CN110818775B - 一种蛋白质及多肽保护剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白质及多肽保护剂及其应用。该保护剂属于一种多肽，其氨基酸序列为(‑Arg‑Gly‑)X，简写为(RG)x。其中，X＝2,3,4,5或6。可采用固相合成法制备。本发明的目的在于：为基因工程及生物制药领域提供一种发酵过程中的目标蛋白质(或多肽)保护剂。其作用在于：能够抑制含有‑Arg‑Gly‑氨基酸序列或于Arg位点处易被蛋白酶水解的重组蛋白质或多肽的水解，促使目标产物的成功表达，并提高其表达量，降低有关杂质含量。还能够降低纯化难度，提高目标产物的制备收率。有助于多种重组蛋白质或多肽类产品实现高效率的工业化生产。

Description

一种蛋白质及多肽保护剂及其应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种蛋白质及多肽保护剂。用于以基因重组技术进行蛋白质或多肽类产品制备时，发酵过程中目标产物的保护。添加该保护剂后，能够抑制目标产物的降解，维持其在生产工艺过程中的稳定性。有助于实现难以在微生物(如酵母菌、大肠杆菌)或动物细胞、昆虫细胞中表达的蛋白质及多肽的制备，并有助于提高其产率，降低目标产物的纯化难度。
背景技术
自十九世纪八十年代，第一个基因工程产品重组人胰岛素问世后，至今已有200余个基因工程药物投放市场。主要包括：干扰素、生长激素、凝血因子、白细胞介素、表皮生长因子、集落素刺激因子、神经生长因子、胰岛素类似物与胰高血糖素样肽-1类似物等。全球人用重组蛋白药物的市场规模已超过1600亿美元，未来的5至10年间，还将有更多的通过DNA重组技术生产的新药进入市场。在我国，生物制品用药总体规模也已超1300亿元，在国内药品市场中占比接近10％。
这些重组蛋白质及多肽类药物的表达与制备，多是利用微生物或者哺乳动物细胞、昆虫细胞等宿主进行。其中，被使用最多的微生物是酵母工程菌与大肠杆菌工程菌。以微生物为宿主，利用重组DNA技术表达目的蛋白的通用方法为：通过基因工程操作，将获取的编码目标产物的外源基因与质粒载体进行体外重组，再将重组后的携带外源基因的质粒转化入宿主菌，或者将质粒线性化后通过同源重组把外源基因整合入宿主菌的染色体，形成稳定的转化子。载有外源基因的工程菌通过发酵扩增以及诱导表达后，得到大量目的蛋白质或多肽。再通过后续的粗提、纯化及制剂等操作，最终获得高纯度的药物制剂。
若要实现利用微生物高效表达真核基因，必需攻克强三个核心难题：①.蛋白产物的生物合成；②.抑制蛋白产物的降解；③.维持或恢复蛋白质的特异性空间构象。其中，在抑制蛋白产物降解方面，外源基因表达产物的稳定性普遍较差，在发酵过程中易被宿主的特异性蛋白酶降解，造成表达量偏低甚至表达失败。例如，丝氨酸蛋白酶会特异性地水解谷氨酸和门冬氨酸残基羧基侧的肽键，对蛋白质造成破坏，并且在pH值4.0～10.0的范围内均具有酶活。而当在某些蛋白酶的作用下，特异性的水解发生在肽链末端的1～2个氨基酸位点时，还会造成与目标物结构高度近似的杂质出现，大幅增加后期的纯化难度，进而造成纯化收率的下降，甚至会高纯度目标物的不可及。这也限制了很多重组产品工业化的实施，尤其是分子量5000Da以下的多肽类产品。
当前，抑制重组蛋白及多肽于发酵过程中降解的方法主要有三种。
第一种方法是开发蛋白酶缺陷的工程菌株。例如，在酵母体系中液泡蛋白酶PrA和PrB分别由基因PEP4和PRB1编码，其对于几个液泡蛋白酶成熟和活化是必需的，因此△PEP4-△PRB-1双突变酵母表现为蛋白酶缺陷。对酿酒酵母、毕赤酵母或C.boidinii酵母的液泡蛋白酶基因PEP4和PRB1以及其它蛋白酶基因，如CPY1、YPS1、KEX2进行敲除可减少外源蛋白质的降解。但若仅敲除个别蛋白酶，多数情况下，对外源蛋白降解的控制有限。因此，系统地考察、筛选宿主微生物的蛋白酶系并对多个蛋白酶进行修改或敲除，才有可能显著降低外源蛋白质的水解程度。例如，文献报道，有研究者构建了8个蛋白酶基因同时被删除的缺陷型菌株A8，使该菌株分泌HGH的量增加了近30倍。
