CN102260345A - 一种固相多肽合成人脑钠素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相多肽合成人脑钠素的制备方法，本发明的技术方案包括以下步骤：以Fmoc-His(trt)-Wang-树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护的三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得前体粗品，前体粗品经制备型HPLC分离纯化，在液相中进行二硫键环化，环化后的人脑钠素再经制备型HPLC纯化，转化成人脑钠素，冻干后，制得人脑钠素精品。本发明的方法，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高。本发明的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种人脑钠素（hBNP）的制备方法，具体涉及固相多肽合成人脑钠素的制备方法。
背景技术
中文名：人脑钠素
英文名：hBNP（human Brain natriuretic peptide）
分子式：C143H244N50O42S4
分子量：3463.75 Da
人脑钠素是由32个氨基酸组成的多肽。作为一种激素，在体内有很多功能。临床研究表明，人脑钠素是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物。
心力衰竭是指心脏当时不能搏出同静脉回流及身体组织代谢所需相称的血液供应。往往由各种疾病引起心肌收缩能力减弱，从而使心脏的血液输出量减少，不足以满足机体的需要，并由此产生一系列症状和体征。心瓣膜疾病、冠状动脉硬化、高血压、内分泌疾患、细菌毒素、急性肺梗塞、肺气肿或其他慢性肺脏疾患等均可引起心脏病而产生心力衰竭的表现。妊娠、劳累、静脉内迅速大量补液等均可加重有病心脏的负担，而诱发心肌衰竭。
充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)又称泵衰竭，通常是指心肌收缩功能明显减退，使心排血量降低，伴有左心室舒张末压增高，临床上引起肺淤血和周围循环灌注不足的表现，以及两者不同程度的合并存在。 泵衰竭常见于急性心肌梗死，特别是患急性广泛性前、侧壁心肌梗死时，更易发生泵衰竭。在泵衰竭早期常伴血压升高，而血压升高、外周阻力增加会加重泵衰竭。因此，泵衰竭的病人若发现血压升高，特别是肺部出现湿啰音-急性肺水肿，应马上采取积极措施，尽快使血压降下来，即所谓打开后负荷，维持血液正常循环，保障组织器官灌注。
充血性心力衰竭在有适量静脉血回流的情况下，由于心脏收缩和(或)舒张功能障碍，心排血量不足以维持组织代谢需要的一种病理状态临床上以心排血量不足，组织的血液灌注减少以及肺循环或体循环静脉系统淤血为特征它是一种临床综合征。从血流动力学而言，由于心肌舒缩功能障碍，使心脏压力高于正常(左室舒张末期压或称左室充盈压＞18mmHg；右室舒张末期压或称右室充盈压＞10mmHg)即为心力衰竭，亦称心功能不全(cardiac insufficiency)。充血性心力衰竭和心功能不全的概念基本上是一致的，但后者的含义更为广泛，包括已有心排血量减少但尚未出现临床症状的这一阶段。
慢性心衰的病因有以下几种：
(1)心肌舒缩功能障碍：这是引起心衰最常见原因，包括各种原因所致心肌炎、心肌病、心肌梗死、缺血性心脏病、心肌代谢障碍(如缺氧、缺血，水、电解质和酸碱失衡等)。其中以舒张功能不全为主见于高血压左室肥厚肥厚型心肌病、主动脉和(或)肺动脉口狭窄、限制型心肌病等。
(2)心室前负荷过重：包括各种原因所致的瓣膜关闭不全，心内或大血管内分流性疾病如房室间隔缺损、动脉导管未闭、主动脉窦瘤破裂、动静脉瘘等。
(3)心室后负荷过重：包括各种原因所致肺动脉高压，体循环高压(原发性和继发性高血压)，左、右心室流出道狭窄以及主肺动脉口狭窄等
(4)心室前负荷不足：导致左和(或)右心房、体循环和(或)肺循环淤血，这类疾病包括二、三尖瓣狭窄、心房黏液瘤、心包炎、心脏压塞和限制型心肌病等
(5)高动力循环状态：包括甲状腺功能亢进、贫血、维生素B1缺乏、体循环动静脉瘘等
慢性心衰诱因有以下几种：
(1)感染：尤其呼吸道感染是心衰最常见的诱因，其次是风湿活动、泌尿系统感染及消化系统感染。感染性心内膜炎是导致心脏病病情迅速恶化的重要原因。
(2)过度体力活动疲劳、情绪激动和紧张。
(3)妊娠和分娩。
(4)心律失常：特别是快速心律失常，如：阵发性房颤、阵发性室性或室上性心动过速严重心动过缓，如完全性房室传导阻滞等。
(5)输血或输液(尤其含钠液体)过多、过快。
(6)电解质紊乱和酸碱失衡
(7)药物作用：如使用负性肌力药或抑制心肌收缩力药、潴留水钠制剂以及洋地黄类正性肌力药用量不足或应用不当等。
1996年，美国心脏学会(AHA)统计报告全美约有慢性心衰患者490万，每年有40万新增患者。佛明汉心脏研究结果表明慢性心衰的患病率与年龄、性别有关。在20世纪80年代，年龄校正后的患病率男性为7.4‰，女性为7.7‰。45岁以上的人群中，男性的患病率为2.4‰，女性患病率为2.5‰；50～59岁的年龄组，男女患病率均为8‰；80～89岁年龄组男性患病率66‰，女性患病率79‰。世界其他地区的慢性心衰患病率与佛明汉心脏研究的结果相似。目前由中国医学科学院心血管病研究所顾东风教授主持的中国心血管健康多中心合作研究显示：中国慢性心衰患病率为0.9%其中男性为0.7%，女性为1.0%；北方为1.4%，南方为0.5%；城市为1.1%，农村为0.8%。中国现有慢性心衰患者400万。随着人群年龄的增长慢性心衰患病率显著上升。这是中国第一份全国人群慢性心衰的流行病学资料，将为中国慢性心衰的防治工作提供科学依据。
BNP（B-type natriuretic peptide，B型利钠肽）是利钠肽类的一种肽类激素, 1988 年由日本学者Sudoh等从猪脑中分离出,由于其最先从猪脑中分离,所以又称为脑钠素。后来在心脏中也分离出BNP ,且心脏分泌的BNP多于脑,它与ANP 均属于心脏利钠肽类。BNP广泛分布于脑、脊髓、心肺等组织,以心脏含量最高,心房和心室均可分泌BNP ,心脏释放的BNP 主要来自心室。BNP与受体结合后，激活鸟苷酸环化酶，促进cGMP升高，激活蛋白激酶，促进细胞内Ca+外流，抑制细胞外Ca+内流，从而发挥生物学效应。CG23 是人工合成的BNP，是一种新型的动、静脉血管扩张剂，实验证实可以降低心脏的前、后负荷。改善慢性心衰病人急性发作时的症状。VMAC（Vasodilation in the Management of Acute Congestive heart failure）试验表明：0.015-0.03/ug/min的剂量可以显著地降低肺毛细血管楔压和肺动脉压，心功能指数提高，而没有心动过速或心律失常等副作用。
BNP 的生理作用主要包括以下四个方面：
