JP3207416B2

JP3207416B2 - ソマトトロピン・アナログ類

Info

Publication number: JP3207416B2
Application number: JP50136890A
Authority: JP
Inventors: パーセルズ，アラン・ジェイ; モット，ジョン・イー; トミッチ，チェー―シェン・シィ
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1989-01-31
Filing date: 1989-12-11
Publication date: 2001-09-10
Anticipated expiration: 2016-09-10
Also published as: AU4663189A; JPH04503001A; WO1990008823A1; EP0456642A1; DK140491D0; CA2005502A1; AU620673B2; CA2005502C; DK140491A

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は動物ソマトトロピンのアナログに関する。よ
り詳細には、本発明はウシ・ソマトトロピン・アナログ
に関する。

発明の背景ソマトトロピンは元来、種々の動物種からの下垂体抽
出物中で発見された。一般に、ソマトトロピンは保存性
の分子であり、異なる動物種間にアミノ酸配列および構
造中の類似点が見いだされる。ウシ・ソマトトロピン
（すなわち成長ホルモン）がよく研究されている。パラ
ディニ・エイ・シー（Paladini,A.C.）らにより、文献
が論評されている（シー・アール・シー・クリティカル
・レビューズ・イン・バイオケミストリー（CRC Crit.
Rev.Biochem.）15:25〜56（1983））。

ウシ・ソマトトロピンを含めたソマトトロピンは、約
200個のアミノ酸の１本鎖からなり、２個の分子内ジス
ルフィド結合を有する球状タンパク質である。詳細に
は、天然ウシ・ソマトトロピン（bSt）の最も一般的な
形態は、190〜191のアミノ酸の１本鎖、２個の分子内ジ
スルフィド結合を有する球状構造および約22,000ダルト
ンの分子量を有する。

しかしながら、下垂体から抽出した天然bStは、不均
一なタンパク質混合物である。該タンパク質の少なくと
も６種の主要形態が記載されている。最長形態は191ア
ミノ酸残基およびala−pheアミノ末端を有する。２番目
の形態は190アミノ酸残基およびpheアミノ末端を有す
る。３番目の形態は187アミノ酸残基およびmetアミノ末
端を有する。bStの残りの３形態は、127位でロイシンが
バリンに変わっている。また、この不均一性に加え、ウ
シ・ソマトトロピンの明らかでない不均一性も記載され
ている（ハート・アイ・シー（Hart.I.C.）ら、バイオ
ケミカル・ジャーナル（Biochem J.）、218:573〜581
（1984）、ワレス・エム（Wallace M.）およびディク
ソン・エイチ・ビー・エフ（Dickson,H.B.F.）、バイオ
ケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）、100:593〜600
（1965））。天然の抽出物を陰イオン交換クロマトグラ
フィーにより分取した場合、明らかでない電気泳動にお
ける不均一さが見られる。これは、既知形態が、バイオ
アッセイにおいて異なる相対的効能を有することを示
す。また、bStの他の明らかでない種は、イオン交換カ
ラム上分取した場合、ラットの成長モデルにおいて種々
の程度の生物活性を示す（ハートら、およびワレスおよ
びディクソン前掲）。

明らかでない不均一性が、遺伝的変異性によるのか、
インビボの翻訳後修飾によるのか、リン酸化の違いによ
るのか（リバティ・ジェイ・ピー（Liberti,J.P.）ら、
バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケイションズ（Biochem.and Biophys.Res.C
omm.）128:713〜720、1985）、または単離時の人工的生
成物によるのか公知でない。

組換え微生物により生産するかまたは下垂体組織から
抽出したbStは商業上重要である。それは、乳牛の乳分
泌を増進し、肉牛の大きさおよび肉生産を増加させる。
商業上許容しうる生産向上をもたらすためには、１匹、
１日あたり20mgまで必要であると見積もられている。か
かる投与量のためには効率的な投与方法を必要とする。
本発明に記載のbStの効能における改良は、各動物に投
与する１日あたりの薬量を減らすことができるため有益
であろう。

さらに、組換え法により生産したタンパク質を回収す
る際の主要な問題の１つは、ジスルフィド結合を適切に
形成させることである。bStは天然の状態で２個のその
ようなジスルフィド架橋を有する。bStは成熟bStの53、
164、181および189のアミノ酸位置に４個のシステイン
残基を含有する。最初の２つは、いわゆる大ループを生
成するジスルフィド結合を形成し、一方、後の２つはbS
tの小ループを形成する。イー・コリ（E.coli）中で生
産される組換えウシ・ソマトトロピン（rbSt）タンパク
質は還元型であり、単離方法において、ジスルフィド架
橋を形成する酸化段階を要する。該タンパク質は還元し
うるダイマーおよびポリマーが形成されることが観察さ
れている。該ダイマーはラット・バイオアッセイにおい
て生物効果を減少させ、乳牛中において乳生産を減少さ
せることが示されている。また、該ダイマーbStは抗原
性でありうる。本発明は、特に、システイン181と189と
の間のジスルフィド架橋を除くことによりこれらの問題
を克服する。

情報の開示 bStのアナログは公知である（例えば、欧州特許出願7
5,444および103,395およびヌクリーク・アシッド・リサ
ーチ（Nucleic Acid Res.）10（20）:6487（1982））
を参照）。

ジー・ウィンター（G.Winter）およびエイ・アール・
フェアシュト（A.R.Fersht）は、キーとなる配列部のア
ミノ酸組成を変化させることによる酵素活性の改変につ
いて論評している（ティー・アイ・ビー・エス（TIB
S）、２、115頁（1984））。著者らはある酵素におい
て、酵素活性を保持したままシステインをセリン残基に
変えることについて言及している。

エル・グラフ（L.Graf）らは、システイン181とシス
テイン189との間のジスルフィド結合が緩和な条件下、
すなわち変性剤の不存在下で容易に開裂されることを示
した（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタ
イド・アンド・プロテイン・リサーチ（Int.J.Peptide
Prot.Res.）、７、467〜73頁（1975））。また、著者
らはラット脛骨試験における測定により、還元bStが成
長促進活性を保持することを報告している。この活性
は、生ずるチオール基をヨードアセトアミドのような無
電荷のアルキル化剤でブロックすることにより左右され
た。著者らは、アルキル化をヨード酢酸でなくヨードア
セトアミドで行った場合、成長促進活性の顕著な損失は
なかったことを示した。

エム・シュレヤー（M.Schleyer）らは、種々の技術に
より、生物活性を保持したままブタ成長ホルモンのジス
ルフィド架橋を開裂させる研究を記載した（ホッペ・ゼ
イラーズ・ザイチュリフト・フューア・フィシオロギシ
ェ・ケミー（Hoppe−Seyler's Ｚ Physiol.Chem.）36
4、291頁（1983））。

