JPH03504240A - インシュリン類似物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリン類似物質 技術分野 本発明は、化学修飾に対し安定である新規インシュリン類似物質およびこのよう なインシュリン類似物質を含む新規インシュリン製剤に関する。

発明の背景 インシュリンを体温（または室温でさえも）で扱う場合、生物学的能力は時間の 関数として衰える傾向がある。生物学的能力のこのような損失は貯蔵の間に生じ るインシュリンの特定の化学修飾が原因のようである。

他のタンパク質のように、インシュリンは安定なものではなくて分子またはイオ ンとその近辺で化学的反応による分解を受けたりまたはインシュリン分子内で分 子内および分子間の変形を受けやすい。

酸性溶液におけるインシュリンの加水分解変形とこれに伴なうアンモニウムイオ ンの遊離および脱アミド化生成物の形成がサンドベイ（Ｓｕｎｄｂｙ）により報 告されている（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　。

２３７（１９６２）、　３４０６−４３１１）。彼はモノデスアミド−（Ａ２１ ）　−インシュリンが形成される主な誘導体であると報告している。

ジャクソンら（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　２１（１ ９７２）、　２３５−２４５）は、酸性と中性溶液を比較し、似ているがしかし それほど明白ではない脱アミド化が中性の一般的インシュリンで見られうろこと を示した。中性溶液ならびに２つの異なった中性懸濁液中でのインシュリンのゆ っくりした脱アミド化は、シュリッヒトクルールＳｃｈ　ｌ　ｉｃｈ　ｔｋｒｕ 　１１らにより報告された０１ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、　Ｎｅｗ　５ｅｒｉｅｓ、　Ｖｏｌ。

ＸＸＸ　Ｕ　／　２　、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　ｐ、７２９−７ ７７）。

より高い貯蔵温度で中性溶液中にて著しい脱アミド化がまた観察されうる。ここ では加水分解変形がインシュリンＢ鎖の主にＡｓｎ（Ｂ３）で生ずることが見出 された（ブランゲＢｒａｎｇｅら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　２５（１９８３ ）、　１９３（アブストラクト））。中性インシュリン製剤における脱アミド化 の割合は配列とともに変化する。

酸性媒体中で生ずる脱アミド−インシュリンがＡ２１で加水分解される一方、中 性ｐＨで形成される生成物は、部分的にＡｓｎ（Ｂ３）の加水分解により、部分 的にこれに伴なう脱アミド化でのＡｓｎ（Ｂ３）のα−βアスパルチル再転再転 上りＢ鎖において脱アミド化される。

中性製剤の貯蔵の間にインシュリンの少量の共有結合二量体と重合生成物が形成 することはシュリッヒトクルールら（同上）およびプランゲＢｒａｎｇｅら、Ｄ ｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　２７（１９８４）。

２５９により報告された。中性溶液において、この変形はインシュリンの配列お よび種類とともに変化する。

インシュリンの共有結合三量化は主にアスパラギンまたはグルタミンのカルボキ サミド基とＮ−末端アミノ基の反応による。

別の部分の三量化は、主に２つのインシュリン分子間の橋を形成するインシュリ ンアミノ基とアルデヒドの反応による。

本発明の目的は、実質的に上記の化学的変形および分解を受けにくい新規インシ ュリン類似物質を提供するものである。

本発明の目的は、後述する新規ヒトインシュリン類似物質で達成される。

多数のインシュリン類似物質がこれまでに報告されてきている。メルキ４　Ｍｉ ｒｋｉら（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｘｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

おいてヒトインシュリンと異なるヒトインシュリン類似物質の合成について記載 しこれによりインシュリンの興味ある構造活性関係に新しい見識をもたらした。

別の研究はインシュリンにおける主なレセプター結合領域（Ｂ　（２２）　−Ｂ 　（２６）　）を変化させてレセプター結合活性におけるこのような変化の効果 を調査した。しかしながら化学的分解および変形に対する安定性は検討されなか った。

ここで使用する「インシュリン類似物質」とは、Ｃｙｓ（Ａ７）とＣｙｓ（Ｂ７ ）の間およびＣｙｓ（Ａ２０）　とＣｙｓ　（Ｂ　１９）の間のジスルフィド橋 およびＣｙｓ（Ａ６）とＣｙｓ（Ａｌｌ）の間の内部ジスルフィド橋を含むイン シュリンと類似の分子構造を有しインシュリン活性を有する化合物を意味するも のである。

発明の要約 その最も広い見地において、本発明は１つ以上のアスパラギン残基（Ａｓｎ）ま たはグルタミン残基（Ｇｌｎ）が別の天然産生アミノ酸残基により置換されたイ ンシュリン類似物質を提供するものである。

本発明によるインシュリン類似物質は、ＡｓｎがＡ１８．Ａ２１および８３位の １つ以上で存在せず、および／またはＧｌｎがＡ５．Ａｌ１および８４位の１つ 以上で存在せず、ただしＡ２１位におけるアミノ酸残基がＡｓｎと異なる場合、 Ａ１５．Ｂ４またはＡ５位におけるアミノ酸残基の１つがＧｉｎと異なるかまた はＡ１８もしくはＢ３におけるアミノ酸残基の１つがＡｓｎと異なりそしてただ しＡ５位におけるアミノ酸残基がＧｌｎと異なる場合Ａ１５または８４位におけ るアミノ酸残基の１つがＧｉｎと異なるかまたはＡ１８　、　Ａ２１または８３ 位におけるアミノ酸残基の１つがＡｓｎと異なることが特徴的である。

