FI102843B - Menetelmä oleellisesti puhdistettujen insuliinijohdannaisten valmistam iseksi - Google Patents

Description

102843

Menetelmä oleellisesti puhdistettujen insuliini johdannaisten valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää oleellisesti puhdistet-5 tujen insuliinijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava II

AO AI —S-S- A21

H-Arg - Gly A-ketju Asn -OH

S S (II) I 1 B1 S S B29 _!_!_

H - Fhe B-ketju Lys-R30-R3L

15 jossa a) R30 ja R31 ovat yhdessä OH [= kaava Ha] , tai b) R30 on neutraalin, geneettisesti koodautuvan L-aminohapon jäännös, ja 20 R31 on OH tai 1-3 L-aminohappoa [= kaava Hb] , lukuunottamatta yhdistettä, jossa samanaikaisesti R30 on Ala, R31 on OH ja A- ja B-ketju ovat naudan insu-liinisekvenssit, sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

25 Insuliinia ja insuliinijohdannaisia tarvitaan tun netusti huomattavia määriä sokeritaudin hoitoon ja niitä tuotetaan osittain myös teollisessa mittakaavassa. Huolimatta jo olemassa olevien, erilaisen vaikutusprofiilin omaavien insuliinivalmisteiden ja -muunnoksien huomatta-30 vasta määrästä on johtuen organismien erilaisuudesta, ja - · niiden yksilön sisäisistä ja yksilöiden välisestä vaihte lusta yhä olemassa tarve saada käyttöön uusia insuliini-tuotteita, joiden ominaisuudet ja vaikutuksen ominaispiirteet poikkeavat aiemmista.

2 102843

Hidastetun vaikutuksen omaavia insuliinijohdannaisia kuvataan esimerkiksi patenttijulkaisuissa EP-B-132 769 ja EP-B-132 770. Kysymyksessä ovat erityisesti insuliinin B-ketjun asemassa B31 emäksisestä modifioidut johdannai-5 set, joilla on seuraava kaava I: AI S-S A21

1 I

H- Gly A-ketju Asn -Oh

io 1 I

I * {I) f ? Λ'- Vai B-ketju 15 jossa R1 on H tai H-Phe, R30 on neutraalin, geneettisesti koodautuvan L-aminoha-pon jäännös, ja R31 on luonteeltaan emäksinen, fysiologisesti vaaraton or-20 gaaninen ryhmä, joka käsittää korkeintaan 50 hiiliatomia ja jonka rakenteeseen osallistuu 0-3 alfa-aminohappoa ja jonka mahdollisesti läsnä oleva päätykarboksyylifunktio voi olla vapaassa muodossa, esterifunktiona, amidifunktio-na, laktonina tai olla pelkistynyt ryhmäksi CH2OH.

25 Näiden insuliinijohdannaisten isoelektrinen piste on tunnusomaisesti 5,8 - 8,5 (isoelektrisellä fokusoinnilla mitattuna). Ei-modifioidun natiivin insuliinin tai pro-insuliinin isoelektriseen pisteeseen (pH:ssa 5,4) verrattuna neutraalialuetta kohden siirtynyt isoelektrinen piste 30 määräytyy molekyylin pinnalla emäksisestä modifioinnis-• ta seurauksena sijaitsevasta yhdestä tai useammasta yli määräisestä positiivisesta varauksesta. Näin muodoin nämä emäksisesti modifioidut insuliinijohdannaiset ovat fysiologisesti tärkeällä neutraalialueella vähemmän liukoisia 9 · 3 102843 kuin natiivi insuliini tai proinsuliini, jotka neutraali-alueella normaalisti esiintyvät liuenneina.

Kaavan I mukaisten emäksisesti modifioitujen insuliini johdannaisten hitaan vapautumisen, tai tietystä 5 varannosta jatkuvan vapautumisen, vaikutus johtuu niiden niukkaliukoisuudesta isoelektrisessä pisteessä. Insu-liinijohdannaiset saadaan jälleen fysiologisissa olosuhteissa liukenemaan kummankin edellä mainitun julkaisun mukaan pilkkomalla pois ylimääräiset emäksiset ryhmät, 10 mikä tapahtuu johdannaisesta riippuen käyttäen trypsiini- tai trypsiinin kaltaista ja/tai karboksipeptidaasi-B- tai karboksipeptidaasi-B:n kaltaista ja/tai esteraasiaktiivi-suutta. Kulloinkin poislohkotut ryhmät pvat joko puhtaasti fysiologisia metaboliitteja tai helposti metaboloituvia, 15 fysiologisesti vaarattomia aineita.

Insuliinin emäksisellä modifioinnilla saatua varan-toperiaatetta, johon edellä viitattiin, hyödynnettiin edelleen sittemmin valmistamalla ja käyttämällä muita -pääasiassa A- ja B-ketjun puitteissa - emäksisesti modi-20 fioituja insuliinijohdannaisia; vrt. EP-A-0194 864 ja EP-A-0254 516.

Tunnetaan niinikään joitakin emäksisesti modifioituja insuliinijohdannaisia, joissa emäksinen modifiointi on A-ketjun jatkeena asemasta AI eteenpäin; vrt. P. Rö-25 sen et. ai. . Biochem. J. 186 (1980) 945 - 952. Tällaisina insuliinijohdannaisina, jotka käsittävät modifiointiraken-neosina emäksisiä aminohappoja, kuvataan tässä kirjallisuuslähteessä erityisesti seuraavia: Lys-Arg-Gly^-nautainsuliini 30 Arg-Gly^-nautainsuliini • Arg-Arg-Gly^-nautainsuliini ja

Arg-Arg-Arg-Gly^-nautainsuliini.

- ' Näiden insuliinijohdannaisten biologinen aktiivi suus on ei-modifioituun insuliiniin verrattuna oletetta-35 vasti huomattavasti alentunut; vrt. erityisesti mainitun • · 4 102843 kirjallisuuslähteen taulukko 1 sivulla 947. Yhdisteiden mahdollisesta varanto- (eli hitaan vapautumisen) vaikutuksesta ei kyseisessä kirjallisuuslähteessä mainita mitään.

