DD290426A5

DD290426A5 - Human insulin analoge

Info

Publication number: DD290426A5
Application number: DD33588989A
Authority: DD
Inventors: Per Balschmidt; Jens J V Brange
Original assignee: Novo-Nordisk A/S,Dk
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-19
Publication date: 1991-05-29
Also published as: ZA899501B; DK721588D0

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung menschlicher Insulinanaloge mit einem positiv geladenen Aminosaeurerest, d. h. Lys oder Ar, in der Position B 28, d. h., in der Position 8 in der B-Kette, berechnet von &GlyB 20!, die wahlweise weiter modifiziert sind im C-Terminal-Ende der B-Kette von &PheB 24! zum C-Terminal-Aminosaeurerest, und bei denen wahlweise A 21 und/oder B 3 von Asn verschieden sind sowie von Insulinpraeparaten, welche die menschlichen Insulinanaloge enthalten.{Insulinanaloge, menschlich; Herstellung; Pharmazeutika}

Description

j-Cye-ί

H-GIy-Ile-Val-Glu-Gln-Cye-Cye-Thr-Ser-Ile-Cye-Ser-Leu-

8 9 10 11 12 13

B-Kette I

H-Phe-Val-Yg-Gln-Hie-Leu-Cys-Gly-Ser-Hie-Leu-Val-Glu 1234567 8 9 10 11 12 13

Α-Kette (fortgesetzt)

14 15 16 17 18 19 20 21

Tyr-Gln-Leu-Glu-Aen-Tyr-Cys-Yj-OH

τ—^S

B-Kette (fortgee·) ^ Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cye-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-X₁-X₂-X₃-14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

B-Kette (fortgesetzt)

X4-X5-X8

28293O₁

worin X₁, X₂, Xa, X₅, Y₁ und Y₂ jeder natürlich vorkommende Aminosäurerest sind; X₄ gleich Lys oder Arg ist; und Xe jeder natürlich vorkommende Aminosäurerest ist, der die C-Terminal-Hydroxygruppe oder-OH trägt, oder X₅ und X₆ zusammen die C-Terminal-Hydroxygruppe bilden, oder dessen pharmazeutisch akzeptables Salz mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff vermischt wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung Vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung neuartiger menschlicher Insulinanaloge, die eine niedrige Fähigkeit zur Assoziation in Lösung aufweisen. Menschliche Insulinanaloge finden in der Medizin zur Behandlung von Diabetes Mellitus Anwendung. Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Seit der Entdeckung des Insulins im Jahre 1922 wurden viele verschiedene Typen von Insulinpräparaten zur Behandlung von Diabetes meilitus eingesetzt. Anfangs wurden ausschließlich Insulinlösungen verwendet, die eine schnell einsebende und eine relativ schnell endende Insulinaktivität aufwiesen, später aber wurden Insulinpräparate hergestellt, die ein breiteres Aktivitätsprofil hatten, was durch die Senkung der Löslichkeit des Insulins durch Zusätze, wie beispielsweise Zinksalz und/oder Protamine, herbeigeführt wurde. Aus Gründen der Verfügbarkeit v/urde das bisher verwendete Insulin normalerweise aus der Pankreas von Haustieren, meistens von Rindern, Schweinen und Schafen, gewonnen, in jüngster Zeit erschienen aber auch Präparate auf dem Markt, die menschliches Insulin biotechnischen Ursprungs enthielten. Die Struktur des menschlichen Insulins wird in der folgenden Formel gezeigt:

A-Kette

I ι

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cye-Cye-Thr-Ser-Ile-Cye-Ser-Leu-Tyr-1 2 3 4 5 6 7l 8 9 IO 11 12 13 14

B-Kette

I s

H-Phe-Val-Asn-Gln-Hie-Leu-Cye-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-12 3 4 5 6 7 θ 9 10 11 12 13 14

A-Kette (fortgesetzt)

Gln-Leu-Glu-Aen-Tyr-Cye-Aen-OH 15 16 17 18 19 120 21

. S

B-Kette (fortgesetzt)

Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

B-Kette (fortgesetzt) Lys-Thr-OH 29 30

Das Insulin bestimmter Haustiere ist in der Struktur menschlichem Insulin sehr ähnlich. So unterscheidet sich das Insulin von Hunden und Schweinen vom Menschlichen Insulin nur dadurch, daß es in der Position 30 der B-Kette AIa enthält, und das Insulin von Kaninchen dadurch, daß es in der gleichen Position Ser aufweist. Diese Insuline können in menschliches Insulin umgewandelt werden, wenn man nach semisynthetischen Verfahren, wie sie von Morihara u. a., Nature 280 C 979), 412-413, und Marcussen (US-PS 4343898) beschrieben werden, den B30-Aminosäurerest durch Thr ersetzt.

Wird ein solches Insulin bei physiologischem pH-Wert aufgelöst, wird ein konzentrationsabhängiges Assoziatio v.gleichgewicht zwischen monomerem, dimerem, tetram'erem, hexamerem und selbst polymerem Insulin hergestellt. Das Gleichgewicht kann z. B. durch Ultrazentrifugieren, durch Osmometrie oder durch Gelfiltrationsmethoden bestimmt werden, siehe beispielsweise R.Valdes Jr. und G.A.Ackers, „Methods in Enzymology" (Methoden in der Enzymologie) Bd.61 (Enzyme Structure [Enzymstruktur], Teil. H. Hsg.: Hirs &Timasheff), Academic Press 1979, S. 125-142. Bei normalen Zusammensetzungen von Insulinpräparaten wird dieses Gleichgewicht so verschoben, daß das Insulin in sehr hohem Maße in hexamerer Form enthalten ist. Substitutionen im Insulinmolekül können zum Zwecke der Verbesserung des Aktivitätsprofils des Insulins bei der Behandlung von Diabetes eingesetzt werden. So legt die veröffentlichte internationale Anmeldung Nr. WO 86/06497 offen, daß eine oder mehrere Substitutionen von GIu im Insulinmolekül durch einen neutralen Aminosäurerest eine Veschiebung der Zone der Insulinausfällung in einer Art um Weise bewirken, durch die eine langsame Freisetzung nach der Injektion erreicht wird. Außerdem legt die veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. EP 214826 Insulinanaloge offen, die nach der Injektion besonders schnell absorbiert werden. Diese Wirkung ist ein Ergebnis der Tatsache, daß durch bestimmte Substitutionen, besonders im Bereich B9-B12 und in den Positionen B26-B28 im Insulinmolekül, eine Unterdrückung der Assoziationstendenz des Insulins erreicht wird, so daß dieses im wesentlichen als Monomer oder Dimer vorhanden ist. Eine Reihe dieser Insulinanaloge weist jedoch eine verminderte biologische Aktivität auf.

Im Verlauf der Jahre wurde eine große Anzahl von künstlich hergestellten Analogen des menschlichen Insulins beschrieben, in der Regel mit dem Ziel, den Einfluß der Struktur auf die Aktivität aufzuhellen, siehe beispielsweise Märke u. a., Hoppe-Seyler's Z. Phyeiol. Chem. 3CO (1979), 1619 bis 1632. Von besonderem Interesse waren Untersuchungen des Einflusses von Substitutioner, in der (B22-B 26)-Folge des Insulins auf die Rezeptorbindung, da diese Folge als eine wesentliche Bindungsstelle für den Insulinrezeptor betrachtet wird und natürlich vorkommende Mutationen mit Substitutionen an dieser Stelle gefunden wurden. Siehe z. B. S. Shoelson u.a., PNAS 80 (1983), 7390-7394, und M. Kobayashi u.a., Biomed. Res. 5 (3) (1984), 267-272. Sehr niedrige biologische Aktivitäten wurden bei Analogen festgestellt, in denen Phe (B 24) oder Phe (B 25) substituiert waren, weshalb geschlußfolgert wurde, daß das Vorhandensein dieser beiden Aminosäuren von entscheidender Bedeutung für die Rezeptorbindung ist.

Vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, daß bestimmte menschliche Insulinanaloge, in denen einer der Aminosäurereste [Phe⁸²⁴] oder [Phe⁸²⁶] nicht vorhanden Ist, eine geringe Assoziationstendenz in Lösung aufweisen, während sie gleichzeitig eine unveränderte oder sogar höhere biologische In-vitro-Aktivität als menschliches Insulin haben. Die Deletierung von entweder [Phe⁸²⁴) oder [Phe⁸²⁶) bewirkt, daß (Lys⁸²⁹) in [Lys⁸²⁸] übertragen wird. Die Position einer positiven Ladung in dieser Position im menschlichen Insulinmolekül wird als der wichtige Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet.

Ziel der Erfindung

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Humaninsulinanalogien mit einer niedrigen Assoziationstendenz und gleichzeitig höheren physikalischen Stabilität als vergleichbare andere Insulinhomologe zur Verfügung gestellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von Humaninsulinanalogien mit einer

niedrigen Assoziationstendenz in der Lösung (und somit einer niedrigen Präzipitationstendenz) zur Verfügung zu stellen, die einebesonders schnelle Aufnahme ermöglichen und gleichzeitig eine verbesserte physikalische Stabilität aufweisen.

