CN108431018A - 药物应用中蛋白质修饰的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及修饰用于药物应用的蛋白的方法和用于治疗诸如病原体感染和癌症等疾病的试剂。本发明还涉及通过连接多个蛋白单元与位点特异性偶联以增加蛋白质分子量从而延长其体内半衰期。本发明还公开了以蛋白质或适体形式构建亲和配体的方法，其达到治疗靶标时会活化，因此，为治疗提供更高的特异性。

Description

药物应用中蛋白质修饰的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求在2015年6月12日提交的美国临时专利申请62/174,528的优先权。该在先申请的全部公开内容被认为是本申请的公开内容的一部分，并通过引用结合与此。

背景技术

技术领域

本发明涉及修饰用于药物应用的蛋白的方法和用于治疗诸如病原体感染和癌症等疾病的试剂。本发明还涉及延长蛋白质和适配体基试剂在体内半衰期和效价的方法。

背景信息

蛋白质药物已经改变了现代医学的面貌，在如癌症，贫血和嗜中性白血球减少症等多种不同的疾病中得到应用。然而，与任何药物一样，对其靶目标具有改进的特异性和选择性的药物的需求和愿望是非常有意义的，特别是在开发具有与其结合的已知靶目标的第二代蛋白质药物。也期望在体内半衰期长的蛋白质药物以降低其注射频率而为患者提供更好的治疗。延长治疗剂(不论是治疗性蛋白质，肽还是小分子)的半衰期通常需要对治疗剂本身进行专门配制或修改。诸如聚乙二醇(PEG)化传统的修饰方法(向治疗剂中加入抗体片段或白蛋白分子)具有许多严重的缺陷。例如，已观察到聚乙二醇化蛋白质在动物模型中引起肾小管空泡化。肾脏清除的聚乙二醇化蛋白质或其代谢物可能在肾脏积聚，导致PEG水合物的形成，干扰正常的肾小球滤过。因此，仍有相当大的需要以合理的成本生产具有延长的半衰期性质的高纯度形式的治疗剂的替代组合物和方法。

附图说明

图1示出了具有适合长度柔性连接子的多价同型Fab(抗原结合片段)形式以获得更高的亲和力。

图2示出了靶向细胞/微生物上的不同蛋白质的两个抗原的异质Fab形式，以获得更高的亲和力。

图3示出了靶向相同靶蛋白的两个表位位点的异质Fab形式以获得更高的亲和力。

图4示出了选择性还原法构建双特异性抗体和ADC。

图5示出了通过连接两个或多个全长抗体的双特异性抗体。

图6示出了通过连接两个全长抗体来制备双特异性抗体的示例。

图7示出了使用靶向抗体上的碳水化合物的固定化的亲和基团以选择性地保护抗体上的一个FC偶联位点以实现单偶联的示例。

图8示出了药物和连接子在抗体上的单标记。

图9示出了自组装前抗体的结构和活化机制。

图10示出了具有Fc修饰物的自组装前抗体的示例。

图11示出了具有Fc修饰物的自组装前抗体的活化机制。

图12示出了具有Fc修饰物的自组装前抗体的示例。

图13示出了具有异种MM的自组装前抗体的示例。

图14示出了前适配体的结构和活化机制。

图15示出了自组装前适配体的结构和活化机制。

图16示出了具有半衰期修饰物或药物偶联物的前适配体的示例。

图17示出了结合基潜酶的示例，其是一种一与适配体结合就活化的酶。

图18示出了结合基潜酶的示例，其是一种一与抗体结合就活化的酶。

图19示出了一个基于抗体结合配体-连接子-酶抑制配体的潜酶的方案。

图20示出了基于抗体结合配体-连接子-酶抑制配体的潜酶的示例。

图21示出了基于裂解的潜酶(由第二种酶活化的酶)的方案。

图22示出了一个由两个与可生物降解聚乳酸连接的PEG嵌段组成的嵌段聚合物的示例。

图23示出了不同形式的生物可降解PEG和生物可降解HGH二聚体。

图24示出了可延长HGH体内半衰期的HGH三聚体的一个示例。

图25示出了HGH三聚体及其制备的一个示例。

图26示出了使用3臂连接子的HGH三聚体的一个示例。

图27示出了使用3臂连接子的HGH三聚体的另一个示例。

图28示出了以亲和基团交联HGH以延长其体内半衰期的方案。

图29示出了以抗体交联以延长其体内半衰期的HGH方案。

图30示出了用短链PEG或肽作为连接子以延长其体内半衰期的HGH三聚体及其合成。

图31示出了另一个用短链PEG作为连接子以延长其体内半衰期的HGH三聚体及其合成的示例。

图32示出了具有可生物降解连接子的HGH寡聚物。

图33示出了用重组技术制备的具有肽连接子的HGH寡聚物的一个示例。

图34示出了具有末端修饰物的HGH寡聚物的示例。

发明内容和优选实施例

本发明公开了通过将蛋白与蛋白-抗体免疫复合物组合并将其施用于患者来提高生物活性蛋白质的体内半衰期和效力的方法和制剂剂型，其中蛋白的量大于抗体的结合能力，以在制剂中提供游离的未结合蛋白。在本发明中，“/”标记是指“和”或“或”。

该方法包括以下步骤：

1)将蛋白-抗体免疫复合物以有效量施用于患者以达到蛋白的所需生物活性。这可以通过首先制备蛋白-抗体免疫复合物，然后将其施用于病人来实现。任选地，游离的额外蛋白和蛋白-抗体免疫复合物的混合物也可替代蛋白-抗体免疫复合物。还可以通过给病人单独施用蛋白和抗体来在体内实现免疫复合物的形成。在一些实施例中，蛋白的量等于或大于抗体的结合容量。例如，如果使用IgG，蛋白的量不低于抗体量的两倍(摩尔比)，因为每个IgG分子结合两个蛋白质分子。在这些实施例中，蛋白-抗体免疫复合物中抗体的所有结合位点都与蛋白质结合。合适的给药途径的例子包括静脉、腹腔、肌内和皮下途径及其组合。

2)经过一定时间后，当蛋白的体内浓度降低到不希望有的水平时，再给患者重新施用足够多的蛋白，以维持体内蛋白浓度(游离和抗体结合型)的需要水平。有时还可以联合施用蛋白-抗体免疫复合物和蛋白，以维持体内抗体浓度到达需要水平，从而达到理想的蛋白-抗体免疫复合物浓度，以确保体内蛋白质浓度持续达到所需要水平。

3)根据体内蛋白质浓度和治疗时间的需要，步骤2可以重复几次。例如，步骤2每7天或每10天或每两周或每20天或每个月重复一次，持续3个月或6个月或1年或几年。

本发明公开了适用于上述方法的药物制剂形式。药物制剂形式含有两个或两个以上的药剂，第一剂含有有效量的蛋白-抗体免疫复合物，或游离(未结合)蛋白和蛋白-抗体免疫复合物的混合物。第二剂和以后的各个剂只含有适量的蛋白质药物，或者含有游离蛋白和蛋白-抗体免疫复合物的混合物。

众所周知，当抗原与抗体结合时，免疫复合物的半衰期比抗原的半衰期长，因此提供较长的体内半衰期，有利于提高药物的药效，减少清除。该抗体还可以保护蛋白质免受酶促降解，这也增加了它的半衰期和效力。然而，在注射免疫复合物后，解离的蛋白的清除率比抗体快得多，蛋白质与抗体的比值逐渐变小，蛋白质的浓度比抗体浓度下降的幅度大得多。而未结合的抗体会抑制蛋白质的活性，从而进一步降低体内的蛋白质活性。重复注射免疫复合物将进一步增加未结合的抗体浓度，从而成为抗体阱，因此不能提供满意的体内蛋白活性用于治疗。本发明通过注射游离蛋白，或注射游离蛋白与蛋白质-抗体免疫混合物，解决了这一问题，以维持所需的蛋白浓度而不引起体内抗体的浓度蓄积。

