DK166730B - Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse - Google Patents

Description

DK 166730 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte humaninsul inanaloger, som udviser lav associationsgrad i opløsning, farmaceutisk tolerable salte deraf og insulinpræpara-5 ter, -som indeholder disse.

DEN KENDTE TEKNIK

Siden insulinets opdagelse i 1922 har der været anvendt mange forskellige insulinpræparattyper til behandling af diabetes mellitus. I starten benyttede man udelukkende io insulinopløsninger med hurtigt indtrædende og relativt hurtigt ophørende insulinvirkning, men senere er der også fremkommet insulinpræparater med mere udstrakt virkningsprofil frembragt ved at sænke insulinets opløselighed ved tilsætning af f.eks. zinksalt og/eller protaminer. Af tilgængeligheds-15 grunde er det hertil anvendte insulin sædvanligvis blevet udvundet af bugspytkirtler fra husdyr, hyppigst okser, svin og får, men i de senere år er der på markedet- også fremkommet præparater indeholdende humaninsulin af bioteknologisk oprindelse.

20 Humaninsulin har den nedenfor anførte struktur: A-kæde

S-S

I 7 | H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-25 1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12

S

B-kæde S

30 H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-1234 56789 10 11 12 20

DK 166730 B

2 A-kæde (fortsat) -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH 13 14 15 16 17 18 19 | 21

5 S

' ^ 1

B-kæde (fortsat) S

-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-10 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 B-kæde (fortsat) -Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH 25 26 27 28 29 30

Insulinerne fra visse husdyr er strukturmæssigt meget 15 lig med humaninsulin. Hunde- og svineinsulin adskiller sig blot fra humaninsulin ved at indeholde Ala i- 3o-stillingen i B-kæden, og kanininsulin adskiller sig blot fra humaninsulin ved at indeholde Ser i samme position. Ved hjælp af semisyn-tetiske fremgangsmåder er det muligt at omdanne disse insuli-20 ner til humaninsulin ved at udskifte B30-aminosyreresten med Thr, jfr. f.eks. Morihara et al., Nature 280 (1979), 412 -413, og Markussen (USA-patentskrift nr. 4.343.898).

Når et sådant insulin opløses ved fysiologisk pH-vær-di, indstiller der sig en koncentrationsafhængig associa-25 tionsligevægt mellem monomert, dimert, tetramert, hexamert og endog polymert insulin. Ligevægten kan eksempelvis bestemmes ved ultracentrifugering, ved osmometri eller ved gelfiltrering, jfr. f.eks. R. Valdes Jr. og G.A. Ackers, "Methods in enzymology", bind 61 (Enzyme Structure, del H, udgivere: 30 Hirs & Timasheff) , Academic Press 1979, side 125 - 142. I normale formuleringer af insulinpræparater forskydes denne ligevægt på en sådan måde, at insulinet i meget høj grad foreligger på en hexamer form.

3

DK 166730 B

Der kan foretages substitutioner i insulinmolekylet med henblik på at forbedre insulinets virkhingsprofil ved behandlingen af diabetes. Fra beskrivelsen til PCT-patent-ansøgning nr. WO 86/05497 er det således kendt at substituere 5 én eller flere af aminosyreresterne Glu i insulinmolekylet med en neutral aminosyrerest, hvorved der sker en forskydning af insulinets udfældningszone, således at der opnås langsom afgivelse efter injektion.

Fra beskrivelsen til europæisk patentansøgning med 10 publikationsnummer 214.826 kendes endvidere insulinanaloger, som absorberes særligt hurtigt efter injektion. Denne virkning skyldes, at man ved visse substitutioner især i B9-B12-stillingerne og i B26-B28-stillingerne i insulinmolekylet opnår en undertrykkelse af insulinets associeringsevne, så-15 ledes at det stort set foreligger på monomer eller dimer form. Imidlertid udviser mange af disse insulinanaloger en nedsat biologisk virkning.

Gennem årene er der beskrevet et stort antal, kunstigt fremstillede humaninsulinanaloger, som oftest med det formål 20 at belyse strukturens indflydelse på aktiviteten, jfr. f.eks. Mårke et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360 (1979), 1619 - 1632. Undersøgelser af indvirkningen af substitutioner i insulinets (B22-B26)-sekvens på receptorbindingen har været særligt interessante, da denne sekvens formodes at være et 25 væsentligt område for bindingen af insulinreceptoren, og da naturligt forekommende mutationer er fundet med substitutioner i dette område, jfr. f.eks. S. Shoelson et al. PNAS 80 (1983), 7390 - 94, og M. Kobayashi et al.: Biomed. Res. 5, (3) (1984), 267 - 72. Man finder meget lave biologiske akti- 30 viteter for analoger, hvori PheB24 eller PheB25 er substitueret, og det konkluderes derfor, at tilstedeværelsen af disse to aminosyrer har afgørende betydning for receptorbindingen.

Det har overraskende vist sig, at visse humaninsul inanaloger, hvori en af aminosyreresterne PheB24 eller PheB25 35 ikke er til stede, udviser lav associationstendens i opløsning og samtidig in vitro udviser uændret eller endog højere biologisk aktivitet end humaninsulin. Udeladelsen af enten

DK 166730B

4

PheB24 eller PheB25 har den virkning, at LysB2^ ændres til LysB28, hvilket fører til en positiv ladning i denne stilling i humaninsulinmolekylet.

SAMMENDRAG AF OPFINDELSEN

5 I det bredeste aspekt angår den foreliggende opfindel se følgelig humaninsulinanaloger, i hvilke der i B28-stillin-gen er en positivt ladet aminosyrerest, dvs. Lys eller Arg, dvs. i 8-stillingen i B-kæden beregnet fra GlyB20.

De foreliggende insulinanaloger har overraskende en io lav associeringsgrad og samtidig en forøget fysisk stabilitet sammenlignet med andre insulinanaloger med lav associeringsgrad. Indførslen af en positiv ladning i B28-stillingen kan opnås på to måder. Enten ved at udelade en af aminosyreresterne i B24-, B25-, B26-, B27- eller B28-stillingen i hu-15 maninsulinmolekylet, hvilket giver en humaninsulinanalog med Lys i B28-stillingen, eller ved at udskifte ProB28 i humaninsulinmolekylet med Lys eller Arg. Hvis der· foretrækkes Arg i B28-stillingen, kan udeladelsen af en af aminosyrerne i B24-, B25-, B26—, B27- eller B28-stillingen yderligere kombi-20 neres med udskiftning af den oprindelige LysB29 med en Argrest.

De foreliggende humaninsulinanaloger kan yderligere have én eller flere ændringer i den C-terminale ende af B-kæden, sammenlignet med humaninsulin. Aminosyreresterne i 25 stillingerne B25 - B27 og aminosyreresterne efter LysB28 el-ler ArgD kan arbitrært vælges blandt de naturligt forekommende aminosyrerester, eller B29-aminosyren eller B30-amino-syren eller begge kan mangle.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse 30 kan TyrB26 være erstattet af en anden, uladet aminosyrerest, i hvilken det andet kulstofatom i sidekæden (C^) er sp2-hy- bridiseret (bindingerne har en (mere) plan struktur).

Med henblik på at stabilisere molekylet mod kemisk nedbrydning kan Asn i A21-stillingen og/eller B3-stillingen 5

DK 166730 B

endvi'dere være udskiftet med en anden aminosyrerest.