然而大量敲除或敲低多种蛋白酶基因后，还能够确保得到的缺陷型工程菌株在培养过程中仍具备较好的生长性与稳定性，并能够经得起大规模工业化生产的考验，具备极高的技术难度，往往很难实现。如GLP-1类似物-利拉鲁肽，国内已有多家研究单位利用大肠杆菌表达系统完成了其开发工作。但尚无一家单位利用酵母表达系统开发成功，也未见利用酵母工程菌成功表达利拉鲁肽的相关文献。其原因是酵母系统的蛋白酶系与大肠杆菌不尽相同，在酵母菌中表达利拉鲁肽，其羧基端末位的Arg-Gly-Arg-Gly氨基酸残基更易被蛋白酶水解，造成目标产物的表达失败或者难以纯化。而使用大肠杆菌进行利拉鲁肽的制备，则无法获得与国外原研产品杂质谱相一致的高质量产品，并且在目的蛋白表达量以及产品收率方面难以达到国外先进企业的工艺水平，存在明显缺陷。
第二种方法是于发酵过程中添加蛋白胨、酪蛋白、酵母粉等作为基底蛋白。这些物质具备随机的与目标蛋白质相似或相同的易被酶解的位点，通过底物与蛋白酶的竞争性结合，起到对表达产物的保护作用。该方法可以对重组蛋白或多肽的降解起到控制作用，但添加物不具备单一性，成分复杂，相当于同时引入了大量非单一性杂质，增加了后期纯化难度，导致纯化流程的复杂化，进而会降低产品的整体收率。并且，在长期使用的过程中，这类保护剂的批间质量均一性也很难得到良好的控制。另外，在发酵过程中添加蛋白酶抑制剂也属于该类方法，可以起到抑制表达产物被降解的作用，但并不具备更高的可行性。因为微生物中的蛋白酶系众多，工业生产中同时加入多种蛋白酶抑制剂的成本过高，还可能对微生物的生长及代谢造成诸多影响，并且也很难确定适宜于特定重组产品的工业化生产的抑制剂组合。
第三种方法则是通过对发酵过程中的培养条件，如pH值、温度等进行调节，以抑制蛋白酶的酶活进而对目的蛋白起到保护作用。但培养条件的可调整幅度有限，调整幅度过大会严重影响到微生物的生长与目的蛋白的表达，因此该方法对于目的蛋白降解的控制有限。
上述三种抑制重组蛋白及多肽降解的方法中，第一种常作为首选。但获得适用于工业化生产的缺陷型工程菌株的技术难度非常高，需要巨大的研发投入并且很多时候成功率不高，极难实现，研发成果也不具备普适性。第二种方法与第三种方法存在明显的缺陷与问题，如引入大量的非单一性杂质、质量均一性难以把控、增加纯化操作的复杂性与成本，或者对目的蛋白降解的控制作用有限等。因此，需要开发一种成分明确、质量易控、成本低廉的且具备通用性的蛋白质及多肽保护剂，以更好地对发酵过程中目标蛋白或多肽的水解进行控制，并显著降低后期纯化工序的难度。
发明内容
为克服现有技术的缺陷与不足，本发明提供了一种分子结构明确、成分简单且具备通用性的蛋白质及多肽类保护剂，可用于基因工程药物制备过程中对目标蛋白质或多肽的结构保护。其本身为一种多肽，氨基酸序列为(-Arg-Gly-)X，简写为(RG)x。其中，X＝2,3,4,5或6。
Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基，简写为R；
Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基，简写为G。
在制备重组蛋白质或多肽的微生物发酵或细胞培养过程中，碱性蛋白酶易对精氨酸残基的羧基端肽键特异性水解。进而造成重组产品的表达失败或表达量低下、杂质增多。如果水解位点发生在肽链的末端，出现与目的蛋白或多肽序列相近的水解产物，还会为后期纯化带来更大的难度，进一步提高生产成本，甚至会造成高纯度产品的不可及。本发明中的保护剂可用于抑制含有-Arg-Gly-氨基酸位点的重组蛋白或多肽的水解，促使目标产物的成功表达，并提高其表达量，降低杂质含量，有助于多种重组蛋白质或多肽类产品实现高效率的工业化生产。
本发明所述的蛋白及多肽保护剂可采用Fmoc固相合成等方法制备。以适宜的固相树脂，将目标多肽的C-羧端基第一个氨基酸以共价键形式与树脂相连。然后，以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基在催化剂的作用下形成肽键。依此重复该过程，完成从C端到N端的合成，即得到目标长度的多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到最终的目标产物。