例如，一种用于治疗某些疾病的蛋白质P(30KD)。抗体IgG AbP(MW＝150KD)是其中和抗体。使用本发明的方法时，将6mg P与15mg AbP混合，以制备免疫复合物P-AbP，其中，每个AbP结合2个P。在治疗开始时，对患者注射21mg P-AbP(静脉注射)。P的体内半衰期为10天，AbP的体内半衰期为20天。在第10天，70％的AbP还存在于体内(根据施用P-AbP后免疫复合物中自由和结合态的浓度计算得出)，不在免疫复合物中的P的体内半衰期是0.5天。因此，包含3-6毫克P的于第10天给药，包含10.5毫克P-AbP以及3毫克的P的第三剂在第20天给药，以维持一个稳定有效的体内蛋白P浓度。这个过程可以重复直到治疗结束(例如第二剂于第30天再次给药，第三剂于第40天再次给药)。所述制剂形式含有一种第一剂(21毫克P-AbP)和多种第二剂(3-6mg P)和多种第三剂(10.5mg P-AbP和3mg P的混合物)。

可选地，在治疗开始时给病人静脉注射21毫克的P-AbP，然后每10天注射一次3毫克P和6.3mg P-AbP的混合物(即21mg的30％，因为在第十天清除30％AbP)。所述制剂形式将包括一种第一剂(21毫克P-AbP)和多种第二剂(3毫克P和6.3mg P-AbP的混合物)。如果高剂量的游离P不引起不良反应，则第1天可注射3倍剂量的第二剂，而不是21毫克P-AbP，因此药物制剂只需要包含多个3毫克P和6.3mg P-AbP的混合物。

除以上列出的内容之外，还可采用其它给药剂量/间隔和制剂组成的方案，以达到P的预期的体内浓度。可以测量每个个体的药代动力学(如体内半衰期)以准备个人化的医疗治疗。也可以用大量人群样本的平均药代动力学数据来设计制剂组成和给药方案。也可以使用其它给药路线(例如皮下注射或肌内注射)。

根据本发明描述的上述方法可以使用多种蛋白质药物。例如，人生长激素(HGH)和抗HGH的抗体(可以是中和的IgG抗体或非中和的IgG抗体，最佳抗体可以通过筛选获得)，IL-7和M25抗体，人白介素10(hIL-10)和人源化抗人IL-10(hαhIL-10)也可用于当前发明。

在一些实施例中，使用的抗体-抗原蛋白药物复合物的抗体：抗原摩尔比例＞0.5，这意味着一些抗体结合位点不与抗原蛋白药物结合，从而达到更稳定的血液药物浓度变化。例如，以与抗原1∶1比例结合的抗体(每个抗体中一半的结合位点为空)被用作抗体抗原药物免疫复合物。在一个示例中，第一剂是与抗原药物以1∶1比例结合的抗体，第二剂和以后的剂型包含两个部分：游离抗原药物和以1∶1比例与抗原药物结合的抗体。这两部分可以同时被注射或按顺序注射。

示例：HGH亲和给药的研发方案

1)抗体筛选：

-将抗HGH的几种抗体(来自小鼠的单克隆抗体，许多可商购)与HGH混合并注射给小鼠

-测量血清HGH水平，选择最能延长HGH半衰期的抗体

2)剂量筛选：

-调整第一剂的抗体：HGH之间的比率，选择在给第一剂后提供最好的PK比率-调整以后剂的抗体：HGH之间的比率，选择以后剂中提供最好的PK结果(或增重)，可以根据在筛选过程中开发的PK模型来设计调整。

3)人源化：抗体人源化和剂量调整

本发明还公开了包括抗体在内的蛋白质的位点特异性偶联的新策略。位点特异性抗体药物偶联是一种很有前途的治疗癌症的药物发现策略；一些公司(例如Ambrx，innate-pharma和sutrobio)正致力于开发用于蛋白质的位点特异性偶联的新方法，一方面，在本发明的新方法中使用高温进行位点特异性偶联，其使用MTgase(微生物转谷氨酰胺酶，又称为细菌性转谷氨酰胺酶，BTG)将具有胺基的药物/连接子偶联到蛋白的Gln(谷氨酰胺)上。优选温度＞40℃，更优选大于45℃，但小于75℃。在一些实施方式中，温度为50～65℃。升高的温度可以暴露先前隐藏的(例如难以被MTgase接触的抗体中的Gln)官能团以用于位点特异性偶联。

在一个示例中，IgG1与单丹磺酰戊二胺(MDC)的偶联由MTgase催化。MDC具有一个伯胺，它的荧光很容易监控。MDC在这里被用来与单克隆抗体偶联。向Tris-缓冲液(pH为6.5-8.5)中纯化的IgG1中(1-10mg/毫升)，添加MDC(Sigma-Aldrich公司)的DMSO溶液直至终浓度为1-5毫摩尔/升(DMSO最终为2-10％)。添加纯化MTGase至终浓度0.05-1.0毫克/毫升。将反应混合物在50℃温浴5小时。用高效液相色谱法监测反应。可以将IgG的抗原肽(例如过量5倍)加入到反应混合物中以稳定抗体的Fab。

在另一方面，本发明的新方法使用MTgase将具有Gln基团的药物或连接子偶联到蛋白(如赖氨酸或N末端胺)的胺基上。这种耦合可以在高温下进行(如45-55℃)或在低温下进行(例如25-37℃)。点突变可用于在蛋白质(如抗体)中引入赖氨酸作为偶联位点。

在一个示例中，通过MTgase催化进行IgG1与1kDa PEG-CO-Gln-COOH或PEG-CO-Gln-Gly-NH2的PEG(聚乙二醇)化。该实验基本上与上述示例中所述的条件相同。用MW为1kDa的PEG-CO-Gln-COOH(HO-PEG-COOH与Gln偶联的产物。为PEG-COOH与Gln的胺之间形成酰胺键的产物)或PEG-CO-Gln-Gly-NH2在pH为7.0替换MDC至终浓度为1至2毫摩尔/升，获得PEG化的IgG1。PEG上的Gln通过MTgase催化与IgG1上的胺基偶联。

本发明还公开了可用于抗体-药物偶联物(ADC)和癌症治疗的新型毒素。目前MMAE(一甲基澳瑞他汀E E)或MMAF被用于ADC作为毒素与抗体偶联。本发明的新型毒素是N-取代的MMAE/MMAF。它们的结构如下所示(连接基团是与毒素偶联的部分)：

其中，R1，R2和R3独立地选自H，C1-C8烷基，卤代C1-C8烷基，C3-C8碳环，芳基，X-芳基，OR21，SR21，N(R21)2，-NHCOR21和-NHSOR2R21，X-(C3-C8碳环)，C3-C8杂环和X-(C3-C8杂环)，每个X独立地为C1-C10亚烷基。

在一些示例中，R1独立地为H或CH3或CH2F或CHF2或CF3，R2独立地为H或CH3或CH2F或CF3，R3独立地为H或CH3或CH2F或CF3。

所述结构还包括

其中R1、R2、R3中分别独立地选自H，C1-C8烷基，卤代C1-C8烷基，C3-C8碳环，芳基，X-芳基，OR21，SR21，N(R21)2，-NHCOR21和-NHSOR2R21，X-(C3-C8碳环)，C3-C8杂环和X-(C3-C8杂环)，每个X独立地为C1-C10亚烷基。N为1-5之间的整数。

