KR100247668B1 - 안정적이고 생물학적으로 활성인 변형된 소마토트로핀 - Google Patents
안정적이고 생물학적으로 활성인 변형된 소마토트로핀 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 소형-루프 시스테인이 기타 아미노산으로 변화되거나 모두 결실된 안정적이고 생물활성적인 재조합 소형-루프 변형된 소마토트로핀 및 이와 같이 소형-루프 변형된 소마토트로핀 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이와 같은 소형-루프 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열, 상기 서열을 함유하는 플라스미드 및 이들 플라스미드를 함유하는 유기체를 제공한다. 또한, 소형-루프 변형된 소마토트로핀을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 사용하는 방법이 기술되어 있다.
Description
[발명의 명칭]
안정적이고 생물학적으로 활성인 변형된 소마토트로핀
[발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 소마토트로핀, 특히 안정적이고 생물학적으로 활성적이며 재조합적으로 변형된 소마토트로핀, 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열, 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 및 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열로 형질전환된 미생물에 관한 것이다. 추가로, 신규한 DNA 서열, 플라스미드 및 미생물 작제 방법이 기술되어 있다. 변형된 소마토트로핀을 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적 조성물을 사용하는 방법 또한 기술되어 있다.
[발명의 배경]
소마토트로핀의 분리, 정제 및 이의 특성은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 성장 호르몬으로 언급되기도 하는 단백질인 소마토트로핀은 동물의 생존기간중 동물의 뇌하수체에서 생성된다. 소마토트로핀은 골격 성장, 질소 보유, 단백질 합성을 촉진하고 글루코스 및 지질 대사에 영향을 끼친다. 이에 따라, 소마토트로핀은 일반적인 동화성 제제로서 인지된다.
소마토트로핀은 절제된 뇌하수체 조직으로부터 분리될 수 있다[참조; Li, J. Biol. Chem., 211:55 (1954)]. 소마토트로핀은 또한 소마토트로핀 생산을 특정하는 재조합 DNA를 함유하는 유전자적으로 조작된 미생물로부터 수득할 수 있다[참조; Seeburg, et al., Nature, 276:795-798 (1978); Seeburg, et al., Nature, 270:486-494 (1978); Martial, Science, 205:602-607 (1979); 및 Seeburg, et al., DNA, 2:37-45 (1983)]. 실시예를 포함한 본 명세서 전반에 걸쳐, 명시된 문헌은 본원중 참조로서 인용되고 있다.
다양한 종으로부터의 소마토트로핀이 연구되어 특성화되었다. 예를 들면, 소의 소마토트로핀은 암소 뇌하수체 전엽에서 합성되어 이로부터 분비되는 것으로 공지되어 있다. 소의 천연 소마토트로핀의 뉴클레오타이드 암호화 서열 및 아미노산 서열이 문헌 [참조; Miller et al., J. Biol. Chem., 255:7521-24 (1980); and Wallis, FEBS Lett, 35:11-14 (1973)]중에 보고되어 있다. 소의 소마토트로핀이 또한 적절한 숙주에서 재조합 DNA 기술로 생산되었다[참조; Miller et al., J. Biol. Chem., 255:7521-24 (1980)]. 프라지어[Frazier]등의 미합중국 특허 제4,443,539호에는 재조합 DNA 방법을 이용하여 소 소마토트로핀 구조 유전자를 효모 세포내로 위치시켜 소 소마토트로핀을 제조하는 방법이 기술되어 있다. 헥트(Hecht)의 미합중국 특허 제4,371,462호에는 뇌하수체 전엽 펩타이드의 정제 방법이 기술되어 있다. 문헌[참조; 유럽 특허원 제83304574.3호(1983.8.8. 출원, 공개 번호 제103,395호); 제82304880.6호(1982.9.16. 출원, 공개 번호 제075,444호); 제81303824.7호(1981.8.21. 출원, 공개 번호 제047,600호); 및 영국 특허원 제2,073,245A호]에는 고도의 수율로 재조합 소 소마토트로핀을 생산하는 방법이 기술되어 있다. 소 소마토트로핀을 생산하는 이.콜라이 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 기탁번호 ATCC 31826, 31840, 31841, 31842 및 31843으로 입수가능하다.
유사하게, 천연 및 재조합 돼지 및 사람 소마토트로핀의 제조 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 문헌 이외에, 미합중국 특허 제4,604,359호는 사람 소마토트로핀의 미생물적 발현 방법을 기술하고; 미합중국 특허 제4,332,717호는 사람 소마토트로핀 정제 방법을 기술하며; 유럽 특허원 제83305717.7호(1983.9.26. 출원, 공개 번호 제104,920호)는 고도의 수율로 재조합 돼지 소마토트로핀을 생산하는 방법을 기술하고 있다. 미합중국 특허 제4,604,359호는 생물학적으로 활성인 테트라-S-카바미도메틸 유도체를 합성하는 방법을 포함하여 생물학적으로 활성인 사람 소마토트로핀을 합성하는 방법을 기술하고 있다. 다양한 소마토트로핀을 수득하기 위한 상기와 같은 많은 기타 문헌 및 방법은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 미합중국 특허 제4,645,755호에는 어류의 소마토트로핀 생산 방법이 기술되어 있다.
