PT90939B

PT90939B - Processo para a preparacao de mini-proinsulina

Info

Publication number: PT90939B
Application number: PT90939A
Authority: PT
Inventors: Paul Habermann; Eugen Uhlmann; Michael Dorschug; Gerhard Seipke
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-06-23
Filing date: 1989-06-22
Publication date: 1994-11-30
Also published as: FI102076B1; NO892597D0; HK1006023A1; ATE101620T1; HUT52548A; DK309989A; AU611303B2; HU211552A9; IL90694A0; KR910000796A; IE62511B1; NO892597L; PT90939A; FI893046A0; NZ229645A; NO302376B1; ES2061797T3; AU3671889A; EP0347781A2; DK309989D0

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIEN GESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Michael Dor£ chug, Dr. Paul Habermann, Dr. Gerhard Seipke e Dr. Eugen Uhlmann, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE I.IINI-PROINSULINA.

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma nova mini-proinsulina na qual a cadeia B não encurtada se encontra ligada à cadeia A através de um resíduo de arginina. A partir desta mino-proinsu lina é possível obter a Insulina humana sem ser necessário pro. ceder a reacçóes químicas complicadas.

São conhecidas mini-proinsulinas com uma cadeia G encurtada. Por exemplo R. Y/etzel et al. , Gene 16 (1981), 63 - 71, descreveu uma proinsulina com uma cadeia C en curtada em 6 ácidos aminados. A partir do pedido de Patente Eu ropeia com o número de publicação (EP-A) 0 055 945 são conheci das proinsulinas com a cadeia C encurtada num máximo de seis ácidos aminados.

A partir da EP-A 0 163 529 são conhecidos precursores da insulina com uma cadeia B encurtada cu1

ja cadeia C está completamente ausente ou está presente mas en curtada num máximo de um ácido aminado. Estes precursores sao transformados em ineulina humana madura por transpeptidação com um éster de c^-treonina catalisada por tripsina.

Em oposição às formas descritas, a presente invenção refere-se a des-(32-65)-proinsulina humana ou a mini-proinsulina da fórmula I

B(1-30)-Arg-A(1-21) (I), na qual B(l-30) e A(l-21) significam as cadeias B e A, respectivamente, da insulina humana. Este composto pode ser utilizado não apenas como produto intermediário para a preparação de insulina-humana-Arg ^J -OH, em seguida denominada por mono-Arg-insulina”, a qual é conhecida das publicações de Patente Europeia (EP-B) 0 132 769 θ 0 132 770, mas também como insulina humana, uma vez que ele próprio apresenta uma indiscutível actividade de insulina.

A presente invenção refere-se por conseguinte também a um processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de Diabetes mellitus por incorporação de um composto da fórmula I eventualmente em conjunto com uma substância veicular farmacologicamente acei tável.

Para além disso a presente invenção refere-se a um processo para a preparação do composto da fórmula II

S-S

I I

A(1 - 21)

I I

S - S (II), ι l s - s I I

B(1 - 30) - Arg na qual A(l-21) e B(l-30) possuem os significados anteriormente definidos e as pontes -S-S- estão dispostas como na insulina e de insulina humana caracterizado por se cindir um composto da fórmula I por via enzimática. É especialmente vantajosa a transformação imediata do composto da fórmula I em insulina numa reacção realizada sem mudança de reactor.

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação do composto da fórmula I caracteriza do por se exprimir numa célula hospedeira, de preferência numa bactéria como E. coli ou numa levedura, especialmente em Saccharomyces cerevisiae, uma estrutura genica que codifica para este composto e, no caso de a estrutura genica codificar para uma proteína de fusão, se libertar o composto da fórmula I a partir da proteína de fusão. A presente invenção refere-se além disso a sequência de AON que codificam para o composto da fórmula I, a estruturas génicas ou a plasmídeos que contém estes ANN’s, bem como a células hospedeiras, especialmente bactérias como E. coli ou células de leveduras, principalmente leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que contêm estas estruturas génicas ou estes plasmídeos. A presente invenção refere-se ainda a proteínas de fusão que contêm um composto da fórmula I, de preferência proteínas de fusão nas quais o composto da fórmula I se encontra ligado na fracção de balastro da proteína de fusão através de uma cadeia da fórmula

- Met - Ile - Glu - Gly - Arg

Em seguida elucidam—se mais em pormenor outras formas preferidas de concretização da presente inven ção.

As figura destinam-se a elucidar os Exemplos, apresentando a Figura 1 ( e a sua continuação nas Figuras la e lb) a construção dos vectores de expressão de E. coli pIKlO e pS¥0 e a Figura 2 (e a sua continuação nas Figuras 2a e 2b) a construção dos vectores de expreesão de leveduras p <xufBlO2 e p<?<BlO4. Estes vectores codificam para a mini-proinsulina.

Verificou-se agora que a mini-proinsu lina apresenta o modo correcto de dobragem de tal modo que após cisão com tripsina se obtém mono-Arg-insulina de modo quase quantitativo. Estabeleceu-se também um processo surpreendentemente simples para a preparação de mono-Arg-insulina. A partir desta é possível preparar insulina humana por um método conhe5 eido em si. Para além disso, a mono-Arg-insulina pode servir de substância activa em medicamentos (EP-B 0 132 769).

Na EP-A 0 229 998 descreveu-se o vector de expressão pk50. A mini-proinsulina pode ser preparada sob a forma de uma proteína de fusão correspondente a esta construção numa bactéria como E. coli.