Nach ihrem breitesten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher Verfahren zur Herstellung menschlicher Insulinanaloge,

bei denen sich ein positiv geladener Aminosäurerest, d. h., Lys oder Arg, Inder Position B 28, d. h., in der Position 8 in der B-Kette,berechnet von [GIy⁸²⁰], befindet.

Die vorliegenden Insulinanaloge haben überraschenderweise eine niedrige Assoziationstendenz und gleichzeitig eine höhere

physische Stabilität im Vergleich zu anderen Insulinanalogen mit niedriger Assoziationstendenz. Die Einführung einer positiven

Ladung in der Position B28 kann auf zweierlei Weise erreicht werden. Entweder wird einer der Aminosäurereste in den Positionen B24, B25, B26, B27 oder B28 Im menschlichen Insulinmolekül deletiert, was zu einem menschlichen Insulinanalog mit Lys in der Position B 28 führt, oder es auf [Pro⁸²⁸] im menschlichen Insulinanalog durch Lys oder Arg ersetzt. Wird in Position B 28 Arg

bevorzugt, kann die Deletierung eines der Aminosäurereste in den Positionen B 24, B 25, B 26, B 27 oder B 28 außerdem mit einer

Substituierung des ursprünglichen [Lys⁸²⁸] durch einen Arg-Rest kombiniert werden. Die vorliegenden menschlichen Insulinanaloge können außerdem eine oder mehrere Modifikationen im C-Terminalende der B-Kette im Vergleich zum menschlichen Insulin enthalten. So können die Aminosäurereste in den Positionen B25 bis B27 und der

(die) Aminosäurerest(e) nach [Lys⁸²⁸) oder [Arg⁸²⁸] willkürlich aus den natürlich vorkommenden Aminosäureresten ausgewähltwerden oder B29 oder B30 oder bfiide können fehlen.

Nach einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung kann [Tyr⁸²⁶] durch einen anderen ungeladenen Aminosäurerest

substituiert werden, bei welchem das zweite Kohlenstoffatom in der Seitankette (Cy) sp²-hybrid!siert ist (wobei die Bindungeneine plane Struktur haben).

Mit dem Ziel der Stabilisierung des Moleküls gegen einen chemischen Abbau kann außerdem Asn in der Position A21 und/oder B3 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt werden. Die vorliegenden menschlichen Insulinanaloge können durch die folgende Formel I charakterisiert werden:

A-Kette

S-^ S

I I

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-

S B-Kette I

I H-Phe-Val-Yg-Gln-His-Leu-Cya-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala

Α-Kette (fortgesetzt)

(ι)

Gln-Leu-Glu-Aan-Tyr-Cya-Y.-OH

B-Kette (fo· !!gesetzt)

S Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-X₁-X₂-X₃-X -X₅-X₆

worin Xi, X₂, X₃, X₆, Y_t und Y₂ joder natürlich vorkommende Aminosäurerest sein kann, X₄ gleich Lys oder Arg Ist, X₆ jedernatürlich vorkommende Aminosäurerest sein kann, der die C-Terminalhydroxygruppe oder-OH trägt, oder X₅ und Xjzusammendie C-Terminalhydroxygruppe bilden.

Bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird X₅ aus der Gruppe ausgewählt, die aus allen natürlich vorkommenden Aminosäureresten mit Ausnahme von Pro besteht. In der vorstehenden Formel können Y₁ und/oder Y₂ in einem Ausführungsbeispiel aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus

allen natürlich vorkommendon Aminosäureresten mit Ausnahme von Asn besteht.

In der vorstehenden Formel I kann Xi vorzugsweise Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn oder Tyr sein. X₂ kann vorzugsweise Tyr, Thr, GIu, Asp, Ala, His, Ser oder Phe sein. X₃ kann vorzugsweise Pro, GIu, Asp, Ser, Thr oder His sein. X₅ kann vorzugsweise Lys, Thr, Ser, Ala, Asp oder GIu sein. X₈ kann vorzugsweise Thr-OH, Ser-OH, AIs-OH, Asp-OH, GIu-Oi! oder-OH sein. Y₁ kann Asn, GIu, Asp, His, Ser, Thr, VaI, Leu, He, AIa, Met, Trp, Tyr, Gin odor GIy sein, vorzugsweise GIy, Asp, GIu oder AIa, und Y₂ kann Asn, GIu, Asp, His, Ser, Thr, VaI, Leu, lie, AIa, Met, Trp, Tyr, GIn oder GIy sein, vorzugsweise GIu oder Asp. Eine Gruppe der vorliegenden menschlichen Insulinanaloge kann als eine Gruppe charakterisiert werden, in welcher einer der Aminosäurereste in der Position B 24 oder B25 deletiert wurde, der Aminosäurerest in der Position B26 wahlweise durch einen

anderen ungeladenen Aminosäurerest substituiert ist, in welchem das Kohlenstoffatom in der γ-Position sp²-hybridisiert ist,wahlweise einer oder mehrere der Aminosäurereste in den Positionen A21, B3 und B30 sich von dem Aminosäurerest in denentsprechenden Positionen in menschlichem Insulin unterscheiden und wahlweise kein Aminosäurerest in der Position B 30vorhanden ist.

Nach einer einfacheren Definition sind diese Analoge menschliche Insulinanaloge, in denen [Tyr^B26j nicht vorhanden ist, in

denen (Phe⁸²⁵] wahlweise durch einen anderen ungeladenen Aminosäurerest substituiert wird, in dem das Kohlenstoffatom inder γ-Position sp²-hybridisiert ist, in denen einer oder mehrere Aminosäurereste in den Positionen A21, B 3 und B 30 sichwahlweise von den Aminosäureresten in menschlichem Insulin unterscheiden und in danen wahlweise in der Position B30 kein

Aminosäurerest vorhanden ist. Beispiele für ungeladene Aminosäurereste, in denen Cy spMiybridisiert ist, sind Tyr, Phe, His, Trp und Asn. Es ist möglich, in die oben genannten menschlichen Insulinanaloge weitere Substitutionen oder Ableitungen einzuführen, wenn

sich die Eigenschaften nicht wesentlich ändern. Solche weiteren Ableitungen könnten Veresterungen oder Amidierungen von

Karboxylgruppen, Azylierung oder Alkylierung von Amino- oder Hydroxylgruppen oder die Deamidierung von Karboxamidgruppen sein. Bei weiteren Substitutionen können (Thr*⁸) durch His oder [His^B'°] durch Asp ersetzt werden. Außerdem ist es möglich, einen einzelnen oder einige wenige Aminosäurereste am C- und/oder N-Ende von vorzugsweise der B-Kette anzufügen. Eine Gruppe der menschlichen Insulinanaloge nach der Lrfindung hat die unten in de¹ Formel Il gezeigte Struktur, worin X für Tyr, His, Phe oder Asn steht, Ygleich Thr, Ser, Ala, Asp oder GIu oder eine Deletierung steht und worin wahlweise eine oder beide

der unterstrichenen Asn durch Substitution oder Deamidierung in Asp verändert wurden oder die unterstrichene Asn in derΑ-Kette gleich GIy sein kann.

Α-Kette

Q"

I »

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cya-Ser-Leu-Tyr

I S

B-Kette J,

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Oys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-

A-Kette (fortgesetzt)

Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH (II)

B-Kette (fortgesetzt)

Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-GIy-Phe-X-Thr-Pro-Lys-Y-OH

Bevorzugte menschliche Insulinanaloge nach der Erfindung sind die folgenden:

menschliches des [Phe^B26]-lnsulin menschliches des |Tyr^B"]-lnsulin menschliches des [Thr^B"]-lnsulin menschliches des [Pro^B28)-lnsulin des [Phe^B26]-Schwe!nsinsulin des [Hro^e28]-Schweinsinsulin des [Pro^BW]-Kanincheninsulin menschliches des |Phe^B28], des [Thr^l-lnsulin menschliches des [Tyr^B26l, des [Th^³⁰I-InSuHn menschliches [Sei"¹]· des [Pro^BM]-lnsulin menschliches [Gl/²¹]-des [Pro^B28]-lnsulin menschliches [GIy*²']- des [Phe^B25]-lnsulin menschliches [Asp*²¹]-des [Phe^B25]-lnsuiin menschliches [His⁸²⁸]- des [Tyr^BM], des [Thr^B30]-lnsulin menschliches [Asn^{B 26}I- des [Tyr^B2i], des [Thr^B30]-lnsulin menschliches [Asp^A21]- des [Phe^B2S], des [Thr^B30]-!nsulin menschliches [Asp^B2ej- des [Phe^Bi6j-lnsulin menschliches [Asp^B3]- des (Phe^B26]-lnsulin menschliches [Lys^B2S]-lnsulin menschliches [Lys^BM, Thr^B29]-lnsulin menschliches [Arg^B28|-des [Lys^B29]-lnsulin

Die menschlichen Insulinanaloge nach der vorliegenden Erfindung können vorteilhaft bei der Behandlung von Diabetes eingesetzt werden, da die verminderte Assoziationsfähigkeit zu einer schnellerer. Aufnahme im Blutstrom als be? normalem Insulin führt, und das nicht nur bei der normalerweise angewendeten subkutanen Injektion, sondern auch bei der nichtparenteralen Anwendung, siehe z. B. veröffentlichte internationale Patentanmeldung Nr. WO87/06137. Außerdem sind diese Analogo auch auf Grund ihrer verbesserten physischen Stabilität bei dor Behandlung von Diabetes vorteilhafter. Die Insulinanaloge nach der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden durch Änderung des Proinsulingens durch Austausch von Kodon(en) an der geeigneten Stelle im natürlichen menschlichen Proinsulingen durch Kodon(e), welche die gewünschten Aminosäurorestsubstitute (das Aminosäurerestsubstitut) codieren, und/oder durch Deletierung des (der) Kodons (Kodone), die der (den) gewünschten Deletierung(en) entsprechen. Als Alternative kann die gesamte DNA-Folge, welche das gewünschte Insulinanalog codiert, synthetisiert werden. Das Gen, welches das gewünschte Insulinanalog codiert, wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, der bei der Übertrag auf einen geeigneten V.'irtsorganismus, z. B. E. coil. Bacillus oder Hefe, das gewünschte Produkt erzeugt. Das expressierte Produkt wird dann aus den Zellen oder der Kulturbrühe isoliert, in Abhängigkeit davon, ob das expressierte Produkt von Zellen sekretiert wird oder nicht.

