PL174955B1 - Sposób wytwarzania wektora do biosyntezy polipeptydu oraz nowy wektor do biosyntezy polipypteku - Google Patents

Abstract

1- Sposób wytwarzania wektora do biosyntezy polipeptydu, zawierającego sekwencję DNA kodującą polipeptyd oraz sekwencję DNA kodującą lider stabilizujący, znamienny tym, że do wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA kodującą polipeptyd włącza się pomiędzy region inicjujący ekspresję a sekwencję kodującą żądany polipeptyd krótkie fragmenty DNA o sekwencji losowej, otrzymaną mieszaninę zrekombinowanych wektorów wprowadza się do komórekmikroorganizmu i izoluje wektory z wyselekcjonowanych klonów produkujących białko hybrydowe zawierające żądany polipeptyd. 10- Wektor do biosyntezy polipeptydu w komórkach mikroorganizmu, zawierający sekwencję DNA kodującą polipeptyd oraz sekwencję DNA kodującą peptyd liderowy, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA kodującą peptyd liderowy o wzorze: Met-ThrMet-Ile-Thr-X1-Asp-Pro-Ala-Vid--X2)n, gdzie X1 oznacza sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na fig. - do fig. 8, X2 oznacza sekwencję umożliwiającą odcięcie lidera, a n jest liczbą z zakresu 0 do 2, włączoną przed sekwencją DNA kodującą żądany polipeptyd i połączoną funkcjonalnie z regionem kierującym ekspresją.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wektora do biosyntezy polipeptydu oraz nowy wektor do biosyntezy polipeptydu.

Istnieje wiele peptydów o bardzo dużym znaczeniu leczniczym i badawczym. Możliwości uzyskiwania ich na dużą skalę ze źródeł naturalnych są bardzo często ograniczone ze względu na niską zawartość produktu w surowcu, dostępność surowca i złożoność metod oczyszczania. Odkrycia dokonywane od połowy lat 70 umożliwiły konstrukcję szczepów mikroorganizmów syntetyzujących pożądane produkty w dużej ilości. Zastosowanie mikroorganizmów likwiduje w dużym stopniu ograniczenia ilościowe surowca, jednak konstrukcja szczepów spełniających wszystkie wymagania nowoczesnej biotechnologii wymaga przezwyciężenia bardzo wielu problemów.

Jednym z podstawowych problemów jest niestabilność produktu polipeptydowego w komórkach mikroorganizmu przejawiająca się niską zawartością w biomasie. Najczęściej stosowanym sposobem zabezpieczenia produktu przed szybką degradacją jest połączenie go z odpowiednią sekwencję s^^l^i^izującą, tzw. liderem. Produkt polipeptydowy jest wytwarzany jako część białka hybrydowego i w procesie oczyszczaniajest odłączany od lidera stabilizującego przy zastosowaniu odpowiedniej metody chemicznej lub enzymatycznej.

Najczęściej stosowane lidery stabilizujące posiadają sekwencję N-terrninalnych fragmentów białek naturalnie występujących w komórkach mikoroorganizmów, np. β-gaładtozydazy Escherichia coli (patrz: Wetzel R. i wsp., 1981,. Gene 16:63:71 oraz Guo L. -H. i wsp., 1984, Gene 29:251-254), β-laktamazy E. coli (patrz: Seeburg P.H. i wsp., 1978, Nature 276:795-298 oraz Villa Komaroff L., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3771), syntazy antranilowej E.coli (patrz: Burnett J.P., 1983, w Experimental Manipulation of Gene Expression, Acad. Press: 261-271), dysmutazy ponadtlenkowej człowieka (patrz: Cousens L.S. i wsp., 1987, Gene 61:265-275 oraz Tottrup H. i Carlsen S. 1990, Biotech. Bioengineering 35:339-348). Częstojako lidery stosuje się fragmenty sygnałowe białek ulegających sekrecji. W ten sposób produkt jest kierowany poza obręb komórki (lub do przestrzeni periplazmatycznej w przypadku niektórych systemów E. coli), przez co staje się niedostępny dla enzymów degradujących i może być łatwo odzyskany wprost z podłoża hodowlanego. Zastosowanie znalazły sekwencje sygnałowe białka A Staphylococcus aureus (patrz: Abrahmsen L. i wsp., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 7487-7500), białka ompA E. coli (patrz: Hsiung H.M. i wsp., 1986 Bio-Technology 4:991-995), hemolizyny E. coli (patrz: Mackman N. i wsp., 1987, EMBO J. 6:2835-2841), alkalicznej fosfatazy E. coli (patrz: Ohsuye K. i wsp., 1983, Nuci, Acids Res. 11:1283-1294), białka wiążącego maltozę E. coli (patrz: Maina C.V. i wsp., 1988, Gene 74:365-373), białka wiążącego galaktozę E. coli (patrz: Muller N. i wsp., 1989, Gene 75:329 - 334) i prepro--zynnika a-l drożdży (patrz: Thim L. i wsp., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6766 - 6770 oraz Bayne M.L. i wsp., 1988, Gene 66:235-244).

Największym problemem jest uzyskanie odpowiednio wysokiego poziomu produkcji białka hybrydowego oraz opracowanie sposobu wydajnego oczyszczania właściwego produktu. Wszystkie opisane wyżej przykłady rozwiązań posiadają jedno lub kilka ograniczeń utrudniających zastosowania ich do produkcji polipepydów na dużą skalę. Takim ograniczeniem jest np. to, iż białko hybrydowe powstaje w komórkach w małej ilości, produkt docelowy stanowi małą część białka hybrydowego, procedura uzyskiwania ostatecznego produktu jest wieloetapowa i nieekonomiczna.

