JPH04503001A - ソマトトロピン・アナログ類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ソマトトロピン・アナログ類 発明の分野 本発明は動物ソマトトロピンのアナログに関する。より詳細には、本発明はウシ ・ソマトトロピン・アナログに関スる。

発明の背景 ソマトトロピンは元来、種々の動物種からの下垂体抽出物中で発見された。一般 に、ソマトトロピンは保存性の分子であり、異なる動物種間にアミノ酸配列およ び構造中の類似点が見いだされる。ウシ・ソマトトロピン（すなわち成長ホルモ ン）がよく研究されている。パラディニ・エイ・シー（Ｐａ　ｌａｄ　ｉｎ　ｉ 、Ａ、Ｃ，）らにより、文献が論評されている（シー・アール・シー・クリティ カル・レビューズ・イン・バイオケミストリー（ＣＲＣＣｒ　ｉ　ｔ、　Ｒｅｖ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１５：２５〜５６　（１９８３））。

ウシ・ソマトトロピンを含めたソマトトロピンは、約２００個のアミノ酸の１本 鎖からなり、２個の分子内ジスルフィド結合を有する球状タンパク質である。詳 細には、天然ウシ・ソマトトロピン（ｂＳｔ）の最も一般的な形態は、１９０〜 １９１のアミノ酸の１本鎖、２個の分子内ジスルフィド結合を有する球状構造お よび約２２．０００ダルトンの分子量を有する。

しかしながら、下垂体から抽出した天然ｂｓｔは、不均一なタンパク質混合物で ある。該タンパク質の少な（とも６種の主要形態が記載されている。最長形態は １９１アミノ酸残基およびａｌａ−ｐｈｅアミノ末端を有する。２番目の形態は １９０アミノ酸残基およびｐｈｅアミノ末端を有する。３番目の形態は１８７ア ミノ酸残基およびｍｅｔアミ／末端を有する。ｂｓｔの残りの３形態は、１２７ 位でロイシンがバリンに変わっている。また、この不均一性に加え、ウシ・ソマ トトロピンの明らかでない不均一性も記載されている（ハート・アイ・シー（Ｈ ａｒｔ、１．Ｃ，）ら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、） 、２１８：５７３〜５８１（１９８４）、ワレス・エム（Ｗａ　１１　ａ　ｃ　 ｅ　Ｍ、）およびディクｖンーｘイチ・ビーーｘフ（Ｄｉｃｋｓｏｎ、Ｈ，Ｂ、 Ｆ、）、バイオケミカル−ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）、１００：５９ ３〜６００　（１９６５））。天然の抽出物を陰イオン交換クロマトグラフィー により分取した場合、明らかでない電気泳動における不均一さが見られる。これ は、既知形態が、バイオアッセイにおいて異なる相対的効能を有することを示す 。また、ｂｓｔの他の明らかでない種は、イオン交換カラム上分取した場合、ラ ットの成長モデルにおいて種々の程度の生物活性を示す（）＼−トら、およびワ レスおよびディクソン前掲）。

明らかでない不均一性が、遺伝的変異性によるのか、インビボの躬訳後修飾によ るのか、リン酸化の違いによるのか（リバティ・ジェイ・ビー（Ｌｉｂｅｒｔｉ 、Ｊ、Ｐ、）ら、バイオケミカル−７ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ ュニケイションズ（Ｂ　ｉ　。

ｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）１２８ニア１３〜７ ２０，１９８５Ｌまたは単離時の人工的生成物によるのか公知でない。

組換え微生物により生産するかまたは下垂体組織から抽出したｂｓｔは商業上重 要である。それは、乳牛の乳分泌を増進し、肉牛の大きさおよび肉生産を増加さ せる。商業上許容しうる生産向上をもたらすためには、１匹、１日あたり２０ｍ ｇまで必要であると見積もられている。かかる投与量のためには効率的な投与方 法を必要とする。本発明に記載のｂｓｔの効能における改良は、各動物に投与す る１日あたりの薬量を減らすことができるため有益であろう。

さらに、組換え法により生産したタンパク質を回収する際の主要な問題の１つは 、ジスルフィド結合を適切に形成させることである。

ｂｓｔは天然の状態で２個のそのようなジスルフィド架橋を有する。

ｂｓｔは成熟ｂｓｔの５３．１６４．１８１および１８９のアミノ酸位置に４個 のシスティン残基を含有する。最初の２つは、いわゆる大ループを生成するジス ルフィド結合を形成し、一方、後の２つはｂｓｔの小ループを形成する。イー・ コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で生産される組換えウシ・ソマトトロピン（ｒｂＳｔ’ ）タンパク質は還元型であり、単離方法において、ジスルフィド架橋を形成する 酸化段階を要する。該タンパク質は還元しうるダイマーおよびポリマーが形成さ れることが観察されている。該ダイマーはラット・バイオアッセイにおいて生物 効果を減少させ、乳牛中において乳生産を減少させることが示されている。また 、該ダイマーｂｓｔは抗原性でありうる。本発明は、特に、システィン１８１と １８９との間のジスルフィド架橋を除くことによりこれらの問題を克服する。

情報の開示 ｂｓｔのアナログは公知である（例えば、欧州特許出願７５，４４４および１０ ３，３９５およびヌクリーク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ 　Ｒｅｓ、）１０　（２０）：６４８７（＋９８２））を参照）。

ジー・ウィンター（Ｇ、　Ｗｉ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒ）およびエイ・アール・フェア シュド（Ａ、Ｒ，Ｆｅｒｓｈｔ）は、キーとなる配列部のアミノ酸組成を変化さ せることによる酵素活性の改変について論評している（ティー・アイ・ビー・ニ ス（ＴＩＢＳ）、２．１１５頁（１９８４））。著者らはある酵素において、酵 素活性を保持したままシスティンをセリン残基に変えることについて言及してい る。

エル・グラフ（Ｌ、Ｇｒａｆ）らは、システィン１８１とシスティン１８９との 間のジスルフィド結合が緩和な条件下、すなわち変性剤の不存在下で容易に開裂 されることを示した（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペブタイド・ア ンド・プロティン・リサーチ（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔ、Ｒｅｓ 、）、７．４６７〜７３頁（１９７５））。また、著者らはラット脛骨試験にお ける測定により、還元ｂｓｔが成長促進活性を保持することを報告している。こ の活性は、生ずるチオール基をヨードアセトアミドのような無電荷のアルキル化 剤でブロックすることにより左右された。著者らは、アルキル化をヨード酢酸で な（ヨードアセトアミドで行った場合、成長促進活性の顕著な損失はなかったこ とを示した。

エム・シュレヤー（Ｍ、５ｃｈｌｅｙｅｒ）らは、種々の技術により、生物活性 を保持したままブタ成長ホルモンのジスルフィド架橋を開裂させる研究を記載し た（ホッパ・ゼイラーズ・ザイチュリフト・フコーア・フィシオロギシェ・ケミ −（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）３５４ ．２９１頁（１９８３））。

エム・シュレヤー（Ｍ、５ｃｈｌｅｙｅｒ）らは、生物活性を完全に失うことな く、ヒト成長ホルモンのジスルフィド架橋を開裂させることについて言及してい る（ホッパ・ゼイラーズ・ザイチ１リフト・フニーア・フィシオロギシェ・ケミ −（Ｈｏｐｐｅ−ｓｅｙＩｅｒ’ｓ　Ｚ　Ｐｈｙｓｉｏ’１．Ｃｈｅｍ、）３６ ３．１１１１頁（１９８２））。

エイ・ワンプ（Ａ、Ｗａｎｇ）らは、インターロイキン２中のシスティン残基の セリンによる置換および該変化が生物学的活性に及ぼす効果について言及してい る（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２４．１４３１頁（１９８４）、米国特 許第４．５１８．５８４号および英国特許出願２，１３０．２１９Ａ）。３個の うち少なくとも２効能のシスティンが十分な生物学的活性には必要のようであっ た。

ピー・マンツァラ（Ｐ、Ｍａｎｔｓａｌａ）およびエイチ・ザルキン（Ｈ，Ｚａ ｌｋｉｎ）は、グルタミンアミドトランスフェラーゼ酵素中のシスティンをフェ ニルアラニン残基で置換することによる効果について言及している。この変化は 、グルタミンからアミドを活性化させる酵素機能をなくさせた（ジャーナル・オ ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、）　、２ ５９．１４２３０頁（１９８４））。

米国特許第３．２６４．１８６号は、ウシ成長ホルモンをメチオニンの箇所で制 限的に開裂して活性なタンパク質を生じることを記載している。

ティー・トクナゲ（Ｔ、Ｔｏｋｕｎａｇｅ）らは、ヒト成長ホルモン中で１６５ 位システィンをアラニンに変えて、ｃｙｓ−５３とｃｙｓ−１６５との間のジス ルフィド結合を除去することについて言及している。著者らは、下垂体摘出ラッ トの体重増加を調べることにより、ａｌａ−１６５分子が完全な生物活性を有す ることを見いだした（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（ Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１５３：４４５〜４４９　（１９８５））。

発明の概要 本発明は、ｂＳ　ｔ　（ｃ　ｙ　ｓ−＋ｓ　ｅ　ｒ）において例示するように、 ５３．１６４．１８１および１８９位のうち少なくとも１位におけるアミノ酸が システィンからセリンに変化した、ならびにブタおよびヒツジを包含する他種か らのソマトトロピンにおいて同様に変化した動物ソマトトロピンの生物活性、加 工性および生産物の均一性の増大に関する。