エム・シュレヤー（M.Schleyer）らは、生物活性を完
全に失うことなく、ヒト成長ホルモンのジスルフィド架
橋を開裂させることについて言及している（ホッペ・ゼ
イラーズ・ザイチュリフト・フューア・フィシオロギシ
ュ・ケミー（Hoppe−Seyler's Ｚ Physiol.Chem.）36
3、1111頁（1982））。

エイ・ワング（A.Wang）らは、インターロイキン２中
のシステイン残基のセリンによる置換および該変化が生
物学的活性に及ぼす効果について言及している（サイエ
ンス（Science）、224、1431頁（1984）、米国特許第4,
518,584号および英国特許出願2,130,219A）。３個のう
ち少なくとも２効能のシステインが十分な生物学的活性
には必要のようであった。

ピー・マンツァラ（P.Mantsala）およびエイチ・ザル
キン（H.Zalkin）は、グルタミンアミドトランスフェラ
ーゼ酵素中のシステインをフェニルアラニン残基で置換
することによる効果について言及している。この変化
は、グルタミンからアミドを活性化させる酵素機能をな
くさせた（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）、259、14230頁（1984））。

米国特許第3,264,186号は、ウシ成長ホルモンをメチ
オニンの箇所で制限的に開裂して活性なタンパク質を生
じることを記載している。

ティー・トクナゲ（T.Tokunage）らは、ヒト成長ホル
モン中で165位システインをアラニンに変えて、cys−53
とcys−165との間のジスルフィド結合を除去することに
ついて言及している。著者らは、下垂体摘出ラットの体
重増加を調べることにより、ala−165分子が完全な生物
活性を有することを見いだした（ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）、
153:445〜449（1985））。

発明の概要本発明は、bSt（cys→ser）において例示するよう
に、53、164、181および189位のうち少なくとも１位に
おけるアミノ酸がシステインからセリンに変化した、な
らびにブタおよびヒツジを包含する他種からのソマトト
ロピンにおいて同様に変化した動物ソマトトロピンの生
物活性、加工性および生産物の均一性の増大に関する。

より詳細には、本発明は、53、164、181および189残
基に対応するシステイン残基の少なくとも１つをセリン
で置換した哺乳動物ソマトトロピンに関する。

より詳細には、181および189残基に対応するシステイ
ン残基を共にセリンで置換した哺乳動物ソマトトロピン
を開示する。

さらにより詳細には、それは、181および189アミノ酸
残基に位置するシステインをセリンに変換したbStアナ
ログ（cys→ser bSt）である。

詳細には、181残基に対応するシステイン残基をセリ
ンで置換するか、または189残基に対応するシステイン
残基をセリンで置換した動物ソマトトロピンを包含す
る。より詳細には、該動物は哺乳動物であり、さらによ
り詳細には、ウシである。

また詳細には、53または164位のシステイン残基の少
なくとも１つをセリンで置換した、より詳細には、シス
テイン残基53をセリンで置換した、またより詳細には、
システイン残基164をセリンで置換した動物ソマトトロ
ピンを包含する。より詳細には、該動物は哺乳動物であ
り、さらにより詳細には、ウシである。

また、開示する少なくとも１つの動物ソマトトロピン
の有効量を該動物に与えることからなる動物の成長を増
進させる方法を提供し、ここに、詳細には、該動物は哺
乳動物であり、より詳細には、該哺乳動物はウシであ
る。

また、本発明における動物ソマトトロピンの有効量を
投与することからなる、メスの反芻動物における乳生産
を増大させる方法を提供し、ここに、より詳細には、該
反芻動物は乳牛であり、該ソマトトロピンはbStであ
る。

また、53、164、181および189残基に対応する少なく
とも１つのシステイン残基をセリンに変化させた動物ソ
マトトロピンをコードするDNAからなるベクターを提供
し、詳細には、これはソマトトロピン様タンパク質の発
現に導きうる。

また、前記ベクターの宿主となる微生物、詳細には、
バクテリア属、エシェリヒアからの微生物を提供する。

これらのアミノ酸残基の化学的および遺伝学的修飾は
共に、本発明により含まれる。

好ましい遺伝学的修飾は、天然に存在するシステイン
の代わりにセリン残基を挿入するための単一部位特異的
突然変異法に依存する。

詳細な記載ソマトトロピンの分子異質性のため、種々のソマトト
ロピンのアミノ酸残基の位置番号が異なりうる。「天然
の哺乳動物ソマトトロピン」なる語は、これらの天然に
存在する種を包含する。チャート１はbStの１つの種を
示し、また本発明の修飾部位に対応するアミノ酸のナン
バリングを示す。他のソマトトロピンについてのナンバ
リングは異なることがある。しかしながら、チャート１
におけるbStの53、164、181および189と番号を付けたシ
ステインを用い、当業者ならば、他の天然の動物ソマト
トロピンまたはそのアナログにおける対応するアミノ酸
配列を容易に位置づけて、所望の、生物活性、加工性お
よび生産物均一性の増大を得ることができる。

「最近縁（closest−related）天然ソマトトロピン」
なる語は、本発明の特異的ソマトトロピンアナログと比
較した場合、動物ソマトトロピンの天然に存在する他の
いずれの形態よりもアミノ酸配列においてより大きな同
一性を有する天然に存在する動物ソマトトロピンの形態
を意味する。例えば、チャート１のbStは、53位のシス
テインをセリンで置換したアナログに対し「最近縁天然
ソマトトロピン」である。天然のソマトトロピンのアナ
ログは、その親化合物との十分なタンパク質同一性を有
して成長促進剤または乳生産刺激剤としての生物活性を
有すると仮定して、「ソマトトロピン様タンパク質」な
る語は、天然の形態のソマトトロピンおよび天然のソマ
トトロピンのアナログの双方をいう。

「動物ソマトトロピン」なる語は、動物由来のソマト
トロピンをいい、例えば下垂体組織のような天然源由来
のソマトトロピンまたは天然存在形態のソマトトロピン
を生産する組み換えDNA技術により形質転換した微生物
由来のソマトトロピンいずれも包含する。例えば、ウシ
・ソマトトロピンのような特別な哺乳動物源を呼称する
場合、該ソマトトロピンは天然由来または形質転換微生
物由来のものいずれも包含する。

本明細書中で使用する「微生物」なる語は、細菌、酵
母、放線菌および細胞培養で増殖させた高等植物または
動物からの単細胞のような単細胞原核ならびに真核生物
を共にいう。また、トランスジェニック・アニマルは、
異種ポリペプチドを生産する分野の当業者に公知であ
る。

「天然」なる語は、例えば下垂体組織のような天然源
または天然に存在する形態のソマトトロピンを生産する
ために組換えDNA技術により形質転換した微生物いずれ
に由来してもよいソマトトロピンの天然に存在する形態
をいう。