在一些示例中，R1独立地为H或CH3或CH2F或CHF2或CF3，R2独立地为H或CH3或CH2F或CF3或异丙基，R3独立地为H或CH3或CH2F或CF3。

连接基团是毒素偶联到连接子或蛋白质的地方。它与当前的MMAE/MMAF ADC中使用的相同。

本发明还公开了抗体纯化和偶联的新策略。目前的抗体纯化方法使用价格昂贵，有潜在风险或泄漏蛋白A的蛋白A柱。新策略采用基于表位肽或模拟肽的亲和柱来纯化抗体，通过将表位肽或模拟肽偶联到固相载体作为柱填料如交联葡聚糖珠。其优点是成本低，更稳定的固定化化学，可以选择性地分离具有高结合亲和力的抗体，去除非结合性抗体/ADC，从而提高抗体或ADC的效价和治疗指标。在一个示例中：使用肽NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI(序列1)偶联到固相载体上以制备可用于纯化利妥昔单抗的亲和柱。使用基于肽的亲和柱(活性珠是市场上可买到的)的好处大于为每个抗体开发肤的成本。可以从文献或表位扫描获得许多肽序列用于线性和构象失礼的表位的确定(例如采用肽扫描技术)。该策略也适用于其它蛋白质药物，通过使用可与该蛋白质的结合位点结合的合成配体(例如亲和肽)来制备亲和柱。

此外，通过添加表位肽或模拟肽(游离形式或固定化的)或掩蔽肽(如在前抗体中使用的)，在抗体-药物偶联过程中形成肤-抗体复合物来选择性地保护在抗体结合位点的反应性氨基酸。同样，也可以通过使用可以掩盖蛋白质的活性结合位点的亲和配体来保护其它类型蛋白质的活性结合位点。该方法适用于化学和酶促偶联，从而为ADC提供更多的载药量，可允许更多的偶联反应(例如＞两种毒素)。类似的策略也应用于酶的偶联，通过添加酶底物来维持酶的活性。使用合成肽而不是制备蛋白质的方法很容易制造合成肽(低成本和更稳定)。利用固相肽合成法可大量制备肽。在一个示例中：在将药物偶联到抗体期间，使用肽NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI(序列1)来保护利妥昔单抗。肽NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI(序列1)可以在其抗原结合位点与利妥昔单抗结合。通过在利妥昔单抗化学偶联之前将NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI(优选大于2∶1比率)加入利妥昔单抗，利妥昔单抗的抗原结合位点得到保护。

本发明还公开了新的双特异性抗体及其应用。它们可用于治疗癌症、病原体、免疫紊乱和载体的靶向传递(逆转录病毒基因治疗)。

双特异性抗体可以是传统的单体形式：以合适长度柔性连接子连接的多价同源Fab形式以获得更高的亲和力(非双特异性)；靶向细胞/微生物上不同蛋白质的两个表位位点以获得较高亲和力的异质Fab形式；靶向靶蛋白的两个表位位点以获得较高亲和力的异质Fab形式。

双特异性抗体还可以是二聚体形式或三聚体或更高度的寡聚体形式：以合适长度柔性连接子连接的多价同源Fab形式以获得更高的亲和力(非双特异性)；靶向细胞/微生物上靶蛋白的两个表位位点的异质Fab形式以获得更高的亲和力；靶向细胞/微生物上不同蛋白的两个表位位点的异质Fab形式以获得更高的亲和力。用硼酸亲和柱或凝集素亲和柱进行单偶联来实现这种类型的双特异性抗体的构建(硼酸亲和柱或凝集素亲和柱也可以用于抗体纯化)。

双特异性抗体(BsAb)可用于抗细胞质内的靶目标。在一些实施例中，双特异性抗体为传统的抗体单体形式：以适合长度的柔性连接子连接的多价同源Fab形式以获得更高亲和力。天然抗体的铰链区不够长和不够柔韧，因此可能不能达到靶细胞上的两种抗原。使用柔性和适当长度的连接子连接抗体部分将大大增加结合亲和力，如图1所示。连接子可以是柔性肽连接子如聚甘氨酸/丝氨酸或合成聚合物如PEG。在本发明中，“/”标记是指“和”或“或”。

它也可以是靶向细胞/微生物上不同蛋白质的两个表位位点的异质Fab形式，以获得更高的亲和力。同样，上述方法也可以应用于将双特异性抗体结合到细胞/病原体上的两个不同抗原的过程中。具有柔性适当长度连接子的双特异性抗体可以容易地同时获得两种抗原的最佳结合，而传统方法则十分耗时，如图2所示。

另一种形式是使用双特异性抗体来靶向同一抗原上的两个不同的表位，这也将显著增加结合亲和力，如图3所示。

这些类型的双特异性抗体的构建：使用2-巯基乙胺选择性还原铰链区的二硫键，如图4所示，可以使用几种形式来制备这种类型的双特异性抗体，收率高，无二聚体形成以减轻工业规模分离过程的难度。下面显示两种形式：可以使用一些-SH反应活性试剂(或突变去除-SH)阻断游离-SH基团以防止-SS-键的再生，这将产生传统形式的双特异性抗体。

类似地，如图5所示，通过连接两种或多种全长抗体的双特异性抗体也可以用于上述应用和形式，并且可以如图6所示而容易地合成，其可以提供如IgA和IgM所示的更高的稳定性和更高的结合亲和力。

使用硼酸亲和柱或凝集素亲和柱进行单偶联来实现这种类型的双特异性抗体的构建。该策略对于抗体纯化也是有用的。该设计采用固定化的抗体来达到抗体的高产率单标记，以消除潜在的双标记抗体(产生聚合抗体)。

使用固定化的蛋白质预先制备单PEG化蛋白质。使用离子交换树脂来固定蛋白质。然而离子交换树脂可能不适用于抗体以阻断一半的FC，并且结合亲和力低，可能引起两侧的互换。

本设计利用靶向抗体上糖类的亲和基团选择性地保护抗体上的一个FC偶联位点以实现单偶联。合适的亲和树脂包括基于硼酸盐的亲和固相载体或基于凝集素的亲和载体，如图7所示。当抗体的一例受保护，另一例可以被选择性地修饰(如用酶如MTGase的位点特异性偶联)。

硼酸盐是一种糖类螯合剂，硼酸盐基柱被广泛用于分离糖类，许多是市场上可买到的(例如，从Sigma)。不同的硼酸盐对不同的糖也有不同的亲和力。凝集素是结合糖的蛋白，大部分来源于植物，可用作动物的抗病毒/细菌药物。不同的凝集素对不同的糖类有选择性。凝集素柱也用于糖类的研究。在ADC偶联中，凝集素或硼酸盐基树脂也可以成为大规模纯化抗体药物的有效工具。如果蛋白质有糖类的修饰，，它们也可以用于蛋白质而不是抗体的单标记。

如图8所示，如果可以有效地完成对抗体的药物单标记，就可以很容易地完成之后连接子的单标记。

利用抗靶细胞的两个标识物的双特异性抗体制备的ADC还会增加药物递送的特异性。

双特异性抗体可用于细胞质内靶目标。例如，在狼疮中，引起细胞损伤的关键自身抗体是抗dsDNA的自身抗体。它们在内化后从溶酶体释放并与细胞核结合引起细胞损伤。也有许多抗体是抗细胞质靶目标的。众所周知，许多细胞表面受体被内化后重新使用，这表明它不在溶酶体中被消化。

类似地，在ADC中可以使用抗微管蛋白的抗体来代替MMAE或其它毒素。因此，ADC本质上是抗体(例如抗HER2)-抗体(例如抗微管蛋白)偶联物，也就是双特异性抗体。使用抗体代替毒素作为效应物的优点在于抗体毒性小得多，并且可以具有高亲和性和特异性，因此降低在血液循环中由于毒素的潜在释放导致的副作用和毒性。此外，效应抗体也可以不靶向微管蛋白；它可以是抗肿瘤细胞中许多其它细胞质的抗体(例如端粒酶)。