상이한 동물 종으로부터 분리한 소마토트로핀은, 펩타이드 쇄중에 존재하는 아미노산의 수 및 서열이 약간 상이한 상태의 고도의 상동성을 나타내는 아미노산서열을 갖는다. 예를 들면, 천연 사람 소마토트로핀(nhST)은 188개 아미노산으로부터 구성된 폴리펩타이드로, 이중 4개는 68, 162, 179 및 186 위치에 위치한 시스테인이다. 시스테인은 두개의 디설파이드 결합을 형성한다: (시스테인 결합) 하나는 아미노산 179와 186 사이 및 다른 하나는 아미노산 68과 162 사이. 아미노산 179와 186 사이의 아미노산 단편은 당해 분야에서 "소형 루프"로서 공지된 루프를 형성한다. "소형-루프" 및 "대형-루프"를 나타내는, 사람 소마토트로핀의 완전한 서열 및 구조가 본원에서 참조로서 인용된 미합중국 특허 제3,853,832호중에 제시되어 있다.
천연 돼지 소마토트로핀(nsST)은 특징적인 소형-루프 및 대형-루프를 형성하는 2개의 시스테인 결합을 갖는 190개 아미노산 폴리펩타이드이다. 소형 루프는 아미노산 180과 188 위치의 시스테인 사이에서 형성되고, 대형 루프는 아미노산 163과 52 사이에서 형성된다. 천연 소 소마토트로핀(nbST)은 또한 특징적인 소형-루프 및 대형-루프를 형성하는 2개의 시스테인 결합을 갖는 191개 아미노산 폴리펩타이드이다. 여기서, 소형 루프는 181과 189 위치의 시스테인 사이에 존재하고, 아미노산의 대형 루프는 53과 164 위치의 시스테인 사이에서 존재한다. 모든 천연 소마토트로핀은 상기한 소형 및 대형 루프를 지닌 특징적인 3차 구조를 갖는 것으로 나타난다. 재조합 또는 합성 소마토트로핀이 다양한 수 또는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 현재까지 모두 대형 및 소형 루프를 포함하는 것으로 보인다.
유럽 특허원 공개번호 제0 103 395호는 람다 PL프로모터(promoter)-오퍼레이터(operator) 조절하에 델타-9(Ser) 소 소마토트로핀(9개 N-말단 아미노산이 결여되고 N- 말단에 추가의 세린 잔기를 가짐)을 암호화하고 박테리오파지 mu(Pmu)로부터 유도된 샤인-달가노 영역을 갖는 제1플라스미드를 함유하는 이.콜라이 형질전환 균주의 작제에 대해 기술하고 있다. 상기 형질 전환체는, 온도-감응성 리프레서(repressor) 단백질 cI857의 생산을 암호화하는 제2플라스미드 pcI857을 함유한다. 이 플라스미드 및 수득된 단백질은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 리프레서 단백질은 약 37℃ 내지 42℃로 승온시 불활성화되어 델타-9(Ser) 소 소마토트로핀 발현이 유도된다. 이러한 유형의 형질전환 균주인 이.콜라이 HB101(PLmu-델타-9(Ser) 소 소마토트로핀 및 pcI857)은 메릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁번호 제53030호로 기탁되어 있다.
델타-7 돼지 소마토트로핀(첫번째 7개 N-말단 아미노산이 결여된 돼지 소마토트로핀)의 생산을 암호화하는 형질전환체 균주의 작제가 유럽 특허원 공개번호 제 0 104 920호에 기술되어 있다. △7-돼지 소마토트로핀을 생산할 수 있는 형질전환체 균주인 이.콜라이 HB101(PLmu-델타-7 돼지 소마토트로핀 및 pcI857)은 ATCC에 기탁번호 제53031호로 기탁되어 있다.
균주 53030 및 53031은 각각 델타-9(Ser) 소 소마토트로핀 및 델타-7 돼지 소마토트로핀의 다산성 생산자이다.
소마토트로핀 생산 방법이 널리 공지되어 있으나, 소마토트로핀 저장 방법은 널리 개발되지 않았다. 상기 기술로 생산된 소마토트로핀은 생산된 소마토트로핀을 실질적으로 사용하기전 장시간이 경과될 수 있으나 장시간 저장될 수 없다. 이와 같은 저장 기간중 소마토트로핀은 생물학적 불활성 이량체, 올리고머 및 불용성 응집체를 형성하는 경향이 있음이 공지되어 있다. 상기 생물학적 불활성 형태의 소마토트로핀은 사용하기에 유용한 소마토트로핀 양을 절감시키고 투여시, 특히 불용성 응집체가 무용의 침전체를 형성하는 경우 문제점을 야기할 수 있다.
따라서, 저장시 안정적이고 생물학적 활성을 유지하는 소마토트로핀이 요구되어진다. 이와 같은 소마토트로핀은 저장중에 생물학적 불활성 이량체, 올리고머 및 응집체 형성에 대한 내성이 있어야 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 생산 및 저장중에 생물-불활성 이량체, 올리고머 및 응집체 형성 경향이 없는 안정적이고 생물학적으로 활성인 변형된 소마토트로핀을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 이와 같은 소마토트로핀 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 저장중에 생물학적 불활성 이량체, 올리고머 또는 응집체 형성 경향이 없는 안정적이고 생물학적으로 활성인 변형된 소마토트로핀을 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 조성물은 장시간 저장 및 용이한 투여형 제제 및 투여에 적합해야 한다.
본 발명의 또다른 목적은 생산 및 저장중에 생물학적으로 불활성인 이량체, 올리고머 또는 응집체를 형성하지 않는 안정적이고 생물학적으로 활성인 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이러한 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 및 이러한 플라스미드로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
[발명의 요약]
본 발명은, 상응하는 천연 폴리펩타이드의 특징인 소형 루프가 결여된 상태의 재조합적으로 변형된 생물학적으로 활성인 소마토트로핀을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열, 이러한 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 및 이러한 플라스미드로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 상기 각각을 작제하는 방법 및 소형 루프가 결여된 소마토트로핀을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 변형된 생물학적 활성 소마토트로핀을 사용하여 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 돼지 소마토트로핀의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.
