CN110662766A - Cd147抗体、可激活cd147抗体及其制备和使用方法 - Google Patents

Cd147抗体、可激活cd147抗体及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明一般涉及结合CD147的抗体，结合CD147的可激活抗体以及在多种治疗、预防和诊断情景下制备和使用这些抗体和可激活抗体的方法。在一些实施方式中，CD147抗体和CD147可激活抗体结合人和食蟹猴CD147。

Description

CD147抗体、可激活CD147抗体及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月9日提交的美国临时专利申请号62/469,429的权益，其内容通过引用将其全文纳入本文。
发明领域
本发明涉及结合CD147的抗体，结合CD147的可激活抗体以及在多种治疗、预防和诊断情景下制备和使用这些抗体和可激活抗体的方法。
背景技术
已经证明基于抗体的疗法有效治疗多种疾病，但是在一些情况中，广泛的靶标表达所导致的毒性限制了它们的治疗效果。此外，基于抗体的疗法显示出其他限制，诸如给药后从循环中快速清除。
在小分子疗法领域，已经开发了提供活性化学实体的前药的策略。这类前药以相对失活的(或活性显著少的)形式给予。一旦给予，前药体内代谢成活性化合物。这类前药策略可以提供药物对其预期靶标增强的选择性以及副作用的减少。
因此，在基于抗体的疗法这一领域持续需要模仿小分子前药所需特征的抗体。
发明概述
本文提供了结合CD147的抗体，结合CD147的可激活抗体以及在多种治疗、预防和诊断情景下制备和使用这些抗体和可激活抗体的方法。在一些实施方式中，CD147抗体和CD147可激活抗体结合人和食蟹猴(cynomolgus monkey)CD147。在一些实施方式中，CD147抗体和CD147可激活抗体结合CD147抗原的糖基化和去糖基化形式。
在本发明的一个方面中，本文提供了特异性结合人CD147和食蟹猴CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)。在本发明的另一方面中，本文提供了特异性结合人CD147和/或食蟹猴CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)。在一些实施方式中，CD147包含去糖基化的CD147和糖基化的CD147。在一些实施方式中，AB特异性地结合人CD147。在一些实施方式中，AB仅结合人CD147。在任一种抗体或其抗原结合片段中，AB可以选自：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单域重链抗体和单域轻链抗体。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有选自下述的氨基酸序列：(a)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ IDNO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，(b)VH CDR1序列GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ IDNO:13)；VL CDR1序列RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，和(c)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VLCDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，本文提供了在其激活状态下结合CD147的可激活抗体，其包含：(a)特异性结合人CD147和食蟹猴CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)；(b)与AB偶联的掩蔽部分(masking moiety，MM)，其中当所述可激活抗体处于未切割(未激活状态)状态时，所述MM抑制AB与CD147的结合；和(c)与AB偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽。在一些实施方式中，CD147包含去糖基化的CD147和糖基化的CD147。在任一种本文所提供的可激活抗体中，AB可以选自：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单域重链抗体和单域轻链抗体。在任一种本文所提供的可激活抗体中，AB特异性地结合人CD147。在任一种本文所提供的可激活抗体中，AB仅结合人CD147。在一些实施方式中，可激活抗体的AB包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有选自下述的氨基酸序列：(a)VHCDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，(b)VHCDR1序列GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VHCDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，和(c)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)。在一些实施方式中，可激活抗体的AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体的AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体包含重链序列和轻链序列，所述重链序列选自SEQ ID NO:1-4和19-22，而所述轻链序列包含选自SEQ ID NO:5-9、23-27、140-182、185-227、230-272和275-317的氨基酸序列。在一些实施方式中，MM结合AB的解离常数大于AB与CD147的解离常数。在一些实施方式中，当可激活抗体处于切割状态时，MM不干扰也不竞争AB与CD147结合。在一些实施方式中，MM是长度不超过40个氨基酸的多肽。在一些实施方式中，MM多肽序列不同于人CD147。在一些实施方式中，MM多肽序列与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过50％。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，MM包含选自SEQID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，CM是在疾病组织中具有活性的蛋白酶的底物。在一些实施方式中，CM包含选自SEQ ID NO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列。在一些实施方式中，CM包含选自SEQ IDNO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。