在一个实施方式中，合成所得目标产物由4个氨基酸组成，序列为Arg-Gly-Arg-Gly；在一个实施方式中，合成所得目标产物由6个氨基酸组成，序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly；在一个实施方式中，合成所得目标产物由8个氨基酸组成，序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly；在一个实施方式中，合成所得目标产物由10个氨基酸组成，序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly；在一个实施方式中，合成所得目标产物由12个氨基酸组成，序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly。目标产物的长度控制在4至12个氨基酸，分子量最大不超过1300Da，可将该保护剂的制备成本控制在较低水平。同时，添加入系统后在纯化工序中也易于与分子量在3000Da以上的重组产物分离。
GLP-1类似物利拉鲁肽是天然的人类胰升血糖素肽-1的序列7-37位的片段(GLP-1[7-37])，用精氨酸替代天然氨基酸序列的34位(赖氨酸)，并且在26位赖氨酸的ε位用具有谷氨酸空间的十六烷酸(棕榈酸)取代。Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]-OH的分子结构式参见附图1，其羧端末位的氨基酸序列为RGRG，易被碱性蛋白酶特异性地水解。
该物质由肽链与脂肪酸修饰物两部分组成，以DNA重组技术于大肠杆菌工程菌或酵母工程菌进行肽链部分(或称为前体)的生产，然后进行化学修饰，接上具有谷氨酸空间的十六烷酸(棕榈酸)取代基。
使用酵母工程菌进行利拉鲁肽前体的分泌表达时，在发酵过程中经诱导表达所得的利拉鲁肽前体被分泌至发酵液中。一些碱性蛋白酶也会被分泌至酵母细胞外，或者在菌体死亡、破裂后被释放至发酵液中。因此，目标产物利拉鲁肽的肽链部分在发酵过程中极易被水解破坏，最易被水解的位点出现在羧端的末位。被水解破坏后造成羧端末位的G缺失，或者GRG缺失，例如，一次利拉鲁肽纯化过程中样品的ESI-MS图谱显示，存在相对分子质量3694Da的杂质，异于利拉鲁肽的理论分子量3751Da，此即为表达产物末端甘氨酸(G)降解所致。
如是造成两大问题：
⑴.严重影响到目标产物的表达量，无法实现较高的表达水平，难以工业化生产。
⑵.目标物的羧端末位被水解后，产生的相关杂质与目标物本身的分子结构非常相似，这也加大了后期的纯化难度，会严重降低工艺的整体收率，甚至造成高纯度目标产物的不可及。
将本发明中的蛋白质及多肽保护剂Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly，替代酵母粉及蛋白胨等基底蛋白，按照0.5g/L的终浓度，于诱导表达利拉鲁肽前体至30h时添加入发酵液中，此为方案一。最终目标产物的发酵表达量达到了3.2g/L以上的水平，RP-HPLC内标法检测中，主要有关物质的占比在16％以内。发酵使用菌种为载有利拉鲁肽前体多核苷酸序列的分泌型表达的毕赤酵母工程菌，发酵液终体积为1000L。
进一步地，在方案二中将蛋白质及多肽保护剂，按照0.1g/L的终浓度，于诱导表达利拉鲁肽至20h后，每10h添加入发酵液中一次。最终目标产物的发酵表达量达到了3.9g/L以上的水平，RP-HPLC内标法检测中，主要有关物质的占比在12％以内。与使用酵母粉及蛋白胨等基底蛋白做保护剂时的表达量相当。
进一步地，在方案三中将蛋白质及多肽保护剂，按照0.1g/L的终浓度，于诱导表达利拉鲁肽至20h与30h时，各添加入发酵液中一次。按照0.2g/L的终浓度，于诱导表达利拉鲁肽至40h、50h、60h以及70h时，各添加入发酵液中一次。最终目标产物的发酵表达量达到了4.3g/L以上的水平，RP-HPLC内标法检测中，主要有关物质的占比在8％以内。与使用酵母粉及蛋白胨等基底蛋白做保护剂的工艺相比，后续的纯化过程中去掉了一步高压反相层析纯化，工艺整体收率达到了20％，高于改进前的12％～15％。
