ES2380093T3 - Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana - Google Patents
Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana Download PDFInfo
- Publication number
- ES2380093T3 ES2380093T3 ES04751591T ES04751591T ES2380093T3 ES 2380093 T3 ES2380093 T3 ES 2380093T3 ES 04751591 T ES04751591 T ES 04751591T ES 04751591 T ES04751591 T ES 04751591T ES 2380093 T3 ES2380093 T3 ES 2380093T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- growth hormone
- human growth
- mutant
- glycosylation site
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 262
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 261
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 title claims abstract description 258
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 207
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 title claims description 58
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 title claims description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims abstract description 43
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 27
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 251
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 165
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 109
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 59
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 45
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 39
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 7
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 170
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 151
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 119
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 100
- -1 sialyl-Lewis X tetrasaccharide Chemical class 0.000 description 97
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 94
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 93
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 87
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 77
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 74
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 73
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 73
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 65
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 62
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 59
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 59
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 56
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 55
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 55
- 125000000837 carbohydrate group Chemical class 0.000 description 54
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 45
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 44
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 44
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 44
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 42
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 42
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 42
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 41
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 38
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 33
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 32
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 31
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 31
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 30
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 27
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 27
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 25
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 25
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 25
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 25
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 23
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 23
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 23
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 22
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 22
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 21
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 description 20
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 description 20
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 20
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- 241000894007 species Species 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 18
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 17
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 17
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 17
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 16
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 13
- 239000000386 donor Substances 0.000 description 13
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 13
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 description 13
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 12
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 12
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 12
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 11
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 11
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 238000012552 review Methods 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 10
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 10
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 10
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 10
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 9
- 108010057005 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 9
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 9
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 8
- 108010087568 Mannosyltransferases Proteins 0.000 description 8
- 102000006722 Mannosyltransferases Human genes 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 8
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 7
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 7
- 102100029962 CMP-N-acetylneuraminate-beta-1,4-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Human genes 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000007524 N-Acetylgalactosaminyltransferases Human genes 0.000 description 7
- 108010046220 N-Acetylgalactosaminyltransferases Proteins 0.000 description 7
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical group N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 6
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 6
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 5
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 5
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 5
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 5
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102100029945 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 4
- TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N CMP-N-acetyl neuraminic acid Natural products O1C(C(O)C(O)CO)C(NC(=O)C)C(O)CC1(C(O)=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N CMP-N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@]1(C(O)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N GDP-L-fucose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 4
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 4
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 4
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 4
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 4
- 108010064886 beta-D-galactoside alpha 2-6-sialyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000348 glycosyl donor Substances 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 4
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 4
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 4
- 125000000311 mannosyl group Chemical class C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=C(F)C=C1F VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 3
- NITXODYAMWZEJY-UHFFFAOYSA-N 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanehydrazide Chemical compound NNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 NITXODYAMWZEJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MZJVXDGQPDYGBY-UHFFFAOYSA-N 3-diazo-2-oxopropanoic acid Chemical class [N+](=[N-])=CC(C(=O)O)=O MZJVXDGQPDYGBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 101710136188 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100029963 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 2 Human genes 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 3
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N GDP-beta-L-fucose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 102000002493 N-Acetylglucosaminyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 108010093077 N-Acetylglucosaminyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 108010071384 Peptide T Proteins 0.000 description 3
- 108010066816 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000010199 Xylosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001266 acyl halides Chemical class 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- IEQCXFNWPAHHQR-YKLSGRGUSA-N beta-D-Gal-(1->4)-beta-D-GlcNAc-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-Glc Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H]([C@@H](O[C@@H]1CO)O[C@@H]1[C@H]([C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]1O)O)NC(=O)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O IEQCXFNWPAHHQR-YKLSGRGUSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- CEIPQQODRKXDSB-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-(6-hydroxynaphthalen-2-yl)-1H-indazole-5-carboximidate dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1=C(O)C=CC2=CC(C3=NNC4=CC=C(C=C43)C(=N)OCC)=CC=C21 CEIPQQODRKXDSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 3
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 3
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 description 3
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 3
- 229940053934 norethindrone Drugs 0.000 description 3
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 3
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OEANUJAFZLQYOD-CXAZCLJRSA-N (2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-acetamido-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methoxyoxan-4-yl]oxy-4,5-dihydroxy-3-methoxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OC)[C@H](C(O)=O)O1 OEANUJAFZLQYOD-CXAZCLJRSA-N 0.000 description 2
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 2
- GERXSZLDSOPHJV-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) 2-iodoacetate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(=O)CI)C=C1 GERXSZLDSOPHJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N (S)-amphetamine Chemical compound C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(CCCCC)N1C(=O)C=CC1=O AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQQBUTMELIQJNY-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(2,5-dioxo-3-sulfopyrrolidin-1-yl)oxy-2,3-dihydroxy-4-oxobutanoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1CC(S(O)(=O)=O)C(=O)N1OC(=O)C(O)C(O)C(=O)ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O WQQBUTMELIQJNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYRLCJMMJQUBY-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCC1=CC=C(N2C(C=CC2=O)=O)C=C1 VHYRLCJMMJQUBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QLHLYJHNOCILIT-UHFFFAOYSA-N 4-o-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 1-o-[2-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoyl]oxyethyl] butanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCC(=O)OCCOC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QLHLYJHNOCILIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- RPTUSVTUFVMDQK-UHFFFAOYSA-N Hidralazin Chemical compound C1=CC=C2C(NN)=NN=CC2=C1 RPTUSVTUFVMDQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N Lactosamine Natural products OC1C(N)C(O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010070158 Lactose synthase Proteins 0.000 description 2
- 108010000817 Leuprolide Proteins 0.000 description 2
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 2
- 108010015197 N-acetyllactosaminide alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 2
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000652822 Rattus norvegicus CMP-N-acetylneuraminate-beta-1,4-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108090001033 Sulfotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004896 Sulfotransferases Human genes 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- ZZHLYYDVIOPZBE-UHFFFAOYSA-N Trimeprazine Chemical compound C1=CC=C2N(CC(CN(C)C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZZHLYYDVIOPZBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 108010090473 UDP-N-acetylglucosamine-peptide beta-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108050001741 Xylosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- NIGUVXFURDGQKZ-UQTBNESHSA-N alpha-Neup5Ac-(2->3)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@]3(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O NIGUVXFURDGQKZ-UQTBNESHSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001502 aryl halides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- RWCCWEUUXYIKHB-UHFFFAOYSA-N benzophenone Chemical group C=1C=CC=CC=1C(=O)C1=CC=CC=C1 RWCCWEUUXYIKHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2,3-dihydroxybutanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)C(O)C(O)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) pentanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 2
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 2
- AQIXAKUUQRKLND-UHFFFAOYSA-N cimetidine Chemical compound N#C/N=C(/NC)NCCSCC=1N=CNC=1C AQIXAKUUQRKLND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001380 cimetidine Drugs 0.000 description 2
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N codeine Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N 0.000 description 2
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 150000003983 crown ethers Chemical class 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- MFXIAHWTYXXWPO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butanediimidate Chemical compound COC(=N)CCC(=N)OC MFXIAHWTYXXWPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N dimethyl octanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCCCC(=N)OC FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRPQMNYCTSPGCX-UHFFFAOYSA-N dimethyl pimelimidate Chemical compound COC(=N)CCCCCC(=N)OC LRPQMNYCTSPGCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AQVMGRVHEOWKRT-UHFFFAOYSA-N dimethyl propanediimidate Chemical compound COC(=N)CC(=N)OC AQVMGRVHEOWKRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005501 duocarmycin Drugs 0.000 description 2
- 229930184221 duocarmycin Natural products 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JYILPERKVHXLNF-QMNUTNMBSA-N ethynodiol Chemical compound O[C@H]1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYILPERKVHXLNF-QMNUTNMBSA-N 0.000 description 2
- 229960000218 etynodiol Drugs 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 108010001671 galactoside 3-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 2
- LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N haloperidol Chemical compound C1CC(O)(C=2C=CC(Cl)=CC=2)CCN1CCCC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LNEPOXFFQSENCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N lactosamine Chemical compound O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N 0.000 description 2
- GFIJNRVAKGFPGQ-LIJARHBVSA-N leuprolide Chemical compound CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 GFIJNRVAKGFPGQ-LIJARHBVSA-N 0.000 description 2
- 229960004338 leuprorelin Drugs 0.000 description 2
- 101150018810 lgtB gene Proteins 0.000 description 2
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 2
- 229960004616 medroxyprogesterone Drugs 0.000 description 2
- FRQMUZJSZHZSGN-HBNHAYAOSA-N medroxyprogesterone Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](O)(C(C)=O)CC[C@H]21 FRQMUZJSZHZSGN-HBNHAYAOSA-N 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 2
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 2
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002924 oxiranes Chemical class 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- XQYZDYMELSJDRZ-UHFFFAOYSA-N papaverine Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CC1=NC=CC2=CC(OC)=C(OC)C=C12 XQYZDYMELSJDRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- DHHVAGZRUROJKS-UHFFFAOYSA-N phentermine Chemical compound CC(C)(N)CC1=CC=CC=C1 DHHVAGZRUROJKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N quinidine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@H]2[C@@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N 0.000 description 2
- UOWVMDUEMSNCAV-WYENRQIDSA-N rachelmycin Chemical compound C1([C@]23C[C@@H]2CN1C(=O)C=1NC=2C(OC)=C(O)C4=C(C=2C=1)CCN4C(=O)C1=CC=2C=4CCN(C=4C(O)=C(C=2N1)OC)C(N)=O)=CC(=O)C1=C3C(C)=CN1 UOWVMDUEMSNCAV-WYENRQIDSA-N 0.000 description 2
- VMXUWOKSQNHOCA-LCYFTJDESA-N ranitidine Chemical compound [O-][N+](=O)/C=C(/NC)NCCSCC1=CC=C(CN(C)C)O1 VMXUWOKSQNHOCA-LCYFTJDESA-N 0.000 description 2
- 229960000620 ranitidine Drugs 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108010066476 ribonuclease B Proteins 0.000 description 2
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 229960005294 triamcinolone Drugs 0.000 description 2
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WWYNJERNGUHSAO-XUDSTZEESA-N (+)-Norgestrel Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WWYNJERNGUHSAO-XUDSTZEESA-N 0.000 description 1
- DBGIVFWFUFKIQN-UHFFFAOYSA-N (+-)-Fenfluramine Chemical compound CCNC(C)CC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 DBGIVFWFUFKIQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYKASZBHFXBROF-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)acetate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CN1C(=O)C=CC1=O TYKASZBHFXBROF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVIQETWEYPIARN-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(3-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1C(O)CC(=O)N1CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QVIQETWEYPIARN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QYEAAMBIUQLHFQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 QYEAAMBIUQLHFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- KYBXNPIASYUWLN-WUCPZUCCSA-N (2s)-5-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC1CC[C@@H](C(O)=O)N1 KYBXNPIASYUWLN-WUCPZUCCSA-N 0.000 description 1
- VCOPTHOUUNAYKQ-WBTCAYNUSA-N (3s)-3,6-diamino-n-[[(2s,5s,8e,11s,15s)-15-amino-11-[(6r)-2-amino-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-6-yl]-8-[(carbamoylamino)methylidene]-2-(hydroxymethyl)-3,6,9,12,16-pentaoxo-1,4,7,10,13-pentazacyclohexadec-5-yl]methyl]hexanamide;(3s)-3,6-diamino-n-[[(2s,5s,8 Chemical compound N1C(=O)\C(=C/NC(N)=O)NC(=O)[C@H](CNC(=O)C[C@@H](N)CCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CNC(=O)[C@@H]1[C@@H]1NC(N)=NCC1.N1C(=O)\C(=C/NC(N)=O)NC(=O)[C@H](CNC(=O)C[C@@H](N)CCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CNC(=O)[C@@H]1[C@@H]1NC(N)=NCC1 VCOPTHOUUNAYKQ-WBTCAYNUSA-N 0.000 description 1
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 1
- XIYOPDCBBDCGOE-IWVLMIASSA-N (4s,4ar,5s,5ar,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methylidene-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C=C1C2=CC=CC(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1[C@H](O)[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O XIYOPDCBBDCGOE-IWVLMIASSA-N 0.000 description 1
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N (4s,4as,5ar,12ar)-4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1C2=C(N(C)C)C=CC(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1C[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O FFTVPQUHLQBXQZ-KVUCHLLUSA-N 0.000 description 1
- UNBRKDKAWYKMIV-QWQRMKEZSA-N (6aR,9R)-N-[(2S)-1-hydroxybutan-2-yl]-7-methyl-6,6a,8,9-tetrahydro-4H-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)CC)C2)=C3C2=CNC3=C1 UNBRKDKAWYKMIV-QWQRMKEZSA-N 0.000 description 1
- GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N (8R,11R,12R,13E,15S)-11,15-Dihydroxy-9-oxo-13-prostenoic acid Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWBNMYSKRDRHAT-RCWTXCDDSA-N (S)-timolol hemihydrate Chemical compound O.CC(C)(C)NC[C@H](O)COC1=NSN=C1N1CCOCC1.CC(C)(C)NC[C@H](O)COC1=NSN=C1N1CCOCC1 TWBNMYSKRDRHAT-RCWTXCDDSA-N 0.000 description 1
- WSPOMRSOLSGNFJ-AUWJEWJLSA-N (Z)-chlorprothixene Chemical compound C1=C(Cl)C=C2C(=C/CCN(C)C)\C3=CC=CC=C3SC2=C1 WSPOMRSOLSGNFJ-AUWJEWJLSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical class C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SEGCNGONCZQFDW-OMCISZLKSA-N 1-[(e)-[5-(4-bromophenyl)-1,3-oxazol-2-yl]methylideneamino]imidazolidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(Br)=CC=C1C(O1)=CN=C1\C=N\N1C(=O)NC(=O)C1 SEGCNGONCZQFDW-OMCISZLKSA-N 0.000 description 1
- OZOMQRBLCMDCEG-CHHVJCJISA-N 1-[(z)-[5-(4-nitrophenyl)furan-2-yl]methylideneamino]imidazolidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1C(O1)=CC=C1\C=N/N1C(=O)NC(=O)C1 OZOMQRBLCMDCEG-CHHVJCJISA-N 0.000 description 1
- UFFVWIGGYXLXPC-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C1=CC=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O UFFVWIGGYXLXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IPJGAEWUPXWFPL-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 IPJGAEWUPXWFPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CULQNACJHGHAER-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=C(NC(=O)CI)C=C1 CULQNACJHGHAER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUWZBLSXACKFQX-IBGZPJMESA-N 1-[4-[ethyl-[(2s)-1-(4-methoxyphenyl)propan-2-yl]amino]butanoyl]-n,n-dimethylpiperidine-4-carboxamide Chemical compound CCN([C@@H](C)CC=1C=CC(OC)=CC=1)CCCC(=O)N1CCC(C(=O)N(C)C)CC1 FUWZBLSXACKFQX-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- DWBCXGZVCAKDGO-UHFFFAOYSA-N 1-azido-4-[(4-azidophenyl)disulfanyl]benzene Chemical compound C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1SSC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 DWBCXGZVCAKDGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GQLYCRTUQGSDSM-UHFFFAOYSA-N 1-benzyl-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CC1=CC=CC=C1 GQLYCRTUQGSDSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)piperidine-2-carboxamide Chemical compound CCCCN1CCCCC1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VCRPKWLNHWPCSR-UHFFFAOYSA-N 1-diazonio-3-(4-nitrophenoxy)-3-oxoprop-1-en-2-olate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(=O)C(=O)C=[N+]=[N-])C=C1 VCRPKWLNHWPCSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLPJNCYCZORXHG-UHFFFAOYSA-N 1-morpholin-4-ylprop-2-en-1-one Chemical compound C=CC(=O)N1CCOCC1 XLPJNCYCZORXHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFJMRBQWBDQYMK-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-1-cyclopentanecarboxylic acid 2-[2-(diethylamino)ethoxy]ethyl ester Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(C(=O)OCCOCCN(CC)CC)CCCC1 CFJMRBQWBDQYMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MVMSCBBUIHUTGJ-UHFFFAOYSA-N 10108-97-1 Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C(C(C1O)O)OC1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O MVMSCBBUIHUTGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFPYWIDHMRZLRN-UHFFFAOYSA-N 17alpha-ethynyl estradiol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)(O)C#C)C4C3CCC2=C1 BFPYWIDHMRZLRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCKMFJBGXUYNAG-UHFFFAOYSA-N 17alpha-methyltestosterone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C)(O)C1(C)CC2 GCKMFJBGXUYNAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- NBSLIHUMUUEJER-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-2-yl formate Chemical class O=COC1=NC=CN1 NBSLIHUMUUEJER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- ZMYAKSMZTVWUJB-UHFFFAOYSA-N 2,3-dibromopropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(Br)CBr ZMYAKSMZTVWUJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZWBOYMQPQVGPM-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-indol-2-yl)guanidine Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=N)N)=CC2=C1 QZWBOYMQPQVGPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYEKJCKNTHYWOJ-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2-sulfobutanedioic acid;ethane-1,2-diol Chemical compound OCCO.OC(=O)CC(S(O)(=O)=O)(C(O)=O)N1C(=O)CCC1=O.OC(=O)CC(S(O)(=O)=O)(C(O)=O)N1C(=O)CCC1=O SYEKJCKNTHYWOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXOXTPQHYPYNJO-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-carboxyacetyl)amino]-3-iodo-6-[(4-iodophenyl)diazenyl]benzoic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)NC1=C(I)C=CC(N=NC=2C=CC(I)=CC=2)=C1C(O)=O NXOXTPQHYPYNJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGDVXSDNEFDTGV-UHFFFAOYSA-N 2-[6-[bis(carboxymethyl)amino]hexyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCCCCCN(CC(O)=O)CC(O)=O YGDVXSDNEFDTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMJMZFPZRVMNCH-FMIVXFBMSA-N 2-[methyl-[(e)-3-phenylprop-2-enyl]amino]-1-phenylpropan-1-ol Chemical compound C=1C=CC=CC=1/C=C/CN(C)C(C)C(O)C1=CC=CC=C1 YMJMZFPZRVMNCH-FMIVXFBMSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 125000000979 2-amino-2-oxoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- MEYQBQFVMJVJFH-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-n'-(2-bromoacetyl)-n'-phenylacetohydrazide Chemical compound BrCC(=O)NN(C(=O)CBr)C1=CC=CC=C1 MEYQBQFVMJVJFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGUAFYQXFOLMHL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-5-{1-hydroxy-2-[(4-phenylbutan-2-yl)amino]ethyl}benzamide Chemical compound C=1C=C(O)C(C(N)=O)=CC=1C(O)CNC(C)CCC1=CC=CC=C1 SGUAFYQXFOLMHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKWBUHMGDKKEGW-UHFFFAOYSA-N 2-isocyanato-4-isothiocyanato-1-methylbenzene Chemical compound CC1=CC=C(N=C=S)C=C1N=C=O HKWBUHMGDKKEGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILYSAKHOYBPSPC-UHFFFAOYSA-N 2-phenylbenzoic acid Chemical class OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ILYSAKHOYBPSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- JMUAKWNHKQBPGJ-UHFFFAOYSA-N 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)-n-[4-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]butyl]propanamide Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSCCC(=O)NCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JMUAKWNHKQBPGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXCGFHGGWZOOAL-UHFFFAOYSA-N 3-amino-4-benzyl-1,6-dibromohexane-2,5-dione Chemical compound BrCC(=O)C(N)C(C(=O)CBr)CC1=CC=CC=C1 WXCGFHGGWZOOAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSCNMFDFYJUPEF-OWOJBTEDSA-N 4,4'-diisothiocyano-trans-stilbene-2,2'-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(N=C=S)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O YSCNMFDFYJUPEF-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- LZKGFGLOQNSMBS-UHFFFAOYSA-N 4,5,6-trichlorotriazine Chemical compound ClC1=NN=NC(Cl)=C1Cl LZKGFGLOQNSMBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEQPBCSPRXFQQS-UHFFFAOYSA-N 4,5-dihydro-1,2-oxazole Chemical group C1CC=NO1 WEQPBCSPRXFQQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMUKKTUHUDJSNZ-UHFFFAOYSA-N 4-[1-hydroxy-2-(1-phenoxypropan-2-ylamino)propyl]phenol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(O)C(C)NC(C)COC1=CC=CC=C1 BMUKKTUHUDJSNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTGXAUBQBSGPKF-UHFFFAOYSA-N 4-[1-hydroxy-2-(4-phenylbutan-2-ylamino)propyl]phenol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(O)C(C)NC(C)CCC1=CC=CC=C1 PTGXAUBQBSGPKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMXVCUFCWIZQSY-UHFFFAOYSA-N 4-azido-n-[2-[2-(4-azido-2-nitroanilino)ethyldisulfanyl]ethyl]-2-nitroaniline Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1NCCSSCCNC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1[N+]([O-])=O CMXVCUFCWIZQSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BYMZEXPKRSJSSO-UHFFFAOYSA-N 4-azido-n-[2-[2-(4-azido-2-nitroanilino)ethylsulfonylsulfanyl]ethyl]-2-nitroaniline Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1NCCSS(=O)(=O)CCNC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1[N+]([O-])=O BYMZEXPKRSJSSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035274 4-galactosyl-N-acetylglucosaminide 3-alpha-L-fucosyltransferase FUT5 Human genes 0.000 description 1
- DAUMUVRLMYMPLB-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzene-1,3-disulfonyl chloride Chemical compound OC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1S(Cl)(=O)=O DAUMUVRLMYMPLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLJZRAUDCHWQPS-NYONGVCJSA-N 4-oxo-n-[(3s,4r,5s,6r)-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]pentanamide Chemical compound CC(=O)CCC(=O)N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O JLJZRAUDCHWQPS-NYONGVCJSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- QRDAGKVHMGNVHB-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,1-dioxo-3,4-dihydro-2h-1$l^{6},2,4-benzothiadiazine-7-sulfonamide;3,5-diamino-6-chloro-n-(diaminomethylidene)pyrazine-2-carboxamide;hydrochloride Chemical compound Cl.NC(N)=NC(=O)C1=NC(Cl)=C(N)N=C1N.C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC2=C1NCNS2(=O)=O QRDAGKVHMGNVHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSFGBPCBPNVLOK-UHFFFAOYSA-N 6-hydroxy-2-methylhex-2-enamide Chemical compound NC(=O)C(C)=CCCCO YSFGBPCBPNVLOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930008281 A03AD01 - Papaverine Natural products 0.000 description 1
- 229930000680 A04AD01 - Scopolamine Natural products 0.000 description 1
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical class CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102100022622 Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710183133 Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031969 Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031970 Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100031971 Alpha-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 3 Human genes 0.000 description 1
- ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N Amiodarone hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(I)=C(OCC[NH+](CC)CC)C(I)=C1 ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 1
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 1
- 244000186140 Asperula odorata Species 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 229930003347 Atropine Natural products 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AWJSUDIVFILJPN-UHFFFAOYSA-N C1CC(=NN2C(=O)CCC2=O)SC1 Chemical compound C1CC(=NN2C(=O)CCC2=O)SC1 AWJSUDIVFILJPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027098 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- KORNTPPJEAJQIU-KJXAQDMKSA-N Cabaser Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(CC=C)[C@@H]2C2)C(=O)N(CCCN(C)C)C(=O)NCC)=C3C2=CNC3=C1 KORNTPPJEAJQIU-KJXAQDMKSA-N 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 101100408676 Caenorhabditis elegans pmt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000202785 Calyptronoma Species 0.000 description 1
- 108010065839 Capreomycin Proteins 0.000 description 1
- 102100038768 Carbohydrate sulfotransferase 3 Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000863012 Caulobacter Species 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKWGIWYCVPQPMF-UHFFFAOYSA-N Chloropropamide Chemical compound CCCNC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 RKWGIWYCVPQPMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCKAMNXUHHNZLN-UHFFFAOYSA-N Chlorphentermine Chemical compound CC(C)(N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 ZCKAMNXUHHNZLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004099 Chlortetracycline Substances 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N Clonidine Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=NCCN1 GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N Cobalt-60 Chemical compound [60Co] GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- VPAXJOUATWLOPR-UHFFFAOYSA-N Conferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(OCC3C4(C)CCC(=O)C(C)(C)C4CC=C3C)=CC=C21 VPAXJOUATWLOPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010000437 Deamino Arginine Vasopressin Proteins 0.000 description 1
- HCYAFALTSJYZDH-UHFFFAOYSA-N Desimpramine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(CCCNC)C2=CC=CC=C21 HCYAFALTSJYZDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTSBMKIZRSBFTA-AIDOXSFESA-N Digoxigenin bisdigitoxoside Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@]([C@@H]4[C@H]([C@]5(CC[C@@H]([C@@]5(C)[C@H](O)C4)C=4COC(=O)C=4)O)CC3)(C)CC2)C[C@@H]1O NTSBMKIZRSBFTA-AIDOXSFESA-N 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- JRWZLRBJNMZMFE-UHFFFAOYSA-N Dobutamine Chemical compound C=1C=C(O)C(O)=CC=1CCNC(C)CCC1=CC=C(O)C=C1 JRWZLRBJNMZMFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089072 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108700035678 EC 2.4.1.45 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010061435 Enalapril Proteins 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100540702 Escherichia coli (strain K12) waaU gene Proteins 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- BFPYWIDHMRZLRN-SLHNCBLASA-N Ethinyl estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 BFPYWIDHMRZLRN-SLHNCBLASA-N 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLDUPXSUYLZYBN-UHFFFAOYSA-N Fluphenazine Chemical compound C1CN(CCO)CCN1CCCN1C2=CC(C(F)(F)F)=CC=C2SC2=CC=CC=C21 PLDUPXSUYLZYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 108030004655 Fucosylgalactoside 3-alpha-galactosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- MVMSCBBUIHUTGJ-GDJBGNAASA-N GDP-alpha-D-mannose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=C(NC(=O)C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O MVMSCBBUIHUTGJ-GDJBGNAASA-N 0.000 description 1
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 235000008526 Galium odoratum Nutrition 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039847 Globoside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010092364 Glucuronosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016354 Glucuronosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N Goserelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](COC(C)(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NNC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N 0.000 description 1
- 108010069236 Goserelin Proteins 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 101001010573 Heliothis virescens Juvenile hormone esterase Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 239000005057 Hexamethylene diisocyanate Substances 0.000 description 1
- ZTVIKZXZYLEVOL-MCOXGKPRSA-N Homatropine Chemical compound O([C@H]1C[C@H]2CC[C@@H](C1)N2C)C(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 ZTVIKZXZYLEVOL-MCOXGKPRSA-N 0.000 description 1
- 101000972916 Homo sapiens Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000863898 Homo sapiens CMP-N-acetylneuraminate-beta-1,4-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000887519 Homo sapiens Globoside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003918 Hyaluronan Synthases Human genes 0.000 description 1
- 108090000320 Hyaluronan Synthases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N Hydroxyurea Chemical compound NC(=O)NO VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N Hyosciamin-hydrochlorid Natural products CN1C(C2)CCC1CC2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N Hyoscine Natural products C1([C@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 206010065973 Iron Overload Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N L-Fucose Natural products C[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LCGISIDBXHGCDW-VKHMYHEASA-N L-glutamine amide Chemical group NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O LCGISIDBXHGCDW-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-LBPRGKRZSA-N L-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@H]([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MKXZASYAUGDDCJ-SZMVWBNQSA-N LSM-2525 Chemical compound C1CCC[C@H]2[C@@]3([H])N(C)CC[C@]21C1=CC(OC)=CC=C1C3 MKXZASYAUGDDCJ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- 102100030928 Lactosylceramide alpha-2,3-sialyltransferase Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010049287 Lipodystrophy acquired Diseases 0.000 description 1
- 101710105045 Lipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- OCJYIGYOJCODJL-UHFFFAOYSA-N Meclizine Chemical compound CC1=CC=CC(CN2CCN(CC2)C(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1 OCJYIGYOJCODJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 239000012359 Methanesulfonyl chloride Substances 0.000 description 1
- DUGOZIWVEXMGBE-UHFFFAOYSA-N Methylphenidate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C(=O)OC)C1CCCCN1 DUGOZIWVEXMGBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 1
- GCKMFJBGXUYNAG-HLXURNFRSA-N Methyltestosterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@](C)(O)[C@@]1(C)CC2 GCKMFJBGXUYNAG-HLXURNFRSA-N 0.000 description 1
- 238000006957 Michael reaction Methods 0.000 description 1
- ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N Minoxidil Chemical compound NC1=[N+]([O-])C(N)=CC(N2CCCCC2)=N1 ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- KLPWJLBORRMFGK-UHFFFAOYSA-N Molindone Chemical compound O=C1C=2C(CC)=C(C)NC=2CCC1CN1CCOCC1 KLPWJLBORRMFGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046068 N-Acetyllactosamine Synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-scopolamin Natural products C1C(C2C3O2)N(C)C3CC1OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N N-acetyllactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010056664 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010033644 N-acylsphingosine galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010052465 Neu5Ac N-acetylgalactosamine 2,6-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 101100108611 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) alg-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- PHVGLTMQBUFIQQ-UHFFFAOYSA-N Nortryptiline Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2C(=CCCNC)C2=CC=CC=C21 PHVGLTMQBUFIQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004100 Oxytetracycline Substances 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 101710137390 P-selectin glycoprotein ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034925 P-selectin glycoprotein ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101710167374 Peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ZGUGWUXLJSTTMA-UHFFFAOYSA-N Promazinum Chemical compound C1=CC=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZGUGWUXLJSTTMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102100030944 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Human genes 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 101100540701 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) waaK gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 1
- 206010049416 Short-bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- LKAJKIOFIWVMDJ-IYRCEVNGSA-N Stanazolol Chemical compound C([C@@H]1CC[C@H]2[C@@H]3CC[C@@]([C@]3(CC[C@@H]2[C@@]1(C)C1)C)(O)C)C2=C1C=NN2 LKAJKIOFIWVMDJ-IYRCEVNGSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Chemical compound CC(O)CN(CC(C)O)CCN(CC(C)O)CC(C)O NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLBQZWRITKRQQV-UHFFFAOYSA-N Thioridazine Chemical compound C12=CC(SC)=CC=C2SC2=CC=CC=C2N1CCC1CCCCN1C KLBQZWRITKRQQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N Triclosan Chemical compound OC1=CC(Cl)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100537665 Trypanosoma cruzi TOR gene Proteins 0.000 description 1
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010065282 UDP xylose-protein xylosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1O[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N 0.000 description 1
- CYKLRRKFBPBYEI-KBQKSTHMSA-N UDP-alpha-D-galactosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](N)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 CYKLRRKFBPBYEI-KBQKSTHMSA-N 0.000 description 1
- CYKLRRKFBPBYEI-NQQHDEILSA-N UDP-alpha-D-glucosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](N)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 CYKLRRKFBPBYEI-NQQHDEILSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N UNPD216 Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC(C1O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)OC1CO AXQLFFDZXPOFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- JSZILQVIPPROJI-CEXWTWQISA-N [(2R,3R,11bS)-3-(diethylcarbamoyl)-9,10-dimethoxy-2,3,4,6,7,11b-hexahydro-1H-benzo[a]quinolizin-2-yl] acetate Chemical compound C1CC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]2N1C[C@@H](C(=O)N(CC)CC)[C@H](OC(C)=O)C2 JSZILQVIPPROJI-CEXWTWQISA-N 0.000 description 1
- QTQAWLPCGQOSGP-VKNBREQOSA-N [(3r,5r,6s,7r,8e,10r,11r,12z,14e)-6-hydroxy-5,11,21-trimethoxy-3,7,9,15-tetramethyl-16,20,22-trioxo-17-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),8,12,14,18-pentaen-10-yl] carbamate Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C\C=C/[C@@H](OC)[C@H](OC(N)=O)\C(C)=C\[C@@H](C)[C@H](O)[C@H](OC)C[C@H](C)CC2=C(OC)C(=O)C=C1C2=O QTQAWLPCGQOSGP-VKNBREQOSA-N 0.000 description 1
- XAKBSHICSHRJCL-UHFFFAOYSA-N [CH2]C(=O)C1=CC=CC=C1 Chemical group [CH2]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAKBSHICSHRJCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOEMGAFJFRBGGG-UHFFFAOYSA-N acebutolol Chemical compound CCCC(=O)NC1=CC=C(OCC(O)CNC(C)C)C(C(C)=O)=C1 GOEMGAFJFRBGGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002122 acebutolol Drugs 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003790 alimemazine Drugs 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229960000711 alprostadil Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 1
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 1
- LSTJLLHJASXKIV-UHFFFAOYSA-N amino hexanoate Chemical compound CCCCCC(=O)ON LSTJLLHJASXKIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 229960005260 amiodarone Drugs 0.000 description 1
- 229960000836 amitriptyline Drugs 0.000 description 1
- KRMDCWKBEZIMAB-UHFFFAOYSA-N amitriptyline Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2C(=CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 KRMDCWKBEZIMAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- RNLQIBCLLYYYFJ-UHFFFAOYSA-N amrinone Chemical compound N1C(=O)C(N)=CC(C=2C=CN=CC=2)=C1 RNLQIBCLLYYYFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002105 amrinone Drugs 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001078 anti-cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002686 anti-diuretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003474 anti-emetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940046836 anti-estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001062 anti-nausea Effects 0.000 description 1
- 230000000842 anti-protozoal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 1
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 1
- 239000003416 antiarrhythmic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940124538 antidiuretic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002111 antiemetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124623 antihistamine drug Drugs 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 229940127088 antihypertensive drug Drugs 0.000 description 1
- 229940111133 antiinflammatory and antirheumatic drug oxicams Drugs 0.000 description 1
- 229940111131 antiinflammatory and antirheumatic product propionic acid derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000003080 antimitotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003904 antiprotozoal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003908 antipruritic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003200 antithyroid agent Substances 0.000 description 1
- 229940043671 antithyroid preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000003434 antitussive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124584 antitussives Drugs 0.000 description 1
- 239000003699 antiulcer agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000002830 appetite depressant Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N atropine Chemical compound O([C@H]1C[C@H]2CC[C@@H](C1)N2C)C(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-SPUOUPEWSA-N 0.000 description 1
- 229960000396 atropine Drugs 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950003578 azumolene Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940092705 beclomethasone Drugs 0.000 description 1
- NBMKJKDGKREAPL-DVTGEIKXSA-N beclomethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(Cl)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O NBMKJKDGKREAPL-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 229950003745 benzfetamine Drugs 0.000 description 1
- ISAOCJYIOMOJEB-UHFFFAOYSA-N benzoin Chemical group C=1C=CC=CC=1C(O)C(=O)C1=CC=CC=C1 ISAOCJYIOMOJEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012965 benzophenone Substances 0.000 description 1
- YXKTVDFXDRQTKV-HNNXBMFYSA-N benzphetamine Chemical compound C([C@H](C)N(C)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 YXKTVDFXDRQTKV-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 229960004564 benzquinamide Drugs 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-Glcp Chemical compound O([C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]([C@H]1O)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO AXQLFFDZXPOFPO-UNTPKZLMSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044698 beta-N-Acetylglucosaminylglycopeptide beta-1,4-Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 229960004324 betaxolol Drugs 0.000 description 1
- CHDPSNLJFOQTRK-UHFFFAOYSA-N betaxolol hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(OCC(O)C[NH2+]C(C)C)=CC=C1CCOCC1CC1 CHDPSNLJFOQTRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- OMWQUXGVXQELIX-UHFFFAOYSA-N bitoscanate Chemical compound S=C=NC1=CC=C(N=C=S)C=C1 OMWQUXGVXQELIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229960001705 buclizine Drugs 0.000 description 1
- MOYGZHXDRJNJEP-UHFFFAOYSA-N buclizine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1CN1CCN(C(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)CC1 MOYGZHXDRJNJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229960003455 buphenine Drugs 0.000 description 1
- 229960003150 bupivacaine Drugs 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229960004596 cabergoline Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960004602 capreomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 108010017957 carbohydrate sulfotransferases Proteins 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005392 carboxamide group Chemical group NC(=O)* 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000496 cardiotonic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N chembl557217 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N 0.000 description 1
- 238000009614 chemical analysis method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012993 chemical processing Methods 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- ANTSCNMPPGJYLG-UHFFFAOYSA-N chlordiazepoxide Chemical compound O=N=1CC(NC)=NC2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 ANTSCNMPPGJYLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004782 chlordiazepoxide Drugs 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002023 chloroprocaine Drugs 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SOYKEARSMXGVTM-UHFFFAOYSA-N chlorphenamine Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(CCN(C)C)C1=CC=C(Cl)C=C1 SOYKEARSMXGVTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003291 chlorphenamine Drugs 0.000 description 1
- 229950007046 chlorphentermine Drugs 0.000 description 1
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 1
- 229960001761 chlorpropamide Drugs 0.000 description 1
- 229960001552 chlorprothixene Drugs 0.000 description 1
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 239000000812 cholinergic antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 229960001747 cinchocaine Drugs 0.000 description 1
- PUFQVTATUTYEAL-UHFFFAOYSA-N cinchocaine Chemical compound C1=CC=CC2=NC(OCCCC)=CC(C(=O)NCCN(CC)CC)=C21 PUFQVTATUTYEAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001750 cinnamedrine Drugs 0.000 description 1
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 1
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 1
- 229960002842 clobetasol Drugs 0.000 description 1
- FCSHDIVRCWTZOX-DVTGEIKXSA-N clobetasol Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CCl)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O FCSHDIVRCWTZOX-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 229960002896 clonidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000002642 cobra venom Substances 0.000 description 1
- 229960004126 codeine Drugs 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- JECGPMYZUFFYJW-UHFFFAOYSA-N conferone Natural products CC1=CCC2C(C)(C)C(=O)CCC2(C)C1COc3cccc4C=CC(=O)Oc34 JECGPMYZUFFYJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000002739 cryptand Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920005565 cyclic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960003564 cyclizine Drugs 0.000 description 1
- UVKZSORBKUEBAZ-UHFFFAOYSA-N cyclizine Chemical compound C1CN(C)CCN1C(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 UVKZSORBKUEBAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- JURKNVYFZMSNLP-UHFFFAOYSA-N cyclobenzaprine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C(=CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 JURKNVYFZMSNLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003572 cyclobenzaprine Drugs 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- 231100000409 cytocidal Toxicity 0.000 description 1
- 230000000445 cytocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- POZRVZJJTULAOH-LHZXLZLDSA-N danazol Chemical compound C1[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=CC2=C1C=NO2 POZRVZJJTULAOH-LHZXLZLDSA-N 0.000 description 1
- 229960000766 danazol Drugs 0.000 description 1
- 229960001987 dantrolene Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960003914 desipramine Drugs 0.000 description 1
- NFLWUMRGJYTJIN-NXBWRCJVSA-N desmopressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSCCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(N)=O)=O)CCC(=O)N)C1=CC=CC=C1 NFLWUMRGJYTJIN-NXBWRCJVSA-N 0.000 description 1
- 229960004281 desmopressin Drugs 0.000 description 1
- 229960004976 desogestrel Drugs 0.000 description 1
- RPLCPCMSCLEKRS-BPIQYHPVSA-N desogestrel Chemical compound C1CC[C@@H]2[C@H]3C(=C)C[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RPLCPCMSCLEKRS-BPIQYHPVSA-N 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960000632 dexamfetamine Drugs 0.000 description 1
