CN103265630A - 艾塞那肽的制备方法 - Google Patents

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CN103265630A CN2013102019525A CN201310201952A CN103265630A CN 103265630 A CN103265630 A CN 103265630A CN 2013102019525 A CN2013102019525 A CN 2013102019525A CN 201310201952 A CN201310201952 A CN 201310201952A CN 103265630 A CN103265630 A CN 103265630A
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Abstract

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及艾塞那肽的制备方法。本发明所要解决的技术问题是现有制备方法分离纯化困难、产品的总收率和纯度低。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种艾塞那肽的制备方法。该方法包括：采用固相多肽法制艾塞那肽树脂，再酸解得到艾塞那肽粗品，最后纯化得到艾塞那肽纯品；其中，固相多肽法为：氨基树脂通过固相偶联合成法依次接入下列序列中对应的保护氨基酸或保护氨基酸片段，制备艾塞那肽树脂：R-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Y(Trt)--Ser(tBu)-Z(tBu)-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂；其中，R为Fmoc、Boc或H，W为His-Gly，X为Glu-Gly，Y为Asn-Gly-Gly-Pro,Z为Ser-Gly。本发明为缩短生产周期、提高产品的纯度和收率提供了一种新方法。

Description

艾塞那肽的制备方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及艾塞那肽的制备方法。
背景技术
艾塞那肽具有以下的结构：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-
Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-
Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-
Pro-Pro-Ser-NH2
                                        。
艾塞那肽是人工合成的GLP-1（胰高血糖素样肽）类似物，由39个氨基酸组成，分子量为4186.6，艾塞那肽是拟肠降血糖素药，可以模拟葡萄糖依赖性胰岛素分泌增强作用和肠降血糖素其他抗高血糖药作用。
艾塞那肽的氨基酸序列与人类GLP-1部分重叠。艾塞那肽在体外显示可以结合并活化已知的人类GLP-1受体。这就意味着通过包括cAMP（环磷酸腺苷）和/或其他细胞内信号传导机制使葡萄糖依赖性胰岛素合成及胰岛β细胞在体内分泌胰岛素增加。在葡萄糖浓度升高的情况下，艾塞那肽可促进胰岛素从β细胞中释放。体内给药后艾塞那肽模拟GLP-1的某种抗高血糖药作用。
艾塞那肽注射液通过下列作用减少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖浓度，从而改善血糖控制。
艾塞那肽具有以下药理作用：
1、葡萄糖依赖性胰岛素分泌
艾塞那肽注射液对胰腺β细胞对葡萄糖的应答性有急性效应，仅在葡萄糖浓度升高的情况下引起胰岛素释放。当血糖浓度下降并接近正常水平时，胰岛素分泌下降。
2、第一相胰岛素反应
在健康个体中，胰岛素大量分泌发生于静脉注射（IV）给与葡萄糖后10分钟内。这种分泌称为“第一相胰岛素反应”，2型糖尿病患者特征性地缺乏这种分泌。缺乏第一相胰岛素反应是由于2型糖尿病患者早期β-细胞受损。给与达到治疗剂量血浆浓度的艾塞那肽注射液能恢复2型糖尿病患者对静脉快速注射葡萄糖的第一相胰岛素反应。与生理盐水比较，用艾塞那肽注射液进行治疗的2型糖尿病患者的第一相胰岛素分泌和第二相胰岛素分泌均明显增加（均ｐ＜0.001）。在t=0min经静脉快速注射葡萄糖（0.3g/kg30秒）前3h开始持续静脉注射艾塞那肽注射液或生理盐水5h，患者接受胰岛素静脉注射6.5h（[t]=-30min时停药）使血糖浓度达到正常水平。
3、胰高血糖素分泌
对于2型糖尿病患者，艾塞那肽能减少高血糖期间胰高血糖素分泌，降低血清胰高血糖素浓度，使肝葡萄糖输出量降低，减少胰岛素需求。但是，艾塞那肽注射液不会损害对低血糖的正常胰高血糖素反应。
胃排空：艾塞那肽注射液可以减慢胃排空，从而减慢食物中的葡萄糖进入循环中的速率。
4、摄食
给与艾塞那肽可以减少动物和人类的食物摄取。
2型糖尿病患者皮下注射艾塞那肽，达到中位血浆浓度峰值的时间为2.1h；皮下注射剂量为10μg的艾塞那肽注射液，艾塞那肽平均峰浓度(Cmax)为211pg/mL，平均曲线下总面积(AUC0-inf)为1036pg·h/mL；在5～10μg的治疗剂量范围内艾塞那肽的暴露（AUC）按比例增加，但Cmax值增加比相应比例少；在腹部、大腿和手臂等部位皮下注射艾塞那肽注射液后暴露量相似。皮下注射单剂量艾塞那肽注射液，艾塞那肽的平均表观分布容积为28.3L；非临床研究显示艾塞那肽主要通过肾小球滤过及随后的蛋白水解而消除；在人类，艾塞那肽的平均表观清除率为9.1L/h，平均终末半衰期为2.4h；艾塞那肽的这些药物代谢动力学特征是非剂量依赖性的；对大多数人，给药后约10h艾塞那肽浓度仍可测。
临床上广泛用于服用二甲双胍、磺脲类、噻唑烷二酮类、二甲双胍和磺脲类联用、二甲双胍和噻唑烷二酮类联用不能有效控制血糖的2型糖尿病患者的辅助治疗以改善血糖控制
国内外关于艾塞那肽制备报道很多，其合成原理基本相同，列如中国专利CN200910104990.2和201110043778.7，所报道的制备方法均采用固相合成法，以氨基树脂为起始原料，以单个Fmoc保护的氨基酸为原料，依次逐个接上氨基酸，然后经过裂解、纯化和冻干，获得艾塞那肽。