ADC药物的一个问题是癌细胞只有有限的细胞表面标记物可以用于抗体，即使HER2也只在30％的患者中是阳性的。为了扩大上述双特异性抗体策略的应用，可以将靶目标扩展到癌症以外的疾病。许多疾病有很多细胞质靶目标，很多药物都是针对细胞质靶目标，双特异性抗体可作为治疗药物使用：一种抗细胞质靶目标；一种抗细胞表面标记物，以帮助细胞内吞的效应抗体。抗体二聚体的内吞化速度不应该是一个大问题，因为在许多情况下，大小不是影响内吞化的关键因素。一个更大的病毒可以很容易地内吞化。即使这是一个问题，还可以使用单体型Bs抗体或添加带正电的连接子来改善内吞。

一种抗体(抗gp120)-毒素偶联物已经被用于杀死HIV病毒感染的T细胞(HIV感染T细胞在T细胞表面表达HIV gp 120)。这种策略可以应用于许多其它病毒感染，因为感染细胞会在其表面表达病毒蛋白。然而，毒素是有毒的，有其局限性。

一个更普遍的策略是使用抗体-病毒抑制剂偶联物来代替。许多病毒抑制剂都是非常有效的，并且有合适的官能团，与抗体相连后对细胞毒性非常低。例如，抗gp120或CD3或CD4的抗体，可与HIV RT抑制剂(如AZT)或HIV蛋白酶抑制剂(如安普那韦)偶联以治疗HIV感染；抗CK18、CK19或HBV表面抗原的抗体与RT抑制剂偶联可用于治疗HBV感染。

使用病毒抑制剂的一个好处是，ADC中的抗体可以靶向正常的细胞表面标志物(例如，使用靶向用于T细胞的CD3和CD4来治疗HIV；使用靶向用于肝细胞的CK 18来治疗乙肝病毒和丙肝病毒)，其禁止使用毒素(会杀死正常细胞)，且毒性非常低。这样在病毒蛋白在宿主细胞表面表达之前，它就可以抑制病毒感染细胞。除了治疗病毒感染和癌症外，ADC在其它疾病中也可以有应用。

本发明还公开了用于抗体或适配体的构建的新策略，其可被酶活化，故被称为自组装前抗体和前适配体。

前抗体(例如由Cytomx公司开发的前抗体)是可以通过酶活化(在活化后对抗原具有结合亲和力)的抗体。前适配体可通过酶活化(在活化后与靶目标具有结合亲和力)的适配体。

美国专利(公开号8529898，公开号2010/0189651，公开号20130315906和公开号20140010810)公开了可被酶激活的前抗体的构建。

现有技术中的前抗体是包含靶结合部分(TBM)，掩蔽部分(MM)和可裂解部分(CM)的可活化结合多肽(ABPs，例如抗体)，提供了含有包含抗原结合结构域(ABD)的TBM，MM和CM的可活化抗体组合物。此外，提供了包含第一TBM，第二TBM和CM的ABPs。ABPs表现出“可活化的”构象，使得当未切割时，至少一个TBMs难以接近靶目标，而在能够切割CM的切割剂(例如酶)存在下切割CM之后则较容易。在现有技术中进一步提供了候选ABPs的文库，筛选以鉴定此类ABPs的方法，以及使用方法。进一步提供了具有结合VEGF，CTLA-4或VCAM的TBMs的ABPs，具有结合VEGF的第一TBM和结合FGF的第二TBM的ABPs，以及组合物和使用方法。现有技术公开提供了含有用掩蔽部分(MM)修饰的抗体或抗体片段(AB)的修饰的抗体。此类修饰的抗体可以进一步偶联于可裂解部分(CM)，产生可活化的抗体(AAs)，其中CM能够被切割，还原，光解或其它修饰。AAs可以表现出活化的构象，使得在例如通过在所述能够切割，降低或光解所述试剂的存在下对CM切割，还原或光解而除去所述MM之后，AB更容易与靶目标结合。

本发明公开了新型前抗体形式。在现有技术中，掩蔽部分MM被共价偶联到靶结合部分TBM(例如抗体、受体、如VEGF等受体的配体)。在本发明中，所述区别在于掩蔽部分MM不与所述TBM(例如，抗体、受体、诸如VEGF等受体的配体)共价连接。本发明中可裂解部分(CM)将两个MM连接，而不是如现有技术中CM将TBM与MM偶联。任选地，在MM和CM之间可以添加连接子/间隔(例如肽或PEG)，以允许两个MM与两个Fab位点(或诸如VEGF等其它结合部分)的最佳结合。如图9所示，TMB(如抗体)，MM，CM序列可以与现有技术中的基本相同，与这些现有技术公开不同的是它们之间的连接与上面所描述不同。现有技术中的串联MM策略也可以应用。本发明的前抗体是一种结合产生的复合物，而不是现有技术中的一个单一的分子。这种策略允许使用当前可用的抗体或蛋白质，而不需要开发新的偶联物，因此简化了药物开发过程。酶切割CM后通过暴露先前封闭的结合位点而激活TBM。给药是可以使用预先形成的复合物，也可以给病人双组分，允许在体内结合而形成复合物。

优选的抗体Fc或它的片段(例如Fc单链)可以连接到MM(例如通过化学偶联或蛋白融合/表达来连接)来增加它的半衰期(示例见下图)。如图10，11所示，除了Fc标记外，目前用于延长体内蛋白质半衰期的其它半衰期延长剂(如PEG、白蛋白、亲脂片段、Xten、人绒毛膜促性腺激素(hCG)β亚单位的羧基端肽CTP等)也可与MM共价相连，以减缓其体内灭活/消除。在一些实施例中，抗体可以被设计成配体(掩蔽部分)与抗体的结合不激活补体。抗体可以通过突变降低其与Fc γR和/或C1q的结合。这类抗体(或其它TBM)可作为靶向给药系统与药物偶联。可以使用过量的可裂解部分(CM)-MM偶联物来完全抑制抗体(或其它TBM)的结合。

在一个示例中，如图12所示，公开了曲妥珠单抗美坦辛自组装前抗体。在没有基质金属蛋白酶9(MMP-9)时，含有HER2模拟肽，连接子肽和MMP-9底物肽的LLGPYELWELSHGGSGGSGGSGGSVPLSLYSGGSGGSGGS(序列2)与Fc融合后，其与曲妥珠单抗美坦辛形成自组装复合物以阻断其与HER-2的结合亲和力。基质金属蛋白酶9(MMP-9)切割Fc-掩蔽肽，释放活性曲妥珠单抗美坦辛(Kadcyla)，其与肿瘤细胞上的HER2结合而达到靶向癌症治疗。

这两个MM也可以是不同的。一个与蛋白质的活性位点(如蛋白质的Fab或结合部分)结合，另一个与蛋白质的另一部分结合(非TBM结合/活性位点)。在这种情况下，有时其中的一个MM可以不再是掩蔽部分，它本质上是一个结合部分(如图13所示)。在图13所示例中，掩蔽部分是TBM的结合配体，而结合部分是可与抗体Fc结合的蛋白A。

本发明还公开了一种新型前适配体，它可通过酶活化，以恢复其结合亲和力。除了可活化结合多肽(如抗体)被适配体取代之外，其与前抗体相似。图14说明了前适配体的设计。在一种形式中，适配体与一个CM偶联，然后再和一个MM共价偶联。CM的序列可以与前抗体中使用的序列相同。MM是可以阻断适配体结合亲和力的亲和配体(例如可以与适配体结合域结合的肽或互补核酸序列)。当活化酶(或其它条件，如低pH值或还原性环境或光)不存在时，前适配体的靶目标结合亲和力被掩蔽部分阻断。当酶存在时，酶会切割CM而暴露之前阻断的适配体结合位点，从而激活前适配体。

可选地，CM也可以与适配体以非共价键连接，类似于在本发明中所描述的新型前抗体。例如图15所示，CM与一段核酸序列相连，这段核酸序列可与适体结合，因此与适配体以非共价键结合。