Pyrittäessä edelleen kehittämään edellä mainittua 5 varantoperiaatetta sen tekemiseksi edullisella tavalla

hyödylliseksi sokeritaudin hoidossa löydettiin uusi ryhmä emäksisesti modifioituja insuliinijohdannaisia; kyseessä ovat insuliinijohdannaiset, joiden AO-asemassa sijaitsee emäksinen aminohappo arginiini ja joilla on seuraava kaava 10 II

AO AI -S-S- A21

H-Arg - Gly A-ketju Asn -OH

15 J S (ID

! I

Bl- S S B29 -1- wHr30-r31

H - Phe B-ketju_Lys|K

20 jossa a) R30 ja R31 ovat yhdessä OH[= kaava Ha] , tai b) R30 on neutraalin, geneettisesti koodautuvan L-aminohapon j äännös, j a R31 on OH tai 1-3 L-aminohappoa [= kaava Hb] , 25 lukuunottamatta yhdiste, jossa samanaikaisesti R30 on Ala, R31 on OH ja A- ja B-ketju ovat naudaninsuliinisek-venssit [eli siis AO-Arg-nautainsuliini].

sekä näiden insuliinijohdannaisten fysiologisesti hyväksyttävät suolat (kuten esim. alkali- tai ammonium-30 suolat).

Nämä uudet insuliinijohdannaiset omaavat - samoin kuin tunnetut emäksisesti modifioidut insuliinijohdannaiset - seurauksena emäksisestä modifioinnista AO-asemassa hitaan vaikutuksen profiilin ja omaavat - tunnettuihin 35 emäksisesti modifioituihin insuliinijohdannaisiin verrat-

. I I

5 102843 tuna - kiistattomia etuja liittyen soveltuvuuteen elimistölle; lisäksi huomioon ottaen kirjallisuuslähteessä P. Rösen et.ai. (suora) esitetyt tiedot on hyvin yllättävää, että niiden biologinen aktiivisuus vastaa natiivin insu-5 liinin biologista aktiivisuutta.

a) Kaavan II mukaiset yhdisteet, joissa R30 ja R31 ovat yhdessä OH, ovat vastaavia A0-Arg-Des-B30-insuliine-ja; nämä yhdisteet ovat erityisen edullisia.

b) Vaihtoehtoisesti kaavassa II R30 voi olla myös 10 neutraalin, geneettisesti koodautuvan L-aminohapon jäännös ja R31 OH, tai 1-3 L-aminohappoa.

Neutraaleja, geneettisesti koodautuvia L-aminohap-poja - R30:ksi - ovat Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe ja Pro; edullisia ovat Ala, 15 Thr ja Ser, erityisesti kuitenkin Thr.

Jos R31 on OH, saadaan insuliinijohdannaisia, jotka eroavat vastaavista insuliineista vain modifikaation A0-asemassa (Arg) osalta - jos kyseessä on erityisen edullinen neutraali, geneettisesti koodautuva L-aminohappo Thr 20 (ja A- sekä Bl-B29-ketju ovat humaani-insuliinisekvenssit) , on tämä AO-Arg-humaani-insuliini.

Jos R31 on vastaava 1-3 aminohappoa käsittävä ryhmä saadaan insuliinijohdannaisia, jotka eroavat aiemmin mainittujen julkaisujen EP-B-132 769 ja EP-B-132 770 mu-25 kaisista emäksisesti modifioiduista insuliinijohdannaisis ta periaatteessa vain ylimääräisen Arg-jäännöksen AO-asemassa osalta.

Jos R31:n rakenteessa esiintyy korkeintaan kolme (3) aifa-aminohappoa, nämä ovat ensisijaisesti neutraaleja 30 tai emäksisiä luontaisesti esiintyviä L-aminohappoja. Neutraaleja luontaisesti esiintyviä aminohappoja ovat erityisesti Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro ja Hyp. Emäksisiä luontaisesti esiintyviä aminohappoja ovat erityisesti Arg, Lys, Hyi, Orn, Cit 35 ja His. Jos läsnä on vain neutraaleja alfa-aminohappoja, s 102843 niiden päätykarboksyylifunktio ei - koska R31 on luonteeltaan emäksinen - voi olla vapaa; karboksyylifunktion on tässä tapauksessa erityisesti oltava esteröity tai ami-doitu emäksisellä ryhmällä, jolloin tällaisina emäksisinä 5 ryhminä tulevat kyseeseen esimerkiksi seuraavat mainitut emäksiset ryhmät:

Amino- (C2-C6) -alkoksi, (Cj.-^) -alkyyliamino- (C2-C6) -alkoksi, di-(Ci-Cj -alkyyliamino- (C2-C6) -alkoksi, tri-(¢^-C4) -ammonio- (C2-C6) -alkoksi, amino- (C2-C6) -alkyyliamino, 10 [ (Cj-CJ -alkyyliamino] - (C2-C6) -alkyyliamino, di-(^-^)-al kyyliamino-(C2-C6)-alkyyliamino tai [tri- (C^-C,,) -alkyyliamino] - (C2-C6) -alkyyliamino, erityisesti -O- [CH2] P-NR2, -O-[CH2]p-tTR3, -NH-[CH2]p-NR2 tai -NH-[CH2] p-N"R3, jossa p on 2 -6 ja R:t ovat identtiset tai poikkeavat toisistaan ja ovat 15 kukin tahollaan vety tai (C^-C^) -alkyyli. Luonnollisesti nämä emäksiset esteri- tai amidiryhmät voivat salvata myös emäksisten alfa-aminohappojen karboksyyli funktion. Emäksisten alfa-aminohappojen karboksyylifunktion salpaukseen -mikäli salpaus on toivottava - saattavat soveltua myös 20 neutraalit esteri- tai amidiryhmät, kuten esimerkiksi (Cl-C6)-alkoksi, (C3-C6)-sykloalkyylioksi, NH2, (C2-Ce) -alkyy liamino tai di-(Cj-Cg)-alkyyliamino .

Päätykarboksyylifunktio voi esiintyä laktonin muodossa luonnollisesti vain, jos päätyaminohappo on hydrok-25 s i aminohappo.

R31 koostuu edullisesti yhdestä, kahdesta tai kolmesta edellä mainitusta emäksisestä luontaisesti esiintyvästä aminohaposta; erityisen edullisesti R31 on Arg-OH tai Arg-Arg-OH.

30 R31:n erityisen edulliseen merkitykseen yhdistyy ,· edullisesti, että R30 on Ala, Thr tai Ser, erityisesti kui tenkin Thr. Kun R30 on Thr ja A-ketju sekä B1-B29-ketju ovat humaani-insuliinisekvenssit, saadaan A0-Arg-B31-Arg-OH-humaani-insuliini ja AO-Arg-B31-Arg-B32-Arg-OH-humaani-35 insuliini.