在本文所提供的另一方面中，本文所提供的任一种抗体或可激活抗体与试剂偶联，生成偶联抗体或偶联可激活抗体。在一些实施方式中，试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方式中，试剂是核酸破坏剂。在一些实施方式中，试剂是可检测部分。在一些实施方式中，可检测部分是诊断剂。
在另一方面中，本文提供了药物组合物，其包含本文所提供的任一种抗体、可激活抗体、偶联抗体或偶联可激活抗体；以及运载体。在一些实施方式中，药物组合物包含其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
在另一方面中，本文提供分离的核酸分子，其编码本文所述的任一种抗体或可激活抗体。在相关方面中，本文提供了含有分离的核酸分子的载体。在另一相关方面中，本文提供了通过在导致抗体或可激活抗体表达的条件下培养细胞产生抗体或可激活抗体的方法，其中所述细胞包含本文所提供的核酸分子或载体。
在另一方面中，本文提供了制造在其激活状态下结合CD147的可激活抗体的方法，所述方法包括：(a)在导致本文所述任一种可激活抗体表达的条件下培养含有编码可激活抗体的核酸构建体的细胞，和(b)回收可激活抗体。
在另一方面中，本文提供了治疗其中疾病细胞表达CD147的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本文所提提供的任一种抗体，偶联抗体，可激活抗体，偶联可激活抗体，或其药物组合物。在另一方面中，本文提供了治疗与表达CD147的细胞相关的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本文所提提供的任一种抗体，偶联抗体，可激活抗体，偶联可激活抗体，或其药物组合物。在一些实施方式中，所述紊乱或疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是腺癌，胆道(胆汁)癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，三阴性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，类癌，宫颈癌，胆管癌，结直肠癌，结肠癌，子宫内膜癌，食道癌，胶质瘤，头颈癌，头颈部鳞状细胞癌，白血病，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，口咽癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，转移性去势抵抗性前列腺癌，肾癌，肉瘤，皮肤癌，鳞状细胞癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，泌尿生殖系统癌或尿路上皮癌。在另一方面中，本文提供了抑制或降低表达CD147的细胞生长、增殖或转移的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本文所提提供的任一种抗体，偶联抗体，可激活抗体，偶联可激活抗体，或其药物组合物。在一些实施方式中，CD147的表达和/或活性是异常的。在另一方面中，本文提供了抑制、阻断或预防天然配体与CD147的结合的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本文所提供的任一种抗体，偶联抗体，可激活抗体，偶联可激活抗体，或其药物组合物。在一些实施方式中，CD147的表达和/或活性是异常的。在本文所提供的包含向有此需要的对象给予本文所提供的抗体、偶联抗体、可激活抗体、偶联可激活抗体或相同的药物组合物中任一种的方法中的任一种方法中，所述方法可以包括给予其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
附图说明
图1是描述本公开的小鼠和人源化抗-人CD147抗体结合人CD147的能力的图表。
图2是描述本公开的人源化抗-人CD147抗体结合人CD147的能力的图表。
图3A-3H是描述本公开偶联的抗-人CD147抗体的体外细胞毒性的图表。
图4是表示筛选和分选本公开的掩蔽肽(masking peptide)的示意图。
图5是描述本公开的细菌表面展示的掩蔽肽与本公开的抗-人CD147抗体的亲和力的图表。
图6A和6B是描述本公开的可激活抗-人CD147抗体相较于本公开的未掩蔽的亲本抗-人CD147抗体的相对结合亲和力的示例性试验的图表。
图7A、7B和7C是描述本公开的可激活抗-人CD147抗体相较于本公开的未掩蔽的亲本抗-人CD147抗体的相对结合亲和力的图表。
图8A-8D显示了本公开的抗-人CD147抗体对各种癌症来源组织的示例性免疫组织化学试验结果。
图9是描述本公开抗-人CD147抗体结合各种人来源细胞系上人CD147能力以及本公开的抗-人CD147抗体药物偶联物对各种人来源细胞系细胞毒性的示例性研究的图表。
图10是描述本公开抗-人CD147抗体与人和食蟹猴细胞系的示例性结合亲和力研究的图表。
图11A是描述本公开完整和蛋白酶激活的抗-人CD147可激活抗体药物偶联物与人细胞系的示例性结合亲和力研究的图表。
图11B是描述本公开完整和蛋白酶激活的抗-人CD147可激活抗体药物偶联物与癌症来源细胞系的示例性体外细胞毒性研究的图表。
图12A和12B是描述异种移植模型中本公开的抗-人CD147可激活抗体药物偶联物的示例性体内功效研究的图。
图13A-13D显示了这样的示例性毒物学研究，其中相较于本公开对应的偶联抗-人CD147抗体(抗-huCD147 3A11 DM4)，接受本公开偶联可激活抗-人CD147抗体(抗-huCD1473A11-440.1-2012DM4)的食蟹猴没有显示出或者显示出较低迹象的血液毒性(基于中性粒细胞、网状红细胞和单核细胞计数)或肝毒性(基于丙氨酸转氨酶(ALT)的水平)。
图14是描述当本公开的偶联可激活抗-人CD147抗体和本公开的偶联亲本抗-人CD147抗体给予食蟹猴时的示例性药代动力学研究的图表。
