modalidades de la presente invención se puede dosificar a un costo más bajo global y puede estar disponible sobre una base de paciente externo y puede ser autoadministrado. En vez de estar limitado al uso con pacientes internos que tienen los casos más agudos de CHF, los conjugados orales de conformidad con modalidades de la presente invención se pueden usar para aquellos que padecen inicio gradual de CHF crónico. El caso de administración, demanda reducida sobre recursos de hospital, y/o costo más bajo soporta la utilidad de los conjugados de compuesto natriurético como una terapia preventiva, autoadministrada (v.gr., en el hogar) para pacientes que son de alto riesgo de insuficiencia cardiaca. Preparaciones orales de conjugado de compuesto hBNP de conformidad con modalidades de la presente invención se espera que tengan muchos sino es que todos los beneficios de Natrecor® con ventajas de un perfil farmacocinética mejorado, mayor facilidad de administración, gastos de hospitalización reducidos, expansión e indicación para incluir CHF crónico, y/o utilidad en enfermedad cardiovascular en etapa temprana. Sujetos que toman o están inclinados a tomar el compuesto natriurético progenitor pueden alternativamente (o adicionalmente) tomar la preparación de compuesto natriurético que aquí se describe. Por ejemplo, los pacientes que padecen trastornos que son convencionalmente tratados usando un compuesto natriurético parenteralmente administrado, tal como NATRECOR®, se puede tratar usando una cantidad efectiva de la forma modificada de este agente descrito aquí. Ventajosamente, en donde dichos agentes son solo previamente administrable vía inyección o administración intravenosa, el compuesto natriurético se puede administrar mediante inhalación y/o muy preferiblemente, administración oral. En una modalidad, la invención provee un método de suministro de un agente biológicamente activo a un sujeto, en donde el agente biológicamente activo e oralmente administrado como un componente de un compuesto natriurético modificado de la invención, una porción del compuesto natriurético oralmente administrado sobrevive intacto en el tracto Gl y atraviesa la pared intestinal para entrar al torrente sanguíneo y después dejar el tracto Gl, algo o todo el compuesto natriurético es hidrolizable in vivo para producir una cantidad farmacéuticamente aceptable del agente biológicamente activo. La hidrólisis, puede por ejemplo, tener lugar en el torrente sanguíneo o en el hígado. En este método, las formas modificadas del compuesto natriurético incrementan la biodisponíbilidad oral del agente biológicamente activo oralmente administrado en relación con la biodisponibilidad oral de un agente biológicamente activo no conjugado oralmente administrado. La cantidad efectiva de cualquier natriurético cuyo uso está en el alcance de la presente invención, variará de un agente a otro, y de paciente a paciente, y dependerá de factores tales como la edad y condición del paciente y de la vía de administración. Dichas dosis pueden determinarse de acuerdo con procedimientos farmacológicos de rutina conocidos por los expertos en la técnica. Como una propuesta general, una dosis de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg tendrá eficacia terapéutica, siendo todos los pesos calculados con base en el peso del paciente. Preocupaciones de toxicidad al nivel más alto pueden restringir dosis intravenosas a un nivel más bajo tal como hasta aproximadamente 10 mg/kg, siendo todos los pesos calculados con base en el peso de la base activa. Una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg se puede utilizar para administración oral. Típicamente, una dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg a d mg/kg se puede utilizar para inyección intramuscular. La frecuencia de administración es generalmente una, dos o tres veces por día o según sea necesario para controlar la condición. La duración del tratamiento depende del tipo de condición que se está tratando puede ser tan larga como la vida del paciente. Sujetos adecuados para tratarse de conformidad con la presente invención incluye pero no se limita a sujetos aves y mamíferos, preferiblemente mamíferos. Los mamíferos de conformidad con la presente invención incluyen pero no se limitan a caninos, felinos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, roedores (v.gr., ratas y ratones), lagomorfos, primates, humanos y similares, y abarcan mamíferos in útero. Cualquier sujeto mamífero que necesita ser tratado de conformidad con la presente invención es adecuado. Se prefieren sujetos humanos. Los sujetos humanos de ambos géneros y en cualquier etapa de desarrollo (es decir, neonato, niños pequeños, juveniles, adolescentes, adultos) se pueden tratar de conformidad con la presente invención. Aves ilustrativas de conformidad con la presente invención incluyen pollos, patos, pavos, gansos, codornices, faisanes, rátidas (v.gr., avestruces) y aves domésticas (v.gr, pericos y canarios), e incluyen aves in ovo. 8J Pruebas Análogos de péptido natriuréticos de la invención pueden incluir los efectos cardiovasculares, renales y/o endocrinos que están asociados con el péptido nativo. Las pruebas basadas en células se pueden usar para mostrar cuáles conjugados son agonistas adecuados de receptor de péptido natriurético humano A, conduciendo a la producción adecuada de GMPc. Se pueden usar pruebas bioquímicas para mostrar cuáles conjugados ofrecen la protección adecuada contra enzimas proteolíticas. Experimentos in vivo se pueden usar para mostrar cuáles conjugados dan una biodisponibilidad deseable. Los conjugados más importantes se pueden probar para establecer modelos de perros. Candidatos deseables pueden ser sometidos a estudios farmacocinétícas, farmacodinámicos y toxicidad detallados en ratas y perros. Conjugados de BMP de conformidad con modalidades de la presente invención serán útiles en el tratamiento de insuficiencia cardiaca congestiva de etapa temprana, crónica y aguda. Los péptidos novedosos y conjugados novedosos de la invención se pueden probar para actividad agonista en el receptor de péptído natriurético humano A (NPR-A) in Vitro. Las propiedades vasorelajadoras, natriuréticas, y diurética de BNP se ascriben a un mensajero secundario, GMP cíclico (GMPc). La producción de GMP cíclico se logra mediante guanilato ciclasa, una enzima que es activada cuando BNP se une a NPR-A. la producción de GMPc se puede medir en cultivos de células endoteliales aórticas humanas que expresan endógenamente NPR-A. Por lo tanto, la activdad relativa de los conjugados de compuesto natriurético y análogos de péptido natriurético de la invención se puede determinar por el nivel de producción de GMPc en estas células. Los conjugados de la invención se pueden probar para resistencia incrementada a proteasas. En general, los fármacos que son suministrados oralmente son sometidos a enzimas digestivas tale como pepsina, tripsina y/o quimotripsina. En el caso de fármaco de péptido, estas enzimas pueden ser particularmente problemáticas. Sin embargo, la conjugación de péptidos se ha mostrado que incrementa la resistencia a estas enzimas. Cocteles de enzimas digestivas se pueden usar para probar resistencia incrementada de conjugados de hBNP y otros conjugados de la invención a proteasas del tracto digestivo. Conjugados de compuesto natriurético son preferiblemente menos susceptibles a degradación proteolítica que los compuestos natriuréticos son conjugados correspondientes, es decir, los conjugados digieren más lentamente en el compuesto no conjugado correspondiente. Los conjugados se pueden probar para biodisponibilidad oral. La biodisponibilidad oral de los conjugados se puede probar en ratas, por ejemplo. Los conjugados se pueden administrar al tracto gastrointestinal por alimentación forzada oral y la presencia de conjugados de hBNP en el torrente sanguíneo se puede probar usando procedimientos de radioinmunoensayo disponibles. Los conjugados de conformidad con modalidades de la presente invención preferiblemente pueden estar disponibles oralmente y/o peroralmente, es decir, una cantidad terapéuticamente significativa del conjugado se puede administrar por las vías oral y/o peroral. El conjugado puede retener algo o toda la actividad del péptido natriurético nativo (v.gr., hBNP) con los beneficios adicionales de administración oral. Dicho compuesto puede reducir costos asociados con el tratamiento de CHF agudo y/o expandir la aplicabilidad de este terapéutico para incluir CHF de etapa temprana y crónico. En un aspecto, la invención provee un método de generación de datos que comprende probar un compuesto natriurético que prueba un conjugado de compuesto natriurético de la invención o una serie de dichos conjugados de compuesto natriurético, y la compilación de datos que resultan de dicha prueba. Los datos mismos por lo tanto se entienden para constituir otra modalidad más de la invención, así como el uso de estos datos. 8.8 Porciones modificadoras oligoméricas ramificadas La presente invención también provee varias porciones modificadoras de PEG lineal y ramificada, amina, microPAGilada y alquilo- PEG. 8.8.1. Fórmulas de porción modificadora oligomérica ramificada La presente invención provee un compuesto que tiene la fórmula: (fórmula VI) en donde R es -H, -C(0)OH o una porción de activación, tal como C(0)X' (en donde X' es un halogenuro (v.gr., Cl, Br) o p-nitrofenol), o .y C, m, X, PAG, y n son como se describió anteriormente para la fórmula I. La presente invención también presenta un compuesto que tiene la fórmula: (fórmula Vil) en donde R es H (se entenderá que el átomo en PAG acoplado a R es O, y por lo tanto que la porción de terminación es OH), C(0)OH o una porción e activación, tal como C(0)X' (en donde X' es un halogenuro (v.gr., Cl, Br) o p-nitrofenol), o -y PAG, n, X y o son como se describió anteriormente para la fórmula II. En otra modalidad más, se provee un compuesto que tiene la fórmula: (fórmula VIII) en donde R es -H, -OH, -C(0)OH o una porción de activación, tal como C(0)X' o OC(0)X' (en donde X' es un halogenuro (v.gr., Cl, Br) o p-nitrofenol), o o, y C, m, X, PAG, n y o son como se describió anteriormente para la fórmula lll. En otro aspecto, la porción modificadora puede tener una fórmula: (fórmula IX) en donde R es H, C(0)OH o una porción de activación, tal como C(0)X" (en donde X" es un halogenuro (v.gr., Cl, Br) o p-nitrofenol), o X' es C, m, PAG, n, y X son como se describió anteriormente para la fórmula IV. En otro aspecto, la porción modificadora puede tener una fórmula: (fórmula X) en donde R3 es -OH, -C(0)OH o una porción de activación, tal como R1 y R2 son seleccionados cada uno independientemente y son cualquiera de las fórmulas I, II, lll o IV anteriores. 8.8.2 Métodos para hacer porciones modificadoras oliqoméricas La presente invención también provee varios métodos para preparar las porciones modificadoras descritas aquí. Un método para hacer un compuesto de la fórmula: (fórmula XI) se provee, en donde C, m, X, PAG, y n son como se describió anteriormente para la fórmula I. Este método se puede describir como que comprende los pasos de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula: Cm-?-PAGn-OH con un compuesto de la fórmula: (nótese que Cl puede ser reemplazado por otro grupo residual, tal como otro halogenuro) en presencia de una base y un solvente para dar un producto de una fórmula: hacer reaccionar el producto con un compuesto de la fórmula: Cm-?-PAGn-OH en presencia de un ácido de Lewis y un solvente para dar: en donde C, m, X, PAG, y n son como se definió antes para la fórmula I. Cl puede ser reemplazado por otro halógeno, tal como Br. A manera de ejemplo, la base se puede definir además com NaH, y el solvente se puede definir además como tetrahidrofurano. El ácido de Lewis que se ha de usar en este método también se puede definir además como BF3OEt2. Otro método de la invención también se describe para hacer un compuesto de la fórmula: (fórmula Xll) en donde C, m, X, PAG y n son como se definió antes para la fórmula I. Este método puede ser además definido como que comprende los pasos de hacer reaccionar un producto en donde C, m, X, PAG y n son como se definió antes, con paranitrocloroformíato o disuccimidilcarbonato. Otra modalidad más de la invención se provee en un método para hacer un compuesto de la fórmula: en donde PAG, n, X y o son como se definió antes para la fórmula II. Este método se puede describir además como que comprende los pasos de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula: (nótese que Cl puede ser reemplazado por otro grupo residual, tal como otro halogenuro) en donde o es como se definió antes para la fórmula I, con un compuesto de la fórmula: HO-PAGn-X en donde X es -NH o -OH, en un solvente, para dar a compuesto de la fórmula: en donde PAG, n, X, y o son como se definió antes para la fórmula II. La invención también provee un método para hacer un compuesto de la fórmula: (fórmula Xlll) en donde PAG, n, X, y o son como se definió antes para la fórmula II. Este método se puede describir como que comprende los pasos de activar un producto (en donde PAG, n, X y o son como se definió antes para la fórmula II usando un agente de activación, tal como carbonato de disuccinimidílo, paranitrocloroformiato, fosgeno y N-hidroxisuccinimida. Otra modalidad más de la invención provee un método para hacer un compuesto de la fórmula: (fórmula XIV) en donde C, m, X, PAG, n y o son como se definió antes para la fórmula lll. Este método se puede describir como que comprende los pasos de hacer reaccionar el producto identificado aquí como fórmula Xll anterior con un compuesto de la fórmula: en presencia de una base en un solvente, en donde o es como se definió antes para la fórmula lll. En modalidades preferidas de este método, la base es K2C03 y el solvente es un solvente acuoso y/u orgánico. Además, la invención además provee un método para hacer un compuesto de la fórmula: (fórmula XV) en donde C, m, PAG, n y o son como se definió antes para la fórmula lll. El método generalmente comprende hacer reaccionar un compuesto producido de conformidad con el método de preparar la fórmula XIV como se definió antes, con un agente de activación tal como N- hidroxisuccinimida.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se han incluido para ilustrar modelos de la invención. Ciertos aspectos de los siguientes ejemplos se describen en términos de técnicas y procedimientos encontrados para demostrar el mejor modo de practicar la invención. A la luz de la presente descripción y el nivel general de los expertos en la técnica de la presente invención, los expertos apreciarán que los siguientes ejemplos pretenden ser ilustrativos únicamente y que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteración sin apartarse del alcance de la invención. 9.1 Activación de porción modificadora de PEG-Alquilo (éster 2-r2-(2-{2-[2-(2-hexadec¡loxi-etoxi)-etoxil-etoxi)-etoxi)-etoxi]-etílico de éster 2,6-dioxo-pirrolidin-1 -ílico de ácido carbónico (II)) Éter monohexadecílico de hexaetilenglicol, I (0.202 g , 0.4 mmoles) se disolvió en acetonitrilo (d ml) y se añadió carbonato de disuccinimidilo (DSC, 0.167 g, 0.6 mmoles). Después se añadió gota a gota trietilamína (0.12 g, 1.2 mmoles)y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHCO3 saturado (10 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 20 ml), se secó sobre MgSO4, y se evaporó a sequedad. La mezcla de producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, EtOAc/metanol, 10:1 ) para dar 0.268 g (81 %) del compuesto del título II como un aceite. ESI EM: m/e 648.84 (M+H)+. r II 9.2 Síntesis de porción modificadora de amina de PEG ramificada (éster 2-r2-(2-hexil-decanoilamino)-etoxp-etílico de éster 2,d-dioxo-pirrolidin-1 -ílico de ácido carbónico (IV)) Cloruro de tionilo (5.5 gm, 46.6 mmoles) se añadió gota a gota durante un periodo de treinta minutos a una solución de ácido 2-hexil-decanoico I (10 gm, 38.9 mmoles) en 100 ml de tetracloruro de carbono. Después de que se completó la adición, la mezcla de reacción se puso a reflujo durante 3 horas. Después de que la reacción se completó, el tetracloruro de carbono se removió por destilación y la mezcla de reacción se concentró para obtener cloruro de ácido crudo. El cloruro de ácido crudo se purificó por destilación fraccional para obtener II como un líquido claro (10.1 gm, 91 %). ESI EM: m/e 275.87 (M+H)+. A una solución enfriada de 2-(2-amino-etoxi)-etanol (57d g, d.47 mmoles) en 10 ml de diclorometano, cloruro de 2-hexil-decanoilo II (760 mg, 2.74 mmoles) se añadió gota a gota durante un periodo de treinta minutos. Después de que se completó la adición, la temperatura de la mezcla de reacción se incrementó a 26 °C. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -20 horas, la reacción cruda se acidificó con HCl 1 N y se diluyó con 10 ml de H2O. La mezcla de reacción se extrajo después con diclorometano. La capa orgánica se lavó después con HCl 1 N, agua, se secó sobre MgS0 , se filtró y se concentró. El material crudo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, elución por gradiente: 2-6% de metanol en CHCI3), para dar 902 mg (96%) del compuesto monodisperso lll como un sólido blanquecino. ESI EM: m/e 344.64 (M+H)+. C16-PEG2 lll ramificado monodisperso (200 mg, 0.68 mmoles) se disolvió en acetonitrilo (d ml) y carbonato de disuccinimidilo (DSC, 0.224 g, 0.87 mmoles). Después, trietilamina (0.118 g, 1.17 mmoles) se añadió gota a gota y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHC03 saturado (10 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 20 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (sílice, EtOAc/metanol, 10:1 ) para dar 0.206 g (74%) del aceite IV (0.206 g, rendimiento de 74%). ESI EM: m/e 485.63 (M+Hf. rv 9.3 Síntesis v activación de porción modificadora de PEG-Alquilo (éster 2,5-dioxo-pirrolidin-1 -ílico de ácido 16-(2-{2-r2-(2-f2-r2-(2-Metoxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi1-etoxi)-etoxi)-hexadecanoico) A una solución de ácido 16-bromo-hexadecanoico monodisperso (15.3 g, 45 mmoles) en etanol (300 ml) se añadió H2S04 (1.5 ml, 31.25 mmoles) y la reacción se agitó durante 48 horas. La mezcla de reacción cruda se diluyó con agua y se extrajo con diclorometano (2 x 300 ml). La capa orgánica se lavó con H20 (300 ml), NaHC03 saturado (2 x 300 ml), H20 (300 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad para dar un sólido blanquecino II (16.03 g, rendimiento de 98%). A una solución de éter monometílico de heptaetilenglicol monodisperso (8.61 g, 26 mmoles) en THF (260 ml) se añadió t-butóxido de potasio (3.1 g, 27.6 mmoles, pequeñas porciones durante -30 minutos). La mezcla de reacción se agitó después durante 1 hora y después II (10 g, 27.5 moles) disuelto en THF (90 ml) se añadió gota a gota y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. La mezcla de reacción cruda se filtró a través de Celite (se lavó con CH2CI2, -200 ml) y se evaporó a sequedad para dar aceite. El aceite crudo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, elución por gradiente: 2-5% de metanol en CHCI3) para dar aceite amarillo claro IV, 2.48 g (16 %). Al aceite del compuesto monodisperso IV (2.22 g, 3.56 mmoles) se añadió NaOH 1 (50.0 ml), 25 ml de metanol, 25 ml de etanol y la mezcla de reacción se agitó durante 24 horas. La mezcla de reacción cruda se concentró, se acidificó (pH~2), se saturó con NaCI, y se lavó con CH2CI2 (3 x 75 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con NaCI saturado, se secaron con MgS04, y se evaporaron a sequedad para dar el compuesto monodisperso V como un sólido blanco. El sólido crudo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, acetato de etilo) para dar V, 858 mg (40 %). Ácido mPEG7-C16 monodisperso V (324 mg, 544 mmoles) se disolvió en 15 ml de cloruro de metileno anhidro y después con solución de N-hidroxisuccinimida (94 mg, 816 mmoles) y 1 -etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida. Se añadió HCl (EDCrHCI, 156 mg, 816 mmoles) en cloruro de metileno anhidro. La reacción se agitó durante 24 horas, después se lavó con HCl 1 N, agua, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, elución por gradiente: 2-6% de metanol en CHCI3), para dar mPEG7-C16 activado monodisperso VI como un aceite claro (290 mg, 77%).

