JPH05279388A - 超活性ｇｒｆ類縁体 - Google Patents
超活性ｇｒｆ類縁体Info
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規成長ホルモン放出因子(ＧＲＦ)類縁体を
提供する。 【構成】 ブタ、ウシおよびヒト由来のＧＲＦに基づ
き、そのアミノ末端の改変および／または種々のアミノ
酸修飾(改変)を施した種々の新規ＧＲＦ類縁体を固相合
成法および／または組換え法およびその化学修飾によっ
て製造し、そのインビボ効果を評価することにより、こ
れらの新規ペプチドが既知の物質より優れた成長ホルモ
ン放出因子活性を示すことを立証した。
提供する。 【構成】 ブタ、ウシおよびヒト由来のＧＲＦに基づ
き、そのアミノ末端の改変および／または種々のアミノ
酸修飾(改変)を施した種々の新規ＧＲＦ類縁体を固相合
成法および／または組換え法およびその化学修飾によっ
て製造し、そのインビボ効果を評価することにより、こ
れらの新規ペプチドが既知の物質より優れた成長ホルモ
ン放出因子活性を示すことを立証した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、増大した効力を有する
と共に、過去に報告されたＧＲＦ類縁体より術的に有利
な特性を有するＧＲＦ類縁体を提供する。本発明の化合
物は動物、特にウシ、ブタ、ヒツジ、家禽および魚類に対
する使用が好ましい。
と共に、過去に報告されたＧＲＦ類縁体より術的に有利
な特性を有するＧＲＦ類縁体を提供する。本発明の化合
物は動物、特にウシ、ブタ、ヒツジ、家禽および魚類に対
する使用が好ましい。
【０００２】
【従来の技術とその課題】成長ホルモンは動物の下垂体
の分泌タンパク質であり、広範囲にわたる成長効果をそ
の生物に与える。成長ホルモンレベルの人工的操作がか
なりの治療的有用性を有していることは立証されてい
る。ヒト成長ホルモンの補足は、成長ホルモン欠乏症お
よびこれに関係するヒトの疾患状態にとって効果的な治
療であることがわかっている。この応用の他にも、成長
ホルモンレベルを制御できるということにさらなる重要
性を付け加えるような新しく重要な成長ホルモンの特性
が見付かっている。例えば最近の臨床的研究は、ヒトの
老化の疾患に対処するのに成長ホルモンの補足が有用で
あり得ることを示している。動物における成長ホルモン
レベルの増大が脂肪の少ない筋肉塊の増加を齎すことが
わかっている。この後者の観測事実を応用すれば、より
脂肪の少ない食肉産物の生産増大や、より大きくおよび
／またはより強い動物の生産が可能になるであろう。
の分泌タンパク質であり、広範囲にわたる成長効果をそ
の生物に与える。成長ホルモンレベルの人工的操作がか
なりの治療的有用性を有していることは立証されてい
る。ヒト成長ホルモンの補足は、成長ホルモン欠乏症お
よびこれに関係するヒトの疾患状態にとって効果的な治
療であることがわかっている。この応用の他にも、成長
ホルモンレベルを制御できるということにさらなる重要
性を付け加えるような新しく重要な成長ホルモンの特性
が見付かっている。例えば最近の臨床的研究は、ヒトの
老化の疾患に対処するのに成長ホルモンの補足が有用で
あり得ることを示している。動物における成長ホルモン
レベルの増大が脂肪の少ない筋肉塊の増加を齎すことが
わかっている。この後者の観測事実を応用すれば、より
脂肪の少ない食肉産物の生産増大や、より大きくおよび
／またはより強い動物の生産が可能になるであろう。
【０００３】成長ホルモンは下垂体によって自然に生産
されるが、成長ホルモンの血流への分泌は第２のタンパ
ク質、成長ホルモン放出因子(ＧＲＦ)によって制御され
ている。このホルモンは当該技術分野ではソマトクリニ
ン、成長ホルモン放出ホルモン(ＧＨＲＨ)、成長放出ホ
ルモン(ＧＲＨ)としても一般に知られている。したがっ
て、成長ホルモンの循環レベルを増大させるという課題
を解決する方法には次の２つが考えられる。(１)その生
物中のヒト成長ホルモンレベルを直接的に増大させる。
(２)その生物の成長ホルモン産出の自然傾向を増大させ
る。後者の方法はＧＲＦを補足することによって達成さ
れるであろう。ＧＲＦはインビボ(生体内)で成長ホルモ
ンの循環レベルを増大させることが立証されている(Riv
ier等,Nature 300:276(1982))。成長ホルモン産生に対
するＧＲＦ(および種々のその構造類縁体)の効果は広く
研究されている。ＧＲＦを直接的補足物として使用する
際の主要な障害は、インビボでその寿命が短いことであ
る(Frohman,L.A.等,J.Clin.Invest.78:906(1986))。そ
れゆえに、効果的なヒト治療剤や畜産用薬剤を開発する
ためには、より強力でおよび/またはより長期間持続す
るＧＲＦ分子が望ましい。
されるが、成長ホルモンの血流への分泌は第２のタンパ
ク質、成長ホルモン放出因子(ＧＲＦ)によって制御され
ている。このホルモンは当該技術分野ではソマトクリニ
ン、成長ホルモン放出ホルモン(ＧＨＲＨ)、成長放出ホ
ルモン(ＧＲＨ)としても一般に知られている。したがっ
て、成長ホルモンの循環レベルを増大させるという課題
を解決する方法には次の２つが考えられる。(１)その生
物中のヒト成長ホルモンレベルを直接的に増大させる。
(２)その生物の成長ホルモン産出の自然傾向を増大させ
る。後者の方法はＧＲＦを補足することによって達成さ
れるであろう。ＧＲＦはインビボ(生体内)で成長ホルモ
ンの循環レベルを増大させることが立証されている(Riv
ier等,Nature 300:276(1982))。成長ホルモン産生に対
するＧＲＦ(および種々のその構造類縁体)の効果は広く
研究されている。ＧＲＦを直接的補足物として使用する
際の主要な障害は、インビボでその寿命が短いことであ
る(Frohman,L.A.等,J.Clin.Invest.78:906(1986))。そ
れゆえに、効果的なヒト治療剤や畜産用薬剤を開発する
ためには、より強力でおよび/またはより長期間持続す
るＧＲＦ分子が望ましい。
【０００４】ＧＦＲの構造は極めて多様な方法で修飾
(改変)されており、これらの修飾によって、より長時間
持続し、および／またはより強力なＧＲＦ類縁体が齎さ
れている。完全なＧＲＦ活性を維持するには、Ｎ-末端
からの最初の２９アミノ酸で充分であることが立証され
ている(Speiss等,Biochemistry 21:6037(1982))。１つ
の方法は、ＧＲＦ分子の種々の領域に新規Ｄ-アミノ酸
残基を挿入することであった(Lance,V.A.等,Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.119:265(1984)；Coy,D.H.等,Peptide
s 8(suppl.1):49(1986))。もう１つの方法は、Ｎ-末端
領域にペプチド結合等配電子体を挿入することによるＧ
ＲＦペプチド骨格の修飾であった(Tourwe,D.,Janssen.C
him.Acta 3:3(1985)；Hocart,S.J.等,J.Med.Chem.33:19
54-58(1990)。
(改変)されており、これらの修飾によって、より長時間
持続し、および／またはより強力なＧＲＦ類縁体が齎さ
れている。完全なＧＲＦ活性を維持するには、Ｎ-末端
からの最初の２９アミノ酸で充分であることが立証され
ている(Speiss等,Biochemistry 21:6037(1982))。１つ
の方法は、ＧＲＦ分子の種々の領域に新規Ｄ-アミノ酸
残基を挿入することであった(Lance,V.A.等,Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.119:265(1984)；Coy,D.H.等,Peptide
s 8(suppl.1):49(1986))。もう１つの方法は、Ｎ-末端
領域にペプチド結合等配電子体を挿入することによるＧ
ＲＦペプチド骨格の修飾であった(Tourwe,D.,Janssen.C
him.Acta 3:3(1985)；Hocart,S.J.等,J.Med.Chem.33:19
54-58(1990)。
【０００５】
【用語の定義】本明細書で使用する用語を以下に定義す
る。 Ala：アミノ酸アラニン 類縁体：ある化合物に構造的に類似した化合物。ポリペ
プチドに関してこの用語を用いる場合は、一次構造、二
次構造、もしくは三次構造に関する。 Arg：アミノ酸アルギニン。 Asn：アミノ酸アスパラギン。 Asp：アミノ酸アスパラギン酸。 塩基対(bp)：ＤＮＡまたはＲＮＡに関する。略号Ａ、
Ｃ、Ｇ、Ｔは、ＤＮＡ分子においてはそれぞれヌクレオ
チド；(デオキシ)アデニン、(デオキシ)シチジン、(デ
オキシ)グアニン、(デオキシ)チミンの５'-モノリン酸
体に対応する。略号Ｕ、Ｃ、Ｇ、Ｔは、ＲＮＡ分子にお
いてはそれぞれヌクレオシド；ウラシル、シチジン、グ
アニン、チミンの５'-モノリン酸体に対応する。二本鎖
ＤＮＡにおける塩基対とは、ＡとＴあるいはＣとＧの結
合を意味し得る。ＤＮＡ／ＲＮＡにおけるヘテロ二本鎖
塩基対とは、ＴとＵあるいはＣとＧの結合を意味し得
る。 Cys：アミノ酸システイン、もしくはシスチン残基の半
分にジスルフィド橋を通して共有結合しているシスチン
残基の半分。 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸。 ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸の略号。 ＥＤ50：半有効投与量の略号。 機能性類縁体：天然型の分子または化合物と比較して類
似の機能的特性を有するが、構造は修飾(改変)を受けて
いる分子を意味する。機能性類縁体には、親分子と類似
の機能的特性および反応性を有する、親分子の断片もし
くは親分子に対する付加物が含まれる。 Gln：アミノ酸グルタミン。 Glu：アミノ酸グルタミン酸。 Gly：アミノ酸グリシン。 ＧＲＦペプチド：下垂体由来の成長ホルモンの放出およ
び合成を促進する２７〜７６アミノ酸残基からなるポリ
ペプチド。ＧＲＦペプチド類には、米国特許第４５１７
１８１号、同第４５１８５８６号、同第４５２８１９０
号、同第４５２９５９５号、同第４５６３３５２号、同
第４５８５７５６号、同第４５９５６７６号、同第４６
０５６４３号、同第４６２０９７６号、同第４６２６５
２３号、同第４６２８０４３号、同第４６８９３１８号
に開示されている天然物またはその合成機能性類縁体が
含まれ、上記の文献の教示はすべて本明細書の一部を構
成する。用語ＧＲＦペプチドはその非毒性塩をも包含す
る。 His：アミノ酸ヒスチジン。 Hse：アミノ酸ホモセリン。 Ile：アミノ酸イソロイシン。 Leu：アミノ酸ロイシン。 Lys：アミノ酸リジン。 Met：アミノ酸メチオニンまたはその脱ホルミル化類縁
体。 mＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ。 ＭＷＣＯ：分子量分断の略号。 Orn：オルニチン。 Phe：アミノ酸フェニルアラニン。 プラスミド：染色体外自己複製遺伝要素。 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリドの略
号。 Pro：アミノ酸プロリン。 読み枠：翻訳が起こるヌクレオチド配列は、tＲＮＡ、
リボソームおよび付随の因子からなる翻訳装置によって
３つずつ“読み取られ”、それぞれの３連(トリプレッ
ト)は特定のアミノ酸に対応する。それぞれのトリプレ
ットは別個でありかつ同じ長さであるから、コード(暗
号)化配列は３の倍数でなければならず、塩基対の挿入
もしくは削除(枠移動変異と呼ばれる)は同じＤＮＡ断片
によってコードされる２つの異なるタンパク質を齎し得
る。これに抗して保証するためには、目的のポリペプチ
ドに対応するトリプレットコドンが開始コドンから３の
倍数の位置に並ぶ必要、即ち正しい“読み枠”が維持さ
れる必要がある。 組換えＤＮＡクローニングベクター：別のＤＮＡ断片を
追加できるか、もしくは別のＤＮＡ断片が既に追加され
ているＤＮＡ分子からなる自律的に複製するあらゆる試
薬であって、プラスミドやファージを含むがこれらに限
定されない。 組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターが挿入されて
いるあらゆる組換えＤＮＡクローニングベクター。 レプリコン：プラスミドまたは他のベクターの自律的複
製を制御し、これを可能にするＤＮＡ配列。 ＲＮＡ：リボ核酸。 ＲＰ-ＨＰＬＣ：逆相高性能液体クロマトグラフィーの
略号。 Ser：アミノ酸セリン。 Thr：アミノ酸スレオニン。 転写：ＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる情報が相補
的ＲＮＡ配列に移される過程。 翻訳：メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報を用いてポリペ
プチド鎖の合成が指定され指示される過程。 トリス：トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの略
号。 Trp：アミノ酸トリプトファン。 Tyr：アミノ酸チロシン。 Val：アミノ酸バリン。 ベクター：遺伝子操作において細胞の形質転換に使用さ
れるレプリコンであって、適切な制御配列と組み合わせ
た場合に、形質転換される宿主細胞に特異的な性質を付
与する適切なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチ
ド配列を有するレプリコン。プラスミド、ウイルス、お
よびバクテリオファージはそれ自体がレプリコンである
ので、これらは適切なベクターである。人工的ベクター
は、制限酵素とリガーゼを用いて、異なる供給源から得
たＤＮＡ分子を切断し、結合することによって構築され
る。用語“ベクター”が本明細書で使用される場合、こ
の用語は組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換
えＤＮＡ発現ベクターを包含する。
る。 Ala：アミノ酸アラニン 類縁体：ある化合物に構造的に類似した化合物。ポリペ
プチドに関してこの用語を用いる場合は、一次構造、二
次構造、もしくは三次構造に関する。 Arg：アミノ酸アルギニン。 Asn：アミノ酸アスパラギン。 Asp：アミノ酸アスパラギン酸。 塩基対(bp)：ＤＮＡまたはＲＮＡに関する。略号Ａ、
Ｃ、Ｇ、Ｔは、ＤＮＡ分子においてはそれぞれヌクレオ
チド；(デオキシ)アデニン、(デオキシ)シチジン、(デ
オキシ)グアニン、(デオキシ)チミンの５'-モノリン酸
体に対応する。略号Ｕ、Ｃ、Ｇ、Ｔは、ＲＮＡ分子にお
いてはそれぞれヌクレオシド；ウラシル、シチジン、グ
アニン、チミンの５'-モノリン酸体に対応する。二本鎖
ＤＮＡにおける塩基対とは、ＡとＴあるいはＣとＧの結
合を意味し得る。ＤＮＡ／ＲＮＡにおけるヘテロ二本鎖
塩基対とは、ＴとＵあるいはＣとＧの結合を意味し得
る。 Cys：アミノ酸システイン、もしくはシスチン残基の半
分にジスルフィド橋を通して共有結合しているシスチン
残基の半分。 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸。 ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸の略号。 ＥＤ50：半有効投与量の略号。 機能性類縁体：天然型の分子または化合物と比較して類
似の機能的特性を有するが、構造は修飾(改変)を受けて
いる分子を意味する。機能性類縁体には、親分子と類似
の機能的特性および反応性を有する、親分子の断片もし
くは親分子に対する付加物が含まれる。 Gln：アミノ酸グルタミン。 Glu：アミノ酸グルタミン酸。 Gly：アミノ酸グリシン。 ＧＲＦペプチド：下垂体由来の成長ホルモンの放出およ
び合成を促進する２７〜７６アミノ酸残基からなるポリ
ペプチド。ＧＲＦペプチド類には、米国特許第４５１７
１８１号、同第４５１８５８６号、同第４５２８１９０
号、同第４５２９５９５号、同第４５６３３５２号、同
第４５８５７５６号、同第４５９５６７６号、同第４６
０５６４３号、同第４６２０９７６号、同第４６２６５
２３号、同第４６２８０４３号、同第４６８９３１８号
に開示されている天然物またはその合成機能性類縁体が
含まれ、上記の文献の教示はすべて本明細書の一部を構
成する。用語ＧＲＦペプチドはその非毒性塩をも包含す
る。 His：アミノ酸ヒスチジン。 Hse：アミノ酸ホモセリン。 Ile：アミノ酸イソロイシン。 Leu：アミノ酸ロイシン。 Lys：アミノ酸リジン。 Met：アミノ酸メチオニンまたはその脱ホルミル化類縁
体。 mＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ。 ＭＷＣＯ：分子量分断の略号。 Orn：オルニチン。 Phe：アミノ酸フェニルアラニン。 プラスミド：染色体外自己複製遺伝要素。 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリドの略
号。 Pro：アミノ酸プロリン。 読み枠：翻訳が起こるヌクレオチド配列は、tＲＮＡ、
リボソームおよび付随の因子からなる翻訳装置によって
３つずつ“読み取られ”、それぞれの３連(トリプレッ
ト)は特定のアミノ酸に対応する。それぞれのトリプレ
ットは別個でありかつ同じ長さであるから、コード(暗
号)化配列は３の倍数でなければならず、塩基対の挿入
もしくは削除(枠移動変異と呼ばれる)は同じＤＮＡ断片
によってコードされる２つの異なるタンパク質を齎し得
る。これに抗して保証するためには、目的のポリペプチ
ドに対応するトリプレットコドンが開始コドンから３の
倍数の位置に並ぶ必要、即ち正しい“読み枠”が維持さ
れる必要がある。 組換えＤＮＡクローニングベクター：別のＤＮＡ断片を
追加できるか、もしくは別のＤＮＡ断片が既に追加され
ているＤＮＡ分子からなる自律的に複製するあらゆる試
薬であって、プラスミドやファージを含むがこれらに限
定されない。 組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターが挿入されて
いるあらゆる組換えＤＮＡクローニングベクター。 レプリコン：プラスミドまたは他のベクターの自律的複
製を制御し、これを可能にするＤＮＡ配列。 ＲＮＡ：リボ核酸。 ＲＰ-ＨＰＬＣ：逆相高性能液体クロマトグラフィーの
略号。 Ser：アミノ酸セリン。 Thr：アミノ酸スレオニン。 転写：ＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる情報が相補
的ＲＮＡ配列に移される過程。 翻訳：メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報を用いてポリペ
プチド鎖の合成が指定され指示される過程。 トリス：トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの略
号。 Trp：アミノ酸トリプトファン。 Tyr：アミノ酸チロシン。 Val：アミノ酸バリン。 ベクター：遺伝子操作において細胞の形質転換に使用さ
れるレプリコンであって、適切な制御配列と組み合わせ
た場合に、形質転換される宿主細胞に特異的な性質を付