Znane jest także zastosowanie krótkich, syntetycznych liderów homooligopeptydowych, które stabilizują proinsulinę w komórkach E. coli (patrz: Sung W. L. i wsp., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:561-565). W rozwiązaniu tym do wektora zawierającego gen kodujący ludzką proinsulinę włącza się przy końcu 5' tego genu syntetyczne sekwencje DNA kodujące krótkie homooligopeptydy. Konstruuje się wiele wektorów z określonymi z góry różnymi

174 955 sekwencjami DNA tak, aby kodowały homooligomery zawierające każdy z 20 występujących naturalnie w białkach aminokwasów, po czym bada się wpływ poszczególnych sekwencji liderowych na ekspresję genu proinsulinowego w komórkach E. coli.. Znalezienie lidera o optymalnych właściwościach (odpowiedniej długości i sekweeci) wymaga jednak przetestowania olbrzymiej ilości wariantów, co jest czasochłonne i nieekonomiczne. Wydajność produkcji proinsuliny dla najskuteczniejszych znanych liderów wynosi nie więcej niż 6 do 26% całkowitej ilości białek komórkowych.

Znane procesy nie posiadają charakteru uniwersalnego. W znanych procesach niezbędne jest dobieranie jednego spośród bardzo wielu liderów dla konkretnego polipeptydu.

Wynalazek umożliwia otrzymanie wektora ekspresyjnego zapewniającego wysoką wydajność biosyntezy dowolnego produktu polipeptydowego w komórkach dowolnego mikroorganizmu. Wysoką wydajność i stabilność żądanego produktu polipeptydowego uzyskuje się przez wyposażenie go w krótki lider stabilizujący.

W wektorach konstruowanych sposobem według wynalazku sekwencje liderowe nie są determinowane z góry. W sposobie według wynalazku źródłem sekwencji kodujących lidery jest mieszanina krótkich fragmentów dwuniciowego DNA o różnorodnych sekwencjach, które łączy się z wektorem w sposób losowy.

Sposób wytwarzania wektora do biosyntezy polipeptydu, zawierającego sekwencję DNA kodującą polipeptyd oraz sekwencję DNA kodującą lider stabilizujący, polega według wynalazku na tym, że do wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA kodującą polipeptyd włącza się pomiędzy region inicjujący ekspresję a sekwencję kodującą żądany polipeptyd krótkie fragmenty DNA o sekwencji losowej, otrzymaną mieszaninę zrekombinowanych wektorów wprowadza się do komórek mikroorganizmu i izoluje wektory z wyselekcjonowanych klonów produkujących białko hybrydowe zawierające żądany polipeptyd.

Fragmenty DNA o losowej sekwencji włącza się do wektora z genem kodującym żądany polipeptyd funkcjonalnie, tzn. pod kontrolą regionu kierującego ekspresją.

W pierwszym etapie do znanego wektora ekspresyjnego włącza się między region inicjujący ekspresję a terminator transkrypcji sekwencję DNA kodującą żądany polipeptyd. W korzystnym przykładzie wykonania wektor taki zawiera ułożone kolejno: sekwencję silnego regulowanego promotora; sekwencję odpowiedzialną za wytworzenie miejsca wiążącego rybosomy; sekwencję inicjującą translację (np. ATG): sekwencję lub kilka sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazę lub endonukleazy restrykcyjne; gen kodujący produkt polipeptydowy ewentualnie poprzedzony dodatkową sekwencję kodującą miejsce umożliwiające odcięcie peptydu od lidera (np. Met), kończący się jednym lub kilkoma kodonami terminacyjnymi; oraz terminator transkrypcji. Wektor powinien być także wyposażony w sekwencje umożliwiające replikację w komórkach odpowiedniego mikroorganizmu oraz gen lub geny umożliwiające selelkcjonowanie klonów mikroorganizmu zawierających wektor.

Przykładem wektora ekspresyjnego z DNA kodującą polipeptyd, taki jak proinsulina, jest plazmid pP412, którego konstrukcję przedstawiono na fig. 9A, a mapę na fig. 9B.

Następnie przygotowuje się mieszaninę fragmentów DNA o różnorodnych sekwencjach i długości korzystnie nie większej niż 500 par zasad. Fragmenty DNA o losowej sekwencji można uzyskać ze źródeł naturalnych lub syntetycznie. Korzystne jest użycie mieszaniny fragmentów dNa otrzymanej w wyniku cięcia wysokocząsteczkowego całkowitego DNA z komórek organizmu prokariotycznego lub eukariotycznego. Preparat całkowitego DNA oczyszcza się znanymi sposobami. Cięcia dokonuje się mechanicznie lub endonukleazami do momentu uzyskania fragmentów o żądanej wielkości. Można na przykład otrzymać mieszaninę fragmentów DNA o końcach komplementarnych do końców uzyskanych w wyniku działania endonukleazą restrykcyjną na wektor.

Korzystnie stosuje się DNA cięte co najmniej jedną endonukleazą rozpoznającą sekwencje czteronukleotydowe.

