CN111349153A - 一种心钠肽的制备方法 - Google Patents

一种心钠肽的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111349153A
CN111349153A CN202010279882.5A CN202010279882A CN111349153A CN 111349153 A CN111349153 A CN 111349153A CN 202010279882 A CN202010279882 A CN 202010279882A CN 111349153 A CN111349153 A CN 111349153A
Authority
CN
China
Prior art keywords
resin
peptide
fmoc
protected amino
atrial natriuretic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010279882.5A
Other languages
English (en)
Inventor
龙春艳
伍万兵
杨玲玲
倪红飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Jisheng Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Sichuan Jisheng Biopharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Jisheng Biopharmaceutical Co ltd filed Critical Sichuan Jisheng Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202010279882.5A priority Critical patent/CN111349153A/zh
Publication of CN111349153A publication Critical patent/CN111349153A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，公开了一种制备心钠肽的方法，包括以下步骤:将Fmoc‑Tyr(tbu)‑OH与树脂偶联，获得Fmoc‑Tyr(tbu)‑树脂；将Fmoc‑Tyr(tbu)‑树脂与保护氨基酸和保护肽片段逐一偶联获得心钠肽线性肽树脂；将心钠肽线性肽树脂在裂解液中裂解，得到还原性粗品；将还原性粗品使用氧化剂氧化，得到氧化粗品；将氧化粗品纯化，得到心钠肽精品,该方法能够减少缺失肽杂质的生成，提高产品收率；同时有效的避免了[+1Gly]‑心钠肽和[‑1Gly]‑心钠肽杂质的产生，降低了纯化难度和生产成本。

Description

一种心钠肽的制备方法
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种心钠肽的制备方法。
背景技术
心钠素，称为心房利尿多肽,又称心钠素(cardionatin)或简称心钠肽(atrialnatriuretic peptide，ANP)或ANF(atrial natriuretic factor)，ANP是由28个氨基酸组成的多肽类激素，ANP的最初翻译产物为prepro-ANP，含153个氨基酸，切除信号肽以后形成含126个氨基酸的pro-ANP并储存在心房内，在蛋白水解酶的作用下，裂解成为无生理活性的N末端(NT-BNP)和有生理活性的BNP(含32个氨基酸的C端片段)。105位和121位的半胱氨酸组成二硫键，从而形成含l7个氨基酸的环行结构，该环是ANP的活性中心。ANP具有强大的排钠利尿、扩张血管和降低血压和增加血管通透性，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的作用，对体内的水电解质平衡，心血管活动及内分泌的调节起着重要作用。2019年末爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的死亡主因是细胞因子风暴导致的窒息而不是病毒本身。免疫系统的日常工作是清除感染，但是大量的COVID-19对人体产生攻击，导致人体免疫系统的紊乱，这种极端的免疫攻击称之为“细胞因子风暴”，因为这个风暴可以触发免疫系统对身体的猛烈攻击，常令血管壁变得更容易穿透，动脉、静脉和毛细血管都开始渗出血液和血浆，最终导致多个器官产生衰竭。因此，如何有效控制细胞因子风暴显得尤为重要。而心钠肽可以有效降低细胞因子风暴。
现有技术中多肽合成方法大多采用基因工程和化学合成，但基因工程表达的方法工艺复杂、成本高、活性低，多肽的化学合成有液相合成和固相合成之分，液相合成的基本步骤是对需要合成的氨基酸进行基团封闭，活化参加反应的氨基端和羧基端，将两种氨基酸混合在液相中进行反应，将一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基连结成肽键，最后分离纯化合成的产物。但由于液相反应在溶剂中进行，所有保护基都是疏水的，而肽键却是亲水的，因此当合成肽的长度超过十个序列时，保护肽的溶解便成了难题。并且，液相合成需要具备选择保护基和缩合方法的策略以及解决溶解性问题等诸多方面的知识。这些都限制了液相法在多肽合成方面的应用。固相多肽合成法指的是将目标肽的第一个氨基酸的C端连接到一个不溶性的聚合物载体上，然后逐个偶联氨基酸，直至合成所需的序列，最后裂解聚合物与肽链之间的共价键，得到自由多肽。