与する適切なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチ
ド配列を有するレプリコン。プラスミド、ウイルス、お
よびバクテリオファージはそれ自体がレプリコンである
ので、これらは適切なベクターである。人工的ベクター
は、制限酵素とリガーゼを用いて、異なる供給源から得
たＤＮＡ分子を切断し、結合することによって構築され
る。用語“ベクター”が本明細書で使用される場合、こ
の用語は組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換
えＤＮＡ発現ベクターを包含する。
【０００６】添付の図面に記載した制限部位および機能
地図は、本明細書に記述する組換えＤＮＡベクターの概
略である。この情報は制限部位を網羅しているわけでは
ないので、図面に記載したベクターにはある型の制限部
位がより多く存在する場合もある。
地図は、本明細書に記述する組換えＤＮＡベクターの概
略である。この情報は制限部位を網羅しているわけでは
ないので、図面に記載したベクターにはある型の制限部
位がより多く存在する場合もある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、次の式(１)：
【化８】 ［式中、Ａ９はSer、Ala、Leu、ThrまたはAsnを表し；
Ａ１２はArgまたはLysを表し；Ａ１５はGly、Ala、Thr
またはLeuを表し；Ａ２１はArgまたはLysを表し；Ａ２
２はAlaまたはLeuを表し；Ａ２５はAspまたはGluを表
し；Ａ２７はMet、Ser、Arg、Leuまたはノルロイシンを
表し；Ａ２８はSerまたはAsnを表し；Ｙは０を表すか、
もしくは１〜１５アミノ酸からなるアミノ酸配列を表
し；Ｚは０を表すか、もしくは１〜３２アミノ酸からな
るアミノ酸配列を表し；Ｔは、式：-ＣＯＯＲa，-ＣＲa
Ｏ、-ＣＯＮＨＮＨＲa，-ＣＯＮ(Ｒa)(Ｒb)、またはＣ
Ｈ2ＯＲa(ＲaおよびＲbは独立に低級アルキル、水素、H
se(ラクトン)、HseＯＨまたはHseＮ(Ｒc)(Ｒd)(ＲCおよ
びＲdは独立に水素または低級アルキルを表す)を表す)
で表されるカルボキシル末端基を表し；Ｘ１は次式：
Ａ１２はArgまたはLysを表し；Ａ１５はGly、Ala、Thr
またはLeuを表し；Ａ２１はArgまたはLysを表し；Ａ２
２はAlaまたはLeuを表し；Ａ２５はAspまたはGluを表
し；Ａ２７はMet、Ser、Arg、Leuまたはノルロイシンを
表し；Ａ２８はSerまたはAsnを表し；Ｙは０を表すか、
もしくは１〜１５アミノ酸からなるアミノ酸配列を表
し；Ｚは０を表すか、もしくは１〜３２アミノ酸からな
るアミノ酸配列を表し；Ｔは、式：-ＣＯＯＲa，-ＣＲa
Ｏ、-ＣＯＮＨＮＨＲa，-ＣＯＮ(Ｒa)(Ｒb)、またはＣ
Ｈ2ＯＲa(ＲaおよびＲbは独立に低級アルキル、水素、H
se(ラクトン)、HseＯＨまたはHseＮ(Ｒc)(Ｒd)(ＲCおよ
びＲdは独立に水素または低級アルキルを表す)を表す)
で表されるカルボキシル末端基を表し；Ｘ１は次式：
【化９】 （式中、Ｒ1は水素、メチル、エチル、ヒドロキシエチ
ル、フェニルを表すか、あるいはハロ、低級アルキル、
低級アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アセト
アミド、トリフルオロメチル、-ＣＨ2-ＯＨ、またはス
ルファミドで置換された置換フェニルを表すか、あるい
は１または複数のＮ、Ｏ、またはＳを含有する５または
６員複素環を表してもよく；ａは０、１、２、または３
を表し；ｂは０または１を表し；ｃは０または１を表
し；ｄは０〜１２を表し；Ａは０(零)を表すか、もしく
はＯまたはＳを表し；Ｂはカルボニル、スルホニルまた
はスルフィニルを表し；Ｒ2は水素、ＣＨ3、ＣＨ2Ｏ
Ｈ、ｐ-ヒドロキシベンジル、または-(ＣＨ2)e-ＣＯ-Ｒ
3（ｅは０〜５を表し、Ｒ3はメチル、エチル、ヒドロキ
シエチル、アミノ、ヒドロキシル、フェニルを表すか、
もしくはハロ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ニ
トロ、アミノ、アセトアミド、またはスルファミドで置
換されたフェニルを表すか、もしくは１または複数の
Ｎ、Ｏ、またはＳを含有する５または６員複素環を表し
てもよい）を表す）；で表されるアシル基を表す］で表
される合成ＧＲＦペプチド類縁体(ＧＲＦペプチド類)お
よび医薬的に許容されるその非毒性塩を提供する。
ル、フェニルを表すか、あるいはハロ、低級アルキル、
低級アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アセト
アミド、トリフルオロメチル、-ＣＨ2-ＯＨ、またはス
ルファミドで置換された置換フェニルを表すか、あるい
は１または複数のＮ、Ｏ、またはＳを含有する５または
６員複素環を表してもよく；ａは０、１、２、または３
を表し；ｂは０または１を表し；ｃは０または１を表
し；ｄは０〜１２を表し；Ａは０(零)を表すか、もしく
はＯまたはＳを表し；Ｂはカルボニル、スルホニルまた
はスルフィニルを表し；Ｒ2は水素、ＣＨ3、ＣＨ2Ｏ
Ｈ、ｐ-ヒドロキシベンジル、または-(ＣＨ2)e-ＣＯ-Ｒ
3（ｅは０〜５を表し、Ｒ3はメチル、エチル、ヒドロキ
シエチル、アミノ、ヒドロキシル、フェニルを表すか、
もしくはハロ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ニ
トロ、アミノ、アセトアミド、またはスルファミドで置
換されたフェニルを表すか、もしくは１または複数の
Ｎ、Ｏ、またはＳを含有する５または６員複素環を表し
てもよい）を表す）；で表されるアシル基を表す］で表
される合成ＧＲＦペプチド類縁体(ＧＲＦペプチド類)お
よび医薬的に許容されるその非毒性塩を提供する。
【０００８】式(１)の定義において、用語“低級アルキ
ル”は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、
n-ブチル、sec-ブチル、イソブチルおよびt-ブチルなど
のＣ1〜Ｃ4アルキル基を意味し；“低級アルコキシ”は
メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、t-ブトキシなどの
基を意味する。“ハロ"はフッ素、塩素、臭素およびヨウ
素などの基を意味する。“置換フェニル”は、ハロ、低
級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、ア
ミノ、アセトアミド、またはスルホンアミドから選択さ
れる１または２個の同一基または異なる基で置換された
フェニルを意味し、４-クロロフェニル、３-ヨードフェ
ニル、２-フルオロフェニル、４-メチルフェニル、３-
クロロ-４-メチルフェニル、３-ブロモフェニル、４-エ
チルフェニル、３-エトキシフェニル、２-メトキシフェ
ニル、４-イソプロポキシフェニル、４-ヒドロキシフェ
ニル、３,４-ジヒドロキシフェニル、２,４-ジヒドロキ
シフェニル、４-ニトロフェニル、３-アミノフェニル、
３-クロロ-４-ヒドロキシフェニル、２-アセトアミドフ
ェニル、４-スルホンアミドフェニル、３,４-ジメトキ
シフェニル、２-フルオロ-４-アミノフェニルなどの基
によって例示される。“１または複数のＮ、Ｏ、または
Ｓを含有する５または６員複素環”は、例えばピロー
ル、チオフェン、フラン、イミダゾール、オキサゾー
ル、オキサジアゾール、チアゾール、１,３,４-チオジ
アゾール、イソオキサゾールなどの５員複素環、および
例えばピリジン、ピリミジン、ピラン、ジヒドロピラ
ン、チアジン、チアピラン、トリアジンなどの６員複素
環を意味する。このような５員複素環および６員複素環
は、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、アミ
ノ、またはハロなどの置換基を保持していてもよい。
ル”は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、
n-ブチル、sec-ブチル、イソブチルおよびt-ブチルなど
のＣ1〜Ｃ4アルキル基を意味し；“低級アルコキシ”は
メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、t-ブトキシなどの
基を意味する。“ハロ"はフッ素、塩素、臭素およびヨウ
素などの基を意味する。“置換フェニル”は、ハロ、低
級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、ア
ミノ、アセトアミド、またはスルホンアミドから選択さ
れる１または２個の同一基または異なる基で置換された
フェニルを意味し、４-クロロフェニル、３-ヨードフェ
ニル、２-フルオロフェニル、４-メチルフェニル、３-
クロロ-４-メチルフェニル、３-ブロモフェニル、４-エ
チルフェニル、３-エトキシフェニル、２-メトキシフェ
ニル、４-イソプロポキシフェニル、４-ヒドロキシフェ
ニル、３,４-ジヒドロキシフェニル、２,４-ジヒドロキ
シフェニル、４-ニトロフェニル、３-アミノフェニル、
３-クロロ-４-ヒドロキシフェニル、２-アセトアミドフ
ェニル、４-スルホンアミドフェニル、３,４-ジメトキ
シフェニル、２-フルオロ-４-アミノフェニルなどの基
によって例示される。“１または複数のＮ、Ｏ、または
Ｓを含有する５または６員複素環”は、例えばピロー
ル、チオフェン、フラン、イミダゾール、オキサゾー
ル、オキサジアゾール、チアゾール、１,３,４-チオジ
アゾール、イソオキサゾールなどの５員複素環、および
例えばピリジン、ピリミジン、ピラン、ジヒドロピラ
ン、チアジン、チアピラン、トリアジンなどの６員複素
環を意味する。このような５員複素環および６員複素環
は、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、アミ
ノ、またはハロなどの置換基を保持していてもよい。
【０００９】式(１)のＸ１によって表されるアシル基の
例には、ｐ-クロロヒプロイル、ｐ-メチルヒプロイル、
ｐ-ニトロヒプロイル、ヒプロイル、ｐ-ヒドロキシヒプ
ロイル、３-ベンゾイルプロピオニル、ｎ-フタルオイル
グリシン、Ｎ-フェニルマロンアミドイル、ｐ-メチル-
Ｎ-フェニルマロンアミドイル、またはｐ-フルオロヒプ
ロイルが含まれる。
例には、ｐ-クロロヒプロイル、ｐ-メチルヒプロイル、
ｐ-ニトロヒプロイル、ヒプロイル、ｐ-ヒドロキシヒプ
ロイル、３-ベンゾイルプロピオニル、ｎ-フタルオイル
グリシン、Ｎ-フェニルマロンアミドイル、ｐ-メチル-
Ｎ-フェニルマロンアミドイル、またはｐ-フルオロヒプ
ロイルが含まれる。
【００１０】上述のように、本発明の好ましい化合物は
動物ＧＲＦペプチドの誘導体および修飾(改変)体であ
る。
動物ＧＲＦペプチドの誘導体および修飾(改変)体であ
る。
【００１１】式(１)の化合物のアミノ酸残基に関する
“Ａ２０”、“Ａ２１”などの指定は、天然および文献に
認められるこのタンパク質のアミノ末端から順番に番号
を付与した場合の特定のアミノ酸番号に対応する。よく
特徴づけられたタンパク質のアミノ酸残基に対するこの
ような統一的番号付与は当業者にはよく知られている。
“des-Tyr1-ＧＲＦ”などの指定は、アミノ末端チロシ
ン残基を欠く天然ＧＲＦ分子を意味することが当業者一
般に理解されている。このタンパク質の残りのアミノ酸
残基に再度番号を付与することは不必要であるし、混乱
を齎すであろう。上記の例では、天然に産出するタンパ
ク質の第２の位置を占めるアミノ酸がアミノ末端となる
が、そのアミノ酸の例えばAla２などの指定が維持され
ることは理解されるであろう。本明細書では、この広く
認められている異なるＧＲＦ種のアミノ酸指定法に従っ
て指定する。
“Ａ２０”、“Ａ２１”などの指定は、天然および文献に
認められるこのタンパク質のアミノ末端から順番に番号
を付与した場合の特定のアミノ酸番号に対応する。よく
特徴づけられたタンパク質のアミノ酸残基に対するこの
ような統一的番号付与は当業者にはよく知られている。
“des-Tyr1-ＧＲＦ”などの指定は、アミノ末端チロシ
ン残基を欠く天然ＧＲＦ分子を意味することが当業者一
般に理解されている。このタンパク質の残りのアミノ酸
残基に再度番号を付与することは不必要であるし、混乱
を齎すであろう。上記の例では、天然に産出するタンパ
ク質の第２の位置を占めるアミノ酸がアミノ末端となる
が、そのアミノ酸の例えばAla２などの指定が維持され
ることは理解されるであろう。本明細書では、この広く
認められている異なるＧＲＦ種のアミノ酸指定法に従っ
て指定する。
【００１２】本発明の好ましいペプチドは、Ａ９＝As
n、Ａ１２＝Arg、Ａ１５＝Thr、Ａ２１＝Arg、Ａ２２＝
Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Leu、Ａ２８＝Serである式
(１）によって表されるブタＧＲＦ（ｐＧＲＦ)の改変体
からなる。
n、Ａ１２＝Arg、Ａ１５＝Thr、Ａ２１＝Arg、Ａ２２＝
Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Leu、Ａ２８＝Serである式
(１）によって表されるブタＧＲＦ（ｐＧＲＦ)の改変体
からなる。
【００１３】また別の本発明の好ましいペプチドは、Ａ
９＝Asn、Ａ１２＝Arg、Ａ１５＝Thr、Ａ２１＝Arg、Ａ
２２＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Leu、Ａ２８＝Asnで
ある式(１)によって表されるウシＧＲＦ(ｂＧＲＦ)の改
変体からなる。
９＝Asn、Ａ１２＝Arg、Ａ１５＝Thr、Ａ２１＝Arg、Ａ
２２＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Leu、Ａ２８＝Asnで
ある式(１)によって表されるウシＧＲＦ(ｂＧＲＦ)の改
変体からなる。
【００１４】さらに別の本発明の好ましいペプチドは、
Ａ９＝Ser、Ａ１２＝Lys、Ａ１５＝Gly、Ａ２１＝Lys、
Ａ２２＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Met、Ａ２８＝Ser
である式(１)で表されるヒトＧＲＦ(ｈＧＲＦ)の改変体
からなる。
Ａ９＝Ser、Ａ１２＝Lys、Ａ１５＝Gly、Ａ２１＝Lys、
Ａ２２＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Met、Ａ２８＝Ser
である式(１)で表されるヒトＧＲＦ(ｈＧＲＦ)の改変体
からなる。
【００１５】本発明の好ましいペプチドは、Ｙが成熟Ｇ
ＲＦペプチドの３０〜４３アミノ酸を表す式(１)の化合
物からなる。本発明の好ましい化合物は、Ｙが当該ＧＲ
Ｆの特定の種(即ちｐＧＲＦ、ｂＧＲＦ、ｈＧＲＦなど)
の天然に認められる３０〜４３アミノ酸配列の３０〜４
３アミノ酸配列を表す式(１)の化合物からなる。特に好
ましいＹペプチドは、次のアミノ酸配列：
ＲＦペプチドの３０〜４３アミノ酸を表す式(１)の化合
物からなる。本発明の好ましい化合物は、Ｙが当該ＧＲ
Ｆの特定の種(即ちｐＧＲＦ、ｂＧＲＦ、ｈＧＲＦなど)
の天然に認められる３０〜４３アミノ酸配列の３０〜４
３アミノ酸配列を表す式(１)の化合物からなる。特に好
ましいＹペプチドは、次のアミノ酸配列：
【化１０】 ［上記配列中、Ａ３４はAspまたはSerを表し；Ａ３８は
ArgまたはGlnを表し；Ａ３９はGlyまたはArgを表し；Ａ
４０はAlaまたはSerを表し；Ａ４２はAla、Val、または
Pheを表す］からなる。
ArgまたはGlnを表し；Ａ３９はGlyまたはArgを表し；Ａ
４０はAlaまたはSerを表し；Ａ４２はAla、Val、または
Pheを表す］からなる。
【００１６】当該ＧＲＦの特定の形態がウシＧＲＦであ
る場合、特に好ましいＹペプチドは、次のアミノ酸配
列：
る場合、特に好ましいＹペプチドは、次のアミノ酸配
列：
【化１１】 からなる。
【００１７】当該ＧＲＦの特定の形態がブタＧＲＦであ
る場合、特に好ましいＹペプチドは、次のアミノ酸配
列：
る場合、特に好ましいＹペプチドは、次のアミノ酸配
列：
【化１２】 からなる。
【００１８】当該ＧＲＦの特定の形態がヒトＧＲＦであ
る場合、特に好ましいＹペプチドは次のアミノ酸配列：
る場合、特に好ましいＹペプチドは次のアミノ酸配列：
【化１３】 からなる。
【００１９】本発明の好ましいペプチドは、ＺがＧＲＦ
前駆体ペプチドの４４〜７６アミノ酸配列からなる場合
に相当する。特に好ましいものは、研究中の特定の種か
ら得たＧＲＦの天然に認められる４４〜７６アミノ酸配
列の４４〜７６アミノ酸配列である。
前駆体ペプチドの４４〜７６アミノ酸配列からなる場合
に相当する。特に好ましいものは、研究中の特定の種か
ら得たＧＲＦの天然に認められる４４〜７６アミノ酸配
列の４４〜７６アミノ酸配列である。
【００２０】Ｚで表されるこのペプチド部分の最も好ま
しい形態は、特定の種の天然に認められる４４〜７６ア
ミノ酸ＧＲＦ配列であって、そのリジン残基がアルギニ
ン残基に置換されており、そのメチオニン残基がロイシ
ン残基に置換されているものからなる。例えば当該ＧＲ
Ｆ種がブタである場合に、そのＧＲＦペプチドの最も好
ましいアミノ酸配列は、ＺがブタＧＲＦの上記のような
改変体である次のアミノ酸配列：
しい形態は、特定の種の天然に認められる４４〜７６ア
ミノ酸ＧＲＦ配列であって、そのリジン残基がアルギニ
ン残基に置換されており、そのメチオニン残基がロイシ
ン残基に置換されているものからなる。例えば当該ＧＲ
Ｆ種がブタである場合に、そのＧＲＦペプチドの最も好
ましいアミノ酸配列は、ＺがブタＧＲＦの上記のような
改変体である次のアミノ酸配列：
【化１４】 からなる場合である。
【００２１】当該ＧＲＦ種がウシである場合に、そのＧ
ＲＦペプチドの最も好ましいアミノ酸配列は、Ｚがウシ
ＧＲＦの上記のような改変体である次のアミノ酸配列：
ＲＦペプチドの最も好ましいアミノ酸配列は、Ｚがウシ
ＧＲＦの上記のような改変体である次のアミノ酸配列：
【化１５】 からなる場合である。
【００２２】当該ＧＲＦ種がヒトである場合に、最も好
ましい式(１)のＺ配列は０(零)である。
ましい式(１)のＺ配列は０(零)である。
【００２３】本発明の好ましい化合物は、Ｙおよび／ま
たはＺペプチドが大腸菌中での高レベル発現を達成する
のに充分な長さのペプチドである式(１)の化合物からな
る。
たはＺペプチドが大腸菌中での高レベル発現を達成する
のに充分な長さのペプチドである式(１)の化合物からな
る。
【００２４】本発明の好ましい化合物はさらに、遊離の
アミノ基を有するアミノ酸の０、１または複数が化学的
に修飾されているＧＲＦペプチド類からなる。本明細書
では、“化学的に修飾された”なる用語を、アルキルま
たはヒドロキシアルキル基によるアミノ酸遊離アミノ基
の誘導体化と定義する。修飾の程度は反応時間および試
薬量によって制御する。遊離のアミノ基を有するアミノ
酸のすべてを化学的に修飾することが好ましい。特に好
ましいものは、化学的に修飾できる遊離のアミノ基を１
つだけ有するＧＲＦペプチドである。このような化合物