适配体也可以与药物偶联(如毒素、放射性元素、放射性元素螯合物)作为靶向给药系统，类似于抗体药物偶联物。适配体也可以与PEG或Fc结构域或其它聚合物(例如Amunix的Xten)或标记物(如可与白蛋白结合的亲和标记物)偶联，以延长其在体内的半衰期。适配体也可以有一个结合序列(由另一个核酸序列组成)，模仿抗体的Fc结构域，使适配体再循环。这个结合序列本质上是一个模拟Fc结构域的适配体，在酸性pH(pH＜6.5)而不是中性或更高pH条件下，其可以与FcRn结合。示例如图16所示。

本发明还公开了一种新的酶构建策略，称为基于结合的潜酶。基于结合的潜酶是与亲和配体(例如适配体或抗体)偶联的酶。当其亲和配体与靶目标不结合时，酶活性较低或无活性。当其与靶目标结合时，酶被活化显示出高催化活性，如图17所示。亲和配体与酶共价偶联，亲和配体还与一个酶抑制剂(例如可以掩盖酶催化中心的分子)或能阻断酶活性位点的分子偶联。当靶分子(抗原)不存在时，酶抑制剂与酶结合，阻止酶的活性。当靶分子(抗原)存在时，适配体与抗原结合，由于结合导致的适配体的构象改变抑制了酶抑制剂与酶的结合，因此暴露了活性酶催化位点而恢复了酶的活性。

在一个示例中，通过使用EDC将在PEG端具有-COOH基团的5′-PEG20-CGA GAG GTTGGT GTG GTT GG(序列3)-荧光素-3′与酶上的胺基偶联生成谷胱甘肤S-转移酶-PEG20-CGAGAG GTT GGT GTG GTG GG-荧光素-3′。-CGA GAG GTT GGT GTG GTT GG(序列3)-是结合凝血酶的DNA适配体。荧光素是谷胱甘肽S-转移酶的抑制剂。当没有凝血酶时，所得的偶联物具有低酶活性，当凝血酶存在时具有高酶活性。

图18示出了抗体与抗原结合产生的空间位阻，从抑制剂释放活性酶，从而恢复酶活性。酶抑制剂在抗体的抗原结合位点附近偶联，用连接子将酶与抗体偶联。当抗原不存在时，酶被抑制剂阻断。当抗原存在时，抗体将与抗原结合，抗体与抗原结合而产生的空间位阻阻止了抑制剂与酶的结合，因此恢复了酶的活性。

这一策略可用于提供治疗性酶的偶联物，当它与特定靶目标结合时，成为活化酶，从而提供更好的靶点特异性。例如，亲和配体能与某些细胞或病原体的表面标记物结合，酶能对细胞或病原体产生一定的生物学效应。当没有靶细胞/病原体存在时，酶是无活性的，当承载有细胞/病原体的标记物存在时，酶偶联物与细胞/病原体结合，酶被活化，对细胞或病原体产生治疗作用。在一个示例中，亲和配体是一种适配体或抗HER2的抗体，酶是一种蛋白酶或一种可以将抗癌前药转化为其活性形式的酶。这个潜酶可以用于选择性地灭活HER2阳性癌细胞。在另一个示例中，亲和配体是一种适配体或抗gp-120的抗体，酶是一种能破坏病毒颗粒的水解酶。这一潜酶可以被用来选择性地灭活HIV病毒。

可选地，亲和配体可以结合目标大分子的一部分(或其复合物)而活性酶可以作用于目标大分子的另一部分(或其复合物)，当目标大分子(或其复合物)存在时，这种酶将活化而作用于目标大分子(或其复合物)。在一个示例中，靶目标是淀粉样蛋白斑块。亲和配体可以与淀粉样蛋白斑块结合，酶是一种可以切割肽键的水解酶。这一潜酶可以用来水解淀粉样蛋白斑块。该方法还提供了一种研发新酶的新方法，将一个特定的配体与具有广泛底物谱的酶结合起来，由此产生的酶具有更高的选择性：只对能与亲和配体结合的靶目标发挥作用。

如图19所示，另一种形式是使用ABP(抗体结合配体)-连接子-EIP(酶抑制配体)形成与抗体-酶融合蛋白结合而形成的非共价复合物，其中酶的结构域被EIP抑制失活。ABP可以是在前抗体中使用的抗原或MM。EIP可以是一种酶抑制剂，或能掩盖酶活性中心的掩蔽分子。优化连接子的长度可以保证ABP和EIP与融合蛋白的最大结合。当抗体结合靶目标存在时，ABP-连接子-EIP被取代，恢复了酶活性。当结合靶目标不存在时，可以添加过量ABP-连接子-EIP以抑制酶活性到所需的水平。在一些实施例中，ABP也可以被偶联于抗体，这将生成一种与抗体-酶融合蛋白的共价复合物。可能形式的示例如图20所示，除抗体或抗体片段外，靶目标的其它亲和配体如适配体也可用于与酶偶联/融合。

本发明公开了基于切割的潜酶构建的新策略。基于切割的潜酶是一种可活化酶，其经第二种酶(或其它条件，如低pH值或还原环境)可裂解部分与酶抑制剂偶联，一种类似于前抗体的机制。当没有第二种酶存在或合适的切割条件时，该酶具有低活性或无活性。如图21所示，当第二种酶存在或其它裂解条件时，酶被激活而显示高催化活性。第二种酶可以与可活化酶或具有不同催化活性的酶相同。

可裂解部分与酶共价偶联，可裂解部分还与酶抑制剂(例如一种可掩蔽酶催化中心的分子)偶联。在一个示例中，使用EDC将在PEG端具有-COOH基团的5′-PEG20-CCCCAAA-荧光素-3′与酶上的胺基反应偶联，生成谷胱甘肽S-转移酶-PEG20-CCCCAAA-荧光素-3′。-CCCCAAA是可被脱氧核糖核酸酶切割的DNA片段。荧光素是谷胱甘肽S-转移酶的抑制剂。当不存在脱氧核糖核酸酶时，所得偶联物具有低的酶活性，并且当存在脱氧核糖核酸酶时，其具有高的酶活性。

这一策略可用于提供一种治疗性酶偶联物，其在接近含有第二种酶的靶点时被激活，从而提供更好的靶特异性。例如，第二种酶可以在某些细胞或病原体的表面或内部，而且所述酶可对细胞或病原体产生一定的生物学作用。当没有靶细胞/病原体存在时，所述酶处于非活性的状态，当携带细胞/病原体的第二种酶存在时，所述酶偶联物将被细胞/病原体裂解，所述酶具有活性，从而对细胞或病原体产生效应。在一个示例中，可裂解部分是一个可被蛋白酶裂解的特殊的肽序列，所述酶是一种可以将抗癌前药转化成其活性形式的酯酶。这种潜酶可以选择性灭活所述富含蛋白酶的癌细胞。

此外，所述潜酶还可以与亲和配体(如抗体)偶联或融合，以提供更高的选择性。在一个示例中，抗体是抗HER2的抗体，因此潜酶-抗体偶联物可以用来杀死HER-2阳性癌细胞。在一个示例中，可裂解部分和连接抗体和酶(例如目前在ADC药物中使用的酶)的连接子是细胞溶酶体中酶的底物。在胞吞作用后，溶酶体中的潜酶-抗体偶联物被裂解，释放活性酶以杀死癌细胞。可以将亲水碳链引入到偶联物中以帮助打破溶酶体膜。

潜酶也可以当作信号放大系统使用(如应用于酶联免疫吸附测定(ELISA))。例如，可激活酶可以是HRP，而第二种酶可以是DNase。ELISA中检测抗体与DNase偶联。底物溶液中含有潜酶和HRP底物，从而可以用于信号放大。