De foreliggende humaninsulinanaloger "er kendetegnet ved følgende formel I: A-kæde

5 S-S

I "" r H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- s 10 |

B-kæde S

H-Phe-Val-Y2-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- A-kæde (fortsat) (I)

15 -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y1-OH

s

B-kæde (fortsat) S

20 | -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- B-kæde (fortsat) -X1-X2-X3-X4-X5-X6 hvor X1, X2, X3, X5, Y1 og Y2 kan være en hvilken som helst, 25 naturligt forekommende aminosyrerest, idet dog X^ ikke er Pro, X4 er Lys eller Arg, X6 kan være en hvilken som helst, naturligt forekommende aminosyrerest, som bærer den C-termi-nale hydroxygruppe, eller -OH, eller X5 og X6 danner sammen den C-terminale hydroxygruppe, eller er farmaceutisk to-30 lerable salte deraf.

Ved en anden udførelsesform af opfindelsen udvælges X5

DK 166730B

6 blandt gruppen bestående af en hvilken som helst, naturligt forekommende aminosyrerest med undtagelse af Tro.

Ved en udførelsesform kan Y1 og/eller Y2 i ovennævnte formel være udvalgt blandt gruppen bestående af en hvilken 5 som helst, naturligt forekommende aminosyrerest med undta-gel-se. af Asn.

I ovennævnte formel I kan X1 mere specifikt være Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn eller Tyr, X2 kan mere specifikt være Tyr, Thr, Glu, Asp, Ala, His, Ser eller Phe, X3 kan mere spe-10 cifikt være Pro, Glu, Asp, Ser, Thr eller His, X5 kan mere specifikt være Lys, Thr, Ser, Ala, Asp eller Glu, X6 kan mere specifikt være Thr-OH, Ser-OH, Ala-OH, Asp-OH, Glu-OH eller -OH, Y1 kan være Asn, Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ala, Met, Trp, Tyr, Gin eller Gly, mere foretrukket Gly, Asp, 15 Glu eller Ala, og Y2 kan være Asn, Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ala, Met, Trp, Tyr, Gin eller Gly, mere foretrukket Glu eller Asp.

En gruppe af de foreliggende humaninsulinanaloger kan karakteriseres som sådanne, i hvilke en af aminosyreresterne 20 i B24- eller B25-stillingen er udeladt, at aminosyreresten i B26-stillingen eventuelt er udskiftet med en anden, uladet aminosyrerest, i hvilken kulstofatomet i γ-stillingen er sp2-hybridiseret, at eventuelt én eller flere af aminosyreresterne i A21-, B3- og B3O-stillingen er forskellig fra amino- 25 syreresten i den tilsvarende stilling i humaninsulin, og at der eventuelt ikke er nogen aminosyrerest i B3O-stillingen.

Ifølge en mere enkel definition er sådanne analoger humaninsulinanaloger, i hvilke der ikke findes TyrB2^, i hvilke PheB25 eventuelt er udskiftet med en anden, uladet 30 aminossyrerest, i hvilken kulstofatomet i γ-stillingen er SP -hybridiseret, i hvilket én eller flere af aminosyreresterne i A21-, B3- og B30-stillingerne eventuelt er for skellige fra aminosyreresterne i humaninsulin, og i hvilke der eventuelt ikke er nogen aminosyrerest i B3O-stillingen.

35 Eksempler på uladede aminosyrerester, i hvilke er sp -hybridiseret, er Tyr, Phe, His, Trp eller Asn.

En gruppe af humaninsulinanaloger ifølge denne opfin- 7

DK 166730 B

delse' har strukturen, der er vist med nedenstående formel II, hvor X betegner Tyr, His, Phe eller Asn, Y beregner Thr, Ser, Ala, Asp eller Glu eller er udeladt, og hvor eventuelt én eller begge de understregede Asn er udskiftet med Asp ved 5 udskiftning eller deamidering, eller den understregede Asn i A-kæden kan være Gly.

A-kæde

S-S

I I

10 H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- s

B-kæde S

15 | H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- A-kæde (fortsat) (II) -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH 20 |

S

B-kæde (fortsat) S

25 -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- 1 B-kæde (fortsat)

-X-Thr-Pro-Lys-Y-OH

Foretrukne humaninsulinanaloger ifølge den foreliggende opfindelse er følgende: des(PheB25)-humaninsulin, des-

DK 166730B

8 (TyrB26)-humaninsulin, des(Thr527)-humaninsulin, des(Pro528)-humaninsulin, des(Phe525)-svineinsulin, des(Pro528)-svinein-sulin, des(ProB28)-kanininsulin, des(PheB25),des(Thr530)-humaninsulin, des(Tyr526),des(Thr530)-humaninsulin, (Ser^21)-5 des(Pro528)-human insulin, (GlyÅ21)-des(Pro528)-humaninsulin, (GlyA2^)-des(Phe525)-humaninsulin, (AspA21j-des(Phe525)-humaninsulin, (His525)-des(Tyr526),des(Thr530)-humaninsulin, (AsnB25)-des(TyrB26),des(ThrB30)-humaninsulin, (AspA21)-des(PheB25),des(Thr530)-humaninsulin, (Asp528)-des(PheB25)-10 humaninsulin, (Asp53)-des(Phe525)-humaninsulin, (Lys528)-hu-maninsulin, (Lys528,Thr529)-humaninsulin og (Arg528)-des-(Lys529)-humaninsulin.

Humaninsulinanalogerne ifølge den foreliggende opfindelse kan fordelagtigt anvendes ved behandling af diabetes, 15 da den formindskede associationsgrad fører til en hurtigere optagelse i blodstrømmen, end det er tilfældet med almindeligt insulin, ikke blot efter den almindeligt anvendte, subkutane injektion, men også ved non-parenteral indgivelse, jfr. international patentansøgning nr. WO '87/06137. Deres 20 forbedrede fysiske stabilitet gør dem mere fordelagtige i behandlingen af diabetes.

Insulinanalogerne ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles ved at ændre proinsulingenet ved at udskifte kodoner på egnede steder i det naturlige humanproinsulingen 25 med kodoner, der koder for de ønskede aminosyrerester og/el-ler ved at udelade kodoner svarende til de ønskede udeladelser. Alternativt kan man syntetisere hele DNA-sekvensen, der koder for den ønskede insulinanalog. Genet, der koder for den ønskede insulinanalog, indsættes derefter i en egnet ekspres-30 sionsvektor, der, når den overføres til en egnet værtsorganisme, f.eks. E. coli, Bacillus eller gær, laver det ønskede produkt. Ekspressionsprodukete isoleres derefter fra cellerne eller dyrkningsmediet afhængigt af, hvorvidt ekspressionsproduktet udskilles fra cellerne eller ej.

35 De hidtil ukendte insulinanaloger kan også fremstilles ved kemisk syntese ved metoder, der er analoge med den meto- 9

DK 166730 B

de, der er beskrevet af Mårki et al. (Hoppe-Seyler' s Z. Physiol. Chem., 360 (1979), 1619 - 1632). DeT'kan også dannes fra adskilte, in vitro fremstillede A- og B-kæder indeholdende de relevante aminosyrerester og udeladelser, hvorefter de 5 modificerede A- og B-kæder knyttes sammen ved at danne di-sulfidbroer på kendt måde (f.eks. Chance et al., i: Rick DH, Gross E (udgivere) Peptides: Synthesis - structure - Function. Proceedings of the seventh American peptide symposium, Illinois, 721 - 728).