A proteína de fusão dificilmente solúvel pode ser concentrada por lavagem com soluções tampão neutras. Por cisão com um halogeneto de cianogénio (E. Gross e B. Wittkop, J. Am. Chem. Soc. 82 (1961) 1510-1517) liberta-se a mini-proinsulina. Esta não se apresenta ainda sob a forma biologicamente activa; pelo contrário a mini-proinsulina é constituída por uma mistura não uniforme com diferentes pontes de dissulfureto inter e intramoleculares, eventualmente também com outros fragmentos proteioos. Como entidade química relativamente estável prepara-se o derivado sob a forma de S-sulfona to de molécula (P. G. Katsoyannis et al., Biochemistry 6 (1967) 2635 - 2641)· Este derivado pode ser purificado facilmente por cromatografia de permuta iónica e é uma matéria prima apropria da para a dobragem na estrutura espacial nativa com estabeleci mento das pontes de dissulfureto correctas (Y. C. Du et al., Sei. Sin. 15 (1965) 229 - 236; Η. P. Gattner et al., Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 362 (1981) 1943-1049; B. H. Prank et al. em Peptides: Synthesis-Structure-Punction”, D. H. Rich e E. Gross, Hrsg., (1981) 1043 — 1049). A efectivaçêo desta dobragem é verificada por meio de análise de HPLC dos fragmentos após cisão com protease V8 de S. aureus (U. Grau, Diabetes 34 (1985) 1174 - 1180).

A libertação da mono-Arg-insulina ou da insulina por acção da tripsina ou da carboxipeptidase B ou por meio de enzimas com actividade semelhante (W. Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246 (1971) 2780 - 2795) decorre sem qualquer complicação, sendo para tal especialmente vantajoso que o número de possíveis locais de cisão seja reduzido em comparação com a proinsulina normal. Deste modo a cisão torna-se consideravelmente facilitada (em relação à formação de produtos secundários como na preparação de des-B30-insulina ou de desocta-B23-B30-insulina). Tanto a mono-Arg-insulina como também

a insulina podem ser isolados numa forma muito pura de modo co-, nhecido em si por cromatografia de permuta iónica. A formação . da insulina e do derivado mono-Arg, o decurso da purificação e i a qualidade do produto final são verificados por processos de HPLC de fase invertida habituais (G. Seipke el al., Angew. i

Chem. 98 (1986) 550 - 548).

De modo surpreendente na cisão da mini-proinsulina, ao contrário do que acontece com a proinsulina natural, a formação de insulina-des-^50 ocorre em grau muito reduzido. Uma vez que este produto é muito difícil de separar da insulina, torna-se preferível na obtenção da insulina a partir de proinsulina natural o processo da reacção em dois reactores, isto é, o produto principal da cisão triptica, insulina- Arg®Arg⁵³² e a mono-Arg-insulina são em primeiro lugar separados da insulina-des-B50 por permuta iónica de um modo conhecido em si e em seguida cindidos por meio de carboxipeptidase b para dar a insulina humana (EP-B 0 195 691). Pelo contrário a mini-proinsulina pode ser transformada em insulina humana de modo ideal numa reacção num único reactor por utilização _Λ i simultânea de tripsina e de carboxipeptidase B ou por meio de enzimas de actividade equivalente.

A expressão do composto da fórmula I : em leveduras seguida de secreção é especialmente vantajosa, umai vez que o derivado de proinsulina com a dobragem correcta é iso] lado directamente. Para sistema hospedeiro selecciona-se uma levedura, como por exemplo na EP-A 0 248 227, nomeadamente por exemplo Pichia pastoris, Hansenula polymorphis, Schizosacchromyces pombe ou de preferência Saccharomyces cerevisiae.

Os vetores para a expressão em leveduras sao conhecidos em grande número. A preparação do derivado' de insulina de acordo com a presente invenção é descrita em seguida com respeito ao sistema do factor c* de insulina, o que, no entanto, se deve entender apenas como exemplificativo, uma vez que também podem ser usados outros sistemas de expressão de modo conhecido em si.

A estrutura do gene da feromona de le vedura hEPc* é conhecida a partir da publicação de Kurjan e Her skovitz, Cell 30 (1982) 955 - 945, onde também se discute a

- 5 ί\ possibilidade da expressão de outros genes e a secreção dos produtos génicos. A este respeito refira-se também Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984), 4642 - 4646.

Em alternativa pode usar-se um siste. ma de toxina destriidora (killertoxin) de levedura ou pode aproveitar-se a secreção através do sistema da fosfatase ou da invertase.

Como vectores de leveduras utilizam-ee com vantagem os vectores designados por lançadeiras (shuttle), os quais apresentam um plasmídeo bacteriano ou uma origem de replicação plaamídica de levedura bem como um gene ou genes para a selecção dos dois sistemas de hospedeiro. Para além disso estes vectores contêm a sequência do promotor nece£ séria para a expressão de genes estranhos e eventualmente para melhorar o rendimento de uma sequência de terminador, de tal modo que o gene heterólogo - de preferência fundido ao sinal de secreção - se encontra situado entre o promotor e o termina dor. Estes vectores são por exemplo descritos em US-A 4 766 073.

códigç genético é, como se sabe, degenerado, isto é, de tal modo que apenas dois ácidos aminados são codificados por uma única sequência nucleotídica, en quanto que os restantes 18 ácidos aminados codificáveis estão relacionados com dois a seis tripletos. Para a síntese do gene para a mini-proinsulina existe por conseguinte um grande número de combinações de codões que podem ser seleccionados. Verificou-se agora que a sequência I de ADN que codifica para a mi ni-proinsulina (que é reproduzido sob a forma dos dois fragmen tos génicos IG I (Quadro 1) e IK II (Quadro 2)) é especialmente vantajosa, uma vez que esta sequência se encontra optimizada com respeito à utilização de codões tanto de leveduras como também de E. coli.

Na extremidade 5’ da cadeia de codificação da sequência de AON I situa-se uma sequência de ADN saliente, que corresponde à endonuclease de restrição Kpnl. Na extremidade 3* da cadeia de codificação está saliente pelo contrário a sequência de cadeia simples correspondente à en- 6 -

zima de restrição HindIII. Estas duas sequências de reconhecimento diferentes garantem a inserção da sequência de AON I em plasmídeos na orientação pretendida. A seguir à sequência de codificação situam-se após o tripleto N-. 65 para a asparagina dois codões de terminação de tradução (stop codons”). Um local de corte interno singular para a enzima de restrição PstI (codão 41/42) possibilita a subclonagem dos dois fragmentos gé nicos, os quais podem ser incorporados em plasmídeos bem inve£ tigados, como o plasmídeo pUC18 ou derivados destes plasmídeos.