より狭い見地において、本発明は、ＡｓｎがＡｌａ、Ａ２１および８３位の１つ 以上に存在せずおよび／またはＧｉｎがＡ１５および／または８４位に存在しな いインシュリン類似物質に関連する。

好ましいインシュリン類似物質は、ＡｓｎがＡ１８．Ａ２１および８３位の１つ 以上に存在しないようなものである。

８３位におけるＡｓｎが別のアミノ酸残基で置換されていることが特に重要であ ると考えられる。Ａｓｎ（Ｂ３）に対する好ましい置換基は、Ａｓｐ、　Ｇｉｎ 、　Ｓｅｒ＋　ＴｈｒまたはＧｔｙである。

Ｇｉｎに対する置換基は、原則として、側鎖に遊離アミド基を有さないいかなる 天然産生アミノ酸残基でもよい。好ましい置換基はＧｌｕ、　Ａｓｐ、　Ｈｉｓ ＋　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｉ］ｅ、　Ａｈａ。

Ｇｌｙ、　Ｍｅｔ、　Ｔｒｐ、　ＴｙｒおよびＧｌｎであり、ＧｌｕとＡｓｐが 最も好ましい。

Ａｓｎに対する置換基は、原則としてＧｉｎを含むいかなる天然産生アミノ酸残 基でよい。好ましい置換基はＧｌｕ、　Ａｓｐ、　Ｈｉｓ。

Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ、　Ａｌａ、　Ｇｌｙ、　Ｍ ｅｔ、　Ｔｒｐ＋　ＴｙｒおよびＧｉｎであり、ＧｌｕおよびＡｓｐが最も好ま しい。

Ａｓｎが側鎖において遊離アミド基を含まないアミノ酸残基で置換されるのが好 ましいとはいえ、化学的分解に対する安定化は幾つかの場合Ａｓｎに対しＧｉｎ を置換することにより得られる。これに対する理由はＡｓｎがＧｉｎよりも脱ア ミド化を受けやすく転位生成物を形成するかまたは三量化反応で沈でんするので はないかと考えられることである。

アスパラギンが上述の変形および分解をより受けやすいという事実のために、イ ンシュリン類似物質の好ましい群はＡｓｎがＡ１８　、　Ａ２１および８３位の １つ以上に存在しないようなものである。

上述したように８３位にＡｓｎがないことが好ましい。８３位における八ｓｎの 置換はＡｓｎ（Ａ２１）またはＡｓｎ（ＡｌＢ）の置換と組合わせてもよい。ま た８３位におけるＡｓｎの置換はＡ　（１８）およびＡ　（２１）位におけるＡ ｓｎまたはＡ１５位におけるＧｉｎおよびＡ１８におけるＡｓｎの置換と組合わ せてもよい。

本発明は、たとえばヒト、ブタまたはウシインシュリンのような天然インシュリ ンのみの安定化に関連することを意図するものではない。近年、ヒトインシュリ ンの特定アミノ酸残基を別のアミノ酸残基により置換した多数のインシュリン類 似物質が見出されてきた。

ヨーロッパ特許出願第２１４８２６１号において、ヒトインシュリンのＡ８　、 Ａ９　、ＡＩＯ，Ａ１３．Ａ２１．Ｂｉ　、Ｂ２　、Ｂ５　。

Ｂ９　、ＢＩＯ，Ｂ１２．Ｂ１４．Ｂ１６．Ｂ１７．Ｂ１８．Ｂ２０．Ｂ２６゜ Ｂ２７およびＢ２８位におけるアミノ酸残基の１つ以上を別のアミノ酸残基によ り置換した速効性インシュリン類似物質が記載されている。好ましい置換基はＧ ｌｕとＡｓｐである。これらのインシュリン類似物質はＡ１．８およびＢ３また はＡ５．Ａ１５および８４位においてＡｓｎおよびＧｉｎをそれぞれ保持してい るので、これらは本発明による化学的分解に対して十分に安定である。

このような化学的分解に対して安定化された速効性インシュリン類似物質の例は 、Ｂ　９　、　ＢＩＯ，Ｂ２７および／またはＢ２８位にＡｓｐまたはＧｌｕを 含むものである。

公知インシュリン類似物質の別の群はヨーロッパ特許出願第２５４５１６号に記 載されている。これらのインシュリン類似物質では塩基性アミノ酸残基を８２７ において置換するかおよび／または中性アミノ酸残基をＡ４　、Ａ１７．Ｂ１３ および／またはＢ２１位において挿入している。さらにＡｓｎ（Ａ２１）を別の アミノ酸残基により置換して酸性ｐＨにおいて遅延性インシュリン類似物質を含 むインシュリン溶液の安定性を増加する。しかしながら、本発明はＡ５　、Ａ］ 、５．Ａ１８．Ｂ３およびその上８４位でのＧｉｎおよび／またはＡｓｎの置換 を示唆するヨーロッパ特許第２５４５１６号に記載されたものよりもさらに進ん でいる。

本発明はまた、誘導体または置換基が本発明の狙いとするゴールに実質的な影響 を及ぼさないという条件でインシュリン類似物質の特定の誘導体または別の置換 基を含むことを意図するものである。したがって、アミノ酸残基において官能基 １つ以上を誘導することができる。たとえば、インシュリン分子における酸性基 のエステルまたはアミド基へのそれ自体公知の転化およびアルコール基のアルコ キシ基への転化またはその逆もまた本発明の範囲内であると考えられる。