- 229960001985 dextromethorphan Drugs 0.000 description 1
- LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl peroxide Chemical compound CC(C)(C)OOC(C)(C)C LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012969 di-tertiary-butyl peroxide Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000008049 diazo compounds Chemical class 0.000 description 1
- RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N diethylstilbestrol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(\CC)C1=CC=C(O)C=C1 RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- HESHRHUZIWVEAJ-JGRZULCMSA-N dihydroergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)C1)C)C1=CC=CC=C1 HESHRHUZIWVEAJ-JGRZULCMSA-N 0.000 description 1
- 229960004704 dihydroergotamine Drugs 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 description 1
- HSUGRBWQSSZJOP-RTWAWAEBSA-N diltiazem Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1[C@H]1[C@@H](OC(C)=O)C(=O)N(CCN(C)C)C2=CC=CC=C2S1 HSUGRBWQSSZJOP-RTWAWAEBSA-N 0.000 description 1
- 229960004166 diltiazem Drugs 0.000 description 1
- SPCNPOWOBZQWJK-UHFFFAOYSA-N dimethoxy-(2-propan-2-ylsulfanylethylsulfanyl)-sulfanylidene-$l^{5}-phosphane Chemical compound COP(=S)(OC)SCCSC(C)C SPCNPOWOBZQWJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- HYPPXZBJBPSRLK-UHFFFAOYSA-N diphenoxylate Chemical compound C1CC(C(=O)OCC)(C=2C=CC=CC=2)CCN1CCC(C#N)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HYPPXZBJBPSRLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004192 diphenoxylate Drugs 0.000 description 1
- XQRLCLUYWUNEEH-UHFFFAOYSA-L diphosphonate(2-) Chemical compound [O-]P(=O)OP([O-])=O XQRLCLUYWUNEEH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229960001066 disopyramide Drugs 0.000 description 1
- UVTNFZQICZKOEM-UHFFFAOYSA-N disopyramide Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(C(N)=O)(CCN(C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 UVTNFZQICZKOEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 230000001882 diuretic effect Effects 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001089 dobutamine Drugs 0.000 description 1
- 108010088016 dolichyl-phosphate beta-D-mannosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003640 drug residue Substances 0.000 description 1
- 238000007336 electrophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- GBXSMTUPTTWBMN-XIRDDKMYSA-N enalapril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 GBXSMTUPTTWBMN-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 229960000873 enalapril Drugs 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- PJWPNDMDCLXCOM-UHFFFAOYSA-N encainide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1CCC1N(C)CCCC1 PJWPNDMDCLXCOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001142 encainide Drugs 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 description 1
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 description 1
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- 229960000285 ethambutol Drugs 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229960002568 ethinylestradiol Drugs 0.000 description 1
- RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N ethyl chloroformate Chemical compound CCOC(Cl)=O RIFGWPKJUGCATF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYBKWXQWKPSYDT-UHFFFAOYSA-L ethylene glycol disuccinate bis(sulfo-N-succinimidyl) ester sodium salt Chemical compound [Na+].[Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCC(=O)OCCOC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)C(S([O-])(=O)=O)CC1=O IYBKWXQWKPSYDT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XFBVBWWRPKNWHW-UHFFFAOYSA-N etodolac Chemical compound C1COC(CC)(CC(O)=O)C2=N[C]3C(CC)=CC=CC3=C21 XFBVBWWRPKNWHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005293 etodolac Drugs 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960001596 famotidine Drugs 0.000 description 1
- XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N famotidine Chemical compound NC(N)=NC1=NC(CSCCC(N)=NS(N)(=O)=O)=CS1 XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229960001582 fenfluramine Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- SPIUTQOUKAMGCX-UHFFFAOYSA-N flavoxate Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=C(C=3C=CC=CC=3)OC2=C1C(=O)OCCN1CCCCC1 SPIUTQOUKAMGCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000855 flavoxate Drugs 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 150000004673 fluoride salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- YLRFCQOZQXIBAB-RBZZARIASA-N fluoxymesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1CC[C@](C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O YLRFCQOZQXIBAB-RBZZARIASA-N 0.000 description 1
- 229960001751 fluoxymesterone Drugs 0.000 description 1
- 229960002690 fluphenazine Drugs 0.000 description 1
- SAADBVWGJQAEFS-UHFFFAOYSA-N flurazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(CCN(CC)CC)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1F SAADBVWGJQAEFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003528 flurazepam Drugs 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002074 flutamide Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 125000002446 fucosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O1)C)* 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 108010082530 galactosyl-1-3-N-acetylgalactosaminyl-specific 2,6-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 150000002256 galaktoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960004580 glibenclamide Drugs 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N glyburide Chemical compound COC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026195 glycanase Proteins 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002913 goserelin Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- HPBNRIOWIXYZFK-UHFFFAOYSA-N guanadrel Chemical compound O1C(CNC(=N)N)COC11CCCCC1 HPBNRIOWIXYZFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003845 guanadrel Drugs 0.000 description 1
- 108010076477 haematoside synthetase Proteins 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 229960003878 haloperidol Drugs 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000002373 hemiacetals Chemical group 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- RRAMGCGOFNQTLD-UHFFFAOYSA-N hexamethylene diisocyanate Chemical compound O=C=NCCCCCCN=C=O RRAMGCGOFNQTLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQLKNTOKMBVBKV-UHFFFAOYSA-N hexamidine Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1OCCCCCCOC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 OQLKNTOKMBVBKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001915 hexamidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003485 histamine H2 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000857 homatropine Drugs 0.000 description 1
- 239000003652 hormone inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002474 hydralazine Drugs 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N hydrocodone Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001330 hydroxycarbamide Drugs 0.000 description 1
- ZQDWXGKKHFNSQK-UHFFFAOYSA-N hydroxyzine Chemical compound C1CN(CCOCCO)CCN1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=CC=C1 ZQDWXGKKHFNSQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000930 hydroxyzine Drugs 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 229950000141 idaverine Drugs 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004801 imipramine Drugs 0.000 description 1
- BCGWQEUPMDMJNV-UHFFFAOYSA-N imipramine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(CCCN(C)C)C2=CC=CC=C21 BCGWQEUPMDMJNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960004819 isoxsuprine Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical group 0.000 description 1
- DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N ketoprofen Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC(C(=O)C=2C=CC=CC=2)=C1 DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000991 ketoprofen Drugs 0.000 description 1
- OZWKMVRBQXNZKK-UHFFFAOYSA-N ketorolac Chemical compound OC(=O)C1CCN2C1=CC=C2C(=O)C1=CC=CC=C1 OZWKMVRBQXNZKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004752 ketorolac Drugs 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 229960001632 labetalol Drugs 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- IEQCXFNWPAHHQR-UHFFFAOYSA-N lacto-N-neotetraose Natural products OCC1OC(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)C(NC(=O)C)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O IEQCXFNWPAHHQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N lacto-N-tetraose Natural products O1C(CO)C(O)C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(=O)C)C1OC1C(O)C(CO)OC(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)C1O USIPEGYTBGEPJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940062780 lacto-n-neotetraose Drugs 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 229960004400 levonorgestrel Drugs 0.000 description 1
- 229950008325 levothyroxine Drugs 0.000 description 1
- 208000006132 lipodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- RVGLGHVJXCETIO-UHFFFAOYSA-N lodoxamide Chemical compound OC(=O)C(=O)NC1=CC(C#N)=CC(NC(=O)C(O)=O)=C1Cl RVGLGHVJXCETIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004305 lodoxamide Drugs 0.000 description 1
- 229960000423 loxapine Drugs 0.000 description 1
- YQZBAXDVDZTKEQ-UHFFFAOYSA-N loxapine succinate Chemical compound [H+].[H+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O.C1CN(C)CCN1C1=NC2=CC=CC=C2OC2=CC=C(Cl)C=C12 YQZBAXDVDZTKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017830 lymphoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 108091005446 macrophage receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Substances [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229960001474 meclozine Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229960001786 megestrol Drugs 0.000 description 1
- RQZAXGRLVPAYTJ-GQFGMJRRSA-N megestrol acetate Chemical compound C1=C(C)C2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RQZAXGRLVPAYTJ-GQFGMJRRSA-N 0.000 description 1
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 229960001390 mestranol Drugs 0.000 description 1
- IMSSROKUHAOUJS-MJCUULBUSA-N mestranol Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@](C#C)(O)CC[C@H]2[C@@H]2CCC3=CC(OC)=CC=C3[C@H]21 IMSSROKUHAOUJS-MJCUULBUSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940042016 methacycline Drugs 0.000 description 1
- 229960001252 methamphetamine Drugs 0.000 description 1
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KNWQLFOXPQZGPX-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl fluoride Chemical compound CS(F)(=O)=O KNWQLFOXPQZGPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004011 methenamine Drugs 0.000 description 1
- PMRYVIKBURPHAH-UHFFFAOYSA-N methimazole Chemical compound CN1C=CNC1=S PMRYVIKBURPHAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- MBAXWTVHCRPVFW-UHFFFAOYSA-N methyl 3-[(3-imino-3-methoxypropyl)disulfanyl]propanimidate Chemical compound COC(=N)CCSSCCC(=N)OC MBAXWTVHCRPVFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQWPRMPSCMSAJU-UHFFFAOYSA-N methyl cyclohexanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CCCCC1 ZQWPRMPSCMSAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000328 methylergometrine Drugs 0.000 description 1
- 229960001344 methylphenidate Drugs 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O methylsulfide anion Chemical compound [SH2+]C LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229960001566 methyltestosterone Drugs 0.000 description 1
- 229960002237 metoprolol Drugs 0.000 description 1
- IUBSYMUCCVWXPE-UHFFFAOYSA-N metoprolol Chemical compound COCCC1=CC=C(OCC(O)CNC(C)C)C=C1 IUBSYMUCCVWXPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 1
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229960003574 milrinone Drugs 0.000 description 1
- PZRHRDRVRGEVNW-UHFFFAOYSA-N milrinone Chemical compound N1C(=O)C(C#N)=CC(C=2C=CN=CC=2)=C1C PZRHRDRVRGEVNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004023 minocycline Drugs 0.000 description 1
- 229960003632 minoxidil Drugs 0.000 description 1
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229960004938 molindone Drugs 0.000 description 1
- HPEUEJRPDGMIMY-IFQPEPLCSA-N molybdopterin Chemical compound O([C@H]1N2)[C@H](COP(O)(O)=O)C(S)=C(S)[C@@H]1NC1=C2N=C(N)NC1=O HPEUEJRPDGMIMY-IFQPEPLCSA-N 0.000 description 1
- 150000002763 monocarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003158 myorelaxant agent Substances 0.000 description 1
- XQZDWKBCGAJXLC-UHFFFAOYSA-N n-butylpropanamide Chemical compound CCCCNC(=O)CC XQZDWKBCGAJXLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- ZBGPYVZLYBDXKO-HILBYHGXSA-N netilmycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@]([C@H](NC)[C@@H](O)CO1)(C)O)NCC)[C@H]1OC(CN)=CC[C@H]1N ZBGPYVZLYBDXKO-HILBYHGXSA-N 0.000 description 1
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000004767 nitrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229960001180 norfloxacin Drugs 0.000 description 1
- OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N norfloxacin Chemical compound C1=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=CC(F)=C1N1CCNCC1 OGJPXUAPXNRGGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001158 nortriptyline Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 229960002700 octreotide Drugs 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- QVYRGXJJSLMXQH-UHFFFAOYSA-N orphenadrine Chemical compound C=1C=CC=C(C)C=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 QVYRGXJJSLMXQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003941 orphenadrine Drugs 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229960000625 oxytetracycline Drugs 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N oxytetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N 0.000 description 1
- 235000019366 oxytetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 239000002863 oxytocic agent Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 229960001789 papaverine Drugs 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960004448 pentamidine Drugs 0.000 description 1
- XDRYMKDFEDOLFX-UHFFFAOYSA-N pentamidine Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1OCCCCCOC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 XDRYMKDFEDOLFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003436 pentoxyverine Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M periodate Chemical compound [O-]I(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 150000007965 phenolic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960003562 phentermine Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 1
- 229920000765 poly(2-oxazolines) Polymers 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N procainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000244 procainamide Drugs 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229940056432 prodrin Drugs 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 229940095055 progestogen systemic hormonal contraceptives Drugs 0.000 description 1
- 229960003598 promazine Drugs 0.000 description 1
- 150000005599 propionic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N prostaglandin E1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001404 quinidine Drugs 0.000 description 1
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 239000002684 recombinant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 101150030372 rfaB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150052269 rfaJ gene Proteins 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVGROKTTNBUGK-SJCJKPOMSA-N ritodrine Chemical compound N([C@@H](C)[C@H](O)C=1C=CC(O)=CC=1)CCC1=CC=C(O)C=C1 IOVGROKTTNBUGK-SJCJKPOMSA-N 0.000 description 1
- 229960001634 ritodrine Drugs 0.000 description 1
- DPCQJLQPDJPRCM-UHFFFAOYSA-N s-acetyl ethanethioate Chemical compound CC(=O)SC(C)=O DPCQJLQPDJPRCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N scopolamine Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)O[C@H]2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N 0.000 description 1
- 229960002646 scopolamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001624 sedative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000007659 semicarbazones Chemical class 0.000 description 1
- 150000003354 serine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229940096017 silver fluoride Drugs 0.000 description 1
- REYHXKZHIMGNSE-UHFFFAOYSA-M silver monofluoride Chemical compound [F-].[Ag+] REYHXKZHIMGNSE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- ULARYIUTHAWJMU-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O ULARYIUTHAWJMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000912 stanozolol Drugs 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002128 sulfonyl halide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003461 sulfonyl halides Chemical class 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical class ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLKXDPUZXIRXEP-MFOYZWKCSA-N sulindac Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(F)=CC=C2\C1=C/C1=CC=C(S(C)=O)C=C1 MLKXDPUZXIRXEP-MFOYZWKCSA-N 0.000 description 1
- 229960000894 sulindac Drugs 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 229920001897 terpolymer Polymers 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N terramycin dehydrate Natural products C1=CC=C2C(O)(C)C3C(O)C4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005353 testolactone Drugs 0.000 description 1
- BPEWUONYVDABNZ-DZBHQSCQSA-N testolactone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(OC(=O)CC4)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 BPEWUONYVDABNZ-DZBHQSCQSA-N 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229960002178 thiamazole Drugs 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-imine Chemical compound N=C1CCCS1 CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960002784 thioridazine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 229960004605 timolol Drugs 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- JIVZKJJQOZQXQB-UHFFFAOYSA-N tolazoline Chemical compound C=1C=CC=CC=1CC1=NCCN1 JIVZKJJQOZQXQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002312 tolazoline Drugs 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N toluene 2,4-diisocyanate Chemical compound CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002936 tranquilizing effect Effects 0.000 description 1
- 108010004486 trans-sialidase Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003597 transferase activity assay Methods 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229960003500 triclosan Drugs 0.000 description 1
- ZEWQUBUPAILYHI-UHFFFAOYSA-N trifluoperazine Chemical compound C1CN(C)CCN1CCCN1C2=CC(C(F)(F)F)=CC=C2SC2=CC=CC=C21 ZEWQUBUPAILYHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002324 trifluoperazine Drugs 0.000 description 1
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 1
- CBEQULMOCCWAQT-WOJGMQOQSA-N triprolidine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(\C=1N=CC=CC=1)=C/CN1CCCC1 CBEQULMOCCWAQT-WOJGMQOQSA-N 0.000 description 1
- 229960001128 triprolidine Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 125000002233 tyrosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N uranium Chemical compound [U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U] DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000019871 vegetable fat Nutrition 0.000 description 1
- 229960001722 verapamil Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante, en el que la hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15.
Description
Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana.
La Hormona del crecimiento humana (hGH) y las variantes agonistas de la misma son miembros de una familia de proteínas recombinantes descritas en la pat. de EE.UU. nº 4.658.021 y la pat. de EE.UU. nº 5.633.352. Su producción recombinante y métodos de uso se detallan en las pat. de EE.UU. nºs 4.342.832, 4.601.980; pat. de EE.UU. nº 4.898.830; pat. de EE.UU. nº 5.424.199; y pat. de EE.UU. nº 5.795.745. La hormona del crecimiento humana participa en diversos aspectos de la regulación del crecimiento y desarrollo humano normal. Por medio de la interacción con sus receptores, esta hormona hipofisaria de 22 kDa modula una multitud de efectos biológicos, tales como el crecimiento lineal (somatogénesis), lactación, activación de macrófagos, y efectos similares a la insulina y diabetógenos. Chawla, Annu. Rev. Med., 34: 519 (1983); Edwards et al., Science, 239: 769 (1988); Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol., 47: 483 (1985); Thomer y Vance, J. Clin. Invest., 82: 745 (1988); Hughes y Friesen, Annu. Rev. Physiol., 47: 469 (1985).
La administración de péptidos glicosilados y no glicosilados para provocar una respuesta fisiológica particular se conoce bien en la técnica médica. La hGH tanto purificada como recombinante se ha usado para tratar afecciones y enfermedades debidas a una deficiencia de hGH, p.ej., enanismo en niños. Un factor importante que ha limitado el uso de los péptidos terapéuticos es la naturaleza inmunógena de la mayoría de los péptidos. En un paciente, una respuesta inmunógena hacia un péptido administrado puede neutralizar el péptido y/o conducir al desarrollo de una respuesta alérgica en el paciente. Otras deficiencias de los glicopéptidos terapéuticos incluyen una potencia subóptima y velocidades de eliminación elevadas. Los problemas inherentes en los compuestos terapéuticos peptídicos se han reconocido en la técnica, y se han investigado diversos métodos para resolver estos problemas. Por ejemplo, para proporcionar compuestos terapéuticos de péptidos solubles, se han unido polímeros sintéticos al esqueleto peptídico.
Poli(etilenglicol) ("PEG") es un polímero ejemplar que se ha conjugado a polipéptidos. Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar compuestos terapéuticos peptídicos reduce la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, la pat. de EE.UU. nº 4.179.337 (Davis et al.) Se refiere a polipéptidos no inmunógenos, tales como enzimas y hormonas peptídicas acopladas a polietilen glicol (PEG) o polipropilen glicol. Se usan entre 10 y 100 moles de polímero por mol de polipéptido, y se mantiene al menos un 15% de la actividad fisiológica. Además, el tiempo de eliminación de la circulación se prolonga debido al tamaño incrementado del conjugado con PEG de los polipéptidos en cuestión. Los métodos descritos por Davis et al. son métodos de PEG-ilación química.
La modificación química de péptidos da como resultado con frecuencia una pérdida indeseable de actividad del péptido, que es atribuible a la naturaleza no selectiva de los procedimientos químicos utilizados para modificar el péptido. Por ejemplo, cuando el grupo modificador es un péptido hidrosoluble, p.ej. PEG, el modo principal de unión de PEG y de sus derivados a los péptidos es una unión inespecífica a través de un residuo de aminoácido del péptido. Los estudios de conjugados de polímeros hidrosolubles e interleucina-2 (Fisher et al., Br. J. Haematol., 82: 654 (1992)), factor estimulante de colonias de granulocitos (Satake-Ishikawa et al., Cell Struct. Funct., 17: 157 (1992)), factor de necrosis tumoral (Tsutsumi et al., Br. J. Cancer, 71: 963 (1996)) y hormona del crecimiento humana (Clark, et al., J. Biol. Chem., 271:21969 (1996)) han revelado que la PEGilación química de estas proteínas disminuyen la actividad de unión al receptor in vivo de los péptidos.
En muchos métodos de PEGilación química, se añade poli(etilenglicol) de una manera básicamente aleatoria, inespecífica, a residuos reactivos de un esqueleto peptídico. Para la producción de péptidos terapéuticos, es claramente deseable utilizar una estrategia de derivatización que dé como resultado la formación de un producto marcado de manera específica, fácilmente caracterizable y esencialmente homogéneo. Una vía prometedora para preparar péptidos marcados de manera específica es por medio del uso de enzimas, tales como glicosiltransferasas, para unir un resto de carbohidrato modificado a un péptido.
Las síntesis basadas en enzimas tienen la ventaja de tener regioselectividad y estereoselectividad. Además, las síntesis enzimáticas se llevan a cabo mediante el uso de sustratos sin protección. Se usan tres clases principales de enzimas en la síntesis de carbohidratos, glicosiltransferasas (p.ej. sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas), y glicosidasas. Las glicosidasas se clasifican además como exoglicosidasas (p.ej., �manosidasa, �-glucosidasa), y endoglicosidasas (p.ej., Endo-A, Endo-M). Cada una de estas tres clases de enzimas se ha usado con éxito sintéticamente para preparar carbohidratos. Para una revisión general, véase, Crout et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98-111 (1998).
Las glicosiltransferasas modifican las estructuras de los oligosacáridos en los glicopéptidos, por lo que producen productos específicos con un buen control estereoquímico y regioquímico. Las glicosiltransferasas se usan para preparar oligosacáridos y para modificar estructuras de carbohidratos con unión en N y O terminales, en particular en glicopéptidos producidos en las células mamíferas. Por ejemplo, los oligosacáridos terminales de los glicopéptidos se han sialilado y/o fucosilado completamente para proporcionar estructuras de carbohidratos más consistentes, lo que mejora la farmacodinámica del glicopéptido y una diversidad de otras propiedades biológicas. Por ejemplo, la �1,4-galactosiltransferasa se usó para sintetizar lactosamina, un ejemplo de la utilidad de las glicosiltransferasas en la síntesis de carbohidratos (véase, p.ej., Wong et al., J. Org. Chem. 47: 5416-5418 (1982)). Además, numerosos procedimientos sintéticos han utilizado a-sialiltransferasas para transferir ácido siálico de ácido citidin-5'-monofosfo-Nacetilneuramínico al 3-OH o 6-OH de galactosa (véase, p.ej., Kevin et al., Chem. Eur. J. 2: 1359-1362 (1996)). Las fucosiltransferasas se usan en rutas sintéticas para transferir una unidad de fucosa de guanosin-5'-difosfofucosa a un hidroxilo específico de un sacárido aceptor. Por ejemplo, Ichikawa preparó sialil-Lewis-X mediante un método que implica la fucosilación de lactosamina sialilada con una fucosiltransferasa clonada (Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992)). Para una discusión de los avances recientes en la síntesis de glicoconjugados para uso terapéutico véase, Koeller et al., Nature Biotechnology 18: 835-841 (2000). Véanse además las patentes de EE.UU. nº 5.876.980; 6.030.815; 5.728.554; 5.922.577; y el documento WO/9831826.
Las glicosidasas también se han usado para preparar sacáridos. Las glicosidasas catalizan normalmente la hidrólisis de un enlace glicosídico. En condiciones adecuadas, sin embargo, se pueden usar para formar este enlace. La mayoría de glicosidasas usadas para la síntesis de carbohidratos son exoglicosidasas; la transferencia de glicosilo se da en el extremo no reductor del sustrato. La glicosidasa capta un donante de glicosilo en un intermedio glicosiloenzima que es interceptado por el agua para proporcionar el producto de hidrólisis, o por un aceptor, para proporcionar un nuevo glicósido u oligosacárido. Una ruta ejemplar que usa una exoglicosidasa es las síntesis del trisacárido central de todos los glicopéptidos con unión en N, que incluyen la unión difícil de �-manósido, que se formó mediante la acción de la �-manosidasa (Singh et al., Chem. Commun. 993-994 (1996)).
En otra aplicación ejemplar del uso de una glicosidasa para formar una unión glicosídica, se ha preparado una glicosidasa mutante en la que el aminoácido nucleófilo normal del sitio activo se cambia por un aminoácido no nucleófilo. Las enzimas mutantes no hidrolizan las uniones glicosídicas, pero todavía pueden formarlas. Las glicosidasas mutantes se usan para preparar oligosacáridos mediante el uso de un fluoruro de a-glicosilo donante y una molécula aceptora de glicósido (Withers et al., patente de EE.UU. nº 5.716.812). Aunque las glicosidasas mutantes son útiles para formar oligosacáridos libres, todavía se tiene que demostrar que tales enzimas son capaces de añadir donantes de glicosilo a polipéptidos glicosilados o no glicosilados, y tampoco se han usado estas enzimas con donantes de glicosilo inactivados.
Aunque su uso es menos habitual que el de las exoglicosidasas, las endoglicosidasas también se utilizan para preparar carbohidratos. Los métodos basados en el uso de las endoglicosidasas tiene la ventaja de que se transfiere un oligosacárido en vez de un monosacárido. Los fragmentos de oligosacáridos se han añadido a los sustratos mediante el uso de endo--N-acetilglucosaminas tales como endo-F, endo-M (Wang et al., Tetrahedron Lett. 37: 19751978); y Haneda et al., Carbohydr. Res. 292: 61-70 (1996)).
Además de su uso en la preparación de carbohidratos, las enzimas discutidas anteriormente también se aplican a la síntesis de glicopéptidos. Se ha publicado la síntesis de una glicoforma homogénea de ribonucleasa B (Witte K. et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 2114-2118 (1997)). El núcleo de manosa elevado de la ribonucleasa B se escindió mediante el tratamiento del glicopéptido con endoglicosidasa H. La escisión se dio de manera específica entre los dos residuos de GlcNAc del núcleo. El tetrasacárido sialil-Lewis X se reconstruyó después enzimáticamente en el sitio de anclaje de GlcNAc restante en la proteína ya homogénea mediante el uso secuencial de �-1,4-galactosiltransferasa, a-2,3-sialiltransferasa y a-1,3-fucosiltransferasa V. Cada etapa catalizada enzimáticamente se desarrolló con un rendimiento excelente.
También se conocen los métodos que combinan elementos sintéticos tanto químicos como enzimáticos. Por ejemplo, Yamamoto y colaboradores (Carbohydr. Res. 305: 415-422 (1998)) informaron de la síntesis quimioenzimática del glicopéptido, Péptido T glicosilado, mediante el uso de una endogliosidasa. El péptido N-acetilglucosaminilo se sintetizó mediante medios puramente químicos. El péptido posteriormente se elaboró enzimáticamente con el oligosacárido del glicopéptido de transferrina humana. La porción de sacárido se añadió al péptido tratándolo con una endo-�-N-acetilglucosaminidasa. El péptido glicosilado resultante fue muy estable y resistente a la proteolisis en comparación con el péptido T y N-acetilglucosaminil péptido T.
Se ha explorado el uso de glicosiltransferasas para modificar la estructura de un péptido con grupos indicadores. Por ejemplo, Brossmer et al. (patente de EE.UU. nº 5.405.753) describe la formación de un derivado de monofosfato de citidina ("CMP") marcado con fluorescencia de ácido siálico y el uso del glicósido fluorescente en un ensayo de la actividad sialil transferasa y para el marcaje fluorescente de superficies celulares, glicoproteínas y gangliósidos. Gross et al. (Analyt. Biochem. 186: 127 (1990) describe un ensayo similar. Bean et al. (patente de EE.UU. nº 5.432.059) describe un ensayo para trastornos por deficiencia de glicosilación que utilizan la reglicosilación de una proteína glicosilada de manera deficiente. La proteína deficiente se reglicosila con un glicósido de CMP marcado con fluorescencia. Cada uno de los derivados de ácido siálico fluorescentes se sustituye con el resto fluorescente en la posición 9 o en la amina que está acetilada normalmente en el ácido siálico. Los métodos que usan los derivados de ácido siálico fluorescentes son ensayos de la presencia de glicosiltransferasas o de glicoproteínas sin glicosilar o glicosiladas de manera inadecuada. Los ensayos se llevan a cabo con cantidades pequeñas de enzima o glicoproteína en una muestra de origen biológico. No se ha descrito o propuesto la derivatización enzimática de un péptido glicosilado o no glicosilado a escala preparativa o industrial mediante el uso de un ácido siálico modificado.
También se han usado métodos enzimáticos para activar residuos de glicosilo en un glicopéptido para la elaboración química posterior. Los residuos de glicosilo se activan en general mediante el uso de galactosa oxidasa, que convierte un residuo de galactosa terminal en el aldehído correspondiente. El aldehído se acopla posteriormente a un grupo modificador que contiene amina. Por ejemplo, Casares et al. (Nature Biotech. 19: 142 (2001)) ha unido doxorrubicina a los residuos de galactosa oxidados de una quimera MHCII-péptido recombinante.
Los residuos de glicosilo también se han modificado para albergar grupos cetona. Por ejemplo, Mahal y colaboradores (Science 276: 1125 (1997)) han preparado N-levulinoil manosamina ("ManLev"), que tiene una función cetona en la posición ocupada normalmente por el grupo acetilo en el sustrato natural. Las células se trataron con ManLev, por lo que se incorporó un grupo cetona en la superficie de las células. Véase también Saxon et al., Science 287: 2007 (2000); Hang et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 1242 (2001); Yarema et al., J. Biol. Chem. 273: 31168 (1998); y Charter et al., Glycobiology 10: 1049 (2000).
Los carbohidratos se unen a los glicopéptidos de varias maneras, de las cuales las uniones en N a asparagina y las uniones en O de tipo mucina a serina y treonina son las más relevantes para los compuestos terapéuticos de glicoproteínas recombinantes. Un factor determinante para la iniciación de la glicosilación de una proteína es el contexto de la secuencia primaria, aunque otros factores desempeñan claramente un papel, lo que incluye la región de la proteína y la conformación. La glicosilación mediante unión en N se da en la secuencia consenso NXS/T, en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina.
Los métodos discutidos anteriormente no proporcionan acceso a cantidades industrialmente relevantes de péptidos modificados, que mantengan sustancialmente la actividad farmacológica de sus análogos sin modificar. Además, los métodos no posibilitan la conjugación específica de sitio de un carbohidrato modificado hasta un péptido o glicopéptido. Los métodos tampoco proporcionan un medio para preparar péptidos modificados que estén glicosilados o glicoconjugados en sitios que no son los naturales.
La presente descripción responde a estas necesidades proporcionando mutantes de hGH que contienen sitios de glicosilación con unión en N u O recién introducidos, lo que proporciona flexibilidad en la glicosilación y/o glicopegilación de estos mutantes de hGH recombinantes. Además, la invención proporciona un método industrialmente práctico para la modificación de péptidos de hGH mutantes con unión en N u O con grupos modificadores tales como polímeros hidrosolubles, restos terapéuticos, biomoléculas, y similares. Son de interés particular los métodos en los que la hGH mutante modificada tiene propiedades mejoradas, que potencian su uso como un agente terapéutico o diagnóstico.
En un aspecto, la presente invención, que se define mediante las reivindicaciones adjuntas, proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante. La hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no está presente en la hormona del crecimiento humana de tipo natural, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15. En ciertas realizaciones, la hormona del crecimiento humana de tipo natural tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:1 o SEQ ID Nº:2. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana mutante incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un casete de expresión o una célula que comprende un ácido nucleico, p.ej., un ácido nucleico aislado, que incluye una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante. La hormona del crecimiento humana mutante incluye un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no está presente en la hormona del crecimiento humana de tipo natural, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no está presente en la hormona del crecimiento humana de tipo natural, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15. En ciertas realizaciones, la hormona del crecimiento humana de tipo natural tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:1 o SEQ ID Nº:2. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no está presente en la hormona del crecimiento humana de tipo natural, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15. Este método incluye las etapas de producir de manera recombinante la hormona del crecimiento humana mutante, y glicosilar la hormona del crecimiento humana mutante en el sitio de glicosilación nuevo. En ciertas realizaciones, la hormona del crecimiento humana de tipo natural tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 o SEQ ID NO:2. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que tiene una cantidad terapéuticamente eficaz de una hormona del crecimiento humana mutante que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no está presente en la hormona del crecimiento humana de tipo natural, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15. En ciertas realizaciones, la hormona del crecimiento humana de tipo natural tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:1 o SEQ ID Nº:2. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una hormona del crecimiento humana mutante en la fabricación de un medicamento para tratar una deficiencia de la hormona del crecimiento humana en un sujeto. El uso incluye administrar al sujeto una cantidad de una hormona del crecimiento humana mutante eficaz para tratar o mejorar la deficiencia de la hormona del crecimiento. La hormona del crecimiento humana mutante usada comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 o SEQ ID NO:2. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
En cada uno de los aspectos descritos anteriormente, la hormona del crecimiento humana mutante está conjugada opcionalmente a uno o más grupos modificadores, preferiblemente a través de la glicoconjugación, lo que da lugar a un grupo ligador de glicosilo entre el sitio de glicosilación y el grupo modificador. Un grupo modificador ejemplar es poli(etilen glicol).
La FIG. 1 son las secuencias de aminoácidos de GH-N (hGH derivada de hipófisis) y GH-V (hGH derivada de placenta). Las flechas indican la posición del aminoácido para la introducción mutacional de (GH-N) o un sitio de glicosilación con unión en N existente de forma natural (GH-V).
La FIG. 2 es la representación de la estructura cristalina de una hGH mutante GH-N glicosilada (Lys140 a Asn140) y su polipéptido receptor.
La FIG. 3 son esquemas de glicoPEGilación para mutantes con glicano unido en N de hGH producidos en células de insecto y células de mamífero.
La FIG. 4 muestra la glicoPEGilación de un mutante con glicano unido en O de hGH producido en Escherichia coli.
La FIG. 5 exhibe mutantes alternativos de GH-N para introducir sitios de glicosilación. Las flechas indican las regiones de los giros de la proteína de GH-N en los que se puede introducir un sitio de glicosilación.
La FIG. 6 son las secuencias de aminoácidos de seis (6) sitios de glicosilación con unión en O diferentes que se pueden introducir en la hGH derivada de hipófisis (GH-N). También se muestra la secuencia de aminoácidos de tipo natural para GH-N como comparación. Las flechas indican el residuo de treonina del mutante de glicano GH-N en el que se dará la glicosilación con unión en O.
La FIG. 7 son las secuencias de aminoácidos de un mutante GH-N con unión en O de hGH 134(rtg) - ttt y de un mutante GH-N 5' con unión en O de hGH en las que los aminoácidos -3 a -1 (ptt) se insertan en el extremo aminoterminal, lo que da como resultado un polipéptido de hGH de 194 de aminoácidos.
La FIG. 8 son las secuencias de aminoácidos de un mutante GH-N con unión en O de hGH 134(rtg) - ttg y de un mutante GH-N 5' con unión en O de hGH en las que los aminoácidos -3 a -1 (mvt) se insertan en el extremo aminoterminal, lo que da como resultado un polipéptido de hGH de 194 de aminoácidos.
La FIG. 9A representa la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humana madura (GH-N) (SEQ ID Nº:1). La FIG. 9B representa la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humana madura (GH-V) (SEQ ID Nº:2). La FIG. 9C representa la secuencia de aminoácidos del mutante 1 de la hormona del crecimiento humana (SEQ ID Nº:3). La FIG. 9D representa la secuencia de aminoácidos del mutante 2 de la hormona del crecimiento humana (SEQ ID NO:4). La FIG. 9E representa la secuencia de aminoácidos del mutante 3 de la hormona del crecimiento humana (SEQ ID NO: 5). La FIG. 9F representa la secuencia de aminoácidos del mutante 4 de la hormona del crecimiento humana (SEQ ID NO:6). La FIG. 9G representa la secuencia de aminoácidos del mutante 5 de la hormona del crecimiento humana (SEQ ID NO:7). La FIG. 9H representa la secuencia de aminoácidos del mutante 6 de la hormona del crecimiento humana (SEQ ID NO:8). La FIG. 9I representa la secuencia de aminoácidos del mutante 7 de la hormona del crecimiento humana (SEQ ID NO:9).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limite de manera específica, el término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente las variantes modificadas de manera conservativa de la misma (p.ej., sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNPs, y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. De forma específica, las sustituciones de codones degenerados se pueden conseguir generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o de todos ellos) está sustituida con residuos de bases mixtas y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa de manera intercambiable con gen, cADN, y mARN codificado por un gen.
El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica. Puede incluir las regiones precedentes y posteriores a la región codificante (líder y tráiler), así como las secuencias intermedias (intrones) entre los segmentos codificantes individuales (exones).
El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, indica que el ácido nucleico o proteína está esencialmente exento de otros componentes celulares con los que está asociado en el estado natural. Preferiblemente, está en un estado homogéneo, aunque puede estar en seco o en disolución acuosa. La pureza y la homogeneidad se determinan en general mediante el uso de técnicas de química analítica tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida o la cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada. En particular, un gen aislado está separado de los marcos de lectura abiertos que flanquean el gen, y que codifican una proteína diferente del gen de interés. El término "purificado" indica que un ácido nucleico o proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel de electroforesis. En particular, significa que el ácido nucleico o proteína tiene una pureza de al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 95%, y lo más preferiblemente al menos un 99%.
El término aminoácido se refiere a los aminoácidos naturales y a los aminoácidos sintéticos, así como a los análogos de aminoácidos y a las moléculas miméticas de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican más tarde, p.ej., hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que los aminoácidos naturales, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, p.ej., homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (p.ej., norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Las "moléculas miméticas de aminoácidos" se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido natural.
Existen diversos métodos conocidos en la técnica que permiten la incorporación de un derivado o análogo de aminoácido que no es natural en una cadena polipeptídica de una manera específica de sitio, véase, p.ej., el documento WO 02/086075.
Los aminoácidos se pueden denominar en la presente memoria mediante los símbolos de tres letras conocidos comúnmente o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, de forma similar, se pueden denominar por sus códigos de una letra aceptados comúnmente.
"Variantes modificadas de manera conservativa" es aplicable tanto a las secuencias de aminoácidos como a las secuencias de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, "variantes modificadas de manera conservativa" se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, respecto de secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican una proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Así, en cada posición en la que una alanina está especificada por un codón, el codón se puede alterar hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codifi
5 cado. Tales variaciones de los ácidos nucleicos son "variaciones sinónimas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservativa. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente memoria que codifica un polipéptido también describe cada variación sinónima posible del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cualquier codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que generalmente es el único codón para metionina, y TGG, que generalmente es el único codón para triptófano) se puede modificar para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. Por lo tanto, cada variación sinónima de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
Como con las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína que altere, añada o elimine un único aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de
15 manera conservativa" en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen muy bien en la técnica. Tales variantes modificadas de manera conservativa son adicionales, y no excluyen las variantes polimórficas, homólogos interespecie, y alelos de la invención.
Los ocho grupos siguientes contienen cada uno los aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) �?cido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
25 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M)
(véase, p.ej., Creighton, Proteins (1984)).
Los aminoácidos se pueden denominar en la presente memoria mediante los símbolos de tres letras conocidos comúnmente o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, de forma similar, se pueden denominar por sus códigos de una letra aceptados comúnmente.
En la presente solicitud, los residuos de aminoácidos se numeran según sus posiciones relativas desde el residuo más a la izquierda, que se numera con el número 1, en una secuencia polipeptídica de tipo natural.
35 "Próximo a un residuo de prolina", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un aminoácido que está a una distancia menor de alrededor de 10 aminoácidos de un residuo de prolina, preferiblemente, a una distancia menor de alrededor de 9, 8, 7, 6 ó 5 aminoácidos de un residuo de prolina, más preferiblemente, a una distancia menor de alrededor de 4, 3, 2 o residuos de un residuo de prolina. El aminoácido "próximo a un residuo de prolina" puede estar en el lado C- o N-terminal del residuo de prolina.
"Polipéptido", "péptido", y "proteína" se usan de manera intercambiable en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los tres términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son una molécula mimética química artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se dan de manera natural y polímeros de aminoácidos que no se dan de manera natural. Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones abarcan las cadenas de aminoáci
45 dos de cualquier longitud, que incluyen proteínas de tamaño completo, en las que los residuos de aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes.
El término "mutar" o "mutación", tal como se usa en el contexto de la introducción de sitio(s) de glicosilación con unión en N u O adicional(es) en una hormona del crecimiento humana de tipo natural, se refiere a la deleción, inserción, o sustitución de cualquier nucleótido o residuo de aminoácido, mediante medios químicos, enzimáticos o de otro tipo, en una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana de tipo natural o la secuencia de aminoácidos de una hormona del crecimiento humana de tipo natural, respectivamente, de forma que la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humana resultante comprende al menos un sitio de glicosilación con unión en N u O que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente. En el caso de la sustitución de aminoácidos, las sustituciones conservativas y no conservativas se pueden usar para crear un mutante de hGH que contiene un sitio de glicosilación con unión en N u O nuevo.
El sitio para una mutación que introduce un sitio de glicosilación con unión en N u O nuevo puede estar localizado en cualquier parte del polipéptido. Las secuencias de aminoácidos ejemplares para los mutantes de la hormona del crecimiento humana se representan en SEQ ID Nºs:3-9. Una "hormona del crecimiento humana mutante" de esta invención, así, comprende al menos un residuo de aminoácido mutado. Por otra parte, la hormona del crecimiento humana de tipo natural cuya secuencia codificante se modifica para generar una hormona del crecimiento humana mutante se denomina en esta solicitud "la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente". Por ejemplo, SEQ ID Nº:1 es la secuencia de aminoácidos de la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente para las hormonas del crecimiento humanas mutantes que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nºs:3-9.
El término "cantidad eficaz", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad que produce los efectos terapéuticos para los que se administra la sustancia. Los efectos incluyen la prevención, corrección, o inhibición de la progresión de los síntomas de una enfermedad/afección y las complicaciones relacionadas en cualquier grado detectable. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento y será determinable por un experto en la técnica mediante el uso de métodos conocidos (véase, p.ej., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); y Pickar, Dosage Calculations (1999)).
Tal como se usa en la presente memoria, el término "carbohidrato modificado" se refiere a un carbohidrato natural o no natural que se añade enzimáticamente en un residuo de aminoácido o un residuo de glicosilo de un péptido en un procedimiento de la invención. El carbohidrato modificado se selecciona de varios sustratos enzimáticos que incluyen, pero sin limitación, nucleótidos de carbohidratos (mono-, di-, y trifosfatos), carbohidratos activados (p.ej., haluros de glicosilo, mesilatos de glicosilo) y carbohidratos que ni están activados ni son nucleótidos. El "carbohidrato modificado" se funcionaliza de manera covalente con un "grupo modificador". Los grupos modificadores útiles incluyen, pero sin limitación, polímeros hidrosolubles, restos terapéuticos, restos de diagnóstico, biomoléculas y similares. El grupo modificador preferiblemente no es un carbohidrato natural, o un carbohidrato sin modificar. El lugar de la funcionalización con el grupo modificador se selecciona de tal manera que no impida que el "carbohidrato modificado" sea añadido enzimáticamente a un péptido.