Adicionalmente incorpora-se no interior do gene estrutural uma série de outras sequências de reccr nhecimento singulares, as quais por um lado conduzem a um aumento para sequências parciais da proinsulina e por outro lado possibilitam a realização de mutações:

Enzima de restrição Ease após o nucleótido N².

(cadeia de codificação)

Accl	201
UralII	46
PnuLII	107
Hgal	105
HindIII	213
Hlnfl	17
Hpal	22
Hphl	76
Mael	155
MaelII	191
KboII	89
MluI	106
Ncol	207
NlalII	208
PvuII	175
Sall	201
Spel	154
Styl	207
Taql	202

A sequência de EDN I foi modificada ; em relação à sequência natural em pontos essenciais. Deste modo foi possível a introdução de numerosos locais de corte singulares para enzimas de restrição.

A sequência de ADN I pode ser consti tuida a partir de um total de 6 oligonucleótidos com um compri mento de cadeia de 47 a 96 unidades nucleotídicas. Leste modo procede-se conforme se descreve em seguida.

fragmento génico IK I (Quadro 1) pode ser constituído a partir de um total de 4 oligonucleótidos com um comprimento de cadeia de 47 a 74 unidades nucleótíctí. cas, por síntese química destes, em primeiro lugar, seguida de ligação enzimática de 3 nucleótidos nas extremidades coesivas (sticky ends”). As extremidades coesivas correspondem às da enzima de restrição DralII, o que é vantajoso para uma modificação posterior.

fragmento génico IK II (Quadro 2) é obtido a partir de dois oligonucleótidos preparados por síntese química com um comprimento de 88 e de 96 unidades nucleotídicas.

Exemplo 1

a) Síntese química de um oligonucleótido de cadeia simples

Com o exemplo do oligonucleótido NS.

(Quadro 1) elucida-se a síntese das unidades constituintes i

de ALN. Para a sintese em fase sólida utiliza-se o nucleósido ! que se situa na extremidade 3*, no caso vertente una adenina (nucleótido N⁹· 125) ligado a um suporte através da função 3’-hidroxi por meio de uma ligação covalente. 0 material de suporte é um vidro de poro controlado (controlled Pore Glaes” = = CPG·) funcionalizado por resíduos de aminoalquilo de cadeia longa. j j

Nas fases de síntese que se seguem utilizam—se os componentes das bases sob a forma do éster de

-cianoetilo de dialquilamida do ácido 5’-0-dimetoxitritilnuc leÓ8ido-3’-fosfórico, apresentando-se a adenina sob a forma do composto N^-benzoílo, a citoeina sob a forma do composto N^—benzoilo, a ganina sob a forma do composto N -isobutirilo e a timina sem grupo protector.

---- —vr !

n n ;

mg do suporte polimérico, que conj 4 z ¹ tém ligado 0,2 μιηοΐ de 5*-0-dimetoxi-tritil-N -benzoil-2’-de-! soxiadenosina, são tratados sucessivamente com os agentes seguintes:

A) Acetonitrilo

B) ácido tricloroacético a 3 £ eia diclorometano

C) Acetonitrilo

P) 5 umol do correspondente nucleósido-3’-0-fosfito e 25 /imol de tetrazol em 0,15 ml de acetonitrilo anidro

E) Acetonitrilo

P) 20 % de anidrido acético em tetra-hidrofurano com 40 / de lutidina e 10 % de dimetilaminopiridina

G) Acetonitrilo

H) 3 % de iodo em lutidina/água/terta-hidrofurano numa proporção em volume de 5:4:1

Por fosfito” entende-se na presente memória descritiva o éster mono-í^-cianoetílico do ácido 2*-de soxirribose-3’-monofosfórico, no qual a terceira valência se encontra saturada por um resíduo diisopropilamina. Os rendimen tos de cada fase de síntese podem ser determinados em cada caso de acordo com a reacçao de destritilação B) por via espectrof otométrica através da medida da absorção do catião dimetoxitritilo no comprimento de onde de 496 nm. j

Após terminada a síntese segue-se a i eliminação do grupo dimetoxltritilo conforme descrito em A) a C). Por meio de tratamento com amónia separa-se o ologonucleótido do suporte e simultaneamente eliminam-se os grupos |9-cia noetilo. Por meio de um tratamento de 16 horas dos oligómeros com amónia concentrada a 50°C separam-se quantitativamente os í grupos protectores de amina das bases. 0 produto bruto obtido i

deste modo é purificado por electroforese em gel de policarilamida.

De modo análogo preparam-se também ! os oligonucleótidos 1 a 3 (Quadro 1) e 5 e 6 (Quadro 2). ί

b) Acoplamento enzimátíco dos oligonucleótidos de cadeia simples

A fim de fosforilar os oligonucleóti- 9 dos na extremidade 5’-terminal tratam-se 1 jumol de eada um dos oligonucleótidos 1 e 4 com 5 pmol de trifosfato de adeno$ sina com 4 unidades de quinase de polinucleótido T4 em 20 μΐ de tampão de tris-HGl 10 mM (pH 7»6)» cloreto de magnésio 10 OM e ditiotreitol (DTT) 10 mM durante 30 minutos a 37°C. A enzima é desactivada por aquecimento durante 5 minutos a 95°C.

Os oligonucleótidos 2 e 3, que formam as sequências de cadeia simples salientes”, não são fosforiladas. Deste modo evita-se na ligação que se segue a formação de fragmentos génicos maiores.