目前并未发现使用固相多肽合成法制备心钠肽的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种心钠肽的制备方法，它是采用固相多肽合成法制备的，包括但不限于如下步骤：将载体树脂与保护氨基酸逐一偶联，制备心钠肽线性肽树脂，再将心钠肽线性肽树脂在裂解液中裂解，氧化生成二硫键，纯化，得到心钠肽。本发明采用该方法制备心钠肽，可以得到纯度99％以上的心钠肽纯品。
但是，在生产过程中发现，上述方法对心钠肽的合成，收率不高，仅能达到5％～6％左右(如实施例1)，并且偶联时间长导致了生产周期被延长，生产成本较高，这样的方法不足以支撑工业化生产。
根据上述情况，本发明还需要提供一种成本较为低廉、收率较高、生产周期较短的心钠肽合成方法。
发明人经过多次实验，对过程条件和数据结果进行统计和分析，最终发现心钠肽(ANP)的合成过程中主要存在以下问题：(1)肽链长，在合成中有些序列容易折叠造成偶联困难；(2)其序列中的氨基酸如Ser，Arg，Cys，Asp，Gln等含有侧链官能团，这些侧链官能团也会使心钠肽的偶联时间增加；(3)氨基酸之间交联效率低，氨基酸缺失严重；(4)有些位点偶联不完全，等。上述多方面问题，导致多肽的合成收率较低。
针对上述问题，发明人采用如下方案进行改善：
在本固相合成法制备心钠肽线性肽树脂的过程中，发明人考虑引入氨基酸片段来代替逐一偶联。但是，如何引入氨基酸片段，是关乎整个工业化生产的重大问题。发明人初期希望基于合成中发现的折叠位点，引入氨基酸片段。如果在折叠位点均使用氨基酸片段进行偶联，就会大幅增加成本，且收率也会收到影响，不利于该方法工业化。发明人回溯整个合成过程，最终发现，仅需要在含Gly氨基酸片段位点引入氨基酸片段进行偶联，就可以解决上述折叠问题。若按照此方法进行偶联，可以大幅降低成本，并提高收率。因此，在本发明中提出如下技术方案：选取三个无侧链官能团含Gly的氨基酸片段与相邻氨基酸片段连接后再与载体树脂偶联。基于此，本发明提供了一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其原料包括含氨基酸保护基的肽片段X、Y、Z，所述X为Gly-Leu-Gly，Y为Gly-Ala，Z为Gly-Gly。
进一步地，发明人在制备心钠肽线性肽树脂的过程中发现，随着肽链的增长，肽链的折叠状态会发生变化，有侧链官能团的位置也会发生折叠，尤其在从C端起第15-25的某几个氨基酸，在偶联时容易发生折叠，这样就很难与羧基进行偶联反应，使偶联率明显降低，从而影响心钠肽的合成收率，基于此，在含有侧链官能团的困难位点(从C端起第15-25的某几个氨基酸)采用二次偶联方式来提高心钠肽合成收率，方案如下：在偶联过程中，接入第15位，第18位，第23位，第25位保护氨基酸，进行二次偶联反应。通过对在心钠肽制备过程中发现的问题的改善，减少了缺失肽杂质的生成，心钠肽精品的质量从9.1g增加到43.7g，合成收率也显著提高，总收率达到了28.4％。
综上，本专利在已有的制备技术基础上进行制备方法的新开发，提供一种新的固态合成方法，采用固相逐一合成、困难位置多片段合成以及利用二次偶联减少缺失肽的方式制备心钠肽，研发其能批量合成的工艺技术，能够降低其生产成本和缩短周期，提高心钠肽合成收率。
若反应不完全，对困难位点进一步采用二次偶联来提高心钠肽合成收率。
更具体地说，所述的心钠肽制备方法包括以下步骤：
制备心钠肽线型肽树脂：原料包括含氨基酸保护基的肽片段X、Y、Z，其中X为Gly-Leu-Gly，Y为Gly-Ala，Z为Gly-Gly。
(1)将Fmoc-Tyr(tbu)-OH与树脂偶联，获得Fmoc-Tyr(tbu)-树脂；
(2)将所得Fmoc-Tyr(tbu)-树脂与保护氨基酸和保护肽片段逐一偶联获得心钠肽线性肽树脂，其中
第7位-第9位三个保护氨基酸是以保护肽片段X进行偶联；
第12位-第13位两个保护氨基酸是以保护肽片段Y进行偶联；
第19位～第20位两个保护氨基酸是以保护肽片段Z进行偶联；
接入第15位，第18位，第23位，第25位保护氨基酸时，需进行二次偶联反应；
(3)将心钠肽线性肽树脂在裂解液中裂解，得到还原性粗品；
(4)将所述还原性粗品使用氧化剂氧化，得到心钠肽氧化粗品；
(5)将氧化粗品纯化，得到心钠肽精品。
优选的，与Fmoc-Tyr(tbu)-OH偶联的树脂为为2-CTC树脂或Wang树脂。
Fmoc-Tyr(tbu)-载体树脂是Fmoc-Tyr(tbu)-OH与2-CTC树脂或Wang树脂偶联得到；
优选的，Fmoc-Tyr(tbu)-树脂是取代值范围为0.3～0.4mmol/g的树脂。
本发明中，是以Fmoc-Tyr(tbu)-树脂中Tyr氨基酸为第一位氨基酸，依次类推计算位数序号，并以Ser氨基酸为第28位即最后一位氨基酸。
