DK159161B - Oehis(b-25)aa-eller oetyr(b-25)aa-humaninsulinforbindelser - Google Patents

Description

i

DK 159161B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte [HisB25 ]-eller [ TyrB25 ]-humaninsulinforbindelser, som udviser høj specifik biologisk aktivitet.

5 Til behandling af diabetes mellitus har der siden insulinets opdagelse omkring 1920 været benyttet mange forskellige insulinpræparattyper. I starten benyttedes udelukkende insulinopløsninger med hurtigt indtrædende og relativt hurtigt ophørende insulinvirkning, men senere er 10 også fremkommet insulinpræparater med mere udstrakt virkningsprofil, fremskaffet ved gennem tilsætninger som f.eks. zinksalt og/eller protaminer at sænke insulinets opløselighed. Det hertil anvendte insulin er af tilgængelighedsgrunde normalt blevet udvundet af bugspytkirtler 15 fra husdyr, hyppigst okser, svin og får, men i de snere år er præparater indeholdende humaninsulin af bioteknologisk oprindelse også fremkommet på markedet.

Gennem årene er beskrevet et stort antal kunstigt fremstillede analoger af humaninsulin, som oftest med det for-20 mål at belyse strukturens indflydelse på aktiviteten, se f.eks. Marke et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 360, s. 1619-1632 (1979). Særlig interesse har undersøgelser haft af indvirkningen af substitutioner i insulinets (B22-B26)-sekvens på receptorbindingen, da denne sekvens 25 antages at være hovedbindingsområdet for insulinreceptoren, og da naturligt fremkommende mutationer er fundet med substitutioner i dette område. Se f.eks. S. Shoelson et al., PNAS 80, s. 7390-7394 (1983) og M. Kobayashi et al.: Biomed. Res. 5, (3) s. 267-272 (1984). Man finder heri 30 således meget lave aktiviteter for analoger, hvori Phe(B24) eller Phe(B25) er substitueret og konkluderer derfor, at tilstedeværelsen af disse to aminosyrer er af afgørende betydning for receptorbindingen.

Substitutioner i insulinmolekylet kan også indføres med 35 det formål at forbedre insulinets virkningsprofil ved

DK 159161B

2 diabetesbehandlingen. Således er det f.eks. beskrevet i dansk patentansøgning nr. 5457/86, at en eller flere substitutioner af Glu i insulinmolekylet med en neutral 5 aminosyrerest bevirker en forskydning af insulinets udfældningszone således, at en langsom frigivelse efter injektion opnås.

I dansk patentansøgning nr. 4116/86 er endvidere beskrevet insulinanaloger, som efter injektion optages særligt 10 hurtigt. Denne effekt er fremkommet ved gennem hydrofile substitutioner især i B9- og i B28-positionerne i insulinmolekylet at opnå, at insulinets aggregationsevne undertrykkes, så det i væsentlig grad forekommer på monomer form. En del af disse insulinanaloger udviser dog nedsat 15 biologisk aktivitet.

Det har nu overraskende vist sig, at visse [ His®22 ©ner [ TyrB25 ]-humaninsulinforbindelser udviser en højere biologisk aktivitet end, når Phe i position B25 ikke er substitueret .

20 I overensstemmelse hermed er [His®25 ]- eller [Tyr®25]-humaninsulinforbindelseme ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at de er afledt af humaninsulin, hvor aminosyre-resten Phe i position B25 er udskiftet med His eller Tyr, hvor der eventuelt er foretaget yderligere 1-4 udskift-25 ninger valgt blandt GlnA^, HisA5, GlnA!?, AspA2^, Asp®®, Asp®!2, Gin®!2, Gin®2!, Arg®2?, Asp®22, Ser®22 og Ala®22, og hvor aminosyreresten i position B30 endvidere helt kan mangle eller være C-terminalt blokeret i form af alkyl-ester, usubstitueret amid eller mono- eller dialkylamid.

30 Særligt foretrukne substitutioner i de ovenfor anførte positioner er: GlnA^, HisA2, GlnA17, AspA21, Asp®®, Asp®!2, Gin®!2, Gin®2!, Arg®27, Asp®22, Ala®22 og Ser®22. Såfremt der ønskes flere substitutioner samtidigt i de ovenfor anførte positioner foretrækkes af anvendelses-

DK 159161B

3 mæssige årsager, at forekommer enten inden for gruppen: Ά4, A8, Ά17, B13, B21, B27 og B30 eller inden for gruppen A8, A21, B9, BIO, B12, B26, B28 og B30.