El término "hidrosoluble" se refiere a restos que tienen cierto grado detectable de solubilidad en agua. Los métodos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua se conocen muy bien en la técnica. Los polímeros hidrosolubles ejemplares incluyen péptidos, sacáridos, poli(éteres), poli(aminas), poli(ácidos carboxílicos) y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mixtas o estar compuestos de un único aminoácido, p.ej., poli(lisina). Un polisacárido ejemplar es poli(ácido siálico). Un poli(éter) ejemplar es poli(etilen glicol), p.ej., m-PEG. La poli(etilen imina) es una poliamina ejemplar, y el poli(ácido acrílico) es un poli(ácido carboxílico) representativo.
El esqueleto polimérico del polímero hidrosoluble puede ser poli(etilen glicol) (es decir, PEG). Sin embargo, se debería entender que también son adecuados otros polímeros relacionados para el uso en la práctica de esta invención, y que el uso del término PEG o poli(etilen glicol) pretende incluir, y no excluir, a este respecto. El término PEG incluye poli(etilen glicol) en cualquiera de sus formas, que incluyen alcoxi PEG, PEG difuncional, PEG con múltiples brazos, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendiente (es decir, PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales que penden del esqueleto polimérico), o PEG con uniones degradables en él.
El esqueleto polimérico puede ser lineal o ramificado. Los esqueletos poliméricos ramificados se conocen en general en la técnica. Generalmente, un polímero ramificado tiene un resto con un núcleo de rama central y una diversidad de cadenas poliméricas lineales unidas al núcleo de la rama central. PEG se usa habitualmente en formas ramificadas que se pueden preparar mediante la adición de óxido de etileno a diversos polioles, tales como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. El resto de la rama central puede derivar también de varios aminoácidos, tales como lisina. El poli(etilen glicol) ramificado se puede representar en una forma general como R(-PEG-OH)m, en la que R representa el resto del núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol, y m representa el número de brazos. Las moléculas de PEG con múltiples brazos, tales como las descritas en la pat. de EE.UU. nº 5.932.462, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad, también se pueden usar como esqueleto del polímero.
Otros muchos polímeros también son adecuados para la invención. Los esqueletos poliméricos no peptídicos e hidrosolubles, con 2 a alrededor de 300 extremos, son especialmente útiles en la invención. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero sin limitación, otros poli(alquilen glicoles), tales como poli(propilen glicol) ("PPG"), copolímeros de etilen glicol y propilen glicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxipropilmetacrilamida), poli(a-hidroxi ácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), tales como los descritos en la pat. de EE.UU. nº 5.629.384, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad, y copolímeros, terpolímeros, y mezclas de los mismos. Aunque el peso molecular de cada cadena del esqueleto de polímero puede variar, normalmente está en el intervalo de alrededor de 100 Da a alrededor de 100.000 Da, a menudo de alrededor de 6.000 Da a alrededor de 80.000 Da.
El "área bajo la curva" o "ABC", tal como se usa en la presente memoria en el contexto de la administración de un fármaco peptídico a un paciente, se define como el área total bajo la curva que describe la concentración de fármaco en la circulación sistémica en el paciente como una función del tiempo de cero al infinito.
El término "semivida" o "t½", tal como se usa en la presente memoria en el contexto de la administración de un fármaco peptídico a un paciente, se define como el tiempo necesario para que la concentración plasmática de un fármaco en un paciente se reduzca a la mitad. Puede haber más de una semivida asociada al fármaco peptídico, dependiendo de múltiples mecanismos de eliminación, redistribución, y otros mecanismos muy conocidos en la técnica. Normalmente, las semividas alfa y beta se definen de manera que la fase alfa está asociada a la redistribución, y la fase beta está asociada a la eliminación. Sin embargo, con los fármacos proteicos que, en su mayor parte, están confinados en el torrente sanguíneo, puede haber como mínimo dos semividas de eliminación. Para algunos péptidos glicosilados, la eliminación de la fase beta rápida puede estar mediada a través de receptores en los macrófagos, o células endoteliales que reconocen la lactosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa, o fucosa terminales. La eliminación de fase beta más lenta se puede dar por medio de la filtración glomerular renal para moléculas con un radio efectivo < 2 nm (aproximadamente 68 kD) y/o la captación y el metabolismo específico o inespecífico en los tejidos. La glicoPEGilación puede tapar los carbohidratos terminales (p.ej., galactosa o N-acetilgalactosamina), y por lo tanto bloquear la eliminación de fase alfa rápida por medio de receptores que reconocen estos carbohidratos. También puede conferir un radio efectivo más largo, y por lo tanto disminuir el volumen de distribución y la captación tisular, por lo que se prolonga la fase beta tardía. Así, el impacto exacto de la glicoPEGilación sobre las semividas de la fase alfa y la fase beta variará dependiendo del tamaño, el estado de glicosilación, y otros parámetros, tal como se conoce en la técnica. Una explicación adicional de la "semivida" se halla en PharmaceuticalBiotechnology (1997, DFA Crommelin y RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, �?msterdam, págs. 101 - 120).
El término "glicoconjugación", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la conjugación mediada enzimáticamente de una especie de carbohidrato modificado en un residuo de aminoácido o glicosilo de un polipéptido, p.ej., una hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención. Un subgénero de la "glicoconjugación" es la "glicol-PEGilación", en la que el grupo modificador del carbohidrato modificado es poli(etilen glicol), y un derivado de alquilo (p.ej., m-PEG) o derivado reactivo (p.ej., H2N-PEG, HOOC-PEG) del mismo.
Las expresiones "a gran escala" y "a escala industrial" se usan de manera intercambiable y se refieren a un ciclo de reacciones que produce al menos alrededor de 250 mg, preferiblemente al menos alrededor de 500 mg, y más preferiblemente al menos alrededor de 1 gramo de glicoconjugado al finalizar un único ciclo de reacciones.
La expresión "grupo ligador de glicosilo", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un residuo de glicosilo al cual se le ha unido de manera covalente un grupo modificador (p.ej., resto de PEG, resto terapéutico, biomolécula); el grupo ligador de glicosilo une el grupo modificador al resto del conjugado. En los métodos de la invención, el "grupo ligador de glicosilo" se une de manera covalente a un péptido glicosilado o sin glicosilar, por lo que une el agente a un aminoácido y/o residuo de glicosilo del péptido. Un "grupo ligador de glicosilo" deriva en general de un "carbohidrato modificado" mediante la unión enzimática del "carbohidrato modificado" a un aminoácido y/o residuo de glicosilo del péptido. El grupo ligador de glicosilo puede ser una estructura derivada de sacárido que se degrada durante la formación del casete grupo modificador-carbohidrato modificado (p.ej., oxidación - formación de base de Schiff - reducción), o el grupo ligador de glicosilo puede estar intacto. Un "grupo ligador de glicosilo intacto" se refiere a un grupo ligador que deriva de un resto de glicosilo en el que el monómero de sacárido que une el grupo modificador y el resto del conjugado no se degrada, p.ej., oxida, p.ej., mediante metaperyodato sódico. Los "grupos ligadores de glicosilo intactos" de la invención se pueden derivar de un oligosacárido natural mediante la adición de unidad(es) de glicosilo o la extracción de una o más unidades de glicosilo de una estructura de sacárido inicial.
La expresión "resto de selección del objetivo", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a las especies que se localizarán de manera selectiva en un tejido o región particular del organismo. La localización está mediada por el reconocimiento específico de determinantes moleculares, el tamaño molecular del agente o conjugado de selección del objetivo, las interacciones iónicas, interacciones hidrófobas y similares. Los expertos en la técnica conocen otros mecanismos para seleccionar como objetivo con un agente un tejido o región particulares. Los restos de selección del objetivo ejemplares incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, transferrina, HS-glicoproteína, factores de coagulación, proteínas séricas, �-glicoproteína, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO y similares.
Tal como se usa en la presente memoria, "resto terapéutico" significa cualquier agente útil para la terapia que incluye, pero sin limitación, antibióticos, agentes anti-inflamatorios, fármacos anti-tumorales, citotoxinas, y agentes radiactivos. El "resto terapéutico" incluye profármacos de agentes bioactivos, construcciones en las que más de un resto terapéutico está unido a un portador, p.ej., agentes multivalentes. El resto terapéutico incluye también proteínas y construcciones que incluyen proteínas. Las proteínas ejemplares incluyen, pero sin limitación, eritropoyetina (EPO), factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF), interferón (p.ej., interferón-a, -�, -y), interleucina (p.ej., Interleucina II), proteínas séricas (p.ej., Factores VII, VIIa, VIII, IX, y X), gonadotropina coriónica humana (HCG), hormona estimulante del folículo (FSH) y hormona luteinizante (LH) y proteínas de fusión de anticuerpos (p.ej. proteína de fusión receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR)/dominio Fc).
Tal como se usa en la presente memoria, "fármaco anti-tumoral" significa cualquier agente útil para combatir el cáncer que incluye, pero sin limitación, citotoxinas y agentes tales como antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos, agentes antimitóticos, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticoesteroides, interferones y agentes radiactivos. También están abarcados dentro del alcance del término "fármaco anti-tumoral" los conjugados de péptidos con actividad anti-tumoral, p.ej. TNF-a. Los conjugados incluyen, pero sin limitación, aquellos formados entre una proteína terapéutica y una glicoproteína de la invención. Un conjugado representativo es el que se forma entre PSGL-1 y TNF-a.
Tal como se usa en la presente memoria, "una citotoxina o agente citotóxico" significa cualquier agente que es perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracinediona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Otras toxinas incluyen, por ejemplo, ricina, CC-1065 y análogos, las duocarmicinas. Aún otras toxinas incluyen la toxina de la difteria, y veneno de serpiente (p.ej., veneno de cobra).
Tal como se usa en la presente memoria, "un agente radiactivo" incluye cualquier radioisótopo que es eficaz en el diagnóstico o la destrucción de un tumor. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, indio-111, cobalto-60. Además, los elementos radiactivos naturales, tales como uranio, radio, y torio, que generalmente representan mezclas de radioisótopos, son ejemplos adecuados de un agente radiactivo. Los iones metálicos se quelan generalmente con un resto quelante orgánico.
Muchos grupos quelantes útiles, éteres corona, criptandos y similares se conocen en la técnica y se pueden incorporar en los compuestos de la invención (p.ej., EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA, etc., y sus análogos de fosfonato tales como DTPP, EDTP, HDTP, NTP, etc.). Véase, por ejemplo, Pitt et al., "The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload", En, INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE; Martell, Ed.; American Chemical Society, Washington, D.C., 1980, págs. 279-312; Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES; Cambridge University Press, Cambridge,1989; Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer-Verlag, Nueva York, 1989, y las referencias contenidas en ellos.
Además, los expertos en la técnica tienen a su disposición una diversidad de vías que permiten la unión de los agentes quelantes, éteres corona y ciclodextrinas a otras moléculas. Véase, por ejemplo, Meares et al., "Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides". En, MODIFICATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL, AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS"; Feeney, et al., Eds., American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, págs. 370-387; Kasina et al., Bioconjugate Chem., 9: 108-117 (1998); Song et al., Bioconjugate Chem., 8: 249-255 (1997).
Tal como se usa en la presente memoria, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que cuando se combina con el conjugado conserva la actividad del conjugado y no es reactivo con el sistema inmunitario del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los vehículos farmacéuticos habituales tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también pueden incluir soluciones estériles, comprimidos que incluyen comprimidos revestidos y cápsulas. En general, tales vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, carbohidratos, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales del mismo, estearato magnésico o cálcico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Tales vehículos pueden incluir también aditivos de aroma y color y otros ingredientes. Las composiciones que comprenden tales vehículos se formulan mediante métodos convencionales muy conocidos.
Tal como se usa en la presente memoria, "administrar" significa la administración oral, inhalación, administración en forma de un supositorio, contacto tópico, intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal o la administración subcutánea, o la implantación de un dispositivo de liberación lenta, p.ej., una bomba mini-osmótica, al sujeto. La administración puede ser mediante cualquier vía que incluye la parenteral, y transmucosa (p.ej., oral, nasal, vaginal, rectal, o transdérmica). La administración parenteral incluye, p.ej., la intravenosa, intramuscular, intraarteriolar, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular, e intracraneal. Además, cuando la inyección es para tratar un tumor, p.ej., inducir la apoptosis, la administración puede ser directamente en el tumor y/o en los tejidos que rodean el tumor. Otros modos de administración incluyen, pero sin limitación, el uso de formulaciones liposómicas, infusión intravenosa, parches transdérmicos, etc.
El término "aislado" se refiere a un material que está sustancialmente o esencialmente exento de componentes, que se usa para producir el material. Para los conjugados peptídicos de la invención, el término "aislado" se refiere a un material que está sustancialmente o esencialmente exento de componentes, que acompañan normalmente al material en la mezcla usada para preparar el conjugado peptídico. "Aislado" y "puro" se usan de manera intercambiable. En general, los conjugados peptídicos aislados de la invención tienen un nivel de pureza que se expresa preferiblemente en forma de un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza para los conjugados peptídicos es de alrededor del 60%, alrededor del 70% o alrededor del 80%, y el extremo superior del intervalo de pureza es de alrededor del 70%, alrededor del 80%, alrededor del 90% o más de alrededor del 90%.
Cuando los conjugados peptídicos tienen una pureza de más de alrededor del 90%, sus purezas también se expresan preferiblemente en forma de un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza es de alrededor del 90%, alrededor del 92%, alrededor del 94%, alrededor del 96% o alrededor del 98%. El extremo superior del intervalo de pureza es de alrededor del 92%, alrededor del 94%, alrededor del 96%, alrededor del 98% o alrededor del 100%.
La pureza se determina mediante cualquier método de análisis reconocido en la técnica (p.ej., intensidad de las bandas en un gel teñido con plata, electroforesis en gel de poliacrilamida, HPLC, o un medio similar).
"Esencialmente cada miembro de la población", tal como se usa en la presente memoria, describe una característica de una población de conjugados peptídicos de la invención en la que un porcentaje seleccionado de los carbohidratos modificados añadidos a un péptido se añaden en múltiples sitios aceptores idénticos del péptido. "Esencialmente cada miembro de la población" se refiere a la "homogeneidad" de los sitios del péptido conjugados a un carbohidrato modificado, y se refiere a los conjugados de la invención, que tienen una homogeneidad de al menos alrededor del 80%, preferiblemente al menos alrededor del 90% y más preferiblemente al menos alrededor del 95%.
"Homogeneidad" se refiere a la consistencia estructural en una población de restos aceptores a los que se conjugan los carbohidratos modificados. Así, en un conjugado peptídico de la invención en el que cada resto de carbohidrato modificado se conjuga a un sitio aceptor que tiene la misma estructura que el sitio aceptor al que se conjugan todos los demás carbohidratos modificados, se dice que el conjugado peptídico tiene una homogeneidad de alrededor del 100%. La homogeneidad se expresa generalmente en forma de un intervalo. El extremo inferior del intervalo de homogeneidad para los conjugados peptídicos es de alrededor del 60%, alrededor del 70% o alrededor del 80%, y el extremo superior del intervalo de pureza es de alrededor del 70%, alrededor del 80%, alrededor del 90% o más de alrededor del 90%.
Cuando los conjugados peptídicos tienen una homogeneidad mayor o igual a alrededor del 90%, su homogeneidad también se expresa preferiblemente en forma de un intervalo. El extremo inferior del intervalo de homogeneidad es de alrededor del 90%, alrededor del 92%, alrededor del 94%, alrededor del 96% o alrededor del 98%. El extremo superior del intervalo de homogeneidad es de alrededor del 92%, alrededor del 94%, alrededor del 96%, alrededor del 98% o alrededor del 100%. La pureza de los conjugados peptídicos se determina en general mediante uno o más métodos conocidos para los expertos en la técnica, p.ej., cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser asistida por matriz (MALDITOF), electroforesis capilar, y similares.
"Glicoforma sustancialmente uniforme" o un "patrón de glicosilación sustancialmente uniforme", cuando se refiere a una especie de glicopéptido, se refiere al porcentaje de restos aceptores que se glicosilan mediante la glicosiltransferasa de interés (p.ej., fucosiltransferasa). Por ejemplo, en el caso de una a1,2 fucosiltransferasa, existe un patrón de fucosilación sustancialmente uniforme si sustancialmente todos los Gal 1,4-GlcNAc-R (tal como se define más adelante) y los análogos sialilados de los mismos están fucosilados en un conjugado peptídico de la invención. Un experto en la técnica entenderá que el material de partida puede contener restos aceptores glicosilados (p.ej., restos Gal�1,4-GlcNAc-R fucosilados). Así, el porcentaje calculado de glicosilación incluirá los restos aceptores que se glicosilan mediante los métodos de la invención, así como aquellos restos aceptores ya glicosilados en el material de partida.
El término "sustancialmente" en las definiciones anteriores de "sustancialmente uniforme" significa en general que se glicosilan al menos alrededor del 40%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80%, o más preferiblemente al menos alrededor del 90%, y aún más preferiblemente al menos alrededor del 95% de los restos aceptores para una glicosiltransferasa particular.
Otros objetivos, aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente.
PEG, poli(etilenglicol); m-PEG, metoxi-poli(etilen glicol); PPG, poli(propilenglicol); m-PPG, metoxi-poli(propilen glicol); Fuc, fucosilo; Gal, galactosilo; GalNAc, N-acetilgalactosaminilo; Glc, glucosilo; GlcNAc, N-acetilglucosaminilo; Man, manosilo; ManAc, acetato de manosaminilo; Sia, ácido siálico; y NeuAc, N-acetilneuraminilo.
Para mejorar la eficacia de la hormona del crecimiento humana recombinante usada para fines terapéuticos, la presente descripción proporciona mutantes modificados mediante ingeniería genética de la hormona del crecimiento humana que contienen sitios de glicosilación con unión en N u O que no están presentes en la hormona del crecimiento humana natural. Aunque estos mutantes de hGH conservan sustancialmente la actividad biológica de la hormona de tipo natural, los sitios de glicosilación recién introducidos permiten que los mutantes de hGH producidos de manera recombinante se glicosilen con una gran diversidad de patrones. Además, los sitios de glicosilación no naturales proporcionan lugares para la conjugación de grupos modificadores al péptido, p.ej., mediante glicoconjugación. Un grupo modificador ejemplar es un polímero hidrosoluble, tal como poli(etilen glicol), p.ej., metoxipoli(etilen glicol). La modificación de los mutantes de hGH puede mejorar la estabilidad y el tiempo de retención de la hGH recombinante en la circulación del paciente, reducir su antigenicidad, y aumentar su capacidad de seleccionar como objetivo un tejido específico que necesita tratamiento.
En la presente memoria se describen mutantes de hGH que incluyen uno o más sitios de glicosilación con unión en O o N que no se hallan en el péptido de tipo natural. Los mutantes son sustratos para la glicosilación enzimática en uno o más sitios que normalmente no estarían glicosilados, o que estarían escasamente glicosilados, en el péptido de tipo natural. Así, los mutantes permiten que se modifique la posición de un residuo de glicosilo o un grupo ligador de glicosilo para obtener un péptido que tiene unas propiedades deseables seleccionadas. Además de la posición y el número de residuos de glicosilo o grupos ligadores de glicosilo, otras propiedades que se pueden variar mediante el uso de los mutantes y métodos de la invención incluyen la farmacocinética, farmacodinámica, resistencia a la proteolisis, inmunogenicidad, reconocimiento por el sistema reticuloendotelial, distribución tisular y similares.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante. La hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó
15. En ciertas realizaciones, la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:1 o SEQ ID Nº:2. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un casete de expresión o una célula que comprende un ácido nucleico, p.ej., un ácido nucleico aislado, que incluye una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante. La hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15. En ciertas realizaciones, la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:1 o SEQ ID Nº:2. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó
15. Este método comprende las etapas de producir de manera recombinante la hormona del crecimiento humana mutante, y glicosilar la hormona del crecimiento humana mutante en el sitio de glicosilación nuevo. En ciertas realizaciones, la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:1 o SEQ ID Nº:2. En ciertas realizaciones preferidas, la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
Adquisición de las Secuencias Codificantes de hGH
Tecnología Recombinante General
Esta invención se basa en técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante. Los libros de texto básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ª ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994).
Para los ácidos nucleicos, los tamaños se proporcionan en kilobases (kb) o pares de bases (pb). Estos son estimaciones derivadas de electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, de ácidos nucleicos secuenciados, o de secuencias de ADN publicadas. Para las proteínas, los tamaños se proporcionan en kilodaltons (kDa) o el número de residuos de aminoácidos. Los tamaños de las proteínas se estiman a partir de electroforesis en gel, de proteínas secuenciadas, de secuencias de aminoácidos derivadas, o de secuencias de proteínas publicadas.
Los oligonucleótidos que no están disponibles comercialmente se pueden sintetizar químicamente, p.ej., según el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981), mediante el uso de un sintetizador automatizado, tal como se describe en Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). La purificación de oligonucleótidos se lleva a cabo mediante el uso de cualquier estrategia reconocida en la técnica, p.ej., electroforesis en gel de acrilamida nativa o HPLC de intercambio aniónico como se describe en Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983).
Las secuencias de los genes de la hormona del crecimiento humana de tipo natural clonada, el polinucleótido que codifica las hormonas del crecimiento humanas mutantes, y los oligonucleótidos sintéticos se pueden verificar después de la clonación mediante el uso, p.ej., del método de terminación de la cadena para la secuenciación de moldes bicatenarios de Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981).
Clonación y Subclonación de una Secuencia Codificante de hGH de Tipo Natural
Se han determinado varias secuencias polinucleotídicas que codifican una hormona del crecimiento humana de tipo natural, p.ej., los nºs de acceso de GenBank NM 000515, NM 002059, NM 022556, NM 022557, NM 022558, NM 022559, NM 022560, NM 022561, y NM 022562, y se pueden obtener de un proveedor comercial.
El progreso rápido en los estudios del genoma humano ha hecho posible una aproximación de clonación, en la que se puede realizar una búsqueda en una base de datos de secuencias de ADN humano para cualquier segmento génico que tenga un cierto porcentaje de homología de secuencia respecto de una secuencia nucleotídica conocida, tal como una que codifica una hormona del crecimiento humana identificada previamente. Cualquier secuencia de ADN identificada de esta manera se puede obtener posteriormente mediante una síntesis química y/o una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como un método de prolongación solapante. Para una secuencia corta, puede ser suficiente la síntesis completamente de novo; a la vez que puede ser necesario un aislamiento adicional de una secuencia codificante de tamaño completo a partir de una biblioteca de cADN o ADN genómico humano mediante el uso de una sonda sintética para obtener un gen más largo.
De manera alternativa, se puede aislar una secuencia de ácido nucleico que codifica una hormona del crecimiento humana a partir de una biblioteca de cADN o de ADN genómico humano mediante el uso de técnicas de clonación habituales, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en las que los cebadores basados en la homología pueden proceder a menudo de una secuencia de ácido nucleico conocida que codifica una hormona del crecimiento humana. Las técnicas utilizadas con más frecuencia para este fin se describen en libros de texto habituales, p.ej., Sambrook y Russell, anteriormente mencionados.
Las bibliotecas de cADN adecuadas para obtener una secuencia codificante para una hormona del crecimiento humana de tipo natural pueden estar disponibles comercialmente o se pueden construir. Los métodos generales para el aislamiento del mARN, producción de cADN mediante transcripción inversa, ligadura del cADN en un vector recombinante, transfección a un hospedador recombinante para la propagación, cribado, y clonación se conocen muy bien (véase, p.ej., Gubler y Hoffman, Gene, 25: 263-269 (1983); Ausubel et al., anteriormente mencionado). Tras la obtención de un segmento amplificado de una secuencia nucleotídica mediante PCR, el segmento se puede usar posteriormente como sonda para aislar la secuencia polinucleotídica de tamaño completo que codifica la hormona del crecimiento humana de tipo natural a partir de la biblioteca de cADN. Se puede hallar una descripción general de los procedimientos adecuados en Sambrook y Russell, anteriormente mencionados.
Se puede seguir un procedimiento similar para obtener una secuencia de tamaño completo que codifica una hormona del crecimiento humana de tipo natural, p.ej., cualquiera de los nºs de acceso de GenBank mencionados anteriormente, a partir de una biblioteca genómica humana. Las bibliotecas genómicas humanas están disponibles comercialmente o se pueden construir según diversos métodos reconocidos en la técnica. En general, para construir una biblioteca genómica, primero se extrae el ADN de un tejido en el que es probable hallar una hormona del crecimiento humana. Después el ADN se fragmenta de manera mecánica o se digiere enzimáticamente para proporcionar fragmentos de alrededor de 12-20 kb de longitud. Los fragmentos se separan posteriormente mediante centrifugación en gradiente de los fragmentos polinucleotídicos de tamaños no deseados, y se insertan en vectores de bacteriófago A. Estos vectores y fagos se empaquetan in vitro. Los fagos recombinantes se analizan mediante hibridación de placas como se describió en Benton y Davis, Science, 196: 180-182 (1977). La hibridación de las colonias se lleva a cabo como se describió en Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 (1975).
Basándose en la homología de secuencia, se pueden diseñar oligonucleótidos degenerados como grupos de cebadores, y se puede llevar a cabo la PCR en condiciones adecuadas (véase, p.ej., White et al., PCR Protocols: Current Methods and Applications, 1993; Griffin y Griffin, PCR Technology, CRC Press Inc. 1994) para amplificar un segmento de secuencia nucleotídica a partir de una biblioteca genómica o de cADN. Mediante el uso del segmento amplificado como sonda, se obtiene el ácido nucleico de tamaño completo que codifica una hormona del crecimiento humana de tipo natural.
Después de conseguir una secuencia de ácido nucleico que codifica una hormona del crecimiento humana de tipo natural, la secuencia codificante se puede subclonar en un vector, por ejemplo, un vector de expresión, de manera que la hormona del crecimiento humana de tipo natural recombinante se puede producir a partir de la construcción resultante. Posteriormente se pueden realizar modificaciones adicionales a la secuencia codificante de la hormona del crecimiento humana de tipo natural, p.ej., sustituciones de nucleósidos, para alterar las características de la molécula.
Introducción de Mutaciones en una Secuencia de hGH
A partir de la secuencia polinucleotídica codificante, se puede determinar la secuencia de aminoácidos de una hormona del crecimiento humana de tipo natural, p.ej., SEQ ID Nº:1 o SEQ ID Nº:2. Posteriormente, esta secuencia de aminoácidos se puede modificar para alterar el patrón de glicosilación de la proteína, mediante la introducción de sitio(s) de glicosilación adicional(es) en diversas localizaciones de la secuencia de aminoácidos.
Se conocen bien en la técnica varios tipos de sitios de glicosilación de proteínas. Por ejemplo, en eucariotas, la glicosilación con unión en N se da en la asparagina de la secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, en la que Xaa es cualquier aminoácido excepto prolina (Kornfeld et al., Ann Rev Biochem 54:631-664 (1985); Kukuruzinska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2145-2149 (1987); Herscovics et al., FASEB J 7:540-550 (1993); y Orlean, Saccharomyces Vol. 3 (1996)). La glicosilación con unión en O tiene lugar en residuos de serina o treonina (Tanner et al., Biochim. Biophys. Acta. 906: 81-91, (1987). y Hounsell et al., Glycoconj. J. 13:19-26 (1996)). Otros patrones de glicosilación se forman mediante la unión de glicosilfosfatidilinositol al grupo carboxiterminal de la proteína (Takeda et al., Trends Biochem. Sci. 20:367-371 (1995); y Udenfriend et al., Ann. Rev. Biochem. 64: 593-591, (1995). Basándose en estos conocimientos, se pueden introducir así mutaciones adecuadas en una secuencia de una hormona del crecimiento humana de tipo natural para formar sitios de glicosilación nuevos.
Aunque la modificación directa de un residuo de aminoácido dentro de una secuencia polipeptídica de una hormona del crecimiento humana puede ser adecuada para introducir un sitio de glicosilación con unión en N o con unión en O nuevo, de manera más frecuente, la introducción de un sitio de glicosilación nuevo se lleva a cabo mutando la secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis conocidos, algunos de los cuales se discuten más adelante. Las modificaciones ejemplares de la hormona del crecimiento humana incluyen las ilustradas en SEQ ID Nº:3 o SEQ ID Nº:4.
En la técnica se establecen y se describen una diversidad de protocolos que generan mutaciones. Véase. p.ej., Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4504-4509 (1997); y Stemmer, Nature, 370: 389-391 (1994). Los procedimientos se pueden usar por separado o en combinación para producir variantes de un grupo de ácidos nucleicos, y por lo tanto variantes de los polipéptidos codificados. Los equipos para la mutagénesis, la construcción de bibliotecas, y otros métodos para la generación de diversidad están disponibles comercialmente.
Los métodos mutacionales para la generación de diversidad incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida (Botstein y Shortle, Science, 229: 1193-1201 (1985)), la mutagénesis mediante el uso de moldes que contienen uracilo (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985)), la mutagénesis dirigida en oligonucleótidos (Zoller y Smith, Nucl. Acids Res., 10: 6487-6500 (1982)), la mutagénesis de ADN modificado mediante fosforotioato (Taylor et al., Nucl. Acids Res., 13: 8749-8764 y 8765-8787 (1985)), y la mutagénesis mediante el uso de ADN doble con huecos (Kramer et al., Nucl. Acids Res., 12: 9441-9456 (1984)).
Otros métodos posibles para generar mutaciones incluyen la reparación de errores puntuales (Kramer et al., Cell, 38: 879-887 (1984)), la mutagénesis mediante el uso de cepas hospedadoras sin reparación (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4431-4443 (1985)), la mutagénesis por deleción (Eghtedarzadeh y Henikoff, Nucl. Acids Res., 14: 5115 (1986)), la selección de restricción y purificación de restricción (Wells et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A, 317: 415423 (1986)), la mutagénesis mediante síntesis génica total (Nambiar et al., Science, 223: 1299-1301 (1984)), la reparación de rupturas bicatenarias (Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986)), la mutagénesis mediante métodos de terminación de la cadena polinucleotídica (patente de EE.UU. nº 5.965.408), y la PCR propensa a errores (Leung et al., Biotechniques, 1: 11-15 (1989)).
Modificación de los �?cidos Nucleicos para la Utilización de Codones Preferidos en un Organismo Hospedador
La secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante se puede alterar adicionalmente para que coincida con la utilización de codones preferidos en un hospedador particular. Por ejemplo, se puede usar la utilización de codones preferidos de una cepa de células bacterianas para modificar un polinucleótido que codifica una hormona del crecimiento humana mutante de la invención y que incluya los codones favorecidos por esta cepa. La frecuencia de la utilización de los codones preferidos exhibida por una célula hospedadora se puede calcular realizando la media de la frecuencia de la utilización de codones preferidos en un gran número de genes expresados por la célula hospedadora (p.ej., hay disponible un servicio de cálculo en el sitio de Internet del Instituto de Investigación de ADN Kazusa, Japón). Este análisis se limita preferiblemente a los genes que la célula hospedadora expresa en gran cantidad. La patente de EE.UU. nº 5.824.864, por ejemplo, proporciona la frecuencia de utilización de codones de genes muy expresados exhibida por plantas dicotiledóneas y plantas monocotiledóneas.
Al final de la modificación, las secuencias codificantes de la hormona del crecimiento humana mutante se verifican mediante secuenciación, y después se subclonan en un vector de expresión adecuado para la producción recombinante de la misma manera que las hormonas del crecimiento humanas de tipo natural.
Expresión y Purificación de la hGH Mutante
Tras la verificación de la secuencia, la hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención se puede producir mediante el uso de técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante, que se basan en las secuencias polinucleotídicas que codifican el polipéptido descrito en la presente memoria.
Sistemas de Expresión
Para obtener un nivel elevado de expresión de un ácido nucleico que codifica una hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención, en general se subclona un polinucleótido que codifica la hormona del crecimiento humana mutante en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción y un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción. Los promotores bacterianos adecuados se conocen bien en la técnica y se describieron, p.ej., en Sambrook y Russell, anteriormente mencionados, y Ausubel et al., anteriormente mencionado. Los sistemas de expresión bacterianos para expresar la hormona del crecimiento humana de tipo natural o mutante están disponibles, p.ej., en E. coli, Bacillus sp., Salmonella, y Caulobacter. Los equipos para tales sistemas de expresión están disponibles comercialmente. Los sistemas de expresión eucarióticos para células mamíferas, levaduras, y células de insecto se conocen bien en la técnica y también están disponibles comercialmente. En una realización, el vector de expresión eucariótico es un vector adenoviral, un vector adenoasociado, o un vector retroviral.
El promotor utilizado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular. El promotor se coloca opcionalmente aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio heterólogo de la transcripción a la que está del sitio de inicio de la transcripción en su entorno natural. Tal como se conoce en la técnica, sin embargo, se puede adaptar cierta variación de esta distancia sin la pérdida de la función del promotor.
Además del promotor, el vector de expresión incluye en general una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales necesarios para la expresión de la hormona del crecimiento humana mutante en las células hospedadoras. Un casete de expresión típico contiene así un promotor unido de forma operable a la secuencia de ácido nucleico que codifica la hormona del crecimiento humana mutante y las señales necesarias para la poliadenilación eficaz del transcrito, los sitios de unión al ribosoma, y de terminación de la traducción. La secuencia de ácido nucleico que codifica la hormona del crecimiento humana está unida generalmente a una secuencia de un péptido señal de escisión para favorecer la secreción de la hormona del crecimiento humana por la célula transformada. Tales péptidos señal incluyen, entre otros, los péptidos señal del activador de plasminógeno tisular, insulina, y factor de crecimiento neuronal, y la esterasa de la hormona juvenil de Heliothis virescens. Otros elementos del casete pueden incluir potenciadores y, si se usa ADN genómico como gen estructural, intrones funcionales con sitios donantes y aceptores de corte y empalme.
Además de una secuencia promotora, el casete de expresión debería contener además una región de terminación de la transcripción en posición 3' del gen estructural para proporcionar una terminación eficaz. La región de terminación se puede obtener del mismo gen que la secuencia promotora, o se puede obtener de genes diferentes.
El vector de expresión particular usado para transportar la información genética a la célula no es especialmente crítico. Se puede usar cualquiera de los vectores convencionales usados para la expresión en células eucarióticas o procarióticas. Los vectores de expresión bacteriana habituales incluyen plásmidos tales como los plásmidos basados en pBR322, pSKF, pET23D, y sistemas de expresión mediante fusión tales como GST y LacZ. También se pueden añadir marcadores de epítopos a las proteínas recombinantes para proporcionar métodos prácticos de aislamiento, p.ej., c-myc.
Generalmente se usan vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucarióticos en los vectores de expresión eucarióticos, p.ej., vectores de SV40, vectores de papiloma virus, y vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucarióticos ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A, pMTO10/A, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus, y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV40, el promotor tardío de SV40, el promotor de metalotioneína, el promotor del virus de tumor mamario murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor de polihedrina, u otros promotores que se ha demostrado que son eficaces para la expresión en las células eucarióticas.
Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan una amplificación génica, tal como timidina quinasa, higromicina B fosfotransferasa, y dihidrofolato reductasa. De manera alternativa, también son adecuados los sistemas de expresión de alto rendimiento que no implican una amplificación génica, tal como un vector de baculovirus en células de insecto, con una secuencia polinucleotídica que codifica la hormona del crecimiento humana mutante bajo la dirección del promotor de polihedrina u otros promotores fuertes de baculovirus.
Los elementos que se incluyen en general en los vectores de expresión también incluyen un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica una resistencia a antibiótico para permitir la selección de las bacterias que albergan los plásmidos recombinantes, y sitios de restricción únicos en regiones que no son esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias eucarióticas. El gen de resistencia a antibióticos particular elegido no es crítico, y es adecuado cualquiera de los muchos genes de resistencia conocidos en la técnica. Las secuencias procarióticas se eligen opcionalmente de manera que no interfieran con la replicación del ADN en las células eucarióticas, si es necesario. De forma similar a los marcadores de selección por resistencia a antibióticos, también se pueden usar marcadores de selección metabólicos basados en rutas metabólicas conocidas como medio para seleccionar las células hospedadoras transformadas.
Cuando se desea la expresión periplásmica de una proteína recombinante (p.ej., un mutante de hGH de la presente invención), el vector de expresión comprende además una secuencia que codifica una señal de secreción, tal como la señal de secreción OppA (proteína periplásmica de unión a oligopéptido) de E. coli o una versión modificada de la misma, que se conecta directamente al extremo 5' de la secuencia codificante de la proteína a expresar. Esta secuencia señal dirige a la proteína recombinante producida en el citoplasma a través de la membrana celular hacia el espacio periplásmico. El vector de expresión puede comprender además una secuencia codificante para una señal peptidasa 1, que es capaz de escindir enzimáticamente la secuencia señal cuando la proteína recombinante va a entrar en el espacio periplásmico. Se puede encontrar una descripción más detallada de la producción periplásmica de una proteína recombinante, p.ej., en Gray et al., Gene 39: 247-254 (1985), patentes de EE.UU. nºs 6.160.089 y
6.436.674.
Tal como se discutió anteriormente, un experto en la técnica reconocerá que se pueden realizar diversas sustituciones conservativas en cualquier hormona del crecimiento humana de tipo natural o mutante o en su secuencia codificante, a la vez que se mantiene la actividad biológica de la hormona del crecimiento humana. Además, también se pueden realizar modificaciones de una secuencia codificante polinucleotídica para adaptar la utilización de codones preferida en un hospedador de expresión particular sin alterar la secuencia de aminoácidos resultante.
Métodos de Transfección
Se usan métodos de transfección habituales para producir líneas celulares bacterianas, mamíferas, de levadura, de insecto, o vegetales que expresan grandes cantidades de la hormona del crecimiento humana mutante, que después se purifica mediante el uso de técnicas habituales (véase, p.ej., Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, en Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). La transformación de las células eucarióticas y procarióticas se lleva a cabo según las técnicas habituales (véase, p.ej., Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds, 1983).
Se puede usar cualquiera de los procedimientos conocidos para la introducción de secuencias nucleotídicas exógenas en células hospedadoras. Estos incluyen el uso de la transfección mediante fosfato cálcico, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, liposomas, microinyección, vectores plasmáticos, vectores virales y cualquiera de los otros métodos conocidos para la introducción de ADN genómico clonado, cADN, ADN sintético u otro material genético exógeno en una célula hospedadora (véase, p.ej., Sambrook y Russell, anteriormente mencionados). Únicamente es necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular usado sea capaz de introducir con éxito al menos un gen en la célula hospedadora capaz de expresar la hormona del crecimiento humana mutante.
Detección de la Expresión de la hGH Mutante en las Células Hospedadoras
Después de introducir el vector de expresión en células hospedadoras adecuadas, las células transfectadas se cultivan en condiciones que favorecen la expresión de la hormona del crecimiento humana mutante. Después las células se someten a un cribado en función de la expresión del polipéptido recombinante, que se recupera posteriormente del cultivo mediante el uso de técnicas habituales (véase, p.ej., Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); patente de EE.UU. nº 4.673.641; Ausubel et al., anteriormente mencionado; y Sambrook y Russell, anteriormente mencionados).
Los expertos en la técnica conocen varios métodos generales para el cribado de la expresión génica. Primero, se puede detectar la expresión génica a nivel del ácido nucleico. Se usa habitualmente una diversidad de métodos de medida específica de ADN y ARN mediante el uso de técnicas de hibridación de ácido nucleico (p.ej., Sambrook y Russell, anteriormente mencionados). Algunos métodos implican una separación electroforética (p.ej., transferencia de Southern para detectar el ADN y transferencia de Northern para detectar el ARN), pero la detección del ADN o ARN también se puede llevar a cabo sin electroforesis (tal como mediante transferencia puntual). La presencia de un ácido nucleico que codifica una hormona del crecimiento humana mutante en células transfectadas se puede detectar también mediante PCR o RT-PCR con el uso de cebadores específicos de secuencia.
En segundo lugar, se puede detectar la expresión génica a nivel del polipéptido. Los expertos en la técnica usan de manera rutinaria diversos ensayos inmunológicos para medir el nivel de un producto génico, en particular mediante el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales que reaccionan de manera específica con una hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:3, 4, o 5, (p.ej., Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, capítulo 14, Cold Spring Harbor, 1988; Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)). Tales técnicas requieren la preparación de un anticuerpo seleccionando los anticuerpos con una especificidad elevada hacia la hormona del crecimiento humana mutante o una porción antigénica de la misma. Los métodos para generar anticuerpos policlonales y monoclonales están bien establecidos, y sus descripciones se pueden hallar en la bibliografía, véase, p.ej., Harlow y Lane, anteriormente mencionados; Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976). En una sección posterior se proporciona una descripción más detallada para la preparación de anticuerpos hacia la hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención y para llevar a cabo ensayos inmunológicos que detectan la hormona del crecimiento humana mutante.