优选的，步骤(1)和步骤(2)的偶联反应中加入活化剂，所述活化剂为1-羟基苯并三唑(HOBT)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAT)。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中选用的缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)中的一种；缩合剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的3倍～7倍，优选为4～6倍。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为20％～50％(v/v)。活化试剂的用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的2倍～7倍，优选的为4～6倍。
优选的，步骤(2)中，接入X对应的保护肽片段为为Fmoc-Gly-Leu-Gly-OH；接入Y对应的保护肽片段为Fmoc-Gly-Ala-OH；接入Z对应的保护肽片段为Fmoc-Gly-Gly-OH。
优选的，保护氨基酸或保护肽片段的用量为树脂总摩尔量的2倍～6倍；最优选为2～4倍。
优选的，Fmoc-Tyr(tbu)-树脂的取代值为0.2mmol/g～0.8mmol/g；最优选Fmoc-Tyr(tbu)-树脂的取代值为0.25～0.6mmol/g。
优选的，步骤(2)中，Fmoc-Tyr(tbu)-树脂与保护氨基酸和保护肽片段偶联时，先反应得到的保护氨基酸树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应；耦联反应结束和脱去Fmoc保护后经过Kaiser Test检测。
优选的，步骤(2)中，接入第15位，第18位，第23位，第25位保护氨基酸，需进行二次偶联反应；
优选的，步骤(3)中，裂解液含有三氟醋酸85％～95％(v/v)、1,2-乙二硫醇1％～5％(v/v)、三异丙基硅烷1％～5％(v/v)，余量为水；更优选的混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为4％，TIS为2％，余量为水。
优选的，每克心钠肽线性肽树脂使用的裂解剂用量为5～15mL；最优选的，每克心钠肽线性肽树脂使用的裂解剂用量为9～11mL；裂解温度为15～25℃，裂解时间为2～6小时，优选的为3～4小时。
优选的，步骤(4)中，氧化剂为碘/甲醇溶液，氧化时间2小时。
优选的，步骤(5)中，纯化的色谱柱为直径10cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，流动相分别为1％醋酸/水溶液和乙腈溶液，流速为150ml/min，上样量为5～10g，色谱仪的检测波长为230nm。
优选的，步骤(5)中，采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为0.1％醋酸/水溶液-乙腈，流速为150mL/min；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
时间/min 0 13 20 40 60
流动相A/(vol.％) 95 87 87 81 81
流动相B/(vol.％) 5 13 13 19 19
区别于现有技术的情况，本发明的有益效果是：
1.选择合理的保护基关系到产物的得率与纯度，本发明通过将Gly氨基酸与相邻氨基酸片段连接后再与载体树脂偶联，使得偶联环境中的[+1Gly]-心钠肽和[-1Gly]-心钠肽杂质减少，使纯化难度大大降低，降低生产成本，提高了产品收率，具有广泛的实用价值和应用前景。
2.在固相逐一合成中，困难位点采用保护片段、高效偶联试剂，二次偶联等方式，提高了偶联收率，降低了缺失肽的含量，从而提高了产品的最终收率。
3.在还原性粗品进行氧化过程中，本发明首先用少量二甲亚砜溶解，再用乙腈水溶液稀，并通过饱和碘/甲醇混合溶液进行氧化，提高了氧化的效率，减少了氧化终点的时间，提高了收率，避免了过长反应时间导致副反应发生。
4.合理的缩合剂体系，缩短了合成时间，提高了合成肽纯度，确保了合成肽的活性。
5.合理的流动相体系，提高了产品纯度及回收率。
本发明所使用的缩写的含义列于下表中。
Figure BDA0002446165610000081
Figure BDA0002446165610000091
本发明使用的氨基酸相对应的保护氨基酸对照表如下：
Figure BDA0002446165610000092
Figure BDA0002446165610000101
具体实施方式
实施例1
制备心钠肽线型肽树脂：以Fmoc-Tyr(tbu)-树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次偶联保护氨基酸，制得心钠肽线型肽树脂，以肽序C端Tyr作为第一位偶联氨基酸，N端Ser作为第28位偶联氨基酸排序，采用逐一偶联氨基酸的方式进行反应，肽序列为：