（1）、心血管作用 BNP 通过舒张血管平滑肌、扩张心腔和静脉,使血压下降、减轻心室的前负荷。BNP 减少体循环和肺循环血管阻力,使心输出量增加。BNP 还对心肌细胞有直接的脂肪分解作用,可以拮抗血管组织的增生和纤维化。BNP 在抑制心肌细胞肥大、防止左心室重构中也发挥一定的作用。
（2）、肾脏作用 BNP 通过增加肾小球滤过率和抑制肾小管对钠的重吸收,产生排钠利尿的效应,同时扩张血管、降低体循环血管阻力和血浆容量,并参与水盐代谢的调节。BNP 利钠机理: ①在于肾小球功能受到影响,BNP 使肾小球系膜细胞中cGMP 累积,抑制细胞通过精氨酸加压素刺激产生内皮激素I ,细胞松弛,增加了肾小球滤过表面积。但对人和大鼠注射足量BNP 并未改变肌苷清除率,说明其对肾小球的影响是次要的。②BNP 和ANP 一样,对内髓集合管细胞具有高度亲和性,抑制这些细胞对钠的摄取,并抑制近曲小管对钠的转运。
（3）、神经系统作用 BNP 具有重要的中枢和外周交感神经抑制效应,减少下丘脑血管加压素和促肾上腺皮质激素的分泌，降低血压。
（4）、内分泌系统作用 BNP 可以抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，抑制儿茶酚胺、血管紧张素和醛固酮等缩血管物质的合成，扩张血管。
BNP 拮抗RAAS,抑制垂体后加压素及交感神经的保钠、保水作用,维持血压,同时降低肺循环及周围循环的血管张力，同ANP一起参与血压、血容量及水盐平衡的调节,提高肾小球滤过率,利钠利尿,扩张血管,降低体循环血管阻力及血浆容量,起到保护心脏、缓解CHF的作用。
BNP在CHF的诊断、治疗、评估预后中，均可起到重要作用。在一个对CHF患者BNP水平的研究中显示，心衰组血浆BNP水平显著高于非心衰组，心衰组随NYHA心功能分级的增加和心功能的恶化，BNP水平逐渐增加，呈正相关。血浆BNP浓度是评价严重CHF患者愈后的敏感指标，其水平越高，预后越差。
BNP (Nesiritide) 的临床研究是一个随机，双盲的VMAC (Vasodilation in the Management of Acute Congestive Heart Failure)试验，在美国55个试验点进行。该试验对比了BNP (nesiritide)和硝酸甘油以及安慰剂对急性心功能衰竭的治疗效果。一级评价指标是PCWP（肺毛细血管楔压）和3小时内呼吸困难的缓解程度。其他评价指标包括：治疗效果出现的时间，超过3小时的PCWP和呼吸困难的改变，在用药时间超过24小时时，对药物的耐受性等。
480个入选病人在分层后进行随机化，以他们是否要求利用心导管检测治疗效果作为依据。要求心导管检查的病人（240人）随机分为BNP (nesiritide) 固定剂量组（60人，首次冲击给药剂量2μg/kg，随后0.01μg/kg/min≥3h）、BNP (nesiritide) 调整剂量组（60人，首次冲击给药剂量2μg/kg 随后0.01-0.03μg/kg/min3h）、硝酸甘油组（60人）以及安慰剂组。不要求导管检查的病人也被随机分为BNP (nesiritide) 固定剂量组（80人）、硝酸甘油组（80人）以及安慰剂组。3小时后，接受安慰剂的病人被交叉分进其他组接受主动性的治疗。而医生始终不知他的病人接受何种治疗。药物暴露的中位持续时间为25个小时。药物暴露时间24-72小时和>72小时的病人的比例在BNP (nesiritide) 组和硝酸甘油组是相似的。
药效的分析
更迅速、更持久的降低肺毛细血管楔压：比较硝酸甘油和安慰剂，BNP (nesiritide) 在3小时内降低PCWP的作用更显著。而且在15分钟时，PCWP就有了明显的下降。另外，一个平滑的药效动力学曲线只出现在BNP (nesiritide) 组。相反，硝酸甘油对于PCWP的峰效果直到开始治疗后的2个小时还不明显。BNP (nesiritide) 对PCWP的作用在48小时后仍然持续存在。同时，BNP (nesiritide) 对肺动脉血压的影响和PCWP类似。 
有效地缓解呼吸困难等症状：和安慰剂组相比，BNP (nesiritide) 组病人的呼吸困难在3小时内得到了明显地缓解。而硝酸甘油组病人和安慰剂组相比，该症状的缓解程度并不显著。对于BNP (nesiritide)调整剂量组的病人来说，0.01μg/kg/min的剂量已能使56%的病人的血液动力学参数维持在一个理想水平。而且病人对BNP (nesiritide) 的反应性并没有降低。相反，维持血液动力学参数稳定的硝酸甘油的剂量在1小时为35μg/min，而在24小时时上升到60μg/min。
非常好的耐受性：在3小时内，接受BNP (nesiritide) 病人的头痛、低血压、腹痛等副反应发生的频率要低于接受硝酸甘油治疗的病人。24小时内的情况也如此。这表明该药有很好的耐受性。另外，应用Kaplan-Meier方法进行生存率分析，结果表明BNP (nesiritide) 组病人和硝酸甘油组病人30天生存率无明显差异。
VMAC试验表明BNP (nesiritide)是一个高效的血管扩张剂，可以有效地缓解急性失代偿性充血性心力衰竭的临床症状，而且安全性较高。更大规模的临床试验正在进行以求对该药作出更全面的评价。
肽的化学合成一般采用液相合成法或固相合成法，本发明采用固相合成法，即把目的肽的C-末端第一个氨基酸偶联在载体树脂上，然后以活化剂活化肽序列C-末端第二个氨基酸残基的羧基，并偶联与前一个氨基酸氨基上形成肽键。未反应的氨基酸衍生物原料可以用溶剂DMF彻底洗掉，以此类推，直到合成整个目的肽。工艺采用Fmoc固相肽合成路线，该路线的基本步骤以Fmoc基团保护每一个氨基酸衍生物的α-氨基，以20%的哌啶脱除Fmoc基团，其侧链保护基团是采用TFA可脱除的基因，如Boc（叔丁氧羰基），tBu（叔丁基），Trt（三苯甲基）等。本项研究采用Fmoc-Lys(Boc)-Wang-树脂，树脂与肽的连接TFA都可以切割下来。此工艺收率为17%左右，收率稳定，且原料易得，国内市场都有销售。
发明内容
本发明的目的是公开一种固相多肽合成人脑钠素的制备方法。本发明提出了一条较适当的路线，使用固相法合成人脑钠素，且收率较高。
本发明的技术方案包括以下步骤：
以Fmoc-His(trt)-Wang-树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护的三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，切肽同时去除侧链保护基团，获得前体粗品，前体粗品经制备型HPLC，分离纯化。在液相中进行二硫键环化，HPLC纯化二硫键环化后的人脑钠素，转化成人脑钠素，冻干后，制得人脑钠素精品。
本发明以Fmoc-His(trt)-Wang-树脂为起始原料，按照固相合成的方法，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次连接氨基酸的方法包括以下步骤：
（1）在Fmoc-His(trt)-Wang-树脂中，加入脱保护试剂（20%哌啶/DMF），振荡反应2次，每次15分钟，中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
