PT92757B

PT92757B - Processo para a preparacao de novos derivados da insulina e de uma composicao farmaceutica que os contem

Info

Publication number: PT92757B
Application number: PT92757A
Authority: PT
Inventors: Laszlo Vertesy; Karl Geisen; Gunther Johannes Riess; Klaus Sauber
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-12-29
Filing date: 1989-12-28
Publication date: 1995-12-29
Also published as: NZ231944A; NO180379C; NO895296D0; IL92905A0; ES2085271T3; HUT53150A; DK669889A; FI102843B1; PT92757A; FI102843B; CA2006818A1; IE73672B1; EP0376156B1; GR3019560T3; ZA899946B; NO895296L; DK669889D0; FI896279A0; IL92905A; CA2006818C

Description

A insulina e os derivados da insulina são, como se sabe, necessários em quantidades importantes para o tratamento da doença diabetes mellitus e hoje em dia são produzidos em quantidades industriais. Apesar do número considerável de preparados e de diversas formas de insulina existentes com diferentes perfis de actividade, subsiste, devido às diferenças entre os organismos com a variabilidade entre os indivíduos e no mesmo indivíduo, a necessidade de novos preparados de insulina ccm novas propriedades e características de actividade.

Derivados da insulina com actividade retardada são descritos por exemplo em EP-B-132 769 e em EP-B-132 770. Trata-se especialmente de derivados básicos modificados na posição B31 da cadeia B da insulina da fórmula I seguintes:

E.I.

Α1 -s-S- ^Α21

	-o--		-OH
Gly	cadeia A	Asn
	I s I	I s \|
B2	I s I	I s !	E29
Vai	cadeia B

na qual R significa H ou H-Phe,

R representa um resíduo de um ácido aminado L geneticamente codificável neutro e 31

R representa um grupo orgânico de carácter básico fisiologieamente aceitável com um máximo de 50 átomos de carbono em cuja constituição participam 0 a 3 ácidos tx-aminados e cuja função carboxilo terminal livre eventualmente existente se pode apresentar sob a forma de uma função éster, de uma função amida, sob a forma de uma lactona ou reduzida a CH^OH.

Para estes derivados da insulina é característico um ponto isoeléctrico entre 5,8 e 8,5 (medido por focagem isoeléctrica). 0 ponto isoeléctrico - ao contrário do ponto isoeléctrico na insulina ou da pró-insulina nativa não modificada (a pH = 5,4) deslocado para a zona de neutralidade - é condicionado pela(s) carga (s) positiva(s) que se encontra(m) na superfície da molécula em consequência da modificação básica. Deste modo, estes derivados da insulina básicos modificados são menos solúveis na zona de neutralidade do que a insulina ou a pró-insulina nativas, as quais normalmente se encontram em dissolução na zona de neutralidade.

A actividade retardada ou depot dos derivados básicos modificados da insulina da fórmula I é devida à sua baixa solubilidade no ponto isoeléctrico. A dissolução dos derivados de insulina sob condições fisiológicas é conseguida, de acordo com as duas publicações referidas, por cisão dos grupos básicos adicionais, cisão que é realizada segundo o derivado por meio da acção da tripsina ou de enzimas dotadas de actividade seme2 lhante a da tripsina e/ou de carboxipeptidase B ou de enzimas dotadas de actividade semelhante à da carboxipeptidase B e/ou de esterase. Os grupos cindidos em cada caso são metabolitos fisiológicos puros ou substâncias fisiologicanente aceitáveis facilmente metabolizáveis.

princípio dos produtos depot atrás referido conseguido por meio de uma modificação básica da insulina foi ainda utilizado na preparação e uso correspondente de outros derivados básicos modificados - fundamentalmente nas cadeias A e B - da insulina; ver por exemplo EP-A-0194 864 e EP-A-0254 516.

São ainda conhecidos alguns derivados modificados básicos de insulina nos quais a modificação básica é constituída pelo prolongamento da cadeia A para além da posição A1; ver P. Rosen et al., Biochem. J. (1980) 186, 945-952. De entre estes derivados de insulina com ácidos aminados básicos como componentes da modificação descrevem-se na literatura em referência especialmente os seguintes:

A1

Lys-Arg-Gly -insulina de bovino A1

Arg-Gly -insulina de bovino A1

Arg-Arg-Gly -insulina de bovino e A1

Arg-Arg-Arg-Gly -insulina de bovino.

Estes derivados de insulina apresentam uma actividade biológica notavelmente reduzida em comparação com a insulina não modificada; ver especialmente o Quadro 1 da página 947 da referência citada. A literatura não refere qualquer eventual actividade ”depot dos compostos.

No esforço para aumentar e de tornar utilizável o referido princípio ”depot” para o tratamento do diabetes mellitus de modo vantajoso desenvolvemos agora um novo grupo de derivados da insulina; trata-se de derivados da insulina da fórmula II apresentada seguidamente em cuja posição AO se situa o ácido aminado básico arginina:

AO A1	-S-S-	A21
H-Arg	Gly	cadeia A	Asn	-OH
		I s I	I s 1
	B1	I s I	1 S 1	B29
H -	Phe	cadeia B		Lys

(II)

-r³⁰-r³¹ na qual

31

a) R + R em conjunto = OH ou

OQ

b) R° = um resíduo de um ácido aminado L neutro e geneticamente codificável e R³¹ = OH ou representa um grupo orgânico fisiologicamente aceitável de caracteristica básica com um máximo de 50 átomos de carbono em cuja constituição participam 0 a 3 ácidos aminados oe e cuja função carboxilo livre terminal eventualmente existente se pode apresentar sob a forma de uma função éster, de uma função amida, de uma lactona ou reduzida a CH_pOH, ^z 30 com excepçâo dos casos em que simultaneamente R = Ala,

R = OH bem como as cadeias A e B são as sequências da insulina de bovino [isto é, a AO-Arg-insulina de bovino].

Os sais fisiologicamente aceitáveis (como por exemplo os sais de metais alcalinos ou de amónio) destes derivados de insulina sâo abrangidos pela presente invenção.