Krótkie fragmenty DNA o różnorodnych sekwencjach łączy się w sposób losowy z wektorem ekspresyjnym, na którym sklonowany jest gen kodujący żądany polipeptyd. Fragmenty włącza się w obszar sekwencji rozpoznawanej przez endonukleazę lub endonukleazy restry174 955 kcyjne między promotorem, inicjującą translację (np. ATG) a pierwszym kodonem genu (np. AtG).

Łączenie losowych fragmentów DNA z wektorem prowadzi się znanymi metodami. Na mieszaninę preparatu wektora (przeciętego endonukleazą restrykcyjną rozpoznającą sekwencję między s^l^^^^^ncją inicjującą translację a pierwszym kodonem genu) i preparatu losowych fragmentów DNA działa się ligazą.

Otrzymaną mieszaninę zrekombinowanych wektorów wprowadza się do komórek mikroorganizmu. Selekcjonuje się komórki, które posiadają wektor i w których zachodzi optymalna produkcja białka hybrydowego zawierającego żądany polipeptyd. Z wyselekcjonowanych klonów izoluje się zrekombinowane wektory i określa sekwencje kodujące lidery jedną ze znanych metod sekwencjono wania DNA. Selekcję komórek transformantów wykazujących odpowiedni poziom białka hybrydowego przeprowadza się różnymi znanymi metodami, np. przez oznaczanie poziomu białka hybrydowego w ekstraktach białkowych otrzymywanych z komórek transformantów z wykorzystaniem testu immunologicznego (typu RlA, ELA, ELISA lub Western).

W przypadku konieczności przeanalizowania dużej ilości transformantów do testowania używa się ekstrakt uzyskanego z odpowiednio dużych pul transformantów. W przypadku stwierdzenia wysokiego poziomu antygenu w komórkach transformanta, oznacza się białko hybrydowe analizując skład białek komórkowych metodą analitycznej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Można też stosować test funkcjonalny (wykazujący aktywność polipeptydu). Na podstawie sekwencji i właściwości stabilizujących in vivo można wybrać wektory o najkorzystniejszych w danym układzie cechach.

Sposób według wynalazku pozwala na wytworzenie wektora zapewniającego wydajną biosyntezę dowolnego polipeptydu. Przykładem takich polipetydów mogą być hormony peptydowe, takie jak insulina (na przykład ludzka), proinsulina, jej prekursory lub analogi, glukagon i hormon wzrostu, czynniki wzrostowe, czynniki krzepliwości krwi, immunostymulatory, inhibitory proteaz, antygeny wirusów i organizmów chorobotwórczych, ich analogi i podobne białka. Gen kodujący polipeptyd może być syntetyczny, może pochodzić ze źródeł naturalnych lub stanowić konstrukcję mieszaną.

Otrzymane w procesie biosyntezy białka hybrydowe są małe i wśród innych białek komórkowych o podobnej wielkości dominującą frakcję, co ułatwia ich oczyszczanie.

Przedmiotem wynalazku jest także nowy wektor do biosyntezy polipeptydu w komórkach mikroorganizmu, który charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję DNA kodującą nowy peptyd liderowy o wzorze: Met-Thr-Met-Ile-Thr-X¹-Asp-Pro-Ala-Val--X2)_n, gdzie X ¹ oznacza sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na fig. 1 do fig. 8, X² oznacza sekwencję umożliwiającą odcięcie lidera, a n jest liczbą z zakresu 0 do 2, włączoną przed ą DNA kodującą żądany polipeptyd i połączoną funkcjonalnie z regionem kierującym ekspresją.

Określenie sekwencja umożliwiająca odcięcie lidera oznacza sekwencję zapewniającą odszczepienie produktu polipeptydowego jedną ze znanych metod chemicznych lub enzymatycznych. χ2 może np. oznaczać Met, Asp-Pro, Arg, Lys, Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Lys-Arg.

Wektor powinien być zdolny do replikacji w komórkach wybranego gospodarza i ewentualnie zawierać gen lub geny markerowe umożliwiające seiekcję. Promotorem w regionie kierującym ekspresją może być dowolny promotor, który będzie funkcjonował w komórkach wybranego mikroorganizmu; korzystne jest zastosowanie silnego i regulowanego promotora.

Do nowych wektorów według wynalazku należą:

plazmid pES 13 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 10 oraz sekwencję proinsuliny;

plazmid pES31 zawierający peptydu liderowego podaną na fig. 11 oraz sekwencję proinsuliny;

plazmid pES 101 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 12 oraz sekwencję proinsuliny;

plazmid pES103 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 13 oraz sekwencję proinsuliny.

174 9SS plazmid pAG747 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 14 oraz sekwencję proinsuliny;

plazmid pAG748 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 15 oraz sekwencję proinsuliny;

plazmid pAG2088 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 16 oraz sekwencję proinsuliny;

plazmid pAG2043 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 17 oraz sekwencję proinsuliny.

Sekwencje DNA kodujące peptydy liderowe przedstawione na fig. 10 do 17 są sekwencjami przykładowymi, przy czym obejmują one sekwencje kończące się przed nawiasem i ewentualnie kodon ATG lub inne sekwencje kodujące miejsce odcięcia poprzedzające gen kodujący polipeptyd.