（2）接上步反应，依次向反应容器中加入DMF，用接肽试剂溶解的具有Fmoc-保护基团的氨基酸、HBTU、HOBt、DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入用接肽试剂溶解的具有Fmoc-保护基团的氨基酸，如此重复，获得：
Fmoc-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val Glu(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-Arg(pbf)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang树脂；
所说的具有Fmoc-保护基团的氨基酸，依次为：
(1) Fmoc-Arg(pbf)-OH、(2) Fmoc-Arg(pbf)-OH、(3) Fmoc-Leu-OH、(4) Fmoc-Val-OH、(5) Fmoc- Lys(Boc)-OH、(6) Fmoc-Cys(Trt)-OH、(7) Fmoc-Gly-OH、(8) Fmoc-Leu-OH、（9）Fmoc-Gly-OH、（10）Fmoc-Ser(tBu)-OH、（11）Fmoc-Ser(tBu)-OH、（12）Fmoc-Ser(tBu)-OH、（13） Fmoc-Ser(tBu)-OH、（14） Fmoc-Ile-OH、（15） Fmoc-Arg(pbf)-OH、（16） Fmoc-Asp(OtBu)-OH、（17） Fmoc-Met-OH、（18） Fmoc-Lys(Boc)-OH、（19） Fmoc-Arg(pbf)-OH、（20） Fmoc-Gly-OH、（21） Fmoc-Phe-OH、（22） Fmoc-Cys(Trt)-OH、（23）Fmoc-Gly-OH、（24） Fmoc-Ser(tBu)-OH、（25） Fmoc-Gly-OH、（26） Fmoc-Glu(OtBu)-OH、（27）Fmoc-Val-OH、（28） Fmoc-Met-OH、（29）Fmoc-Lys(Boc)-OH、（30）Fmoc-Pro-OH、（31） Fmoc-Ser(tBu)-OH。
所说的接肽试剂为：DIPEA∶DMF=1∶10，体积比；
脱保护试剂的体积与树脂的重量比例为50ml/g；
接肽试剂的体积与树脂的重量比例为20ml/g；
HBTU的摩尔数为树脂的5倍；
HOBt的摩尔数为树脂的5倍；
Fmoc-His(trt)- OH的摩尔数为树脂的5倍；
切肽同时去除侧链保护基团，获得前体粗品，包括如下步骤：
将保护肽树脂转移至反应器中，加入事先配制好并预冷至约5℃的切割试剂（EDT:TIS:苯甲硫醚:H2O:TFA=3:2:2:3:90）500 ml，25℃搅拌2.5小时。减压除溶剂至小体积，加入1000ml冷乙醚，沉淀，过滤收集沉淀，用无水乙醚洗充分后，真空干燥。得EDT:TIS:苯甲硫醚:H2O:TFA=3:2:2:3:90粗品；
所说的切肽试剂为：EDT:TIS:苯甲硫醚:H2O:TFA=3:2:2:3:90；
切肽试剂与树脂的体积重量比为50ml/g；
前体粗品经HPLC分离纯化的方法包括如下步骤：将粗品溶于纯净水中，过滤，滤液经HPLC纯化，流速为20ml/min；检测波长为：220nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，除溶剂、冻干，获得成品；
流动相为： A体积比0.2%三氟乙酸+纯净水 B乙腈；
粗品在液相中进行二硫键环化方法包括如下步骤：用醋酸水溶解多肽，比例应需要而定，稀释到多肽浓度为0.5-1.6mg/ml，最终醋酸的浓度为5%，用碳酸氨调节PH值到6。加DMSO（10-20%体积），在25℃，反应2-3天，（HPLC或Ellman test监测）。稀释最终溶液到TFA为0.05%，乙腈为5%，上反相柱除掉DMSO和其他杂质。
HPLC纯化二硫键环化后的人脑钠素的方法包括如下步骤：将二硫键环后的样品溶于纯净水中，过滤，滤液经HPLC纯化，流速为20ml/min；检测波长为：220nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，除溶剂、冻干，获得成品；
流动相为： A体积比0.2%三氟乙酸+纯净水 B乙腈。
由上述公开的技术方案可见，本发明的方法，采用Fmoc-His(trt)-Wang-树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护的三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得前体粗品，前体粗品经制备型HPLC分离纯化，在液相中进行二硫键环化，环化后的人脑钠素再经HPLC纯化，转化成人脑钠素，冻干后，制得人脑钠素精品。本发明的方法，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高。本发明的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。
附图说明
图1为人脑钠素的化学结构。
具体实施方式
实施例和前述过程中所采用的原料列表如下：
| No | 品 名 | 生产厂商 |
| 1 | Fmoc-His(trt)-Wang树脂 | 天津南开合成 |
| 2 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 吉尔生化 |
| 3 | Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 吉尔生化 |
| 4 | Fmoc-Trp-OH | 吉尔生化 |
| 5 | Fmoc–Pro-OH | 吉尔生化 |
| 6 | Fmoc-Leu-OH | 吉尔生化 |
| 7 | Boc-Ile-OH | 吉尔生化 |
| 8 | 1-羟基苯并三氮唑(HOBt) | 吉尔生化 |
| 9 | 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU) | 吉尔生化 |
| 11 | 二甲基甲酰胺(DMF) | 韩国三星工业 |
| 12 | 六氢吡啶（PIP） | 国药集团 |
实施例中：
所说的脱保护试剂为：PIP∶DMF=1∶2~5，体积比；
所说的接肽试剂为：NMM∶DMF=1∶5~15，体积比；
实施例1
1、制备Fmoc-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-His(trt)-Wang Resin 10克 1
Fmoc-Arg(pbf)-OH 12.65克 3 656