Os novos derivados da insulina apresentam em consequência da sua modificação básica na posição AO - como também os derivados de insulina de modificação básica conhecidos - um perfil de actividade alterado e - em comparação com os derivados de insulina de modificação básica conhecidos - vantagens nítidas no que se refere à tolerabilidade pelo organismo; para além disso é extraordinariamente surpreendente tendo em vista a literatura referida de P. Rõsen et al. (ver acima) que a acti4

vidade biológica destes derivados corresponda à da insulina nativa .

a) Os compostos da fórmula II com R^J + R^J em conjunto = OH são as AO-Arg-des-B30-insulinas correspondentes; estes compostos são especialmente preferidos.

b) Em alternativa na fórmula II pode também ser o resíduo de um ácido aminado L neutro geneticamente codificável e 31 = OH ou um grupo correspondente fisiologicamente aceitável de carácter básico com um máximo de 50 átomos de carbono.

Os ácidos aminados L neutors geneticamente codificáveis que podem tomar o valor de _sg_o Gly, Ala, Ser, Thr, Vai

Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe e Pro; de preferência Ala, Thr e Ser, de modo especialmente preferido apenas Thr.

No caso de R = OH, resultam derivados de insulina que se diferenciam da insulina correspondente apenas pela modificação na posição AO (Arg) - no caso do ácido aminado L neutro especialmente preferido geneticamente codificável Thr (e de as cadeias A e B1 a B29 = sequências da insulina humana) o derivado é AO-Arg-insulina humana.

No caso de R^J = um grupo orgânico correspondente de carácter básico fisiologicamente aceitável com um máximo de 50 átomos de carbono, resultam derivados da insulina que se diferenciam dos derivados de insulina de modificação básica de acordo com as publicações já referidas ΞΡ-Β-132 769 e EP-B-132 770 em princípio apenas por meio do resíduo de Arg adicional na posição AO.

Quando na composição de R não participa qualquer acido of-aminado, o significado deste resíduo pode ser por exemplo de um dos seguintes grupos básicos:

amino-alcoxi-CC^-Cg), alquil-(C^-C^)-amino-alcoxi-(C₂~Cg) , dialquil-( -C^ )-amino-?.lcoxi- (C₂-Cg ) , tri- (C^-C^ )-amónio-alcoxi-(^c2-0g), amino-alc '-(Cg-Cg)-amino, [alquil-ÍC^C^J-amino]alquil-(C₂-Cg)-amino, dialquil-(C₁-C_i|)-amino-alquil-(C₂-Cg)-amino ou [tri-alquil-(C^-C^)-amino]-alquil-(C₂-Cg)-amino, espe5

cialmente -0-[CH_o] -NR~, -O-[CH„] -N⁽⁺⁾R_O, -NH-[CH_O] -NR_O ou / X í p á _r 2 p 5 2 P 2

-NH-ÍCH^lp-N R^, en que pe = 2a6eRe igual ou diferente e representa hidrogénio ou alquilo-CC^-C^).

Quando na composição de R participam até um máximo de 3 ácidos q-aminados, estes são principalmente ácidos aminados L de ocorrência natural neutros ou básicos e/ou os ácidos aminados D correspondentes a estes. Os ácidos aminados de ocorrência natural neutros são especialmente Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro e Hyp. Os ácidos aminados de ocorrência natural básicos são especialmente Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit e His. No caso de apenas participarem ácidos q-aminados neutros, a respectiva função carboxilo terminal - que confere a R^J carácter básico - não pode estar livre; a função carboxilo terminal deverá pelo contrário, neste caso, estar esterificada com um grupo básico ou transformada em amida, podendo neste caso serem considerados os grupos básicos já anteriormente referidos - para o caso de na composição de R não participar qualquer ácido «-aminado. Naturalmente estes grupos éster ou amida podem também bloquear a função carboxilo de ácidos q-aminados básicos. Para o bloqueamento da função carboxilo dos ácidos «-aminados básicos podem utilizar-se também - no caso de se pretender um bloqueamento - grupos éster neutros ou grupos amida, como por exemplo alcoxi-(C^-Cg) , cicloalquiloxi-(C^-Cg) , NH₂, alquil-(C-Cg)-araino ou dialquil—(C^-Cg)-amino.

Naturalmente a função carboxilo terminal apenas pode estar sob a forma de uma lactona quando o ácido aminado terminal é um ácido hidroxiaminado.

Além disso uma função carboxilo terminal também se pode apresentar sob forma reduzida CH₂0H.

De preferência R^J é constituído por 1, 2 ou 3 ácidos aminados básicos de ocorrência natural de entre os anteriormen31 ' te referidos; de modo especialmente preferido R e = Arg-OH ou Arg-Arg-OH.

' significado especialmente preferido de R e de - 30 preferencia combinado com R = Ala, Thr ou Ser, especialmente

apenas Thr. Com R = Thr e a cadeia A e a cadeia BI a B29 = = sequências da insulina humana resultam A0-Arg-B31-Arg-0H-insulina humana AO-Arg-B31-Arg-B32-Arg-OH-insulina humana.

A cadeia A e a cadeia B1 a B29 na fórmula II podem em princípio ser as sequências de todas as insulinas possíveis; de preferência estas cadeias sSo no entanto as sequências da insulina humana, de suíno ou de bovino, especialmente as sequências da insulina humana (as quais são idênticas às sequências A1 a A21 e E1 a B29 da insulina de suíno).

ponto isoeléctrico dos derivados da insulina da fórmula II situa-se entre 5,5 e 9,0 (medido na focagem isoeléctrica).