« 7 102843

Kaavassa II A-ketju ja Bl-B29-ketju voivat periaatteessa olla minkä tahansa kuviteltavan insuliinin sekvenssejä; edullisesti ne kuitenkin ovat humaani-, sika- tai nautainsuliinisekvenssejä, erityisesti humaani-insuliini-5 sekvenssejä (joka A1-A21- ja Bl-B29-sekvenssien osalta on identtinen sikainsuliiniin nähden).

Kaavan II mukaisten insuliinijohdannaisten iso-elektrinen piste on 5,5 - 9,0 (isoelektrisellä fokusoinnilla mitattuna)·.

10 Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan II mukais ten insuliinijohdannaisten valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) insuliiniyhdiste, jolla on kaava III tai IV -Lys-Xn 15 AI_|— S S —|_A21

Arg- Gly A-ketju Asn -OH

-T—-1- S S (III)

I I

B1 SS B29 20 ____I_I_ R^Y- Phe B-ketju Lys-R30 25 AI_S— S—j A21

Rj-Lys-Arg- Gly A-ketju Asn ”0H

T T (IV)

I I

B1 S S B29 __I_I_ 30 RJ.-Y- Phe B-ketju_Lys|R30-R31 joissa X:t ovat keskenään identtisiä tai erilaisia geneettisesti koodautuvien L-aminohappojen jäännöksiä, Y on Lys tai Arg, 35 n on 0 tai kokonaisluku 1-60, 8 102843

Ri ja R2 ovat molemmat vety, tai luontaisen aminohapon jäännöksiä - valinnaisesti johdannaisen muodossa - tai 1 -90, edullisesti 70 - 80, luontaisesta aminohaposta koostuvia peptidijäännöksiä - valinnaisesti johdannaisen muodos-5 sa, R30 ja R31 ovat kuten määritelty kaavan II yhteydessä ja A-ja B(1-29)-ketjut ovat edullisesti humaani-, sian tai nau-daninsuliinisekvenssejä, erityisesti humaani- tai sianin-suliinisekvenssejä, saatetaan kosketukseen lysyyliendopep-10 tidaasin kanssa, jolloin sidokset Lys-jäännöksien C-pää-dyssä katkeavat, minkä jälkeen valinnaisesti - eli kun Y on Arg - suoritetaan edelleen trypsiinikäsittely tai käsittely trypsiinin kaltaisella endopeptidaasilla, jolloin osa Rx - Y lohkeaa B-ketjusta ja muodostuu kaavan Ha mu-15 kainen A0-Arg-Des-B30-insuliinijohdannainen, ja/tai

b) kaavan Hb mukaisen insuliinijohdannaisen valmistamiseksi kaavan Ha mukainen A0-Arg-Des-B30-insuliini-johdannainen saatetaan lysyyliendopeptidaasin tai trypsiinin tai trypsiinin kaltaisen endopeptidaasin läsnäollessa 20 reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava V

HR30 - R31 (V) jossa R30 ja R31 ovat kuten määritelty kaavan Hb yhteydessä 25 ja jossa esiintyvät vapaat COOH-, OH-, SH-, NH2-, guanidi- no- ja/tai imidatsolifunktiot voivat olla sinänsä tunnetulla tavalla suojattuja, minkä jälkeen mahdollisesti läsnä olevat suojaryhmät poistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, minkä jälkeen valinnaisesti menettelyvaihtoehdosta a 30 tai b saatu lopputuote muutetaan sen fysiologisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Edellä esitettyjä menetelmävaihtoehtoja a) ja b) selvitetään tarkemmin seuraavasti.

Vaihtoehtoon a) liittyen lähtöaineyhdisteiden kaa-35 voja III ja IV havainnollistetaan seuraavasti: 9 102843 kaavassa III esiintyy suure X, joka on kulloinkin sama tai erilainen geneettisesti koodautuva aminohappo. Geneettisesti koodautuvia ovat seuraavat aminohapot {kulloinkin L-muodossa): 5 Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu,

Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro.

Luontaisia aminohappoja - esimerkiksi jäännöksiksi tai -jäännöksiin Rx ja R2 kaavassa IV - ovat mm. Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, 10 Pro, Hyp, Arg, Lys, Hyi, Orn, Cit ja His.

Aminohapot ja peptidiketjut voivat tavanomaiseen tapaan olla johdannaisen muodossa - eli niiden amino- ja/-tai karboksyyliryhmät voivat olla varustettuja peptidike-mian alalla tavanomaisilla suojaryhmillä.

15 Kaavan III mukaiset yhdisteet tai niiden vailla disulfidisiltoja olevat esituotteet valmistetaan edullisesti geeniteknisesti, erityisesti patenttijulkaisusta EP-A-0 289 936 tutun menetelmän mukaan. Tässä julkaisussa kuvatut esituotteet ovat fuusioproteiineja, joissa apina-20 proinsuliini (valinnaisesti lyhennettynä) on sidottu ten-damistaattiin lyhyen peptidisiltasekvenssin välityksellä. Tällaiset fuusioproteiinit voidaan ilmaista Streptomvces-soluissa ja saada erittyneinä kasvualustaan, josta ne voidaan eristää erityisen helposti. DE-hakemusjulkaisussa 25 P 3 837 273.8 (HOE 88/F 313) esitetään käytettäviksi erityisen rakenteen omaavia fuusioproteiineja, joille on tunnusomaista, että insuliinin A- ja B-ketju omaavat oikeanlaisen disulfidisiltakytkennän ja että C-peptidi on lyhentynyt aminohapoksi lysiini. Täysin analogisesti voidaan 30 valmistaa fuusioproteiini, jossa C-ketju on lyhentynyt aminohapoksi arginiini. Esitetyn menetelmän erityisen edullisen muunnoksen mukaan kuitenkin fuusioproteiinin geenissä esiintyvään lysiinikodoniin liitetään aminohapon arginiini kodoni, jolloin tuloksena saadaan fuusioproteii-35 ni, jonka C-ketju koostuu ryhmästä Lys-Arg.

10 102843

Vastaavanlaisia fuusioproteiineja voidaan valmistaa myös muiden, sinänsä tunnettujen menetelmien mukaan, esimerkiksi patenttijulkaisujen EP-A-0 227 938, EP-A- 0 229 998, EP-A-0 286 956 ja EP-A-0 290 005 mukaan EL. co-5 lissa.