제2도는 델타 7 돼지 소마토트로핀(△7pST)의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.
제3도는 위치 173에 아스파라긴, 위치 181에 세린이 있는 △7pST의 아미노산 163 내지 183의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.
제4도는 위치 173 및 181에 알라닌이 있는 △7pST의 아미노산 163 내지 183의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.
제5a 및 5b도는 부위-지시된 돌연변이 유발 방법을 나타낸다.
제6도는 △7pST DNA에 어닐링된 아스파라긴(173) 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
제7도는 본 발명에 따른 변형된 pST와 천연 pST의 일정 시일 후 잔류하는 단량체 %를 비교한다.
제8도는 조절된 방출 삽입물로부터 변형 및 천연 돼지 소마토트로핀의 방출 프로파일을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
[A. 정의]
본 원중 사용된 용어 "소마토트로핀"이란 단백질의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 형성된 "대형-루프"를 갖는 어떠한 소마토트로핀도 포괄하여, "천연 소마토트로핀" 뿐아니라 동물 또는 사람에게 투여하는 경우 천연 소마토트로핀의 생리학적 효과를 나타낼 수 있는 "합성 소마토트로핀" 및 "재조합 소마토트로핀"을 포함한다.
천연 소마토트로핀은 동물에 의해 생체내에서 생산되는 소마토트로핀으로 정의된다.
합성 소마토트로핀은 천연 소마토트로핀의 성장촉진 생리학적 효과를 나타내는 화학적으로 합성된 폴리펩타이드로서 정의된다.
재조합 소마토트로핀은 재조합 유전자 조작에 의해 생산되는 폴리펩타이드 서열로서, 천연 소마토트로핀의 성장촉진 효과를 나타낸다.
이러한 소마토트로핀은 천연 소마토트로핀의 아미노산 서열, 이와 실질적으로 유사한 아미노산 서열, 또는 이의 축약된 서열을 가질 수 있고, 치환되거나, 결실되거나, 연장되거나, 대체되거나 다른 방식으로 변형된 서열을 갖는 동족체 및 뮤테인(mutein)을 포함한다. 특히, 본원에 사용된 용어 "소마토트로핀"은 아미노 및/또는 카복시 말단으로부터 아미노산이 결실된, 천연 소마토트로핀과 동일한 서열의 재조합 단백질을 포함한다. 이와 같은 단백질의 예로는, 아미노 말단으로부터 각각 7개 및 4개 잔기가 결실된 델타-7 재조합 돼지 소마토트로핀 및 델타-4 재조합 소 소마토트로핀을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "소형-루프 변형된 소마토트로핀"이란, 상기한 바와 같이, 대형-루프는 갖지만 소형-루프는 갖지 않는 "소마토트로핀"을 기술한다. 소형-루프를 형성하는 설프하이드릴 그룹을 제공하는 시스테인이 다른 아미노산으로 대체되어 필요한 시스틴, 또는 디설파이드 결합의 형성을 방지하기 때문에 소형 루프가 존재하지 않는다. 소형-루프 변형된 소마토트로핀은, 일반적으로 천연 소마토트로핀에서 소형-루프 형성과 관련된 시스테인이 다른 아미노산으로 대체된다는 점을 제외하고 비-변형된 "소마토트로핀"과 아미노산 서열에 있어 동일할 수 있다.
[B. 설명]
유전자 조작된 돼지 소마토트로핀의 3차 구조가 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조; Abdel-Meguid, et al., "Three-dimensional Structure of a Genetically Engineered Variant of Porcine Growth Hormone" Proc. Natl. Acad., U.S.A., 84: 6434-6437 (1987)]중에 설명되어 있다.
본 발명은 소형-루프 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열을 제공한다. 바람직한 소마토트로핀 유형은 돼지, 소 또는 사람 소마토트로핀이다. 특히 델타 7 돼지 소마토트로핀 (△7pST)이 바람직한 소마토트로핀이다. △7이란 폴리펩타이드 N-말단으로부터 7개 아미노산이 결실되었음을 의미한다. 상기 기술한 바와 같이, △7pST를 생산할 수 있는 유기체는 메릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수가능하다.