5 Humaninsulinanalogerne ifølge opfindelsen er således fordelagtige til brug ved diabetesbehandling, idet den forøgede biologiske aktivitet, der er et resultat af substitutionen i B25-positionen, betyder en hurtigere optagelse fra blodet og desuden modvirker den nedgang i 10 biologisk aktivitet, der kan være resultatet af andre substitutioner i det humane insulinmolekyle.

De i opfindelsen beskrevne modificerede insuliner kan fremstilles biosyntetisk i gær ud fra en DNA-sekvens, der koder for en precursor, indeholdendede de ønskede modi-15 fikationer. Denne precursor kan derefter via enzymatisk katalyseret semisyntese omdannes til det ønskede modificerede insulin. For at tilvejebringe udskillelse til mediet kan DNA-sekvensen, der koder for insulinprecur-sorerne, forbindes med en yderligere DNA-sekvens, der 20 koder for et signalpeptid funktionelt i gær. Udskillelse kan opnås ved i udtrykkel sesmediet at indsætte gær MFal-leadersekvensen (Kur jan & Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982). En foretrukket udførelsesform udnytter DNA-sekvensen, der koder for hele MFal-leadersekvensen til 25 og med det dibasiske site LysArg, men hvor GluAlaGluAla, der er substrat for gær-proteasen DPAP (dipeptidyl-amino-peptidase), er udeladt. Der opnås herved effektiv udskillelse af insulinprecursorer med den korrekte N-terminal.

30 DNA-Sekvenser, der koder for modificerede insulinprecur-sorer, konstrueres med basis i ekspressionskassetten, der indeholdes i BamHI-restriktionsfragmentet på ekspressions-plasmidet pYGABA som vist i fig. 1. Det har længden 1103 basepar og indeholder i det væsentligste følgende (nævnt i 35 rækkefølgestartende i 5'-enden): GAPDH-promotoren (Travis

DK 159161 B

4 et al., J. Biol. Chem., 260, 4384-4389, 1985) efterfulgt af den kodende region bestående af: De 83 N-terminale aminosyrer af MFal-leaderen kodet for af vildtype 5 gær-DNA-sekvensen som beskrevet af Kurjan & Herskowitz (reference angivet tidligere) efterfulgt af de to kodons AAA og AGA for Lys og Arg og igen efterfulgt af den kodende region for insulinprecursoren single chain des(ThrB30)-humaninsulin (SCI), som er et syntetisk frem-10 stillet gen, hvor der er benyttet foretrukne gær-kodons.

Efter to stop-kodons findes restriktions-sitet Sall, og resten af sekvensen udgøres af MFal-sekvenser indeholdende terminator-regionen. Sekvensen er fremstillet udelukkende ved hjælp af standardteknikker.

15 DNA-Sekvenser, kodende for modificerede insulinprecurso-rer, blev konstrueret ud fra ekspressionskassetten beskrevet ovenfor (BamHI-restriktionsfragmentet fra plas-midet pYGABA). Metoden, der blev anvendt, var "site-direc-ted in vitro mutagenesis", som er beskrevet af Zoller & 20 Smith, DNA, Vol. 3, nr. 6, 479-488 (1984). Metoden går i korthed ud på følgende og er beskrevet i detalje under eksempel 1: Isoleret fra ekspressionsplasmidet indsættes insulinprecursorsekvensen i en enkeltstrenget, cirkulær M-13 bakteriofag vektor, hvortil der annelleres en kemisk 25 syntetiseret komplementær DNA-streng med den ønskede sekvens omgivet på hver side af sekvenser fuldstændigt homologe til insulinsekvenser i det cirkulære DNA. In vitro ekstenderes dernæst primeren i hele det cirkulære genoms længde biokemisk ved hjælp af Klenow-polymerase.

30 Herved opnås et dobbeltstrenget molekyle, hvor den ene streng har den ønskede sekvens. Denne streng vil være ophav til enkeltstrengede fager, som ved dyrkning i Escherichia coli kan give mulighed for oprensning af dobbeltstrenget DNA med den ønskede sekvens. Herfra kan 35 oprenses et restriktionsfragment, som kan sættes tilbage i ekspressionsvektoren.