「ベクター」なる語は、クローニング・プラスミド、
および微生物中で機能できるプロモーターに作動可能に
連結しているソマトトロピンをコードするDNAによりソ
マトトロピンの発現を指令するためのプラスミドの双方
を意味する。また、いくつかの状況においては、ベクタ
ーなる語は異種ポリペプチドをコードするDNAの染色体
挿入を包含しうる。

ソマトトロピン類は、アミノ酸配列および物理的構造
において非常に類似している。実施例において記載する
方法は、bStに向けられているが、該方法は、セリンへ
の変換に使用できる必要なシステイン残基を有するあら
ゆる動物ソマトトロピン、特に他の哺乳動物ソマトトロ
ピンに同等に適用できる。

rbStの単離における酸化段階の間、分子間ジスルフィ
ド架橋により、還元しうるタンパク質ダイマーおよびオ
リゴマーが形成される。この問題を克服するために、rb
Stアナログを構築した。これらのアナログは、システイ
ンのコドンに対応する181および189位をセリンのコドン
に変えたDNA配列を有するものを包含し、２種の他のア
ナログはセリンコドンに変化させた181または189いずれ
かにおけるコドンを有し、１種は179位は翻訳停止コド
ンを含有する切形rbStタンパク質をコードする。これら
４種のアナログを遺伝子融合で作り、発現ベクターpCFM
414およびイー・コリ株AM343cを使用して発現させた。
該ベクターは、pRA−bSt/hyb−Ser181/9、pRA−bSt/hyb
−Ser181、pRA−bSt/hyb−Ser189およびpRA−bSt/hyp−
179Tと称する。また、対照として供するために、非修飾
rbSt生産物、pRA−bSt/hybをコードするDNAを含有する
ベクターを構築した。これら５種のベクターはすべて、
AM343c株中で高いレベルでrbStを発現することが判明し
た。

cys→ser bStのより高い相対的効能は、下垂体摘出
ラットを使用することにより容易に測定できる（エバン
ス・エイチ・エム（Evans.H.M.）およびロング・ジェイ
・エイ（Long.J.A）、アナトミカル・レコード（Anat.R
ec.）21:61、1921）。下垂体bSt、rbStおよびbStアナロ
グの種々の画分を使用して全体重の相対的増加を記録す
る。

cys→ser bStの乳牛への投与は、必要量を該動物の
循環系に送達させるのに有効ないずれかの経路を使用す
る公知方法に従って行った。投与方法は、経口、筋肉注
射、皮下注射および時間調節放出インプラントの使用を
包含する。好ましい投与方法は、時間調節放出インプラ
ントを使用する皮下注射によるものである。注射のため
の適当なビヒクルは、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリ
ウムまたはリン酸アンモニウム溶液のような生理学的に
適合した緩衝剤を包含する。時間調節放出インプラント
は該技術において公知である（例えば、米国特許第4,33
3,919号）。

有効な用量の範囲は、動物１匹、１日当たり1.0〜200
mgである。bStを多く与えるほど、得られる成長、泌乳
または乳実質細胞の数は増加する。最も好ましくは、該
用量の範囲は、１日当たり５〜50mgである。

成長ホルモン類はそのアミノ酸配列において非常に類
似しているため、１つの種由来のホルモンは、通常、他
の非類縁動物種の成長を増加させることができる。本発
明におけるbStアナログを使用して、ウシ、ヒツジ、ラ
ット、サケおよびニワトリのような、天然のbStが成長
関連生物活性を有することが示されている種における成
長を増大させうる。好ましい動物は、バル、ヘファーま
たはスティアーのような牛肉に使用されるウシである。

肉牛は、完全な成熟および大きさに達する直前に屠殺
される。

cys→ser bStを使用して、屠殺までの離乳の間に随時
投与することにより、肉牛の成長速度を増大させうる。
所望の屠殺時に応じて、最小30日間、最大450日間、cys
→ser bStを肉牛に投与する。ビール（veal）に使用す
る動物は、典型的には、約６月齢で屠殺し、屠殺の齢に
なるまで１日当たり10〜30mgのcys→ser bStを投与し
て所望の成長速度の増大を得る。

ウシ、特に乳牛における泌乳を増加させるためには、
出産後の30と90日の間にcys→ser bStを投与し、300日
間まで継続する。また、cys→ser bStは、ヤギおよび
ヒツジのような他の商業的乳生産動物における泌乳を増
加させる。

株:MC1000（F^-、araD₁₃₉、del（araABC−leu）₇₆₇₉、
galU、trp_am、malB_am、rspL、relA、thi）（ジ・エクス
パーリメンツ・ウィズ・ジーン・フージョン・ストレイ
ン・キット（the Experiments with Gene Fusion
Strain Kit）、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コ
ールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbo
r）、ニューヨーク（New York）で入手可能）およびJM
83（ara,del（lac−pro）,rspL,phi80 lacZ delM15）
（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Am
erican Type Culture Collection）、12301、パーク
ローン、ドライブ、ロックビレ、メリーランド（Parkla
wn Drive Rockville,Maryland）20852）より入手可
能）株をベクター構築のコンピテント細胞として使用す
る。AM343c（F^-,sup゜,tonA）株を誘導に使用する。そ
れは内在性発現プラスミドpCFM414−bGHの株を脱落させ
ることによって、発現株AM343Cから得た。AM343C株（UC
^R9801とも称される）を、アグリカルチャル／リサーチ
・サービス・カルチャー・コレクション（Agricultural
/Research service Culture Collection）、ノーザ
ン・リージョナル・リサーチ・センター（Northern Re
gional Research Center）、1815、ノース・ユニバー
シティー・ストリート、ペオリア、イリノイ、（North
University Street,Peoria,Illinois）61604）に、1
989年１月24日に寄託し、受託番号NRRL Ｂ−18443が付
与された。発現用の別の株は、BST−1Cである（ここに
参照文献として合体させるPCT/US88/00328参照）。

プラスミド：本明細書中に記載の構築には、pUC9（ジ
ェイ・ビエイラ（J.Vieira）およびジェイ・メッシング
（J.Messing）、ジーン（Gene）19、259〜268頁（198
2）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー（Bethesda R
esearch Laboratories）より入手可能）およびpCFM414
−bGHベクターを使用した。trpプロモーターおよびイー
・コリ（E.Coli）からのtrpLリボゾーム結合部位を含有
するEcoR I/BamH I断片、および合成bSt遺伝子を挿入す
ることにより、pCFM414−bGHベクター（前記AM343Cで寄
託）をpCFM414（米国特許第4,710,473号）から構築し
た。pTrp−BStmlおよびpTrp−BStmlbベクターがPCT/US8
8/00328に記載されている。これらのベクターは共に、b
St cDNA遺伝子を使用して構築した（ここに参照文献と
して合体させるPCT/US88/00328）。bStカルボキシル末
端をコードするDNA配列において、両ベクターを修飾し
た。pTrp−BStmlベクターは、bStについての翻訳停止コ
ドンの直後にBamH I制限部位を有し、189位にセリンコ
ドンを含有する。pTrp−BStmlbベクターは、それがbSt
の189位に対応するシステインコドンを含有する点を除
き、pTrp−BStmlと同様である。