본 발명의 DNA 서열은 화학적 합성법 또는 재조합 기술을 포함한 어떠한 적합한 방법으로도 제조될 수 있다. 특히 바람직한 기술은 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조; Kunkel et al., Methods in Enzymology, 154:367-382 (1987)]중에 기술된 부위-지시된 돌연변이 유발 기술이다. 부위-지시된 돌연변이 유발시, 변화될 아미노산을 암호화하는 코돈의 양측 염기에 상보성인 서열을 갖는 소형 올리고뉴클레오타이드가 단백질을 암호화하는 일본쇄 DNA에 어닐링된다. 비-상보성 3-염기쌍 서열은 변화될 아미노산을 암호화는 코돈 반대쪽에 위치하게 되고 이하 "치환 부위"로 언급된다. 통상적으로, 올리고뉴클레오타이드 서열은 15 내지 30개 염기 길이일 수 있다. 보다 긴 올리고뉴클레오타이드는 염기 사이의 정확하게 배향된 수소 결합수의 증가로 인해 짧은 올리고뉴클레오타이드보다 안정하다. 치환 부위의 각각의 측면에 동수의 상보성 염기를 갖는 것이 바람직하다. 치환될 아미노산을 암호화하는 코돈을 올리고뉴클레오타이드내로 삽입하여 모 일본쇄 DNA에 어닐링한다. 변화된 아미노산을 치환하게 될 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 일본쇄 DNA에 어닐링한 후, 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라, DNA 폴리머라제, 이후 T4 리가제로 처리하여 이본쇄 DNA 분자를 제조한다. 바람직한 위치에 아미노산 치환이 이루어진 단백질을 암호화하는 DNA 쇄 선별은 컨켈(Kunkel)등의 방법에 따라 수행한다. 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화를 반복하여 폴리펩타이드 서열중 특정 아미노산을 더욱 치환시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 이의 3차 구조에 소형-루프를 갖는 소마토트로핀을 생성시키는 디설파이드 브릿지를 형성케하는 시스테인은 컨켈등의 기술을 사용하여 기타 아미노산으로 치환될 수 있다. 생성된 소형-루프 변형된 소마토트로핀은 천연 소마토트로핀에서 형성되는 소형 루프를 야기할 수 있는 시스테인은 갖지 않지만 생물학적 활성은 천연 소마토트로핀과 비견할만 한다.
소형-루프 변형된 소마토트로핀 유전자 발현으로 소형 루프 시스테인과 분자간 시스테인 결합을 형성할 수 없는 소마토트로핀이 생산된다. 이에 따라, 이량체, 올리고머 및 응집체 형성이 소마토트로핀 저장중 상당히 감소된다. 또한, 투여용량당 고도의 생물학적 활성이 수득된다.
제4도에 도시된 바와 같이 본 발명의 하나의 양태에 있어서, △7pST를 암호화하는 DNA 서열은 펩타이드 서열의 위치 173 및 181에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 알라닌 암호화 코돈으로 대체하여 변형시킨다. 이론을 고수하고자 함을 아니지만, 상기 위치에서 일반적으로 발견되는 시스테인 대신, 보다 큰 측쇄를 갖는 기타 아미노산과 달리 알라닌 같은 아미노산을 도입시키면 생성된 분자는 입체적 뒤틀림이 덜하게 되리라고 간주된다. 당해 분야의 숙련가는 이와 같은 기능을 또한 수행하는 글리신, 발린, 류신 또는 알라닌을 포함한 기타 아미노산 치환체를 용이하게 결정할 수 있다.
제3도에 도시된 바와 같은 본 발명의 또다른 양태에 있어, △7pST를 암호화하는 DNA 서열을 아미노산 서열중 위치 173 및 181 각각에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 위치 173에서는 아스파라긴을, 위치 181에서는 세린을 암호화하는 뉴클레오타이드로 대체하여 변형시킨다. 다시, 이론을 고수하고자 함은 아니지만, 아스파라긴의 아미드 그룹과 세린의 하이드록실 그룹 사이의 수소 결합이 분자간 결합을 방지하면서 소마토트로핀의 3차 구조를 보존하는 것으로 간주된다. 기타 적합한 아미노산 치환체는 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있으며 본 발명의 영역내에 포함하고자 한다.
부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 본 발명의 변형된 DNA를 제조하기 위하여, 출발 소마토트로핀 DNA 서열을 수득한다. 이러한 DNA 서열을 수득하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 일반적으로, 목적하는 소마토트로핀 유전자를 적합한 공급원으로부터 수득하여 적절한 벡터내로 서브클로닝한다. 적절한 벡터는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고 M13과 같은 파지를 포함한다. 파지는, 이.콜라이의 dut_ung_이중 돌연변이 균주인 RZ1032 또는 CJ236 균주와 같은 돌연변이 세균내에서 생장시킨다. 이와 같은 세균은 세포간 dUTP를 고도의 수준으로 생성시키는 효소 dUTP아제 및 도입된 우라실을 DNA중에 보유케 하는 효소인 우라실 N-글리코실라제가 결여된 상태이다. 상기 유전자의 일본쇄를 분리하여 어닐링하고 목적하는 뉴클레오타이드 치환체를 함유하는 올리고뉴클레오타이드에 키나제 처리할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 복제 인자를 포함하여 서브클론의 파지 쇄에 존재하는 외래 DNA 쇄에 상응하는 서열에 상보성이다. 이 쇄는 사용된 특정 파지의 DNA 서열내로 사용된 특정 클로닝 부위 및 폴리링커를 위치시켜 결정할 수 있다. 이러한 결정은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 수행될 수 있고, 예를 들면 위스콘신 대학에서 입수 가능한 컴퓨터 데이타베이스(예: VECBASE)를 참조로 한다. 정확한 서열 결정후, 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 일본쇄 DNA에 어닐링한다. 어닐링된 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 T4DNA 폴리머라제를 사용하는 상보적 쇄 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. dUTP가 부재한 반응 혼합물중에서 상보성 쇄를 시험관 내에서 합성한다. 따라서, 상보성 쇄는 우라실을 함유하지 않게 된다. 전체적인 상보성 쇄를 합성한 후, 예를 들면, T4DNA 리가제에 의한 연결반응을 수행하여 이본쇄 유전자 작제를 완결한다. 그후, 예를 들어 우라실을 함유하지 않는 올리고뉴클레오타이드를 도입한 쇄에 유리한 선별압을 본원중 참조로서 인용된 컨켈등의 방법으로 적용한다.
적절한 변형물을 갖는 파지를 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 검출한다. 이러한 방법에는, 예를 들면, 제한 효소 지도법 또는 DNA 서열 측정을 포함한다.