はリジンまたはメチオニン残基を有さない。リジンおよ
び／またはメチオニンを含有する化合物のリジンをアル
ギニンに、メチオニンをロイシンに置換することによっ
て、このような化合物をそのＮ−末端のみに遊離アミノ
基を有する化合物に変換する。
アミノ基を有するアミノ酸の０、１または複数が化学的
に修飾されているＧＲＦペプチド類からなる。本明細書
では、“化学的に修飾された”なる用語を、アルキルま
たはヒドロキシアルキル基によるアミノ酸遊離アミノ基
の誘導体化と定義する。修飾の程度は反応時間および試
薬量によって制御する。遊離のアミノ基を有するアミノ
酸のすべてを化学的に修飾することが好ましい。特に好
ましいものは、化学的に修飾できる遊離のアミノ基を１
つだけ有するＧＲＦペプチドである。このような化合物
はリジンまたはメチオニン残基を有さない。リジンおよ
び／またはメチオニンを含有する化合物のリジンをアル
ギニンに、メチオニンをロイシンに置換することによっ
て、このような化合物をそのＮ−末端のみに遊離アミノ
基を有する化合物に変換する。
【００２５】本発明のＧＲＦ化合物の構築を、まずＮ-
末端に遊離アミノ基を有するＧＲＦペプチドを合成し、
次にそのＮ-末端を目的のＸ１酸またはその活性誘導体
でアシル化することによって行う。ＧＲＦペプチド類は
固相ペプチド合成か、あるいは組換え法によって作成で
きる。これらの方法は共に米国特許第４６１７１４９号
に記述されており、この文献の教示はすべて本明細書の
一部を構成する。高収率を望む場合には組換え法が好ま
しい。
末端に遊離アミノ基を有するＧＲＦペプチドを合成し、
次にそのＮ-末端を目的のＸ１酸またはその活性誘導体
でアシル化することによって行う。ＧＲＦペプチド類は
固相ペプチド合成か、あるいは組換え法によって作成で
きる。これらの方法は共に米国特許第４６１７１４９号
に記述されており、この文献の教示はすべて本明細書の
一部を構成する。高収率を望む場合には組換え法が好ま
しい。
【００２６】ポリペプチドの固相化学合成の原理は当該
技術分野でよく知られており、Dugas,H.およびPenney,
C.,Bioorganic Chemistry (1981),Springer-Verlag,New
York,54-92頁などこの分野の一般的教科書にも認めら
れる。ＧＲＦ類縁体の固相合成の技術と方法に関する記
述は欧州特許出願第８５３０２９７５.９号、公開番号
第０ １６１ ８５２(１９８５年１１月２１日公開)に認
めることができ、この文献の教示はすべて本明細書の一
部を構成する。
技術分野でよく知られており、Dugas,H.およびPenney,
C.,Bioorganic Chemistry (1981),Springer-Verlag,New
York,54-92頁などこの分野の一般的教科書にも認めら
れる。ＧＲＦ類縁体の固相合成の技術と方法に関する記
述は欧州特許出願第８５３０２９７５.９号、公開番号
第０ １６１ ８５２(１９８５年１１月２１日公開)に認
めることができ、この文献の教示はすべて本明細書の一
部を構成する。
【００２７】本発明の好ましい実施として、組換えＤＮ
Ａ技術によってＧＲＦペプチドの合成を達成する。与え
られたアミノ酸配列をコードする全合成または半合成Ｄ
ＮＡ配列の構築法は、当該技術分野でよく知られている
(Brown等,Methods in Enzymology 68:109(1979))。目的
のポリペプチドの翻訳を達成するためには、適切な制限
エンドヌクレアーゼ類を用いて、多くの適切な組換えＤ
ＮＡ発現ベクターのいずれかに、加工した合成ＤＮＡ配
列を挿入する。使用する特定のエンドヌクレアーゼは、
使用する親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断
様式によって決まるであろう。ＧＲＦペプチドコード化
配列は、そのＧＲＦペプチドが発現すべき宿主細胞にお
いて機能性である発現ベクターのプロモーターおよびリ
ボソーム結合部位を伴い、適切な読み枠にあるよう位置
しなければならない。特定の組換え環境において高レベ
ル発現を達成するために特定のコドンを使用できること
も、当該技術分野ではよく知られている。W.Fiers等,Na
ture 260:500(1976)および米国特許第４３５６２７０号
を参照のこと。
Ａ技術によってＧＲＦペプチドの合成を達成する。与え
られたアミノ酸配列をコードする全合成または半合成Ｄ
ＮＡ配列の構築法は、当該技術分野でよく知られている
(Brown等,Methods in Enzymology 68:109(1979))。目的
のポリペプチドの翻訳を達成するためには、適切な制限
エンドヌクレアーゼ類を用いて、多くの適切な組換えＤ
ＮＡ発現ベクターのいずれかに、加工した合成ＤＮＡ配
列を挿入する。使用する特定のエンドヌクレアーゼは、
使用する親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断
様式によって決まるであろう。ＧＲＦペプチドコード化
配列は、そのＧＲＦペプチドが発現すべき宿主細胞にお
いて機能性である発現ベクターのプロモーターおよびリ
ボソーム結合部位を伴い、適切な読み枠にあるよう位置
しなければならない。特定の組換え環境において高レベ
ル発現を達成するために特定のコドンを使用できること
も、当該技術分野ではよく知られている。W.Fiers等,Na
ture 260:500(1976)および米国特許第４３５６２７０号
を参照のこと。
【００２８】大腸菌宿主中での発現にとって好ましいベ
クターを、ＴcＲ遺伝子、ラムダcＩ８５７リプレッサー
およびラムダｐＬプロモーターからなる大腸菌プラスミ
ドｐＨＳ１９０から誘導する。ｐＨＳ１９０の制限部位
と機能地図を添付の図面の図１に記載する。プラスミド
ｐＨＳ１９０はノーザンリジョナルリサーチラボラトリ
ーズ(Northern Reginoal Research Laboratories)に受
託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８４１０のもとで寄託されている
(受託日：１９８８年９月９日)。
クターを、ＴcＲ遺伝子、ラムダcＩ８５７リプレッサー
およびラムダｐＬプロモーターからなる大腸菌プラスミ
ドｐＨＳ１９０から誘導する。ｐＨＳ１９０の制限部位
と機能地図を添付の図面の図１に記載する。プラスミド
ｐＨＳ１９０はノーザンリジョナルリサーチラボラトリ
ーズ(Northern Reginoal Research Laboratories)に受
託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１８４１０のもとで寄託されている
(受託日：１９８８年９月９日)。
【００２９】本発明の合成遺伝子配列は、Met1-Ala2-ｐ
ＧＲＦ(３-７６)ＯＨ、Met1-Ala2-ｂＧＲＦ(３-７６)Ｏ
Ｈ、およびMet1-Ala2-ｈＧＲＦ(３-７６)ＯＨの構造を
有するブタ、ウシ、およびヒトＧＲＦ類縁体をコードし
ている。ウマ、カモ・アヒル、ラット、モルモット、チ
ンチラ、ニワトリなど様々な他の種に有用なＧＲＦ類縁
体は、これらの分子の既知のアミノ酸配列を用い、本明
細書に例示するウシおよびブタＧＲＦペプチドと同様の
方法でこれらを修飾することによって得られる対応する
ＧＲＦペプチドをコードする合成遺伝子を用いて得るこ
とができる。
ＧＲＦ(３-７６)ＯＨ、Met1-Ala2-ｂＧＲＦ(３-７６)Ｏ
Ｈ、およびMet1-Ala2-ｈＧＲＦ(３-７６)ＯＨの構造を
有するブタ、ウシ、およびヒトＧＲＦ類縁体をコードし
ている。ウマ、カモ・アヒル、ラット、モルモット、チ
ンチラ、ニワトリなど様々な他の種に有用なＧＲＦ類縁
体は、これらの分子の既知のアミノ酸配列を用い、本明
細書に例示するウシおよびブタＧＲＦペプチドと同様の
方法でこれらを修飾することによって得られる対応する
ＧＲＦペプチドをコードする合成遺伝子を用いて得るこ
とができる。
【００３０】大腸菌に固有のタンパク質であるメチオニ
ルアミノペプチダーゼ(ＭＡＰ)の作用は、上記の化合物
のＮ-末端メチオニンを内因的に除去し、目的のｐＧＲ
Ｆ(２-７６)ＯＨ、ｂＧＲＦ(２-７６)ＯＨ、およびｈＧ
ＲＦ(２-７６)ＯＨペプチドを産出するであろう。次
に、Ｘ１酸またはその活性化誘導体を用いてこれらの
(２-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドのアミノ末端アミノ基を
アシル化することにより、これらを本発明の化合物(式
(１))に変換する。しかし分子生物学の分野では、融合
タンパク質としてペプチドを発現することが一般的であ
る。ＧＲＦペプチドを融合タンパク質として生産した
後、その構築物からＧＲＦペプチドを切断する場合に
は、得られる融合構築物中のＧＲＦペプチドと異種ペプ
チドとの間にプロテアーゼ(例えばカルボキシペプチダ
ーゼ)切断部位または化学的(例えば臭化シアン)切断部
位が存在するように、そのコード化配列を工作しなけれ
ばならない。融合タンパク質を生産するための技術、融
合タンパク質構築物から外来性異種ペプチドを切断する
方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば米国
特許第４３６６２４６号および同第４４２５４３７号を
参照のこと。適切なタンパク加水分解酵素を決定する際
には、融合タンパク質のアミノ酸骨格が、目的のペプチ
ド(即ちＧＲＦペプチド)と外来性ペプチドとの境界以外
にはその目的ポリペプチド中に追加の切断部位を含まな
いよう計画することが好ましい。これによって目的のＧ
ＲＦペプチドの分解の可能性を避けることができる。極
めて多様な化学試薬および酵素試薬のアミノ酸配列特異
性が当該技術分野でよく知られている。例えば“Proteo
lytic Enzymes：A Practical Approach”(1989),Benyo
n,R.J.およびBond.J.S.共編,Oxford University Press,
Oxford,England,UKを参照のこと。
ルアミノペプチダーゼ(ＭＡＰ)の作用は、上記の化合物
のＮ-末端メチオニンを内因的に除去し、目的のｐＧＲ
Ｆ(２-７６)ＯＨ、ｂＧＲＦ(２-７６)ＯＨ、およびｈＧ
ＲＦ(２-７６)ＯＨペプチドを産出するであろう。次
に、Ｘ１酸またはその活性化誘導体を用いてこれらの
(２-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドのアミノ末端アミノ基を
アシル化することにより、これらを本発明の化合物(式
(１))に変換する。しかし分子生物学の分野では、融合
タンパク質としてペプチドを発現することが一般的であ
る。ＧＲＦペプチドを融合タンパク質として生産した
後、その構築物からＧＲＦペプチドを切断する場合に
は、得られる融合構築物中のＧＲＦペプチドと異種ペプ
チドとの間にプロテアーゼ(例えばカルボキシペプチダ
ーゼ)切断部位または化学的(例えば臭化シアン)切断部
位が存在するように、そのコード化配列を工作しなけれ
ばならない。融合タンパク質を生産するための技術、融
合タンパク質構築物から外来性異種ペプチドを切断する
方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば米国
特許第４３６６２４６号および同第４４２５４３７号を
参照のこと。適切なタンパク加水分解酵素を決定する際
には、融合タンパク質のアミノ酸骨格が、目的のペプチ
ド(即ちＧＲＦペプチド)と外来性ペプチドとの境界以外
にはその目的ポリペプチド中に追加の切断部位を含まな
いよう計画することが好ましい。これによって目的のＧ
ＲＦペプチドの分解の可能性を避けることができる。極
めて多様な化学試薬および酵素試薬のアミノ酸配列特異
性が当該技術分野でよく知られている。例えば“Proteo
lytic Enzymes：A Practical Approach”(1989),Benyo
n,R.J.およびBond.J.S.共編,Oxford University Press,
Oxford,England,UKを参照のこと。
【００３１】本明細書に例示する本発明の好ましい実施
として、目的のＧＲＦペプチドをコードする望ましい合
成ＤＮＡ配列を、そのコード鎖の５'末端にＸbaＩ部位
を保持し、そのコード鎖の３'末端にＢamＨＩ部位を保
持するように構築する。ベクターＤＮＡを作成するため
に、ｐＨＳ１９０のＥcoＲＩ部位を除去する。ｐＨＳ１
９０ベクターをＥcoＲＩで消化し、その突出末端を補充
し、このプラスミドを再連結する。次にＢamＨＩおよび
ＸbaＩで消化することにより、ベクターＤＮＡが得られ
る。次いで、合成ＧＲＦペプチドコード化配列をこのベ
クターＤＮＡに挿入し、このベクターを再連結する。
として、目的のＧＲＦペプチドをコードする望ましい合
成ＤＮＡ配列を、そのコード鎖の５'末端にＸbaＩ部位
を保持し、そのコード鎖の３'末端にＢamＨＩ部位を保
持するように構築する。ベクターＤＮＡを作成するため
に、ｐＨＳ１９０のＥcoＲＩ部位を除去する。ｐＨＳ１
９０ベクターをＥcoＲＩで消化し、その突出末端を補充
し、このプラスミドを再連結する。次にＢamＨＩおよび
ＸbaＩで消化することにより、ベクターＤＮＡが得られ
る。次いで、合成ＧＲＦペプチドコード化配列をこのベ
クターＤＮＡに挿入し、このベクターを再連結する。
【００３２】連結した発現ベクターを、使用した特定の
発現ベクターに適した細菌(例えば大腸菌)または哺乳類
宿主細胞に導入することにより、本発明の実施で使用す
るのに適したＧＲＦペプチドを発現し得る組換え細胞が
得られる。細菌および哺乳類の発現環境に適した発現ベ
クターは、よく知られた当該技術分野の実験書(例えばC
urrent Protocols in Molecular Biology,(1989および
補足書),Ausubel等共編，John Wiley and Sons,NY)など
に認められる。
発現ベクターに適した細菌(例えば大腸菌)または哺乳類
宿主細胞に導入することにより、本発明の実施で使用す
るのに適したＧＲＦペプチドを発現し得る組換え細胞が
得られる。細菌および哺乳類の発現環境に適した発現ベ
クターは、よく知られた当該技術分野の実験書(例えばC
urrent Protocols in Molecular Biology,(1989および
補足書),Ausubel等共編，John Wiley and Sons,NY)など
に認められる。
【００３３】本明細書に例示する本発明の好ましい態様
として、上述のようにMet1-Ala2-ｐＧＲＦ(３-７６)Ｏ
Ｈ ＧＲＦペプチドのコード化配列を挿入することによ
ってプラスミドｐＨＳ４５２を調製する。Met1-Ala2-ｐ
ＧＲＦ(３-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドをコードするこの
ＤＮＡ配列とこれに対応するアミノ酸配列を次に記載す
る：
として、上述のようにMet1-Ala2-ｐＧＲＦ(３-７６)Ｏ
Ｈ ＧＲＦペプチドのコード化配列を挿入することによ
ってプラスミドｐＨＳ４５２を調製する。Met1-Ala2-ｐ
ＧＲＦ(３-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドをコードするこの
ＤＮＡ配列とこれに対応するアミノ酸配列を次に記載す
る：
【化１６】
【００３４】挿入したＤＮＡ配列がMet1-Ala2-ｂＧＲＦ
(３-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドをコードする場合に得ら
れるプラスミドをｐＨＳ５００と命名する。Met1-Ala2-
ｂＧＲＦ(３-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列とこれに対応するアミノ酸配列を次に記載す
る：
(３-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドをコードする場合に得ら
れるプラスミドをｐＨＳ５００と命名する。Met1-Ala2-
ｂＧＲＦ(３-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列とこれに対応するアミノ酸配列を次に記載す
る：
【化１７】
【００３５】Met1-Ala2-ｈＧＲＦ(３-７６)ＯＨ ＧＲＦ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入することもでき
る。Met1-Ala2-ｈＧＲＦ(３-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチド
をコードするＤＮＡ配列と、これに対応するアミノ酸配
列を次に記載する：
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入することもでき
る。Met1-Ala2-ｈＧＲＦ(３-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチド
をコードするＤＮＡ配列と、これに対応するアミノ酸配
列を次に記載する：
【化１８】 (Cravador,A.等,Biochimie 67:829-834(1985))
【００３６】本明細書に例示する本発明の好ましい態様
として、発現ベクターとしてｐＨＳ１９０骨格を使用
し、そのポリペプチド化合物の発現を希望するまで宿主
細胞を３２℃で生育させる。生育温度を約４２℃に変更
すればｃＩ８５７リプレッサーが不活性になり、ｐＬプ
ロモーターの抑制が解除される。次いで、ＧＲＦ活性を
有する大量のポリペプチドが、総細胞タンパク質の約１
５％までのレベルで生産される。この活性ポリペプチド
を当業者によく知られた技術や以降の実施例に記述する
方法で精製することができる。前述のように、固有のＭ
ＡＰ作用によってＮ-末端メチオニン残基が除去され、
ＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドが得られるであろ
う。しかし、このタンパク質を精製した後、適切なアミ
ノペプチダーゼの作用や他の化学的方法(例えば臭化シ
アンの作用)によって、残存するＮ-末端メチオニン残基
をすべて除去してもよい。
として、発現ベクターとしてｐＨＳ１９０骨格を使用
し、そのポリペプチド化合物の発現を希望するまで宿主
細胞を３２℃で生育させる。生育温度を約４２℃に変更
すればｃＩ８５７リプレッサーが不活性になり、ｐＬプ
ロモーターの抑制が解除される。次いで、ＧＲＦ活性を
有する大量のポリペプチドが、総細胞タンパク質の約１
５％までのレベルで生産される。この活性ポリペプチド
を当業者によく知られた技術や以降の実施例に記述する
方法で精製することができる。前述のように、固有のＭ
ＡＰ作用によってＮ-末端メチオニン残基が除去され、
ＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドが得られるであろ
う。しかし、このタンパク質を精製した後、適切なアミ
ノペプチダーゼの作用や他の化学的方法(例えば臭化シ
アンの作用)によって、残存するＮ-末端メチオニン残基
をすべて除去してもよい。
【００３７】本発明の化合物を、(２-２７)ＯＨ ＧＲＦ
ペプチドのアミノ末端を所望のＸ１カルボン酸でＮ-ア