Os oligonucleótidos 1 a 4 são ligados como se segue: hibridam-se alíquotas de 1 /umol de cada um dos oligonucleótidos 1 e 2 ou 3 e 4, aos pares, dissolvendo es tes em volumes de 20 fi.1 de tampão de tris’HCl 50 mí.í (pH 7,6), cloreto de magnésio 10 mH e DTT 10 mil, aquecendo estas soluções durante 5 minutos a 95°C e arrefecendo até à temperatura ambiente no espaço de 2 horas. Nesta operação utilizam-se os oligonucleótidos 1 e 4 sob a forma dos seus 5’-fosfatos. Para acoplamento dos fragmentos de ADN bi-helicoidais formados reunem-se as soluções dos mesmos, aquece-se durante 15 minutos a 60°C e arrefece-se à temperatura ambiente. Em seguida adiciona -se 2 ul de DTT 0,1 AI, 16 ul de trifosfato de adenosina 2,5 xuAí (pH 7) bem como 1 ul de ligase de ADN T4 (400 unidades) e incu ba-se durante 16 horas a 22°C.

A purificação dos fragmentos génicos assim obtidos (Quadros 1 e 2) é levada a efeito por electroforese em gel sobre uma placa de gel de poliacrilamida a lo % (sem adição de ureia, 40 x 20 x 0,1 cm), servindo de substância de marcação ADN de 0x174 (da firma BRE) cortado com Hinfl ou pBP322 cortado com HaelII.

Exemplo 2

a) Clonagem do fragmento de ADN sintetizado

Abre-se o plasmideo comercial pUCl9 com as enzimas de restrição Kpnl e PstI e separa-se o fragmento maior (1) num gel seaplaque a 0,8 %. Paz-se reagir este fragmento com o ADN sintético (2) de acordo com o Quadro 1 com

- 10 ligase de ADN T4 θ incuba-se a mistura de ligação com células competentes de E. coli 79/02. Inoculam-se placas de IPTG/Xgal que contém 20 mg/1 de ampicilina com a mistura de transformação. A partir das colónias brancas obtidas isola-se o ADN pias mídico e caracteriza-se este por meio de análises de restrição e de sequência de ADN. Aos plasmídeos pretendidos atribui-se a designação de pIKl.

De modo idêntico liga-se o ADN (5) de acordo com o Quadro 2 em pUCl9 previamente aberto com PstI e HindIII (4). Obtém-se o plasmídeo pIK2 (6).

b) Construção do gene da mini-proinsulina

A partir dos plasmideos pIKl (3) e pIK2 (6) isolam-se novamente as sequências de ADN (2) e (5) de acordo com os Quadros 1 e 2 e ligam-se com pUCl9· Obtém-se des. te modo o plasmídeo pIK3 (8) que codifica para uma sequência modificada da insulina humana.

Abre-se o plasmídeo pIK3 (8) com MluI e Spel e isola-se o fragmento maior (9)· Liga-se este com a sequência de ADN (10)

	B30	Al	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8 A9
	(Thr)(Arg)	Giy	Ile	Vai	Glu	Gin	Cys	Cys	(Thr)(Ser)	(10)
5*	CG CGT	GGT	ATC	GTT	GAA	CAA	TGT	TGT	A	3’
3’	A	CCA	TAG	CAA	CTT	GTT	ACA	ACA	TGA TC	5’

(MluI) (Spel) que completa o último codão da cadeia B (B30) num codao para a arginina, substitui os codões cortados para os 7 primeiros áci. dos aminados da cadeia A e completa os codões para os ácidos aminados 8 e 9 desta cadeia.

Obtém-se deste modo o plasmídeo pIE4 (11) que codifica para a mini-proinsulina humana de acordo com a presente invenção.

c) Vectores de expressão para a mini-proinsulina ρίκ 1:

Corta-se o plasmídeo pk50 (12) conhecido da EP-A 0 229 998 (descrito neste pedido de patente he Exemplo 3; Figura 3 (33)) com EcoRI e HindIII. Isolam-se os dois fragmentos (13) e! (14). Corta-se novamente o fragmento menor (14) com a sequência parcial da 11-2 com KluI e isola-se a sequência parcial da 11-2 (15).

Corta-se o plasmídeo pIK4 (11) com EcoRI e Hpal e isola-se o fragmento maior (16). Em seguida liga-se este com a sequência parcial da 11-2 (15) e com o AON sintético (17)

		Met	Ile	Glu	Gly	Arg	Phe	Vai
5’	CG CGT	ATG	ATT	GAG	GGC	CGT	TTC	GTT	3’	(17)
3»	A	TAC	TAA	CTC	CCG	GCA	AAG	CAA	5’

(Mlul) (Hpal) obtendo-se o plasmldeo pIK8 (18). Este codifica para uma proteína de fusão na qual aos primeiros 38 ácidos aminados da IL—2 se segue um elo da cadela constituido por Met-Ile-Glu- : -Gly-Arg e a este a sequência de ácidos aminados da mini-proin sulina.

A partir do plasmídeo pIK8 (18) cor ta-se o fragmento EcoRI-HindIIl (19) que codifica para a proteína de fusão referida. Este fragmento é ligado com o fragmen to maior (13) que foi obtido por cisão do plasmídeo pK5O. Obtém-se deste modo o vector de expressão pIKlO (2o) que codifica para a proteína de fusão anteriormente referida. |

PSV73:

Quando se rètira do vector pIKlO (20) o segmento Ndel-BstEII que inclui o bom site, obtém-se um vector que ocorre nas células em maior número de cópias e por causa de bom site” em falta corresponde ao bom site e que não é mobilisável por meio de plasmídeos conjugativos.

para este fim corta-se o vector pIKlO (20) com BstEII e lidei, precipita-se o AON com etanol, retoma-se com tampão de polimerase de A1H e submete-se a uma reacção com polimerase de Glenow. Os fragmentos de ADH com exJ tremidades alinhadas deste modo obtidos são separados por elec.