A preparação dos derivados da insulina da fórmula II pode ser levada a efeito por meio de um processo caracterizado por:

a) fazer contactar um produto derivado da insulina da fórmula III ou IV

-Lys-X

Aég -

A1	-S-S-	I	A21
Gly	cadeia	A	Asn	-OH
	I s I		I s I
B1	I S I		I I	B29
Phe	cadeia	B		Lys

(III)

- 7 Α1

R -Lys-Arg^Rr^Y Gly

B1

Phe

A21 cadeia A cadeia B

Asn

-OH

B29 (IV)

Lys R³⁰-R³¹ em que

X = resíduos de ácidos aminados L codificáveis geneticamente iguais ou diferentes,

Y = Lys ou Arg, n = 0 ou um número inteiro de 1 a 60, e R^ = θΗ ^ou resíduos de um ácido aminado natural - eventualmente derivatizados ou resíduos de peptídeos formados por 1 a 90 ácidos aminados, de preferência por 70 a 80 ácidos aminados eventualmente derivatizados -,

R^Q e R^ possuem o mesmo significado dado em relação à fórmula II e as cadeias A e B(1-29) apresentam de preferência as sequên cias da insulina humana, de suíno ou de bovino, especialmente da insulina humana ou de suíno, com lisilendopeptidase, provocando a cisão das ligações na extremidade C-termínal do resíduo de lisilo, e eventualmente - isto é, quando Y = Arg - fazer-se reagir ainda com tripsina ou com uma endopeptidase semelhante à tripsina, cindindo deste modo a fracçâo R^-Y da cadeia B e obtendo um derivado da insulina AO-Arg-des-B30 da fórmula lia, e/ou por

b) para a preparação de um derivado da insulina da fórmula Ilb, fazer-se reagir um derivado da insulina AO-Arg-des-E30 da fórmula lia na presença de lisilendopeptidase ou de tripsina ou de uma endopeptidase semelhante à tripsina com um composto da fórmula V

HR³°-R³¹ (V),

cm que Ρ^θ _e p_{OSSuem 03} significados definidos em relação à fórmula Ilb e em que as funções COOH-, OH-, SH-, NH₂~, guanidino- e/ou imidazolo livres existentes podem apresentar-se protegidas de um modo conhecido em si, e em seguida eliminar os grupos protectores eventualmente existentes de um modo conhecido em si, ou por

c) fazer reagir uma AO-Arg-des-octapeptídeo-(B23-30)-insulina da fórmula VI

AO

ArgA1

Gly cadeia A

A21

Asn

-OH (VI)

S S i I s s

	B1		B22
H -	Phe	cadeia B	Arg

-GH na presença de tripsina ou de uma endopeptidase semelhante à tripsina com um composto da fórmula VII an

H-Gly-Phe-Phe-Tyr-Tyr-Pro-Lys-R^J -F. (VII)

31 em que R^J e R^J possuem os mesmos significados já definidos em relaçSo à fórmula II em a) e em b) e em que as funções COOH-, OH-, SH-, NH,,-, guanidino- e/ou imidazolo livres existentes podem apresentar-se protegidas de um modo conhecido em si, e em seguida eliminar os grupos protectores eventualmente existentes de um modo conhecido em si, ou por

d) fazer reagir uma insulina ou um derivado da insulina da fórmula II *

Η

Η -

A1	o o	A21
Gly	cadeia A	Asn	-OH
	I s I	I s I
B1	I s !	I S I	B29
Phe	cadeia B		Lys

(II’) ,30 „31

31 em que ív e n possuem os mesmos significados já definidos em relação à fórmula II (a/b) e em que os grupos amina reactivos - com excepção dos grupos amina em A1-Gly - se encontram protegidos de modo conhecido, com arginina, cujos grupos amina se encontram igualmente protegidos de modo conhecido e cujo grupo carboxilo se encontra eventualmente sob forma activada, e em seguida eliminar os grupos protectores existentes de modo conhecido.

Os derivados de insulina da fórmula II obtidos podem, caso se pretenda, ser transformados de modo conhecido nos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

As variantes processuais referidas a) a b) são elucidadas mais em pormenor do modo seguinte.

Variante a):

Elucidação das fórmulas dos produtos de partida III e IV:

Na fórmula III o símbolo X significa ácidos aminados geneticamente codificáveis que podem ser iguais ou diferentes. Os ácidos aminados geneticamente codificáveis são os seguintes (todos na forma L):

Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp e Pro.

Os ácidos aminados naturais - para os resíduos R^ e R₂ da fórmula IV - são, entre outros, os seguintes: Gly, Ala,

Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit e Eis.

Os ácidos aminados e as cadeias peptídicas podem ser derivatizados de modo conhecido, isto é, providos com os grupos protectores habituais da química dos peptídeos para os grupos amina e/ou carboxilo.

Os compostos da fórmula III e os seus precursores sem pontes de dissulfureto são de preferência preparados por tecnologia genética, especialmente de acordo com o processo da EP-A 0 289 936. Os precursores descritos nesta publicação são proteínas de fusão da insulina de macaco com tendamistato (eventualmente encurtado) , ligadas através de um curto elo de ponte peptídico. Estas proteínas de fusão podem ser expressas em células de estreptomicetes e são segregadas para o meio de cultura, a partir do qual podem ser isoladas de modo especialmente simples. No pedido de Patente Alemã P 38 37 273.8 (HOE 88/F 313) são descritas proteínas de fusão especialmcnte preparadas que são caracterizadas por apresentarem entre as cadeias A e B da insulina uma ligação de pontes de dissulfuretos correcta e o peptídeo C encurtado do ácido aminado lisina. De modo perfeitamente análogo é possível preparar uma proteína de fusão em que a cadeia C se encontra encurtada do ácido aminado arginina. Uma modificação especialmente vantajosa do processo descrito é constituída por se acrescentar no gene para a proteína de fusão um codão para o ácido aminado arginina depois do codão existente para a lisina de tal modo que resulta assim uma proteína de fusão cuja cadeia C é constituída por Lys-Arg.

É possível preparar proteínas de fusão correspondentes de acordo com outros processos conhecidos em si, por exemplo de acordo com EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 e EP-A 0 290 005 em E. coli.

Os compostos da fórmula IV e os seus precursores são preparados por formação separada de cada uma das cadeias

Β1

B29

R, - ϊ Phe - Cadeia B — Lys

- R³⁰ - R³¹ de preferência por tecnologia genética, por exemplo de modo semelhante ao do processo de acordo com EP-A- 0 289 936, EP-A-0 286 956, EP-A-0 229 998, EP-A-0 227 938 e EP-A-0 290 005. Em seguida as cadeias são ligadas entre si de acordo com um processo conhecido em si e eventualmente providas de forma apropri ada com grupos protectores. Estes processos são descritos en literatura diversa, por exemplo de P.G. Katsoyannis et al., em J. Am Chem. Soc. 85, 2863-2865 (1963).