NH2-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(trt)-Asn(trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)-树脂，所使用的保护氨基酸以下面的形式进行偶联：Fmoc-Tyr(tbu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(otbu)-OH、Fmoc-Met-OH。
(1)将2-CTC树脂或Wang树脂与Fmoc-Tyr(tbu)-OH偶联得到Fmoc-Tyr(tbu)-树脂；得到的Fmoc-Tyr(tbu)-树脂可以是取代值为0.2～0.6mmol/g的树脂。
(2)在Fmoc-Tyr(tbu)-树脂上偶联Arg
取0.2mol第2位保护氨基酸Fmoc-Arg(pbf)-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.25mol DIC，搅拌下慢慢加入含有保护氨基酸的DMF溶液中，于-5℃中搅拌反应1小时，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取Fmoc-Tyr(tbu)-树脂125g，取代值为0.4mmol/g，用1500mL20％PIP/DMF溶液去保护30分钟，洗涤抽滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，室温偶联反应2-5小时，抽滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。偶联反应结束和脱去Fmoc保护后经过KaiserTest检测。
(3)接入第3位～第28位保护氨基酸
使用步骤(2)中的方法，将第3位～第28位保护氨基酸逐一偶联在树脂上，得到含28个保护氨基酸的树脂，即心钠肽线型肽树脂。偶联反应结束和脱去Fmoc保护后经过Kaiser Test检测。随着氨基酸偶联，部分位点肽链折叠，树脂体积收缩，Kaiser Test检测显示偶联反应过后，树脂任然有颜色，则按照以下方案进行封头处理：
取0.2mol HOBt，用适量DMF溶解，加入0.1mol的乙酸酐，搅拌均匀，另取0.2molDIC加入，于-5℃中搅拌反应1小时，得到活化后的乙酸酐反应液，将该反应液加入到上述偶联过后显示的树脂中，偶联2-4小时，Kaiser Test检测显示树脂无色或者浅黄色，说明未反应完的氨基被乙酰化，可继续进行后续反应，去除Fmoc，偶联下一位氨基酸的反应。
制备心钠肽线型肽粗品：
取心钠肽线型肽树脂，加入体积比为TFA︰EDT：TIS︰水＝90︰4︰2：4的裂解液，裂解液用量为10mL/g树脂，搅拌均匀。室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为心钠肽线型肽粗品。
心钠肽线型肽粗品的氧化：
取心钠肽线型肽粗品于少量的二甲亚砜溶液全部溶解，然后用乙腈水溶液稀释，溶液中心钠肽的浓度为0.5～5mg/ml，乙腈水溶液的浓度为40％～80％，二甲亚砜浓度在1-5％，本实施例选用心钠肽浓度为2mg/ml，溶液中乙腈的质量分数为50％，二甲亚砜浓度在1％。然后用饱和碘/甲醇溶液氧化2小时，得心钠肽粗品。
心钠肽粗品的纯化和冷冻干燥：
心钠肽粗品溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化的色谱柱为直径10cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，色谱仪的检测波长为230nm，流动相分别为1％醋酸/水溶液和乙腈溶液，梯度洗脱程序为：
时间/min 0 13 20 40 60
流动相A/(vol.％) 95 87 87 81 81
流动相B/(vol.％) 5 13 13 19 19
流速为150ml/min，上样量为5～10g。
取心钠肽纯化中间体浓缩液，纯度97％以上用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为0.1％醋酸/水溶液-乙腈，流速为150mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到心钠肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得心钠肽精品9.1g，总收率为5.9％。
分子量：3079.40(100％M+H)；纯度：99.2％。
在实施上述实施例时，N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)中的一种；选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为10％～30％(v/v)。
实施例2
制备心钠肽线型肽树脂：
原料包括含氨基酸保护基的肽片段X、Y、Z，其中X为Gly-Leu-Gly，Y为Gly-Ala，Z为Gly-Gly。
以Fmoc-Tyr(tbu)-树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次偶联保护氨基酸，制得心钠肽线型肽树脂，以肽序C端Tyr作为第一位偶联氨基酸，N端Ser作为第28位偶联氨基酸排序，偶联氨基酸片段为：