• troforese em gel e isola-se o fragmento maior (21). Por liga- 12 ção obtém-se o vector pSW3 (22). Após transformação de células i competentes de E. coli ííclOól e amplificação isola-se e caracteriza-se o plasmideo pSW3 (22).

Exemplo 3; Expressão na estirpe E. coli 7/3110

Dilui-se numa proporção de cerca de 1:100 uma cultura obtida por crescimento de um dia para o outro de células de E. coli que contém o plasmideo pIKlO (20) ou pSY/3 (22) com meio 1B (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor laboratory, 1972), que contém 50 μg/ml de ampieilina e segue-se o crescimento por medida da DO.

A uma DO = 0,5 ajusta-se a concentração da cultura em IPTG a 1 mM e separam-se as bactérias após 150 a 180 minutos por centrifugação. Aquecem-se as bactérias durante 5 minutos numa mistura tampão (ureia 7 11, 0,1 $ de SDS, fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0) e depositam-se amostras sobre uma placa de electroforese em gel de SDS. Após a análise por electroforese em gel observa-J -se uma banda adicional do domínio de cerca de 10 kD que corres ponde à proteína de fusão esperada. Esta banda reage na experiência da mancha de Western (Western blot) com anticorpos contra insulina.

Por rotura das células sob pressão e centrifugação do resíduo obtém-se a proteína de fusão no sedimento juntamente com outros componentes celulares insolúveis.

As condições de indução dadas são válidas para culturas agitadas em balões em agitadores orbitais; para fermentações em escala maior é vantajoso seleccionar outros meios e outras condições, por exemplo a utilização de valores da D.O. diferentes.

Exemplo 4:

a) Preparaçao de mono-Arg-insulina

Dissolvem-se 40 g da proteína de fusão concentrada por centrifugação e lavagem com tampão de fosfato (pH 7) e com água (conteúdo em substância seca cerca de 25 $) em 75 ml de ácido fosfórico a 98 a 100$ e trata-se com 5 g de BrCN. Após 6 horas de reacção à temperatura ambiente trata-se a

mistura com 2 1 de água e liofiliza-se.

Lissolve-se a mistura dos fragmentos j i

(10 g) em 1 1 da solução tampão (ureia 8 LI, tris-HCl 0,2 Lí (pH 8,5)), aquece-se a 30°C e trata-se com 10 g de sulfito de sódio e 2,5 g de tetrationato de sódio. Após 90 minutos a 30°C adicionam-se 3 1 de água fria e ajusta-se o valor do pH a 7,0. Separa-se por centrifugação o sedimento resultante. Precipita-se o hexa-S-sulfonato de mini-proinsulina a partir do sobrena dante por ajuste do pH a 3,5. Após 15 horas de incubação a +4°C centrifuga-se. Lava-se o precipitado com água e liofiliza-se. Obtêm-se 4,8 g de uma mistura de substâncias na qual se determina uma fracção de 900 mg de mini-proinsulina por HPLC de fase invertida. A obtenção do S-sulfonato é levada a efeito em 2 fases:

1. Cromatografia de permutação aniónica através de uma coluna de 50 x 60 cm com ^^Practogel TSK DEAE-650 LI em ureia

I

M; tris-HCl 0,05 LI (pll 8,3). A eluição é levada a efeito com um gradiente de NaCl de 0,05 a 0,5 LI (cada 6 1). Após análise do eluido por focagem isoeléctrica precipita-se o produto a partir das fracções reunidas por diluição até uma concentração de ureia 1 M e ajuste do pH a 3,5·

2. Eliminação de impurezas de alto e baixo peso molecular poij filtração em gel através de ^Sephacryl S200 em ureia 3 tris-HCl 0,05 Li; NaCl 0,05 LI (pH 8,3). Levam-se a efeito análises das fracções e o isolamento do produto como na fase anterior. Lava-se o precipitado com 20 ml de água e liofiliza—se. Obtém-se 1,10 g do produto concentrado até um grau de pureza de 69%.

Para a dobragem e a formação das pontes de dissulfureto dissolve-se o S-sulfonato em 50 ml de ureiâ 8 LI e tris-HCl 0,02 Lí a pH 8,6. Após adição de algumas gotas dei octanol fez-se passar durante 15 minutos azoto puro. Por adiçãol de 1,1 ml (16 mmol) de 2-mercaptoetanol leva-se a efeito no decurso de 1 hora à temperatura ambiente a redução completa. Paz-se passar a solução através de una coluna de ^'^Sephadex G25 (5 x 60 cm) e elui-se com glicina/NaOIi 0,05 LI (pH 10,6). A fracção proteica é conservada durante 2 dias a 4° C após veri14

ficação e eventual correcção do valor do pH (10,6). Em seguida ajusta-se o valor do pH a 6,8 e incuba-se a solução com 1 mg i

(5,5 U) de tripsina (Merck, tratada com l-l-p-tosilamino-2-fe-| niletil-clorometilcetona (TPCK)) à temperatura ambiente durante horas. Em seguida ajusta-se o valor do plí a 5,5, trata-se a solução com 1 mg de um inibidor de tripsina de soja (Sigma) e j ml de ZnCI₂ a 10% e ajusta-se novamente a pH 6,8. Separa-se por centrifugação o precipitado resultante. Este precipitado contém predominantemente mono-Arg-insulina, a qual é purificada por cromatografia de permuta iónica em S-Sepharose(2,5 x 40 cm) num tampão de ácido láctico 50 mM e 50% de isopropanol (pH 5,5). A eluição é levada a efeito por meio de um gradiente de NaCl de 0,05 a 0,5 M (cada 11). Analisa-se o eluído por HPLC; a partir das fracções que contém o produto precipita -se a mono-Arg-insulina após diluição 1:1 com H₂0 por adição de 10 ml de ZnCI₂ ^a 10% para 1 1 e ajuste do pH a 6,8. Cristaliza-se o precipitado separado por centrifugação a partir de ί um tampão de 1 g/1 de fenol, 10,5 g/1 de ácido cítrico e 200 mg/1 de ZnCl₂ a plí 6. Após liofilização dos cristais lavados com um pouco de água obtêm-se 590 mg de mono-Arg-insulina num grau de pureza superior a 90%.