また、インシュリン類似物質の性質全体には何らの顕著な影響も及ぼさないとい う条件でＡ−およびＢ鎖のＮ−またはＣ−末端における２、３のアミノ酸残基の 追加または除去も本発明の範囲内であると思われる。

Ａ−およびＢ−ポリペプチド鎖の末端におけるこのような変形は本発明によるイ ンシュリン類似物質においてインビトロで行なわれるかまたは当業者にとって公 知であるように組換えＤＮＡ技術により行なわれる。

本発明による新規インシュリン類似物質は、天然ヒトプロインシュリン遺伝子に おける適当な部位におけるコドンを所望のアミノ酸残基置換基をエンコードする コドンで置き換えることによりプロインシュリン遺伝子を代えるかまたは所望の インシュリン類似物質をエンコードする全ＤＮＡ配列を合成することにより調製 されうる。次いで所望のインシュリン類似物質をエンコードする遺伝子を適当な 発現ベクターへ挿゛入し、これを適当な宿主生物たとえば大腸菌、バチルス菌ま たは酵母へ移すと所望の産生物を生じる。次いで、発現産生物が細胞から分泌さ れるか否かに応じて、細胞または培養ブロスから単離する。

新規インシュリン類似物質はまたメルキイらにより記載された方法と同じ方法に より化学的合成により調製されうる（Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　３６０（１９７９）、　１６１９−１６３２）。

これらはまた、適当なアミノ酸残基置換基を含む別々にインビトロで調製された Ａ−およびＢ−鎖から形成され、その際修飾されたＡ−およびＢ−１ｆｉは公知 方法にしたがってジスルフィド橋を確立することにより一緒に結合される（たと えば、チャンスＣｈａｎｃｅら、Ｉｎ　：リックディエイチＲｉｃｋ　ＤＨ、グ ロス　イー〇ｒｏｓｓ　Ｅ、（ｍ）ペプチド二合成−構造−機能。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｖｅｎｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。

イリノイ、ｐｐ　７２１−７２８）。

さらにインシュリン類似物質は、ヨーロッパ特許出願第０１６３５２９八号に記 載の方法と同じ方法により調製され、その記載は参考としてここに編入される。

このような方法により、正しく配置されたジスルフィド橋を有しペプチド結合ま たは長さの変わったペプチド鎖のいずれかを介してＩ、ｙｓｆｉ２９がＧ　］　 ｙ　Ａ　ｔ　ｌに結合したヒトインシュリンのインシュリン前駆体が酵母により 発現され分泌され、次いでいわゆるペプチド転移反応によりヒトインシュリンへ 転化される。

したがって、本発明インシュリン類似物質は、該当するインシュリン類似物質の 前駆体をエンコードするＤＮＡ配列を、適当な普通培地中で形質転換酵母菌株を 培養した時に、酵母へ移すと、次式Ｉニ ーＲｎ　　−Ｒ’　　−（Ｉ） （式中、Ｒはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、ｎはＯ〜３３の整 数であり、Ｒ′はＬｙｓまたはＡｒｇである。）で表わされるペプチド結合また はペプチド鎖によりＬｙｓＢ２９が（ｉｌｙＡ２１　に接続しているインシュリ ン類似物質の前駆体を発現し分泌しうる適当な酵母発現ビヒクルへ挿入すること により調製されうる。次いで前駆体を培養ブロスから回収し、米国特許第４３４ ３８９８号明細書（この記載は参考のためにここに編入する）に記載されている のと同じように、水と有機溶媒の混液中で触媒としてｌ・リプシンまたはトリプ シン様酵素を用いて、次式■： Ｑ−ＯＲ”　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｕ）Ｃ式中、Ｑは８３０位 に挿入されるべきアミノ酸残基、好ましくはＴｈｒであり、そしてＲ１１はカル ボキシ保護基（たとえばメチルまたはｔｅｒ　ｔ−ブチル基）である。）で表わ されるアミノ化合物と反応させ、その際カルボキシ保護基を除去し、そしてイン シュリン類似物質を反応混合物から単離する。

インシュリン類似物質はまたヨーロッパ特許出願第８６３０２１３３．３号に記 載されたと同じ方法により調製され、この記載はここに参考のために編入される 。この方法により一対の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、　Ａｒｇ）からなるＡ鎖およ びＢ鏡開の橋を存するタイプのインシュリン前駆体が酵母中で作られ次いで酵素 転化によりインシュリンへ転化される。

本発明インシュリン類似物質は、当該技術でこれまで公知のインシュリン製剤に おいてヒトまたはブタインシュリンに置き代えられるべきインシュリン活性を有 する新規インシュリン製剤の調製に使用されうる。このような新規インシュリン 製剤は、好ましくは中性ｐＨにて水溶液または懸濁液中で本発明によるインシュ リン類似物質または薬剤上許容されうる塩を含む。水性媒体はたとえば塩化ナト リウム、酢酸ナトリウムまたはグリセロールを用いて等張化される。さらに、水 性媒体は亜鉛イオン、酢酸塩およびクエン酸塩のような緩衝液およびｍ−クレゾ ール、メチルパラベンまたはフェノールのような保存剤を含んでもよい。製剤の ｐＨ値は所望の値に調節される。インシュリンは滅菌濾過により滅菌される。