Para levar a efeito a variante processual a) o composto da fórmula III ou IV é em seguida feito contactar com uma lisilendopeptidase, por exemplo de Lysobacter enzymogenes em solução ou em suspensSo aquosa. A quantidade utilizada (em peso da enzima pura é de preferência de cerca de 1/50 a 1/10000, especialmente entre cerca de 1/100 e 1/1000, da quantidade do produto de insulina de partida da fórmula III ou IV.

valor do pH da mistura reaccional pode variar entre limites relativamente amplos; de preferência no entanto o domínio do pH é entre 5,5 e 10,5, especialmente entre 7 e 9.

Λ temperatura de reacçSo é de preferência a temperatura ambiente.

tempo de reacção pode ser de poucos minutos até vários dias, de preferência de várias horas, em fusão principalmente da quantidade de enzima.

A enzima lisilendopeptidase cinde as cadeias peptídi12

ca3 que contêm o ácido aminado lisina no lado do carboxilo da lisina. A partir dos compostos da fórmula III e IV obtêm-se quando Y = Lys - a A0-Arg-des-B30-insulina, a qual pode ser purificada de acordo com métodos conhecidos em si. Quando nos compostos de partida III ou IV Y = Arg, o agrupamento R^-Y-Phe mantém-se na extremidade N-terminal da cadeia B. A cisão do resíduo R.J-Y (=R₁-Arg) da cadeia B deve então ser levada a efeito por meio da acção da tripsina ou de uma protease semelhante à tripsina, que pode ocorrer sem ou também após isolamento do produto intermediário R^Arg-Phe-...). 0 isolamento e a purificação do derivado AO-Arg-des-330-insulina são em seguida efectuados novamente por meio de métodos conhecidos.

Na literatura a lisilendopeptidase é frequentemente classificada com as endopeptidases semelhantes a tripsina e frequentemente é também referida como um produto aparentado. No presente caso segue-se esta última opinião.

Variante b);

Trata-se de uma reacção de acoplamento na qual o composto da fórmula V é acoplado ao derivado A0-Arg-des-B30-in3ulina (da fórmula lia) - que pode ser obtido de acordo com a variante processual a) - de modo a obter-se uma AO-Arg-insulina ou um seu derivado da fórmula Ilb. Esta reacção é levada a efeito de acordo com um método conhecido em si análogo ao descrito para a transamidação na EP-B-00 56 951.

Quando se utiliza, neste caso, um produto de partida que possui grupos protectores, estes são eliminados no fim de modo conhecido.

Variante c):

produto de partida da fórmula VI pode ser obtido de modo análogo ao do produto de partida para a variante a).

acoplamento com o peptídeo da fórmula VII é levado a efeito de um modo conhecido em si, como por exemplo é descrito por Inouye et al. em J. Am. Chem. Soc. 101, 751 - 752 (1979).

Também neste caso, quando se utiliza um produto de

partida que possui grupos protectores, estes são eliminados no fim de modo conhecido.

Variante d):

Trata-se da ligação de arginina num derivado de insulina da fórmula II’ na posição AO.

Os grupos protectores da função amina tanto no derivado de insulina da fórmula II* - no qual como se sabe o grupo amina de A1-Gly deve ficar desprotegido - como também no ácido aminado arginina podem ser os grupos protectores habituais das aminas na química dos peptídeos, como por exemplo os grupos benziloxicarbonilo, terc-butiloxicarbonilo ou fluoreno-9-ilo-metoxicarbonilo.

Quando a arginina de partida é utilizada com o grupo carboxilo livre, é vantajoso efectuar o acoplamento com A1-Gly por meio de uma carbodiimida. Caso contrário, é conveniente activar o grupo carboxílico, isto é transformá-lo antes da reacção numa forma activa como por exemplo um halogeneto de ácido ou uma azida.

Os derivados da insulina da fórmula II (a/b) da presente invenção e/ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis são utilizados principalmente como substâncias activas para uma composição farmacêutica para o tratamento de diabetes mellitus.

É portanto um objectivo da presente invenção um processo para a preparação de uma composição farmacêutica que se caracteriza por se incorporar como princípio activo uma quantidade eficaz de pelo menos um derivado da insulina da fórmula II e/ou pelo menos um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis sob forma dissolvida, amorfa e/ou cristalina - de preferência sob forma dissolvida.

São adequados para a preparação destas composições farmacêuticas os derivados da insulina da fórmula II seguintes AO-Arg-des-B30-insulina humana

AO-Arg-insulina humana

A0-Arg-B31-Arg-OH-insulina humana e

A0-Arg-B31-Arg-B32-Arg-0H-insulina humana

e os respectivos sais fisiologicarcente aceitáveis.

A composição farmacêutica é de preferência uma solução ou uma suspensão para injecção com um valor de pH entre cerca de 3,0 e 9,0, especialmente entre cerca de 5,0 e 8,5 a qual contém um agente de isotonicidade adequado, um conservante adequado e eventualmente um tampão adequado, bem como de preferência ainda uma concentração determinada de iões de zinco ou um outro princípio de depot como por exemplo sulfato de protamina, tudo naturalmente em solução ou suspensão aquosa estéril. 0 conjunto dos componentes da composição farmacêutica com excepção da subtância activa formam a substância veicular do preparado .

São agentes de isotonicidade adequados por exemplo glicerina, glucose, manitol, NaCl e compostos de cálcio ου de magnésio como CaCl₂, MgCl₂, etc..

São conservantes adequados por exemplo fenol, m-cresol, álcool benzílico e/ou p-hidroxibenzoatos.

Como substâncias tampão, especialmente para o ajuste de um valor de pH entre 5,0 e 8,5, é possível usar por exemplo acetato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio, etc.. Em alternativa são também adequados para o ajuste do valor do pH ácidos fisiologicamente aceitáveis diluídos (normalmente HC1) ou bases (normalmente NaOH).