Exemplo 5:

Preparação da insulina !

Dissolvem-se 200 mg de mono-Arg-in— sulina (ver Exemplo 4) em 100 ml de tris-HCl 0,05 M (pH 8,5).

Em seguida adiciona-se 1 TJ (cerca de 4 pg) de carboxipeptidase B e agita-se lentamente a solução à temperatura ambiente. Após horas cristeliza-se a insulina humana por acidificação a pHi í

5,5 θ adição de 1 ml de ZnCI₂ a 10% a pH 5,5. Obtêm-se 200 mg de insulina cristalina com uma pureza superior a 85%. -^ste material é submetido a uma purificação por cromatografia em permutador iónico numa coluna com Eractogel TSK-DEAE-650 M (2,5 χ x 40 cm) em ^Lutensol DN 100 a 0,1% (BASE AG; oxetilato de um álcool gordo linear saturado, maioritariamente com 12 átomos de carbono); tris-HCl 0,05 M (pH 8,5), efectuando-se a eluição • com um gradiente de NaCl de 0 a 0,4 M (cada 1 1). A partir das ·_ fracções que contém o produto identificadas por HPLC crista- 15 liza-se a insulina por adição de 10 ml de ZnCI₂ a 10% e 1 ml de acido cítrico a 10% a pH 5,5. Após agitação lenta de um dia para o outro, centrifuga-se e recristaliza-se o sedimento obti do a partir de 20 ml de um tampão de 5 g/1 de ácido citrico,

125 ml/1 de acetona e 200 mg/1 de ZnCI₂ a PH 5,5. Obtêm-se 160 mg de insulina com um grau de pureza superior a 95%.

Exemplo 6

Preparação de insulina a partir de mono-Arg-insulina por acção combinada de tpripsina e de carboxipeptidase B

Dissolvem-se 5 mg de mono-Arg-insuli na em 20 ml de tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) e aquece-se a 30°C. Adi cionam-se simultaneamente 2,5 ul de solução de tripsina (1 U/ /ml) e 150 μΐ de solução de carboxipeptidase 3 (1 U/ml). Após 3 horas ajusta-se o pH da solução a 3,5 θ adicionam-se 2,5 ul de solução de inibidor de tripsina (1 U/ml) bem como 200 /ul de solução de ZnCI₂ a 10%. Precipita-se a insulina humana por ajuste do pH a 6,8, separa-se por centrifugação e cristaliza-se como no Exemplo 5· A insulina cristalizada tem um grau de pure. za > 95%.

Exemplo 7: Construção de um vector de expressão em levedura

Em primeiro lugar sintetiza-se a sequência de ADN (23) (Quadro 3) de acordo com o processo do fo£ fito. Esta sequência de ADN (23) codifica para os ácidos amina dos 49 a 80 da proteina precursora ΛΦχ' e corresponde essencialmente à sequência de ADN natural.

Utiliza-se em primeiro lugar a sequência de ADN (23) como sonda para o isolamento do gene para τ2ϋ o factor e marca-se para este efeito com ' Com o auxilioi í

desta sonda isola-se a partir de um banco de genes de levedura Agtll gemómico (que pode ser obtido inclusivamente de uma ori! gem comercial como por exemplo de Clontech Laboratories Inc., 4055 Fabian Way, Paio Alto, CA943O3). Para este fil identificai -se fagos Àgtll que possuem o gene do factor ol num encsaio de hibridação em placa. Isolam-se os fagos de todas as placas identificadas como positivas, ampliam-se e isola-se o ADN.

Cinde-se este cora EcoRI e analisa-se num gel de agarose a 0,8$i Após um ensaio de transferência de Southern hiBrida-se a mera- ί brana contra a sequência de AON (23) marcada por 32p que apresenta um fragmento de cerca de 1,75 kb (24), o qual hiBrida contra a sequência de ADR (23), cinde-se novamente com a enzima e isola-se o fragmento pretendido (24). Abre-se o vector pUC 19 com EcoRI (25) e faz-se reagir com o fragmento de 1,75 kb (25) com ligase T4. Obtém-se o vector de clonagem (26).

Transforma-se a estirpe de E. coli 79/02 com a mistura de ligação. Isolam-se colónias brancas a partir das quais se obtém o ADR plasmídico e se identifica o plasmídeo que contém o fragmento EcoRI de 1,75 kb.

A sequência de ADR natural da protei na precursora para IIP c/ contém no domínio dos ácidos aminados 8 a 10 um local de corte PstI e no domnio dos ácidos aminados 48/49 um local de corte Taql. A partir do ADIÍ plasmídico isola do (26) isola-se em seguida por reacção com PstI e Taql o frag mento (27), o qual codifica para os ácidos aminados 9 a 48 da sequência precursora Ι,ΣΡοί . Abre-se o vetor pUCl8 com PstI e Kpnl (28) e faz-se reagir com o fragmento PstI-Taql (27) bem como com a sequência de ADR sintética (23) com o auxílio de ligase T4. Com a mistura de ligação transforma-se E. coli 79/02. Deposita-se a mistura de transformação sobre placas de IPTG—Xgal-Ap. Isolam-se colónias brancas e caracteriza-se o ADR plasmídico destes clones por análise de restrição. Obtém-se deste modo o vector de clonagem (29), o qual codifica para os ácidos aminados 8 a 80 da sequência precursora ME<?< .

