CN103275208B - 利拉鲁肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及利拉鲁肽的制备方法。本发明要解决的技术问题是现有制备方法分离纯化困难、产品的总收率和纯度低。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种利拉鲁肽的制备方法。该方法包括：采用固相多肽法制利拉鲁肽肽树脂、再酸解得到利拉鲁肽粗品、最后纯化得利拉鲁肽纯品。其中固相多肽法的步骤为：氨基树脂通过固相偶联合成法依次接入下列序列中对应的保护氨基酸或保护氨基酸片段，制备利拉鲁肽肽树脂：Boc-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-X(OtBu)-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[Y(α-OtBu)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Z(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-树脂；其中，W为His-Ala，X为Glu-Gly，Y为Nα-PAL-Glu，Z为Arg-Gly。本发明为缩短生产周期、提高产品的纯度和收率提供了一种新方法。

Description

利拉鲁肽的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及利拉鲁肽的制备方法。

背景技术

利拉鲁肽具有以下的结构：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-

Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Nα-PAL-γ-Glu)-

Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

利拉鲁肽是一种GLP-1（胰高血糖素样肽）类似物，与人GLP-1具有97%的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与大然GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括:使吸收减慢的自联作用;与白蛋白结合;对二肽基肽酶IV（DPP-IV）和中性内肽酶（NEP）具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。

利拉鲁肽的活性由其与GLP-1受体间特定的相互作用介导，导致环磷酸腺苷（cAMP）的增加。利拉鲁肽能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌，同时以葡萄糖浓度依赖的模式降低过高的胰高糖素的分泌。因此，当血糖升高时，胰岛素分泌受到刺激，同时胰高糖素分泌受到抑制。与之相反，在低血糖时利拉鲁肽能够减少胰岛素分泌，且不影响胰高糖素的分泌。利拉鲁肽的降血糖机理还包括轻微延长胃排空时间。利拉鲁肽能够通过减轻饥饿感和能量摄入降低体重和体脂量。

利拉鲁肽的作用持续时间为24小时，能够通过降低2型糖尿病患者的空腹及餐后血糖而改善血糖控制。在2型糖尿病患者中，单次给予利拉鲁肽可以观察到胰岛素分泌率以葡萄糖浓度依赖的模式增加。

利拉鲁肽经皮下注射后的吸收比较缓慢，在给药后8-12小时达到最大浓度。单次皮下注射利拉鲁肽0.6mg之后，利拉鲁肽的最大浓度估计值为9.4nmol/L。在1.8mg的利拉鲁肽剂量水平下，利拉鲁肽的平均稳态浓度（AUC1/24）达到约34nmol/L。利拉鲁肽的暴露程度随剂量成比例增加。单次给予利拉鲁肽，药时曲线下面积（（AUC）的个体内变异系数为11%。利拉鲁肽皮下注射后的绝对生物利用度约为55%。分布皮下注射后的表观分布容积为11-17L。利拉鲁肽静脉注射后的平均分布容积为0.07L/kg。利拉鲁肽可与血浆蛋白广泛结合（>98%）。

本品用于成人2型糖尿病患者控制血糖：适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。

国内外关于利拉鲁肽制备报道的报道很多，如中国专利CN201110271342.3提供了一种固相合成法，以Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次逐个接上氨基酸得到线性利拉鲁肽树脂，采用TFA裂解获得粗品，最后采用反相高效液相色谱法纯化，获得利拉鲁肽，未规定+Gly和-Gly杂质；中国专利201210369966.3采用片段合成的制备方法。

上述制备方法存在以下不足，在制备利拉鲁肽过程中，由于Gly结构特点，接入Gly时会发生多接入一个Gly或漏接一个Gly的副反应，所以在接入Gly的时候会产生[+1Gly]-利拉鲁肽和[-1Gly]-利拉鲁肽杂质，从而降低粗品纯度，这些杂质极性与利拉鲁肽非常接近，增大粗品纯化难度，降低了产品收率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有制备方法分离纯化困难、产品的总收率和纯度低。

本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种利拉鲁肽的制备方法。该制备方法使用了含Gly的保护氨基酸片段为原料，避免了[+1Gly]-利拉鲁肽和[-1Gly]-利拉鲁肽杂质的产生。