본 발명의 플라스미드는 안정적이고 생물학적으로 활성인 소형-루프 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 및 프로모터-오퍼레이터 영역을 포함하여 소마토트로핀 유전자 발현에 필수 요소를 함유한다. 바람직한 플라스미드는 소형-루프 변형된 돼지, 소 또는 사람 소마토트로핀에 대한 DNA를 함유하는 것들이다. 이들중, 소형-루프 변형된 돼지 소마토트로핀에 대한 DNA를 함유하는 플라스미드가 특히 바람직하다.
미생물 세포, 특히 세균 세포는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 통상의 방법에 따라 소형-루프 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 목적하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드로 형질전환시킬 수 있다. HB101 세포가 특히 바람직하다. 미생물은 또한 소마토트로핀의 회수를 용이케하는 기타 플라스미드로 공형질전환시킬 수 있다. 이러한 기타 플라스미드에는 널리 공지된 온도-감응성 리프레서 단백질 암호화 유전자를 함유하는 플라스미드 pcI857을 포함한다. 이러한 기타 플라스미드는 본 발명의 일부를 구성하진 않는다.
본 발명의 재조합 세포를 배양하여 이들이 생산한 소마토트로핀을 회수한다. 배양 및 회수 기술 모두 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있고 본 발명의 일부를 구성하진 않는다.
회수된 본 발명의 소마토트로핀은 비-변형된 소마토트로핀의 생물학적 활성과 거의 동일하거나 보다 큰 생물학적 활성을 갖는다.
추가로, 본 발명의 소마토트로핀에서 분자간 시스틴 결합은 상당히 감소된다. 따라서, 본 발명의 소마토트로핀은 생물학적 활성 형태로 보유되어 장기간 저장중에 보다 안정해진다.
본 발명의 또다른 양태는 변형된 소마토트로핀이 희석제 또는 기타 비히클과 같은 허용가능한 담체와 혼합된 상태의 약제학적 조성물을 제공한다. 담체는 어떠한 생체 적합성, 소형-루프 변형된 소마토트로핀 적합성 담체, 바람직하게는 인산염 완충된 식염수, 트리스-HCl, 아르기닌, 히스티딘등일 수 있다. 통상적으로, pH 6 내지 11의 어떠한 생체 적합성 용액 또는 담체가 본 발명에 있어 소형-루프 변형된 소마토트로핀에 대한 담체로서 가능하다. 소형-루프 변형된 소마토트로핀을 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 장기간의 저장중에 안정하고 용이한 용량형 제제 및 투여를 허용하는 조성물을 형성한다. 조성물은 저장을 위해 동결건조함이 바람직하다.
소형-루프 변형된 소마토트로핀을 표적 대상에 투여하여, 천연 소마토트로핀과 필적하는 방식으로 표적물의 성장을 촉진시킨다. 표적물은 사람 또는 동물일 수 있다. 소마토트로핀 투여 기술은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 기술은 본 발명의 약제학적 조성물 투여에 적용 가능하다.
일반적으로 기술된 본 발명에서 하기 실시예는 발명의 특정 양태로서 제시되어 발명의 실행 및 잇점을 설명한다. 이들 실시예는 단지 예시적 목적이고 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 하기 실시예중 사용된 재조합 돼지 소마토트로핀(rpST)은 메릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁번호 제53031호로 기탁된 이.콜라이 미생물을 사용하여 생산된다. 상기 미생물에 대한 완전한 기술사항은 본원에 참조로서 인용된 미합중국 특허 제4,656,255호에 제시되어 있다.
[실시예]
1. 부위-지시된 올리고뉴클레오타이드 돌연변이 유발에 의한 시스테인 173 및 시스테인 181의 변형
a. 컴피턴트 JM103 세포의 제조
JM103 세포를 M9 배지 평판으로부터의 단일 콜로니로 밤새 37℃에서 배양한다. 가온된 LB 액체 배지 100ml를 JM103 밤샌 배양물 1ml로 접종시키고 O.D.650=0.2에 도달할 때까지 37℃에서 진탕배양한다. 그런 다음 배양물을 빙상에 20분 동안 놓고 10,000rpm으로 10분간 원심분리한다. 세포 펠렛을 보유하고 100mm MgCl250ml로 세척한다. 상기한 조건하에서 혼합물을 원심분리하고 상등액을 다시 버린다. 세포 펠렛을 100mM CaCl2/50mM MgCl250ml중에 1시간 동안 현탁시키고 상기한 바와 같이 펠렛화한다. 세포를 냉각된 100mM CaCl2/50mM MgCl2/30% 저장 용액 1ml중 현탁시키고 사용시까지 -80℃에서 0.2ml 분취량으로 저장한다.
b. M13RF 델타-7-pST DNA를 사용한 JM103 세포의 형질전환
저장된 JM103 세포의 3개의 0.2ml 분취량을 얼음통에서 서서히 해동시킨다. 공지된 방법에 따라 세포를 M13RF△ 7pST DNA 50ng으로 형질전환시킨다.
c. M13 주형내로 우라실 도입
형질전환된 세포의 무색 플라크를 평판으로부터 200μl 모세관 피펫으로 공동을 만들어(core) 균주 JM103의 접종물이 있는 YT 배지로 가한다. 이 배양물을 밤새 생장시키고 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포 및 세포 파편을 펠렛화된다. pST 유전자 함유 M13mp11pST 파지를 JM103 배양물로부터 분리하고 균주 RZ1032(dut_ung_)로 형질감염시킨다. 균주 RZ1032(dut_ung_) 내에서 파지를 생장시켜 우라실이 파지 DNA 내로 도입됨을 확인한다. 균주 RZ1032를 20㎍/ml 테트라사이클린 존재하에 생장시켜 앰버써프레서 표현형을 유지시킨다. 이 균주의 밤샌 배양물을 신선한 LB 액체 배지내로 접종하여 7 내지 8시간 생장시킨다. 10-6, 10-7및 10-8희석 적정된 파지 스톡을 상기 균주와 혼합하여 20분 동안 흡수시킨다. 그런 다음 파지를 함유하는 세포를 도말하고 분리된 플라크를 RZ1032 균주 파지 스톡을 위해 공동을 만든다.