Purificación de la hGH Mutante Producida de Manera Recombinante
Una vez que se confirma la expresión de una hormona del crecimiento humana mutante recombinante en las células hospedadoras transfectadas, las células hospedadoras se cultivan a una escala adecuada con el fin de purificar el polipéptido recombinante.
Purificación de hGH Mutante Producida de Manera Recombinante a Partir de Bacterias
Cuando las hormonas del crecimiento humanas mutantes de la presente invención se producen de manera recombinante mediante bacterias transformadas en grandes cantidades, en general tras la inducción de un promotor, aunque la expresión puede ser constitutiva, las proteínas pueden formar agregados insolubles. Existen varios protocolos que son adecuados para la purificación de cuerpos de inclusión proteicos. Por ejemplo, la purificación de proteínas agregadas (más adelante en la presente memoria denominadas cuerpos de inclusión) implica en general la extracción, separación y/o purificación de los cuerpos de inclusión mediante la ruptura de las células bacterianas, p.ej., mediante incubación en un tampón de alrededor de 100-150 μg/ml de lisozima y 0,1% de Nonidet P40, un detergente no iónico. La suspensión de células se puede homogeneizar mediante el uso de un homogeneizador Politron (Brinkman Instruments, Westbury, NY). De manera alternativa, las células se pueden someter a sonicación en hielo. Se describen métodos alternativos para lisar bacterias en Ausubel et al. y Sambrook y Russell, ambos mencionados anteriormente, y serán evidentes para los expertos en la técnica.
La suspensión de células generalmente se centrifuga, y el sedimento que contiene los cuerpos de inclusión se resuspende en un tampón que no los disuelve, sino que lava los cuerpos de inclusión, p.ej., Tris-HCl 20 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM y 2% de Triton-X 100, un detergente no iónico. Puede ser necesario repetir la etapa de lavado para eliminar tantos restos celulares como sea posible. El sedimento restante de cuerpos de inclusión se puede resuspender en un tampón adecuado (p.ej., fosfato sódico 20 mM, pH 6,8, NaCl 150 mM). Otros tampones adecuados serán evidentes para los expertos en la técnica.
Tras la etapa de lavado, los cuerpos de inclusión se solubilizan mediante la adición de un disolvente que es un aceptor fuerte de hidrógeno y un donante fuerte de hidrógeno (o una combinación de disolventes que tienen cada uno estas propiedades). Las proteínas que forman los cuerpos de inclusión se pueden renaturalizar después mediante dilución o diálisis con un tampón compatible. Los disolventes adecuados incluyen, pero sin limitación, urea (de alrededor de 4 M a alrededor de 8 M), formamida (al menos alrededor del 80%, en volumen/volumen), e hidrocloruro de guanidina (de alrededor de 4 M a alrededor de 8 M). Ciertos disolventes que son capaces de solubilizar proteínas que forman agregados, tales como SDS (dodecil sulfato sódico) y un 70% de ácido fórmico, pueden ser inadecuados para el uso en este procedimiento debido a la posibilidad de una desnaturalización irreversible de las proteínas, acompañada por la ausencia de inmunogenicidad y/o actividad. Aunque el hidrocloruro de guanidina y los agentes similares son desnaturalizantes, esta desnaturalización no es irreversible, y se puede dar la renaturalización tras la eliminación (mediante diálisis, por ejemplo) o dilución del desnaturalizante, lo que permite el restablecimiento de la proteína de interés inmunológicamente y/o biológicamente activa. Tras la solubilización, la proteína se puede separar de otras proteínas bacterianas mediante técnicas de separación habituales. Para una descripción adicional de la purificación de hormonas del crecimiento humanas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión bacterianos, véase, p.ej., Patra et al., Protein Expression and Purification 18: 182-190 (2000).
De manera alternativa, es posible purificar polipéptidos recombinantes, p.ej., una hormona del crecimiento humana mutante, a partir del periplasma bacteriano. Cuando la proteína recombinante se exporta al periplasma de las bacterias, la fracción periplásmica de las bacterias se puede aislar mediante choque osmótico en frío, además de otros métodos conocidos para los expertos en la técnica (véase p.ej., Ausubel et al., anteriormente mencionado). Para aislar proteínas recombinantes a partir del periplasma, las células bacterianas se centrifugan para formar un sedimento. El sedimento se resuspende en un tampón que contiene un 20% de sacarosa. Para lisar las células, las bacterias se centrifugan y el sedimento se resuspende en MgSO4 5 mM helado y se mantiene en un baño de hielo durante aproximadamente 10 minutos. La suspensión de células se centrifuga, y el sobrenadante se decanta y se guarda. Las proteínas recombinantes presentes en el sobrenadante se pueden separar de las proteínas del hospedador mediante técnicas de separación habituales muy conocidas para los expertos en la técnica.
Técnicas de Separación de Proteínas Habituales para la Purificación
Cuando un polipéptido recombinante, p.ej., la hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención, se expresa en células hospedadoras en una forma soluble, su purificación puede seguir el procedimiento de purificación de proteínas habitual descrito más adelante.
Fraccionamiento Mediante Solubilidad
A menudo como etapa inicial, y si la mezcla de proteínas es compleja, un fraccionamiento salino inicial puede separar muchas de las proteínas indeseadas de la célula hospedadora (o proteínas derivadas del medio de cultivo celular) de la proteína recombinante de interés, p.ej., una hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención. La sal preferida es sulfato amónico. El sulfato amónico precipita las proteínas reduciendo de manera efectiva la cantidad de agua en la mezcla proteica. Las proteínas precipitan después en base a su solubilidad. Cuanto más hidrófoba es una proteína, es más probable que precipite a una concentración baja de sulfato amónico. Un protocolo típico es añadir sulfato amónico saturado a una disolución de proteínas de manera que la concentración de sulfato amónico resultante sea del 20-30%. Esto hará que precipite la mayor parte de las proteínas hidrófobas. El precipitado se descarta (a menos que la proteína de interés sea hidrófoba) y se añade sulfato amónico al sobrenadante a una concentración que se sabe que hace precipitar la proteína de interés. El precipitado se solubiliza después en un tampón, y el exceso salino se elimina si es necesario, por medio de diálisis o diafiltración. Otros métodos que se basan en la solubilidad de las proteínas, tales como precipitación con etanol frío, son muy conocidos para los expertos en la técnica, y se pueden usar para fraccionar mezclas proteicas complejas.
Filtración Diferencial por Tamaño
Basándose en un peso molecular calculado, se puede aislar una proteína de un tamaño mayor o menor mediante el uso de la ultrafiltración a través de membranas de diferentes tamaños de poro (por ejemplo, membranas Amicon o Millipore). Como primera etapa, la mezcla de proteínas se somete a ultrafiltración a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un umbral de peso molecular menor que el peso molecular de la proteína de interés, p.ej., una hormona del crecimiento humana mutante. La fracción retenida de la ultrafiltración se somete después a ultrafiltración con una membrana con un umbral de peso molecular mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana al filtrado. El filtrado se puede someter después a cromatografía como se describe a continuación.
Cromatografía en Columna
Las proteínas de interés (tales como la hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención) se pueden separar también de otras proteínas basándose en su tamaño, carga superficial neta, hidrofobicidad, o afinidad por ligandos. Además, se pueden conjugar anticuerpos generados hacia la hormona del crecimiento humana a las matrices de las columnas, y la hormona del crecimiento humana se puede someter a una inmunopurificación. Todos estos métodos se conocen bien en la técnica.
Será evidente para un experto en la técnica que los métodos cromatográficos se pueden llevar a cabo a cualquier escala mediante el uso del equipo de diferentes fabricantes (p.ej., Pharmacia Biotech).
Inmunoensayos para la Detección de la Expresión de hGH Mutante
Para confirmar la producción de una hormona del crecimiento humana mutante recombinante, pueden ser útiles los ensayos inmunológicos para detectar en una muestra la expresión del polipéptido. Los ensayos inmunológicos también son útiles para cuantificar el nivel de expresión de la hormona recombinante. Los anticuerpos hacia la hormona del crecimiento humana mutante son necesarios para llevar a cabo estos ensayos inmunológicos.
Producción de Anticuerpos hacia hGH Mutante
Los expertos en la técnica conocen los métodos para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan de manera específica con un inmunógeno de interés (véase, p.ej., Coligan, Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY, 1991; Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en ese documento; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY, 1986; y Kohler y Milstein Nature 256: 495-497, 1975). Tales técnicas incluyen la preparación de anticuerpos mediante la selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares (véase, Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989; y Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989).
Para producir antisueros que contienen anticuerpos con una especificidad deseada, se puede usar el polipéptido de interés (p.ej., una hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención) o un fragmento antigénico del mismo para inmunizar animales adecuados, p.ej., ratones, conejos o primates. Se puede usar un adyuvante habitual, tal como adyuvante de Freund, de acuerdo con un protocolo de inmunización habitual. De manera alternativa, se puede conjugar un péptido antigénico sintético derivado de ese polipéptido particular a una proteína portadora, y posteriormente usarlo como inmunógeno.
La respuesta inmunitaria del animal a la preparación de inmunógeno se monitoriza realizando extracciones de sangre y determinando el título de la reactividad hacia el antígeno de interés. Cuando se obtienen de manera apropiada títulos elevados de anticuerpo hacia el antígeno, se recoge la sangre del animal y se preparan los antisueros. Posteriormente se puede llevar a cabo un fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecerlos en los anticuerpos reactivos específicamente hacia el antígeno y una purificación de los anticuerpos, véase, Harlow y Lane, anteriormente mencionados, y las descripciones generales de purificación de proteínas proporcionadas anteriormente.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen mediante el uso de diversos métodos familiares para los expertos en la técnica. En general, las células del bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, habitualmente mediante fusión con una célula de mieloma (véase, Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976). Los métodos alternativos de inmortalización incluyen, p.ej., la transformación con un virus de Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros métodos muy conocidos en la técnica. Las colonias que se generan a partir de células inmortalizadas individuales se criban en función de la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas hacia el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células se puede aumentar mediante diversas técnicas, que incluyen la inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado.
Además, los anticuerpos monoclonales también se pueden producir de manera recombinante tras la identificación de las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo con la especificidad deseada o un fragmento de unión de tal anticuerpo mediante cribado de una biblioteca de cADN de células B humanas según el protocolo general resumido por Huse et al., anteriormente mencionado. Los principios y métodos generales de producción de polipéptidos recombinantes discutidos anteriormente son aplicables a la producción de anticuerpos mediante métodos recombinantes.
Cuando se desee, se pueden ensayar los anticuerpos capaces de reconocer de manera específica una hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención en función de su reactividad cruzada hacia la hormona del crecimiento humana de tipo natural y así distinguirlos de los anticuerpos hacia la proteína de tipo natural. Por ejemplo, los antisueros obtenidos a partir de un animal inmunizado con una hormona del crecimiento humana mutante se pueden hacer pasar a través de una columna en la que está inmovilizada una hormona del crecimiento humana de tipo natural. La porción de los antisueros que pasa a través de la columna reconoce solamente la hormona del crecimiento humana mutante, y no la hormona del crecimiento humana de tipo natural. De forma similar, los anticuerpos hacia la hormona del crecimiento humana mutante se pueden cribar también en función de su exclusividad en el reconocimiento únicamente de la hormona del crecimiento humana mutante, pero no de la de tipo natural.
Los anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen de manera específica solamente la hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención, pero no la hormona del crecimiento humana de tipo natural, son útiles para aislar la proteína mutante de la proteína de tipo natural, por ejemplo, incubando una muestra con un anticuerpo policlonal o monoclonal específico de la hormona del crecimiento humana mutante inmovilizado en un soporte sólido.
Inmunoensayos para la Detección de la Expresión de hGH Mutante
Una vez que están disponibles los anticuerpos específicos para una hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención, se puede medir la cantidad del polipéptido en una muestra, p.ej., un lisado celular, mediante una diversidad de métodos de inmunoensayos que proporcionan resultados cualitativos y cuantitativos a un técnico experto. Para una revisión de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayos, en general, véase, p.ej., Stites, anteriormente mencionado; patentes de EE.UU. Nºs 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168.
Marcaje en Inmunoensayos
Los inmunoensayos utilizan a menudo un agente marcador para unirse de manera específica y marcar el complejo de unión formado por el anticuerpo y la proteína objetivo. El agente marcador puede ser él mismo uno de los restos que constituyen el complejo anticuerpo/proteína objetivo, o puede ser un tercer resto, tal como otro anticuerpo, que se une específicamente al complejo anticuerpo/proteína objetivo. Un marcador puede ser detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, microesferas magnéticas (p.ej., Dynabeads™), tintes fluorescentes (p.ej., isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, y similares), radiomarcadores (p.ej., 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), enzimas (p.ej., peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, y otras usadas habitualmente en un ELISA), y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal o microesferas de vidrio o plástico coloreado (p.ej., poliestireno, polipropileno, látex, etc.).
En algunos casos, el agente marcador es un segundo anticuerpo que alberga un marcador detectable. De manera alternativa, el segundo anticuerpo puede carecer de un marcador, pero puede, a su vez, unirse a un tercer anticuerpo marcado específico hacia los anticuerpos de la especie de la que deriva el segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo se puede modificar con un resto detectable, tal como biotina, al cual se puede unir de manera específica una tercera molécula marcada, tal como estreptavidina marcada con una enzima.
También se pueden usar como agentes marcadores otras proteínas capaces de unirse de manera específica a regiones constantes de inmunoglobulinas, tales como proteína A o proteína G. Estas proteínas son constituyentes normales de las paredes celulares de las bacterias estreptocócicas. Exhiben una reactividad no inmunógena intensa con las regiones constantes de las inmunoglobulinas de una diversidad de especies (véase, en general, Kronval, et al. J. Immunol., 111: 1401-1406 (1973); y Akerstrom, et al., J. Immunol., 135: 2589-2542 (1985)).
Formatos de Inmunoensayos
Los inmunoensayos para detectar una proteína objetivo de interés (p.ej., una hormona del crecimiento humana mutante) a partir de muestras pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que la cantidad de proteína objetivo capturada se mide directamente. En un ensayo de tipo "sándwich" preferido, por ejemplo, el anticuerpo específico para la proteína objetivo puede estar unido directamente a un soporte sólido en el que el anticuerpo está inmovilizado. Después captura la proteína objetivo de las muestras de ensayo. El complejo anticuerpo/proteína objetivo así inmovilizado se une después a un agente marcador, tal como un segundo o tercer anticuerpo que alberga un marcador, como se describió anteriormente.
En los ensayos competitivos, la cantidad de proteína objetivo en una muestra se mide de manera indirecta midiendo la cantidad de una proteína objetivo añadida (exógena) desplazada (o reemplazada competitivamente) de un anticuerpo específico para la proteína objetivo por la proteína objetivo presente en la muestra. En un ejemplo típico de tal ensayo, el anticuerpo está inmovilizado y la proteína objetivo exógena está marcada. Debido a que la cantidad de la proteína objetivo exógena unida al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de la proteína objetivo presente en la muestra, el nivel de proteína objetivo en la muestra se puede determinar así basándose en la cantidad de la proteína objetivo exógena unida al anticuerpo y así inmovilizada.
En algunos casos, se usa del análisis de transferencia de western (inmunotrasferencia) para detectar y cuantificar la presencia de una hormona del crecimiento humana mutante en las muestras. La técnica comprende en general separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel basándose en el peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nailon, o un filtro de nailon derivatizado) e incubar las muestras con los anticuerpos que se unen de manera específica a la proteína objetivo. Estos anticuerpos pueden estar marcados directamente, o de manera alternativa se pueden detectar posteriormente mediante el uso de anticuerpos marcados (p.ej., anticuerpos anti-ratón de oveja marcados) que se unen de manera específica a los anticuerpos hacia la hormona del crecimiento humana mutante.
Otros formatos de ensayo incluyen los inmunoensayos con liposomas (LIA), que usan liposomas diseñados para unirse a moléculas específicas (p.ej., anticuerpos) y liberar reactivos o marcadores encapsulados. Los productos químicos liberados se detectan después según las técnicas habituales (véase, Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev.,
5: 34-41 (1986)).
Glicosilación y Glicoconjugación de la hGH Mutante
Glicosilación y Glicoconjugación mediante Métodos Enzimáticos
La modificación in vitro post-expresión de los péptidos es una estrategia atractiva para remediar las deficiencias de los métodos que se basan en el control de la glicosilación mediante sistemas de expresión modificados; incluyen la modificación de las estructuras de glicano o la introducción de glicanos en sitios nuevos. Hay disponible una colección extensa de enzimas que transfieren restos donantes de sacáridos, lo que hace posible la síntesis enzimática in vitro de glucoconjugados con patrones de glicosilación y estructuras de glicosilo diseñadas a medida. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nºs 5.876.980; 6.030.815; 5.728.554; 5.922.577; y las solicitudes de patentes publicadas WO 98/31826; WO 01/88117; WO 03/031464; WO 03/046150; WO 03/045980; WO 03/093448; WO 04/009838; US2002/142370; US2003/040037; US2003/180835; US2004/063911; US2003/207406; y US2003/124645.
También se describen en la presente memoria los métodos para preparar conjugados de hormonas del crecimiento humanas mutantes glicosiladas y sin glicosilar, que tienen sitios de glicosilación nuevos que no existen en la hGH de tipo natural correspondiente. Tal conjugación puede tener lugar directamente en las unidades de carbohidrato adecuadas de una hGH mutante glicosilada, o tras la eliminación (es decir, el "recorte") de cualquier unidad de carbohidrato indeseada. Los conjugados se forman entre péptidos y diversas especies tales como polímeros hidrosolubles, restos terapéuticos, restos de diagnóstico, restos de selección del objetivo y similares. También se describen conjugados que incluyen dos o más péptidos unidos entre sí por medio de un brazo ligador, es decir, conjugados multifuncionales. Los conjugados multifuncionales de la invención pueden incluir dos o más copias del mismo péptido o una colección de diversos péptidos con diferentes estructuras y/o propiedades.
Los conjugados se forman mediante la unión enzimática de un carbohidrato modificado al péptido glicosilado o sin glicosilar. El carbohidrato modificado, cuando se interpone entre el péptido y el grupo modificador del carbohidrato se convierte en lo que se denomina en la presente memoria "un grupo ligador de glicosilo intacto". Mediante el uso de la selectividad exquisita de las enzimas, tales como las glicosiltransferasas, el presente método proporciona péptidos que albergan un grupo deseado en una o más localizaciones específicas. Así, según la presente descripción, un carbohidrato modificado se une directamente a un sitio seleccionado de la cadena peptídica o, de manera alternativa, el carbohidrato modificado se añade a un resto de carbohidrato de un glicopéptido. Los péptidos en los que hay unidos carbohidratos modificados tanto a un carbohidrato de glicopéptido como directamente a un residuo de aminoácido del esqueleto peptídico también están dentro del alcance de la presente invención.
5 En contraste con las estrategias químicas y enzimáticas de elaboración de péptidos, los métodos de la invención hacen posible construir péptidos y glicopéptidos que tienen un patrón de derivatización sustancialmente homogéneo; las enzimas usadas en la invención son selectivas en general para un residuo de aminoácido particular o combinación de residuos de aminoácidos del péptido. Los métodos también son prácticos para la producción a gran escala de péptidos modificados y glicopéptidos. Así, los métodos de la invención proporcionan un medio práctico para la preparación a gran escala de glicopéptidos que tienen patrones de derivatización uniformes preseleccionados. Los métodos son muy adecuados especialmente para la modificación de péptidos terapéuticos, que incluyen, pero sin limitación, glicopéptidos que se glicosilan de manera incompleta durante la producción en las células cultivadas (p.ej., células de mamífero, células de insecto, células vegetales, células fúngicas, células de levadura, o células procarióticas) o plantas o animales transgénicos.
15 Los métodos proporcionan además conjugados de péptidos glicosilados y sin glicosilar con una semivida terapéutica incrementada debido, por ejemplo, a una velocidad de eliminación reducida, o a una velocidad reducida de captación por el sistema inmunitario o reticuloendotelial (SRE). Además, los métodos de la invención proporcionan un medio para enmascarar determinantes antigénicos en los péptidos, por lo que se reduce o se elimina una respuesta inmunitaria del hospedador contra el péptido. También se puede usar la unión selectiva de agentes de selección del objetivo para dirigir un péptido hacia un tejido particular o hacia un receptor de la superficie celular que es específico para el agente de selección del objetivo particular.
Conjugados
La presente descripción describe un conjugado entre un grupo modificador seleccionado y un péptido mutante de hGH que tiene un sitio de glicosilación que no está presente en el péptido de tipo natural. El grupo modificador se
25 puede unir en el sitio de glicosilación mutante o en un sitio que está presente en el péptido de tipo natural.
La unión entre el péptido y el grupo modificador incluye un grupo ligador de glicosilo interpuesto entre el péptido y el resto seleccionado. Tal como se discute en la presente memoria, el resto seleccionado es esencialmente cualquier especie que se puede unir a una unidad de sacárido, lo que da como resultado un carbohidrato modificado que es reconocido por una enzima transferasa adecuada, que une el carbohidrato modificado al péptido. El componente de sacárido del carbohidrato modificado, cuando está interpuesto entre el péptido y un resto seleccionado, se convierte en un "grupo ligador de glicosilo", p.ej., un "grupo ligador de glicosilo intacto". El grupo ligador de glicosilo se forma a partir de cualquier mono- u oligo-sacárido que, tras la modificación con un grupo modificador, es un sustrato para una enzima que añade el carbohidrato modificado a un aminoácido o residuo de glicosilo de un péptido.
El grupo ligador de glicosilo puede ser, o puede incluir, un resto de sacárido que se modifica de forma degradativa
35 durante la adición del grupo modificador. Por ejemplo, el grupo ligador de glicosilo puede proceder de un residuo de sacárido que se produce mediante la degradación oxidativa de un sacárido intacto hasta el aldehído correspondiente, p.ej., por medio de la acción de metaperyodato, y que se convierte posteriormente en una base de Schiff con una amina adecuada, que después se reduce hasta la amina correspondiente.
Los conjugados de la invención corresponderán generalmente a la estructura general:
en la que los símbolos a, b, c, d y s representan un número entero positivo que no es cero; y t es 0 o un número entero positivo. El "agente" es un agente terapéutico, un agente bioactivo, un marcador detectable, resto hidrosoluble (p.ej., PEG, m-PEG, PPG, y m-PPG) o similares. El "agente" puede ser un péptido, p.ej., enzima, anticuerpo, antígeno, etc. El ligador puede ser cualquiera de una serie extensa de grupos ligadores, mencionados más adelante.
45 De manera alternativa, el ligador puede ser un enlace simple o un "ligador de orden cero".
En una realización ejemplar, el grupo modificador seleccionado es un polímero hidrosoluble, p.ej., m-PEG. El polímero hidrosoluble se une de manera covalente al péptido por medio de un grupo ligador de glicosilo. El grupo ligador de glicosilo se une de manera covalente a un residuo de aminoácido o a un residuo de glicosilo del péptido. La invención también proporciona conjugados en los que un residuo de aminoácido y un residuo de glicosilo se modifican con un grupo ligador de glicosilo.
Un polímero hidrosoluble ejemplar es poli(etilen glicol), p.ej., metoxipoli(etilen glicol). El poli(etilen glicol) usado en la presente invención no está limitado a ninguna forma o intervalo de peso molecular particular. El peso molecular del poli(etilen glicol) es preferiblemente de entre 500 y 100.000. Se usa preferiblemente un peso molecular de 50060.000, y preferiblemente de 1.000-40.000. Más preferiblemente, el peso molecular es de alrededor de 5.000 a alrededor de 40.000.
En otra realización, el poli(etilen glicol) es un PEG ramificado que tiene más de un resto de PEG unido. Los ejemplos de PEGs ramificados se describen en la pat. de EE.UU. nº 5.932.462; pat. de EE.UU. nº 5.342.940; pat. de EE.UU. nº 5.643.575; pat. de EE.UU. nº 5.919.455; pat. de EE.UU. nº 6.113.906; pat. de EE.UU. nº 5.183.660; documento WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); y Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998. En una realización preferida, el peso molecular de cada poli(etilen glicol) del PEG ramificado es 5.000-20.000.
Además de proporcionar conjugados que se forman por medio de un grupo ligador de glicosilo añadido enzimáticamente, la presente invención proporciona conjugados que son muy homogéneos en sus patrones de sustitución. Mediante el uso de los métodos de la invención, es posible formar conjugados peptídicos en los que esencialmente todos los restos de carbohidratos modificados en una población de conjugados de la invención están unidos en múltiples copias de un residuo de aminoácido o de glicosilo estructuralmente idéntico. Así, en un segundo aspecto, la invención proporciona un conjugado peptídico que tiene una población de restos de polímeros hidrosolubles, que están unidos de manera covalente al péptido a través de un grupo ligador de glicosilo intacto. En un conjugado preferido de la invención, esencialmente cada miembro de la población se une a través del grupo ligador de glicosilo a un residuo de glicosilo del péptido, y cada residuo de glicosilo del péptido al que está unido el grupo ligador de glicosilo tiene la misma estructura.
También se proporciona un conjugado peptídico que tiene una población de restos de polímero hidrosoluble unidos de manera covalente a él por medio de un grupo ligador de glicosilo. En una realización preferida, esencialmente cada miembro de la población de restos de polímero hidrosoluble está unido a un residuo de aminoácido del péptido a través de un grupo ligador de glicosilo, y cada residuo de aminoácido que tiene un grupo ligador de glicosilo unido a él tiene la misma estructura.
La presente invención también proporciona conjugados análogos a los descritos anteriormente en los que el péptido está conjugado a un resto terapéutico, resto de diagnóstico, resto de selección del objetivo, resto de toxina o similar a través de un grupo ligador de glicosilo intacto. Cada uno de los restos anteriormente enumerados puede ser una molécula pequeña, polímero natural (p.ej., polipéptido) o polímero sintético.
En una realización ejemplar, la hormona del crecimiento humana mutante está conjugada a transferrina a través de un ligador bifuncional que incluye un grupo ligador de glicosilo intacto en cada extremo del resto de PEG (Esquema 1). Por ejemplo, un extremo del ligador de PEG esta funcionalizado con un ligador de ácido siálico intacto que está unido a transferrina, y el otro está funcionalizado con un ligador de GalNAc intacto que está unido a la hGH mutante.
Los conjugados de la invención pueden incluir grupos ligadores de glicosilo intactos que son mono- o multi-valentes (p.ej., estructuras de antena). Así, los conjugados de la invención incluyen ambas especies en las que un resto seleccionado está unido a un péptido a través de un grupo ligador de glicosilo monovalente. También están incluidos en la invención los conjugados en los que más de un resto seleccionado está unido a un péptido a través de un grupo ligador multivalente.
En una realización adicional, la invención proporciona conjugados que se localizan de manera selectiva en un tejido particular debido a la presencia de un agente de selección del objetivo como componente del conjugado. En una realización ejemplar, el agente de selección del objetivo es una proteína. Las proteínas ejemplares incluyen transferrina (cerebro, conjunto de la sangre), HS-glicoproteína (hueso, cerebro, conjunto de la sangre), anticuerpos (cerebro, tejido con antígeno específico de anticuerpo, conjunto de la sangre), factores de coagulación V-XII (tejido lesionado, coágulos, cáncer, conjunto de la sangre), proteínas séricas, p.ej., a-glicoproteína acida, fetuina, a-feto proteína (cerebro, conjunto de la sangre), �2-glicoproteína (hígado, placas ateroescleróticas, cerebro, conjunto de la sangre), G-CSF, GM-CSF, M-CSF, y EPO (estimulación inmunitaria, cánceres, conjunto de la sangre, sobreproducción de eritrocitos, neuroprotección), albúmina (incremento de la semivida), y lipoproteína E.
Además de los conjugados discutidos anteriormente, la presente descripción describe métodos para la preparación de estos y otros conjugados. Así, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la formación de un conjugado covalente entre un resto seleccionado y un péptido. También se describen en la presente memoria métodos para dirigir los conjugados de la invención hacia un tejido o región particular del organismo. Además, la presente descripción proporciona un método para prevenir, curar, o mejorar un estado patológico administrando un conjugado de la invención a un sujeto que corre el riesgo de desarrollar la enfermedad o a un sujeto que tiene la enfermedad.
En las realizaciones ejemplares, el conjugado se forma entre un polímero hidrosoluble, un resto terapéutico, un resto de selección del objetivo o una biomolécula, y un péptido glicosilado o no glicosilado. El polímero, resto terapéutico o biomolécula se conjugan con el péptido por medio de un grupo ligador de glicosilo intacto, que se interpone, y se une de manera covalente tanto al péptido como al grupo modificador (p.ej., polímero hidrosoluble). El método incluye poner en contacto el péptido con una mezcla que contiene un carbohidrato modificado y una glicosiltransferasa para la que el carbohidrato modificado es un sustrato. La reacción se lleva a cabo en condiciones suficientes para formar un enlace covalente entre el carbohidrato modificado y el péptido. El resto de carbohidrato del carbohidrato modificado se selecciona preferiblemente de carbohidratos de nucleótidos, carbohidratos activados, y carbohidratos que no son de nucleótidos ni están activados.
El péptido aceptor (glicosilado o sin glicosilar) generalmente se sintetiza de novo, o se expresa de manera recombinante en una célula procariótica (p.ej., célula bacteriana, tal como E. coli) o en una célula eucariótica, tal como una célula de mamífero, de levadura, de insecto, fúngica o vegetal. El péptido puede ser una proteína de tamaño completo o un fragmento. Además, el péptido puede ser de tipo natural o un péptido mutado. En una realización ejemplar, el péptido incluye una mutación que añade uno o más sitios consenso de glicosilación a la secuencia del péptido.
El método de la invención también prevé la modificación de péptidos glicosilados de manera incompleta que se producen de forma recombinante. Muchas lipoproteínas producidas de forma recombinante están glicosiladas de manera incompleta, por lo que exponen residuos de carbohidratos que pueden tener propiedades indeseables, p.ej., inmunogenicidad, reconocimiento por parte del SRE. Mediante el empleo de un carbohidrato modificado en un método de la invención, el péptido se puede glicosilar adicionalmente de forma simultánea y derivatizar, por ejemplo, con un polímero hidrosoluble, agente terapéutico, o similares. El resto de carbohidrato del carbohidrato modificado puede ser el residuo que se conjugaría correctamente con el aceptor en un péptido completamente glicosilado, u otro resto de carbohidrato con propiedades deseables.
Los péptidos modificados mediante los métodos de la invención pueden ser péptidos sintéticos o de tipo natural, o pueden ser péptidos mutados, producidos mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida. La glicosilación de los péptidos es en general con unión en N o con unión en O. Una unión en N ejemplar es la unión del carbohidrato modificado a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de un resto de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación con unión en O se refiere a la unión de un carbohidrato (p.ej., N-acetilgalactosamina, galactosa, manosa, GlcNAc, glucosa, fucosa o xilosa) en la cadena lateral de hidroxilo de un hidroxiaminoácido, preferiblemente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación a un péptido u otra estructura se lleva a cabo de manera conveniente alterando la secuencia de aminoácidos, de forma que contenga uno o más sitios de glicosilación. La adición se puede realizar también mediante la incorporación de una o más especies que presentan un grupo OH, preferiblemente residuos de serina o treonina, en la secuencia del péptido (para los sitios de glicosilación con unión en O). La adición se puede realizar mediante mutación o mediante síntesis química completa del péptido. La secuencia de aminoácidos del péptido se altera preferiblemente por medio de cambios a nivel del ADN, en particular mutando el ADN que codifica el péptido en bases preseleccionadas, de manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. La(s) mutación(es) del ADN se realizan preferiblemente mediante el uso de métodos conocidos en la técnica.
En una realización ejemplar, el sitio de glicosilación se añade reordenando aleatoriamente polinucleótidos. Los polinucleótidos que codifican un péptido candidato se pueden modular con protocolos de reordenamiento aleatorio del ADN. El reordenamiento aleatorio del ADN es un procedimiento de recombinación y mutación recurrentes, llevado a cabo mediante la fragmentación aleatoria de un grupo de genes relacionados, seguido por la reconstrucción de los fragmentos mediante un procedimiento similar a la reacción en cadena de la polimerasa. Véase, p.ej., Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994); y las patentes de EE.UU. nºs 5.605.793, 5.837.458, 5.830.721 y 5.811.238.
La presente invención también proporciona medios para añadir (o eliminar) uno o más residuos de glicosilo seleccionados a un péptido, tras lo cual se conjuga un carbohidrato modificado a al menos uno de los residuos de glicosilo seleccionados del péptido. La presente realización es útil, por ejemplo, cuando se desea conjugar el carbohidrato modificado a un residuo de glicosilo seleccionado que no está presente en un péptido o que no está presente en una cantidad deseada. Así, antes de acoplar un carbohidrato modificado a un péptido, el residuo de glicosilo seleccionado se conjuga al péptido mediante acoplamiento enzimático o químico. En otra realización, se altera el patrón de glicosilación de un glicopéptido antes de la conjugación del carbohidrato modificado mediante la eliminación de un residuo de carbohidrato del glicopéptido. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/31826.
La adición o eliminación de cualquier resto de carbohidrato presente en el glicopéptido se lleva a cabo de manera química o enzimática. La desglicosilación química se lleva a cabo preferiblemente mediante la exposición de la variante del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o a un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayor parte o de todos los carbohidratos excepto el carbohidrato de unión (Nacetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), y al mismo tiempo deja el péptido intacto. La desglicosilación química se describe en Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) y en Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981). La escisión enzimática de restos de carbohidrato en variantes polipeptídicas se puede llevar a cabo mediante el uso de una diversidad de endo- y exo-glicosilasas tal como se describe en Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
La adición química de restos de glicosilo se lleva a cabo mediante cualquier método reconocido en la técnica. La adición enzimática de restos de carbohidrato se lleva a cabo preferiblemente mediante el uso de una modificación de los métodos expuestos en la presente memoria, sustituyendo las unidades de glicosilo nativas por los carbohidratos modificados usados en la invención. Otros métodos para añadir restos de carbohidratos se describen en las patentes de EE.UU. nºs 5.876.980, 6.030.815, 5.728.554, y 5.922.577.
Los puntos de unión ejemplares para el residuo de glicosilo seleccionado incluyen, pero sin limitación: (a) sitios consenso para la glicosilación con unión en N y la glicosilación con unión en O; (b) restos de glicosilo terminales que son aceptores para una glicosiltransferasa; (c) arginina, asparagina e histidina; (d) grupos carboxilo libres; (e) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína; (f) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina; (g) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano; o (h) el grupo amida de glutamina. Los métodos ejemplares para el uso en la presente invención se describen en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de sep. de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC CRIT. REV. BIOCHEM., págs. 259-306 (1981).
En una realización, la invención proporciona un método para unir hGH y uno o más péptidos por medio de un grupo ligador. El grupo ligador tiene cualquier estructura útil, y se puede seleccionar de estructuras de cadena lineal y de cadena ramificada. Preferiblemente, cada extremo del ligador, que está unido a un péptido, incluye un carbohidrato modificado (es decir, un grupo ligador de glicosilo intacto naciente).
En un método ejemplar de la invención, dos péptidos están unidos entre sí a través de un resto ligador que incluye un ligador de PEG. La estructura se ajusta a la estructura general expuesta en el dibujo anterior. Tal como se describe en la presente memoria, la construcción de la invención incluye dos grupos ligadores de glicosilo intactos (es decir, s + t = 1). El foco sobre un ligador de PEG que incluye dos grupos glicosilo es por motivos de claridad, y no se debería interpretar como limitante de la identidad de los brazos del ligador para el uso en esta realización de la invención.
Así, un resto de PEG se funcionaliza en un primer extremo con una primera unidad de glicosilo y en un segundo extremo con una segunda unidad de glicosilo. La primera y segunda unidades de glicosilo son preferiblemente sustratos para diferentes transferasas, lo que permite la unión ortogonal del primer y segundo péptido a la primera y segunda unidad de glicosilo, respectivamente. En la práctica, el ligador (glicosilo)1-PEG-(glicosilo)2 se pone en contacto con el primer péptido y una primera transferasa para la que la primera unidad de glicosilo es un sustrato, por lo que se forma (péptido)1-(glicosilo)1-PEG-(glicosilo)2. Después, la glicosiltransferasa y/o el péptido sin reaccionar se eliminan opcionalmente de la mezcla de reacción. El segundo péptido y una segunda transferasa para la que la segunda unidad de glicosilo es un sustrato se añaden al conjugado (péptido)1-(glicosilo)1-PEG-(glicosilo)2, por lo que se forma (péptido)1-(glicosilo)1-PEG-(glicosilo)2-(péptido)2. Los expertos en la técnica apreciarán que el método resumido anteriormente también es aplicable para la formación de conjugados entre más de dos péptidos, por ejemplo, mediante el uso de un PEG ramificado, dendrímero, poli(aminoácido), polisacárido o similares.
En una realización ejemplar, la hormona del crecimiento humana está conjugada a transferrina a través de un ligador bifuncional que incluye un grupo ligador de glicosilo intacto en cada extremo del resto de PEG (Esquema 1). El conjugado de hGH tiene una semivida in vivo que está incrementada respecto de la de hGH sola en virtud del tamaño molecular mayor del conjugado. Además, la conjugación de hGH a transferrina sirve para dirigir de manera selectiva el conjugado al cerebro. Por ejemplo, un extremo del ligador de PEG se funcionaliza con CMP-ácido siálico y el otro se funcionaliza con UDP-GalNAc. El ligador se combina con hGH en presencia de una GalNAc transferasa, lo que da como resultado la unión del GalNAc del brazo del ligador a un residuo de serina y/o treonina de la hGH.
Esquema 1
El procedimiento descrito anteriormente se puede llevar a cabo por medio de tantos ciclos como se desee, y no se limita a la formación de un conjugado entre dos péptidos con un único ligador. Además, los expertos en la técnica
5 apreciarán que las reacciones que funcionalizan los grupos ligadores de glicosilo intactos en los extremos del ligador de PEG (u otros) con el péptido se pueden dar de manera simultánea en el mismo recipiente de reacción, o se pueden llevar a cabo por etapas. Cuando las reacciones se llevan a cabo por etapas, el conjugado producido en cada etapa se purifica opcionalmente de uno o más componentes de la reacción (p.ej., enzimas, péptidos).
Otra realización ejemplar se expone en el Esquema 2. El Esquema 2 muestra un método para preparar un conju
10 gado que dirige una proteína seleccionada, p.ej., la hormona del crecimiento humana, hacia el hueso e incrementa la semivida circulatoria de la proteína seleccionada.
Esquema 2
en el que G es un residuo de glicosilo en un resto de carbohidrato activado (p.ej., nucleótidos de carbohidratos) que 15 se convierte en un grupo ligador de glicosilo intacto en el conjugado. Cuando s es mayor de 0, L es un grupo ligador de sacarilo tal como GalNAc, o GalNAc-Gal.
El uso de derivados reactivos de PEG (u otros ligadores) para unir uno o más restos de péptidos al ligador está dentro del alcance de la presente invención. La invención no se limita a la identidad del análogo de PEG reactivo. Muchos derivados activados de poli(etilenglicol) están disponibles comercialmente y en la biografía. Un experto en la 20 técnica tiene capacidad para elegir, y sintetizar si es necesario, un derivado de PEG activado adecuado con el que preparar un sustrato útil en la presente invención. Véase, Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984); Abuchowski et al., J. Biol. Chem., 252: 3582-3586 (1977); Jackson et al., Anal. Biochem., 165: 114-127 (1987); Koide et al., Biochem Biophys. Res. Commun., 111: 659-667 (1983)), tresilato (Nilsson et al., Methods Enzymol., 104: 56-69 (1984); Delgado et al, Biotechnol. Appl. Biochem., 12: 119-128 (1990)); ésteres activos deriva25 dos de N-hidroxisuccinimida (Buckmann et al., Makromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981); Joppich et al., Makromol. Chem., 180: 1381-1384 (1979); Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984); Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 1487-1491 (1987); Kitamura et al., Cancer Res., 51: 4310-4315 (1991); Boccu et al., Z. Naturforsch., 38C: 94-99 (1983), carbonatos (Zalipsky et al., POLY(ETHYLENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, Harris, Ed., Plenum Press, Nueva York, 1992, págs. 347-370; 30 Zalipsky et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 15: 100-114 (1992); Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141152 (1985)), formiatos de imidazolilo (Beauchamp et al., Anal. Biochem., 131: 25-33 (1983); Berger et al., Blood, 71: 1641-1647 (1988)), 4-ditiopiridinas (Woghiren et al., Bioconjugate chem. 4, 314-318 (1993)), isocianatos (Byun et al., ASAIO Journal, M649-M-653 (1992)) y epóxidos (pat. de EE.UU. nº 4.806.595, expedida a Noishiki et al., (1989).
Otros grupos ligadores incluyen la unión uretano entre grupos amino y PEG activado. Véase, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 11: 141-152 (1985).