シル化することによって製造する。(２-７６)ＯＨ ＧＲ
Ｆペプチドのアミノ末端窒素のアシル化は、Ｘ１酸のス
クシンイミジルエステルを用いて行うことが好ましい。
(２-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドのアミノ末端窒素がスク
シンイミジルエステルのエステル結合のカルボニル炭素
を求核攻撃することによってアシル化が起こる。次に示
す反応式に、ヒプロイル-ＧＲＦ(２-７６)ＯＨの合成を
齎すアシル化反応を図示する。
ペプチドのアミノ末端を所望のＸ１カルボン酸でＮ-ア
シル化することによって製造する。(２-７６)ＯＨ ＧＲ
Ｆペプチドのアミノ末端窒素のアシル化は、Ｘ１酸のス
クシンイミジルエステルを用いて行うことが好ましい。
(２-７６)ＯＨ ＧＲＦペプチドのアミノ末端窒素がスク
シンイミジルエステルのエステル結合のカルボニル炭素
を求核攻撃することによってアシル化が起こる。次に示
す反応式に、ヒプロイル-ＧＲＦ(２-７６)ＯＨの合成を
齎すアシル化反応を図示する。
【化１９】
【００３８】Ｘ１カルボン酸の他の活性エステルをこの
アシル化に使用することもできる。例えばクロロギ酸エ
チルやクロロギ酸イソブチルなどのクロロギ酸エステル
類によって生成した活性エステル、あるいはＨｏＢＴ
(ヒドロキシベンゾトリアゾール)などのＮ-ヒドロキシ
複素環類によって生成した活性エステルなどを使用でき
る。アミノ酸のアシル化やアミノ酸のカップリングに従
来から用いられている他の活性誘導体も使用できる。こ
れらの誘導体には対称無水物やＮ-カルボキシ無水物を
含まれ得る。
アシル化に使用することもできる。例えばクロロギ酸エ
チルやクロロギ酸イソブチルなどのクロロギ酸エステル
類によって生成した活性エステル、あるいはＨｏＢＴ
(ヒドロキシベンゾトリアゾール)などのＮ-ヒドロキシ
複素環類によって生成した活性エステルなどを使用でき
る。アミノ酸のアシル化やアミノ酸のカップリングに従
来から用いられている他の活性誘導体も使用できる。こ
れらの誘導体には対称無水物やＮ-カルボキシ無水物を
含まれ得る。
【００３９】このアシル化反応をｐＨ約７.５〜９.５の
水性媒質中、約１５〜３５℃の温度で実行する。別法と
してＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒を使用することも
できる。
水性媒質中、約１５〜３５℃の温度で実行する。別法と
してＤＭＳＯなどの非プロトン性溶媒を使用することも
できる。
【００４０】式(１)のＧＲＦ化合物を製造するために使
用するＸ１酸の例には、(２-２９,４４,または７６)Ｇ
ＲＦペプチドをアシル化する場合について、馬尿酸、p-
メチル馬尿酸、p-クロロ馬尿酸、p-ニトロ馬尿酸、p-ヒ
ドロキシ馬尿酸、フェニルアミノ炭酸、４-ヒドロキシ
フェニルピルビン酸、p-フルオロ馬尿酸、Ｎ-フェニル
マロン酸アミド、p-メチル-Ｎ-フェニルマロン酸アミ
ド、Ｎ-(２-チエノイル)グリシン、Ｎ-(２-フロイル)グ
リシン、Ｎ-(２-フロイル)-ｂ-アミノプロピオン酸、Ｎ
-(３-チエノイル)-ａ-アミノプロピオン酸、Ｎ-(３-ピ
リジノイル)グリシン、Ｎ-(４-ピリジニル)マロンアミ
ド酸、Ｎ-(１,３-チアジニル)マロンアミド酸、Ｎ-(１,
３-チアジアニル)スクシンアミド、Ｎ-フェニルグルタ
ルアミド酸、Ｎ-[(２-メトキシエチル)アミノスルホニ
ル］グリシンおよびスルフィニル、Ｎ-[(２-エチルチオ
エチル)アミノスルホニル]グリシンおよびスルフィニ
ル、Ｎ-(２-ヒドロキシエチル)マロンアミド酸などが含
まれる。
用するＸ１酸の例には、(２-２９,４４,または７６)Ｇ
ＲＦペプチドをアシル化する場合について、馬尿酸、p-
メチル馬尿酸、p-クロロ馬尿酸、p-ニトロ馬尿酸、p-ヒ
ドロキシ馬尿酸、フェニルアミノ炭酸、４-ヒドロキシ
フェニルピルビン酸、p-フルオロ馬尿酸、Ｎ-フェニル
マロン酸アミド、p-メチル-Ｎ-フェニルマロン酸アミ
ド、Ｎ-(２-チエノイル)グリシン、Ｎ-(２-フロイル)グ
リシン、Ｎ-(２-フロイル)-ｂ-アミノプロピオン酸、Ｎ
-(３-チエノイル)-ａ-アミノプロピオン酸、Ｎ-(３-ピ
リジノイル)グリシン、Ｎ-(４-ピリジニル)マロンアミ
ド酸、Ｎ-(１,３-チアジニル)マロンアミド酸、Ｎ-(１,
３-チアジアニル)スクシンアミド、Ｎ-フェニルグルタ
ルアミド酸、Ｎ-[(２-メトキシエチル)アミノスルホニ
ル］グリシンおよびスルフィニル、Ｎ-[(２-エチルチオ
エチル)アミノスルホニル]グリシンおよびスルフィニ
ル、Ｎ-(２-ヒドロキシエチル)マロンアミド酸などが含
まれる。
【００４１】本発明の化合物を、遊離の、あるいは類似
のＮ-末端保護ペプチドまたは置換カルボン酸誘導体を
伴う支持体に結合した、(３-２９,４４,または７６)Ｇ
ＲＦペプチド、ＧＲＦ(４-２９,４４,または７６) ＧＲ
Ｆペプチドなどから出発しても製造できることは、当業
者には自明であろう。
のＮ-末端保護ペプチドまたは置換カルボン酸誘導体を
伴う支持体に結合した、(３-２９,４４,または７６)Ｇ
ＲＦペプチド、ＧＲＦ(４-２９,４４,または７６) ＧＲ
Ｆペプチドなどから出発しても製造できることは、当業
者には自明であろう。
【００４２】アシル化したＧＲＦペプチド類の医薬的に
許容される非毒性塩は本発明の化合物に包含される。用
語“医薬的に許容される非毒性塩”は、有機酸付加塩お
よび無機酸付加塩の両者を包含し、例えば塩酸、フッ化
水素酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化水
素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、
コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、p-
トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレン
スルホン酸、プロピオン酸などの酸から製造した塩が含
まれる。酸付加塩は塩酸、酢酸、またはコハク酸から製
造したものが好ましい。上記の塩はいずれも従来の方法
によって製造する。またこの用語は、存在するカルボキ
シ基のいずれかによって生成する“カルボン酸塩”、例
えばアミン、アンモニウム、４級アンモニウム、アルカ
リ金属およびアルカリ土類金属塩(例：カルシウム、マ
グネシウム、ナトリウム、カリウム、およびリチウムな
ど)をも包含する。
許容される非毒性塩は本発明の化合物に包含される。用
語“医薬的に許容される非毒性塩”は、有機酸付加塩お
よび無機酸付加塩の両者を包含し、例えば塩酸、フッ化
水素酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化水
素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、
コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、p-
トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレン
スルホン酸、プロピオン酸などの酸から製造した塩が含
まれる。酸付加塩は塩酸、酢酸、またはコハク酸から製
造したものが好ましい。上記の塩はいずれも従来の方法
によって製造する。またこの用語は、存在するカルボキ
シ基のいずれかによって生成する“カルボン酸塩”、例
えばアミン、アンモニウム、４級アンモニウム、アルカ
リ金属およびアルカリ土類金属塩(例：カルシウム、マ
グネシウム、ナトリウム、カリウム、およびリチウムな
ど)をも包含する。
【００４３】次の表１、表２および表３に、本発明の化
合物の増大した活性を例示する。
合物の増大した活性を例示する。
【表１】 Tyr-１の置換によるｂＧＲＦ(１-７７)ＯＨの成長ホルモン放出活性の増大1 ペプチド ＥＣ50(ｎＭ)2 ｂＧＲＦ(１-７７)ＯＨ ０.５９ ヒプロイル-１ ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ０.８６ p-ヒドロキシヒプロイル ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ０.３３ p-クロロヒプロイル ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ０.１９ p-フルオロヒプロイル ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ０.１４ p-ニトロヒプロイル ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ０.５１ p-メチルヒプロイル ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ０.０５ n-フェニルマロンアミンドイル bＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ０.１９
【表２】 Tyr-１の置換によるｐＧＲＦ(１-７６)ＯＨの成長ホルモン放出活性の増大1 ペプチド ＥＣ50(ｎＭ)2 des Tyr-1 ｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ９５.０ ヒプロイル-１ ｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ０.２８ p-メチルヒプロイル ｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ０.０６ p-メチルフェニルマロンアミンドイル ｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ０.０６
【表３】 長さの異なるｐ−メチルヒプロイル-1 ｐＧＲＦ類縁体のインビトロ効力1
ペプチド ＥＣ50(ｎＭ)2 p-メチルヒプロイル ｐＧＲＦ(２-２９)ＮＨ2 ０.０２ p-メチルヒプロイル ｐＧＲＦ(２-４４)ＯＨ ０.０７ p-メチルヒプロイル ｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ０.０６ 注） 1 ラット一次下垂体細胞から媒質中に放出された
成長ホルモンを、分泌促進物質７投与量に３時間さらし
た後に測定した。2 ＥＣ50は半有効投与量計算値である。
ペプチド ＥＣ50(ｎＭ)2 p-メチルヒプロイル ｐＧＲＦ(２-２９)ＮＨ2 ０.０２ p-メチルヒプロイル ｐＧＲＦ(２-４４)ＯＨ ０.０７ p-メチルヒプロイル ｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ０.０６ 注） 1 ラット一次下垂体細胞から媒質中に放出された
成長ホルモンを、分泌促進物質７投与量に３時間さらし
た後に測定した。2 ＥＣ50は半有効投与量計算値である。
【００４４】また本発明は、活性剤として式(１)で表さ
れるポリペプチド化合物または医薬的に許容されるその
非毒性塩を含有し、医薬的に許容される固体または液体
担体を含有する医薬組成物を提供する。
れるポリペプチド化合物または医薬的に許容されるその
非毒性塩を含有し、医薬的に許容される固体または液体
担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００４５】本発明のポリペプチド化合物を非経口的に
投与する場合、注射に適した医薬形態には、滅菌水性溶
液剤または分散剤、並びに、滅菌注射可能溶液剤または
分散剤を調製するための滅菌粉末が含まれる。担体は、
例えば水、エタノール、ポリオール(例；グリセロー
ル、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコー
ルなど)、上記の物質の適切な混合物、および植物油な
どを含む溶媒または分散化媒質であり得る。例えば、レ
チシンなどの被膜を使用することによって、あるいは分
散剤の場合には必要な粒子サイズを維持することによっ
て、または界面活性剤を使用することによって適切な流
動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、
種々の抗菌剤および抗カビ剤(例えばパラベン類、クロ
ロブタノール、フェノール、ソルビン酸など)によって
確実に実行できる。多くの場合、等張性剤、例えば糖、
塩化ナトリウムなどを添加することが望ましい。注射可
能な医薬形態の長時間吸収は、吸収を遅らせる薬物(例
えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチン)の
使用によって達成できる。
投与する場合、注射に適した医薬形態には、滅菌水性溶
液剤または分散剤、並びに、滅菌注射可能溶液剤または
分散剤を調製するための滅菌粉末が含まれる。担体は、
例えば水、エタノール、ポリオール(例；グリセロー
ル、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコー
ルなど)、上記の物質の適切な混合物、および植物油な
どを含む溶媒または分散化媒質であり得る。例えば、レ
チシンなどの被膜を使用することによって、あるいは分
散剤の場合には必要な粒子サイズを維持することによっ
て、または界面活性剤を使用することによって適切な流
動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、
種々の抗菌剤および抗カビ剤(例えばパラベン類、クロ
ロブタノール、フェノール、ソルビン酸など)によって
確実に実行できる。多くの場合、等張性剤、例えば糖、
塩化ナトリウムなどを添加することが望ましい。注射可
能な医薬形態の長時間吸収は、吸収を遅らせる薬物(例
えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチン)の
使用によって達成できる。
【００４６】滅菌注射可能溶液剤は、必要量の適切な溶
媒に本発明の化合物を、所望により他の種々の成分と共
に添加することによって調製できる。所望により、より
効果的な分布のために、この化合物を徐放系または標的
指定配送系(targeted delivery system)(例えばポリマ
ーマトリックス、リポソーム、微小球)中に組み込むこと
ができる。この化合物を、機械式放出装置、浸透ポン
プ、あるいは連続的または脈動的配送を可能にする他の
放出装置(系)を用いて配送することができる。
媒に本発明の化合物を、所望により他の種々の成分と共
に添加することによって調製できる。所望により、より
効果的な分布のために、この化合物を徐放系または標的
指定配送系(targeted delivery system)(例えばポリマ
ーマトリックス、リポソーム、微小球)中に組み込むこと
ができる。この化合物を、機械式放出装置、浸透ポン
プ、あるいは連続的または脈動的配送を可能にする他の
放出装置(系)を用いて配送することができる。
【００４７】静脈内(ＩＶ)使用のためには、水溶性型の
本発明の化合物を、一般的に使用される静脈用液体の１
つに溶解し、これを注入によって投与することができ
る。例えば生理食塩水、リンゲル溶液、または５％デキ
ストロース溶液などの液体を使用することができる。適
切な本発明の化合物の不溶性型を製造し、これを水基剤
または医薬的に許容される油基剤(例えばオレイン酸エ
チルなどの長鎖脂肪酸のエステル)として投与してもよ
い。
本発明の化合物を、一般的に使用される静脈用液体の１
つに溶解し、これを注入によって投与することができ
る。例えば生理食塩水、リンゲル溶液、または５％デキ
ストロース溶液などの液体を使用することができる。適
切な本発明の化合物の不溶性型を製造し、これを水基剤
または医薬的に許容される油基剤(例えばオレイン酸エ
チルなどの長鎖脂肪酸のエステル)として投与してもよ
い。
【００４８】本発明の化合物の単位剤形は、密閉アンプ
ル中のその化合物(好ましくはその塩型)の適切な希釈剤
溶液であり得る。この化合物の濃度は、その化合物の特
定の形態、その溶解度およびその適用に望ましい投与量
に応じて、例えば約１％〜約５０％の範囲で変化するで
あろう。
ル中のその化合物(好ましくはその塩型)の適切な希釈剤
溶液であり得る。この化合物の濃度は、その化合物の特
定の形態、その溶解度およびその適用に望ましい投与量
に応じて、例えば約１％〜約５０％の範囲で変化するで
あろう。
【００４９】また本発明は、式(１)で表されるポリペプ
チド化合物または医薬的に許容されるその非毒性塩の有
効量および医薬的に許容される固体または液体担体を投
与することからなる、成長ホルモン放出を誘発する方法
を提供する。
チド化合物または医薬的に許容されるその非毒性塩の有
効量および医薬的に許容される固体または液体担体を投
与することからなる、成長ホルモン放出を誘発する方法
を提供する。
【００５０】成長ホルモン放出の刺激が望まれる期間、
本発明の化合物を受容者に投与する。受容者の体重と投
与法が、特定の応答を誘発するのに必要な投与サイズに
影響を与えるであろう。ヒツジの場合、好ましい投与量
は約０.０１〜３.０ｍｇ／ｋｇ／日であり、最も好まし
い投与量は約０.５ｍｇ／ｋｇ／日である。ブタの場
合、好ましい投与量は約３μｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／
ｋｇ／日である。ブタの場合、最も好ましい投与量は約
３μｇ／ｋｇ／日である。ウシにとって好ましい投与量
は約０.５〜１２ｍｇ／ｋｇ／日である。特に好ましい
投与量は３ｍｇ／ｋｇ／日である。ヒトの場合、好まし
い投与量は約０.３ｍｇ／ｋｇ／日〜１.０ｍｇ／ｋｇ／
日である。最も好ましい投与量は約０.３ｍｇ／ｋｇ／
日である。
本発明の化合物を受容者に投与する。受容者の体重と投
与法が、特定の応答を誘発するのに必要な投与サイズに
影響を与えるであろう。ヒツジの場合、好ましい投与量
は約０.０１〜３.０ｍｇ／ｋｇ／日であり、最も好まし
い投与量は約０.５ｍｇ／ｋｇ／日である。ブタの場
合、好ましい投与量は約３μｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／
ｋｇ／日である。ブタの場合、最も好ましい投与量は約
３μｇ／ｋｇ／日である。ウシにとって好ましい投与量
は約０.５〜１２ｍｇ／ｋｇ／日である。特に好ましい
投与量は３ｍｇ／ｋｇ／日である。ヒトの場合、好まし
い投与量は約０.３ｍｇ／ｋｇ／日〜１.０ｍｇ／ｋｇ／
日である。最も好ましい投与量は約０.３ｍｇ／ｋｇ／
日である。
【００５１】本発明の化合物を単位投与剤形で製剤化す
ることは、投与が簡便であることと投与量の統一性の点
で特に利点を有する。本明細書で使用される単位投与剤
形という用語は、治療される患者のための単位剤として
ふさわしい物理的に分離した単位を意味する。各単位
は、目的の治療効果を生み出すように計算され、予め決
定された量の化合物を医薬的に許容される担体と共に含
有する。特定の単位投与剤形は、(ａ)特定の組成物に独
特の性質、および(ｂ)達成されるべき特定の治療効果に
よって決定され、これらに直接的に依存する。
ることは、投与が簡便であることと投与量の統一性の点
で特に利点を有する。本明細書で使用される単位投与剤