Die neuartigen Insulinanaloge können auch durch chemische Synthese nach Methoden hergestellt werden, die der Methode analog sind, die von Märki u.a. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 [1979], 1619-1632) beschrieben wird. Sie können auch, gebildet werden aus getrennt In vitro hergestellen A- und B-Ketten, welche die entsprechenden Substitutionen oder Deletierungen von Aminosäureresten enthalten, worauf die modifizierten A- und B-Ketten durch Herstellung von Disulfid-Brücken nach den bekannten Methoden (.'.B. Chance u. a., In: Rick DH., Gross, E. (Hsg.), Peptides: Synthesis-Structure-Function (Peptide: Synthese-Struktur-Funktion). Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Illinois, S. 721-728) miteinander verbunden werden.

Die Insulinanaloge können außerdem nach einer Methode hergestellt werden, die der Methode analog ist, v/elche in der EP-Patentanmeldung Nr. 0163529 A beschrieben wird, deren Offenlegung hier als Verweis einbezogen wird. Durch diese Methode wird ein Insulinvorläufer des menschlichen Insulinanalogs, bei dem die Basisaminosäure in der Position B28 oder B29 (wenn das Endprodukt eine Basisaminosäure in dieser Position haben soll) mittels einer Peptidbindung oder einer Peptidkette von unterschiedlicher Länge mit GIy*' verbunden ist, durch Hefe mit richtig positionierten Disulfidbrücken expressiert und sekretiert und dann in das gewünschte menschliche Insulinanalog durch die Morihara-Methode (Morihara, siehe oben) oder durch die sogenannte Transpeptidierungsreaktion (siehe US-PS 4343898) umgewandelt.

Dementsprechend können die vorliegenden Insulinanaloge dadurch hergestellt werden, daß eine DNA-Folge mit der Codierung für einen Vorläufer des in Frage kommenden Insulinanalogs in ein geeignetes Hefeexpressionsvehikel übertragen wird, die bei der Übertragung auf Hefe in der Lage ist, den Vorläufer des Insulinanalog zu expressieren und zu sekretieren, in welchem |Lys^BW), [Arg^BW], [Lys^B28l oder [Arg^BW] mit GIy*¹ verbunden sind durch eine Peptidbindung oder eine Peptidkette mit der Formel III

-R_n-R¹-, (III)

worin R eine Peptidkette mit η Aminosäureresten ist, η eine ganze Zahl zwischen 0 und 33 ist und R' gleich Lys oder Arg ist, wenn die Kultur des transformierten Hefestammes in einem geeigneten Nährmedium erfolgt. Der Vorläufer wird dann aus der Kulturbrühe gewonnen und mit einer Aminoverbindung mit der Formel IV reagiert,

Q-OR" . (IV)

worin Q ein einzelner Aminosäurerest, vorzugsweise Thr, oder ein Dipeptid ist und R" eine Karboxyschutzgruppe ist (z. B. Methyloder tert-Butyl), wobei Trypsin oder ein trypsinShnliches Enzym als Katalysator in einem Gemisch aus Wasser und organischen

Lösungsmitteln analog dem verwendet werden, das in der US-PS 4343898 (deren Offenlegungsschrift hier als Verwois

einbezogen wird) beschrieben wird, worauf die Karboxyschutzgruppe entfernt und das Insulinanalog aus dem Reaktionsgemischentfernt wird.

Wenn die Insulinanaloge einen von Lys oder Arg verschiedenen Aminosäurerest enthalten, wie der C-Terminalrest in der B-Kette, können sie auch nach einer Methode analog zu der Methode hergestellt werden, die in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. EP195691 beschrieben wird, deren Offenlegungsschrift hier als Verweis einbezogen wird. Durch diese Methode werden Insulinanalogvorläufer des Typs, die eine Brücke zwischen der A- und der B-Kette haben, welche aus einem

einzigen Paar der Basisaminosäure (Lys, Arg) besteht, in Hefe hergestellt und dann durch enzymatische Umwandlung in das

Insulinanalog umgewandelt. Wenn der C-Terminal-Aminosäurerest in der B-Kette gleich Lys oder Arg ist, können die Insulinanaloge aus den oben genannten

biosynthetischen Vorläufern durch enzymatisches Schneiden mit Trypsin hergestellt werden.

Menschliche Insulinanaloge nach der Erfindung, bei denen Substitutionen nur innerhalb der letzten Aminosäurereste nahe des C-Terminals der B-Kette vorhanden sind, können außerdem auf bekannt:-* Weise aus beispielsweise Schweinsinsulin hergestellt

werden, wie das von K. Inoye u.a., JACS101 (3) (1979), 751-752, beschrieben wird, wobei das Schweinsinsulin zuerst mit Trypsinin menschliches des-(B23-30)-lnsulin gespalten wird, worauf dieses ebenfalls enzymatisch mit einem synthetischen Peptidgekoppelt wird, welches die gewünschte Aminosäurefolge hat.

Die vorliegenden Insulinanaloge können für die Herstellung von neuartigen Insulinpräparaten mit Insulinaktivität verwendet

werden, welche in den bisher bekannten Insulinpräparaten anstelle von menschlichem und Schweinsinsulin eingesetzt werdenkönnen. Diese neuartigen Insulinpräparate enthalten die Insulinanaloge nach der Erfindung oder deren pharmazeutischakzeptables Salz in wäßriger Lösung oder Suspension, vorzugsweise bei einem neutralen pH-Wert. Das wäßrige Medium wirdisotonisch gemacht, beispielsweise mit Natriumchlorid, Natriumazetat oder Glyzerol. Außerdem kann das wäßrige Medium

Zinkionen, Puffer wie Azetat und Zitrat und Präservative wie m-Kresol, Methylparaben oder Phenol enthalten. Der pH-Wert des Präparates ist auf den gewünschten Wert abzustimmen, und das Insulinpräparat wird durch steriles Filtern steril gemacht. Die vorliegenden Irisulinanaloge können auch mit anderen Insulinanalogen gemischt werden, die eine Insulinlangzeitaktivität

haben, um Insulinpräparate herzustellen, die aus einem Gemisch von schnellwirkendem und Langzeitinsulin bestehen.

Die Insulinpräparate der vorliegenden Erfindung können ähnlich wie die bekannten Insulinpräparate eingesetzt werden. Terminologie: Für die Aminosäuren werden die Abkürzungen verwendet, die im J. Biol. Chem. 243 (1968), 3558, angegeben werden. Die Aminosäuren haben L-Konfiguration. Wenn nichts anderes angegeben wird, handelt es sich bei den hier angegebenen Insulinspezies um menschliches Insulin. Kurze Beschreibung der Zeichnungen: Die Erfindung wird weiter beschrieben unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, in denen Abb. 1 das Expressionsplasmid pYGABA 14276 zeigt, Abb. 2 den Hefevektor pAB 24 zeigt, Abb. 3 die DNA-Folge des 0,4kbEcoRI-Xbal-Fragments von Plasmid pKFN-864 zeigt und Abb.4 die Herstellung des Expressionsplasmids pKFN-866 zeigt. DNA-Folgen, welche modifizierte Insulinvorläufer codieren, wurden mit der Basis in der Expressionskassette konstruiert, die im BamHI-Restriktionsfragment vom Expiessions-Plasmid pYGABA enthalten ist, das in der Abb. 1 gezeigt wird, eine Länge von

1103 Basenpaaren hat und im wesentlichen folgendes enthält (aufgeführt in der Reihenfolge, am 5'-Ende beginnend): Den

GAPDH-Promotor (Travis u. a., J. Biol. Chem. 260 (1985), 4384-4389), gefolgt vom Codierungsbereich, der besteht aus: den

83 N-Terminal-Aminosäuren der MF-a 1 -Führungssequenz, codiert durch die Wildtyp-Hefe-DNA-Folgen, wie sie von Kurjan und

Herskowitz beschrieben werden, gefolgt von den beiden Codonen AAA und AGA, die Lys und Arg codieren, und erneut gefolgt

vom Codierungsbereich für die einzelne Kette des menschlichen des [Thr^B30]-lnsulin-VorlSuferinsulins (SCi), das ein synthetischkonstruiertes Gen ist, das unter Verwendung bevorzugter Hefecodone entsteht. Nach zwei Stoppcodonen wird eine Sail I

Restriktionsstelle positioniert, und der Rest der Sequenz stellt die MF-a 1-Sequenz dar, welche den Terminatorbereich enthält. Die Sequenz wird ausschließlich unter Anwendung von Standardmethoden hergestellt. Die angewandte Methode war die »oligonukleotidstellengerichtete Mutagenese", die von Zoller und Smith, DNA, Bd.3, Nr. 6

(1984), 479-488, beschrieben wird. Die Methode wird nachstehend kurz und im Beispiel 1 ausführlich beschrieben.