本发明公开了一种通过将蛋白与蛋白-抗体免疫复合物组合并将其施用于患者来提高生物活性蛋白质的体内半衰期和效力的方法和制剂组合，其中蛋白质的含量大于抗体的结合能力以在制剂中提供游离的未结合蛋白。本发明还公开了可作为低聚物形式的潜在药物的生物活性蛋白(如三聚体的形式，其将3种蛋白与可裂解或非裂解的连接子连接)，以及其在生长激素寡聚体(如三聚体)中应用，以增加其体内半衰期和效力。

亲水聚合物修饰蛋白质是调控蛋白质药代动学的有效策略。然而，缓慢降解或不可生物降解材料的偶联物，如聚乙二醇(PEG)，当其分子量(MW)很高时，特别是在肾上皮细胞中，会引起长期的细胞空泡化。更多可降解聚合物的偶联物，如多糖，具有很大的免疫毒性风险。具有完全降解能力、体内循环长、低免疫和化学毒性的聚合物作为蛋白质偶联物成分将是最有益的。在一个方面，目前的发明使用可生物降解的连接子连接PEG嵌段聚合物(或其它合成聚合物)，以产生大分子量生物可降解的PEG(或其它合成聚合物)。由此产生的大分子量PEG(或其它合成聚合物)可以分解成小的PEG(或其它合成聚合物)，以增加药物效力和PEG(或其它合成聚合物)的清除，并减少大分子量PEG(或其它合成聚合物)的毒性。分子量小于70KD的蛋白质可以通过肾脏迅速清除，人们使用PEG来偶联蛋白质，以增加其分子量以降低肾脏的清除率。然而，大分子量的PEG(MW＞40KD)会造成肾脏损害，并且具有高的粘度，使蛋白药物注射困难。可生物降解的连接子的示例包括肽，酯，聚乳酸，碳水化合物，聚缩醛或聚缩酮(例如美国专利#US8524214中描述的)，生物可降解的亲水性聚缩醛，聚1-羟甲基乙撑羟甲基甲缩醛，聚磷酸酯，Mersana′s聚合物等。可被内源性肽酶/蛋白酶切割的肽和ADC中使用的那些可裂解连接子(例如腙连接子，二硫键连接子，肽连接子例如-Val-Cit-)也可以用于连接小PEG片段/嵌段(或其它合成聚合物)，使其可发生酶裂解，酸性裂解(例如在溶酶体pH下的质子催化水解)，蛋白水解或氧化还原裂解。

当使用PEG(聚乙二醇)时，其具有以下通用结构：(PEG-生物可降解连接子)N-蛋白质，其中N为是整数。可任选地在(PEG-生物可降解的连接子)N与蛋白质之间存在连接部分(例如化学键或偶联连接子)以将它们连接在一起。图22给出了一个示例，它是由两个PEG嵌段与可生物降解的聚乳酸连接而成的嵌段聚合物。PEG的一端具有-COOH基团，可以用于偶联蛋白质表面上的赖氨酸的胺基团。其它合成聚合物如聚乙烯醇也可以代替PEG。

在另一个示例中，构建了HGH二聚体。人类生长激素(HGH，MW＝22KD)由于其快速的肾脏清除需要每日注射。可生物降解的HGH二聚体可以作为一种更好的替代品：HGH-PEG(20KD)-可切割的连接子-PEG(20K)-HGH。其MW＝85K＞70K(肾清除的截留分子量)。在一个实施方案中，PEG具有可以通过mTgase与HGH上的Gln偶联的胺基末端。图23示出了不同形式的可生物降解地PEG和可生物降解的HGH二聚体。

可选地，3个蛋白质分子可以通过两个连接子共价连接，形成一个三聚体，这将进一步增加它的大小和分子量，从而延长它在内体的半衰期。连接子可以是可生物降解的，也可以是不可生物降解的。优选地产生的三聚体的分子大于60KD。在一些实施例中，其大于70KD。优选的连接子应该具有优选的分子量，使得三聚体的总分子量大于60KD。连接子可以是PEG、肽或其它生物学上可接受的连接子。图24示出了HGH三聚体的一个示例，它可以延长HGH的体内半衰期。

连接3个HGH分子的两个连接子可以是相同的。例如，它可以是MW在500D-15KD之间的亲水性肽(例如富含Ser，Thr，Glu，Asp的肽)或PEG。

图25示出了HGH三聚体及其制备的另一个示例。每个生长激素有两个修饰，产生两个反应基团。R1-PEG-NH2和R2-PEG-NH2可以通过MTGase位点特异性地偶联在HGH上。R1和R2是活性基团(如在点击化学使用的基团，-SH/马来酰亚胺对等)，其能特异性地偶联在一起形成共价键。接着将产生的两个HGH混合，通过连接R1和R2形成共价键。为确保形成三聚体为主要产品而不是四聚体和更高程度的聚合物，R1-HGH-R1可以添加过量(例如为R2-HGH-R2的10倍以上)，或在偶联前一个R1可以被保护或封闭。

如图26所示，三聚体也可以由具有三个臂的的连接子来构造。例如，3臂连接子可以是三臂PEG或三臂亲水肽(如富含Ser、Thr、Glu、Asp的肽)或其分子量在2KD-20KD之间的偶联物。在另一个示例中如图27所示，连接子1和连接子2共价偶联。连接子2和连接子1用MTGase偶联至HGH的Gln，然后使用连接子1和连接子2上的反应基团将其偶联在一起。连接子1和2可以是MW为500D-10KD的官能化PEG。

可选地，药物活性蛋白的体内半衰期延长可以应用具有多个亲和基团的连接子以非共价键交联蛋白质而实现(亲和基团可以是抗体或其片段如Fab，适配体或亲和肽，亲和基团可以用噬菌体显示或类似于前抗体中使用的掩蔽肽的研发或筛选或设计合理的方法产生)。任选地连接子是可生物降解的(如酶可裂解肽)。亲和基团可以在蛋白质活性位点或其非活性部位与其结合。

图28示出了两种交联HGH以延长其体内半衰期的方式。一种方式是使用具有与HGH两端非受体结合位点结合的亲和基团的连接子交联HGH。在一个示例中，亲和基团是一个30氨基酸的肽，而连接子是具有10个氨基酸的肽或短PEG。另一种方式是具有一个携带多个与HGH受体结合位点结合的亲和基团的连接子。

具有多个亲和基团的连接子可以是含有多个亲和基团的蛋白质或肽，例如抗体，因为每个抗体具有两个结合位点。亲和基团的结合位点也可以人工引入到药物活性蛋白上。例如，生物素可以通过表达或化学偶联连接到靶蛋白上，亲和素可用于交联所述生物素化的蛋白以得到较长的体内半衰期。在一些示例中，用赛默飞世尔的EZ-Link磺基-NHS-生物素化试剂盒(#21425)或EZ-Link戊胺-生物素(#21345)应用试剂说明书里提供的方法对蛋白进行修饰，然后透析去除未偶联的生物素。接下来将亲和素或链霉亲和素添加到生物素化蛋白中，以1∶2的比例在PBS溶液中混合30分钟以形成结合复合物，与原来的蛋白质相比，它的体内半衰期更长。

另一种方法是使用蛋白质特异性抗体或抗体片段或适配体来形成免疫复合物或适配体蛋白复合物，这将具有更高的分子量(也可以保护蛋白质不受酶的降解)，从而呈现较缓消除速度。抗体/适配体的结合可以靶向蛋白质的活性位点或非活性位点。在一个示例中，抗HGH非结合区域的抗体与HGH以1∶2的比例混合，形成其免疫复合物，该复合物可用作具有延长半衰期的治疗药物以施用于病人。它也可以是结合一种蛋白质形式的两种抗体(类似于ELISA中所见的三明治式结合形式)。任选地与抗体结合的蛋白质不激活补体，可以通过对抗体进行结构改造来实现，突变可引入抗体FC区以消除其补体(例如c1q)结合能力，CR1结合能力和FcγR结合能力。图29示出了使用上述策略的两个示例。结合靶蛋白的两个不同的表位的双特异性抗体也可以用来交联蛋白质。