形という用語は、治療される患者のための単位剤として
ふさわしい物理的に分離した単位を意味する。各単位
は、目的の治療効果を生み出すように計算され、予め決
定された量の化合物を医薬的に許容される担体と共に含
有する。特定の単位投与剤形は、(ａ)特定の組成物に独
特の性質、および(ｂ)達成されるべき特定の治療効果に
よって決定され、これらに直接的に依存する。
【００５２】当然、ＧＲＦおよび好ましくは本発明のＧ
ＲＦ化合物を医薬的に許容される形態で適切に投与すれ
ば、哺乳類において成長ホルモンの産生増大が齎され
る。したがって哺乳類成長ホルモンの医学的および農学
的応用は、本発明の化合物を投与することによって同様
に達成されるであろう。現在、成長ホルモンの投与によ
る治療が指摘されている疾患状態の例には、小人症およ
び骨粗鬆症が含まれる。成長ホルモンの他の有益な効
果、例えば脂肪の少ない筋肉塊の増加効果、創傷治癒促
進効果および老化の効果に対する対処効果なども、本発
明の化合物を投与することによって達成されるであろ
う。
ＲＦ化合物を医薬的に許容される形態で適切に投与すれ
ば、哺乳類において成長ホルモンの産生増大が齎され
る。したがって哺乳類成長ホルモンの医学的および農学
的応用は、本発明の化合物を投与することによって同様
に達成されるであろう。現在、成長ホルモンの投与によ
る治療が指摘されている疾患状態の例には、小人症およ
び骨粗鬆症が含まれる。成長ホルモンの他の有益な効
果、例えば脂肪の少ない筋肉塊の増加効果、創傷治癒促
進効果および老化の効果に対する対処効果なども、本発
明の化合物を投与することによって達成されるであろ
う。
【００５３】本発明のポリペプチド化合物は多くの系で
検定できる。インビボ検定の１つはペントバルビタール
ナトリウムで麻酔したラットで実行する(Wehrenberg等,
Biochem.Biophys.Res.Commun.109:382(1982))。成長ホ
ルモンの放出は、ラットの前部下垂体細胞を用いてイン
ビトロで測定する(Heiman等,Endocrinol.116:410(198
5))。
検定できる。インビボ検定の１つはペントバルビタール
ナトリウムで麻酔したラットで実行する(Wehrenberg等,
Biochem.Biophys.Res.Commun.109:382(1982))。成長ホ
ルモンの放出は、ラットの前部下垂体細胞を用いてイン
ビトロで測定する(Heiman等,Endocrinol.116:410(198
5))。
【００５４】
【実施例】以下の実施例は本明細書に記述した本発明を
さらに例示するためのものであるが、本発明の限定を意
図するものではない。
さらに例示するためのものであるが、本発明の限定を意
図するものではない。
【００５５】実施例１：ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨの固相
製造 ＧＲＦペプチドを、アプライドバイオシステムズ４３０
Ａペプチド合成装置(アフ゜ライト゛ハ゛イオシステムス゛,フォスターシティー,カリフ
ォルニアから市販されている)およびアプライドバイオシス
テムズによって供給された合成サイクルを使用し、固相
法によって合成した。Bocアミノ酸および他の試薬はア
プライドバイオシステムズおよび他の市販供給源から供
給された。Ｃ-末端カルボキサミドを作成するために、
出発物質p-メチルベンズヒドリルアミン樹脂に、ダブル
カップル法を用いる連続的Boc化学を適用する。Ｃ-末端
酸作成のために、対応するＰＡＭ樹脂を使用する。予め
形成させたヒドロキシベンゾトリアゾールエステル類を
用いて、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、[α-
(p-ヒドロキシフェニル)酢酸類]、[β-(p-ヒドロキシフ
ェニル)プロピオン酸類］、p-ヒドロキシ安息香酸類、p
-ヒドロキシケイ皮酸類、p-ヒドロキシフェノキシ酢酸
類をカップリングさせる。ＨＯＢＴ活性化アミノ酸を用
い固相合成で、すべてのＮ-末端付加を行った。
製造 ＧＲＦペプチドを、アプライドバイオシステムズ４３０
Ａペプチド合成装置(アフ゜ライト゛ハ゛イオシステムス゛,フォスターシティー,カリフ
ォルニアから市販されている)およびアプライドバイオシス
テムズによって供給された合成サイクルを使用し、固相
法によって合成した。Bocアミノ酸および他の試薬はア
プライドバイオシステムズおよび他の市販供給源から供
給された。Ｃ-末端カルボキサミドを作成するために、
出発物質p-メチルベンズヒドリルアミン樹脂に、ダブル
カップル法を用いる連続的Boc化学を適用する。Ｃ-末端
酸作成のために、対応するＰＡＭ樹脂を使用する。予め
形成させたヒドロキシベンゾトリアゾールエステル類を
用いて、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、[α-
(p-ヒドロキシフェニル)酢酸類]、[β-(p-ヒドロキシフ
ェニル)プロピオン酸類］、p-ヒドロキシ安息香酸類、p
-ヒドロキシケイ皮酸類、p-ヒドロキシフェノキシ酢酸
類をカップリングさせる。ＨＯＢＴ活性化アミノ酸を用
い固相合成で、すべてのＮ-末端付加を行った。
【００５６】次の側鎖保護を用いる： Arg：トシル Asp：シクロヘキシル Glu：シクロヘキシル Ser：ベンジル Thr：ベンジル Tyr：４-ブロモカルボベンズオキシ
【００５７】Boc脱保護を、塩化メチレン中のトリフル
オロ酢酸(ＴＦＡ)を用いて行う。合成が完了した後、１
０％メタクレゾールを含む無水フッ化水素を用いて、そ
のペプチドを脱保護し、樹脂から切り離す。側鎖保護基
の切断と、ペプチドの樹脂からの切断は０℃以下で行
い、好ましくは−２０℃で３０分間の後０℃で３０分間
行う。ＨＦを除去した後、ペプチド／樹脂をエーテルで
洗浄し、氷酢酸でペプチドを抽出し、凍結乾燥する。精
製は、１０％酢酸中のセファデックスＧ-１０(ファルマシア)
カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって
実行する。
オロ酢酸(ＴＦＡ)を用いて行う。合成が完了した後、１
０％メタクレゾールを含む無水フッ化水素を用いて、そ
のペプチドを脱保護し、樹脂から切り離す。側鎖保護基
の切断と、ペプチドの樹脂からの切断は０℃以下で行
い、好ましくは−２０℃で３０分間の後０℃で３０分間
行う。ＨＦを除去した後、ペプチド／樹脂をエーテルで
洗浄し、氷酢酸でペプチドを抽出し、凍結乾燥する。精
製は、１０％酢酸中のセファデックスＧ-１０(ファルマシア)
カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって
実行する。
【００５８】実施例２：ＧＲＦペプチドの組換え生産 ２.Ａ ：ＧＲＦ(２-７６)ＯＨの組換え発現 ２.Ａ.１ ：Met1-ｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨをコードするプ
ラスミドｐＨＳ４５２の合成 プラスミドｐＨＳ４５２は、その宿主細胞を適切な条件
下で培養すれば、本発明の好ましいｐＧＲＦ(２-７６)
ＯＨポリペプチド化合物を大量に生産する組換えＤＮＡ
発現ベクターである。
ラスミドｐＨＳ４５２の合成 プラスミドｐＨＳ４５２は、その宿主細胞を適切な条件
下で培養すれば、本発明の好ましいｐＧＲＦ(２-７６)
ＯＨポリペプチド化合物を大量に生産する組換えＤＮＡ
発現ベクターである。
【００５９】大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＳ１９０
の凍結乾燥品は、ノーザンリジョナルリサーチラボラト
リーズ(ＮＲＲＬ)(ヘ゜オリア、イリノイ61604)から受託番号ＮＲ
ＲＬＢ-１８４１０(受託日：１９８８年９月９日)のも
とで入手可能であり、以下の工程における“培養(物)”
として直接使用できる。プラスミドｐＨＳ１９０の制限
部位および機能地図を添付の図面の図１に示す。５mg／
mlのテトラサイクリンを含有するＴＹブロス(１ｌあた
り、トリプトン１０g、塩化ナトリウム５g、酵母エキス
５g)１０mlに大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＳ１９０
の培養を植菌し、３０℃で通気しながら終夜(１５〜１
８時間)インキュベートする。得られた培養をプラスミ
ドｐＨＳ１９０の供給源として使用する。
の凍結乾燥品は、ノーザンリジョナルリサーチラボラト
リーズ(ＮＲＲＬ)(ヘ゜オリア、イリノイ61604)から受託番号ＮＲ
ＲＬＢ-１８４１０(受託日：１９８８年９月９日)のも
とで入手可能であり、以下の工程における“培養(物)”
として直接使用できる。プラスミドｐＨＳ１９０の制限
部位および機能地図を添付の図面の図１に示す。５mg／
mlのテトラサイクリンを含有するＴＹブロス(１ｌあた
り、トリプトン１０g、塩化ナトリウム５g、酵母エキス
５g)１０mlに大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＳ１９０
の培養を植菌し、３０℃で通気しながら終夜(１５〜１
８時間)インキュベートする。得られた培養をプラスミ
ドｐＨＳ１９０の供給源として使用する。
【００６０】５mg／mlのテトラサイクリンを含有するＴ
Ｙブロス１ｌに大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＳ１９
０を植菌し、３２℃で通気しながら終夜(１５〜１８時
間)インキュベートする。次にこの培養をソーバル(テ゛ュホ
゜ンカンハ゜ニー,インストルメントフ゜ロタ゛クツ・ハ゛イオメテ゛ィカルテ゛ィヒ゛シ゛ョン,ニュート
ン,CT06470)ＧＳＡローター中で、５２００rpm、４℃で
１０分間遠心分離することにより細胞をペレット化す
る。得られた上清を捨てる。細胞ペレットを２５％ショ
糖および５０mM ＥＤＴＡ(エチレンジアミンテトラ酢
酸)の溶液２８ml中に再懸濁する。０.２５M トリス-塩酸
(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン・塩酸塩)(ｐ
Ｈ８.０)および０.５M ＥＤＴＡ約１.５ml中の２０mg／
mlリゾチーム溶液約１mlを細胞懸濁液に加え、混合す
る。得られた混合物を氷上で１５分間インキュベートす
る。１０％トリトン(ToritonR)Ｘ-１００(ローム・アント゛・ハース
(Rohm & Haas))３ml；０.２５M ＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)７
５ml；および水７mlを混合することにより調製した溶解
溶液３mlを、リゾチーム処理した細胞に穏やかに混合し
ながら加える。得られた溶液を氷上でさらに１５分間イ
ンキュベートする。
Ｙブロス１ｌに大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＳ１９
０を植菌し、３２℃で通気しながら終夜(１５〜１８時
間)インキュベートする。次にこの培養をソーバル(テ゛ュホ
゜ンカンハ゜ニー,インストルメントフ゜ロタ゛クツ・ハ゛イオメテ゛ィカルテ゛ィヒ゛シ゛ョン,ニュート
ン,CT06470)ＧＳＡローター中で、５２００rpm、４℃で
１０分間遠心分離することにより細胞をペレット化す
る。得られた上清を捨てる。細胞ペレットを２５％ショ
糖および５０mM ＥＤＴＡ(エチレンジアミンテトラ酢
酸)の溶液２８ml中に再懸濁する。０.２５M トリス-塩酸
(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン・塩酸塩)(ｐ
Ｈ８.０)および０.５M ＥＤＴＡ約１.５ml中の２０mg／
mlリゾチーム溶液約１mlを細胞懸濁液に加え、混合す
る。得られた混合物を氷上で１５分間インキュベートす
る。１０％トリトン(ToritonR)Ｘ-１００(ローム・アント゛・ハース
(Rohm & Haas))３ml；０.２５M ＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)７
５ml；および水７mlを混合することにより調製した溶解
溶液３mlを、リゾチーム処理した細胞に穏やかに混合し
ながら加える。得られた溶液を氷上でさらに１５分間イ
ンキュベートする。
【００６１】ソーバルＳＳ３４ローター中、１７０００
rpm、４℃で約４５分間遠心分離することにより細胞残
渣を溶液から除去する。５mg／ml 臭化エチジウム溶液
約１mlとＣｓＣｌ約２８.６gを上清約３０mlに加える。
次いで、その体積を水で４０mlに調節し、その溶液を超
遠心管中にデカントする。この超遠心管を封印し、溶液
をＴｉ７０ローター(ヘ゛ックマン,7360N.リンカーンアヘ゛ニュー,リンカーンウ
ット゛,IL60646)中、４９５００rpmで約１８時間遠心分離
する。得られたプラスミドバンドを紫外線で可視化し、
単離し、ＣｓＣｌ飽和イソプロパノールで抽出すること
により臭化エチジウムを除去し、約２０体積のＴＥ緩衝
液(１０mM トリス-塩酸(ｐＨ７.５)および１mM ＥＤＴ
Ａ)(３回交換)に対して透析する。透析液を集めた後、
エタノール２体積および３M 酢酸ナトリウム溶液０.０
５体積を加える。このエタノール混合物を−２０℃に冷
却し、ＳＳ３４ローター中１００００rpm、−１０℃で
３０分間遠心分離することによりプラスミドＤＮＡをペ
レット化する。得られたペレットをＴＥ緩衝液約１ml中
に再懸濁した後、等体積のフェノール：クロロホルム
(体積比１:１)混合物で抽出する。３M 酢酸ナトリウム
０.１体積およびエタノール２体積を添加した後、−２
０℃で約３０分間インキュベートし、ＳＳ３４ローター
中１５０００rpmで２０分間遠心分離することによっ
て、水層中のＤＮＡを回収する。得られたＤＮＡペレッ
トをまず７０％エタノールで濯ぎ、次に１００％エタノ
ールで濯いだ後、乾燥する。
rpm、４℃で約４５分間遠心分離することにより細胞残
渣を溶液から除去する。５mg／ml 臭化エチジウム溶液
約１mlとＣｓＣｌ約２８.６gを上清約３０mlに加える。
次いで、その体積を水で４０mlに調節し、その溶液を超
遠心管中にデカントする。この超遠心管を封印し、溶液
をＴｉ７０ローター(ヘ゛ックマン,7360N.リンカーンアヘ゛ニュー,リンカーンウ
ット゛,IL60646)中、４９５００rpmで約１８時間遠心分離
する。得られたプラスミドバンドを紫外線で可視化し、
単離し、ＣｓＣｌ飽和イソプロパノールで抽出すること
により臭化エチジウムを除去し、約２０体積のＴＥ緩衝
液(１０mM トリス-塩酸(ｐＨ７.５)および１mM ＥＤＴ
Ａ)(３回交換)に対して透析する。透析液を集めた後、
エタノール２体積および３M 酢酸ナトリウム溶液０.０
５体積を加える。このエタノール混合物を−２０℃に冷
却し、ＳＳ３４ローター中１００００rpm、−１０℃で
３０分間遠心分離することによりプラスミドＤＮＡをペ
レット化する。得られたペレットをＴＥ緩衝液約１ml中
に再懸濁した後、等体積のフェノール：クロロホルム
(体積比１:１)混合物で抽出する。３M 酢酸ナトリウム
０.１体積およびエタノール２体積を添加した後、−２
０℃で約３０分間インキュベートし、ＳＳ３４ローター
中１５０００rpmで２０分間遠心分離することによっ
て、水層中のＤＮＡを回収する。得られたＤＮＡペレッ
トをまず７０％エタノールで濯ぎ、次に１００％エタノ
ールで濯いだ後、乾燥する。
【００６２】上記の操作によって得られたプラスミドｐ
ＨＳ１９０ ＤＮＡ約１.０mgを０.１ｘＴＥ緩衝液１.５
ml中に懸濁し、−２０℃で保存する。ＥcoＲＩ緩衝液
(１００mM トリス-塩酸(ｐＨ７.５)、５mM ＭｇＣｌ、
５０mM ＮａＣｌ)中のプラスミドｐＨＳ１９０約１０mg
を含む反応液中で、このＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩ(約
１０単位)で消化する。この反応液を３７℃で２時間イ
ンキュベートする。
ＨＳ１９０ ＤＮＡ約１.０mgを０.１ｘＴＥ緩衝液１.５
ml中に懸濁し、−２０℃で保存する。ＥcoＲＩ緩衝液
(１００mM トリス-塩酸(ｐＨ７.５)、５mM ＭｇＣｌ、
５０mM ＮａＣｌ)中のプラスミドｐＨＳ１９０約１０mg
を含む反応液中で、このＤＮＡを制限酵素ＥcoＲＩ(約
１０単位)で消化する。この反応液を３７℃で２時間イ
ンキュベートする。
【００６３】５'-突出末端を平滑末端に変換するため
に、それぞれ０.５mMのｄＮＴＰ(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ＴＴＰ)をクレノー断片(ヘ゛ーリンカ゛ーマンハイムハ゛イオケミカル
ス゛,7941キャッスルウェイト゛ライフ゛,インテ゛アナホ゜リス,IN46250)１〜５単
位と共に加える。この反応液を３０℃で１５分間インキ
ュベートした後、７５℃１０分間の処理によって酵素を
失活させる。この反応混合物をフェノール、フェノール
／クロロホルム、クロロホルムで抽出した後、エタノー
ル沈殿させる。
に、それぞれ０.５mMのｄＮＴＰ(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ＴＴＰ)をクレノー断片(ヘ゛ーリンカ゛ーマンハイムハ゛イオケミカル
ス゛,7941キャッスルウェイト゛ライフ゛,インテ゛アナホ゜リス,IN46250)１〜５単
位と共に加える。この反応液を３０℃で１５分間インキ
ュベートした後、７５℃１０分間の処理によって酵素を
失活させる。この反応混合物をフェノール、フェノール
／クロロホルム、クロロホルムで抽出した後、エタノー
ル沈殿させる。
【００６４】次にこのプラスミドを、４０mM トリス-塩
酸(ｐＨ７.５)、１０mM ＭｇＣｌ、１０mM ジチオスレ
イトール(ＤＴＴ)、０.５mM アデノシン三リン酸、およ
びＴ４ ＤＮＡリガーゼ(ヘ゛ーリンカ゛ーマンハイムハ゛イオケミカルス゛,7941
キャスルウェイト゛ライフ゛,インテ゛アナホ゜リス,IN46250)１単位を含有する
溶液５０ｍｌ中に再懸濁する。この反応液を１４℃で終
夜インキュベートする。
酸(ｐＨ７.５)、１０mM ＭｇＣｌ、１０mM ジチオスレ
イトール(ＤＴＴ)、０.５mM アデノシン三リン酸、およ
びＴ４ ＤＮＡリガーゼ(ヘ゛ーリンカ゛ーマンハイムハ゛イオケミカルス゛,7941
キャスルウェイト゛ライフ゛,インテ゛アナホ゜リス,IN46250)１単位を含有する
溶液５０ｍｌ中に再懸濁する。この反応液を１４℃で終
夜インキュベートする。
【００６５】連結したこの混合物を用い、マニアティス
等,モレキュラークローニング,250-251頁(コールト゛スフ゜リンク゛
ハーハ゛ーフ゜レス,1982)の方法に従うことによって、大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８(NRRLからNRRL B-15624として入手可能)
を形質転換した。５００mlフラスコ中のＴＹブロス１０
０mlにＲＶ３０８の終夜培養物１mlを植菌した。この細
胞を３７℃で激しく振盪しながら、密度が約５ｘ１０細
胞／mlになるまで生育させた。この培養物を氷上に１０
分間置いた後、４０００ｘｇ４℃で５分間遠心分離し
た。この細胞を、氷冷した１０mM トリス-塩酸(ｐＨ８.