Die Sequenz des Insulinvorläufers wird aus dem Expressionsplasmid isoliert und in ein einzelsträngiges Genom, einen runden M 13-Bakteriophagvektor eingefügt. Dann wird ein chemisch synthetisierter, komplementärer DNA-Strang auf das einzelsträngige Genom hybridisiert. Der DNA-Strang enthält die gewünschte Sequenz, eingeschlossen von Sequenzen, die vollkommen homolog zu den Insulinsequenzen auf der runden DNA sind. Der Starter wird dann in vitro biochemisch auf die vollständige Länge des runden Genoms unter Verwendung von Klenow-Polymerase erweitert. Dieser Strang führt zur Entstehung von einzelsträngigen Phagen, die bei der Züchtung in E. coli die Möglichkeit schaffen, doppelsträngige DNA mit der gewünschten Sequenz zu analysieren. Aus dieser doppelsträngigen DNA kann ein Restriktionsfragment isoliert und wieder in den Expressionsvektor eingesetzt werden.

Ausfuhrungsbeispiele

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

Beispiel I

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zum Expressieren von des [Phe^B2S]-SCI verwendet werden kann.

Es wurde die Expressionskassette isoliert, die im Expressionsplasmid pYGABA (in Abb. 1 gezeigt) an einem BamHI-Restriktionsfragment enthalten ist: Das Expressionsplasmid wu rdemit der Restriktionsendonuklease BamHI inkubiert. Es wurde mit folgenden Bedingungen gearbeitet: 20pg Plasmid, 50 Einheiten BamHI, 10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂ und 1 mM DTT in einem Volumen von 100 μΙ. Die Temperatur betrug 37⁰C, die Reaktionszeit lag bei 2 Stunden. Die beiden DNA-Fragmente wurden auf einem 1%igen Agarosegel getrennt, und das gewünschte Fragment wurde isoliert.

Llgatlon an den M13-Vektor M13mp18

Das isolierta Restriktionsfragment wurde an den Bakteriophag-Vektor M13mp18 liglert, der auch mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten wurde, wobei folgendes Reaktionsgemisch verwendet wurde: Fragment 0,2 Mg, Vektor 0,02 ug, 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,4,1OmM MgCI₂,1OmM DTT und 1 mM ATP in einem Volumen von 20μΙ. Von diesem Gemisch wurden 5μΙ in den E. coli-Stamm JM101 transformiert. Das Vorhandensein des Fragments im Vektor und die Orientierung des Fragments wurden durch Restriktionsenzymkartierung auf doppelsträngiger M13-DNA bestimmt, die aus den Transformanten isoliert wurde.

Isolierung der elnzelstringigen (ss) DNA (Matrize)

Aus dem oben beschriebenen Transformanten wurde ss-DNA nach der Meihode isoliert, die von Messing in Gene, 19 (1982), 269-276, beschrieben wurde.

5'-Phosphoryllerung des Mutagenlsatlonsstarters

Der Mutagenlsationsstarter mit der Sequenz S'-TTGGAGTGTAGAA-ACCTCTT-S' wurde im 5'-Ende in einem 30μΙ-Reaktionsgemisch phosphoryliert, das 7OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,0,1OmM MgCI₂,5mM DTT, 1 mM ATP, 10OpMoI Oligonukleotid und 3,6 Einheiten T4-Polynukleotidkinase enthält. Die Reaktion wurde bei 37⁰C für die Dauer von 30min ausgeführt. Dann wurde das Enzym durch Inkubation des Gemische bei 65⁰C für die Dauer von 10 Minuten inaktiviert.

Hybridisation der Matrize und des phosphorylierten Mutagenlsatlonsstarters

Die Hybridisation von Matrize und Starter wurde in einem ΙΟμΙ-Volumen ausgeführt, das 0,5pMol Matrize, 5pMol Starter, 2OmM Tris-HCI, pH-Wert7,5,1OmM MuCI₂,5OmM NaCI und 1 mM DTT enthielt, dazu wurde es für die Dauer von 10 Minuten auf 65⁰C erhitzt und anschließend auf O⁰C abgekühlt.

Erweiterungs-/Llgatlonsreaktlon

Dem oben genannten Reaktionsgemisch wurden 10μΙ der folgenden Mischung zugesetzt: 0,3 mM dATP, 0,3mM dCTP, 0,3mM dGTP, 0,3mM TTP, 1 mM ATP, 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 3 Einheiten T4-DNA-Ligase und 2,5 Einheiten Klenow-Polymerase. Anschließend wurde die Reaktion über 16 Stunden bei 16⁰C durchgeführt.

Transformation von JM101

Das oben genannte Reaktionsgemisch wurde in unterschiedlichen Verdünnungen unter Anwendung von Standardverfahren in CaCI₂- behandelte E. coli-JM 101 -Zellen transformiert und in 2X YT-Top-Agar auf 2X YT-Agarplatten plattiert. (2X YT = Trypton 16g/l, Hefeextrakt 10g/l, NaCI 5g/l. 2X YT-Top-Agar = 2X YTmitO,4%Agarosezusatz und Autoklavbehandlung. 2X YT-Agarplatten = 2X YT mit 2% Agarzusatz und Autoklavbehandlung.) Die Planen wurden bei 37⁰C über Nacht inkubiert.

Identifizierung von positiven Klonen

Angewendet wurde die Methode der „plaque"-Lifthybridisation, die nachstehend beschrieben wird: Ein Nitrozellulosefilter wurde auf eine Platte mit einer geeigneten „plaque"-Dichte gebracht, so daß der Filter benetzt wurde.

Dann wurde der Filter in folgender Lösung gebadet: 1,5M NaCI, 0,5 M NaOH für die Dauer von 30s, 1,5M NaCI, 0,5 M Tris-HCi, pH-Wert 8,0, für die Dauer von einer Minute, 2X SSC (0,3 M NaCI, 0,03 M Natriumzitrat) bis zur anschließenden Nutzung. Der Filter wurde auf 3 MM-Filterpapier getrocknet und 2 Stunden lang bei 80°C in einem Vakuumofen getrocknet.

Der Mutagenisationsstarter mit der Sequenz 5'TTGGAGTGTAG-AAACCTCTt-S' wurde am 5'-Ende in einem 30Ml-Volumen radioaktiv markiert, das 7OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,5mM DTT, 1OpMoI Oligonukleotid, 2OpMoI Y-³²P-ATP und 3,5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase enthielt. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37⁰C inkubiert, anschließend 5 Minuten lang bei 100⁰C.

Der getrocknete Filter wurde 2 Stunden lang bei 65⁰C in 6X SSC, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Natriumdodezylsulfat (SDS) und B0\ig/vn\ Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Dann wurde das

Reaktionsgemisch, das die markierte Sonde enthielt, zu 15ml frischem Vorhybridisationsgemisch gegeben, und der Filter wurde darin über Nacht bei 28⁰C unter sanftem Rühren gebadet. Nach dem Hybridisieren wurde der Filtor dreimal für die Dauer von

jeweils 15 Minuten in 2 X SSC + 0,1 % SDS gewaschen und autoradiograf iert. Nach dem Waschen in derselben Lösung, aber bei 52⁰C, und niner weiteren Autoradiografie wurden „plaques" identifiziert, die DNA-Folgen enthielten, die komplementär zum Mutagenisationsstarter waren.

Erneutes Screenleren der positiven Klone

Da der identifizierte Klon das Ergebnis eines Heteroduplexes ist, wurde das „plaque" erneut plattiert. Hybridisierung und Identifizierung wurden wiederholt.

Reinigung der doppelstrftngigen M 13-Phag-DNA

Ein rescreenierter Klon wurde zur Infektion des E. coli-Stammes JM101 verwendet. Für die Dauer von 5 Stunden wurde eine Kultur, die etwa 10⁸ Phage und 5 Kolonien von JM101 enthielt, bei 37⁰C in einem Volumen von 5ml 2X YT-Medium gezogen. Dann wurde aus dem Pellet doppelsträngige, runde DNA nach der Methode gereinigt, die von Birnboim und Doley, Nucleic Acids Res., 2 (1979), 1513, beschrieben wurde.

Isolierung olnes Restriktionsfragments, das den modifizierten InsullnvorlSufer enthalt

Das oben isolierte DNA-Präparat (etwa 5Mg) wurde mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease BamHI in 00μΙ von 10OmM NaCI, 5OmM TrIs-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂ und 1 mM DTT für die Dauer von 2 Stunden bei 37⁰C verdaut.