进一步地，按照方案三，将蛋白质及多肽保护剂以0.1g/L的终浓度，于诱导表达利拉鲁肽至20h与30h时，各添加入发酵液中一次。按照0.2g/L的终浓度，于诱导表达利拉鲁肽至40h、50h、60h以及70h时，各添加入发酵液中一次。重复8个批次的生产，最终目标产物的发酵表达量分别为4.39g/L、4.54g/L、4.44g/L、4.67g/L、4.38g/L、4.51g/L、4.80g/L、4.59g/L，均在4.3g/L以上的水平，且未有极低表达量的情况出现；RP-HPLC内标法检测中，主要有关物质的占比均在8％以内；工艺整体收率分别为20.3％、21.7％、19.8％、22.5％、21.4％、20.1％、21.8％、20.9％均在19％以上。
有益效果
与现有技术相比，本发明具备如下优点和技术效果：
本发明首次合成了该蛋白质及多肽保护剂，并将该保护剂应用于基于酵母表达系统的利拉鲁肽的工业化生产。新技术的应用使连续8批次的目标产物的表达量达到了4.3g/L，高于以酵母粉及蛋白胨等基底蛋白做保护剂时的表达量。主要的降解产物得到了更好的控制，连续8批次的生产中均控制在了8％以内。并且使发酵产物易于纯化，令纯化工序得到精简，工艺整体收率由12％～15％的水平提升至19％～23％的水平。该保护剂还可用于其它含有-Arg-Gly-氨基酸序列或于Arg位点处易被蛋白酶水解的重组蛋白质及多肽，在发酵过程中的保护。
具体实施方式
本发明将结合以下具体实施例做进一步说明，必须理解的是，说明书中所给出的实施例仅为示例性质，不应理解为对本发明的范围的限制。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本领域技术人员在阅读说明书后，可以对本发明的实施例做出适当改变，而这些改变仍然属于本发明的范围之内。
实施例1氨基酸序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly的保护剂的固相合成
选用高分子树脂Wang Resin，按照氨基酸序列Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly的特征，自羧基端Gly开始进行固相合成。称取Wang Resin树脂500g，加入合成反应器中，以适量DMF充分溶胀1h后，再使用DMF清洗5遍。再使用20％哌啶/DMF(V/V)脱除Fmoc基团，温度20～30℃，反应时间30min。之后，用DMF清洗5遍，每遍5min。完成固相树脂的脱Fmoc保护基。
加入Fmoc-Gly-OH 297.31g(1mol)，HOBt Hydratel 36.5g，BOP Reagent 445.2g，NMM150mL，于反应器中振荡或搅拌反应1h，反应温度20～30℃。之后，用DMF清洗5遍，每遍3min，完成第一个氨基酸与固相树脂的挂载。再使用20％哌啶/DMF(V/V)脱除Fmoc基团，温度25～30℃，反应时间30min。用DMF清洗5遍，每遍3min，完成肽链的第一次脱Fmoc保护基。
继续于反应器中加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648.77g，于反应器中振荡或搅拌反应1h，反应温度20～30℃。之后，用DMF清洗5遍，每遍3min，完成第一次缩合反应。用同样的方法和程序进行合成，直到最后一个氨基酸衍生物Fmoc-Arg(Pbf)-OH缩合完成。再以甲醇冲洗树脂5次，真空干燥，得到肽-树脂。
将肽-树脂加入适宜的反应瓶中，再加入脱保护切割试剂TFA/苯甲醚(25:1)，在氮气保护下，20～30℃反应2h。过滤除去树脂。向过滤液中加入预冷的沉淀试剂无水乙醚/石油醚(2:1)，于-20℃～-25℃条件下，沉淀20～30min，得到该保护剂的粗品。将粗品于纯化水中溶解，并利用C18高压反相层析柱进行纯化，流动相为乙腈:0.1％TFA/H2O，等度洗脱19:81，280nm检测，收集样品峰。