Quando a composição farmacêutica contêm zinco, considera-se preferida uma concentração de zinco de 1 pg a 2 mg/ml, de preferência de 5 pg a 200 pg/ml.

Com o objectivo de variar o perfil de actividade das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção é possível incorporar adicionalmente à composição farmacêutica uma outra insulina modificada (ver EP-B 132 769 e EP-B 132 770) e/ou uma insulina não modificada, de preferência insulina de bovino, de suíno ou humana, de modo especialmente preferido insulina humana.

As concentrações da substância activa preferidas são

tais que correspondem a cerca de 1 a 1500 Unidades internacionais/ml, de preferência de cerca de 5 a 1000 Unidades internacionais/ml e de modo especialmente preferido de cerca de 40 a 400 Unidades internacionais/ml.

A composição farmacêutica é preparada dando uma forma de apresentação adequada a uma mistura de pelo menos um derivado da insulina da fórmula II e/ou pelo menos um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, eventualmente em conjunto com outras insulinas ou outros derivados da insulina modificados e/ou não modificados, com uma substância veicular fisiologicamente aceitável bem como eventualmente com aditivos e adjuvantes.

A presente invenção á em seguida elucidada mais em pormenor por meio dos exemplos que se seguem.

Preparação de AQ-Arg-de3-B30-insullna humana de acordo com a variante processual a)

A) Preparação de um produto de partida da fórmula III:

A1) gene sintético reproduzido no Quadro 1 (1) é sintetizado de acordo com o método da fosfoamidite de um modo conhecido em si. Para a escolha dos codOes tomou-se em consideração a preferência dos estreptomicetes para G e C. Como o gene que codifica para a proinsulina de macaco da EP-A 0 289 936 (ver Quadro 2) o gene (1) também apresenta de acordo com o Quadro 1 na extremidade 5’ uma sequência saliente típica para a enzima de restrição EcoRI. Após o gene estrutural encontram-se dois codOes de paragem e uma sequência adaptadora com um local de reconhecimento para a enzima Sall. Na extremidade 3* encontra-se a sequência saliente correspondente à enzima de restrição HindIII.

Corta-se o plasmídeo comercial pUC19 com as enzimas EcoRI e HindIII e integra-se o gene sintético (1) de acordo com o Quadro 1. Obtém-se deste modo o plasmídeo p13 (2). Após amplificação corta-se o gene sintético com as enzimas EcoRI e Sall sob a forma de um fragmento (3) e utiliza-se para as fases restantes da construção.

Digere-se o plasmídeo pUC19 completamente com Smal e liga-se com a sequência de terminação (4) reproduzida no Quadro 2. Designaram-se os plasmídeos que contêm esta sequência na orientação correcta por pT3 (5). Abre-se este plasmídeo (5) com EcoRI e preenche-se o local de corte com polimerase de ADN (fragmento de Klenow). Por religação obtém-se o plasmídeo pT4 (6). Abre-se este plasmídeo com as enzimas Sall e Sphl e isola-se o fragmento maior (7).

Corta-se o plasmídeo pKK400 (8) (ver EP-A 0 289 936, Figura 4, (20)) com Sphl e EcoRI e isola-se o fragmento menor (9) com o gene de tendamistato.

Por ligação dos fragmentos (3), (7) e (9) obtém-se o plasmídeo pKK700 (10), no qual à sequência de tendamistato se segue o elo em ponte que codifica para 12 ácidos aminados

Phe	Asn	Ala	Met	Ala	Thr	Gly	Asn	Ser	Asn	Gly	Lys
TTC	AAT	GCG	ATG	GCC	ACC	GGG	ATT	TCG	AAC	GGC	AAG
AAG	TTA	CGC	TAC	CGG	TGG	CCC	TAA	AGC	TTG	CCG	TTC

EcoRI e a este o gene para a proinsulina modificada. A ordenação correcta é controlada por corte com Sphl e SstI, obtendo-se deste modo a partir do plasmídeo de cerca de 3,5 kb um fragmento de 826 pb. Por sequênciação de ADN de acordo com o método di-desoxi é confirmada a correcção da sequência.

As construções génicas em que no peptídeo C fundido se substitui Lys por Arg são preparadas de modo análogo. Para este fim substitui-se o tripleto que codifica para Lys por CCC. Obtém-se de modo análogo o plasmídeo p15 e a partir deste o vector pKK800.

A Figura 1 elucida a construção génica de acordo com o método A1 aqui descrito; esta figura não está desenhada à escala .

A2)

De modo análogo ao vector pGF1 descrito em EP-A 0 289

936 prepara-se o plasmídeo de expressão pGF4 a partir dos vectores pKK700 e ρΚΚδΟΟ. Para este fim isolam-se a partir dos

vectores pKK700 e ρΚΚδΟΟ por dupla digestão com Sphl e SstI as inserções de 826 e 823 pb respectivamente e ligam-se estes fragmentos de ADM no plasmídeo de expressão pIJ702 cortado com as mesmas enzimas. Transforma-se S. lividans TK 24 com a mistura de ligação e isola-se o ADIÍ plasmídico que apresenta actividade de tendamistato (ensaios em placa) a partir dos transformantes resistentes à tioestreptona. Todos os clones positivos contêm a inserção utilizada a partir de pKK700 ou de pKK800, respectivamente .

A expressão da proteína de fusão codificada pode ser levada a efeito de modo conhecido. Incuba-se a estirpe transformante de S. lividans TK 24 durante quatro dias a 28 C em balões de Erlenmeyer agitados e separa-se o micélio do caldo de cultura por centrifugação, sendo possível em seguida detectar a proteína de fusão na solução límpida como se segue:

Tratam-se 10 a 100 pl da solução com 20 a 200 μΐ de ácido tricloroacético a 15 %, concentra-se por centrifugação a proteína precipitada, lava-se e retoma-se em tampão de amostra que contém SDS (U. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685). Após 2 minutos de incubação a 90°C separa-se por electoforese num gel de poliacrilamida-SDS a 10 a 17 ?. Obtém-se uma proteína de peso molecular 15 kD, portanto com um peso molecular na região prevista para a proteína de fusão de tendamistato com insulina. A proteína de fusão - um produto que corresponde à fórmula III - reage tanto com anticorpos contra tendamistato como também com anticorpos contra insulina.