DK 159161B

5

Humaninsulinanaloger ifølge opfindelsen, hvori eventuelle substitutioner kun forekommer indenfor de sidste amino-syrerester nærmest B-kædens C-terminal, kan endvidere på i 5 og for sig kendt vis fremstilles ad semisyntetisk vej ud fra f.eks. svineinsulin, som beskrevet i K. Inouye et al.: JACS 101 (3), s. 751-752 (1979), idet svineinsulinet først nedspaltes med trypsin til des-(B23-30)-humaninsulin, hvorpå dette ligeledes enzymatisk sammenkobles med et 10 syntetisk octapeptid med den ønskede aminosyresekvens.

Fremstilling af Gly-Phe-His-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

Peptidet fremstilles på kendt måde ved hjælp af en peptid-syntesemaskine af fabrikat Applied Biosystems, idet opbygningen sker på en PAM-harpiks ved hjælp af beskyttede 15 symmetriske aminosyreanhydrider. Kapaciteten er ca. 1/2 mmol peptid. Sluttelig fraspaltes peptidet fra harpiksen ved reaktion med vandfrit hydrogenfluorid ved 0°C, hvorunder resterende beskyttelsesgrupper samtidigt fjernes.

Fig. 1 viser ekspressionsplasmidet pYGABA (eksempel 1).

20 Fig. 2 viser gærvektoren pAB24 (eksempel 1).

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de følgende eksempler.

Eksempel 1

Konstruktion af et ekspressionspiasmid, der kan bringes 25 til at producere \ TyrB25 1-SCI

Ekspressionskassetten, som er indeholdt i ekspressionsplasmidet pYGABA, vist i fig. 1 i et BamHI-restriktions-fragment, blev isoleret ved inkubation af ekspressionsplasmidet med restriktionsendonukleasen BamHI. Reaktions-30 betingelserne var: 20 μg plasmid, 50 enh. BamHI, 100 mM

DK 159161B

6

NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i et reaktionsvolumen på 100 μΐ, temperaturen var 37°C, reaktionstiden 2 timer. De to DNA-fragmenter blev adskilt 5 på en 1% lavtsmeltende agarosegel, og det ønskede fragment blev oprenset herfra.

Ligering til vektoren M13mpl8

Det isolerede restriktionsfragment blev ligeret til bakte-riofagvektoren M13mpl8 ligeledes skåret med restriktions-10 endonukleasen BamHI i følgende reaktionsblanding: Fragment 0,2 μg, vektor 0,02 μg, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM

MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP i et volumen på 20 μΐ. 5 μΐ af denne blanding blev transformeret ind i Escherichia coli-stammen JM101. Tilstedeværelsen af fragment i vektoren 15 samt orienteringen af dette blev bestemt ved restrik-tionsenzymmapning på M13-DNA (dobbeltstrenget) oprenset fra transformanterne.

Oprensning af enkeltstrenget (ss) DNA (tempiat)

Fra den ovenfor nævnte transformant blev der isoleret 20 ss-DNA efter en metode beskrevet af Messing & Vieira i Gene, 19, 269-276 (1982).

51-Phosphorylering af mutageniseringsprimer

En mutageniseringsprimer med sekvensen 5'-TGGAGTGTAGTAGAAACCTCT-3' blev phosphoryleret i 5'-enden 25 i et 30 μΐ reaktionsvolumen indeholdende 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligo-nukleotid og 3,6 enheder T4-polynukleotidkinase. Reaktionen blev udført i 30 min. ved 37°C, hvorefter enzymet blev inaktiveret ved inkubation i 10 min. ved 65°C.

DK 159161B

7

Anneliering af templet og mutageniseringsprimer

Annellering af templat og primer blev foretaget i et 10 μΐ volumen indeholdende 0,5 pmol templat, 4 pmol primer, 20 5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM DTT ved opvarmning i 10 min. til 65°C og efterfølgende afkøling til 0°C.

Ekstension/1igeringsreaktion

Reaktionsvolumenet ovenfor blev tilsat 10 μΐ volumen af 10 følgende sammensætning: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 enh. T4-DNA-ligase og 2,5 enh. Klenow-polymerase. Herefter blev reaktionen udført i 16 timer ved 16°C.