本发明提供的利拉鲁肽的制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备利拉鲁肽肽树脂，利拉鲁肽肽树脂再经酸解得到利拉鲁肽粗品，最后利拉鲁肽粗品纯化得到利拉鲁肽纯品；其中固相多肽合成法制备利拉鲁肽肽树脂的步骤为：在Fmoc-Gly-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，制备利拉鲁肽肽树脂：

Boc-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-

Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-X(OtBu)-

Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[Y(α-OtBu)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-

Trp(Boc)-Leu-Val-Z(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-树脂；

其中，W为His-Ala，X为Glu-Gly，Y为Nα-PAL-Glu，Z为Arg-Gly。

优选的，接入W时，可采用一步接入法或两步接入法：（1）采用一步接入W时，对应的保护氨基酸为Boc-His(Trt)-Ala-OH；或（2）采用两步接入W时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Ala和Boc-His(Trt)-OH。

优选的，接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。

优选的，接入Y时，可采用一步接入法或两步接入法：采用一步接入Y时，对应的保护氨基酸为Nα-PAL-Glu(α-OtBu)-OH；或采用两步接入Y时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和PAL（棕榈酸）。

优选的，接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。

优选的，接入Lys时，使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(Alloc)、Fmoc-Lys(Dde)或Fmoc-Lys(ivDde)-OH。

上述利拉鲁肽的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

上述利拉鲁肽的制备方法中，所述的Fmoc-Gly载体树脂是将载体树脂与Fmoc-Gly-OH偶联得到的；其中，所述Fmoc-Gly-载体树脂的Fmoc-Gly取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的Fmoc-Gly-取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

进一步优选的，所述载体树脂为Trityl-Cl（三苯甲基氯）类型树脂或羟基类型树脂，其中Trityl-Cl类型树脂优选为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl树脂、4-Methoxytrityl-Cl（4-甲氧基三苯甲基氯）树脂或2-Cl Trity-Cl（2-氯三苯甲基氯）树脂；羟基类型树脂优选为Wang（王）树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯（HMP）树脂。

作为本发明优选的方案，当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Gly-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷基在碱的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为本发明优选的方案，当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Gly-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。

优选的，利拉鲁肽肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到利拉鲁肽粗品：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-

Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Nα-PAL-γ-Glu)-

Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

进一步优选的，所述利拉鲁肽肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂；其中，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95%，EDT为1～10%，余量为水。

更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91%、EDT为4～6%，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90%、EDT为5%，余量为水。

所述酸解剂用量为每克利拉鲁肽肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克利拉鲁肽肽树脂需要9～11mL酸解剂。

所述的酸解时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。

进一步的，利拉鲁肽粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到利拉鲁肽纯品。

本发明方法直接使用含Gly的保护氨基酸片段制备利拉鲁肽，在整个接肽过程中未使用Fmoc-Gly-OH作为原料，直接避免了[+1Gly]-利拉鲁肽和[-1Gly]-利拉鲁肽杂质的产生，而这些杂质与利拉鲁肽极性特别相近，当前多肽的纯化方法为反相C18纯化法和离子色谱纯化法，而这两种方法对这类杂质均无法达到有效分离，只能靠反复循环纯化达到降低这类杂质的目的。而采用本发明的方法就避免了上述杂质的产生，使纯化难度降低，提高了产品收率，所得产品纯度大于99.0%，与已有技术相比，本发明工艺更具有广泛的实用价值和应用前景。

具体实施方式

本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称见表1所示：

表1

利拉鲁肽的制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备利拉鲁肽肽树脂，利拉鲁肽肽树脂再经酸解得到利拉鲁肽粗品，最后利拉鲁肽粗品纯化得到利拉鲁肽纯品；其中固相多肽合成法制备利拉鲁肽肽树脂的步骤为：在Fmoc-Gly-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，制备利拉鲁肽肽树脂：

Boc-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-

Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-X(OtBu)-

Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[Y(α-OtBu)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-

Trp(Boc)-Leu-Val-Z(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-树脂；

其中，W为His-Ala，X为Glu-Gly，Y为Nα-PAL-Glu，Z为Arg-Gly。

接入W时，可采用一步接入法或两步接入法：（1）采用一步接入W时，对应的保护氨基酸为Boc-His(Trt)-Ala-OH；或（2）采用两步接入W时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Ala和Boc-His(Trt)-OH。

优选的，接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH。

优选的，接入Y时，可采用一步接入法或两步接入法。采用一步接入Y时，对应的保护氨基酸为Nα-PAL-Glu(α-OtBu)-OH。采用两步接入Y时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和PAL（棕榈酸）。