NH2-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(trt)-Phe-Z-Arg(pbf)-Met-Asp(otbu)-Arg(pbf)-Ile-Y-Gln(trt)-Ser(tbu)-X-Cys(trt)-Asn(trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)-树脂，
接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Gly-Leu-Gly-OH；
接入Y时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Gly-Ala-OH；
接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Gly-Gly-OH。
接入第15位，第18位，第23位，第25位保护氨基酸时，需进行二次偶联反应；
本发明的具体步骤如下：
(1)将2-CTC树脂或Wang树脂与Fmoc-Tyr(tbu)-OH偶联得到Fmoc-Tyr(tbu)-树脂；得到的Fmoc-Tyr(tbu)-树脂可以是取代值为0.2～0.6mmol/g的树脂。
(2)在Fmoc-Tyr(tbu)-树脂上偶联Arg
取0.2mol第2位保护氨基酸Fmoc-Arg(pbf)-OH和0.25mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.25mol DIC，搅拌下慢慢加入含有保护氨基酸的DMF溶液中，于-5℃中搅拌反应1小时，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
取Fmoc-Tyr(tbu)-树脂125g，取代值为0.4mmol/g，用1500mL20％PIP/DMF溶液去保护30分钟，洗涤抽滤得到去Fmoc的树脂。
将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，室温偶联反应2-5小时，抽滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。偶联反应结束和脱去Fmoc保护后经过KaiserTest检测。
(3)接入第3位～第6位保护氨基酸
使用步骤(2)中的方法，将第3位～第6位保护氨基酸逐一偶联在树脂上，得到含6个保护氨基酸的树脂。
(4)接入第7-9位保护氨基酸片段
取0.2mol第7-9位保护氨基酸片段，即Fmoc-Gly-Leu-Gly-OH和0.25mol HOAT，用适量DMF溶解；另取0.25mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于-5℃中搅拌反应1小时，得到活化后的保护氨基酸溶液。
将加入活化后的Fmoc-Gly-Leu-Gly-OH溶液加入到已去Fmoc的树脂，偶联反应3～5小时，过滤洗涤，得含9个保护氨基酸的树脂。
(5)接入第10位，第11位保护氨基酸
采用接入第2位保护氨基酸相同方法，依次接入上述对应的第10位，第11位保护氨基酸，得到含11个保护氨基酸的树脂。
(6)接入第12-13位保护氨基酸片段
采用接入第7-9位保护氨基酸片段的方法，依次接入对应的第12-13位保护氨基酸，得到含13个保护氨基酸的树脂。
(7)接入第14位保护氨基酸
采用接入第2位保护氨基酸相同方法，接入第14位保护氨基酸，得到含14个保护氨基酸的树脂。
(8)接入第15位保护氨基酸片段
第一次偶联反应：取0.2mol第15位保护氨基酸Fmoc-Arg(pbf)-OH和0.25molHOBt，用适量DMF溶解；另取0.25mol DIC，搅拌下慢慢加入含有保护氨基酸的DMF溶液中，于-5℃中搅拌反应1小时，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
将活化后的第15个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的含14个保护氨基酸的肽树脂中，室温偶联反应4小时，抽滤洗涤多次，除去未反应完的保护氨基酸和偶联剂，得含部分已经接入第15个保护氨基酸的树脂。
第二次偶联反应：取0.1mol第15位保护氨基酸Fmoc-Arg(pbf)-OH、0.1mol HOBt、0.15mol HBTU，用适量DMF溶解；另取0.2mol DIEA，搅拌下慢慢加入含有保护氨基酸的DMF溶液中，于-5℃中搅拌反应1小时，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。
将活上述化过后的保护氨基酸溶液，加入第一次偶联过后已经部分已经接入第15个保护氨基酸的树脂中，继续偶联反应，2小时。抽滤洗涤树脂，通过两次偶联，得到接入第15位保护氨基酸，得到含15个保护氨基酸的树脂。
(9)接入第16，17位保护氨基酸
采用接入第2位保护氨基酸相同方法，接入第16位，第17位保护氨基酸，得到含17个保护氨基酸的树脂。
(10)接入第18位保护氨基酸
采用接入第15位保护氨基酸的方法，接入对应的第18位，得到含18个保护氨基酸的树脂。
(11)接入第19-20位保护氨基酸片段