本発明インシュリン製剤は公知インシュリン製剤の使用と同様に使用されうる。

朋−亘 アミノ酸で使用される略語は、Ｊ、Ｂｉｏｌ’、Ｃｈｅｍ、、　２４３（１９６ ８）。

３５５８に記されているものである。アミノ酸はＬ型装置である。

特記しない限り、ここに記載したインシュリンの種類はヒトである。

以下のテキストで使用されるようにＢ（１−２９）はＢ（１）ＰｈｅからＢ　（ ２９）　Ｉｙｓまでのヒトインシュリンの短かいＢ鎖であり、Ａ（１−２１）は ヒトインシュリンのＡ鎖を意味する。

本発明の実施にしたがってヒトインシュリン分子において行なわれる置換基は、 ヒトインシュリンに関連した接頭語で示される。例として、Ｇｌｕ（Ｂ３）　　 ヒトインシュリンは、Ｂ鎖における位置３のＡｓｎに対しＧｌｕが置換されたヒ トインシュリン類似物質を意味する。Ｇｌｕ（Ｂ　３　）、　　Ｂ　（１−２９ ）　−Ａｌａ　−八１ａ−Ｌｙｓ−Ａ（１２１）ヒトインシュリンは、短かいＢ 鎖（上記参照）における位置３のＡｓｎに対しＧｌｕが置換され、Ｂ（１−２９ ）鎖およびＡ鎖（Ａ（１−２１））をペプチド配列へ］ａ−Ａｌａ−Ｌｙｓによ り接続したインシュリン類似物質の前駆体を意味する。特記しない限り、Ｂ（１ −２９）鎖とＡ（１−２１）鎖は、ヒトインシュリンにおけるようにそれぞれＡ （７）ＣｙｓとＢ（７）Ｃｙｓ間およびＡ　（２０）ＣｙｓとＢ　（１９）Ｃｙ ｓ間のジスルフィド橋により接続しておりそしてＡ鎖がＡ（６）ＣｙｓとＡ（１ １）Ｃｙｓ間に内部ジスルフィド橋を有することと理解されるべきである。

詳細な記載 インシュリン類似物質の前駆体をエンコードする遺伝子は、部位特異的突然変異 誘発により相当するヒトインシュリン前駆体をエンコードする遺伝子を修飾し所 望の突然変異をエンコードするコドンで置換するかまたは挿入することにより調 製される。インシュリン類似物質の前駆体をエンコードするＤＮＡ配列はまたイ ンシュリン類似物質前駆体遺伝子の全部または一部に相当するオリゴヌクレオチ ドから酵素合成によっても作られる。

所望の突然変異を有する遺伝子を含むＤＮＡ配列は次いで適当なプロモーター配 列たとえばＴＰ！プロモーター（ＴＰ　Ｉ　ｐ＞をコードするフラグメント（テ ィ、アルバーおよびシイ、カワサキ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒｉｏｓｅ　ＰｈｏｓｐｈａｔｅＩｓｏｍｅｒａｓｅ　Ｇｅ ｎｅ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、　Ｊ、Ｍｏ １．ＡｐｐｌｉｅｃｆＧｅｎｅｔ．　Ｈ１９８２），　４１９−４３４）、適当 なリーダー配列および可能ならば転写末端配列たとえばサノ力口ミセス　セレヴ イシアエのＴＰＩからのもの（ＴＰＩＴ）と組合わせられる。これらのフラグメ ントは配列に前駆体エンコード遺伝子に対する高い割合の転写を確実にしならび に前駆体の分泌経路への局在化とその結果としての増殖培地への排出を行ないう る予備配列を提供する。さらに発現単位は複製の酵母原株たとえば２μ原株およ び選択可能なマーカーたとえばＬＥＵ　２を備えている。

本発明の目的のために、エル．チムＬ．Ｔｈｉ＋ｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｅ．八 ｃａｄ．Ｓｃｉ＋　ｔｌｓＡ．ξ！３（１９８６），　６７６６−６７７０およ びジエイ．マノレク・ノセンＪ．Ｍａｒｋｕｓｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｈ１９８７），　２１５−２２３に記載のように１０個の オリゴヌクレオチドを連結して問題のインシュリン類似物質前駆体をエンコード する遺伝子を作り続いてこの遺伝子を酵母発現プラスミドヘ挿入ずる。

例　　１ Ｇｌｕ（Ａ１５），　Ａｓｐ（Ａ１８），　Ａｓｐ（Ｂ　３）　ヒトインシュリ ンの産生前駆体Ａｓｐ（　Ｂ　３　）　Ｂ　（　１　−２９）−Ａｌａ，八Ｉａ −Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（Ａ１５），八ｓｐ（Ａ１８），　Ａ（１−２１）に対する合 成遺伝子は、連結により１０個のオリゴヌクレオチドから構築された。オリゴヌ クレオチドは、調整された多孔性ガラス支持体中でホスホロアミダイト化学を用 いて自動ＤＮＡ合成機中で合成された（ビューケージ．エス．エル．　Ｂｅａｕ ｃａｇｅ，　Ｓ．Ｌ．およびカルーザーズ，エム．エソチＣａｒｕｔｈｅｒｓ． 　Ｍ．Ｈ．　Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２（１９８１）＋１ ８５９−１８６９）。合成遺伝子は次のようである：ｒ，Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　 Ａ　ｃ　Ａ　ＩＩ；　Ｇ　Ｔ　Ｔ丘■ヒ匹Ａ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ 　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ａ　`　ｃ　ａ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｃ 　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｃ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　−ＣＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧ＾ ＾ＧＡＴＧＴＧＡＧＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧＡＴＴＣＣＣＡＴＡＡＣＡＧＣＴＴＧ ＴＴＡＣＧ−ＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＴＡＣＧＡＡ〒ＴＧ ＧＡＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＧＡＣＧＣＡＧＣＣ−ＡＣＡＴＧＧＡＧＧ ＴＡＧＡＣＧＡＧＧＡＡＣＡＴＧＣＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＣＧＴＴＧ ＡＴＣＴＧＣＧＴＣＧＧ−Ｘｂａｌ ＤＮＡ配列上の文字および数字は、それぞれＡ鎖およびＢ鎖における相当するア ミン＃Ｉ残基（１文字表記を用いる冫およびその位置を示す。配列ＡｌａＡ１ａ ＬｙｓはＡ鎖およびＢ鎖の間橋である．ならびに合成遺伝子におけるエンドヌク レアーゼ制限部位が示される。