En otra realización ejemplar, la invención proporciona un método para prolongar la semivida en la circulación sanguínea de un péptido seleccionado, básicamente dirigiendo el péptido hacia el conjunto de la sangre, conjugando el péptido con un polímero sintético o natural de un tamaño suficiente para retrasar la filtración de la proteína en el glomérulo (p.ej., albúmina). Véase el Esquema 3. Esta realización de la invención se ilustra en el Esquema 3, en el que la hGH se conjuga a albúmina por medio de un ligador de PEG mediante el uso de una combinación de modificaciones químicas y enzimáticas.
Esquema 3
Así, tal como se muestra en el Esquema 3, se modifica un residuo (p.ej., la cadena lateral de un aminoácido) de la albúmina con un derivado de PEG reactivo, tal como X-PEG-(CMP-ácido siálico), en el que X es un grupo activante (p.ej., éster activo, isotiocianato, etc.). El derivado de PEG y hGH se combinan y se ponen en contacto con una transferasa para la que CMP-ácido siálico es un sustrato. En una realización ilustrativa adicional, se hace reaccionar 15 una £-amina de lisina con el éster de N-hidroxisuccinimida del ligador de PEG para formar un conjugado con la albúmina. El CMP-ácido siálico del ligador se conjuga enzimáticamente con un residuo adecuado de hGH, p.ej., Gal o GalNAc, por lo que se forma el conjugado. Los expertos en la técnica apreciarán que el método anteriormente descrito no se limita a las moléculas de reacción expuestas en él. Además, el método se puede poner en práctica para formar conjugados que incluyen más de dos restos de proteína, por ejemplo, mediante la utilización de ligadores
20 ramificados que tienen más de dos extremos.
Carbohidratos Modificados
Las especies donantes de glicosilo modificadas ("carbohidratos modificados") se seleccionan preferiblemente de nucleótidos de carbohidratos modificados, carbohidratos modificados activados y carbohidratos modificados que son sacáridos simples que no son nucleótidos ni están activados. Se puede añadir cualquier estructura de carbohidrato
25 deseada a un péptido mediante el uso de los métodos de la invención. En general, la estructura será un monosacárido, pero la presente invención no se limita al uso de carbohidratos de monosacáridos modificados; los oligosacáridos y polisacáridos también son útiles.
El grupo modificador se une a un resto de carbohidrato por medios enzimáticos, medios químicos o una combinación de los mismos, por lo que se produce un carbohidrato modificado. Los carbohidratos se sustituyen en cualquier posi
30 ción que permita la unión del resto modificador, y que todavía permita que el carbohidrato funcione como un sustrato para la enzima utilizada para ligar el sustrato modificado al péptido. En una realización preferida, cuando el ácido siálico es el carbohidrato, el ácido siálico se sustituye con el grupo modificador en la posición 9 de la cadena lateral de piruvilo, o en la posición 5 en el resto de amina que está acetilado normalmente en el ácido siálico.
En ciertas realizaciones de la presente invención, se utiliza un nucleótido de carbohidrato modificado para añadir el
35 carbohidrato modificado al péptido. Los nucleótidos de carbohidrato ejemplares que se usan en la presente invención en su forma modificada incluyen los mono-, di- o trifosfatos de nucleótidos o los análogos de los mismos. En una realización preferida, el nucleótido de carbohidrato modificado se selecciona de un UDP-glicósido, CMP-glicósido, o un GDP-glicósido. Aún más preferiblemente, el nucleótido de carbohidrato modificado se selecciona de una UDP-galactosa, UDP-galactosamina, UDP-glucosa, UDP-glucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, CMP-ácido
40 siálico, o CMP-NeuAc. Los derivados de N-acetilamina de los nucleótidos de carbohidrato también son útiles en el método de la invención.
La invención también proporciona métodos para sintetizar un péptido modificado mediante el uso de un carbohidrato modificado, p.ej., galactosa, fucosa, GalNAc, y ácido siálico modificados. Cuando se usa un ácido siálico modificado, se puede usar una sialiltransferasa o una trans-sialidasa (para el ácido siálico unido en a2,3 únicamente) en estos métodos.
En otras realizaciones, el carbohidrato modificado es un carbohidrato activado. Los carbohidratos modificados activados, que son útiles en la presente invención, son en general glicósidos que se han alterado sintéticamente para que incluyan un grupo saliente activado. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "grupo saliente activado" se refiere a los restos que se desplazan fácilmente en reacciones de sustitución nucleófila reguladas por enzimas. Se conocen muchos carbohidratos activados en la técnica. Véase, por ejemplo, Vocadlo et al. En CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY, Vol. 2, Ernst et al. Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Alemania, 2000; Kodama et al., Tetrahedron Lett. 34: 6419 (1993); Lougheed, et al., J. Biol. Chem. 274: 37717 (1999)).
Los ejemplos de grupos activadores (grupos salientes) incluyen fluoro, cloro, bromo, éster de tosilato, éster de mesilato, éster de triflato y similares. Los grupos salientes activados preferidos para el uso en la presente invención son aquellos que no dificultan estéricamente de manera significativa la transferencia enzimática del glicósido al aceptor. Por lo tanto, las realizaciones preferidas de los derivados de glicósido activados incluyen fluoruros de glicosilo y mesilatos de glicosilo, y los fluoruros de glicosilo se prefieren especialmente. Entre los fluoruros de glicosilo, el fluoruro de a-galactosilo, fluoruro de a-manosilo, fluoruro de a-glucosilo, fluoruro de a-fucosilo, fluoruro de a-xilosilo, fluoruro de a-sialilo, fluoruro de a-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de a-N-acetilgalactosaminilo, fluoruro de �-galactosilo, fluoruro de �-manosilo, fluoruro de �-glucosilo, fluoruro de �-fucosilo, fluoruro de �-xilosilo, fluoruro de �-sialilo, fluoruro de �-N-acetilglucosaminilo y fluoruro de �-N-acetilgalactosaminilo son los más preferidos.
A modo de ilustración, los fluoruros de glicosilo se pueden preparar a partir del carbohidrato libre, acetilando primero el carbohidrato y después tratándolo con HF/piridina. Esto genera el anómero termodinámicamente más estable del fluoruro de glicosilo protegido (acetilado) (es decir, el fluoruro de a-glicosilo). Si se desea el anómero menos estable (es decir, el fluoruro de �-glicosilo), se puede preparar convirtiendo el carbohidrato peracetilado con HBr/HOAc o con HCl para generar el bromuro o cloruro anomérico. Este intermedio se hace reaccionar con una sal de fluoruro, tal como fluoruro de plata, para generar el fluoruro de glicosilo. Los fluoruros de glicosilo acetilados se pueden desproteger mediante una reacción con una base suave (catalítica) en metanol (p.ej., NaOMe/MeOH). Además, muchos fluoruros de glicosilo están disponibles comercialmente.
Otros derivados de glicosilo activados se pueden preparar mediante el uso de métodos convencionales conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar mesilatos de glicosilo mediante el tratamiento de la forma hemiacetal completamente bencilada del carbohidrato con cloruro de mesilo, seguido de hidrogenación catalítica para eliminar los grupos bencilo.
En una realización ejemplar adicional, el carbohidrato modificado es un oligosacárido que tiene una estructura de antena. En una realización preferida, uno o más de los extremos de la antena albergan el resto modificador. Cuando hay unido más de un resto modificador a un oligosacárido que tiene una estructura de antena, el oligosacárido es útil para "amplificar" el resto modificador; cada unidad de oligosacárido conjugada al péptido une múltiples copias del grupo modificador del péptido. La estructura general de un quelato típico de la invención, tal como se expone en los dibujos anteriores, abarca especies multivalentes que son el resultado de preparar un conjugado de la invención mediante la utilización de una estructura de antena. Se conocen en la técnica muchas estructuras de sacáridos con forma de antena, y el presente método se puede poner en práctica con ellos sin limitación.
Los grupos modificadores ejemplares se discuten a continuación. Los grupos modificadores se pueden seleccionar en función de su capacidad de conferir a un polipéptido una o más propiedades deseables. Las propiedades ejemplares incluyen, pero sin limitación, farmacocinética incrementada, farmacodinámica incrementada, biodistribución mejorada, proporcionar una especie polivalente, solubilidad en agua mejorada, lipofilia aumentada o disminuida, y selección como objetivo de tejidos.
Polímeros Hidrosolubles
La hidrofilia de un péptido seleccionado se incrementa mediante la conjugación con moléculas polares tales como moléculas que contienen amina, éster, hidroxilo y polihidroxilo. Los ejemplos representativos incluyen, pero sin limitación, polilisina, polietilenimina, y poliéteres, p.ej., poli(etilen glicol), m-poli(etilen glicol), poli(propilenglicol), mpoli(propilen glicol), y otros restos de O-alquil poli(alquilen glicol). Los polímeros hidrosolubles preferidos son esencialmente no fluorescentes, o emiten tal cantidad mínima de fluorescencia que son inadecuados para el uso como marcador fluorescente en un ensayo. Además, en general se prefiere usar polímeros que no sean carbohidratos que se den de manera natural. Una excepción a esta preferencia es el uso de un carbohidrato que por otra parte se da de manera natural que se modifica mediante la unión covalente de otra entidad (p.ej., poli(etilen glicol), poli(propilen glicol), biomolécula, resto terapéutico, resto de diagnóstico, etc.). En otra realización ejemplar, se conjuga un resto de carbohidrato terapéutico a un brazo ligador y el casete carbohidrato-brazo ligador se conjuga posteriormente a un péptido por medio de un método de la invención.
Los métodos y procedimientos químicos para la activación de polímeros hidrosolubles y sacáridos, así como los métodos para la conjugación de sacáridos y polímeros a diversas especies, se describen en la bibliografía. Los métodos usados habitualmente para la activación de polímeros incluyen la activación de grupos funcionales con bromuro de cianógeno, peryodato, glutaraldehído, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, haluros de sulfonilo, triclorotriazina, etc. (véase, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).
Los expertos en la técnica conocen muchos polímeros hidrosolubles, y son útiles en la práctica de la presente invención. La expresión polímero hidrosoluble abarca especies tales como sacáridos (p.ej., dextrano, amilosa, ácido hialurónico, poli(ácido siálico), heparanos, heparinas, etc.); poli (aminoácidos); ácidos nucleicos; polímeros sintéticos (p.ej., poli(ácido acrílico), poli(éteres), p.ej., poli(etilen glicol); péptidos, proteínas, y similares. La presente invención se puede poner en práctica con cualquier polímero hidrosoluble, con la única limitación de que el polímero debe incluir un punto en el que el resto del conjugado se pueda unir.
Los métodos para la activación de polímeros se pueden hallar también en el documento WO 94/17039, pat. de EE.UU. nº 5.324.844, documento WO 94/18247, documento WO 94/04193, pat. de EE.UU. nº 5.219.564, pat. de EE.UU. nº 5.122.614, documento WO 90/13540, pat. de EE.UU. nº 5.281.698, y documento WO 93/15189, y para la conjugación entre polímeros activados y péptidos, p.ej. el Factor de Coagulación VIII (documento WO 94/15625), hemoglobina (documento WO 94/09027), molécula portadora de oxígeno (pat. de EE.UU. nº 4.412.989), ribonucleasa y superóxido dismutasa (Veronese et al., App Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)).
Los polímeros hidrosolubles preferidos son aquellos en los que una porción sustancial de las moléculas de polímero en una muestra del polímero tienen aproximadamente el mismo peso molecular; se dice que tales polímeros son "homodispersos" o "monodispersos".
La presente invención se ilustra además mediante referencia a un conjugado con poli(etilen glicol) o monometoxipoli(etilen glicol) (m-PEG). Hay disponibles varias revisiones y monografías sobre la funcionalización y conjugación de PEG. Véase, por ejemplo, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology
135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); y Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002).
El poli(etilen glicol) útil en la formación del conjugado de la invención es lineal o ramificado.
La semivida in vivo o área bajo la curva (ABC) de los glicopéptidos terapéuticos se puede incrementar también con polímeros hidrosolubles tales como PEG, m-PEG, PPG, y m-PPG. Por ejemplo, la modificación química de proteínas con PEG (PEG-ilación) o m-PEG (m-PEG-ilación) incrementa su tamaño molecular y disminuye su accesibilidad superficial y su accesibilidad a grupos funcionales, cada una de las cuales depende del tamaño del PEG unido a la proteína. Esto da como resultado una mejora de las semividas plasmáticas o ABCs y de la estabilidad proteolítica, y una disminución de la inmunogenicidad y de la captación hepática (Chaffee et al. J. Clin. Invest. 89: 1643-1651 (1992); Pyatak et al. Res. Commun. Chem. Pathol Pharmacol. 29: 113-127 (1980)). Se ha informado que la PEGilación de la interleucina-2 incrementa su potencia antitumoral in vivo (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 14871491 (1987)) y la PEG-ilación de un F(ab')2 derivado del anticuerpo monoclonal A7 ha mejorado su localización tumoral (Kitamura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387-1394 (1990)). Así, en otra realización preferida, la semivida in vivo de un péptido derivatizado con un polímero hidrosoluble mediante un método de la invención se incrementa respecto de la semivida in vivo o ABC del péptido sin derivatizar.
El incremento de la semivida in vivo del péptido o de la ABC se expresa mejor en forma de un intervalo de incremento en porcentaje de esta cantidad. El extremo inferior del intervalo de incremento en porcentaje es de alrededor del 40%, alrededor del 60%, alrededor del 80%, alrededor del 100%, alrededor del 150% o alrededor del 200%. El extremo superior del intervalo es de alrededor del 60%, alrededor del 80%, alrededor del 100%, alrededor del 150%,
o más de alrededor del 250%.
Los restos de PEG de cualquier peso molecular, p.ej., 5 kD, 10 kD, 20 kD, y 30 kD, son útiles en la presente invención.
Biomoléculas
En otra realización preferida, el carbohidrato modificado alberga una biomolécula. En otras realizaciones preferidas, la biomolécula es una proteína funcional, enzima, antígeno, anticuerpo, péptido, ácido nucleico (p.ej., nucleótidos o nucleósidos simples, oligonucleótidos, polinucleótidos y ácidos nucleicos monocatenarios o de cadenas superiores), lectina, receptores o una combinación de los mismos.
Las biomoléculas preferidas son esencialmente no fluorescentes, o emiten tal cantidad mínima de fluorescencia que son inadecuadas para el uso como marcador fluorescente en un ensayo. Además, se prefiere en general usar biomoléculas que no sean carbohidratos. Una excepción a esta preferencia es el uso de carbohidratos que por otra parte se dan de manera natural que se modifican mediante la unión covalente de otra entidad (p.ej., PEG, biomolécula, resto terapéutico, resto de diagnóstico, etc.). En una realización ejemplar, se conjuga un resto de carbohidrato, que es una biomolécula, a un brazo ligador y el casete carbohidrato-brazo ligador se conjuga posteriormente a un péptido por medio de un método de la invención.
Las biomoléculas útiles en la práctica de la presente invención pueden proceder de cualquier fuente. Las biomoléculas se pueden aislar a partir de fuentes naturales o se pueden producir mediante métodos sintéticos. Los péptidos pueden ser péptidos naturales o péptidos mutados. Las mutaciones se pueden llevar a cabo mediante mutagénesis química, mutagénesis dirigida u otros medios para la introducción de mutaciones conocidas para los expertos en la técnica. Los péptidos útiles en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, enzimas, antígenos, anticuerpos y receptores. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; intactos o fragmentos. Los péptidos son opcionalmente los productos de un programa de evolución dirigida.
Tanto los péptidos obtenidos de forma natural como los sintéticos y los ácidos nucleicos son útiles junto con la presente invención; estas moléculas se pueden unir a un componente de residuo de carbohidrato o a un agente ligador cruzado mediante cualquier grupo reactivo disponible. Por ejemplo, los péptidos se pueden unir por medio de un grupo amina, carboxilo, sulfhidrilo, o hidroxilo reactivo. El grupo reactivo puede hallarse en el extremo de un péptido
o en un sitio interno en la cadena peptídica. Los ácidos nucleicos se pueden unir por medio de un grupo reactivo en una base (p.ej., amina exocíclica) o un grupo hidroxilo disponible en un resto de carbohidrato (p.ej., 3'- o 5'-hidroxilo). Las cadenas de péptido y de ácido nucleico se pueden derivatizar adicionalmente en uno o más sitios para permitir la unión de grupos reactivos adecuados en la cadena. Véase, Chrisey et al. Nucleic Acids Res. 24: 3031-3039 (1996).
En una realización preferida adicional, la biomolécula se selecciona para dirigir el péptido modificado mediante los métodos de la invención a un tejido específico, por lo que se incrementa el trasporte del péptido a ese tejido respecto de la cantidad de péptido sin derivatizar que se transporta al tejido. En otra realización preferida, la cantidad de péptido derivatizado transportado a un tejido específico en un periodo de tiempo seleccionado se incrementa mediante la derivatización de al menos alrededor del 20%, más preferiblemente, al menos alrededor del 40%, y más preferiblemente todavía, al menos alrededor del 100%. En la actualidad, las biomoléculas preferidas para las aplicaciones de selección de objetivos incluyen los anticuerpos, hormonas y ligandos para receptores de la superficie celular.
En una realización ejemplar adicional, se proporciona un conjugado con biotina. Así, por ejemplo, se elabora un péptido biotinilado de manera selectiva mediante la unión de un resto de avidina o estreptavidina que alberga uno o más grupos modificadores.
Restos Terapéuticos
En otra realización preferida, el carbohidrato modificado incluye un resto terapéutico. Los expertos en la técnica apreciarán que existe una coincidencia parcial entre la categoría de restos terapéuticos y biomoléculas; muchas biomoléculas tienen propiedades o potencial terapéutico.
Los restos terapéuticos pueden ser agentes ya aceptados para el uso clínico, o pueden ser fármacos cuyo uso es experimental, o cuya actividad o mecanismo de acción se está investigando. Los restos terapéuticos pueden tener una acción demostrada en un estado patológico dado, o se puede haber hecho solamente la hipótesis de que muestren una acción deseable en un estado patológico dado. En una realización preferida, los restos terapéuticos son compuestos que se están cribando en función de su capacidad de interaccionar con un tejido de elección. Los restos terapéuticos, que son útiles en la práctica de la presente invención, incluyen fármacos de un amplio intervalo de clases de fármacos que tienen una diversidad de actividades farmacológicas. Los restos terapéuticos preferidos son esencialmente no fluorescentes, o emiten tal cantidad mínima de fluorescencia que son inadecuados para el uso como marcador fluorescente en un ensayo. Además, se prefiere usar restos terapéuticos que no sean carbohidratos. Una excepción a esta preferencia es el uso de un carbohidrato que se modifica mediante la unión covalente de otra entidad, tal como un PEG, biomolécula, resto terapéutico, resto de diagnóstico y similares. En otra realización ejemplar, se conjuga un resto de carbohidrato terapéutico a un brazo ligador y el casete carbohidrato-brazo ligador se conjuga posteriormente a un péptido por medio de un método de la invención.
Los expertos en la técnica conocen los métodos para la conjugación de agentes terapéuticos y de diagnóstico a otras especies diversas. Véase, por ejemplo, Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Dunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991.
En una realización ejemplar, el resto terapéutico se une al carbohidrato modificado por medio de una unión que se escinde en condiciones seleccionadas. Las condiciones ejemplares incluyen, pero sin limitación, un pH seleccionado (p.ej., estómago, intestino, vacuola endocítica), la presencia de una enzima activa (p.ej., esterasa, reductasa, oxidasa), luz, calor y similares. Se conocen muchos grupos escindibles en la técnica. Véase, por ejemplo, Jung et al., Biochem. Biophys. Acta, 761: 152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol. Chem., 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al., J. Immunol., 124: 913-920 (1980); Bouizar et al., Eur. J. Biochem., 155: 141-147 (1986), Park et al., J. Biol. chem.,
1261: 205-210 (1986); Browning et al., J. Immunol., 143: 1859-1867 (1989).
Las clases de restos terapéuticos útiles incluyen, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS). Los NSAIDS se pueden seleccionar, por ejemplo, de las siguientes categorías: (p.ej., derivados de ácido propiónico, derivados de ácido acético, derivados de ácido fenámico, derivados de ácido bifenilcarboxílico y oxicams); fármacos antiinflamatorios esteroideos que incluyen hidrocortisona y similares; fármacos antihistamínicos (p.ej., clorfeniramina, triprolidina); fármacos antitusivos (p.ej., dextrometorfano, codeína, caramifeno y carbetapentano); fármacos antipruriginosos (p.ej., metdilazina y trimeprazina); fármacos anticolinérgicos (p.ej., escopolamina, atropina, homatropina, levodopa); fármacos anti-eméticos y anti-náusea (p.ej., ciclizina, meclizina, clorpromazina, buclizina); fármacos anoréxicos (p.ej., benzfetamina, fentermina, clorfentermina, fenfluramina); fármacos estimulantes centrales (p.ej., anfetamina, metanfetamina, dextroanfetamina y metilfenidato); fármacos antiarrítmicos (p.ej., propanolol, procainamida, disopiramida, quinidina, encainida); fármacos bloqueantes �-adrenérgicos (p.ej., metoprolol, acebutolol, betaxolol, labetalol y timolol); fármacos cardiotónicos (p.ej., milrinona, amrinona y dobutamina); fármacos antihipertensivos (p.ej., enalapril, clonidina, hidralazina, minoxidil, guanadrel, guanetidina); fármacos diuréticos (p.ej., amilorida e hidroclorotiazida); fármacos vasodilatadores (p.ej., diltiazem, amiodarona, isoxsuprina, nilidrina, tolazolina y verapamilo); fármacos vasoconstrictores (p.ej., dihidroergotamina, ergotamina y metilsergida); fármacos antiúlcera (p.ej., ranitidina y cimetidina); fármacos anestésicos (p.ej., lidocaína, bupivacaína, cloroprocaína, dibucaína); fármacos antidepresivos (p.ej., imipramina, desipramina, amitriptilina, nortriptilina); fármacos tranquilizantes y sedantes (p.ej., clordiazepóxido, benacitizina, benzquinamida, flurazepam, hidroxizina, loxapina y promazina); fármacos antipsicóticos (p.ej., clorprotixeno, flufenazina, haloperidol, molindona, tioridazina y trifluoperazina); fármacos antimicrobianos (fármacos antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoarios y antivirales).
Los fármacos antimicrobianos que se prefieren para la incorporación en la presente composición incluyen, por ejemplo, las sales farmacéuticamente aceptables de fármacos de �-lactamas, fármacos de quinolonas, ciprofloxacino, norfloxacino, tetraciclina, eritromicina, amikacina, triclosán, doxiciclina, capreomicina, clorhexidina, clortetraciclina, oxitetraciclina, clindamicina, etambutol, isotionato de hexamidina, metronidazol, pentamidina, gentamicina, kanamicina, lineomicina, metaciclina, metenamina, minociclina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina, tobramicina, miconazol y amantadina.
Otros restos de fármacos para el uso en la presente invención incluyen los fármacos antineoplásicos (p.ej., antiandrógenos (p.ej., leuprolida o flutamida), agentes citocidas (p.ej., adriamicina, doxorrubicina, taxol, ciclofosfamida, busulfano, cisplatino, �-2-interferón) anti-estrógenos (p.ej., tamoxifeno), antimetabolitos (p.ej., fluorouracilo, metotrexato, mercaptopurina, tioguanina). También se incluyen dentro de esta clase los agentes basados en radioisótopos tanto para el diagnóstico como para la terapia, y las toxinas conjugadas, tales como ricina, geldanamicina, mitansina, CC-1065, las duocarmicinas, caliqueamicina y las estructuras relacionadas y los análogos de los mismos.
El resto terapéutico también puede ser una hormona (p.ej., medroxiprogesterona, estradiol, leuprolida, megestrol, octreótido o somatostatina); fármacos relajantes musculares (p.ej., cinamedrina, ciclobenzaprina, flavoxato, orfenadrina, papaverina, mebeverina, idaverina, ritodrina, difenoxilato, dantroleno y azumoleno); fármacos antiespasmódicos; fármacos oseo-activos (p.ej., compuestos farmacológicos de difosfonato y fosfonoalquilfosfinato); fármacos moduladores endocrinos (p.ej., anticonceptivos (p.ej., etinodiol, etinil estradiol, noretindrona, mestranol, desogestrel, medroxiprogesterona), moduladores de la diabetes (p.ej., gliburida o clorpropamida), fármacos anabólicos, tales como testolactona o estanozolol, andrógenos (p.ej., metiltestosterona, testosterona o fluoximesterona), antidiuréticos (p.ej., desmopresina) y calcitoninas).
También son útiles en la presente invención los estrógenos (p.ej., dietilestilbesterol), los glucocorticoides (p.ej., triamcinolona, betametasona, etc.) y progestágenos, tales como noretindrona, etinodiol, noretindrona, levonorgestrel; agentes tiroideos (p.ej., liotironina o levotiroxina) o agentes anti-tiroideos (p.ej., metimazol); fármacos antihiperprolactinémicos (p.ej., cabergolina); y también se pueden emplear inhibidores de hormonas (p.ej., danazol o goserelina), agentes oxitócicos (p.ej., metilergonovina u oxitocina) y prostaglandinas, tales como mioprostol, alprostadil o dinoprostona.
Otros grupos modificadores útiles incluyen los fármacos inmunomoduladores (p.ej., antihistaminas, estabilizadores de mastocitos, tales como lodoxamida y/o cromolina, esteroides (p.ej., triamcinolona, beclometazona, cortisona, dexametasona, prednisolona, metilprednisolona, beclometasona, o clobetasol), antagonistas de histamina H2 (p.ej., famotidina, cimetidina, ranitidina), inmunosupresores (p.ej., azatioprina, ciclosporina), etc. También son útiles los grupos con actividad antiinflamatoria, tales como sulindac, etodolac, cetoprofeno y cetorolac. Otros fármacos útiles junto con la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica.
Preparación de Carbohidratos Modificados
En general, el resto de carbohidrato y el grupo modificador se unen por medio del uso de grupos reactivos, que se transforman generalmente mediante el procedimiento de unión hasta un grupo funcional orgánico nuevo o especie que no es reactiva en las condiciones fisiológicas relevantes. El/los grupo(s) funcional(es) reactivo(s) del carbohidrato se localiza(n) en cualquier posición del resto de carbohidrato. Los grupos reactivos y clases de reacciones útiles en la práctica de la presente invención son generalmente aquellos que se conocen bien en la técnica de la química de bioconjugados. Las clases de reacciones preferidas actualmente disponibles con restos de carbohidratos reactivos son aquellas que se desarrollan en condiciones relativamente suaves. Estas incluyen, pero sin limitación, las sustituciones nucleófilas (p.ej., reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, ésteres activos), las sustituciones electrófilas (p.ej., reacciones de enaminas) y adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono y carbonoheteroátomo (p.ej., reacción de Michael, adición de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se discuten, por ejemplo, en March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3ª Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.
Los grupos funcionales reactivos útiles que penden de un núcleo de carbohidrato o grupo modificador incluyen, pero sin limitación:
- (a)
- grupos carboxilo y diversos derivados de los mismos que incluyen, pero sin limitación, ésteres de Nhidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxibenztriazol, haluros de ácido, acil imidazoles, tioésteres, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de alquilo, alquenilo, alquinilo y ésteres aromáticos;
- (b)
- grupos hidroxilo, que se pueden convertir, p.ej., en ésteres, éteres, aldehídos, etc.
- (c)
- grupos haloalquilo, en los que el haluro se puede desplazar más tarde con un grupo nucleófilo tal como, por ejemplo, una amina, un ión carboxilato, anión tiol, carbanión, o un ión alcóxido, por lo que se da como resultado la unión covalente de un grupo nuevo al grupo funcional del átomo de halógeno;
- (d)
- grupos dienófilos, que son capaces de participar en reacciones de Diels-Alder tales como, por ejemplo, grupos maleimido;
- (e)
- grupos aldehído o cetona, de forma que la derivatización posterior es posible a través de la formación de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o a través de mecanismos tales como la adición de Grignard o la adición de alquil-litio;
- (f)
- grupos de haluro de sulfonilo para la reacción posterior con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas;
- (g)
- grupos tiol, que se pueden convertir, por ejemplo, en disulfuro o que se pueden hacer reaccionar con haluros de acilo;
- (h)
- grupos amina o sulfhidrilo, que, por ejemplo, se pueden acilar, alquilar u oxidar;
- (i)
- alquenos, que, por ejemplo, se pueden someter a cicloadiciones, acilación, adición de Michael, etc.; y
- (j)
- epóxidos, que pueden reaccionar, por ejemplo, con aminas y compuestos hidroxilo.
Los grupos funcionales reactivos se pueden elegir de manera que no participen, o interfieran, en las reacciones necesarias para construir el núcleo del carbohidrato reactivo o el grupo modificador. De manera alternativa, un grupo funcional reactivo se puede proteger de la participación en la reacción mediante la presencia de un grupo protector. Los expertos en la técnica entienden cómo proteger un grupo funcional particular de manera que no interfiera con un grupo elegido de condiciones de reacción. Para ejemplos de grupos protectores, véase, por ejemplo, Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991.
En la discusión siguiente, se exponen varios ejemplos específicos de carbohidratos modificados que son útiles en la práctica de la presente invención. En las realizaciones ejemplares, se utiliza un derivado de ácido siálico como núcleo de carbohidrato al que se une el grupo modificador. El foco de la discusión sobre los derivados de ácido siálico es por motivos de claridad de ilustración únicamente, y no se debería considerar como limitante del alcance de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden activar una diversidad de otros restos de carbohidrato y derivatizarlos de una manera análoga a la expuesta mediante el uso de ácido siálico como ejemplo. Por ejemplo, hay disponibles numerosos métodos para la modificación de galactosa, glucosa, N-acetilgalactosamina y fucosa, por nombrar unos cuantos sustratos de carbohidratos, que se modifican fácilmente mediante métodos reconocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Elhalabi et al., Curr. Med. Chem. 6: 93 (1999); y Schafer et al., J. Org. Chem. 65: 24 (2000)).
En una realización ejemplar, el péptido que se modifica mediante un método de la invención es un glicopéptido que se produce en células procarióticas (p.ej., E.coli), células eucarióticas que incluyen levaduras y células mamíferas (p.ej., células CHO), o en un animal transgénico, y así, contiene cadenas de oligosacáridos unidas en N y/o O que están sialiladas de manera incompleta. Las cadenas de oligosacáridos del glicopéptido que carece de ácido siálico y que contiene un residuo de galactosa terminal se pueden PEG-ilar, PPG-ilar o modificar de otra manera con un ácido siálico modificado.
El derivado ejemplar de PEG-ácido siálico incluye: en el que L es un resto ligador de alquilo sustituido o sin sustituir o de heteroalquilo sustituido o sin sustituir que une el resto de ácido siálico y el resto de PEG, y "n" es 1 o mayor; y
5 en el que el índice "s" representa un número entero de 0 a 20, y "n" es 1 o mayor.
En el Esquema 4, el amino glicósido 1 se trata con el éster activo de un derivado de aminoácido protegido (p.ej., glicina), por lo que se convierte el residuo de amina del carbohidrato en el aducto de amida-aminoácido protegido correspondiente. El aducto se trata con una aldolasa para formar el a-hidroxi carboxilato 2. El compuesto 2 se convierte en el derivado de CMP correspondiente mediante la acción de una CMP-SA sintetasa, seguido de hidrogena
10 ción catalítica del derivado de CMP para producir el compuesto 3. La amina introducida por medio de la formación del aducto de glicina se utiliza como lugar para la unión de PEG haciendo reaccionar el compuesto 3 con un derivado de PEG o PPG activado (p.ej., PEG-C(O)NHS, PEG-OC(O)O-p-nitrofenilo), que produce especies tales como 4 ó 5, respectivamente.
Esquema 4
La Tabla 1 enumera ejemplos representativos de monofosfatos de carbohidratos que se derivatizan con un resto de PEG o PPG. Los mutantes de la hormona del crecimiento humana se pueden modificar mediante el método del Esquema 1. Se preparan otros derivados mediante métodos reconocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Keppler et al., Glycobiology 11: 11R (2001); y Charter et al., Glycobiology 10: 1049 (2000)). Otros análogos de PEG y PPG amino-reactivos están disponibles comercialmente, o se pueden preparar mediante métodos fácilmente accesibles para los expertos en la técnica.
Tabla 1
Los fosfatos de carbohidratos modificados útiles en la práctica de la presente invención se pueden sustituir en otras posiciones, así como en las expuestas anteriormente. Las sustituciones preferidas actualmente del ácido siálico se exponen en la Fórmula I:
en la que X es un grupo ligador, que se selecciona preferiblemente de -O-, -N(H)-, -S, CH2-, y - N(R)2, en la que cada R es un miembro seleccionado independientemente de R1-R5. Los símbolos Y, Z, A y B representan cada uno un grupo que se selecciona del grupo expuesto anteriormente para la identidad de X. X, Y, Z, A y B se seleccionan cada uno independientemente y, por lo tanto, pueden ser iguales o diferentes. Los símbolos R1, R2, R3, R4, y R5 representan H, un polímero hidrosoluble, resto terapéutico, biomolécula u otro resto. De manera alternativa, estos símbolos representan un ligador que se une a un polímero hidrosoluble, resto terapéutico, biomolécula u otro resto.
Los restos ejemplares unidos a los conjugados descritos en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, derivados de PEG (p.ej., alquil-PEG, acil-PEG, acil-alquil-PEG, alquil-acil-PEG carbamoil-PEG, aril-PEG), derivados de PPG (p.ej., alquil-PPG, acil-PPG, acil-alquil-PPG, alquil-acil-PPG carbamoil-PPG, aril-PPG), restos terapéuticos, restos de diagnóstico, manosa-6-fosfato, heparina, heparano, SLex, manosa, manosa-6-fosfato, Sialil-Lewis X, FGF, VFGF, proteínas, condroitina, queratano, dermatano, albúmina, integrinas, oligosacáridos con estructura de antena, péptidos y similares. Los métodos para la conjugación de los diversos grupos modificadores a un resto de sacárido son fácilmente accesibles para los expertos en la técnica (POLY (ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; POLY (ETHYLENE GLYCOL) CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Dunn et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).
Grupos Ligadores Cruzados
La preparación del carbohidrato modificado para el uso en los métodos de la presente invención incluye la unión de un grupo modificador a un residuo de carbohidrato y la formación de un aducto estable, que es un sustrato para una glicosiltransferasa. El carbohidrato y el grupo modificador se pueden acoplar mediante un agente ligador cruzado de orden cero o superior. Los compuestos bifuncionales ejemplares que se pueden usar para unir grupos modificadores a restos de carbohidrato incluyen, pero sin limitación, poli(etilenglicoles) bifuncionales, poliamidas, poliéteres, poliésteres y similares. Las aproximaciones generales para la unión de carbohidratos a otras moléculas se conocen en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Lee et al., Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia et al., Anal. Biochem. 178: 408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 8886 (1990) y Bednarski et al., documento WO 92/18135. En la discusión siguiente, los grupos reactivos se consideran favorables para el resto de carbohidrato del carbohidrato modificado naciente. El foco de la discusión es por motivos de claridad de ilustración. Los expertos en la técnica apreciarán que la discusión también es relevante para los grupos reactivos del grupo modificador.
Una estrategia ejemplar implica la incorporación de un sulfhidrilo protegido en el carbohidrato mediante el uso del ligador cruzado heterobifuncional SPDP (n-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato y después la desprotección del sulfhidrilo para la formación de un enlace disulfuro con otro sulfhidrilo en el grupo modificador.
Si SPDP afecta perjudicialmente a la capacidad del carbohidrato modificado de actuar como un sustrato para la glicosiltransferasa, se usa uno de una serie de otros ligadores cruzados tales como 2-iminotiolano o S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA) para formar un enlace disulfuro. El 2-iminotiolano reacciona con aminas primarias, que incorporan instantáneamente un sulfhidrilo desprotegido en la molécula que contiene amina. SATA también reacciona con aminas primarias, pero incorpora un sulfhidrilo protegido, que se desacetila más tarde mediante el uso de hidroxilamina para producir un sulfhidrilo libre. En cada caso, el sulfhidrilo incorporado está libre para reaccionar con otros sulfhidrilos o sulfhidrilos protegidos, como SPDP, por lo que se forma el enlace disulfuro necesario.
La estrategia anteriormente descrita es ejemplar, y no limitante, de los ligadores útiles en la invención. Hay disponibles otros ligadores cruzados que se pueden usar en diferentes estrategias para el ligamiento cruzado del grupo modificador con el péptido. Por ejemplo, TPCH (S-(2-tiopiridil)-L-cisteín-hidrazida) y TPMPH (S-(2-tiopiridil)mercaptopropionohidrazida) reaccionan con restos de carbohidrato que se han oxidado previamente mediante tratamiento suave con peryodato, por lo que forman así un enlace hidrazona entre la porción de hidrazida del ligador cruzado y los aldehídos generados por el peryodato. TPCH y TPMPH introducen un grupo sulfhidrilo protegido con 2-piridiltiona en el carbohidrato, que se puede desproteger con DTT y usarlo posteriormente para la conjugación, tal como mediante la formación de enlaces disulfuro entre los componentes.
Si se descubre que la formación de enlaces disulfuro es inadecuada para la producción de carbohidratos modificados estables, se pueden usar otros ligadores cruzados que incorporan enlaces más estables entre los componentes. Los ligadores cruzados heterobifuncionales GMBS (N-gamma-malimidobutiriloxi)succinimida) y SMCC (succinimidil4-(N-maleimido-metil)ciclohexano) reaccionan con las aminas primarias, por lo que introducen un grupo maleimida en el componente. El grupo maleimida puede reaccionar posteriormente con sulfhidrilos del otro componente, que se pueden introducir mediante los ligadores cruzados mencionados previamente, por lo que se forma un enlace tioéter estable entre los componentes. Si el impedimento estérico entre componentes interfiere con la actividad del componente o con la capacidad del carbohidrato modificado de actuar como sustrato para la glicosiltransferasa, se pueden usar ligadores cruzados que introducen brazos espaciadores largos entre los componentes y que incluyen derivados de algunos de los ligadores cruzados mencionados previamente (es decir, SPDP). Así, existe gran abundancia de ligadores cruzados adecuados, que son útiles y que se seleccionan dependiendo del efecto que tienen sobre la producción óptima del conjugado peptídico y del carbohidrato modificado.
Se usa una diversidad de reactivos para modificar los componentes del carbohidrato modificado con uniones cruzadas químicas intramoleculares (para revisiones de los reactivos de ligadura cruzada y de procedimientos de ligadura cruzada véase: Wold, F., Meth. Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., y Cooney, D. A., En: ENZYMES AS DRUGS. (Holcenberg, y Roberts, eds.) págs. 395-442, Wiley, Nueva York, 1981; Ji, T. H., Meth. Enzymol. 91: 580609, 1983; Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17: 167-183, 1993, todos los cuales se incorporan en la presente memoria como referencia). Los reactivos de ligadura cruzada preferidos derivan de diversos reactivos de ligadura cruzada de longitud cero, homobifuncionales y heterobifuncionales. Los reactivos de ligadura cruzada de longitud cero incluyen la conjugación directa de dos grupos químicos intrínsecos sin la introducción de material extrínseco. Los agentes que catalizan la formación de un enlace disulfuro pertenecen a esta categoría. Otro ejemplo son los reactivos que inducen la condensación de un carboxilo y de un grupo amino primario para formar un enlace amida, tales como carbodiimidas, cloroformiato de etilo, reactivo K de Woodward (3'-sulfonato de 2-etil-5-fenilisoxazolio), y carbonildiimidazol. Además de estos reactivos químicos, la enzima transglutaminasa (glutamil-péptido y-glutamiltransferasa; EC 2.3.2.13) se puede usar como reactivo ligador cruzado de longitud cero. Esta enzima cataliza reacciones de transferencia de acilo en grupos carboxamida de residuos de glutaminilo unidos a proteínas, normalmente con un grupo amino primario como sustrato. Los reactivos homo- y hetero-bifuncionales preferidos contienen dos sitios idénticos o dos sitios diferentes, respectivamente, que pueden ser reactivos para grupos amino, sulfhidrilo, guanidino, indol, o inespecíficos.
Grupos Amino-Reactivos
En una realización preferida, los sitios del ligador cruzado son grupos amino-reactivos. Los ejemplos no limitantes útiles de grupos amino-reactivos incluyen ésteres de carbonato, ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), imidoésteres, isocianatos, acilhaluros, arilazidas, ésteres de p-nitrofenilo, aldehídos, y cloruros de sulfonilo.
Los ésteres de NHS reaccionan de manera preferente con los grupos amino primarios (que incluyen los grupos aromáticos) de un componente de carbohidrato modificado. Se sabe que los grupos imidazol de las histidinas compiten con las aminas primarias por la reacción, pero los productos de la reacción son inestables y se hidrolizan fácilmente. La reacción implica el ataque nucleófilo de una amina en el carboxilo del ácido de un éster de NHS para formar una amida, liberando la N-hidroxisuccinimida. Así, se pierde la carga positiva del grupo amino original.