Kaavan IV mukaiset yhdisteet tai niiden esituotteet valmistetaan, jolloin yksittäisketjut AI A21 10 R2 - Lys - Arg - Phe - A-ketju - Asn - OH ja B1 B29

Ri - Y - Phe - B-ketju - Lys R30 - R31 15 muodostetaan erikseen, edullisesti geeniteknisesti esimer kiksi patenttijulkaisujen EP-A-0 289 936, EP-A-0 286 956, EP-A-0 229 998, EP-A-0 227 938 ja EP-A-0 290 005 mukaisilla menetelmillä. Sitten ketjut, valinnaisesti soveliaassa muodossa suojaryhmillä varustettuina, kytketään 20 toisiinsa sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Tällaisia me netelmiä kuvataan eri tahoilla kirjallisuudessa, esim. P.G. Katsoyanniksen et.ai.. artikkelissa J.Am.Chem.Soc. 85 (1963) 2863 - 2865.

Menetelmävaihtoehdon a) suorittamiseksi kaavan III 25 tai IV mukainen yhdiste saatetaan kosketuksiin lysyyli- endopeptidaasin, esim. Lvsobacter enzymoaenes1tä. kanssa vesiliuoksessa tai -lietteessä. Käytetty (paino-) määrä puhdasta entsyymiä on edullisesti noin 1/50 - 1/10 000, erityisesti noin 1/100 - 1/1 000 kaavan III tai IV mukai-30 sen lähtöinsuliiniyhdisteen määrästä.

Reaktioseoksen pH-arvo voi vaihdella verraten laajoissa rajoissa; edullisesti vaihtelualue on kuitenkin noin 5,5 - 10,5, erityisesti noin 7-9.

Reaktiolämpötilana on edullisesti huoneenlämpötila.

» 11 102843 Pääasiassa entsyymin määrästä riippuvainen reaktioaika on muutamasta minuutista useampaan päivään, edullisesti jokunen tunti.

Entsyymi lysyyliendopeptidaasi pilkkoo peptidiket-5 juja, jotka sisältävät aminohapon lysiini, tämän karbok-syyliryhmän kohdalta. Kaavan III ja IV mukaisista yhdisteistä muodostuu tällöin Y:n ollessa Lys A0-Arg-Des-B30-insuliinia, joka voidaan puhdistaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Jos lähtöyhdisteissä III tai IV Y on Arg, ΒΙΟ ketjun N-päätyyn jää ryhmittymä I^-Y-Phe. Tällöin jäännös Rx-Y (= Ri-Arg) on lohkaistava B-ketjusta jälkipilkkomalla trypsiinillä tai trypsiinin kaltaisella proteaasilla, mikä voi tapahtua välituotetta (Ri-Arg-Phe-...) eristämättä tai myös tämän eristyksen jälkeen. Muodostunut A0-Arg-Des-B30-15 insuliinijohdannainen eristetään ja puhdistetaan sitten tunnettujen menetelmien mukaan.

Kirjallisuudessa lysyyliendopeptidaasi esitetään usein yhtenä trypsiinin kaltaisena endopeptidaasina, jolloin se kuitenkin usein mainitaan näistä erillisenä. Tässä 20 suositaan jälkimmäistä näkemystapaa.

Menettelyvaihtoehdossa b) on kyseessä kytkentäreak-tio, jossa kaavan V mukainen yhdiste - mahdollisesti mene-telmävaihtoehdon a) mukaan saadussa - (kaavan Ha mukaisessa) A0-Arg-Des-B30-insuliinijohdannaisessa kytketään 25 kaavan Hb mukaiseen AO-Arg-insuliiniin tai -insuliinijoh- dannaiseen. Tämä tapahtuu sinänsä tunnettujen menetelmien mukaan vastaavalla tavalla kuin esimerkiksi transamidoin-nille on kuvattu patenttijulkaisussa EP-B-00 56 951.

Jos tässä käytettiin suojaryhmillä varustettuja 30 lähtöyhdisteitä, nämä lohkaistaan lopuksi pois tunnettuun tapaan.

Kaavan II (a/b) mukaiset insuliinijohdannaiset ja niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat soveltuvat ensi sijassa vaikuttaviksi aineiksi farmaseuttisiin valmis-35 teisiin sokeritaudin hoitamiseksi.

12 102843

Tarkoitusta varten voidaan muodostaa farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät vähintään yhtä kaavan II mukaista insuliinijohdannaista ja/tai ainakin yhtä sen fysiologisesti hyväksyttävää suolaa liuenneessa, amfoteeri-5 sessä ja/tai kiteisessä - edullisesti amfoteerisessä ja/tai kiteisessä - muodossa.

Näitä farmaseuttisia valmisteita silmällä pitäen edullisia kaavan II mukaisia insuliinijohdannaisia ovat: AO-Arg-Des-B3 0-humaani-insuliini, 10 AO-Arg-humaani-insuliini, AO-Arg-B31-Arg-OH-humaani-insuliini, ja AO-Arg-B31-Arg-B32-Arg-OH-humaani-insuliini, sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat.

Farmaseuttinen valmiste on edullisesti injisointi-15 liuos tai -liete, jonka pH-arvo on noin 3,0 - 9,0, edullisesti noin 5,0 - 8,5, ja joka sisältää: - sopivan isotoonisen väliaineen - sopivan säilytysaineen ja - valinnaisesti sopivan puskurin, sekä 20 - valinnaisesti tietyn sinkki-ionipitoisuuden tai muun varantotekijän kuten esimerkiksi protamiinisulfaatti, jotka kaikki ovat luonnollisesti steriilissä vesiliuoksessa tai -lietteessä. Valmisteainesosat yhdessä vaikuttava aine poislukien muodostavat valmistekantajan.

* 25 Sopivia isotoonisia väliaineita ovat esim. glyse roli, glukoosi, mannitoli, natriumkloridi, kalsium- tai magnesiumyhdisteet, kuten kalsiumkloridi, magnesiumkloridi jne.

Sopivia säilytysaineita ovat esim. fenoli, m-kreso-30 li, bentsyylialkoholi ja/tai p-hydroksibentsoehappoesteri.

Puskuriaineina, erityisesti pH-arvon säätämiseksi lukemaan noin 5,0 - 8,5, voidaan käyttää esim. natriumase-taattia, natriumsitraattia, natriumfosfaattia jne. Muutoin pH-arvon säätöön soveltuvat myös fysiologisesti vaaratto- « « 13 102843 mat laimeat hapot (tyypillisesti laimea kloorivetyhappo) tai emäkset (tyypillisesti laimea natriumhydroksidi).