优选的，接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。

优选的，接入Lys时，使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(Alloc)、或为Fmoc-Lys(Dde)、或为Fmoc-Lys(ivDde)-OH。

上述利拉鲁肽的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

上述利拉鲁肽的制备方法中，所述的Fmoc-Gly载体树脂是将载体树脂与Fmoc-Gly-OH偶联得到的；其中，所述Fmoc-Gly-载体树脂的Fmoc-Gly取代值为0.2～1.0mmol/g树脂，优选的Fmoc-Gly-取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

进一步优选的，所述载体树脂为Trityl-Cl（三苯甲基氯）类型树脂或羟基类型树脂，其中Trityl-Cl类型树脂优选为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl（4-甲基三苯甲基氯）树脂、4-Methoxytrityl-Cl（4-甲氧基三苯甲基氯）树脂或2-Cl Trity-Cl树脂（2-氯三苯甲基氯）；羟基类型树脂优选为Wang（王）树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯（HMP）树脂。

作为本发明优选的方案，当载体树脂为三苯甲基氯树脂时，Fmoc-Gly-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂中的Cl-代烷基在碱的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为本发明优选的方案，当载体树脂为羟基类型树脂时，Fmoc-Gly-OH与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂中的羟基在偶联剂、活化剂和碱催化剂的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。

作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的去Fmoc保护的脱保护时间为10～60分钟，优选的为15～25分钟。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。

所述的偶联反应需添加缩合试剂，缩合试剂选自DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)、N,N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；优选的为N,N-二异丙基碳二亚胺。所述缩合试剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选为2.5～3.5倍。

所述的偶联反应需添加活化试剂，活化试剂选自1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑，优选的为1-羟基苯并三唑。活化试剂的用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1.2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。

作为本发明优选的方案，所述的脱去Fmoc保护的试剂为PIP/DMF（哌啶/N,N-二甲基甲酰胺）混合溶液，混合溶液中含哌啶为10～30%(V)。去Fmoc保护试剂的用量为每克氨基树脂5～15mL，优选的为每克氨基树脂8～12mL。

优选的，利拉鲁肽肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到利拉鲁肽粗品：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-

Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Nα-PAL-γ-Glu)-

Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

进一步优选的，所述利拉鲁肽肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95%，EDT为1～10%，余量为水。

更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91%、EDT为4～6%，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90%、EDT为5%，余量为水。

所述酸解剂用量为每克利拉鲁肽肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克利拉鲁肽肽树脂需要9～11mL酸解剂。

使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。

进一步的，利拉鲁肽粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到利拉鲁肽纯品，具体方法为：

利拉鲁肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得利拉鲁肽纯化中间体浓缩液；

取利拉鲁肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min（可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速）；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利拉鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利拉鲁肽纯品。

实施例1利拉鲁肽肽树脂的合成

利拉鲁肽肽脂树为：

Boc-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-

Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-X(OtBu)-

Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[Y(α-OtBu)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-

Trp(Boc)-Leu-Val-Z(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-树脂；

其中，W为His-Ala，X为Glu-Gly，Y为Nα-PAL-Glu，Z为Arg-Gly。

接入W时，对应的保护氨基酸为Boc-His(Trt)-Ala-OH；接入X时对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-OH；接入Y时采用两步接入法，两步接入Y时对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(α-OtBu)-OH和PAL（棕榈酸）；接入Z时对应的保护氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH；接入Lys时使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(Alloc)。

使用Fmoc-Gly-树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得利拉鲁肽肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如下所示：

表2

接肽顺序n=	保护氨基酸	分子量
			2	Fmoc-Arg(Pbf)	648
3	Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH	705
			4	Fmoc-Val	339
5	Fmoc-Leu	353
			6	Fmoc-Trp(Boc)	526
7	Fmoc-Ala	311
			8	Fmoc-Ile	353
9	Fmoc-Phe	387
			10	Fmoc-Glu(OtBu)	412
11	Fmoc-Lys(Alloc)-OH	452
			12	Fmoc-Ala	311
13	Fmoc-Ala	311
			14	Fmoc-Gln(Trt)	611
15	Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH	483
			16	Fmoc-Leu	353
17	Fmoc-Tyr(tBu)	460
			18	Fmoc-Ser(tBu)	384