图15A和15B是描述食蟹猴中本公开的偶联可激活抗-人CD147抗体和本公开的偶联亲本抗-人CD147抗体的示例性耐受性研究的图表，其通过监测给予偶联抗体的食蟹猴的丙氨酸转氨酶水平和中性粒细胞计数。
图16是描述本公开的人源化抗-人CD147抗体结合糖基化的和去糖基化的人CD147融合蛋白的能力的图像。
发明详述
CD147(也称之为基础免疫球蛋白(Basigin)，胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)，gp42，BSG，HT7，神经上皮素(neurothelin)，OX-47，M6和5A11)是一种跨膜糖蛋白，其属于免疫球蛋白超家族并在细胞间通信中其关键作用。(术语“CD147”的使用旨在覆盖其各种变形，例如，作为非限制性的示例，本所用CD-147和/或CD 147及其所有变化可以互换使用)。CD147是亲环素A和B、S100A9和血小板糖蛋白VI的受体，然而CD147作为杆细胞来源视锥细胞活力因子(rod-derived cone viability factor)的受体。.CD147与单羧酸转运体相关并且对其细胞表面易位和活性十分关键。CD147还与多种整合素相互作用。在相同的膜平面中，CD147还与其他蛋白质，包含GLUT1、CD44和CD98相关。凝集素诸如半乳凝素-3和E-选择素识别CD147的糖类(carbohydrate)部分。这些分子识别形成CD147在转运营养物质、迁移炎症性白细胞和诱导基质金属蛋白酶(MMP)中作用的基础。CD147在视力、精子发生等生理现象中起作用，并还在许多疾病，包括癌症的发病机理中起作用。CD147还是存在于疟原虫中的侵入性蛋白RH5的受体。
CD147在造血和非造血细胞，诸如单核细胞、粒细胞、上皮细胞和内皮细胞上具有广泛的表达模式。CD147在活性T淋巴细胞上被上调。一些CD147抗体，针对特定的表位，抑制CD3 mAb诱导的增殖。
CD147是所需的靶标，因为其普遍存在于多种癌症适应症。
相应地，本公开提供了特异性结合哺乳动物CD147的抗体，可激活抗体，偶联抗体和偶联可激活抗体及其制备和使用的方法。
更具体地，本公开提供了这样的抗-哺乳动物CD147抗体和其片段(在本文中可互换地指CD147抗体或AB)，偶联CD147抗体，可激活CD147抗体和偶联可激活CD147抗体，它们能够用于治疗、预防和延缓与表达CD147细胞相关疾病或紊乱的进展，减轻和/或缓解其症状的方法。在一些实施方式中，细胞与正常CD147表达和/或活性相关。在一些实施方式中，细胞与异常CD147表达和/或活性相关。在一些实施方式中，细胞与疾病细胞中CD147表达和/或活性相关。例如，本文所述的抗体/可激活抗体中的任一种可以用于治疗、预防、延缓癌症或其他肿瘤病症的进展，减轻和/或缓解其症状。本文所述的抗体/可激活抗体中的任一种还可以用于检测/诊断应用。
在一些实施方式中，抗体和可激活抗体特异性地结合人CD147和食蟹猴CD147。在一些实施方式中，抗体和可激活抗体结合人CD147。在一些实施方式中，抗体和可激活抗体结合食蟹猴CD147。在一些实施方式中，抗体和可激活抗体通过含CD147的细胞内化。在一些实施方式中，抗体和可激活抗体结合CD147抗原的糖基化和去糖基化形式。
定义：
除非另有说明，与本公开联用的科技术语应当具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。术语“一个”实体或“一种”实体指一种或多种所述实体。例如，化合物指一种或多种化合物。因此，术语“一个”、“一种”、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。此外，除非另有说明，单数术语包括复数且复数术语包括单数。通常，本文所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交中使用的命名和技术是本领域公知且普遍使用的。对于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化(如电穿孔、脂质转染)，使用了标准技术。酶促反应和纯化技术按照生产商的说明书或按照本领域常规操作或按照本文所述来进行。以上所述技术和方法通常按照如本领域所知、亦如本说明书所引用和论述的众多综合性和专论性文献中所述来进行。参见例如，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(1989))。本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药学化学中使用的命名以及实验室方法和技术是本领域公知且普遍使用的。对于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者，使用了标准技术。
如本公开中所用，除非另有说明，以下术语应理解为具有以下含义：
本文所用术语“抗体”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与……免疫反应”或“免疫特异性地结合”表示抗体与所需抗原的一种或多种抗原决定簇反应而不与其他多肽反应或以很低的亲和力(Kd>10-6)结合其他多肽。抗体包括但不限于多克隆，单克隆，嵌合，结构域抗体，单链，Fab和F(ab’)2片段，scFv，和Fab表达文库。本文所提供的抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类型(或其亚型)中的任一种。
本文所用术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”表示仅包含一种分子种类的抗体分子的抗体分子群体，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。具体而言，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在所述群体的所有分子中均相同。MAb包含能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点，所述免疫反应表征为与其独特的结合亲和力。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。所述抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区中三个高度分化的分支(被称作“高变区”)位于更保守的侧翼分支(被称作“框架区”或“FR”)之间。因此，术语“FR”表示免疫球蛋白中在天然情况下存在于高变区之间或邻近高变区的氨基酸序列。在一抗体分子中，轻链的3个高变区和重链的3个高变区在三维空间中彼此相对设置以形成抗原-结合表面。抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，且每条重链和轻链的三个高变区均被称作“互补决定区”或“CDR”。各结构域氨基酸的分配与Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(《免疫学感兴趣蛋白的序列》)(马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National Institutes of Health)(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等，Nature 342:878-883(1989)的定义一致。