Die DNA-Produkte.wurden auf einem Agarosegel getrennt und das Fragment aus dem Gel goreinigt.

Llgatlon an den Hefevektor pAB 24 (Abb. 2)

Das isolierte Restriktionsfragment wurde mit dem Hefevektor ρ AB 24 liglert, der mit der Restriktionsendonuklease BamHI verdaut wurde, wozu folgendes Reaktionsgemisch verwendet wurde: Fragment 0,2pg, Vektor 0,02 μg, 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,4,1OmM MgCI], 10mM DTT, 1mM ATP in einem Gesamtvolumen von 20 μΙ. Von diesem Reaktionsgomisch wurden 5 μΙ für die Transformation des E. coli-Stammes MC 1061 verwendet, in welchem das modifizierte Expressionsplasmid identifiziert und vermehrt wurde. Das Plasmid war mit Ausnahme des deletierten Codons mit pYGABA identisch.

Transformation von Hefe

Die Transformation des Expressionsplasmids in den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae JC482ApepALeu 2cir' (α, his4, pep4, ura 3, Ieu2,cir') wurde so durchgeführt, wiedas von ltou.a„J. Bact., Bd.153, Nr.1 (1983), 163-168, beschrieben wurde. Die transformierten Zellen wurden auf SC-ura-Medium (0,7% Hefestickstoff basis, 2,0% Glukose, 0,5% Kasaminosäuren, 2,0% Agar) zur Auswahl der plasmidhaltigen Zellen plattiert.

Beispiel Il

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Herstellung von des [Tyr⁸²⁸I-SCI verwenc* Jt werden kann. Im wesentlichen wurde das gleiche Verfahren wie im Beispiel I angewendet, mit der Ausnahme daß der Mutagenisationsstarter die Folge S'-ACCCTTTGGAGTGAAGAAACCTCT-S' hatte, daß die Hybridisationstemperatur 36 ⁰C betrug und daß die Waschtemperatur nach dem Hybridisieren bei 60°C lag. Das modifizierte Plasmid hatte eine m t pYGABA identische Sequenz, ausgenommen den deletierten Codon.

Beispiel III

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Herstellung von |His^B2e], des [Tyr^B"J-SCI verwendet werden kann.

Im wesentlichen wurde das gleiche Verfahren wie im Beispiel I angewendet, mit der Ausnahme, daß der Mutagenisationsstarter die Sequenz 5'-AATACCCTTTGGAGTGTGGAAACCtCTTTCACC-S' hatte, daß die Hybridisationstemperatur 43⁰C betrug und daß die Waschtemperatur nach dem Hybridisieren bei 66⁰C lag. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Sequenz, ausgenommen die modifizierten und deletierten Codone.

Beispiel IV

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Herstellung von [Asn^B2e], des [Tyr^B2e]-SCI verwendet werden kann. Im wesentlichen wurde das gleiche Verfahren wie im Beispiel I angewendet, mit der Ausnahme, daß der Mutagenisationsstarter die Sequenz e'-AATACCCTTTGGAGTGTTGAAACCTCTTTCACC-S' hatte, daß die Hybridisationstemperatur 42⁰C betrug und daß die Waschtemperatur nach dem Hybridisieren bei 65⁰C lag. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Sequenz, ausgenommen die modifizierten und dnletierten Codone.

Beispiel V

Expression des Vorläufers und Isolierung aus dem Kulturmedium.

Hefe, die wie in den Beispielen I bis IV beschrieben transformiert worden war, wurde auf Petrischalen vermehrt, die Minimalmedium ohne Uracil enthielten, D wer 48 Stunden bei 3O⁰C. Schüttelflaschen zu 100ml, die Minimalmedium ohne Uracil, 5g/l Kasaminosäuren, 10g/l Sukziiisäure und 30g/l Glukose bei einem pH-Wert von 5,0 enthielten, wurden mit einer einzigen Kolonie von der Petrischale geimpft. Die Flaschen wurden in einem Schüttelapparat bei 30°C in einem Inkubator 72 Stunden lang geschüttelt.

Nach dem Zentrifugieren wurde 11 der zusammengefaßten, obenaufschwimmenden Schicht durch Filtrieren sterilisiert und durch den Zusatz von 5M HCI und Wasser auf einen pH-Wert von 4 bis 4,5 und eine Leitfähigkeit von < 1OmS abgestimmt. Mit einem Strom von 120ml/h wurde die obenaufschwimmende Schicht dann einer 1,6cm χ 6cm-Kolonne von S/Sepharose®FF zugeführt, die vorher mit 5OmM Essigsäure, 50Vol.-% Ethanol, mit NaOH auf einen pH-Wert von 4,0 abgestimmt, äquilibriert worden war. Dia Kolonne wurde mit 60ml Puffer gewaschen, anschließend wurde der Vorläufer durch einen linearen Gradienten von NaCI von 0 bis 0,35M in 360ml Puffer bei einem Strom von 10ml/h eluiert. Das Eiuat wurde in 4ml-Fraktionen aufgeteilt und auf UV-Absorbanz untersucht. Fraktionen, die den Vorläufer enthielten, wurden durch RP-HPLC-Analyse (RP-Hochdruckflüssigkeitschromatografieanalyse) identifiziert und zusammengefaßt. Nach dem Entsalzen in einer Sephadex*G 25-Kolonne in 1M Essigsäure wurde der Vorläufer durch Lyophilisieren isoliert.

Beispiel VI Herstellung von menschlichem des [Phe⁸²⁶), des |Thr^B30]-lnsulin. Ee wurden 400mg des [Phe^B26)-SCI, das nach den In den Beispielen I bis V beschriebenen Methoden hergestellt worden war, In

40ml von 5OmM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 20Vol.-% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von 9 abgestimmt, aufgelöst,und es wurden 40ml (abgesetztes Volumen) an Sepharose*, die 32mg immobilisiertes Trypsin in dem gleichen Puffer enthielt,zugesetzt. Man ließ die Suspension unter sanftem Rühren bei 8°C-10°C 24 Stunden stehen, anschließend wurde sie gefiltert. Das

Gel wurde mit 40ml Puffer gewaschen, und das zusammengefaßte Filtrat wurde einer 2,6cm χ 7,5cm-Kolonne von Q- Sepharose*FF zugeführt, die vorher mit 5OmM Tris-(Hydroxymethyl)aminomethan, 50% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von

8,0 abgestimmt, äquibriliert worden war. Dann wurde die Kolonne mit einem linearen Gradienten von NaCI von 0 bis 0,15M indem gleichen Puffer bei einem Strom von 225ml/h über 6 Stunden eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Absorbanz untersucht und

Fraktionen, welche die Proteinhauptspitze enthielten, wurden zusammengefaßt. Nachdem das Ethanol In vacuo entfernt worden

war, wurde das Protein bei einem pH-Wert von 5,4 ausgefällt.

Die Identität des Produktes wurde durch Analyse der Aminosäure, durch Plasmadesorptionsmassenspektromotrie und durch

sequentiellen Edman-Abbau der getrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

Beispiel VII Herstellung von menschlichem des [Phe^B26)-lnsulin. Es wurden 200mg des [Phe^B25|, des [Thr^B30]-menschliches Insulin, das nach der im Beispiel Vl beschriebenen Methode

hergestellt worden war, in einem Gemisch aufgelöst, das 400 mg Threoninmethy !ester, 2,0 ml Ethanol und 0,8 ml Wasser enthielt.

Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 6,3 abgestimmt, und es wurden 4ml (abgesetztes Volumen) an Sepharose*, die 3,2 mg

immobilisiertes Trypsin enthielt, zugesetzt. Nach zweistündigem Stehenlassen bei 2O⁰C und unter sanftem Rühren wurde das

Gel durch Filtern entfernt, und das Protein wurde durch den Zusatz von 10 Volumen 2-Propanol ausgefällt. Der luftgetrocknete Niederschlag wurde wieder in 2OmM Tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCI, 60 Vol.-% Ethanol, pH-Wert 8,25, aufgelöst und

einer 2,6 x 20cm-Q-Sepharose*FF-Kolonne zugeführt, die vorher mit dem genannten Puffer äquilibriert worden war, und miteinem linearen NaCI-Gradienten in dem gleichen Puffer eluiert, der von 0 auf 0,1 M anstieg, Dauer 15 Stunden bei einer

Strömungsrate von 125ml/h. Das Ethanol wurde in vacuo aus den zusammengefaßten Fraktionen, die den menschlichen

des-[Phe^B26]-lnsulin-(B30^!Methylester) enthielten, entfernt, und das Protein wurde bei einem pH-Wert von 6,1 ausgefällt. Die

Suspension wurde zentrifugiert, und der Niederschlag wurde lyophiliert. Dann wurde der Methylester 10 Minuten lang in kaltem

0,1 M NaOH bei einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml hydrolysiert. Durch Abstimmung des pH-Wertes auf 8,5 wurde die

Reaktion gestoppt, und es wurden 2 Volumen an 2OmM Tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCI, pH-Wert 8,5, zugesetzt. Dann

wurde die Lösung einer 2,6 χ 20cm-Q-Sepharose^eFF-Kolonne zugeführt und wie oben eluiert.