10 Insulinanalogerne kan endvidere fremstilles ved en metode, der er analog med den metode, der er beskrevet i europæisk patentansøgning med publikationsnummer 163.529, hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning. Ved sådanne metoder udtrykkes en insulinprecursor for humaninsulinanalogen, hvori 15 den basiske aminosyre i B28- eller B29-stillingen, (hvis slutproduktet skal have en basisk aminosyre i denne stilling) knyttes til GlyA1 enten ved hjælp af en peptidbinding eller en peptidkæde af varierende længde og udskilles af gær med disulfidbroerne i de rigtige stillinger og omdannes derefter 20 til den ønskede humaninsulinanalog under anvendelse af Mori-haras metode (Morihara supra) eller den såkaldte transpepti-deringsreaktion (se USA-patentskrift nr. 4.343.898).

De foreliggende insulinanaloger kan følgelig fremstilles ved at indsætte en DNA-sekvens, der koder for en precur-25 sor for den pågældende insulinanalog, i en egnet gærekspressionsvektor, der, når den transformeres til gær, er i stand til udtrykke og udskille precursoren for insulinanalogen, i hvilken LysB28, ArgB28, Lys629 eller ArgB29 er knyttet til GlyA1 med en peptidbinding eller en peptidkæde med formlen 30 III

-Rn-R1- (III) hvor R er en peptidkæde med n aminosyrerester, n er et helt tal fra 0 til 33, og R1 er Lys eller Arg, når den transformerede gærstammer dyrkes i et egnet næringsmedium. Precur-35 soren udvindes derefter fra dyrkningsmediet og omsættes med 10

DK 166730 B

en aminoforbindelse med formlen IV

Q-QR" (IV) hvori Q er en enkelt aminosyrerest, fortrinsvis Thr, eller et dipeptid, og R" er en carboxylbeskyttelsesgruppe (f.eks.

5 methyl eller tert.butyl), under anvendelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym som katalysator i en blanding af vand og organisk opløsningsmiddel på analog måde som beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.343.898 (hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning), hvorefter carboxylbeskyttelses-io gruppen fjernes, og insulinanalogen isoleres fra reaktionsblandingen.

Hvis insulinanal ogerne som den C-terminale rest i B-kæden indeholder en aminosyrerest, der er forskellig fra Lys eller Arg , kan de også fremstilles ved en metode, der er 15 analog med den metode, der er beskrevet i europæisk patentansøgning med publikationsnummer 195.691, hvis beskrivelse inkorporeres heri ved reference. Ved denne metode fremstilles insulinanalogprecursorer af den art, der har -en bro mellem A~ og B-kæden bestående af et enkelt par af basiske aminosyrer 20 (Lys, Arg) , i gær, og de omdannes derefter til. insulinanalo-gen ved enzymatisk omdannelse.

Hvis den C-terminale aminosyrerest i B-kæden er Lys eller Arg, kan insulinanalogerne fremstilles ud fra ovennævnte biosyntetiske precursorer ved enzymatisk spaltning med 25 trypsin.

Humaninsulinanalogerne ifølge denne opfindelse, i hvilke der kun findes udskiftninger inden for de sidste ami-nosyrerester nærmest den C-terminale ende af B-kæden, kan endvidere fremstilles på i og for sig kendt måde ud fra 30 f.eks. svineinsulin som beskrevet i K. Inoye et al.; JACS 101 (3), (1979), 751 - 752, hvorved svineinsulin først spaltes med trypsin til des-(B23-30)-humaninsulin, hvorefter sidstnævnte enzymatisk kobles med et syntetisk peptid, der har den ønskede aminosyresekvens.

35 De foreliggende insulinanaloger kan anvendes til frem- 11

DK 166730 B

stilling af hidtil ukendte præparater med insulinaktivitet, der kan erstatte human- og svineinsulin i dé~"insulinpræparater, der hidtil har været kendt. Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater, der er kendetegnet ved at indeholde en 5 humaninsulinanalog med den i krav 1 angivne formel eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf. Sådanne præparater foreligger i vandig opløsning eller suspension, fortrinsvis ved neutral pH-værdi. Det vandige medium er gjort isotonisk, f.eks. med natriumchlorid, natriumacetat eller glycerol. End-io videre kan det vandige medium indeholde zinkioner, pufferstoffer, såsom acetat og citrat, og konserveringsmidler såsom m-cresol, methylparaben eller phenol. Præparatets pH-værdi indstilles til en ønsket værdi, og insulinpræparatet steriliseres ved sterilfiltrering.

15 De foreliggende insulinanaloger kan også blandes med andre insulinanaloger med retarderet insulinaktivitet til fremstilling af insulinpræparater bestående af en blanding af hurtigtvirkende og protraheret virkende insulin.

Insulinpræparaterne ifølge denne opfindelse kan anven-20 des analogt med anvendelsen af kendte insulinpræparater.

TERMINOLOGI

De for aminosyrerne anvendte forkortelser er dem, der er angivet i J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558. Aminosyrerne er i L-konfiguration. Arten af de heri angivne insuliner er human, 25 medmindre andet er angivet.

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE

Opfindelsen belyses yderligere under henvisning til vedlagte tegninger, på hvilke

Fig. 1 viser ekspressionsplasmidet pYGABA 14-276, 30 Fig. 2 viser gærvektoren pAB24,

Fig. 3 viser DNA-sekvensen af det 0,4 kb lange EcoRI-Xbal-fragment fra plasmidet pKFN-864, og

DK 166730B

12

Fig. '4 viser fremstillingen af ekspressionsplasmidet pKFN- 866.

DETALJERET BESKRIVELSE

• DNA-sekvenser, som koder for modificerede insulinpre-5 cursorer, konstrueres med basis i ekspressionskassétten, der er indeholdt i BamHI-restriktionsfragmentet fra ekspressionsplasmidet pYGABA som vist i fig. 1. Det har en længde på 1103 basepar og indeholder i det væsentlige følgende (nævnt i rækkefølge startende fra 5'-enden): GAPDH-promotoren (Travis io et al., J. Biol. Chem., 260 (1985), 4384 - 4389) efterfulgt af det kodende område bestående af følgende: De 83 N-terminale aminosyrer af MF al-leadersekvensen kodet for af vildtype-gær-DNA-sekvensen som beskrevet af Kurjan & Herskowitz efterfulgt af de to kodons AAA og AGA for Lys og Arg og efterfulgt 15 af det kodende område for insulinprecursorenkeltkæde des[ThrB30]-humaninsulin (SCI), som er et syntetisk fremstillet gen, hvor der er benyttet foretrukne gærkodons. Efter to stopkodons findes et Sall-restriktionssted, og resten af sekvensen udgøres af MFal-sekvensen indeholdende ter-20 minatorområdet. Sekvensen er fremstillet udelukkende ved hjælp af standardteknikker.

Den anvendte metode er den såkaldte "oligonucleotide site directed mutanegesis", som er beskrevet af Zoller & Smith, DNA, bind 3. (1984), Nr. 6, 479 - 488. Metoden er kort 25 beskrevet i det følgende og er detaljeret beskrevet i eksempel 1: Isoleret fra ekspressionsplasmidet indsættes insulin-precursorsekvensen i en enkeltstrenget, genomt cirkulær M13-bakteriofagvektor. Til det enkeltstrengede genom annelleres en kemisk syntetiseret komplementær DNA-streng. DNA-strengen 30 indeholder den ønskede sekvens omgivet af sekvenser, som er helt homologe med insulinsekvenser i det cirkulære DNA. Derpå forlænges primeren biokemisk in vitro i hele det cirkulære genoms længde under anvendelse af Klenow-polymerase. Denne streng vil bevirke dannelse af enkeltstrengede fager, som ved 35 dyrkning i E.coli gør det muligt at isolere dobbeltstrenget 13

DK 166730 B

DNA med den ønskede sekvens. Fra dette dobbeltstrengede DNA kan der isoleres et restriktionsfragment, som kan genindsættes i ekspressionsvektoren.