本文所用术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白、scFv或T细胞受体的蛋白决定区。术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白决定区。表位决定区通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。例如，针对多肽N-末端或C-末端肽产生抗体。当解离常数≤1μM，在一些实施方式中≤100nM，且在一些实施方式中≤10nM时，即可称抗体特异性结合抗原。
本文所用术语“特异性结合”、“免疫球蛋白结合”和“免疫球蛋白结合特性”指这些类型的非共价相互作用，其在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生。免疫结合相互作用的强度或亲和力可用术语相互作用的解离常数(Kd)表示，其中Kd越小表面亲和力越高。选定多肽的免疫结合特性可以使用本领域所熟知的方法定量。一种这类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中速率依赖复合物参与者的浓度、相互作用的亲和力和几何参数，这些因素同等地两个方向的速率。因此“结合速率常数(kon)”和“解离速率常数(koff)”均可通过对浓度以及结合与解离的实际速率的计算确定。(参见Nature 361:185-87(1993))。Koff/Kon的比率能够滤除所有与亲和力不相关的参数，且等于解离常数Kd。(通常参见，Davies等(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。当结合常数(Kd)是≤1μM时，在一些实施方式中是≤100nM时，在一些实施方式中是≤10nM，且在一些实施方式中是≤100pM至约1pM时，由试验诸如放射性配体结合试验或本领域技术人员所知的相似试验测量，据信本公开的抗体将特异性地结合靶标。
本文所用术语“分离的多核苷酸”表示基因组多核苷酸、cDNA或合成来源或其一些组合，从本义上说“分离的多核苷酸”(1)与在自然中发现的“分离的多核苷酸”的全部或部分不相关，(2)可操作地连接至在自然中不连接的多核苷酸，或(3)不以较长序列一部分的形式出现在自然中。根据本公开的多核苷酸包含编码本文所示重链免疫球蛋白分子的核酸分子，以及编码本文所示轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文中术语“分离的蛋白质”表示cDNA、重组RNA或合成来源或其一些组合的蛋白质，从本义或派生含义上说“分离的蛋白质”(1)与自然中发现的蛋白质不相关，(2)不含同一来源的其他蛋白质(如不含鼠蛋白质)，(3)通过来自其他物种的细胞表达，或(4)不存在于自然中。
本文所用术语“多肽”是一个普通术语，表示天然蛋白质、片段或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属中的种。根据本公开的多肽包含本文所示重链免疫球蛋白分子和本文所示轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子的组合形成的抗体分子，如κ轻链免疫球蛋白分子，并且反之亦然，及其片段和类似物。
本文中术语“天然形成”用于描述某一物体，表明某一物体是在自然中发现的这一事实。例如，可以从自然来源中分离且尚未被人类在实验室中或以其他方式有意修改的生物体(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然形成的。
本文所用术语“可操作地连接”表示组分的位置，其中如此描述的组分的关系允许其以所需方式发挥功能。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以在与控制序列相容的条件下完成编码序列表达的方式连接。
如本文所用术语“控制序列”指影响其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。这类控制序列的性质根据原核生物中宿主生物体而不同，这类控制序列在真核生物中通常包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，通常这类控制序列包含启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在最低限度包括其存在对表达和加工必要的所有组分，且还可包括其存在是有益的其他组分，例如前导序列和融合伙伴序列。本文所用术语“多核苷酸”表示长度为至少10个碱基的核苷酸，包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这两种类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。
本文所用术语寡核苷酸包括天然形成的核苷酸，和通过天然形成和非天然形成的寡核苷酸连接相连的经修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的一个子集，通常包括200个碱基的长度或更短。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基，并且在一些实施方式中，长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个碱基。寡核苷酸通常是单链，例如，对于探针，虽然寡核苷酸可以是双链的，例如，用于构建基因突变体。本公开的寡核苷酸是正义或反义寡核苷酸。