15 Transformation af JM101

Reaktionsblandingen ovenfor blev i forskellige fortyndinger transformeret ind i CaCl2“behandlede E. coli JM101 efter standardmetoden og udpladet i 2xYT-topagar på 2xYT-agarplader. (2xYT = trypton 16 g/1, gærekstrakt 10 g/1, 20 NaCl 5 g/1. 2xYT-Topagar = 2xYT tilsat 0,4% agarose og autoklaveret. 2xYT agarplader = 2xYT tilsat 2% agar og autoklaveret). Pladerne blev inkuberet natten over ved 37°C.

Identifikation af positive kloner

25 Her benyttedes plaque-lift hybridisering, som er beskrevet i det følgende: Et nitrocellulose-filter placeredes på en plade med en passende pi ague-tæthed, så væde fra pladen blev suget op gennem filteret. Filteret blev herefter badet i følgende opløsninger: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 30 30 sek., 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 i 1 min., 2 x SSC

DK 159161B

8 (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat) til senere brug. Filteret blev herefter tørret på 3MM-papir og bagt mindst 2 timer ved 80QC i vakuumovn.

5 51-32p_Mærkning af mutageniseringsprimeren

Mutageniseringsprimeren med sekvensen 5'-TGGAGTGTAGTAGAAACCTCT-3' blev mærket radioaktivt i 5’ -enden i et 50 /ti reaktionsvolumen indeholdende 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmol oligo-10 nukleotid og 50 pmol γ-32ρ-ΑΤΡ. Reagenserne opvarmedes til 37°C, og reaktionen blev startet ved tilsætning af 3,5 enh. T4-polynukleotidkinase. Reaktionen forløb ved 37°C i 30 min., og derefter blev enzymet inaktiveret ved opvarmning til 100°C i 3 min.

15 Hybridisering med radioaktiv primer til nitrocellulosefiltre

De tørrede filtre blev præhybridiseret i 50 ml af følgende opløsning i 2 timer ved 65°C: 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat, 0,2% okseserumalbumin, 0,2% "Ficoll"®, 0,2% poly-20 vinylpyrrolidon, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) og 50 μg/ml laksesperm-DNA. Herefter blev halvdelen af volumenet fra mærkningsreaktionen ovenfor tilsat som probe til 15 ml frisk præhybridiseringsbuffer. Heri blev filteret badet ved 31°C natten over under blid rystning. Efter hybridi-25 sering blev filtret vasket 3 gange 15 min. ved 30°C i 0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat og autoradiograferet. Efter vask ved 53°C i samme vaskebuffer og ny autoradiografering blev der identificeret plaques indeholdende DNA-sekvenser komplementære til mutageniseringsprimeren.

30 Oprensning af dobbeltstrenget M13-fag-DNA

Efter renstrygning af en positiv klon og fornyet identifikation af positive ved hybridisering, blev en positiv plaque brugt til at inficere bakteriestammen JM101. Ca.

DK 159161B

9 ΙΟ** fager og 5 kolonier af JM101 blev dyrket 5 timer i 5 ml 2xYT-medium, hvorefter det dobbeltstrengede, cirkulære DNA blev oprenset fra cellepellet efter metoden beskrevet 5 i Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 2, 1513 (1979).

Oprensning af restriktionsfragment indeholdende modificeret insulinprecursor

DNA-præparationen (ca. 5 /tg) oprenset efter ovenstående procedure blev fordøjet med 10 enh. af restriktionsendo-10 nukleasen BamHI i 60 /il 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH

7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i 2 timer ved 37°C. DNA-produkterne blev adskilt ved agarosegelelektroforese og det ønskede fragment oprenset herfra.

Ligering til gær-vektoren pAB24 (fig. 2) 15 Det isolerede restriktionsfragment blev ligeret til gærvektoren pAB24 skåret med restriktionsendonukleasen BamHI i følgende reaktionsblanding: Fragment 0,2 μgr vektor 0,02 μgf 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP i et volumen på 20 /il. 5 /il af denne reaktionsblanding 20 blev transformeret ind i E. coli-stammen MC1061, hvori det modificerede ekspressionspiasmid blev identificeret og opformeret. Plasmidet blev kaldt pYGAB-N4-A og har samme sekvens som pYGABA, bortset fra det ændrede kodon.

Transformation af gær 25 Indføring af ekspressionspiasmidet i Saccharomyces cere-visiae gærstammen JC482ApepAleu cir°(a,his4, ura3, leu2, cir°) blev foretaget som beskrevet af H. Ito et al., J.