Los imidoésteres son los reactivos acilantes más específicos para la reacción con los grupos amina de los componentes de carbohidratos modificados. A un pH entre 7 y 10, los imidoésteres reaccionan solamente con las aminas primarias. Las aminas primarias atacan los imidatos de manera nucleófila para producir un intermedio que se descompone hasta amidina a pH elevado o hasta un imidato nuevo a pH bajo. El imidato nuevo puede reaccionar con otra amina primaria, por lo que liga de forma cruzada dos grupos amino, un caso de un imidato supuestamente monofuncional que reacciona de forma bifuncional. El producto principal de la reacción con aminas primarias es una amidina que es una base más fuerte que la amina original. Por lo tanto, se conserva la carga positiva del grupo amino original.
Los isocianatos (e isotiocianatos) reaccionan con las aminas primarias de los componentes de carbohidratos modificados para formar enlaces estables. Sus reacciones con grupos sulfhidrilo, imidazol, y tirosilo proporcionan productos relativamente inestables.
Las acilazidas se usan también como reactivos específicos de aminas, en los que las aminas nucleófilas del componente de afinidad atacan grupos carboxilo ácidos en condiciones ligeramente alcalinas, p.ej. pH 8,5.
Los haluros de arilo, tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno, reaccionan de manera preferente con los grupos amino y los grupos fenólicos de tirosina de los componentes de carbohidratos modificados, pero también con los grupos sulfhidrilo e imidazol.
Los ésteres de p-nitrofenilo de ácidos mono- y dicarboxílicos también son grupos amino-reactivos útiles. Aunque la especificidad del reactivo no es muy elevada, los grupos a- y £-amino parecen reaccionar más rápidamente.
Los aldehídos tales como glutaraldehído reaccionan con las aminas primarias del carbohidrato modificado. Aunque se forman bases de Schiff inestables tras la reacción de los grupos amino con los grupos aldehído de los aldehídos, el glutaraldehído es capaz de modificar el carbohidrato modificado con ligaduras cruzadas estables. A pH 6-8, el pH de las condiciones típicas de ligadura cruzada, los polímeros cíclicos experimentan una deshidratación para formar polímeros de aldehído a-� insaturados. Las bases de Schiff, sin embargo, son estables, cuando se conjugan a otro enlace doble. La interacción resonante de ambos enlaces dobles impide la hidrólisis de la unión de Schiff. Además, las aminas a concentraciones locales elevadas pueden atacar el enlace doble etilénico para formar un producto de adición de Michael estable.
Los cloruros de sulfonilo aromáticos reaccionan con una diversidad de sitios de los componentes del carbohidrato modificado, pero la reacción con los grupos amino es la más importante, y da como resultado una unión sulfonamida estable.
Grupos Sulfhidril-Reactivos
En otra realización preferida, los sitios son grupos sulfhidril-reactivos. Los ejemplos útiles, no limitantes de grupos sulfhidril-reactivos incluyen maleimidas, haluros de alquilo, disulfuros de piridilo, y tioftalimidas.
Las maleimidas reaccionan de manera preferente con el grupo sulfhidrilo de los componentes del carbohidrato modificado para formar enlaces tioéter estables. También reaccionan a una velocidad mucho más lenta con grupos amino primarios y los grupos imidazol de las histidinas. Sin embargo, a pH 7 el grupo maleimida se puede considerar un grupo específico de sulfhidrilos, ya que a este pH la velocidad de reacción de los tioles simples es 1000 veces mayor que la de la amina correspondiente.
Los haluros de alquilo reaccionan con grupos sulfhidrilo, sulfuros, imidazoles, y grupos amino. A un pH neutro a ligeramente alcalino, sin embargo, los haluros de alquilo reaccionan principalmente con grupos sulfhidrilo para formar enlaces tioéter estables. A un pH más elevado, está favorecida la reacción con los grupos amino.
Los disulfuros de piridilo reaccionan con sulfhidrilos libres por medio del intercambio de disulfuro para proporcionar disulfuros mixtos. Como resultado, los disulfuros de piridilo son los grupos sulfhidril-reactivos más específicos.
Las tioftalimidas reaccionan con grupos sulfhidrilo libres para formar disulfuros.
Residuo Carboxil-Reactivo
En otra realización, se usan carbodiimidas solubles tanto en agua como en disolventes orgánicos, como reactivos carboxil-reactivos. Estos compuestos reaccionan con grupos carboxilo libres formando una pseudourea que después se puede acoplar a las aminas disponibles, por lo que se produce una unión amida. Se enseña cómo modificar un grupo carboxilo con carbodiimida (Yamada et al., Biochemistry 20: 4836-4842, 1981).
Además del uso de restos reactivos específicos de sitio, la presente invención contempla el uso de grupos reactivos inespecíficos para unir el carbohidrato al grupo modificador. Los ligadores cruzados inespecíficos ejemplares incluyen grupos fotoactivables, completamente inertes en la oscuridad, que se convierten en especies reactivas tras la absorción de un fotón de energía adecuado. En una realización preferida, los grupos fotoactivables se seleccionan de precursores de nitrenos generados en el calentamiento o la fotolisis de azidas. Los nitrenos deficientes de electrones son extremadamente reactivos, y pueden reaccionar con una diversidad de enlaces químicos que incluyen N-H, O-H, C-H, y C=C. Aunque se pueden emplear tres tipos de azidas (derivados de arilo, alquilo, y acilo), actualmente se prefieren las arilazidas. La reactividad de las arilazidas en la fotolisis es mejor con los enlaces N-H y O-H que con los enlaces C-H. Los arilnitrenos deficientes de electrones expanden el anillo rápidamente para formar deshidroazepinas, que tienden a reaccionar con nucleófilos, en vez de formar productos de inserción en C-H. La reactividad de las arilazidas se puede incrementar mediante la presencia de sustituyentes atractores de electrones tales como grupos nitro o hidroxilo en el anillo. Tales sustituyentes llevan el máximo de absorción de las arilazidas a una longitud de onda más larga. Las arilazidas sin sustituir tienen el máximo de absorción en el intervalo de 260-280 nm, mientras las hidroxi y nitroarilazidas absorben la luz de manera significativa más allá de 305 nm. Por lo tanto, se prefieren más las hidroxi y nitroarilazidas, ya que permiten emplear condiciones de fotolisis menos perjudiciales para el componente de afinidad que las arilazidas sin sustituir.
En otra realización preferida, los grupos fotoactivables se seleccionan de arilazidas fluoradas. Los productos de fotolisis de las arilazidas fluoradas son arilnitrenos, todos los cuales experimentan las reacciones características de este grupo, que incluyen la inserción en el enlace C-H, con una eficacia elevada (Keana et al., J. Org. Chem. 55: 3640-3647, 1990).
En otra realización, los grupos fotoactivables se seleccionan de residuos de benzofenona. Los reactivos de benzofenona proporcionan en general rendimientos de ligadura cruzada mayores que los reactivos de arilazida.
En otra realización, los grupos fotoactivables se seleccionan de diazo-compuestos, que forman un carbeno deficiente de elecciones tras la fotolisis. Estos carbenos experimentan una diversidad de reacciones que incluyen la inserción en enlaces C-H, la adición a enlaces dobles (lo que incluye los sistemas aromáticos), la atracción de hidrógeno y la coordinación con centros nucleófilos para proporcionar los iones de carbono.
En otra realización, los grupos fotoactivables se seleccionan de diazopiruvatos. Por ejemplo, el éster de p-nitrofenilo del diazopiruvato de p-nitrofenilo reacciona con aminas alifáticas para proporcionar amidas del ácido diazopirúvico que se someten a fotolisis ultravioleta para formar aldehídos. El componente de afinidad modificado mediante diazopiruvato sometido a fotolisis reaccionará como un formaldehído o glutaraldehído que forma ligaduras cruzadas.
Ligadores cruzados homobifuncionales reactivos con aminas primarias
La síntesis, propiedades, y aplicaciones de los ligadores cruzados amino-reactivos se describen comercialmente en la bibliografía (para revisiones de los procedimientos de ligadura cruzada y reactivos, véase lo anteriormente mencionado). Muchos reactivos están disponibles (p.ej., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.).
Los ejemplos preferidos no limitantes de ésteres de NHS homobifuncionales incluyen glutarato de disuccinimidilo (DSG), suberato de disuccinimidilo (DSS), bis(sulfosuccinimidil)-suberato (BS), tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST), bis-2-(succinimidooxicarboniloxi)etilsulfona (BSOCOES); bis-2-(sulfosuccinimidooxi-carboniloxi)etilsulfona (sulfo-BSOCOES), etilen glicol-bis(succinimidilsuccinato) (EGS), etilen glicolbis(sulfosuccinimidilsuccinato) (sulfo-EGS), ditiobis(succinimidil)-propionato (DSP), y ditiobis(sulfosuccinimidil)-propionato (sulfo-DSP). Los ejemplos preferidos no limitantes de imidoésteres homobifuncionales incluyen malonimidato de dimetilo (DMM), succinimidato de dimetilo (DMSC), adipimidato de dimetilo (DMA), pimelimidato de dimetilo (DMP), suberimidato de dimetilo (DMS), 3,3'-oxidipropionimidato de dimetilo (DODP), 3,3'-(metilendioxi)dipropionimidato de dimetilo (DMDP), 3,3'-(dimetilendioxi)dipropionimidato de dimetilo (DDDP), 3,3'-(tetrametilendioxi)-dipropionimidato de dimetilo (DTDP), y 3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo (DTBP).
Los ejemplos preferidos no limitantes de isotiocianatos homobifuncionales incluyen: diisotiocianato de p-fenileno (DITC), y ácido 4,4'-diisotiociano-2,2'-disulfónico-estilbeno (DIDS).
Los ejemplos preferidos no limitantes de isocianatos homobifuncionales incluyen diisocianato de xileno, 2,4-diisocianato de tolueno, 2-isocianato-4-isotiocianato de tolueno, 4,4'-diisocianato de 3-metoxidifenilmetano, diisocianato de 2,2'-dicarboxi-4,4'-azofenilo, y diisocianato de hexametileno.
Los ejemplos preferidos no limitantes de haluros de arilo homobifuncionales incluyen 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB), y 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrofenil-sulfona.
Los ejemplos preferidos no limitantes de reactivos de aldehídos alifáticos homobifuncionales incluyen glioxal, malondialdehído, y glutaraldehído.
Los ejemplos preferidos no limitantes de reactivos acilantes homobifuncionales incluyen ésteres de nitrofenilo de ácidos dicarboxílicos.
Los ejemplos preferidos no limitantes de cloruros de sulfonilo aromáticos homobifuncionales incluyen cloruro de fenol-2,4-disulfonilo, y cloruro de a-naftol-2,4-disulfonilo.
Los ejemplos preferidos no limitantes de reactivos homobifuncionales amino-reactivos adicionales incluyen biscarbonato de eritritol, que reacciona con aminas para proporcionar los biscarbamatos.
Ligadores Cruzados Homobifuncionales Reactivos con Grupos Sulfhidrilo Libres
La síntesis, propiedades, y aplicaciones de tales reactivos se describen en la bibliografía (para revisiones de procedimientos de ligadura cruzada y reactivos, véase lo anteriormente mencionado). Muchos de los reactivos están disponibles comercialmente (p.ej., Pierce Chemical Company, Rockford, III.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
Los ejemplos preferidos no limitantes de maleimidas homobifuncionales incluyen bismaleimidohexano (BMH), N,N'(1,3-fenilen)-bismaleimida, N,N'-(1,2-fenilen)bismaleimida, azofenildimaleimida, y bis(N-maleimidometil)éter.
Los ejemplos preferidos no limitantes de sulfuros de piridilo homobifuncionales incluyen 1,4-di-3'-(2'-piridilditio)propionamidobutano (DPDPB).
Los ejemplos preferidos no limitantes de haluros de alquilo homobifuncionales incluyen 2,2'-dicarboxi-4,4'-diyodoacetamidoazobenceno, ácido a,a'-diyodo-p-xilenosulfónico, ácido a,a'-dibromo-p-xilenosulfónico, N,N'-bis(b-bromoetil)bencilamina, N,N'-di(bromoacetil)fenilhidrazina, y 1,2-di(bromoacetil)amino-3-fenilpropano.
Ligadores Cruzados Fotoactivables Homobifuncionales
La síntesis, propiedades, y aplicaciones de tales reactivos se describen en la bibliografía (para revisiones de procedimientos de ligadura cruzada y reactivos, véase lo anteriormente mencionado). Algunos de los reactivos están disponibles comercialmente (p.ej., Pierce Chemical Company, Rockford, III.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
Los ejemplos preferidos no limitantes de ligadores cruzados fotoactivables homobifuncionales incluyen disulfuro de bis-�-(4-azidosalicilamido)etilo (BASED), S,S-dióxido de di-N-(2-nitro-4-azidofenil)-cistamina (DNCO), y 4,4'-ditiobisfenilazida.
Reactivos Heterobifuncionales Amino-Reactivos con un Resto de Disulfuro de Piridilo
La síntesis, propiedades, y aplicaciones de tales reactivos se describen en la bibliografía (para revisiones de procedimientos de ligadura cruzada y reactivos, véase lo anteriormente mencionado). Muchos de los reactivos están disponibles comercialmente (p.ej., Pierce Chemical Company, Rockford, III.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
Los ejemplos no limitantes de reactivos heterobifuncionales con un resto de disulfuro de piridilo y un éster de NHS amino-reactivo incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 6-3-(2-piridilditio)propionamidohexanoato de succinimidilo (LC-SPDP), 6-3-(2-piridilditio)propionamidohexanoato de sulfosuccinimidilo (sulfo-LCSPDP), 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno (SMPT), y 6-a-metil-a-(2-piridilditio)toluamidohexanoato de sulfosuccinimidilo (sulfo-LC-SMPT).
Reactivos Heterobifuncionales Amino-Reactivos con un Resto de Maleimida
La síntesis, propiedades, y aplicaciones de tales reactivos se describen en la bibliografía. Los ejemplos preferidos no limitantes de reactivos heterobifuncionales con un resto de maleimida y un éster de NHS amino-reactivo incluyen maleimidilacetato de succinimidilo (AMAS), 3-maleimidilpropionato de succinimidilo (BMPS), éster de N-y-maleimidobutiriloxisuccinimida (GMBS), éster de N-y-maleimidobutiriloxisulfo-succinimida (sulfo-GMBS), 6-maleimidilhexanoato de succinimidilo (EMCS), 3-maleimidilbenzoato de succinimidilo (SMB), éster de m-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimida (MBS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB), y 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMPB).
Reactivos Heterobifuncionales Amino-Reactivos con un Resto de Haluro de Alquilo
La síntesis, propiedades, y aplicaciones de tales reactivos se describen en la bibliografía. Los ejemplos preferidos no limitantes de reactivos heterobifuncionales con un resto de haluro de alquilo y un éster de NHS amino-reactivo incluyen (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB), (4-yodoacetil)aminobenzoato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SIAB), 6-(yodoacetil)aminohexanoato de succinimidilo (SIAX), 6-(6-((yodoacetil)amino)hexanoilamino)hexanoato de succinimidilo (SIAXX), 6-(((4-(yodoacetil)-amino)-metil)-ciclohexano-1-carbonil)aminohexanoato de succinimidilo (SIACX), y 4-((yodoacetil)-amino)metilciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SIAC).
Un ejemplo preferido de un reactivo heterobifuncional con un éster de NHS amino-reactivo y un resto de dihaluro de alquilo es 2,3-dibromopropionato de N-hidroxisuccinimidilo (SDBP). SDBP introduce ligaduras cruzadas intramoleculares en el componente de afinidad mediante la conjugación de sus grupos amino. La reactividad del resto de dibromopropionilo hacia los grupos amina primarios se controla mediante la temperatura de la reacción (McKenzie et al., Protein Chem. 7: 581-592 (1988)).
Los ejemplos preferidos no limitantes de reactivos heterobifuncionales con un resto de haluro de alquilo y un éster de p-nitrofenilo amino-reactivo incluyen el yodoacetato de p-nitrofenilo (NPIA).
Los expertos en la técnica conocen otros agentes de ligadura cruzada. Véase, por ejemplo, Pomato et al., patente de EE.UU. nº 5.965.106. Dentro de la capacidad de un experto en la técnica está elegir un agente de ligadura cruzada adecuado para una aplicación particular.
Grupos Ligadores Escindibles
En una realización adicional, el grupo ligador está provisto de un grupo que se puede escindir para liberar el grupo modificador del residuo de carbohidrato. Se conocen muchos grupos escindibles en la técnica. Véase, por ejemplo, Jung et al., Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983); Joshi et al., J. Biol. Chem. 265: 14518-14525 (1990); Zarling et al., J. Immunol. 124: 913-920 (1980); Bouizar et al., Eur. J. Biochem. 155: 141-147 (1986); Park et al., J. Biol. Chem. 261: 205-210 (1986); Browning et al., J. Immunol. 143: 1859-1867 (1989). Además, una amplia diversidad de grupos ligadores escindibles bifuncionales (tanto homo- como hetero-bifuncionales) están disponibles comercialmente de proveedores tales como Pierce.
Los restos escindibles ejemplares se pueden escindir mediante el uso de luz, calor o reactivos tales como tioles, hidroxilamina, bases, peryodato y similares. Además, ciertos grupos preferidos se escinden in vivo en respuesta a haber sido endocitados (p.ej., cis-aconitilo; véase, Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048 (1991)). Los grupos escindibles preferidos comprenden un resto escindible que es un miembro seleccionado del grupo que consiste en grupos disulfuro, éster, imida, carbonato, nitrobencilo, fenacilo y benzoína.
Conjugación de Carbohidratos Modificados a Péptidos
Los carbohidratos modificados se conjugan a un péptido glicosilado o sin glicosilar mediante el uso de una enzima adecuada para mediar en la conjugación. Preferiblemente, las concentraciones de el/los carbohidrato(s) donante(s) modificado(s), enzima(s) y péptido(s) aceptor(es) se seleccionan de tal manera que la glicosilación continúa hasta que se consume el aceptor. Las consideraciones discutidas más adelante, aunque se exponen en el contexto de una sialiltransferasa, son aplicables en general a otras reacciones de glicosiltransferasas.
Se conocen varios métodos de uso de glicosiltransferasas para sintetizar estructuras de oligosacáridos deseadas, y son aplicables en general a la presente invención. Los métodos ejemplares se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/32491, Ito et al., Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993), y en las pat. de EE.UU. nºs 5.352.670, 5.374.541, y 5.545.553.
La presente invención se pone en práctica mediante el uso de una única glicosiltransferasa o una combinación de glicosiltransferasas. Por ejemplo, se puede usar una combinación de una sialiltransferasa y una galactosiltransferasa. En las realizaciones que usan más de una enzima, las enzimas y sustratos se combinan preferiblemente en una mezcla de reacción inicial, o las enzimas y reactivos para una segunda reacción enzimática se añaden al medio de reacción una vez que la primera reacción enzimática se ha completado o casi se ha completado. Llevando a cabo dos reacciones enzimáticas secuencialmente en un único recipiente, los rendimientos globales mejoran respecto de los procedimientos en los que se aísla una especie intermedia. Además, se reduce la limpieza y eliminación de los disolventes y subproductos adicionales.
En una realización preferida, la primera y la segunda enzima son una glicosiltransferasa. En otra realización preferida, una enzima es una endoglicosidasa. En una realización preferida adicional, se usan más de dos enzimas para construir la glicoproteína modificada de la invención. Las enzimas se usan para alterar una estructura de sacárido en el péptido en cualquier punto antes o después de la adición del carbohidrato modificado al péptido.
En otra realización, el método utiliza una o más exo- o endoglicosidasas. La glicosidasa es generalmente un mutante, que se modifica para formar enlaces glicosilo en vez de escindirlos. La glicanasa mutante incluye en general una sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido ácido en el sitio activo. Por ejemplo, cuando la endoglicanasa es endo-H, los residuos del sitio activo sustituidos serán en general Asp en la posición 130, Glu en la posición 132 o una combinación de los mismos. Los aminoácidos se sustituyen en general con serina, alanina, asparagina, o glutamina.
La enzima mutante cataliza la reacción, normalmente mediante una etapa de síntesis que es análoga a la reacción inversa de la etapa de hidrólisis de la endoglicanasa. En estas realizaciones, la molécula donante de glicosilo (p.ej., una estructura de oligo- o mono-sacárido deseada) contiene un grupo saliente, y la reacción se desarrolla con la adición de la molécula donante en un residuo de GlcNAc de la proteína. Por ejemplo, el grupo saliente puede ser un halógeno, tal como fluoruro. En otras realizaciones, el grupo saliente es una Asn, o un resto Asn-péptido. En otras realizaciones adicionales, el residuo de GlcNAc de la molécula donante de glicosilo está modificado. Por ejemplo, el residuo de GlcNAc puede comprender un resto de 1,2-oxazolina.
En una realización preferida, cada una de las enzimas utilizadas para producir un conjugado de la invención están presentes en una cantidad catalítica. La cantidad catalítica de una enzima particular varía según la concentración del sustrato de esa enzima, así como según las condiciones de reacción, tales como la temperatura, el tiempo y el valor del pH. Los medios para determinar la cantidad catalítica para una enzima dada a concentraciones de sustrato y condiciones de reacción preseleccionadas son muy conocidos para los expertos en la técnica.
La temperatura a la que se lleva a cabo el proceso anterior puede oscilar desde justo por encima de la temperatura de congelación hasta la temperatura a la que la enzima más sensible se desnaturaliza. Los intervalos de temperatura preferidos son de alrededor de 0 °C a alrededor de 55 °C, y más preferiblemente alrededor de 20 °C a alrededor de 30 °C. En otra realización ejemplar, uno o más componentes del método presente se llevan a cabo a una temperatura elevada mediante el uso de la enzima termófila.
La mezcla de reacción se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que el aceptor se glicosile, por lo que se forma el conjugado deseado. Algunos de los conjugados se pueden detectar a menudo tras unas cuantas horas, con cantidades recuperables que se obtienen normalmente en 24 horas o menos. Los expertos en la técnica entienden que la velocidad de la reacción depende de varios factores variables (p.ej., la concentración de la enzima, la concentración del donante, la concentración del aceptor, la temperatura, el volumen del disolvente), que se optimizan para un sistema seleccionado.
La presente invención también prevé la producción a escala industrial de los péptidos modificados. Tal como se usa en la presente memoria, una escala industrial produce en general al menos alrededor de 250 mg, preferiblemente al menos alrededor de 500 mg, y más preferiblemente al menos alrededor de 1 gramo de conjugado purificado, acabado, preferiblemente tras un ciclo de reacción simple, es decir, el conjugado no es una combinación de los productos de reacción de ciclos de síntesis idénticos, repetidos de manera consecutiva.
En la discusión siguiente, la invención se ejemplifica mediante la conjugación de restos de ácido siálico modificados a un péptido glicosilado. El ácido siálico modificado ejemplar está marcado con m-PEG. El foco de la discusión siguiente en el uso de PEG-ácido siálico modificado y péptidos glicosilados es por motivos de claridad de ilustración, y no pretende implicar que la invención se limite a la conjugación de estas dos moléculas. Un experto entiende que la discusión es aplicable en general a las adiciones de restos de glicosilo modificados diferentes de ácido siálico. Además, la discusión es igualmente aplicable a la modificación de una unidad de glicosilo con agentes diferentes de m-PEG, que incluyen otros polímeros hidrosolubles, restos terapéuticos, y biomoléculas.
Se puede usar una aproximación enzimática para la introducción selectiva de carbohidratos m-PEG-ilado o m-PPGilado en un péptido o glicopéptido. El método utiliza carbohidratos modificados que contienen PEG, PPG, o un grupo funcional reactivo protegido, y se combina con la glicosiltransferasa o glicosintasa adecuada. Mediante la selección de la glicosiltransferasa que producirá la unión de carbohidrato deseada y la utilización del carbohidrato modificado como sustrato donante, el PEG o PPG se puede introducir directamente en el esqueleto del péptido, en residuos de carbohidrato existentes de un glicopéptido o en residuos de carbohidrato que se han añadido a un péptido.
Un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el péptido a modificar mediante los métodos de la presente invención en forma de una estructura que se da de manera natural o una colocada ahí de manera recombinante, enzimática o química. Los aceptores adecuados incluyen, por ejemplo, aceptores de galactosilo tales como Gal�1,4GlcNAc, Gal�1,4GalNAc, Gal�1,3GalNAc, lacto-N-tetraosa, Gal�1,3GlcNAc, GalNAc, Gal�1,3GalNAc, Gal�1,6GlcNAc, Gal�1,4Glc (lactosa), y otros aceptores conocidos para los expertos en la técnica (véase, p.ej., Paulson et al., J. Biol. Chem. 253: 5617-5624 (1978)).
En una realización, un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el glicopéptido a modificar tras la síntesis in vivo del glicopéptido. Tales glicopéptidos se pueden sialilar mediante el uso de los métodos reivindicados sin la modificación previa del patrón de glicosilación del glicopéptido. De manera alternativa, los métodos de la invención se pueden usar para sialilar un péptido que no incluye un aceptor adecuado; primero se modifica el péptido para que incluya un aceptor mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. En una realización ejemplar, se añade un residuo de GalNAc mediante la acción de una GalNAc transferasa.
En una realización ejemplar, el aceptor de galactosilo se construye uniendo un residuo de galactosa a un aceptor adecuado unido al péptido, p.ej., una GalNAc. El método incluye incubar el péptido a modificar con una mezcla de reacción que contiene una cantidad adecuada de una galactosiltransferasa (p.ej., Gal 1,3 o Gal�1,4), y un donante de galactosilo adecuado (p.ej., UDP-galactosa). La reacción se deja transcurrir sustancialmente hasta la finalización o, de manera alternativa, la reacción se finaliza cuando se añade una cantidad preseleccionada del residuo de galactosa. Otros métodos para construir un aceptor de sacárido seleccionado serán evidentes para los expertos en la técnica.
En otra realización, los oligosacáridos unidos a glicopéptidos se "recortan" primero, completamente o en parte, para exponer un aceptor para la sialiltransferasa o un resto en el que se pueden añadir uno o más residuos adecuados para obtener un aceptor adecuado. Las enzimas tales como glicosiltransferasas y endoglicosidasas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.716.812) son útiles para las reacciones de unión y de recorte.
En la discusión siguiente, el método de la invención se ejemplifica mediante el uso de carbohidratos modificados que tienen un polímero hidrosoluble unido a ellos. El foco de la discusión es por motivos de claridad de ilustración. Los expertos apreciarán que la discusión es igualmente relevante para aquellas realizaciones en las que el carbohidrato modificado alberga un resto terapéutico, biomolécula o similar.
En una realización ejemplar, un residuo de carbohidrato con unión en O se "recorta" antes de la adición del carbohidrato modificado. Por ejemplo, se recorta un residuo de GalNAc-Gal hasta GalNAc. Se conjuga un carbohidrato modificado que alberga un polímero hidrosoluble a uno o más de los residuos de carbohidrato expuestos por el "recorte". En un ejemplo, se "recorta" un glicopéptido y se añade un polímero hidrosoluble al aminoácido de cadena lateral con O o glicano de glicopéptido por medio de un resto de sacarilo, p.ej., resto de Sia, Gal, o GalNAc conjugado al polímero hidrosoluble. El resto de sacarilo modificado se une a un sitio aceptor del glicopéptido "recortado". De manera alternativa, se puede añadir un resto sacarilo sin modificar, p.ej., Gal, al extremo del glicano unido en O.
En otra realización ejemplar, se añade un polímero hidrosoluble a un residuo de GalNAc por medio de un carbohidrato modificado que tiene un resto de galactosa. De manera alternativa, se puede añadir una Gal sin modificar al residuo de GalNAc terminal.
En un ejemplo adicional, se añade un polímero hidrosoluble a un residuo de Gal mediante el uso de un ácido siálico modificado.
En otra realización ejemplar, se "recorta" un residuo de glicosilo con unión en O hasta el GalNAc unido al aminoácido. En un ejemplo, se añade un polímero hidrosoluble por medio de una Gal modificada con el polímero. De manera alternativa, se añade una Gal sin modificar a la GalNAc, seguido de una Gal con un polímero hidrosoluble unido. En otra realización, se añade uno o más residuos de Gal sin modificar a GalNAc, seguido de un resto de ácido siálico modificado con un polímero hidrosoluble.
5 Mediante el uso de los métodos de la invención, es posible "recortar" y construir un residuo de carbohidrato sustancialmente de cualquier estructura deseada. El carbohidrato modificado se puede añadir a los extremos del resto de carbohidrato como se expuso anteriormente, o se puede insertar entre el núcleo del péptido y el extremo del carbohidrato.
En una realización ejemplar, el polímero hidrosoluble se añade a un residuo de Gal terminal mediante el uso de un
10 ácido siálico modificado polimérico. Se usa una sialiltransferasa adecuada para añadir un ácido siálico modificado. La aproximación se resume en el Esquema 5.
Esquema 5
En una aproximación adicional, resumida en el Esquema 6, hay una función reactiva protegida en el ácido siálico. El
15 grupo reactivo protegido no se ve afectado preferiblemente por las condiciones usadas para unir el ácido siálico modificado al péptido. Tras la unión covalente del ácido siálico modificado al péptido, la protección se elimina y el péptido se conjuga con un agente tal como PEG, PPG, un resto terapéutico, biomolécula u otro agente. El agente se conjuga al péptido de una manera específica mediante su reacción con el grupo reactivo desprotegido en el residuo de carbohidrato modificado.
Esquema 6
Se puede usar cualquier carbohidrato modificado con su glicosiltransferasa adecuada, dependiendo de los carbohidratos terminales de las cadenas laterales del oligosacárido del glicopéptido (Tabla 2). Tal como se discutió anteriormente, el carbohidrato terminal del glicopéptido necesario para la introducción de la estructura PEG-ilada o PPGilada se puede introducir de manera natural durante la expresión, o se puede producir tras la expresión mediante el uso de la(s) glicosidasa(s) adecuada(s), glicosiltransferasa(s) o mezcla de glicosidasa(s) y glicosiltransferasa(s).
Tabla 2
- X = O, NH, S, CH2, N-(R1-5)2.
- Ligando de interés = acil-PEG, acil-PPG, alquil-PEG, acil-alquil-PEG,
- acil-alquil-PEG, carbamoil-PEG, carbamoil-PPG, PEG, PPG, acil-aril-
- Y = X; Z = X; A = X; B = X.
- PEG, acil-aril-PPG, aril-PEG, aril-PPG, Manosa-6-fosfato, heparina,
- heparano, SLex, Manosa, FGF, VFGF, proteína, condroitina, queratano,
- Q = H2, O, S, NH, N-R.
- dermatano, albúmina, integrinas, péptidos, etc.
- R, R1-4 = H, Ligador-M, M
- M = Ligando de interés
En otra realización ejemplar, se hace reaccionar UDP-galactosa-PEG con �1,4-galactosiltransferasa de leche de vaca, por lo que se transfiere la galactosa modificada a la estructura de N-acetilglucosamina terminal adecuada. Los
5 residuos de GlcNAc terminales del glucopéptido se pueden producir durante la expresión, como puede ocurrir en sistemas de expresión tales como los de mamíferos, insectos, vegetales u hongos, pero también se pueden producir mediante el tratamiento del glicopéptido con una sialidasa y/o glicosidasa y/o glicosiltransferasa, según sea necesario.
En otra realización ejemplar, se utiliza una GlcNAc transferasa, tal como GNT1-5, para transferir GlcN PEGilada a un
10 residuo de manosa terminal en un glicopéptido. En una realización ejemplar adicional, las estructuras de glicano con unión en N y/o O se eliminan enzimáticamente de un glicopéptido para exponer un residuo de aminoácido o un residuo de glicosilo terminal que se conjuga posteriormente con el carbohidrato modificado. Por ejemplo, se usa una endoglicanasa para eliminar las estructuras con unión en N de un glicopéptido para exponer una GlcNAc terminal, como una Asn unida en GlcNAc del glicopéptido. Se usa UDP-Gal-PEG y la galactosiltransferasa adecuada para
introducir la función PEG- o PPG-galactosa en la GlcNAc expuesta.
En una realización alternativa, el carbohidrato modificado se añade directamente al esqueleto del péptido mediante el uso de una glicosiltransferasa que se sabe que transfiere residuos de carbohidrato al esqueleto del péptido. Esta realización ejemplar se expone en el Esquema 7. Las glicosiltransferasas ejemplares útiles en la práctica de la pre5 sente invención incluyen, pero sin limitación, GalNAc transferasas (GalNAc T1-20), GlcNAc transferasas, fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, xilosiltransferasas, manosiltransferasas y similares. El uso de esta aproximación permite la adición directa de carbohidratos modificados a los péptidos que carecen de carbohidratos o, de manera alternativa, a los glicopéptidos existentes. En ambos casos, la adición del carbohidrato modificado se da en posiciones específicas en el esqueleto del péptido, tal como lo define la especificidad del sustrato de la glicosiltransferasa, y
10 no de una manera aleatoria como se da durante la modificación del esqueleto peptídico de una proteína mediante el uso de métodos químicos. Se puede introducir una serie de agentes en proteínas o glicopéptidos que carecen de la secuencia peptídica sustrato para la glicosiltransferasa modificando la secuencia de aminoácidos adecuada en la cadena del polipéptido.
Esquema 7
En cada una de las realizaciones ejemplares expuestas anteriormente, se pueden utilizar una o más etapas de modificación química o enzimática tras la conjugación del carbohidrato modificado al péptido. En una realización ejemplar, se usa una enzima (p.ej., fucosiltransferasa) para añadir una unidad de glicosilo (p.ej., fucosa) al carbohidrato modificado terminal unido al péptido. En otro ejemplo, se utiliza una reacción enzimática para "tapar" (p.ej., sialilar) 20 sitios en los que el carbohidrato modificado no pudo conjugarse. De manera alternativa, se utiliza una reacción química para alterar la estructura del carbohidrato modificado conjugado. Por ejemplo, el carbohidrato modificado conjugado se hace reaccionar con agentes que estabilizan o desestabilizan su unión con el componente peptídico al que está unido el carbohidrato modificado. En otro ejemplo, se desprotege un componente del carbohidrato modificado tras su conjugación al péptido. Un experto apreciará que existe una serie de procedimientos enzimáticos y químicos
25 que son útiles en los métodos de la invención en una etapa después de haber conjugado el carbohidrato modificado al péptido. La elaboración adicional del conjugado carbohidrato modificado-péptido está dentro del alcance de la invención.
Glicosiltransferasas
30 Las glicosiltransferasas catalizan la adición de carbohidratos activados (NDP-carbohidratos donantes) por etapas a una proteína, glicopéptido, lípido o glicolípido o al extremo no reductor de un oligosacárido en crecimiento. Los glicopéptidos con unión en N se sintetizan por medio de una transferasa y un donante de oligosacárido unido a un lípido Dol-PP-NAG2Glc3Man9 en una transferencia en bloque, seguido por el recorte del núcleo. En este caso, la naturaleza del sacárido del "núcleo" es algo diferente de las uniones posteriores. Se conoce en la técnica un gran número de
35 glicosiltransferasas.
La glicosiltransferasa a usar en la presente invención puede ser cualquiera con tal de que utilice el carbohidrato modificado como donante de carbohidrato. Los ejemplos de tales enzimas incluyen glicosiltransferasas de ruta de Leloir, tales como galactosiltransferasa, N-acetilglucosaminiltransferasa, N-acetilgalactosaminiltransferasa, fucosiltransferasa, sialiltransferasa, manosiltransferasa, xilosiltransferasa, glucurononiltransferasa y similares.
40 Para la síntesis enzimática de sacáridos que implican reacciones de glicosiltransferasa, la glicosiltransferasa se puede clonar o aislar de cualquier fuente. Se conocen muchas glicosiltransferasas clonadas, al igual que sus secuencias polinucleotídicas. Véase, p.ej., "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases" (http://www.vei.co.uk/TGN/gt guide.htm). Las secuencias de aminoácidos de las glicosiltransferasas y las secuencias nucleotídicas que codifican glicosiltransferasas de las que se pueden deducir las secuencias de aminoácidos tam
45 bién se hallan en diversas bases de datos disponibles públicamente, que incluyen GenBank, Swiss-Prot, EMBL, y otras.
Las glicosiltransferasas que se pueden emplear en los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación, galactosiltransferasas, fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, N-acetilgalactosaminiltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas, glucuroniltransferasas, sialiltransferasas, manosiltransferasas, ácido glucurónico transferasas, ácido galacturónico transferasas, y oligosacariltransferasas. Las glicosiltransferasas adecuadas incluyen las obtenidas de eucariotas, así como de procariotas.
El ADN que codifica las enzimas glicosiltransferasas se puede obtener mediante síntesis química, mediante el cribado de transcritos inversos de mARN de células adecuadas o de cultivos de líneas celulares, mediante el cribado de bibliotecas genómicas de células adecuadas, o mediante combinaciones de estos procedimientos. El cribado del mARN o ADN genómico se puede llevar a cabo con sondas oligonucleotídicas generadas a partir de la secuencia génica de las glicosiltransferasas. Las sondas se pueden marcar con un grupo detectable, tal como un grupo fluorescente, un átomo radiactivo o un grupo quimioluminiscente de acuerdo con procedimientos conocidos y usado en los ensayos de hibridación convencionales. Como alternativa, se pueden obtener secuencias génicas de glicosiltransferasas mediante el uso del procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y los cebadores oligonucleotídicos para la PCR se producen a partir de la secuencia génica de las glicosiltransferasas. Véase la pat. de EE.UU. nº 4.683.195 de Mullis et al. y la pat. de EE.UU. nº 4.683.202 de Mullis.
La enzima glicosiltransferasa se puede sintetizar en células hospedadoras transformadas con vectores que contienen el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa. Un vector es una construcción replicable de ADN. Los vectores se usan para amplificar el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa y/o para expresar el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa. Un vector de expresión es una construcción replicable de ADN en la que una secuencia de ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa está unida de forma operable a secuencias de control adecuadas capaces de llevar a cabo la expresión de la enzima glicosiltransferasa en un hospedador adecuado. La necesidad de tales secuencias de control variará dependiendo del hospedador seleccionado y del método de transformación elegido. En general, las secuencias de control incluyen un promotor transcripcional, una secuencia de un operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma adecuados para el mARN, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de amplificación no requieren la expresión de dominios de control. Todo lo necesario es la capacidad de replicarse en un hospedador, conferida normalmente mediante un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.
Fucosiltransferasas
En ciertas realizaciones, la glicosiltransferasa utilizada en el método de la invención es una fucosiltransferasa. Los expertos en la técnica conocen las fucosiltransferasas. Las fucosiltransferasas ejemplares incluyen enzimas que transfieren L-fucosa de GDP-fucosa a una posición de un grupo hidroxi en un carbohidrato aceptor. Las fucosiltransferasas que transfieren carbohidratos que no son de nucleótidos a un aceptor también son útiles en la presente invención.
En ciertas realizaciones, el carbohidrato aceptor es, por ejemplo, GlcNAc de un grupo Gal (1-3,4)GlcNAc� en un glicósido de un oligosacárido. Las fucosiltransferasas adecuadas para esta reacción incluyen la Gal�(1-3,4)GlcNAc�-a(1-3,4)fucosiltransferasa (FTIII E.C. Nº 2.4.1.65), que se caracterizó por primera vez a partir de la leche humana (véase, Palcic, et al., Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels, et al., J. Biol. Chem. 256: 10456-10463 (1981); y Nunez, et al., Can. J. Chem. 59: 2086-2095 (1981)) y las Gal (1-4)GlcNAc�-afucosiltransferasas (FTIV, FTV, FTVI) que se hallan en el suero humano. También se ha caracterizado FTVII (E.C. Nº 2.4.1.65), una sialil a(2-�)Gal�((1-3)GlcNAc� fucosiltransferasa. También se ha caracterizado una forma recombinante de la Gal�(1-3,4) GlcNAc�-a(1-3,4)fucosiltransferasa (véase, Dumas, et al., Bioorg. Med. Letters 1: 425-428 (1991) y Kukowska-Latallo, et al., Genes and Development 4: 1288-1303 (1990)). Otras fucosiltransferasas ejemplares incluyen, por ejemplo, a1,2 fucosiltransferasa (E.C. Nº 2.4.1.69). La fucosilación enzimática se puede llevar a cabo mediante los métodos descritos en Mollicone, et al., Eur. J. Biochem. 191: 169-176 (1990) o la patente de EE.UU. nº 5.374.655. Las células que se usan para producir una fucosiltransferasa también incluirán un sistema enzimático para sintetizar GDP-fucosa.