上述制备方法存在以下不足：由于Gly结构特点，接入Gly或Gly-Gly时会发生多接入一个Gly或Gly-Gly的副反应，同时还会因接不完全产生漏接一个Gly或Gly-Gly的副产物，所以在制备艾塞那肽过程中，在接入Gly时会产生[+1Gly]-艾塞那肽、[+2Gly]-艾塞那肽、[-1Gly]-艾塞那肽和[-2Gly]-艾塞那肽杂质，从而降低粗品纯度，这些杂质极性与艾塞那肽非常接近，增大粗品纯化难度，降低了产品收率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有制备方法分离纯化困难、产品的总收率和纯度低。
本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种艾塞那肽的制备方法，该制备方法使用了含Gly的保护氨基酸片段，避免了[+1Gly]-艾塞那肽、[+2Gly]-艾塞那肽、[-1Gly]-艾塞那肽和[-2Gly]-艾塞那肽杂质的产生；提高粗品纯度，降低粗品纯化难度，缩短生产周期。
上述艾塞那肽的制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备艾塞那肽树脂，艾塞那肽树脂再酸解得到艾塞那肽粗品，最后艾塞那肽粗品纯化得到艾塞那肽纯品；其中，固相多肽合成法制备艾塞那肽树脂的步骤为：从氨基树脂开始，通过固相偶联合成法依次接入下列序列中对应片段的Fmoc-保护氨基酸，制备艾塞那肽树脂：
R-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-
Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-
Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Y(Trt)-
-Ser(tBu)-Z(tBu)-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂；
其中，R为Fmoc、Boc或H，W为His-Gly，X为Glu-Gly，Y为Asn-Gly-Gly-Pro,Z为Ser-Gly。
优选的，接入W时，对应的保护氨基酸为Boc-His(Trt)-Gly-OH，或为Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。
优选的，接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。
优选的，接入Y时，有两种接入法：（1）对应的保护氨基酸为Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Gly-OH和Fmoc-Pro-OH；或（2）对应的保护氨基酸为Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Gly-Gly-Pro-OH。
优选的，接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH。
优选的，上述艾塞那肽的制备方法中，所述Fmoc-保护氨基酸的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选的，所述Fmoc-保护氨基酸的用量为所投料树脂总摩尔数的2.5～3.5倍。
上述艾塞那肽的制备方法中，所述的氨基树脂选自Rink Amide AM树脂、Rink Amide树脂、Rink MBHA树脂和Sieber树脂中的一种。优选为Rink Amide AM树脂。
进一步地，所述氨基树脂的取代值为0.2～1.2mmol/g树脂。优选的，氨基树脂的取代值为0.4～0.6mmol/g树脂。
作为本发明优选的方案是，所述固相偶联合成法：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护Fmoc后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的偶联反应时间为60～300分钟；优选的，偶联反应时间为120～240分钟。
进一步的，上述艾塞那肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到艾塞那肽粗品：
W-X-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-
Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-
Lys-Y-Ser-Z-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
其中，W为His-Gly,X为Glu-Gly,Y为Asn-Gly-Gly-Pro,Z为Ser-Gly。
进一步地，所述艾塞那肽树脂酸解时采用的酸解剂为TFA（三氟醋酸）、EDT（1,2-乙二硫醇）和水的混合溶剂，混合溶剂的体积配比为：80～95%的TFA，1～10%的EDT，余量为水。
优选的，混合溶剂的体积配比为89～91%的TFA、4～6%的EDT，余量为水。最优的，混合溶剂的配比为90%的TFA、5%的EDT，余量为水。
所述酸解剂的用量为每克艾塞那肽树脂需要4～15mL酸解剂。优选的，每克艾塞那肽树脂需要9～11mL酸解剂。
所述使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～5小时，优选的为2小时。
进一步的，艾塞那肽粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到艾塞那肽纯品。
本发明方法直接使用含Gly的保护氨基酸片段制备艾塞那肽，在整个制备过程中未使用Fmoc-Gly-OH或Fmoc-Gly-Gly-OH作为原料，直接避免了[+1Gly]-艾塞那肽、[+2Gly]-艾塞那肽、[-1Gly]-艾塞那肽和[-2Gly]-艾塞那肽杂质的产生，而这些杂质与艾塞那肽极性特别相近，当前多肽的纯化方法为反相C18纯化法和离子色谱纯化法，而这两种方法对这类杂质均无法达到有效分离，只能靠反复循环纯化达到降低这类杂质的母的，而采用本发明的方法就避免了上述杂质的产生，使纯化难度降低，提高了产品收率，所得产品纯度大于99.0%，单一杂质小于0.2%。与已有技术相比，本发明工艺更具有广泛的实用价值和应用前景。