Bact., Vol. 153, nr. 1, 163-168 (1983). Udpladningen af de transformerede celler skete på plader indeholdende SC-ura 30 (0,7% Yeast Nitrogen Base, 2,0% glucose, 0,5% casamino- syrer, 2,0% agar) for selektion for plasmidholdige celler.

DK 159161B

10

Eksempel 2

Konstruktion af et ekspressionsplasmid, der kan bringes til at producere fHisB25y Asp5^^ ]-SCI

5 Proceduren, der blev benyttet, var den samme som under eksempel 1 bortset fra, at mutageniseringsprimeren havde sekvensen 5'ACAATACCCTTGTCAGTGTAGTGGAAACCTCTTT3', at hybridiseringstemperaturen var 42°C, og at vasketemperaturen efter hybridiseringen var 63°C. Det endelige 10 plasmid har samme sekvens som pYGABA, bortset fra de modificerede kodons.

Eksempel 3

Konstruktion af et ekspressionsplasmid, der kan bringes til at producere fAsp5^, Tyr52^ ]-sci 15 Proceduren, der blev benyttet, var den samme som under eksempel 1 bortset fra, at det anvendte templat blev fremskaffet ved kloning af BamHI-kassetten fra pYGAB-N4-A i M13, at mutageniseringsprimeren havde sekvensen 5’TCAACCAGTGGTCACCACACAAGT31, at hybridiseringstemperatu-20 ren var 38°C, og at vasketemperaturen efter hybridiseringen var 60°C. Det endelige plasmid har samme sekvens som pYGABA, bortset fra de modificerede kodons.

Eksempel 4

Ekspression af precursor og isolering af denne fra kultur-25 mediet Gær, transformeret som beskrevet i eksemplerne 1-3, blev propageret på Petri-piader indeholdende minimalmedium uden uracil i 48 timer ved 30°C. 100 ml rystekolber indeholdende minimalmedium uden uracil + 5 g/1 casaminosyrer + 10 30 g/1 ravsyre + 30 g/1 glucose, pH 5,0, blev derpå podet

DK 159161 ES

11 med en enkeltkoloni fra petripladen. Rystekolberne inkuberedes derpå i 72 timer ved 30°C i rysteinkubator ved 180 o/m.

5 Efter centrifugering blev 5 1 dyrkningssupernatant steril-filtreret og indstillet til pH 4-4,5 og en ledningsevne under 10 mS ved tilsætning af 5 M saltsyre samt vand. Med et flow på 300 ml/t blev supernatanten sat på en 2,6x6,7 cm kolonne pakket med S-"Sepharose"®FF (Pharmacia), som i 10 forvejen er ækvilibreret med 50 mM eddikesyre, 50% (v/v) ethanol, indstillet til pH 4,0 med NaOH. Kolonnen blev derpå med 25 ml/t elueret med 150 ml buffer, efterfulgt af en lineær gradient af NaCl fra 0 til 0,35 M i 1000 ml buffer. Eluatet blev opdelt i fraktioner og detekteret for 15 UV-absorbans. Fraktioner indeholdende precursor, identificeret ved RP-HPLC-analyse, blev hældt sammen. Efter afsaltning på en kolonne pakket med ''Sephadex"®G25 i 1 M eddikesyre blev precursoren isoleret ved frysetørring.

Eksempel 5 20 Fremstilling af Γ Tyr525 1-desfThrB3° 1-humaninsulin

450 mg [TyrB^5 ]-sci, fremstillet ifølge metoderne beskrevet i eksemplerne 1 og 4, blev opløst i 45 ml 50 mM tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 20% (v/v) ethanol, indstillet til pH 7,7 med HC1 og 45 ml (sedimenteret volumen) af 25 "Sepharose"®, indeholdende 36 mg immobiliseret trypsin, i samme buffer blev tilsat. Suspensionen henstilledes derpå i 3 timer ved 20°C under let omrøring, hvorefter den filtreredes. Gelen vaskedes med 40 ml buffer, og de samlede filtrater blev påsat en 2,6x7,5 cm kolonne af 30 Q-"Sepharose"®FF, som i forvejen er ækvilibreret med 50 mM

tris(hydroxymethyl)aminomethan, 50% (v/v) ethanol, indstillet til pH 8,0 med HC1. Kolonnen blev derpå elueret med et flow på 225 ml/t med en lineær gradient af NaCl fra

DK 159161B

12 O til 0,15 M i samme buffer over 6 timer. Eluatet blev detekteret for UV-absorbans og fraktioner indeholdende protein-hovedtoppen samledes.