より詳細には、本発明は、５３．１６４．１８１および１８９残基に対応するシ スティン残基の少なくとも１つをセリンで置換した哺乳動物ソマトトロピンに関 する。

より詳細には、１８１および１８９残基に対応するシスティン残基を共にセリン で置換した哺乳動物ソマトトロピンを開示する。

さらにより詳細には、それは、１８１および１８９アミノ酸残基に位置するシス ティンをセリンに変換したｂｓｔアナログ（ｃｙｓ−＊ｓｅｒ　ｂＳｔ）である 。

詳細には、１８１残基に対応するシスティン残基をセリンで置換するか、または １８９残基に対応するシスティン残基をセリンで置換した動物ソマトトロピンを 包含する。より詳細には、該動物は哺乳動物であり、さらにより詳細には、ウシ である。

また詳細には、５３または１６４位のシスティン残基の少なくとも１つをセリン で置換した、より詳細には、システィン残基５３をセリンで置換した、またより 詳細には、システィン残基１６４をセリンで置換した動物ソマトトロピンを包含 する。より詳細には、該動物は哺乳動物であり、さらにより詳細には、ウシであ る。

また、開示する少なくとも１つの動物ソマトトロピンの有効量を該動物に与える ことからなる動物の成長を増進させる方法を提供し、ここに、詳細には、該動物 は哺乳動物であり、より詳細には、該哺乳動物はウシである。

また、本発明における動物ソマトトロピンの有効量を投与することからなる、メ スの反別動物における乳生産を増大させる方法を提供し、ここに、より詳細には 、該反別動物は乳牛であり、該ソマトトロピンはｂｓｔである。

また、５３．１６４．１８１および１８９残基に対応する少な（とも１つのシス ティン残基をセリンに変化させた動物ソマトトロピンをコードするＤＮＡからな るベクターを提供し、詳細には、これはソマトトロピン様タンパク質の発現に導 きうる。

また、前記ベクターの宿主となる微生物、詳細には、バクテリア属、エシェリヒ アからの微生物を提供する。

これらのアミノ酸残基の化学的および遺伝学的修飾は共に、本発明により含まれ る。

好ましい遺伝学的修飾は、天然に存在するシスティンの代わりにセリン残基を挿 入するための単一部位特異的突然変異法に依存する。

詳細な記載 ソマトトロピンの分子異質性のため、種々のソマトトロピンのアミノ酸残基の位 置番号が異なりうる。「天然の哺乳動物ソマトトロピン」なる語は、これらの天 然に存在する種を包含する。チャートｌはｂｓｔの１つの種を示し、また本発明 の修飾部位に対応するアミノ酸のナンバリングを示す。他のソマトトロピンにつ いてのナンバリングは異なることがある。しかしながら、チャート１におけるｂ ｓｔの５３．１６４．１８１および１８９と番号を付けたシスティンを用い、当 業者ならば、他の天然の動物ソマトトロピンまたはそのアナログにおける対応す るアミノ酸配列を容易に位置づけて、所望の、生物活性、加工性および生産物均 一性の増大を得ることができる。

「最近縁（ｃｌｏｓｅｓｔ−ｒｅｌａｔｅｄ）天然ソマトトロピン」なる語は、 本発明の特異的ソマトトロピンアナログと比較した場合、動物ソマトトロピンの 天然に存在する他のいずれの形態よりもアミノ酸配列においてより大きな同一性 を有する天然に存在する動物ソマトトロピンの形態を意味する。例えば、チャー ト１のｂｓｔは、５３位のシスティンをセリンで置換したアナログに対し「最近 縁天然ンマトトロビン」である。天然のソマトトロピンのアナログは、その親代 合物との十分なタンパク質問−性を有して成長促進剤または乳生産刺激剤として の生物活性を有すると仮定して、「ソマトトロピン様タンパク質」なる語は、天 然の形態のソマトトロピンおよび天然のソマトトロピンのアナログの双方をいう 。

「動物ソマトトロピン」なる語は、動物由来のソマトトロピンをいい、例えば下 垂体組織のような天然源由来のソマトトロピンまたは天然存在形態のソマトトロ ピンを生産する組み換えＤＮＡ技術により形質転換した微生物由来のソマトトロ ピンいずれも包含する。

例えば、ウシ・ソマトトロピンのような特別な哺乳動物源を呼称する場合、該ソ マトトロピンは天然由来または形質転換微生物由来のものいずれも包含する。

本明細書中で使用する「微生物」なる語は、細菌、酵母、放線菌および細胞培養 で増殖させた高等植物または動物からの単細胞のような単細胞原核ならびに真核 生物を共にいう。また、トランスジェニック・アニマルは、異種ポリペプチドを 生産する分野の当業者に公知である。

「天然」なる語は、例えば下垂体組織のような天然源または天然に存在する形態 のソマトトロピンを生産するために組換えＤＮＡ技術により形質転換した微生物 いずれに由来してもよいツマ２−コドンの天然に存在する形態をいう。

「ベクター」なる語は、クローニング・プラスミド、および微生物中で機能でき るプロモーターに作動可能に連結しているソマトトロピンをコードするＤＮＡに よりソマトトロピンの発現を指令スるためのプラスミドの双方を意味する。また 、いくつかの状況においては、ベクターなる語は異種ポリペプチドをフードする ＤＮＡの染色体挿入を包含しうる。

ソマトトロピン類は、アミノ酸配列および物理的構造において非常に類似してい る。実施例において記載する方法は、ｂｓｔに向けられているが、該方法は、セ リンへの変換に使用できる必要なシスティン残基を有するあらゆる動物ソマトト ロピン、特に他の哺乳動物ソマトトロピンに同等に適用できる。

ｒｂＳｔの単離における酸化段階の間、分子間ジスルフィド架橋にユリ、還元し うるタンパク質ダイマーおよびオリゴマーが形成される。この問題を克服するた めに、ｒｂＳｔアナログを構築した。

これらのアナログは、システィンのコドンに対応する１８１および１８９位をセ リンのコドンに変えたＤＮＡ配列を有するものを包含し、２種の他のアナログは セリンコドンに変化させた１８１または１８９いずれかにおけるコドンを有し、 １種は１７９位に翻訳停止コドンを含有する切形ｒｂＳｔタンパク質をコードす る。これら４種のアナログを遺伝子融合で作り、発現ベクターｐｃＦＭ４１４お よびイー・コリ株ＡＭ３４３　Ｃを使用して発現させた。該ベクターは、ｐＲＡ −ｂＳｔ／ｈｙｂ−８ｅｒ１８１／９、ｐＲＡ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−３ｅｒ１８ １、ｐＲＡ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−３ｅｒ１８９およびｐＲＡ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−１ ７９Ｔと称する。また、対照として供するために、非修飾ｒｂＳｔ生産物、ｐＲ Ａ−ｂＳｔ／ｈｙｂをフードするＤＮＡを含有するベクターを構築した。これら ５種のベクターはすべて、ＡＭ３４３ｃ株中で高いレベルでｒｂＳｔを発現する ことが判明した。

ｃｙｓ−＊ｓｅｒ　ｂＳｔのより高い相対的効能は、下垂体摘出ラットを使用す ることにより容易に測定できる（エバンス・エイチ・エム（Ｅ　ｖ　ａ　ｎ　ｓ 、　Ｈ，Ｍ、）およびロング・ジェイ・エイ（Ｌｏｎｇ。

Ｊ、Ａ）、アナトミカル・レコード（Ａｎａｔ、Ｒｅｃ、）２１　：６１．１９ ２１）、下垂体ｂＳ　ｔ、ｒｂＳ　ｔおよびｂｓｔ７す。グの種々の画分を使用 して全体重の相対的増加を記録する。

ｃｙｓ−＋ｓｅｒ　ｂＳｔの乳牛への投与は、必要量を該動物の循環系に送達さ せるのに有効ないずれかの経路を使用する公知方法に従って行った。投与方法は 、経口、筋肉注射、皮下注射および時間調節放出インブラントの使用を包含する 。好ましい投与方法は、時間調節放出インブラントを使用する皮下注射によるも のである。注射のための適当なビヒクルは、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウ ムまたはリン酸アンモニウム溶液のような生理学的に適合した緩衝剤を包含する 。時間調節放出インブラントは該技術において公知である（例えば、米国特許第 ４．３３３．９１９号）。

有効な用量の範囲は、動物１匹、１日当たり１．０〜２００ｍｇである。ｂｓｔ を多く与えるほど、得られる成長、泌乳または乳実質細胞の数は増加する。最も 好ましくは、該用量の範囲は、１日当たり５〜５０ｍｇである。

成長ホルモン類はそのアミノ酸配列において非常に類似しているため、１つの種 由来のホルモンは、通常、他の非類縁動物種の成長を増加させることができる。

本発明におけるｂｓｔアナログを使用して、ウシ、ヒツジ、ラット、サケおよび ニワトリのような、天然のｂｓｔが成長関連生物活性を有することが示されてい る種における成長を増大させうる。好ましい動物は、パル、ヘファーまたはステ イア−のような牛肉に使用されるウシである。

