CN104540518A - 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般性涉及可活化的抗体，其包括掩蔽部分（MM）、可切割的部分（CM）和特异性结合表皮生长因子受体（EGFR）的抗体（AB），以及制造和在多种治疗性、诊断性和预防性适应症中使用这些可EGFR可活化的抗体的方法。

Description

结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
相关申请
本申请要求2012年4月27日提交的美国临时申请号61/639,796，2012年6月20日提交的美国临时申请号61/662,204，2013年1月4日提交的美国临时申请号61/749,220，2013年1月7日提交的美国临时申请号61/749,529和2013年2月11日提交的美国临时申请号61/763,237的优先权，其每个通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本发明一般性涉及特异性结合表皮生长因子受体（EGFR）的可活化的抗体，特异性结合EGFR的缀合的可活化的抗体，以及在各种治疗性、诊断性和预防性适应症中制备和使用这些抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体的方法。
发明背景
基于抗体的疗法已证明对于某些疾病的治疗是有效的，但在某些情况下，由于广泛的靶表达导致的毒性已限制了它们的治疗有效性。此外，基于抗体的治疗剂已经表现出其它的限制，例如施用后从循环的快速清除。
在小分子治疗剂的领域中，已开发了提供活性化学实体的前药的策略。这样的前药以相对无活性（或活性显著较低）的形式被施用。一旦施用，前药在体内被代谢成活性化合物。这样的前药的策略可以提供药物对其预定靶的增加的选择性，以及降低的副作用。
因此，在基于抗体的治疗剂领域对于模仿小分子前药的理想特性的抗体存在持续的需求。
发明概述
本发明提供可活化的抗体，其包括偶联到掩蔽部分（masking moiety，MM）的特异性结合表皮生长因子受体（EGFR）的抗体或其抗原结合片段，使得所述MM的偶联减小了所述抗体或其抗原结合片段结合EGFR的能力。在一个优选的实施方案中，所述MM经由序列偶联，所述序列包括蛋白酶底物，例如，与EGFR共定位于对象中的治疗部位的蛋白酶。本文提供的可活化的抗EGFR抗体在循环中稳定，在意向治疗和/或诊断部位而非正常，即，健康组织，被活化，并且，当被活化时，显示至少与相应的未修饰的抗体相当的对EGFR的结合。
本发明提供缀合的可活化的抗体，其包括偶联到掩蔽部分的特异性结合表皮生长因子受体（EGFR）的抗体或其抗原结合片段，使得所述MM的偶联减小了所述抗体或其抗原结合片段结合EGFR的能力，并且其中可活化的抗体缀合到一种或多种额外的试剂。在所述缀合的可活化的抗体的一个优选的实施方案中，所述MM经由序列偶联，所述序列包括蛋白酶底物，例如，与EGFR共定位于对象中的治疗部位的蛋白酶。本文提供的缀合的可活化的抗EGFR抗体在循环中稳定，在意向治疗和/或诊断部位而非正常，即，健康组织，被活化，并且，当被活化时，显示至少与相应的未修饰的抗体相当的对EGFR的结合。
本发明提供了在对象中使用治疗性分子治疗、预防和/或延缓适应症发作或进展，或减轻适应症症状的方法，所述适应症例如，与EGFR的异常表达和/或活性相关的疾病或病症，例如，EGFR相关病症，所述治疗性分子例如，在活化状态结合EGFR的可活化的抗体和/或在活化状态结合EGFR的缀合的可活化的抗体，特别是当活化时结合和中和或以其它方式抑制EGFR的至少一种生物活性和/或EGFR介导的信号传导的可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体。
本文所述的可活化的抗体在活化状态结合EGFR并包括（i）特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段（AB），其中所述AB是或者衍生自西妥昔单抗；（ii）掩蔽部分（MM），其抑制在未切割状态的可活化的抗体的AB对EGFR的结合；和（c）偶联到所述AB的可切割部分（CM），其中所述CM是多肽，其作为蛋白酶的底物发挥作用。
在一些实施方案中，MM对于结合AB具有的平衡解离常数大于AB对EGFR的平衡解离常数。
在一些实施方案中，MM对于结合AB具有的平衡解离常数不超过AB对EGFR的平衡解离常数。
在一些实施方案中，MM不干扰或竞争在切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，蛋白酶与EGFR在组织中共定位，并且当可活化的抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶切割可活化的抗体中的CM。在一些实施方案中，所述蛋白酶在不显著表达EGFR组织中无活性或者活性显著较低。在一些实施方案中，所述蛋白酶在健康，例如非患病的组织中无活性或者活性显著较低。
在一些实施方案中，在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
在一些实施方案中，可活化的抗体在MM和CM之间包括连接肽。
在一些实施方案中，可活化的抗体在CM和AB之间包括连接肽。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），并且其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方案中，所述两个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方案中，所述AB对于结合EGFR具有约100nM或更低的平衡解离常数。
在一些实施方案中，所述MM是长度约2-40个氨基酸的多肽，例如，不超过40个氨基酸长。
在一些实施方案中，所述MM多肽序列不同于EGFR，并且MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体不超过50%相同。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少20倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少100倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少200倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的解离常数（Kd）比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少20倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少100倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少1000倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少10,000倍。
在一些实施方案中，CM是长度至多达15个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，当在体外测定时使用靶置换测定（target displacement assay），在EGFR的存在下，当CM未切割时，相比CM切割时MM使AB结合EGFR的能力减少至少90%，所述靶置换测定诸如，例如在PCT公开号WO 2009/025846和WO 2010/081173中描述的测定。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其免疫学活性片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F（ab'）2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体以及单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，结合EGFR的这种抗体或其免疫学活性片段是小鼠的、嵌合的、人源化的或全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，在活化状态的可活化抗体结合表皮生长因子受体（EGFR），包括特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段（AB），其中AB包括选自以下的重链氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10，以及包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸；掩蔽部分（MM），其抑制在未切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR，其中所述掩蔽部分包括氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14)；和偶联AB的可切割部分（CM），其中CM是作为蛋白酶的底物发挥作用的多肽，并且其中CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)，其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。
在一些实施方案中，在活化状态的可活化抗体结合表皮生长因子受体（EGFR），包括特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段（AB），其中AB包括选自以下的重链氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10，以及包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸；掩蔽部分（MM），其抑制在未切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR，其中所述掩蔽部分包括氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14)；和偶联AB的可切割部分（CM），其中CM是作为蛋白酶的底物发挥作用的多肽，并且其中CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)，其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由编码选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由编码与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由编码选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包括SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由编码与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由编码选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包括SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由编码与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包括选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包括SEQ ID NO: 67的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包括与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 67的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包括选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包括SEQ ID NO: 27的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包括与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 27的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包括选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包括SEQ ID NO: 3的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包括与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 3的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由编码选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包括编码包括与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由编码选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包括SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包括编码包括与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由编码选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包括SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包括编码包括与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包括选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包括SEQ ID NO: 67的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包括与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码轻链氨基酸的与包括SEQ ID NO: 67的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包括选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包括SEQ ID NO: 27的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包括与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码轻链氨基酸的与包括SEQ ID NO: 27的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包括选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包括SEQ ID NO: 3的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包括与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码轻链氨基酸的与包括SEQ ID NO: 3的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包括SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 26的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 26的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 26的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包括SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包括SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 30的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 30的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 30的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包括SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包括SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包括SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述CM是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的酶的底物。在一些实施方案中，所述酶包含uPA。在一些实施方案中，所述酶包含豆荚蛋白。在一些实施方案中，所述酶包含MT-SP1。
在一些实施方案中，所述CM包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)。
在一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过25%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过10%的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，所述MM包含氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY(SEQ ID NO: 14)。
在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包括选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 15)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包括选自GGSG (SEQ ID NO: 17)、GGSGG (SEQ ID NO: 18)、GSGSG (SEQ ID NO: 19)、GSGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGSG (SEQ ID NO: 21)和GSSSG (SEQ ID NO: 22)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO: 23)。
在一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSSGT (SEQ ID NO: 24)或GSSG (SEQ ID NO: 37)。
在一些实施方案中，抗EGFR可活化的抗体暴露于uPA或MT-SP1并被uPA或MT-SP1切割，使得在活化或切割状态下，活化的抗体包括SEQ ID NO：69的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EGFR可活化的抗体暴露于豆荚蛋白并被豆荚蛋白切割，使得在活化或切割状态下，活化的抗体包括SEQ ID NO：70的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化的抗体还包含缀合到AB的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，所述试剂是选自表1中所列的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是海兔毒素(dolastatin)。在一些实施方案中，所述试剂是阿里他汀(auristatin)或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，所述试剂是类美登素(maytansinoid)或类美登素衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，所述试剂是倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是加利车霉素（calicheamicin）或其衍生物。
在一些实施方案中，所述试剂经由接头缀合到AB。在一些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头选自表2和3中所示接头。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体还包括可检测的部分。在一些实施方案中，所述可检测的部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述可检测的部分是可缀合的检测试剂。在一些实施方案中，所述可检测的部分是，例如荧光素衍生物，诸如异硫氰酸荧光素（FITC）。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽经由间隔物缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物在不存在信号肽的情况下缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物直接连接到可活化的抗体的MM。在一些实施方案中，所述间隔物包含至少氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到MM序列CISPRGCPDGPYVMY（SEQ ID NO：14）的序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）的间隔物，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到MM序列的间隔物，并包括氨基酸序列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59)，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。
在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少5天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少4天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少3天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少2天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少24小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少20小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少18小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少16小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少14小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少12小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少10小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少8小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少6小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少4小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少3小时。
在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体是单特异性的。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体是多特异性的，例如，通过非限制性的实例的方式，双特异性的或三功能性的。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体被配制作为前-双特异性T细胞衔接器（pro-Bispecific T Cell Engager）（BITE）分子的部分。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体被配制作为前-嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞或其它工程化受体的部分。
在一些实施方案中，在活化状态的可活化抗体结合表皮生长因子受体（EGFR），包括特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段（AB），其中AB包括选自以下的重链氨基酸序列：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：34，以及包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸；掩蔽部分（MM），其抑制在未切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR，其中所述掩蔽部分包括氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14)；和偶联AB的可切割部分（CM），其中CM是作为蛋白酶的底物发挥作用的多肽，并且其中CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)，其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到包含氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列的SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，在活化状态的可活化抗体结合表皮生长因子受体（EGFR），包括特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段（AB），其中AB包括选自以下的重链氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10，以及包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸；掩蔽部分（MM），其抑制在未切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR，其中所述掩蔽部分包括氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14)；和偶联AB的可切割部分（CM），其中CM是作为蛋白酶的底物发挥作用的多肽，并且其中CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)，其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到包含氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列的SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，其抗原结合片段选自Fab片段、F（ab'）2片段、scFv和scAb。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包括选自下列的重和轻链的组合：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链；包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链；包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链；包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链；包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链；以及包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 2的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 2的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 2的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 26的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 26的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 26的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 6的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 6的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 6的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 30的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 30的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 30的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 10的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 10的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 10的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括和包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 34的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 34的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 34的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述AB对于结合EGFR具有约100nM或更低的平衡解离常数。
在一些实施方案中，MM对于结合AB具有的平衡解离常数大于AB对EGFR的平衡解离常数。在一些实施方案中，MM不干扰或竞争在切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，MM是长度不超过40个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，所述MM多肽序列不同于EGFR，并且MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体不超过50%相同。在一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过25%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过10%的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，所述CM是长度至多达15个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，所述CM是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的酶的底物。在一些实施方案中，所述酶包含uPA。在一些实施方案中，所述酶包含豆荚蛋白。在一些实施方案中，所述酶包含MT-SP1。在一些实施方案中，蛋白酶与EGFR在组织中共定位，并且其中当可活化的抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶切割可活化的抗体中的CM。
在一些实施方案中，可活化的抗体在MM和CM之间包括连接肽。在一些实施方案中，可活化的抗体在CM和AB之间包括连接肽。在一些实施方案中，可活化的抗体包括第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），并且在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方案中，所述两个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包括选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 15)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包含选自GGSG (SEQ ID NO: 17)、GGSGG (SEQ ID NO: 18)、GSGSG (SEQ ID NO: 19)、GSGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGSG (SEQ ID NO: 21)和GSSSG (SEQ ID NO: 22)的氨基酸序列。在一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO: 23)。在一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSSGT (SEQ ID NO: 24)或GSSG (SEQ ID NO: 37)。