부위-지시된 돌연변이 유발에 사용하기 위한 우라실 함유 파지 DNA를 분리하기 위하여, M13mp11pST 파지 균주를 함유하는 RZ1032 균주를 O.D. 500=0.08이 될때까지 LB 액체 배지 500ml 중에서 생장시킨다. 그런 다음, 우라실-함유 파지 스톡 0.5ml 및 최종 농도 0.25㎍/ml의 우리딘을 가한다. 수득한 혼합물을 37℃에서 진탕하며 6시간 배양한다. 세포를 펠렛화하고 NaCl 7.25g 및 PEG8000 12.5g을 상등액에 가한다. 상등액을 빙상에 1시간 둔 다음 10,000rpm으로 20분간 원심분리하여 파지를 펠렛화된다. 그후, 파지를 CsCl 농도를 구배로 밴드화하고 TE 완충액에 대해 투석한다.
파지로부터의 일본쇄 DNA를 등용적의 페놀:클로로포름(1:1)을 가하여 추출하고, 볼텍싱한 후 원심분리하여 2개 상을 분리한다. 파지 DNA를 함유하는 수상을 페놀로 2회 재추출한 후 추가의 TE 완충액에 대해 투석한다.
부위-지시된 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드를 합성하여, 일리노이 우르바나 소재의 일리노이 대학 제네틱 엔지니어링 래보러토리(Genetic Engineering Laboratory)에서 HPLC 정제한다. 돌연변이유발성 올리고뉴클레오타이드는 변형된 코돈의 각각의 측면에 3개의 코돈이 위치되도록 작제한다. 먼저 21량체 올리고뉴클레오타이드 200pmol을 키나제 처리한다. 어닐링 반응을 위해 올리고뉴클레오타이드 대 주형의 몰비 30:1을 이용한다. 반응 혼합물을 70℃로 가열하고 반응물을 1℃/분의 속도로 30℃로 냉각시켜 어닐링을 수행한다. 냉각 후, Bio-Rad로부터 입수가능한 상보성쇄 합성 완충액, T4DNA 리가제 5단위, 유전자 32 단백질 2㎍(1단위), T4DNA 폴리머라제 1단위를 명시한 순서대로 튜브에 가한다. 반응 혼합물을 얼음 상에서 5분, 실온에서 5분, 이후 최종적으로 37℃의 수욕 중에서 90분간 넣어둔다. TE 완충액을 가해 반응을 중지시키고 JM103 균주 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용한다. 이들 형질전환된 세포를 대수적 생장기의 JM103 균주 배양물과 혼합하고 LB 상부 한천중에 도말한다. 플라크에 공동을 만들어 완충액중에 넣는다. 이와 같은 파지 스톡을 사용하여 JM103 배양물을 접종하고, 밤새 생장시켜 플라스미드 소규모 제조에 사용한다. 마니아티스(Maniatis)에 의해 기술된 알칼리 용해 방법을 플라스미드 소규모 제조물 분리에 사용한다. 정확한 돌연변이의 최초 확인은 제한 효소 분식을 이용하여 수행한다. 위치 173에서 시스테인 코돈의 아스파라긴 코돈으로의 변형은 추가의 MboII 제한 효소 부위를 생성시킨다. 이는 플라스미드 DNA의 제한 효소 분해에 의해 가시화된다. 이와 같은 첫번째 코돈 변화의 최초 확인 이후, 변형된 DNA를 RZ1032 균주내로 재형질전환하고, DNA를 분리한 후 2차 부위-지시된 돌연변이 유발을 수행하여 위치 181에서 시스테인 코돈을 세린 코돈으로 변형시킨다. 이러한 코돈 변형으로 PvuII 제한 효소 부위가 소실된다. 이 또한 플라스미드 DNA의 제한 효소 분해로 가시화된다. 이와 같은 변형의 결정적 확인은 DNA 서열측정으로 수행된다. 그런 다음 상기와 같은 돌연변이를 갖는 DNA를 pIC101 발현 벡터내에 도입한다. 돌연변이체 RF DNA와 플라스미드 pIC101 모두를 BstXI 및 BamH I으로 제한 효소 분해한다. 돌연변이된 영역을 포함하는 366bp BstX I 및 BamHI DNA 단편을 플라스미드 pIC101로 연결하여 야생형 영역을 대체시킨다. 이와 같이 asn(173) 및 Ser(181) 변형부를 함유하는 신규한 플라스미드를 pPM100으로 명명한다. 상기 플라스미드 pPM 100 및 플라스미드 pcI857을 함유하는 이.콜라이 HB101은 1990년 2월 14일자로 ATCC에 기탁번호 제68226호로 기탁되었다.