Stwierdzono, że nowe peptydy liderowe wykazują korzystne właściwości stabilizujące białka heterologiczne w komórkach mikroorganizmów, takich jak bakterie. Białko hybrydowe zawierające nowy peptyd liderowy oraz kompletną sekwencję ludzkiej proinsuliny akumuluje się w komórkach Escherichia coli stanowiąc 20 do 40% wszystkich białek komórkowych. Do produkcji insuliny ludzkiej na dużą skalę najkorzystniejszy jest wektor z sekwencją kodującą lider podaną na fig. 12. Umożliwia on biosyntezę białka hybrydowego zawierającego kompletną sekwencję ludzkiej proinsuliny w komórkach E. coli na poziomie wynoszącym do 40% wszystkich białek komórkowych.

Na załączonych rysunkach fig. 1 do 8 przedstawiają sekwencje objęte symbolem X¹ we wzorze peptydu liderowego. Fig. 4A przedstawia schemat konstrukcji plazmidu pP412 zawierającego syntetyczny gen kodujący ludzką proinsulinę z następującymi oznaczeniami: B-sekwencja kodująca łańcuch B ludzkiej proinsuliny; CA- sekwencja kodująca peptyd C i łańcuch A ludzkiej proinsuliny; P(BCA) - sekwenc|a kodującaJudzką proinsulinę; amp^R - gen markerowy warunkujący oporność na ampicylinę; tetR - gen markerowy warunkujący oporność na tetracyklinę; lacZ - fragment genu kodującego N-końcowączęść β-galaktozydazy; zaznaczono miejsca restrykcyjne i lepkie końcowe istotne dla przebiegu konstrukcji poszczególnych cząstek dNa. Fig. 4B przedstawia mapę plazmidu pP412 z zaznaczeniem miejsc restrykcyjnych użytych do włączania sekwencji kodujących peptydy liderowe.

Figury 10 do 17 przedstawiają sekwencje kodujące i aminokwasowe nowych liderów. Na fig. 10-17 wstawki oznaczono przez wytłuszczenie.

Niżej podane przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. Konstrukcja wektora

A. Wektor uzyskuje się wykorzystując znany plazmid bakteryjny pUC8. Odcinek DNA plazmidu pUC8 zawarty między miejscami BamHi i Sali wycina się endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i Sali, a następnie łączy się pozostającą część plazmidu z fragmentem DNa zawierającym kompletną sekwencję kodującą ludzką proinsulinę. Fragment ten otrzymuje się przez złożenie ze sobą jednoniciowych odcinków DNA otrzymanych na drodze chemicznej syntezy DNA o określonej sekwencji. Schemat otrzymywania plazmidu pP412jest przedstawiony na fig. 4A. Otrzymany wektor przecina się endonukleazą restrykcyjną BamHi (fig. 4B). Rozcięty plazmid traktuje się następnie enzymem alkaliczną fosfatazą z jelita cielęcego w pH 8,5 celem usunięcia terminalnych grup fosforanowych i zabezpieczenia końców plazmidu przed łączeniem się ze sobą w kolejnych etapach procedury.

B. Preparat DNA Aspergillus nidulans otrzymany metodą oczyszczania w roztworach chlorku cezu (patrz: Yelton M.M. i wsp., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1475) poddaje się działaniu endonukleazy restrykcyjnej Sau3AI tak długo, aż zostanie całkowicie pofragmentowany. 200ng plazmidu pP412 strawionego endonukleazą restrykc^^ą BamHi i defosforylowanego alkaliczną fosfatazą miesza się z 800ng fragmentów powstałych w wyniku strawienia całkowitego DNA Aspergillus nidulans endonukleazą resttykcyjną Sau3AI i po dodaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 inkubuje w obecności ATP w temperaturze 4°C przez 16 godzin.

C. Zrekombinowane wektory wprowadza się do komórek bakterii Escherichia coli szczepu 5346 metodą transformacji. Komórki kompetentne bakterii przygotowuje się przez traktowanie hodowli z wczesnej fazy logarytmicznej 0,1M roztworem chlorku wapnia

174 955 w temperaturze 0° przez co najmniej 20 minut. Do 0,1 ml zawiesiny komórek kompetentnych w 0,1M chlorku wapnia dodaje się 100ng DNA, inkubuje się zawiesinę 30 minut w temperaturze 0°C, przenosi na 5 minut do temperatury 37°C, uzupełnia się mieszaninę 0,9 ml podłoża kompletnego, inkubuje się przez 1 godzinę w 37°C i następnie wysiewa po 0,1 ml na kompletne podłoże stałe z dodatkiem 50 μg/ml ampicyliny jako substancji selekcjonującej transformanty.

Ekstrakt białek komórkowych z transformantów Escherichia coli otrzymuje się przez rozpuszczenie komórek bakterii w buforze o składzie: 7M chlorowodorek guanidyny, l0mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7,5 i odwirowanie debris. Pomiaru poziomu białek hybrydowych zawierających sekwencję ludzkiej proinsuliny dokonuje się stosując zestaw do oznaczania peptydu C ludzkiej proinsuliny firmy NOVO. 100 pl ekstraktu bakteryjnych białek komórkowych rozcieńczonych 20 razy buforem NaFAM (40mM bufor fosforanowy, pH 7,4, 6% albumina wołowa, 0,6% NaCl) miesza się z 100 pl surowicy świnki morskiej zawierającej przeciwciała przeciwko ludzkiemu peptydowi C rozcieńczonej 1:18000 buforem FAM (40mM bufor fosforanowy, pH 7,4, 6% albumina wołowa) i inkubuje 24 godziny w temperaturze 4°C; po tym czasie dodaje się 100 pl znakowanego jodem 125 roztworu peptydu C i inkubuje kolejne 24 godziny; po tym czasie kompleksy antygen- przeciwciało wytrąca się etanolem przy stężeniu 80% i po rozpuszczeniu osadu w 0,5ml 50mM roztworu wodorotlenku sodu i mierzy się radioaktywność próbek w liczniku scyntylacyjnym w obecności 5 ml płynu scyntylacyjnego Permablend III firmy Packard. Przy oznaczeniach ilościowych wykorzystuje się krzywą wzorcową wydajności reakcji immunologicznej surowicy ze standardowymi roztworami ludzkiego peptydu C zawierającego 0,35M chlorowodorek guanidyny.