培地：培地については既に記載されている（ジェイ・
エイチ・ミラー（J.H.Miller）、エクスパーリメンツ・
イン・モレキュラー・ジェネティックス（Experiments
in Molecular Genetics）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor La
boratory）、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（Cold Spring Harbor,New York）。

DNA調製およびクローニング法：ほとんどのDNA調製お
よび一般的技術は、当業者によく知られた技術により行
う（ここに参照文献として合体させる、ティー・マニア
ティス（T.Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）：ア・ラボラトリー・マニュア
ル（Ａ Laboratory Manual）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor La
boratory）、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（Cold Spring Harbor,New York）参照）。詳
細には、既に記載されているようにDNAを調製する（ジ
ェイ・イー・モット（J.E.Mott）ら、イーエムビーオー
・ジャーナル（EMBO J.）、４、1887〜1891頁（198
5））。製造者の推薦に従い、制限消化および連結反応
を行う。ニュー・イングランド・バイオラブズ（New E
ngland Biolabs）から制限酵素およびリガーゼを購入
する。DNA断片をアガロースゲルから２つの技術のうち
の１つにより単離する。800bp未満の断片については、
バンドを該ゲルから切り取り、砕き、フェノール存在下
ドライアイス上乾燥する。遠心分離により水性相を分離
し、エタノール沈殿させる。800bp以上の断片について
は、バンドを該ゲルから切り取り、電気溶出させる（テ
ィー・マニアティス（T.Maniatis）ら、同上）。

プラスミド形質転換：形質転換すべき細胞を一夜増殖
させ、1/100を継代培養させる。これらの細胞を中期対
数相にまで増殖させ、5mlを遠心分離し、冷50mM CaCl₂1
0ml注に再懸濁させ、氷上または４℃で少なくとも１時
間インキュベートする。再度、該細胞を遠心分離し、0.
5ml 50mM CaCl₂にとる。約100μの細胞を氷上でプラ
スミドDNAとともに１時間インキュベートする。37℃で
７分間、細胞に熱ショックを与え、アンピシリン100μg
/mlを含有するLB平板上で平板培養する。27℃でランナ
ウェイ・ベクターの選択を行う。非ランナウェイ・ベク
ターの選択は37℃で行う。

オリゴマー精製：既に記載されているようにしてオリ
ゴマーを合成し単離する（PCT/US88/00328）。

合成断片の形成：リガーゼ緩衝液の存在下でオリゴヌ
クレオチドJM−１およびJM−２（チャート２）を100℃
まで加熱し、該混合物を室温まで冷却することにより、
179位の終止コドンの導入のための合成DNA断片を形成す
る。181および189のセリン置換のための４個のオリゴヌ
クレオチド・ブロックを生成するために、まず高特異的
P³²標識ガンマATPでオリゴマーJM−４および５をキナー
ゼ反応に付し、ついでJM−３およびJM−６にハイブリッ
ド形成する（チャート３）。その４個のオリゴヌクレオ
チド構造を連結し、非変性ポリアクリルアミドゲルから
単離する。

誘導法:pCFM414ランナウェイ・ベクター由来のベクタ
ーを含有する細胞を27℃で一夜増殖させ、アンピシリン
100μg/mlで補足したブロスに1/50を継代培養する。ニ
ュー・ブルンスウィック・エアー・シェイカー（New B
runswick air shaker）中、約250rpm、27℃で該細胞
を増殖させる。該細胞が0.2と0.4との間のO.D.550に到
達した時、SDS PAGEについてのサンプル採取し、該培
養を37℃のエアー・シェイカーに移す。pURA−１由来の
ベクターを含有する細胞を、既に記載されているように
誘導させる（PCT/US88/00328）。

SDS PAGE:SDS PAGE法は既に記載されている（ジェ
イ・イー・モット（J.E.Mott）ら、プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ユナイティド・ステイツ・オブ・アメリ
カ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、82、88〜92頁（198
5））。

ユナイティド・ステイツ・バイオケミカル（United
States Biochemical）からシークエンシング・キッ
ト、シークエナーゼ（Sequenase^TM）を購入する。製造
者の推薦に配列決定を行う。エル・ビー・アジェロン
（L.B.Agellon）およびティー・ティー・チェン（T.T.C
hen）、ジーン・アナリシス・テクニックス（Gene Ana
al.Techn.）、３、86〜89頁（1986）の方法により、２
本鎖配列決定用のDNAを調製する。２本鎖DNAの配列決定
については、アニーリング方法を以下のように修飾す
る:2M NaOH3μ、2mM EDTAを２本鎖プラスミドDNA12μ
に加え、室温で５分間インキュベートし、100ng/μ
プライマー３μを加え、該混合物を10分間インキュベ
ートし、ついで3M酢酸ナトリウム６μを加える。さら
に５分のインキュベーションの後、氷冷95％エタノール
100μを加え、ドライアイス上で20分間、DNAを沈殿さ
せる。該DNAをペレット化し、70％エタノールですす
ぎ、真空乾燥する。水８μおよび配列決定用緩衝液２
μ中に再懸濁させた後、製造者の指示に従い配列決定
を継続する。dGTP終結混合物Ａ、Ｃ、ＧおよびT2.5μ
をピペットで個々のマイクロタイターのウェルに入れ、
37℃で予備加熱する。氷冷TE緩衝液中でシークエナーゼ
酵素を1:8に希釈する。標識反応については、0.1M DDT1
μ、希釈標識混合物２μ、³⁵S−dATP2μおよび希
釈シークエナーゼ２μをアニール化したDNAに加え、
該反応を室温で２分間インキュベートする。終結反応に
ついては、標識反応3.5μを各終結ウェル（Ａ、Ｃ、
ＧおよびＴ）に加え、さらに５分間インキュベートす
る。停止混合物４μで該反応を停止する。75℃で２分
間、該反応を沸騰させた後、各反応４μを配列決定用
ゲル上に載せる。