可选地，靶向两个不同表位的两个抗体可以连接在一起(例如融合或偶联)，作为一种双特异性抗体来交联靶蛋白。图5和图6示出了这种两个抗体偶联物的一个示例。靶向蛋白的不同抗原表位的抗体或抗体片段(如HGH)可进行筛选，以获得提供最佳效能和药代动力学特性的抗体/抗体片段(如体内半衰期)。

在一些实施例中，含有抗原表位结合区域的抗体片段被用来形成免疫复合物，以延长蛋白质的半衰期。可从F(ab′)2(110KD)，Fab′(55KD)，Fab(50KD)，Fv(25KD)(可通过交联来提高其稳定性)，scFV，di-scFV，sdAb等中选择合适的抗体片段。在一个示例中，抗HGH的Fab或半个IgG(rIgG)可以与HGH以1∶1的比例混合，形成免疫复合物，其可以作为一种控释HGH药物。不同的Fab(如Fab与不同区域的HGH结合)可以通过筛选来达到理想的体内稳定性。由此产生的结合复合物其MW＞70KD，因此肾脏清除率降低。Fab的MW(50KD)确保了其与HGH的清除率相似，从而减少了抗HGH的Fab的积累。

任选地，本发明使用的包括FC融合蛋白的抗体或抗体片段可以在其FC区上进行改造和突变以消除其补体(例如c1q)结合，与CR1结合和与FcγR结合。Fc区域也可以进行改造/突变，以调整其FcRN结合能力(例如，为含Fc的蛋白的较长体内半衰期提供更高的结合亲和力)。

本发明公开了以蛋白质为单体构建块的蛋白质药物三聚体(或更高程度低聚物)用于蛋白质药物半衰期延长的方法。许多小的治疗蛋白质(例如10KD-30KD)需要与高MW的PEG偶联，以减少快速的肾清除(＞60KD)。高MW的PEG可能导致细胞空泡化、蛋白质活性降低、溶解性问题和高粘度；而单PEG化可能无法对蛋白酶/肽酶提供足够的保护。本发明公开了延长半衰期的蛋白三聚体(或更高的寡聚体)。

图30示出了使用低分子量的PEG(或肽)作为连接子的HGH(人类生长激素)三聚体以延长半衰期的示例，及其合成。适用于本发明的HGH，可以是垂体起源的生长激素(191氨基酸，美国专利公开号US8841249中公开的SEQ ID 1，其cDNA编号为DB00052(BIOD00086，BTD00086)。例如，两端有-NH2基团的低分子量的PEG(例如它的MW可以在5KD-20KD之间)可以用作连接子，可选地，也可以使用具有30-200个氨基酸残基且两端有两个NH2基团的肤。用谷氨酰胺转移酶(TGase)将连接子与HGH中的谷氨酰胺偶联进行偶联。优选的是在HGH中谷氨酰胺40和/或谷氨酰胺141的位置对应的位置上引入连接子。使用谷氨酰胺转移酶(TGase)，特别来自茂原链轮丝菌或利迪链霉菌的微生物转谷氨酰胺酶(mTGase)，可以选择性地在HGH中谷氨酰胺40和/或141位置引入连接子，而剩下的11个谷氨酰胺残基不受影响，尽管谷氨酰胺是谷氨酰胺转移酶的底物。用MTGase偶联的具体步骤可以在许多出版物中找到，例如美国专利号US8841249，可以很容易地用于本发明中。在图30中所示的示例中，将过量的连接子(例如相对于HGH 10-20倍过量的二氨基PEG)添加到HGH中，用mTGase进行偶联。将所产生的在每一个HGH单体上携带两个连接子的HGH纯化，以去除未偶联的连接子和未偶联/单偶联的HGH。然后过量的非偶联HGH(如20倍过量)与先前制备的双偶联HGH混合，并通过mTGase进行偶联。由此产生的偶联物是一种HGH三聚体，所述HGH三聚体在中间的HGH有两个连接子，在每个末端HGH有一个连接子。使用特定的mTgase可以在谷氨酰胺40和/或141位置进行位点特异性偶联。

例如，美国专利申请13/318,865和12/527,451中描述了使用一种谷氨酰胺酶将PEG与谷氨酰胺残基上HGH偶联在一起。该方法可根据本发明(连接子的连接以及与HGH偶联的连接子)使用。使用的TGase可以是美国专利5156956里公开的微生物转谷氨酰胺酶。在一个实施例中，HGH溶解在三乙醇胺缓冲液中(20mM，pH 8.5，40％v/v乙二醇)。该溶液与含胺供体连接子的溶液混合，如NH2-PEG-NH2溶解在三乙醇胺缓冲液中(200mM，pH 8.5，40％v/v乙二醇，在胺供体溶解后，以稀盐酸将pH值调整为8.6)。最后，将溶解于pH为6.0的20mM磷酸盐缓冲液中的mTGase(0.5-7mg/g HGH)溶液加入，调整体积到5-15mg/mlHGH(20mM，pH8.5)。混合物在室温下孵育1-25小时。反应混合物由CIE HPLC监测。然后将产生的在每个蛋白质上有两个连接子的HGH提纯。

可选地，如果将过量的单偶联HGH(例如过量20倍)与先前制备的双偶联的HGH混合并且用mTGase进行偶联。所得偶联物则是在所有HGH上具有两个连接子的HGH三聚体，如图31所示。在一些实施方案中，用于制备单偶联的HGH的连接子一端具有-NH2基团而另一端不具有-NH2基团。通过使用具有不同底物特异性的特定mTgase并改变偶联顺序和反应物比例，本领域技术人员可以容易地制备不同的三聚体或寡聚体。

其它位点特异性偶联方法也可用于构建寡聚体。它可以是选择性化学合成，如点击化学，硫醇-马来酰亚胺偶联方法等。它也可以是酶基偶联而不是mTgase偶联，例如基于转肽酶的偶联以及不同的偶联方法的组合。转肽酶，特别是来自金黄色葡萄球菌的转肽酶A作为一种有用的蛋白质工程工具已经被人们认识了一段时间，它将含有寡聚甘氨酸的多肽或小分子连接至含有转肽酶-五肽底物序列的蛋白质(LPXTG是金黄色葡萄球菌转肽酶A的五肽底物序列，LPXTG：Leu-Pro-any-Thr-Gly)，例如：RLPXTG+GGGGG→LPXTGGGGG。基于转肽酶的偶联方案可以在许多出版物中找到(例如，美国专利申请US 14/774,986)，并且可以容易地应用于本发明。

用于构建蛋白质寡聚体(例如：三聚体)的连接子也可以包含一个或多个可被切割/可生物降解的区域(图32)，它本质上是一个与之前描述的类似的可被切割/可生物降解的连接子。这将使蛋白质单体或低程度的寡聚物在体内缓慢释放，从而更好地控制体内的稳定性。

这种方法可以最少连接子(如PEG)含量有效地减少肾清除。可以使用低分子量PEG(如1KD-5KD)来达到偶联物的总MW＞60KD，以避免应用高分子量PEG引起的相关问题，线性结构也增加了其流体动力学尺寸。它可以提供更好的保护，防止蛋白酶降解。由于多聚产生的比单聚乙二醇化蛋白质多的药物负荷和较高的活性将减少药量和体积，以提高皮下注射的舒适度。它将提供明确的结构，并允许位点特异性偶联。比三聚物更高聚合度(如四聚物)、可生物降解的连接子和非PEG连接子(PVA连接子、肤基连接子等)都可以很容易地被采用。它适用于许多分子量在10KD-30KD的蛋白质。蛋白质的例子可以在众所周知的出版物和现有技术里找到，包括但不局限EPO(促红细胞生成素)，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，因子VIII，因子IX，IL-1，IL-2，胰岛素，胰岛素类似物，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，纤维蛋白原，促血小板生成素(TPO)和生长激素释放激素(GHRH)。