肉牛は、完全な成熟および大きさに達する直前に層殺される。

ｃｙｓ−＋ｓｅｒ　ｂＳｔを使用して、層殺までの離乳の間に随時投与すること により、肉牛の成長速度を増大させうる。所望の屠殺時に応じて、最小３０日間 、最大４５０日間、ｃｙｓ−＋ｓｅｒ　ｂＳｔを肉牛に投与する。ビール（ｖｅ ａｌ）に使用する動物は、典型的には、約６月齢で層殺し、層殺の齢になるまで １日当たり１０〜３０ｍｇのｃｙｓ−＋ｓｅｒ　ｂＳｔを投与して所望の成長速 度の増大を得る。

ウシ、特に乳牛における泌乳を増加させるためには、出産後の３０と９０日の間 にｃｙｓ−＋ｓｅｒ　ｂＳｔを投与し、３００日間まで継続する。また、ｃｙｓ −＋ｓｅｒ　ｂＳｔは、ヤギおよびヒツジのような他の商業的乳生産動物におけ る泌乳を増加させる。

株＋ＭＣ１０００（Ｆ−１ａｒａＤ＋ｓ＊、ｄｅｌ　（ａｒａＡＢＣ−１ｅ　ｕ ）　ｗｅｔｓ、　ｇ　ａ　ｌ　Ｕ、ｔ　ｒ　ｐ　ａｗａ、　ｍ　ａ　Ｉ　Ｂ　ａ ｍ、　ｒｓｐＬ。

ｒｅｌＡ、ｔｈｉ）（ジ・エクスパーリメンツ・ウィズ・ジーン・ラージ１ン・ ストレイン・キット（ｔｈｅ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆ ｕｓｉｏｎ　５ｔｒａｉｎ　Ｋｉｔ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 ：ｌ−ルド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ） 、二ニーヨーク（Ｎｅｗ　ＹＯｒｋ）で入手可能）およびＪＭ８３　（ａｒａ、 ｄｅｌ（Ｉａｃ−ｐｒｏ）、ｒｓｐＬ、ｐｈｉ８Ｑ　１ａｃＺ”ｄｅ１Ｍ１５） （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ｔｅｃｔ　１ｏｎ）　、１２３０１．パークローン 、ドライブ、ロックピし、メリーランド（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ　Ｒｏ ｃｋｖｆ］　１ｅ、Ｍａ　ｒｙ　１ａｎｄ）２０８５２）より入手可能）株をベ クター構築のコンピテント細胞として使用する。ＡＭ３４３ｃ　（Ｆ−。

ｓｕｐ’、ｔｏｎＡ）株を誘導に使用する。それは内在性発現プラスミドｐＣＦ Ｍ４１４−ｂＧＨの株を脱落させることによって、発現株ＡＭ３４３Ｃから得た 。ＡＭ３４３Ｃ株（ＵＣ”９８０１とも称される）を、アグリカルテャル／リサ ーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ／Ｒｅ ５ｅａｒｃｈｓｅｒｖｉｃｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、ノー イン・リージョナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａ ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）、１８１５、ノース・ユニバージティー ・ストリート、ペオリア、イリノイ、（Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ ｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ。

１１１ｉｎｏｉｓ）６１６０４）に、１９８９年１月２４日に寄託し、受託番号 ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４４３が付与された。発現用の別の株は、ＢＳＴ−ＩＣであ る（ここに参照文献として合体させるＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８参照）。

プラスミド：本明細書中に記載の構築には、ｐＵＣ９（ジェイ・ビエイラ（Ｊ、 Ｖｊｅｉｒａ）およびジェイ・スプリング（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ）、ジーン（Ｇ ｅｎｅ）１９．２５９〜２６８頁（１９８２Ｌベセスダ・リサーチ・ラボラトリ −（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）より入手 可能）およびｐＣＦＭ４１４−ｂＧＨベクターを使用した。ｔｒｐプロモーター およびイー・コリ（Ｅ、Ｃｏ　Ｉ　ｉ）からのｔｒｐｔ、リボゾーム結合部位を 含有するＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片、および合成りｓｔ遺伝子を挿入すること により、ｐＣＦＭ４１４−ｂＧＨベクター（前記ＡＭ３４３　Ｃで寄託）をｐｃ ＦＭ４１４（米国特許第４゜７１０．４７３号）から構築した。ｐＴｒｐ−ＢＳ ｔｍｌおよびｐＴｒｐ−ＢＳ　ｔｍｌ　ｂベクターがＰＣＴ／ＵＳ　８８１０　 Ｏ３２８に記載されている。これらのベクターは共に、ｂＳｔ　ｃＤＮＡ遺伝子 を使用して構築した（ここに参照文献として合体させるＰＣＴ／ＵＳ８８１００ ３２８）。ｂｓｔカルボキシル末端をコードするＤＮＡ配列において、両ベクタ ーを修飾した。ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌベクターは、ｂｓｔについての翻訳停止コ ドンの直後にＢａｍＨＩ制限部位を有し、１８９位にセリンコドンを含有する。

ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂベクターは、それがｂｓｔの１８９位に対応するシステ ィンコドンを含有する点を除き、ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌと同様である。

培地：培地については既に記載されている（ジエイ・エイチ・ミラー（Ｊ、　Ｈ ，Ｍｉ　Ｉ　Ｉｅｒ）、エクスバーリメンツ・イン・モレキユラー・ジェネティ ックス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＣｏｌｃＪ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−、 ニューヨーク　（Ｃｏｌｃｉ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ）。

ＤＮＡｇ製およびクローニング法：はとんどのＤＮＡｍ製および一般的技術は、 当業者によく知られた技術により行う（ここに参照文献として合体させる、ティ ー・マニアテイス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング（ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）ニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌ ａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ −（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（Ｃｏｌｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）’ｌ照）。詳細には、既に記 載されているようにＤＮＡｆｃ調製する（ジエイ・イー・モノト（Ｊ、ＥｏＭｏ 　ｔ　ｔ）ら、イーエムビーオー・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、４．１８８７ 〜１８９１頁（１９８５））。

製造者の推薦に従い、制限消化および連結反応を行う。ニュー・イングランド・ バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から制限酵素および リガーゼを購入する。ＤＮＡ断片をアガロースゲルから２つの技術のうちの１つ により単離する。８００ｂｐ未満の断片については、バンドを該ゲルから切り取 り、砕き、フェノール存在下ドライアイス上乾燥する。遠心分離により水性相を 分離し、エタノール沈殿させる。８００ｂｐ以上の断片については、バンドを該 ゲルから切り取り、電気溶出させる（ティー・マニアティス（Ｔ、　Ｍａｎ　ｉ 　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、同上）。

プラスミド形質転換：形質転換すべき細胞を一夜増殖させ、ｌ／１００を継代培 養させる。これらの細胞を中期対数相にまで増殖させ、５ｍｆｆを遠心分離し、 冷５０ｍＭ　ＣａＣ１，１０ｍ１２中に再懸濁させ、氷上または４℃で少なくと も１時間インキュベートする。

再度、該細胞を遠心分離し、０．５　ｍＱ　５０　ｍＭ　Ｃａ　Ｃ］　ｔニとる 。

約１００μＱの細胞を氷上でプラスミドＤＮＡとともに１時間インキュベートす る。３７°Ｃで７分間、細胞に熱シラツクを与え、アンピシリン　１００μｇ／ ｍＱを含有するＬＢ平板上で平板培養する。２７℃でランナウェイ・ベクターの 選択を行う。非ランナウェイ・ベクターの選択は３７℃で行う。

吋すゴマー精製：既に記載されているようにしてオリゴマーを合成し単離する（ ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８）。

合成断片の形成：リガーゼ緩衝液の存在下でオリゴヌクレオチドＪＭ−１および ＪＭ−２（チャート２）を１００℃まで加熱し、該混合物を室温まで冷却するこ とにより、１７９位の終止コドンの導入のための合成りＮＡ断片を形成する。１ ８１および１８９のセリン置換のための４個のオリゴヌクレオチド・ブロックを 生成するために、まず高時異的ｐｓｔ標識ガンマＡＴＰでオリゴマーＪＭ−４お よび５をキナ−ゼ反応に付し、ついでＪＭ−３およびＪＭ−（３にハイブリッド 形成する（チャート３）。その４個のオリゴヌクレオチド構造を連結し、非変性 ポリアクリルアミドゲルから単離する。

誘導法：ｐＣＦＭ４１４ランナウェイ・ベクター由来のベクターを含有する細胞 を２７℃で一夜増殖させ、アンピシリン　１００μｇ／ｍＱで補足したブロスに １１５０を継代培養する。二ニー・ブルンスウィック・エアー・シェイカ−（Ｎ ｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋａ　ｉ　ｒ　５ｈａｋｅ　ｒ）中、約２５Ｏｒｐｍ、 ２７℃で該細胞を増殖させる。該細胞が０．２と０．４との間のＯ，Ｄ、５５０ に到達した時、ＳＤＳ　ＰＡＧＥについてのサンプル採取し、該培養を３７℃の エアー・シェイカーに移す。ｐＵＲＡ−１由来のベクターを含有する細胞を、既 に記載されているように誘導させる（ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８）。

ＳＤＳ　ＰＡＧＥ：ＳＤＳ　ＰＡＧＥ法は既に記載されている（ジェイ・イー・ モット（Ｊ、Ｅ、　Ｍｏ　ｔ　ｔ）ら、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル ・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイティド・スティソ・オ ブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、８２． ８８〜９２頁（１９８５））。