Początkowo analizuje się ekstrakty z pul liczących po 100 transformantów, następnie wyselekcjonowane pule dzieli się na dziesiątki i po oznaczeniu bierze się do dalsżej analizy pojedyncze klony z wyselekcjonowanych dziesiątek. Względnym kryterium selekcjijest poziom peptydu C przekraczający wartość 10 pikomoli na mililitr ekstraktu pochodzącego z 100 mg komórek bakteryjnych. Białka hybrydowe identyfikuje się następnie po ele-ktroforetycznym rozdzieleniu wszystkich białek komórkowych wyselekcjonowanych transformantów w 15% żelu poliakrylamidowym zawierającym 6M mocznik (patrz: Perball B. i wsp., 1988, w A Practical Guide to Molecular Cloning, J. Wiley and Sons: 34-38) i wybarwieniu żelu barwnikiem Coomassie Brilliant Blue R-250.

Izolację zrekombinowanych wektorów z komórek wyselekcjonowanych transformantów wykonuje się metodą lizy alkalicznej (patrz: Bimboim H.C. i Doły J., 1979, Nuci. Acids Res. 7:1513-1516).

Wyizolowany plazmid denaturuje się i używa jako matrycy w reakcjach sekwencjonowania z użyciem zestawu Sequenase v.2.0 firmy USB. Starterem (primerem) jest oligonukleotyd oznaczony symbolem Π0, o sekwanci komplementarnej do końca 5' nici kodującej łańcuch A proinsuliny. Po odczytaniu sekwencci DNA ustala się sekwencję lidera stabilizującego na podstawie tabeli kodu genetycznego.

Przykład II

A. Plazmid pP412 przygotowany metodą z przykładu IA przecina się endonukleazą c^y^ią Smal i defosforyluje lepkie końce alkaliczną fosfatazą.

B. Handlowy preparat DNA łososia firmy Sigma oczyszczony w gradiencie chlorku cezu trawi się całkowicie kolejno endonukleazami restrykcyjnymi RsaI i HaeIH, rozpoznającymi sekwencje czteronukleotydowe i wytwarzającymi odcinki DNA posiadające tępe końce. Preparatu takiego używa się w połączeniu z plazmidem pP412 przygotowanym jak opisano w punkcie A.

C. Zrekombinowane wektory wprowadza się do komórek Escherichia coli szczepu 5346 postępując analogicznie jak w przykładzie IC.

Przykład III

A. Plazmid pP412 przygotowany metodą z przykładu LA przecina się endonukleazą

EcoRI i defosforyluje końce alkaliczną fosfatazą.

B. . Preparat DNA jak w przykładzie IIB trawi się całkowicie endonukleazą restrykcyjną EcoRI, następnie preparat poddaje się frakcjonowaniu w celu wyodrębnienia fragmentów o wielkości mniejszej niż 500pz (par zasad). W tym celu rozdziela się elektroforetycznie preparat fragmentów w żelu agarozowym w obecności wzorca wielkości, następnie wycina się bloczek

174 955 żelu zawierający fragmenty o wielkości mniejszej niż 500 par zasad i eluuje się DNA elektroforetycznie po umieszczeniu bloczku w wypełnionym buforem do elektroforezy woreczku do dializy. Oczyszczonego preparatu używa się w połączeniu z plazmidem pP412 przygotowanym jak opisano w punkcie A.

C. Zrekombinowane wektory wprowadza się do komórek bakterii Escherichia coli szczepu 5346 postępując analogicznie jak w przykładzie IC.

Przykład IV-VIL Po izolacji z komórek bakteryjnych zrekombinowanych wektorów, otrzymanych sposobem według przykładu I uzyskano:

plazmid pES -3 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 10 w połączeniu z sekwencią proinsuliny;

plazmid pES31 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. -- w połączeniu z sekwencją proinsuliny;

plazmid pES - 0- zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. -2 w połączeniu z sekwenecą proinsuliny;

plazmid pES -03 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. -3 w połączeniu z sekwenecą proinsuliny.

Przykład VIII-XI. Po izolacji z komórek bakteryjnych zrekombinowanych wektorów, otrzymanych sposobem według przykładu III uzyskano:

plazmid pAG747 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. -4 w połączeniu z sekwencją proinsuliny;

plazmid pAG748 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. -5 w połączeniu z sekwencją proinsuliny;

plazmid pAG2088 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. -6 w połączeniu z sekwencją proinsuliny;

plazmid pAG2093 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. -7 w połączeniu z sekwencją proinsuliny.

Na fig. ł0--7 wstawki oznaczono przez wytłuszczenie.