蛋白质三聚体、四聚体或更高程度的寡聚体也可以通过表达作为重组蛋白来产生，其中每一个单体由一个柔性肽连接区域从一个单体的C端连接到另一个单体N端。蛋白质三聚物/四聚物或多聚体药物是作为一个整体蛋白质来表达，所述整体蛋白质具有几个由亲水性肽连接区连接的单体单元，例如富含Asp，Glu，Ser/Gly/Ala的含有20-200AA(氨基酸)的肽，负电性的Asp/Glu可以抑制蛋白质药物的细胞内吞作用以降低受体介导的清除，可选的蛋白酶可切割序列可并入连接区以调整其PK。在一些实施例中，适用于本发明的肽连接子包含10-150个氨基酸；优选15-100个氨基酸；甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、脯氨酸(P)残基的总和约超过了连接子总氨基酸残基的90％以上；谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)残基的总和约超过了连接子总氨基酸残基的20％。在某些实施例中，优选谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)残基的总和约超过了连接子总氨基酸残基的30％。优选地所述连接子是柔性的，并显示一个随机的二级/三级结构。任选地，所述连接子包括一个或多个可裂解序列(如肽酶/蛋白酶可裂解序列)。优选地，所述连接子约占所得寡聚物的总氨基酸残基的不到50％。在一些实施方案中，更优选地，所述连接子约占所得寡聚物的总氨基酸残基的不到40％。在一些实施方案中，更优选地，所述连接子约占所得寡聚物的总氨基酸残基的不到30％。所得到的低聚物优选的分子量＞60KD。一个所述连接子的示例是-GG(ASEGSDEAEGSEASGEGDG)5-GG(序列4)。图33示出了重组表达的HGH三聚体及其构建的示例。它可以用大肠杆菌表达体系来制备。具有连接子序列的人类生长激素三聚体使用与来自垂体来源(191个氨基酸)的HGH相同的HGH/生长激素，其cDNA编号：DB00052(BIOD00086，BTD00086)。它用6-His或其它序列标记以用于纯化。所述肽连接子是-GGD(GSEGSEGEASEGSAEGEG)2-DGG-(序列5)。重组蛋白的表达方案对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且来自出版物的方案可以很容易地应用于本发明。

还可以通过重组技术将N末端或C末端修饰物引入寡聚物至寡聚物的N末端和/或C末端。抗体FC或白蛋白也可以与上述寡聚体一起表达。例如，它们可以通过重组技术连接到寡聚体的N末端或C末端。寡聚体的N末端和/或C末端也可以添加修饰物序列如与采用重组技术的连接子相似的柔性肤序列，以调节其体内半衰期，如图34所示。也可以使用烷基/脂肪酸偶联。由重组表达产生的蛋白质寡聚物还可以用位点特异性偶联方法(例如转肽酶或mTgase偶联)进一步与半衰期修饰基团(例如PEG)偶联。

蛋白质寡聚体也可以用重组技术和位点特异性偶联的结合方式构建。首先可以用重组技术构建具有反应活性N末端和/或C末端肽末端的蛋白质单体。接下来，可以使用反应活性N端和/或C端肽末端作为连接区，以位点特异性偶联方法与其它蛋白质或连接子(例如肽或PEG)偶联。例如，蛋白质单体可以用反应活性末端例如Gln/Lys来表达，用于基于mTgase偶联或用于基于转肽酶偶联的LPXTG/GGGGG。任选地，在表达过程中可以在天然蛋白和反应活性末端之间添加肽连接子。该策略可以避免直接表达蛋白质寡聚体时的潜在蛋白折叠问题。例如，一个HGH的N末端在表达过程中加入GGGGG，另一个HGH的C末端在表达过程中通过柔性肽连接子(例如上述的富含G/A/D/E的肽)加入LPETGX。接下来，两种修饰的HGH单体通过转肽酶介导的偶联反应偶联在一起。在另一个示例中，表达具有N端GGGGG和C端LPETGX(例如GGGGG-肽连接子-HGH-肽连接子-LPETGX)的HGH，接着以其作为单体以通过转肽酶介导的偶联反应来制备寡聚体，所得寡聚体可以是具有不同聚合度的HGH寡聚体(例如二聚体，三聚体，四聚体等)的混合物。在另一个示例中，使用转肽酶介导的偶联反应，过量的(例如5～10倍)表达的HGH-肽连接子-LPETGX与表达的GGGGG-HGH-肽连接子-LPETGX反应，以产生HGH-肽连接子-LPET-GGGGG-HGH-肽连接子-LPETGX，其是一种HGH二聚体。接下来，使用转肤酶介导的偶联反应将上述纯化的HGH二聚体与GGGG-HGH偶联以形成HGH三聚体：HGH-肽连接子-LPET-GGGGG-HGH-肽连接子-LPET-GGGGG-HGH。表达的HGH也可以与带有反应性基团的合成分子(例如修饰的PEG)偶联，然后使用所得的HGH构建寡聚体。例如，表达的HGH-(G)n-LPETG与GGGGGG-PEG-叠氮化物通过转肽酶偶联以形成具有叠氮基团的HGH，接着使用点击化学将HGH叠氮化物与具有两个炔基的HGH(其可通过mTgase将炔烃-PEG-NH2与HGH偶联来制备)偶联。该产物是通过叠氮化物与炔烃的环加成产物偶联的HGH三聚体。

本说明书中提到的所有专利和出版物均表示本发明所属领域技术人员的水平。所有的专利和出版物以相同的程度通过引用并入本文中，如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示以通过引用并入本文中。上述发明涉及许多众所周知的化学、仪器、方法和技能。本领域技术人员可以很容易地从教材如化学教材、科学期刊论文和其它公知参考来源中找到相应知识。

Claims (15)

1.一种延长蛋白质体内半衰期的方法，包括：

以线性形式将至少3个蛋白质单体与连接子连接，以形成总分子量大于60,000的低聚物，其中所述连接子选自肽或合成聚合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述连接子组合的分子量小于所述低聚物的分子量的30％。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述合成聚合物是聚乙二醇。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述低聚物为三聚体。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述低聚物为四聚体。

6.一种延长体内半衰期的人体生长激素(HGH)形式，包括至少3个HGH单体，所述至少3个HGH单体以线性形式与连接子连接，以形成总分子量大于60,000的低聚物，其中所述连接子选自肽或合成聚合物。

7.如权利要求6所述的HGH形式，其中所述连接子组合的分子量小于所述低聚物的分子量的30％。

8.如权利要求6所述的HGH形式，其中所述合成聚合物是聚乙二醇。

9.如权利要求6所述的HGH形式，其中所述低聚物为三聚体。

10.如权利要求6所述的HGH形式，其中所述低聚物为四聚体。

11.一种可活化结合适配体，包括：

靶结合部分(TBM)，

掩蔽部分(MM)，其能够抑制所述TBM与靶目标结合，以及

可裂解部分(CM)，其中所述CM位于所述可活化结合适配体中，使得在靶目标存在的情况下处于裂解状态时，所述TBM与所述靶目标结合，而在靶目标存在的情况下处于未裂解状态时，所述TBM与所述靶目标的结合受到所述MM的抑制。

12.如权利要求11所述的适配体，还进一步偶联有毒素。

13.如权利要求11所述的适配体，还进一步偶联有放射性物质。

14.如权利要求11所述的适配体，其中所述掩蔽部分是核苷酸。

15.如权利要求11所述的适配体，其中所述CM是酶底物。