FREMGANGSMÅDE TIL UDFØRELSE AF OPFINDELSEN

5 Opfindelsen illustreres yderligere ved følgende eksempler: EKSEMPEL 1

Konstruktion af ekspressionsplasmidet, der kan anvendes til at udtrykke des(PheB25]-SCI.

io Ekspressionskassetten, der er indeholdt i ekspres sionsplasmidet pYGABA (vist i figur 1) på et BamHI-restrik-tionsfragment, isoleres: Ekspressionsplasmidet inkuberes med restriktionsendonuclease BamHI. Betingelserne var: 20 jug plasmid, 50 enheder BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-15 værdi: 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i et rumfang på 100 μΐ. Temperaturen var 37°C og reaktionstiden 2 timer. De to DNA-fragmenter opspaltes på en 1%'s agarosegel, og de tørrede fragmenter isoleres.

Ligering til M13 vektoren Ml3mpi8: 20 Det isolerede restriktionsfragment ligeres til bakte- riofagvektoren M13mpl8 også klippet med restriktionsendo-nukleasen BamHI i følgende reaktionsblanding: 0,2 μg frag ment, 0,02 μg vektor, 50 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP i et rumfang på 20 μΐ. 5 μΐ af 25 denne blanding transformeres ind i E. coli-stammen JM101. Tilstedeværelsen af fragment i vektoren og orienteringen af fragmentet bestemmes ved restriktionsenzymkortlægning på dobbeltstrenget M13-DNA, som er isoleret for transformanter.

Isolering af enkeltstrenget (ss) DNA (templat): 30 ss-DNA isoleres fra ovennævnte transformant under an vendelse af en metode, der er beskrevet af Messing i Gene 19

DK 166730 B

14.

(1982), 269 - 276.

5'-fosforylering af mutageniserlngsprimeren:

Mutagenisationsprimern med sekvensen 51-TTGGAGTGTA-GAAACCTCTT-31 phosphoryleres i 5'-enden i en 30 μΐ reaktions-5 blanding indeholdende 70 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,0, 10 mM MgCl2/ 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligonucleotid og 3,6 enheder af T4 polynucleotidkinase. Reaktionen udføres i 30 minutter ved 37°C. Derefter inaktiveres enzymet ved at inkubere blandingen i 10 minutter ved 65°c.

io Sammenføjning af templat og phosphoryleret mutageniseringsprimer:

Sammenføjningen af templat og primer udføres i et 10 μΐ rumfang indeholdende 0,5 pmol templat, 5 pmol primer, 20 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM 15 DTT ved opvarmning i 10 minutter ved 65“C og efterfølgende afkøling til 0°C.

Ekstension/ligeringsreaktion:

Til ovennævnte reaktionsblanding sættes 10 μΐ af følgende blanding: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM 20 TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 enheder T4 DNA ligase og 2,5 enheder af Klenowpoly-merase. Derefter udføres omsætningen i 16 timer ved 16°C,

Transformering af JM101:

Ovennævnte reaktionsblanding transformeres i forskel-25 lige fortyndinger til CaCl2-behandlet E.coli JM191-celler under anvendelse af standardprocedurer og udspredes på 2 x YT-topagar på 2 x YT-agarplader. (2 x TY = trypton: 16 g/1, gærekstrakt: 10 g/1, NaCl 5 g/1. 2 x YT-topagar = 2 x YT tilsat 0,4% agarose og autoklaveret. 2 x YT-agarplader = 2 x YT 30 tilsat 2% agar og autoklaveret). Pladerne inkuberes natten over ved 37°C.

DK 166730B

15

Identificering af positive kloner:

Der anvendes plaque-lifthybridisering,~som beskrives i det følgende: Et nitrocellulosefilter anbringes på en plade med en passende plaquetæthed, således at filteret befugtes.

5 Filteret bades herefter i følgende opløsninger: 1,5 M NaCl, 0,5 M. NaOH i 30 sekunder, 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH-vær-di: 8,0 i 1 minut, 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M"natriumcitrat) til senere brug. Filteret tørres på et 3 MM filtrerpapir og pvarmes i 2 timer ved 8°C i en vakuumovn.

io Mutageniseringsprimeren med sekvensen 5'-TTGGAGTGTA- GAAACCTCTT-31 mærkes radioaktivt i 5'-enden i et 30 μΐ reak-tionsrumfang indeholdene 70 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmol oligonucleotid, 20 pmol γ-·*2Ρ-ΑΤΡ og 3,5 enheder T4-polynucleotidkinase. Blandingen inkuberes ved 15 37°C i 30 minutter og derefter i 5 minutter ved 100°C.

Det tørre filter præhybridiseres i 2 timer ved 65° C i 6 x SSC, 0,2% okseserumalbumin, 0,2% "Ficoll"®, 0,2% poly-vinylpyrrolidon, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) og 50 jug/ml laksesperm-DNA. Derefter sættes reaktionsblandingen indehol-20 dende den mærkede probe til 15 ml frisk præhybridiserings-blanding, og filteret bades deri natten over ved 28eC under forsigtig omrystning. Efter hybridisering vaskes filteret tre gange i 2 x SSC + 0,1% SDS i 15 minutter pr. gang, hvorpå der autoradiograferes. Efter vaskning i den samme opløsning, men 25 nu ved 52° C og ny autoradiografering identificeres plaques indeholdende DNA-sekvenser, som er komplementære til mutageniseringsprimeren .

Re-screening af positive kloner

Da den identificerede klon er et resultat af en he-30 teroduplex, udplades plaquen igen. Hybridiseringen og identificeringen gentages.

Oprensning af dobbeltstrenget M13-fag-DNA

En rescreenet klon anvendes til infektion af E. coli-stamme JM101. En kultur indeholdende ca. 108 fager og 5 kolo- 16

DK 166730 B

nier 'af JM101 dyrkes i 5 timer i et 5 ml 2 x YT medium ved 37°C. Derefter oprenses dobbeltstrenget, cirkulært DNA fra pelletten under anvendelse af den fremgangsmåde, som er beskrevet af Birnboim, & Doly, Nucleic Acids, Res., 2 (1979), 5 1513.

Isolering af et restriktionsfragment indeholdende modificeret insulinprecursor DNA-præparationen (ca. 5 μg) oprenset som beskrevet ovenfor spaltes med 10 enheder af restriktionsendonucleasen io BamHI i 60 μΐ 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i 2 timer ved 37eC. DNA-produkterne adskilles på en agarosegel, og fragmentet oprenses fra gelen.

Ligering til gærvektoren pAB24 (fig. 2)

Det isolerede restriktionsfragment ligeres til gærvek-15 toren pAB24, som er skåret med restriktionsendonucleasen BamHI, i følgende reaktionsblanding: Fragment 0,2 μg, vektor 0,02 /xg, 50 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM

DTT, 1 mM ATP i et samlet rumfang på 20 μΐ-. 5 μΐ af reaktionsblandingen anvendes til transformation af E. coli-stam-20 men MC1061, hvori det modificerede ekspressionspiamid identificeres og opformeres. Plasmidet er identisk med pYGABA, bortset fra det deleterede kodon.