合成遺伝子は、肝α１シグナルおよびリーダー配列（１−８５）をコードするブ ラスミドｐＫＦＮ　９からの３３０ｂｐ　ＥｃｏＲ　Ｉ　−Ｈｇａ　１フラグメ ントおよびｐＵｃ１９からの大きなＥｃｏＲ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントと 連結された． 肝αｌリーダー配列直後のＨｇａ　１部位を含むｐＫＦＮ　９の構築はヨーロッ パ特許出願第０２１４８２６号に記載されている。

連結混合物を用いてアンピシリン耐性を選択するコンビテント大腸菌株（ｒ−， ｍ”）を形質転換する。”　Ｐ　−Ｘｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲ　Ｉフラグメントの 配列化（マクサム．エー．　Ｍａｘａｍ＋　Ａ．およびギルハート，ダブリュ． 　Ｇｉｌｂｅｒｔ，　Ｗ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｚｙｍｏＪ．６５（１９８ ０），　４９９−５６０）は、得られたコロニーからのプラスミドが正しいＤＮ Ａ配列を含むことを示した。

１つの正確なプラスミドが別の使用のために選択されそしてＥｃｏＲ　Ｉおよび Ｘｂａ　Ｉで切断される。ＥｃｏＲ　Ｉ　−Ｘｂａ　ｌフラグメントをｐＭＴ６ ３６からの９．　５　ｋｂ　Ｎｃｏ　Ｉ　−Ｘｂａ　ＩフラグメントとｐＭＴ６ ３６からの１．　４　ｋｂ　Ｎｃｏ　１　−ＥｃｏＲ　Ｉフラグメントと連結し た。プラスミドｐＭＴ６３６の構築はＷＯ特許出願第８９／０１９６８号に記載 されている。これはＳｃｈｉｚｏ．ｐｏｍｂｅ　ＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）　、サ ソヵロ工一ト　イソメラーゼプロモーターおよびターミネーター、ＴＰＩｐおよ びＴＰｈを含む゛（アノレハー．テイ．八ｌｂｅｒ　Ｔ．およびカワサキ，ジ− ｔ．　Ｋａ１１ｌａｓａｋｉ，　Ｇ．，　Ｊ．Ｍｏ１．ＡｐｐｌＧｅｎ．１（１ ９８２）．４１９−４３４）。

得られたブラスミドは次の配列をエンコードするＴＰＩ，〜肝α１−シグナルー リーダー（１−８５）一前駆体遺伝子−ＴＰＩＴ （式中、ＭＦαｌはサノカロミセス　セレビシアエ（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）肝α１コード配列（クルジャン，ジェイ，　Ｋｕｒｊａｎ，　Ｊ．およびヘ ルスコウィッッ，アイ．　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ＋　１．，　Ｃｅｌｌ　３０（ １９８２）＋９３３−９４３）であり、ジグナルーリーダー（１−８５）は肝α ｌシ？ナルーリーダー配列の最初の８５個のアミノ酸残基を含むことを意味する 。） サソ力口ミセス　セレヴイシアエ（Ｅ２−７Ｂ　ＸＥＩＩ−３６　ａ／　ｃｘ， Δｔｐｉ　Δｔｐｉ，　ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３）はＹＰＧａＬ（　１％バ クト酵母抽出物、２％バタトベプトン、２％ガラクトース、１％ラクテート）中 で増殖して６００ｎｍでの０．０．０．６までとした。