A3)

Conservação da estirpe e fermentação

Inoculam-se estirpes de S. lividans que contêm o plasmídeo recombinante pGF4 de acordo com A2), sobre placas com meio de agar que contêm um meio complexo R2YE (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual; John Innes Foudation, Morwich, Inglaterra; 1985) e cultivam-se a uma temperatura entre 25 e 30°C, de preferência a 28°C. 0 meio de esporulaçâo contêm para estabilização do plasmídeo tioestreptona como aditivo de selecçâo numa concentração de 20 pg/ml. Após

se ter dado a esporulaçâo recolhem-se os esporos por sobreposição de uma camada de água e tratamento com ultra-sons. Após titulação dos esporos prepara-se uma solução de 10^θ esporos/ml em glicerina aquosa a 20 ? e conservam-se a -20°C.

A4)

Cultura

Utiliza-se um meio nutriente de pré-cultura complexo constituído por farinha de soja (20 g/1), glucose (10 g/1), amido de milho (2 g/1), ureia (1 g/1), nitrato de amónio (1 g/1) extracto de malte (5 g/1) e KH^PO^ (2 g/1) e como aditivo de selecçâo tioestreptona numa concentração de 10 a 50 pg/1. Para inoculo utilizam-se 5 x 10^ esporos/1 de volume final. Agita-se a pré-cultura a 220 rpm a uma temperatura de 27°C e após 60 horas inocula-se a cultura principal numa diluição de 1:20.

Para meio de cultura principal usa-se um meio nutriente complexo cujo pH é ajustado a 7,2 e que é constituído por amido solúvel (40 g/1), licor de maceração de milho (4 g/1), leite em pó magro (7 g/1), glucose (10 g/1), (NH^^SO^ (12 g/1) e farinha de soja (4 g/1).

A fermentação é levada a efeito durante 48 horas em fermentadores normais agitados com um arejamento de 0,5 vvm de ar, uma agitação de 200 a 240 rpm e a 25°C. Após terminada a fermentação efectua-se um processamento final do caldo da cultura pelo qual se separa o agregado celular do caldo por meio de filtração num filtro de placa fechado para evitar a formação de aerossois. 0 filtrado da cultura límpido contêm a proteína de fusão pretendida.

rendimento da proteína de fusão é superior até 20 quando o valor do pH do meio da cultura principal é conservado constante entre 6,5 e 7,2, de preferência em 6,9, por adição de NaOH e de ácido fosfórico a 3 ?.

A5)

Isolamento da proteína de fusão PTF1

Tratam-se com 4,0 g de p-cloro-metacresol para matar

a cultura 3θ 1 do caldo de cultura da fermentação de Streptomyces lividans para a formação da proteína de fusão codificada pelo plasmídeo obtida de acordo com o processo da EP-A-0 289 936, seguidamente designada por PTF1 , e deixa-se em repouso durante 30 minutos. Após este tempo separa-se a massa celular num filtro prensa e ajusta-se o pH do filtrado sob arrefecimento com ácido tricloroacético ao valor 4,0. Após 3 horas recolhe-se o precipitado por centrifugação. Em seguida por agitação com um volume de 10 vezes de acetona eliminam-se as gorduras. Filtra-se a fase acetónica e despreza-se. Por adição a uma solução de ureia 6 molar e ajustamento do valor do pH a 7,5 solubiliza-se a proteína PTF1 e separa-se do material insolúvel residual por uma nova centrifugação. A fase líquida límpida pode ser feita passar directamente através de uma coluna de Q- 'Sepharose que tenha sido equilibrada com tampão de Tris/HCl (pH 7,5) em ureia 3 molar. A coluna (5 cm de diâmetro, 15 cm de altura) contêm 300 ml de permutador de iões. A eluição é efectuada com uma solução de NaCl-ureia de 0 a 0,5 molar.

As fracções que contêm a PTF1 são reunidas e são desmineralizadas por diálise. Fazem-se passar 300 mg do produto concentrado através de uma coluna de HPLC Macrobore ^>Nucleosil 120 - 10 C4 e faz-se a eluição com ácido trifluoroacético a 0,1 Ϊ a que se adiciona uma quantidade de acetonitrilo até formar uma pasta. A proteína é dissolvida da coluna com acetonitrilo a 36 %. As fracções correspondentes são libertadas do solvente sob vácuo. Resultam 186 mg de PTF1 pura. A fórmula estrutural encontra-se reproduzida na Figura 2.

A6)

Dobragem da proteína de fusão PTF1

Dissolvem-se 34 mg de PTF1 em 70 ml de ureia 8 molar (pH 8,6) e faz-se borbulhar hélio durante 5 minutos. Em seguida adicionam-se 760 μΐ de J3-mercaptoetanol (pH 10,5). Após 30 minutos de redução submete-se a diálise durante 16 horas em atmosfera isenta de oxigénio contra um tampão de glicina/NaOH (pH 10,5). Após este período faz-se borbulhar ar, em seguida acidifica-se e faz-se passar através de Nucleosil 120 10 Ca. A es20

trutura do produto dobrado encontra-se reproduzida na Figura 3· 0 rendimento é de 8,2 mg, correspondente a 24 £ do teórico.

A7)

Isolamento da Proteína PGF4

A proteína preparada de acordo com A4) é processada de modo análogo a A5).

Exemplo da invenção 1:

Cisão enzimática da proteína dobrada PTF1

Dissolvem-se 8,2 mg de PTF1 dobrada em 1 ml de tampão de tris (pH 8,0) e adicionam-se 10 pl de uma lisilendopeptidase (LEP) de Lysobacter enzymogenes com uma concentração de 1 mg/ml. Deixa-se a solução durante 2 horas à temperatura ambiente e em seguida faz-se passar novamente através de uma coluna de HPLC de Nucleosil 120 - 5 Ca.

Rendimento: 3,8 mg, correspondente a 92 % do teórico.