Nachdem das Ethanol In vacuo entfernt worden war, wurde das Protein bei einem pH-Wert von 5,5 ausgefällt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 80mg menschliches des-[Phe^B26]-lnsulin. Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäurenanalyse, durch Plasmadesorptionsmassenspektrometrie und durch

sequentiellen Edman-Abbau der getrennten vinylpyridylierten Ar und B-Ketten bestätigt.

Beispiel VIII _/ Herstellung des menschlichen des [Tyr^B2e], des [Thr^B30l-!nsulins. Es wurden 250mg des (Tyr^B2e]-SCI, das nach den in den Beispielen Il und V beschriebenen Methoden hergestellt worden war, in

25ml von 5OmM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20Vol.-% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von 9 abgestimmt, aufgelöstund 25ml (abgesetztes Volumen) von Sepharose*zugesetzt, die 20 mg immobilisiertes Trypsin in dem gleichen Puffer enthielt.

Man ließ die Suspension unter sanftem Rühren 24 Stunden bei 8⁰C-IO⁰C stehen, anschließend wurde sie gefiltert. Das Gel

wurde mit 25 ml Puffer gewaschen, und die zusammengefaßten Filtrate wurden einer 2,6 x 7,5cm-Kolonne von Q-Sepharose*FFzugeführt, die vorher mit 50 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 50% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von 8,0abgestimmt, äquilibriert worden war. Dann wurde die Kolonne mit einem linearen Gradienten von NaCI von 0 bis 0,15M in demgleichen Puffer bei einem Strom von 225 ml/h über 6 Stunden eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Absorbanz untorsucht, und

war, wurde das Protein bei einem pH-Wert von 5,4 ausgefällt.

Durch Lyophilisieren wurden 130mg menschliches des [Tyr^B2e], dos [Thr^B30]-lnsulin isoliert. Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäurenanalyse und durch sequentiellen Edman-Abbau der getrennten,

vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

Beispiel IX Herstellung von menschlichem (His^B2S], des |Tyr^B2e], des-[Thr^B30)-lnsulin. Es wurden 450 mg [His⁸²⁶], des [Tyr^B2i]-SCI, das nach den in den Beispielen III und V hergestellt worden war, aufgelöst in 45 ml

von 5OmM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von 9 abgestimmt, und es wurden 45 ml(abgesetztes Volumen) Sepharose®, die 36mg immobilisiertes Trypsin im gleichen Puffer enthielt, zugesetzt. Man ließ die

Suspension unter sanftem Rühren bei 8⁰C bis 10°C stehen, Dauer 24 Stunden, und filterte sie dann. Das Gel wurde mit 40ml Puffer gewaschen, und die zusammengefaßten Filtrate wurden einer 2,6 χ 7,5cm-Q-Sepharose^RFF-Kolonne zugeführt, die

vorher mit 5OmM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 50% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von 8,0 abgestimmt, äquilibriertworden war. Dann wurde die Kolonne mit einem linearen NaCI-Gradienten von 0 bis 0,15 M in dem gleichen Puffer bei einem

Strom von 225ml/h über 6 Stunden eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Absorbanz untersucht, und die Fraktionen, welche die Proteinhauptspitze enthielten, wurden zusammengefaßt. Nachdem das Ethanol In vacuo entfernt worden war, wurde das Protein bei einem pH-Wert von 5,4 ausgefällt. Durch Lyophilisieren wurden 200mg menschliches [HIs⁸²⁶J, des |Tyr^B2e|, des [Thr⁸³⁰J-lnsulin isoliert. Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäurenanalyse und durch sequentiellen Edman-Abbau von getrennten,

vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

Beispiel X Herstellung von menschlichem [Asn⁸²⁶], des [Tyr^BMJ, des-lThr^e30]-lnsulin. Es wurden 150mg [Asn^B26], des lTyr^B2e)-SCI, das nach den in den Beispielen IV und V beschriebenen Methoden hergestellt

worden war, in 15 ml von 50 mM Tris(hydroxymethy Oaminomethan, 20% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von 9 abgestimmt,aufgelöst, und es wurden 15ml (abgesetztes Volumen) Sepharose« zugesetzt, die 12mg immobilisiertes Trypsin in dem gleichen

Puffer enthielt. Man ließ die Suspension unter sanftem Rühren bei 8⁰C-IO⁰C 24 Stunden lang stehen, anschließend wurde sie

gefiltert. Das Gel wurde mit 40 ml Puffer gewaschen, und die zusammengefaßten Filtrate wurden einer 1,6 χ 10cm-Kolonne von

Q-Sepharose®FF zugeführt, die vorher mit 5OmM Tris(hyaroxymethyl)aminomethan, 50% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert

von 8,0 abgestimmt, äquilibriert worden war. Die Kolonne wurde mit einem linearen NaCI-Gradienten von 0 bis 0,15 in demgleichen Puffer bei einem Strom von 90 ml/h übe; 6 Standen eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Absorbanz untersucht, und die

war, wurde das Protein bei einem pH-Wert von 5,4 lusgefällt.

Nach dem Lyophilisieren wurden 80mg an (Ans⁰²⁶), des [Tyr^B:e|, des |Thr^B30]-menschlichem Insulin isoliert. Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäurenanalyse und durch sequentiellen Edman-Abbau der getrennten,

vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

Beispiel Xl Herstellung von menschlichem (Asp*²¹), des (Phe^B2e), des-lThr^J-lnsulin.

Ee wurden 50mg von menschlichem des (Phe^e26|, des [Thr^B40]-lnsulln, das nach den im Beispiel Vl beschriebenen Methoden hergestellt worden war, in 10ml Wasser aufgelöst, wobei der pH-Wert mit 1M HCI auf 2 abgestimmt wurde. Dann ließ man die Lösung bei 30°C 16 Tage lang stehen. Nach dem Abkühlen (auf 2O⁰C) wurden 7,5g Harnstoff zugesetzt, und der pH-Wert wurde mit 1MNaOHauf8,1 abgestimmt.DannwurdedieLösungeiner 1,6 χ 20cm-KolonnevonQ-Sepharose^eFFzugeführt,dievorher mit 2OmM TrisfhydroxymethyOamlnomethan/HCI, 7 M Harnstoff, pH-Wert 8,1 bei 4°C, äquilibriert worden war, und mit einem linearen NaCI-Gradienten in dem gleichen Puffer mit einem Anstieg von 0 auf 0,05M über 24 Stunden bei einer Strömungsrate von 40 ml/h eluiert. Die zusammengefaßten Fraktionen, welche das Protein aus der letzten Eluierungsspitze enthielten, wurden auf einer Kolonne von Sephadex®G 25 in 1M Essigsäure entsalzt und lyophiüert. Man erhielt 30mg menschliches [Asp^A21], des lPhe^BM], des-[Thr^B30I-InSuHn.

Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäurenanalyse, durch Fünfschritt-Edman-Abbau und durch C-Terminalanalyse unter Verwendung von Karboxypeptidase A bestätigt.

Beispiel XII Herstellung von menschlichem (Ser*"], des (Pro^B28l-lnsulin. Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Herstellung von menschlichem [Ser*²¹], des [Pro^B28]-lnsulin und die Herstellung von menschlichem [Ser*²¹], des [Pro^BWl-lnsjlin verwendet werden kann. Ein pUC-19 abgeleitetes Plasmid, pKFN-864, welches dieses Analog codiert, wurde durch Lücken-Duplex-Mutagenese (Y. Morinaga u.a.. Biotechnology 2 [1984], 636-639) von Plasmid pKFN-734 hergestellt unter Verwendung der beiden mutagenen Starter NOR-648 CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGCTGCAGTAG und Nor-745 ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTGGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACC. Plasmid pKFN-734 wurde konstruiert durch Ligation des 0,4kb-EcoRI-Xbal-Fragmentes, welches ein synthetisches Hefe-Signalführungselement codiert, das in Phase mit

einem synthetischen Insulinvorläufer-Gen B(1-29)AlaAlaLys-A(1-21) von Plasmid pLaC 212 spx3 verschmolzen ist, an das2,7 kb-EcoRI-Xbl-Fragment von pUC-19 (C. Yannisch-Perron u. a„ Gene 33 (1985], 103-119).

Pla?mid pLaC212spx3 wird im Beispiel 3 und in den Abbildungen 6 und 13 der internationalen Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO89/02463 beschrieben. Die DNA-Folge des 0,4kb-EcoRI-Xbal-Fragmentes von pKFN-864, das das Signalführungsinsulin B(1-29, des 28 Pm)-AIaAIaLyS- A(1- 21,21 Ser) codiert, wird in der Abb. 3 gegeben.

pKFN-864 wurde mit EcoRI und Xbal geschnitten, und das 0,5 kb-Fragment wurde mit dem 9,5 kb-Fragment Ncol-Xbal vonpMT636 und dem 1,4kb-Fragment Ncol-EcoRI von pMT636 llgiert, was Plasmid pKFN-866 ergibt, siehe Abb.4. Plasmid pMT636wurde aus pMT608 nach Deletierung des LEU-2-Gens und aus pMT479 konstruiert, siehe Abb.4. pMT608 wird in der EP 195691beschrieben. pMT479 wird in der EP163529 beschrieben. pMT479 enthält das Schizosaccharomycei pombe-TPI-Gen (POT),den S. cerevislae-Triosephosphatisomerasepromotor und -terminator, TPIp und TPIt (Alber, T. und Kawasaki, G., J. Mol. Appl.