在一些实施方案中，抗EGFR可活化的抗体暴露于uPA或MT-SP1并被uPA或MT-SP1切割，使得在活化或切割状态下，活化的抗体包括SEQ ID NO：69的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EGFR可活化的抗体暴露于豆荚蛋白并被豆荚蛋白切割，使得在活化或切割状态下，活化的抗体包括SEQ ID NO：70的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化的抗体还包含缀合到AB的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，所述试剂是选自表1中所列的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是海兔毒素。在一些实施方案中，所述试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，所述试剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，所述试剂是倍癌霉素或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是加利车霉素或其衍生物。
在一些实施方案中，所述试剂经由接头缀合到AB。在一些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头选自表2和3中所示接头。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体还包括可检测的部分。在一些实施方案中，所述可检测的部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述可检测的部分是可缀合的检测试剂。在一些实施方案中，所述可检测的部分是，例如荧光素衍生物，诸如异硫氰酸荧光素（FITC）。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽经由间隔物缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物在不存在信号肽的情况下缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物直接连接到可活化的抗体的MM。在一些实施方案中，所述间隔物包含至少氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到MM序列CISPRGCPDGPYVMY（SEQ ID NO：14）的序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）的间隔物，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到MM序列的间隔物，并包括氨基酸序列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59)，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。
在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少5天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少4天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少3天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少2天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少24小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少20小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少18小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少16小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少14小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少12小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少10小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少8小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少6小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少4小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，可活化的抗体的血清半衰期为至少3小时。
在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体是单特异性的。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体是多特异性的，例如，通过非限制性的实例的方式，双特异性的或三功能性的。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体被配制作为前-双特异性T细胞衔接器（BITE）分子的部分。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体被配制作为前-嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞或其它工程化受体的部分。
本发明还提供了缀合的可活化的抗体，其在活化的状态结合表皮生长因子受体（EGFR），并包括特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段（AB）；掩蔽部分（MM），其抑制在未切割状态的可活化的抗体的AB对EGFR的结合；偶联到所述AB的可切割部分（CM），其中所述CM是多肽，其作为蛋白酶的底物发挥作用，以及毒性试剂。
在一些实施方案中，所述AB是或者衍生自西妥昔单抗。
在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，其抗原结合片段选自Fab片段、F（ab'）2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体以及单结构域轻链抗体。
在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体的AB包括选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体的AB包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到包含氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列的SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括和包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述AB对于结合EGFR具有约100nM或更低的平衡解离常数。
在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，MM对于结合AB具有的平衡解离常数大于AB对EGFR的平衡解离常数。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，MM不干扰或竞争在切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，MM是长度不超过40个氨基酸的多肽。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述MM多肽序列不同于EGFR，并且MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体不超过50%相同。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过25%的氨基酸序列同一性。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过10%的氨基酸序列同一性。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述MM包含氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY(SEQ ID NO: 14)。
在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，CM是长度至多达15个氨基酸的多肽。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述CM是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的酶的底物。在一些实施方案中，所述酶包含uPA。在一些实施方案中，所述酶包含豆荚蛋白。在一些实施方案中，所述酶包含MT-SP1。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述CM包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)。
在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体在MM和CM之间包括连接肽。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体在CM和AB之间包括连接肽。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗体包括第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），并且其中在未切割状态的缀合的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方案中，所述两个连接肽不需要彼此相同。
在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包括选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 15)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包含选自GGSG (SEQ ID NO: 17)、GGSGG (SEQ ID NO: 18)、GSGSG (SEQ ID NO: 19)、GSGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGSG (SEQ ID NO: 21)和GSSSG (SEQ ID NO: 22)的氨基酸序列。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23)。在缀合的可活化的一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSSGT (SEQ ID NO: 24)或GSSG (SEQ ID NO: 37)。
在一些实施方案中，抗EGFR可活化的抗体暴露于uPA或MT-SP1并被uPA或MT-SP1切割，使得在活化或切割状态下，活化的抗体包括SEQ ID NO：69的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗EGFR可活化的抗体暴露于豆荚蛋白并被豆荚蛋白切割，使得在活化或切割状态下，活化的抗体包括SEQ ID NO：70的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，在缀合的可活化的抗体中包含的毒性试剂是缀合到AB的试剂。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述试剂是治疗试剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述试剂是选自表1中所列的试剂。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述试剂是海兔毒素。在一些实施方案中，所述试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是阿里他汀E或其衍生物。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，所述试剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，所述试剂是倍癌霉素或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是加利车霉素或其衍生物。
在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述试剂经由接头缀合到AB。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述接头选自表2和3中所示接头。
在一些实施方案中，所述缀合的可活化的抗体还包括可检测的部分。在缀合的可活化的抗体的一些实施方案中，所述可检测的部分是诊断试剂。在一些实施方案中，所述可检测的部分是可缀合的检测试剂。在一些实施方案中，所述可检测的部分是，例如荧光素衍生物，诸如异硫氰酸荧光素（FITC）。
在一些实施方案中，所述缀合的可活化的抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽经由间隔物缀合到缀合的可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物在不存在信号肽的情况下缀合到缀合的可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物直接连接到缀合的可活化的抗体的MM。在一些实施方案中，所述间隔物包含至少氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到MM序列CISPRGCPDGPYVMY（SEQ ID NO：14）的序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）的间隔物，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到MM序列的间隔物，并包括氨基酸序列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59)，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。
在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少5天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少4天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少3天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少2天。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少24小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少20小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少18小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少16小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少14小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少12小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少10小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少8小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少6小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少4小时。在一些实施方案中，当施用给生物体时，缀合的可活化的抗体的血清半衰期为至少3小时。
在一些实施方案中，缀合的可活化的抗EGFR抗体是单特异性的。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗EGFR抗体是多特异性的，例如，通过非限制性的实例的方式，双特异性的或三功能性的。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗EGFR抗体被配制作为前-双特异性T细胞衔接器（BITE）分子的部分。在一些实施方案中，缀合的可活化的抗EGFR抗体被配制作为前-嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞或其它工程化受体的部分。
本发明还提供了编码本文所述的可活化的抗EGFR抗体的分离的核酸分子，以及包含这些分离的核酸序列的载体。本发明提供生产可活化的抗体的方法，通过在导致可活化抗体表达的条件下培养细胞，其中所述细胞包括这样的载体。
在一些实施方案中，所述核酸编码MM，所述MM对于结合AB具有的平衡解离常数大于AB对EGFR的平衡解离常数。在一些实施方案中，所述核酸编码MM，所述MM对于结合AB具有的平衡解离常数不超过AB对EGFR的平衡解离常数。在一些实施方案中，所述核酸编码MM，所述MM不干扰或竞争在切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述核酸编码CM，所述CM被蛋白酶切割，所述蛋白酶与EGFR在组织中共定位，并且当可活化的抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶切割可活化的抗体中的CM。在一些实施方案中，所述蛋白酶在不显著表达EGFR组织中无活性或者活性显著较低。在一些实施方案中，所述蛋白酶在健康，例如非患病的组织中无活性或者活性显著较低。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体在未切割状态从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，其在MM和CM之间包括连接肽。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，其在CM和AB之间包括连接肽。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述抗体包括第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），并且其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方案中，所述两个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体的AB，所述可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体的AB，所述可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体的AB，所述可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体的AB，所述可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体的AB，所述可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体的AB，所述可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码AB，所述AB包括包含SEQ ID NO: 1的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 67的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 1的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 3的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 1的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 27的核酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码AB，所述AB包括包含SEQ ID NO: 25的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 67的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 25的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 3的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 25的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 27的核酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码AB，所述AB包括包含SEQ ID NO: 5的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 67的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 5的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 3的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 5的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 27的核酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码AB，所述AB包括包含SEQ ID NO: 29的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 67的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 29的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 3的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 29的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 27的核酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码AB，所述AB包括包含SEQ ID NO: 9的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 67的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 9的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 3的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 9的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 27的核酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码AB，所述AB包括包含SEQ ID NO: 33的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 67的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 33的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 3的核酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述核酸包括包含SEQ ID NO: 33的核酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 27的核酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述核酸编码AB，所述AB对于结合EGFR具有约100nM或更低的平衡解离常数。
在一些实施方案中，所述核酸编码MM，所述MM是长度约2-40个氨基酸的多肽，例如，不超过40个氨基酸长。
在一些实施方案中，所述核酸编码MM，所述MM多肽序列不同于EGFR，并且MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体不超过50%相同。
在一些实施方案中，所述核酸编码CM，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少20倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述核酸编码CM，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少100倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述核酸编码CM，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少200倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述核酸编码CM，所述CM是长度至多达15个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，核酸编码MM，当在体外测定时使用靶置换测定，在EGFR的存在下，当CM未切割时，相比CM切割时所述MM使AB结合EGFR的能力减少至少90%，所述靶置换测定诸如，例如在PCT公开号WO 2009/025846和WO 2010/081173中描述的测定。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，可活化的抗体包括特异性结合EGFR的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述核酸编码抗体或其免疫学活性片段，所述抗体或其免疫学活性片段结合EGFR并且是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F（ab'）2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体以及单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，所述核酸编码抗体或其免疫学活性片段，所述抗体或其免疫学活性片段结合EGFR，并且是小鼠的、嵌合的、人源化的或全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体的AB，可活化的抗体的AB包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体的AB，所述可活化的抗体的AB包括与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。
在一些实施方案中，所述核酸包括AB，所述AB包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包括SEQ ID NO: 67的轻链核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列包括AB，所述AB包含与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列，和与包含SEQ ID NO: 67的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸。
在一些实施方案中，所述核酸包括选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 27的轻链核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列包括与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列，和与包含SEQ ID NO: 27的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸。
在一些实施方案中，所述核酸包括选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 3的轻链核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列包括与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列，和与包含SEQ ID NO: 3的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸。
在一些实施方案中，编码可活化的抗体核酸包括AB，所述AB包括选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括AB，所述AB包括与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包括SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸包括AB，所述AB包含选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包括SEQ ID NO: 67的轻链核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列包括AB，所述AB包含与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列，和与包含SEQ ID NO: 67的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸。
在一些实施方案中，所述核酸包括选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 27的轻链核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列包括与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列，和与包含SEQ ID NO: 27的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸。
在一些实施方案中，所述核酸包括选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 4的轻链核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列包括与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列，和与包含SEQ ID NO: 4的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸。
在一些实施方案中，所述核酸编码CM，所述CM是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的酶的底物。在一些实施方案中，所述酶包含uPA。在一些实施方案中，所述酶包含豆荚蛋白。在一些实施方案中，所述酶包含MT-SP1。
在一些实施方案中，所述核酸编码CM，所述CM包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)。
在一些实施方案中，所述核酸编码MM，所述MM对EGFR不包含超过25%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述核酸编码MM，所述MM对EGFR不包含超过10%的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，所述核酸编码MM，所述MM包含氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14)。
在一些实施方案中，所述核酸编码LP1和/或LP2，其中LP1或LP2的至少一个包括选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 15)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。
在一些实施方案中，所述核酸编码LP1和/或LP2，其中LP1或LP2的至少一个包含选自GGSG (SEQ ID NO: 17)、GGSGG (SEQ ID NO: 18)、GSGSG (SEQ ID NO: 19)、GSGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGSG (SEQ ID NO: 21)和GSSSG (SEQ ID NO: 22)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸编码LP1，所述LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 23)。
在一些实施方案中，所述核酸编码LP1，所述LP1包含氨基酸序列GSSGT (SEQ ID NO: 24) or GSSG (SEQ ID NO: 37)。