II .o. .o. .OH Tr r "O" III KOtBu VI 9.4 Activación de porción modificadora de PEG-alquilo (éster 2,5-dioxo-pirrolidin-1 -ílico de ácido 12-(2-{2-f2-(2-{2-r2-(2-metoxi-etoxi)-etox¡l-etoxi|-etoxi)-etoxil-etoxi}-etoxi)-dodecanoico) Acido mPEG7-C12 monodisperso I (500 mg, 0.78 mmoles) se disolvió en 20 ml de cloruro de metileno anhidro y después en solución de N-hidroxisuccinimida (160 mg, 1.39 mmoles) y 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodümida. Se añadió HCl (EDCI'HCI, 233 mg, 1.390 mmoles) en cloruro de metileno anhidro. La reacción se agitó durante 24 horas, después se lavó con HCl 1 N, agua, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, elución por gradiente: 2-5% de metanol en CHCI3), para dar mPEG7-C16 activado monodisperso VI como un aceite claro (370 mg, 62%).

II 9.5 Síntesis de porción mopdificadora de PEG (éster 2-metoxietílico de éster 2, d-dioxo-pirrolidin-1 -ílico de ácido carbónico) MPEG1 ramificado monodisperso I (200 mg, 2.63 mmoles) se disolvió en acetonitrilo (20 ml) y se añadió carbonato de disuccinimidilo (DSC, II, 1.00 g, 3.94 mmoles). Después trietilamina (0.399 g, 3.94 mmoles) se añadió gota a gota y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHC03 saturado (20 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 60 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, EtOAc/MeOH, 10:1 ) dio el sólido lll (0.346 g, rendimiento de 60%). ESI EM: m/e 218.09 (M+H)+.

I I I 9.6 Síntesis de porción modificadora microPAGilada hidrolizable (éster 2-(2,d-d¡oxo-p¡rrolidin-1-¡loxicarboniloxi)-etílico de ácido hexanoico) C6-PEG1 ramificado monodisperso I (100 mg, 0.626 mmoles) se disolvió en acetonitrilo (10 ml) y se añadió carbonato de disuccinimidilo (DSC, II, 0.240 g, 0.936 mmoles). Después se añadió gota a gota trietílamina (0.096 g, 0.936 mmoles) y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHC03 saturado (10 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 20 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, EtOAc/MeOH, 10:1 ) dio un sólido blanquecino lll (0.146 g, rendimiento de 78%). ESI EM: m/e 302.29 (M+H)+.

I I I 9.7 Síntesis de porción modificadora de mPEG lineal (éster 2-(2-metoxi-etoxQ-etílico de éster 2. d-dioxo-pirrolidin-1 -ílico de ácido carbónico) MPEG2 ramificado monodiperso I (470 mg, 3.91 mmoles) se disolvió en acetonitrilo (20 ml) y se añadió carbonato de disuccinimidilo (DSC, ll, 1.50 g, d.87 mmoles). Después se añadió gota a gota trietilamina (0.594 g, 5.87 mmoles) y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHC03 saturado (20 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 50 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, EtOAc/MeOH, 10:1 ) dio el sólido lll (0..632 g, rendimiento de 62%). ESI EM: m/e 262.23 (M+H)+.

II Acetonitrilo Trietilamina III 9.8 Síntesis de Porción modificadora microPAGilada hodrolizable (éter 2-r2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarboniloxi)-etoxp-etílico de ácido dodecanoico) C12-PEG2 ramificado monodisperso I (200 mg, 0.69 mmoles) se disolvió en acetonitrilo (10 ml) y se añadió carbonato de disuccinimidilo (DSC, II, 0.265 g, 1.035 mmoles). Después se añadió gota a gota trietilamina (0.104 g, 1.035 mmoles) y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHC03 saturado (10 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 20 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, EtOAc/MeOH, 10:1 ) dio el aceite lll (0.247 g, rendimiento de 83%). ESI EM: m/e 430.50(M+H)+. 9.9 Síntesis de porción modificadora de PEG lineal (éster 2-f2-(2-metoxi-etoxi)-etox¡1-etílico de éster 2,d-dioxo-pirrolidin-1-ílico de ácido carbónico) MPEG3 ramificado monodisperso I (200 mg, 1.21 mmoles) se disolvió en acetonitrilo (20 ml) y se añadió carbonato de disuccinimidilo (DSC, II, 0.468 g, 1.82 mmoles). Después trietílamina (0.184 g, 1.82 mmoles) se añadió gota a gota y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHC03 saturado (20 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 50 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, EtOAc/MeOH, 10:1 ) dio el sólido lll (0.206 g, rendimiento de 55%). ESI EM: m/e 306.11 (M+H)+.

Acetonitrilo Trietilamina III 9.10 Síntesis de porción modificadora microPAGilada hodrolizable (éster 2-(2-[2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1 -iloxicarboniloxQ-etoxil-etoxi}-etílico de ácido hexanoico) C6-PEG3 ramificado monodisperso I (200 mg, 0.80 mmoles) se disolvió en acetonitrilo (20 ml) y seañadió carbonato de disuccinimidilo (DSC, II, 0.309 g, 1.209 mmoles). Después se añadió gota a gota trietilamina (0.122 g, 1.209 mmoles) y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHC03 saturado (10 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 20 ml), se secó sobre MgS0 , y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, EtOAc/MeOH, 10:1 ) dio el aceite lll (0.203 g, rendimiento de 64%). ESI EM: m/e 390.40 (M+H)+.