温度感受性ランナウェイ・ベクターpCFM414−bGHはrb
Stを高レベルで発現させる。trpプロモーターから発現
され、翻訳開始のためのtrpLリボソーム結合部位を使用
する合成rbSt遺伝子を、該ベクターは含有する。この合
成rbSt遺伝子およびcDNA rbSt遺伝子（PCT/US88/0032
8）は共に、アミノ酸90および91に対応する配列に、特
有のPst I制限部位を有する。したがって、この共通の
イン・フレーム部位を使用してハイブリッドbSt遺伝子
をつくることができる。pCFM414ベクター中にクローニ
ングする場合、該合成遺伝子のＮ−末端領域およびcDNA
遺伝子のカルボキシル末端をコードする配列を含有する
ハイブリッド遺伝子、bSt/hybを発現させて、rbStタン
パク質を高レベルで生産させる。bSt/hyb遺伝子を使用
して、bSt遺伝子の末端部をcDNAセグメント上に位置す
る唯一の制限部位を用いて改変させうる。例えば、該cD
NAは、アミノ酸175、176および177をコードする配列
に、Mst II制限部位を含有する。これらは、181および1
89位のシステイコドンを改変させるかまたは翻訳を未完
成に終結させる合成DNA断片で、カルボキシル末端の配
列を置換するのに使用しうる。制限部位を利用するため
には、これらの部位が唯一のままであるベクター中に、
該ハイブリッド遺伝子を入れなければならない。

実施例１小ループを欠いた切切bStをコードするbSt遺
伝子の構築 1.pDH23の構築 pUC−９ベクター（ジェイ・ビエイラ（J.Vieira）お
よびジェイ・メッシング（J.Messing）、ジーン（Gen
e）、19、259〜268頁（1982）、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ、ガイセルブルク、メリーランド（Beth
esda Reasearch Laboratories,Gaitherburg,Marylan
d）、20877より入手可能）はpBR322由来の、高コピー数
の構成的ベクターである。それはアンピシリン耐性用遺
伝子およびlacZ'ベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子を発
現させるlacプロモーターを含有する。該lacZ'遺伝子
は、lacZdelM15ベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子（ビエ
イラおよびメッシング、前掲）により産生されたペプチ
ド断片を機能的に相補しうるＮ末端の小ペプチド断片を
コードする。この相補性は、ベータガラクトシダーゼを
機能させて細胞中で青変する色素基質物質Ｘ−Gal（ベ
ゼスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ガイセルブルク、
メリーランド（Bethesda Reasearch Laboratories、G
aitherburg、MD）を使用することにより可視化されう
る。pUC9を修飾して、lacZ'についての配列内にポリク
ローナル部位と称される唯一の制限部位を含有させた。
これらの部位に挿入したDNA断片は、lacZ'ペプチドが産
生される能力およびそれがlacZdelM15ベータ・ガラクト
シダーゼタンパクを相補する能力を喪失させる。そのよ
うな細胞は、Ｘ−Gal指示剤の存在下、青に変化しな
い。

pUC−９ベクターはMst II制限部位は含有しないが、E
coR I、BamH I、Pst IおよびHind IIIについてのlacZ'
ポリリンカー中に唯一の部位を含有する。該pUC−９ベ
クターを修飾して、ハイブリッド遺伝子の構築およびそ
れに続く修飾を妨げるPst IおよびHind III部位を除去
する。これはHind IIIおよびHind IIで該ベクターを消
化することにより行う。また、Hin II部位はポリクロー
ナル部位中に存在する。Hind III部位をPolAクレノウで
満たし、該ベクターを連結し、コンピテント細胞JM83細
胞に形質転換する。得られたプラスミドをスクリーニン
グし、Hind IIIおよびPst I制限部位を欠失しているがB
amH IおよびEcoR I部位を保持している候補を選択す
る。lacZ'遺伝子は適切な読み取り枠を保持しているた
め、ポリクローナル部位へのこの変換はlacZ'ペプチド
の補完能力に影響を与えない。得られたベクターをpDH2
3と呼ぶ。唯一なEcoR IおよびBamH I制限部位は合成bSt
遺伝子のクローニングを可能にする。

2.bSt/hyb合成bSt−bSt cDNAハイブリッド遺伝子の構
築。

合成bSt遺伝子をプラスミドpCFM414−bGHからEcoR I/
BamH I断片として単離し、前もってBamH IおよびEcoR I
で消化したpDH23ベクター中にクローニングする。ま
た、EcoR I/BamH I断片は、trpプロモーターおよびtrpL
リボソーム結合部位を含有する。得られたベクターはpD
H−bStと称する。このベクターにおいて、bSt遺伝子中
のPst IおよびBamH I制限部位は唯一のものである。

Pst I/BamH I断片をpTrp−BStmlベクターから単離す
る。このベクターは、trpプロモーターから発現されるb
St cDNAを含有し、trpLリボソーム結合部位を用いる。p
Trp−BStml中のbSt遺伝子を修飾して189位のセリンをコ
ードさせる。pTrp−BStmlベクターをPst IおよびBamH I
で消化し、bStのカルボキシル末端についてのDNA配列を
含有する約315bpの断片を単離する。この断片を、前も
ってPst IおよびBamH Iで消化したプラスミドpDH−bSt
中に結び、合成bSt遺伝子のPst IからBamH I配列と置換
する。このクローニングから得られたベクターをpDH−b
St/hyb−189Sと呼ぶ。この構築は、bSt遺伝子のPst Iと
BamH Iとの間に位置する唯一の制限部位Mst IIを含有す
る。

3.pDH−bSt/hyb−189Sベクター誘導体３種のベクターは第２節のpDH−bSt/hyb−189Sからの
由来である。最初のクローニングでは、pDH−bSt/hyb−
189SベクターをPst IIおよびBamH Iで消化し、大きなベ
クター断片を単離する。Pst I/BamH I断片をpTrb−BStm
lbから単離する（PCT/US88/00328）から単離する。pTrp
−BStmlbは、Mst IIとBamH I制限部位との間にクローニ
ングした合成由来のオリゴヌクレオチド断片を含有する
以外は、pTrp−BStmlと同様である。この断片は、アミ
ノ酸181および189に対応する位置にシステイン・コドン
TGCを含有する以外は、チャート３に記載する断片と同
一である。該コドンの使用を最適化し、Hind III制限部
位を189および189のコドンの間の配列中に設ける。Pst
I/BamH I断片をpTrp−BStmlbから単離し、pDH−bSt/hyb
−189Sベクターの大断片に結んで、pDH−bSt/hybを得
る。pDH−bSt/hybのbSt遺伝子のbStをコードする。

次の２つのクローニングにおいて、pDH−bSt/hyb−18
9SをMst IIおよびBamH Iで消化し、該消化物から大きな
ベクター断片を単離する。４個のオリゴヌクレオチド由
来の合成断片をチャート３に示す。この合成断片を消化
してMst II/BamH I制限部位中に挿入する。この断片の
挿入により、アミノ酸の181および189位にセリンを有す
るbStタンパク質をコードする遺伝子が生成する。この
断片をpDH−bSt/hyb−189SのMst II/BamH Iの大断片に
結んで第２のベクターpDH−bSt/hyb−Ser181/9をつく
る。このベクターにおいて、制限部位Pst I、Mst II、H
ind IIIおよびBamH Iは唯一のものである。