在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，所述核酸编码信号肽，所述信号肽经由间隔物缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述核酸编码间隔物，所述间隔物在不存在信号肽的情况下缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述核酸编码间隔物，所述间隔物直接连接到可活化的抗体的MM。在一些实施方案中，所述核酸编码间隔物，所述间隔物包含至少氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 38)。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括直接连接到MM序列CISPRGCPDGPYVMY（SEQ ID NO：14）的序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）的间隔物，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。在一些实施方案中，所述核酸编码可活化的抗体，所述可活化的抗体包括直接连接到MM序列的间隔物，并包括氨基酸序列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59)，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。
本发明还提供了制造可活化的抗体的方法，所述可活化的抗体在活化状态结合表皮生长因子受体（EGFR），所述方法通过（a）在导致所述可活化的抗体表达的条件下培养细胞，所述细胞包含编码可活化的抗体的核酸构建体，其中所述可活化的抗体包含掩蔽部分（MM）、可裂解部分（CM）和特异性结合EGFR的抗体或抗原结合片段（AB），（i）其中所述CM是作为蛋白酶底物发挥作用的多肽；并且（ii）其中CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，MM干扰AB对EGFR的特异性结合并且，当可活化的抗体在切割的状态下时，MM不干扰或竞争AB对EGFR的特异性结合；和（b）回收所述可活化的抗体。
在一些实施方案中，所述AB是或者衍生自西妥昔单抗。
在一些实施方案中，MM对于结合AB具有的平衡解离常数大于AB对EGFR的平衡解离常数。
在一些实施方案中，MM对于结合AB具有的平衡解离常数不超过AB对EGFR的平衡解离常数。
在一些实施方案中，MM不干扰或竞争在切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，蛋白酶与EGFR在组织中共定位，并且当可活化的抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶切割可活化的抗体中的CM。在一些实施方案中，所述蛋白酶在不显著表达EGFR组织中无活性或者活性显著较低。在一些实施方案中，所述蛋白酶在健康，例如非患病的组织中无活性或者活性显著较低。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体在未切割状态从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
在一些实施方案中，可活化的抗体在MM和CM之间包含连接肽。
在一些实施方案中，可活化的抗体在CM和AB之间包含连接肽。
在一些实施方案中，可活化的抗体包含第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），并且其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。
在一些实施方案中，所述两个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方案中，所述AB对于结合EGFR具有约100nM或更低的平衡解离常数。
在一些实施方案中，所述MM是长度约2-40个氨基酸的多肽，例如，不超过40个氨基酸长。
在一些实施方案中，所述MM多肽序列不同于EGFR，并且MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体不超过50%相同。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少20倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少100倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少200倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的解离常数（Kd）比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少20倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少100倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少1000倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少10,000倍。
在一些实施方案中，所述CM是长度至多达15个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，当在体外测定时使用靶置换测定（target displacement assay），在EGFR的存在下，当CM未切割时，相比CM切割时MM使AB结合EGFR的能力减少至少90%，所述靶置换测定诸如，例如在PCT公开号WO 2009/025846和WO 2010/081173中描述的测定。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其免疫学活性片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F（ab'）2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体以及单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其免疫学活性片段是小鼠的、嵌合的、人源化的或全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包含选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包含与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体包含选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包含与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。
在一些实施方案中，可活化的抗体包含选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包含与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包括编码选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列的核酸的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由编码包含与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包括编码选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包含SEQ ID NO: 67的轻链氨基酸序列的核酸的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由编码包含与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包含SEQ ID NO: 67的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包括编码选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包含SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列的核酸的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由编码包含与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 67的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包含与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和包含编码与包括SEQ ID NO: 67的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸的核酸序列的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 27的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包含与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和包含编码与包括SEQ ID NO: 27的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸的核酸序列的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 4的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包含与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和包含编码与包括SEQ ID NO: 4的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸的核酸序列的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包含选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包含与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体包含选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包含与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化的抗体包含选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包含与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由编码选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由编码与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸，和编码与包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体由编码选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包含SEQ ID NO: 28的轻链氨基酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由编码与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸，和编码与包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由编码选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包含SEQ ID NO: 4的轻链氨基酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由编码与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸，和编码与包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包含选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 67的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB由包含与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码与包含SEQ ID NO: 67的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包含选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 27的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包含与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码与包含SEQ ID NO: 27的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体由包含选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 3的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体由包含与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码与包含SEQ ID NO: 3的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 26的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 26的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 26的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 30的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 30的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 30的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 28的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括包含与SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，所述CM是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的酶的底物。在一些实施方案中，所述酶包含uPA。在一些实施方案中，所述酶包含豆荚蛋白。在一些实施方案中，所述酶包含MT-SP1。
在一些实施方案中，所述CM包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)。
在一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过25%的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过10%的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，所述MM包含氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY(SEQ ID NO: 14)。
在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包含选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 15)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。
在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包含选自GGSG (SEQ ID NO: 17)、GGSGG (SEQ ID NO: 18)、GSGSG (SEQ ID NO: 19)、GSGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGSG (SEQ ID NO: 21)和GSSSG (SEQ ID NO: 22)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO: 23)。
在一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSSGT (SEQ ID NO: 24)或GSSG (SEQ ID NO: 37)。
在一些实施方案中，可活化的抗体还包含缀合到AB的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，所述试剂经由接头缀合到AB。在一些实施方案中，所述接头是可切割的接头。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体还包括可检测的部分。在一些实施方案中，所述可检测的部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述可检测的部分是可缀合的检测试剂。在一些实施方案中，所述可检测的部分是，例如荧光素衍生物，诸如异硫氰酸荧光素（FITC）。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽经由间隔物缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物在不存在信号肽的情况下缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物直接连接到可活化的抗体的MM。在一些实施方案中，所述间隔物包含至少氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)。在一些实施方案中，可活化的抗体包含直接连接到MM序列CISPRGCPDGPYVMY（SEQ ID NO：14）的序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）的间隔物，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到MM序列的间隔物序列，并包括氨基酸序列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59)，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。
本发明提供了在对象中使用治疗性分子治疗、预防和/或延缓适应症发作或进展，或减轻适应症症状的方法，所述适应症例如，与EGFR的异常表达和/或活性相关的疾病或病症，例如，EGFR相关病症，或EGFR相关疾病，所述治疗性分子例如，结合EGFR的可活化的抗体和/或结合EGFR的缀合的可活化的抗体，特别是结合和中和或以其它方式抑制EGFR的至少一种生物活性和/或EGFR介导的信号传导的可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体。
在一些实施方案中，与EGFR异常表达和/或活性相关的适应症，例如，疾病或病症，是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌，例如，通过非限制性实例的方式，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是胃癌。在一些实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是头颈部癌，例如，通过非限制性实例的方式，食道癌。在一些实施方案中，所述癌症是食道癌。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌，例如，通过非限制性实例的方式，非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢/子宫内膜癌。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是肾癌。在一些实施方案中，所述癌症是肉瘤，例如，通过非限制性实例的方式，骨肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症是骨肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症是皮肤癌，例如，通过非限制性实例的方式，鳞状细胞癌、基底细胞癌和/或黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是基底细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。
在一些实施方案中，与EGFR的异常表达和/或活性相关的适应症，例如，疾病或病症，是炎性病症和/或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述炎性和/或自身免疫性疾病是银屑病。
所述治疗性分子，例如，可活化的抗EGFR抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体，可以在疾病的任何阶段施用。例如，所述治疗性分子可以施用于任何阶段的患癌患者，从早期到转移性的。例如，治疗性分子可以施用于患有任何阶段的炎性病症和/或自身免疫疾病的患者，从发病初期至后期阶段。但是应该理解的是，术语对象和患者在本文可互换使用。
治疗性分子，例如可活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体，也可用于其它治疗适应症和治疗方案。例如，本文提供的实施方案的治疗性分子可以用于包括新辅助治疗的治疗方案。
在一些实施方案中，所述治疗性分子，例如可活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体，在与一种或多种额外试剂，例如，以非限制性实例的方式，化疗剂组合的治疗期间和/或之后施用。在一些实施方案中，所述治疗性分子和一种或多种额外的试剂同时施用。例如，所述治疗性分子和一种或多种额外试剂可以配制在单一组合物中或作为两种或更多种分开的组合物施用。在一些实施方案中，所述治疗性分子和一种或多种额外的试剂顺次施用。
本发明还提供了在对象中预防，延缓其进展，治疗，缓解其症状，或以其它方式改善EGFR相关病症，例如癌症的方法，所述方法通过向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述的可活化的抗EGFR抗体。
本发明还提供了通过向有需要的对象施用治疗有效量的本文所述可活化的抗EGFR抗体来抑制血管生成的方法。
在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述对象是非人哺乳动物，如非人灵长类、伴侣动物（如猫、狗、马）、农场动物、役用动物或动物园动物。
可活化的抗EGFR抗体和其治疗制剂施用给患有或易患与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的对象。使用任何各种本领域中已知的方法鉴定患有或易患与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的对象。例如，使用评估健康状况的任何各种临床和/或实验室测试，例如，体检和血液，尿液和粪便分析来鉴定患有癌症或其它肿瘤状况的对象。
如果任何的各种实验室或临床目标得以实现，则认为向患有与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的患者施用可活化的抗EGFR抗体是成功的。例如，如果与疾病或病症相关的一种或多种症状减轻，减少，抑制或不发展到进一步，即，更差的状态，则认为向患有与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的患者施用可活化的抗EGFR抗体是成功的。如果如果糖尿病患者进入缓解或不发展到进一步，即，更差的状态，则认为向患有与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的患者施用可活化的抗EGFR抗体是成功的。
在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体在与一种或多种额外试剂，诸如，例如化疗剂组合的治疗期间和/或之后施用。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体和一种或多种额外的活性剂同时施用。例如，所述可活化的抗EGFR抗体和一种或多种额外试剂可以配制在单一组合物中或作为两种或更多种分开的组合物施用。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体和一种或多种额外的活性剂顺次施用。
本发明还提供了在各种诊断和/或预防适应症中使用结合EGFR的可活化的抗体（即，可活化的抗EGFR抗体，本文也称为抗EGFR可活化的抗体）的方法，以及用于这些方法的试剂盒。例如，本发明提供了检测对象或样品中切割试剂和EGFR存在或不存在的方法，所述方法通过（i）使抗EGFR可活化的抗体接触对象或样品，和（ii）测量对象或样品中活化的抗EGFR可活化的抗体的水平，其中，对象或样品中可检测的活化的抗EGFR可活化抗体的水平表明在对象或样品中存在切割剂和EGFR，并且其中对象或样品中不可检测的活化的抗EGFR可活化的抗体的水平表明在对象或样品中不存在切割剂、EGFR或切割剂和EGFR两者。这样的抗EGFR可活化的抗体包括掩蔽部分（MM）、被所述切割剂切割的可切割部分（CM），和特异性结合EGFR的抗原结合结构域或其片段（AB），其中在未切割（即，非活化的）状态的抗EGFR可活化的抗体包括下列从N末端到C末端的结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM；（ii）其中所述MM是抑制AB结合EGFR的肽，并且其中所述MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；并且（iii）其中在未切割的状态的可活化的抗体的MM干扰AB对EGFR的特异性结合并且，其中在切割（即，活化）状态的可活化的抗体的MM不干扰或竞争AB对EGFR的特异性结合。
例如，本发明还提供了用于检测对象或样品中切割试剂和目标靶（EGFR）存在或不存在的方法的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括用于接触对象或样品的本文所述的抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体，和用于检测对象或样品中活化的抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体的水平的手段，其中对象或样品中可检测的活化的抗EGFR可活化抗体的水平表明在对象或样品中存在切割剂和EGFR，并且其中对象或样品中不可检测的活化的抗EGFR可活化的抗体的水平表明在对象或样品中不存在切割剂、EGFR或切割剂和EGFR两者。
本发明还提供了检测对象或样品中切割试剂存在或不存在的方法，所述方法通过（i）在EGFR的存在下，用抗EGFR可活化的抗体接触对象或样品，和（ii）测量对象或样品中活化的抗EGFR可活化的抗体的水平，其中，对象或样品中可检测的活化的抗EGFR可活化抗体的水平表明在对象或样品中存在切割剂，并且其中对象或样品中不可检测的活化的抗EGFR可活化的抗体的水平表明在对象或样品中不存在切割剂。这样的抗EGFR可活化的抗体包括掩蔽部分（MM）、被所述切割剂切割的可切割部分（CM），和特异性结合EGFR的抗原结合结构域或其片段（AB），其中在未切割（即，非活化的）状态的抗EGFR可活化的抗体包括下列从N末端到C末端的结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM；（ii）其中所述MM是抑制AB结合EGFR的肽，并且其中所述MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；并且（iii）其中在未切割的状态的可活化的抗体的MM干扰AB对EGFR的特异性结合并且，其中在切割（即，活化）状态的可活化的抗体的MM不干扰或竞争AB对EGFR的特异性结合。
本发明还提供了用于检测对象或样品中切割试剂存在或不存在的方法的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括用于接触对象或样品的本文所述的抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体，和用于检测对象或样品中活化的抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体的水平的手段，其中对象或样品中可检测的活化的抗EGFR可活化抗体的水平表明在对象或样品中存在切割剂，并且其中对象或样品中不可检测的活化的抗EGFR可活化的抗体的水平表明在对象或样品中不存在切割剂。
本发明提供了检测对象或样品中切割试剂和EGFR存在或不存在的方法，所述方法通过（i）用抗EGFR可活化的抗体接触对象或样品，其中所述抗EGFR可活化的抗体包含可检测的标记，其位于CM切割后释放的抗EGFR可活化的抗体的部分上，和（ii）测量对象或样品中活化的抗EGFR可活化的抗体的水平，其中，对象或样品中可检测的活化的抗EGFR可活化抗体的水平表明在对象或样品中存在切割剂和EGFR，并且其中对象或样品中不可检测的活化的抗EGFR可活化的抗体的水平表明在对象或样品中不存在切割剂、EGFR或切割剂和EGFR两者。这样的抗EGFR可活化的抗体包括掩蔽部分（MM）、被所述切割剂切割的可切割部分（CM），和特异性结合EGFR的抗原结合结构域或其片段（AB），其中在未切割（即，非活化的）状态的抗EGFR可活化的抗体包括下列从N末端到C末端的结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM；（ii）其中所述MM是抑制AB结合EGFR的肽，并且其中所述MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；并且（iii）其中在未切割的状态的可活化的抗体的MM干扰AB对EGFR的特异性结合并且，其中在切割（即，活化）状态的可活化的抗体的MM不干扰或竞争AB对EGFR的特异性结合。
本发明还提供了检测对象或样品中切割试剂存在或不存在的方法，所述方法通过（i）用抗EGFR可活化的抗体接触对象或样品，其中所述抗EGFR可活化的抗体包含可检测的标记，其位于CM切割后释放的抗EGFR可活化的抗体的部分上，和（ii）测量对象或样品中可检测标记的水平，其中，对象或样品中可检测的可检测标记的水平表明在对象或样品中存在切割剂，并且其中对象或样品中不可检测的可检测标记的水平表明在对象或样品中不存在切割剂。这样的抗EGFR可活化的抗体包括掩蔽部分（MM）、被所述切割剂切割的可切割部分（CM），和特异性结合EGFR的抗原结合结构域或其片段（AB），其中在未切割（即，非活化的）状态的抗EGFR可活化的抗体包括下列从N末端到C末端的结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM；（ii）其中所述MM是抑制AB结合EGFR的肽，并且其中所述MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；并且（iii）其中在未切割的状态的可活化的抗体的MM干扰AB对EGFR的特异性结合并且，其中在切割（即，活化）状态的可活化的抗体的MM不干扰或竞争AB对EGFR的特异性结合。
本发明还提供了用于检测对象或样品中切割试剂和目标靶（EGFR）存在或不存在的方法的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括用于接触对象或样品的本文所述的抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体，和用于检测对象或样品中活化的抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体的水平的手段，其中对象或样品中可检测的可检测标记的水平表明在对象或样品中不存在切割剂，并且其中对象或样品中不可检测的可检测标记的水平表明在对象或样品中存在切割剂。
在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述抗EGFR可活化的抗体包括可检测标记。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述成像剂包含放射性同位素。在这些方法的一些实施方案中，所述放射性同位素是铟或锝。在这些方法的一些实施方案中，所述放射性同位素是或衍生自碘。在这些方法的一些实施方案中，所述放射性同位素是125I或133I。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述造影剂包括碘、钆或氧化铁。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，荧光标记包括黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白（CFP）、绿色荧光蛋白（GFP）、修饰的红色荧光蛋白（mRFP）、红色荧光蛋白tdimer2（RFPtdimer2）、HCRED或铕衍生物。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述发光标记包括N-methylacrydium衍生物。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述标记包括AlexaFluor?标记，诸如Alex Fluor? 680或Alexa Fluor? 750。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，基于配体的标记包括生物素、亲和素、链霉亲和素或一种或多种半抗原。