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（1）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF），振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，12.65克Fmoc-Arg(pbf)-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
2、制备Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Arg(pbf)-OH 12.65克 3 656
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（1）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，12.65克Fmoc- Arg(pbf)-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
3、制备Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Leu-OH 7.72克 3 353
HBTU 8.30克 3 379
HoBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（2）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟，中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，7.72克Fmoc-Leu-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
4、制备Fmoc-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Val-OH 7.42克 3 339
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（3）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，呈阳性，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，7.42克Fmoc-Val-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
5、制备Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Lys(Boc)-OH 10.24克 3 468
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（4）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Lys(Boc)-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
6、制备Fmoc-Cys(trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Cys(trt)-OH 12.80克 3 585
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（5）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Cys(trt)-OH，12.80克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
7、制备Fmoc-Gly-Cys(trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Gly-OH 6.50克 3 297
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（6）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Gly-OH，6.50克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
8、制备Fmoc-Leu-Gly-Cys(trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Leu-OH 7.72克 3 353
HBTU 8.30克 3 379
HoBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（7）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，7.72克Fmoc-Leu-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟，取少许树脂做茚三酮检测，呈阴性。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
9、制备Fmoc-Gly-Leu-Gly-Cys(trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang -树脂
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Gly-OH 6.50克 3 297
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（8）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Gly-OH，6.50克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
10、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Ser(tBu)-OH 8.38克 3 383
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（9）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Ser(tBu)-OH，8.38克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
11、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Ser(tBu)-OH 8.38克 3 383
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（10）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Ser(tBu)-OH，8.38克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