A partir do vector de clonagem (29) corta-se a sequência de codificação referida (30) por reacção j com PstI e Kpnl e integra-se na ligação descrita seguidamente.j Para este fim faz-se reagir o vector de clonagem (26) com í

EcoRI e parcialmente com PstI e isola-se o fragmento (31) que abrange a sequência de codificação para os primeiros 8 ácidos aminados da sequência do precursor ílFc* . Para além disso abre-se o vector pUC19 com EcoRI e Kpnl (32) e liga-se com os dois fragmentos descritos (30) e (31), obtendo-se deste modo o vector de clonagem (33). Este vector de clonagem çp3ifica para a sequência precursora integral de i.IPoe até ao ácido aainado 80.

Abre-se o vector de clonagem (33) i com Kpnl e IíindIII e isola-se o fragmento maior (34). Liga-se ' _f i este fragmento com o fragmento Kpnl-HindIII (35) do plasmideo (11), o qual codifica para mini-proinsulina. Obtém-se deste mo. do o plasmideo pIK20 (36), cuja estrutura é confirmada por aná lise de restrição.

Abre-se o plasmideo Yepl3 (Broach et al., Gene 8 (1979) 121) com BamHI e preenchem-se ae extremidades reentrantes com polimerase de Klenow (38). Precipita-se o ADK com etanol e trata-se com fosfatase alcalina de bovino.

A partir do vector de clonagem (36) corta-se com HindIII e EcoRI o fragmento que codifica para o derivado de insulina e para a sequência precursora de MFb* e preenchem-se as extremidades reentrantes conforme descrito (37}

Ligam-se entre si as duas sequências de ADIÍ de extremidades alinhadas (37) e (38), obtendo-se os plasmideos p<*fBlO2 (39) e pt*fBlO4 (40). Estes dois plasmide- j os diferenciam-se entre si apenas pela ocientação do fragmento inserido.

Conforme descrito em EP-A 0 171 024, ! é possível ántegrar um terminador depois da sequência inserida (Figuras 4 a 6 da EP-A 0 171 024). Para esse fim são adequados os locais de corte Ncol e/ou BamHI.

Após amplificação do AON plasmídico em E. coli 111294, utiliza-se o plasmideo p=*fBlO2 para trnasfor mação das estirpes de levedura deficientes em leucina Y79 («<,trpl-l, leu2-l) (Centrell et al., Proc. Acad. Natl. Sei.

USA 82 (1985) 6250) e DN6-6 ( leu2-3,112: :ura3⁺/leu2: :

lys2⁺, trpl~/trpl”, his3-ll, 15/his3-ll, 15, ura3~/^ura3~, I

Iys2~/lys2“, arg4-17/arg4⁺, adel~/^ad^el⁺) (Maya Hanna, Dept. J.iolj ίBiol. Líassachusets General Hospital, Boston, EUA) de acordo com o método do litio de Ito, H. et al., J. Bacteriol., 153 (1983) 163. Isolam-se as colónias que podem crescer no meio selectivo sem adição de leucina. Inocula-se meio mínimo de levedura com as colónias isoladas e incuba-se durante 24 horas a 28°C. Sepa ram-se as células por centrifugação e verifica-se a actividade •jde insulina no sobrenadante por meio de um ensaio de RIA. A • partir de clonss de levedura cujo sobrenadante apresenta ac- 18 -

tividade de insulina isola-se novamente e caracteriza-se por j meio de análise de restrição o AON plasmídico. Utilizam-se as j estirpes de levedura transformadas para a expressão que tem lu-j gar em seguida.

Exemplo 8: Expressão em levedura

Inoculam-se 10 ml de meio inte- j gral de levedura com as células que foram isoladas a partir de I uma cultura fresca efectuada de um dia para o outro de uma estirpe obtida de acordo com o Exemplo 7 em meio selectivo, de modo a atingir uaa densidade óptica de ΡΟ^θθ =0,1. Agita-se a cultura num agitador orbital durante 8 horas a 28°C, adicionan do-se 90 ml de meio fresco. Em seguida agita-se a cultura du·? rante mais 20 horas. Separam-se as células por centrifugação e determina-se a concentração de insulina no sobrenadante. As condições são modificadas para fermentações em maior escala, | nas quais, por exemplo, é possível adicionar meio fresco de modo contíno.

i

Exemplo 9: Purificação de mono-Arg-insulina a partir de sobrenadante de levedura

Paz-se passar o sobrenadante da fermentação através de uma coluna comuna resina adsorvente porosa constituída por um copolímero de estireno e divinilbenzeno ((^Diaion HP20). Previamente a coluna tinha sido equilibra da com um tampão de acetato de 20 a 50 mLí (pH 5)· Após lavagem com tampão de tris (pH 8), fazem-se passar 10 vezes o volume

I da coluna com um gradiante de isopropanol (0 a 50$). Ajusta-se a 6 o pH das fracções que contêm a insulina, trata» ae com (^MATREX CE1LUPINE AM (da firma Amicon), agita-se, separa-se ; por filtração e lava-se com tampão de acetato 50 mil (pH 6). j Reunem-se a fracção de lavagem e a fracçâo principal, ajusta- | -se a pH 3,5 com ácido láctico e faz-se passar através de uma coluna de S-SEPIíAROSE previamente equilibrada com ácido lácticc 50 mí.I (pH 5 )/isopropanol a 30%.

' A eluição é levada a efeito por . meio de um gradiente de NaCl de 0 a 0,6 Μ. A mini-proinsulina 1 é eluida no domínio de 0,25 a 0,3 M.