在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在这些方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述对象是非人哺乳动物，如非人灵长类、伴侣动物（如猫、狗、马）、农场动物、役用动物或动物园动物。
在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体内方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是原位方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是从体内到体外方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体外方法。
在所述方法和/或试剂盒的一些实施方案中，所述方法和/或试剂盒用于鉴定或以其它方式细化，例如，分层，适合用本公开的抗EGFR可活化的抗体治疗的患者群体。例如，在这些方法中测试的对于靶（例如，EGFR）和切割抗EGFR可活化的抗体的可切割部分（CM）中底物的蛋白酶测试阳性的患者被鉴定为对于用包含这样的CM的这样的抗EGFR可活化的抗体治疗合适的候选者。同样，在使用这些方法测试的对于靶（例如，EGFR）和切割可活化的抗体的CM中底物的蛋白酶任一或两者测试阴性的患者被鉴定为对于另一种形式的治疗合适的候选者（即，不适合用所测试的抗EGFR可活化的抗体治疗）。在一些实施方案中，这样的患者可用其它抗EGFR活化的抗体测试，直到鉴定出合适的用于治疗的抗EGFR可活化的抗体（例如，包含被该患者在疾病部位切割的CM的抗EGFR可活化的抗体）。
本发明还提供用于鉴定或以其它方式细化患者群体的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少（ⅰ）本文所述的用于接触对象或样品的抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体，（ⅱ）用于检测对象或样品中活化的抗EGFR可活化抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体的水平的手段，其中样品中活化的抗EGFR可活化抗体的可检测的水平表明该样品对于EGFR和切割所述抗EGFR可活化抗体和/或缀合的抗EGFR可活化抗体的可切割部分（CM）中底物的切割剂的存在是阳性的，和（iii）用于鉴定和选择对于EGFR和切割剂的存在是阳性的一个或多个对象由此鉴定或细化患者群的手段。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于向患者群中一个或多个对象施用本文所述的治疗有效量的抗EGFR可活化抗体和/或缀合的抗EGFR可活化抗体的设备，所述患者群体对于EGFR和切割剂的存在测试为阳性。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于向患者群体中一个或多个对象施用另一种本文所述的治疗有效量的抗EGFR治疗剂的设备，所述患者群对于EGFR和切割剂的存在测试不为阳性。在一些实施方案中，所述抗EGFR可活化的抗体包含可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记包含成像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在一些实施方案中，所述EGFR相关病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤或皮肤癌。在一些实施方案中，所述EGFR相关病症是银屑病。
在这些方法的一些实施方案中，所述MM是具有长度约2至40个氨基酸的肽。在这些方法的一些实施方案中，所述抗EGFR可活化的抗体包含接头肽，其中所述接头肽位于MM和CM之间。在这些方法的一些实施方案中，所述抗EGFR可活化的抗体包含接头肽，其中所述接头肽位于AB和CM之间。在这些方法的一些实施方案中，抗EGFR可活化的抗体包含第一接头肽（L1）和第二接头肽（L2），其中，所述第一接头肽位于MM和CM之间并且所述第二接头肽位于AB和CM之间。在这些方法的一些实施方案中，L1和L2的每一个是长度约1-20个氨基酸的肽，并且其中L1和L2的每一个不需要是相同的接头。在这些方法的一些实施方案中，L1和L2之一或两者包含甘氨酸-丝氨酸聚合物。
在这些方法的一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包含选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 15)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在这些方法的一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包含选自GGSG (SEQ ID NO: 17)、GGSGG (SEQ ID NO: 18)、GSGSG (SEQ ID NO: 19)、GSGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGSG (SEQ ID NO: 21)和GSSSG (SEQ ID NO: 22)的氨基酸序列。在这些方法的一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO: 23)。在这些方法的一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSSGT (SEQ ID NO: 24)或GSSG (SEQ ID NO: 37)。
在这些方法的一些实施方案中，所述AB包含选自本文所示的抗EGFR抗体序列的抗体或抗体片段序列。在这些方法的一些实施方案中，所述AB包含Fab片段、scFv或单链抗体（SCAB）。
在这些方法的一些实施方案中，所述切割剂是在对象或样品中与EGFR共定位的蛋白酶并且所述CM是多肽，其作为蛋白酶的底物发挥作用，其中当抗EGFR可活化的抗体暴露于蛋白酶时，所述蛋白酶切割抗EGFR可活化的抗体中的CM。在这些方法的一些实施方案中，所述CM是长度至多达15个氨基酸的多肽。在这些方法的一些实施方案中，所述CM偶联到AB的N末端。在这些方法的一些实施方案中，所述CM偶联到AB的C末端。在这些方法的一些实施方案中，所述CM偶联到AB的VL链的N末端。
在这些方法的一些实施方案中，所述切割剂是酶并且所述CM是该酶的底物。在这些方法的一些实施方案中，所述酶是本文公开的蛋白酶。在这些方法的一些实施方案中，所述蛋白酶是本文公开的蛋白酶之一。在这些方法的一些实施方案中，所述蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白、MT-SP1、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-14。在一些实施方案中，所述酶包含uPA。在一些实施方案中，所述酶包含豆荚蛋白。在一些实施方案中，所述酶包含MT-SP1。在一些实施方案中，所述蛋白酶在不显著表达EGFR的组织中无活性或者活性显著较低。在一些实施方案中，所述蛋白酶在健康，例如非患病的组织中无活性或者活性显著较低。
本发明还提供了在多种诊断和/或预防性适应症中使用抗EGFR可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体（即，可活化的抗EGFR抗体缀合物，本文也称为缀合的可活化的抗EGFR抗体和/或缀合的抗EGFR可活化的抗体）的方法。例如，本发明提供了检测对象或样品中切割试剂和目标靶（EGFR）存在或不存在的方法，所述方法通过（i）使抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体接触对象或样品，和（ii）测量对象或样品中抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体的水平，其中，对象或样品中可检测的活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体的水平表明在对象或样品中存在切割剂和EGFR，并且其中对象或样品中不可检测的活化的抗EGFR的抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体的水平表明在对象或样品中不存在切割剂、EGFR或切割剂和EGFR两者。
本发明还提供了检测对象或样品中切割试剂存在或不存在的方法，所述方法通过（i）在EGFR的存在下，用抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体接触对象或样品，和（ii）测量对象或样品中活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体的水平，其中，对象或样品中可检测的活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体的水平表明在对象或样品中存在切割剂，并且其中对象或样品中不可检测的抗EGFR的抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体的水平表明在对象或样品中不存在切割剂。
本发明还提供了检测对象或样品中切割试剂存在或不存在的方法，所述方法通过（i）用抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体接触对象或样品，和（ii）测量对象或样品中可检测标记的水平，其中，对象或样品中可检测的可检测标记的水平表明在对象或样品中存在切割剂，并且其中对象或样品中不可检测的可检测标记的水平表明在对象或样品中不存在切割剂。
在这些方法的一些实施方案中，抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体包括选自下列的可检测标记：成像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子和基于配体的标记。在这些方法的一些实施方案中，所述成像剂包含放射性同位素。在这些方法的一些实施方案中，所述放射性同位素是铟或锝。在这些方法的一些实施方案中，所述造影剂包括碘、钆或氧化铁。在这些方法的一些实施方案中，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法的一些实施方案中，荧光标记包括黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白（CFP）、绿色荧光蛋白（GFP）、修饰的红色荧光蛋白（mRFP）、红色荧光蛋白tdimer2（RFPtdimer2）、HCRED或铕衍生物。在这些方法的一些实施方案中，所述发光标记包括N-methylacrydium衍生物。在这些方法的一些实施方案中，所述标记包括AlexaFluor?标记，诸如Alex Fluor? 680或Alexa Fluor? 750。在这些方法的一些实施方案中，基于配体的标记包括生物素、亲和素、链霉亲和素或一种或多种半抗原。
在这些方法的一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在这些方法的一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述对象是非人哺乳动物，如非人灵长类、伴侣动物（如猫、狗、马）、农场动物、役用动物或动物园动物。
在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体内方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是原位方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是从体内到体外方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体外方法。
在所述方法的一些实施方案中，所述方法用于鉴定或以其它方式细化适合用本公开的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体治疗的患者群。例如，在这些方法中测试的对于靶（例如，EGFR）和切割抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体的可切割部分（CM）中底物的蛋白酶两者测试阳性的患者被鉴定为对于用包含这样的CM的这样的抗EGFR抗体和/或这样的缀合的可活化的抗EGFR抗体治疗合适的候选者。同样，在使用这些方法测试的对于靶（例如，EGFR）和切割可活化的抗体的CM中底物的蛋白酶任一或两者测试阴性的患者被鉴定为对于另一种形式的治疗合适的候选者（即，不适合用所测试的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体治疗）。在一些实施方案中，这样的患者可用其它抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体测试，直到鉴定出合适的用于治疗的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体（例如，包含被该患者在疾病部位切割的CM的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体）。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体在活化状态结合EGFR并包括（i）特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段（AB），其中所述AB是或者衍生自西妥昔单抗；（ii）掩蔽部分（MM），其抑制在未切割状态的可活化的抗体的AB对EGFR的结合；和（c）偶联到所述AB的可切割部分（CM），其中所述CM是多肽，其作为蛋白酶的底物发挥作用。
在一些实施方案中，MM对于结合AB具有的平衡解离常数大于AB对EGFR的平衡解离常数。在一些实施方案中，MM对于结合AB具有的平衡解离常数不超过AB对EGFR的平衡解离常数。在一些实施方案中，MM不干扰或竞争在切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR，当所述可活化的抗体是。
在一些实施方案中，蛋白酶与EGFR在组织中共定位，并且当可活化的抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶切割可活化的抗体中的CM。在一些实施方案中，所述蛋白酶在不显著表达EGFR的组织中无活性或者活性显著较低。在一些实施方案中，所述蛋白酶在健康，例如非患病的组织中无活性或者活性显著较低。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体在未切割状态从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体在MM和CM之间包括连接肽。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体在CM和AB之间包括连接肽。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体包括第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），并且其中在未切割状态的可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方案中，所述两个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方案中，所述AB对于结合EGFR具有约100nM或更低的平衡解离常数。
在一些实施方案中，所述MM是长度约2-40个氨基酸的多肽，例如，不超过40个氨基酸长。
在一些实施方案中，所述MM多肽序列不同于EGFR，并且MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体不超过50%相同。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少20倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少100倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，所述CM位于可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体中使得在未切割的状态，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体对EGFR的结合被减少到以比未修饰的AB结合EGFR的平衡解离常数高至少200倍的平衡解离常数发生，并且其中以切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的解离常数（Kd）比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少20倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少100倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少1000倍。在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合EGFR的能力，使得当偶联MM时AB对EGFR的Kd比当未偶联MM时AB对EGFR的Kd高至少10,000倍。
在一些实施方案中，所述CM是长度至多达15个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，当在体外测定时使用靶置换测定（target displacement assay），在EGFR的存在下，当CM未切割时，相比CM切割时MM使AB结合EGFR的能力减少至少90%，所述靶置换测定诸如，例如在PCT公开号WO 2009/025846和WO 2010/081173中描述的测定。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体包括特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其免疫学活性片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F（ab'）2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体以及单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其免疫学活性片段是小鼠的、嵌合的、人源化的或全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB由包含编码选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列的核酸的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB由编码包含与选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和包含编码与包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB由包括选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的重链核酸序列和SEQ ID NO: 67的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB由包含与选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 9的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和包含编码与包含SEQ ID NO: 67的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链核酸的核酸序列的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括与选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列，和与包括SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB由编码选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列的核酸序列和编码包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB由包括编码包含与包括SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的氨基酸至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链氨基酸序列的核酸序列，和编码与包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列的核酸序列编码。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB由包括选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的重链核酸序列和包含SEQ ID NO: 67的轻链核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB由包括与选自SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的重链核酸序列的核酸序列，和编码与包括SEQ ID NO: 67的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的轻链氨基酸的核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 26的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 6的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 30的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的AB包括包含与SEQ ID NO: 34的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链，和包含与SEQ ID NO: 68的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列和间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸和包含氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)的间隔物氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括轻链氨基酸和间隔物氨基酸序列，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到间隔物氨基酸序列的轻链氨基酸，所述轻链氨基酸与SEQ ID NO：68的轻链氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，所述间隔物氨基酸序列包含氨基酸序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）。
在一些实施方案中，所述CM是选自uPA、豆荚蛋白和MT-SP1的酶的底物。在一些实施方案中，所述酶包含uPA。在一些实施方案中，所述酶包含豆荚蛋白。在一些实施方案中，所述酶包含MT-SP1。
在一些实施方案中，所述CM包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)。
在一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过25%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述MM对EGFR不包含超过10%的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，所述MM包含氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY(SEQ ID NO: 14)。
在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包括选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 15)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包含选自GGSG (SEQ ID NO: 17)、GGSGG (SEQ ID NO: 18)、GSGSG (SEQ ID NO: 19)、GSGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGSG (SEQ ID NO: 21)和GSSSG (SEQ ID NO: 22)的氨基酸序列。在一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO: 23)。在一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSSGT (SEQ ID NO: 24)或GSSG (SEQ ID NO: 37)。
在一些实施方案中，可活化的抗体还包含缀合到AB的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，所述试剂是选自表1中所列的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是海兔毒素。在一些实施方案中，所述试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，所述试剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，所述试剂是倍癌霉素或其衍生物。在一些实施方案中，所述试剂是加利车霉素或其衍生物。
在一些实施方案中，所述试剂经由接头缀合到AB。在一些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头选自表2和3中所示接头。
在一些实施方案中，所述可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽经由间隔物缀合到可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物在不存在信号肽的情况下缀合到可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物直接连接到可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体的MM。在一些实施方案中，所述间隔物包含至少氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO: 38)。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体包括直接连接到MM序列CISPRGCPDGPYVMY（SEQ ID NO：14）的序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）的间隔物，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。在一些实施方案中，可活化的抗体和/或缀合的可活化的抗体包括直接连接到MM序列的间隔物，并包括氨基酸序列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59)，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。
在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体是单特异性的。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体是多特异性的，例如，通过非限制性的实例的方式，双特异性的或三功能性的。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体被配制作为前-双特异性T细胞衔接器（BITE）分子的部分。在一些实施方案中，可活化的抗EGFR抗体和/或缀合的可活化的抗EGFR抗体被配制作为前-嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞或其它工程化受体的部分。
根据本发明的药物组合物可以包括本发明的抗体和/或缀合的抗体和载体。这些药物组合物可以包括在试剂盒，诸如例如诊断试剂盒中。
附图简述
图1A是描绘本发明的可活化的抗体在第一状态被掩蔽和在疾病相关的蛋白酶的存在下被活化的图示。
图1B是描绘用于鉴定合适的底物的底物选择方法的图示，所述底物将在期望的位置选择性地活化本发明的可活化的抗EGFR抗体。
图2A是可活化的抗体的示意图。
图2B-2D是描绘抗EGFR可活化抗体（在本文中称为“Pb-1204”或3954-1204-C225v4可活化抗体）的体外表征的一系列图形。图2B是描绘两个蛋白酶，MT-SP1和uPA在切割Pb-1204时的酶促效率的图形。图2C是描绘Pb-1204用蛋白酶uPA、MT-SP1和豆荚蛋白消化之前和之后的毛细管电泳分析的图形。图2D是描绘抗EGFR抗体西妥昔单抗，Pb-1204和uPA活化的Pb-1204对H292细胞的增殖的效果的图形。
图3A是近红外猝灭探针Cy5.5-1204-Q的化学结构的示意图。
图3B-3H是描绘可活化抗EGFR抗体（在本文中称为Pb-1204）在异种移植物肿瘤中累积的一系列图示。图3B是描绘腹膜内注射任一下列的HT29异种移植物肿瘤荷瘤小鼠的光学成像的图示：Alexa Fluor750-缀合的Pb-NSUB（红色）和淬灭的探针Cy5-NSUB-Q（在本文中称为“IQ-NSUB”）（蓝色；左小图），其中NSUB代表不容易受到蛋白酶切割的氨基酸序列；或Alexa Fluor750-缀合的Pb-1204（红色）和淬灭的探针Cy5.5-1204-Q（在本文中称为“IQ-1204”）（蓝色；右小图），其中1204是底物序列1204：LSGRSDNH（SEQ ID NO：13），其易受至少uPA的切割。仅在施用可活化的抗EGFR抗体和含有1204底物的探针的小鼠肿瘤中检测到高强度重叠的荧光信号。图3C和3D是描绘小鼠用Alexa Fluor750-缀合的Pb-1204（图3C）或Alexa Fluor750-缀合的Pb-NSUB（图3D）注射后7天在HT29异种移植物肿瘤中可活化的抗EGFR抗体的免疫荧光检测的图示。图3E和3F是用Pb-NSUB、3954-1204-C225v4或西妥昔单抗（即，未经修饰的西妥昔单抗）腹膜内注射的H292异种移植物肿瘤荷瘤小鼠的光学成像的一系列照片。3954-1204-C225v4可活化抗体定位于H292异种移植物小鼠模型中的肿瘤部位。图3G是描绘施用西妥昔单抗、Pb-NSUB或3954-1204-C225v4的H292异种移植物小鼠模型动物的三维光学和计算机断层摄影（3D/CT断层摄影）的一系列照片。图3H是描绘来自体内成像研究的在代表性的H292肿瘤上人IgG免疫组织化学染色的一系列照片。
图4A-4F是描绘可活化的抗EGFR抗体（本文称为Pb-1204）抑制异种移植物模型中肿瘤生长的能力的一系列图形。图4A是描绘在每周用西妥昔单抗（25mg/kg，蓝线），Pb-1204（25mg/kg，红线）、Pb-NSUB (25 mg/kg，黑线)治疗的H292异种移植物肿瘤荷瘤小鼠中看到的效果的图形，其中Pb-NSUB表示可活化的抗EGFR抗体构建物具有结合EGFR的抗体部分，并且还包括所述NSUB氨基酸序列，其不容易被蛋白酶切割。数据表示为平均肿瘤体积±SEM。在第20天评价百分比肿瘤生长抑制（TGI）。图4B和4C是描绘从注射25mg/kg西妥昔单抗、Pb-NSUB或Pb-1204的H292异种移植物肿瘤荷瘤小鼠收集的血浆样品中（给药1、8、24、72小时后）（图4B）和肿瘤样品（给药72小时后）（图4C）中IgG浓度水平和结合EGFR的Ig水平的图形。通过ELISA测量IgG浓度（蓝色）和EGFR结合（红色）。图4D是描绘在用西妥昔单抗（2525 mg/kg，蓝线），Pb-1204（25 mg/kg，红线），媒介物（黑线）在腹膜内一次注射（IP）的LXFA677荷瘤小鼠中观察到的肿瘤体积的图形。数据表示为平均肿瘤体积±SEM。在第25天评价百分比肿瘤生长抑制（TGI）。图4E和4F是描绘从注射媒介物、25mg/kg西妥昔单抗或Pb-1204的LXFA677异种移植物肿瘤荷瘤小鼠收集的血浆样品中（给药1、7、14、21、28天后）（图4E）和肿瘤样品（给药72小时后）（图4F）中IgG浓度水平和结合EGFR的Ig水平的图形。通过ELISA测量IgG浓度（蓝色）和EGFR结合（红色）。
图5A-5C是显示可活化的抗EGFR抗体的进一步体外表征的一系列图形。图5A是描绘通过MT-SP1和uPA的Pb-1204切割的蛋白水解转化水平的图形。图5B是描绘Pb-1204用豆荚蛋白、MT-SP1和uPA消化之前和之后的SDS-PAGE分析的图形。图5C是描绘西妥昔单抗、亲本抗体、Pb-1204或uPA活化的Pb-1204与固定化的EGFR-ECD的结合的图形。
图6A和6B是描绘在正常肝脏中Pb-1204如何没有被活化的图示。图6A和6B描绘小鼠用Alexa Fluor750-缀合的Pb-1204（图6A）或Alexa Fluor750-缀合的Pb-NSUB（图6B）注射后7天在肝脏中可活化的抗EGFR抗体的免疫荧光检测。
图7A和7B是描绘在荷瘤小鼠中肿瘤活化与西妥昔单抗和Pb-1204的PK的图示和图形。在图7A中，西妥昔单抗、Pb-NSUB和Pb-1204（25 mg/kg）治疗的H292异种移植物肿瘤的裂解物在治疗后72小时生成并且人IgG轻链通过免疫印迹进行分析。在图7B中，来自在第0天注射25mg/kg的西妥昔单抗或Pb-1204的LXFA677异种移植物肿瘤荷瘤小鼠的血浆在给药后第1、7、14、21、28天进行收集，并且测量与固定化的EGFR-ECD（西妥昔单抗，蓝色；Pb-1204，红色）的结合。
图8A和8B是描绘其中指示了蛋白酶的几个相互依赖过程导致的肿瘤的进展、侵袭和转移的一系列图示。这些图改编自Affara NI, 等 “Delineating protease functions during cancer development.” Methods Mol Biol. 539 (2009): 1-32。