ユナイティド・スティソ・バイオケミカル（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ）からシーフェンシング・キット、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕ ｅｎａｓｅ”）を購入する。製造者の推薦に従い配列決定を行う。エル・ビー・ アジエロン（Ｌ。

Ｂ、Ａｇｅ　Ｉ　Ｉｏｎ）およびティー・ティー・チェノ（Ｔ、　Ｔ、　Ｃｈｅ ｎ）、ジーン・アナリシス・テクニックス（Ｇｅｎｅ　Ａｎａａ　１．Ｔｅｃｈ ｎ、）　、３．８６〜８９頁（１９８６）の方法により、２本鎖配列決定用のＤ ＮＡを調製する。２本鎖ＤＮＡの配列決定については、アニーリング方法を以下 のように修飾する：２ＭＮａＯＨ３μＱ、２ｍＭ　ＥＤＴＡを２本鎖プラスミド ＤＮＡ１２μｆｆに加え、室温で５分間インキュベートし、１１００ｎ／μＱプ ライマー３μＱを加え、該混合物をｌＯ分間インキユベートシ、ついで３Ｍ酢酸 ナトリウム　６μＱを加える。さらに５分のインキュベーションの後、水冷９５ ％エタノール　１００μｇを加え、ドライアイス上で２０分間、ＤＮＡを沈殿さ せる。該ＤＮＡをベレット化し、７０％エタノールですすぎ、真空乾燥する。水 ８μＱおよび配列決定用緩衝液２μρ中に再懸濁させた後、製造者の指示に従い 配列決定を継続する。ｄＧＴＰ終結混合物Ａ、Ｃ，ＧおよびＴ　２．５μＱをピ ペットで個々のマイクロタイターのウェルに入れ、３７℃で予備加熱する。

水冷ＴＥ緩衝液中でシークエナーゼ酵素をに８に希釈する。標識反応については 、０．１Ｍ　ＤＴＴ　ｌμＱ、希釈標識混合物２μＱ、３５Ｓ−ｄＡＴＰ　２μ ｇおよび希釈シークエナーゼ２μＱをアニール化したＤＮＡに加え、該反応を室 温で２分間インキュベートする。終結反応については、標識反応３．５μＱを各 終結ウェル（Ａ、Ｃ，ＧおよびＴ）に加え、さらに５分間インキュベートする。

停止混合物４μＱで該反応を停止する。７５℃で２分間、該反応を沸騰させた後 、各反応４μＣを配列決定用ゲル上に載せる。

温度感受性ランチウェイ・ベクターｐＣＦＭ４１４−ｂＧＨはｒｂＳｔを高レベ ルで発現させる。ｔｒｐプロモーターから発現され、翻訳開始のためのｔ　ｒｐ Ｌリポソーム結合部位を使用する合成ｒｂｓｔ遺伝子を、該ベクターは含有する 。この合成ｒｂＳｔ遺伝子およびｃＤＮＡ　ｒｂＳｔ遺伝子（ＰＣＴ／ＵＳ８８ １００３２８）は共に、アミノ酸９０および９１に対応する配列に、特有のＰｓ ｔＩ制限部位を有する。したがって、この共通のイン・フレーム部位を使用して ハイブリッドｂｓｔ遺伝子をつくることができる。

ｐｃＦＭ４１４ベクター中にクローニングする場合、該合成遺伝子のＮ−末端領 域およびｃＤＮＡ遺伝子のカルボキシル末端をコードする配列を含有するハイブ リッド遺伝子、ｂＳｔ／ｈｙｂを発現させて、ｒｂＳｔタンパク質を高レベルで 生産させる。ｂｓｔ／ｈｙｂ遺伝子を使用して、ｂｓｔ遺伝子の末端部をｃＤＮ Ａセグメント上に位置する唯一の制限部位を用いて改変させうる。例えば、該ｃ ＤＮＡは、アミノ酸１７５．１７６および１７７をコードする配列に、Ｍｓｔ１ １制限部位を含有する。これらは、１８１および１８９位のシスティコトンを改 変させるかまたは翻訳を未完成に終結させる合成りＮＡ断片で、カルボキシル末 端の配列を置換するのに使用しうる。制限部位を利用するためには、これらの部 位が唯一のままであるベクター中に、該ハイブリッド遺伝子を入れなければなら ない。

実施例１　小ループを欠いた切切ｂｓｔをコードするｂｓｔ遺伝子の構築 １、ｐＤＨ２３の構築 ｐＵＣ−９ベクター（ジェイ・ピエイラ（Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ）およびジェイ・メ ッシング（Ｊ、Ｍｅｓｓ　ｉｎｇ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９．２５９〜２ ６８頁（１９８２）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ガイセルブルク、 メリーランド（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅａｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、２０８７７より入手可能） はｐＢＲ３２２由来の、高コピー数の構成的ベクターである。それはアンピシリ ン耐性用遺伝子およびＩ　ａ　ｃ　Ｚ’　ベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子を発 現させるｌａｃプロモーターを含有する。該Ｉａｃ２′遺伝子は、］ａｃＺｄｅ １Ｍ１５ベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子（ビエイラおよびメッシング、前掲） により産生されたペプチド断片を機能的に相補しうるＮ末端の小ペプチド断片を コードする。

この相補性は、ベータガラクトシターゼを機能させて細胞中で青変する色素基質 物質Ｘ−Ｇａ１（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ガイセルブルク、メリ ーランド（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅａｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ。

ＭＤ）を使用することにより可視化されうる。ｐＵＣ９を修飾して、１ａｃＺ’ 　についての配列内にポリクローナル部位と称される唯一の制限部位を含有させ た。これらの部位に挿入したＤＮＡ断片は、Ｉ　ａ　ｃ　Ｚ’　ペプチドが産生 される能力およびそれがｌａｃＺｄｅｌＭ）５ベータ・ガラクトシダーゼタンパ クを相補する能力を喪失させる。そのような細胞は、Ｘ−Ｇａ１指示剤の存在下 、青に変化しない。

ｐＵＣ−９ベクターはＭｓｔＩ［制限部位は含有しないが、Ｅｃ。

Ｒ１，ＢａｍＨＩＳＰｓｔ　ＩおよびＨ４ｎｄＩＩＩについてのｌ　ａ　ｃ　Ｚ ’ポリリンカー中に唯一の部位を含有する。該ｐＵＣ−９ベクターを修飾して、 ハイブリッド遺伝子の構築およびそれに続く修飾を妨げるＰｓｔＩおよびＨｉ　 ｎｄＩ［［部位を除去する。これはＨｉｎｄＩ［［およびＨｉｎｄＩｒで該ベク ターを消化することにより行う。また、Ｈｉｎ［部位はポリクローナル部位中に 存在する。Ｈｉｎｄ■部位をＰｏ１Ａクレノウで満たし、該ベクターを連結し、 コンピテント細胞ＪＭ８３細胞に形質転換する。得られたプラスミドをスクリー ニングし、Ｈｉ　ｎｄｌｌＩおよびＰｓｔｌ制限部位を欠失しているがＢａｍＨ ＩおよびＥｃｏＲ１部位を保持している候補を選択する。

Ｉ　ａ　ｃ　Ｚ’遺伝子は適切な読み取り枠を保持しているため、ポリクローナ ル部位へのこの変換は１ａｃＺ“ペプチドの補完能力に影響を与えない。得られ たベクターをｐＤＨ２３と呼ぶ。唯一なＥｃ。

Ｒ１およびＢａｍＨＩ制限部位は合成りｓｔ遺伝子のクローニングを可能にする 。

２、ｂＳｔ／ｈ３ｒｂ　合成り５ｔ−ｂＳｔ　ＣＤＮＡハイブリッド遺伝子の構 築。

合成りｓｔ遺伝子をプラスミドｐＣＦＭ４１４−ｂＧＨからＥｃｏＲ１／Ｂａｍ Ｈ１断片として単離し、前もってＢａｍＨｌおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＤＨ ２３ベクター中にクローニングする。

また、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片はｔｒｐプロモーターおよびｔｒｐＬリポソ ーム結合部位を含有する。得られたベクターはｐＤＨ−ｂｓｔと称する。このベ クターにおいて、ｂｓｔ遺伝子中のＰｓｔｌおよびＢａｍＨＩ制限部位は唯一の ものである。

Ｐｓ　ｔ　Ｉ／ＢａｍＨＩ断片をｐＴｒｐ−ＢＳ　ｔｍｌベクターから単離する 。このベクターは、ｔｒｐプロモーターから発現されるｂＳｔ　ｃＤＮＡを含有 し、ｔｒｐＬリポソーム結合部位を用いる。

ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌ中のｂｓｔ遺伝子を修飾して１８９位のセリンをコードさ せる。ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌベクターをＰｓｔｌおよびＢａｍＨｌで消化し、ｂ ｓｔのカルボキシル末端についてのＤＮＡ配列を含有する約３１５ｂｐの断片を 単離する。この断片を、前もってＰｓｔｌおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミ ドｐＤＨ−ｂｓｔ中に結び、合成りｓｔ遺伝子のＰｓｔｌからＢａｍＨＩ配列と 置換する。このクローニングから得られたベクターをｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ− １８９Ｓと呼ぶ。この構築は、ｂｓｔ遺伝子のＰｓｔｌとＢａｍＨＩとの間に位 置する唯一の制限部位ＭｓｔＩＩを含有する。