０)中の５０mM CaCl ５０ml中に再懸濁した。この細胞
を再度氷上で１５分間インキュベートし、再度遠心分離
した。次にこの細胞を、この塩化カルシウム溶液３.３
ｍｌ中に再懸濁した。上記の連結(ライゲーション)混合
物を細胞２００ｍｌに加え、氷上で３０分間インキュベ
ートした。次にこの細胞を４２℃の水浴に２分間移し
た。このチューブにＴＹブロス１mlを加え、その細胞を
３０℃で１時間インキュベートした。次に、５mg／mlテ
トラサイクリンを含有するＴＹ寒天(ＴＹブロス＋１.５
％寒天)プレート上に２００μｌを植菌し、３０℃で終
夜生育させた。
等,モレキュラークローニング,250-251頁(コールト゛スフ゜リンク゛
ハーハ゛ーフ゜レス,1982)の方法に従うことによって、大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８(NRRLからNRRL B-15624として入手可能)
を形質転換した。５００mlフラスコ中のＴＹブロス１０
０mlにＲＶ３０８の終夜培養物１mlを植菌した。この細
胞を３７℃で激しく振盪しながら、密度が約５ｘ１０細
胞／mlになるまで生育させた。この培養物を氷上に１０
分間置いた後、４０００ｘｇ４℃で５分間遠心分離し
た。この細胞を、氷冷した１０mM トリス-塩酸(ｐＨ８.
０)中の５０mM CaCl ５０ml中に再懸濁した。この細胞
を再度氷上で１５分間インキュベートし、再度遠心分離
した。次にこの細胞を、この塩化カルシウム溶液３.３
ｍｌ中に再懸濁した。上記の連結(ライゲーション)混合
物を細胞２００ｍｌに加え、氷上で３０分間インキュベ
ートした。次にこの細胞を４２℃の水浴に２分間移し
た。このチューブにＴＹブロス１mlを加え、その細胞を
３０℃で１時間インキュベートした。次に、５mg／mlテ
トラサイクリンを含有するＴＹ寒天(ＴＹブロス＋１.５
％寒天)プレート上に２００μｌを植菌し、３０℃で終
夜生育させた。
【００６６】次にこのプラスミドを水１０ml中に再懸濁
する。このプラスミドをＸbaＩおよびＢamＨＩで消化す
ることによりベクターを作成する。プラスミドＤＮＡ１
０ml(約１０mg)および１０Ｘ ＸbaＩ緩衝液(５００mM
トリス-塩酸(ｐＨ８.０)、１００mM ＭｇＣｌ、５００m
M ＮａＣｌ)５mlにＸbaＩ約１ｍｌ(約１０単位)を加え
る。３７℃で９０分間インキュベートした後、５M Ｎａ
Ｃｌ ０.５mlとＢamＨI１ml(１０単位)を加え、インキ
ュベーションを３７℃でさらに９０分間続行する。次に
この反応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約
５.７５kbのＸbaＩ-ＢamＨＩベクター断片を電気溶出
し、エタノール沈殿によってこれを単離した。
する。このプラスミドをＸbaＩおよびＢamＨＩで消化す
ることによりベクターを作成する。プラスミドＤＮＡ１
０ml(約１０mg)および１０Ｘ ＸbaＩ緩衝液(５００mM
トリス-塩酸(ｐＨ８.０)、１００mM ＭｇＣｌ、５００m
M ＮａＣｌ)５mlにＸbaＩ約１ｍｌ(約１０単位)を加え
る。３７℃で９０分間インキュベートした後、５M Ｎａ
Ｃｌ ０.５mlとＢamＨI１ml(１０単位)を加え、インキ
ュベーションを３７℃でさらに９０分間続行する。次に
この反応混合物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約
５.７５kbのＸbaＩ-ＢamＨＩベクター断片を電気溶出
し、エタノール沈殿によってこれを単離した。
【００６７】次のＤＮＡ配列を、アプライドバイオシス
テムズモデル３８０Ｂ合成装置を用い、当業者によく知
られた技術で合成した。この配列をオリゴヌクレオチド
に分割し、次いでこれらのオリゴヌクレオチドを連結す
ることによって達成されるこの合成遺伝子の構築工程
を、実質的にブラウン等の方法(Brown等,Methods in En
zymology,68:109(1979))に従って行った。次のＤＮＡ配
列は、Ａ９＝Asn、Ａ１２＝Arg、Ａ１５＝Thr、Ａ２１
＝Arg、Ａ２２＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Leu、Ａ２
８＝Ser、Ａ３８＝Gln、Ａ３９＝Gly、Ａ４０＝Ala、Ａ
４２＝Valであり、Ｚが次の配列：
テムズモデル３８０Ｂ合成装置を用い、当業者によく知
られた技術で合成した。この配列をオリゴヌクレオチド
に分割し、次いでこれらのオリゴヌクレオチドを連結す
ることによって達成されるこの合成遺伝子の構築工程
を、実質的にブラウン等の方法(Brown等,Methods in En
zymology,68:109(1979))に従って行った。次のＤＮＡ配
列は、Ａ９＝Asn、Ａ１２＝Arg、Ａ１５＝Thr、Ａ２１
＝Arg、Ａ２２＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Leu、Ａ２
８＝Ser、Ａ３８＝Gln、Ａ３９＝Gly、Ａ４０＝Ala、Ａ
４２＝Valであり、Ｚが次の配列：
【化２０】 を表す本発明の好ましいポリペプチドをコードしてお
り、該配列のプラス鎖は次の配列：
り、該配列のプラス鎖は次の配列：
【化２１】 からなる。
【００６８】次にこのコード化配列からなるＤＮＡを、
上で構築したＸbaＩ-ＢamＨＩベクター断片と混合し、
これらを連結した。次に、連結したこの混合物で上述の
ように大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８を形質転換した。テト
ラサイクリン耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを制限
酵素消化で分析することにより、このプラスミドがｐＨ
Ｓ４５２であることを立証した。
上で構築したＸbaＩ-ＢamＨＩベクター断片と混合し、
これらを連結した。次に、連結したこの混合物で上述の
ように大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８を形質転換した。テト
ラサイクリン耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを制限
酵素消化で分析することにより、このプラスミドがｐＨ
Ｓ４５２であることを立証した。
【００６９】２.Ａ.２：Met1-ｂＧＲＦ(２-７６)ＯＨを
コードするプラスミドｐＨＳ５００の合成 ウシ由来の組換えＧＲＦペプチドを、上記の実施例２.
Ａ.１の教示に実質的に従って製造した。ただし、組換
えウシＧＲＦペプチドを生産するＤＮＡ配列は、Ａ９＝
Ser、Ａ１２＝Arg、Ａ１５＝Thr、Ａ２１＝Arg、Ａ２２
＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Leu、Ａ２８＝Asn、Ａ３
８＝Gln、Ａ３９＝Gly、Ａ４０＝Ala、Ａ４２＝Valであ
り、Ｚが次の配列：
コードするプラスミドｐＨＳ５００の合成 ウシ由来の組換えＧＲＦペプチドを、上記の実施例２.
Ａ.１の教示に実質的に従って製造した。ただし、組換
えウシＧＲＦペプチドを生産するＤＮＡ配列は、Ａ９＝
Ser、Ａ１２＝Arg、Ａ１５＝Thr、Ａ２１＝Arg、Ａ２２
＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Leu、Ａ２８＝Asn、Ａ３
８＝Gln、Ａ３９＝Gly、Ａ４０＝Ala、Ａ４２＝Valであ
り、Ｚが次の配列：
【化２２】 を表す本発明の好ましいポリペプチドをコードしてお
り、このＤＮＡ配列のプラス鎖配列は次の配列：
り、このＤＮＡ配列のプラス鎖配列は次の配列：
【化２３】 を有する。
【００７０】次にこのコード化配列からなるＤＮＡをＸ
baＩ-ＢamＨＩベクター断片と混合し、上記の実施例２.
Ａ.１に記述したようにこれらを連結した。次に、連結
したこの混合物で大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８を上述のよ
うに形質転換した。このｂＧＲＦ配列をコードしている
プラスミドをｐＨＳ５００と命名した。テトラサイクリ
ン耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを制限酵素消化で
分析することにより、このプラスミドがｐＨＳ５００で
あることを立証した。
baＩ-ＢamＨＩベクター断片と混合し、上記の実施例２.
Ａ.１に記述したようにこれらを連結した。次に、連結
したこの混合物で大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８を上述のよ
うに形質転換した。このｂＧＲＦ配列をコードしている
プラスミドをｐＨＳ５００と命名した。テトラサイクリ
ン耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを制限酵素消化で
分析することにより、このプラスミドがｐＨＳ５００で
あることを立証した。
【００７１】２.Ａ.３：Met1-ｈＧＲＦ(２-４６)ＯＨを
コードするＤＮＡの合成 ヒト由来の組換えＧＲＦペプチドを、上記の実施例２.
Ａ.１の教示に実質的に従って製造する。ただし、組換
えヒトＧＲＦペプチドを生産する際に好ましい本発明の
実施として、Ａ９＝Ser、Ａ１２＝Lys、Ａ１５＝Gly、
Ａ２１＝Lys、Ａ２２＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Me
t、Ａ２８＝Serであり、Ｙが次のアミノ酸配列：
コードするＤＮＡの合成 ヒト由来の組換えＧＲＦペプチドを、上記の実施例２.
Ａ.１の教示に実質的に従って製造する。ただし、組換
えヒトＧＲＦペプチドを生産する際に好ましい本発明の
実施として、Ａ９＝Ser、Ａ１２＝Lys、Ａ１５＝Gly、
Ａ２１＝Lys、Ａ２２＝Leu、Ａ２５＝Asp、Ａ２７＝Me
t、Ａ２８＝Serであり、Ｙが次のアミノ酸配列：
【化２４】 からなり、Ｚが０(零)である改変ｈＧＲＦペプチドを使
用し、このペプチドをコードするＤＮＡ配列のプラス鎖
配列は次の配列：
用し、このペプチドをコードするＤＮＡ配列のプラス鎖
配列は次の配列：
【化２５】 からなる。
【００７２】次にこのコード化配列からなるＤＮＡをＸ
baＩ-ＢamＨＩベクター断片と混合し、上記の実施例２.
Ａ.１に記述したようにこれらを連結する。次に、連結
したこの混合物で大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８を上述のよ
うに形質転換する。
baＩ-ＢamＨＩベクター断片と混合し、上記の実施例２.
Ａ.１に記述したようにこれらを連結する。次に、連結
したこの混合物で大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８を上述のよ
うに形質転換する。
【００７３】実施例２.Ｂ：組換えＧＲＦペプチドの単
離 ２.Ｂ.１ ：大腸菌におけるＧＲＦ類縁体の発現 大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＳ４５１を、５mg／ml
のテトラサイクリンを含むＴＹブロス中３２℃で、細胞
が対数期中期に達するまで生育させた。この混合物の温
度を４２℃に上げ、さらに約３時間インキュベーション
を続行した。プラスミドｐＨＳ４５１上でＧＲＦ類縁体
の発現を駆動するように位置するラムダｐＬプロモータ
ーのｃＩ８５７温度感受性リプレッサーは４２℃で不活
化し、したがってＧＲＦ類縁体の発現が可能になる。ｂ
ＧＲＦペプチドを、ｐＧＲＦについて上述した方法に実
質的に従い、ただしプラスミドｐＨＳ４５２の代わりに
ｐＨＳ５００を使用することによって発現させた。
離 ２.Ｂ.１ ：大腸菌におけるＧＲＦ類縁体の発現 大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨＳ４５１を、５mg／ml
のテトラサイクリンを含むＴＹブロス中３２℃で、細胞
が対数期中期に達するまで生育させた。この混合物の温
度を４２℃に上げ、さらに約３時間インキュベーション
を続行した。プラスミドｐＨＳ４５１上でＧＲＦ類縁体
の発現を駆動するように位置するラムダｐＬプロモータ
ーのｃＩ８５７温度感受性リプレッサーは４２℃で不活
化し、したがってＧＲＦ類縁体の発現が可能になる。ｂ
ＧＲＦペプチドを、ｐＧＲＦについて上述した方法に実
質的に従い、ただしプラスミドｐＨＳ４５２の代わりに
ｐＨＳ５００を使用することによって発現させた。
【００７４】２.Ｂ.２：ＧＲＦ類縁体を含有する顆粒の
単離 本明細書に例示した高レベル大腸菌発現系を用いる場
合、そのタンパク質産物は封入体(インクルージョンボ
ディー)または顆粒中に隔離される。ＧＲＦ類縁体を含
有する顆粒を単離し、可溶化することにより、目的のＧ
ＲＦペプチドを単離する。まず全細胞を遠心分離した
後、これを１０℃の水に再懸濁する。この細胞スラリー
をガウリン(Gaulin)ホモジナイザー中８０００psigでホ
モジナイズする。次に、ホモジナイズしたこのスラリー
を水で希釈し、１０分間撹拌した後、１０％水酸化ナト
リウムでｐＨを８.４〜８.６に調節する。次にこの混合
物を遠心分離する。その固体はＧＲＦ類縁体を含有する
顆粒であり、これを次に使用するまで−７０℃で凍結さ
せる。
単離 本明細書に例示した高レベル大腸菌発現系を用いる場
合、そのタンパク質産物は封入体(インクルージョンボ
ディー)または顆粒中に隔離される。ＧＲＦ類縁体を含
有する顆粒を単離し、可溶化することにより、目的のＧ
ＲＦペプチドを単離する。まず全細胞を遠心分離した
後、これを１０℃の水に再懸濁する。この細胞スラリー
をガウリン(Gaulin)ホモジナイザー中８０００psigでホ
モジナイズする。次に、ホモジナイズしたこのスラリー
を水で希釈し、１０分間撹拌した後、１０％水酸化ナト
リウムでｐＨを８.４〜８.６に調節する。次にこの混合
物を遠心分離する。その固体はＧＲＦ類縁体を含有する
顆粒であり、これを次に使用するまで−７０℃で凍結さ
せる。
【００７５】２.Ｂ.３：ＧＲＦ類縁体の最終的精製 上記の実施例２.Ｂ.２で調製した顆粒を２〜５℃で融解
する。１０体積の０.０５N 酢酸-７M 尿素を加えた後、
５〜８分間ホモジナイズすることによりこの顆粒を可溶
化する。次に、１０％塩酸を加えることによってｐＨを
２.５〜２.６に調節する。この混合物を２〜５℃で１２
〜１５時間撹拌する。この溶液を、ディカライトスピー
デックスフィルターエイド(Dicalite Speedex filter a
id)(ク゛レフコ,トランス,カリフォルニア(Grefco,Torrance,CA))で被覆
したスパークラーフィルター(Sparkler filter)を通し
て濾過することによって透明にする。この溶液を上記の
酢酸-尿素溶液で希釈することにより、この溶液の伝導
度を４０００mohm以下に下げる。
する。１０体積の０.０５N 酢酸-７M 尿素を加えた後、
５〜８分間ホモジナイズすることによりこの顆粒を可溶
化する。次に、１０％塩酸を加えることによってｐＨを
２.５〜２.６に調節する。この混合物を２〜５℃で１２
〜１５時間撹拌する。この溶液を、ディカライトスピー
デックスフィルターエイド(Dicalite Speedex filter a
id)(ク゛レフコ,トランス,カリフォルニア(Grefco,Torrance,CA))で被覆
したスパークラーフィルター(Sparkler filter)を通し
て濾過することによって透明にする。この溶液を上記の
酢酸-尿素溶液で希釈することにより、この溶液の伝導
度を４０００mohm以下に下げる。
【００７６】ＳセファロースR(ファルマシア,800センテニアルアヘ゛ニュ
ー,ヒ゜スカタウェイ,NJ08854)樹脂を用いてカチオン交換カラム
を調製する。このカラムには物質５０gあたり１ｌの樹
脂を入れる。物質をこのカラムに流速０.１ｌ／cm／時
間で添加し、これを上記の酢酸-尿素溶液中の０.１M 塩
化ナトリウム２カラム体積で洗浄する。酢酸-尿素中の
塩化ナトリウムの０.２５Mから１.６Mへの直線的勾配
(３カラム体積)でＧＲＦ類縁体を溶出させ、各０.１カ
ラム体積の分画を集める。ＧＲＦ類縁体を含有する分画
を、伝導度、Ｏ.Ｄ.276、ＨＰＬＣおよびポリアクリル
アミドゲル電気泳動で同定する。次にこれらの分画を合
わせる。
ー,ヒ゜スカタウェイ,NJ08854)樹脂を用いてカチオン交換カラム
を調製する。このカラムには物質５０gあたり１ｌの樹
脂を入れる。物質をこのカラムに流速０.１ｌ／cm／時
間で添加し、これを上記の酢酸-尿素溶液中の０.１M 塩
化ナトリウム２カラム体積で洗浄する。酢酸-尿素中の
塩化ナトリウムの０.２５Mから１.６Mへの直線的勾配
(３カラム体積)でＧＲＦ類縁体を溶出させ、各０.１カ
ラム体積の分画を集める。ＧＲＦ類縁体を含有する分画
を、伝導度、Ｏ.Ｄ.276、ＨＰＬＣおよびポリアクリル
アミドゲル電気泳動で同定する。次にこれらの分画を合
わせる。
【００７７】合わせた分画に等体積の酢酸-尿素溶液を
加える。次にこの物質を、樹脂１ｌあたりに５０ｇのタ
ンパク質を付加するように量を決定した酢酸-尿素中の
ＳセファロースR樹脂のカラムにかける。流速を０.０２
ｌ／cm2／時間とする。酢酸-尿素中の塩化ナトリウムの
０.２５Mから１.２Mへの直線的勾配で、ＧＲＦ類縁体分
画を溶出させる。各０.１カラム体積の分画を集める。
上述と同様に各分画を分析し、ＧＲＦ類縁体を含有する
分画を合わせる。
加える。次にこの物質を、樹脂１ｌあたりに５０ｇのタ
ンパク質を付加するように量を決定した酢酸-尿素中の
ＳセファロースR樹脂のカラムにかける。流速を０.０２
ｌ／cm2／時間とする。酢酸-尿素中の塩化ナトリウムの
０.２５Mから１.２Mへの直線的勾配で、ＧＲＦ類縁体分
画を溶出させる。各０.１カラム体積の分画を集める。
上述と同様に各分画を分析し、ＧＲＦ類縁体を含有する
分画を合わせる。
【００７８】上で合わせた分画の体積の５倍のカラム体
積を持つセファデックスR Ｇ-１５(ファルマシア)カラ
ムを、０.０２M グリシン(ｐＨ２.５)中に調製する。
Ｏ.Ｄ.276ピークを含む分画を単離する。
積を持つセファデックスR Ｇ-１５(ファルマシア)カラ
ムを、０.０２M グリシン(ｐＨ２.５)中に調製する。
Ｏ.Ｄ.276ピークを含む分画を単離する。
【００７９】次に、１０％アセトニトリル-０.０２M グ
リシン(ｐＨ２.５)中のＳＰ２０ＳＳ樹脂(セファビーズ
R,ミツビシケミカル,トーキョー)を含むカラムを調製す
る。合わせたＧＲＦ類縁体含有溶液をアセトニトリル中
に１０％濃度にし、これを流速１.５〜２カラム体積／
時間で上記カラムに添加する。このカラムを上記のアセ
トニトリル-グリシン緩衝液２カラム体積で洗浄する。
３カラム体積の１０％アセトニトリル-０.０２M グリシ
ンを３カラム体積の５０％アセトニトリル-０.０２M グ
リシンと混合することによって形成した勾配でＧＲＦ類
縁体を溶出させる。各０.１カラム体積の分画を集め、
ＧＲＦ類縁体について検定する。
リシン(ｐＨ２.５)中のＳＰ２０ＳＳ樹脂(セファビーズ