II Acetonitrilo Trietilamina in 9.11 Síntesis de oligómero hidrolizable por eliminación de bencilo (éster 4-(4-nitro-fenoxicarboniloximetil)-fenílico de ácido 6-(2-í2-(2-(2-l"2-(2-metoxi-etoxi)-etoxi1-etoxi}-etoxi)-etoxi1-etoxi}-hexanoico) Ter-butóxído de potasio (3.64 g, 32.4 mmoles) se disolvió en 260 ml de THF. Se añadió alcohol MPEG6 (9.68 g, 32.3 mmoles) en 10 ml de THF. La solución se agitó durante dos horas El mesilato (7.0 g, 29.4 mmoles) preparado a partir de etil 6-hidroxi-hexanoato comercialmente disponible se disolvió en 15 ml de THF y se añadió a solución de PEG. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se extinguió con 25 ml de MeOH y se filtró a través de una almohadilla corta de Ceilite. El filtrado se concentró bajo vacío y el residuo se purificó por cromatografía instantánea (EtOAc/2% de MeOH) para dar 3.19 g (25 %) de I. ESI EM: m/e 461.07 (M+Na)+. Para hidrolizar el éster etílico, 1.1 g (2.51 mmoles) de I se trató con 35 ml de NaOH 1 N. Después de seis horas, la mezcla turbia inicial se había convertido en una solución color amarillo clara. La mezcla se saturó con NaCI y se acidificó con HCl concentrado hasta que el pH fue de 2. La solución se extrajo con 100 ml de CH2CI2. Los compuestos orgánicos se secaron sobre Na2S0 , se filtraron y se concentraron bajo vacío para dar 0.80 g (78%) del ácido carboxílico II. ESI EM: m/e 411.07 (M+H)+, 433.10 (M+Na)+. Ácido carboxílico lll (0.80 g, 1.95 mmoles) se disolvió en 16 ml de CH CI2 y se colocó bajo N2. A la solución, se añadieron 0.486 g (2.5 mmoles) de EDC y 0.288 g (2.5 mmoles) de N-hidroxisuccínimida (NHS). Después de cinco horas, otros 0.2 g de EDC y 0.12 g de NHS se añadieron para completar la reacción. Cuando CCD indicó que no quedaba ácido carboxílico sin reaccionar, la mezcla se diluyó con 60 ml de CH2CI2 y se lavó con HCl 1 N frío (1 x 100 ml), agua fría (2 x 100 ml) y salmuera (3 x 100 ml). Los compuestos orgánicos se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron bajo vacío para dar 0J1 g (71 %) de lll. ESI EM: m/e 508.17 (M+H)\ 530.07 (M+Na)+. En 120 ml de CH2CI2 seco, se disolvieron alcohol 4-hidroxibencílico (2.93 g, 3.6 mmoles) y 2.98 g (24.4 mmoles) de DMAP. El compuesto lll (1.2 g, 2.37 mmoles) se disolvió en otros 40 ml de CH2CI2 y se añadió. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se lavó con HCl 1 N (2 x 200 ml) y salmuera (2 x 200 ml). Los compuestos orgánicos se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se evaporaron a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, EtOAc/10% de MeOH) para dar 0.701 g (68%) del oligómero IV. ESI EM: 539.10 m/e (M+Na)+. El oligómero IV (0.562 g, 1.09 mmoles) se disolvió en 15 ml de CH2CI2 seco. A esta solución se añadió 0.23 ml (1.64 mmoles) de TEA y 0.329 g (1.64 mmoles) de p-nitro-fenilcloroformiato. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó después con 15 ml adicionales de CH2CI2 y se lavó con 15 ml de HCl 1 N seguido por 15 ml de agua. Los compuestos orgánicos se secaron sobre MgS0 , se filtraron y se concentraron a sequedad. El producto crudo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, elución por gradiente: 3/1 de EtOAc/hexanos-EtOAc) para dar 504 mg (74%) del oligómero activado. ESI EM: m/e 682.72 (M+H)+, 704.72 (M+Na)+. 2) M s K""OtBu M P E¿S) H T H F T H F rt*- IN NaOH DMAP, CH2C12 rtro 9.12 Síntesis de porción modificadora hidrolizable de carbamato de arilo (éster ester 4-nitro-fen ílico de éster 4-(6-{2-F2-(,2Y2-r2-(2-metoxi-etox¡)-etoxfl-etoxiV-etoxi)-etoxi1-etoxi}-hexiloxi)-fenílico de ácido carbónico) Alcohol MPEG6 (10.0 g, 33J mmoles) se disolvió en 40 ml de CH2CI2 seco y la solución resultante se enfrió a 0°C en un baño de hielo. Se añadió TEA (5.64 ml, 40.5 mmoles) y después 3.13 ml (40.6 mmoles) de cloruro de metansulfonilo se añadieron gota a gota. La reacción se agitó durante treinta minutos a 0°C y después se removió del baño de hielo, permitiendo que llegara hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con más CH2CI2 y se lavó con NaHC03 saturado y agua. Los compuestos orgánicos se secaron sobre MgS0 , se filtraron y se concentraron bajo vacío para dar 12.4 g (98%) de mesilato deMPEG6 1. Una solución de 1 ,6-hexanodiol se preparó a partir de 6.311 g del diol (53.41 mmoles) y 180 ml de THF seco. La solución se enfrió a 0°C y se colocó bajo una atmósfera de N2. Ter-butóxido de potasio (6.996 g, 63.41 mmoles) se añadió a la solución y la mezcla resultante se agitó durante una hora. Se añadió I (10.0 g, 26J mmoles) en 30 ml de THF a la mezcla. Todo se agitó durante 30 minutos adicionales a 0°C, después se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite. El Celite se enjuagó con CH2CI2 y el filtrado combinado se concentró bajo vacío. El residuo se volvió a disolver en CH2CI2 y se lavó con agua. Los compuestos orgánicos se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se evaporaron a sequedad. La purificación por cromatografía instantánea (sílice, CHCI3/10% de MeOH). Algún material se purificó adicionalmente por CCD preparatoria (EtOAc/10% de MeOH). El rendimiento combinado fue de 3.923 g (37%) de II. Se disolvió II (3.923 g, 9.89 mmoles) en 16 ml de CH2CI2 seco y la solución resultante se enfrió a 0°C y se colocó bajo N2. Se añadió trietilamina (1.66 ml, 11.9 mmoles) y después 0.92 ml (11.9 mmoles) de cloruro de metansulfonilo se añadió gota a gota. La reacción se agitó a 0°C durante treinta minutos adicionales y después se permitió que llegara hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con más CH2CI2 y se lavó con NaHC03 saturado y agua. Los compuestos orgánicos se secaron sobre Mg2S04, se filtraron y se concentraron bajo vacío para proveer 4.25 g (91 %) del mesilato lll. En un matraz que contenía 50 ml de THF seco, se disolvieron 5.001 g (24.97 mmoles) de 4-benciloxifenol. Se añadió íer-butóxido de potasio (1.202 g, 9.989 mmoles) y la mezcla resultante se agitó durante una hora a temperatura ambiente bajo una atmósfera inerte. Se añadió una solución de 3.950 g (8.324 mmoles) de 111 en 20 ml de THF. Después de 18 horas adicionales, toda la mezcla se extinguió con 10 ml de MeOH y se filtró a través de una almohadilla corta de Ceilite. El filtrado se concentró bajo vacío y el residuo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, EtOAc/MeOH 20:1 ) para proveer 1.584 g (33%) del compuesto IV. ESI EM: m/e 679.16 (M+H)+, 601.14 (M+Na)+. El compuesto IV (0.683 g, 1.18 mmoles) se disolvió en 20 ml de MeOH. A esta solución se añadió una suspensión de 136 mg de d% de Pd/C en MeOH. Toda la mezcla se colocó bajo H2 y se agitó hasta que CCD confirmó que todo el material de partida se había cosumido. La mezcla se filtró después a través de Celíte y el filtrado se evaporó a sequedad para dar 412 mg (71 %) de V. ESI EM: m/e 611.09 (M+Na)+. El oligómero V (0.605 g, 1.09 mmoles) se disolvió en 15 ml de CH2CI2 seco. A esta solución se añadieron 0.23 ml (1.64 mmoles) de TEA y 0.329 g (1.64 mmoles) de p-nitro-fenilcloroformiato. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó después con 15 ml adicionales de CH2CI2 y se lavó con 15 ml de HCl 1 N seguido por 15 ml de agua. Los compuestos orgánicos se secaron sobre MgS04, se filtraron y se concentraron a sequedad. El producto crudo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, elución por gradiente: 3/1 de EtOAc/hexanos-EtOAc) para dar 491 mg (75%) del oligómero activado. ESI EM: m/e 654.71 (M+H)+, 675.71 (M+Na)+.

PEG6OMs OH CH-.CK I 1 ) K O/Bu 2) XXXI M EG?OCCHjJfiOH CH,C. MPEG60(CH2)6OMs 11 III vr 9.13 Métodos para porciones oligoméricas activadas El presente ejemplo describe métodos por los cuales una porción oligomérica de la presente invención se puede activar. 9.13.1 Método l - Activación usando DSC Alquil-PEG-OH, I (0.4 mmoles, 1 eq.) se disolvió en acetonitrilo (5 ml) y se añadió carbonato de disuccinimidilo (DSC, 0.6 mmoles, 1.5 eq.). Después trietílamina (1.2 mmoles, 1.5 eq.) se añadió gota a gota y, después de 10 minutos, la mezcla de reacción se volvió clara. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante -16 horas, la reacción cruda se evaporó a sequedad y después se disolvió en NaHC03 saturado (10 ml), se lavó con acetato de etilo (2 x 20 ml), se secó sobre MgS0 , y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, EtOAc/MeOH, 10:1 ) dio el oligómero activado II.

Alquil-PEG-OH + Acetonitrilo Trietilamina I I 9.13.2 Método II: Activación usando NHS MPEG-alquilo-ácido I (0.644 mmoles, 1.0 eq.) se disolvió en 16 ml de cloruro de metíleno anhidro y después en solución de N-hidroxisuccínimida (0.816 mmoles, 1.5 eq.) y 1-etil-3-(3'-d¡metilamínoprop¡l) carbodiimida. Se añadió HCl (EDCl- HCl, 0.816 mmoles, 1.5 eq.) en cloruro de metileno anhidro. La reacción se agitó durante varias horas, después se lavó con HCl 1 N, agua, se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó por cromatografía instantánea (sílice, elución por gradiente: 2-5% de metanol en CHCI3), para dar MPEG-alquilo-ácido activado II. i EDC?CL, p ECM 9.14 Síntesis de porción modificada con PEG ramificado (éster 2,d-dioxo-pirrolidin-1-ílico de ácido 6-[2-(2-{2-f2-(2-Metoxi-etoxi)-etoxp-etoxi)-etoxi)-1-(2-{2-r2-(2-metoxi-etoxi)-etoxi1-etoxi)-etox¡metil)-etoxicarbonilamino1-hexanoico) 1. Éter tetraetilenglicolmonometílico (14.0 g, 67 mmoles) se disolvió en tetrahidrofurano (90 ml) y se añadió NaH (1 J7 g, 74 mmoles) en porciones y la reacción se agitó durante 2 horas. Después, se añadió gota a gota epíclorhidrina (26.3 ml, 0.34 moles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. La mezcla de reacción cruda se filtró a través de Celite y se lavó con CH2CI2 (250 ml). El filtrado se lavó con H20 (2 x 250 ml), se secó sobre MgS0 , y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 1 como un aceite claro (10.15 g, rendimiento de 57%). 2 2. Éter monometílico de tetraetilenglicol (7.96 g, 0.038 moles) y 1 (10.1 , 0.038 moles) se disolvieron en CH2CI2 (100 ml) y se añadió BF3 OEt2 (0.48 ml, 0.0038 moles). La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con CH2CI2 (200 ml), se lavó con NaHC03 saturado (300 ml), H20 (300 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 10:1 ) dio 2 como un aceite claro (4.5 g, rendimiento de 25%). 3. 4-Nitrocloroformiato (2.87 g, 14.3 mmoles) y 2 (4.5 g, 9.6 mmoles) se disolvieron en CH2CI2 (45 ml). Después de agitación durante 10 minutos, se añadió TEA (2.1 ml, 15 mmoles) y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con CH2CI2 (130 ml), se lavó con HCl 1 M (175 ml), H20 (175 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 15:1) dio 3 como un aceite amarillento (2.38 g, rendimiento de 40%). 4. Acido 6-aminocaproico (0.126 g, 0.96 mmoles) y K2C03 (0.221 g, 1.6 mmoles) se disolvieron en H20 (DI, 5 ml). Después 3 (0.5 g, 0.8 mmoles) se disolvió en THF (0.7 ml) y se añadió gota a gota. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con H20 (20 ml), se acidificó a pH -1 con HCl, se lavó con CH2CI2 (2 x 25 ml), las capas orgánicas se secaron sobre MgS04, y se evaporaron a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, CHCI3/MeOH, 15:1 ) dio 4 como un aceite claro (0.428 g, rendimiento de 85%). 5. Activado usando el método 11: 4 (0.40 g, 0.64 mmoles), N-hidroxisuccinimida (0.088 g, 0.77 mmoles), EDCl (0.160 g, 0.83 mmoles), y CH2CI2 (5 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 10:1 ) dio 5 como un aceite claro (0.320 g, rendimiento de 69%). 9.15 Síntesis de porción modificadora de PEG-alquilo lineal (éster 2-{2-r2-(2-{2-f2-(2-hexyloxi-etoxi)-etoxi1-etox¡)-etox¡)-etox¡1-etoxi}-etílico de éster 2,d-dioxo-pirrolid¡n-1-íl¡co de ácido carbónico) 1 1. Trietilenglicol (30 g, 0.2 moles) se disolvió en una solución de NaOH (8 g en 8 ml de H20) y se agitó durante 10 minutos. Después se añadió cloruro de bencilo (7 ml, 0.062 moles) y la mezcla de reacción se calentó a 100°C y se agitó durante la noche. La reacción cruda se diluyó con NaCI saturado (500 ml), se lavó con CH2CI2 (2 x 400 ml), las capas orgánicas se secaron sobre MgS04, y se evaporaron a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo a acetato de etilo/MeOH, 10:1 ) dio 1 como un aceite amarillento (9.87 g, rendimiento de 67%). 2 2. A una solución de 1 (9.87 g, 0.041 moles) en CH2CI2 (50 ml) se añadió TEA (7.1 ml, 0.064 moles). La solución se enfrió después a 0°C en un baño de hielo y después se añadió gota a gota cloruro de metansulfonilo (3.9 ml, 0.049 moles) disuelto en CH2Cl2 (10 ml). La reacción se agitó a 0°C durante 0.5 horas y después a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción cruda se filtró a través de Celite, se lavó con CH2CI2 (100 ml), el filtrado se lavó con NaHC03 saturado (150 ml), H20 (150 ml), se secó sobre MgS0 , y se evaporó a sequedad para dar 2 como un aceite amarillo (11.06 g, rendimiento de 85%). 3 3. Tetraetilenglicol (7.32 g, 0.038 moles) se disolvió en tetrahidrofurano (140 ml) y NaH se añadió en porciones durante 0.5 horas y la reacción se agitó durante 1 hora adicional. Después 2 (6.0 g, 0.019 moles) se disolvió en CH2CI2 (20 ml) y se añadió gota a gota y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se filtró a través de Celite, se lavó con CH2CI2, y se evaporó a sequedad. El aceite resultante se disolvió en CH2CI2 (150 ml), se lavó con H20 (150 ml), NaHC03 saturado (150 ml), H20 (150 ml), se secó sobre MgS0 , y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 10:1 ) dio 3 como aceite amarillento (3.83 g, rendimiento de 49%). i 4. Preparado de la misma manera que 2: hexanol (6.2 ml, 0.05 moles), cloruro de metansulfonilo (4.6 ml, 0.058 moles), TEA (8.6 ml, 0.065 moles), y CH2CI2 (60 ml) dio 4 como un aceite amarillo (7.8 g, rendimiento de 86%). 5. A una solución de 3 (5.45 g, 0.13 moles) en tetrahidrofurano (160 ml) se añadió fer-butóxido de potasio (1.60 g, 0.0144 moles) y la reacción se agitó durante 1.5 horas. Después, 4 (2.59 g, 0.0144 moles) disuelto en tetrahidrofurano (20 ml) se añadió gota a gota y la reacción se agitó durante la noche. La reacción cruda se filtró a través de Celite, se lavó con CH2CI2, y se evaporó a sequedad. El aceite resultante se disolvió en acetato de etilo (150 ml), se lavó con H20 (2 x 150 ml), se secó sobre MgS0 , y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 5 como un aceite amarillento (2.40 g, rendimiento de 36%). 6. A una solución de 5 (2.4 g, 4.8 mmoles) en acetato de etilo (16 ml) se añadió paladio sobre carbón activado 10% en peso (1.0 g) y el recipiente de reacción se selló con un septo. Un balón que contenía H2 se insertó después en el septo mediante aguja y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción cruda se filtró a través de Celíte, se lavó con acetato de etilo, y se evaporó a sequedad para dar 6 como un aceite claro(1.61 g, rendimiento de 82%). o -0- ^y ^ "o" ^^ ^ "? CI 7 7. Una solución de fosgeno (15 ml de un 20% de fosgeno en en tolueno) se enfrió a -10°C y 6 (1.60 g, 3.9 mmoles) disuelto en tolueno (5 ml) se añadió gota a gota. La reacción se agitó a -10°C durante 0.5 horas y después 4 horas a temperatura ambiente. El fosgeno y tolueno se destilaron después y el aceite resultante se secó bajo vacío para dar 7 como un aceite amarillento. 8 8. Activado usando el método II: 7 (1.65 g, 0.79 mmoles), N-hídroxisuccinimida (0.437 g, 3.8 mmoles), TEA (2.7 ml, 3.8 mmoles), y CH2CI2 (10 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 15:1 ) dio 8 como un aceite claro (1.06 g, rendimiento de 57%). 9.16 Síntesis de alquilo-PEG-alquilo ramificado (éster 2,5-dioxo-pirrolidin-1 -ílico de ácido 6-[2-(2-f2-f2-(2-Heptiloxi-etox¡)-etoxi1-etoxi)-etox¡)-1-(2-(2-r2-(2-heptylox¡-etoxi)-etoxp-etox¡}-etoximetil)-etox¡carbonilaminol-hexanoico) .o„S02CH3 1. Preparado de la misma manera que la mostrada que la mostrada en el ejemplo 9.15: hexanol (18 ml, 0.15 moles), cloruro de metansulfonilo (12.3 ml, 0.16 moles), TEA (25 ml, 0.18 moles), y CH2CI2 (180 ml) dio 1 com un aceite amarillo (23.1 g, rendimiento de 85%). 2 2. Tetraetilenglicol (50.6 g, 0.26 moles) se disolvió en tetrahidrofurano (350 ml) y ter-butóxido de potasio (29.2 g, 0.26 moles) se añadió en porciones durante 0.5 horas. La reacción se agitó 1 hora adicional y después 1 (23.0 g, 0.13 moles) disuelto en THF (50 ml) se añadió. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se filtró a través de Celite, se lavó con CH2CI2, y se evaporó a sequedad. El aceite resultante se disolvió en CH2CI2 (300 ml), se lavó con H20 (2 x 300 ml), se secó sobre MgSO , y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 2 como un aceite claro (18.51 g, rendimiento de 51 %). 3. A una solución de 2 (10.0 g, 36 mmoles) en tetrahidrofurano (60 ml) se añadió NaH (0.95 g, 40 mmoles) en porciones y la reacción se agitó durante 0.5 horas. Después epiclorhidrina (14.1 ml, 0.34 moles) se añadió gota a gota y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas.