Valmisteen sisältäessä sinkkiä tämän pitoisuus on noin 1 mikrogrammaa - 2 mg, erityisesti noin 5 mikrogram-5 maa - 200 mikrogrammaa sinkkiä/ml.

Farmaseuttisen valmisteen vaikutusprofiilin vaih-telemiseksi valmisteeseen voidaan sekoittaa myös muita modifioituja (vrt. EP-B 132 769 ja EP-B 132 770 !) ja/tai ei-modifioituja insuliineja, edullisesti nauta-, sika- tai 10 humaani-insuliinia, erityisesti humaani-insuliinia.

Vaikuttavan aineen edullisia pitoisuuksia ovat pitoisuudet, jotka vastaavat noin 1-15 000, edullisemmin noin 5-1 000 ja erityisesti noin 40 - 400 kansainvälistä yksikköä/ml.

15 Farmaseuttinen valmiste valmistetaan siten, että ainakin yhtä kaavan II mukaista insuliinijohdannaista ja/-tai ainakin yhtä sen fysiologisesti hyväksyttävää suolaa, valinnaisesti yhdessä muiden modifioitujen ja/tai ei-modi-fioitujen insuliini(johdannaisi)en kanssa, saatetaan fy-20 siologisesti vaarattoman kantajan sekä valinnaisesti sopivien lisä- ja apuaineiden kerällä sopivaan antomuotoon.

Keksintöä esitellään seuraavaksi tarkemmin seuraa-vien esimerkkien avulla.

A0-Arg-Des-B30-humaani-insuliinin valmistus mene-25 telmävaihtoehdon a) mukaan A) Kaavan III mukaisen lähtöyhdisteen valmistus AI) Taulukossa 1 esitetty synteettinen geeni (1) syntetisoidaan sinänsä tunnetulla tavalla kemiallisesti fosfoamidiittimenetelmän mukaan. Kodonivalinnassa otettiin 30 huomioon, että Streptomvces-laiit suosivat G:tä ja C:tä. Samoin kuin patenttijulkaisun EP-A-0 289 936 (siinä taulukko 2) mukainen apinaproinsuliinia koodaava geeni omaa myös taulukon 1 mukainen geeni (1) 5'-päädyssä restriktio-entsyymille EcoRI tyypillisen ylimääräsekvenssin. Raken-35 negeenin jälkeen sijaitsee kaksi päätöskodonia ja tunnis- m 14 102843 tuskeskuksen entsyymille Sali käsittävä liittosekvenssi.

3'-päätteessä sijaitsee restriktioentsyymiä Hindlll vastaava ylimääräsekvenssi.

Kaupallisesti saatavana olevaa plasmidia pUC19 pil-5 kotaan entsyymeillä EcoRI ja Hindlll ja tuotteeseen liga- ' toidaan taulukon 1 mukainen synteettinen geeni (1). Näin saadaan plasmidi pI3 (2). Monistamisen jälkeen synteettinen geeni leikataan irti EcoRI:n ja Sallin avulla fragmenttina (3) , minkä jälkeen sitä käytetään jäljempänä kulo vatussa rakenteessa.

Plasmidi pUC19 pilkotaan täydellisesti Smalillä ja tuote ligatoidaan taulukon 2 mukaiseen päätössekvenssiin (4) . Plasmidit, jotka sisältävät tämän sekvenssin oikealla tavalla suuntautuneena, nimetään pT3:ksi (5) . Tämä plasmi-15 di (5) leikataan auki EcoRI:llä ja leikkauskohta täytetään DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti) käyttäen. Uudelleen-ligatoimalla saadaan plasmidi pT4 (6). Tämä plasmidi leikataan auki entsyymeillä Sali ja Sphl ja eristetään suurikokoinen fragmentti (7).

20 Plasmidia pKK400 (8) [vrt. EP-A-0 289 936, kuvio 4, (20)] pilkotaan Sphlillä ja EcoRI:llä ja eristetään pieni, tendamistaattigeenin sisältävä fragmentti (9).

Ligatoimalla fragmentit (3) , (7) ja (9) saadaan plasmidi pKK700 (10) , jossa tendamistaattigeeniä seuraa 25 ensin 12 aminohappoa koodaava siltasekvenssi

Phe Asn Ala Met Ala Thr Gly Asn Ser Asn Gly Lys

TTC AAT GCG ATG GCC ACC GGG ATT TCG AAC GGC AAG

AAG TTA CGC TAC CGG TGG CCC TAA AGC TTG CCG TTC

EcoRI

30 ja sen jälkeen modifioidun proinsuliinin geeni. Oikeanlaisesta järjestäytymisestä varmistutaan pilkkomalla Sphlillä ja Sstlillä, jolloin kooltaan noin 3,5 kbin plasmidista saadaan 826 bpin fragmentti. DNA-sekvensoinnilla dideok-35 simenetelmällä varmistutaan sekvenssin oikeellisuudesta.

is 102843

Geenirakenteita, joissa C-peptidinä toimivan Lys:n korvaa Arg, valmistetaan vastaavalla tavalla. Tässä tarkoituksessa Lys:ää koodaava tripletti korvataan tripletil-lä CCC. Analogisesti saadaan plasmidi pI5 ja siitä vektori 5 pKK800.

Kuvio 1 havainnollistaa geenirakenteen kokoamista tässä kuvatun menetelmän AI) mukaan; kuvio ei ole todellisuutta vastaavassa mittakaavassa.

A2) Analogisesti patenttijulkaisussa EP-A-0 289 936 10 kuvattuun vektoriin pGFl nähden vektoreista pKK700 ja pKK800 valmistetaan ilmaisuplasmidit pGF4 ja pGF5. Tässä tarkoituksessa vektoreista pKK700 ja pKK800 eristetään Sphl:llä ja Sstl:llä kaksoispilkkomalla 826 bp:n ja vastaavasti 823 bp:n insertti, minkä jälkeen nämä DNA-frag-15 mentit ligatoidaan samoilla entsyymeillä pilkottuun ilmai- suplasmidiin pIJ702. Ligatointiseoksella transformoidaan S. lividans -kanta TK 24, minkä jälkeen tiostreptoniresis-tenteistä, tendamistaattiaktiivisuutta osoittavista (mal-jakoe) transformanteista eristetään plasmidi-DNA. Kaikki 20 positiiviset kloonit sisältävät kyseisen insertin vekto rista pKK700 tai pKK800.