R,ミツビシケミカル,トーキョー)を含むカラムを調製す
る。合わせたＧＲＦ類縁体含有溶液をアセトニトリル中
に１０％濃度にし、これを流速１.５〜２カラム体積／
時間で上記カラムに添加する。このカラムを上記のアセ
トニトリル-グリシン緩衝液２カラム体積で洗浄する。
３カラム体積の１０％アセトニトリル-０.０２M グリシ
ンを３カラム体積の５０％アセトニトリル-０.０２M グ
リシンと混合することによって形成した勾配でＧＲＦ類
縁体を溶出させる。各０.１カラム体積の分画を集め、
ＧＲＦ類縁体について検定する。
【００８０】次にこのＧＲＦ類縁体含有物質を、０.２
５M 酢酸で平衡化したセファデックスR Ｇ-１５カラム
クロマトグラフィーにかける。次にＯ.Ｄ.276ピークを
単離し、次に使用するまで凍結乾燥する。
５M 酢酸で平衡化したセファデックスR Ｇ-１５カラム
クロマトグラフィーにかける。次にＯ.Ｄ.276ピークを
単離し、次に使用するまで凍結乾燥する。
【００８１】実施例３：ヒプロイル-１-ｐＧＲＦ(２-７
６)ＯＨの製造 ベンゾイルグリシン(トランスワールト゛ケミカルス゛(Transworld Chem
icals)から市販されている)３.５８gをＤＭＦ約２０ml
に、氷浴中で冷却し撹拌しながら溶解した。この溶液に
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド２.５gを加え、次にジシ
クロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)４.５gを加えた。
この反応液を室温に温めながら終夜撹拌した。
６)ＯＨの製造 ベンゾイルグリシン(トランスワールト゛ケミカルス゛(Transworld Chem
icals)から市販されている)３.５８gをＤＭＦ約２０ml
に、氷浴中で冷却し撹拌しながら溶解した。この溶液に
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド２.５gを加え、次にジシ
クロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)４.５gを加えた。
この反応液を室温に温めながら終夜撹拌した。
【００８２】この反応によって生成した不溶性のジシク
ロヘキシル尿素(ＤＣＵ)を濾過によって除去し、そのＤ
ＭＦ濾液を減圧下で濃縮した。その残渣を塩化メチレン
で希釈した。生成した沈殿を濾過し、減圧下で乾燥する
ことによりスクシンイミジルヒプロエート(馬尿酸エス
テル)３.７９gを得た。
ロヘキシル尿素(ＤＣＵ)を濾過によって除去し、そのＤ
ＭＦ濾液を減圧下で濃縮した。その残渣を塩化メチレン
で希釈した。生成した沈殿を濾過し、減圧下で乾燥する
ことによりスクシンイミジルヒプロエート(馬尿酸エス
テル)３.７９gを得た。
【００８３】上記の実施例２.Ａの教示に実質的に従っ
て製造したｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ約７２mgを０.１M ト
リス-塩酸(ｐＨ７.８)、３０％プロパノール３mlに室温
で撹拌しながら溶解した。この反応液に、スクシンイミ
ジルＮ-ベンゾイルグリシネート５７mgを加え、この反
応液を室温で撹拌し、反応の進行を追跡するために、ス
クシンイミジルＮ-ベンゾイルグリシネートの添加後１
５分、１時間、２時間に５μｌの試料を取り出した。こ
れらの試料のそれぞれを０.１％ ＴＦＡで５００μｌに
希釈し(０.１５〜０.２mg／ml)、ＲＰ-ＨＰＬＣ分析お
よび出発物質との比較のために０.４６ｘ１５cmブイダ
ック(Vydac)Ｃ１８カラムに注入した。
て製造したｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ約７２mgを０.１M ト
リス-塩酸(ｐＨ７.８)、３０％プロパノール３mlに室温
で撹拌しながら溶解した。この反応液に、スクシンイミ
ジルＮ-ベンゾイルグリシネート５７mgを加え、この反
応液を室温で撹拌し、反応の進行を追跡するために、ス
クシンイミジルＮ-ベンゾイルグリシネートの添加後１
５分、１時間、２時間に５μｌの試料を取り出した。こ
れらの試料のそれぞれを０.１％ ＴＦＡで５００μｌに
希釈し(０.１５〜０.２mg／ml)、ＲＰ-ＨＰＬＣ分析お
よび出発物質との比較のために０.４６ｘ１５cmブイダ
ック(Vydac)Ｃ１８カラムに注入した。
【００８４】２.５時間後、この反応混合物を氷酢酸約
１mlで酸性化し、これを２.２ｘ２８.５cmセファデック
スＧ-１０カラムにかけた。このカラムを１０％酢酸で
溶出させ、各７.５mlの分画を集めた。各分画のＡＢＳ
280を決定することによってペプチドの存在を確認し
た。ペプチドの存在を示した分画７〜１０を合わせ、凍
結し、凍結乾燥することにより凍結乾燥物７０mgを得
た。
１mlで酸性化し、これを２.２ｘ２８.５cmセファデック
スＧ-１０カラムにかけた。このカラムを１０％酢酸で
溶出させ、各７.５mlの分画を集めた。各分画のＡＢＳ
280を決定することによってペプチドの存在を確認し
た。ペプチドの存在を示した分画７〜１０を合わせ、凍
結し、凍結乾燥することにより凍結乾燥物７０mgを得
た。
【００８５】この試料約９mgを０.１％ ＴＦＡ １.０ml
に溶解した。この溶液を０.１mlずつ１０個に分け、こ
れらを凍結し、凍結乾燥した。この凍結乾燥物試料の１
つを高速原子衝撃質量分析(ＦＡＢ-ＭＳ)に使用した。
また別の試料をアミノ酸配列分析に使用した。
に溶解した。この溶液を０.１mlずつ１０個に分け、こ
れらを凍結し、凍結乾燥した。この凍結乾燥物試料の１
つを高速原子衝撃質量分析(ＦＡＢ-ＭＳ)に使用した。
また別の試料をアミノ酸配列分析に使用した。
【００８６】実施例４：ｐ-メチルヒプロイルｐＧＲＦ
(２-７６)ＯＨの製造 工程Ａ ：ｐ-メチルベンゾイルグリシンの合成 グリシン約７.５gを、２N ＮａＯＨ １０５mlおよびジ
オキサン５０mlからなる溶液に機械的に撹拌しながら０
〜５℃で溶解した。p-トルオイルクロリド約１４.９ml
をジオキサンで体積５０mlに希釈し、これを上記の反応
液に１５〜２０分間かけて滴下した。この反応混合物を
２５℃(即ち室温)に温めながら終夜撹拌した。
(２-７６)ＯＨの製造 工程Ａ ：ｐ-メチルベンゾイルグリシンの合成 グリシン約７.５gを、２N ＮａＯＨ １０５mlおよびジ
オキサン５０mlからなる溶液に機械的に撹拌しながら０
〜５℃で溶解した。p-トルオイルクロリド約１４.９ml
をジオキサンで体積５０mlに希釈し、これを上記の反応
液に１５〜２０分間かけて滴下した。この反応混合物を
２５℃(即ち室温)に温めながら終夜撹拌した。
【００８７】この反応液をＮａＯＨ水溶液で塩基性に
し、ジエチルエーテルで抽出した。その水層を６N ＨＣ
ｌでｐＨ３.０に酸性化した。この水層を酢酸エチルで
抽出し、その酢酸エチル層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で
乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮することによりほ
ぼ乾燥させた。この固体をジエチルエーテルに懸濁し、
濾過し、減圧下で乾燥することにより１４.２５gの物質
を得、後にこの物質がp-メチル馬尿酸であることがわか
った。融点測定と元素燃焼分析の結果がp-メチル馬尿酸
の理論値とよく一致することからこの生成物の同定を確
認した。上で生成した化合物の融点は１５１〜１５４℃
であった。元素燃焼分析の結果を次に記載する。
し、ジエチルエーテルで抽出した。その水層を６N ＨＣ
ｌでｐＨ３.０に酸性化した。この水層を酢酸エチルで
抽出し、その酢酸エチル層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で
乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮することによりほ
ぼ乾燥させた。この固体をジエチルエーテルに懸濁し、
濾過し、減圧下で乾燥することにより１４.２５gの物質
を得、後にこの物質がp-メチル馬尿酸であることがわか
った。融点測定と元素燃焼分析の結果がp-メチル馬尿酸
の理論値とよく一致することからこの生成物の同定を確
認した。上で生成した化合物の融点は１５１〜１５４℃
であった。元素燃焼分析の結果を次に記載する。
【００８８】工程Ｂ：ｐ-メチルヒプロイルｐＧＲＦ(２
-７６)ＯＨの合成 上記の実施例４工程Ａの教示に実質的に従って製造した
p-メチル馬尿酸 約１.６５gをジメチルホルムアミド(Ｄ
ＭＦ)１５mlに、氷浴中で冷却し撹拌しながら溶解し
た。Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド約１gをこの溶液に加
え、次でＤＣＣ１.９gを加えた。この反応液を室温(２
５℃)に温めながら終夜撹拌した。
-７６)ＯＨの合成 上記の実施例４工程Ａの教示に実質的に従って製造した
p-メチル馬尿酸 約１.６５gをジメチルホルムアミド(Ｄ
ＭＦ)１５mlに、氷浴中で冷却し撹拌しながら溶解し
た。Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド約１gをこの溶液に加
え、次でＤＣＣ１.９gを加えた。この反応液を室温(２
５℃)に温めながら終夜撹拌した。
【００８９】ＤＣＵ沈殿物を濾過によって除去し、その
濾液を減圧下で濃縮した。その油状残渣をジエチルエー
テルで希釈すると、結晶化がいくらか起こった。この固
体を濾過によって単離し、ジエチルエーテルで洗浄し、
減圧下で乾燥することにより、融点１６７〜１７０℃の
生成物３.２８gを得た。この物質を元素燃焼分析にかけ
たところ、その結果はp-メチル馬尿酸のスクシンイミジ
ルエステル(Ｃ14Ｈ14Ｎ2Ｏ5)に予期される理論値とよく
一致した。
濾液を減圧下で濃縮した。その油状残渣をジエチルエー
テルで希釈すると、結晶化がいくらか起こった。この固
体を濾過によって単離し、ジエチルエーテルで洗浄し、
減圧下で乾燥することにより、融点１６７〜１７０℃の
生成物３.２８gを得た。この物質を元素燃焼分析にかけ
たところ、その結果はp-メチル馬尿酸のスクシンイミジ
ルエステル(Ｃ14Ｈ14Ｎ2Ｏ5)に予期される理論値とよく
一致した。
【００９０】上記の実施例２.Ａの教示に実質的に従っ
て製造したｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ約７２mgを０.１M ト
リス-塩酸(ｐＨ７.８)、３０％プロパノール ３ｍｌに
室温で撹拌しながら溶解した。この反応液にp-メチル馬
尿酸のスクシンイミジルエステル５７mgを加え、その反
応液を室温で撹拌し、反応の進行を追跡するために、ス
クシンイミジルＮ-(p-メチル)馬尿酸の添加後１５分、
１時間および２時間に各５μｌに試料を取り出した。こ
れらの試料のそれぞれを０.１％ＴＦＡで５００ｍｌに
希釈し、これをＲＰ-ＨＰＬＣ分析および出発物質との
比較のために０.４６ｘ１５cmブイダックＣ１８カラム
に注入した。
て製造したｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ約７２mgを０.１M ト
リス-塩酸(ｐＨ７.８)、３０％プロパノール ３ｍｌに
室温で撹拌しながら溶解した。この反応液にp-メチル馬
尿酸のスクシンイミジルエステル５７mgを加え、その反
応液を室温で撹拌し、反応の進行を追跡するために、ス
クシンイミジルＮ-(p-メチル)馬尿酸の添加後１５分、
１時間および２時間に各５μｌに試料を取り出した。こ
れらの試料のそれぞれを０.１％ＴＦＡで５００ｍｌに
希釈し、これをＲＰ-ＨＰＬＣ分析および出発物質との
比較のために０.４６ｘ１５cmブイダックＣ１８カラム
に注入した。
【００９１】２.５時間後、この反応混合物を氷酢酸約
１mlで酸性化し、これを２.２ｘ２８.５cmセファデック
スＧ-１０カラムにかけた。このカラムを１０％酢酸で
溶出させ、各７.５mlの分画を集めた。各分画のＡＢＳ
280を測定することによってポリペプチジル化合物の存
在を確認した。ポリペプチドの存在を示した分画７〜１
０を合わせ、凍結し、凍結乾燥することによって凍結乾
燥物７０mgを得た。
１mlで酸性化し、これを２.２ｘ２８.５cmセファデック
スＧ-１０カラムにかけた。このカラムを１０％酢酸で
溶出させ、各７.５mlの分画を集めた。各分画のＡＢＳ
280を測定することによってポリペプチジル化合物の存
在を確認した。ポリペプチドの存在を示した分画７〜１
０を合わせ、凍結し、凍結乾燥することによって凍結乾
燥物７０mgを得た。
【００９２】実施例５：p-クロロヒプロイルｂＧＲＦ
(２-７７)ＯＨの製造 このp-クロロヒプロイルＧＲＦ誘導体を、工程Ａにおい
てp-トルオイルクロリドをp-クロロベンゾイルクロリド
に変更し、ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ＧＲＦペプチドを実
施例１の教示(固相法)に実質的に従って製造する点以外
は上記の実施例４の教示に実質的に従って製造する。
(２-７７)ＯＨの製造 このp-クロロヒプロイルＧＲＦ誘導体を、工程Ａにおい
てp-トルオイルクロリドをp-クロロベンゾイルクロリド
に変更し、ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ＧＲＦペプチドを実
施例１の教示(固相法)に実質的に従って製造する点以外
は上記の実施例４の教示に実質的に従って製造する。
【００９３】実施例６：ｐ-ニトロヒプロイルｂＧＲＦ
(２-７７)ＯＨの製造 このp-ニトロヒプロイルＧＲＦ誘導体を、工程Ａにおい
てp-トルオイルクロリドをp-ニトロベンゾイルクロリド
に変更し、ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ＧＲＦペプチドを実
施例１の教示(固相法)に実質的に従って製造する点以外
は上記の実施例４の教示に実質的に従って製造する。
(２-７７)ＯＨの製造 このp-ニトロヒプロイルＧＲＦ誘導体を、工程Ａにおい
てp-トルオイルクロリドをp-ニトロベンゾイルクロリド
に変更し、ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ＧＲＦペプチドを実
施例１の教示(固相法)に実質的に従って製造する点以外
は上記の実施例４の教示に実質的に従って製造する。
【００９４】実施例７：ｐ-ヒドロキシヒプロイルｂＧ
ＲＦ(２-７７)ＯＨの製造 このp-ヒドロキシヒプロイルＧＲＦ誘導体を、工程Ａに
おいてp-トルオイルクロリドをp-ヒドロキシベンゾイル
クロリドに変更し、ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ＧＲＦペプ
チドを実施例１の教示(固相法)に実質的に従って製造す
る点以外は上記の実施例４の教示に実質的に従って製造
する。
ＲＦ(２-７７)ＯＨの製造 このp-ヒドロキシヒプロイルＧＲＦ誘導体を、工程Ａに
おいてp-トルオイルクロリドをp-ヒドロキシベンゾイル
クロリドに変更し、ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ＧＲＦペプ
チドを実施例１の教示(固相法)に実質的に従って製造す
る点以外は上記の実施例４の教示に実質的に従って製造
する。
【００９５】実施例８：ｐ-フルオロヒプロイルｂＧＲ
Ｆ(２-７７)ＯＨの製造 このp-フルオロヒプロイルＧＲＦ誘導体を、工程Ａにお
いてp-トルオイルクロリドをp-フルオロベンゾイルクロ
リドに変更し、ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ＧＲＦペプチド
を実施例１の教示(固相法)に実質的に従って製造する点
以外は上記の実施例４の教示に実質的に従って製造す
る。
Ｆ(２-７７)ＯＨの製造 このp-フルオロヒプロイルＧＲＦ誘導体を、工程Ａにお
いてp-トルオイルクロリドをp-フルオロベンゾイルクロ
リドに変更し、ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨ ＧＲＦペプチド
を実施例１の教示(固相法)に実質的に従って製造する点
以外は上記の実施例４の教示に実質的に従って製造す
る。
【００９６】実施例９：Ｎ-フェニルマロンアミンドイ
ル-１-ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨの製造 アニリン約９.１ml(０.１mol)を塩化メチレン１００ｍ
ｌに２５℃で機械的に撹拌しながら溶解した。この溶液
にＫ2ＣＯ3１５.１gを加えた後、塩化メチレン２０ml中
のエチルマロニルクロリド１４mlを滴下した。この反応
液を２５℃で３〜４時間撹拌し、約７２時間反応を進行
させた。
ル-１-ｂＧＲＦ(２-７７)ＯＨの製造 アニリン約９.１ml(０.１mol)を塩化メチレン１００ｍ
ｌに２５℃で機械的に撹拌しながら溶解した。この溶液
にＫ2ＣＯ3１５.１gを加えた後、塩化メチレン２０ml中
のエチルマロニルクロリド１４mlを滴下した。この反応
液を２５℃で３〜４時間撹拌し、約７２時間反応を進行
させた。
【００９７】この反応液を水／塩化メチレン約５００ml
で希釈した。この混合物を振盪し、その塩化メチレン層
を分離し、まず塩酸水溶液で洗浄し、次いで水で洗浄
し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、その濾液の溶媒を留
去することにより油状物１４.５ｇを得た。
で希釈した。この混合物を振盪し、その塩化メチレン層
を分離し、まず塩酸水溶液で洗浄し、次いで水で洗浄
し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、その濾液の溶媒を留
去することにより油状物１４.５ｇを得た。
【００９８】上で製造したエチルＮ-フェニルマロンア
ミド約１４gをジオキサン２５mlおよび１N ＮａＯＨ ７
５mlに溶解した。この反応液を２５℃で約３時間撹拌し
た。
ミド約１４gをジオキサン２５mlおよび１N ＮａＯＨ ７
５mlに溶解した。この反応液を２５℃で約３時間撹拌し
た。
【００９９】この反応液を、塩基性を維持したままジエ
チルエーテルで抽出した。その水層を６N ＨＣｌで酸性
化し、酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。こ
の酢酸エチル濾液を蒸発乾固した。この固体をジエチル
エーテルでトリチュレートし、濾過し、減圧下で乾燥す
ることにより５.１gの生成物を得た。この生成物を元素
燃焼分析および1Ｈ-ＮＭＲで分析した。その結果、この
生成物がＮ-フェニルマロンアミド酸（Ｎ-フェニルマロ
ン酸モノアミド）であることがわかった。
チルエーテルで抽出した。その水層を６N ＨＣｌで酸性
化し、酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。こ
の酢酸エチル濾液を蒸発乾固した。この固体をジエチル
エーテルでトリチュレートし、濾過し、減圧下で乾燥す
ることにより５.１gの生成物を得た。この生成物を元素