培養物１００ｄを遠心分離により採取し、水１０戚で洗浄し、再度遠心分離し、 そして１，２Ｍソルビトール、２５ｍＭ　Ｎａｚ　ＥＤＴＡｐＨ８．０と６．７ ■／成ジチオトレイトールを含む溶液１０ｄ中で再懸濁する。懸濁液を１５分間 ３０゜Ｃにてインキユベートし、遠心分離し、そして細胞を１，２Ｍソルビトー ル、１０ｍＭ　Ｎａｇ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝５．８ および２■ノボザイムＮｏνｏｚｙｍ　＠　２３４を含む溶液１０ｄ中に再懸濁 した。懸濁液を３０゜Ｃで３０分間インキユベートし、細胞を遠心分離により集 め、１．２Ｍソルビトール１０戚とＣＡＳ（　１．　２　Ｍソルビトール、１　 ０ＲＩＭＣａＣ１２、１０ｍＭ　｝リスーＨＣＩ（｝リス＝トリス（ヒドロキシ メチル）アミノメタン）　ｐＨ＝　７．　５　）　１０ｄ中で洗浄し、ＣＡ８２ Ｉｄ中に再懸濁する。形質転換のためにＣＡＳ一再懸濁細胞０．　１　ｄを上述 のプラスミドのほぼ１犀と混合し、室温で１５分間放置した。　（２０％ポリエ チレングリコール４０００、１０ｍＭ　ＣａＣ１■、１０１トリスー｝ＩＣＩ　 、ｐＨ＝７．　５　）　　１　ｄを加え、混合物をさらに３０分間室温で放置し た。混合物を遠心分離し、ペレットをＳＯＳ（　１．　２　Ｍソルビトール、３ ３％ｖ／ｖＹＰＤ、６．　７　ｍＭ　ＣａＣ１ｔ、１４ｎ／ｍｌロイシン）０． １ｄ中に再懸濁し、３０゜Ｃで２時間インキユベートした。次いでトップ寒天（ 　１．　２　Ｍソルビトール＋２．５％寒天を含むシェアマンＳｈｅｒｍａｎら のＳＣ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８１）６ｄ、５ ２°Ｃを加え、懸濁液を同じ寒天固化ソルビトール含有培地を含むプレート表面 へ注入した。形質転換体コロニーを３０°Ｃで３日後に捨い、再度単離しそして 出発液体培養物として使用した。

形質転換菌株を３０°Ｃにて１５００ｆタンク中ＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、 ２％ペプトン（ディフコ　ラポラトリイ社製）および２％グルコース）中で増殖 した。発現生成物を培養ブロスから単離した。収率は４０．３ｍｇ／ｌであった 。

ペプチド転移化 ０．２モル（４７，１ｇ　）Ｔｈｒ−Ｍｅｔ、　ＨＯＡＣをＤＭＦ中に溶かして １０〇−溶液とし、７６．５％ｗ　／　ｖ　ＤＭＦ水溶液５０−を加え、粗製の 八５ｐ（Ｂ　　３　）、　　　Ｂ　（１−２９）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇ ｌｕ（Ａ１５）、　　八５ｐ（Ａ１８）Ａ（１−２１）　ヒトインシュリンＬｏ ｇを混合物中に溶かし、これをサーモスタットで１２°Ｃに調節した。次いで０ ．０５Ｍ酢酸カルシウム２５ｄ中のトリプシン１ｇを加え、２４時間後１２°Ｃ にて混合物をアセトン２Ｉ！、へ加え、沈でんしたペプチドを遠心分離により単 離し、減圧乾燥した。Ｇｌｕ（Ａ１５）、八５ｐ（Ａ１８）。

八５ｐ（Ｂ　３）、　　Ｂ２ＯＴｈｒ−ＯＭｅヒトインシュリンをカラム材料と してシリカ−Ｃ１８を用いた調製用ＨＰＬＣカラム中で調製した。

Ｇｌｕ（Ａ１５）、　Ａｓｐ（ＡｌＢ）、　Ａｓｐ（Ｂ　３）、　　Ｂ２ＯＴｈ ｒ−ＯＭｅヒトインシュリンを水に分散させて１％ｗ　／　ｖとし、ＩＮ水酸化 ナトリウムを添加してｐ）Ｉ値１０．０にすることにより溶解した。ｐＨ値を２ ５°Ｃで２４時間１０．０のままに保つ。形成されたＧｌｕ（Ａ１５）。

Ａｓｐ（Ａ１８）、　Ａｓｐ（Ｂ　３）　　ヒトインシュリンは、塩化ナトリウ ム約８％（ｗ／ｖ）、酢酸ナトリウム三水和物約１．４％（Ｗ／Ｖ）および酢酸 亜鉛二水和物約０．０１％（ｗ／ｖ）を加え続いてＩＮ塩酸をｐＨ５，５まで加 えることにより沈でんした。沈でん物は遠心分離により単離し陰イオン交換クロ マトグラフィにより精製しそしてゲル濾過により脱塩化した。収量二Ｇｌｕ（Ａ １５）、　Ａｓｐ（Ａ１８）、　Ａｓｐ（Ｂ　３）　　ヒトインシュリン２．４ ０ｇ。

例２ Ｇｌｕ（Ａ１８）、　Ｇｌｕ（Ｂ　３）、　Ａｓｐ（ＢＩＯ）　　ヒトインシュ リンの調製前駆体Ｇ］、ｕ（Ｂ　３）、　Ａｓｐ（ＢＩＯ）　−Ａｌａ−Ａｌａ −Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（Ａ１８）Ａ（１−２１）をエンコードする合成遺伝子は、例 １に記載のように調製された。遺伝子は次の配列を有する：ＡＴＴＣＧＴＴＧＡ ＡＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡ　ＡＧＣＴＴ ＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣ−ＧＣＡＡＣＴτＧＴＴＧＴＧＡ　ＡＣＡＣＧＣ ＣＡＡＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＴＣＧ　ＡＡＡＣＡＴＧＡ　ＡＣＣＡ　Ａ　 ＡＣＧ　−ｂａ　Ｔ ＤＮＡ配列上の文字および数字は、Ｂ−およびＡ−鎖Ｇこおける相当するアミノ 酸残基（１文字表記を用し）て）とその（立置をそれぞれ示す。配列ＡＩａＡ、 ＩａＬｙｓはＡ−およびＢ鎖の間の橋である。また合成遺伝子におけるエンドヌ クレアーゼ１１限部位も示されている。