Gen. 1(1982], 419-434). Plasmid pKFN-866 enthält die folgende Sequenz: TPIp-Signal-Führungs-lnsulin B(1-29, des 28 Pm)-AIaAIaLy s-A(1-21,21 Ser)-TPI_T. Der S. cerevlsiae-Stamm MT663 (E 2-7 B XE11-36a/a, AtpiAtpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1 % Bacto-Hefoextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Galaktose, 1 % Laktat) bis zu einem OD-Wert bei 600nm von 0,6 gezogen. Es wurden 100 ml der resultierenden Kultur durch Zentrifugieren geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und

in 10ml einer Lösung wieder zur Suspension gebracht, dio 1,2M Sorbitol, 25mM Na₂EDTA, pH-Wert 8,0, und 6,7mg/ml

Dithiotreitol enthielt. Die Suspension wurde bei 30⁰C15 Minuten lang inkubiert, zentrifugiert und die Zellen erneut in einer Lösung (10ml) zur Suspension gebracht, die 1,2M Sorbitol, 1OmM Na₂EDTA, 0,1 M Natriumzitrat, pH-Wert 5,8, und 2mg Novozym· 234 enthielt. Die Suspension wurde bei 3O⁰C 30 Minuten lang inkubiert, die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen,

in 10ml von 1,2M Sorbitol und 10ml von CAS (1,2M Sorbitol, 1OmM CaCI₂,1OmM Tris-HCI (Tris =

Tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH-Wert 7,5) gewaschen und in 2ml CAS wieder zur Suspension gebracht. Zur Transformation wurden 0,1 ml der CAS-suspendi6rten Zellen mit etwa 1 \xg von Plasmid pKFN-866 gemischt und bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang stehengelassen. Es wurde 1 ml von (20% Polyethylenglykol 4000,1OmM CaCI₂,10mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5) zugesetzt und das Gemisch weitere

30 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und das Pellet wurde In 0,1 ml SOS (1,2M

Sorbitol, 33% YPD, 6,7 mM CaCI₂,14 \ig/m\ Leuzin) wieder zur Suspension gebracht und 2 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Dann

wurde die Suspension zentrifugiert und das Pellet in 0,5 ml von 1,2 M Sorbitol wieder zur Suspension gebracht. Anschließendwurden bei 52⁰C6mlTop-A&ar (SC-Medium von Sherman u.a. (Methods in Yeast Genetics {Methoden in der Hefegenetik}, Cold

Spring Harbor Laboratory, 1981], das 1,2 M Sorbitol plus 2,5% Agar enthält) zugesetzt und die Suspension oben auf Platten

gegossen, welche das gleiche agar-verfestigte, sorbitolhaltige Medium enthielten. Nach 3 Tagen bei 3O⁰C wurden Transformant-

-13- 2SC 426

Kolonien herausgenommen, wieder Isoliert und zum Ansetzen von flüssigen Kulturen verwendet. Einer dieser Transformanten, KFN-883, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.

Der Hefestamm KFN-883 wurde auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2% Pepton [von den Difco Laboratories] und 2% Glukose) gezogen. Eine 10-ml-Kultur des Stammes wurde bei 30°C auf einen OD-Wert bei 600 nm von 20 geschüttelt. Nach dem Zentrifugieren wurde die oben aufschwimmende Schicht durch HPLC (Hochdruckf lüssigkeitschromatografie) analysiert, wie das von L. Snel u.a., Chromatographia 24 (1987), 329-332, beschrieben wurde. Die Ausbeute betrug 0,14mg/l Insulin B (1-29, des 28Pro)-AlaAlaLys-A(1-21), 21 Ser).

Der einzelkettige Insulinvorläufer wurde aus der obenaufschwimmenden Fermentationsschicht durch Adsorption in eine lonenaustauschkolonne bei niedrigem pH-Wert, Desorption bei hohem pH-Wert und Ausfällung des Pools durch Zinkionen

Isolier: Die Transpeptldierung des Vorläufers von menschlichem (Ser*²¹!, des [Pro⁸²⁸], [Thr^B30-OMe]-lnsulin wurde folgendermaßen ausgeführt:

Es wurden 10mMoI (2,35) Threoninmethylester und Eisessig in DMF aufgelöst, was 5 ml ergab, es wurden 2,5 ml von 76,5%igem DMF in Wasser zugesetzt und 0,5g des Vorläufers im Gemisch aufgelöst, das bei 12⁰C gehalten wurde; dann wurden 50mg Trypsin in 1,25 ml von 0,05 M Kalziumazetat zugesetzt, und nach 24 Stunden bei 12°C wurde das Reaktionsgemisch 100 ml Azeton zur Ausfällung des Peptide zugesetzt, das ausgeschleudert und In vacuo getrocknet wurde.

Der isolierte Insulinanalog-Ester wurde auf einer präparativen HPLC-Kolonne unter Verwendung einer Kieselgel-C 18-Matrix bei saurem pH-Wert gereinigt. Dann wurde der gereinigte Ester in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 10 und 25⁰C für die Dauer von 24 Stunden hydrolysiert. Das gebildete menschliche [Ser*²¹], des [Pro^B28l-lnsulin wurde bei neutralem pH-Wert mit Zinkionen ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Anicnanaustauschchromatografie gereinigt und anschließend durch Gelfiltration entsalzt. Die Ausbeute an lyophilisiertem menschlichen [Ser*²¹], des [Pro^B28]-lnsulin betrug 102 mg.

Beispiel XIII

Herstellung von menschlichem des [Thr^B"]-lnsulin.

In 40ml Wasser wurde 1 g Zn-freies Schweinsinsulin durch Abstimmung des pH-Wertes auf 9 aufgelöst, und eine Lösung von 50 mg Schweinstrypsin in 10 ml von 0,25 M Ammoniumwasserstoffkarbonat, mit Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 9 abgestimmt, wurde zugesetzt. Man ließ die Lösung bei 4°C stehen, und nach 48 Stunden stellte man durch HPLC-Analyse eine Ausbeute von 65% fest. Dann wurde das Reaktionsgemisch bei 4⁰C auf einer 5 χ 90cm-Kolonne von Sephadex* G 50 superfein in 0,05 M Ammoniumwasserstoffkarbonat bei einem Strom von 90 ml/h gelfiltriert. Die Fraktionen, welche die Proteinhauptspitze enthielten, wurden zusammengefaßt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 520mg menschliches des(B23-B30)-lnsu!in.

Ein Peptid mit der Sequenz Gly-Phe-Phe-Tyr-Pro-Lys-Thr wurde auf einem PAM-Haiz mit Hilfe von geschützten, symmetrischen Aminosäureanhydr'den mit einer Peptidsyntheseanlage von Applied Biosystems synthetisiert. Abschließend wurde das Peptid durch enhydrischep Wasserstofffluorid bei O⁰C aus dem Harz geschnitten, wodurch gleichzeitig die restlichen Schutzgruppen entfernt wurden.

Es wurden 200mg von menschlichem des (B23-B30)-lnsulin und 400 mg des Peptids in einem Gemisch aus 2,40ml Dimethylformamid und 1,20 ml Wasser aufgelöst, und der pH-Wert des Gemische wurde mit Triethylamin auf 6,5 abgestimmt.

Dann wurden 10mg Schweinstrypsin in 0,20ml Wasser zug·, setzt, und das Reaktionsgemisch blieb 4 Stunden lang bei 2O⁰C stehen. Anschließend wurde die Reaktion durch den Zusatz von 25 ml 2-Propanol gestoppt, und die ausgefällten Proteine wurden durch Zentrifugieren isoliert. Der abgeleitete Niederschlag wurde wieder in 10ml von 1M Essigsäure aufgelöst und einer 2,6 x 20cm-Kolonne von Lichrop.ep· RP-18 (25-40μιτι) zugeführt, die vorher mit 0,5mM Chlorwasserstoffsäure, 0,1 M Natriumchlorid in 30%Äthano! äquilibriert worden war. Dann wurde die Kolonne bei 20⁰C br i einem Stror. 'On 20ml/h mit dem gleichen Puffer, aber bei einer linearen Zunahme des Ethanolgehalts aiif 50%, für die Dauer von 24 Stunden eluiert. Das Eluat wurde auf UV-Absorbanz überwacht, und die Fraktionen, welche die froteinhauptspitze enthielten, wurden zusammengefaßt.

Das Protein wurde durch Verdünnung mit dem gleichen Volumen Wasser und Abstimmung des pH-Wertes auf 5,5 mit Natriumhydroxidlösung ausgefällt, und nachdem sie bei 4°C eine Stunden lang erstanden hatte, wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren und Lyophilisieren isoliert.

Der Ertrag betrug 80mg menschliches des [Thr^B27]-lnsulin, das durch sequentiellen Edman-Abbau der getrennten, vinylpyridylierten A- und B-Ketten identifiziert wurde.

Beispiel XIV

Herstellung einer injizierbaren Lösung.