Dissolvem-se os 3,8 mg do precursor da insulina em 1 ml de tampão de tris (pH 8,4) e adicionam-se 5 pl de uma solução que contêm 1 mg/ml de tripsina. Após 90 minutos faz-se parar a reacção por redução do valor do pH a 3,0 e faz-se passar através de uma coluna de HPLC de Nucleosil 120 - 5 C4 com o sistema ácido trifluoroacético a 0,05 ? em água/acetonitrilo. Por liofilização das fracções activas obtêm-se 2,1 mg de AO-Arg-des-Thr-B30-insulina humana pura. 0 ponto isoeléctrico do novo material é de cerca de 6,2.

Exemplo da invenção 2:

Obtenção de A0-Arg-des-Thr-B30-in3ulina a partir de proteínas de E. coli

Produto de partida:

Por fermentação de uma estirpe de E. coli que foi transformada com um plasmídeo correspondente ao plasmídeo pWZIP dMdC (EP-A 0 286 956, Exemplo 3)> mas que codifica para uma proinsulina com uma cadeia C encurtada de uma Arg, e por isolamento em seguida bem como por transformação da proteína formada obtêm-se um precursor da insulina análogo.

Invenção:

Dissolvem-se 208 mg deste material em 100 ml de tampão de tris/HCl 0,1 M (pH 8,4) e trata-se com 1 mg de uma lisilendopeptidase de Lysobacter enzymogenes dissolvida no mesmo tampão. Deixa-se reagir à temperatura ambiente com agitação ocasional durante 4 horas. A reacção é seguida regularmente por HPLC. Após o tempo indicado cinde-se o peptídeo C em 95 í. Para esse fim adicionam-se à mistura reaccional 416 μΐ de solução de tripsina (concentração 1 mg/ml) e deixa-se reagir durante mais 3 horas. Em seguida faz-se parar a reacção por acidificação com ácido trifluoroacético e faz-se passar a mistura reaccional através de uma coluna de Nucleosil RP-C4 (25 cm x 4,8 cm) no sistema de solventes água/ácido trifluoroacético (0,1 $) - acetonitrilo. Resulta após liofilizaçâo das fracções que contêm insulina 88 mg de AO-Arg-des-Thr-B30-insulina humana.

Preparação de AO-Arg-insulina humana de acordo com a variante processual b):

Exemplo da invenção 3:

Transformação de A0-Arg-des-Thr-B30-insulina em AO-Arg-insulina

Dissolvem-se 13 mg de Â0-Arg-B30-des-Thr-insulina, obtida de acordo com os Exemplos de invenção 1 ou 2, com 0,25 ml de ácido acético 10 M e 0,65 ml do éster metílico de L-treonina 1,54 M em DMS0/butanodiol-1,3 (1:1). A esta solução adicionam-se 150 pl de lisilendopeptidase de Lysobacter enzymogenes (Calbiochem NS. 440275) dissolvida em água (14 mg/ml). 0 pH resultante é de cerca de 5,3. Deixa-se repousar a mistura reaccional durante 2 horas à temperatura ambiente. Resultam 94 % do correspondente éster metílico da AO-Arg-insulina humana. A reacção é seguida por meio de HPLC. A proteína é precipitada por adição de 1 ml de metanol e 4 ml de éter metil-terc-butílico. Lava-se o precipitado uma vez com éter e seca-se. A fim de hidrolisar o éster metílico deixa-se o produto em repouso em 10 ml de tampão de glicina, 0,1 M + butilamina 10 mM a pH = 10,0 durante algumas horas.

Claims

Processo para a preparação de insulina da fórmula II derivados da

AO

H-Arg

A1 -^S-^S- A21 Gly cadeia A Asn -OH I s I I s I (II) B1 s l s ! B29 Phe cadeia B Lys -r³°-r³¹

na qual

a) R + R^J em conjunto = OH [= fórmula Ila] ou

b) R = um resíduo de um ácido aminado L neutro e geneticamente codificável e R³¹ = OH ou representa um grupo orgânico fisiologicamente aceitável de característica básica cora um máximo de 50 átomos de carbono em cuja constituição participam 0 a 3 ácidos aminados «x e cuja função carboxilo livre terminal eventualmente existente se pode apresentar sob a forma de uma função éster, de uma função amida de uma lactona ou reduzida a CH_?OH [=fórmula Ilb],

30 31 com excepçâo dos casos em que simultaneamente R - Ala, R = OH bem como as cadeias A e B são as sequências da insulina de bovino, e dos seus sais fisiologicamente aceitáveis caracterizado por, a) fazer contactar ura produto derivado da insulina da fórmula

III ou IV

A1

A21

-Lys-X

Arg Gly cadeia A

Asn

-OH (III)

B1

B29 ^R1-^Y

Phe cadeia 3

Lys - R

A1

A21

R₂-Lys-Arg^R1^Y Gly

B1

Phe cadeia A cadeia B

Asn

-OH

B29 (IV)

Lys kR³⁰-R³¹ em que

X = resíduos de ácidos aminados L codificáveis geneticamente iguais ou diferentes,

Y = Lys ou Arg, n = 0 ou um número inteiro de 1 a 60, ^R1 ^{e R}2 ~ ^Ou resíduos de um ácido aminado natural - eventualmente derivatizados -, ou resíduos de peptídeos formados por 1 a 90 ácidos aminados, de preferência por 70 a 80 ácidos aminados eventualmente derivatizados

30 31 - R e R possuem o mesmo significado dado em relação a formula

II e as cadeias A e B(1-29) apresentam de preferência as sequ24 ências da insulina humana, de suíno ou de bovino, especialmente da insulina humana ou de suíno, com lisilendopeptidase, provocando a cisSo das ligações na extremidade C-terminal do resíduo de lisilo, e eventualmente - isto é, quando Y = Arg - fazer-se reagir ainda com tripsina ou com uma endopeptidase semelhante à tripsina, cindindo deste modo a fracção R^-Y da cadeia B e obtendo um derivado da insulina AO-Arg-des-B3C da fórmula lia, e/ou por

b) para a preparação de um derivado da insulina da fórmula Ilb, fazer-se reagir um derivado da insulina AO-Arg-des-B30 da fórmula lia na presença de lisilendopeptidase ou de tripsina ou de uma endopeptidase semelhante à tripsina com um compostos da fórmula V