チャート２に示す合成断片を挿入することにより、pD
H−bSt/hyb−189S由来の第３のベクターをつくる。この
断片は、bStの179位に対応する翻訳停止コドンをコード
する。該断片をpDH−bSt/hyb−189SのMst II/BamH I断
片に結んで小ループを欠いた切形bStをコードするbSt遺
伝子を生成させる。このベクターはpDH−bSt/hyb−179T
と称する。

pDH−bSt/hyb−Ser181/9およびpDH−bSt/hyb−179Tの
構築は、DNA配列分析により確認する。

実施例２ 181または189位のいずれかにおいてコードさ
れる各セリン置換bSt遺伝子の構築本実施例は、181または189位にそれぞれセリンコドン
を有する遺伝子を構築するためのクローニング戦略を記
載する。pDH−bSt/hybおよびpDH−bSt/hyb−Ser181/9
（実施例１）の２種の出発ベクターを使用する。pDH−b
St/hybは天然のbSt遺伝子をコードし、pDH−bSt/hyb−S
er181/9は、アミノ酸181および189についてのセリンコ
ドンを有する。両ベクターは、これら２のコドンについ
ての配列の間に位置する唯一のHind III制限部位を有す
る。これらのベクターをEcoR IおよびHind IIIで消化す
ることにより、各ベクターから２個の断片が生成する。
850bpの断片はtrpプロモーター、および181コドンを含
めたbSt遺伝子の約95％を含有する。クローニングにお
いて出発ベクター間で該850bp断片を交換して、181位の
システインコドンを含有するpDH−bSt/hybからの断片を
189にセリンコドンを有するpDH−bSt/hyb−Ser181/9ベ
クター中に導入し、逆に、pDH−bSt/hyb−Ser181/9から
のセリン181コドンを含有する該850bp断片を189システ
インコドンを含有するpDH−bSt/hybベクター中にクロー
ニングする。このクローニングの結果、２種のベクタ
ー、pDH−bSt/hyb−Ser181およびpDH−bSt/hyb−Ser189
が得られ、これはアミノ酸の181または189位いずれかで
単一のシステインがセリンに置換したbStアナログを発
現する。

実施例３ pCFM414クローニング高レベルの発現のために、発現ベクターpCFM414−bGH
に修飾遺伝子をクローニングする。pCFM414−bGHをEcoR
IおよびBamH Iで消化し、この大きなベクター断片を精
製し、このように内因性のbSt遺伝子を取り出す。ベク
ターpDH−bSt/hyb、pDH−bSt/hyb−Ser181/9、pDH−bSt
/hyb−Serd181、pDH−bSt/hyb−Ser189およびpDH−bSt/
hyb−179TをEcoR IおよびBamH Iで消化し、trpプロモー
ター、trpLリボソーム結合部位および全bSt遺伝子を含
有する870bp断片をそれぞれから単離する。該断片を各
々pCFM414ベクター断片に結び、イー・コリ（E.coli）
株MC1000のコンピテント細胞に形質転換する。各構築の
ためのプラスミドDNAを調製する。得られたベクター
を、pRA−bSt/hyb、pRA−bSt/hyb−Ser181/9、pRA−bSt
/hyb−Ser181、pRA−bSt/hyb−Ser189およびpRA−bSt/h
yb−179Tと称する。

実施例４ pRAベクターの発現ベクターpRA−bSt/hyb、pRA−bSt/hyb−Ser181/9、pR
A−bSt/hyb−Ser181、pRA−bSt/hyb−Ser189およびpRA
−bSt/hyb−179Tをイー・コリAM343cのコンピテント細
胞に形質転換する。該培養を前記のように誘導し、各培
養からの誘導後６時間のサンプルをSDS PAGEにより分
析する。すべての構築体は、その各rbStタンパク質の高
レベルの発現を示す。また、イー・コリ株BST−1Cを発
現に使用する（PCT/US88/00328）。

実施例５ 181および189位にセリンを含有するbStアナ
ログの別の発現系の構築前記ベクターpDH−bSt/hyb−Ser181/9はEcoR IとPst
I部位との間にtrpプロモーター、trpLリボソーム結合部
位およびbStの１〜90のアミノ酸をコードする合成bStDN
A配列を含有し、それはPst I部位からMst II部位までに
アミノ酸91〜176位（実施例１）に対応するcDNA遺伝子
由来の配列を含有し、Mst IIからBamH I制限部位までに
合成オリゴヌクレオチドブロック（実施例１）由来の配
列を含有する。合成bSt遺伝子由来の遺伝子部分は、pDH
−bSt/hyb−Ser181/9をEcoR IおよびPst Iで消化し大き
なベクター断片を単離することにより欠失しうる。欠失
したセグメントは、pTrp−BStm4（PCT/US88/00328）か
らのEcoR I、Pst I制限断片で置換でき、これはtrpプロ
モーターおよびtrpLリボソーム結合部位およびbStの１
〜90のアミノ酸をコードするcDNAからのDNA配列を含有
する。また、このDNAはbStの第２のアラニンに対応する
コドンにおいてGCCからGCTへコドンが変化しており、こ
の結果、発現が改良される（PCT/US88/00328）。得られ
るベクターはpDH−bStm4−Ser181/9と称する。

bStm4−Ser181/9cDNA遺伝子をpURA発現ベクター（PCT
/US88/00328）に導入するために、pDH−bSTm4−Ser181/
9およびpURA−１ベクターを共にEcoR IおよびBamH I制
限酵素で消化する。pURA−Ｉからの大きなベクター断片
およびpDH−bStm4−Ser181/9からの小さい方のbSt遺伝
子断片を単離し、rpoCのBamH I転写終止断片と結ぶ（PC
T/US88/00328）。結んだDNAを使用してMC1000のコンピ
テント細胞を形質転換する。得られたベクター、pURA−
bStm4−Ser181/9は、それが181および189にcys→serの
修飾を含有することを除き、pURA−４（PCT/US88/0032
8）と同一である。