5 Efter fortynding med samme volumen vand blev de samlede fraktioner påsat en 2,6 x 25 cm kolonne af "Lichroprep"® RP-18 (25-40 /an), som i forvejen er ækvilibreret med 10 mM H3PO4, 0,1 M NaCl, 30% (v/v) ethanol. Med et flow på 16 ml/t blev kolonnen elueret med en lineær gradient af 10 ethanol fra 30% til 40% (v/v) over 20 timer. Eluatet blev detekteret for UV-absorbans og fraktioner indeholdende protein-hovedtoppen samledes. Efter afsaltning heraf på en kolonne af "Sephadex"®G25 i 1 M eddikesyre blev der efter frysetørring isoleret 105 mg [ TyrB^5 ]-des[ ThrB^0 ]-human-15 insulin.

Produktets identitet blev bekræftet ved arainosyreanalyse samt ved sekventiel Edman-degradation af de separerede A-og B-kæder.

Eksempel 6 20 Fremstilling af Γ TyrB25 1-humaninsulin 100 mg [ TyrB^5 ]-des[ ThrB30 ]-humaninsulin, fremstillet efter den i eksempel 5 angivne fremgangsmåde, opløstes i en blanding indeholdende 200 mg threoninmethylester, 1,0 ml ethanol og 0,4 ml vand. Opløsningens pH-værdi indstil-25 ledes på 6,3 med eddikesyre, og 2 ml (sedimenteret volumen) "Sepharose"® indeholdende 1,6 mg immobiliseret trypsin tilsattes. Efter henstand i 2 timer ved 20°C under let omrøring frafiltreredes gelen, og proteinet udfældedes ved tilsætning af 10 volumen 2-propanol. Det lufttørrede 30 bundfald genopløstes i 20 mM tris(hydroxymethyl)amino-methan, 60% (v/v) ethanol, indstillet til pH 8,5 med HC1, og sattes på en 1,6 x 20 cm kolonne af Q-"Sepharose"®FF, ækvilibreret med samme buffer. Denne elueredes derpå med

DK 159161B

13 en lineær NaCl-gradient fra O til 0,1 M i samme buffer over 15 timer med et flow på 50 ml/t. Fra de samlede fraktioner indeholdende [ TyrB25 ]-humaninsulin-(B30-meth-5 ylester), identificeret ved RP-HPLC, fjernedes ethanolet ved vakuumafdampning, og proteinet udfældedes ved indstilling af pH til 6,1. Efter frysetørring af den isolerede methylester hydrolyseredes denne i 10 min. i iskold 0,1 M NaOH ved en proteinkoncentration på ca. 10 mg/ml.

10 Reaktionen standsedes ved indstilling af pH til 8,5, hvorefter 2 volumen 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH

8.5 med HC1, blev tilsat. Opløsnignen blev derpå sat på en 1.6 x 20 cm kolonne af Q-"Sepharose"®FF og elueret som beskrevet ovenfor. Proteinet fældedes ved pH 5,5 efter 15 afdampning af ethanolet i vakuum, og efter frysetørring opnåedes 40 mg [ TyrB^5 ]-humaninsulin.

Produktets identitet blev bekræftet ved plasmadesorptions-massespektrometri.

Eksempel 7 20 Fremstilling af Γ TyrB25 ~|-humaninsulin-(Β30-ΝΗ?) 200 mg [ TyrB^5 ]-des[ ThrB30 ]-humaninsulin, fremstillet som beskrevet i eksempel 5, blev opløst i en blanding af 400 mg threoninamid, 2,0 ml ethanol og 0,8 ml vand. Opløsningens pH indstilledes på 6,3 med eddikesyre, og 4 ml 25 (sedimenteret volumen) "Sepharose"® indeholdende 3,2 mg immobiliseret trypsin blev tilsat. Efter henstand i 2 timer ved 20°C under let omrøring blev gelen frafiltreret, og proteinet udfældedes ved tilsætning af 10 vol.