图9A和9B是描绘蛋白酶uPA（人和小鼠）、MT-SP1（人和小鼠）、豆荚蛋白（人）、组织纤溶酶原激活物（tPA，人）和凝血酶（人）对于在IQ探针中的1204底物序列LSGRSDNH（SEQ ID NO：13）切割速率和底物选择性的表和图形。图9C和9D是描绘通过重组人类uPA（图9C）和重组人MT-SP1（图9D）的1204底物序列的切割速率的一系列图形。在每个研究中，1204底物序列以500nM的终浓度呈现。
图10A是描绘未修饰抗体西妥昔单抗（“亲本”）、Pb-NSUB构建体（“NSUB”）、以及未切割的3954-1204-C225v4可活化抗体在不存在蛋白酶的情况下结合EGFR的相对能力的图形。图10B是描绘未修饰抗体西妥昔单抗（“亲本”）、Pb-NSUB构建体（“NSUB”）、以及活化的，即切割的的3954-1204-C225v4可活化抗体在存在两种蛋白酶uPA和人MT-SP1的情况下结合EGFR的相对能力的图形。图10B表明一旦由适当的蛋白酶活化，3954-1204-C225v4可活化抗体以与亲本抗体相当的水平结合EGFR。
图11A和11B是一系列图形，描绘可活化的抗EGFR抗体3954-1204-C225v4，在小鼠中给药至少四周后，在循环中是稳定的并表现出在血浆中的低活化，其表明优异的毒性概况。如在图11A和11B中使用的“亲本抗体”指未经修饰的西妥昔单抗抗体，所述Pb-NSUB构建体表示可活化抗EGFR抗体，其包括不容易被蛋白酶切割的NSUB序列，而“PB-NSELECT”是可活化的抗EGFR抗体，其包括非选择性底物，即，被循环中的酶识别的氨基酸序列。
图12是描绘显示施用西妥昔单抗、Pb-NSUBv5（即3954-NSUB-C225v5）或3954-1204-C225v5后显示皮疹的非人灵长类的数目的图形。
图13A-13D是一系列比较在初始40mg/kg负荷剂量后接受25mg/kg每周给药的食蟹猴的血液中检测到的西妥昔单抗和3954-1204-C225v5水平的图形。
图14A-14C是一系列用特异性识别MT-SP1的活性位点的抗体（抗体A11）在H292异种移植物肿瘤中荧光成像的照片。
图15是可活化的抗体的原位成像的示意图：1.铺在载玻片上的组织切片。2.载玻片用包含标记的可活化抗体的溶液覆盖并孵育。3.充分洗涤后，可活化抗体的结合可视化。
图16是使用原位成像显示抗EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5被活化并结合冷冻的人癌组织的能力的一系列照片。图16中的红色荧光组织图像，小图A显示抗EGFR可活化抗体的被组织衍生的蛋白水解切割活化的C225v5抗体的结合。如图16，小图B所示，通过将可商购获得的抗EGFR抗体暴露于组织检测到相同模式的组织染色。图16，小图C表明在小图A中所示的荧光信号被用1：100稀释的广谱抑制剂混合物集合III和50mM EDTA的组织预处理所抑制。蓝色染色表示DAPI核染色。
图17是一系列表格，描绘3954-1204-C225v5在广泛的人类肿瘤样本中是可活化的。第2列表示如通过可商购获得的抗EGFR抗体所检测的，对于各种人癌症组织样品的EGFR受体的表达水平。第3列表示如通过抗体A11在各种人癌症组织样品中检测的活性蛋白裂解酶（matriptase，MT-SP1）的量。第4和5列表示EGFR可活化抗体（第5列）相比西妥昔单抗（Cetux）组织染色（第4列）原位活化和结合的评价。测量结合组织样品的EGFR和A11抗体的量的IHC染色从0到3+进行评分：0，无染色；1+（即“+”），弱染色；2+（即“++”），中等染色；和3+（即，“+++”），强染色。原位成像染色评分是基于与西妥昔单抗抗体染色的比较并定义如下：0，无染色；1+（即“+”），相比于亲本抗体弱染色；2+（即“++”），相比于亲本抗体中度染色；和3+（即，“+++”），类似于亲本抗体染色。
图18是描绘抗EGFR可活化抗体-试剂缀合物3954-1204-C225v5-MMAE的抑制肿瘤生长的能力的图形。
图19是描绘抗EGFR可活化抗体3954-1204-的C225v5的半衰期的图形，相比于西妥昔单抗的半衰期。
图20A和20B是描绘MMAE的赖氨酸缀合增加3954-1204-C225v5效价，同时保持掩蔽和活化潜力的一系列图形。MMAE缀合到3954-1204-C225v5没有改变其对EGFR的结合。MMAE缀合到3954-1204-C225v5增加了其细胞杀伤活性。
图21是描绘人结肠直肠癌肝转移组织样品中EGFR和A11共定位的图示。
图22是描绘人结肠直肠癌肝转移组织活化和结合抗EGFR可活化抗体的能力的图示。
图23是一系列照片，显示原位成像、EGFRIHC和A11 IHC的三重染色。图像的上部行展示了在原位成像条件下在单个组织切片上进行的染色，展示了（左到右）：EGFR表达、蛋白裂解酶（MT-SP1）的活性和西妥昔单抗的结合。图像的下部行展示了在单个组织切片上进行的染色，展示了（左到右）：EGFR表达、蛋白裂解酶（MT-SP1）的活性和抗EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5的原位成像。图23中图像的右列比较了在原位成像条件下西妥昔单抗（上部的图像）的结合和通过组织来源的蛋白裂解（下部图像）活化的抗EGFR可活化抗体的结合。如图23，图像左列所示，通过将可商购获得的抗EGFR抗体暴露于组织检测到相同模式的组织染色。图23，图像的中间栏，显示出蛋白裂解酶（MT-SP1）的活性与EGFR表达的共定位。
发明详述
本发明提供可活化的单克隆抗体（mAb），其特异性结合人表皮生长因子受体（EGFR），也称为EGF受体、人EGF受体-1（HER1）、erbB、erbB1和物种抗原7（SA-7）。在治疗与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症，预防与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症，延缓与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的进展，缓解和/或减轻与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的症状的方法中使用可活化的抗EGFR抗体，本文也称为抗EGFR可活化的抗体或EGFR可活化的抗体。例如，在治疗癌症或其它肿瘤状况，预防癌症或其它肿瘤状况，延缓癌症或其它肿瘤状况的进展，缓解和/或减轻癌症或其它肿瘤状况的症状的方法中使用可活化的抗EGFR抗体。
可活化的抗EGFR抗体包括偶联到掩蔽部分（MM）的特异性结合表皮生长因子受体（EGFR）的抗体或其抗原结合片段，使得所述MM的偶联减小了所述抗体或其抗原结合片段结合EGFR的能力。在一个优选的实施方案中，所述MM经由序列偶联，所述序列包括蛋白酶底物，例如，与EGFR共定位于对象中的治疗部位的蛋白酶。许多研究已经证实异常蛋白酶的水平，例如，uPA、豆荚蛋白、MT-SP1、基质金属蛋白酶（MMPs）在实体瘤中的相关性。(参见，例如Murthy RV, 等 “Legumain expression in relation to clinicopathologic and biological variables in colorectal cancer.” Clin Cancer Res. 11 (2005): 2293-2299; Nielsen BS, 等 “Urokinase plasminogen activator is localized in stromal cells in ductal breast cancer.” Lab Invest 81 (2001): 1485–1501; Mook OR, 等 “In situ localization of gelatinolytic activity in the extracellular matrix of metastases of colon cancer in rat liver using quenched fluorogenic DQ-gelatin.” J Histochem Cytochem. 51 (2003): 821-829)。
本文提供的可活化的抗EGFR抗体包括蛋白酶的底物，其对于在肿瘤细胞中利用蛋白酶活性用于在治疗和/或诊断部位的靶向的抗体活化是有用的。该方法的一般概述示于图1A中，并且选择对于蛋白酶如uPA、MT-SP1、豆荚蛋白等的合适底物的方法的一般概述示于图1B。底物选择过程被用于鉴定具有许多希望的特性的底物。例如，所选的底物是全身稳定的（在对象的全身循环中是稳定的），一般不容易受到循环的蛋白酶如纤溶酶、凝血酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）或激肽释放酶（KLK）如KLK-5和/或KLK-7的切割，是无毒的，一般不容易在毒性的潜在位点（如皮肤）被蛋白酶（如ADAM9、ADAM10、ADAM17和/或激肽释放酶，如KLK-5和KLK-7）切割并且在预期治疗和/或诊断部位是有活性的。优选地，对于在治疗和/或诊断的预期部位过表达，但在正常、健康的或以其它方式非患病或受损组织通常不表达的蛋白酶选择鉴定的底物，并然后将所选的底物随后针对表达于正常，例如，非病变，组织的蛋白酶进行反选（counter-screened）。
在一些实施方案中，在可活化的抗EGFR抗体中的抗体或其抗原结合片段是衍生自抗EGFR抗体西妥昔单抗。西妥昔单抗，也称为爱必妥或C225，是特异性结合EGFR的嵌合（小鼠/人）单克隆抗体。西妥昔单抗目前用于转移性结直肠癌和头颈部癌症的治疗。
优选地，可活化的抗EGFR抗体包括重链，其是或衍生自SEQ ID NO：26的氨基酸序列，SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其抗原结合片段的序列含有至少一个氨基酸取代，以去除糖基化的潜在位点。例如，结合EGFR的抗体或其抗原结合片段包含在重链和/或轻链中的氨基酸取代，以除去糖基化的潜在位点。在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其抗原结合片段，具有重链，其中对应于具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链位置88的天冬酰胺的天冬酰胺（N）被替换为谷氨酰胺（Q）残基，以产生具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，在可活化的抗体中的结合EGFR的抗体或其抗原结合片段可以包括额外的修饰，特别是在抗体或其抗原结合片段的Fc区。例如，抗体或其抗原结合片段的Fc区可以包括一个或多个氨基酸取代，以去除糖基化的潜在位点，和或破坏其受体的Fc区的结合。在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其抗原结合片段，具有重链，其中对应于具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链位置299的天冬酰胺的天冬酰胺（N）被替换为丙氨酸（A）残基。这种突变去除Fc区中一个糖基化位点，并导致降低Fc对Fc受体的结合。在一些实施方案中，结合EGFR的抗体或其抗原结合片段，具有重链，其中对应于具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链位置88的天冬酰胺的天冬酰胺（N）被替换为谷氨酰胺（Q）残基，并且其中对应于具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链位置299的天冬酰胺的天冬酰胺（N）被替换为丙氨酸（A）残基，以产生具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，所述可活化的抗EGFR抗体包括信号肽。所述信号肽可以通过间隔物连接到可活化的抗EGFR抗体。在一些实施方案中，所述间隔物在不存在信号肽的情况下缀合到可活化的抗体。在一些实施方案中，所述间隔物直接连接到可活化的抗体的MM。在一些实施方案中，所述间隔肽具有氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 38)。在一些实施方案中，可活化的抗体包含直接连接到MM序列CISPRGCPDGPYVMY（SEQ ID NO：14）的序列QGQSGQ（SEQ ID NO：38）的间隔物，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。在一些实施方案中，可活化的抗体包括直接连接到MM序列的间隔物，并包括氨基酸序列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59)，以间隔物-MM-CM-AB的从N末端到C末端的结构安排。
本文提供的可活化的抗EGFR抗体包括掩蔽部分。在一些实施方案中，掩蔽部分是偶联或以其它方式连接到抗EGFR抗体的氨基酸序列并位于可活化的抗EGFR抗体构建体内，使得掩蔽部分降低了抗EGFR抗体特异性结合EGFR的能力。使用任何各种已知的技术鉴定合适的掩蔽部分。例如，使用由Daugherty等人在美国专利申请公开号2009/0062142（其内容通过引用整体并入本文）中描述的方法鉴定肽掩蔽部分。
本文提供的可活化的抗EGFR抗体包括可切割部分。在一些实施方案中，可切割部分包括是蛋白酶，通常是胞外蛋白酶的底物的氨基酸序列。使用任何各种已知的技术鉴定合适的底物。例如，使用由Daugherty等人在美国专利号7,666,817（其内容通过引用整体并入本文）中描述的方法鉴定肽底物。(还参见Boulware 等“Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics.” Biotechnol Bioeng. 106.3 (2010): 339-46)。
本文所述的可活化的抗EGFR抗体克服抗体疗法的限制，特别是已知至少在某种程度上在体内是有毒的抗体疗法。靶介导的毒性构成治疗性抗体发展的一个主要限制。这最有代表性的是皮疹，其困扰88％的用西妥昔单抗治疗的患者，所述西妥昔单抗特异性结合表皮生长因子受体（EGFR）并已被批准用于结直肠癌和头颈部癌的治疗。本文所提供的可活化的抗EGFR抗体的目的是解决与在正常组织中通过传统的治疗性抗体抑制靶标相关的毒性。这些可活化的抗EGFR抗体保持屏蔽直到在疾病部位蛋白水解活化。从用西妥昔单抗作为亲本治疗抗体开始，本发明的可活化的抗EGFR抗体通过经由掺入蛋白酶底物的接头将所述抗体偶联到抑制性掩蔽物进行工程化。在体外研究进行的研究中，相比西妥昔单抗，可活化抗EGFR抗体对EGFR的结合与基于细胞的活性降低。在体内研究进行的研究中，可活化的抗EGFR抗体在正常组织中保持掩蔽，但在肿瘤环境中被活化并积累。可活化的抗EGFR抗体的肿瘤活化转化成相当于西妥昔单抗的效力的体内效力。
本文提供的可活化的抗EGFR抗体满足显著的临床需求。EGFR是已经显示促进增殖、血管发生和侵袭/转移，以及抑制肿瘤细胞凋亡的临床验证的靶标。靶向EGFR的抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂已被批准用于癌症治疗（Nature Rev Cancer 5 (2005) 341; Curr Opin Cell Biol 21, (2009) 177）。然而，目前的抗EGFR治疗剂，也称作EGFR抑制剂（EGFRi），已被证明表现出许多治疗后不良事件，包括，例如，丘疹脓疱性皮疹，特别是在人对象的面部和上部躯干；皮肤干燥和瘙痒；指甲周围的炎症，头皮脱发；以及增加的睫毛和面部毛发的生长。用EGFRi治疗导致的皮肤毒性已经显示影响患者的45-100％。(参见，例如Segaert and Van Cutsem. Ann Oncol. 16(9) (2005):1425-33)。
本发明的示例性可活化的抗EGFR抗体包括，例如本文中称作3954-1204-C225v5可活化抗体的可活化的抗体，其结合表皮生长因子受体（EGFR）。3954-1204-C225v5可活化抗EGFR抗体的两个序列如下所示，序列1是3954-1204-C225v5可活化抗EGFR抗体的一个版本的序列，其包括信号肽，并且序列2是没有信号肽的3954-1204-C225v5可活化抗EGFR抗体的序列：
3954-1204-C225v5 可活化的抗体重链核苷酸序列 1:
[信号肽 (SEQ ID NO: 60)][C225v5 (SEQ ID NO: 25)]
意大利体：　　信号肽
正常文本：　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v5 可活化的抗体重链氨基酸序列 1:
[信号肽 (SEQ ID NO: 61)][C225v5 (SEQ ID NO: 26)]
意大利体：　　信号肽
正常文本：　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v5 可活化的抗体轻链核苷酸序列 1:
[信号肽(SEQ ID NO: 60)][间隔物 (SEQ ID NO: 62)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 63)][ 接头1  (SEQ ID NO: 64)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 65)][ 接头2  (SEQ ID NO: 66)][C225 (SEQ ID NO: 67)]
意大利体：　　　　　　　　　信号肽
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v5 可活化的抗体轻链氨基酸序列 1:
[信号肽(SEQ ID NO: 61)][间隔物 (SEQ ID NO: 38)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 14)][ 接头1  (SEQ ID NO: 23)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 13)][ 接头2  (SEQ ID NO: 24)][C225 (SEQ ID NO: 68)]
意大利体：　　　　　　　　　信号肽
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v5 可活化的抗体重链核苷酸序列 2:
[C225v5 (SEQ ID NO: 25)]
3954-1204-C225v5 可活化的抗体重链氨基酸序列 2:
[C225v5 (SEQ ID NO: 26)]
3954-1204-C225v5 可活化的抗体轻链核苷酸序列 2:
[间隔物(SEQ ID NO: 62)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 63)][ 接头1  (SEQ ID NO: 64)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 65)][ 接头2  (SEQ ID NO: 66)][C225 (SEQ ID NO: 67)]
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v5 可活化的抗体轻链氨基酸序列 2:
[间隔物(SEQ ID NO: 38)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 14)][ 接头1  (SEQ ID NO: 23)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 13)][ 接头2  (SEQ ID NO: 24)][C225 (SEQ ID NO: 68)]
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列。
本发明的另一示例性可活化的抗EGFR抗体是本文中称作3954-1204-C225v4可活化抗体的可活化的抗体，其结合表皮生长因子受体（EGFR）。3954-1204-C225v4可活化抗EGFR抗体的两个序列如下所示，序列1是3954-1204-C225v4可活化抗EGFR抗体的一个版本的序列，其包括信号肽，并且序列2是没有信号肽的3954-1204-C225v4可活化抗EGFR抗体的序列：
3954-1204-C225v4 可活化的抗体重链核苷酸序列 1:
[信号肽 (SEQ ID NO: 60)][C225v4 (SEQ ID NO: 29)]
意大利体：　　信号肽
正常文本：　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v4可活化的抗体重链氨基酸序列 1:
[信号肽 (SEQ ID NO: 61)][C225v4 (SEQ ID NO: 30)]
意大利体：　　信号肽
正常文本：　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v4可活化的抗体轻链核苷酸序列 1:
[信号肽(SEQ ID NO: 60)][间隔物 (SEQ ID NO: 62)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 63)][ 接头1  (SEQ ID NO: 64)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 65)][ 接头2  (SEQ ID NO: 66)][C225 (SEQ ID NO: 67)]
意大利体：　　　　　　　　　信号肽
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v4可活化的抗体轻链氨基酸序列 1:
[信号肽(SEQ ID NO: 61)][间隔物 (SEQ ID NO: 38)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 14)][ 接头1  (SEQ ID NO: 23)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 13)][ 接头2  (SEQ ID NO: 24)][C225 (SEQ ID NO: 68)]
意大利体：　　　　　　　　　信号肽
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v4 可活化的抗体重链核苷酸序列 2:
[C225v4 (SEQ ID NO: 29)]
3954-1204-C225v4可活化的抗体重链氨基酸序列 2:
[C225v4 (SEQ ID NO: 30)]
3954-1204-C225v4可活化的抗体轻链核苷酸序列 2:
[间隔物(SEQ ID NO: 62)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 63)][ 接头1  (SEQ ID NO: 64)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 65)][ 接头2  (SEQ ID NO: 66)][C225 (SEQ ID NO: 67)]
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v4可活化的抗体轻链氨基酸序列 2:
[间隔物(SEQ ID NO: 38)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 14)][ 接头1  (SEQ ID NO: 23)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 13)][ 接头2  (SEQ ID NO: 24)][C225 (SEQ ID NO: 68)]
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列。
本发明的另一示例性可活化的抗EGFR抗体是本文中称作3954-1204-C225v6可活化抗体的可活化的抗体，其结合表皮生长因子受体（EGFR）。3954-1204-C225v6可活化抗EGFR抗体的两个序列如下所示，序列1是3954-1204-C225v6可活化抗EGFR抗体的一个版本的序列，其包括信号肽，并且序列2是没有信号肽的3954-1204-C225v6可活化抗EGFR抗体的序列：
3954-1204-C225v6可活化的抗体重链核苷酸序列 1:
[信号肽 (SEQ ID NO: 60)][C225v6 (SEQ ID NO: 33)]
意大利体：　　信号肽
正常文本：　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v6可活化的抗体重链氨基酸序列 1:
[信号肽 (SEQ ID NO: 61)][C225v6 (SEQ ID NO: 34)]
意大利体：　　信号肽
正常文本：　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v6可活化的抗体轻链核苷酸序列 1:
[信号肽(SEQ ID NO: 60)][间隔物 (SEQ ID NO: 62)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 63)][ 接头1  (SEQ ID NO: 64)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 65)][ 接头2  (SEQ ID NO: 66)][C225 (SEQ ID NO: 67)]
意大利体：　　　　　　　　　信号肽
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v6可活化的抗体轻链氨基酸序列 1:
[信号肽(SEQ ID NO: 61)][间隔物 (SEQ ID NO: 38)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 14)][ 接头1  (SEQ ID NO: 23)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 13)][ 接头2  (SEQ ID NO: 24)][C225 (SEQ ID NO: 68)]
意大利体：信号肽
黑体：间隔物
下划线：掩蔽物
意大利体和下划线：接头 1
黑体和下划线 ：1204 底物
黑体、意大利体和下划线：接头 2
正常文本：抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v6可活化的抗体重链核苷酸序列 2:
[C225v6 (SEQ ID NO: 33)]
3954-1204-C225v6可活化的抗体重链氨基酸序列 2:
[C225v6 (SEQ ID NO: 34)]
3954-1204-C225v6可活化的抗体轻链核苷酸序列 2:
[间隔物(SEQ ID NO: 62)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 63)][ 接头1  (SEQ ID NO: 64)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 65)][ 接头2  (SEQ ID NO: 66)][C225 (SEQ ID NO: 67)]
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列
3954-1204-C225v6可活化的抗体轻链氨基酸序列 2:
[间隔物(SEQ ID NO: 38)][掩蔽物 (SEQ ID NO: 14)][ 接头1  (SEQ ID NO: 23)][ 1204 底物  (SEQ ID NO: 13)][ 接头2  (SEQ ID NO: 24)][C225 (SEQ ID NO: 68)]
黑体：　　　　　　　　　　　间隔物
下划线：　　　　　　　　　　掩蔽物
意大利体和下划线：　　　　　接头 1
黑体和下划线 ：　　　　　　　1204 底物
黑体、意大利体和下划线：　　接头 2
正常文本：　　　　　　　　　抗EGFR抗体衍生的序列。
当本发明的可活化的抗EGFR抗体被蛋白酶切割时，即，当所述可活化的抗EGFR处于有活性或切割状态下时，所述活化的抗EGFR抗体将仅保留无活性或未切割状态的可活化的抗体的氨基酸序列的一部分。有活性或切割状态下的可活化的抗EGFR的序列将取决于哪一种蛋白酶切割底物（CM）而变化，因为不同的蛋白酶可以有不同的识别位点。
例如，本发明的示例性抗EGFR抗体，3954-1204-C225v5可活化的抗体、3954-1204-C225v4可活化的抗体和/或3954-1204-C225v6可活化的抗体，各自具有相同的轻链氨基酸（本文称为轻链氨基酸序列2）。当暴露于尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）或MT-SP1或被其活化时，抗EGFR可活化抗体的活化形式将具有下列氨基酸序列：
当被uPA或MT-SP1活化时，3954-1204-C225v5, 3954-1204-C225v4 和/或 3954-1204-C225v6 可活化的抗体轻链氨基酸序列2的活化形式：
当暴露于活化的豆荚蛋白时，抗EGFR可活化抗体的活化形式将具有下列氨基酸序列：
当被豆荚蛋白活化时，3954-1204-C225v5, 3954-1204-C225v4 和/或 3954-1204-C225v6 可活化的抗体轻链氨基酸序列2的活化形式：
。
在一些实施方案中，本文所述的可活化的抗体还包含缀合到可活化抗体的试剂。在一些实施方案中，缀合试剂是治疗性试剂，诸如抗肿瘤剂。在这样的实施方案中，所述试剂缀合至可活化抗体的碳水化合物部分，优选其中所述碳水化合物部分位于可活化的抗体的抗体或抗原结合片段的抗原结合区以外。在一些实施方案中，所述试剂缀合到可活化抗体的抗体或抗原结合片段的巯基。在一些实施方案中，所述试剂缀合到可活化抗体的抗体或抗原结合片段的氨基。在一些实施方案中，所述试剂缀合到可活化抗体的抗体或抗原结合片段的羧基。
在一些实施方案中，所述试剂是细胞毒性剂诸如毒素（例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段），或放射性同位素（即放射缀合物）。合适的细胞毒性剂包括，例如，表1中列出任何所述细胞毒性剂。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是海兔毒素或其衍生物（如甲基阿里他汀 E、AFP、MMAF、MMAE、DMAF、DMAE）。例如，所述毒性剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。
在一些实施方案中，缀合的可活化抗体可以被修饰用于通过在所述可活化的抗体序列中插入或以其它方式包含修饰的氨基酸序列进行位点特异性缀合。设计这些修饰的氨基酸序列以允许缀合剂在缀合的可活化的抗EGFR抗体之内的受控的放置和/或剂量。例如，可活化的抗体可被工程化以在轻链和重链上的位置包括半胱氨酸取代，其提供反应性硫醇基团，并且不对蛋白折叠和装配造成负面影响，也不改变抗原结合。在一些实施方案中，可活化的抗体可以被工程改造为在可活化抗体中包括或以其它方式引入一个或多个非天然氨基酸残基，以提供合适的缀合位点。在一些实施方案中，可活化的抗体可以被工程改造为在可活化的抗体序列内包括或以其它方式引入酶促可活化的肽序列。
在一些实施方案中，所述试剂是可检测的部分，诸如，例如，标记或其他标记物。例如，所述试剂是或包含放射性标记的氨基酸、可以通过标记的亲和素（例如，包含可通过光学或量热法来检测的荧光标记物或酶促活性的链霉亲和素）来检测的一种或多种生物素基团、一种或多种放射性同位素或放射性核素、一种或多种荧光标记、一种或多种酶标记和/或一种或多种化学发光剂。在一些实施方案中，可检测部分通过间隔物分子连接。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链（来自绿脓杆菌），蓖麻毒素A链，相思子毒素A链，蒴莲素A链，α-帚曲毒蛋白，油桐蛋白，石竹素蛋白，美洲商陆蛋白（PAPI，PAPII，及PAP-S），苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒素，肥皂草（sapaonaria officinalis）抑制剂，白树毒素，mitogellin，restrictocin，酚霉素，伊诺霉素和单端孢霉烯。可获得用于产生放射性缀合抗体的各种放射性核素。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用各种双功能蛋白偶联剂制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、2-亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta 等, Science 238: 1098 (1987)所述制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸（MX-DTPA）是示例性螯合剂用于将放射性核苷酸与抗体缀合。(参见WO94/11026)。
那些本领域的普通技术人员将认识到，大量的各种可能的部分可偶联到本发明的所得的抗体。(参见，例如"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)，其整体内容通过引用并入本文)。
表1列出了一些可在本文所述本发明中利用的示例性的药剂，但绝不意在是穷尽的清单。
偶联可以通过将结合两个分子的任何化学反应实现，只要该抗体和其它部分保留它们各自的活性。这种连接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合和络合。但是，优选的结合是共价结合。共价结合可通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的掺入来实现。许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白分子，例如本发明的抗体，到其它分子。例如，代表性的偶联剂可以包括有机化合物，诸如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。此列表并非意图是穷尽本领域中已知的各种偶合剂，而是比较常见的偶联剂示例。(参见Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); and Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)。
文献中描述了优选的接头。(参见，例如Ramakrishnan, S. 等, Cancer Res. 44:201-208 (1984)描述使用MBS (M-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)。还参见，美国专利号5,030,719，描述使用卤代乙酰肼衍生物通过寡肽接头的方式偶联至抗体。特别优选的接头包括：（i）SMPT（4-琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-α-（2-吡啶-二硫代）-甲苯(Pierce Chem. Co., Cat. (21558G)；（ii）SPDP（琥珀酰亚胺基-6[3-（2-吡啶基二硫代)丙酰胺]己酸酯（Pierce Chem. Co., Cat #21651G）；和（iii）磺基-LC-SPDP（磺基琥珀酰亚胺6 [3-（2-吡啶基二硫代）-丙酰胺]己酸酯（Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G）。