発現については、該ベクターをBST−1C株（PCT/US88/
00328）に形質転換し、前記のように誘導する（PCT/U88
/00328）。

実施例６ 53または164位のシステインをセリンに置換
するbSt遺伝子の構築以下の方法を使用することにより、２本鎖DNAプラス
ミドにつき、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を
行うことにより、53または164位にセリンを有するbStを
コードするDNAからSer−53またはser−164をつくる：オリゴヌクレオチド４μ（４μｇ）を水54μ、緩
衝液（0.5MTris−HCl、pH7.4、0.1M MgCl₂、0.1Mジチオ
トレイトール）７μ、50mM ATP2μおよびT4ポリヌ
クレオチドキナーゼ10単位／μ 3μを、最終容量を
70μとして、37℃で60分間インキュベートすることに
より、オリゴヌクレオチドプライマーをリン酸化する。
該反応混合物をフェノールおよびエーテルで抽出し、乾
燥乾固し、水３μに溶解する。このリン酸化オリゴヌ
クレオチド２μを（室温で15〜20分間、DNA2μｇを2N
NaOH3μおよび2mM EDTAと12μ中でインキュベート
することにより変性させた）変性プラスミドDNA15μ
と混合し、ついで3M酢酸ナトリウム６μおよびエタノ
ール100μを加える。該混合物をドライアイス中に15
〜30分間保持し、遠心により沈殿物を収集し、70％エタ
ノールで洗浄し、乾燥し、10mMトリス−HCl（pH7.4）25
μおよび1mM EDTA中に溶解する。この溶液を該リン酸
化オリゴヌクレオチド１μ、水20μ、1Mトリス−HC
l（pH8.3）7.5μ、0.2M NaCl10μ、0.1M MgCl₂25
μ、10mM dNTP20μ、5mM ATP17.5μ、0.4Mβ−メ
ルカプトエタノール20μ、クレノウ酵素（80単位）16
μ、T4 DNAリガーゼ（8,000単位）20μおよびT4遺
伝子32タンパク質（32μｇ）18μと混合する。合計容
量が200μの該反応混合物を37℃で１時間インキュベー
トし、NaClと混合して最終的に0.2Mとし、フェノールお
よびエーテルで抽出し、エタノールで沈殿させる。該沈
殿物を10mMトリス−HCl（pH7.4）および1mM EDTA100μ
に溶解し、イー・コリ（E.Coli）DH1、MC1000または
他の適当な株の形質転換に使用する。形質転換効率に依
存し、形質転換に突然変異誘発プラスミドを使用する。

コロニー・ハイブリダイゼーションにより、突然変異
誘発オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、野生
型バックグラウンド上で変異を発見するために洗浄条件
を選択して、突然変異を有するプラスミドを担持する形
質転換株をスクリーニングする。ハイブリダイゼーショ
ンの方法は、ティー・マニアティス（T.Maniatis）、イ
ー・エフ・フリッチュ（E.F.Fritsch）およびジェイ・
サンブルック（J.Sambrook）、モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）中に記載のとおりである。
一般に、オリゴヌクレオチド・プローブ１〜２μｇを、
50mMトリス−HCl（pH7.8）、10mM MgCl₂および10mMジチ
オトレイトールの合計量20μ中の（γ−³²P）ATP100
〜200MCiおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ10〜20単位
でリン酸化する。5xデンハーツ溶液、5xSSCおよび0.1％
SDS中、42℃でハイブダイゼーションを行う。5xSSCおよ
び0.1％SDS中、オリゴヌクレオチド・プローブが、変化
した配列にアニーリングしたままとなり野生型配列から
解離したままとなることを許容する温度で、該フィルタ
ーを洗浄する。該オリゴヌクレオチド・プローブと強力
にハイブリッド形成する形質転換株を選択し、改変配列
を確認するためにDNA配列決定を行う。

前記技術を使用し、53または164位にセリンを有するb
StをコードするDNAを生じさせるために、オリゴヌクレ
オチド特異的変異誘発をプラスミドpURA−m4（PCT/US88
/00328）で行う。cys−53をセリンに変えるためにGTTGC
CTTCTCTTTCTCTGAAACの配列を有するオリゴヌクレオチド
を突然変異誘発に、またフィルターの洗浄温度を51℃と
するコロニー・ハイブリダイゼーションのプローブとし
て使用する。この変化したプラスミドをpURA−m4−53se
rと称する。CTGCTCTCCTCTTTCCGGAAGGのオリゴヌクレオ
チドにより、フィルターの洗浄を51℃にて、164位にお
けるセリン置換を行い、得られたプラスミドはpURA−m4
−164Serと称する。

実施例７ 53位および164位の双方にてシステインをセ
リンで置換したbSt遺伝子の構築この戦略では、bSt遺伝子のコドン90に位置するPst I
部位を使用して、53または164位で１個のセリンで置換
したbSt配列を接合させる。操作の便宜のため該ベクタ
ー中の他のPst I部位を除去するため、pURA−m4−164se
rからのtrpプロモーターおよびbSt遺伝子を含有するEco
R I/BamH Iの小断片を単離し、それをpDH23から単離し
たEcoR I/BamH I大きなベクター断片に結ぶことによ
り、セリンを164位に有するbSt配列を、pDH23にサブク
ローニングする。得られたプラスミドpDH−m4−164ser
は、bSt遺伝子のコドン90に単一のPst I部位を有する。
164位がセリンであるbSt配列の３′側の半分を含有する
EcoR I/Pst Iの大きなベクター断片を、pDH−m4−164か
ら単離する。この断片をtrpプロモーターおよびpURA−m
4−53serから単離した、53位がセリンであるbStをコー
ドする配列の５′側の半分を含有するEcoR I/Pst Iの小
断片に結ぶ。得られたプラスミドをpDH−m4−53/164ser
と称する。

53および164位がセリンであるbStの高レベルの発現の
ため、trpプロモーターおよび該bSt配列を含有するEcoR
I/Hind IIIの小断片をpDH23−m4−53/164serから単離
する。この断片をpURA−m4から単離したEcoR I/Hind II
Iの大きなベクター断片に結ぶ。得られたプラスミドはp
URA−m4−53/164serと称する。

実施例８ 54、164、181および189位がセリンであるbSt
遺伝子の構築 53、164、181および189位のシステインをセリンで置
換したbStをコードするベクターを構築するため、trpプ
ロモーターならびに53および164位がセリンであるbStを
コードする配列の大部分を担持するEcoR I/Mst II小断
片をpDH−m4−53/164serから単離する。この断片を、pD
H−bSt/hyb−ser181/9から単離した181および189位がセ
リンである３′bStをコードする配列を含有するEcoR I/
Mst II大ベクター断片に連結する。得られたプラスミド
はpDH−m4−53/164/181/189serと称する。すべての４シ
ステイン残基がセリンで置換されたrbStの高レベルの発
現のため、trpプロモーターおよび53、164、181および1
89位がセリンであるbStをコードする配列を含有するEco
R I/BamH I小断片をpDH−m4−53/164/181/189serから単
離する（断片Ｉ）。該EcoR I/BamH I大ベクター断片
（断片II）およびイー・コリ（E.Coli）遺伝子rpoBC用
の転写ターミネーターを担持する350bpBamH I断片（断
片III）をpURA−m4から単離する。断片Ｉ、IIおよびIII
を結び、ターミネーターが正しい向きにあるプラスミド
を選択し、pURA−m4−53/164/181/189serと命名する。