将C18高压反相层析纯化所收集的样品溶液，减压蒸馏以减小体积，再于真空冷冻干燥箱内进行冻干，即得到氨基酸序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly的蛋白质及多肽保护剂。利用ESI-MS或Edman降解法等方法对制得的保护剂进行检测，确认其结构的正确性。
实例2添加氨基酸序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly的保护剂的利拉鲁肽发酵实验
将冻存于超低温冰柜的携带编码利拉鲁肽前体的毕赤酵母工程菌种取出，待融化后划线接种于YPG固体培养基，30℃进行活化培养。
将活化后的菌种接入摇瓶中的种子培养基中，置于摇床内进行培养，转速250～300rpm，温度30℃，培养时间16～24h，直至OD600＝2～6，即得一级种子液。再将一级种子液按1％的接种量至接种至二级摇瓶培养基中，进行扩增培养培养。
将扩增后的菌种按照5％～10％的接种量，接种至发酵罐内的BSM+PTM1培养基中，以甘油做碳源，不添加酵母粉或蛋白胨等基底蛋白，开始初始阶段的发酵培养。培养过程中控制搅拌转速在120～500rpm，溶氧值在35％以上，培养温度28～30℃。至溶氧出现陡升现象后，开始甘油补料阶段的培养，50％w/v的每升含12ml PTM1的甘油补料速度控制在18～22ml每小时每升初始发酵液体积。此阶段搅拌转速控制在300～600rpm，培养温度28～30℃，溶氧值30％以上。
当发酵液中的细胞密度达到200g/L左右的水平时，开始补入甲醇，在诱导过程中逐渐提升甲醇的补加量，进行目标蛋白利拉鲁肽前体的诱导表达。该阶段的培养温度控制在25～30℃，溶氧值20％以上，搅拌转速300～800rpm，诱导时间控制在70～80h。在此阶段，目标蛋白利拉鲁肽前体会以分泌型的表达方式，被释放至发酵液中。
在诱导表达阶段的第20h，按照0.1g/L的终浓度，将本蛋白质及多肽保护剂无菌添加入发酵液中；在诱导表达阶段的第30h，按照0.1g/L的终浓度，将本蛋白质及多肽保护剂无菌添加入发酵液中，此时目的蛋白的表达量约为每升发酵液1.37g，主要相关杂质的占比5.902％；在诱导表达阶段的第40h以及第50h，按照0.2g/L的终浓度，将本蛋白质及多肽保护剂无菌添加入发酵液中，至50h时目的蛋白的表达量约为每升发酵液3.23g，主要相关杂质的占比7.196％；在诱导表达阶段的第60h以及第70h，按照0.2g/L的终浓度，将本蛋白质及多肽保护剂无菌添加入发酵液中，至最终诱导结束的75h时目的蛋白的表达量约为每升发酵液4.44g，主要相关杂质的占比7.674％。
结果表明，氨基酸序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly的蛋白质及多肽保护剂能够在毕赤酵母分泌表达利拉鲁肽的发酵过程中对目标产物起到很好的保护作用，促使其表达量在每升发酵液4.3g以上的高水平，主要相关杂质也可控制在8％以下的低水平。
实例3添加氨基酸序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly的保护剂的利拉鲁肽发酵实验
将冻存于超低温冰柜的携带编码利拉鲁肽前体的毕赤酵母工程菌种取出，待融化后划线接种于YPG固体培养基，30℃进行活化培养。
将活化后的菌种接入摇瓶中的种子培养基中，置于摇床内进行培养，转速250～300rpm，温度30℃，培养时间16～24h，直至OD600＝2～6，即得一级种子液。再将一级种子液按1％的接种量至接种至二级摇瓶培养基中，进行扩增培养培养。
将扩增后的菌种按照5％～10％的接种量，接种至发酵罐内的BSM+PTM1培养基中，以甘油做碳源，不添加酵母粉或蛋白胨等基底蛋白，开始初始阶段的发酵培养。培养过程中控制搅拌转速在120～500rpm，溶氧值在35％以上，培养温度28～30℃。至溶氧出现陡升现象后，开始甘油补料阶段的培养，50％w/v的每升含12ml PTM1的甘油补料速度控制在18～22ml每小时每升初始发酵液体积。此阶段搅拌转速控制在300～600rpm，培养温度28～30℃，溶氧值30％以上。