12、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Ser(tBu)-OH 8.38克 3 383
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（11）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Ser(tBu)-OH，8.38克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
13、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Ser(tBu)-OH 8.38克 3 383
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（12）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Ser(tBu)-OH，8.38克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
14、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Ile-OH 7.72克 3 353
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（13）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Ile-OH，7.72克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
15、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Arg(pbf)-OH 12.65克 3 656
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（14）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，12.65克Fmoc- Arg(pbf)-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
16、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Asp(OtBu)-OH 7.92克 3 411
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（14）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，12.65克Fmoc-Asp(OtBu)-OH，7.92克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
17、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Met-OH 7.14克 3 371
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（14）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，12.65克Fmoc-Met-OH，7.14克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
18、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Lys(Boc)-OH 10.24克 3 468
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（17）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Lys(Boc)-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
19、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Arg(pbf)-OH 12.65克 3 656
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（18）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，12.65克Fmoc- Arg(pbf)-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
20、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Gly-OH 6.50克 3 297
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（19）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Gly-OH，6.50克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
21、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Phe-OH 8.46克 3 387
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（19）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Phe-OH，8.46克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
22、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Cys(trt)-OH 12.80克 3 585
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（21）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Cys(trt)-OH，12.80克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
23、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Gly-OH 6.50克 3 297