Transformation af gær

Transformation af ekspressionspladmidet til gærstammen 25 Saccharomyces cerevisiae JC482ÅpepALeu2cir° (a, his4, pep4, ura3, leu2, cir°) gennemføres som beskrevet at Ito et al., J. Bact., Vol 153 (1983), No. 1, 153 - 168. De transformerede celler udplades på SC-ura-medium (0,7% Yeast Nitrogen Base, 2,0% glucose, 0,5% casaminosyrer, 2,0% agar) til selektion 30 for plasmidholdige celler.

17

DK 166730 B

Eksempel 2

Konstruktion af et ekspressionsplasmid, som kan anvendes til produktion af des(TyrB26)-SCI.

Der gås frem på stort set samme måde som beskrevet 5 ovenfor i eksempel 1 bortset fra, at mutageniseringsprimeren har sekvensen 5' -ACCCTTTGGAGTGAAGAAACCTCT-if'at hybridi-seringstemperaturen er 36°C, og at vasketemperaturen efter hybridiseringen er 60°C. Det modificerede plasmid har en sekvens, som er identisk med pYGABA, bortset fra det deleterede io kodon.

Eksempel 3

Konstruktion af et ekspressionsplasmid, som kan anvendes til produktion af (HisB25),des(TyrB26)-SCI.

Der gås frem på stort set samme måde som beskrevet 15 ovenfor i eksempel 1 bortset fra, at mutageniseringsprimeren har sekvensen 5'AATACCCTTTGGAGTGTGGAAACCTCTTTCACC-3', at hy-bridiseringstemperaturen er 43°C, og at vasketemperaturen efter hybridiseringen er 66’C. Det modificerede plasmid har en sekvens, som er identisk med pYGABA, bortset fra de modi-20 ficerede og deleterede kodons.

Eksempel 4

Konstruktion af et ekspressionspiamid, som kan anvendes til produktion af (AsnB25),des(TyrB26)-SCI.

Der anvendes stort set samme fremgangsmåde som beskre-25 vet ovenfor i eksempel 1 bortset fra, at mutageniseringsprimeren har sekvensen 51-AATACCCTTTGGAGTGTTGAAACCTCTTTCACC-31, at hybridiseringstemperaturen er 42°C, og at vasketemperaturen efter hybridiseringen er 65°C. Det modificerede plasmid har en sekvens, som er identisk med pYGABA, bortset 30 fra de modificerede og deleterede kodons.

18

DK 166730 B

Eksempel 5

Ekspression af precursor og isolering deraf fra kulturmediet.

Gær, som er transformeret som beskrevet i eksempel l -4, propageres på Petriskåle, som indeholder minimalmedium 5 udenniracil, i 48 timer ved 30°C. 100 ml rystekolber indeholdende minimalmedium uden uracil + 5 g/1 casaminosyrer + 10 g/1 ravsyre + 30 g/1 glucose ved pH 5,0 inokuleres med en enkelt koloni fra Petripladen. Kolberne rystes derpå ved 30°C i en inkubator i 72 timer.

10 Efter centrifugering steriliseres 1 liter opsamlet su pernatant ved filtrering og indstilling på pH-værdien 4-4,5 og en ledningsevne under 10 mS ved tilsætning af 5 M saltsyre samt vand. Med en gennemstrømingshastighed på 120 ml/time sættes supernatanten derpå på en 1,6 x 6 cm søjle af S/"Se-15 pharose"® FF, som i forvejen er ækvilibreret med 50 mM eddikesyre, 50% (rumfang) ethanol, indstillet på pH-værdien 4,0 med NaOH. Søjlen vaskes derpå med 60 ml puffer, hvorefter precursoren elueres med en lineær gradient af NaCl fra 0 til 0,35 M i 360 ml puffer med en gennemstrømningshastighed på 10 20 ml/time. Eluatet opdeles i fraktioner på 4 ml og detekteres for UV-absorbans. Fraktioner indeholdende precursor identificeres ved hjælp af RP-HPLC-analyse, og fraktionerne hældes sammen. Efter afsaltning på en søjle af "Sephadex"® G25 i 1 M eddikesyre isoleres precursoren ved frysetørring.

25 Eksempel 6

Fremstilling af des (PheB2S),des(ThrB30)-humaninsulin.

400 mg des(PheB25)-SCI, fremstillet ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 1 og 5, opløses i 40 ml 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20% (rumfang) ethanol 30 indstillet til pH-værdien 9 med HC1, og 40 ml (sedimenteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 32 mg immobiliseret trypsin i den samme puffer tilsættes. Suspensionen henstår i 24 timer ved 8 - 10°C med forsigtig omrøring, hvorpå der filtreres. Gelen vaskes med 40 ml puffer, og de opsamlede fil- 19 trate'r sættes på en 2,6 x 7,5 cm søjle af Q-"Sepharose"® FF, som forinden er ækvilibreret med 50 mM tr i s*( hydroxymethyl) -aminomethan, 50% (på rumfangsbasis) ethanol, indstillet på pH-værdien 8,0 med HC1. Derefter elueres søjlen med en lineær 5 gradient af NaCl fra 0 til 0,15 M i den samme puffer i løbet af -6 -timer med et flow på 225 ml/time. Eluatet detekteres for UV-absorbans, og fraktioner, som indeholder proteinhovedtop-pen, samles. Proteinet fældes ved pH-værdien 5,4 efter fjernelse af ethanol i vakuum.

io 250 mg des(PheB25),des(ThrB3°)-humaninsulin isoleres ved frysetørring.

Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse, ved plasmadesorptionsmassespektrometri og ved sekventiel Ed-man-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridylerede A- og B-kæ-15 der.

Eksempel 7

Fremstilling af des(PheB25)-humaninsulin.

200 mg des(PheB25),des(ThrB3°)-humaninsulin, som er fremstillet ved den i eksempel 6 beskrevne fremgangsmåde, 20 opløses i en blanding indeholdende 400 mg threoninmethyl-ester, 2,0 ml ethanol og 0,8 ml vand. pH-Værdien indstilles på 6,3 med eddikesyre, og der tilsættes 4 ml (sedimenteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 3,2 mg immobiliseret trypsin. Efter henstand i 2 timer ved 20°C med let omrøring fra-25 filtreres gelen, og proteinet fældes ved tilsætning af 10 rumfang 2-propanol. Det lufttørrede bundfald genopløses i 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl, 60% (på rumfangsbasis) ethanol, pH 8,25, og sættes på en 2,6 x 20 cm Q-"SepharoseM® FF-søjle, som er ækvilibreret med den samme puffer, og der 30 elueres med en lineær NaCl-gradient i den samme puffer stigende fra 0 til 0,1 M over 15 timer ved et flow på 125 ml/time. Fraktionerne, som indeholder des(PheB25)-humaninsulin-(B30-methylester), hældes sammen, og ethanolet fjernes i vakuum, hvorpå proteinet fældes ved pH-værdien 6,1. Suspensio-35 nen centrifugeres, og bundfaldet frysetørres. Methylesteren 20

DK 166730B

hydrdlyseres derpå i 10 minutter i kold 0,1 M NaOH ved en proteinkoncentration på 10 mg/ml. Reaktionen afbrydes ved indstilling af pH-værdien på 8,5, og der tilsættes 2 rumfang 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan/HCl, pH 8,5. Opløsningen 5 sættes derefter på en 2,6 x 20 cm Q-"Sepharosen® FF-søjle, og der elueres som beskrevet ovenfor. Proteinet fældes ved pH-værdien 5,5 efter fjernelse af ethanolet i vakuum.