上述接头含有具有不同属性的部件，从而导致偶联物具有不同的物理-化学性质。例如，接头SMPT含有具有空间位阻的二硫键，并可以形成具有增加的稳定性的缀合物。二硫键，在一般情况下，比其它连接更不稳定，因为二硫键在体外裂解，导致更少的缀合物可用。
试剂EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐可用于建立从羧酸和伯或仲胺开始的羧酰胺。因此，EDC可用于将抗体中赖氨酸残基与接头或毒素中羧酸连接，或者将抗体中天冬氨酸或谷氨酸残基与接头或毒素中的胺连接。利用EDC的此类缀合反应可以通过加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），或磺基-NHS（N-羟基-3-氧基磺酰基琥珀酰亚胺）来增强。此外向这些缀合反应添加NHS或磺基-NHS可提高缀合反应的速率、完整性、选择性和/或再现性。
在一些实施方案中，所述接头是可切割的。在一些实施方案中，所述接头是不可切割的。在一些实施方案中，存在两个或更多个接头。所述两个或更多个接头是完全一样的，例如，可切割或不可切割的，或者两个或更多个接头是不同的，例如，至少一个可切割和至少一个不可切割。
本发明利用几种方法用于将试剂连接到AB：（a）连接至AB的碳水化合物部分，或（b）连接至AB的巯基，或（c）连接至AB的氨基，或（d）连接至AB的羧基。根据本发明，AB可通过中间接头共价连接到试剂，所述接头具有至少两个反应性基团，一个与AB反应并且另一个与试剂反应。接头可包括任何相容的有机化合物，可以选择使得与AB（或试剂）的反应对于AB反应性和选择性没有不利影响。此外，接头与试剂的连接可不破坏试剂的活性。对于与氧化的抗体或氧化抗体片段反应的合适的接头包括那些含有选自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和氨基硫脲基团的胺。此类反应性官能团可作为接头结构的一部分存在，或者可以通过不含有这种基团的接头的合适的化学修饰引入。
根据本发明，用于连接到还原的AB的合适的接头包括那些具有某些能够与还原的抗体或片段的巯基反应的反应基团的接头。这样的反应性基团包括，但不限于：反应性的卤代烷基（包括，例如，卤代乙酰基）、对-苯甲酸汞基团和能够发生Michael-型加成反应的基团（包括，例如，马来酰亚胺和Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110所述的类型的基团）。
根据本发明，用于连接到既非氧化也非还原的Ab的合适的接头包括那些具有某些能够与存在于Ab中未修饰的赖氨酸残基的伯氨基反应的官能团的接头。这样的反应性基团包括，但不限于，NHS羧酸或碳酸酯、磺基-NHS羧酸或碳酸酯、4-硝基苯基羧酸或碳酸酯、五氟苯基羧酸或碳酸酯、酰基咪唑、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
根据本发明，用于连接到既非氧化也非还原的Ab的合适的接头包括那些具有某些能够与存在于Ab中天冬氨酸或谷氨酸残基的羧酸基团反应的官能团的接头，所述Ab已用合适的试剂活化。合适的活化剂包括EDC、加或不加的NHS或磺基-NHS以及用于羧酰胺形成的其它脱水剂。在这些情况下，存在于合适的接头中的官能团将包括伯胺和仲胺、肼、羟胺和酰肼。
所述试剂可以在接头连接到AB之前或之后连接接头。在某些应用中，可能希望首先产生AB-接头中间体，其中所述接头不含相关的试剂。根据具体的应用，然后可将具体试剂共价连接至接头。在其它实施方案中，首先将AB连接到MM、CM和相关的接头，然后连接到接头用于缀合的目的。
支化的接头：在具体的实施方案中，利用具有多个位点用于试剂连接的支化的接头。对于多个位点接头，单一的共价连接到AB将导致AB-接头中间体能够在多个位点结合试剂。该位点可以是醛或硫氢基或试剂可以连接到其上的任何化学位点。
可替代地，较高的比活性（或试剂对AB的更高比率）可以通过单个位点接头在AB上多个位点的连接来实现。此多个站点可通过两种方法的任何一种引入到AB。首先，可以在相同的AB中产生多个醛基和/或巯基。其次，可以将具有多个功能位点的“支化的接头”连接到AB的醛或巯基以进行后续连接到接头。支化的接头或多位点接头的功能性位点可以是醛或巯基，或可以是接头可以连接到其上的任何化学位点。更高的比活性可以通过组合这两种方法来获得，即，在AB上的几个位点上连接多个接头。
可切割的接头：本发明的一个实施方案中可以使用容易被补体系统的酶切割的肽接头，所述酶诸如但不限于尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶或具有蛋白水解活性的另一种酶。根据本发明的一种方法，试剂通过易被补体切割的接头连接。该抗体选自可以活化补体的类型。由此，抗体-试剂缀合物活化补体级联并在靶位点释放试剂。根据本发明的另一方法，试剂通过易被由具有蛋白水解活性的酶切割的接头连接，所述酶诸如尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、纤溶酶或胰蛋白酶。这些可切割接头可用于包括细胞外毒素的缀合的可活化的抗体，所述细胞外毒素例如，通过非限制性示例的方式，任何表1中所示胞外毒素。
表2中提供了可切割接头序列的非限制性实例。
此外，试剂可以经由二硫键连接（例如，在半胱氨酸分子上的二硫键）到AB。因为许多肿瘤自然释放高水平谷胱甘肽（还原剂），这样可以还原二硫键并随后在递送位点释放试剂。在某些具体实施方案中，会修饰CM的还原剂也将修饰缀合的可活化抗体的接头。
间隔物和可切割的元件：在又一实施方案中，可能有必要以这样的方式构建接头：优化试剂和可活化的抗体的AB之间的间距。这可通过使用通式结构的接头实现：
其中
W 是或；
Q是氨基酸、肽；和
n是从0-20的整数。
在其它实施方案中，所述接头可以包含间隔物元件和可切割的元件。所述间隔物元件作用在于使可切割的元件位置远离AB的核心使得可切割的元件更易于负责切割的酶接近。某些上述支化的接头可充当间隔物元件。
遍布本讨论的是，应当理解接头与试剂（或间隔物与可切割的元件，或可切割的元件与试剂）的连接不需要是特定模式的连接或反应。提供合适的稳定性和生物相容性的任何反应都是可接受的。
血清补体和接头的选择：根据本发明的一个方法，当希望释放试剂时，使用AB，所述AB是可以活化补体的类型的抗体。所获得的缀合物保留结合抗原并活化补体级联的能力。因此，根据本发明的实施方案，所述试剂连接到可切割的接头或可切割的元件的一端，并且接头基团的另一端连接到AB上的特定位点。例如，如果试剂具有羟基或氨基，其可以分别经由酯键或酰胺键连接到肽、氨基酸或其它适当选择的接头的羧基末端。例如，这些试剂可以经由碳二亚胺反应连接到接头肽。如果所述试剂包含将干扰与接头的连接的官能团，这些干扰性官能团可以在连接前被封闭并且一旦制成产品缀合物或中间体后去封闭。然后直接使用或进一步修饰后使用接头的对侧或氨基末端结合AB，所述AB能够活化补体。
接头（或接头的间隔物元件）可以是任何所希望的长度，其一端可以共价连接到可活化抗体的AB的特定位点。接头或间隔物元件的其它末端可以连接到氨基酸或肽接头。
因此，当这些缀合物在补体的存在下结合抗原时，将试剂连接到接头的酰胺键或酯键将被切割，导致以其活性形式的试剂的释放。当施用于对象时，这些缀合物将实现试剂在靶位点的递送和释放，并且对于如表1中所示但不限于其的那些药物试剂、抗生素、抗代谢物、抗增殖剂等的体内递送是特别有效的。
用于不存在补体活化的释放的接头：在又一个靶向递送的应用中，希望无补体活化的试剂的释放，因为补体级联的活化将最终裂解靶细胞。因此，当试剂的递送和释放应在不杀死靶细胞的情况下实现的时候，此应用是有用的。当希望对靶细胞递送细胞介质诸如激素、酶、糖皮质激素、神经递质、基因或酶时，这就是目标。可以通过将试剂连接到AB制备这些缀合物，所述AB不能经由温和易于被血清蛋白酶切割的接头来活化补体。当将此缀合物施用给个体时，抗原-抗体复合物将快速形成，而试剂的切割将缓慢发生，从而导致化合物在靶部位的释放。
生物化学交联剂：在其它实施方案中，所述可活化的抗体可以使用某些生物化学交联剂缀合一种或多种治疗剂。交联剂形成将两个不同分子的官能团栓系在一起的分子桥。为了逐步连接两个不同蛋白，可以使用异双功能交联剂以消除不需要的均聚物形成。
可以被溶酶体蛋白酶切割的肽接头也是有用的，例如Val-Cit、Val-Ala或其它二肽。此外，可以使用在溶酶体的低pH值环境中可切割的酸不稳定接头，例如：双-唾液酸醚。其它合适的接头包括组织蛋白酶不稳定底物，特别是在酸性pH表现出最佳的功能的那些。
表3中引用了示例性的异双功能交联剂。
不可切割接头或直接连接：在本发明的其它实施方案中，可以设计缀合物使得试剂被递送到靶但不释放。这可以通过将试剂直接或经由不可切割的接头连接到AB来实现。
这些不可切割的接头可以包括氨基酸、肽、D-氨基酸或其它有机化合物，其可以被修饰以包括可以随后在通过本文所述方法连接到AB中利用的官能团。对于这种有机接头的通式可以是
其中
W 是或；
Q是氨基酸、肽；和
n是从0-20的整数。
不可切割的缀合物：可替代地，化合物可以连接到不活化补体的AB。当使用不能活化补体的AB时，此连接可以使用易于被活化的补体切割的接头或使用不易于被活化的不同切割的接头实现。
定义：
除非另外定义，关于本发明使用的科技术语应具有本领域普通技术人员一般都了解的含义。此外，除非上下文另有需要，单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。通常本文所述关于细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡或多核苷酸化学和杂交使用的命名法，以及细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡或多核苷酸化学和杂交的技术是本领域熟知和常规使用的那些。对于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化（例如，电转化、脂质转染）使用标准技术。酶学反应和纯化技术根据制造商的说明进行或者如本领域常规实现的进行，或如本文所述进行。前述技术和方法通常根据本领域熟知的常规方法进行，和如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的进行。参见，例如Sambrook 等 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))。本文所述的分析化学，合成有机化学和医学和药物化学所使用的相关命名法，以及分析化学，合成有机化学和医学和药物化学的实验室方法和技术是本领域熟知并常规使用的。对于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者治疗使用标准技术。
当根据本公开内容使用时，下列术语，除非另有说明，应理解为具有以下含义：
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白（Ig）分子的免疫活性部分，所述免疫球蛋白分子即包含特异性结合（与其发生免疫反应）抗原的抗原结合位点的分子。通过“特异性结合”或“与其发生免疫反应”或“免疫特异性结合”指抗体与希望的抗原的一个或多个抗原性决定簇反应，并且不与其它多肽反应或以低得多的亲和力结合（Kd > 10-6）。抗体包括但不限于，多克隆、单克隆、嵌合、结构域抗体、单链、Fab和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。
已知基础的抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链形成，每对具有一个“轻”链（约25 kDa）和一个“重”链（约50-70 kDa）。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。通常，从人获得的抗体分子涉及任何种类IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，其通过分子中存在的重链的性质彼此不同。某些类型还具有亚类，诸如IgG1、IgG2等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用的术语“单克隆抗体”（mAb）或“单克隆抗体组合物”，指是仅包含由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子的一个分子种类的抗体分子群体。特别地，单克隆抗体的互补性决定区（CDR）在群体中的所有分子中是相同的。单克隆抗体含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点，特征在于对该表位的独特结合亲和力。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合位点是由重链（“H”）和轻（“L”）链的N末端可变（“V”）区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区中的三个高度不同的延伸，被称为“高变区”，插入在被称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼延伸之间。因此，术语“FR”是指在免疫球蛋白的高变区之间或附近天然存在的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置，以形成抗原结合表面。该抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。氨基酸到各个结构域的分配是按照免疫学目的蛋白的Kabat序列（Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest）的定义（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 或Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia 等 Nature 342:878-883 (1989)）。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv或T细胞受体的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面组群组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有具体的三维结构特征，以及特定的电荷特征。例如，可以针对多肽的N末端或C末端产生抗体。当解离常数≤ 1 μM；优选≤ 100 nM并且最优选≤ 10 nM时，认为抗体特异性结合抗原。
如本文所用，术语“特异性结合”，“免疫结合”和“免疫学结合性质”指一种类型的非共价相互作用，其在免疫球蛋白分子和该免疫球蛋白特异性针对的抗原之间发生。免疫学结合相互作用的强度或亲和力可以表示为相互作用的解离常数（Kd），其中更小的Kd值表示更大的亲和力。所选多肽的免疫学结合性质可以使用本领域中熟知的方法来定量。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度，相互作用的亲和力，和在两个方向上同样影响速率的几何参数。因此，“开速率常数”（Kon）和“关速率常数”（Koff）可以通过浓度和结合和解离的实际速率的计算来确定。(参见Nature 361:186-87 (1993))。Koff /Kon的比率使与亲和力不相关所有参数能够消去，并等于解离常数Kd。(一般性参见 Davies 等 (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。本发明的抗体被认为特异性结合EGFR，当平衡结合常数（Kd）为≤1 μM，优选≤100nM，更优选为≤10nM，和最优选≤100pM至约1pM时，如通过测定例如放射性配体结合测定法或本领域技术人员已知的类似测定法所测量。
如本文所用，术语“分离的多核苷酸”应指基因组、cDNA或合成来源或其一些组合的多核苷酸，其根据其来源，“分离的多核苷酸”（1）不与在自然界中其中发现“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或一部分结合，（2）可操作地连接到其在自然界中未连接的多核苷酸，或（3）在自然界中不会作为更大序列的一部分存在。按照本发明多核苷酸包括编码本文所示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子，和编码本文所示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文所述术语“分离的蛋白”指cDNA、重组RNA或合成来源或其一些组合的蛋白，其根据其来源或衍生来源，所述“分离的蛋白”（1）不与自然界中存在的蛋白结合，（2）不含来自相同来源的其它蛋白，例如，不含鼠蛋白，（3）由来自不同物种的细胞表达，或（4）自然界中不存在。
本文所用术语“多肽”作为通用术语指多肽序列的天然蛋白、片段或类似物。因此，天然蛋白片段和类似物是多肽属的种。根据本发明的多肽包含本文所示的重链免疫球蛋白分子，和本文所示的轻链免疫球蛋白分子，以及通过组合形成的抗体分子，所述组合包含重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子，如κ轻链免疫球蛋白分子，并且反之亦然，以及其片段和类似物。
如本文所用的术语“天然存在的”当应用于目标时指目标可以在自然界中找到的事实。例如，存在于生物体（包括病毒）中的多肽或多核苷酸序列，其可以从自然界中来源中分离，并且其还没有被有意地由人在实验室中或以其它方式修饰，是天然存在的。
本文所用术语“可操作地连接”指这样描述的部件的位置是以允许它们以其预期方式发挥功能的关系。控制序列“可操作地连接”到编码序列以这样一种方式连接，使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。
如本文所用术语“控制序列”指多核苷酸序列：所述多核苷酸序列是影响它们可操作地连接的编码序列的表达和加工所必需的。这样的控制序列的性质随宿主生物体而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，在真核生物中，通常这些控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意图至少包括其存在对于表达和加工而言是必需的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的额外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。本文中所述术语“多核苷酸”指长度至少10个碱基的核苷酸，无论是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA单链和双链形式。
本文所述术语寡核苷酸包括天然存在的和经修饰的核苷酸，通过天然存在的和非天然存在的寡核苷酸连接物连接在一起。寡核苷酸是多核苷酸的子集，通常包含200个碱基或更少的长度。优选地，寡核苷酸长度为10-60个碱基，并且最优选长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。寡核苷酸通常是单链的，例如，对于探针，尽管寡核苷酸可以是双链的，例如，用于基因突变体的构建。本发明的寡核苷酸是正义或反义寡核苷酸。
本文所述术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文所述术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。本文所述术语“寡核苷酸连接物”包括寡核苷酸连接物，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)、氨基磷酸酯等。参见，例如LaPlanche　等　Nucl.　Acids　Res.　14:9081　(1986);　Stec　等　J.　Am.　Chem.　Soc.　106:6077　(1984),　Stein　等　Nucl.　Acids　Res.　16:3209　(1988),　Zon　等　Anti　Cancer　Drug　Design　6:539　(1991);　Zon　等　Oligonucleotides　and　Analogues:　A　Practical　Approach,　pp.　87-108　(F.　Eckstein,　Ed.,　Oxford　University　Press,　Oxford　England　(1991));　Stec　等　美国专利号　5,151,510;　Uhlmann　and　Peyman　Chemical　Reviews　90:543　(1990)。如果需要，寡核苷酸可以包含用于检测的标记。
如本文所用，20个常规氨基酸和它们的缩写按照常规用法。参见Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))。20种常规氨基酸的立体异构体（例如，D-氨基酸），非天然氨基酸如α-、α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其它非常规氨基酸也可以是用于本发明多肽合适的组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟脯氨酸、γ羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-二甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸（例如，4-羟脯氨酸）。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向并且右手方向是羧基末端方向。
同样地，除非另有说明，单链多核苷酸序列的左手端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加的方向被称为转录方向，与RNA具有相同序列的DNA链上的序列区域，并且其是5'至RNA转录物的5'末端，被称为“上游序列”，与RNA具有相同序列的DNA链上的序列区域，并且其是3'至RNA转录物的3'末端，被称为“下游序列”。
当应用于多肽时，术语“实质同一性”是指两个肽序列，当最佳比对时，例如通过程序GAP或BESTFIT使用缺省空位权重，共有至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性，和最优选至少99％的序列同一性。
优选地，不相同的残基位置是通过保守的氨基酸取代而不同。
如本文中所讨论的，在抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小变化被考虑为被包括在本发明中，条件是在氨基酸序列中的变异维持至少75％，更优选至少80％、90％、95％和最优选99％。具体地，保守氨基酸替换是预期的。保守替换是那些在它们侧链相关的氨基酸家族内发生的替换。遗传编码的氨基酸一般分为下列家族：（1）酸性氨基酸是天冬氨酸，谷氨酸；（2）碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；（3）非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，和（4）不带电的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸其它家族包括（i）丝氨酸和苏氨酸，其是脂肪族-羟基家族；（ii）天冬酰胺和谷氨酰胺，其是含有酰胺的家族；（ⅲ）丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其是脂肪族家族；及（iv）苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其是芳族。例如，可以合理地预期亮氨酸用异亮氨酸或缬氨酸的分离的替换，用谷氨酸替换天冬氨酸，用丝氨酸替换苏氨酸，或用结构相关的氨基酸对氨基酸的类似的替换，对所得分子的结合或性质不具有重要影响，尤其是如果替换不涉及框架位点内的氨基酸。是否氨基酸的改变导致功能性肽可容易地通过测定该多肽衍生物的比活性来确定。测定法在本文中详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以被本领域普通技术人员容易地制备。优选的氨基和羧基末端片段或类似物存在于功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私有的序列数据库进行比较来鉴定。优选地，使用计算机化的比较方法来鉴定序列基序或预测的存在于已知结构和/或功能的其它蛋白中的蛋白构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie 等 Science 253:164 (1991)。因此，前述的实例说明，本领域技术人员可以识别序列基序和结构构象，其可用于限定根据本发明的结构和功能结构域。
优选的氨基酸取代是那些，其：（1）降低对蛋白水解的易感性，（2）降低对氧化的易感性，（3）改变对于形成蛋白复合物的结合亲和力，（4）改变结合亲和力，和（4）赋予或修饰其它这些类似物的物理化学或功能性质。类似物可以包括天然存在的肽序列之外的序列的各种突变蛋白。例如，可以在天然存在的序列（优选在形成分子间接触的一个或多个结构域以外的多肽部分）中进行单个或多个氨基酸取代（优选保守氨基酸取代）。保守氨基酸取代不应该实质上改变亲本序列的结构特征（例如，替换氨基酸不应倾向于打破发生在亲本序列中的螺旋，或破坏表征亲本序列的其它类型的二级结构）。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))；和Thornton 等 Nature 354:105 (1991)。
如本文所用的术语“多肽片段”指一种多肽，该多肽具有氨基端和/或羧基末端缺失和/或一个或多个内部缺失，但其中剩余的氨基酸序列是与推导（例如，从全长cDNA序列推导）的天然存在的序列中对应位置相同的。片段通常为长度至少5、6、8或10个氨基酸，优选长度至少14个氨基酸，更优选长度至少20个氨基酸，通常长度至少50个氨基酸，并且甚至更优选长度至少70个氨基酸。如本文所用的术语“类似物”指包含至少25个氨基酸的区段的多肽，其与推导的氨基酸序列的一部分具有实质同一性，且其在合适的结合条件下特异性结合EGFR。通常，多肽类似物相对于天然存在的序列包括保守氨基酸取代（或添加或缺失）。类似物通常是长度至少20个氨基酸，优选地长度至少50个氨基酸或更长，并且通常可以是长度如全长天然存在的多肽。
术语“试剂”在本文中用于指化学化合物，化学化合物的混合物，生物大分子，或由生物学材料制备的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“标记的”指掺入可检测标记物，例如，通过放射性标记的氨基酸的掺入或生物素基团与多肽的连接，所述生物素基团可以通过标记的亲和素（例如，包含可通过光学或量热法来检测的荧光标记或酶促活性的链霉亲和素）来检测。在某些情况下，标记或标记物还可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记的实例包括，但不限于下列：放射性同位素或放射性核素（例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、荧光标记（例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体）、酶标记（例如，辣根过氧化物酶、对-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶）、化学发光剂、生物素基团、被次级报告物识别的预先确定的多肽表位（例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签）。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减少潜在的空间位阻。如本文所用的术语“药剂或药物”指的是当适当地施用于患者时，能够诱导所需的治疗效果的化学化合物或组合物。
本文其它化学术语根据本领域的常规用法使用，如麦格劳-希尔化学术语词典所示例的（Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)）。
如本文所用，“基本上纯”是指目标种类是存在的主导种类（即以摩尔计其比组合物中任何其它个别种类更丰富），并且优选基本上纯的级分是组合物，其中目标种类占所存在的所有大分子种类的至少约50％（以摩尔计）。
通常，基本上纯的组合物将占存在于所述组合物中的所有大分子种类的大于约80％，更优选大于约85％、90％、95％和99％。最优选地，目标种类纯化至基本上同质（组合物中不能通过常规的检测方法来检测到的污染物种类），其中该组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语患者包括人和兽医对象。
抗体
本发明的可活化的抗体特异性结合人表皮生长因子受体（EGFR）。还包括在本发明中的是结合如本文所述的可活化的抗EGFR抗体相同表位的可活化的抗体。
本领域技术人员会认识到，无需过度实验，有可能确定是否单克隆抗体（例如，鼠单克隆抗体或人源化抗体）具有如本文所述方法中使用的单克隆抗体的相同特异性，通过评价前者是否阻止后者结合EGFR。如果所测试的单克隆抗体与本发明的单克隆抗体竞争，如通过本发明的单克隆抗体结合的降低所显示，则该两种单克隆抗体结合相同或密切相关的表位。用于确定单克隆抗体是否具有本发明的单克隆抗体的特异性的替代方法是，将本发明的单克隆抗体与EGFR预孵育，然后添加被测试的单克隆抗体，以确定是否被测试的单克隆抗体在其结合EGFR的能力方面是否被抑制。如果被测试的单克隆抗体被抑制，则在所有的可能性上，它具有与本发明的单克隆抗体相同的，或功能上等同的表位特异性。
可活化的抗EGFR抗体的用途
应当理解的是，根据本发明治疗实体的施用将与合适的载体，赋形剂和其它掺入制剂以提供改善的转移、递送、耐受等的试剂一起施用。许多合适的制剂可以见于所有药物化学家公知的：雷明顿氏药物科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（第15版， Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)），特别是其中Blaug, Seymour的第87章。这些制剂包括，例如，粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有脂质（阳离子或阴离子）的囊泡（如Lipofectin?）、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡（各种分子量的聚乙二醇）、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。任何前述混合物可以适合于根据本发明的治疗和疗法，条件是在制剂中的活性成分不被制剂灭活并且该制剂是与施用途径生理上相容的和可耐受的。对于药物化学家熟知的涉及制剂、赋形剂和载体的额外信息，还参见Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell 等 “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)，以及其中的引文。
本发明的治疗性制剂，包括可活化的抗EGFR抗体，用于预防、治疗或以其它方式缓解与异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症。例如包括可活化的抗EGFR抗体的本发明的治疗性制剂用于治疗或以其它方式缓解癌症或其它肿瘤状况。
已知增加的蛋白酶解是癌症的标志。(参见，例如Affara NI, 等 “Delineating protease functions during cancer development.” Methods Mol Biol. 539 (2009): 1-32)。肿瘤的进展、侵袭和转移是其中牵涉蛋白酶的几个相互依存的过程导致。该过程一般性显示于图8A和8B。
结合用于诊断或治疗与异常的EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的任何已知方法来确定预防、改善或治疗的有效性。延长对象的存活或以其它方式延缓与对象中异常EGFR表达和/或活性相关的疾病或病症的进展表明可活化的抗体赋予临床益处。
可活化的抗EGFR抗体可以药物组合物的形式施用。例如在Remington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro等编辑) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994；和Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.中提供了这些组合物的制备中涉及的原理和考虑，以及组分的选择中的指导。
当使用可活化的抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白的结合结构域的最小的片段。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计肽分子保留结合靶蛋白序列的能力。这些肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见，例如 Marasco 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993))。制剂还可以包含超过一种对于所治疗的特定适应症必需的活性化合物，优选具有补体活性彼此没有不良影响的那些。可替代地，或另外，所述组合物可以包含增强其功能的试剂，诸如，例如细胞毒性剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。这些分子以对于预期目的有效的量适当地存在于组合中。
活性成分也可以包埋在微胶囊中，所述微胶囊，例如，通过凝聚技术或通过界面聚合，来制备，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚（甲基丙烯酸甲酯）微胶囊，分别在胶体药物投递系统（例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊）或在粗乳液中。
要用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固态疏水性聚合物的半透性基质，该基质以成形制品，例如，膜，或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶（例如，聚（2-羟乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚交酯（美国专利号3,773,919）、L-谷氨酸和γ乙基L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射的微球）和聚-D-（-）-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸能够使分子的释放达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间阶段较短。