Koodatut fuusioproteiinit voidaan ilmaista tunne tulla tavalla. Jos transformoitua Sj_ lividans -kantaa TK 24 inkuboidaan 4 päivän ajan 28 °C:ssa ravistelukolveissa 25 ja erotetaan myseeli viljelmänesteestä sentrifugoimalla, voidaan fuusioproteiinit osoittaa kirkkaasta liuoksesta seuraavasti: 10 - 100 mikrolitraan liuosta lisätään 20 - 200 mikrolitraa 15-%:ista trikloorietikkahappoliuosta, saos-30 tunut proteiini rikastetaan sentrifugoimalla, se pestään * sekä lietetään SDS-pitoiseen näytepuskuriin (U. Laemmli, Nature 227 (1970) 680 - 685). 2 minuutin inkuboinnin 90 °C-.ssa jälkeen suoritetaan erotus elektroforeettisesti 10 -17-%:isessa SDS-polyakryyliamidigeelissä. Saadaan pro-35 teiini, jonka molekyylipaino on 15 kD:tä, joka molekyyli- 16 102843 paino siis vastaa tendamistaatista ja proinsuliinista muodostuneelle fuusioproteiinille asetettuja odotuksia. Fuu-sioproteiini - kaavan III mukainen yhdiste - reagoi sekä tendamistaattivastaisten vasta-aineiden että insuliinivas-5 täisten vasta-aineiden kanssa.

A3) Varastokanta ja fermentointi

Kohdan A2) mukaisen yhdistelmäplasmidin pGF4 sisältäviä S^_ lividans -kantoja viivasiirrostetaan ravintoagar-agar-maljoihin, jotka sisältävät kompleksisena ravintokas-10 vualustana R2YE-kasvualustaa (Hopwood et.ai.. Genetic Manipulation of Streptomvces: A Laboratory Manual; John Innes Foundation, Norwich, Englanti; 1985) ja inkuboidaan lämpötilassa 25 - 30 °C, edullisesti 28 °C:ssa. Plasmidien stabiloimiseksi itiöintialusta sisältää valikointiaineli-15 sänä tiostreptonia pitoisuuden 20 mikrogrammaa/ml. Kun itiöinti on tapahtunut, itiöt otetaan talteen lisäämällä maljapinnoille kerrokseksi vettä ja käsittelemällä ultraäänellä. Itiöiden titrauksen jälkeen valmistetaan liuos, jossa on 1010 itiötä/ml glyserolin 20-%:isessa vesiliuok-20 sessa, ja jota sitten säilytetään -20 °C:ssa.

A4) Viljelmien valmistus

Esikasvualustana käytetään kompleksista ravintokas-vualustaa, joka koostuu soijajauhosta (20 g/litra), glukoosista (10 g/litra), maissitärkkelyksestä (2 g/litra), 25 ureasta (1 g/litra), ammoniumnitraatista (1 g/litra), mal-lasuutteesta (5 g/litra) ja kaliumdivetyfosfaatista (KH2P04; 2 g/litra), ja sisältää valikointiaineena tio streptonia pitoisuuden 10 - 50 mikrogrammaa/litra. Siir-rosteeksi lisätään 5 x 109 itiötä litraa kohden lopputi-30 lavuutta. Esiviljelmää ravistellaan 220 kierr./min kier-rosnopeudella 27 °C:ssa, ja 60 tunnin kuluttua se siirros-tetaan laimennoksena 1:20 pääviljelmään.

Pääviljelmäkasvualustana käytetään kompleksista ravintokasvualustaa, jonka pH-arvo säädetään 7,2:ksi ja 35 joka koostuu liukoisesta tärkkelyksestä (40 g/litra), 17 102843 maissinliotusvedestä (4 g/litra), rasvattomasta maitojauheesta (7 g/litra), glukoosista (10 g/litra), ammoniumsul-faatista [(NH4)2S04; 12 g/litra] ja soijajauhosta (4 g/litra) .

5 Fermentoinnin annetaan kestää 48 tunnin ajan tavan omaisissa sekoitusfermentoreissa ilmastaen (0,5 vvm ilmaa), sekoittaen 200 - 240 kierr./min ja 25 °C:n lämpötilassa. Fermentoinnin päätyttyä viljelmäliuosta käsitellään edelleen erottaen solupelletit viljelmänesteestä 10 suodattamalla imulla suljetussa imusuodatusjärjestelmässä aerosolimuodostuksen estämiseksi. Kirkas viljelmäsuodos sisältää halutun fuusioproteiinin.

Fuusioproteiinisaanto on aina 20 %:iin asti korkeampi, jos pääviljelmäliuoksen pH-arvo pidetään vakiolu-15 kemassa 6,5 - 7,2, edullisesti 6,9, natriumhydroksidin ja 3-%:isen fosforihappoliuoksen avulla.

A5) Fuusioproteiinin PTF1 eristys 30 litraan Streptomvces lividans -fermentoinnin viljelmäliuosta plasmidikoodautuvan fuusioproteiinin 20 muodostamiseksi, joka saadaan patenttijulkaisun EP-A-0 289 936 mukaista menetelmää noudattaen ja jota kutsutaan seuraavassa PTFl:ksi, lisätään viljelmäsolujen tappamiseksi 4,0 g p-kloorimetakresolia, minkä jälkeen erä jätetään 30 minuutiksi seisomaan. Mainitun ajan kuluttua solumassa 25 erotetaan suodatinpuristimellä ja suodoksen pH säädetään 4,0:ksi trikloorietikkahappoa lisäämällä samalla jäähdyttäen. Kolmen (3) tunnin kuluttua sakka otetaan sentrifu-goimalla talteen. Sen jälkeen rasva-ainesosat poistetaan sekoittamalla lOx määrässä asetonia. Asetonifaasi suoda-30 tetaan eroon ja heitetään pois. Liettämällä 6 M urealiuok-seen ja säätämällä pH 7,5:een PTF1-proteiini saadaan liukenemaan, minkä jälkeen se erotetaan liukenematta jääneestä materiaalista sentrifugoimalla toistamiseen. Kirkas nestefaasi voidaan siirtää suoraan QR-Sepharose-kolonniin, 35 jota on tasapainoitettu Tris/HCl-puskurilla (pH 7,5), joka käsittää pitoisuuden 3 M urea. Kolonni (halkaisija 5 cm, 18 102843 korkeus 15 cm) sisältää 300 ml ioninvaihtohartsia. Eluoin-nissa käytetään 0 - 0,5 M NaCl-urealiuosta.