実施例９ 53、164、181および189位のうち１またはそ
れ以上の位置にセリンを有するbStの発現ベクターpURA−m4−53ser、pURA−m4−164ser、pURA
−m4−53/164serまたはpURA−m4−53/164/181/189serを
イー・コリ Bst−1Cに形質転換し、特許出願PCT/US88/
00328に記載の通り誘導する。

実施例10 cys→ser bStアナログの生物活性 200のビール中、修飾ルリア・ブロスを使用し、pRA
−bSt/hyb−ser181/9で形質転換されたAM343c細胞を増
殖させた。初めに27℃、pH7で、１のA₅₅₀を得るまで該
細胞を増殖させた。温度を37℃まで、pHを６までシフト
させ、酵母エキスを添加することにより誘導を起こさせ
た（PCT/US88/00328）。以下の遠心により収集した細胞
からrbStを収穫する：１）まず細胞をリゾチームで溶解し、ついで該溶解産物
をタージトール（Tergitol）で洗浄する。

２）該DNAを切断し、封入体を洗浄し、ついでラウロイ
ルサルコシンナトリウムで可溶化する。

３）かく生産したrbStを酸化し、空気と24時間撹拌する
ことにより折り畳ませる。

４）ダウェックス（Dowex）1x4で処理することによりラ
ウロイルサルコシンナトリウムを除去する。

５）rbSt混合物をDEAE−セファロース上でクロマトグラ
フィーに付し、該rbSt画分を回収し、凍結乾燥する。

ラット・バイオアッセイのため、下垂体を摘出した、
メスのスプラグ・ドーリー（Sprague−Dawley）ラット
をチャールズ・リバー・ラボラトリーズ・インコーポレ
イティド（Charles River Laboratories,Inc.）から
購入する。該ラットを、１グループ当たり７匹の試験グ
ループに分ける。対照用標準下垂体由来bStを、0.15M N
aCl/0.03M重炭酸ナトリウム緩衝液（pH10.8）に溶解す
る。該溶液のpHを9.5に調整し、pH9.5の同緩衝液で2mg/
mlのタンパク質濃度に希釈する。重炭酸ナトリウム緩衝
液中にトゥイーン80およびマンニトールを含有する凍結
乾燥分として試験用rbStを調製する。これらを10mg/ml
溶液に復元し、ついで1:5に希釈してストック溶液とす
る。cys→serアナログに加え、組換えにより生産した天
然rbStの調製物を対照として使用する。該試験グループ
の各動物に毎日２回（100μ／注射）、合計９日間で
合計用量7.5、15、30または60mgタンパク質／日を注射
する。処方期間の初めから終わりまで週末を除く毎日、
該ラットの体重を計測する。

乳牛のバイオアッセイでは、泌乳ホルシュタイン牛を
使用した。これらの乳牛には該実験に用いる前に代謝異
常、乳腺炎、疾病はなく、また投薬も行わなかった。試
験化合物の最初の注射の３および２日前に、平均乳収量
に基づき、乳牛を５頭の４連にてブロックに分けた。出
産後122日と289日の間の乳牛を該実験に使用した。各ブ
ロックの５匹の乳牛を３つの実験グループ（それぞれ毎
日5mgおよび15mgのcys→ser rbSt、rbStプロセス対照
ならびに注射をしない対照群）の１つに任意に割り当て
た。ほぼ0745〜0815時、すなわち搾乳後２〜３時間後に
乳牛に注射した。ラットの実験に使用したのと同一の凍
結乾燥調製物を使用して10mg/mlの注射用ストック溶液
をつくった。注射は毎日１回、半腱様筋中に行い、７日
間継続した。該乳牛の日常の搾乳計画および方法に従
い、0500時および1600時に搾乳した。各乳牛に７日間注
射した後の３〜５日、すなわち合計15日の実験におい
て、目盛り付き乳びんを使用して各搾乳における個々の
牛乳重量を見積もった。乳収率を3.5％脂肪補正乳に合
わせた。

cys→serアナログ調製物および組換え法により生産し
た天然rbStの対照調製物の分析的プロフィールの概要を
表１に示す。

一般にこの２つの調製物はその分析的プロフィールに
おいて類似している。しかしながら、ラジオイムノアッ
セイにおいてはcys→ser bStアナログは、対照の92％と
比較して、標準のわずか18％であった。

乳収率もまた、cys→ser bSt（181、189）アナログで
処理した乳牛については、天然rbSt対照と比較して高か
った（表２）。

実施例11 ベクターpURA−bStm4−Ser181/189を使用す
る、181および189位にセリンを有するbStの発現細胞（BST−1C）をpURA−bStm4−Ser181/189で形質転
換し、先の記載のとおり（1988年２月17日付け出願、米
国特許第157,275号）200リットルのビール中で増殖させ
た。工程４（ダウェックス−1x4の処理によるラウロイ
ルサルコシンナトリウムの除去）および工程５（DEAE−
セファロース上のクロマトグラフィー）を繰り返すこと
が必要なことを除き実施例10と同様にして、収集した細
胞から該rbStを収穫した。該発酵からの２つの調製物に
ついてこれを行った。イン・ビトロの分析データを表４
に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (72)発明者モット，ジョン・イーアメリカ合衆国ミシガン州49004、カラマズー、イースト・シィ・アベニュー 4720番 (72)発明者トミッチ，チェー―シェン・シィアメリカ合衆国ミシガン州49008、カラマズー、ブラックベリー・レイン3703番 (56)参考文献特開昭61−195698（ＪＰ，Ａ) 特開昭64−20096（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．153，ｐ．445−449（1985)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ウシ・ソマトトロピンにおける残基181お
よび189に対応するシステイン残基がセリンで置換され
た哺乳動物ソマトトロピン。
【請求項２】ウシ・ソマトトロピンである請求項１に記
載の哺乳動物ソマトトロピン。
【請求項３】請求項１または２に記載のソマトトロピン
で非ヒト・動物を処理することを特徴とする非ヒト・動
物の成長を促進する方法。
【請求項４】該動物がウシである請求項３の方法。
【請求項５】請求項１または２に記載のソマトトロピン
を投与することを特徴とする雌反芻動物においてミルク
生産を増大させる方法。
【請求項６】該反芻動物が乳牛である請求項５に記載の
方法。
【請求項７】請求項１または２に記載の哺乳動物ソマト
トロピンについてコードするDNAよりなるベクター。
【請求項８】ソマトトロピンの発現を指令できる請求項
７に記載のベクター。
【請求項９】請求項７または８に記載のベクターの宿主
である微生物。
【請求項１０】エシュリヒア（Escherichia）属である
請求項９に記載の微生物。