As fracções que contêm a proinsulinaί são concentradas até 1/4 do seu volume e feitas passar através de uma coluna com Biogel-PlO (Bio-Rad) equilibrada em ácido acético a 6% (pH 2). 0 eluido que contém a insulina é liofilizado e purificado por meio de cromatografia preparativa de h | HPLC de fase invertida (material RP18, TPA 0,1%, gradiente de acetonitrilo de 20 a 40%). Após nova liofilização, dissolve-se em tampão de tris (pH 6,8) e incuba-se com 4 uidades de tripsi na por grama de mono-Arg-insulina à temperatura ambiente duran te 3 a 5 horas. 0 decurso da reacção é seguido por meio de aná lise de fase invertida. Verifica-se que se obtém mono-Arg-insu lina de forma quase quantitativa. No fim da reacção ajusta-se o pH a um valor de 3,5 θ faz-se parar a reacção por adição de uma quantidade equivalente de inibidor de tripsina. Em seguida ajusta-se a concentração de cloreto de zinco a 0,21 g/1 e o va lor do pH a 6,8. Obtém-se um precipitado floculento que se di£ solve em tampão de ácido láctico. Os componentes são separados entre si por cromatografia em S-SEPHAROSE. Purificam-se as fra_c ções que contêm a mono-Arg-insulina e mistura-se com água numa proporção de 1:1. Em seguida trata-se a solução com 10 ml de ZnCI₂ a 10% para 1 1. A mono-Arg-insulina precipita a pli 6,8 e em seguida é recristalizada de modo conhecido (para a in sulina).

Exemplo 10: Preparação da insulina Humana

A mono-Arg-insulina obtida de acordo com o Exemplo 9 serve de matéria prima para a cisão por carboxipeptidase 3. Para este fim, dissolve-se o õferivado de insulina em tampão de tris (pli 8,5) θ trata-se com 5 unidades de carboxi peptidase E por grama de mono-Arg-insulina. A reacção é levada a efeito durante 3 horas com agitação lenta à temperatura ambiente. Em seguida precipita-se com ZnCI₂ conforme descrito no Exemplo 9. A insulina humana é então purificada de modo conhe- ; eido (DE-3 2 629 568).

Quadro 1: Fragmento génico IK I (2)

Phe

30

CT TTG GAO AAG AGA TTG GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGT TOT CAC CAT GGA AAC CTG TTC TCT AAG CAA TTG GTT GTG AAC fiCA CCA AGA GTG <----------------------------1------------------------------>

(Kpnl) Hpal

60 70 80 90 • · · · ·

TTG GTG GAA GCG TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAG GGT GGT TTG TTC AAC CAC CTT CGC AAC ATG AAC CAA ACA CCA CTC GCA CCA AAG AAG _C-------------------------------------------₅-----------B⁵⁰

Thr Arg Lys Gly Ser Beu 100 110 120

----------------------------------------->

IAC ACT CCA AAG ACG CGT AAG GGT TCT CTG CA A.TG TGA GGT TTC TGC GCA TTC CCA AGA G ----------------------------------->

iílul (Pstl)

- 21 Quadro 2: Fragmento génico IK II (5)

Gin Lys Arg Gly

130 140 150 160 • · · · t-----------------------------------------------------6

G AAG CGT GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT AGT ATC TGT TCT

AC GTC TTC GCA CCA TAG CAA CTT GTT ACA ACA TGA TCA TAG ACA AGA (PstI) Spel

A²¹

Asn

170 180 190 200 210

---------------------------------------------------------->

TTG TAC CAG CTC- GAA AAC TAC TGT AAC TGA TAG TGG ACC CAT CGA AAC ATG GTC GAC CTT TTG ATG ACA TTG ACT ATC AGC TGG GTA CCT TOGA -------------------------------------------------------------->

(HindIII)

I

Quadro 3: Sequência de ADN (23)

		50					55
G	GAT	GTT	GCT	GTT	TTG	CCA	TTC	TCC
	TA	CAA	CGA	CAA	AAC	GGT	AAG	AGG
'aql)			60					65
AAC	AGT	ACT	AAT	AAC	GGT	TTA	TTG	TTC
TTG	TCA	TGA	TTA	TTG	CCA	AAT	AAC	AAG

ATT	AAT	ACT	ACT	ATT	GCT	AGC	ATT	GCT
TAA	TTA	TGA	TGA	TAA	CGA	TCG	TAA	CGA
75					80
GCT	AAA	GAA	GAA	GGG	GTA	C	3*
CGA	TTT	CTT	CTT	CCC			5*

(Kpnl)

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lê Processo para a preparação de um composto da fórmula I

B(1-30)-Arg-A(1-21) (I), na qual B(l-30) e A(l-21) significam as cadeias B e A, respectivamente, da insulina humana, caracterizado por se exprimir numa célula hospedeira, de preferência numa bactéria ou numa levedura, uma estrutura génica que codifica para este com posto e, no caso de a estrutura génica codificar para uma proteína de fusão, se libertar o composto da fórmula I a partir da proteína de fusão.

- 2â Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se cindir por via enzimática uma proteí na de fusão obtida de acordo com a reivindicação 1 e se isolar a proteína da fórmula I.

I

- 5δ Processo para a preparação do compos ^! to da fórmula II

S - S

A(í - 21)

S - S (II), s - s

B(1 - 30) - Arg na qual A(l-21) e B(l-30) possuem os significados anterior mente definidos e as pontes -S-S- estão dispostas como na insu lina, caracterizado por si cindir a proteína obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 por via enzimática, de preferência com tripsina.

- 4ê Processo para a preparação de insuli na humana caracterizado por se cindir numa reacção sem mudança de recipiente uma proteína obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 com tripsina ou com uma enzima de activi dade equivalente e com carboxipeptidase B ou com uma enzima de actividade equivalente.

ί _ 5ã Processo para a preparação de insuli^ na humana caracterizado por se preparar uma proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, se cindir esta proteína de fu são, isolar-se a proteína da fórmula I, preparar-se a partir desta o composto da fórmula II e cindir-se a arginina C-terminal após se isolar o intermediário ou, de preferência, sem is£ lamento.

- 6a _

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por na proteína de fusão a proteína da fórmula I se encontrar ligada na fracção de balastro através de uma cadeia da fórmula

-Met-Ile-Glu-Gly-Arg-.

- 25 A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 23 de Junho de 1988, sob o n$.