2-propanol. Det lufttørrede bundfald blev opløst ved 4°C i 30 20 ml 7 M urinstof, idet pH justeredes til 8,1, og opløs ningen sattes på 1,6 x 20 cm kolonne af Q-"Sepharose"®FF, som i forvejen var ækvilibreret ved 4QC i 20 mM tris(hydroxymethyl )aminome than, 7 M urinstof, indstilles til pH 8,1 med HC1. Med et flow på 40 ml/t blev kolonnen elueret med 35 en lineær gradient fra 0 til 50 mM NaCl i samme buffer

DK 159161 B

14 over 24 timer. Eluatet blev detekteret for UV-absorbans og fraktioner indeholdende den først eluerende protein-hovedtop blev samlet. Poolen blev afsaltet på en kolonne 5 af "Sephadex"®G25 i 1 M eddikesyre og efter frysetørring kunne isoleres 75 mg [ TyrB25 ]-humaninsulin-(B30-NH2).

Produktets identitet blev bekræftet ved plasmadesorptions-massespektrometri og C-terminalanalyse.

Eksempel 8 10 Fremstilling af Γ His525„Asp52** 1-desr ThrB3° 1-humaninsulin 200 mg [ HisB25,Asp02® ]-SCI fremstillet ved metoderne, beskrevet i eksemplerne 2 og 4, blev behandlet med immobili-seret trypsin, og reaktionsproduktet blev oprenset i det væsentlige som beskrevet i eksempel 5. Udbyttet var 30 mg 15 [ His025, Asp02® ]-des[ ThrB®0 ]-humaninsulin.

Produktets identitet blev bekræftet ved plasmadesorptions-massespektrometri samt ved sekventiel Edman-degradation af de separerede A- og B-kæder.

Eksempel 9 20 Fremstilling af ΓAspB®,TyrB2® l-desfThrB®0 1-humaninsulin 300 mg [ Asp09,TyrB2® ]-SCI, fremstillet ved metoderne beskrevet i eksemplerne 3 og 4, blev behandlet med immobiliseret trypsin, og reaktionsproduktet blev oprenset i det væsentlige som beskrevet i eksempel 5. Udbyttet var 25 80 mg [ Asp09,TyrB2® ]-des[ ThrB®0 ]-humaninsulin.

Produktets identitet blev bekræftet ved plasmadesorptions-massespektrometri samt ved sekventiel Edman-degradation af de separerede A- og B-kæder.

DK 159161B

15

Eksempel 10

Fremstilling af des-(B23-B30)-humaninsulin 1 g Na-krystalliseret svineinsulin (proteinvægt) opløses i 5 40 ml vand, og der tilsættes en opløsning af 50 mg svine- trypsin i 10 ml friskfremstillet 0,25 M ammoniumhydrogen-carbonatopløsning, hvori pH er indstillet til 9,0 med ammoniakvand. Opløsningen henstilles derpå i ro i køleskab ved 4°C. Efter 48 timer viser en HPLC-analyse en 10 omsætningsgrad på 65%. Opløsningen gelfiltreres dernæst ved 4°C på en 5 x 90 cm søjle af "Sephadex" %50 superfine i 0,05 M ammoniumhydrogenc ar bonat med et flow på 90 ml/t. Der opsamles fraktioner, og de hovedtopholdige fraktioner hældes sammen og frysetørres.

15 Udbytte: 520 mg des-(B23-30)-humaninsulin med en renhed på 97,5% målt ved HPLC-analyse.

Eksempel 11

Fremstilling af (His625)-humaninsulin 200 mg des-(B23-30)-humaninsulin og 400 mg Gly-Phe-His-20 Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr opløses i en blanding af 2,40 ml dimethyl formamid og 1,20 ml vand, idet blandingens pH justeres til 6,5 med triethylamin. Der tilsættes dernæst en opløsning af 10 mg svinetrypsin i 0,20 ml vand, og reaktionsblandingen henstilles i ro ved 20°C. Efter 4 25 timer viser en HPLC-analyse en omsætning på 60%, og reaktionen standses ved udfældning med 25 ml 2-propanol. Det ved centrifugering isolerede bundfald genopløses i 10 ml 1 M eddikesyre og sættes ved 20°C på en 2,6 x 20 cm søjle af "Li chr opr ep"®RP-18 (25-40 /tin), som er ækvilibreret i en 30 buffer bestående af 0,5 mM hydrogenchlorid, 0,1 M natrium-chlorid i 30 volumen-% ethanol. Søjlen elueres dernæst med samme buffer med et flow på 20 ml/t, idet dog ethanolind-