Der fås 80 mg des(PheB25)-humaninsulin efter frysetørring.

io Produktets identitet bekræftes ved hjælp af aminosyre- analyse, plasmadesorptionsmassespektrometri og sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte vinylpyridylerede A- og B-kæder.

Eksempel 8 15 Fremstilling af des(TyrB26),des(ThrB30)-humaninsulin.

250 mg des(TyrB2®)-sci, som er fremstillet under anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 2 og 5, opløses i 25 ml 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan, 20% (på rumfangsbasis) ethanol indstillet til pH-værdien 9 med HC1 og 20 25 ml (sedimenteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 20 mg immobiliseret trypsin i den samme puffer tilsættes. Suspensionen henstår i 24 timer ved 8' - 10“C med let omrøring, hvorpå der filtreres. Gelen vaskes med 25 ml puffer, og de opsamlede filtrater sættes på en 2,6 x 7,5 cm søjle af Q-"Se-25 pharose"® FF, som forinden er ækvilibreret med 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, 50% (på rumfangsbasis) ethanol, indstillet på pH-værdien 8,0 med HC1. Søjlen elueres derefter med en lineær NaCl-gradient fra 0 til 0,15 M i den samme puffer over 6 timer med et flow på 225 ml/time. Eluatet 30 detekteres for UV-absorbering, og fraktioner indeholdende proteinhovedtoppen hældes sammen. Proteinet fældes ved pH-værdien 5,4 efter fjernelse af ethanolet i vakuum.

Ved frysetørring fås 130 mg des(TyrB26),des(ThrB30)-humaninsulin.

35 Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse og 21 sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridyle-rede A- og B-kæder.

Eksempel 9

Fremstilling af (His®25),des(TyrB26),des(ThrB30)-humaninsu-5 lin.

450 mg (His®25),des(Tyr®25)-sci, fremstillet ved hjælp af fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 3 og 5, opløses i 45 ml 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20% (på rumfangsbasis) ehtanol indstillet til pH 9 med HCl, og 45 ml (sedi-io menteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 36 mg immobili-seret trypsin i den samme puffer tilsættes. Suspensionen henstår i 24 timer ved 8 - 10°C med let omrøring, hvorpå den filtreres. Gelen vaskes med 40 ml puffer, og de sammenblandede filtrater sættes på en 2,6 x 7,5 cm søjle af Q-"Sepha-15 rose"® FF, som i forvejen er ævkilibreret med 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan, 50% (på rumfangsbasis) ethanol, indstillet til pH 8,0 med HCl. Derefter elueres søjlen med en lineær NaCl-gradient fra 0 til 0,15 M i den samme puffer over 6 timer med et flow på 225 ml/time. Eluatet detekteres for 20 UV-absorbering, og fraktioner, som indeholder. proteinhoved-toppen hældes sammen. Proteinet fældes ved pH 5,4 efter fjernelse af ethanolet i vakuum.

Ved frysetørring isoleres 200 mg (His®25),des-(TyrB26),des(ThrB3°)-humaninsulin.

25 Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanlyse og sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridyle-rede A- og B-kæder.

Eksempel 10

Fremstilling af (AsnB25),des(Tyr®26),des(Thr®30)-humaninsulin 30 150 mg (AsnB25),des(Thr®26)-SCI, fremstillet ved an vendelse af fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 4 og 5, opløses i 15 ml 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20% (på rumfangsbasis) ethanol indstillet til pH 9 med HCl, og der 22

DK 166730B

tilsættes 15 ml (sedimenteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 12 mg immobiliseret trypsin i den samme"puffer. Suspensionen henstår i 24 timer ved 8 - 10°c med let omrøring, hvorpå den filtreres. Gelen vaskes med 40 ml puffer, og de 5 sammenblandede filtrater sættes på en 1,6 x 10 cm søjle af Q-"Sepharose"® FF, som forinden er ækvilibreret med 50 mM tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 50% (på rumfangsbasis) ethanol, indstillet til pH 8,0 med HC1. Derefter elueres søjlen med en lineær NaCl-gradient fra 0 til 0,15 i den samme puffer over 6 10 timer med et flow på 90 ml/time. Eluatet detekteres for UV-absorbering, og fraktioner, som indeholder proteinhovedtop-pen, hældes sammen. Proteinet fældes ved pH-værdien 5,4 efter fjernelse af ethanolet i vakuum.

Ved frysetørring fås 80 mg (AsnB25),des(TyrB26)-15 des (ThrOJU) -humaninsulin.

Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse og sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridylere-de A- og B-kæder.

Eksempel 11 20 Fremstilling af (AspA21),des(PheB25),des(ThrB30)-humaninsulin 50 mg des(PheB2 5),des(ThrB3 0)-humaninsulin, som er fremstillet ved fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 6, opløses i 10 ml vand ved indstilling af pH-værdien på 2 med 1 M HC1. Opløsningen henstår i 16 dage ved 30“C. Efter afkøling 25 (til 20°C) tilsættes 7,5 g urinstof, og pH-værdien indstilles på 8,1 med 1 M NaOH. Opløsningen sættes derpå til en 1,6 x 20 cm Q-"SepharoseM® FF-søjle, som i forvejen er ækvilibreret med 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl, 7 M urinstof, pH 8,1, ved 4°C, og der elueres med en lineær NaCl-gradient i 30 den samme puffer stigende fra 0 til 0,05 M over 24 timer med et flow på 40 ml/time. De sammenblandede fraktioner, som indeholder proteinet fra den sidste elueringtop, afsaltes på en søjle af "Sephadex"® G25 i 1 M eddikesyre og frysetørres.

Der fås 30 mg (AspA21),des(PheB25),des(ThrB30)-human-35 insulin.

23

Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse, 5-trins-Edman-nedbrydning og c-terminalanalyse under anvendelse af carboxypeptidase A.

Eksempel 12 5 Fremstilling af (SerA21),des(ProB28)-humaninsulin

Konstruktion af et ekspressionsplasmid, der kan anvendes til fremstilling af (SerA21),des(Pro328)-humaninsulin og fremstilling af (Ser^·2-*-) ,des (Pro328) -humaninsulin.

Et plasmid stammende fra pUC-19, pKFN-864, som koder 10 for denne analog, fremstilles ved spaltet duplexmutagenese (Y. Morinaga et al., Biotechnology 2 (1984), 636 - 639) af plasmidet pKFN-734 under anvendelse af to mutagene primere, NOR-648 CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGCTGCAGTA og NOR-745 ATTGTTC-GACAATACCCTTAGCAGCCTTGGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACC. Plasmidet 15 pKFN-734 fremstilles ved ligering af det 0,4 kb lange EcoRI-Xbal-fragment, som koder for en syntetisk gærsignalleader, der er sammensmeltet indvendigt til et syntetisk insulinpre-cursorgen, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21), ‘fra plasmidet pLaC212spx3 til det 2,7 kb lange EcoRI-Xbl-fragment fra pUC-20 19 (c. Yannisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103 - 119).

Plasmidet pLaC212spx3 er beskrevet i eksempel 3 og i fig. 6 og 13 i PCT-ansøgning nr. WO 89/02463.