Galactosiltransferasas
En otro grupo de realizaciones, la glicosiltransferasa es una galactosiltransferasa. Las galactosiltransferasas ejemplares incluyen las a(1,3) galactosiltransferasas (E.C. Nº 2.4.1.151, véase, p.ej., Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993) y Yamamoto et al. Nature 345: 229-233 (1990), bovina (GenBank j04989, Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264: 14290-14297 (1989)), murina (GenBank m26925; Larsen et al., Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 86: 82278231 (1989)), porcina (GenBank L36152; Strahan et al., Immunogenetics 41: 101-105 (1995)). Otra a1,3 galactosiltransferasa adecuada es la que está implicada en la síntesis del antígeno del grupo sanguíneo B (EC 2.4.1.37, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265: 1146-1151 (1990) (humana)).
También son adecuadas para el uso en los métodos de la invención las (1,4) galactosiltransferasas, que incluyen, por ejemplo, EC 2.4.1.90 (LacNAc sintetasa) y EC 2.4.1.22 (lactosa sintetasa) (bovina (D'Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), humana (Masri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 657-663 (1988)), murina (Nakazawa et al., J. Biochem. 104: 165-168 (1988)), así como E.C. 2.4.1.38 y la ceramida galactosiltransferasa (EC 2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38: 234-242 (1994)). Otras galactosiltransferasas adecuadas incluyen, por ejemplo, a1,2 galactosiltransferasas (p.ej., de Schizosaccharomyces pombe, Chapell et al., Mol. Biol. Cell 5: 519528 (1994)).
5 Se conoce bien la producción de proteínas tales como la enzima GalNAc TI-XIV a partir de genes clonados mediante ingeniería genética. Véase, p.ej., la pat. de EE.UU. nº 4.761.371. Un método implica la recogida de muestras suficientes, y después se determina la secuencia de aminoácidos de la enzima mediante secuenciación N-terminal. Esta información se usa después para aislar un clon de cADN que codifica una transferasa de tamaño completo (asociada a la membrana) que tras la expresión en la línea celular de insecto Sf9 da como resultado la síntesis de una enzima
10 completamente activa. La especificidad por el aceptor de la enzima se determina después mediante el uso de un análisis semicuantitativo de los aminoácidos que rodean los sitios de glicosilación conocidos en 16 proteínas diferentes, seguido por estudios de glicosilación in vitro de péptidos sintéticos. Este trabajo ha demostrado que ciertos residuos de aminoácidos están muy representados en segmentos de péptidos glicosilados, y que los residuos en posiciones específicas que rodean los residuos de serina y treonina glicosilados pueden tener una influencia más
15 marcada sobre la eficacia del aceptor que otros restos de aminoácidos.
Sialiltransferasas
Las sialiltransferasas son otro tipo de glicosiltransferasas que son útiles en las células recombinantes y las mezclas de reacción de la invención. Las células que producen sialiltransferasas recombinantes producirán también CMPácido siálico, que es un donante de ácido siálico para las sialiltransferasas. Los ejemplos de sialiltransferasas que 20 son adecuadas para el uso en la presente invención incluyen ST3Gal III (p.ej., una ST3Gal III de rata o humana), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II, y ST6GalNAc III (la nomenclatura de sialiltransferasas usada en la presente memoria es como se describe en Tsuji et al., Glycobiology 6: v-xiv (1996)). Una a(2,3)sialiltransferasa ejemplar denominada a(2,3)sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) transfiere ácido siálico a la Gal terminal no reductora de un disacárido o glicósido de Gal 1-3Glc. Véase, Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 25 256: 3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982) y Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992). Otra a2,3-sialiltransferasa ejemplar (EC 2.4.99.4) transfiere ácido siálico a la Gal terminal no reductora del disacárido
- o glicósido. véase, Rearick et al., J. Biol. Chem. 254: 4444 (1979) y Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267: 21004 (1992). Las enzimas ejemplares adicionales incluyen Gal-�-1,4-GlcNAc a-2,6 sialiltransferasa (Véase, Kurosawa et al. Eur.
- J.
- Biochem. 219: 375-381 (1994)).
30 Preferiblemente, para la glicosilación de carbohidratos de glicopéptidos la sialiltransferasa será capaz de transferir ácido siálico a la secuencia Gal�1,4GlcNAc-, la penúltima secuencia más habitual que subyace detrás del ácido siálico terminal en las estructuras de carbohidratos completamente sialilados (véase la Tabla 3).
Tabla 3: Sialiltransferasas que usan la secuencia Gal11,4GlcNAc como sustrato aceptor
- Sialiltransferasa
- Fuente Secuencia(s) formadas Ref.
- ST6Gal I
- Mamífero NeuAca2,6Gal �1,4GlCNAc 1
- ST3Gal III
- Mamífero NeuAca2,3Gal �1,4GlCNAcNeuAca2,3Gal�1,3GlCNAc 1
- ST3Gal IV
- Mamífero NeuAca2,3Gal �1,4GlCNAcNeuAca2,3Gal�1,3GlCNAc 1
- ST6Gal II
- Mamífero NeuAca2,3Gal�1,4GlCNAc-
- ST6Gal II
- fotobacteria NeuAca2,3Gal �1,4GlCNAc 2
- S13Gal V
- N. meningitides N. gonorrhoeae NeuAca2,3Gal �1,4GlCNAc 3
1) Goochee et al., Bio/Technology 9: 1347-1355 (1991)
2) Yamamoto et al., J. Biochem. 120: 104-110 (1996)
3) Gilbert et al., J. Biol. Chem. 271: 28271-28276 (1996)
35 Un ejemplo de una sialiltransferasa que es útil en los métodos reivindicados es ST3Gal III, que también se denomina a(2,3)sialiltransferasa (EC 2.4.99.6). Esta enzima cataliza la transferencia de ácido siálico a la Gal de un glicósido Gal�1,3GlcNAc o Gal� 1,4GlcNAc (véase, p.ej., Wen et al., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden et al.,
J. Biol. Chem. 256: 3159 (1991)) y es responsable de la sialilación de oligosacáridos unidos a asparagina en glicopéptidos. El ácido siálico se une a una Gal con la formación de una unión a entre los dos sacáridos. El enlace (unión) entre los sacáridos es entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de Gal. Esta enzima particular se puede aislar a partir de hígado de rata (Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982)); se conocen secuencias de cADN humano (Sasaki et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa y Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394-1401) y genómicas (Kitagawa et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 931-938), que facilitan la producción de esta enzima mediante expresión recombinante. En una realización preferida, los métodos de sialilación reivindicados usan una ST3Gal III de rata.
Otras sialiltransferasas ejemplares útiles en la presente invención incluyen las aisladas a partir de Campylobacter jejuni, que incluyen la a(2,3). Véase, p.ej., el documento WO99/49051.
Otras sialiltransferasas diferentes de las enumeradas en la Tabla 3 también son útiles en un procedimiento a gran escala económico y eficaz de sialilación de glicopéptidos comercialmente importantes. Como ensayo simple para descubrir la utilidad de estas otras enzimas, se hacen reaccionar cantidades diversas de cada enzima (1-100 mU/mg de proteína) con asialo-a1 AGP (a 1-10 mg/ml) para comparar la capacidad de la sialiltransferasa de interés de sialilar glicopéptidos respecto de las sialiltransferasas bovinas ST6Gal I, ST3Gal III o ambas. De manera alternativa, se pueden usar otros glicopéptidos, u oligosacáridos con unión en N, liberados enzimáticamente del esqueleto peptídico en lugar de asialo-a1 AGP para esta determinación. Las sialiltransferasas con la capacidad de sialilar los oligosacáridos con unión en N de glicopéptidos de manera más eficaz que ST6Gal I son útiles en un procedimiento práctico a gran escala para la sialilación de péptidos (como se ilustra para ST3Gal III en esta descripción).
Otras glicosiltransferasas
Un experto en la técnica entenderá que se pueden sustituir otras glicosiltransferasas en ciclos de transferasa similares tal como se ha descrito con detalle para la sialiltransferasa. En particular, la glicosiltransferasa puede ser también, por ejemplo, glucosiltransferasa, p.ej., Alg8 (Stagljov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5977 (1994)) o Alg5 (Heesen et al., Eur. J. Biochem. 224: 71 (1994)).
Las N-acetilgalactosaminiltransferasas también son útiles en la práctica de la presente invención. Las N-acetilgalactosaminiltransferasas incluyen, pero sin limitación, a(1,3) N-acetilgalactosaminiltransferasa, �(1,4) N-acetilgalactosaminiltransferasas (Nagata et al., J. Biol. Chem. 267: 12082-12089 (1992) y Smith et al., J. Biol Chem. 269: 15162 (1994)) y polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasa (Homa et al., J. Biol. Chem. 268: 12609 (1993)). Las N-acetilglucosaminiltransferasas adecuadas incluyen GnTI (2.4.1.101, Hull et al., BBRC 176: 608 (1991)), GnTII, GnTIII (Ihara et al., J. Biochem. 113: 692 (1993)), GnTIV, y GnTV (Shoreiban et al., J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)), Nacetilglucosaminiltransferasa con unión en O (Bierhuizen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9326 (1992)), N-acetilglucosamin-1-fosfato transferasa (Rajput et al., Biochem J. 285: 985 (1992), e hialuronano sintasa.
Las manosiltransferasas son útiles para transferir restos de manosa modificados. Las manosiltransferasas adecuadas incluyen a(1,2) manosiltransferasa, a(1,3) manosiltransferasa, a(1,6) manosiltransferasa, �(1,4) manosiltransferasa, Dol-P-Man sintasa, OCh1, y Pmt1 (véase, Kornfeld et al., Annu. Rev. Biochem. 54: 631-664 (1985)).
Las xilosiltransferasas también son útiles en la presente invención. Véase, por ejemplo, Rodgers, et al., Biochem. J., 288:817-822 (1992); y Elbain, et al., patente de EE.UU. nº 6.168.937.
Otros ciclos de glicosiltransferasa adecuados se describen en Ichikawa et al., JACS 114: 9283 (1992), Wong et al., J. Org. Chem. 57: 4343 (1992), e Ichikawa et al. en CARBOHYDRATES AND CARBOHYDRATE POLYMERS. Yaltami, ed. (ATL Press, 1993).
Las glicosiltransferasas procarióticas son útiles también en la práctica de la invención. Tales glicosiltransferasas incluyen enzimas implicadas en la síntesis de lipooligosacáridos (LOS), que son producidos por muchas bacterias gramnegativas. Los LOS tienen generalmente secuencias de glicano terminales que imitan los glicoconjugados hallados en la superficie de las células epiteliales humanas o en secreciones del hospedador (Preston et al., Critical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180 (1996)). Tales enzimas incluyen, pero sin limitación, las proteínas de los operones rfa de especies tales como E. coli y Salmonella typhimurium, que incluyen una �1,6 galactosiltransferasa y una �1,3 galactosiltransferasa (véase, p.ej., los nºs de acceso de EMBL M80599 y M86935 (E. coil); Nº de acceso de EMBL S56361 (S. typhimurium)), una glucosiltransferasa (Nº de acceso de Swiss-Prot P25740 (E. coil), una �1,2glucosiltransferasa (rfaJ) (Nº de acceso de Swiss-Prot P27129 (E. coli) y Nº de acceso de Swiss-Prot P19817 (S. typhimurium)), y una �1,2-N-acetilglucosaminiltransferasa (rfaK) (Nº de acceso de EMBL U00039 (E. coli). Otras glicosiltransferasas para las que se conocen las secuencias de aminoácidos incluyen las codificadas por operones tales como rfaB, que se han caracterizado en organismos tales como Klebsiella pneumoniae, E. coli, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica, Mycobacterium leprosum, y el operón rhl de Pseudomonas aeruginosa.
También están disponibles para el uso en la presente invención las glicosiltransferasas que están implicadas en la producción de estructuras que contienen lacto-N-neotetraosa, D-galactosil-�-1,4-N-acetil-D-glucosaminil-�-1,3-Dgalactosil-�-1,4-D-glucosa, y la secuencia de trisacárido de grupo sanguíneo Pk, D-galactosil-a-1,4-D-galactosil-�1,4-D-glucosa, que se han identificado en los LOS de los patógenos mucosos de Neisseria gonnorhoeae y N. meningitidis (Scholten et al., J. Med. Microbiol. 41: 236-243 (1994)). Los genes de N. meningitidis y N. gonorrhoeae que codifican las glicosiltransferasas implicadas en la biosíntesis de estas estructuras se han identificado a partir de los inmunotipos de N. meningitidis L3 y L1 (Jennings et al., Mol. Microbiol. 18: 729-740 (1995)) y el mutante F62 de N. gonorrhoeae (Gotshlich, J. Exp. Med. 180: 2181-2190 (1994)). En N. meningitidis, un locus que consiste en tres genes, lgtA, lgtB e IgE, codifica las enzimas glicosiltransferasas necesarias para la adición de los tres últimos carbohidratos de la cadena de lacto-N-neotetraosa (Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271: 19166-73 (1996)). Recientemente, se ha demostrado la actividad enzimática del producto de los genes lgtB y lgtA, lo que proporciona la primera prueba directa de su función propuesta como glicosiltransferasa (Wakarchuk et al.,) J. Biol. Chem. 271(45): 28271276 (1996)). En N. gonorrhoeae, hay dos genes adicionales, lgtD que añade �-D-GalNAc en la posición 3 de la galactosa terminal de la estructura de lacto-N-neotetraosa y lgtC que añade una a-D-Gal terminal al elemento de lactosa de un LOS truncado, por lo que se crea así la estructura antigénica de grupo sanguíneo Pk (Gotshlich (1994), anteriormente mencionado). En N. meningitidis, un inmunotipo L1 distinto también expresa el antígeno de grupo sanguíneo Pk, y se ha demostrado que porta un gen lgtC (Jennings et al., (1995), anteriormente mencionado). Las glicosiltransferasas de Neisseria y los genes asociados también se describen en el documento USPN 5.545.553 (Gotschlich). Los genes para a1,2-fucosiltransferasa y a1,3-fucosiltransferasa de Helicobacter pilori también se han caracterizado (Martin et al., J. Biol. Chem. 272: 21349-21356 (1997)). También son útiles en la presente invención las glicosiltransferasas de Campylobacter jejuni (véase, por ejemplo, http://afmb.cnrsmrs.fr/~pedro/CAZY/gtf_42.html).
Sulfotransferasas
La invención también proporciona métodos para producir péptidos que incluyen moléculas sulfatadas, que incluyen, por ejemplo, polisacáridos sulfatados tales como heparina, sulfato de heparano, carragenano, y compuestos relacionados. Las sulfotransferasas adecuadas incluyen, por ejemplo, condroitina-6-sulfotransferasa (cADN de gallina descrito por Fukuta et al., J. Biol. Chem. 270: 18575-18580 (1995); Nº de acceso de GenBank D49915), glicosaminoglicano N-acetilglucosamina N-desacetilasa/N-sulfotransferasa 1 (Dixon et al., Genomics 26: 239-241 (1995); UL18918), y glicosaminoglicano N-acetilglucosamina N-desacetilasa/N-sulfotransferasa 2 (cADN murino descrito en Orellana et al., J. Biol. Chem. 269: 2270-2276 (1994) y Eriksson et al., J. Biol. Chem. 269: 10438-10443 (1994); cADN humano descrito en el Nº de acceso de GenBank U2304).
Glicosiltransferasas Asociadas a Células
En otra realización, las enzimas utilizadas en el método de la invención son glicosiltransferasas asociadas a células. Aunque se conocen muchas glicosiltransferasas solubles (véase, por ejemplo, la pat. de EE.UU. nº 5.032.519), las glicosiltransferasas generalmente están en forma asociada a membranas cuando están asociadas a células. Muchas de las enzimas asociadas a membranas estudiadas hasta ahora se consideran proteínas intrínsecas; es decir, no se liberan de las membranas mediante sonicación, y requieren detergentes para su solubilización. Se han identificado glicosiltransferasas de superficie en las superficies de las células de vertebrados e invertebrados, y también se ha reconocido que estas transferasas superficiales mantienen la actividad catalítica en condiciones fisiológicas. Sin embargo, la función más reconocida de las glicosiltransferasas de la superficie celular es el reconocimiento intercelular (Roth, MOLECULAR APPROACHES TO SUPRACELLULAR PHENOMENA, 1990).
Se han desarrollado métodos para alterar las glicosiltransferasas expresadas por las células. Por ejemplo, Larsen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 8227-8231 (1989), informa de una aproximación genética para aislar secuencias de cADN clonadas que determinan la expresión de estructuras de oligosacáridos de la superficie celular y sus glicosiltransferasas afines. Una biblioteca de cADN generada a partir de mARN aislado de una línea celular murina que se sabe que expresa UDP-galactosa:. �.-D-galactosil-1,4-N-acetil-D-glucosaminida a-1,3-galactosiltransferasa se transfectó en células COS-1. Las células transfectadas se cultivaron después y se ensayó la actividad de a 1-3 galactosiltransferasa.
Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2713-2717 (1992), describe un método de anclaje de �-lactamasa en la superficie externa de Escherichia coli. Se produce una fusión tripartita que consiste en (i) una secuencia señal de una proteína de la membrana externa, (ii) una sección que cruza la membrana de una proteína de la membrana externa, y (iii) una secuencia de �-lactamasa madura completa, lo que da como resultado una molécula de -lactamasa activa asociada a la superficie. Sin embargo, el método de Francisco se limita solamente a sistemas de células procarióticas y, como reconocieron los autores, requiere la fusión tripartita completa para un funcionamiento adecuado.
Proteínas de Fusión
En otras realizaciones ejemplares, los métodos de la invención utilizan proteínas de fusión que pueden tener más de una actividad enzimática que está implicada en la síntesis de un conjugado de glicopéptido deseado. Los polipéptidos de fusión pueden estar compuestos, por ejemplo, de un dominio catalíticamente activo de una glicosiltransferasa que se une a un dominio catalíticamente activo de una enzima accesoria. El dominio catalítico de la enzima accesoria puede catalizar, por ejemplo, una etapa de la formación de un carbohidrato de nucleótido que es un donante para la glicosiltransferasa, o puede catalizar una reacción implicada en un ciclo de la glicosiltransferasa. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una glicosiltransferasa se puede unir, en el marco de lectura, a un polinucleótido que codifica una enzima implicada en la síntesis de carbohidratos de nucleótidos. La proteína de fusión resultante puede catalizar entonces no solamente la síntesis del carbohidrato de nucleótido, sino también la transferencia del resto de carbohidrato a la molécula aceptora. La proteína de fusión puede ser dos o más enzimas cíclicas unidas en una secuencia nucleotídica expresable. En otras realizaciones, la proteína de fusión incluye los dominios catalíticamente activos de dos o más glicosiltransferasas. Véase, por ejemplo, el documento 5.641.668. Los glicopéptidos modificados de la presente invención se pueden diseñar y fabricar fácilmente mediante la utilización de diversas proteínas de fusión adecuadas (véase, por ejemplo, la solicitud de patente PCT/CA98/01180, que se publicó como el documento WO 99/31224 el 24 de junio de 1999).
Enzimas Inmovilizadas
Además de las enzimas asociadas a células, la presente invención también prevé el uso de enzimas que están inmovilizadas en un soporte sólido y/o soluble. En una realización ejemplar, se proporciona una glicosiltransferasa que está conjugada a un PEG por medio de un ligador de glicosilo intacto según los métodos de la invención. El conjugado PEG-ligador-enzima está unido opcionalmente a un soporte sólido. El uso de enzimas en soportes sólidos en los métodos de la invención simplifica el tratamiento de la mezcla de reacción y la purificación del producto de la reacción, y también posibilita la recuperación sencilla de la enzima. El conjugado de glicosiltransferasa se utiliza en los métodos de la invención. Otras combinaciones de enzimas y soportes serán evidentes para los expertos en la técnica.
También se ha llevado a cabo la glicosilación de una hormona del crecimiento humana mutante de manera intracelular por medios recombinantes. Una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende al menos un sitio de glicosilación con unión en N u O recién introducido, se puede transfectar en una línea celular hospedadora adecuada, p.ej., una línea celular eucariótica derivada de levadura, insecto,
o mamífero. La hormona del crecimiento humana mutante producida de manera recombinante de tal línea celular se glicosila mediante la maquinaria de glicosilación de la célula hospedadora.
La hormona del crecimiento humana glicosilada producida mediante los procedimientos anteriores preferiblemente se purifica antes del uso. Se pueden usar técnicas habituales muy conocidas, tales como cromatografía en capa fina
- o gruesa, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico, o filtración en membrana. Se prefiere el uso de la filtración en membrana, más preferiblemente con la utilización de una membrana osmótica inversa, o una o más técnicas cromatográficas en columna para la recuperación, tal como se discute más adelante en la presente memoria y en la bibliografía citada en el presente documento.
Si la hormona del crecimiento humana mutante glicosilada se produce de manera intracelular, como primera etapa, se eliminan los restos particulados, células hospedadoras o fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración; opcionalmente, la proteína se puede concentrar con un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, seguido de la separación de la variante de polipéptido de otras impurezas mediante una
- o más etapas seleccionadas de cromatografía de inmunoafinidad, fraccionamiento en columna de intercambio iónico (p.ej., con dietilaminoetilo (DEAE) o matrices que contienen grupos carboximetilo o sulfopropilo), cromatografía con Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lectina de lenteja-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Éter Toyopearl, Butil Toyopearl, Fenil Toyopearl, SP-Sepharose, o proteína A Sefarosa, cromatografía SDS-PAGE, cromatografía con sílice, cromatoenfoque, HPLC de fase inversa (p.ej., gel de sílice con grupos alifáticos unidos), filtración en gel mediante el uso, p.ej., de tamices moleculares de Sephadex o cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía en columnas que unen de manera selectiva el polipéptido, y precipitación con etanol
- o sulfato amónico.
Una hormona del crecimiento humana mutante glicosilada producida en cultivo se aísla normalmente mediante una extracción inicial de las células, lisado celular, medio de cultivo, etc., seguido de una o más etapas de concentración, precipitación a concentración salina elevada, intercambio iónico acuoso, o cromatografía de exclusión por tamaño. Además, la glicoproteína se puede purificar mediante cromatografía de afinidad. Finalmente, se puede emplear una HPLC para las etapas finales de purificación.
Se puede incluir un inhibidor de proteasas, p.ej., fluoruro de metilsulfonilo (PMSF) en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis, y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes casuales.
En ciertos casos, los sobrenadantes de los sistemas que producen la hormona del crecimiento humana glicosilada de la invención se concentran primero mediante el uso de un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender un ligando para el péptido, una lectina o una molécula de anticuerpo unida a un soporte adecuado. De manera alternativa, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos de DEAE que penden de ella. Las matrices adecuadas incluyen acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa, u otros tipos empleados habitualmente en la purificación de proteínas. Además, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren en particular los grupos sulfopropilo.
Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de RP-HPLC que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos, p.ej., gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos pendientes, para purificar adicionalmente una hormona del crecimiento humana mutante glicosilada. También se pueden utilizar algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una glicoproteína.
La hormona del crecimiento humana mutante glicosilada de la invención que resulta de una fermentación a gran escala se puede purificar mediante métodos análogos a los descritos por Urdal et al., J. Chromatog. 296: 171 (1984). Esta referencia describe dos etapas de RP-HPLC secuenciales para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa. De manera alternativa, se pueden utilizar técnicas tales como la cromatografía de afinidad para purificar la glicoproteína.
Ensayos Funcionales para la hGH Mutante
Tras la producción y, preferiblemente, la purificación de una hormona del crecimiento humana mutante glicosilada, se ensayan las funciones biológicas de la glicoproteína mediante el uso de varios métodos conocidos en la técnica. Los ensayos funcionales se basan en las diversas características de la hormona del crecimiento humana, tales como su unión específica al receptor de la hormona del crecimiento humana, la activación del receptor de hGH, y su actividad en la estimulación del crecimiento celular. En cada ensayo, la hormona del crecimiento humana de tipo natural se incluye como un control positivo.
Se puede llevar a cabo un ensayo de unión a un radiorreceptor para medir la unión entre un receptor de hGH radiomarcado y una hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención. Se puede hallar una descripción detallada de tal ensayo en la bibliografía, p.ej., Tsushima et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 37: 334-337 (1973); Chin et al., Endocr. Meta. 37: 334 (1973); y las patentes de EE.UU. nºs 4.871.835, 5.079.230.
La capacidad de una hormona del crecimiento humana mutante de estimular el crecimiento celular se determina mediante métodos tales como el ensayo de tibia (Parlow et al., Endocrinology 77: 1126 (1965); patente de EE.UU. nº 4.871.835). Brevemente, se extrae la hipófisis de ratas de 28-30 días de edad y se mantienen durante 10-14 días sin tratamiento. Después se administran a las ratas los mutantes de la hormona del crecimiento humana derivados de una fuente recombinante mediante inyecciones subcutáneas diarias. Los animales se sacrifican en el sexto día, se extraen los huesos de la rodilla de las patas delanteras y se mide la anchura de las placas epifisarias. También se monitoriza el peso de estas ratas al inicio del experimento y antes de ser sacrificadas, y se compara entre los diferentes grupos que recibieron inyecciones diarias de la hormona del crecimiento humana mutante a concentraciones diferentes.
Además, se puede demostrar la actividad biológica de una hormona del crecimiento humana mutante por su capacidad de provocar la fosforilación de tirosinas dependiente de la hGH en células IM-9, que proceden de un clon de linfoblastoma humano y que expresan el receptor de la hormona del crecimiento humana en la superficie celular. También pueden ser adecuados otros tipos de células, tales como las células MB-2 para los ensayos funcionales de hGH. El nivel de fosforilación de tirosinas de las proteínas celulares tras la exposición a la hormona del crecimiento humana mutante se demuestra mediante un anticuerpo monoclonal hacia la tirosina fosforilada, tal como describió Silva et al., Endocrinology, 132: 101 (1993) y la patente de EE.UU. nº 6.238.915.
Composición Farmacéutica y Administración
La hormona del crecimiento humana mutante glicosilada que tiene los determinantes de oligosacáridos deseados descrita anteriormente se puede usar como agente terapéutico para el tratamiento de una diversidad de enfermedades y afecciones relacionadas con una deficiencia de la hormona del crecimiento. Las afecciones relacionadas con el crecimiento que se pueden tratar con la hormona del crecimiento humana mutante de la presente invención incluyen: enanismo, estatura corta en niños y adultos, caquexia/debilidad muscular, atrofia muscular general, y anormalidad cromosómica sexual (p.ej., síndrome de Turner). Otras afecciones que se pueden tratar mediante el uso de la hGH mutante de la presente invención incluyen: síndrome de intestino corto, lipodistrofia, osteoporosis, uremia, quemaduras, infertilidad femenina, regeneración ósea, diabetes general, diabetes tipo II, osteo-artritis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), e insomnio. La hGH mutante de la invención se puede usar también para estimular diversos procesos de cicatrización, p.ej., regeneración de tejido general, regeneración ósea, y cicatrización de heridas, o como un adyuvante de vacuna. Así, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de la hormona del crecimiento humana mutante glicosilada, que se produce según los métodos descritos anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para el uso en una diversidad de sistemas de administración de fármacos. Las formulaciones adecuadas para el uso de la presente invención se hallan en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, PA, 17ª ed. (1985). Para una revisión breve de los métodos para la administración de fármacos, véase, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).
5 Las composiciones farmacéuticas están destinadas a la administración parenteral, intranasal, tópica, oral, o local, tal como mediante inyección subcutánea, inhalación de aerosol, o adsorción transdérmica, para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Normalmente, las composiciones farmacéuticas se administran de manera parenteral, p.ej., de manera subcutánea o intravenosa. Así, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden la hormona del crecimiento humana mutante glicosilada disuelta o suspendida en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso, p.ej., agua, agua tamponada, solución salina, PBS y similares. Las composiciones también pueden contener detergentes tales como Tween 20 y Tween 80; estabilizantes tales como manitol, sorbitol, sacarosa, y trehalosa; y conservantes tales como EDTA y m-cresol. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y agentes tamponadores, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes
15 humectantes, detergentes y similares.
Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales, o se pueden filtrar de manera estéril. Las disoluciones acuosas resultantes se pueden envasar para su uso tal como están, o liofizadas, y la preparación liofilizada se combina con un vehículo acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones será en general de entre 3 y 11, más preferiblemente de 5 a 9, y lo más preferiblemente de 7 y 8.
Las composiciones que contienen la hormona del crecimiento humana mutante glicosilada se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya padece una enfermedad o afección relacionada con la deficiencia de la hormona del crecimiento, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las
25 cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad o afección y del peso y estado general del paciente, pero generalmente oscilan de alrededor de 0,1 mg a alrededor de 2.000 mg de hormona del crecimiento humana mutante glicosilada por día para un paciente de 70 kg, y se usan más frecuentemente las dosis de alrededor de 5 mg a alrededor de 200 mg de los compuestos por día.
En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen la hormona del crecimiento humana mutante glicosilada de la invención se administran a un paciente susceptible a, o que de otro modo tiene riesgo de desarrollar, una enfermedad particular. Tal cantidad se define como una "dosis profilácticamente eficaz". En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud del paciente y del peso, pero generalmente oscilan de alrededor de 0,1 mg a alrededor de 1,000 mg por paciente de 70 kilogramos, más habitualmente de alrededor de 5 mg a alrededor de 200 mg por 70 kg de peso corporal.
35 Se pueden llevar a cabo administraciones simples o múltiples de las composiciones con niveles y patrones de dosis seleccionados por el médico que aplica el tratamiento. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deberían proporcionar una cantidad de la hormona del crecimiento humana mutante glicosilada de esta invención suficiente para tratar de manera eficaz al paciente.
Los ejemplos siguientes se proporcionan a modo de ilustración únicamente, y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros que no son críticos que se podrían cambiar o modificar para producir resultados esencialmente similares.
Ejemplo 1
La hormona del crecimiento humana se da en una diversidad de diferentes isoformas y diferentes secuencias de aminoácidos. Las dos formas mejor caracterizadas incluyen la hGH derivada de placenta, que también se conoce
45 como GH-V (PDB P01242) y la hGH derivada de hipófisis, que también se conoce como somatotropina o GH-N (P01241); véase la Figura 1. La hGH derivada de hipófisis no está glicosilada, y se produce en Escherichia coli como un compuesto terapéutico. La hGH derivada de placenta (GH-V) tiene un sitio de glicosilación en N en el aminoácido 140 (véase la Tabla 4 y la FIG. 1, véase la flecha).
Tabla 4. Hormona del Crecimiento Humana (GH-V), derivada de placenta; P01242 (SEQ ID Nº:2)
La hGH derivada de hipófisis (GH-N) se puede modificar en la posición del aminoácido 140 para introducir un sitio de glicosilación con unión en N mutando la secuencia nucleotídica que codifica este polipéptido de manera que en vez de que codificar la lisina de tipo natural (abreviada como "k" en el aminoácido 140 de la secuencia polipeptídica de GH-N de la Tabla 5 y la FIG. 1, véase la flecha), la secuencia nucleotídica codificará una asparagina (abreviada "n") en la posición del aminoácido 140 de GH-N (véase también la FIG. 2).
Tabla 5. Hormona del Crecimiento Humana (GH-N), derivada de hipófisis; P01241 (SEQ ID Nº:1)
5 Esta hGH mutada derivada de hipófisis, independientemente del sistema de expresión utilizado para producir este polipéptido, se puede glicosilar después o glicoconjugar (véase el documento WO 03/31464, incorporado en la presente memoria como referencia). Preferiblemente, la hGH mutada derivada de hipófisis se glicoPEGila, en donde un resto de polietilen glicol (PEG) se conjuga al polipéptido de la hGH mutada derivada de hipófisis por medio de una unión glicosilo (véase el documento WO 03/31464, incorporado en la presente memoria como referencia). LA FIG. 3
10 describe la GlicoPEGilación de un mutante de hGH con glicano unido en N producido en células de insecto Sf9 o células de mamífero. Se espera que la glicoPEGilación de la hGH mutante derivada de hipófisis dé como resultado propiedades biofísicas mejoradas, que pueden incluir, pero sin limitación, una semivida mejorada, valores mejorados del área bajo la curva (ABC), una eliminación reducida, y una inmunogenicidad reducida.
Ejemplo 2
15 Una aproximación alternativa es crear un sitio de glicosilación con unión en O en el polipéptido de hGH derivada de hipófisis. Este sitio de glicosilación con unión en O se puede usar después como sitio en el que se puede glicoPEGilar el polipéptido de hGH mutada mediante el uso de una enzima GalNAcT2 o similar. Después se pueden usar una o más transferasas adicionales para añadir glicanos o glicoconjugados en ese sitio. Preferiblemente, el polipéptido de la hGH mutada derivada de hipófisis se glicoPEGila. La FIG. 4 describe la glicoPEGilación de un mu
20 tante de hGH con glicano unido en O producido en Escherichia coli.
Ejemplo 3
Tal como se identificó mediante la estructura cristalina de hGH y de su receptor, las regiones de giros de la proteína de la hGH derivada de hipófisis son las más adecuadas para que la mutación introduzca un sitio de glicosilación (FIG. 5). Específicamente, la secuencia nucleotídica que codifica los aminoácidos 1-6 (FPTIPL; SEQ ID Nº:10), ami
25 noácidos 48-52 (PQTSL; SEQ ID Nº:11), aminoácidos 59-64 (PTPSNR; SEQ ID Nº:12), aminoácidos 133-139 (PRTGQIF; SEQ ID Nº:13), aminoácidos 133-145 (PRTGQIFKQTYSK; SEQ ID Nº:14), o aminoácidos 139-142 (FKQT; SEQ ID Nº:15) de la secuencia de aminoácidos de hGH derivada de hipófisis de tipo natural (véase la Tabla 5 y la FIG. 1) se pueden mutar de manera que se introduzca un sitio de glicosilación con unión en N o con unión en O en el polipéptido de la hGH mutada derivada de hipófisis resultante.
30 La FIG. 6 ilustra seis (6) de estos sitios de glicosilación con unión en O introducidos. Las flechas de la Figura 6 representan cada una el residuo de treonina en el que se dará la glicosilación con unión en O en el mutante de hGH GH-N con glicano unido en O.
Las FIG. 7 y FIG. 8 ilustran cada una dos mutantes de hGH GH-N con glicano unido en O.
Ejemplo 4
35 Este ejemplo describe mutaciones de la secuencia de aminoácidos que introducen sitios de glicosilación con unión en O, es decir, residuos de serina o treonina, en un sitio que contiene preferiblemente prolina de una secuencia de la hormona del crecimiento humana de tipo natural o cualquier versión modificada de la misma.
1. Mutaciones N-terminales
En los mutantes N-terminales, el extremo N-terminal de una hGH de tipo natural, FP2TIP5LS; SEQ ID Nº:16, se sus40 tituye con MXnTP2TIP5LS o MAPTSSXnP2TIP5LS. Los ejemplos preferidos incluyen:
MVTPTIPLS; SEQ ID Nº:17
MQTPTIPLS; SEQ ID Nº:18
MAPTSSPTIPLS; SEQ ID Nº:19
MAPTSSSPTIPLS (extremo N-terminal de IL-2); SEQ ID Nº:20
45 MPTTFPTIPLS; SEQ ID Nº:21
MPTSSPTIPLS; SEQ ID Nº:22
MPTSSSPTIPLS; SEQ ID Nº:23
- 2.
- Sitio 1 de Mutación Interna En este tipo de mutantes, el extremo N-terminal de una hGH de tipo natural, FP2TIP5LS; SEQ ID Nº:24, se sustituye
con ZmP2T XnBoP5LS. Las mutaciones preferidas incluyen: MFPTQIPLS; SEQ ID Nº:25 MFPTSIPLS; SEQ ID Nº:26 MFPTSSPLS; SEQ ID Nº:27 MTPTQIPLS; SEQ ID Nº:28 MFPTTTPLS; SEQ ID Nº:29
- 3.
- Sitio 2 de Mutación Interna En este tipo de mutantes, la secuencia de aminoácidos que rodea a P37, AYIP37KEQKY; SEQ ID Nº:30, se sustituye con AZmJqP37OrXnBoLpY, en el que al menos uno de Z, J, O, X, y B se selecciona independientemente de Thr o
Ser; L puede incluir Lys (K) y X puede ser Asp (D). Los ejemplos preferidos incluyen: AYIP37TQGAY; SEQ ID Nº:31 AYIP37TSSSY; SEQ ID Nº:32 AQITP37TEQKY; SEQ ID Nº:33 AYIP37TEQSY; SEQ ID Nº:34
- 4.
- Sitio 3 de Mutación Interna En este tipo de mutantes, la secuencia de aminoácidos que rodea a P48, LQNP48QTSLC; SEQ ID Nº:35, se sustituye con LZmJqP48OrXnBoLC, en el que al menos uno de Z, J, O, y X se selecciona independientemente de Thr o Ser.
Los ejemplos preferidos incluyen: LQTP48QTSLC; SEQ ID Nº:36 LQNP48TTSLC; SEQ ID Nº:37
- 5.
- Sitio 4 de Mutación Interna En este tipo de mutantes, la secuencia de aminoácidos que rodea a P59, SESIP59TPNREET; SEQ ID Nº:38, se sustituye con SZmUsJqP59TPOrXnBoLrT, en el que al menos uno de Z, J, O, B, L, U, y X se selecciona independiente
mente de Thr o Ser; B, L, y Z pueden incluir aminoácidos cargados. Los ejemplos preferidos incluyen: SESTP59TPNREET; SEQ ID Nº:39 SSSTP59TPNREET; SEQ ID Nº:40 SESIP59TPNTEET; SEQ ID Nº:41 SESIP59TPNTQET; SEQ ID Nº:42 SESIP59TPTQGAT; SEQ ID Nº:43 SESIP59TPTESST; SEQ ID Nº:44 SQSTP59TPNREET; SEQ ID Nº:45 SQSTP59TPNQEET; SEQ ID Nº:46 SESTP59TPTSSST; SEQ ID Nº:47
- 6.
- Sitio 5 de Mutación Interna
En este tipo de mutantes, la secuencia de aminoácidos que rodea a P89, SWLEP89VQFLRS; SEQ ID Nº:48, se sustituye con SZmUsJqP89OrXnBoLrAtS, en el que al menos uno de Z, U, J, O, B, y X se selecciona independientemente de Thr o Ser; J y A pueden incluir aminoácidos cargados. Los ejemplos preferidos incluyen:
SWLEP89TQGLRS; SEQ ID Nº:49
SWLEP89TQGATS; SEQ ID Nº:50
SSQTP89VQFLRS; SEQ ID Nº:51
SWLEP89TSSLSS; SEQ ID Nº:52
SMVTP19VQFLRS; SEQ ID Nº:53
7. Sitio 6 de Mutación Interna En este tipo de mutantes, la secuencia de aminoácidos que rodea a P133, EDGSP133RTGQIF; SEQ ID Nº:54, se ha sustituido con EZmUsJqP133OrXnBoLrAtF, en el que al menos uno de Z, U, J, O, B, y X se selecciona independientemente de Thr o Ser. Los ejemplos preferidos incluyen: EDGSP133TTGQIF; SEQ ID Nº:55 EDGSP133NTGQIF; SEQ ID Nº:56 EDGSP133TQGQIF; SEQ ID Nº:57 EDGSP133TVGQIF; SEQ ID Nº:58 EDGSP133TTTQIF; SEQ ID Nº:59 EDGSP133TSSQIF; SEQ ID Nº:60 EDGSP133TTQGIF; SEQ ID Nº:61 EDGSP133QTGQIF; SEQ ID Nº:62 EDGTP133NTGQIF; SEQ ID Nº:63 EDQTP133NTGQIF; SEQ ID Nº:64
8. Sitio 7 de Mutación Interna En este tipo de mutantes, la secuencia de aminoácidos que rodea a P140, GQIFK140QTYS; SEQ ID Nº:65, se sustituye con GZmUsJqLr140OrXnBoS, en el que al menos uno de Z, U, J, O, B, y X se selecciona independientemente de Thr o Ser. Los ejemplos preferidos incluyen: GQIFN140QTYS; SEQ ID Nº:66 GQIFN140ITYS; SEQ ID Nº:67 GQIFP140QTSS; SEQ ID Nº:68 GQIFP140TTTS; SEQ ID Nº:69 GQITP140QTYS; SEQ ID Nº:70 GQIFT140QTYS; SEQ ID Nº:71 GQIST140QTYS; SEQ ID Nº:72 GQIPT140TTYS; SEQ ID Nº:73
9. Mutaciones C-terminales En este tipo de mutantes, la secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de una hGH de tipo natural, VEGSCG190F; SEQ ID Nº:74, se sustituye con VEGSCG190PXnBoZmUsP, en el que al menos uno de Z, U, B, y X se selecciona independientemente de Thr o Ser. Los ejemplos preferidos incluyen: VEGSCGPTTTP; SEQ ID Nº:75 VEGSCGPTSSP; SEQ ID Nº:76 VEGSCGPTQGAMP; SEQ ID Nº:77 VEGSCGPTTIP; SEQ ID Nº:78
VEGSCGPMVTP; SEQ ID Nº:79
En todos los casos anteriores, X, Z, B, L, J, U, O, y A se seleccionan independientemente de E (glutamato), cualquier aminoácido sin carga o combinación de dipéptidos que incluye M, F, MF, y similares; m, n, o, p, q, r, s, y t se seleccionan independientemente de números enteros de 0 a 3. En todos los casos, la Met N-terminal puede estar presente o ausente en cualquier mutante de hGH. La numeración de los residuos de aminoácidos se basa en la secuencia inicial sin modificar en la que el residuo más a la izquierda se numera como 1. La numeración de los aminoácidos sin modificar permanece sin cambios tras la modificación. Puede haber presentes más de una de las modificaciones de secuencias anteriormente descritas en un mutante de hGH de la presente invención.