３、ｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−１８９Ｓベクタ一誘導体３種のベクターは第２節 のｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−１８９Ｓからの由来である。最初のクローニング では、ｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−１８９ＳベクターをＰｓｔＩ［およびＢａｍＨ Ｉで消化し、大きなベクター断片を単離する。Ｐｓｔｌ／ＢａｍＨＩ断片をｐＴ ｒｐ−ＢＳｔｍｌｂから単離する（ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８）から単離す る。ｐ’ｌ”ｙｐ−ＢＳｔｍｌｂは、ＭｓｔＩｌとＢａｍＨＩ制限部位との間に クローニングした合成由来のオリゴヌクレオチド断片を含有する以外は、ｐＴｒ ｐ−ＢＳｔｍｌと同様である。この断片は、アミノ酸１８１および１８９に対応 する位置にシスティン・コドンＴＧＣを含有する以外は、チャート３に記載する 断片と同一である。該コドンの使用を最適化し、ＨｉｎｄＩ［［制限部位を１８ ９および１８９のコドンの間の配列中に設ける。Ｐｓ　ｔ　Ｉ／ＢａｍＨＩ断片 をｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂから単離し、ｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−１８９Ｓベ クターの大断片に結んで、ｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂを得る。ｐＤＨ−ｂＳｔ／ ｈｙｂのｂｓｔ遺伝子は天然のｂｓｔをコードする。

次の２つのクローニングにおいて、ｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−１８９ＳをＭｓｔ ＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、該消化物から大きなベクター断片を単離する。

４個のオリゴヌクレオチド由来の合成断片をチャート３に示す。この合成断片を 消化してＭｓｔｌｌ／ＢａｍＨＩ制限部位中に挿入する。この断片の挿入により 、アミノ酸の１８１および１８９位にセリンを有するｂｓｔタンパク質をコード する遺伝子が生成する。この断片をｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−１８９ＳのＭｓ　 ｔ　ＩＩ／　Ｂ　ａｍＨＩの大断片に結んで第２のベクターｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈ ｙｂ−３ｅｒ１８１／９をつくる。このベクターにおいて、制限部位Ｐｓｔｌ、 ＭｓｔＩ［、ＨｉｎｄｌｌおよびＢａｍＨＩは唯一のものである。

チャート２に示す合成断片を挿入することにより、ｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−ｔ ａｓｓ由来の第３のベクターをつくる。この断片は、ｂｓｔの１７９位に対応す る翻訳停止コドンをコードする。該断片をｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−１８９Ｓ のＭｓ　ｔ　ＩＩ／ＢａｍＨＩ断片に結んで小ループを欠いた切形ｂｓｔをコー ドするｂｓｔ遺伝子を生成させる。このベクターはｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ− １７９Ｔと称する。

ｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−３ｅｒ１８１／９およびｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／Ｍｂ−１ ７９Ｔの構築は、ＤＮＡ配列分析により確認する。

実施例２　１８１または１８９位のいずれかにおいてコードされる各セリン置換 ｂｓｔ遺伝子の構築 本実施例は、１８１または１８９位にそれぞれセリンコドンを有する遺伝子を構 築するためのクローニング戦略を記載する。ｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂおよびｐＤ Ｈ−ｂＳ　ｔ／ｈ　ｙ　ｂ−３ｅ　ｒ　１８１／９（実施例１）の２種の出発ベ クターを使用する。ｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／Ｉ−Ｂｂは天然のｂｓｔ遺伝子をコード し、ｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−５ｅ　ｒ　１８１．／９は、アミノ酸１８１お よび１８９についてのセリンコドンを有する。両ベクターは、これら２のコドン についての配列の間に位置する唯一のＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ制限部位を有する。これ らのベクターをＥｃｏＲＩおよびＨｉ　ｎｄＩＩ［で消化することにより、各ベ クターから２個の断片が生成する。８５０ｂｐの断片はｔｒｐプロモーター、お よび１８１コドンを含めたｂｓｔ遺伝子の約９５％を含有する。クローニングに おいて出発ベクター間で該８５０ｂｐ断片を交換して、１８１位のシスティンコ ドンを含有するｐＤＨ−ｂ　Ｓ　ｔ　／　ｈ　ｙ　ｂからの断片を１８９にセリ ンコドンを有するｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−３ｅ　ｒ　１８１／９ベクター中 に導入し、逆に、ｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−３ｅ　ｒ　１８　］、／９からの セリン１８１コドンを含有する該８５０ｂｐ断片を１’８９システインコドンを 含有するｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂベクター中にクローニングする。このクローニ ングの結果、２種のベクター、ｐＤＨ−ｂｓ　ｔ／ｈｙｂ　−３ｅｒ１８１およ びｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈ）’ｂ−３ｅ　ｒ　１８９が得られ、これはアミノ酸の １８１または１８９位いずれかで単一のシスティンがセリンに置換したｂｓｔア ナログを発現する。

実施例３　ｐｃＦＭ４１４クローニング高レベルの発現のために、発現ベクター ｐＣＦＭ４１４−ｂＧＨに修飾遺伝子をクローニングする。ｐＣＦＭ４１４−ｂ ＧＨをＥｃｏＲＩおよびＢａｒｎＨＩで消化し、この大きなベクター断片を精製 し、このように内因性のｂｓｔ遺伝子を取り出す。ベクターｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ ｈｙｂ、ｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−３ｅ　ｒ　１８１／９、ｐＤＨ−ｂＳｔ／ ｈｙｂ−Ｓｅｒ１８１、ｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−３ｅｒ１８９およびｐＤＨ− ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−１７９ＴをＥｃ。

ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐＬリポソーム結合 部位および全ｂｓｔ遺伝子を含有する８７０ｂｐ断片をそれぞれから単離する。

該断片を各々ｐＣＦＭ４１４ベクタ一断片に結び、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ） 株ＭＣ１００Ｏのコンピテント細胞に形質転換する。各構築のためのプラスミド ＤＮＡを調製する。得られたベクターを、ｐＲＡ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ、ｐＲＡ　 −ｂＳｔ／ｈｙｂ−８ｅｒ１８１／９、ｐＲＡ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−５ｅｒ１８ １、ｐＲＡ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−３ｅ　ｒ　１８９およびｐＲＡ−ｂＳｔ／ｈｙ ｂ−１７９Ｔと称する。

実施例４　ｐＲＡベクターの発現 ベクターｐＲＡ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂＳｐＲＡ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−３ｅ　ｒ　１ ８１／９、ｐＲＡ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−３ｅ　ｒ　ｌ　８１、ｐＲＡ−ｂＳ　ｔ ／ｈｙｂ−３ｅ　ｒ　１８９およびｐＲＡ−ｂＳ　ｔ／Ｍｂ−１７９Ｔをイー・ フリＡＭ３４３　ｃのコンピテント細胞に形質転換する。該培養を前記のように 誘導し、各培養からの誘導後６時間のサンプルを５ＤＳＰＡ、ＧＥにより分析す る。すべての構築体は、その各ｒｂＳｔタンパク質の高レベルの発現を示す。ま た、イー・コリ株ＢＳＴ−ＩＣを発現に使用する（ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２ ８）。

実施例５１８１および１８９位にセリンを含有するｂｓｔアナログの別の発現系 の構築 前記ベクターｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−Ｓｅ　ｒ　１８１／９はＥｃｏＲＩと Ｐｓｔ１部位との間にｔｒｐプロモーター、ｔｒｐＬリポソーム結合部位および ｂｓｔの１〜９０のアミノ酸をコードする合成り５ｔＤＮＡ配列を含有し、それ はＰｓｔ１部位からＭｓｔｌＩ部位までにアミノ酸９１〜１７６位（実施例１） に対応するｃＤＮＡ遺伝子由来の配列を含有し、ＭｓｔｎからＢａｍＨＩ制限部 位までに合成オリゴヌクレオチドブロック（実施例１）由来の配列を含有する。

合成りｓｔ遺伝子由来の遺伝子部分は、ｐＤＨ−ｂＳ　ｔ／ｈｙｂ−５ｅｒ１８ １／９をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで消化し大きなベクター断片を単離すること により欠失しうる。欠失したセグメントは、ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４　（ＰＣＴ／ ＵＳ８８１００３２８）からのＥｃｏＲＩ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ制限断片で置換でき、 これはｔｒｐプロモーターおよびｔｒｐＬリポソーム結合部位およびｂｓｔの１ 〜９０のアミノ酸をコードするｃＤＮＡからのＤＮＡ配列を含有する。

また、このＤＮＡはｂｓｔの第２のアラニンに対応するコドンにおいてＧＣＣか らＧＣＴヘコドンが変化しており、この結果、発現が改良される（ＰＣＴ／ＵＳ ８８１００３２８）。得られるベクターはｐＤＨ−ｂＳｔｍ４−３ｅｒ１８１／ ９と称する。

ｂＳＴｍ４−３ｅｒ１８１／９　ｃＤＮＡ遺伝子をｐＵＲＡ発現ベクター（ＰＣ Ｔ／Ｕ　Ｓ　８８１０　Ｏ３２８）に導入するために、ｐＤＨ−ｂＳＴｍ４−Ｓ ｅｒ１８１／９およびｐＵＲＡ−１ベクターを共にＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ 制限酵素で消化する。ｐＵＲＡ−１からの大きなベクター断片およびｐＤＨ−ｂ Ｓ　ｔｍ４−３ｅ　ｒ１８１／９からの小さい方のｂｓｔ遺伝子断片を単離し、 ｒｐｏＣのＢａｍＨ１転写終止断片と結ぶ（ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８）。