DNA-sekvensen af det 0,4 kb lange EcoRI-Xbal-fragment fra pKFN-864, som koder for signalleaderinsulin, B(l-29,des-25 Pro28)-Ala-Ala-Lys-A(l-21,Ser21) er vist i fig. 3.

pKFN-864 skæres med EcoRI og Xbal, og det 0,5 kb lange fragment sammenføjes med det 9,5 kb lange NcoI-Xbal-fragment fra pMT636 og det 1,4 kb lange NcoI-EcoRI-fragment fra pMT636 og danner plasmidet pKFN-866, jvf. figur 4. Plasmidet pMT636 30 fremstilles fra pMT608 efter fjernelse af LEU-2-genet og fra pMT479, jvf. fig. 4. pMT608 er beskrevet i EP 195.691. pMT479 er beskrevet i EP 163.529. pMT479 indeholder Schizosaccharo-myces pombe TPI genet (POT), S. cerevisiae-triose-phosphatisomerasepromoteren og terminatoren, TPIp og TPIT 35 (Alber, T. og Kawasaki, G.J. Mol. Appl. Gen 1 (1982), 419 -

DK 166730 B

24 434) Plasmidet pKFN-866 indeholder følgende sekvens: TPIp-signalleaderinsulin B(l-29,des-Pro28)-Ala-Ala-Lys-A(l-21,Ser21)-TPIT.

S. cerevisiae stammen MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, AtpiA-5 tpi, pep 4-3/pep 4-3) dyrkes på YPGal (1% Bacto gærekstrakt, 2% galactose, 1% lactat) til en O.D. på 0,6 ved 600 nm.

100 ml af den dannede kultur høstes ved centrifugering, vaskes med 10 ml vand, centrifugeres og suspenderes i 10 ml af en opløsning indeholdende 1,2 M sorbitol, 25 mM io Na2EDTA, pH = 8,0, og 6,7 mg/ml dithiotreitol. Suspensionen inkuberes ved 30°C i 15 minutter og centrifugeres, og cellerne suspenderes i 10 ml af en opløsning indeholdende 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat, pH = 5.8, og 2 mg Novozym® 234. Suspensionen inkuberes ved 30°C i 30 minut-15 ter, og cellerne opsamles ved centrifugering, vaskes i 10 ml 1.2 M sorbitol og 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1 (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH = 7,5) og suspenderes i 2 ml CAS. Til transformering blandes 0,1 ml CAS-resuspenderede celler med ca. 1 μg plasmid pKFN-866 og 20 henstår ved stuetemperatur i ca. 15 minutter. L ml (20% poly-ethylenglycol 4000, 10 mM CaCl2/ io mM Tris HC1, pH = 7.5) tilsættes, og blandingen henstår i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Blandingen centrifugeres, og pellet suspenderes i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6,7 mM 25 CaCl2, 14 μg/ml leucin) og inkuberes ved 30°C i 2 timer. Derefter centrifugeres suspensionen, pellet suspenderes i 0,5 ml 1.2 M sorbitol. 6 ml topagar (SC medium ifølge Shennan et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) indeholdende 1,2 M sorbitol plus 2,5% agar) til- 30 sættes ved 52°C, og suspensionen hældes på toppen af plader indeholdende det samme agarstørknede medium, som indeholder sorbitol. Transformantkolonier opsamles efter 3 dages forløb ved 30°C, isoleres og anvendes til at starte flydende kulturer. En sådan transformant KFN-883 udvælges til nærmere ka-35 rakterisering.

25 Gærstammen KFN-883 dyrkes på YPD-medium (1% gærekstrakt, 2% pepton (fra Difco Laboratories) og"2% glucose). 10 ml kultur af stammen omrystes ved 30°C til en O.D. på 20 ved 600 nm. Efter centrifugering analyseres supernatanten ved 5 HPLC som beskrevet (L. Snel et al., Chromatographia 24 (1987.), 329 - 332). Der fås et udbyttet på ca 0,14 mg/1 insulin B(1-29,des-Pro28)-Ala-Ala-Lys-A(1-21,Ser2^·) .

Den enkeltstrengede insulinprecursor isoleres fra gæ-ringssupernatanten ved adsorption til en ionbyttersøjle ved 10 lav pH-værdi, desorption ved høj pH-værdi og udfældning af det opsamlede med zinkioner. Transpeptidering af precursoren til (SerA21),des(ProB2S),(ThrB30-OMe)-humaninsulin er som følger: 10 mmol (2,35 g) threoninmethylester og iskold eddikeis syre opløses i DMF til 5 ml, 2,5 ml 76,5% rumfang/rumfang DMF i vand tilsættes, og 0,5 g precursor opløses i blandingen, som holdes ved 12°C. Derpå tilsættes 50 mg trypsin i 1,25 ml 0,05 M calciumacetat, og efter 24 timers forløb ved 12eC sættes reaktionsblandingen til 100 ml acetone til udfældning af 20 peptiderne, som hvirvles rundt og tørres i vakuum.

Den isolerede insulinanalogester oprenses på en præparativ HPLC-søjle under anvendelse af en silica-C18-matrix ved sur pH. Den rensede ester hydrolyseres i et vandigt medium ved en pH-værdi på 10 og 25°C i 24 timer. Det dannede 25 (SerA21),des(ProB28)-humaninsulin fældes ved neutral pH med zinkioner. Bundfaldet renses med anionbytterkromatografi og afsaltes derefter ved gelfiltrering. Der fås et udbyttet af frysetørret (Ser^21),des(ProB28)-humaninsulin på 102 mg.

Eksempel 13 30 Fremstilling af des(ThrB27)-humaninsulin 1 g zinkfrit svineinsulin opløses i 40 ml vand ved indstilling af pH-værdien til 9, og en opløsning af 50 mg svinetrypsin i 10 ml 0,25 M ammoniumhydrogencarbonat indstillet til en pH-værdi på 9 med ammoniumopløsning tilsættes.

DK 166730 B

26

Opløsningen henstår derefter ved 48C, og efter 48 timers forløb fås et udbytte på 65% ved HPLC-analyse. Kéaktionsblandin-gen gelfiltreres ved 4°C på en 5 x 90 cm søjle af Sephadex® G50 superfine i 0,05 M ammoniumhydrogencarbonat med et flow 5 på 90 ml pr. time. Fraktioner indeholdende proteinhovedtoppen samles og frysetørres. Der fås et udbytte på 520 mg des(B23-B30)-humaninsulin.

Et peptid med sekvensen Gly-Phe-Phe-Tyr-Pro-Lys-Thr syntetiseres på en PAM-harpiks under anvendelse af beskytte-io de, symmetriske aminosyreanhydrider ved hjælp af et peptid-synteseapparat fra Applied Biosystems. Derefter spaltes pep-tidet fra harpiksen ved hjælp af vandfri hydrogenfluorid ved 0°C, hvorefter de tiloversblevne beskyttelsesgrupper fjernes på tilsvarende måde.