在一些实施方案中，可活化的抗体含有可检测标记。使用完整抗体，或其片段（例如，Fab、scFv或F(ab)2）。关于探针或抗体的术语“标记的”意在包括通过偶联（即物理连接）可检测物质至探针或抗体的探针或抗体的直接标记，以及通过与直接标记的另一种试剂反应的探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体和用生物素末端标记DNA探针，使其可以用荧光标记的链霉亲和素检测。术语“生物样品”旨在包括从对象中分离的组织、细胞和生物流体，以及对象内存在的组织、细胞和流体。因此包括在术语“生物样品”的用法中的是血液和血液的级分或组分，包括血清、血浆或淋巴。也就是说，本发明的检测方法可以用来体外以及体内检测生物样品中分析物mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。进行免疫测定的方法描述于，例如“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; 和 “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白抗体引入对象。例如，可用放射性标记物标记抗体，其在对象中的存在和位置可以通过标准成像技术来检测。
诊断和预防性制剂
本发明的抗EGFR抗体和/或可活化的抗EGFR抗体用于诊断和预防制剂。在一个实施方案中，抗EGFR抗体和/或可活化的抗EGFR抗体施用给具有发展一种或多种上述癌症或其它病症的风险的患者。患者或器官对一种或多种前述病症的倾向可使用基因型、血清学或生物化学标记物来确定。
在本发明的另一实施方案中，抗EGFR抗体和/或可活化的抗EGFR抗体施用给诊断患有与一种或多种上述病症相关的临床适应症的人个体。在诊断后，施用抗EGFR抗体和/或可活化的抗EGFR抗体以减轻或逆转临床适应症的作用。
本发明的抗体和/或可活化的抗体还可以用于患者样品中EGFR的检测，并且因此可用作诊断剂。例如，本发明的抗EGFR抗体和/或可活化的抗EGFR抗体可用于体外测定，如ELISA，以检测患者样品中的EGFR水平。
在一个实施方案中，本发明的抗EGFR抗体和/或可活化的抗EGFR抗体固定在固体支持物上（例如，微量滴定板的一个或多个孔）。固定的抗体和/或可活化的抗体对于可能存在于测试样品中的任何EGFR充当捕获抗体。在将固定的抗体与患者样品接触之前，所述固体支持物进行漂洗并用封闭剂处理以防止分析物的非特异性吸附，所述封闭剂诸如乳蛋白或白蛋白。
随后将孔用怀疑含有抗原的测试样品或用包含标准量的抗原溶液处理。这样的样品是，例如，来自怀疑具有被认为是病理诊断性循环抗原水平的对象的血清样品。漂洗掉测试样品或标准品后，将固体支持物用被可检测地标记的二级抗体处理。所述标记的二级抗体充当检测抗体。测量可检测标记的水平，并且测试样品中的EGFR抗原的浓度通过与来自标准样品的标准曲线进行比较来确定。
应该理解的是，在体外诊断测定中基于使用本发明的抗EGFR抗体获得的结果，有可能基于EGFR抗原的表达水平对对象中疾病的分期。对于给定的疾病，从诊断为在疾病进展的不同的阶段和/或在疾病的治疗性处理的不同点的对象取血液样品。使用对进展或治疗的每个阶段提供统计学显著结果的样品的群体，指定可以考虑为每个阶段的特征的一定范围的抗原的浓度。
抗EGFR抗体和/或可活化的抗EGFR抗体也可以用在诊断和/或成像方法中。在一些实施方案中，这些方法是体外方法。在一些实施方案中，这些方法是体内方法。在一些实施方案中，这些方法是原位方法。在一些实施方案中，这些方法是从体内到体外方法。例如，可以使用具有酶可切割的CM的可活化抗EGFR抗体来检测是否存在能够切割CM的酶。通过在给定宿主生物体的给定细胞或组织中活化的抗EGFR抗体（即，从可活化抗EGFR抗体的切割获得的抗体）的测量的积累，可以在诊断中使用这些可活化的抗EGFR抗体，所述诊断可以包括酶活性的体内检测（例如，定性或定量）（或者，在一些实施方案中，还原电势增加的环境，诸如那些可提供二硫键还原的环境）。活化的抗EGFR抗体的这种积累不仅表示该组织表达酶活性（或取决于CM的性质，增加的还原电势），还指示组织表达活化的抗体结合的靶。
例如，可以选择CM为在肿瘤部位，在生物学上密闭部位的病毒或细菌感染的部位（例如，诸如在脓肿中，在器官中等）等发现的蛋白酶的蛋白酶底物。AB可以是结合靶抗原的AB。采用本领域技术人员熟悉的方法，可以将可检测的标记（例如，荧光标记或放射性标记或放射性示踪剂）缀合至AB或抗EGFR抗体和/或可活化抗EGFR抗体的其它区域。在上述筛选方法的背景下讨论合适的可检测标记，并在下文中提供额外的具体实例。使用对疾病状态的蛋白或肽特异性的AB，以及其活性在目的疾病组织中升高的蛋白酶，可活化的抗EGFR抗体将显示相对其中不存在可检测水平的CM特异性酶，或CM特异性酶以比疾病组织更低的水平存在，或无活性（例如，以酶原形式或与抑制剂复合）的组织对疾病组织增加的结合率。因为小的蛋白和肽通过肾脏过滤系统迅速地从血液中清除，并且由于不存在可检测的水平的对CM酶特异性的酶（或在非疾病组织以更低水平存在，或以无活性构象存在），活化的抗EGFR抗体在疾病组织中的积累相对于非疾病组织被增强。
在另一个实例中，可活化的抗EGFR抗体可以用于检测样品中是否存在切割剂。例如，其中所述可活化的抗EGFR抗体含有易被酶切割的CM，可活化的抗EGFR抗体可用于检测（通过定量或定性）样品中的酶的存在。在另一实例中，其中所述可活化的抗EGFR抗体含有易被还原剂切割的CM，可活化的抗EGFR抗体可用于检测（通过定量或定性）样品中的还原剂的存在。为了有利于在这些方法中的分析，可活化的抗体可以被可检测地标记，并且可以结合到支持物（例如，固体支持物，如玻片或珠）。可检测标记可以定位在切割之后未释放的可活化的抗EGFR抗体的部分，例如，可检测标记可以是淬灭的荧光标记或直到切割已经发生才可检测的其它标记。该测定可以通过以下进行，例如，固定化的、可检测地标记的、可活化的抗EGFR与怀疑含有酶和/或还原剂的样品接触足以使切割发生的时间，然后洗涤以除去过量的样品和污染物。然后通过在可活化的抗EGFR抗体与样品接触前可检测的信号的变化评估切割剂（例如，酶或还原剂）在样品中的存在或不存在，例如，由于样品中切割剂对可活化的抗体的切割导致的可检测信号的存在和/或增加。
这些检测方法还可适于提供对于切割时能够结合可活化抗EGFR抗体的AB的靶的存在或不存在的检测。因此，该测定法可以适于评估切割剂的存在或不存在以及目的靶（EGFR）的存在或不存在。切割剂的存在或不存在可通过如上文所述可活化的抗EGFR抗体的可检测标记的存在和/或增加而被检测，并且靶的存在或不存在可通过靶-AB复合物的检测而被检测，例如，通过使用可检测标记的抗靶抗体。
可活化的抗EGFR抗体，还可以用于原位成像，以验证可活化抗体的活化，例如，通过蛋白酶切割，和结合到特定的靶。原位成像是一种技术，它使生物样品，如细胞培养物或组织切片中蛋白水解活性和靶能够定位。使用这种技术，能够基于可检测的标记（例如，荧光标记）的存在证实与给定靶的结合和蛋白水解活性。
这些技术可用于从疾病部位（例如肿瘤组织）或健康组织衍生的任何冷冻细胞或组织。这些技术也用于新鲜的细胞或组织样品。
在这些技术中，可活化的抗EGFR抗体用可检测标记进行标记。可检测标记可以是荧光染料，（例如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）、近红外（NIR）染料（例如，Qdot?纳米晶体）、胶体金属、半抗原、放射性标记物、生物素和扩增试剂如链霉亲和素或酶（例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）。
已与标记的可活化的抗EGFR抗体一起孵育的样品中标记的检测表明样品中含有靶，即，EGFR，并包含对于可活化的抗EGFR抗体的CM特异性的蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶的存在可以通过如下证实：使用广谱的蛋白酶抑制剂，诸如本文描述的那些，和/或通过使用蛋白酶特异性的试剂，例如，抗体，如A11，其对于蛋白酶蛋白裂解酶（MT-SP1）是特异性的并抑制MT-SP1的蛋白水解活性；参见，例如2010年11月11日公布的国际公开号WO 2010/129609。使用广谱的蛋白酶抑制剂，诸如本文描述的那些，和/或通过使用更具选择性的抑制剂的同样的方法可用于鉴定对于可活化的抗EGFR抗体的的CM特异性的蛋白酶或蛋白酶的种类。在一些实施方案中，可使用特异性针对靶的试剂证实靶的存在，例如，另一种抗EGFR抗体，或可检测标记可以与未标记的EGFR竞争。在一些实施方案中，可以使用未标记的可活化抗EGFR抗体，用标记的二级抗体或更复杂的检测系统来检测。
类似的技术也可用于体内成像，其中在对象(例如，哺乳动物，包括人)中的荧光信号的检测指示该疾病部位包含靶，即，EGFR，并包含对于可活化的抗EGFR抗体的CM是特异性的蛋白酶。
基于可活化的抗EGFR抗体中的蛋白酶特异性的CM，这些技术还可以用于试剂盒和/或作为试剂用于在各种细胞，组织和生物体中检测，鉴定或表征蛋白酶活性。
在一些实施方案中，原位成像和/或体内成像可用于鉴定那些患者需要治疗的方法。例如，在原位成像中，可活化的抗EGFR抗体用于筛选患者样本，以鉴定在适当的位置，例如，在肿瘤部位具有一个或多个适当的蛋白酶和一个或多个靶的那些患者。
在一些实施方案中，原位成像用于鉴定或以其它方式细化适合用本公开的抗EGFR可活化的抗体治疗的患者群体。例如，对于靶（例如，EGFR）和切割所测试的抗EGFR可活化的抗体（例如，在疾病位点积累可活化的抗体）的可切割部分（CM）中底物的蛋白酶测试阳性的患者被鉴定为对于用包含这样的CM的这样的抗EGFR可活化的抗体治疗合适的候选者。同样，对于靶（例如，EGFR）和切割使用这些方法测试的可活化的抗体的CM中底物的蛋白酶任一或两者测试阴性的患者被鉴定为对于另一种形式的治疗合适的候选者（即，不适合用所测试的抗EGFR可活化的抗体治疗）。在一些实施方案中，关于第一抗EGFR可活化的抗体测试阴性的这样的患者可用包含不同CM的其它抗EGFR活化的抗体测试，直到鉴定出合适的用于治疗的抗EGFR可活化的抗体（例如，包含被该患者在疾病部位切割的CM的抗EGFR可活化的抗体）。
在一些实施方案中，体内成像用于鉴定或以其它方式细化适合用本公开的抗EGFR可活化的抗体治疗的患者群体。例如，对于靶（例如，EGFR）和切割所测试的抗EGFR可活化的抗体（例如，在疾病位点积累可活化的抗体）的可切割部分（CM）中底物的蛋白酶两者测试阳性的患者被鉴定为对于用包含这样的CM的这样的抗EGFR可活化的抗体治疗合适的候选者。类似地，测试阴性的患者鉴定为对于另一种治疗形式的合适的候选者（即，不适合用所测试的抗EGFR可活化的抗体治疗）。在一些实施方案中，关于第一抗EGFR可活化的抗体测试阴性的这样的患者可用包含不同CM的其它抗EGFR活化的抗体测试，直到鉴定出合适的用于治疗的抗EGFR可活化的抗体（例如，包含被该患者在疾病部位切割的CM的抗EGFR可活化的抗体）。
药物组合物
本发明的可活化的抗EGFR抗体（本文也称为“活性化合物”）及其衍生物，片段，类似物和同系物，可以掺入适合于施用的药物组合物。此类组合物通常包含可活化的抗体和药学上可接受的载体。如本文所使用的，术语“药学可接受的载体”旨在包括任何和所有与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。合适的载体描述于本领域的标准参考文献最新版的雷明顿氏药物科学，其通过引用并入本文。这样的载体或稀释剂的优选实例包括，但不限于，水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液及5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物如固定油。这些介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则其在组合物中的使用是预期的。补充的活性化合物也可以掺入组合物。
本发明的药物组合物被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、口服（例如，吸入）、经皮（即，局部），经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸（EDTA）；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可封装在安瓿，一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液（其中水可溶）或分散体和用于无菌注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL（BASF, Parsippany, N.J.）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是达到存在易注射性的程度的流体。其必须在制造和贮存的条件下是稳定的，并且必须保存免于诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等），及其合适的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散液的情况下维持所要求的粒径和通过使用表面活性剂。防止微生物的作用可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇）、氯化钠。注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
可通过将所需量的活性化合物在适当的溶剂中掺入以上列举的一种成分或成分的组合，如需要，随后过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和来自那些上述列举的所需的其它成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于无菌注射液的制备的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其获得来自其先前无菌过滤的溶液的活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以被封入明胶胶囊或压成片剂。对于口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体制备，用作漱口水，其中流体载体中的化合物口服施用，并涮洗和吐出或吞下。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以被包含作为组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何下列成分，或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味剂。
对于吸入施用，所述化合物以气溶胶喷雾的形式从包含合适的推进剂，例如，气体，诸如二氧化碳的加压容器或分配器，或喷雾器递送。
全身施用也可以通过经粘膜或经皮方法。对于经粘膜或透皮施用，适于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。这样的渗透剂通常是本领域已知的，并且包括，例如，对于经粘膜施用，去垢剂，胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。用于经皮施用，活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂，或作为本领域通常已知的霜剂。
所述化合物也可以以栓剂（例如，用常规的栓剂基质诸如可可脂和其它甘油酯）或用于直肠递送的保留灌肠剂的形式制备。
在一个实施方案中，所述活性化合物可以与载体一起来制备，所述载体将保护化合物免于从机体快速清除，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.购得。脂质体悬浮液（包括用单克隆抗体对病毒抗原靶向受感染细胞的脂质体）也可以用作药学可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如如美国专利号4,522,811中所述。
特别有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀。本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗对象的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生与所需的药物载体组合产生所需的治疗效果的活性化合物的预定量。对于本发明的剂量单位形式的说明是由活性化合物的独特性质和要实现的特定的治疗效果，以及在配制此类活性化合物用于个体治疗的领域中固有的限制决定的，并直接取决于其。
药物组合物可以包含在容器、包装或分配器中，连同施用说明书。
本发明将在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1.材料和方法。
可活化的抗EGFR抗体的表达和纯化。编码各所述可活化的抗EGFR抗体的重链和轻链的cDNA分别克隆入经修饰的pcDNA3.1哺乳动物表达载体（Life Technologies）。按照制造商的说明书使用FreeStyle MAX转染试剂（Life Technologies）使用用于每种可活化的抗EGFR抗体的质粒瞬时转染CHO-S细胞（Life Technologies）5-7天，。使用偶联到AKTA纯化仪（GE Healthcare）的HiTrap Mab Select Sure 蛋白A柱（GE Healthcare公司）纯化可活化的抗EGFR抗体。纯度和纯化的可活化抗EGFR抗体的同质性分别通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下和使用Superdex200，10/300 GL柱（GE Healthcare）的尺寸排阻色谱法进行分析。
可活化的抗EGFR抗体切割的速率和Kcat/Km的确定。重组人uPA和MT-SP1（R & D Systems；终浓度1.6-100nM）在50mM Tris-HCl，pH值7.4，150mM NaCl，0.05％吐温-20，5mM 氯化钙，（TBST）中与500nM（uPA）和2μM（MT-SP1）一起在37℃孵育24小时。通过将5μl样品加到7μlHT蛋白表达样品缓冲液（Caliper LifeSciences）中并在95℃下孵育10分钟停止反应。通过毛细管电泳（GXII; Caliper LifeSciences）分析样品并且使用LabChip GX软件（Caliper LifeSciences）确定切割和未切割的轻链的浓度。使用下列公式确定kcat/Km：
。
C =产物转化的相对部分（切割的轻链/切割的+未切割的轻链），t =时间（s）并且P=蛋白酶浓度（M）。底物浓度保持低于Km和蛋白酶过量。
可活化的抗EGFR抗体的蛋白酶消化/活化。3954-1204-C225v4可活化的抗体，本文也称为Pb-1204（100ug）与各种蛋白酶：uPA（在PBS中50nM，pH7.2），MT-SP1（在PBS中10nM，pH 7.2），或者豆荚蛋白（在50mM MES，250mM氯化钠，pH6.0中30ug/ml），在室温下孵育4天。对于细胞增殖和EGFR结合测定，uPA切割的Pb-1204通过蛋白A琼脂糖亲和层析纯化。Pb-1204的切割通过SDS PAGE和毛细管电泳（LabChip GXII; Caliper Life Sciences）进行分析。
细胞培养和增殖测定。H292人肺癌细胞（美国典型培养物保藏中心）维持在37℃（5％CO2），在补充有10％胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中。对于增殖试验，将细胞在低血清条件（RPMI+1％FBS）下以3000个细胞/孔接种在96孔板中。第二天，以指定浓度添加抗体或可活化的抗EGFR抗体并且细胞在37℃孵育另外4天。使用Cell-Titer Glo (Promega)根据制造商的说明书测量细胞活力。
EGFR结合测定。96孔板（Nunc）用在Hank氏平衡盐溶液（HBSS pH为7.4，10mM的HEPES）中的EGFR-Fc（50ng/孔，R＆D Systems）包被并用含1％BSA的HBSS封闭。将平板与指定浓度的在HBSS/1％BSA中的抗体或可活化的抗EGFR抗体在室温下孵育1小时。然后将板与在HBSS中的缀合辣根过氧化物酶（HRP）的抗-人F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories）孵育30分钟。并通过加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物（1-Step Ultra-TMB, Pierce）随后是等体积的1M盐酸进行检测。然后测量450nm处的吸光度，并报告为光密度（OD450nm）。
在某些情况下，相对的EGFR结合使用西妥昔单抗的标准曲线（1nM的起始浓度，10点连续稀释）转化至IgG浓度。在4-参数曲线上拟合标准曲线并使用Elx 800软件内推结果。
通过光学成像对可活化的抗EGFR抗体的体内分布进行评价。HT29异种移植物肿瘤荷瘤小鼠用12.5mg/kg的Alexa Fluor750缀合的可活化的抗EGFR抗体进行腹膜内注射。成像前一个小时小鼠用淬灭的聚乙二醇化的Cy5.5底物探针（2nmol）静脉注射。在可活化的抗EGFR抗体注射后24小时用IVIS光谱/CT成像系统（Caliper LifeSciences）对小鼠进行成像。在手术过程中，将小鼠在37℃下保持在气体麻醉（5％异氟烷）下。在750nm的成像用于评估可活化的抗EGFR抗体的积累水平（例如，3954-1204-C225v4或3954-1204-C225v5以及Pb-NSUB构建体，其中来自3954-1204-C225v4或3954-1204-C225v5的蛋白酶底物序列分别已用不容易受到蛋白酶裂解的序列替换），因为标记的可活化的抗EGFR抗体构建体在该波长的分布是抗体活化和EGFR受体结合的指示。使用在680nm成像通过监测肿瘤组织中的探针活化动力学以评价底物切割的水平。最后，使用剖检评价从体内到体外的生物分布。
免疫荧光。可活化的抗EGFR抗体注射后七天处死小鼠，并将组织样品切出和冷冻保存。HT29异种移植物肿瘤和肝脏的样品在-20℃进行切片（5μm）。切片用AlexaFluor488缀合的驴抗人IgG染色并用DAPI抗褪色封片剂复染。染色的切片使用荧光显微镜（Olympus IX81）和用于Life Science Microscopy Cell的成像软件成像。
人IgG　ELISA。96孔Maxisorp板（Nunc）用在HBSS（Invitrogen）中的小鼠抗人IgG Fc抗体（50ng/孔；Jackson ImmunoResearch）包被，并用含1％BSA的HBSS封闭。将样品添加到孔中并在室温下孵育1小时。然后将板与在HBSS中的缀合辣根过氧化物酶（HRP）的抗-人F(ab')2（Jackson ImmunoResearch Laboratories）孵育30分钟。并通过加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物（1-Step Ultra-TMB, Pierce）随后是等体积的1M盐酸进行检测。然后测量450nm处的吸光度，并报告为光密度（OD450nm）。对于每个板使用西妥昔单抗（1nM起始浓度，10点稀释）生成标准曲线。在4-参数曲线上拟合标准曲线并使用Elx 800软件内推结果。
免疫沉淀和Western印迹。使用含不锈钢珠的Bullet Blender均化管（Next Advance）以每2ml裂解缓冲液1g肿瘤/组织的比例在裂解缓冲液(HBSS/ 2% Triton X-100, Halt 蛋白酶抑制剂混合物；Thermo Fisher Scientific)中对组织样品匀浆。将组织匀浆物在3000×g离心，并将上清液以20800×g在4℃下进一步离心45分钟。组织裂解物立即与10微升山羊抗人IgG Fc特异性磁珠（Bangs Laboratories, Inc.）在4℃下孵育过夜。洗涤珠并然后通过在含有β-巯基乙醇（Sigma, St. Louis, MO）的LDS样品缓冲液（Invitrogen）中变性（5分钟，95℃）洗脱。将样品电泳，转移至硝酸纤维素，用HRP-缀合的小鼠抗人IgG Fc（Jackson ImmunoResearch）印迹。条带用SuperSignal Pico化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）和ImageQuant LAS 4000（GE Healthcare）进行可视化。
体内效力研究。在Jackson Laboratory进行的体内研究经动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准。在Oncotest GmbH进行的体内研究，由德国Regierungs-pr?sidium Freiburg审查批准，并根据德国动物福利法的指导进行。
体内异种移植物研究。在Jackson Laboratory的一组异种移植物研究中，6-8周龄雌性NU/J (JAX #2019)小鼠在右后侧面皮下接种在无血清培养基中与Matrigel?1:1悬浮的5×106的NCI-H292细胞（ATCC）。一旦肿瘤变得可测量，则每周进行3次临床观察，体重和数字卡尺肿瘤体积测量。动物按照肿瘤大小分级匹配在组群中（12只小鼠/组）具有~150 mm3-200 mm3的平均肿瘤体积并开始治疗。动物每周进行静脉内治疗，进行4周。在研究的持续时间中肿瘤用卡尺每周测量两次。在1小时，8小时，24小时，72小时，将来自每组3只小鼠的血浆被收集在K2EDTA中，血液收集在组群内的小鼠间进行交替。在第3天每组4只小鼠进行安乐死并且收集肿瘤和进行快速冷冻用于分析。
在Oncotest GmbH在知情同意后从原发性患者材料使用LXFA677异种移植物模型建立了另一组异种移植物研究。异种移植物在无胸腺NMRI nu/nu小鼠中皮下生长并在达到100-300 mm3肿瘤体积后随机化。小鼠（12只/组）用抗体每周腹膜内处理一次并用卡尺每周两次测量肿瘤。每周在每组3只小鼠中收集血液，并且血液收集在组群内的小鼠间进行交替。在第3天每组4只小鼠进行安乐死并且收集肿瘤和进行快速冷冻用于分析。
免疫组化：异种移植物肿瘤和肝的样品进行切片（5μm）。载玻片脱石蜡和在蒸馏水中再水化随后用柠檬酸盐缓冲液pH6.0（Thermo Scientific）恢复。内源性过氧化物酶用0.3％过氧化氢猝灭。切片用亲和素/生物素封闭试剂盒（Vector Laboratories公司）随后3％BSA进行封闭。切片用缀合生物素的驴抗人IgG（Jackson）抗体利用ABC Elite检测试剂盒（Vector Laboratories）染色并用DAB（Pierce Scientific）可视化。载玻片用苏木精复染，脱水，透明和覆盖盖玻片。染色切片用明视场显微镜（Leica DM750）和LAS EZ软件（Leica Application Suite）成像。
药代动力学：从西妥昔单抗，或者可活化的抗EGFR抗体浓度衍生血浆药代动力学参数，使用非隔室分析，稀疏采样（Phoenix WinNonlin, v 5.2; Pharsight; Mountain View, CA）并对于每个组在每个时间点汇集个体动物的浓度。值报告为具有估计的标准误差的群体估计值（population estimates）。
实施例2.可活化的抗EGFR抗体的制备。
本文所述的可活化的抗EGFR抗体包括衍生自抗EGFR抗体西妥昔单抗的抗体或抗原结合片段。西妥昔单抗是批准用于结肠直肠癌和头颈癌的治疗的充分表征的治疗性抗体。一种基于西妥昔单抗的可活化抗EGFR抗体，在本文中称为Pb-1204，通过向轻链的N-末端加入21个氨基酸长的结合肽，即，掩蔽部分进行改造（图2A）。掩蔽物通过携带8个残基长的序列的26个氨基酸长的接头连接抗体，所述8个残基长的序列是uPA、MT-SP1或豆荚蛋白特异性底物序列。各种蛋白酶（uPA，MT-SP1，组织纤溶酶原激活剂（tPA）和/或凝血酶）关于Pb-1204可活化抗体内的底物（本文称为1204底物或简称1204）的效率，切割率和选择性显示于图9A-9D。
对Pb-1204被不同的蛋白酶切割的效率和特异性进行评价。PB-1204被人MT-SP1（2200 M-1 s-1 ± 470 M-1 s-1）、人uPA（530 M-1 s-1 ± 40 M-1 s-1）和豆荚蛋白有效地切割。然而Pb-1204不被tPA或纤溶酶，ADAM9、10和17，激肽释放酶5和7切割。PB-1204被消化到接近完成，并通过SDS-PAGE、毛细管电泳和N-末端测序分析（图2C和图5B）。切割的产物的N末端序列显示了对这三种蛋白酶的预测的切割位点。MT-SP1和uPA在相同的P1位点切割Pb-1204底物序列，并且得到相同分子量的轻链产物。通过豆荚蛋白切割产生了迁移较慢的轻链，其短3个氨基酸。
实施例3.可活化的抗EGFR抗体的体外活性。
接下来评价西妥昔单抗、Pb-1204和用uPA消化完全的Pb-1204的相对体外活性。Pb-1204与EGFR的结合相对西妥昔单抗降低了23倍，分别显示0.36nM的表观Kd相比0.02nM（图5C）。完全活化的Pb-1204和西妥昔单抗的表观Kd值是相同的（0.02nM）。Pb-1204对H292细胞增殖的抑制活性相对西妥昔单抗降低了990倍（IC50 分别为46.6 nM和0.05 nM；图2D）。一旦被活化，Pb-1204显示出与西妥昔单抗相当的抑制活性（IC50 0.07 nM）。
实施例4.可活化的抗EGFR抗体的体内分布。
为了评估易于切割Pb-1204的蛋白水解活性的体内分布，使用近红外荧光自淬灭成像（IQ）探针。载有Pb-1204的底物序列的IQ探针（IQ-1204；图3A）和载有无底物序列的肽接头的阴性对照IQ探针（IQ-NSUB）注射入HT29肿瘤荷瘤小鼠。本文所用的术语“NSUB”是指氨基酸底物序列，其包括甘氨酸和丝氨酸残基，但不容易受到蛋白酶切割。注射IQ-1204一小时后，成像显示荧光限于肿瘤部位（图3B）。这些小鼠在注射用荧光标记的Pb-1204后48小时的同时成像展示与IQ-1204相同的荧光分布并限于肿瘤。在注射IQ-NSUB和荧光标记的Pb-NSUB阴性对照的动物中没有检测到荧光。注射后七天，利用免疫荧光染色对来自处理的小鼠肿瘤和肝脏样品中可活化的抗EGFR抗体的定位进行评价。用Pb-1204注射的动物的肿瘤展示上皮细胞上的膜荧光染色，而从注射Pb-NSUB的小鼠肿瘤中没有检测到染色（图3C和3D）。来自用Pb-1204或Pb-NSUB（图6A和6B）处理的动物的肝脏样品中没有检测到染色。这些结果表明，与肿瘤部位相关的蛋白水解活性特异性切割1204底物序列。底物序列的切割允许抗体结合其靶并在肿瘤部位积累。
实施例5.可活化的抗EGFR抗体在异种移植物模型中的分析。
使用NSCLC异种移植物模型H292研究Pb-1204对EGFR依赖的肿瘤生长的影响。在Pb-1204治疗组与西妥昔单抗对照治疗组中看到肿瘤消退（图4A）。这些治疗组之间的平均肿瘤体积在研究结束（第20天）没有统计学差异，表明Pb-1204像西妥昔单抗一样有效。在Pb-NSUB对照治疗的小鼠中没有看到统计学显著肿瘤缩小。在小鼠的一个子集（n = 4）中，在长达72小时的不同的时间收集血浆样品，在72小时的时间点处死小鼠并切除肿瘤。尽管Pb-1204的循环浓度比西妥昔单抗和Pb-NSUB浓度更高，Pb-1204（2.2％±0.2）和Pb-NSUB（3.9％±0.3）的所得EGFR结合活性相比西妥昔单抗（95.6％±3.5；图4B）是轻微的。在肿瘤中发现的Pb-1204、Pb-NSUB和西妥昔单抗浓度是等价的。来自这些肿瘤裂解物的免疫印迹分析表明，Pb-1204的一个显著级分已经被活化，而Pb-NSUB保持完整和未活化。如预期的，在肿瘤中发现的Pb-1204（51.6％±0.8）的EGFR结合活性大于其血浆中的活性或Pb-NSUB（18.2％±0.3；图4C）的结合活性。
接着，Pb-1204相对于西妥昔单抗的单次剂量的活性在患者衍生的非小细胞肺癌肿瘤异种移植物模型（LXFA677）中被确定。可活化的抗EGFR抗体和抗体都同样有效抑制肿瘤生长。在第21天，西妥昔单抗已抑制肿瘤生长96％并且Pb-1204抑制肿瘤生长100％（图4D）。西妥昔单抗和Pb-1204的血浆浓度在整个研究（图7B）期间相等，并具有相同的暴露（3331 μg/ml ×天）。对于西妥昔单抗，在血浆中的EGFR结合活性浓度与抗体的浓度相等。然而，对于Pb-1204，EGFR结合活性的浓度相比循环的可活化抗EGFR抗体的总浓度大大减少。对于Pb-1204（1214 μg/ml×天）的EGFR结合活性的暴露（第1-28天）占总可活化抗EGFR抗体的循环浓度暴露的36％。治疗后72小时，切除小鼠子集（n = 4）的肿瘤，并评价可活化的抗EGFR抗体和抗体浓度和活性。肿瘤中Pb-1204中的平均浓度等于西妥昔单抗的浓度。在肿瘤中发现了可活化的抗EGFR抗体的相当大的级分（35±4％），展示出EGFR结合活性。
总之，通过两个细菌展示筛选平台的开发，鉴定了用于西妥昔单抗的抑制结合肽，即，掩蔽物，和用于蛋白酶MT-SP1、uPA和豆荚蛋白的新的肽底物。修饰亲本抗体将抑制肽通过载有新的肽底物的柔性肽接头连接到轻链的N-末端。这种可活化的抗EGFR抗体被命名为Pb-1204。Pb-1204的体外表征表明，所述掩蔽肽大大抑制可活化的抗EGFR抗体相比西妥昔单抗的活性。含底物的接头允许可活化的抗EGFR抗体被MT-SP1、uPA和豆荚蛋白特异性活化，并且一旦被活化，可活化的抗EGFR抗体表现出的活性等于西妥昔单抗。在体内，Pb-1204在循环中和在正常组织中保持稳定，但在异种移植物肿瘤中被有效地活化。Pb-1204的特异性肿瘤活化导致等于西妥昔单抗的抗肿瘤效力。
因此，本文所述的可活化的抗EGFR抗体在改进显示靶介导的毒性的多数抗体治疗剂的治疗窗口中是有用的。此外，使用可活化的抗EGFR抗体通过允许开发针对由于相关毒性不能考虑用传统抗体的靶的癌症治疗剂，扩大了癌症靶范围。
实施例6.可活化的抗EGFR抗体在非人灵长类模型中的分析。
皮疹见于施用西妥昔单抗的人和非人灵长类动物的毒性中，包括面部和上躯干的丘疹脓疱性皮疹，以及干燥和皮肤瘙痒。在本文所述的研究中，使用非人灵长类动物模型评估了可活化的抗EGFR抗体3954-1204-C225v5。简要地说，3只雌性食蟹猴的3个组用西妥昔单抗（即未修饰的西妥昔单抗）、3954-1204-C225v5或Pb-NSUB（即3954-NSUB-C225v5，可活化的抗EGFR抗体，其包括不容易被蛋白酶切割的NSUB序列）分别静脉内（IV）给药。施用40 mg/kg的负荷剂量（3次2小时的输注分配于5天），随后每周施用25mg/kg的剂量（每周2次2小时输注）。所述动物经5周的时间给药（最后剂量在第32天施用），随后是4周的无治疗恢复阶段。所有的动物每天检查皮疹。所有的动物也接受临床化学和血液学分析，以及TK和免疫原性。如图12和表4中所示，施用可活化的抗EGFR抗体3954-1204-C225v5的动物相比那些施用西妥昔单抗的动物没有表现出可检测的皮疹。此外，施用可活化的抗EGFR抗体3954-1204-C225v5的动物相比那些被施用西妥昔单抗的动物表现出减少的皮肤毒性。
表4.在非人灵长类动物中观察的皮肤毒性结果的总结
0=无红斑
1=轻微红斑
2=边界清楚的红斑
3=中度或严重红斑
4=轻微痂形成的严重红斑
（a）=此动物上标注的“红色”不是其它两只动物中标注的典型的“疹”。