Es wurden 60μΜοΙ eines menschlichen Insulinanalogs nach der Erfindung in 4ml 0,1 M HCI aufgelöst und 20ml 1,5%lges m-Kresol zugesetzt. Anschließend wurde die Lösung mit 40 ml 4%igem Glyzerol und 20 ml von 65 mM Dinatriumwasserstoffphosphat gemischt, und der pH-Wert wurde auf 7,3 abgestimmt. Abschließend wurde die Lösung mit Wasser auf 100ml gebracht und durch Filtern sterilisiert.

Beispiel XV

Bestimmung des Assoziationsgrades.

Eine 2,6 χ 88cm-Kolonne von Sephadex*G-75 wurde mit 13mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,3, bei einem Strom von 22ml/h äquilibriert. Durch Einführung von menschlichem des-IOktapeptid-B^^Hnsulin, Cytochrome C, Ribonukloase und mono- und dimerem Myoglobin als Molekulargewichtsmarkierungen wurde eine Kurve gezeichnet, welche das Molekulargewicht als eine Funktion des Eluierungsvolumens darstellt.

Durch Einführung von 1 ml einer Lösung, die 0,6 mM Zn-freies, menschliches Insulin oder 0,6mM Insulinanalog, hergestellt nach dem Beispiel XII, enthielt, konnte festgestellt werden, daß Zn-freies, menschliches Insulin als eine nacheilende Spitze mit einem scheinbaren Molekulargewicht von »14 kD eluiert und daß die Analoge, die in den Beispielen Vl bis X beschrieben wurden, alle als symmetrische Spitze mit einem scheinbaren Molekulargewicht von » 5 kD eluierten.

Diese Ergebnisse zeigen, daß menschliche Insulinanaloge nach der Erfindung in Lösung bei einem pH-Wert von 7,3 im wesentlichen monomer sind, während das normale menschliche Insulin unter denselben Bedingungen im hohen Maße als ein Gemisch von Dimeren und höheren Oligomeren erscheint.

Beispiel XVI

Bestimmung der biologischen Aktivität.

Die biologische Aktivität In vitro wurde durch Messen der Bindungsaffinität an die Insulinrezeptoren von isolierten Ratten-Adipozyten und -Hepatozyten gemessen, wie das im wesentlichen bei Gliemann, J., Gammeltoft, S., Dlabetologia, 10 (1974), 105-113, beschrieben wurde.

Die Insulinanaloge wurden mit semisynthetischem, menschlichen Insulin verglichen, dessen Wirksamkeit mit 100% festgelegt wurde, und die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle gezeigt:

Adipozyten Hepatozyten

des |Phe^B2sJ, des [Thr^B30]-lnsulin, menschliches 223 % 201 %

des (Phe^BW)-lnsulin, menschliches 225% 249%

[Asp^A21),des[Phe^BM),des(Thr^B30]-lnsulin,

menschliches 250% 242%

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Insulinanaloge mit der folgenden Formel:

A-Kette 9 ?

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cye-Cye-Thr-Ser-Ile-Cye-Ser-Leu

1 2 3 4 5 6 7| 8 9 IO 11 12 13 B-Kette _c

H-Phe-Val-Yg-Gln-Hie-Leu-Cye-Gly-Ser-Hle-Leu-Val-Glu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 O 11 12 13

A-Kette (fortgee.)

14 15 16 17 18 19 20 21
Tyr-Gln-Leu-Glu-Aen-Tyr-Cye-Yj-oH

B-Kette (fortgee.)
Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cye-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-X^Xg-Xj-14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

B-Kette (fortges.)
X_-J-Xe-Xe
282930,

worin X₁, X2, X3, Xs, Yi und Y2 jeder natürlich vorkommende Aminosäurerest sind; X4 gleich Lys oder Arg ist und Xe jeder natürlich vorkommende Aminosäurerest ist, der die C-Terminal-Hydroxygruppe oder-Oh trägt, oder X₆ und X₆ zusammen die C-Terminal-Hydroxygruppe bilden, dadurch gekennzeichnet, daß

A) eine DNA-Folge, welche einen Vorläufer des in Frage kommenden Insulinanalogs codiert, eingefügt wird in ein geeignetes Hefeexpressionsvehikel, das bei der Übertragung auf Hefe in der Lage ist, den Vorläufer des Insulinanalogs zu expressieren und zu sekretieren, in welchem [Lys⁸²⁸], [Arg⁸²⁸], [Lys⁸²⁹] oder [Arg⁸²⁹] an GIvA¹ durch eine Peptidbildung oder ein Peptid mit der Formel III gebunden ist,

worin R eine Peptidkette mit η Aminosäureresten ist, η eine ganze Zahl von O bis 33 ist und R(D gleich Lys oder Arg ist, der transformierte Hefestamm in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird und der Vorläufer aus der Kulturbrühe gewonnen und mit einer Aminoverbindung mit der Formel IV reagiert wird:

Q-QR"

worin Q ein einzelner Aminosäurerest ist und R" eine Karboxyschutzgruppe, wie Methyl oder tert-Butyl, ist, wobei Trypsin oder ein trypsinähniiches Enzym als Katalysator in einem Gemisch aus Wasser und organischen Lösungsmitteln verwendet wird, worauf die Karboxyschutzgruppe entfernt und das Insulinanalog aus dem Reaktionsgemisch entfernt wird, oder

ein Insulinanalogvorläufer, in welchem die C-Terminal-Aminosäure von Lys oder Arg
verschieden ist und der Vorläufer eine Brücke eines einzelnen Paares von Basisaminosäuren, die aus der aus Lys und Arg bestehenden Gruppe ausgewählt werden, zwischen dem C-Terminal und GIy^¹ hat, isoliert und dann durch enzymatische Behandlung unter Verwendung von Trypsin und Karboxypeptidase B in das Insulinanalog umgewandelt werden kann oder
B) durch die Behandlung eines Insulins mit Trypsin, um die (B23-B30)-Aminosäuren

wegzuschneiden, das gewünschte Peptid von 5 bis 7 Aminosäuren synthetisiert wird, das
resultierende Peptid an das menschliche des (B23-B30)-lnsulin gekoppelt wird und das
resultierende Insulinanalog aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei Xb aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus jedem natürlich vorkommenden
Aminosäurerest mit Ausnahme von Pro besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanalog
hergestellt werden, wobei Y₁ und/oder Y₂ ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus jedem
natürlich vorkommenden Aminosäurerest mit Ausnahme von Asn besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei

X₁ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn oder Tyr besteht;

X₂ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Tyr, Thr, GIu, Asp, Ala, His, Ser oder Phe besteht;

X₃ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Pro, GIu, Asp, Ser, Thr oder His besteht;

X₅ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Lys, Thr, Ser, Ala, Asp oder GIu besteht;

X₆ ausgewählt wird aus der Gruppe, die ausThr-OH, Ser-OH, AIa-OH, Asp-OH, GIu-OH oder-OH besteht, oder X₅ und X₆ zusammen die C-Terminal-Hydroxygruppe bilden;

Y₁ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Asp, GIy, Ser, GIu oder AIa besteht, und

Y₂ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Gin, GIu oder Asp besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei

X₅ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Lys, Thr, Ger, Ala, Asp oder GIu besteht;

X₆ gleich-OH ist;

Y₂ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Gin, GIu oder Asp besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei

X₅ und X₆ zusammen die C-Terminal-Hydroxygruppe bilden;

Y₁ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Asp, GIy, GIu, Ser oder AIa besteht, und

Y₂ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Gin, GIu oder Asp besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei X₁ gleich Phe ist; X₂ gleich Tyr; X₃ gleich Thr ist; X₅ gleich Lys ist; X₆ gleich Thr-OH ist; Y₁ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Asp, Ser oder GIy besteht, und Y₂ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Gin, Asp oder GIu besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei X₁ gleich Tyr ist; X₂ gleich Thr ist; X₃ gleich Pro ist; X₅ gleich Thr ist; X₆ gleich -OH ist; Y₁ ausgewählt wird aus derGruppe,dieaus Asn, Asp, SeroderGly besteht, und Y₂ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Gin, Asp oder GIu besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei X₁ gleich Phe ist; X₂ gleich Thr ist; X₃ gleich Pro ist; X₅ gleich Thr ist; X₉ gleich -OH ist; Y₁ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Asp, Ser oder GIy besteht, und Y₂ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Gin, Asp oder GIu besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei X₁ gleich Phe ist; X₂ gleich Tyr ist; X₃ gleich pro ist; X₅ gleich Thr ist; X₆ gleich -OH ist; Y₁ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Asp, Ser oder GIy besteht, und Y₂ ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Asn, Gin, Asp oder GIu besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei die ^-Aminosäure ungeladen ist und ein Kohlenstoffatom in der Gamma-Position hat, das sp2-hybridisiert ist, und Xe gleich-OH ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei Y₁ und Y₂ aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus allen natürlich vorkommenden Aminosäureresten mit Ausnahme von Asn besteht, und X₆ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus jedem natürlich vorkommenden Aminosäurerest mit Ausnahme von Thr besteht.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß menschliche Insulinanaloge hergestellt werden, wobei Xs und Xe zusammen -OH bilden.

14. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß menschliches Insulinanalog mit der folgenden Formel

A-Kette © <i