La mezcla de reacción cruda se filtró a través de Celite, se lavó con CH2CI2, y se evaporó a sequedad. El aceite resultante se disolvió CH2CI2 (200 ml), se lavaron con NaCI saturado (200 ml), NaHCO3 saturado (200 ml), H2O (200 ml), se secó sobre MgSO4, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/hexanos, 10:1 ) dio 3 como un aceite claro (5.46 g, rendimiento de 45%). 4. A una solución de 2 (4.64 g, 16 mmoles) y 3 (6.46, 16 mmoles) en CH2CI2 (50 ml) se añadió BF3.OEt2 (0.48 ml, 0.0038 moles). La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con CH2CI2 (50 ml), se lavó con NaHCO3 saturado (100 ml), H20 (100 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo a acetato de etilo/MeOH, 10:1 ) dio 4 como un aceite claro (2.40 g, rendimiento de 24%). 5. 4-Nitrocloroformiato (1.18 g, 5.8 mmoles) y 4 (2.4 g, 3.9 mmoles) se disolvieron en CH2CI2 (25 ml). Después de agitación durante 10 minutos, se añadió TEA (0.89 ml, 6.4 mmoles) y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con CH2CI2 (75 ml), se lavó con HCl 1 M (100 ml), H20 (100 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 5 como un aceite amarillento (1.04 g, rendimiento de 34%). 6. Acido 6-aminocaproico (0.157 g, 1.2 mmoles) y K2CO3 (0.276 g, 2.0 mmoles) se disolvieron en H2O (DI, 8 ml). Después 5 (0.80 g, 1.0 mmoles) se disolvió en THF (1.0 ml) y se añadió gota a gota. Gotitas de aceite se formaron cuando se añadió 3 y se añadió etanol (2 ml) y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con H20 (30 ml), se acidificó a pH -1 con HCl, se lavó con CH2CI2 (2 x 35 ml), las capas orgánicas se secaron sobre MgS0 , y se evaporaron a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 20:1 ) dio 6 como un aceite claro (0J20 g, rendimiento de 46%). 7. Activado usando el método II: 6 (0.356 g, 0.46 mmoles), N-hídroxisuccinimida (0.063 g, 0.56 mmoles), EDCl (0.115 g, 0.6 mmoles), y CH2CI2 (3 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 7 com un aceite claro (0.180 g, rendimiento de 45%). 9.17 Ester 2-[2-(2-{2-r2-f6-(2,5-dioxo-pirrolidin-1 -iloxicarboniloxi)-hexilcarbamoiloxi]-3-(2-{2-f2-(2-hexanoiloxi-etoxi)-etoxi1-etoxi)-etoxi)-propox¡]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etílico de ácido hexanoico 1 1. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.15: Tetraetilenglícol (58.27 g, 0.3 moles), Solución de NaOH (12 g en 12 ml de H2O), cloruro de bencilo (10.6 ml, 0.092 moles). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 1 como un aceite amarillento (16.8 g, rendimiento de 64%). 2 2. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.14: 1 (9.6 g, 34 mmoles), NaH (0.898 g, 37 mmoles), tetrahidrofurano (50 ml), epiclorhidrina (13.2 ml, 0.17 moles). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 2 como un aceite claro (6.78 g, rendimiento de 58%). 3. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.14: Tetraetilenglícol (4.86 g, 20 mmoles), 2 (6.78 g, 25 mmoles), BF3 OEt2 (0.25 ml, 2.0 mmoles), CH2CI2 (75 ml). La cromatografía en columna (sílice, CHCI3/MeOH, 20:1 ) dio 3 com un aceite claro (2.85 g, rendimiento de 27%). 4. A una solución de 3 (2.80 g, 5.2 mmoles) en CH2CI2 (20 ml), se añadió TEA (0.8 ml, 5.7 mmoles) y la solución se enfrió a 0°C. Después, cloruro de hexanoilo (0J3 ml, 5.2 mmoles) se añadió gota a gota. La reacción se agitó a 0°C durante 0.5 horas, después a temperatura ambiente durante la noche. La reacción cruda se diluyó con CH2CI2 (80 ml), se lavó con H20 (100 ml), NaHC03 saturado (100 ml), H20 (100 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 15:1 ) dio 4 como un aceite amarillento (1.95 g, rendimiento de 59%). 5. A una solución de 4 (1.94 g, 3.1 mmoles) en acetato de etilo (20 ml) se añadió paladio (1.60 g, 5% en peso sobre carbón activado). La reacción se selló y se= agitó bajo H2 durante la noche. La mezcla de reacción cruda se filtró a través de Celite, se lavó con acetato de etilo y se evaporó a sequedad para dar 6 como un aceite claro (1.09 g, rendimiento de 65%). 6. A una solución de 5 (1.09 g, 2.0 mmoles) en CH2CI2 (14 ml), se añadió TEA (0.31 ml, 2.2 mmoles) y la solución se enfrió a 0°C. Después, cloruro de hexanoilo (0.28 ml, 2.0 mmoles) se añadió gota a gota. La reacción se agitó a 0°C durante 0.5 horas, después a temperatura ambiente durante la noche. La reacción cruda se diluyó con CH2CI2 (86 ml), se lavó con H20 (100 ml), NaHC03 saturado (100 ml), H20 (100 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 15:1 ) dio 6 como un aceite amarillento (0.698 g, rendimiento de 55%). 7. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.14: 4-Nitrocloroformíato (0.332 g, 1.65 mmoles), 6 (0.698 g, 1.1 mmoles), TEA (0.28 ml, 2.0 mmoles), CH2CI2 (7 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 7 como un aceite amarillento (0.688 g, rendimiento de 78%). 8 8. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.14: 6-amino-1 -hexanol (0.142 g, 1.2 mmoles), 7 (0.488 g, 0.6 mmoles), TEA (0.12 ml, 0.9 mmoles), CH2CI2 (5 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 15:1 ) dio 8 como un aceite claro (0.30 g, rendimiento de 65%). 9. Activado usando el método I: Carbonato de N,N'- disuccinimidilo (0.118 g, 0.46 mmoles), 8 (0.30 g, 0.38 mmoles), TEA (80 µl, 0.57 mmoles), acetonitrilo (4 ml). Los lavados dieron 9 como un aceite claro (0.344 g, rendimiento de 90%). 9.18 Ester 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ílico de ácido 6-{2-(2-(2-r2-(2- Hexyloxi-etoxi)-etoxi1-etoxi}-etoxi)-1-[6-(2-{2-f2-(2-metoxi-etoxi)-etoxil-etoxi)-etoxi)-hexyloximetill-etoxicarbonilamino}-hexanoico O'^-" ""S02CH3 1. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.15: éter tetraetilenglicolmonometílico (25 g, 0.12 moles), TEA (19.5 ml, 0.14 moles), cloruro de metansulfonilo (10.0 ml, 0.13 moles), CH2CI2 (100 ml) dio 1 como un aceite amarillo (31.35 g, rendimiento de 91 %).

OH 2. 1 ,6-hexanodiol (7.93 g, 0.084 moles) se disolvió en tetrahidrofurano (200 ml). f-butóxido de potasio (10.37 g, 0.092 moles) se añadió en porciones durante 0.5 horas y se agitó 1 hora adicional. Después, 1 (12.0 g, 0.042 moles) disuelto en tetrahidrofurano (40 ml) se añadió gota a gota medíante embudo de adición y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se filtró a través de Celite, se lavó con CH2CI2, y se evaporó a sequedad. El aceite resultante se disolvió en CH2CI2 (300 ml), se lavó con H20 (2 x 300 ml), se secó sobre MgS04, se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 2 como un aceite claro (5.09 g, rendimiento de 39%). 3. A una solución de 2 (5.0 g, 16 mmoles) en tetrahidrofurano (35 ml) se añadió NaH (0.422 g, 17.6 mmoles) en porciones y la reacción se agitó durante 2 horas. Después se añadió gota a gota epíclorhidrina (6.3 ml, 8.0 mmoles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. La mezcla de reacción cruda se filtró a través de Celite y se lavó con CH2CI2. El aceite resultante se disolvió en CH2CI2 (125 ml), se lavó con H20 (125 ml), NaHC03 saturado (125 ml), H20 (125 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 20:1 ) dio 3 como un aceite claro (2.00 g, rendimiento de 34%). 4. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.14: 2 (1.34 g, 4.8 mmoles), 3 (1.75 g, 4.8 mmoles), BF3OEt2 (0.06 ml, 0.48 mmoles), CH2CI2 (30 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 20:1 ) dio 4 como un aceite claro (1.05 g, rendimiento de 34%). 5. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.14: 4-Nitrocloroformiato (0.464 g, 2.3 mmoles), 4 (1.0 g, 9.5 mmoles), TEA (2.1 ml, 1.55 mmoles), CH2CI2 (10 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo a acetato de etilo/MeOH, 20:1 ) dio 5 como un aceite amarillento (0.663 g, rendimiento de 53%). 6. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.14: ácido 6-aminocaproico (0.054 g, 0.41 mmoles), 5 (0.277 g, 0.34 mmoles), K2C03 (0.094 g, 0.068 mmoles), H20 (DI, 5 ml) dio 6 como un aceite claro (0.268 g, rendimiento de 96%). 7. Activado usando el método II: 6 (0.268 g, 0.34 mmoles), N-hidroxisuccinimida (0.047 g, 0.41 mmoles), EDCl (0.084 g, 0.44 mmoles), y CH2CI2 (4 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH, 15:1 ) dio 7 como un aceite claro (0.178 g, rendimiento de 58%). 9.19 Síntesis de oligómero multi-ramificado 1. Como se preparó en el ejemplo 9.14. 2 2. Diclorhidrato de éster etílico de L-lisina (0.32 g, 1.3 mmoles) y 1 (1.71 g, 2J mmoles) se disolvieron en DMF (30 ml) y se añadió TEA (0.90 ml, 6.5 mmoles). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se evaporó a sequedad, se disolvió en CH2CI2 (30 ml), se lavó con HCl 1 M (30 ml), H20 (30 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, CHCI3/MeOH, 25:1 ) dio 2 como un aceite claro (1.01 g, rendimiento de 66%). 3. Una solución de 2 (1.0 g, 0.85 mmoles) en NaOH 1 M (10 ml) se agitó durante 6 horas a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con NaCI saturado (50 ml), se acidificó a pH -2, se lavó con CH2CI2 (2 x 50 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad para dar 3 como un aceite claro (0J24 g, rendimiento de 74%). 4. Activado usando el método II: 3 (0.070 g, 0.61 mmoles), N-hidroxisuccinimida (0.091 g, 0.79 mmoles), EDCl (0.182 g, 0.95 mmoles), y CH2CI2 (7 ml). La cromatografía en columna (sílice, CHCI3/MeOH, 20:1 ) dio 4 como un aceite claro (0.480 g, rendimiento de 63%). 9.20 Síntesis de porción modificadora de azúcar-PEG-alquilo (éster 4,5-b¡s-(2,2-dimetil-propioniloxi)-6-(2,2-dimetil-propionilox¡metil)-3-{6-|"2-(2-{2-["2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarboniloxi)-etoxp-etoxi}-etoxi)-etoxi]-hexanoilaminoHetrahidro-piran-2-ílico de ácido 2,2-dimetil-propionico) 1. Preparado de la misma manera como se muestra en el ejemplo 9.15: 6-hídroxíhexanoato de etilo (8.0 g, 0.05 moles), cloruro de metansulfonilo (4.6 ml, 0.06 moles), TEA (10 ml, 0.072 moles), y CH2CI2 (32 ml) dio 1 como un aceite amarillo (11.15 g, rendimiento de 93%). 2. Tetraetilenglicol (19.1 g, 0.098 moles) se disolvió en tetrahidrofurano (190 ml) y NaH (1.69 g, 0.071 moles) se añadió en porciones durante 0.5 horas. La reacción se agitó 1 hora adicional y después se añadió 1 (23.0 g, 0.13 moles) disuelto en tetrahidrofurano (10 ml). La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se filtró a través de Celite, se lavó con CH2CI2, y se evaporó a sequedad. El aceite resultante se disolvió en CH2CI2 (200 ml), se lavó con NaCI saturado (200 ml), H20 (200 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de efilo/MeOH, 25:1 ) dio 2 como un aceite claro (1.60 g, rendimiento de 10%). 3. Una solución de 2 (1.60 g, 4J mmoles) en NaOH 1M (6 ml) se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con NaCI saturado (24 ml), se acidificó a pH -2, se lavó con CH2CI2 (2 x 30 ml), se secó sobre MgS04l y se evaporó a sequedad para dar 3 como un aceite claro (1.08 g, rendimiento de 73%). 4. 2,3,4,6-Jeíra-O-pivaloil-ß-D-galactoespiranosilamina (0.836 g, 1.6 mmoles) y 3 (0.50 g, 1.6 mmoles) se disolvieron en CH2CI2 (8 ml). Después, EDCl (0.368 g, 1.92 mmoles) se añadió y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de agitación durante la noche, la reacción fue incompleta por lo que se añadió EDCl (0.368 g, 1.92 mmoles) y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción cruda se diluyó con CH2Cl2 (22 ml), se lavó con HCl 1 M (30 ml), H20 (30 ml), NaCI saturado (30 ml), se secó sobre MgS04, y se evaporó a sequedad. La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo/MeOH) dio 4 como un aceite viscoso (0.397 g, rendimiento de 31 %). 5. Activado usando el método I: 4 (0.397 g, 0.50 mmoles), N-hidroxisuccinimida (0.063 g, 0.60 mmoles), TEA (0.10 ml, 0.75 mmoles), y acetonitrilo (4 ml). La cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo) dio 5 como un aceite viscoso (0.256 g, rendimiento de 56%). 9.21 Conjugados natriuréticos hidrolizables, no hídrolizables y pegilados El presente ejemplo se provee para demostrar la utilidad de la presente invención para proveer conjugados de compuesto natriurético que han sido modificados para incluir virtualmente todas las clases de porciones oligoméricas, particularmente oligómeros no hidrolizados, oligómeros microPAGilados y oligómeros hidrolizables. Los presentes conjugados de hBNP se sintetizaron utilizando varios oligómeros conjugados en diferentes posiciones en el péptido. Los conjugados que tienen la mejor combinación de rasgos (actividad agonista en el receptor, resistencia a proteólisis, y biodisponibilidad oral) se han vuelto los candidatos líderes para pruebas in vivo más extensivas. El hBNP nativo se obtuvo de una compañía de síntesis de péptido de contrato. Los oligómeros anfifílicos que se usaron en la conjugación provienen de un suministro de oligómeros y de olígómeros diseñados y sintetizados específicamente para conjugación a hBNP. La conjugación siguió una estrategia de conjugación de tres clases como se ilustra en la figura 2. Los oligómeros de clase 1 se probaron primero. Debido a que la conjugación extensiva con oligómeros de la clase 1 redujo la actividad, se investigaron tri y tetra conjugados con oligómeros de clase 2. Debido a que los oligómeros de clase 2 no fueron tan eficaces, se evaluaron dos conjugados de profármaco (oligómeros de clase 3). Una primera clase de conjugados es no hidrolizable. Para conjugados de esta clase, la sustancia de fármaco que es dosificada (es decir, el conjugado) es la sustancia que actúa en el receptor. En otras palabras, el oligómero y su unión al péptido permanece intacto desde el tiempo de la dosificación hasta el tiempo de aclaramiento. Estos oligómeros generalmente pueden estar compuestos de una porción alquilo y una porción PEG. Para aumentar al máximo la efectividad del oligómero para hacer el conjugado oralmente disponible y resistente a proteólisis, las longitudes de las porciones alquilo y PEG pueden ser alteradas y el orden puede ser cambiado. El grado de conjugación (v.gr. mono-, diconjugado) también puede ser manipulado. Algunos oligómeros que pueden proveer conjugados caen dentro de esta primera clase así como los métodos para proveer dichos conjugados se describen en la patente de E.U.A. No. 5,359,030 de Ekwuribe; patente de E.U.A. No. 5,438,040 de Ekwuribe; patente de E.U.A. No. 5,681 ,811 de Ekwuribe; patente de E.U.A. No. 6,191 ,105 de Ekwuribe; solicitud de E.U.A. No. 09/474,915, presentada el 31 de diciembre de 1999; solicitud de E.U.A. No. 09/459,443, presentada el 13 de diciembre de 1999; y solicitud de E.U.A. No. 09/873,797, presentada el 4 de junio de 2001 , cuyas descripciones se incorporan aquí por refrenda en su totalidad. Una segunda clase de conjugados son microPAGilados. Para conjugados de esta clase, la porción alquilo del oligómero es digerida una vez que el conjugado está en el torrente sanguíneo. Estos conjugados pueden ser particularmente útiles cuando ocurre conjugación dentro de una región del péptido natriurético que es necesario para unir al receptor, NPR-A. En tales casos, la primera clase de oligómeros puede ser benéfica para estabilidad y suministro, pero puede ser perjudicial para actividad. La segunda clase de conjugados reduce o elimina ese problema. El oligómero anfifílico permanece intacto a través del tracto digestivo e incrementa la absorción en el duodeno superior. Una vez en circulación, la porción alquilo es digerida. Por lo tanto, un oligómero más pequeño es unido al péptido circulante cuando alcanza el receptor. En algunas modalidades, el impedimiento estérico disminuido conduce a actividad incrementada en el receptor. Algunos olígómeros que pueden proveer conjugados que caen dentro de esta segunda clase así como métodos para proveer dichos conjugados se decriben en la patente de E.U.A.