DK 159161B

16 holdet over 24 timer lineært øges til 50%. De hovedtop-holdige fraktioner pooles, hvorefter proteinet udfældes ved fortynding med samme volumen vand og justering af pH 5 til 5,5 med natriumhydroxidopløsning. Efter henstand ved 4°C i 1 time centrifugeres suspensionen, og bundfaldet frysetørres. Herved opnås 90 mg (His525)-humaninsulin, identificeret ved total aminosyreanalyse samt ved sekventiel Edman-degradation af de adskilte vinylpyridylerede A-10 og B-kæder.

Eksempel 12

Fremstilling af (Tyr525,Asp525)-humaninsulin

150 mg des-(B23-30)-humaninsulin og 350 mg Gly-Phe-Tyr-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr opløses i en blanding af 2,0 ml 15 dimethyl formamid og 1,0 ml vand, idet pH justeres til 6,5 med triethylamin. Nu tilsættes en opløsning af 8 mg svine-trypsin i 0,20 ml 1 mM calciumacetatopløsning, og reaktionsblandingen henstilles i ro ved 15°C. Efter 3 timers forløb viser en HPLC-analyse en omsætning på 50%, og reak-20 tionen standses ved tilsætning af 25 ml 2-propanol. Efter centrifugering genopløses bundfaldet i 10 ml 1 M eddikesyre og sættes ved 20°C på en 2,6 x 20 cm søjle af "Lichroprep"®RP-18 (25-40 /m), som er ækvilibreret i en buffer bestående af 0,5 mM hydrogenchlorid, 0,1 M

25 natriumchlorid i 30 volumen-% ethanol. Søjlen elueres dernæst med samme buffer med et flow på 20 ml/t, idet dog ethanolindholdet over 24 timer lineært øges til 50%. De hovedtopholdige fraktioner pooles, hvorefter proteinet udfældes ved fortynding med samme volumen vand og 30 justering af pH til 5,0 med natriumhydroxidopløsning.

Efter henstand natten over ved 4°C isoleres bundfaldet ved centrifugering og frysetørres.

Udbytte: 60 mg (Tyr525,Asp525)-humaninsulin, identificeret ved total aminosyreanalyse samt ved sekventiel Edman-

DK 159161 B

17 degradation af de adskilte vinylpyridylerede A- og B-kæder.

Eksempel 13 5 Evaluering af biologisk aktivitet

Den biologiske aktivitet in vitro blev bestemt ved måling af bindingsaffiniteten til insulinreceptorerne på isolerede rottefedtceller, i det væsentlige ved metoden beskrevet i J. Gliemann, S. Gammeltoft: Diabetologia 10, 105-113 10 (1974).

De humane insulinanaloger blev sammenlignet over for semisyntetisk humaninsulin, hvis potens blev sat til 100%, og resultaterne er vist i nedenstående tabel:

Biol. aktivitet 15 [ Tyr®25 ]-humaninsulin 356% [ TyrB25 ]-humaninsulin-(B30-NH2) 226% ^TyrB25 ASpB28 ]-humaninsulin 201% 1) [ HisB^^, AspB^8 ]-des[ ThrBB^ ]-humaninsulin 130% *) [ AspB^,TyrB^5 ]-des[ ThrBB0 ]-humaninsulin 69% 1) 20 1) Til sammenligning hermed kan findes følgende resulta ter i J. Brange et al.: Nature 333, 679-682 (1988):

Biol. aktivitet [Asp®9 J-humaninsulin 26% [ AspB^B ]-humaninsulin 101%

Claims (1)

1. DK 159161B [ His®25 j- eller [ TyrB^5J-humaninsulinforbindelser, kendetegnet ved, at de er afledt af humaninsulin, hvor amino-5 syreresten Phe 1 position B25 er udskiftet med His eller Tyr, hvor der eventuelt er foretaget yderligere 1-4 udskiftninger valgt blandt GlnA^, HisA^, Gln^?, AspA21, AspB^, AspB^0, Gln81^^ Gln®2l^ ArgB27, AspB^8/ §erB30 0g AlaB30r og hvor aminosyreresten i position B30 endvidere 10 helt kan mangle eller være C-terminalt blokeret i form af alkylester, usubstitueret amid eller mono- eller dialkylamid.