附图说明
图1Rink Amide AM树脂的结构式。
图2Rink Amide树脂的结构式。
图3Rink MBHA树脂的结构式。
图4Sieber树脂的结构式。
具体实施方式
本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称见表1所示：
表1
Figure BDA00003253138700041
Figure BDA00003253138700051
艾塞那肽的制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备艾塞那肽树脂，艾塞那肽树脂再酸解得到艾塞那肽粗品，最后艾塞那肽粗品纯化得到艾塞那肽纯品。其中，固相多肽合成法制备艾塞那肽树脂的步骤为：氨基树脂通过固相偶联合成法依次接入下列序列中对应片段的Fmoc-保护氨基酸，制备艾塞那肽树脂：
R-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-
Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-
Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Y(Trt)-
-Ser(tBu)-Z(tBu)-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂；
其中，R为Fmoc、Boc或H，W为His-Gly，X为Glu-Gly，Y为Asn-Gly-Gly-Pro,Z为Ser-Gly。
优选的，接入W时，对应的保护氨基酸为Boc-His(Trt)-Gly-OH，或为Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。
优选的，接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。
优选的，接入Y时，有两种接入法：（1）对应的保护氨基酸为Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Gly-OH和Fmoc-Pro-OH；或（2）对应的保护氨基酸为Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Gly-Gly-Pro-OH。
优选的，接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH。
其中，所述的保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍。优选的，所述保护氨基酸片段的用量所投料树脂总摩尔数的2.5～3.5倍。
上述艾塞那肽的制备方法中，所述的氨基树脂选自Rink Amide AM树脂、Rink Amide树脂、Rink MBHA树脂和Sieber树脂中的一种，优选为Rink Amide AM树脂。
进一步地，所述氨基树脂的取代值为0.2～1.2mmol/g树脂。优选的，氨基树脂的取代值为0.4～0.6mmol/g树脂。
作为本发明优选的方案是，所述固相偶联合成法：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护Fmoc后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述脱去Fmoc保护试剂的脱保护时间为10～60分钟，优选的为15～25分钟。所述的偶联反应时间为60～300分钟；优选的，为偶联反应时间120～240分钟。
所述的偶联反应需添加缩合试剂，缩合试剂选自N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；优选的为N,N-二异丙基碳二亚胺。所述缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选为2.5～3.5倍。
所述的偶联反应需添加活化试剂，活化试剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑中的一种；优选为1-羟基苯并三唑。所述活化试剂的用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。
作为本发明优选的方案，所述的脱去Fmoc保护的试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶10～30%(V)。所述脱去Fmoc保护试剂的用量为每克氨基树脂5～15ml，优选的为每克氨基树脂8～12mL。
进一步的，上述艾塞那肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到艾塞那肽粗品：
W-X-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-
Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-
Lys-Y-Ser-Z-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2；
其中，W为His-Gly,X为Glu-Gly,Y为Asn-Gly-Gly-Pro,Z为Ser-Gly。
进一步地，所述艾塞那肽树脂酸解时采用的酸解剂为TFA（三氟醋酸）、EDT（1,2-乙二硫醇）和水的混合溶剂，混合溶剂的体积配比为：80～95%的TFA，1～10%的EDT，余量为水。
优选的，混合溶剂的体积配比为89～91%的TFA、4～6%的EDT，余量为水。最优的，混合溶剂的配比为90%的TFA、5%的EDT，余量为水。
所述酸解剂的用量为每克艾塞那肽树脂需要4～15mL酸解剂。优选的，每克艾塞那肽树脂需要9～11mL酸解剂。