<110> Neose Technologies, Inc.
DeFrees, Shawn
<120> Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento 5 humana.
<130> 0408WO
<150> US 60/469, 114
<151> 2003-05-09
<150> US 60/494, 751 10 <151> 2003-08-13
<150> US 60/495, 076
<151> 2003-08-14
<150> US 60/535,290
<151> 2004-01-08
<170> Patent In versión 3.2
<210> 1
<211> 191
<212> PRT 20 <213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA
<223> hormona del crecimiento humana madura (GH-N)
<400> 1
<210> 2
5 <211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA 10 <223> hormona del crecimiento humana madura (GH-V)
<400> 2
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo, sapiens
<220> 10 <221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA
<223> hormona del crecimiento humana, mutante 1
<400> 3
<210> 4
<211> 194
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA
<223> hormona del crecimiento humana, mutante 2 (unida mediante O, terminada en N))
<400> 4
<210> 5
5 <211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA 10 <223> hormona del crecimiento humana, mutante 3
<400> 5
<210> 6
5 <211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA 10 <223> hormona del crecimiento humana, mutante 4 (unida mediante O, terminada en N)
<400> 6
<210> 7
5 <211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA 10 <223> hormona del crecimiento humana, mutante 5
<400> 7
<210> 8
5 <211> 192
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA 10 <223> hormona del crecimiento humana, mutante 6
<400> 8
<210> 9
<211> 192
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CARACTER�?STICA MISCEL�?NEA
<223> hormona del crecimiento humana, mutante 7
<400> 9
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11 10 <211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes con N terminal
<400> 17
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes con N terminal
<400> 18
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes con N terminal
<400> 19
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes con N terminal
<400> 20
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes con N terminal
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes con N terminal
<400> 22 <210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes con N terminal
<400> 23
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 25
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 26
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 27
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 28
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 29
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 31
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 32
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 33
5 <210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> mutantes
<400> 34
<210> 35
<211> 9 15 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36 20 <211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
25 <400> 36
<210> 37
<211> 9
<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 37
35 <210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 39
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 40
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 41
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 42
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 43
5 <210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> mutantes
<400> 44
<210> 45
<211> 12 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 45
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
25 <220>
<223> mutantes
<400> 46
<210> 47 30 <211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
35 <400> 47
<210> 48
<211> 11
<212> PRT 40 <213> Homo sapiens
<400> 48
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 49
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 50
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 51
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 52
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 53
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 55
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 56
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 57
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 58
5 <210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> mutantes
<400> 59
<210> 60
<211> 11 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 60
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
25 <220>
<223> mutantes
<400> 61
<210> 62 30 <211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
35 <400> 62
<210> 63
<211> 11
<212> PRT 40 <213> Secuencia Artificial <220>
<223> mutantes z00> 63
5 <210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 10 <223> mutantes
<400> 64
<210> 65
<211> 9 15 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
<210> 66 20 <211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
25 <400> 66
<210> 67
<211> 9
<212> PRT 30 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 67
35 <210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 40 <223> mutantes
<400> 68
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 69
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 70
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 71
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 72
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 73
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
<210> 75 10 <211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
15 <400> 75
<210> 76
<211> 11
<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 76
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 30 <223> mutantes
<400> 77
<210> 78
<211> 11 35 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 78
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> mutantes
<400> 79
Claims (18)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante, en el que la hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15.
-
- 2.
- Un casete de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.
-
- 3.
- Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.
-
- 4.
- Una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15.
-
- 5.
- La hormona del crecimiento humana mutante de la reivindicación 4, que comprende un polímero hidrosoluble unido a dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido por medio de un ligador de glicosilo, en el que dicho ligador de glicosilo es un ligador de glicosilo intacto.
-
- 6.
- La hormona del crecimiento humana mutante de la reivindicación 4 ó 5 para el uso como un medicamento.
-
- 7.
- Un método para producir una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15, que comprende las etapas de:
- (a)
- producir de manera recombinante la hormona del crecimiento humana mutante; y
- (b)
- glicosilar la hormona del crecimiento humana mutante en el sitio de glicosilación recién introducido.
-
- 8.
- El método de la reivindicación 7, en el que la hormona del crecimiento humana mutante comprende más de un sitio de glicosilación recién introducido.
-
- 9.
- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una hormona del crecimiento humana mutante según la reivindicación 4 ó 5.
-
- 10.
- El uso de una hormona del crecimiento humana mutante, en el que la hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una deficiencia de la hormona del crecimiento humana en un paciente, en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15.
-
- 11.
- Un método para producir un glicoconjugado de una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15, que comprende las etapas de:
- (a)
- producir de manera recombinante la hormona del crecimiento humana mutante, y
- (b)
- glicosilar enzimáticamente la hormona del crecimiento humana mutante con un carbohidrato modificado en el sitio de glicosilación recién introducido.
-
- 12.
- El método de la reivindicación 11, en el que el carbohidrato modificado se modifica con un miembro seleccionado de poli(etilen glicol) y m-poli(etilen glicol).
-
- 13.
- El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, el método de la reivindicación 7 ó 8, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10, o el método de la
reivindicación 11 ó 12, en los que la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 o SEQ ID Nº: 2. -
- 14.
- El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, el mé
todo de la reivindicación 7 ó 8, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10 o el método de la 5 reivindicación 11 ó 12, en los que el sitio de glicosilación recién introducido está cerca de un residuo de prolina. - 15. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, el método de la reivindicación 7 ó 8, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10 o el método de la reivindicación 11 ó 12, en los que el sitio de glicosilación recién introducido está cerca de un residuo de prolina que está localizado en la posición 2, 5, 133 ó 140 de SEQ ID Nº: 1 o SEQ ID NO:2.10 16. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, el método de la reivindicación 7 ó 8, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10, o el método de la reivindicación 11 ó 12, en los que la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.
- 17. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, la15 composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10 o el método de la reivindicación 11 ó 12, en los que la hormona del crecimiento humana mutante comprende más de un sitio de glicosilación recién introducido.
-
- 18.
- Un péptido de hGH codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1.
-
- 19.
- La hormona del crecimiento humana mutante de la reivindicación 4 ó 5 para el uso en el tratamiento de una deficiencia de la hormona del crecimiento humana en un paciente.
hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraConsensohGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraConsensohGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraConsensohGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraConsenso hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 madurahGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 madurahGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 madurahGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraFig 8
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US46911403P | 2003-05-09 | 2003-05-09 | |
US469114P | 2003-05-09 | ||
US49475103P | 2003-08-13 | 2003-08-13 | |
US494751P | 2003-08-13 | ||
US49507603P | 2003-08-14 | 2003-08-14 | |
US495076P | 2003-08-14 | ||
US53529004P | 2004-01-08 | 2004-01-08 | |
US535290P | 2004-01-08 | ||
PCT/US2004/014254 WO2004103275A2 (en) | 2003-05-09 | 2004-05-07 | Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2380093T3 true ES2380093T3 (es) | 2012-05-08 |
Family
ID=33479814
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04751591T Expired - Lifetime ES2380093T3 (es) | 2003-05-09 | 2004-05-07 | Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7932364B2 (es) |
EP (1) | EP1624847B1 (es) |
JP (1) | JP2007523630A (es) |
KR (1) | KR20060030023A (es) |
AT (1) | ATE540055T1 (es) |
AU (1) | AU2004240553A1 (es) |
BR (1) | BRPI0410164A (es) |
CA (1) | CA2524936A1 (es) |
ES (1) | ES2380093T3 (es) |
MX (1) | MXPA05011832A (es) |
WO (1) | WO2004103275A2 (es) |
Families Citing this family (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6639050B1 (en) | 1997-07-21 | 2003-10-28 | Ohio University | Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins |
US7378506B2 (en) | 1997-07-21 | 2008-05-27 | Ohio University | Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins |
US8008252B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
US7795210B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
WO2004099231A2 (en) * | 2003-04-09 | 2004-11-18 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7696163B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7214660B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
MXPA04012496A (es) | 2002-06-21 | 2005-09-12 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Glicoformos del factor vii pegilados. |
BRPI0408358A (pt) | 2003-03-14 | 2006-03-21 | Neose Technologies Inc | polìmeros hidrossolúveis ramificados e seus conjugados |
US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
AU2004240553A1 (en) | 2003-05-09 | 2004-12-02 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants |
WO2005012484A2 (en) * | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
US20100069264A1 (en) * | 2003-08-27 | 2010-03-18 | Gil Sharon | Libraries of recombinant chimeric proteins |
US20070254834A1 (en) * | 2003-11-24 | 2007-11-01 | Defrees Shawn | Glycopegylated Erythropoietin |
US8633157B2 (en) * | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US20080305992A1 (en) * | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US7842661B2 (en) * | 2003-11-24 | 2010-11-30 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin formulations |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
EP1694274B1 (en) * | 2003-12-03 | 2013-04-24 | BioGeneriX AG | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
CA2552892C (en) * | 2004-01-08 | 2014-08-05 | Neose Technologies, Inc. | O-linked glycosylation of peptides |
CA2553257A1 (en) | 2004-01-14 | 2005-08-04 | Ohio University | Methods of producing peptides/proteins in plants and peptides/proteins produced thereby |
US8623812B2 (en) | 2004-04-19 | 2014-01-07 | Ohio University | Cross-linkable glycoproteins and methods of making the same |
WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
WO2006020372A2 (en) * | 2004-07-23 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Enzymatic modification of glycopeptides |
US8268967B2 (en) * | 2004-09-10 | 2012-09-18 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated interferon α |
EP1814573B1 (en) | 2004-10-29 | 2016-03-09 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
JP2008526864A (ja) * | 2005-01-06 | 2008-07-24 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 糖断片を用いる糖結合 |
ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
EP1871795A4 (en) * | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
US20080255026A1 (en) | 2005-05-25 | 2008-10-16 | Glycopegylated Factor 1X | Glycopegylated Factor Ix |
US20110003744A1 (en) * | 2005-05-25 | 2011-01-06 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated Erythropoietin Formulations |
US20070105755A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
US8043833B2 (en) | 2005-10-31 | 2011-10-25 | Novo Nordisk A/S | Expression of soluble therapeutic proteins |
US20090048440A1 (en) * | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
US8198045B2 (en) | 2006-04-19 | 2012-06-12 | Biogenerix Ag | Expression of O-glycosylated therapeutic proteins in prokaryotic microorganisms |
CN101516388B (zh) * | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
AU2007289344B2 (en) * | 2006-08-31 | 2011-04-14 | Novartis Ag | Pharmaceutical compositions comprising hGH for oral delivery |
WO2008057683A2 (en) * | 2006-10-03 | 2008-05-15 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates |
DK2068907T3 (en) * | 2006-10-04 | 2018-01-15 | Novo Nordisk As | GLYCEROL BOND PEGYLED SUGAR AND GLYCOPE Peptides |
KR20100016160A (ko) | 2007-04-03 | 2010-02-12 | 바이오제너릭스 에이지 | 글리코페길화 g―csf를 이용하는 치료 방법 |
JP2010531135A (ja) * | 2007-06-04 | 2010-09-24 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用したo結合型グリコシル化 |
WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
US7968811B2 (en) * | 2007-06-29 | 2011-06-28 | Harley-Davidson Motor Company Group, Inc. | Integrated ignition and key switch |
US8207112B2 (en) | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
CN102037004A (zh) * | 2008-01-08 | 2011-04-27 | 生物种属学股份公司 | 使用寡糖基转移酶的多肽的糖缀合 |
ES2476690T3 (es) | 2008-02-27 | 2014-07-15 | Novo Nordisk A/S | Moléculas conjugadas del Factor VIII |
WO2009156511A2 (en) * | 2008-06-27 | 2009-12-30 | Novo Nordisk A/S | N-glycosylated human growth hormone with prolonged circulatory half-life |
US20110105735A1 (en) * | 2009-10-29 | 2011-05-05 | Heather Desaire | Methods of producing and purifying proteins |
CN108431018A (zh) * | 2015-06-12 | 2018-08-21 | 王天欣 | 药物应用中蛋白质修饰的方法 |
EP3491012A4 (en) * | 2016-07-27 | 2020-07-01 | Amunix Operating Inc. | TREATING ADULT GROWTH HORMONE WITH ANALOGUE OF HUMAN GROWTH HORMONE |
Family Cites Families (231)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1479268A (en) | 1973-07-05 | 1977-07-13 | Beecham Group Ltd | Pharmaceutical compositions |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
CH596313A5 (es) | 1975-05-30 | 1978-03-15 | Battelle Memorial Institute | |
US4385260A (en) | 1975-09-09 | 1983-05-24 | Beckman Instruments, Inc. | Bargraph display |
US4414147A (en) | 1981-04-17 | 1983-11-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons |
JPS57206622A (en) | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Ajinomoto Co Inc | Blood substitute |
US4438253A (en) | 1982-11-12 | 1984-03-20 | American Cyanamid Company | Poly(glycolic acid)/poly(alkylene glycol) block copolymers and method of manufacturing the same |
US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
US4565653A (en) | 1984-03-30 | 1986-01-21 | Pfizer Inc. | Acyltripeptide immunostimulants |
US4879236A (en) | 1984-05-16 | 1989-11-07 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
JPS6238172A (ja) | 1985-08-12 | 1987-02-19 | 株式会社 高研 | 抗血栓性医用材料の製造方法 |
JPS63502716A (ja) | 1986-03-07 | 1988-10-13 | マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー | 糖タンパク安定性の強化方法 |
US4925796A (en) | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for enhancing glycoprotein stability |
US4902505A (en) | 1986-07-30 | 1990-02-20 | Alkermes | Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier |
IL82834A (en) | 1987-06-09 | 1990-11-05 | Yissum Res Dev Co | Biodegradable polymeric materials based on polyether glycols,processes for the preparation thereof and surgical artiicles made therefrom |
US4847325A (en) | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
US5153265A (en) | 1988-01-20 | 1992-10-06 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
GB8810808D0 (en) | 1988-05-06 | 1988-06-08 | Wellcome Found | Vectors |
US5169933A (en) | 1988-08-15 | 1992-12-08 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
US5104651A (en) | 1988-12-16 | 1992-04-14 | Amgen Inc. | Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf |
US6166183A (en) | 1992-11-30 | 2000-12-26 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically-modified G-CSF |
ATE135370T1 (de) | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
KR910700264A (ko) * | 1989-01-19 | 1991-03-14 | 로버트 에이. 아미테이지 | 소마토트로핀 유사물 |
JP3207416B2 (ja) * | 1989-01-31 | 2001-09-10 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | ソマトトロピン・アナログ類 |
US5194376A (en) | 1989-02-28 | 1993-03-16 | University Of Ottawa | Baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels |
US5122614A (en) | 1989-04-19 | 1992-06-16 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
EP0470128B2 (en) | 1989-04-19 | 2003-08-13 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
US5324844A (en) | 1989-04-19 | 1994-06-28 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
US5342940A (en) | 1989-05-27 | 1994-08-30 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same |
US5182107A (en) | 1989-09-07 | 1993-01-26 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
US5527527A (en) | 1989-09-07 | 1996-06-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
US5672683A (en) | 1989-09-07 | 1997-09-30 | Alkermes, Inc. | Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein |
US5154924A (en) | 1989-09-07 | 1992-10-13 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
US5977307A (en) | 1989-09-07 | 1999-11-02 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins |
US5032519A (en) | 1989-10-24 | 1991-07-16 | The Regents Of The Univ. Of California | Method for producing secretable glycosyltransferases and other Golgi processing enzymes |
US5312808A (en) | 1989-11-22 | 1994-05-17 | Enzon, Inc. | Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions |
US5324663A (en) | 1990-02-14 | 1994-06-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures |
US5595900A (en) | 1990-02-14 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures |
DE4009630C2 (de) | 1990-03-26 | 1995-09-28 | Reinhard Prof Dr Dr Brossmer | CMP-aktivierte fluoreszierende Sialinsäuren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung |
US5583042A (en) | 1990-04-16 | 1996-12-10 | Neose Pharmaceuticals, Inc. | Apparatus for the synthesis of saccharide compositions |
US5951972A (en) | 1990-05-04 | 1999-09-14 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues |
US5219564A (en) | 1990-07-06 | 1993-06-15 | Enzon, Inc. | Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon |
CU22302A1 (es) | 1990-09-07 | 1995-01-31 | Cigb | Secuencia nucleotidica codificante para una proteina de la membrana externa de neisseria meningitidis y uso de dicha proteina en preparados vacunales |
US5529914A (en) | 1990-10-15 | 1996-06-25 | The Board Of Regents The Univeristy Of Texas System | Gels for encapsulation of biological materials |
US5410016A (en) | 1990-10-15 | 1995-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers |
DE69231467T2 (de) * | 1991-05-10 | 2001-01-25 | Genentech Inc | Auswählen von agonisten und antagonisten von liganden |
US5374655A (en) | 1991-06-10 | 1994-12-20 | Alberta Research Council | Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-N-acetyllactosaminyl structures |
US5352670A (en) | 1991-06-10 | 1994-10-04 | Alberta Research Council | Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides |
KR950014915B1 (ko) | 1991-06-19 | 1995-12-18 | 주식회사녹십자 | 탈시알로당단백-포함화합물 |
US5281698A (en) | 1991-07-23 | 1994-01-25 | Cetus Oncology Corporation | Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation |
IT1260468B (it) | 1992-01-29 | 1996-04-09 | Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole | |
US5962294A (en) | 1992-03-09 | 1999-10-05 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for the identification and synthesis of sialyltransferases |
US5858751A (en) | 1992-03-09 | 1999-01-12 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for producing sialyltransferases |
US6037452A (en) | 1992-04-10 | 2000-03-14 | Alpha Therapeutic Corporation | Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate |
US5614184A (en) | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
WO1994004193A1 (en) | 1992-08-21 | 1994-03-03 | Enzon, Inc. | Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances |
JP3979678B2 (ja) | 1992-08-24 | 2007-09-19 | サントリー株式会社 | 新規糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該酵素の製造方法 |
NZ250375A (en) | 1992-12-09 | 1995-07-26 | Ortho Pharma Corp | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives |
AU6029594A (en) | 1993-01-15 | 1994-08-15 | Enzon, Inc. | Factor viii - polymeric conjugates |
US5349001A (en) | 1993-01-19 | 1994-09-20 | Enzon, Inc. | Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides |
US5321095A (en) | 1993-02-02 | 1994-06-14 | Enzon, Inc. | Azlactone activated polyalkylene oxides |
US5202413A (en) | 1993-02-16 | 1993-04-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Alternating (ABA)N polylactide block copolymers |
US5374541A (en) | 1993-05-04 | 1994-12-20 | The Scripps Research Institute | Combined use of β-galactosidase and sialyltransferase coupled with in situ regeneration of CMP-sialic acid for one pot synthesis of oligosaccharides |
EP0726318A1 (en) | 1993-05-14 | 1996-08-14 | The Upjohn Company | An acceptor polypeptide for an N-acetylgalactosaminyltransferase |
US5621039A (en) | 1993-06-08 | 1997-04-15 | Hallahan; Terrence W. | Factor IX- polymeric conjugates |
US5919455A (en) | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5446090A (en) | 1993-11-12 | 1995-08-29 | Shearwater Polymers, Inc. | Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules |
US5443953A (en) | 1993-12-08 | 1995-08-22 | Immunomedics, Inc. | Preparation and use of immunoconjugates |
US5369017A (en) | 1994-02-04 | 1994-11-29 | The Scripps Research Institute | Process for solid phase glycopeptide synthesis |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US5837458A (en) | 1994-02-17 | 1998-11-17 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
US5492841A (en) | 1994-02-18 | 1996-02-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents |
US5432059A (en) | 1994-04-01 | 1995-07-11 | Specialty Laboratories, Inc. | Assay for glycosylation deficiency disorders |
US5646113A (en) | 1994-04-07 | 1997-07-08 | Genentech, Inc. | Treatment of partial growth hormone insensitivity syndrome |
US5629384A (en) | 1994-05-17 | 1997-05-13 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces |
US5545553A (en) | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
US5834251A (en) | 1994-12-30 | 1998-11-10 | Alko Group Ltd. | Methods of modifying carbohydrate moieties |
US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US5922577A (en) | 1995-04-11 | 1999-07-13 | Cytel Corporation | Enzymatic synthesis of glycosidic linkages |
US5728554A (en) | 1995-04-11 | 1998-03-17 | Cytel Corporation | Enzymatic synthesis of glycosidic linkages |
US6030815A (en) | 1995-04-11 | 2000-02-29 | Neose Technologies, Inc. | Enzymatic synthesis of oligosaccharides |
US5876980A (en) | 1995-04-11 | 1999-03-02 | Cytel Corporation | Enzymatic synthesis of oligosaccharides |
US6015555A (en) | 1995-05-19 | 2000-01-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
US5824864A (en) | 1995-05-25 | 1998-10-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize gene and protein for insect control |
US6127153A (en) | 1995-06-07 | 2000-10-03 | Neose Technologies, Inc. | Method of transferring at least two saccharide units with a polyglycosyltransferase, a polyglycosyltransferase and gene encoding a polyglycosyltransferase |
US5858752A (en) | 1995-06-07 | 1999-01-12 | The General Hospital Corporation | Fucosyltransferase genes and uses thereof |
US5672662A (en) | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
US5770420A (en) | 1995-09-08 | 1998-06-23 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures |
DK1568772T3 (da) | 1995-09-21 | 2010-10-18 | Genentech Inc | Varianter af humant væksthormon |
US5716812A (en) | 1995-12-12 | 1998-02-10 | The University Of British Columbia | Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby |
JP2000507095A (ja) | 1996-03-08 | 2000-06-13 | ザ、リージェンツ、オブ、ザ、ユニバーシティ、オブ、ミシガン | ネズミα(1,3)フコシルトランスフェラーゼFuc―TVII、それをコードするDNA、その製造法、それを認識する抗体、それを検出するためのイムノアッセイ、このようなDNAを含むプラスミド、およびこのようなプラスミドを含む細胞 |
US20020064546A1 (en) | 1996-09-13 | 2002-05-30 | J. Milton Harris | Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor |
NZ335203A (en) | 1996-10-10 | 2000-10-27 | Neose Technologies Inc | Carbohydrate, purification using ultrafiltration, reverse osmosis and nanofiltration |
IL130823A (en) | 1996-10-15 | 2005-12-18 | Elan Pharm Inc | Peptide-lipid conjugates, liposomes drug delivery |
AU718382B2 (en) | 1996-11-08 | 2000-04-13 | Neose Technologies, Inc. | Improved expression vectors |
DK1015622T3 (da) | 1997-01-16 | 2004-08-02 | Neose Technologies Inc | Praktisk sialylering in vitro af rekombinante glycoproteiner |
US5945314A (en) | 1997-03-31 | 1999-08-31 | Abbott Laboratories | Process for synthesizing oligosaccharides |
JP4187277B2 (ja) | 1997-04-30 | 2008-11-26 | エンゾン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用 |
US6183738B1 (en) | 1997-05-12 | 2001-02-06 | Phoenix Pharamacologics, Inc. | Modified arginine deiminase |
AU8005098A (en) | 1997-06-06 | 1998-12-21 | Governors Of The University Of Alberta, The | Alpha1,3-fucosyltransferase of helicobacter pylori |
WO1999000150A2 (en) | 1997-06-27 | 1999-01-07 | Regents Of The University Of California | Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor |
US20030027257A1 (en) * | 1997-08-21 | 2003-02-06 | University Technologies International, Inc. | Sequences for improving the efficiency of secretion of non-secreted protein from mammalian and insect cells |
ATE419009T1 (de) | 1997-10-31 | 2009-01-15 | Genentech Inc | Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen |
AU744303B2 (en) | 1997-12-01 | 2002-02-21 | Neose Technologies, Inc. | Enzymatic synthesis of gangliosides |
EP0924298A1 (en) | 1997-12-18 | 1999-06-23 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Protein expression in baculovirus vector expression systems |
CA2316834C (en) | 1998-01-07 | 2006-01-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Degradable heterobifunctional poly(ethylene glycol) acrylates and gels and conjugates derived therefrom |
PT1061954E (pt) | 1998-03-12 | 2004-10-29 | Nektar Therapeutics Al Corp | Derivados de poli(etileno glicol) com grupos reactivos proximos |
AU758097B2 (en) * | 1998-03-25 | 2003-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Trimeric antigenic O-linked glycopeptide conjugates, methods of preparation and uses thereof |
US20030166525A1 (en) | 1998-07-23 | 2003-09-04 | Hoffmann James Arthur | FSH Formulation |
US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
DE69936351T2 (de) * | 1998-10-30 | 2008-02-21 | Novozymes A/S | Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität |
DE19852729A1 (de) | 1998-11-16 | 2000-05-18 | Werner Reutter | Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung |
US6465220B1 (en) | 1998-12-21 | 2002-10-15 | Glycozym Aps | Glycosylation using GalNac-T4 transferase |
US6949372B2 (en) | 1999-03-02 | 2005-09-27 | The Johns Hopkins University | Engineering intracellular sialylation pathways |
US6261805B1 (en) | 1999-07-15 | 2001-07-17 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system |
US6642038B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-11-04 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | GlcNAc phosphotransferase of the lysosomal targeting pathway |
US6716626B1 (en) | 1999-11-18 | 2004-04-06 | Chiron Corporation | Human FGF-21 nucleic acids |
US6348558B1 (en) | 1999-12-10 | 2002-02-19 | Shearwater Corporation | Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom |
US6376604B2 (en) | 1999-12-22 | 2002-04-23 | Shearwater Corporation | Method for the preparation of 1-benzotriazolylcarbonate esters of poly(ethylene glycol) |
WO2001049830A2 (en) | 1999-12-30 | 2001-07-12 | Maxygen Aps | Improved lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators |
US6555660B2 (en) | 2000-01-10 | 2003-04-29 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
DE60138364D1 (de) | 2000-02-11 | 2009-05-28 | Bayer Healthcare Llc | Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate |
WO2001060411A1 (en) | 2000-02-18 | 2001-08-23 | Kanagawa Academy Of Science And Technology | Pharmaceutical composition, reagent and method for intracerebral delivery of pharmaceutically active ingredient or labeling substance |
AU2001281463A1 (en) | 2000-03-16 | 2001-09-24 | The Regents Of The University Of California | Chemoselective ligation |
US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
US7338932B2 (en) | 2000-05-11 | 2008-03-04 | Glycozym Aps | Methods of modulating functions of polypeptide GalNAc-transferases and of screening test substances to find agents herefor, pharmaceutical compositions comprising such agents and the use of such agents for preparing medicaments |
WO2001088117A2 (en) | 2000-05-12 | 2001-11-22 | Neose Technologies, Inc. | In vitro fucosylation recombinant glycopeptides |
EP1525889A1 (en) | 2000-05-15 | 2005-04-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative |
AU7684201A (en) | 2000-06-28 | 2002-01-08 | Glycofi Inc | Methods for producing modified glycoproteins |
US6423826B1 (en) | 2000-06-30 | 2002-07-23 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
AU2001267337A1 (en) | 2000-06-30 | 2002-01-14 | Maxygen Aps | Peptide extended glycosylated polypeptides |
AU2001283740A1 (en) | 2000-08-17 | 2002-02-25 | University Of British Columbia | Chemotherapeutic agents conjugated to p97 and their methods of use in treating neurological tumours |
MXPA03005406A (es) | 2000-12-20 | 2003-09-25 | Hoffmann La Roche | Conjugados de eritropoyetina. |
US7892730B2 (en) | 2000-12-22 | 2011-02-22 | Sagres Discovery, Inc. | Compositions and methods for cancer |
US6531121B2 (en) | 2000-12-29 | 2003-03-11 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
PA8536201A1 (es) | 2000-12-29 | 2002-08-29 | Kenneth S Warren Inst Inc | Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina |
ATE432288T1 (de) | 2001-02-27 | 2009-06-15 | Maxygen Aps | Neue interferon-beta-ähnliche moleküle |
US7235638B2 (en) | 2001-03-22 | 2007-06-26 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Coagulation factor VII derivatives |
US20020168323A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-14 | Igor Gonda | Optimization of the molecular properties and formulation of proteins delivered by inhalation |
AU2002342653A1 (en) | 2001-05-14 | 2002-11-25 | The Gouvernment Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health | Modified growth hormone |
KR100453877B1 (ko) | 2001-07-26 | 2004-10-20 | 메덱스젠 주식회사 | 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 TNFR/Fc 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체 |
JP2005527467A (ja) | 2001-08-29 | 2005-09-15 | ネオーズ テクノロジーズ, インコーポレイテッド | 新規な合成ガングリオシド誘導体およびその組成物 |
US7795210B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
EP2279755B1 (en) | 2001-10-10 | 2014-02-26 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of Fibroblast Growth Factor (FGF) |
US7226903B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-06-05 | Neose Technologies, Inc. | Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta |
US7125843B2 (en) | 2001-10-19 | 2006-10-24 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugates including more than one peptide |
US8008252B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
US7439043B2 (en) | 2001-10-10 | 2008-10-21 | Neose Technologies, Inc. | Galactosyl nucleotide sugars |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
WO2004099231A2 (en) | 2003-04-09 | 2004-11-18 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7696163B2 (en) | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7265085B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-09-04 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7179617B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX |
US7297511B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-11-20 | Neose Technologies, Inc. | Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha |
US7265084B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-09-04 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US7399613B2 (en) | 2001-10-10 | 2008-07-15 | Neose Technologies, Inc. | Sialic acid nucleotide sugars |
CA2468230A1 (en) | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Neose Technologies, Inc. | Glycopeptide remodeling using amidases |
US7473680B2 (en) | 2001-11-28 | 2009-01-06 | Neose Technologies, Inc. | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
US20060035224A1 (en) | 2002-03-21 | 2006-02-16 | Johansen Jack T | Purification methods for oligonucleotides and their analogs |
MXPA04012496A (es) | 2002-06-21 | 2005-09-12 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Glicoformos del factor vii pegilados. |
DE10232916B4 (de) | 2002-07-19 | 2008-08-07 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Vorrichtung und Verfahren zum Charakterisieren eines Informationssignals |
NZ538439A (en) | 2002-07-23 | 2007-02-23 | Neose Technologies Inc | Synthesis of oligosaccharides, glycolipids, and glycoproteins using bacterial glycosyltransferases |
KR20050083677A (ko) | 2002-09-05 | 2005-08-26 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 변형 아시알로 인터페론 및 그의 용도 |
WO2004022004A2 (en) | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Modified glp-1 receptor agonists and their pharmacological methods of use |
EP1558728B1 (en) | 2002-11-08 | 2007-06-27 | Glycozym ApS | Methods to identify agents modulating functions of polypeptide galnac-transferases, pharmaceutical compositions comprising such agents and the use of such agents for preparing medicaments |
JP4412461B2 (ja) | 2002-11-20 | 2010-02-10 | 日油株式会社 | 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体 |
US20050064540A1 (en) | 2002-11-27 | 2005-03-24 | Defrees Shawn Ph.D | Glycoprotein remodeling using endoglycanases |
EP1424344A1 (en) | 2002-11-29 | 2004-06-02 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Modified cDNA factor VIII and its derivates |
DE60228460D1 (de) | 2002-12-13 | 2008-10-02 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Erythropoietin |
BRPI0408358A (pt) | 2003-03-14 | 2006-03-21 | Neose Technologies Inc | polìmeros hidrossolúveis ramificados e seus conjugados |
EP1603954A4 (en) | 2003-03-18 | 2006-04-12 | Neose Technologies Inc | ACTIVATED FORMS OF WATER SOLUBLE POLYMERS |
EP1613261A4 (en) | 2003-04-09 | 2011-01-26 | Novo Nordisk As | INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES |
US7718363B2 (en) | 2003-04-25 | 2010-05-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Tissue protective cytokine receptor complex and assays for identifying tissue protective compounds |
AU2004240553A1 (en) | 2003-05-09 | 2004-12-02 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants |
WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
US20060198819A1 (en) | 2003-08-08 | 2006-09-07 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest |
CN1882355A (zh) | 2003-09-09 | 2006-12-20 | 沃伦药品公司 | 保持内源性促红细胞生成素组织保护活性的长效促红细胞生成素 |
US7524813B2 (en) | 2003-10-10 | 2009-04-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Selectively conjugated peptides and methods of making the same |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US20070254834A1 (en) | 2003-11-24 | 2007-11-01 | Defrees Shawn | Glycopegylated Erythropoietin |
US7842661B2 (en) | 2003-11-24 | 2010-11-30 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin formulations |
US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US20080318850A1 (en) | 2003-12-03 | 2008-12-25 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated Factor Ix |
EP1694274B1 (en) | 2003-12-03 | 2013-04-24 | BioGeneriX AG | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
EP1694351A2 (en) | 2003-12-03 | 2006-08-30 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated follicle stimulating hormone |
US7956032B2 (en) | 2003-12-03 | 2011-06-07 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
CA2552892C (en) * | 2004-01-08 | 2014-08-05 | Neose Technologies, Inc. | O-linked glycosylation of peptides |
US20080058245A1 (en) | 2004-01-09 | 2008-03-06 | Johnson Karl F | Vectors for Recombinant Protein Expression in E. Coli |
US20070105770A1 (en) | 2004-01-21 | 2007-05-10 | Novo Nordisk A/S | Transglutaminase mediated conjugation of peptides |
EP1720892B1 (en) | 2004-01-26 | 2013-07-24 | BioGeneriX AG | Branched polymer-modified sugars and nucleotides |
WO2005091944A2 (en) | 2004-03-17 | 2005-10-06 | Eli Lilly And Company | Glycol linked fgf-21 compounds |
DE602005019038D1 (de) | 2004-05-04 | 2010-03-11 | Novo Nordisk Healthcare Ag | O-verknüpfte glykoformen von faktor vii und verfahren zu deren herstellung |
WO2005121331A2 (en) | 2004-06-03 | 2005-12-22 | Neose Technologies, Inc. | Truncated galnact2 polypeptides and nucleic acids |
US20080206810A1 (en) | 2004-06-03 | 2008-08-28 | Neose Technologies, Inc. | Truncated St6galnaci Polypeptides and Nucleic Acids |
WO2006014466A2 (en) | 2004-07-02 | 2006-02-09 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Novel carbamylated epo and method for its production |
EP1771190A4 (en) | 2004-07-02 | 2009-07-22 | Kenneth S Warren Inst Inc | METHOD FOR THE PRODUCTION OF COMPLETELY CARBAMYLATED ERYTHROPOIETIN |
WO2006010143A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
WO2006020372A2 (en) | 2004-07-23 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Enzymatic modification of glycopeptides |
EP1778838A2 (en) | 2004-08-02 | 2007-05-02 | Novo Nordisk Health Care AG | Conjugation of fvii |
US20060024286A1 (en) | 2004-08-02 | 2006-02-02 | Paul Glidden | Variants of tRNA synthetase fragments and uses thereof |
US8268967B2 (en) | 2004-09-10 | 2012-09-18 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated interferon α |
US20080108557A1 (en) | 2004-09-29 | 2008-05-08 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Modified Proteins |
EP1814573B1 (en) | 2004-10-29 | 2016-03-09 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
US20090054623A1 (en) | 2004-12-17 | 2009-02-26 | Neose Technologies, Inc. | Lipo-Conjugation of Peptides |
JP2008526864A (ja) | 2005-01-06 | 2008-07-24 | ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド | 糖断片を用いる糖結合 |
ES2449195T3 (es) | 2005-01-10 | 2014-03-18 | Ratiopharm Gmbh | Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado |
WO2006078645A2 (en) | 2005-01-19 | 2006-07-27 | Neose Technologies, Inc. | Heterologous polypeptide expression using low multiplicity of infection of viruses |
WO2006105426A2 (en) | 2005-03-30 | 2006-10-05 | Neose Technologies, Inc. | Manufacturing process for the production of peptides grown in insect cell lines |
EP1871795A4 (en) | 2005-04-08 | 2010-03-31 | Biogenerix Ag | COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE |
US20080255026A1 (en) | 2005-05-25 | 2008-10-16 | Glycopegylated Factor 1X | Glycopegylated Factor Ix |
ES2553160T3 (es) | 2005-06-17 | 2015-12-04 | Novo Nordisk Health Care Ag | Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
AU2006280932A1 (en) | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor VII and factor Vila |
US20090055942A1 (en) | 2005-09-14 | 2009-02-26 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human Coagulation Factor VII Polypeptides |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
EP2029738A2 (en) | 2006-05-24 | 2009-03-04 | Novo Nordisk Health Care AG | Factor ix analogues having prolonged in vivo half life |
CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
ITMI20061624A1 (it) | 2006-08-11 | 2008-02-12 | Bioker Srl | Mono-coniugati sito-specifici di g-csf |
ES2531934T3 (es) | 2006-09-01 | 2015-03-20 | Novo Nordisk Health Care Ag | Glicoproteínas modificadas |
WO2008057683A2 (en) | 2006-10-03 | 2008-05-15 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates |
DK2068907T3 (en) | 2006-10-04 | 2018-01-15 | Novo Nordisk As | GLYCEROL BOND PEGYLED SUGAR AND GLYCOPE Peptides |
US20080207487A1 (en) | 2006-11-02 | 2008-08-28 | Neose Technologies, Inc. | Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines |
KR20100016160A (ko) | 2007-04-03 | 2010-02-12 | 바이오제너릭스 에이지 | 글리코페길화 g―csf를 이용하는 치료 방법 |
US20090053167A1 (en) | 2007-05-14 | 2009-02-26 | Neose Technologies, Inc. | C-, S- and N-glycosylation of peptides |
JP2010531135A (ja) | 2007-06-04 | 2010-09-24 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用したo結合型グリコシル化 |
WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
FR2918288B1 (fr) | 2007-07-03 | 2009-08-28 | Zedel Soc Par Actions Simplifi | Dispositif bloqueur de remontee sur corde double |
US8207112B2 (en) | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
-
2004
- 2004-05-07 AU AU2004240553A patent/AU2004240553A1/en not_active Abandoned
- 2004-05-07 ES ES04751591T patent/ES2380093T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-05-07 AT AT04751591T patent/ATE540055T1/de active
- 2004-05-07 WO PCT/US2004/014254 patent/WO2004103275A2/en active Application Filing
- 2004-05-07 CA CA002524936A patent/CA2524936A1/en not_active Abandoned
- 2004-05-07 MX MXPA05011832A patent/MXPA05011832A/es not_active Application Discontinuation
- 2004-05-07 JP JP2006532844A patent/JP2007523630A/ja active Pending
- 2004-05-07 US US10/556,094 patent/US7932364B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-05-07 BR BRPI0410164-2A patent/BRPI0410164A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-05-07 EP EP04751591A patent/EP1624847B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-05-07 KR KR1020057021304A patent/KR20060030023A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2007523630A (ja) | 2007-08-23 |
WO2004103275A3 (en) | 2007-05-18 |
EP1624847A4 (en) | 2008-06-18 |
ATE540055T1 (de) | 2012-01-15 |
EP1624847A2 (en) | 2006-02-15 |
MXPA05011832A (es) | 2006-02-17 |
KR20060030023A (ko) | 2006-04-07 |
AU2004240553A1 (en) | 2004-12-02 |
EP1624847B1 (en) | 2012-01-04 |
US7932364B2 (en) | 2011-04-26 |
BRPI0410164A (pt) | 2006-05-16 |
CA2524936A1 (en) | 2004-12-02 |
US20080102083A1 (en) | 2008-05-01 |
WO2004103275A2 (en) | 2004-12-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2380093T3 (es) | Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana | |
EP1765853B1 (en) | O-linked glycosylation of G-CSF peptides | |
US8791066B2 (en) | Branched PEG remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [GLP-1] | |
ES2516694T3 (es) | Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O | |
US9187546B2 (en) | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants | |
US20090053167A1 (en) | C-, S- and N-glycosylation of peptides | |
EP2242505A2 (en) | Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases | |
EP2162535A2 (en) | O-linked glycosylation using n-acetylglucosaminyl transferases | |
ZA200701909B (en) | Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants | |
MXPA06007725A (es) | Glucosilacion de peptidos ligada en o |