No. 6,309,633 de Ekwuribe et al. y solicitud de E.U.A. No. 10/018,879, presentada el 19 de diciembre de 2001 , cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Una trecera clase de conjugados es completamente hídrolizable. Para conjugados de esta clase, el oligómero entero es digerido una vez que el conjugado es absorbido. Igual que la segunda clase, estos conjugados pueden ser particularmente útiles cuando ocurre la conjugación dentro de una región que es necesaria para unión. Sin embargo, en el caso de que los conjugados microPAGilados aún no retengan suficiente actividad, la tercera clase de conjugados pueden obviar completamente la posibilidad de que el oligómero interfiera con la unión del receptor. En este caso, el conjugado permanece intacto a través del tracto digestivo. Una vez que el conjugado es absorbido, el oligómero es digerido, el cual libera el péptido nativo en circulación. Conjugación de hBNP. El grupo carboxilo del oligómero anfifílico (CßPEG7) es activado con N-hidroxisuccinimida, un grupo de activación común en qupimica de péptidos. Una vez activados, los oligómeros se unen al péptido ya sea en solución acuosa o DMSO. hBNP tiene cuatro sitios para conjugación: tres residuos de Lys y el N-terminal. Al variar la estequiometría de la reacción, el grado de conjugación (mono-, di-, etc.) puede ser controlado. La dísttribución de producto puede ser alterada al variar las condiciones de reacción. A medida que los sitios preferidos para conjugación son descubiertos a través de las pruebas de actividad, la síntesis preferencial de los conjugados deseados se pueden obtener al variar la estequiometría y las condiciones de reacción. Elección de oligómeros de PEG-alquilo. Al variar la longitud relativa de los componentes alcano (hidrofóbico) y PEG (hidrofílico), el carácter afifílico y la estructura de solución del conjugado puede ser mejorada. La porción PEG es muy flexible en solución y puede jugar un papel importante en resistencia a enzimas. La porción alquilo puede mejorar la absorción en el intestino y/o permitir interacción con membranas celulares. La última característica puede ser particularmente importante cuando el objetivo es una proteína unida a la membrana sobre la superficie celular, tal como NPR-A. Por lo tanto, la elección del oligómero puede determinar la efectividad del conjugado en términos de estabilidad de enzima y biodisponíbilidad oral. Purificación de conjugados de hBNP. Las mezclas de reacción son purificadas en una columna de CLAR preparativa (C-18) con un sistema de gradiente de solventes hecho de isopropanol/agua (ácido trifluoroacético al 0.1 %). El solvente se evapora y liofiliza para dar productos secos. La pureza de los conjugados se determina por CLAR de fase inversa y espectrometría de masa. 9.21.1 Oligómeros de clase 1 : No hidrolizables Se sintetizron aproximadamente de treinta conjugados que utilizaron oligómeros no hidrolizables (clase 1 ). Para conjugados de esta clase, la sustancia de fármaco que es dosificada es la sustancia que actúa como el receptor. En otras palabras, el oligómero y su unión al péptido permanece intacto desde el tiempo de dosificación hasta el tiempo de aclaramiento. Experimentos de mapeo de fármaco revelaron los sitios sobre hBNP a los cuales se unen los oligómeros. Al cambiar la cantidad de oligómero añadido a la reacción, se podría sesgar la distribución de producto. El monoconjugado predominante que se formó se conjugó a Lys3; el diconjugado predominante tuvo los oligómeros unidos en la Lys3 y Lys4. Al variar las condiciones de reacción, el triconjugado y el tetraconjugado se podrían formar como el producto exclusivo. El triconjugado realizó unión de oligómero en Lys3, Lys14 y Lys27. El tetraconjugado añadió una cuarta unión-en el N-terminal. Inicialmente todos los mono, di, tri, and tetraconjugados disponibles se aislaron para probar actividad in vitro. Con base en los datos de actividad, se enfocó en los monoconjugados de Lys3 cuando se usaron oligómeros de clase 1. 9.21.2 Oligómeros de clase 2: Micropegilados Ocho conjugados que utilizaron micropegilación (clase 2) se sintetizaron con base en la teoría que, debido a que Lys14 y Lys27 están en (o próximos a) la porción de unión a BNP, la conjugación micropegilada de estos sitios permitiría al péptido ser más completamente conjugado y aún rterener actividad. El oligómero anfifílico permanece intacto a través del tracto digestivo e incrementa la absorción en el duodeno superior. Una vez en circulación, la porción alquilo es digerida. Por lo tanto, un oligómero más pequeño se une al péptido circulante cuando alcanza el receptor. Tri- y tetraconjugados de esta clase se sintetizaron tanto antes como después de digestión del grupo alquilo. Incluso después de que los grupos alquilo fueron digeridos, unidades de PEG pequeñas unidas a BNP en tres o cuatro sitios fueron perjudiciales para la actividad (datos mostrados en la siguiente sección), aunque estos conjugados retuvieron un grado de actividad terapéuticamente significativo. 9.21.3 Oligómeros de clase 3: Oligómeros hidrolizables Se sintetizaron ocho conjugados que utilizaron que oligómeros completamente hidrolizables (clase 3). Para conjugados de esta clase, el conjugado permanece intacto a través del tracto digestivo. Una vez que el conjugado es absorbido, el oligómero es digerido, liberando el péptido nativo en circulación. Igual que con la segunda clase, estos conjugados son útiles cuando la conjugación occurre dentro de una región que es necesaria para unión. Sin embargo, en situaciones en donde los conjugados micropegilados aún no retienen actividad, la tercera clase de conjugados obvia completamente la posibilidad de que el oligómero interfiera con la unión de receptor. Mono, di, tri, y tetraconjugados se hicieron a partir de esta clase de oligómeros. Los tri y tetraconjugados fueron menos estables. Se probaron dos conjugados. Las mezclas de reacción se purificaron en una columna de CLAR preparativa (C18) con un sistema de gradientes de solvente hecho de isopropanol/agua (ácido trifluoroacético al 0.1 %). El solvente se evaporó y liofilizó para proveer los conjugados como polvos secos. Las purezas de los conjugados se determinaron por CLAR de fase inversa y espectrometría de masa. BNP se examinó en la prueba para proveer una medida de actividad para el péptido hBNP de tipo silvestre nativo. El péptido hBNP nativo usado fue la secuencia de 1-32 aminoácidos, SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH, (SEQ ID NO: 98) en la cual C10 y C26 son unidos por un enlace de disulfuro para formar un enlace. Los resultados y estructuras de veintinueve de las construcciones se proveen en el cuadro 1. Los conjugados BNP se evaluaron para CE50 y Emáx, y estos valoresa se compararon con aquellos obtenidos bajo las mismas condiciones experimentales que para el péptido nativo. Estos datos en comparación con BNP nativo (1-32 aa) sin una porción oligomérica se proveen en el cuadro 1. Estos resultados indican hacia una preferencia para el monoconjugado de BNP que incluye una porción modificadora de clase 1 en Lys3 (BNP-002), y el monoconjugado de BNP que incluye una porción de modificación de clase 2 en Lys 14 o Lys 27. El mono-1 , mono-2, mono-3 y mono-4 son los monoconjugados de BNP y marcados como en el orden que se eluyen en CLAR. En el siguiente cuadro, el mono-1 BNP es el péptido conjugado de BNP que incluye la porción modificadora indicada (estructura de oligómero) en el residuo de BNP Lys-3. El mono-2 y mono-3 son co-eluidos en CLAR y es una una mezcla de Lys-14 y Lys-27. Los diconjugados generalmente se obtienen como mezclas que se eluyen estrechamente juntas en CLAR. Los diconjugados mayores son Lys3/Lys14 y Lys3/Lys27. El triconjugado predominante es conjugado en Lys3, Lys14, y Lys27. El producto identificado como "mono-4" incluye la porción modificadora (oligómero) en el N-terminal del péptido BNP. El "mono-1" incluye la porción modificadora conjugada en Lys3 del péptido BNP. El producto "mono-2" incluye la porción modificadora (olig?mero) conjugado en Lys14 del péptido BNP, o en Lys 27 del péptido BNP. Para resultados, véase los cuadros A-D.

CUADRO A NOBEX Corporation -fc.

CUADRO B NOBEX Corporation Ul CUADRO C NOBEX Corporation 00 CUADRO D NOBEX Corporation 9.22 Péptidos natriuréticos candidatos - Urodilatin, péptido natriurétrico de Dendroaspis (DNP). y péptido natriurético de canino Se prevé que la presente tecnología de conjugación se puede usar con muchos péptidos natriuréticos diferentes y análogos de estos péptidos para construir cualquier número de diferentes modalidades de conjugados de péptido natriurético bioactivos con actividad farmacológica retenida, permeabilidad de membrana celular mejorada, y/o resistencia a proteasa. Además del hBNP descrito en algunos de los ejemplos aquí, estos péptidos candidatos incluyen a manera de lista parcial, péptidos, fragmentos de péptido y péptidos enteros, y péptidos de construcciones múltiples preparadas y/o aisladas del siguiente ensamble de péptidos/proteínas bioequivalentes. Está dentro del alcance de la presente invención incluir estas construcciones y construcciones sustituidas conservativas de las mismas en la preparación de las modalidades, la presente invención, así como en las preparaciones farmacéuticas que contienen estas construcciones en un conjugado de con por lo menos una porción modificadora com se define aquí en el tratameinto de insuficiencia cardiaca congestiva. Estos péptidos poseen una estructura susceptible de modificar la porción de conjugación. 1. Urodilatin (hANP con cuatro residuos adicionales en el N-terminal) TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFX1Y (SEQ ID NO: 99) El aminoácido T define un sitio de conjugación de porción modificadora. En la secuencia anterior, X1 es lisina o un aminoácido distinto de la arginina. En donde X1 es lisina, se provee un segundo sitio de conjugación de porción modificadora. 2. Péptido natriurético de canino (NP de canino) BNP de canino ofrece ventajas natural para la fabricación de conjugados. No existen sitios de conjugación en la región de bucle. Los sitios de conjugación están presentes en las colas N- y C- terminales. Estas características permitirían conjugación sin pérdida de actividad. También conduciría a una distribución más pequeña de productos, dando por resultado un rendimiento más alto y purificación más fácil.