Stwierdzono, że do produkcji insuliny ludzkiej na dużą skalę najkorzystniejszy jest wektor pES 10- z sekwencją kodującą lider podaną na fig. -2. Umożliwia on biosyntezę białka hybrydowego zawierającego kompletną sekwencją ludzkiej proinsuliny w komórkach Escherichia coli na poziomie wynoszącym do 40% wszystkich białek komórkowych. Uzyskane białko można łatwo oczyszczać, a obecne na styku liderproinsulina sekwencje umożliwiają następne odcinanie sekwencji proinsulinowej z zastosowaniem prostych metod.

W procesie wytwarzania produktu polipeptydowego komórki produkujące białko hybrydowe hoduje się w podłożu płynnym typu LB w temperaturze 37°C do momentu uzyskania przez hodowlę stanu nasycenia. Stosuje się presję selekcyjną przez dodanie do podłoża ampicyliny w stężeniu 35-50 fig/ml, przez co eliminuje się komórki, które utraciły wektor.

Przykład XII. Izolacja inkluzji komórkowych oraz oczyszczanie białka hybrydowego.

Całą preparatykę prowadzi się w temperaturze pokojowej. Bakterie odwirowuje się przy 4000xg w ciągu -0 minut. Mokrą masę waży się, zamraża w -20°C, rozmraża i powtórnie zamraża. Po rozmrożeniu bakterie zawiesza się w 4 ml/gram mokrej masy 0,-M Tris-HCl, pH 8,0. Do zawiesiny bakterii dodaje się lizozym do stężenia 2 mg/ml i inkubuje w temperaturze 30°C do momentu lizy bakterii. Wstępnie zlizowane bakterie poddaje się działaniu ultradźwięków posługując się dezintegratorem ultradźwiękowym. Dezintegrację prowadzi się do momentu całkowitego rozbicia komórek i DNA. Zsonikowane bakterie wiruje się przez 30 minut przy ł4000xg, osad przepłukuje się 0,-M Tris-HCl, pH 8,0 i powtórnie wiruje. Osad rozpuszcza się w buforze UC (8M mocznik, 0,-M bufor węglanowy, pH -0, -% 2-merkaptoetanol). Roztwór rozpuszczonych białek filtruje się przez filtr 0,45 μ. Następnie dializuje się go wobec wody destylowanej, a wytrącone białko odwirowuje i suszy pod próżnią.

Oczyszczanie metodą ultrafiltracji na małą skalę prowadzi się przy użyciu aparatu M8200 firmy Amicon. Białko rozpuszczone w buforze UC do stężenia 5--0 mg/ml poddaje się filtracji przez filtr YM-00, a następnie YM30. Przefiltrowany roztwór białka dializuje się wobec wody. Wytrącone białko odwirowuje się i suszy pod próżnią. Przy zastosowaniu tej metody otrzymuje

174 955 się białko hybrydowe o czystości 70-95%, w zależności od wyjściowego stopnia czystości białka hybrydowego, z wydajnością około 95%.

Na skalę preparaty wną białko hybrydowe oczyszcza się metodą ultrafiltracji przy użyciu zestawu do ultrafiltracji CH2PRS firmy Amicon. Białko o czystości 37% rozpuszcza się w buforze UC do stężenia 5-10 mg/ml i poddaje filtracji przez filtr S1Y100, a następnie S1Y30. Przefiltrowany roztwór białka zagęszcza się na wyparce lub przy użyciu filtra S1Y3, a następnie dializuje wobec wody. Wytrącone białko odwirowuje się i suszy pod próżnią. Przy zastosowaniu tej metody otrzymuje się białko hybrydowe o czystości powyżej 90% z wydajnością około 85%.

Odcięcie lidera dokonuje się w reakcji cyjanobromowania. Białko hybrydowe rozpuszcza się w 70% kwasie mrówkowym, dodaje stałego cyjanobromu i inkubuje mieszaninę w ciemności w temperaturze pokojowej przez kilkanaście godzin. Preparat następnie dializuje się i liofilizuje. Rozdziału produktów cyjanobromowania dokonuje się przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym lub wysokorozdzielczą chromatografię cieczową HPLC.

Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Gln-Asp-Arg-Tyr-Pro-Phe-VaiGln-Tyr-Pro-Leu-Val-Leu-Cys-Gln

Fig.1

Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Gln-Thr-Thr-Val-Gln-Aia-Glu-GinGln-lie-Ser-Glu-Thr-Gly-Leu-Ser-Pro

Fig. 2

Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Arg-GIn-Phe-Pro-Pro-Leu-ProHis-His-Leu-Leu-Gly

Fig. 3

Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Gln-His-Thr-Gly-Glu-Pro-GlnSer-Arg-Ala-Ser-Ser-Thr-Phe-His-Thr-Arg-Cys-ProVal-Ser-Ser-T rp-Ser

Fig. 4

Asn-Ser-Ser-Arg-Lys-Phe-Ser-lle-Phe-Pro-Ser-AsnHe-Phe-Leu-Val-His-Ser-Leu-Asp-Ser-Leu-Ser-SerGly-lle-Arg-Gly-Ser

Fig. 5

174 955

Asn-Ser-Pro-Ile-Phe-Va--lle-Lys-Lys-Lys-Ser-Gly-LysTrp-Arg-Leu-Leu-Thr-Asp-Leu-Arg-Lys-Val-Asn-ThrSer-Met-Lys-Pro-Met-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Gly-Ile-ArgGly-Ser