15 200 mg des(B23-B30)-humaninsulin og 400 mg peptid op løses i en blanding af 2,40 ml dimethylformamid og 1,20 ml vand, og blandingens pH-værdi indstilles til 6,5 med tri-ethylamin. Derpå tilsættes 10 mg svinetrypsin i 0,20 ml vand, og reaktionsblandingen henstår ved 20°C i 4 timer. Reaktionen 20 stoppes derefter ved tilsætning af 25 ml 2-propanol, og de udfældede proteiner isoleres ved centrifugering. Det drænede bundfald opløses i 10 ml 1 M eddikesyre og sættes på en 2,6 x 20 cm søjle af Lichroprep® RP-18 (25 - 40 μιιι) , som forinden er ækvilibreret med 0,5 mM saltsyre, 0,1 M natriumchlorid i 25 30% (på rumfangsbasis) ethanol. Søjlen elueres derefter ved 20°c med et flow på 20 ml pr. time med den samme buffer, men med en lineær forøgelse af ethanol indholdet til 50% i løbet af 24 timer. Eluatet overvåges for UV-absorption, og fraktioner indeholdende proteinhovedtoppen opsamles. Proteinet blev 30 udfældet ved fortynding med samme rumfang som vand og indstilling af pH-værdien til 5,5 med natriumhydroxidopløsning, og efter henstand ved 4°C i 1 time isoleres bundfaldet ved centrifugering og frysetørring.

Der fås et udbytte på 80 mg des (ThrB27) -humaninsulin, 35 som identificeres ved sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridylerede A- og B-kæder.

27

Eksempel 14

Formulering af injektionsopløsning 60 μιηοΐ af en humaninsulinanalog ifølge opfindelsen opløses i 4 ml 0,1 M HC1, og der tilsættes 20 ml 1,5%'s m-5 cresol. Opløsningen blandes derpå med 40 ml 4%'s glycerol og 20 ml 65 mM dinatriumhydrogenphosphat, og pH-værdién indstilles til 7,3. Til sidst indstilles opløsningen på 100 ml med vand, hvorpå den sterilfiltreres.

Eksempel 15 io Bedømmelse af associationsgrad

En 2,6 x 88 cm søjle af "Sephadex"® G-75 ækvilibreres med 13 mM natriumphosphatpuffer pH 7,3 med et flow på 22 ml/ time. Ved anvendelse af des(octapeptid-B23-30)-humaninsulin, cytochrome C, ribonuclease og mono- og dimermyoglobin som 15 molekylvægtsmarkører optegnes en kurve, der angiver molekylvægten som funktion af elueringsrumfanget.

Ved anvendelse af 1 ml opløsning indeholdende 0,6 mM zingfrit humaninsulin eller 0,6 mM insulinanalog fremstillet som beskrevet i eksempel 12 viser det sig, at sinkfrit human-20 insulin elueres som en såkaldt "tailing"-top med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 14 kD, og at analogerne fremstillet som beskrevet i eksempel 6-10 alle elueres som en symmetrisk top med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 5 kD.

Disse resultater viser, at humaninsulinanaloger ifølge 25 opfindelsen stort set er monomere i opløsning ved pH 7,3, hvorimod det normale humaninsulin under de samme betingelser i vid udstrækning foreligger som en blanding af dimerer og højere oligomerer.

Eksempel 16 30 Bedømmelse af biologisk virkning

Den biologiske virkning in vitro bestemmes ved måling af bindingsaffiniteten til insulinreceptorerne på isolerede

DK 166730 B

28 rotteadipocyter og rottehepatocyter stort set som beskrevet i J. Gliemann, S- Gammeltoft: Diabetologia ITT (1974), 105 - 113.

Insulinanalogerne sammenlignes med semisyntetisk hu-5 maninsulin, hvis styrke sættes til 100%, og resultaterne er anført i nedenstående tabel:

Tabel

Adipocyter Hepatocyter des(PheB25),des(ThrB3 0)- io humaninsulin 223% 201% des(PheB25)-humaninsulin 225% 249% (AspA21),des(PheB25) des(ThrB3°)-humaninsulin 250% 242%

Claims (19)

1. Humaninsulinanaloger, kendetegnet ved, at de har følgende formel: -A-kæde S---S

5 I 7 'Τ' H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys~Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12 S

10 B-kæde S H-Phe-Val-Y2-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val~ 123456789 10 11 12 A-kæde (fortsat) » 15 13 14 15 16 17 18 19 20 21 -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y1-OH s

20 I B-kæde (fortsat) S -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

25 B-kæde (fortsat) -X1-X2-X3-X4-X5-X6 25 26 27 28 29 30 hvori X1, X2, X3, X5, Y1 og Y2 er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest, idet dog X5 ikke er Pro, X4 30 er Lys eller Arg, og Xs er en hvilken som helst naturligt DK 166730 B forekommende aminosyrerest, der bærer den c-terminale -hydroxygruppe, eller -OH, eller X1 og X2 sammen danner den C-terminale hydroxygruppe, eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf. 52.· - Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, 1 Λ - ·>—. at Y og/eller Y er udvalgt blandt gruppen bestående af en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest med undtagelse af Asn.

3. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at X1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn og Tyr, X2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Tyr, Thr, Glu, Asp, Ala, His, Ser og Phe, X3 er udvalgt blandt gruppen bestående af Pro, Glu, Asp, Ser, Thr og His, • X1 er udvalgt blandt gruppen bestående af.Lys, Thr, Ser, Ala,

15 Asp og Glu, X2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Thr-OH, ' Ser-OH, Ala-OH, Asp-OH, Glu-OH og -OH, eller X1 og X2 sammen danner den C-terminale hydroxygruppe, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Gly, Ser, Glu -og Ala, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, Glu og Asp.

4. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, η at X er udvalgt blandt gruppen bestående af Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn og Tyr, X2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Tyr, Thr, Glu, Asp,. Ala, His, Ser og Phe, X3 er udvalgt blandt gruppen bestående af Pro, Glu, Asp, Ser, Thr og His,

25 X1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Lys, Thr, Ser, Ala, Asp og Glu, X2 er -OH, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Gly, Ser, Glu og Ala, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, Glu og Asp. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, 2 30 at X1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn og Tyr, X2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Tyr, Thr, Glu, Asp, Ala, His, Ser og Phe, X3 er udvalgt blandt gruppen bestående af Pro, Glu, Asp, Ser, Thr og His, X5 og X6 sammen danner den C-terminale hydroxygruppe, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Gly, Glu, Ser og Ala, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, 5 Gin, Glu og Asp.

6. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X1 er Phe, X2 er Tyr, X3 er Thr, X^ er Lys, Xs er Thr-OH, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Ser og Gly, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, ίο Asp og Glu.

7. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X1 er Tyr, X2 er Thr, X3 er Pro, X5 er Thr, X6 er -OH, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Ser og Gly, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, Asp og

15 Glu.

8. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X1 er Phe, X2 er Tyr, X3 er Thr, X^ er Lys, X6 er Thr-OH, Y^ er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Ser og Gly, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin,

20 Asp og Glu.

9. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X1 er Tyr, X2 er Thr, X3 er Pro, X5 er Thr, X6 er -OH, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Ser og Gly, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, Asp og

25 GlU.

10. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved at indeholde en humaninsulinanalog med følgende formel: DK 166730B Ά-kæde S-S I 7 -| H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12

5 S ...... I B-kæde S H-Phe-Val-Y2-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A-kæde (fortsat) 13 14 15 16 17 18 19 20 21 -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y1-OH 15 | S B-kæde (fortsat) S

20 -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22. 23 24 B-kæde (fortsat) -X1-X2-X3-X4-X5-X6 25 26 27 28 29 30 25 hvor X1, X2, X3, x5, Y1 og Y2 er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest, idet dog X5 ikke er Pro, X4 er Lys eller Arg, og X6 er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest, der bærer den C-terminale hydroxygruppe, eller -OH, eller X5 og X6 sammen danner den C-30 terminale hydroxygruppe, eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf og en farmaceutisk tolerabel bærer.