H-R³°-R³¹ (V),

30 31 em que R e R possuem os significados definidos em relação a fórmula Ilb e em que as funções COOH-, OH-, SH-, í^-, guanidino- e/ou imidazolo livres existentes podem apresentar-se protegidas de um modo conhecido em si, e em seguida eliminar os grupos protectores eventualmente existentes de um modo conhecido em si, ou por

c) fazer reagir uma AO-Arg-des-octapeptídeo-(B23-30)-insulina da fórmula VI

AO A1

ArgA21

Gly cadeia A

Asn

-OH

S

I s

s

I ί

s (VI)

B1 I ί B22 H - Phe cadeia B Arg -OH

na presença de tripsina ou de uma endopeptidase semelhante à tripsina com um composto da fórmula VII

H-Gly-Phe-Phe-Tyr-Tyr-Pro-Lys-R³°-R³¹ (VII) em que Ρ³θ e R³^ possuem os mesmos significados já definidos em relaçSo à fórmula II(a/b) e em que as funções COOH-, OH-, SH-, NH^-, guanidino- e/ou imidazolo livres existentes podem apresentar-se protegidas de um modo conhecido em si, e em seguida eliminar os grupos protectores eventualmente existentes de um modo conhecido em si, ou por

d) fazer reagir uma insulina ou um derivado da insulina da fórmula II*

H

A1 -S-S- A21 Gly cadeia A Asn -OH I s I I s 1 B1 1 s 1 1 s ! B29 Phe cadeia B Lys

em que Κ³θ e R³^ possuem os mesmos significados já definidos em relaçSo à fórmula II(a/b) e em que os grupos amina reactivos - com excepçSo dos grupos amina em Al-Gly - se encontram protegidos de modo conhecido, com arginina, cujos grupos amina se encontram igualmente protegidos de modo conhecido e cujo grupo carboxilo se encontra eventualmente sob forma activada, e em seguida eliminar os grupos protectores existentes de modc conhecido, e por eventualmente se transformarem os produtos finais de qual· quer das variantes processuais a-d nos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

- 26
2ã

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem derivados da insulina da fórmula lia em que + R^ em conjunto = OH, e eventualmente os seus sais fisiologicamente aceitáveis.

_
3a _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se prepararem derivados da insulina da fórmula

Ilb em que = um resíduo de Ala, Thr ou Ser, especialmente de Thr e R = OH, Arg-OH ou Arg-Arg-OH e eventualmente os seus sais fisiologicamente aceitáveis.

_ Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se prepararem compostos da fórmula II em que a cadeia A e a cadeia B (B1 a B29) são as sequências da insulina humana, da insulina de suíno ou da insulina de bovino, de preferência as sequências da insulina humana ou da insulina de suíno e eventualmente por se transformar o produto obtido num seu sal fisiologicamente aceitável.

- 5â Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a
4, caracterizado por se preparar um composto da fórmula II com um ponto isoeléctrico entre 5,5 e 9,0.

- 6§ Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de Diabetes mellitus caracterizado por se incorporar como substância activa pelo menos um derivado da insulina da fórmula II (a/b) de acordo com a defi27 niçâo da reivindicação 1 e/ou pelo menos um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, eventualmente com outro ou outros derivados da insulina modificados e/ou não modificados com uma substância veicular fisiologicamente aceitável bem como eventualmente com aditivos e/ou adjuvantes apropriados, numa forma de apresentação apropriada.

- 7§ _

Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se utilizarem os derivados da insulina da fórmula II (a/b) e/ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis sob forma dissolvida, amorfa e/ou cristalina, de preferência sob forma amorfa e/ou cristalina.

- 8s Processo de acordo com qualquer das reivindicações 8 e 9, caracterizado por se utilizar pelo menos um dos seguintes derivados de insulina abrangidos pela fórmula II (a/b):

AO-Arg-des-B30-insulina humana,

AO-Arg-insulina humana,

A0-Arg-B31-Arg-0H-insulina humana e

A0-Arg-B31-Arg-B32-Arg-0H-insulina humana bem como os seus sais fisiologicamente aceitáveis.

- 9® Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 6 a 8, caracterizado por se preparar a composição farmacológica sob a forma de uma solução ou suspensão injectável com um valor de pH entre cerca de 3,0 θ 9,0 de preferência entre cerca de 5,0 e 8,5.

Quadro 1

B

ASN SER ASN GLY LYS PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HIS A AT TCG AAC GGC AAG TTC y, yi y» Uil AAC CAG CAC CTG TGC GCC TCG CAC GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG CTC GTG C-AC ACG CCG AGC C-TG (EcoRI) 20 30 LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHE CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC GAG CAC CTC CGG GAG ATG C-AC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG

C¹ A¹ 40

TYR THR PRO LYS THR LYS ARG GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SER TAC ACC CCC AAG ACC AAG CGG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC ATG TGG GGG TTC TGG TTC GCC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG 50 ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STP ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA TAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT

GTC GAC CTG CAG CCA CAG CTG GAC GTC GGT TCG A

Sall (HindIII)

Quadro 2
5’-CGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAAC

GTGGATCGCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTA

AAAGTTGCACCTAG-5’

A requerente reivindica a prioridade do pedi dc alemSo apresentado em 29 de Dezembro de 1988, sob o nQ. P 38 44 211.6.

Lisboa, 28 de Dezembro de 1989 o AGE5TE OFICUL DA PROPRIEDADE ISDUSIEÍAL

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS DA INSULINA E DE

UMA COMPOSIÇÃO FARMACfiUTICA QUE OS CONTfiM

A invençSo refere-se a um processo para a preparação de derivados da insulina da fórmula II

AO A1 O o A21 H-Arg - Gly cadeia A Asn -OH I S I I s I B1 I S I I s I B29 H - Phe cadeia B Lys

bem como dos seus sais fisiologicamente aceitáveis que compreende nomeadamente fazer contactar um produto derivado da insulina da fórmula III ou IV