所述使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～5小时，优选的为2小时。
进一步的，艾塞那肽粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到艾塞那肽纯品，具体方法为：
取艾塞那肽粗品浓缩溶液，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，备纯化用；
采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得艾塞那肽纯化中间体浓缩液；
取艾塞那肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min（可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速）；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到艾塞那肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得艾塞那肽纯品。
实施例1艾塞那肽树脂的合成
艾塞那肽树脂为：
R-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-
Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-
Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Y(Trt)-
-Ser(tBu)-Z(tBu)-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂
其中，R为Boc，W为His-Gly，X为Glu-Gly，Y为Asn-Gly-Gly-Pro,Z为Ser-Gly。
接入W时对应的保护氨基酸为Boc-His(Trt)-Gly-OH，接入X时对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH，接入Y时对应的保护氨基酸Fmoc-Gly-Gly-Pro-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，接入Z时对应的保护氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH。
采用Rink Amide AM树脂为开始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得艾塞那肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1至第34个氨基酸相对应的保护氨基酸或片段如下所示：
表2
接肽顺序n= 保护氨基酸或片段 分子量
1 Fmoc-Ser(tBu)-OH 384
2 Fmoc-Pro 337
3 Fmoc-Pro 337
4 Fmoc-Pro 337
5 Fmoc-Ala 311
6 Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH 441
7 Fmoc-Ser(tBu)-OH 384
8 Fmoc-Gly-Gly-Pro-OH 451
9 Fmoc-Asn(Trt) 598
10 Fmoc-Lys(Boc) 468
11 Fmoc-Leu 353
12 Fmoc-Trp(Boc) 526
13 Fmoc-Glu(OtBu) 426
14 Fmoc-Ile 353
15 Fmoc-Phe 387
16 Fmoc-Leu 353
17 Fmoc-Arg(Pbf) 648
18 Fmoc-Val 339
19 Fmoc-Ala 311
20 Fmoc-Glu(OtBu) 426
21 Fmoc-Glu(OtBu) 426
22 Fmoc-Glu(OtBu) 426
23 Fmoc-Met 371
24 Fmoc-Gln(Trt) 611
25 Fmoc-Lys(Boc) 468
26 Fmoc-Ser(tBu)-OH 384
27 Fmoc-Leu 353
28 Fmoc-Asp(OtBu) 412
29 Fmoc-Ser(tBu)-OH 384
30 Fmoc-Thr(tBu)-OH 398
31 Fmoc-Phe 387
32 Fmoc-Thr(tBu)-OH 398
33 Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH 483
34 Boc-His(Trt)-Gly-OH 555
1、第1个保护氨基酸的接入
取Rink Amide AM树脂（取代值为0.4mmol/g）125g，采用1000mL20%PIP/DMF（哌啶/N,N-二甲基甲酰胺）溶液去保护25分钟，过滤得到去Fmoc的树脂备用。
取0.15mol第1个保护氨基酸和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。
去Fmoc的树脂加入活化后的第1个保护氨基酸溶液，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤，得带第1个保护氨基酸的树脂。
2、第2～34个保护氨基酸的接入
采用上述同样方法，依次接入上述对应的第2～34个保护氨基酸或片段，接完所有保护氨基酸后，过滤洗涤，即得艾塞那肽树脂。
实施例2艾塞那肽粗品的制备
取实施例1制得的艾塞那肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT=95︰5︰5的裂解试剂（裂解试剂10mL/克树脂），搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得白色粉末即为艾塞那肽粗品,纯度为60.1%。
实施例3艾塞那肽粗品的纯化
取实施例2制得的艾塞那肽粗品浓缩溶液，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，备纯化用。采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得艾塞那肽纯化中间体浓缩液。