PTFl-pitoiset fraktiot kerätään, yhdistetään ja poistetaan dialysoimalla suolat. Sitten 300 mg rikastettua 5 tuotetta siirretään MacroboreR Nucleosil 120 - 10 C4 HPLC-kolonniin ja eluoidaan 0,l-%:isella trifluorietikkahappo-liuoksella lisäten kasvavia määriä asetonitriiliä. Pitoisuudessa 36 % asetonitriiliä proteiini PTF1 irtaantuu kolonnista. Vastaavista fraktioista poistetaan tyhjössä 10 haihduttamalla liuotin. Saadaan 186 mg puhdasta PTFlrtä. Rakennekaava on esitetty kuviossa 2.

A6) Fuusioproteiinin PTF1 uudelleenlaskostaminen 34 mg PTFl:tä liuotetaan 70 ml:aan 8 M urealiuosta (pH 8,6) ja liuokseen johdetaan 5 minuutin ajan helium-15 kaasua. Sitten lisätään 760 mikrolitraa beta-merkapto-etanolia (pH 10,5). 30 minuutin pelkistysajan kuluttua dialysoidaan 16 tunnin ajan happisulkua käyttäen glysii-ni/NaOH-puskuria (pH 10,5) vastaan. Kun tämä aika on kulunut, liuokseen johdetaan ilmaa, se tehdään happamaksi ja 20 erotetaan Nucleosil51 120 10 Ca -kolonnissa. Laskostuneen proteiinin rakenne on esitetty kuviossa 3.

Saanto on 8,2 mg, mikä vastaa 24 % teoreettisesta saannosta.

A7) Proteiinin PGF4 eristys 25 Kohdan A4) mukaan muodostettua proteiinia jatkokä- sitellään kohdan A5) mukaan.

Keksintöesimerkki 1: Laskostetun proteiinin PTF1 entsymaattinen pilkkominen

Saatu 8,2 mg laskostunutta PTFl:tä liuotetaan 30 1 ml:aan Tris-puskuria (pH 8,0) ja lisätään 10 mikrolitraa liuosta, jossa on 1 mg lysyyliendopeptidaasia (LEP) Lvso-bacter enzvmoqenes'tä millilitrassa. Liuos jätetään 2 tunniksi huoneenlämpötilaan, minkä jälkeen se erotetaan toistamiseen NucleosilR 120 - 5 Ca-HPLC-kolonnissa.

19 102843

Saanto on 3,8 mg, mikä vastaa 92 % teoreettisesta saannosta.

Saatu 3,8 mg insuliiniesituotetta liuotetaan 1 ml:aan Tris-puskuria (pH 8,4) ja liuokseen lisätään 5 5 mikrolitraa liuosta, jossa on 1 mg trypsiiniä millilitras-sa. 90 minuutin kuluttua reaktio keskeytetään laskemalla pH-arvo 3,0:aan ja reaktioseos erotetaan NucleosilR 120 -5 C4-HPLC-kolonnissa käyttäen eluoinnissa järjestel-mää 0,05 % trifluorietikkahappoa vesi/asetonitriilissä. Aktii-10 viset fraktiot kylmäkuivaamalla saadaan 2,1 mg puhdasta A0-Arg-Des-Thr-B30-humaani-insuliinia. Tämän uuden materiaalin isoelektrinen piste on noin 6,2.

Keksintöesimerkki 2: A0-Arg-Des-Thr-B30-insuliinin valmistus ]jh_ coli -proteiineista 15 Lähtömateriaali saadaan seuraavasti. Fermentoidaan E. coli -kantaa, joka on transformoitu plasmidilla, joka vastaa plasmidia pWZIP dMdC (EP-A-0 286 956, esimerkki 3), mutta koodaa Arg:ksi typistyneen C-ketjun omaavaa proinsu-liinia, minkä jälkeen eristämällä muodostunut proteiini 20 sekä sitä muokkaamalla saadaan analoginen insuliiniesi-tuote.

Keksinnön mukaan 208 mg tätä materiaalia liuotetaan 100 ml:aan 0,1 M Tris/HCl-puskuria (pH 8,4), minkä jälkeen se saatetaan reagoimaan 1 mg:n kanssa samaan puskuriin 25 liuotettua Lvsobacter enzvmoqenes1tä peräisin olevaa ly-syyliendopeptidaasia. Seoksen annetaan reagoida 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa sitä silloin tällöin sekoittaen. Reaktion etenemistä tarkkaillaan tasaisin väliajoin HPLC:n avulla. Mainitun ajan kuluttua C-peptidi on yli 95-%:ises-30 ti lohjennut pois. Tällöin reaktioseokseen lisätään 416 * mikrolitraa trypsiiniliuosta (pitoisuus 1 mg/ml) ja seoksen annetaan reagoida edelleen 3 tunnin ajan. Sitten reaktio keskeytetään tekemällä reaktioseos happamaksi tri-fluorietikkahappoa lisäämällä, minkä jälkeen seos erote-35 taan NucleosilR RP-C4-kolonnissa (25 cm x 4,8 cm) liuotin- 20 102843 järjestelmää vesi-trifluorietikkahappo (0,1 %) -asetonit-riili käyttäen. Insuliinipitoinen fraktio kylmäkuivaamalla saadaan 88 mg A0-Arg-Des-Thr-B30-humaani-insuliinia.

AO-Arg-humaani-insuliinin valmistus menetelmävaih-5 toehdon b) mukaan:

Keksintöesimerkki 3: A0-Arg-Des-Thr-B30-insuliinin muuttaminen AO-Arg-insuliiniksi 13 mg A0-Arg-B30-Des-Thr-insuliinia, joka on saatu keksintöesimerkin 1 tai 2 mukaan, liuotetaan seokseen, 10 jossa on 0,25 ml 10 M etikkahappoa ja 0,65 ml 1,54 M L-treoniinimetyyliesteriä DMSO/butaani-1,3-diolissa (1:1) . Liuokseen lisätään 150 mikrolitraa Lvsobacter erizvmoae-nes1tä peräisin olevaa lysyyliendopeptidaasia (Calbiochem n:o 440275), joka on etukäteen liuotettu veteen (14 mg/-15 ml). pH:ksi tulee noin 5,3. Seos jätetään 2 tunniksi huoneenlämpötilaan. Muodostuu 94 %:n saanto AO-Arg-humaani-insuliinia vastaavaa metyyliesteriä. Muutosta seurataan HPLC:n avulla. Proteiini saostetaan lisäämällä 1 ml meta-nolia ja 4 ml metyyli-tert-butyylieetteriä, minkä jälkeen 20 saatu sakka pestään kerran eetterillä ja kuivataan. Metyy-liesterin pilkkomiseksi saatu tuote jätetään muutamaksi tunniksi 10 ml:aan 0,1 M glysiinipuskuria, joka käsittää pitoisuuden 10 mM butyyliamiini tai jonka pH on 10,0.