SPX1MMHX2GGCFGRRLDRIGSLSGLGCNVLRX3Y (SEQ. ID. NO . 100) Los sitios de aminoácido de X , X2, y X3 presentan sitios de conjugación de porción modificadora. En este péptido neutro, los 3 sitios del péptido están disponibles para conjugación con una porción modificadora. La región de bucle es identificada en el aminoácido 10 (C) al aminoácido 26 (C). Se contempla que cualesquiera 2 o los 3 de los aminoácidos en la posición 3, 14 ó 27 pueden ser sustituidos con un residuo distinto de Lys, tal como Arg. 3. Péptido natriurético de Dendroaspis (DNP) EVX1YDPCFGH X2IDRINHVSN LGCPSLRDPRPNAPSTSA (SEQ ID NO. 101 ) El sitio de aminoácido del Xx y X2 son sitios de conjugación de porción modificadora. En este ejemplo, tanto Xi como X2 son el aminoácido Lys. En algunas modalidades, X1 es Arg o X2 es Arg. El N terminal es también un sitio de conjugación. Preferiblemente, en donde X1 es lisina, X2 es arginina (u otro distinto a la lisina). Opcionalmente, el péptido puede incluir un sitio de conjugación adicional en el N-terminal. 4. Péptido natriurético de tipo C (CNP) GLSK1GCFGLK2LDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO.: 102) El sitio de aminoácido de K1 y K2 son son sitios de conjugación de porción modificadora. En este ejemplo, tanto K1 como K2 son el aminoácido Lys. Sin embargo, análogos del péptido pueden incluir un Arg (R) en lugar de Lys en cualquiera o ambas de estas posiciones en el péptido.

Opcionalmente, el péptido puede incluir un sitio de conjugación adicional en el N-terminal. 5. ANP (humano)(rata)(porcino) SLRRSSCFGGRXDRIGAQSGLGCNSFRY (SEQ ID NO.: 103) En este ejemplo, X es Met(M) o lle(l), y en donde un sitio de conjugación de porción modificadora está en el N-terminal, o R es cargado a K para proveer un sitio de porción modificadora. 9.23 Actividad agonista en el receptor de péptido natriurético humano A (NPR-A) Las propiedades vasorelajadoras, natriuréticas y diuréticas de BNP se ascriben a un mensajero secundario, GMP cíclico (GMPc). La producción de GMPc se logra por guanilato ciclasa, una enzima que es activada cuando BNP se une al receptor de péptido natriurético A (NPR-A) sobre la superficie de células endoteliales. La capacidad de los conjugados ya sea con oligómeros no hidrolizables (clase 1 ) o micropegilados (clase 2) para estimular la producción de GMPc en células endoteliales aórticas humanas (HAEC) que espresan el receptor de péptido natriurético-A (NPR-A) se evaluó. Para el grupo micropegilado, los conjugados se probaron con y sin la porción alquilo unida. Los conjugados con oligómeros completamente hidrolizables (clase 3) no se evaluaron en esta prueba porque el compuesto que es finalmente liberado en la circulación es el péptido nativo. Los tri- y tetra-conjugados que utilizan oligómeros no hidrolizables (clase 1 ) fueron menos activos. Por lo tanto, los tri- y tetraconjugados que utilizan micropegilados (clase 2) se prepararon y se probaron. Los datos in vitro generados a partir de estos oligómeros de clase 2 se presentan en el cuadro 2.

CUADRO 2 Conjugados de hBNP que utilizan oligómeros de clase 2 La figura 3 muestra las curvas de actividad para varios conjugados de Lys-3 que utilizan oligómeros de clase 1. Los cuatro conjugados en el cuadro 2 demuestran un Emáx promedio y una EC50 promedio más cercano a aquellos con la actividad obtenida con formas nativas del péptido BNP (cuadro 3) y por lo tanto se evaluaron en otras pruebas.

CUADRO 3 Actividad ín vitro de conjugados de hBNPs Las HAEC primarios se compraron de Clonetics para determinación selectiva de GMPc. Las células se colocaron en placas de 12 pozos el día anterior al experimento. El día del experimento, las células se pre-incubaron durante 10 minutos a 37°C con IBMX 0.5 mM par inhibir fosfodiesterasas. Los compuestos de prueba se añadieron a las células durante 60 min adicionales a 37°C y la incubación se detuvo usando las células para medir GMPc. Un equipo de GMPc basado en ELISA se usó para medir la producción de GMPc (equipo de prueba fluorescente de GMPc CatchPoint-cyclic GMP Fluorescent Assay Kit, catálogo #R8074, Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA). Este equipo mide GMPc mediante un inmunoensayo competitivo en formato de 96 pozos. Los lisados de células se añadieron a la microplaca revestida seguida por la adición de un anticuerpo anti-GMPc y un conjugado de peroxidasa de rábano (HRP)-GMPc. Las placas se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente, seguido por cuatro lavados. Se añadió una solución de sustrato y la intensidad fluorescente de cada pozo se determinó cuantitativamente. La intensidad de señal fluorescente disminuyó con niveles cada vez mayores de GMPc. Se probó hBNP nativo en cada experimento como un control positivo. 9.24 Conjugados de BNP y resistencia incrementada a proteasas Los compuestos natriuréticos que fueron activos in vitro están siendo probados para su estabilidad en presencia de varias proteasas, tales como tripsina y quimotripsina. La estabilidad de estos compuestos conjugados a proteasas puede ser determinada por las vidas medias de los compuestos conjugados en presencia de tripsina y quimotripsina. Por lo tanto, varios conjugados evaluados en estas pruebas tuvo una vida media más larga que hBNP nativo. Por ejemplo, véase la figura 4. Los conjugados se incubaron con la enzima durante 2 a 120 minutos a 37°C. Las digestiones se detuvieron añadiendo 1 :1 de ácido trifluoroacético al 1% (TFA): solución de extinción de isopropanol. La digestión de los conjugados de hBNP se compararon con la digestión de hBNP nativo en cada experimento. La cantidad de compuesto progenitor que quedó en cada muestra se determinó cuantitativamente por análisis de CLAR. 9.25 Conjugados de BNP y biodisponibilidad oral Los conjugados que fueron activos in vitro se probaron para su biodisponibilidad oral en ratas. Los conjugados se administraron al tracto gastrointestinal por alimentación forzada oral y la presencia de los conjugado de hBNP en el torrente sanguíneo se probó usando procedimientos de radioinmunoensayodisponibles. Los anticuerpos para detección de hBNP son específicos; la reactividad cruzada con BNP de rata es menor que 1 %. Consecuentemente, la reactividad cruzada e interferencia por BNP de rata endógeno no se produjo. Ratas machos adultas que pesaban aproximadamente 250 g se usaron para determinar biodisponibilidad oral de hBNP y conjugados de hB NP. Las ratas se dejaron en ayuno durante la noche y se les proveyó agua corriente ad libitum (excepto durante un período sin agua durante 2 horas antes de la dosificación hastal 1 hora después de la dosificación). Antes de la dosis, las ratas se pesaron y se distribuyeron en todos los grupos de dosificación por peso corporal por lo que cada grupo de dosificación pesaron aproximadamente lo mismo. Cinco ratas se usaron por punto de tiempo. Los conjugados se administraron en una formulación líquida de ácido graso a una dosis de 2.5 mg/kg. Se tomaron muetsras de sangre a 5, 15, 30 y 60 min después de la dosificación. Células veosas centrales para todos los experimentos de dosificación se recogieron y se centrifugaron. Las muestras de plasma se congelaron a -80°C para análisis. Las concentraciones en el plasma de conjugados de hBNP se midieron mediante una prueba inmunoradiométrica comercial (IRMA) específica para la determinación cuantitativa de BNP humano en el plasma (SHIONORIA™ BNP, Catálogo # 127024, Shionogi & Co., Ltd, Osaka, Japón). Se extrajo sangre de las ratas dosificadas en tubos de recolección de sangre de terftalato de polietileno (PET) plásticos revestidos con EDTA y se centrifugaron a 1600 - 2000 x g durante 5 minutos en una centrífuga (2 - 8°C) refrigerada. Las muetsras se almacenaron en tubos de plástico a - 80°C en un congeladores libres de congelamiento hasta análisis. 500 µl de muestra se usaron para la IRMA. 100 µl de la muestra se añadieron a un tubo con 200 µl de reactivo de 125I-BNP y una esfera revestida con anticuerpo anti-BNP. Cada tubo se sometió a acción de remolino y se incubó sin agitación, durante 18 a 22 horas a 2 a 8°C. Los tubos después se aspiraron y se lavaron con 2.0 ml de solución de lavado (solución regulada en su pH + NaN3 al 0.05%) y después se volvieron a aspirar. El procedimiento de lavado se repitió y el contenido del tubo aspirado. La radioactividad restante en cada tubo fue contado por un contador gamma. La radioactividad fue directamente proporcional a la concentración de hBNP o conjugados de hBNP en la muestra. Para cuantificar con precisión muetsras de conjugados de hBNP y permitir diferencias de reconocimiento de anticuerpo entre conjugados de hBNP y la molécula nativa, la concentración se determinó de una curva estándar obtenida para el conjugado de hBNP apropiado. Los cuatro conjugados que se dosificaron en ratas fueron todos detectables en la circulación cinco minutos después de la dosificación (figura 5). Estos cuatro conjugados fueron BNP-002, BN-021 , BN-022, y BN-024. 9.26 Preparación de modificaciones de un polímero diconjugado, monoconiugado y triconjuqado en la estructura peptídica El presente ejemplo se provee para demostrar la utilidad para la presente invención en la creación de formas de multi-conjugado del péptido bioactivo de elección. A manera de ejemplo, la presente descripción describirá una forma de monoconjugado, diconjugado y triconjugado del péptido natriurético humano, hBNP.

Protocolo para conjugar a hBNP Los oligómeros se unirían mediante el mismo procedimiento usado para conjugación a hBNP. Una diferencia es que se puede añadir más del oligómero activado (1 - 10 equivalentes; preferiblemente 3-5 equivalentes). Las lisinas son las colas de la secuencia. Los sitios de conjugación múltiple supuestamente darían mayor estabilidad en presencia de proteasas. La falta de sitios de conjugación dentro del bucle es ventajoso para unirse al motivo de unión a NPR-A. 9.27 Síntesis de un conjugado de polímero anfifílico de hBNP Usando oligómeros anfifílicos de diferente tamaño y composición químca, las propiedades de absorción y partición de un conjugado de péptido, tal com conjugado de hBNP, pueden ser alteradas. La determinación selectiva de conjugado se usa para determinar cuál de los conjugados retiene la actividad del péptido nativo y muestra resistencia mejorada a enzimas. Los conjugados que tienen una combinación deseable de rasgos (v.gr., actividad agonista en el receptor, resistencia to proteólisis, y biodisponibilidad oral) pueden convertirse en candidatos principales para prueba in vivo más extensiva. 9.27.1 Procedimiento general para conjugación a BNP El monoconjugado hBNP usa los sitios Lys 3 o Lys 14, o Lys 27, o en el N-terminal del péptido.

Método I: Preparación de monoconjugados h-BNP (1 equiv) se disolvió en DMSO (1 ml / 35 mg de h-BNP). El oligómero activado (1.1 equiv) se disolvió en una cantidad mínima de THF y se añadió a la solución de h-BNP en DMSO. La reacción se monitoreó por CLAR. Muestras para monitoreo de CLAR se prepararon tomando 50 µl de la reacción y diluyéndola en 500 µl de H2O que contenía TFA al 0.1%. Las reacciones se llevaron a cabo durante 45 minutos. Si las reacciones no se purificaban inmediatamente, se congelaban hasta que se pudiera llevar a cabo la purificación.

Método ll: Preparación de conjugados múltiples h-BNP (1 equiv) se disolvió en DMSO (1 ml/35 mg de h-BNP).

Una vez que se disolvió h-BNP, se añadió TEA (120 equiv) y la solución se agitó durante 5 min. Después, el oligómero activado (2.2 equiv. para diconjugado, 4 equiv. para triconjugado, 5 equiv. para tetraconjugado) se disolvió en una cantidad mínima de THF y se añadió a la solución de h-BNP en DMSO. Las reacción se monitoreó por CLAR. Las muestras para monitoreo por CLAR se preparó tomando 50 µl de la reacción y diluyéndola en 500 µl de H20 que contenía TFA al 0.1 %. Las reacciones se llevaron a cabo durante 45 min. Si las reacciones no se purificaban inmediatamente, se congelaban hasta que se pudiera llevar a cabo la purificación. El diconjugado hBNP usa sitios Lys 3, y Lys 14, o Lys 3 y Lys 27 sitio en hBNP.