結んだＤＮＡを使用してＭＣ１００Ｏのコンピテント細胞を形質転換する。得ら れたベクター、ｐＵＲＡ−ｂＳｔｍ４−３ｅｒ１８１／９は、それが１８１およ び１８９にｃｙｓ−＋ｓｅｒの修飾を含有することを除き、ｐＵＲＡ−４（ＰＣ Ｔ／ＵＳ８８１００３２８）と同一である。

発現については、該ベクターをＢＳＴ−１ｅ株（ＰＣＴ／ＵＳ８８１０　Ｏ３２ ８）に形質転換し、前記のように誘導する（ＰＣＴ／Ｕ８８１０　Ｏ３２８）。

実施例６５３または１６４位のシスティンをセリンに置換するｂｓｔ遺伝子の構 築 以下の方法を使用することにより、２本鎖ＤＮＡプラスミドにつき、オリゴヌク レオチド特異的突然変異誘発を行うことにより、５３または１６４位にセリンを 有するｂｓｔをコードするＤＮＡから５ｅｔ−５３または５ｅｔ−１６４をつく る：オリゴヌクレオチド４μ１２（４μｇ）を水５４μｅ１緩衝液（０，５ＭＴ ｒ　ｉ　５−ＨＣＱ、ｐＨ７，４，０，１Ｍ　Ｍｇ　Ｃｌ２ｔ、０．１Ｍジチオ トレイトール）７ｕＱ、５０ｍＭ　ＡＴＰ　２ｕＱおよびＴ４ポリヌクレオチド キナーゼ　１０単位／μａ３μｇを、最終容量を７０ｕｇとして、３７℃で６０ 分間インキコベートすることにより、オリゴヌクレオチドプライマーをリン酸化 する。該反応混合物をフェノールおよびエーテルで抽出し、乾燥乾固し、水３μ Ｑに溶解する。このリン酸化オリゴヌクレオチド２μＱを（室温で１５〜２０分 間、ＤＮＡ　２μｇヲ２Ｎ　ＮａＯＨ３ｕＱおよび２ｍＭ　ＥＤＴＡと１２ｕＱ 中でインキュベートすることにより変性させた）変性プラスミドＤＮＡ１５μｇ と混合し、ついで３Ｍ酢酸ナトリウム６μＱおよびエタノール１００μＱを加え る。該混合物をドライアイス中に１５〜３０分間保持し、遠心により沈殿物を収 集し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１０ｍＭ　トリｘ−ＨＣｆ２　（ｐ Ｈ７，４）２５ｕ（ｌおよび１ｍＭＥＤＴＡ中に溶解する。この溶液を該リン酸 化オリゴヌクレオチド１μＣ１水２０ｕＱ、１Ｍトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ８，３ ）７．５μ（２，０，２ＭＮａＣｌ２　１０μ１２、Ｏ，ＬＭ　ＭｇＣｆ２，２ ５ｕＱ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ２０ｕＱ、５ｍＭ　ＡＴＰ　１７．５μＱ、０．４ Ｍβ−メルカプトエタノール２０ｕｇ、フレノウ酵素（８０単位）１６μＣ，Ｔ ４ＤＮＡリガーゼ（８，０００単位）２０ｕｇおよびＴ４遺伝子３２タンパク質 （３２μｇ）１８μＱと混合する。合計容量が２００μの該反応混合物を３７° Ｃで１時間インキュベートし、ＮａＣＱと混合して最終的に０．２Ｍとし、フェ ノールおよびエーテルで抽出し、エタノールで沈殿させる。該沈殿物を１０ｍＭ トリス−ＨＣ＆　（ｐＨ７，４）および１ｍＭ　ＥＤＴＡ　１００μｉ２に溶解 し、イー−）す（Ｅ、Ｃｏ　１１）ＤＨＩ、ＭＣ１００Ｏまたは他の適当な株の 形質転換に使用する。

形質転換効率に依存し、形質転換に突然変異誘発プラスミドを使用する。

コロニー・ハイブリダイゼーションにより、突然変異誘発オリゴヌクレオチドを プローブとして使用し、野生型バックグラウンド上で変異を発見するために洗浄 条件を選択して、突然変異を有するプラスミドを担持する形質転換株をスクリー ニングする。ハイブリダイゼーションの方法は、ティー・マニアナイス（Ｔ、Ｍ ａｎｉａｔｉｓ）、イーーｘフ・フリッチｘ　（Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ）およ びジェイ・サンプルツク（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、モレキュラー・クローニ ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）中に記載のとおりである。一般に 、オリゴヌクレオチド・プローブ１〜２μｇを、５ＱｍＭ）リス−ＨＣＱ　（ｐ Ｈ７，８）　、１０ｍＭ　Ｍｇｃｃ、おｊび１０ｍＭ　ジチオトレイトールの合 計量２０μρ中の（γ−”Ｐ）ＡＴＰ　１００〜２００ＭＣ１およびＴ４ポリヌ クレオチドキナーゼ１０〜２０単位でリン酸化する。５ｘデンノ・−ツ溶液、５ ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、４２°Ｃでハイブリダイゼーションを行う。

５ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、オリゴヌクレオチド・プローブが、変化し た配列にアニーリングしたままとなり野生型配列から解離したままとなることを 許容する温度で、該フィルターを洗浄する。該オリゴヌクレオチド・プローブと 強力にハイブリッド形成する形質転換株を選択し、改変配列を確認するためにＤ ＮＡ配列決定を行う。

前記技術を使用し、５３または１６４位にセリンを有するｂｓｔをコードするＤ ＮＡを生じさせるために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発をプラスミドｐＵ ＲＡ−ｍ４　（ＰＣＴ／ＵＳ８８１０○３２８）で行う。ｃｙｓ−５３をセリン に変えるためにＧＴＴＧＣＣＴ　Ｔ　ＣＴ　ＣＴ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　ＣＴ　Ｇ　Ａ 　Ａ　Ａ、　Ｃの配列を有するオリゴヌクレオチドを突然変異誘発に、またフィ ルターの洗浄温度を５１°Ｃとスルコロニー・ハイブリダイゼーションのプロー ブとして使用する。

この変化したプラスミドをｐＵＲＡ−ｍ４−５３ｓｅ　ｔと称する。

ＣＴＧＣＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧＧのオリゴヌクレオチドにより、 フィルターの洗浄を５１℃にて、１６４位におけるセリン置換を行い、得られた プラスミドはｐＵＲＡ−ｍ４　１６４Ｓｅｒと称する。

実施例７　５３位および１６４位の双方にてシスティンをセリンで置換したｂｓ ｔ遺伝子の構築 この戦略では、ｂｓｔ遺伝子のコドン９０に位置するＰｓｔ１部位を使用して、 ５３または１６４位で１個のセリンで置換したｂｓｔ配列を接合させる。操作の 便宜のため該ベクター中の他のＰｓｔ１部位を除去するため、ｐＵＲＡ−ｍ４− １６４ｓｅｒからのｔｒｐプロモーターおよびｂｓｔ遺伝子を含有するＥｃｏＲ Ｉ／ＢａｍＨＩの小断片を単離し、それをｐＤＨ２３から単離したＥｃｏＲＴ／ ＢａｍＨＴの大きなベクター断片に結ぶことにより、セリンを１６４位に有する ｂｓｔ配列を、ｐＤＨ２３にサブクローニングする。得られたプラスミドｐＤＨ −ｍ４−１６４　ｓ　ｅ　ｒは、ｂｓｔ遺伝子のコドン９０に単一のＰｓｔＩ部 位を有する。１６４位がセリンであるｂｓｔ配列の３°側の半分を含有するＥｃ ｏＲＩ／ＰｓｔＩの大きなベクター断片を、ｐＤＨ−ｍ４　１６４から単離する 。この断片をｔｒｐプロモーターおよびｐＵＲＡ−ｍ４−５３ｓｅｔから単離し た、５３位がセリンであるｂｓｔをコードする配列の５′側の半分を含有するＥ ｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌの小断片に結ぶ。

得られたプラスミドをｐＤＨ−ｍ４−５３／１６４ｓｅｒと称する。

５３および１６４位がセリンであるｂｓｔの高レベルの発現のため、ｔｒｐプロ モーターおよび該ｂｓｔ配列を含有するＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ［ｌの小断片を ｐＤＨ２３−ｍ４−５３／１６４ｓｅｒから単離する。この断片をｐＵＲＡ−ｍ ４から単離したＥｃｏＲＩ／Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍの大きなベクター断片に結ぶ。得 られたプラスミドはｐＵＲＡ−ｍ４　５３／１６４ｓｅｒと称する。

実施例８　５４．１６４．１８１および１８９位がセリンであるｂｓｔ遺伝子の 構築 ５３．１６４．１８１および１８９位のシスティンをセリンで置換したｂｓｔを コードするベクターを構築するため、ｔｒｐプロモーターならびに５３および１ ６４位がセリンであるｂｓｔをコードする配列の大部分を担持するＥｃｏＲＩ／ Ｍｓ　ｔ　ＩＩ小小片片ｐＤＨ−ｍ４−５３／１６４ｓｅｒから単離する。この 断片を、ｐＤＨ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−ｓｅｒ１８１／９から単離した１８１および １８９位がセリンである３’ｂｓｔをコードする配列を含有するＥｃ。