Tämän jälkeen saostetaan toistamiseen, sakka liete-' 25 tään 0,l-%:iseen trifluorietikkahappoliuokseen ja sitä puhdistetaan preparatiivisella HPLC:llä. Puhtaat fraktiot sisältävät AO-Arg-humaani-insuliinia.

102843

Taulukko 1 B1 10 5 asn ser asn gly lys phe val asn gln hi s leu cys gly ser hi s

AAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC

GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG

(EcoRI)

20 30 1Q LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHE CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC

GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG

15 °1 A1 40

TYR THR PRO LYS THR LYS ARG GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SER

TAC ACC CCC AAG ACC AAG CGG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC

ATG TGG GGG TTC TGG TTC GCC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG

50 20

ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STP

ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA

TAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT

25

GTC GAC CTG CAG CCA CAG CTG GAC GTC GGT TCG A

Sali (Hindlll) 30

Taulukko 2

5'-CGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAAOGTGGATC

GCTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACCTAG-5' 35

Claims (5)

22 1 0 2 8 4 3

1. Menetelmä oleellisesti puhdistettujen insuliini-johdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava II 5 AO AI p“S ......S — A21 H-Arg — G ly A-ketju As n -OH S s (II)

10. I B1 S S B29 _;_I_!_ H - Phe B-ketju Lys -R30-il31, 15 jossa a) R30 ja R31 ovat yhdessä OH [= kaava Ha] , tai b) R30 on neutraalin, geneettisesti koodautuvan L-aminohapon jäännös, ja R31 on OH tai 1-3 L-aminohappoa [= kaava Hb] , 20 lukuunottamatta yhdistettä, jossa samanaikaisesti R30 on Ala, R31 on OH ja A- ja B-ketju ovat naudan insu-liinisekvenssit, sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 23 102843 a) insuliiniyhdiste, jolla on kaava III tai IV -Lys-Xn Al_j-S S-j_A21

5 Arg- Gly A-ketju Asn -OH -—r-1 s I (III) B1 S S B29 _I_I- Phe B-ketju LysR30 10--- A1 S- " S—j_A21 Rj-Lys-Arg- Gly A-ketju Asn -OH J I (IV)

15 II B1 S S B29 _I_I_ Rl-Y- Phe B-ketju Lys R30-R31 joissa

20 X:t ovat keskenään identtisiä tai erilaisia geneettisesti koodautuvien L-aminohappojen jäännöksiä, Y on Lys tai Arg, n on 0 tai kokonaisluku 1 - 60, Ri ja R2 ovat molemmat vety, tai luontaisen aminohapon 25 jäännöksiä - valinnaisesti johdannaisen muodossa - tai 1 -90, edullisesti 70 - 80, luontaisesta aminohaposta koostuvia peptidijäännöksiä - valinnaisesti johdannaisen muodossa, R30 ja R31 ovat kuten määritelty kaavan II yhteydessä ja A-30 ja B(1-29)-ketjut ovat edullisesti humaani-, sian tai naudan insuliinisekvenssejä, erityisesti humaani- tai sian insuliinisekvenssejä, saatetaan kosketukseen lysyyliendo-peptidaasin kanssa, jolloin sidokset Lys-jäännöksien C-päätteessä katkeavat, minkä jälkeen valinnaisesti - eli 35 kun Y on Arg - suoritetaan edelleen trypsiinikäsittely tai 24 102843 käsittely trypsiinin kaltaisella endopeptidaasilla, jolloin osa Rx - Y lohkeaa B-ketjusta ja muodostuu kaavan Ha mukainen A0-Arg-des-B30-insuliinijohdannainen, ja/tai b) kaavan Hb mukaisen insuliinijohdannaisen val-5 mistamiseksi kaavan Ha mukainen A0-Arg-des-B30-insuliini-johdannainen saatetaan lysyyliendopeptidaasin tai trypsiinin tai trypsiinin kaltaisen endopeptidaasin läsnäollessa reagoimaan yhdisteen kanssa, jolla on kaava V

10 H-R30 - R31 (V) jossa R30 ja R31 ovat kuten määritelty kaavan Hb yhteydessä ja jossa esiintyvät vapaat COOH-, OH-, SH-, NH2-, guanidi-no- ja/tai imidatsoliryhmät voivat olla sinänsä tunnetulla 15 tavalla suojattuja, minkä jälkeen mahdollisesti läsnä olevat suojaryhmät poistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, minkä jälkeen valinnaisesti menettelyvaihtoehdosta a tai b saatu lopputuote muutetaan sen fysiologisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ha, jossa R30 ja R31 ovat yhdessä OH, mukaisia insuliini johdannaisia, jotka muutetaan valinnaisesti fysiologisesti hyväksyttäviksi suoloikseen. ' 25

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Hb, jossa R30 on Ala-, Thr- tai Ser-, erityisesti Thr-ryhmä, ja R31 on OH, Arg-OH tai Arg-Arg-OH, mukaisia insuliinijohdannai-sia, jotka muutetaan valinnaisesti fysiologisesti hyväk-30 syttäviksi suoloikseen.

4. Jonkin tai useamman patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II, jossa A-ketju ja B-ketju (B1 - B29) ovat humaani-, sian tai naudan insuliinisekvenssejä, edullises-35 ti humaani- tai sian insuliinisekvenssejä, mukaisia yhdis- 25 102843 teitä, jotka muutetaan valinnaisesti fysiologisesti hyväksyttäviksi suoloikseen.

5. Jonkin tai useamman patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmis-5 tetaan kaavan II mukaisia yhdisteitä, joiden isoelektrinen piste on 5,5 - 9,0. « 26 1 0 2 8 4 3