El triconjugado hBNP usa sitios Lys 3, Lys 14 y Lys 27. 9.28 Análogos de compuesto natriurético El presente ejemplo se provee para demostrar la utilidad de la presente invención para una variedad de formas de péptido similar a BNP bioactivo y fragmentos de péptido del mismo para usarse en la práctica de presente invención. Estas formas variantes, o análogos, se caracterizan por la presencia de uno o más aminoácidos mutados en lugar de un aminoácido que ocurre naturalmente a partir de péptido /proteína nativa correspondiente. 1. Análogo de región de bucle de hBNP CFGRXMDRISSSSGLGC- (SEQ ID NO. 1 ) en donde X es una aminoácido distinto de Lys, o X is Arg o Gly. 2. Análogo de hBNP-3Arg o un aminoácido distinto de Lys -SPRMVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-X2- (SEQ ID NO. 104) en donde X2 es 1 a 10 aminoácidos, preferiblemente 1-6 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, X2 es KVLRRH (SEQ ID NO. 105), KVLRR (SEQ ID NO. 105), KVLR (SEQ ID NO. 106), KVL, KV, K, RVLRRH (SEQ ID NO. 16), RVLRR (SEQ ID NO. 16), RVLR (SEQ ID NO. 17), RVL, RV, o R. 3. Análogo de sitios de mutación de hBNP-3; 3Arg, 14Arg. 27Arg SPX1MVQGSG-CFGRX2MDRISSSSGLGC-X3VLRRH (SEQ ID NO. 107) en donde X1 es Lys o un aminoácido distinto de Lys, X2 es una aminoácido distinto de Lys, y X3 es Lys o un aminoácido distinto de Lys. En algunas modalidades, X1, X2, y X3, son independientemente Arg o Gly. En otras modalidades, X1 es Lys, X2 y X3 son independientemente Arg o Gly. En una modalidad preferida, por lo menos uno de X1, X2 y X3 es Lys. 4. Análogo de hBNP-14 y 27Arg, y un sitio de modificación terminal, X1 X1SPKMVQGSG-CFGRX2MDRISSSSGLGC-X3VLRRH- (SEQ ID NO. 108) en donde X1 es u n sitio de modificación C-terminal (Ser); y en donde X2 y X3 son un aminoácido distinto de Lys. En algunas modalidades X2 y X3 son independientemente Arg o Gly. En otras modalidades, X2 es Arg y X3 es Lys. 5. Análogo de hBNP-14Arg (Todos los fragmentos en los cuales una o ambas colas son acortadas hasta el bucle) X1— CFGRRMDRISSSSGLGC - X2 (SEQ ID NO. 4 109) en donde X1 es 1 a 10 aminoácidos, preferiblemente 1-9 aminoácidos de longitud, y en donde X2 es 1 a 10, preferiblemente 1-6 aminoácidos de longitud. X1 puede comprender SPKMVQGSGC (SEQ ID NO. 110), PKMVQGSGC (SEQ ID NO. 111 ), KMVQGSGC (SEQ ID NO. 112), MVQGSGC (SEQ ID NO. 113), VQGSGC (SEQ ID NO. 114), QGSGC (SEQ ID NO. 115), GSGC (SEQ ID NO. 116), SGC, GC, C, SPK, SPKM (SEQ ID NO. 117), SPKMV (SEQ ID NO. 118), SPKMVQ (SEQ ID NO. 119), SPKMVQ (SEQ ID NO. 119), KMVQ (SEQ ID NO. 120), KMV, KMVQG (SEQ ID NO. 121 ), KMVQGS (SEQ ID NO. 122), KMVQGSG (SEQ ID NO. 123), o KMVQGSGC (SEQ ID NO. 112). X2 puede comprender KVLRRH (SEQ ID NO. 105), KVLRR (SEQ ID NO. 105), KVLR (SEQ ID NO. 106), KVL, KV, K, RVLRRH (SEQ ID NO. 16), RVLRR (SEQ ID NO. 16), RVLR (SEQ ID NO. 17), RVL, RV, o R. 6. Análogo de hBNP 1-29-3Arg o aminoácidos distintos a Lys SP X1MVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC- KVL (SEQ ID NO. 124) en donde X1 es Arg, o aminoácidos distintos a Lys 7. Análogo de hBNP 1-26-3Arg o aminoácido distinto de Lvs SPX1MVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC (SEQ ID NO. 125) en donde X1 es Arg, Gly, u otro aminoácido distinto de Lys. 8. Análogo de cola C-terminal acortada por hBNP Lys 14 Arg, 27Arg, o aminoácido distinto de Lys X1 - CFGRRMDRISSSSGLGC-RVLRRH (SEQ ID NO.: 126) en donde X1 es 1 a 10 aminoácidos, preferiblemente 1 a 9 aminoácidos de longitud. X1 puede comprender SPKMVQGSGC (SEQ ID NO. 110), PKMVQGSGC (SEQ ID NO.111), KMVQGSGC (SEQ ID NO. 112), MVQGSGC (SEQ ID NO.113), VQGSGC (SEQ ID NO.114), QGSGC (SEQ ID NO.115), GSGC (SEQ ID NO.116), SGC, GC, o C. 9. Análogo de hBNP-Lys 14Arg o un aminoácido distinto de Lys -CFGR X1MDRIX2GLGC- (SEQ. ID. NO. 127) en donde X1 es Arg o un aminoácido distinto de Lys, y X2 es uno a cuatro aminoácidos. En algunas modalidades, X2 es SSSS (SEQ ID NO. 3), SSS, SS, S, KSSS (SEQ ID NO. 4), KSS, o KS. 10. Análogo de hBNP-Arg 30 Lys u otro aminoácido equivalente de carga similar SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVRX-,RH (SEQ ID NO. 128) en donde X1 es Lys o un aminoácido distinto de Arg. 11. Análogo de hBNP-27Arg o un aminoácido distinto de Lys SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGC X1VLRRH (SEQ ID NO. 129) en donde X1 es Arg o un aminoácido distinto de Lys. 12. Formas de extensión de hBNP - SPKMVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC- KVLRRH - X2 (SEQ ID NO. 130) X2 es Lys, Cys, o Lys + Xaan en donde n es 1-100, 1-50 o 1-10, y Xaa es cualquier aminoácido, o grupo de aminoácidos independientemente seleccionados o un aminoácido desconocido 13. Análogo de mutatnte de deleción - hBNP -CFGR X1MDRIX2GLGC - (SEQ ID NO. 131 ) en donde X1 es Arg o un aminoácido distinto de Lys y en donde X2 es 1 a 4 aminoácidos, tal como SSSS (SEQ ID NO. 3), SSS, SS, S, KSSS (SEQ ID NO. 4), KSS, o KS. 14. Análogo de hBNP - Especificidad de receptor SPZ MVQGSG-CFGRZ2MDR1SSSSX1X2X3C (SEQ ID NO. 132) en donden Z1 es arginina o un aminoácido distinto de lisina, y en donde Z2 es arginina o un aminoácido distinto de lisina, en donde X1 es Gly Met Leu, Phe, lie o una sustitución conservativa de los mismos, en donde X2 es Leu, Trp, Tyr, o Phe o una sustitución conservativa de los mismos, y en donde X3 es Gly, Arg, o una sustitución conservativa de los mismos. En otra modalidad de este análogo, Z1 es lisina y Z2 es arginina o un aminoácido distinto de lisina. 15. Análogos de ANP K CFKGKNDRX1 KX2 QSGLX3 C-NSFKY (SEQ ID NO. 133) en donden X1 es T, a, R, H, P, E; en donde X2 es K, N-metilo, Arg, S, D, o P; en donde X3 es Arg, K, Y, F, S, P, Orn, Har, Har, p-amidinofenil Ala, I, cualquier otro aminoácido que tenga una carga positiva distinta de Gly, o Tyr 9.26 Producción recombinante de BNP nativo y Pro-péptido BNP y enfoque de pro-péptido para la fabricación de conjugado de BNP Una vía de adminstración oral requerirá un suministro de volumen grande de péptido BNP. Debido al alto costo y limitaciones de volumen de suministro asociadas con medios sintéticos para suministrar BNP, una tecnología recombinante será preferida para preparar el péptido BNP conjugado. Una tecnología recombinante para el suministro de péptido para la producción del conjugado se describe aquí. 9.26.1 Selección de tecnología recombinante La meta es seleccionar una tecnología recombinante de alta expresión que se sabe que expresa proteínas pequeñas (>10,000K) libres de glicosilación y tienen los péptidos secretados en forma soluble para fácil aislamiento. Un sistema de expresión basado en E. coli (U.S. 5,114,923, Seilhamer et. al. Se incorpora aquí por referencia), se usa para la producción de BNP a granel para el fármaco aprobado Natrecor®. El uso del sistema baceteriano de E. coli es bien conocido y es bien utilizado en la industria para el pasado muchas décadas para producción recombinante de proteínas de cadena individual. El sistema de E coli es en general un sistema más simple para usos de laboratorio. Muchos sistemas de E. coli nuevos se han desarrollado con densidad de células alta para proveer alto rendimiento de expresión de proteína. Sin embargo, en general, existe una limitación al uso de un sistema basado en E. coli debido a su tendencia a secretar la proteína en su forma ¡nsoluble en un cuerpo de inclusión y que ha de ser inapropiadamente doblada (enlace de disulfuro inapropiado entre residuo de cisteína de aminoácidos). Estas limitaciones a menudo conducen a un alto costo de bienes, pasos de procesamiento corriente abajo costosos se deben implementar para aislar la proteína del cuerpo de inclusión, y redoblar la proteína inapropiadamente doblada a su estado natural. 9.27 Construcción de secuencias de pro-proteína (pro-BNP) El compuesto natriurético también puede ser un multioéptido que tiene dos o más unidades de compuesto natriurético en secuencia y opcionalmente incluyendo una secuencia separadora entre la unidad de compuesto natriurético, y la construcción también puede comprender opcionalmente una secuencia líder y/o extensora en cualquiera o ambos extremos del compuesto de péptido natriurético. Por ejemplo, sin limitar el multipéptido, a cualquier construcción particular, el multipéptido puede tener las siguientes estructuras: NP-[NP]p; NP-[Separador-NP]n; Líder-NP-[NP]n; Líder-NP-[Separador-NP]n; Líder-[Separador-NP]n; Líder-[Separador-NP]n-Extensión; Líder-NP-[Separador -NP]n- Extensión; en donde n puede ser, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; NP es un péptido natriurético o análogo de péptido natriurético: 9.29 Pro-BNP La invención también provee un pro-X-polipéptido, en donde X es un péptido natriurético. El pro-X-péptido para BNP puede ser diseñado para portar un péptido líder como la pro-porción y que puede ser enlazado a la secuencia de BNP mediante un sitio de digestión enzimática. Se puede diseñar una secuencia de gen que codifique la expresión de péptido como péptido pro-BNP en la tecnología recombinante seleccionada. La pro-porción también se puede seleccionar para ayudar a una purificación más eficiente del esquema de fermentación. El péptido pro-BNP puede ser conjugado después de la expresión con el oligómero y después la pro-porción puede ser digerida por una enzima seleccionada, movilizada o inmovilizada, para proveer el conjugado de BNP que puede ser más fácilmenbte purificado por métodos cromatográficos convencionales en alto rendimiento. Los sitios de digestión de enzima específicos se incluirán entre la pro-porción y secuencia de BNP de modo que la pro-porción puede ser enzimáticamente digerida para dar la secuencia de BNP. 9.29.1 Síntesis de modelo de pro-BNP La construcción de pro-BNP se evaluará con un modelo de pro-BNP sintético que tiene una secuencia de BNP y aminoácidos específicos adicionales. Este modelo sintético será conjugado con oligómero y estará sujeto a digestión por una enzima específica para monitorear la producción de conjugado de BNP-oligómero. 9.29.2 Diseños de pro-BNP La secuencia líder (pro-porción) pueden incluir un péptido pequeño con una secuencia de digestión de enzima específica basada en el modelo sintético. Otras secuencias de aminoácido funcionales también se pueden insertar en la secuencia líder/separador para permitir la purificación fácil de la proteína pro-BNP. La secuencia líder también puede servir como la pro-porción para proteger el N-terminal contra modificación no deseada durante conjugación y puede ser digerida bajo tratamiento de enzima específico. Otras características también se pueden construir en las secuencias de péptido líder para permitir facilidad de aislamiento como pro- BNP o como conjugado de oligómero de pro-BNP. El péptido líder también puede ser unido al C-terminal de la secuencia de BNP. El péptido líder también puede ser diseñado para permitir la unión de proteínas de fusión conocidas. 9.29.3 Expresión de Pro-BNP Se pueden proveer secuencias líder funcionalmente específicas en el N-terminal y/o C-terminal de BNP para inserción en la secuencia de gen de expresión o cassette de expresión de la tecnología recombinante seleccionada. La secuencia de expresión de una proteína de fusión conocida (véase Gaken et al, 2000, cuya descripción se incorpora aquí por referencia en su totalidad para su ensañanza con respecto a proteínas de fusión) también se puede insertar en el gen de expresión en una de las construcciones. Usando procedimientos establecidos, los genes expresados por transformación exitosamente en las células pueden ser monitoreados. Los aislado o células transgénicos positivos pueden ser aislados y hechos crecer para evaluarse para la expresión de las proteínas diseñadas. Las proteínas de expresión pueden ser purificadas y seqcenciadas. Las construcciones de pro-BNP purificadas pueden entonces ser evaluadas. Las líneas celulares seleccionadas pueden ser caracterizadas y seleccionadas para uso futuro de selección. 9.29.4 Construcción de pro-pentapéptido BNP-1 con separadores de digestión de tripsina y carboxi peptidasa-B y péptido líder etiquetado con His La secuencia de codificación para la longitud completa de pro-pentapéptido BNP-1 se puede proveer de acuerdo con la siguiente fórmula: Líder-NP-[Separador-NP]n en donde: el separador es Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg (SEQ ID NO. 78), el líder es Glu-Gly-Asp-Arg-Arg (SEQ ID NO. 79), la extensión es (His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg (SEQ ID NO. 80); NP es hBNP. En esta modalidad, el NP o conjugado de NP puede ser liberado usando un coctel de enzimas de tripsin y carboxipeptidsa B. (a) Construcción de plásmido Usando las técnicas de biología molecular estándares, se construye un plásmido para expresar la secuencia de aminoácidos de pro-pentapéptido BNP-1 [(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg.)-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP- Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP- Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP] (SEQ ID NO. 134). El plásmido es codón optimizado para la célula hospedero (v.gr., E. colí) usada.