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（22）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Gly-OH，6.50克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
24、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Ser(tBu)-OH 8.38克 3 383
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（23）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Ser(tBu)-OH，8.38克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
25、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Gly-OH 6.50克 3 297
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（24）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Gly-OH，6.50克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
26、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Gln(trt)-OH 13.30克 3 610
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（24）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Gln(trt)-OH，13.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
27、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Val-OH 7.41克 3 339
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（14）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，12.65克Fmoc-Val-OH，7.41克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
28、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Met-OH 7.14克 3 371
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（14）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，12.65克Fmoc-Met-OH，7.14克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
29、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Lys(Boc)-OH 10.24克 3 468
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（28）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Lys(Boc)-OH，8.30克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
30、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Pro-OH 7.37克 3 337
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（30）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Pro-OH，7.37克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
31、
投料量 摩尔比 分子量
Fmoc-Ser(tBu)-OH 8.38克 3 383
HBTU 8.30克 3 379
HOBt 2.7 克 3 128
DIPEA 2.4毫升 3 78
DMF 50毫升 80 73
在步骤（30）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
接上步反应，依次向反应容器中加入50毫升DMF，10.24克Fmoc-Ser(tBu)-OH，8.38克HBTU，2.7 克HOBt，2.4毫升DIPEA，振荡30分钟。抽出反应液，再用DMF洗涤树脂3次，每次50毫升，3分钟1次，抽干。
32、
在步骤（30）所得的树脂中，加入50毫升脱保护试剂（20%哌啶/DMF）振荡反应2次，每次15分钟,中间再用DMF洗涤1次，抽出脱保护液，用DMF洗涤树脂3次，抽干。
33、切肽：
将保护肽树脂转移至2000ml反应器中，加入事先配制好并预冷至约5℃的试剂（EDT:TIS:苯甲硫醚:H2O:TFA=3:2:2:3:90）切割试剂500 ml，25℃搅拌2.5小时。减压除溶剂至小体积，加入1000ml冷乙醚，沉淀，过滤收集沉淀，用无水乙醚洗充分后，真空干燥。得粗品122.8g（69mmol），收率95.8%。
34、分离纯化：
将粗品溶于5%乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：A相：0.2%TFA水 B相:乙腈；流速为20ml/min；检测波长为：220nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，减压除去溶剂后，冻干，约得45.06g白色块状物成品，总收率36.7%(以树脂的72mmol计)。
35、二硫键环化：
用醋酸水溶解多肽，比例应需要而定，稀释到多肽浓度为0.5-1.6mg/ml，最终醋酸的浓度为5%，用碳酸氨调节PH值到6。加DMSO（10-20%体积）在25℃，反应2-3天，（HPLC或Ellman test监测），稀释最终溶液到TFA为0.05%，乙腈为5%，上反相柱除掉DMSO和其他杂质。
36、分离纯化二硫键环化后的肽：
将二硫键环化后的肽滤液经C18柱纯化，流动相：A相：0.2%TFA水 B相:乙腈；流速为20ml/min；检测波长为：220nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，减压除去溶剂后，冻干，约得13.5g白色块状物成品，总收率30.4%。
Claims (11)