在初始40mg/kg负荷剂量后接受25mg/kg每周给药的食蟹猴的血液中检测到的西妥昔单抗和3954-1204-C225v5水平的比较显示于图13A-13D。
食蟹猴皮肤中人IgG的IHC分析表明西妥昔单抗在皮肤中的显著结合，但抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5在皮肤中没有可检测的结合。
比较随时间推移的血清浓度的药代动力学研究表明，抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5的半衰期为6.6±0.5天，而西妥昔单抗的半衰期为3.2±0.4天。图19显示了显示抗EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5的半衰期相比西妥昔单抗的半衰期的示例性研究。西妥昔单抗的半衰期类似于先前报道的值。抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5的药代动力学符合缺乏全身抗原介导的清除（EGFR在正常组织中）。
实施例7.肿瘤组织用A11活性位点抗体成像和免疫组织化学染色。
设计本文所述的研究以证明本文所述的可活化的抗EGFR抗体的靶蛋白酶，具体是MT-SP1蛋白酶，在肿瘤组织中是有活性的。
如图14A-14C所示，肿瘤组织用A11活性位点抗体在体内成像和免疫组化（IHC）染色（Darragh 等, “Tumor detection by imaging proteolytic activity.” Cancer Res. 70 (2010): 1505-1512）证实了活性MT-SP1在H292异种移植物模型中的存在。A11是特异性结合MT-SP1蛋白酶（也称为蛋白裂解酶）的活性位点的抗体。
实施例8.抗EGFR可活化的抗体的原位成像。
本实施例描述本公开的抗EGFR可活化抗体的活化和结合的原位成像的使用。结果表明，本公开的抗EGFR可活化抗体可以被组织表达的蛋白酶活化并结合该组织上的EGFR靶。
可活化的抗体的原位成像代表表征细胞和组织中蛋白酶活性的独特的方法。该技术使得能够验证可活化抗体的活化和与在表达能够切割可活化抗体的蛋白酶的细胞和组织的组织切片中的靶的结合。这样的原位方法的示意图示于图15。
通过能够在与由活化的抗体识别的靶共定位的部位切割所述可活化的抗体的细胞或组织的对抗EGFR可活化抗体结合和活化的原位成像（在此也称为原位成像）如下进行：冷冻的组织切片铺在载玻片上。将含有标记的抗EGFR可活化抗体（标记的，例如，用荧光标签）溶液施加在组织上并孵育，例如在室温（约22-24℃）下1小时，所述孵育在50 mM Tris-HCl缓冲液 pH7.4的孵育缓冲液中，所述孵育缓冲液含有150mM NaCl，100μM的ZnCl2，5mM CaCl2和0.05％吐温20；以约1 μg/ml浓度的可活化抗体。这样的孵育条件可被调节以有利于在组织切片中的切割剂发挥作用，例如，通过改变该溶液的pH值（例如，在约pH 7至约pH8.5的的范围内），温度（例如，约20℃至约40℃的范围内，例如室温或37℃），孵育时间（例如，约15分钟至约150分钟的范围内，和/或可活化的抗体的浓度（例如，约0.05 μg/ml至约10 μg/ml的范围内）。然后充分洗涤组织以除去未结合的材料，并测量可检测标记。例如，当使用荧光标签时，组织提交荧光显微镜检查。在组织上检测到活化的抗体表明，组织表达切割该可活化的抗体的蛋白酶，并还表达活化的抗体结合的EGFR靶。
抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5被活化并结合冷冻的人肺癌组织的能力用原位成像进行评价。可活化的抗体用AlexaFluor? 680（Invitrogen）标记以产生标记的可活化抗体3954-1204-C225v5-AF680。如上述，标记的可活化的抗体与冷冻的人肺癌组织样品一起孵育。结果显示于图16，小图A。红色荧光组织图像显示抗EGFR可活化抗体的被组织衍生的蛋白水解切割活化的C225v5抗体的结合。如图16，小图B所示，通过将EGFR抗体（单克隆兔抗EGFR抗体，Cell Signaling）暴露于组织检测到相同模式的组织染色。如图16，小图C所示，在小图A中所示的荧光信号被用1：100稀释的广谱抑制剂混合物集III（539134, EMD Millipore, Billerica, MA）和50 mM EDTA的组织的预处理抑制。蓝色染色代表DAPI核染色。
图17表明3954-1204-C225v5在广泛的人肿瘤样品中是可活化的。第2列表明如通过EGFR抗体（单克隆兔抗EGFR抗体，Cell Signaling）所检测的，对于各种人癌症组织样品的EGFR受体的表达水平。第3列表示如通过抗体A11在各种人癌症组织样品中检测的活性蛋白裂解酶（matriptase，MT-SP1）的量。第4和5列表示EGFR可活化抗体（第5列）相比西妥昔单抗（Cetux）组织染色（第4列）原位活化和结合的评价。测量结合组织样品的EGFR、A11和西妥昔单抗抗体的量的染色评分为0到3+：0，无染色；1+（即“+”），弱染色；2+（即“++”），中等染色；和3+（即，“+++”），强染色。可活化的抗体的原位成像染色评分是基于与西妥昔单抗抗体染色的比较并定义如下：0，无染色；1+（即“+”），相比于亲本抗体弱染色；2+（即“++”），相比于亲本抗体中度染色；和3+（即，“+++”），类似于亲本抗体染色。如图17所示，已经在来自结肠直肠癌（CRC）肿瘤的9个样品中的8个观察到高水平的活性蛋白裂解酶，并且已在来自10个肺癌（NSCLC）肿瘤中5个的样品中观察到高水平的活性蛋白裂解酶。在来自相邻健康肺组织的标本中没有观察到活性蛋白裂解酶。
这些数据表明原位成像在有效和高效地鉴定或以其它方式细化适于用本公开的抗EGFR可活化的抗体（例如可活化的抗体3954-1204-C225v5）治疗的患者群体的方法中的实用性。例如，使用这些原位成像技术对于靶（例如，EGFR）和切割抗EGFR可活化的抗体的可切割部分（CM）中底物的蛋白酶(例如，MT-SP1)两者测试阳性的患者被鉴定为对于用所测试的抗EGFR可活化的抗体治疗合适的候选者。同样，使用这些原位成像技术对于靶（例如，EGFR）和切割CM中底物的蛋白酶（例如，MT-SP1）任一或两者测试阴性的患者被鉴定为对于另一种形式的治疗合适的候选者（即，不适合用所测试的抗EGFR可活化的抗体治疗）。在一些实施方案中，这样的患者可用其它抗EGFR活化的抗体测试，直到鉴定出合适的用于治疗的抗EGFR可活化的抗体（例如，包含被该患者在疾病部位切割的CM的抗EGFR可活化的抗体）。
实施例9.缀合试剂的可活化的抗体。
本实施例展示了本公开的可活化的抗体 -试剂缀合物抑制肿瘤生长的能力。
可活化抗体3954-1204-C225v5经由基于Val-Cit的接头（K-锁C5-vc-PAB；Concortis Biosystems Corp., San Diego, CA）缀合到单甲基阿里他汀 E（MMAE）（合成的抗有丝分裂微管聚合抑制剂）上，以产生可活化的抗体-试剂缀合物3954-1204-C225v5-MMAE。使用H292肺癌细胞系异种移植物小鼠模型测试3954-1204-C225v5-MMAE相对3954-1204-C225v5和相对西妥昔单抗的体内效力。通过在6-8周龄雌性NU/J (JAX #2019)小鼠右后侧面皮下接种在无血清培养基中与Matrigel?1:1悬浮的5×106的NCI-H292细胞（ATCC）建立H292异种移植物模型。一旦肿瘤变得可测量，则每周进行3次（3x）肿瘤体积测量。动物按肿瘤大小分级匹配在组群中（8只小鼠/组）具有~150 mm3-200mm3的平均肿瘤体积，并且在第0天对各组如下施用1次治疗：（a）12.5mg/kg 3954-1204-C225v5-MMAE，静脉内施加；（b）2.5mg/kg 3954-1204-C225v5-MMAE，静脉内施加；（c）12.5mg/kg Rituxan-MMAE（即，利妥昔单抗-MMAE；利妥昔单抗可购自Genentech, So. San Francisco, CA），静脉内施加；（d）12.5mg/kg3954-1204-C225v5，腹膜内施加；（e）12.5mg/kg 西妥昔单抗，腹膜内施加；或（f）12.5mg/kg IVIg，腹膜内施加。在研究的持续时间中肿瘤用卡尺每周测量两次。
如图18所示，施用28天后，12.5 mg/kg可活化抗体-试剂缀合物3954-1204-C225v5-MMAE的单次注射相比12.5 mg/kg IVIg展示显著功效（92％肿瘤缩小，p =0.0000003），如12.5 mg/kg西妥昔单抗（78％肿瘤缩小; P =0.000006）单次注射所为。在第28天，3954-1204-C225v5-MMAE的功效显著高于以该剂量的西妥昔单抗（p=0.03）的功效。在第28天，对于3954-1204-C225v5-MMAE的较低剂量 (2.5 mg/kg)（p=0.007）以及对于12.5 mg/kg剂量的利妥昔单抗-MMAE（p=0.008）记录了减少的功效。对于12.5 mg/kg的可活化的抗体3954-1204-C225v5（p=0.06，在第28天）没有观察到统计学显著的功效。
在相同的H292异种移植物肿瘤模型中进行了额外的剂量分级研究以比较以12.5mg/kg的单剂量施用或每周两次施用每次2.5mg/kg的剂量总共5次剂量（在第0、3、7、10和14天）（在研究期间总共施用12.5mg/kg可活化抗体）的西妥昔单抗和可活化的抗体3954-1204-C225v5-MMAE的活性。该剂量分级研究使用与上述对于H292异种移植物模型，EGFR结合测定法和细胞培养和增殖测定相同的对照 (12.5 mg/kg IVIg) 和方法。在此剂量分级研究中，可活化的抗体3954-1204-C225v5-MMAE的耐受性良好，如在治疗的小鼠中没有缺乏体重丧失所证明。体重丧失>20％的单个对照动物在第23天安乐死，但所有其它动物存活经过35天。
如下表5所示，在所有可活化抗体3954-1204-C225v5-MMAE和西妥昔单抗治疗组中看到显著的抗肿瘤活性，其中大于100％的值代表肿瘤缩小。
西妥昔单抗作为12.5 mg/kg的单一剂量在8/8小鼠中产生肿瘤停滞或肿瘤消退；然而，其效果是短暂的，在第35天在6/8的小鼠表现出肿瘤再生的迹象。2.5 mg/kg的分级剂量的西妥昔单抗在所有动物中同样产生肿瘤停滞或消退，随后在第35天在5/8小鼠中再生长。12.5 mg/kg的单一剂量的可活化的抗体3954-1204-C225v5-MMAE的施用具有更明显的抗肿瘤作用，在7/7小鼠中导致肿瘤消退，并且在第35天没有肿瘤再生长的迹象。2.5 mg/kg 3954-1204-C225v5-MMAE的每周两次施用在8/8小鼠中产生肿瘤消退，其中只有一个在第35天显示肿瘤再生长的迹象。在第35天肿瘤体积的统计分析表明，采用3954-1204-C225v5-MMAE的两种方案均比西妥昔单抗的分级剂量显著更有效（单因素方差分析，每种情况P<0.005）。当比较西妥昔单抗单一剂量组时也是如此。在第35天使用3954-1204-C225v5-MMAE的两个方案的活性之间没有显著性差异（使用双尾t检验，P =0.22）。
总之，可活化的抗EGFR抗体-试剂缀合物3954-1204-C225v5-MMAE在H292肿瘤模型中显示鲁棒和持久的功效，并且活性优于匹配剂量的西妥昔单抗。当作为12.5 mg/kg的单一剂量或2.5 mg/kg的重复剂量每周两次给予总共5个剂量来施用时，可活化的抗体-试剂缀合物3954-1204-C225v5-MMAE同样有效。
实施例10.缀合试剂的可活化的抗体的体外表征。
本实施例描述了本公开的可活化的抗体-试剂缀合物保持结合EGFR和抑制H292细胞增殖培养的能力。
如本文实施例中所述，抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5缀合到单甲基阿里他汀 E（MMAE）（合成的抗有丝分裂的微管蛋白聚合抑制剂），以产生可活化的抗体-试剂缀合物3954-1204-C225v5-MMAE。平均药物对抗体比（DAR）为3.44。
确定了下列化合物在基于ELISA的测定法中结合EGFR的能力和在细胞培养中抑制H292细胞增殖的能力：抗EGFR可活化抗体-试剂缀合物3954-1204-C225v5-MMAE；uPA活化的抗EGFR可活化的抗体-试剂缀合物3954-1204-C225v5-MMAE；抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5；uPA活化的抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5；和抗EGFR抗体C225v5。可活化的抗体和可活化的抗体-试剂缀合物的活化通过用在Tris pH8.5中活性位点滴定的uPA（500nM）在37℃消化过夜实现，通过CE分析（LabChip GXII）测定活化。uPA活化的可活化的抗体和uPA活化的可活化抗体-试剂缀合物使用蛋白A纯化并然后在研究之前储存在4℃。
对于基于ELISA的结合实验，将EGFR-Fc（R&D Systems）包被到96孔ELISA板的孔中。将化合物的1：3连续稀释施加到板，并使其结合。结合的抗体用抗-人F（ab'）2 IgG-HRP缀合物（Jackson ImmunoResearch Laboratories）可视化，并用生色底物TMB显色。图20A表明，MMAE缀合至可活化的抗体不干扰掩蔽部分抑制可活化抗体结合EGFR的能力。此外，MMAE对uPA活化的可活化的抗体的缀合并没有改变活化的抗体结合EGFR的能力。
对于细胞增殖测定，人肺癌细胞系H292得自ATCC。H292细胞在完全培养基（添加有10％胎牛血清的RPMI-1640）中在37℃在5％CO2的气氛中生长。在对数生长期间收获H292细胞，重悬浮于完全培养基中，并以每孔10,000个细胞的密度接种在96孔白壁烟囱状板（chimney plate）中。过夜孵育后，每种化合物的从10μg/ml开始并结束于基本上0 μg/ml的10点1:3系列稀释一式多份（in replicates）加入到培养中的细胞。细胞培养3天，并按照生产商的方案使用CellTiterGlo（Promega）和光度计（Tecan）测量细胞活力。使用Prism GraphPad分析数据。图20B表明，MMAE缀合到uPA活化的可活化的抗体提高了活化的抗体的细胞杀伤活性。此外，MMAE缀合至可活化的抗体不干扰掩蔽部分抑制未切割的可活化抗体的细胞杀伤的能力。
实施例11.抗EGFR可活化的抗体的原位成像。
本实施例描述了对于抗EGFR可活化抗体的活化和结合，使用原位成像方法筛选患者的组织样品。结果表明，本公开的抗EGFR可活化抗体可以被癌症患者的组织表达的蛋白酶活化并结合该组织上的EGFR受体。
人结肠直肠癌、非小细胞肺癌（NSCLC）和肝转移组织样品通过用标记的EGFR和A11抗体分别以1μg/ml和5μg/ml的浓度处理冷冻的组织1小时分析EGFR和MT-SP1表达的概况（图21和表6-8）。此外，抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5被活化并结合人肿瘤或肝转移组织的能力用原位成像进行评价。如上所述，用AlexaFluor?680（Invitrogen）标记可活化的抗体。根据本文所述的原位成像方案，所得的可活化的抗体3954-1204-C225V5-AF680（也称为1204-C225v5或1204-C225）与冷冻的患者组织样品一起孵育。图22阐释结肠直肠癌肝转移组织活化和结合抗EGFR可活化抗体的能力。对癌症患者的组织样本活化和结合抗EGFR可活化抗体的能力的结果总结在表6-8。测量结合组织样品的EGFR和A11抗体的量的IHC染色从0到3+进行评分：0，无染色；1+（即“+”），弱染色；2+（即“++”），中等染色；和3+（即，“+++”），强染色。原位成像染色评分是基于与西妥昔单抗抗体染色的比较并定义如下：0，无染色；1+（即“+”），相比于亲本抗体弱染色；2+（即“++”），相比于亲本抗体中度染色；和3+（即，“+++”），类似于亲本抗体染色。
*IHC染色评分为0至3+，其测量抗体结合量：0，无染色；1+，弱染色；2+，中度染色；和3+，强染色。
**IHZ染色评分是基于与亲本抗体染色的比较：0，无染色；1+，相比于亲本抗体弱染色；2+，相比于亲本抗体中度染色；和3+，类似于亲本抗体染色。
*IHC染色评分为0至3+，其测量抗体结合量：0，无染色；1+，弱染色；2+，中度染色；和3+，强染色。
**IHZ染色评分是基于与亲本抗体染色的比较：0，无染色；1+，相比于亲本抗体弱染色；2+，相比于亲本抗体中度染色；和3+，类似于亲本抗体染色。
*IHC染色评分为0至3+，其测量抗体结合量：0，无染色；1+，弱染色；2+，中度染色；和3+，强染色。
**IHZ染色评分是基于与亲本抗体染色的比较：0，无染色；1+，相比于亲本抗体弱染色；2+，相比于亲本抗体中度染色；和3+，类似于亲本抗体染色。
实施例12.抗EGFR可活化抗体的原位成像的定量。
本实施例描述结合抗EGFR抗体的IHC和A11抗体IHC的抗EGFR可活化抗体对从体内到体外生物组织的活化和结合的原位成像。可商购获得的抗EGFR抗体IHC的使用允许相对组织中EGFR表达量标准化亲本抗体（例如西妥昔单抗）和抗EGFR可活化的抗体的染色。用EGFR抗体共染色还使得抗EGFR可活化的抗体的原位成像能够相对于标准化到EGFR表达的西妥昔单抗染色定性定量。可以使用用于研究成像的生物分析软件诸如MetaMorph来执行荧光信号的定量。也可以进行用特异性识别MT-SP1的活性位点的抗体（抗体A11）的组织染色，以监测MT-SP1的活性，MT-SP1是蛋白水解切割可活化的抗体3954-1204-C225v4，3954-1204-C225v5和3954-1204-C225v6的底物的酶。
抗EGFR可活化抗体被细胞或组织切割的结合EGFR IHC进行的原位成像的定量如下进行：将冷冻组织切片放置在玻璃载玻片和在1×PBS-T中漂洗。将含有标记的抗EGFR可活化抗体（标记的，例如，用荧光标签）溶液施加在组织上并孵育，例如在室温下1小时，所述孵育在50 mM Tris-HCl缓冲液 pH7.4的孵育缓冲液中，所述孵育缓冲液含有150mM NaCl，100μM的ZnCl2，5mM CaCl2和0.05％吐温20；以约1 μg/ml浓度的可活化抗体。组织然后在1×PBS-T中漂洗以除去未结合的材料，并且内源性的IgG用3％BSA封闭。切片与可商购获得的抗兔，抗EGFR抗体和标记的A11抗体（标记的，例如，用荧光标签）孵育，例如，在室温下1小时。冲洗后，浓度施加标记有荧光标签的二级抗体抗兔IgG并在切片上孵育如30分钟，在室温下以5 μg/ml的来放大一级抗体。切片冲洗并测量可检测标记。例如，当使用荧光标签时，组织提交荧光显微镜检查。抗EGFR可抗体被活化并原位结合受体的能力通过下式来定量：
。
PbA=相比亲本抗体（如西妥昔单抗），抗EGFR可活化抗体活化和结合的%，Ab EGFR=切片上用西妥昔单抗结合的EGFR IHC的染色强度，Pb EGFR=切片上用抗EGFR可活化抗体原位成像的EGFR IHC的染色强度，Ab原位成像=西妥昔单抗结合的强度，Pb原位成像=抗EGFR可活化的抗体结合的强度。
分析人食道癌和胰腺癌组织样品的EGFR和MT-SP1表达概况；抗EGFR可活化的抗体3954-1204-C225v5被活化并结合人肿瘤的能力用原位成像进行评价。如上所述，用AlexaFluor?680（Invitrogen）标记可活化的抗体。根据本文所述的原位成像方案，所得的可活化的抗体3954-1204-C225V5-AF680与冷冻的患者组织样品一起孵育。此外，通过分别以1μg/ml 和5μg/ml 的浓度处理冷冻组织1小时来使用EGFR和AlexaFluor?750标记的A11抗体。图23阐释了食道癌组织活化和结合抗EGFR可活化抗体的能力。关于食道癌和胰腺癌患者的组织样品的活化和结合抗EGFR可活化抗体的能力的结果总结在表9。测量结合组织样品西妥昔单抗、EGFR和A11抗体的量的IHC染色从0到3+进行评分：0，无染色；1+（即“+”），弱染色；2+（即“++”），中等染色；和3+（即，“+++”），强染色。抗EGFR可活化的抗体染色的原位成像基于与标准化为EGFR染色的西妥昔单抗抗体染色的比较进行定量并通过上述的公式计算。
*IHC和西妥昔单抗染色评分为0至3+，其测量抗体结合量：0，无染色；1+，弱染色；2+，中度染色；和3+，强染色。
**3954-1204-C225的原位成像评分是基于与标准化为EGFR IHC染色的亲本抗体染色的比较，并鉴定为活化的％：0，没有活化；100％活化导致染色类似亲本抗体染色。
图23是一系列照片，显示EGFR、IHC和A11原位成像的三重染色。图像的上部行展示了在原位成像条件下在单个组织切片上进行的染色，展示了（左到右）：EGFR表达、蛋白裂解酶（MT-SP1）的活性和西妥昔单抗的结合。图像的下部行展示了在单个组织切片上进行的染色，展示了（左到右）：EGFR表达、蛋白裂解酶（MT-SP1）的活性和抗EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5的原位成像。图23中图像的右列比较了在原位成像条件下西妥昔单抗（上部的图像）的结合和通过组织来源的蛋白裂解活化的抗EGFR可活化抗体的结合（下部图像）。如图23，图像左列所示，通过将可商购获得的抗EGFR抗体暴露于组织检测到相同模式的组织染色。图23，图像的中间栏，显示出蛋白裂解酶（MT-SP1）的活性与EGFR表达的共定位。如本文所用，术语“共定位”并不旨在暗示EGFR和/或A11染色的任何重叠或其它重叠，并且术语“共定位”用来表示在表达EGFR的患者组织中MT-SP1活性的存在。总体而言，这些数据表明抗EGFR抗体3954-1204-C255v5的约90％活化是由人食管癌组织样品。
其它实施方案
虽然本发明已经结合其详细说明进行了描述，前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求的范围限定。其它方面、优点和修饰在以下的范围内。

Claims (68)

1.可活化的抗体，其在活化的状态下结合表皮生长因子受体（EGFR），包含：
特异性结合EGFR的抗体或其抗原结合片段（AB），其中所述AB包含（i）选自SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 34的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列；
或（ii）选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 10的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 68的轻链氨基酸序列；
掩蔽部分（MM），其抑制在未切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR，其中所述掩蔽部分包含氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 14)；和
偶联到所述AB的可切割部分（CM），其中所述CM是多肽，其作为蛋白酶的底物发挥作用，并且其中CM包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 13)；
其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
2.权利要求1的可活化的抗体，其中其抗原结合片段选自Fab片段、F（ab'）2片段、scFv和scAb。
3.权利要求1的可活化的抗体，其中所述可活化的抗体包含选自下列的重链和轻链的组合：
（a）包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链；
（b）包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链；
（c）包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链；
（d）包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链；
（e）包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的轻链；和
（f）包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
4.权利要求1的可活化的抗体，其中所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
5.权利要求1的可活化的抗体，其中所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
6.权利要求1的可活化的抗体，其中所述可活化的抗体包括包含SEQ ID NO: 34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的轻链。
7.权利要求1的可活化的抗体，其中所述AB对于结合EGFR具有约100nM或更低的平衡解离常数。
8.权利要求1的可活化的抗体，其中所述MM对于结合AB具有的平衡解离常数大于AB对EGFR的平衡解离常数。
9.权利要求1的可活化的抗体，其中所述MM不干扰或竞争在切割状态的可活化的抗体的AB结合EGFR。
10.权利要求1的可活化的抗体，其中所述MM是长度不超过40个氨基酸的多肽。
11.权利要求1的可活化的抗体，其中所述MM多肽序列不同于EGFR的序列，并且其中MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体不超过50%相同。
12.权利要求1的可活化的抗体，其中所述MM对EGFR不包含超过25%的氨基酸序列同一性。
13.权利要求1的可活化的抗体，其中所述MM对EGFR不包含超过10%的氨基酸序列同一性。
14.权利要求1的可活化的抗体，其中所述CM是长度至多15个氨基酸的多肽。
15.权利要求1的可活化的抗体，其中所述蛋白酶与EGFR在组织中共定位，并且其中当可活化的抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶切割可活化的抗体中的CM。
16.权利要求1的可活化的抗体，其中所述可活化的抗体在MM和CM之间包含连接肽。
17.权利要求1的可活化的抗体，其中所述可活化的抗体在CM和AB之间包含连接肽。
18.权利要求1的可活化的抗体，其中所述可活化的抗体包括第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），并且其中在未切割状态的可活化的抗体从N末端到C末端具有下列结构安排：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。
19.权利要求18的可活化的抗体，其中所述两个连接肽不需要彼此相同。
20.权利要求18的可活化的抗体，其中LP1或LP2的至少一个包含选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 15)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。
21.权利要求18的可活化的抗体，其中LP1或LP2的至少一个包含选自GGSG (SEQ ID NO: 17)、GGSGG (SEQ ID NO: 18)、GSGSG (SEQ ID NO: 19)、GSGGG (SEQ ID NO: 20)、GGGSG (SEQ ID NO: 21)和GSSSG (SEQ ID NO: 22)的氨基酸序列。
22.权利要求18的可活化的抗体，其中LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO: 23)。
23.权利要求18的可活化的抗体，其中LP2包含氨基酸序列GSSGT (SEQ ID NO: 24)或GSSG (SEQ ID NO: 37)。
24.权利要求1的可活化的抗体，其中在未切割状态的可活化的抗体包含间隔物，其中所述间隔物直接连接到MM并从N末端至C末端具有间隔物-MM-CM-AB的结构安排。
25.权利要求24的可活化的抗体，其中所述间隔物包含氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 38)。
26.权利要求24的可活化的抗体，其中所述间隔物和MM包含氨基酸序列QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 59)。
27.权利要求1的可活化的抗体，其中所述AB缀合到试剂。
28.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是毒素或其片段。
29.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是海兔毒素。
30.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是阿里他汀或其衍生物。
31.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是阿里他汀E或其衍生物。
32.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是单甲基阿里他汀E（MMAE）。
33.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是类美登素或其衍生物。
34.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是DM1或DM4。
35.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是倍癌霉素或其衍生物。
36.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂是加利车霉素或其衍生物。
37.权利要求27的可活化的抗体，其中所述试剂经由接头缀合到AB。
38.权利要求37的可活化的抗体，其中所述接头是可切割的接头。
39.权利要求1的可活化的抗体，其包含可检测部分。
40.权利要求39的可活化的抗体，其中所述可检测部分是诊断剂。
41.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1的可活化的抗体。
42.权利要求41的分离的核酸分子，其中编码可活化的抗体的核酸包含编码信号肽的核酸。
43.权利要求42的分离的核酸分子，其中编码信号肽的核酸经由编码间隔物的核酸可操作地连接编码可活化的抗体的核酸。
44.权利要求43的分离的核酸分子，其中所述编码间隔物的核酸编码包含QGQSGQ (SEQ ID NO: 38)的氨基酸序列。
45.载体，其包含根据权利要求41-44任一项的分离的核酸分子。
46.生产可活化的抗体的方法，通过在导致可活化抗体表达的条件下培养细胞，其中所述细胞包含权利要求45的载体。
47.制备可活化的抗体的方法，所述可活化的抗体在活化的状态下结合表皮生长因子受体（EGFR），所述方法包含：
（a）在导致可活化的抗体表达的条件下培养包含编码权利要求1的可活化的抗体的核酸构建体的细胞，和
（b）回收所述可活化的抗体。
48.治疗或延缓对象中EGFR相关病症的进展的方法，其包含对有需要的对象施用治疗有效量的权利要求1或权利要求27的可活化的抗体。
49.权利要求48的方法，其中所述EGFR相关病症是癌症。
50.权利要求49的方法，其中所述癌症是乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤或皮肤癌。
51.权利要求48的方法，其中所述EGFR相关病症是银屑病。
52.抑制对象中血管生成的方法，其包含对有需要的对象施用治疗有效量的权利要求1或权利要求27的可活化的抗体。
53.检测对象或样品中切割剂和表皮生长因子受体（EGFR）存在或不存在的方法，所述方法包括：
（a）用权利要求1的抗EGFR可活化抗体或权利要求24的抗EGFR可活化的抗体接触对象或样品，和
（b）测量对象或样品中活化的抗EGFR可活化的抗体的水平，
其中，对象或样品中可检测的活化的抗EGFR可活化抗体的水平表明在对象或样品中存在切割剂和EGFR，并且其中对象或样品中不可检测的活化的抗EGFR可活化的抗体的水平表明在对象或样品中不存在切割剂、EGFR或切割剂和EGFR两者。
54.权利要求53的方法，其中所述抗EGFR可活化的抗体包含可检测标记。
55.权利要求54的方法，其中所述可检测标记包含成像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。
56.权利要求53的方法，其中所述方法是体内方法、原位方法、从体内到体外方法或体外方法。
57.鉴定或细化患者群体用于EGFR相关病症的治疗的方法，其中所述方法包括（ⅰ）使来自对象的样品与根据权利要求1或权利要求27的抗EGFR可活化的抗体接触；（ⅱ）测量样品中活化的抗EGFR可活化抗体的水平，其中样品中可检测的活化的抗EGFR可活化抗体的水平表明该样品对于EGFR和切割根据权利要求1或权利要求27的可活化抗体的可切割部分（CM）中底物的切割剂的存在是阳性的；（iii）鉴定和选择对于EGFR和切割剂的存在测试阳性的一个或多个对象由此鉴定或细化患者群体；和（iv）向患者群体中一个或多个对象施用治疗有效量的根据权利要求1或权利要求27的可活化抗体，所述患者群体对于EGFR和切割剂的存在为阳性。
58.权利要求57的方法，其中所述抗EGFR可活化的抗体包含可检测标记。
59.权利要求58的方法，其中所述可检测标记包含成像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。
60.权利要求57的方法，其中所述EGFR相关病症是癌症。
61.权利要求60的方法，其中所述癌症是乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤或皮肤癌。
62.权利要求57的方法，其中所述EGFR相关病症是银屑病。
63.用于鉴定或细化患者群体用于EGFR相关病症的治疗的试剂盒，其中所述试剂盒包括（ⅰ）根据权利要求1或权利要求27的抗EGFR可活化的抗体；（ⅱ）用于测量来自对象的样品中活化的抗EGFR可活化抗体的水平的手段，其中样品中可检测的活化的抗EGFR可活化抗体的水平表明该样品对于EGFR和切割根据权利要求1或权利要求27的可活化抗体的可切割部分（CM）中底物的切割剂的存在是阳性的；（iii）用于鉴定和选择对于EGFR和切割剂的存在测试阳性的一个或多个对象由此鉴定或细化患者群体的手段；和（iv）向患者群体中一个或多个对象施用治疗有效量的根据权利要求1或权利要求27的可活化抗体的说明书，所述患者群对于EGFR和切割剂的存在为阳性。
64.权利要求63的试剂盒，其中所述抗EGFR可活化的抗体包含可检测标记。
65.权利要求64的试剂盒，其中所述可检测标记包含成像剂、造影剂、酶、荧光标记、生色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。
66.权利要求63的试剂盒，其中所述EGFR相关病症是癌症。
67.权利要求66的试剂盒，其中所述癌症是乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤或皮肤癌。
68.权利要求63的试剂盒，其中所述EGFR相关病症是银屑病。
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