Fig. 6

Ser-Ser-Tyr-Gly-Ala-Phe-Ile-Pro-Ser-Phe-Leu-ArgAsn-Leu-His-Thr-Ile-Phe-His-Ser-Gly-Tyr-Thr-Asn-LeuHis-Cys-His-Gln-Gln-Cys-Lys-Arg-Ile-Arg-Giy-Ser

Fig. 7

Asn-Ser-Lys-Ile-Cys-Ser-Pro-Tyr-Asn-Leu-Ala-LysLeu-His-Asp-Ser-Pro-Trp-Val-Lys-Phe-Phe-Tyr-ThrGlu-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Gly-Ser

Fig. 8

174 955

syntetycznych oligonukleotydów składających się na fragment kodujący łańcuch B ludzkiej proinsuliny trawienie BamHI i Sali

trawienie BamHI i Sali syntetycznych oligonukleotydów składających się na fragment kodujący peptyd C i łańcuch A ludzkiej proinsuliny

Sali

Fig.9A

174 955

CQ o>

W iZ

174 955

NTT	ACC	ATG	ATT ACG AAT	TCC	CGG	GGA	TCT
Met	Thr	Met	Ole Thr Asn	Ser	Arg	Gly	Ser
CAA	GAC	CGT	TAT CCT TTT	GTT	CAA	TAT	CCT
Gln	Asp	Arg	Tyr Pro Phe	Val	Gln	Tyr	Pro
CTA	GTT	CTC	TGT CAA GAT	CCT	GCA	GTG	-
Leu	Val	Leu	Cys Gin Asp	Pro	Ala	Val	-
- (ATGGPROONSSLONNG-NT-TAG)
-(Met--rrOn-ulOnaG-erpG;	stop)
			Fig.10

ATG	ACC	ATG	ATT	ACG	AAT	TCC	CGG	GGA	TCT
Met	Thr	Met	Ile	Thr	Asn	Ser	Arg	Gly	Ser
CAA	ACC	ACA	GTC	CAA	GCG	GAA	CAG	CAA	ATT
Gln	Thr	Thr	Val	Gln	Ala	Glu	Gin	Gln	Ile
TCG	GAA	ACA	GGT	TTA	TCT	CCT	GAT	CCT	GCA
Ser	Glu	Thr	Gly	Leu	Ser	Pro	Asp	Pro	Ala

GTG -(ATG-PROINSULINA-TAG-TAG) Val -(MeG-ProinsulinG-stop-stop)

Fig.11

174 955

ATG	ACC	ATG	ATT ACG AAT	TCC	CGG	GGA	TCT
Met	Thr	Met	Ile Thr Asn	Ser	Arg	Gly	Ser
CGT	CAA	TTT	CCT CCT CTC	CCT	CAT	CTT	CTG
Arg	Gln	Phe	Pro Pro Leu	Pro	His	His	Leu
CTG	GGT	GAT	CCT GCA GTG	-
Leu	Gly	Asp	Pro Ala Val	-
-(ATG-PROINSULINA-TAG-TAG)
-(Met-Proinsulina-stop-:	stop)
			Fig.12

ATG	ACC	ATG	ATT	ACG	AAT	TCC	CGG	GGA	TCT
Met	Thr	Met	Ile	Thr	Asn	Ser	Arg	Gly	Ser
GAA	CAC	ACT	GGT	GAG	CCT	CAG	TCC	CGG	GCA
Gln	His	Thr	Gly	Glu	Pro	Gln	Ser	Arg	Ala
TCG	TCG	ACT	TTC	CAC	ACG	CGC	TGC	CCC	GGT
Ser	Ser	Thr	Phe	His	Thr	Arg	Cys	Pro-	Val
TCT	TCT	TGG	TCG	GAT	CCT	GCA	GTG	-
Ser	Ser	Trp	Ser	Asp	Pro	Ala	Val	-
- (ATG-PROINSULINA-TAG-TAG)
-(Met-Proinsulina-stop-stop)

Fig.13

174 455

ATG ACC ATG	ATT	ACG AAT TCT TCT AGA AAA
Met Thr Met	Ile	Thr Asn Ser Ser Arg Lys
TTC TCT ATT	TTC	CCT TCA AAT ATA TTT CTA
Phe Ser Ile	Phe	Pro Ser Asn Ile Phe Leu
GTC CAT TCT	CTT	GAC TCT CTC TCA AGT GGA
Val His Ser	Leu	Asp Ser Leu Ser Ser Gly
ATT CGG GGA	TCT	GAT CCT GCA GTG -
Ile Arg Gly	Ser	Asp Pro Ala Val -
- (ATG-PROINSULINA-TAG-TAG)
-(Met-Proinsulina-stop-stop)
		Fig.14

ATG	ACC	ATG	ATT	ACG	AAT	TCT	CCC	ATT	TTT
Met	Thr	Met	Ile	Thr	Asn	Ser	Pro	Ile	Phe
GTA	ATA	AAA	AAG	AAA	TCT	GGC	AAA	TGG	CGT
Val	Ile	Lys	Lys	Lys	Ser	Gly	Lys	Trp	Arg
CTT	TTA	ACA	GAT	CTT	CGA	AAA	GTT	AAT	ACA
Leu	Leu	Thr	Asp	Leu	Arg	Lys	Val	Asn	Thr
TCT	ATG	AAA	CCT	ATG	GGT	GCA	TTA	CAA	CTA
Ser	Met	Lys	Pro	Met	Gly	Ala	Leu	Gln	Leu
GGA	ATT	CGG	GGA	TCT	GAT	CCT	GCA	GTG	-
Gly	Ile	Arg	Gly	Ser	Asp	Pro	Ala	Val	-