19	Fmoc-Ser(tBu)	384
			20	Fmoc-Val	339
13	Fmoc-Asp(OtBu)	412
			23	Fmoc-Ser(tBu)	384
23	Fmoc-Thr(tBu)	398
			24	Fmoc-Phe	387
25	Fmoc-Thr(tBu)	398
			26	Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH	483
27	Fmoc-Ala	311
			28	Boc-His(Trt)	498
29	Fmoc-Glu(α-OtBu)	412
			30	PAL	256

1、接入第2个保护氨基酸

取0.15mol第2个保护氨基酸和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取Fmoc-Gly-树脂（取代值为0.5mmol/g）100g，采用1000mL20%PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第2个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤，得含2个保护氨基酸的树脂。

2、接入第3～28个保护氨基酸或片段

采用上述同样方法，依次接入上述对应的第3～28个保护氨基酸或片段。

3、接入第29个保护氨基酸

取0.15mol第29个保护氨基酸和0.15mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.15mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。

取0.0125mol四三苯基膦钯和0.125mol苯硅烷，用适量二氯甲烷溶解，去保护4小时，过滤洗涤，得到去Alloc的树脂备用。

将加入活化后的第29个保护氨基酸溶液加入到已去Alloc的树脂，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤，得含第29个保护氨基酸的树脂。

4、接入第30个(棕榈酸)

采用接入第2个保护氨基酸相同方法接入第30个(棕榈酸)，得利拉鲁肽肽树脂。

实施例2利拉鲁肽粗品的制备

取实施例1制得的利拉鲁肽肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT=95︰5︰5的裂解试剂（裂解试剂10mL/克树脂），搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为利拉鲁肽粗品，粗品纯度为45.3%。

实施例3利拉鲁肽粗品的纯化

取实施例2制得的利拉鲁肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1%TFA/水溶液-0.1%TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得利拉鲁肽纯化中间体浓缩液；

取利拉鲁肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min（可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速）；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利拉鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利拉鲁肽纯品37.9g，总收率为20.2%。

分子量：3750.2(100%M+H)；纯度：98.6%；最大单一杂质0.3%。

上述实施例表明，本发明提供的方法直接避免了[+1Gly]-利拉鲁肽和[-1Gly]-利拉鲁肽杂质的产生，使纯化难度大大降低，提高了产品收率，所得产品纯度大于99.0%，具有广泛的实用价值和应用前景。

Claims (9)

1.利拉鲁肽的制备方法，包括：采用固相多肽合成法制备利拉鲁肽肽树脂，利拉鲁肽肽树脂再经酸解得到利拉鲁肽粗品，最后利拉鲁肽粗品纯化得到利拉鲁肽纯品；其中固相多肽合成法制备利拉鲁肽肽树脂的步骤为：在Fmoc-Gly-载体树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，制备利拉鲁肽肽树脂：

Boc-W(Trt)-X(OtBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-

Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-X(OtBu)-

Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[Y(α-OtBu)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-

Trp(Boc)-Leu-Val-Z(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-树脂；

其中，W为His-Ala，X为Glu-Gly，Y为Nα-PAL-Glu，Z为Arg-Gly；

接入W时，对应的保护氨基酸为Boc-His(Trt)-Ala-OH；

接入X时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH；

接入Y时，对应的保护氨基酸为Nα-PAL-Glu(α-OtBu)-OH；

接入Z时，对应的保护氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-OH。

2.根据权利要求1任一项所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：接入Lys时，使用的保护氨基酸为Fmoc-Lys(Alloc)、Fmoc-Lys(Dde)或Fmoc-Lys(ivDde)-OH。

3.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的Fmoc-Gly载体树脂是将载体树脂与Fmoc-Gly-OH偶联得到的；其中，所述Fmoc-Gly-载体树脂的Fmoc-Gly取代值为0.2～1.0mmol/g树脂。

4.根据权利要求3所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述Fmoc-Gly-载体树脂的Fmoc-Gly-取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

5.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述的固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。

6.根据权利要求1～5任一项所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：利拉鲁肽肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到利拉鲁肽粗品：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-

Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Nα-PAL-γ-Glu)-

Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。

7.根据权利要求6所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述利拉鲁肽肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸、1,2-乙二硫醇和水的混合溶剂；其中，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95％，EDT为1～10％，余量为水。

8.根据权利要求7所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91％、EDT为4～6％，余量为水。

9.根据权利要求8所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为5％，余量为水。