当发酵液中的细胞密度达到200g/L左右的水平时，开始补入甲醇，在诱导过程中逐渐提升甲醇的补加量，进行目标蛋白利拉鲁肽前体的诱导表达。该阶段的培养温度控制在25～30℃，溶氧值20％以上，搅拌转速300～800rpm，诱导时间控制在70～80h。在此阶段，目标蛋白利拉鲁肽前体会以分泌型的表达方式，被释放至发酵液中。
在诱导表达阶段的第20h，按照0.1g/L的终浓度，将本蛋白质及多肽保护剂无菌添加入发酵液中；在诱导表达阶段的第30h，按照0.1g/L的终浓度，将本蛋白质及多肽保护剂无菌添加入发酵液中，此时目的蛋白的表达量约为每升发酵液1.28g，主要相关杂质的占比6.073％以下；在诱导表达阶段的第40h以及第50h，按照0.2g/L的终浓度，将本蛋白质及多肽保护剂无菌添加入发酵液中，至50h时目的蛋白的表达量约为每升发酵液3.49g，主要相关杂质的占比6.713％；在诱导表达阶段的第60h以及第70h，按照0.2g/L的终浓度，将本蛋白质及多肽保护剂无菌添加入发酵液中，至最终诱导结束的75h时目的蛋白的表达量约为每升发酵液4.51g，主要相关杂质的占比7.601％。
结果表明，氨基酸序列为Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly的蛋白质及多肽保护剂能够在毕赤酵母分泌表达利拉鲁肽的发酵过程中对目标产物起到很好的保护作用，促使其表达量在每升发酵液4.3g以上的高水平，主要相关杂质也可控制在8％以下的低水平。
附图说明
图1为Arg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))-GLP-1[7-37]-OH的分子结构式，其羧端末位的氨基酸序列为RGRG。
图2为使用本发明的保护剂，按照方案一进行时，目标蛋白的最终表达量及主要有关物质的RP-HPLC检测图谱。
图3为使用本发明的保护剂，按照方案二进行时，目标蛋白的最终表达量及主要有关物质的RP-HPLC检测图谱。
图4为使用本发明的保护剂，按照方案三进行时，目标蛋白的最终表达量及主要有关物质的RP-HPLC检测图谱。
图5为使用本发明的保护剂Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly，按照方案三进行时，诱导至30h的目标蛋白的表达量及主要有关物质的RP-HPLC检测图谱。
图6为使用本发明的保护剂Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly，按照方案三进行时，诱导至50h的目标蛋白的表达量及主要有关物质的RP-HPLC检测图谱。
图7为使用本发明的保护剂Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly，按照方案三进行时，诱导至30h的目标蛋白的表达量及主要有关物质的RP-HPLC检测图谱。
图8为使用本发明的保护剂Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly，按照方案三进行时，诱导至50h的目标蛋白的表达量及主要有关物质的RP-HPLC检测图谱。
图9为使用本发明的保护剂Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly，按照方案三进行时，目标蛋白的最终表达量及主要有关物质的RP-HPLC检测图谱。

Claims (1)

1.一种蛋白质及多肽保护剂在毕赤酵母表达利拉鲁肽的发酵过程中，对目标产物起到保护作用的用途， 其中，所述蛋白质及多肽保护剂为氨基酸序列Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly或Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly。
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