El fragmento de ADN que codifica esta secuencia de multipéptidos es ensamblada sintéticamente, empezando de la secuencia post -líder y los sitios de digestión se añaden en orden de 3' de etiqueta de His/5' de secuencia de BNP. ANNc de la secuencia es purificada a partir de gel de poliacrilamida usando técnicas estándares. La estructura de plásmido es confirmada por análisis de enzima de restricción. (b) Expresión y recuperación celular Las células de E. coli que expresan pro-pentapéptido BNP-1 son cultivadas con nutrientes suficientes para producir el pro-multipéptido. La etiqueta de (His)6 pro-penta BNP es recuperada de las células por alteración de la célula seguida por centrifugation, filtración/intrafiltración tangencial, homogenización y solubilización de cuerpos de inclusión. (c) Aislamiento del pro-pentapéptido BNP-1 a partir de la inclusión solubilidada por cromatografía de afinidad Se prepara una columna de HP con quelatación de HiTrp (N¡2+) (Amersham Bioscience) y las columnas se lavan con 10 volúmenes de columna de agua destilada para remover la solución de almacenamiento, se carga con solución de ion de metal (NiS0 ? 0.1 M) y se lavó con agua destilada para remover desligado. La solución filtrada después de solubilización de cuerpo de inclusión, se carga a esta columna y la columna se lava con 10 volúmenes de columna de regulador de pH de ligado (20 mM de regulador de pH de fosfato, pH 7.4, que contenía 0.5M de cloruro de sodio y 20 mM de imidazol). Usando un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna de regulador de pH de elución (20 mM de regulador de pH de fosfato, pH 7.4, que contenía 0.5M de cloruro de sodio y 0.5M de imidazol) la columna se eluye y es seguida por otros 2 volúmenes de columna de regulador de pH de elución a 100%. Este procedimiento purifica el pentapéptido de etiqueta (His^ de otros componentes a partir de la muestra de recuperación de células por quelatación a afinidad de columna de Ni2+. La pureza del pentapéptido es analizada por el método de CLAR-FI para que sea > 30%. (d) Purificación y análisis El pentapéptido es después purificado adicionalmente medianteCLAR preparativa de C-18 a una pureza >75%. El pentapéptido purificado es analizado análisis de ES/MS y proveyó picos de iones de M+1 para el PM esperado de pro-pentapéptido BNP-1. La microsecuenciación del material se usa para confirmar la secuencia de aminoácidos del multipéptido. 9.29.5 Producción de unidades múltiples de conjugado de BNP de Lys-3 a partir de pro-pentapéptido BNP-1 (a) Conjugación de pentapéptido Pro-pentapéptido BNP-1 (3.20 x 10-4 mmoles) se disuelve en 5 ml de DMSO. A la solución se añade 45 ul de trietilamina. La solución se deja agitar durante 5 minutos antes de que se añada una solución de oligómero de PEG7-hexilo activado (19.6 x 10-4 mmoles) en etanol. Después de que la reacción ha progresado, de tal manera que el análisis de CLAR indica que el pro-multipéptido ha sido consumido (o la concentración de pro-multipéptido ya no está disminuyendo), la reacción es extinguida mediante la adición de 0.5 ml de solución acuosa de ácido acético al 50%. La mezcla de reacción es después procesada e intercambiada en 100 mM de regulador de pH Tris-HCl, pH 7.6. La composición mayor de esta mezcla se espera que sea multipéptido conjugado en Lys3 de cada unidad BNP. (b) Digestión por coctel de enzimas de pro-pentapéptido BNP-1 conjugado con oligómero a unidades BNP conjugadas Una alícuota de la solución de Tris-HCl de la mezcla de producto del ejemplo 2(a) es analizada por CLAR para determinar la concentración de polipéptido en el mismo. Una solución de tripsina (tratada con TPCK; de páncreas de bovino) se prepara en 100 mM de regulador de pH Tris-HCl, pH 7.6. Una solución de carboxipeptidasa B (de páncreas de porcino) se prepara en 100 mM de regulador de pH Tris-HCl, pH 7.6. La mezcla cruda (1 eq. molar) se dejan reaccionar con tripsina (1.39 x 10"3 eq. molar) y carboxipeptidasa B (4.56 x 10"4 eq. molar). Después de 30 minutos, la reacción es extinguida mediante la adición de ácido trifluoroacético al 1 % en acetonitrilo. La mezcla de producto de la reacción es procesada y analizada por CLAR. El tiempo de reacción (versus el de los estándares de referencia) y análisis espectral de masa se usan para determinar identidad. Los productos esperados de la reacción son Lys3 hexilo-PEG7-BNP conjugado, Lys14 hexilo-PEG7-oligómero-BNP conjugado, Lys 27 hexilo-PEG7-oligómero-BNP conjugado, Di hexilo-PEG7-oligómero BNP conjugado, Des Arg-His BNP y Des Arg-His hexilo-PEG7-oligómero conjugado (Lys3 o Lys14 o Lys27) BNP. La composición mayor de esta mezcla es Lys3-hexilo-PEG7-BNP conjugado. 9.29.6 Purificación de pro-pentapéptido BNP-1 conjugado de mezcla de conjugación cruda Cada producto mayor obtenido a partir de la reacción de conjugación descrita en el ejemplo 2(b) se aisla usando CLAR de fase inversa. Una columna (1.0 cm. de d.i. x 25 cm. de longitud) es empacado con una fase estacionaria de C18 comercialmente disponible que se sabe que es útil para la resolución de polipéptidos y proteínas, y después se incorpora en un sistema de CLAR. El sistema es equilibrado con regulador de pH de elución que comprende una mezcla de 75% de fase móvil A (H20 con ácido trifluoroacético al 0.1 %) y 25% de fase móvil B (acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0.1 %). La solución de Tris-HCl de la mezcla de producto a partir del ejemplo 21 (a) se aplica a la columna, y los productos mayores son separados y eluidos usando una elución por gradientes en la cual el percentaje del componente de acetonitrilo se incrementa de 25%-55% durante 120 minutos. Las fracciones se recogen y se analizan por CLAR para determinar la identidad y pureza del producto en las mismas. Las fracciones comunes de cada producto se ponen en acervo, y el solvente es removido por evaporación giratoria. La identidad y pureza de cada pico de producto se determinan port CLAR y espectrometría de masa. Los productos esperados consisten de monoconjugados de 3 multipéptidos (conjugado ya sea en Lys3 o Lys 14 o Lys 27 de cada unidad de BNP), diconjugado de 3 multipéptido (conjugado en Lys3 y Lys14 o Lys14 y Lys27 o Lys27 y Lys3), triconjugado de 1 multipéptido (conjugado en Lys3, Lys14 y Lys 27) y tetraconjugado de 1 multipéptido (conjugado en N-terminal de péptido líder, Lys3, Lys14 y Lys 27). 9.29J Preparación de Lvs3-Hexyl-PEG7-oligómero BNP conjugado a partir de digestión con coctel de enzimas de conjugado aislado de pro-pentapéptido BNP-1 El conjugado, monoconjugado Lys3-hex¡lo-PEG7-oligómero pro-pentapéptido BNP-1 , que se obtiene usando el procedimiento descrito en el ejemplo 3 se disuelve en 100 mM de regulador de pH Tris-HCl, pH 7.6, y la solución resultante es analizada por CLAR para determinar la concentración de polipéptido en la misma. Una solución de tripsina (tratada con TPCK; de páncreas de bovino) se prepara en 100 mM de regulador de pH Tris-HCl, pH 7.6. Una solución de carboxipeptidasa B (de páncreas de porcino) se prepara en 100 mM de regulador de pH Tris-HCl, pH 7.6. La mezcla cruda (1 eq. molar) se deja reaccionar con tripsina (1.39 x 10-3 eq. molar) y carboxipeptidasa B (4.56 x 10-4 eq. molar). Después de 30 minutos, la reacción se extingue mediante la adición de ácido trifluoroacético al 1 % en acetonitrilo. Los productos son procesados y analizados por CLAR. El tiempo de retención (comparado con el de estándares de referencia) y análisis espectral de masa se usan para determinar identidad. Los productos esperados de la reacción son respectivos de cada conjugado usado. Por ejemplo, el monoconjugado Lys3- hexilo-PEG7-oligómero-conjugado pro-pentapéptido BNP-1 es para proveer Lys3 -hexilo-PEG7-oligómero-BNP conjugado y Des Arg-His Lys3-hexilo-PEG7-oligómero-BNP conjugado. 9.29.8 Conjugación selectiva de sitio en Lys3 de pro-pentapéptido BNP-1 en regulador de pH de borato/solvente orgánico El pro-pentapéptido BNP-1 (0.0195 mmoles) puede ser disuelto en 5 ml de ácido bórico 50 mM. La solución se puede llevar a pH 9.3 con solución 4N de hidróxido de sodio y añadirse a 1 ml de etanol y ajustarse a pH 10.4-10.9 con hidróxido de sodio. A la solución agitada anterior se puede añadir una solución de metilheptaetilenglicol activado ((PEG7)-hexilo oligómero) (7.5x 0.0195 mmoles) en 1 ml de etanoi. El curso de la reacción de conjugación (acilación) es monitoreado por CLAR y el pH se mantiene a pH 10.5 usando hidróxido de sodio 4N. Cuando la reacción parece estar completa después de 20 minutos, se extingue mediante la adición de ácido clorhídrico 4N a pH 6.8. La mezcla de reacción después es procesada e intercambiada en 100 mM de regilador de pH Tris-HCl, pH 7.6 . El perfil de CLAR de la mezcla de producto mostró >40% de conjugación en Lys3 de cada unidad de la unidad BNP de pro-pentapéptido BNP-1 9.29.9 Conjugación selectiva de sitio en Lys3 de hBNP nativo en regulador de pH de borato/solvente orgánico Pro-pentapéptido BNP-1 (0.0195 mmoles) se disuelve en 5 ml de ácido bórico 50 mM. La solución se lleva a pH 9.3 con solución 4N de hidróxido de sodio y se añadió a 1 ml de etanol y se ajustó a pH 10.4-10.9 con hidróxido de sodio. A la solución agitada anterior se añadió una solución de metilheptaetilenglicol activado (oligómero de (PEG7)-hexilo) (1.6x 0.0195 mmoles) en 1 ml de etanol. El curso de la reacción de conjugación (acilación) se monitorea por CLAR y el pH se mantuvo a pH 10.5 usando hidróxido de sodio 4N. Cuando la reacción pareció completarse después de 20 minutos, se extinguió mediante la adicipón de ácido clorhídrico 4N a pH 6.8. La mezcla de reacción después se procesa y se intercambia en 100 mM de regulador de pH Tris-HCl, pH 7.6. El perfil de CLAR de la mezcla de producto se espera que muestre >40% de conjugación en Lys3 de la molécula de BNP. 9.30 Cromatografía preparativa El análisis y purificación por CLAR de fase inversa se realizó para BN-054 en un sistema Waters Prep-LC con un detector de absorbancia de ? doble Waters 2487. La mezcla de reacción que contenía DMSO y agua (16 ml) se diluyó adicionalmente con 0.1.% de TFA agua para hacer un volumen final de 100 ml. Cinco inyeccüones, de 20 ml cada una, se realizaron a una columna preparativa. Especificaciones de columna: columna Symmetry Prep C18 7µm, 19 x 300 mm. El gradiente de elución se muestra más adelante en donde A era 0.1% de TFA en agua (v/v) y B era 0.1 % de TFA en acetonitrilo (v/v). La detección se fijó a 220 nm.

Las fracciones se recogieron y analizaron para la presencia de BN-54 usando cromatografía analítica en un sistema Waters 2690/5 con detector de disposición de diodos 996 y calentador de columna. Los conjugados se analizaron en una columna analítica Phenomenex Luna C18(2), (tamaño de partícula de 5 µm, tamaño de poro de 300 ?, 150 x 2 mm) a una velocidad de flujo de 1.0 ml/min y una temperatura de columna de 60°C. El gradiente de elución fue 0-80% B en 23 min en donde A fue 0.1% de TFA en agua (v/v) y B fue 0.1 % de TFA en acetonitrilo (v/v). La detección fue a 220 nm. Las fracciones que contenían BN-54 se recogieron, se rotoevaporaron y se secaron por congelamiento para obtener BN-54 como polvo blanco. El contenido y pureza de proteína de BN-54 se determinó y se resumió como sigue. El siguiente cuadro resume el contenido de proteína para diferentes lotes de Nobex-BN054: Cromatogramas representativos para los diferentes lotes de BN054, incluyendo los estándares de BNP asociados, se incluyen como figuras 8, 9 y 10. Este enfoque a la purificación se adapta fácilmente para usarse con otros conjugados de la invención.

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Claims (58)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un conjugado de compuesto natriurético que comprende: un compuesto natriurético biológicamente activo que comprende: un sitio de unión a molécula natriurética NPR-A, y por lo menos un sitio de conjugación de porción modificadora; y por lo menos una porción modificadora unida al sitio de conjugación de la porción modificadora; en donde el conjugado de compuesto natriurético presenta una o más ventajas seleccionadas del grupo que consiste de resistencia incrementada a degradación enzimática en relación con un compuesto natriurético no conjugado correspondiente, vida media circulante incrementada, biodisponibilidad incrementada, y duración de efecto prolongado.

2.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto natriurético comprende un péptido o un segmento de péptido biológicamente activo de péptido natriurético de cerebro, péptido natriurético auricular, péptido natriurético de tipo C, o péptido natriurético de Dendroaspis.

3.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto natriurético comprende una secuencia de hBNP nativa que tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste de Lys3Arg, Lys14Arg, Arg30Lys, Lys27Arg, y Arg31 Lys.

4.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto natriurético comprende una secuencia de hBNP nativa, que tiene una o más inserciones, deleciones o extensiones.

5.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción modificadora tiene una fórmula: (fórmula I) en donde cada C se selecciona independientemente y es una porción alquilo que tiene m carbonos y m es 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20; y cada PAG se selecciona independientemente y es una porción polialquilenglicol que tiene n subunidades y n es 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25; cada X se selecciona independientemente y es una porción enlazada.

6.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la porción modificadora tiene una fórmula: (fórmula 1A).

7.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la porción modificadora tiene una fórmula: H3CO(CH2CH20)n CH2CH2)nOCH3 (fórmula 1B).

8.- El uso de un conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 5, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una condición determinada por un nivel excesivo de fluido extracelular en un sujeto.

9.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción modificadora tiene una fórmula:

10.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la porción modificadora tiene una fórmula:

11.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la porción modificadora tiene una fórmula:

12.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la porción modificadora tiene una fórmula:

13.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la porción modificadora tiene una fórmula: y el compuesto natriurético es hBNP, y la porción modificadora es acoplada en Lys3, y el conjugado de compuesto natriurético es un monoconjugado.

14.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el compuesto natriurético es hBNP.

15.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el compuesto natriurético es hBNP.

16.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el compuesto natriurético es hBNP.

17.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el compuesto natriurético es hBNP.

18.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el compuesto natriurético es hBNP, y la porción modificadora es acoplada en Lys3, y el conjugado de compuesto natriurético es un monoconjugado.

19.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el compuesto natriurético es hBNP, y la porción modificadora es acoplada en Lys3, y el conjugado de compuesto natriurético es un monoconjugado.

20.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el compuesto natriurético es hBNP, y la porción modificadora es acoplada en Lys3, y el conjugado de compuesto natriurético es un monoconjugado.

21.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el compuesto natriurético es hBNP, y la porción modificadora es acoplada en Lys3, y el conjugado de compuesto natriurético es un monoconjugado.

22.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

26.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

28.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

29.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

30.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 18 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

31.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 19 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

33.- Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 21 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

34.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 9, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

35.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 10, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

36.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 11 , el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

37.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 12, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

38.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 14, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

39.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 15, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

40.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 16, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

41.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 17, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

42.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 18, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

43.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 19, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

44.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 20, el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

45.- Un método para hacer el conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 21 , el método comprendiendo acoplar la porción modificadora al compuesto natriurético.

46.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 9.

47.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 10.

48.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 11.

49.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 12.

50.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 14.

51.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 15.

52.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 16.

53.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 17.

54.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 18.

55.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 19.

56.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 20.

57.- Una composición farmacéuticamente pura del conjugado de compuesto natriurético de la reivindicación 21.

58.- El conjugado de compuesto natriurético de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado además porque m es 1 , X es -O-, n es 4, y C es -CH3.