合成遺伝子は例１に記載されたように酵母形質転換体プラスミドへ挿入された。

酵母の形質転換および形質中云換された酵母菌株の培養は例１に記載のように行 なわれた。前馬区体の収量は８７．３ｄ／Ｎであった。前駆体をペプチド転移イ ヒしそして例１と同じ方法により上記最終生成物へ転化した。Ｇｌｕ（ＡｌＢ） 。

Ｇｌｕ（Ｂ３）、＾５ｐ（ＢＩＯ）　ヒトインシュリンの収量側よ１７．７３ｇ でＧｌｙ（Ａ２１）、　Ｇｉｎ（Ｂ　３）　　ヒトインシュリンの調製前駆体Ｇ ｉｎ（Ｂ　３）　Ｂ　（１−２９）　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（Ａ２ １）Ａ（１−２１）の合成遺伝子は例１に記載のように構築された。

合成遺伝子は次の配列を有する： ＤＮＡ配列の上の文字および数字は、Ｂ鎖およびＡ鎖において、それぞれ相当す るアミノ酸残基（１文字表ｇ己を用０て）およびその位置を示す、配列ＡｌａＡ ＩａＬｙｓ　ＬよＡ鎖およびＢｉ貞間の橋である。また合成遺伝子におけるエン ドヌクレアーゼ−１限部位も示される。

合成遺伝子は例１に記載のように酵母形質転換ブラスミドヒトインシュリンの収 量は０．３１ｇであった。

橋である。また合成遺伝子におけるエンドヌクレアーゼ制限部位も示される。

合成遺伝子を例１に記載のように酵母形質転換プラスミドへ挿入した。酵母の形 質転換および形質転換された酵母菌株の培養は例１に記載のように実施された。

前駆体の収量は７゜３■／２であった。前駆体はペプチド転移を受けそして例１ と同じ方法により上記最終製品へ転化された。旧５（Ａ１８）。

５ｅｔ（Ａ２１）、　Ｔｈｒ（Ｂ　３）ヒトインシュリンの収量は０．７９ｇで あった。

フェノールとグリセロールを含む上記インシュリン類似物質の中性溶液は３７゛ Ｃにて４週間貯蔵後室定性について試験された。参考としてヒトインシュリンの 亜鉛不含有中性溶液および速効性インシュリン＾５ｐ（ＢＩＯ）　　ヒトインシ ュリンを使用した。脱アミド生成物の％は）ＩＰＬＣにより測定した。結果は次 の表から明らかである。

Ｇｉｕ（Ａ２５）、　Ａｓｐ（Ａ１８）、　Ａｓ９（Ｂ　３）　ヒトインシュリ ン　　　０，７Ｇｌｙ（Ａ２１）、　Ｇｌｎ（Ｂ　３）　　ヒトインシュリン　 　　　　　　　　０．３）１ｉｓ（Ａ３Ｂ）、　５ｅｔ（Ａ２１）、　Ｔｈｒ（ Ｂ　３）ヒトインシュリン　　　０．７Ａｓｐ（ＢＩＯ）　　ヒトインシュリン （参考）３．２表１における結果から本発明によるインシュリン類似物質が参考 化合物よりデアミデート化が著しく低く、それゆλ−貯蔵ついて試験した。結果 を次表に示す。

−、リヘルＵ、Ｒ４ｂｅｌら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　 Ｃ１１ｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ、　５ｕｐｐ、１〜ｖｏ１．５．　ｐｏｓ、 ００３−３．１９８８）。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年１１月ｑ　日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＤＫ８９１００１１７ ２　発明の名称 インシュリン類似物質 ３　特許出願人 住所テンマーク国、デーコー−２８８０バグスバエルト。

ノボ　アレ（番地なし） 名　称　ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスヵブ４代理人 ５　補正書の提出年月日 請求の範囲 １１位置Ｂ３におけるＡｓｎが別の天然産生アミノ酸残基により置換され、さら に少なくとも位ＷＡ５もしくはＡ１５におけるＧｉｎまたは位置Ａ１８もしくは Ａ２１におけるＡｓｎが別の天然産生アミノ酸残基により置換されそして場合に より位置Ｂ４におけるＧｉｎもまた別の天然産生アミノ酸残基により置換されて もよいヒトインシュリン類似物質。

２、位ＩＦＢ３およびＡ１８におけるＡｓｎが別の天然産生アミノ酸残基により 置換された請求項１に記載のヒトインシュリン類似物質。

３、　Ｂ３およびＡ２１におけるＡｓｎが別の天然産生アミノ酸残基により置換 された請求項１に記載のヒトインシュリン類似物質。

４、位置Ｂ３およびＡ２１におけるＡｓｎおよび位置Ａ１５におけるＧ］ｎが別 の天然産生アミノ酸残基により置換された請求項Ｉに記載のヒトインシュリン類 似物質。

５、位置Ａ１Ｂ、Ａ２１およびＢ３におけるアミノ酸残基置換がＧｌｕ、八ｓｐ 、　Ｈｉｓ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ＋　Ａｌａ、 　Ｍｅｔ。

Ｔｒｐ、　Ｔｙｒ、　ＧｌｙおよびＧｉｎからなる群から選択され、そして位置 Ａ５．Ａ１５およびＢ４におけるアミノ酸残基置換がＧｌｕ。

ヒトインシュリン類似物質。

６、位置Ｂ３におけるアミノ酸残基がＡｓｐ、　Ｇｉｎ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒま たはＧｉｎである請求項１に記載のヒトインシュリン類似物質。