采用接入第7-9位保护氨基酸片段的方法，依次接入对应的第19-20位保护氨基酸，得到含20个保护氨基酸的树脂。
(12)接入第21位，第22位保护氨基酸
采用接入第2位保护氨基酸相同方法，接入第21位，第22位保护氨基酸，得到含22个保护氨基酸的树脂。
(13)接入第23位保护氨基酸
采用接入第15位保护氨基酸的方法，接入对应的第23位保护氨基酸，得到含23个保护氨基酸的树脂。
(14)接入第24位保护氨基酸
采用接入第2位保护氨基酸相同方法，接入第24位保护氨基酸，得到含24个保护氨基酸的树脂。
(15)接入第25位保护氨基酸
采用接入第15位保护氨基酸的方法，接入对应的第25位保护氨基酸，得到含25个保护氨基酸的树脂。
(16)接入第26位，27位保护氨基酸
采用接入第2位保护氨基酸相同方法，接入第26位，第27位保护氨基酸，得到含27个保护氨基酸的树脂。
(17)接入第28位保护氨基酸
采用接入第15位保护氨基酸的方法，接入对应的第28位保护氨基酸，得到含28个保护氨基酸的树脂，即心钠肽线型肽树脂。
制备心钠肽线性肽粗品：
采用实施例1中制备心钠肽线性肽粗品的相同方法制备。
心钠肽线型肽粗品的氧化：
采用实施例1中制备心钠肽线性肽粗品的氧化的相同方法制备。
心钠肽粗品的纯化和冷冻干燥：
采用实施例1中制备心钠肽线性肽粗品的纯化和冷冻干燥的相同方法制备，得心钠肽精品43.7g，总收率为28.4％。
分子量：3079.41(100％M+H)；纯度：99.2％。
在实施上述实施例时，N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)中的一种；选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为10％～30％(v/v)。
实施例1与实施例2的不同之处在于，实施例1是将第3位～第28位保护氨基酸逐一偶联在树脂上，每个氨基酸均只进行一次偶联反应，实施例是将Gly氨基酸与相邻氨基酸片段连接后再与载体树脂偶联，且困难位点采用保护片段、高效偶联试剂，接入第15位，第18位，第23位，第25位保护氨基酸，进行了二次偶联反应。结果表明，将Gly氨基酸与相邻氨基酸片段连接后再与载体树脂偶联，使偶联环境中的[+1Gly]-心钠肽和[-1Gly]-心钠肽杂质减少，提高了产品纯度，降低了生产成本。在固相逐一合成中，困难位点采用保护片段、高效偶联试剂，二次偶联等方式，降低了缺失肽的含量，极大的提高了产品的最终收率。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其特征在于，原料包括含氨基酸保护基的肽片段X、Y、Z，所述X为Gly-Leu-Gly，Y为Gly-Ala，Z为Gly-Gly。
2.根据权利要求1所述的一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其特征在于，所述肽片段X为第7位-第9位三个保护氨基酸片段，肽片段Y为第12位-第13位两个保护氨基酸片段，肽片段Z为第19位～第20位两个保护氨基酸片段。
3.根据权利要求1所述的一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其特征在于，所述心钠肽线型肽树脂是将Fmoc-Tyr(tbu)-树脂与保护氨基酸逐一偶联所得。
进一步地，接入第15位，第18位，第23位，第25位保护氨基酸时进行二次偶联。
进一步地，所述Fmoc-Tyr(tbu)-树脂为2-CTC树脂或Wang树脂与Fmoc-Tyr(tbu)-OH偶联得到的。
进一步地，Fmoc-Tyr(tbu)-树脂的取代值为0.2mmol/g～0.6mmol/g。
4.根据权利要求3-所述的一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其特征在于，所述的偶联反应中加入活化剂，所述活化剂为1-羟基苯并三唑(HOBT)或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAT)。
进一步地，所述活化剂的用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的2倍～7倍。
5.根据权利要求3所述的一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其特征在于，所述的偶联反应中选用的缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)中的一种。进一步地，所述缩合剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的3倍～7倍。
6.根据权利要求3所述的一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其特征在于,所述偶联反应中选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为20％～50％(v/v)。