取艾塞那肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用。采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)。采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得到艾塞那肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得产品226.5g，总收率为36.1%。
分子量：2640(100%M+H)；纯度：99.6%，最大单一杂质：0.12%。
上述实施例表明，本发明提供的方法直接避免了[+1Gly]-艾塞那肽、[+2Gly]-艾塞那肽、[-1Gly]-艾塞那肽和[-2Gly]-艾塞那肽杂质的产生，使纯化难度大大降低，提高了产品收率，所得产品纯度大于99.0%，单一杂质小于0.2%，具有广泛的实用价值和应用前景。

Claims (10)

1.艾塞那肽的制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备艾塞那肽树脂，艾塞那肽树脂再酸解得到艾塞那肽粗品，最后艾塞那肽粗品纯化得到艾塞那肽纯品；其中，固相多肽合成法制备艾塞那肽树脂的步骤为：从氨基树脂开始，通过固相偶联合成法依次接入下列序列中对应片段的Fmoc-保护氨基酸，制备艾塞那肽树脂：
R-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-
Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-
Val-Arg(Pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Y(Trt)-
-Ser(tBu)-Z(tBu)-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂；
其中，R为Fmoc、Boc或H，W为His-Gly，X为Glu-Gly，Y为Asn-Gly-Gly-Pro,Z为Ser-Gly。
2.根据权利要求1所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：接入W时，对应的保护氨基酸为Boc-His(Trt)-Gly-OH，或为Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。
3.根据权利要求1或2所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。
4.根据权利要求1～3任一项所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：接入Y有两种接入法：（1）对应的保护氨基酸为Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Gly-OH和Fmoc-Pro-OH；或（2）对应的保护氨基酸为Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Gly-Gly-Pro-OH。
5.根据权利要求1～4任一项所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH。
6.根据权利要求1～5任一项所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：所述Fmoc-保护氨基酸的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选的所述Fmoc-保护氨基酸的用量为所投料树脂总摩尔数的2.5～3.5倍。
7.根据权利要求1所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：所述的氨基树脂选自RinkAmide AM树脂、Rink Amide树脂、Rink MBHA树脂和Sieber树脂中的一种；所述氨基树脂的取代值为0.2～1.2mmol/g树脂；优选的，氨基树脂的取代值为0.4～0.6mmol/g树脂。
8.根据权利要求1所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：所述的固相偶联合成法包括：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护Fmoc后再与下一个保护氨基酸偶联反应。
9.根据权利要求1～8任一项所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：艾塞那肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到艾塞那肽粗品：
W-X-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-
Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-
Lys-Y-Ser-Z-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2；
其中，W为His-Gly,X为Glu-Gly,Y为Asn-Gly-Gly-Pro,Z为Ser-Gly。
10.根据权利要求9所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于：所述艾塞那肽树脂酸解时采用的酸解剂为TFA、EDT和水的混合溶剂，混合溶剂的体积配比为：80～95%的TFA，1～10%的EDT，余量为水；优选的，混合溶剂的体积配比为89～91%的TFA、4～6%的EDT，余量为水；最优的，混合溶剂的配比为90%的TFA、5%的EDT，余量为水。
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