７、　前記の請求項のいずれかに記載のインシュリン類似物質またはその薬剤上 許容されうる塩を含むインシュリン活性を有するインシュリン製荊。

Ｂ、　　ＬｙｓＢＺＱが次式Ｉニ ーＲｎ　−Ｒ’　−（Ｉ） （式中、Ｒはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、ｎは０〜３３の整 数であり、Ｒ’　はＬｙｓまたはＡｒｇである。）で表わされるペプチド結合ま たはペプチド鎖によりＧ］ｙＡｌに結合したインシュリン類似物質の前駆体をエ ンコードするＤＮＡ配列を含む複製可能な発現ビヒクルで形質転換された酵母株 を適当な普通培地で培養し、前駆体を培養ブロスから回収し、次式■： Ｔｈｒ−ＯＲ”　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｕ　）（式中、Ｒｒｒが カルボキシ保護基である。）で表わされるアミノ化合物と、水および有機溶媒の 混液中で触媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵素を用いて反応させ、その 後カルボキシ保護基を加水分解により除去することからなる請求項１に記載のヒ トインシュリンの調製方法。

国際調査報告 一一一一−ＡＨｋ株−ｍ、ＰＣＴ／Ｄに８９１００１１７１＋ＬＭ＋１１１１６ ＋１゜。ｌ１１３５５、□。　ＰＣＴ／ＤＫ８９１００１１７

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．Ａｓｎが位置Ａ１８，Ａ２１およびＢ３の１つ以上に存在せず、および／ま たはＧｌｎが位置Ａ５，Ａ１５およびＢ４の１つ以上に存在せず、ただし位置Ａ ２１のアミノ酸残基がＡｓｎと異なる場合、位置Ａ１５，Ｂ４またはＡ５のアミ ノ酸残基の１つはＧＩｎと異なるかまたは位置Ａ１８またはＢ３のアミノ酸残基 の１つはＡｓｎと異なり、そしてただし位置Ａ５のアミノ酸残基がＧｌｎと異な る場合、位置Ａ１５またはＢ４のアミノ酸残基の１つがＧｌｎと異なるかまたは 位置Ａ１８，Ａ２１もしくはＢ３のアミノ酸残基の１つがＡｓｎと異なることを 特徴とするインシュリン類似物質。
2. ２．Ａｓｎが位置Ａ１８，Ａ２１およびＢ３の１つ以上に存在しないか、および ／またはＧＩｎが位置Ａ１５および／もしくはＢ４に存在しない請求項１に記載 のインシュリン類似物質。
3. ３．Ａｓｎが位置Ａ１８，Ａ２１およびＢ３の１つ以上に存在しない請求項１に 記載のインシュリン類似物質。
4. ４．Ａｓｎが位置Ｂ３とＡ１８に存在しない請求項１に記載のインシュリン類似 物質。
5. ５．Ａｓｎが位置Ｂ３とＡ２１に存在しない請求項１に記載のインシュリン類似 物質。
6. ６．Ａｓｎが位置Ｂ３に存在しない請求項１に記載のインシュリン類似物質。
7. ７．Ａｓｎが位置Ｂ３とＡ２１に存在せずそしてＧｌｎが位置Ａ１５に存在しな い請求項１に記載のインシュリン類似物質。
8. ８．位置Ａ１８，Ａ２１またはＢ３におけるアミノ酸残基の１つ以上がＧＩｕ， ＡｓＰ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，ｌｌｅ，Ａｌａ，Ｍｅｔ， Ｔｒｐ，Ｔｙｒ．ＧｌｙまたはＧｌｎであり、および／または位置Ａ５，Ａ１５ およびＢ４におけるアミノ酸残基の１つ以上がＧｌｕ，Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ ，Ｔｈｒ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，ｌｌｅ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，ＴｒＰ，ＴｙｒまたはＧ ｌｙである請求項１に記載のインシュリン類似物質。
9. ９．位置Ｂ３におけるアミノ酸残基がＡｓｐ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＧ ｌｕである請求項１に記載のインシュリン類似物質。
10. １０．前記請求項のいずれかに記載のインシュリン類似物質またはこれらの薬剤 上許容されうる塩を含むインシュリン活性を有するインシュリン製剤。
11. １１．次式１： −Ｒｎ−Ｒ１−（Ｉ） （式中、Ｒはｎ個のアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、ｎは０〜３３の整 数であり、Ｒ１はＬｙｓまたはＡｒｇである。）で表わされるペプチド結合また はペプチド鎖によりＬｙｓＢ２９がＧｌｙＡ１に結合しているインシュリン類似 物質の前躯体をエンコードするＤＮＡ配列を含む複製可能な発現ビヒクルで形質 転換された酵母株を適当な普通培地中で培養し、前駆体を培養ブロスから回収し 、そして水を有機溶媒の混液中で触媒としてトリプシンまたはトリプシン様酵素 を用いて、次式ＩＩ：Ｑ−ＯＲ′′（ＩＩ） （式中、ＱはＢ３０位にて挿入されるべきものであるアミノ酸残基好ましくはＴ ｈｒであり、Ｒ′′はカルボキシ保護基である。）で表わされるアミノ化合物と 反応させ、その後加水分解によりカルボキシ保護基を除去することからなる請求 項１に記載のヒトインシュリンの調製方法。