7.根据权利要求3所述的一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其特征在于，所述偶联反应中接入X对应的保护肽片段为Fmoc-Gly-Leu-Gly-OH；接入Y对应的保护肽片段为Fmoc-Gly-Ala-OH；接入Z对应的保护肽片段为Fmoc-Gly-Gly-OH。
进一步地，保护氨基酸或保护肽片段的用量为树脂总摩尔量的2倍～6倍。
8.根据权利要求3-5任一所述的一种心钠肽线型肽树脂的制备方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)-树脂与保护氨基酸和保护肽片段偶联时，先反应得到的保护氨基酸树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应；耦联反应结束和脱去Fmoc保护后经过Kaiser Test检测。
9.一种心钠肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过权利要求1～8任一项所述的方法制备心钠肽线型肽树脂。
10.根据权利要求14所述的一种心钠肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述Fmoc-Tyr(tbu)-树脂与保护氨基酸逐一偶联获得心钠肽线性肽树脂；其中
第7位-第9位三个保护氨基酸是以保护肽片段X进行偶联；
第12位-第13位两个保护氨基酸是以保护肽片段Y进行偶联；
第19位～第20位两个保护氨基酸是以保护肽片段Z进行偶联；
所述X为Gly-Leu-Gly，Y为Gly-Ala，Z为Gly-Gly；
接入第15位，第18位，第23位，第25位保护氨基酸，进行二次偶联反应；
(2)在裂解液作用下，将心钠肽线型肽树脂裂解，抽干得类白色粉末即为心钠肽线型肽还原性粗品；
(3)将还原性粗品全部溶解、稀释后，使用氧化剂氧化，得到心钠肽氧化粗品；
(4)将心钠肽氧化粗品纯化、冻干，得到心钠肽精品。
进一步地，所述步骤(3)中，裂解液含有三氟醋酸85％～95％(v/v)、1,2-乙二硫醇1％～5％(v/v)、三异丙基硅烷1％～5％(v/v)，余量为水。
进一步地，所述步骤(4)中，溶解的试剂为二甲亚砜溶液，稀释的试剂为乙腈水溶液氧化剂为碘/甲醇溶液。
进一步地，所述步骤(5)中，纯化方法为高效液相色谱法。
更进一步地，所述高效液相色谱法中的检测条件包括：
色谱柱：十八烷基键合硅胶柱；色谱仪的检测波长为230nm；
流动相：流动相A、流动相B；所述流动相A包括1％醋酸/水溶液，所述流动相B包括乙腈溶液；流动相采用如下梯度洗脱程序：
时间/min 0 13 20 40 60 流动相A/(vol.％) 95 87 87 81 81 流动相B/(vol.％) 5 13 13 19 19
进一步地，流速为150ml/min；
更进一步地，上样量为5～10g。
CN202010279882.5A 2020-04-10 2020-04-10 一种心钠肽的制备方法 Pending CN111349153A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010279882.5A CN111349153A (zh) 2020-04-10 2020-04-10 一种心钠肽的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010279882.5A CN111349153A (zh) 2020-04-10 2020-04-10 一种心钠肽的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111349153A true CN111349153A (zh) 2020-06-30

Family

ID=71194897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010279882.5A Pending CN111349153A (zh) 2020-04-10 2020-04-10 一种心钠肽的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111349153A (zh)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340317C (en) * 1983-10-31 1999-01-12 Adolfo Jose De Bold Atrial natriuretic factor
US20050227313A1 (en) * 2002-05-24 2005-10-13 Seo Jin S Polypeptide cleavage process
CN102260345A (zh) * 2011-05-17 2011-11-30 上海格尼生物技术有限公司 一种固相多肽合成人脑钠素的制备方法
CN103265630A (zh) * 2013-05-27 2013-08-28 成都圣诺生物制药有限公司 艾塞那肽的制备方法
CN103304655A (zh) * 2013-05-27 2013-09-18 成都圣诺生物制药有限公司 齐考诺肽的制备方法