2. pST 유전자 변형의 입증
변형된 제한 효소 분석에 의해 잠정적 돌연변이체를 확인한 후, DNA 서열측정 분석으로 확인한다. 이용된 DNA 서열측정 방법은 Promega pGEM 시스템(Promega Biotec, 2800 S. Fish Hatchery Rd., Madison, WI 53711-5305)의 변형법으로서, 주형으로서 사용하기 위해 이본쇄 분자의 변성을 포함한다. 염화세슘 정제된 돌연변이체 RF DNA를 DNA 서열측정에 사용한다. 돌연변이된 영역으로부터 상부에 있는 DNA 영역과 상동성인 17량체 올리고뉴클레오타이드를 DNA 서열측정 프라이머로서 합성한다.
3. 단량체를 단백질의 회수
플라스미드 pPM100을 함유하는 세균 균주로부터의 돼지 소마토트로핀(pST) 회수는, 고분자량 단백질 대 단량체 비의 50% 정도의 상당한 감소 및 회수가능한 단백질 수율 증가에 의해 특징지을 수 있다. 수율에 있어서의 포지티브 효과 이외에 고분자량 단백질의 상기와 같은 감소는 또한 프로세싱을 용이하게 한다. 변형된 단백질을 비변형 단백질의 182% 정도로 회수된다. 돼지 소마토트로핀의 회수 및 정제는 본원에 참조로서 인용한 상기 로슈 및 멩(Rausch and Meng)에 의해 기술된 방법으로 수행한다.
변형된 pST는 용액중에 저장하는 동안 안정성이 증가된다. 다양한 완충액중 다양한 온도에서 용해되는 경우, 정제된 소마토트로핀은 용액중에서의 응집 및 분해에 대해 증가된 안정성 및 내성을 나타낸다. 비변형 단백질과 비교하여, 변형된 단백질은 7일후 용액중에 잔류하는 단량체성 pST 양에 있어 20% 정도의 증가를 나타낸다. 이들 데이타는 제7도에 도시된 바와 같이 변형된 pST 단백질의 증가된 안정성을 입증한다.
4. 변형된 단백질 생산의 입증
변형된 asn(173) ser(181) △7pST 10mg을 시아노겐 브로마이드로 분해하여 단백질내 메티오닌 잔기에서 단백질을 절단한다. 이는, 대형 루프의 감소 없이, 상이한 크기의 2개 펩타이드를 수득케한다. 소형 12개 아미노산 C-말단 펩타이드를 Beckman Spherogel TSK SW300 컬럼을 사용한 크기 배척 크로마토그래피에 의해 분리한다. 크기 배척 크로마토그래피에 있어 이동상은 1% 포름산이다. 크로마토 그래피에 의해 C-말단 펩타이드를 분리한 후, Applied Biosystems 477A 단백질 서열분석기를 사용하여 아미노산 서열에 대해 펩타이드를 특성화한다. 이 서열분석기를 제조업자의 지침에 따라 작동한다. 12개 아미노산 C-말단 펩타이드는 실험상 Lys-Asn-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-Ser-Ala-Phe으로 분석된다. 이 서열은 변형된 단백질에 대해 추정된 서열과 일치하고 173 위치의 시스테인이 아스파라긴으로, 181 위치의 시스테인이 세린으로 변화되었음을 입증한다.
5. 방사성수용체 검정
방사성수용체 검정(RRA)을 이용하여 pST 분자의 이의 세포 표면 수용체로의 결합을 직접적으로 측정한다. 이용된 방법은 문헌[참조; Tsushima and Friesen, Radioreceptor Assay for Growth Hormone, J. Clin. Endocrinol. Metab., 37:334-337 (1973)]에 기술된 방법의 변형법이다. 수태한 토끼 간 마이크로솜은 제라시모 등(Gerasimo et al. (1979))에 의해 현저히 증가된 소마토트로핀 결합 단백질을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 검정색 이들을 사용한다. 돼지 소마토트로핀에 대한 상기 검정의 최적화 및 특성화가 청 및 에테르톤(Chung and Etherton, 1986 )에 의해 기술되었다. 1mg/ml의 변형된 △7pST 샘플을 제조하여 I125로 표지화한다. 비변형된 연구소 표준 △7pST를 대조군으로서 사용하고 결합 활성을 평가한다. 데이타 분석을 위해 4-변주 기호 등식을 이용한다. 4개의 변수는 ALLFIT(Delean et al., 1977)를 사용하여 각각의 치환 커브에 대해 계산한다. 두 가지 각각의 검정에서 변형된 asn(173) ser(181) 7pST 분자는 대조군에 대해 190% 및 225%의 결합 특성을 나타낸다.
6. 단백질 안정성
L-아르기닌, 유리 염기(3부) 및 Destab 직접적으로 압착가능한 형태의 슈크로오스 (1부)를 갖는 변형된 △7pST 또는 △7pST(1중량부)의 조성물을 혼합하여 프레스(Key International single punch press)로 압착시켜 직경이 4mm인 펠렛 100mg을 수득한다. 3개 펠렛을, 한측 말단이 유리 비이드로 밀봉된 프리-컷트(pre-cut) 실리콘 튜빙내로 삽입한다. 미세다공성 폴리에틸렌 디스크를 다른쪽 말단내로 삽입한다. 이와 같은 삽입물을 10mM 인산염 완충 식염수 (pH: 7.4)내에 넣고 용액을 매일 교체하여 분석한다. FPLC에 의한 상기 용액의 분석은 pST를 함유하는 삽입물에서는 7일 후에 17%의 단량체성 단백질이 방출되었음을 나타내었다. 변형된 pST를 함유하는 제형은 동일한 기간중에 37%의 단량체를 방출하였다. 이와 같은 데이타는, 변형된 pST는 알칼리 조건하에서 응집을 감소시키고 방출되는 생물학적 활성 단백질의 양을 증가시킨다는 것을 나타내며, 이는 제8도에 설명되어 있다.