ＲＩ／Ｍｓｔ■大ベクター断片に連結する。得られたプラスミドはｐＤＨ−ｍ４ −５３／１６４／１８１／１８９　ｓ　ｅ　ｒと称する。すべての４システイン 残基がセリンで置換されたｒｂＳｔの高レベルの発現のため、ｔｒｐプロモータ ーおよび５３．１６４．１８１および１８９位がセリンであるｂｓｔをコードす る配列を含有するＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＴ小断片をｐＤＨ−ｍ４−５３／１６４ ／１８１／１８９ｓｅｒから単離する（断片■）。該Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｂ 　ａｍＨＩ大ベクター断片（断片■）およびイー・コリ（Ｅ、Ｃｏ　ｌ　ｉ）遺 伝子ｒｐｏＢＣ用の転写ターミネータ−を担持する３５０ｂｐＢシｍＨＩ断片（ 断片■）をｐ　Ｕ　Ｒ，Ａ　−ｍ　４から単離する。断片Ｉ、■および■を結び 、ターミネータ−が正しい向きにあるプラスミドを選択し、ｐＵＲＡ−ｍ４−５ ３／１６４／１８１／１８９　ｓ　ｅ　ｒと命名する。

実施例９　５３．１６４．１８１および１８９位のうち１またはそれ以上の位置 にセリンを有するｂｓｔの発現ベクターｐＵＲＡ−ｍ４−５３ｓｅ　ｒ、ｐＵＲ Ａ−ｍ４−１６４ｓｅｒ、ｐＵＲＡ−ｍ４−５３／１６４ｓｅｒまたはｐＵＲＡ −ｍ４　５３／１６４／１８１／１８９ｓｅｒをイー・コリ　Ｂｓｔ−ＩＣに形 質転換し、特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８１００３２８に記載の通り誘導する。

実施例１０　ｃｙｓ→ｓｅｒ　ｂＳｔアナログの生物活性２００Ｑのビール中、 修飾ルリア・ブロスを使用し、ｐＲＡ−ｂＳｔ／ｈｙｂ−ｓｅｒ１８１／９で形 質転換されたＡＭ３４３Ｇ細胞を増殖させた。初めに２７°Ｃ，ｐＨ７で、１の Ａ　６５　ｏを得るまで該細胞を増殖させた。温度を３７℃まで、ｐＨを６まで シフトさせ、酵母エキスを添加することにより誘導を起こさせた（ＰＣＴ／ＵＳ ８８１０　Ｏ３２８）。以下の遠心により収集した細胞からｒｂＳｔを収穫する ： １）まず細胞をリゾチームで溶解し、ついで該溶解産物をタージトール（Ｔｅｒ ｇｉｔｏｌ）で洗浄する。

２）該ＤＮＡを切断し、封入体を洗浄し、ついでラウロイルサルコシンナトリウ ムで可溶化する。

３）か（生産したｒｂＳｔを酸化し、空気と２４時間撹拌することにより折り畳 ませる。

４）ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ｌｘ４で処理することによりラウロイルサルコ シンナトリウムを除去する。

５）ｒｂＳｔｆｉ合物をＤＥＡＥ−セファロース上でクロマトグラフィーに付し 、該ｒｂＳｔ画分を回収し、凍結乾燥する。

う・ノド・バイオアッセイのため、下垂体を摘出した、メスのスプラグ・ドーリ −（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットをチャールズ・リバー・ラボラトリ ーズ・インコーホレイティド（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ。

Ｉ　ｎ　ｃ、）から購入する。該ラットを、１グループ当たり７匹の試験グルー プに分ける。対照用標準下垂体由来ｂｓｔを、０．１５ＭＮａＣｅ１０．０３Ｍ 重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，８）に溶解する。該溶液のｐＨを９．５に 調整し、ｐＨ９，５の同緩衝液で２ｍｇ／ｍＱのタンパク質濃度に希釈する。重 炭酸ナトリウム緩衝液中にトゥイーン８０およびマンニトールを含有する凍結乾 燥粉として試験用ｒｂＳｔを調製する。これらを１０ｍｇ／ｍＱ溶液に復元し、 ついでｌ：５に希釈してストック溶液とする。ｃｙｓ＋ｓｅｒアナログに加え、 組換えにより生産した天然ｒｂＳｔの調製物を対照として使用する。該試験グル ープの各動物に毎日２回（１００ｕρ／注射）、合計９日間で合計用量７．５． １５．３０または６０ｍｇタンパク質／日を注射する。処方期間の初めから終わ りまで週末を除く毎日、該ラットの体重を計測する。

乳牛のバイオアッセイでは、泌乳ホルシュタイン牛を使用した。

これらの乳牛には該実験に用いる前に代謝異常、乳腺炎、疾病はなく、また投薬 も行わなかった。試験化合物の最初の注射の３および２日前に、平均孔収量に基 づき、乳牛を５頭の４連にてブロックに分けた。出産後１２２日と２８９日の間 の乳牛を該実験に使用した。各ブロックの５匹の乳牛を３つの実験グループ（そ れぞれ毎日５ｍｇおよび１５ｍｇのｃｙｓ→ｓｅｒ　ｒｂＳｔ、ｒｂＳｔプロセ ス対照ならびに注射をしない対照群）の１つに任意に割り当てた。はぼ０７４５ 〜０８１５時、すなわち搾乳後２〜３時間後に乳牛に注射した。ラットの実験に 使用したのと同一の凍結乾燥調製物を使用して１０ｍｇ／ｍｉ２の注射用ストッ ク溶液をつくった。注射は毎日１回、半翼様筋中に行い、７日間継続した。該乳 牛の日常の搾乳計画および方法に従い、０５００時および１６００時に搾乳した 。各乳牛に７日間注射した後の３〜５日、すなわち合計１５日の実験において、 目盛り付き乳びんを使用して各搾乳における個々の牛乳重量を見積もった。乳酸 率を３．５％脂肪補正乳に合わせた。

ｃｙｓ−＊ｓｅｒアナログ調製物および組換え法により生産した天然ｒｂｓｔの 対照調製物の分析的プロフィールの概要を表１に示す。

表１ アッセイ　対照　Ｃ）’Ｓ−’Ｓｅｒ＊ＲＩＡ　９２％　１８％ ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（モノマー）　９７．８％　９８．０％ＩＥＦ（主要ｐり　 ８．１および８．２　８．１および８．２エンドトキシン　１．５ＥＵ／ｍｇタ ンパク質　６．２ＥＵ／ｍｇタンパク質ＨＰＬＣ−ＳＥＣポリマー０．００％　 ポリマー０，００％モノマー９７．９７％　モノマー９８．９９％８４、３４重 １％　９０．９３重量％ ＲＰ−ＨＰＬＣ酸化１１６．７％　酸化１２０．３２還元０．７３％　還元０． ２％ ＤＮＡ含量　０．１５ｎｇ／ｍｇ　０．１１５ｎｇ／ｍｇイー・コリ（Ｅ、　ｃ ｏｌ　ｉ） 一タンパク質　＜０．０５％　０．０５２％＊このアナログは１８１および１８ ９位で共にシスティンをセリン（１８１，１８９）で置換したものである。

一般にこの２つの調製物はその分析的プロフィールにおいて類似している。しか しながら、ラジオイムノアッセイにおいてはｃｙｓ→ｓｅｒ　ｂＳｔアナログは 、対照の９２％と比較して、標準のわずか１８％であった。

乳酸率もまた、ｃｙｓ−＊ｓｅｒ　ｂＳｔ　（１８１，１８９）アナログで処理 した乳牛については、天然ｒｂＳｔ対照と比較して高かった（表２）。

表２ 脂肪補正孔収率 （ｋｇ乳／日） 用量（ｍｇ） 化合物　０　５　猛 対照　２４．６ ｒｂＳｔ対照　２５．　Ｏ２５，７ ｃｙｓ０ｓｅｒ　２７．６　２６．２ （１８１，１８９） 下垂体摘出ラットに注射した場合、ｃｙｓ−＋ｓｅｔ　（１８１，１８９）ｒｂ Ｓｔは、体重増加の誘導において対照調製物より活性である（表３）。

表３ 下垂体摘出ラットにおける体重増加効能下垂体ｂｓｔ　ｔ、。

ｒｂＳｔ対照　１．４２　１．０９〜１．８７　１．０ｃｙｓ４ｓｅｔ　１．７ ８　１．３６〜２．３５　１．２５　０．９６〜１．６４実施例１１　ベクター ｐＵＲＡ−ｂＳ　ｔｍ４−５　ｅ　ｒ　１８１／１８９を使用する、１８１およ び１８９位にセリンを有するｂｓｔの発現 細胞（ＢＳＴ−１ｃ）をｐＵＲＡ−ｂＳｔｍ４−３ｅｒ１８１／１８９で形質転 換し、先の記載のとおり（１９８８年２月１７日付は出順、米国特許第１５７． ２７５号）２００リツトルのビール中で増殖させた。工程４（ダウエックス−１ ｘ４の処理によるラウロイルサルコシンナトリウムの除去）および工程５　（Ｄ ＥＡＥ−セファロース上のクロマトグラフィー）を繰り返すことが必要なことを 除き実施例１０と同様にして、収集した細胞から該ｒｂＳｔを収穫した。該発酵 からの２つの調製物についてこれを行った。イン・ビトロの分析データを表４に 示す。