1.本发明是一种固相多肽合成人脑钠素的制备方法，包括以下步骤：
（1）以Fmoc-His(trt)-Wang-树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护的三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团；
（2）切肽同时去除侧链保护基团，获得前体粗品；
（3）前体粗品经制备型HPLC，分离纯化；
（4）在液相中进行二硫键环化；
（5）HPLC纯化二硫键环化后的人脑钠素；
（6）转化成人脑钠素；
（7）冻干后，制得人脑钠素精品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的依次连接具有Fmoc-保护基团的氨基酸，获得保护三十二肽的树脂，包括如下步骤：
（1）将Fmoc-His(trt)-Wang树脂用DMF浸泡15分钟，使树脂溶胀；
树脂的重量体积浓度为50ml/g；
（2）在上述的树脂中，加入脱保护试剂，进行脱保护反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，然后加入用接肽试剂溶解的具有Fmoc保护基团的氨基酸、HBTU/HOBt和DIPEA的混合物，接肽反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入用接肽试剂溶解的具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此重复，获得
Fmoc-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val Glu(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-Arg(pbf)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(trt)-Wang树脂
所说的具有Fmoc保护基团的氨基酸，依次为：
Fmoc-Arg(pbf)-OH
Fmoc-Arg(pbf)-OH
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Val-OH
Fmoc- Lys(Boc)-OH
Fmoc-Cys(Trt)-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Arg(pbf)-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH
Fmoc-Met-OH
Fmoc-Lys(Boc)-OH
Fmoc-Arg(pbf)-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Phe-OH
Fmoc-Cys(Trt)-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Glu(OtBu)-OH
Fmoc-Val-OH
Fmoc-Met-OH
Fmoc-Lys(Boc)-OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Ser(tBu)-OH。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的脱保护试剂的组分和体积比为：
PIP∶DMF=1∶5，体积比；
所说的接肽试剂为：DIPEA∶DMF=1∶10，体积比；
脱保护试剂的体积与树脂的重量比例为50ml/g；
接肽试剂的体积与树脂的重量比例为20ml/g；
HBTU的摩尔数为树脂的5倍；
HOBt的摩尔数为树脂的5倍；
Fmoc-His(trt)- OH的摩尔数为树脂的5倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，切肽同时去除侧链保护基团，获得前体粗品，包括如下步骤：
将保护肽树脂转移至反应器中，加入事先配制好并预冷至约5℃的切割试剂（EDT:TIS:苯甲硫醚:H2O:TFA=3:2:2:3:90）500 ml，25℃搅拌2.5小时；
减压除溶剂至小体积，加入1000ml冷乙醚，沉淀，过滤收集沉淀，用无水乙醚洗充分后，真空干燥；
得EDT:TIS:苯甲硫醚:H2O:TFA=3:2:2:3:90粗品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所说的切肽试剂为：EDT:TIS:苯甲硫醚:H2O:TFA=3:2:2:3:90；
切肽试剂与树脂的体积重量比为50ml/g。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，25℃切肽反应4小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，前体粗品经HPLC分离纯化的方法包括如下步骤：
将粗品溶于纯净水中，过滤，滤液经HPLC纯化，流速为20ml/min；检测波长为：220nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，除溶剂、冻干，获得成品；
流动相为： A体积比0.2%三氟乙酸+纯净水 B乙腈。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粗品在液相中进行二硫键环化方法包括如下步骤：
用醋酸水溶解多肽，比例应需要而定，稀释到多肽浓度为0.5-1.6mg/ml，最终醋酸的浓度为5%，用碳酸氨调节PH值到6；
加DMSO（10-20%体积），在25℃，反应2-3天，（HPLC或Ellman test监测）；
稀释最终溶液到TFA为0.05%，乙腈为5%，上反相柱除掉DMSO和其他杂质。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，HPLC纯化二硫键环化后的人脑钠素的方法包括如下步骤：
将二硫键环后的样品溶于纯净水中，过滤，滤液经HPLC纯化，流速为20ml/min；检测波长为：220nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，除溶剂、冻干，获得成品；
流动相为： A体积比0.2%三氟乙酸+纯净水 B乙腈。
10.根据权利要求1~9任一项所述的方法，其特征在于，脱保护反应温度为25℃，反应时间为0.5小时。
11.根据权利要求1~9任一项所述的方法，其特征在于，接肽温度为25℃，时间为1小时。
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Cited By (1)
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2011
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