燃焼分析および1Ｈ-ＮＭＲで分析した。その結果、この
生成物がＮ-フェニルマロンアミド酸（Ｎ-フェニルマロ
ン酸モノアミド）であることがわかった。
【０１００】このＮ-フェニルマロンアミド酸をＨＯＢ
Ｔエステル経由でｂＧＲＦ(２-７７)-樹脂にカップリン
グさせた。
Ｔエステル経由でｂＧＲＦ(２-７７)-樹脂にカップリン
グさせた。
【０１０１】実施例１０:Ｎ-フェニルマロンアミンドイ
ル-１-ｐＧＲＦ(２-７７)ＯＨの製造 上記の実施例９の教示に実質的に従って製造したＮ-フ
ェニルマロンアミド酸３.５８gをＤＭＦ約２０mlに、氷
浴中で冷却し撹拌しながら溶解した。この溶液にＮ-ヒ
ドロキシスルシンイミド２.５gを加えた後、ジシクロヘ
キシルカルボジイミド(ＤＣＣ)４.５gを加えた。この反
応液を室温に温めながら終夜撹拌した。
ル-１-ｐＧＲＦ(２-７７)ＯＨの製造 上記の実施例９の教示に実質的に従って製造したＮ-フ
ェニルマロンアミド酸３.５８gをＤＭＦ約２０mlに、氷
浴中で冷却し撹拌しながら溶解した。この溶液にＮ-ヒ
ドロキシスルシンイミド２.５gを加えた後、ジシクロヘ
キシルカルボジイミド(ＤＣＣ)４.５gを加えた。この反
応液を室温に温めながら終夜撹拌した。
【０１０２】ＤＣＵを濾過し、そのＤＭＦ濾液を減圧下
で濃縮した。その残渣をジエチルエーテルで希釈した。
生成した沈殿を濾過し、減圧下で乾燥することによりＮ
-フェニルマロンアミド酸のスクシンイミジルエステル
３.７９gを得た。
で濃縮した。その残渣をジエチルエーテルで希釈した。
生成した沈殿を濾過し、減圧下で乾燥することによりＮ
-フェニルマロンアミド酸のスクシンイミジルエステル
３.７９gを得た。
【０１０３】上記の実施例２.Ａの教示に実質的に従っ
て製造したｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ約７２mgを０.１M ト
リス-塩酸(ｐＨ７.８)、３０％プロパノール３mlに室温
で撹拌しながら溶解した。この反応液に、上で製造した
Ｎ-フェニルマロンアミド酸のスクシンイミジルエステ
ル５７mgを加え、その反応液を室温で撹拌し、反応の進
行を追跡するために、Ｎ-フェニルマロンアミド酸のス
クシンイミジルエステルの添加後１５分、１時間および
２時間に各５μｌの試料を取り出した。これらの試料の
それぞれを０.１％ＴＦＡで５００μｌに希釈し(０.１
５〜０.２mg／ml)、ＲＰ-ＨＰＬＣ分析および出発物質
との比較のために、これを０.４６ｘ１５cmブイダック
Ｃ１８カラムに注入した。
て製造したｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ約７２mgを０.１M ト
リス-塩酸(ｐＨ７.８)、３０％プロパノール３mlに室温
で撹拌しながら溶解した。この反応液に、上で製造した
Ｎ-フェニルマロンアミド酸のスクシンイミジルエステ
ル５７mgを加え、その反応液を室温で撹拌し、反応の進
行を追跡するために、Ｎ-フェニルマロンアミド酸のス
クシンイミジルエステルの添加後１５分、１時間および
２時間に各５μｌの試料を取り出した。これらの試料の
それぞれを０.１％ＴＦＡで５００μｌに希釈し(０.１
５〜０.２mg／ml)、ＲＰ-ＨＰＬＣ分析および出発物質
との比較のために、これを０.４６ｘ１５cmブイダック
Ｃ１８カラムに注入した。
【０１０４】２.５時間後、この反応混合物を氷酢酸約
１ｍｌで酸性化し、これを２.２ｘ２８.５cmセファデッ
クスＧ-１０カラムにかけた。このカラムを１０％酢酸
で溶出させ、各７.５mlの分画を集めた。各分画のＡＢ
Ｓ280を測定することによりポリペプチジル化合物の存
在を確認した。ポリペプチドの存在を示した分画７〜１
０を合わせ、凍結し、凍結乾燥することによって凍結乾
燥物７０mgを得た。
１ｍｌで酸性化し、これを２.２ｘ２８.５cmセファデッ
クスＧ-１０カラムにかけた。このカラムを１０％酢酸
で溶出させ、各７.５mlの分画を集めた。各分画のＡＢ
Ｓ280を測定することによりポリペプチジル化合物の存
在を確認した。ポリペプチドの存在を示した分画７〜１
０を合わせ、凍結し、凍結乾燥することによって凍結乾
燥物７０mgを得た。
【０１０５】実施例１１：ｐ−メチルヒプロイルｐＧＲ
Ｆ(２-７６)ＯＨの製剤化 Ｎａ2ＨＰＯ4１.３８gおよびＰＳＡ１.０gを発熱物質を
含まない水に溶解し、最終体積を１ｌ、ｐＨを約５.１
に調節することにより担体溶液を調製した。上記の実施
例４.Ｂの教示に実質的に従って製造したp-メチルヒプ
ロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ２７.４mgを、この担体
溶液６４mlに加えることにより、最終濃度３６０ミリ当
量／mlにした。
Ｆ(２-７６)ＯＨの製剤化 Ｎａ2ＨＰＯ4１.３８gおよびＰＳＡ１.０gを発熱物質を
含まない水に溶解し、最終体積を１ｌ、ｐＨを約５.１
に調節することにより担体溶液を調製した。上記の実施
例４.Ｂの教示に実質的に従って製造したp-メチルヒプ
ロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ ２７.４mgを、この担体
溶液６４mlに加えることにより、最終濃度３６０ミリ当
量／mlにした。
【０１０６】実施例１２：去勢ブタに毎日３回皮下もし
くは静脈内注射した場合のp-メチルヒプロイルｐＧＲＦ
(２-７６)ＯＨのインビボ効果 大腿深静脈中に外科的に挿入した内在カテーテルを有す
る平均約７２kgの雑種の去勢ブタ２０頭を使用して、p-
メチルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨの効果を測定
した。上記の実施例１１の教示に実質的に従ってp-メチ
ルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨの製剤を調製し、
これを毎日３回１０.０μｇ／ｋｇ／注射の割合で静脈
内(Ｉ.Ｖ.)または皮下(Ｓ.Ｑ.)に注射した。これらの去
勢ブタに、１日あたり２０００gの１８.５％粗タンパク
質トウモロコシ-大豆飼料を、２つに等分して午前８時
および午後４時に与えた。これらのブタに午前８時、午
後４時、および午後１２時に注射した。５日間の対照期
間１、３日間の処置期間４、および処置停止後の３日間
２に、尿の尿素窒素排出データを集めた。処置第１２日
の２４時間中に３０の血液血清試料を集めた。この血清
試料をＧＨ、ＢＵＮ、グルコース、インスリン、ＦＦＡ
およびトリグリセリド類について検定した。この検定結
果の平均値を次の表４に示す。
くは静脈内注射した場合のp-メチルヒプロイルｐＧＲＦ
(２-７６)ＯＨのインビボ効果 大腿深静脈中に外科的に挿入した内在カテーテルを有す
る平均約７２kgの雑種の去勢ブタ２０頭を使用して、p-
メチルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨの効果を測定
した。上記の実施例１１の教示に実質的に従ってp-メチ
ルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨの製剤を調製し、
これを毎日３回１０.０μｇ／ｋｇ／注射の割合で静脈
内(Ｉ.Ｖ.)または皮下(Ｓ.Ｑ.)に注射した。これらの去
勢ブタに、１日あたり２０００gの１８.５％粗タンパク
質トウモロコシ-大豆飼料を、２つに等分して午前８時
および午後４時に与えた。これらのブタに午前８時、午
後４時、および午後１２時に注射した。５日間の対照期
間１、３日間の処置期間４、および処置停止後の３日間
２に、尿の尿素窒素排出データを集めた。処置第１２日
の２４時間中に３０の血液血清試料を集めた。この血清
試料をＧＨ、ＢＵＮ、グルコース、インスリン、ＦＦＡ
およびトリグリセリド類について検定した。この検定結
果の平均値を次の表４に示す。
【表４】 処置 レヘ゛ル 尿素 GH BUN ク゛ルコース FFA トリク゛リセリト゛ インスリン μg/kg/d g/日 ng/ml mg/dl mg/dl μM/la mg/dla μu/ml 対照 IV 0 27.5a 2.5a 15.8a 95.4a 55.8a 23.8a 20.8a 処置 IV 30 16.3b 9.9b 7.0b 132.7b 97.3b 35.3b 76.8b 対照 SQ 0 28.0a 2.1a 15.5a 101.4a 55.9a 24.3a 22.8a 処置 SQ 30 16.4b 8.9b 7.5b 147.3b 97.5b 32.5ab 112.9c 注) 処置：p-メチルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ
をそれぞれの投与経路で毎日３回注射した。 対照：対照去勢ブタには毎日３回担体溶液(リン酸緩衝
液)をそれぞれの投与経路で注射した。 (ａ,ｂ)：同じ添え文字を付した同カラム内のものの平
均値は相違しないＰ＜０.０５,スチューデント-ニュー
マン-ケウルス。 ＧＨ：成長ホルモンレベル。
をそれぞれの投与経路で毎日３回注射した。 対照：対照去勢ブタには毎日３回担体溶液(リン酸緩衝
液)をそれぞれの投与経路で注射した。 (ａ,ｂ)：同じ添え文字を付した同カラム内のものの平
均値は相違しないＰ＜０.０５,スチューデント-ニュー
マン-ケウルス。 ＧＨ：成長ホルモンレベル。
【０１０７】これらのデータは、p-メチルヒプロイルｐ
ＧＲＦ(２-７６)ＯＨを毎日３回３０.０μｇ／kg／日の
割合で注射した場合、尿の尿素窒素排出の減少(４１％)
および血清ＢＵＮレベルの減少(５４％)によって示され
るように、この化合物が極めて同化促進性であったこと
を立証している。p-メチルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７
６)ＯＨの注射は、血清ＧＨレベルを４倍増大させ(図４
参照)、これには血清グルコース、インスリン、ＦＦ
Ａ、およびトリグリセリド類レベルの増大が伴ってい
た。静脈内注射した去勢ブタより皮下注射した去勢ブタ
の方がより大きい血清インスリンレベル増大が認められ
たことを除いて、投与法による血清応答の相違はないよ
うに思われた。皮下注射した去勢ブタの場合、尿の尿素
窒素排出の低下(図５参照)は、処置を停止した後２〜３
日間持続した。
ＧＲＦ(２-７６)ＯＨを毎日３回３０.０μｇ／kg／日の
割合で注射した場合、尿の尿素窒素排出の減少(４１％)
および血清ＢＵＮレベルの減少(５４％)によって示され
るように、この化合物が極めて同化促進性であったこと
を立証している。p-メチルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７
６)ＯＨの注射は、血清ＧＨレベルを４倍増大させ(図４
参照)、これには血清グルコース、インスリン、ＦＦ
Ａ、およびトリグリセリド類レベルの増大が伴ってい
た。静脈内注射した去勢ブタより皮下注射した去勢ブタ
の方がより大きい血清インスリンレベル増大が認められ
たことを除いて、投与法による血清応答の相違はないよ
うに思われた。皮下注射した去勢ブタの場合、尿の尿素
窒素排出の低下(図５参照)は、処置を停止した後２〜３
日間持続した。
【図１】 プラスミドｐＨＳ１９０の制限部位および機
能地図。
能地図。
【図２】 プラスミドｐＨＳ５００の制限部位および機
能地図。
能地図。
【図３】 プラスミドｐＨＳ４５２の制限部位および機
能地図。
能地図。
【図４】 p-メチルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ
を投与することによって達成された去勢ブタにおける成
長ホルモンレベル上昇を示す図。
を投与することによって達成された去勢ブタにおける成
長ホルモンレベル上昇を示す図。
【図５】 p-メチルヒプロイルｐＧＲＦ(２-７６)ＯＨ
の投与に対して応答する去勢ブタの尿の尿素窒素レベル
排出に対する効果を示す図。
の投与に対して応答する去勢ブタの尿の尿素窒素レベル
排出に対する効果を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 マーク・ルイス・ヘイマン アメリカ合衆国46250インディアナ州イン ディアナポリス、スーザン・ドライブ・イ ースト5740番 (72)発明者 ジェイムズ・エドウィン・シールズ アメリカ合衆国46060インディアナ州ノー ブルズビル、グラッシー・ブランチ・ロー ド17808番 (72)発明者 デイビッド・リー・スマイリー アメリカ合衆国46140インディアナ州グリ ーンフィールド、イースト・200・サウ ス・ロード6468番 (72)発明者 デイビッド・アイラ・ウィッキザー アメリカ合衆国46219インディアナ州イン ディアナポリス、ラムフォード・ロード 8140番
Claims (15)
- 【請求項１】 次式： 【化１】 ［式中、Ａ９はSer、Ala、Leu、ThrまたはAsnを表し；
Ａ１２はArgまたはLysを表し；Ａ１５はGly、Ala、Thr
またはLeuを表し；Ａ２１はArgまたはLysを表し；Ａ２
２はAlaまたはLeuを表し；Ａ２５はAspまたはGluを表
し；Ａ２７はMet、Ser、Arg、Leuまたはノルロイシンを
表し；Ａ２８はSerまたはAsnを表し；Ｙは０を表すか、
もしくは１〜１５アミノ酸からなるペプチドを表し；Ｚ
は０を表すか、もしくは１〜３２アミノ酸からなるペプ
チドを表し；Ｔは、式：-ＣＯＯＲa，-ＣＲaＯ、-ＣＯ
ＮＨＮＨＲa，-ＣＯＮ(Ｒa)(Ｒb)、またはＣＨ2ＯＲ
a(ＲaおよびＲbは独立に低級アルキル、水素、Hse(ラク
トン)、HseＯＨまたはHseＮ(Ｒc)(Ｒd)(ＲCおよびＲdは
独立に水素または低級アルキルを表す)を表す)で表され
るカルボキシル末端基を表し；Ｘ１は次式： 【化２】 （式中、Ｒ1は水素、メチル、エチル、ヒドロキシエチ
ル、フェニルを表すか、あるいはハロ、低級アルキル、
低級アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アセト
アミド、トリフルオロメチル、-ＣＨ2-ＯＨ、またはス
ルファミドで置換された置換フェニルを表すか、あるい
は１または複数のＮ、Ｏ、またはＳを含有する５または
６員複素環を表してもよく；ａは０、１、２、または３
を表し；ｂは０または１を表し；ｃは０または１を表
し；ｄは０ないし１２を表し；Ａは０(零)を表すか、も
しくはＯまたはＳを表し；Ｂはカルボニル、スルホニル
またはスルフィニルを表し；Ｒ2は水素、ＣＨ3、ＣＨ2
ＯＨ、ｐ-ヒドロキシベンジル、または-(ＣＨ2)e-ＣＯ-
Ｒ3（ｅは０ないし５を表し、Ｒ3はメチル、エチル、ヒ
ドロキシエチル、アミノ、ヒドロキシル、フェニルを表
すか、もしくはハロ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキ
シ、ニトロ、アミノ、アセトアミド、またはスルファミ
ドで置換されたフェニルを表すか、もしくは１または複
数のＮ、Ｏ、またはＳを含有する５または６員複素環を
表してもよい）を表す）；で表されるアシル基を表す］
で表される化合物および医薬的に許容されるその非毒性
塩。 - 【請求項２】 ａが０を表し、ｂが１を表し、Ｂがカル
ボニルを表し、ｃが０を表し、ｄが０を表し、Ａが０を
表す請求項１の化合物。 - 【請求項３】 Ｒ1が、メチル、フェニル、p-ニトロフ
ェニル、p-クロロフェニル、p-フルオロフェニル、p-ヒ
ドロキシフェニル、p-メチルフェニル、Ｎ-ベンジル(イ
ソニコチニル)からなる群から選択される請求項２の化
合物。 - 【請求項４】 Ｒ2が、Ｈ、ＣＨ3、またはＣＨ2ＯＨか
らなる群から選択される請求項３の化合物。 - 【請求項５】 Ｒ2がＨを表す請求項３の化合物。
- 【請求項６】 Ａ９がAsnを表し、Ａ１２がArgを表し、
Ａ１５がThrを表し、Ａ２１がArgを表し、Ａ２２がLeu
を表し、Ａ２５がAspを表し、Ａ２７がLeuを表し、Ａ２
８がSerを表す請求項１から請求項５までのいずれかの
化合物。 - 【請求項７】 Ｙが次のアミノ酸配列： 【化３】 を有するペプチドまたはその機能性誘導体からなる請求
項１から請求項６までのいずれかの化合物。 - 【請求項８】 Ｚが次のアミノ酸配列： 【化４】 またはその機能性誘導体からなる請求項１から請求項７
までのいずれかの化合物。 - 【請求項９】 Ａ９がSerを表し、Ａ１２がArgを表し、
Ａ１５がThrを表し、Ａ２１がArgを表し、Ａ２２がLeu
を表し、Ａ２５がAspを表し、Ａ２８がAsnを表す請求項
１から請求項５までのいずれかの化合物。 - 【請求項１０】 Ｙが次のアミノ酸配列： 【化５】 またはその機能性誘導体からなる請求項９の化合物。
- 【請求項１１】 Ｚが次のアミノ酸配列： 【化６】 からなる請求項１０の化合物。
- 【請求項１２】 Ａ９がSerを表し、Ａ１２がLysを表
し、Ａ１５がGlyを表し、Ａ２１がLysを表し、Ａ２２が
Leuを表し、Ａ２５がAspを表し、Ａ２７がMetを表し、
Ａ２８がSerを表す請求項１から請求項５までのいずれ
かの化合物。 - 【請求項１３】 Ｙが次のアミノ酸配列： 【化７】 またはその機能性誘導体からなる請求項１２の化合物。
- 【請求項１４】 Ｚが０(零)を表す請求項１３の化合物
- 【請求項１５】 請求項１から請求項１４までのいずれ
かの化合物を活性成分とする医薬製剤。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US69209091A | 1991-04-26 | 1991-04-26 | |
| US692090 | 1991-04-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05279388A true JPH05279388A (ja) | 1993-10-26 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4106569A Pending JPH05279388A (ja) | 1991-04-26 | 1992-04-24 | 超活性ｇｒｆ類縁体 |
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|---|---|
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| JP (1) | JPH05279388A (ja) |
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| US4626523A (en) * | 1983-09-13 | 1986-12-02 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs II |
| US4528190A (en) * | 1983-10-25 | 1985-07-09 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs IV |
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