(ATG-PROINSULINA-TAG-TAG) (Met-Proinsulina-stop-stop)

Fig.15

174 955

ATG	ACC	ATG	ATT	ACG	AGT	TCA	TAT	GGT	GCT
Met	Thr	Met	Ile	Thr	Ser	Ser	Tyr	Gly	Ala
TTT	ATT	CCT	AGT	TTT	TTA	AGG	AAT	CTC	CAT
Phe	Ile	Pro	Ser	Phe	Leu	Arg	Asn	Leu	His
ACC	ATC	TTC	CAT	AGT	GGC	TAT	ACC	AAT	TTA
Thr	Ile	Phe	His	Ser	Gly	Tyr	Thr	Asn	Leu
CAT	TGC	CAC	CAA	CAG	TGC	AAG	AGA	ATT	CGG
His	Cys	His	Gln	Gin	Cys	Lys	Arg	Ile	Arg
GGA	TCT	GAT	CCT	GCA	GTG	-
Gly	Ser	Asp	Pro	Ala	Vnl	-

-(ATG-PROINSULINA-TAG-TAG)

-(Met-Proinsulina-stop-stop)

Fig.16

ATG	ACC	ATG	ATT	ACG	AAT	TCT	AAA	ATT	TGC
Met	Thr	Met	Ile	Thr	Asn	Ser	Lys	Ile	Cys
AGC	CCT	TAT	AAC	CTG	GCA	AAA	TTG	CAT	GAT
Ser	Pro	Tyr	Asn	Leu	Ala	Lys	Leu	His	Asp
AGC	CCT	TGG	GTT	AAA	TTT	TTC	TAT	ACA	GAA
Ser	Pro	Trp	Val	Lys	Phe	Phe	Tyr	Thr	Glu
CCC	CTC	AAG	AAT	CGG	GGA	TCT	GAT	CCT	GCA
Pro	Leu	Lys	Asn	Arg	Gly	Ser	Asp	Pro	Ala

GTG -(AGGpROOINSULINA-TAG-TAG) Val -MMt-prooinsulin-st‘p-sstop)

Fig.17

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania wektora do biosyntezy polipeptydu, zawierającego sekwencję DNA kodującą polipeptyd oraz sekwencję DNA kodującą lider stabilizujący, znamienny tym, że do wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA kodującą polipeptyd włącza się pomiędzy region inicjujący ekspresję a sekwencję kodującą żądany polipeptyd krótkie fragmenty DNA o sekwencji losowej, otrzymaną mieszaninę zrekombinowanych wektorów wprowadza się do komórek mikroorganizmu i izoluje wektory z wyselekcjonowanych klonów produkujących białko hybrydowe zawierające żądany polipeptyd.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się fragmenty DNA o długości nie większej niż 500 par zasad.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako fragmenty DNA stosuje się mieszaninę stanowiącą produkt cięcia wysokocząsteczkowego całkowitego DNA z komórek organizmu prokariotycznego lub eukariotycznego.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się DNA cięte endonukleazami lub mechanicznie.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się DNA cięte co najmniej jedną endonukleazą restrykcyjną rozpoznającą sekwencje czteronukleotydowe.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wektor izoluje się z komórek produkujących białko hybrydowe ,z optymalną wydajnością, wyselekcjonowanych za pomocą testu immunologicznego lub testu funkcjonalnego.
7. 7. Sposób według zastrz;. 1, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresyjny z sekwencją DNA kodującą żądany polipeptyd dodatkowo wyposażoną w sekwencję kodującą miejsce umożliwiające odcięcie lidera.
8. 8. Sposób według zastrz. 1 albo 7, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresyjny z sekwencją DNA kodującą łańcuchy insuliny, proinsulinę, ich prekursory i analogi.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się plazmid pP412.
10. 10. Wektor do biosyntezy polipeptydu w komórkach mikroorganizmu, zawierający sekwencję DNA kodującą polipeptyd oraz sekwencję DNA kodującą peptyd liderowy, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA kodującą peptyd liderowy o wzorze: Met-Thr-Met-Ile-Thr-X*Asp-Pro-Ala-Val-(X²)_n, gdzie X¹ oznacza sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na fig. 1 do fig. 8, X² oznacza sekwencję umożliwiającą odcięcie lidera, a n jest liczbą z zakresu 0 do 2, włączoną przed sekwencją DNA kodującą żądany polipeptyd i połączoną funkcjonalnie z regionem kierującym ekspresją.
11. 11. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że jest nim plazmid pES13 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 10 oraz sekwencję proinsuliny.
12. 12. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że jest nim plazmid pES31 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 11 oraz sekwencję proinsuliny.
13. 13. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że jest nim plazmid pES 101 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 12 oraz sekwencję proinsuliny.
14. 14. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że jest nim plazmid pES103 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 13 oraz sekwencję proinsuliny.
15. 15. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że jest nim plazmid pAG747 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 14 oraz sekwencję proinsuliny.
16. 16. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że jest nim plazmid pAG748 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 15 oraz sekwencję proinsuliny.
17. 17. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że jest nim plazmid pAG2088 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 16 oraz sekwencję proinsuliny.

    174 955
18. 18. Wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że jest nim plazmid pAG2093 zawierający sekwencję peptydu liderowego podaną na fig. 17 oraz sekwencję proinsuliny.