表４ ｒｂＳｔアナログ調製物の分析 アッセイ　調製物Ａ　調製物Ｂ ＲＩＡ　４１％　３１％ ＰＬＣ 酸化（重量％）　７２．６８　７４．０５還元（重量％）　０．７８　０．２１ ＥＣ ポリマー（面積％）　０．９２　０．００ダイマー（面積％）　４．０５　３． ９５モノマー（面積％’）　９３．５１　９４．１５モノマー（重量％）　８４ ．１７　７９．５５アミノ酸分析による 合計タンパク質　９８．０％　９５．３％チャート１．ウシ・ソマトトロピンの アミノ酸配列ａｌａ　ｐｈ＠ｐｒｏ　ａｌａ　ｍａｅ　ｓａｒ　ｌｅｕ　ｓｉｒ 　ｇｌｙ　１＠ｕ　ｐｈ曇ａ１ａ　ａｓｎ　ａｌａ　ｖａｎ１ａｕ　ａｒｇ　ａ ｉｍ　ｇｉｎ　ｈｉｓ　ｌ＠ｕ　ｈｉｓ　ｇｉｎ　１＊ｕ　ａｉｍ　ａｉｍ　ａ ｓｐ　ｔｈｒ　ｐｈａ　ｌｙｓｇｌｕ　ｐｈ龜　ｇｌｕ　ａｒｇ　ｔｈｒ　ｔｙ ｒ　Ｌｉｅ　ｐｒｏ　ｇｌｕ　ｇｌｙ　ｇｉｎ　ａｒｇ　ｔｙｒ　ｓａｔ　ｉｌ ＊ｇｌｎ　ａｓｎ　ｔｈｒ　ｇｉｎ　ｖａｌ　ａｌａ　ｐｈ−ａｙｓ　ｐｈａ　 ｓｉｒ　ｇｌｕセｈｒ　ｉｌａ　ｐｒｏ　ａｌｍｐｒｏ　ｔｂｘ　ｇｌｙ　ｌｙ ｓ　ａｓｎ　ｇｌｕ　ａｈａ　ｇｉｎ　ｇｉｎ　ｌｙｓ　ｓａｒ　ａｓｐ　１＊ ｕ　ｇｌｕ　１ａｕＬａｕ　ａｒｇ　ｉｌ＠Ｓａｒ　ｌａｕ　１＊ｕ　１＊ｕ　 １１ｍ　ｇｉｎ　ｇｓｒ　ｅｒｐ　１的ｇｌｙ　ｐｒｏ　ｌａｕｇｌｎ　ｐｈａ 　ｌａｕ　ｓｉｒ　ａｒｇ　ｖａｎ　ｐｈ＊セｈｒ　ａｓｎ　ｓｉｒ　ｌ＠ｕ　 ｖａｌ　ｐｈａ　ｇｌｙ　ｅｈｒｍａｒ　ａｓｐ　ａｒｇ　ｖａｌ　ｔｙｒ　ｇ ｌｕ　１ｙ寓１＊ｕ　ｌｙｓ　ｎｉｐ　ｌａｕ　ｇｌｕ　ｇｌｕ　ｇｌｙ　１１ ｍ１＊ｕ　ａｌａ　１＊ｕ　ｗｅｅ　ａｒｇ　ｇｌｕ　ｌａｕ　ｇｌｕ　ａｓｐ 　ｇｌｙ　ｔｈｒ　ｐｒｏ　ａｒｇ　ａｌａ　ｇｌｙｇｌｎ　Ｌｌａ　１自ｕ　 ｌｙｓ　ｇｉｎ　ｔｈｒ　ｔｙｒ　ａｓｐ　ｌｙｓ　ｐｈａ　ａｓｐ　ｅｈｒ　 ａｓｎ　ｍａｔ　ａｒｇｓａｒ　ａｓｐ　ａｓｐ　ａｌａ　１＠ｕ　ｌｅｕ　ｌ ｙｓ　ａｓｎ　セｙｒ　ｇｌｙ　１＊ｕ　１＊ｕ　ｓａｒ　ａｙｓ　ｐｈａａｒ ｇ　ｌｙｍ　ａｓｐ　ｌｅｕ　ｈｉｓ　ｌｙｓ　ｔｈｒ　ｇｌｕ　ｔｈｒ　ｔｙ ｒ　１＊ｕ　ａｒｇ　ｖａｎ　ａｈａセリＳａｙｓ　ａｒｇ　ａｒｇ　ｐｈ・ｇ ｌｙ　ｇｌｕ　ａｉｍ　ｓ＠τｃｙｓ　ａｌａ　ｐｈ＠チャート２．コドン１７ ９に翻訳ターミネータ−を導入するための合成りＮＡ断片の組立て Ａ、各オリゴマーの配列 ＪＭ−１３°ＧＧＡＴＡＡＴＧＴＧＧＧＡＧＴｊト２３”ＣＣＣＡＣＡＴＴＡＴ ＣＣＣＴＡＧＢ０合成断片の配列 ５’　ＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＡＴＡＧＧＣＣＣＡＣＡＴＴＡＴＣＣＣＴＡＧ チャート３．１８１および１８９位におけるシスティンからセリンへのコドンの 改変のための合成断片の構築１）合成断片を構築するために使用する各オリゴマ ーの配列ＪＭ−３３’ＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＡＡＡＧＴＡＴＴＣＧＧＡ（ｉ ＴＪＭ−４３’ＧＧＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＪ ト５３”ＣＣＣＡＡＴＡＣＴＴＴＡＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＴＪＭ− ６３’ＣＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＣＣＣＴＡＧ２）合成断片中 のオリゴマーの配置 ５’　ＪＭ−３ＪＭ−４３’ ３）ｄｓＤＮＡ合成断片の配列 ５’　−ＴＧＡＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＣＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡ ＧＣＴＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＣＣＡ　ＡＴ　Ａ　ＣＴＴＴ ＡＧＧＧＣＡＧＣＡ　Ａ　ＡＧＣＣＡ　ＣＴＴＣＧＡＡＧＧ　Ａ　ＧＧＣＧＡ　 Ａ　ＡＧＡ　ＴＴＡＴＣＣＣＴＡＧ−５’ ４）キイとなる制限部位の位置 ＭｓｔｌＩ　ＨｉｎｄＩＩＩ　ＢａｍＨＩ補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年７月２２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．残基５４、１６４、１８１および１８９に対応するシステイン残基のうちの 少なくとも１個がセリンで置換された哺乳動物ソマトトロピン。 ２．残基１８１および１８９に対応するシステイン残基が共にセリンで置換され た請求項１記載の哺乳動物ソマトトロピン。 ３．残基１８１に対応するシステイン残基がセリンで置換された請求項１記載の 哺乳動物ソマトトロピン。 ４．残基１８９に対応するシステイン残基がセリンで置換された請求項１記載の 哺乳動物ソマトトロピン。 ５．ウシ・ソマトトロピンである請求項１記載の哺乳動物ソマトトロピン。 ６．ウシ・ソマトトロピンである請求項２記載の哺乳動物ソマトトロピン。 ７．ウシ・ソマトトロピンである請求項３記載の哺乳動物ソマトトロピン。 ８．ウシ・ソマトトロピンである請求項４記載の哺乳動物ソマトトロピン。 ９．５３または１６４位のシステイン残基の少なくとも１個がセリンで置換され た請求項１記載の哺乳動物ソマトトロピン。 １０．システイン残基５３がセリンで置換された請求項９記載の哺乳動物ソマト トロピン。 １１．システイン残基１６４がセリンで置換された請求項９記載の哺乳動物ソマ トトロピン。 １２．５３および１６４位のシステイン残基がセリンで置換された請求項９記載 の哺乳動物ソマトトロピン。 １３、５３、１６４、１８１および１８９のシステイン残基がセリンで置換され た請求項１記載の哺乳動物ソマトトロピン。 １４．ウシ・ソマトトロピンである請求項９記載の哺乳動物ソマトトロピン。 １５．ウシ・ソマトトロピンである請求項１０記載の哺乳動物ソマトトロピン。 １６．ウシ・ソマトトロピンである請求項１１記載の哺乳動物ソマトトロピン。 １７．ウシ・ソマトトロピンである請求項１２記載の哺乳動物ソマトトロピン。 １８．ウシ・ソマトトロピンである請求項１３記載の哺乳動物ソマトトロピン。 １９．動物に有効量の請求項１記載の組成物を処方することを特徴とする動物の 成長増進方法。 ２０．動物の種がウシである請求項１９記載の方法。 ２１．有効量の請求項１記載の組成物を投与することを特徴とするメスの反芻動 物の乳生産を増加させる方法。 ２２．該反芻動物が乳牛である請求項２１記載の方法。 ２３．残基５４、１６４、１８１および１８９に対応するシステインのうちの少 なくとも１個をセリンに変化させた哺乳動物ソマトトロピンをコードするＤＮＡ からなることを特徴とするベクター。 ２４．ソマトトロピン様タンパク質の発現を指令しうる請求項２．３記載のベク ター。 ２５．最近縁天然ソマトトロピンの残基５４、１６４、１８１および１８９に対 応するシステイン残基の少なくとも１個をセリンに変化させた哺乳動物ソマトト ロピン様タンパク質をコードするＤＮＡからなるベクターを宿主する微生物。 ２６．バクテリア属、エシエリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）から選択される 請求項２５記載の微生物。