CN104788546A (zh) * 2015-03-12 2015-07-22 吉尔生化（上海）有限公司 一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法
CN105037496A (zh) * 2015-09-17 2015-11-11 四川吉晟生物医药有限公司 一种依替巴肽的制备方法
CN106167521A (zh) * 2016-08-29 2016-11-30 杭州湃肽生化科技有限公司 一种艾塞那肽的固相合成方法
CN107056927A (zh) * 2017-01-16 2017-08-18 四川吉晟生物医药有限公司 一种利拉鲁肽的制备方法
WO2019184089A1 (zh) * 2018-03-29 2019-10-03 深圳翰宇药业股份有限公司 化合物及其制备方法和应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340317C (en) * 1983-10-31 1999-01-12 Adolfo Jose De Bold Atrial natriuretic factor
US20050227313A1 (en) * 2002-05-24 2005-10-13 Seo Jin S Polypeptide cleavage process
CN102260345A (zh) * 2011-05-17 2011-11-30 上海格尼生物技术有限公司 一种固相多肽合成人脑钠素的制备方法
CN103265630A (zh) * 2013-05-27 2013-08-28 成都圣诺生物制药有限公司 艾塞那肽的制备方法
CN103304655A (zh) * 2013-05-27 2013-09-18 成都圣诺生物制药有限公司 齐考诺肽的制备方法
CN104788546A (zh) * 2015-03-12 2015-07-22 吉尔生化（上海）有限公司 一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法
CN105037496A (zh) * 2015-09-17 2015-11-11 四川吉晟生物医药有限公司 一种依替巴肽的制备方法
CN106167521A (zh) * 2016-08-29 2016-11-30 杭州湃肽生化科技有限公司 一种艾塞那肽的固相合成方法
CN107056927A (zh) * 2017-01-16 2017-08-18 四川吉晟生物医药有限公司 一种利拉鲁肽的制备方法
WO2019184089A1 (zh) * 2018-03-29 2019-10-03 深圳翰宇药业股份有限公司 化合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周思翔等: "心房肽的研究进展", 《西部医学》 *
姜和 等: "多肽"困难序列"的合成研究进展", 《重庆理工大学学报（自然科学）》 *
徐坤 等: "超高效液相色谱-质谱联用法监测人心房钠尿肽的化学合成", 《色谱》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106699871B (zh) 一种利拉鲁肽的制备方法
CN109180801B (zh) 一种合成索玛鲁肽的方法
CN110372785B (zh) 一种索马鲁肽的合成方法
CN107880111B (zh) 一种制备利拉鲁肽的方法
CN101357938B (zh) 固相多肽合成Exenatide的制备方法
CN113880936B (zh) 一种阿巴帕肽的固相合成方法
CN104177491B (zh) 一种替莫瑞林的制备方法
CN106478805A (zh) 一种glp-1衍生物的制备方法
CN109306366B (zh) 一种合成pt141的方法
CN115594744A (zh) 一种芋螺抗皱素的制备方法
CN108070030B (zh) 洛塞那肽及其类似物的制备方法
CN107778351B (zh) 一种全固相合成奥曲肽的方法
CN105037496A (zh) 一种依替巴肽的制备方法
CN105111301B (zh) 一种鲑鱼降钙素的制备方法
CN117106055A (zh) 一种替尔泊肽的合成方法
CN105367627A (zh) 一种特利加压素的制备方法
CN111349153A (zh) 一种心钠肽的制备方法
CN106554407B (zh) 一种乌拉立肽的合成方法
CN103992401B (zh) 一种制备艾塞那肽的方法
CN111892650A (zh) 一种利拉鲁肽固相合成方法
CN113135988B (zh) 一种胸腺肽β4的制备方法
CN113480633B (zh) 一种替度鲁肽的制备方法
CN112521482B (zh) 一种固液结合合成奈西立肽的制备方法
CN110964097B (zh) 一种固相片段法合成艾塞那肽
CN114585636B (zh) 一种普卡那肽的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200630

RJ01 Rejection of invention patent application after publication