Claims (37)
- 하기 아미노산 서열로 이루어진 소형 루프 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열.
- 하기 아미노산 서열로 이루어진 △7 돼지 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열.
- 아미노산 서열중 소형-루프내에서 시스테인 결합 형성과 관련된 시스테인이 asn 및 ser으로 치환된 소마토트로핀.
- 제3항에 있어서, △7-돼지 소마토트로핀임을 특징으로 하는 소마토트로핀.
- 제1항의 DNA 서열로 암호화된 돼지 소마토트로핀.
- 제2항의 DNA 서열로 암호화된 △7-돼지 소마토트로핀.
- 제1항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
- 제2항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
- ATCC 기탁번호 제68226호의 플라스미드 pPM100.
- 제7항의 플라스미드로 형질전환된 세균.
- 제8항의 플라스미드로 형질전환된 세균.
- 제9항의 플라스미드로 형질전환된 세균.
- (a) 시스테인 결합을 형성하는 2개의 시스테인이 측면에 위치한 아미노산으로 이루어진 소형-루프를 포함한 3차 구조의 소마토트로핀을 암호화하는 돼지 소마토트로핀 유전자를 파지내로 서브클로닝하고, (b) 서브클로닝된 파지를, 우라실의 소마토트로핀 유전자 내로의 통합을 허용하는 돌연변이 숙주내에서 생장시키며, (c) 상기 우라실을 함유하는, 소마토트로핀 유전자로부터의 일본쇄 DNA를 파지로부터 분리하고, (d) 상기 DNA 상에서 부위-지시된 돌연변이 유발을 수행하여, 2개의 시스테인 중 하나에 대한 코돈을 asn에 대한 코돈으로, 나머지 시스테인에 대한 코돈을 ser에 대한 코돈으로 치환하고, (e) 세포를 상기의 돌연변이된 DNA로 형질전환시키며, (f) 상기 소마토트로핀을 발현시키고, (g) 소마토트로핀을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 안정적이고 생물학적으로 활성인 소형-루프 변형된 돼지 소마토트로핀을 생산하는 방법.
- 하기 아미노산 서열을 갖는 소형 루프 변형된 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열.
- 하기 아미노산 서열을 갖는 △7 돼지 소마토트로핀을 암호화하는 DNA 서열.
- 아미노산 서열중 소형-루프내에서 시스테인 결합 형성과 관련된 시스테인 asn 및 ser으로 치환된 소마토트로핀.
- 제16항에 있어서, △7-돼지 소마토트로핀임을 특징으로 하는 소마토트로핀.
- 제14항의 DNA 서열로 암호화된 돼지 소마토트로핀.
- 제15항의 DNA 서열로 암호화된 △7-돼지 소마토트로핀.
- 제14항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
- 제15항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 플라스미드.
- ATCC 기탁번호 제68226호의 플라스미드 pPM100.
- 제20항의 플라스미드로 형질전환된 재조합 유기체.
- 제21항의 플라스미드로 형질전환된 재조합 유기체.
- 제22항의 플라스미드로 형질전환된 재조합 유기체.
- 제23항에 있어서, 세균인 유기체.
- 제24항에 있어서, 세균인 유기체.
- 제25항에 있어서, 세균인 유기체.
- 소형-루프에서 시스테인 결합형성과 관련된 시스테인 대신 asn 및 ser을 갖는 돼지 소마토트로핀 및 이에 대한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 성장 촉진을 위한 안정적이고 생물학적으로 활성인 돼지 소마토트로핀의 약제학적 조성물.
- 제29항에 있어서, △7-돼지 소마토트로핀을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제29항에 있어서, 돼지 소마토트로핀 ans(180) ser(188)을 포함하는 조성물.
- 제30항에 있어서, △7-돼지 소마토트로핀 ans(173) ser(181)을 포함하는 조성물.
- (a) 시스테인 결합을 형성하는 2개의 시스테인이 측면에 위치한 아미노산으로 이루어진 소형-루프를 포함한 3차 구조의 소마토트로핀을 암호화하는 돼지 소마토트로핀 유전자를 파지내로 서브클로닝하고, (b) 서브클로닝된 파지를, 우라실의 소마토트로핀 유전자 내로의 통합을 허용하는 돌연변이 숙주내에서 생장시키며, (c) 상기 우라실을 함유하는, 소마토트로핀 유전자로부터의 일본쇄 DNA를 파지로부터 분리하고, (d) 상기 DNA 상에서 부위-지시된 돌연변이 유발을 수행하여, 2개 시스테인중 하나에 대한 코돈을 asn에 대한 코돈으로, 나머지 시스테인에 대한 코돈을 ser에 대한 코돈으로 치환하고, (e) 세포를 상기의 돌연변이된 DNA로 형질전환시키며, (f) 상기 소마토트로핀을 발현시키고, (g) 소마토트로핀을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 안정적이고 생물학적으로 활성인 소형-루프 변형된 돼지 소마토트로핀을 생산하는 방법.
- 제31항에 있어서, 동결건조된 조성물.
- 제32항에 있어서, 동결건조된 조성물.
- 성장 촉진량의 제31항의 조성물을 사람을 제외한 동물에게 투여함을 특징으로 하여, 사람을 제외한 동물의 성장을 촉진하는 방법.
- 성장 촉진량의 제32항의 조성물을 사람을 제외한 동물에게 투여함을 특징으로 하여, 사람을 제외한 동물의 성장을 촉진하는 방법.
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