本文所用术语“天然形成的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文所用术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰或取代的糖基团的核苷酸等。本文所用术语“寡核苷酸连接”包括寡核苷酸连接，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代磷酰硫酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等。参见，例如，LaPlanche等，Nucl.AcidsRes.14:9081(1986)；Stec等，J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984)；Stein等，Nucl.AcidsRes.16:3209(1988)；Zon等，Anti Cancer Drug Design 6:539(1991)；Zon等，Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach(《寡核苷酸和类似物：一种实践方法》)第87-108页(F.Eckstein编，牛津大学出版社，英格兰牛津(1991))；Stec等，美国专利号5,151,510；Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)。如果需要，寡核苷酸可包括用于检测的标记物。
本文中使用的20种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见，Immunology-ASynthesis(《免疫学–合成》)(第2版，E.S.Golub和D.R.Green编著，希努联合公司(SinauerAssociates)，马萨诸塞州桑德兰(1991))。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸(如α-,α-双取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本公开的多肽的合适组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似氨基酸和亚氨基酸(如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，左手方向是氨基端方向，右手方向是羧基端方向，按照标准用法和常规。
类似地，除非另有说明，单链多核苷酸序列的左手端为5’端，双链多核苷酸序列的左手端称作5’方向。新生RNA转录本的5’至3’方向称作转录方向，DNA链上序列RNA相同且为5’的序列区域至RNA转录本的5’端称作“上游序列”，DNA链上序列与RNA相同且为3’的序列区域至RNA转录本的3’端称作“下游序列”。
应用于多肽时，术语“基本相同”表示进行最优比对(如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认缺口权重)时两条多肽序列存在至少80％的序列相同性，在一些实施方式中，至少90％的序列相同性，在一些实施方式中，至少95％的序列相同性，且在一些实施方式中，至少99％的序列相同性。
在一些实施方式中，不相同的残基位点是由于保守性氨基酸取代造成的。
如本文所述，可将抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的较小变异视作被本公开所涵盖，前提是氨基酸序列中的变异保持在至少75％，在一些实施方式中，至少80％、90％、95％，且在一些实施方式中，为99％。特别地，考虑了保守性氨基酸取代。保守性取代是在侧链相关的氨基酸家族内发生的取代。遗传编码的氨基酸通常分为几个家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他氨基酸家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，属于脂肪族-羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，属于含酰胺家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，属于脂肪族家族；以及(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，属于芳香族家族。例如，能合理预期用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸，或用结构上相关的氨基酸类似地取代某氨基酸对所得分子的结合和性质不会产生大影响，特别是如果该取代并不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能肽能易于通过测定所述多肽衍生物的特异活性来测定。本文详细描述了试验。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物能易于通过本领域普通技术制备。合适的片段或类似物的氨基和羧基末端出现在功能结构域的边界附近。通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有的序列数据库能鉴定结构和功能结构域。在一些实施方式中，使用计算机比较方法以鉴定在已知结构和/或功能的其他蛋白上出现的序列基序或预测蛋白构型结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等，Science253:164(1991)。因此，上述实施例显示了本领域技术人员能识别可用于定义根据本公开所述结构和功能结构域的序列基序和结构构型。
合适的氨基酸取代具有如下特性：(1)减少对蛋白水解的敏感性，(2)减少对氧化的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(5)给予或修饰这类类似物的其他理化或功能特性。类似物可包括多种不同于天然形成肽序列的序列突变蛋白。例如，可在天然形成的序列中(例如，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当从本质上改变亲本序列的结构特征(例如，取代氨基酸不倾向于破坏存在于亲本序列中的双螺旋，或者破坏作为亲本序列特征的其他类型的二级结构)。本领域公认的二级和三级结构示例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(《蛋白质、结构和分子原理》)(Creighton编，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)，纽约(1984))；Introduction to Protein Structure(《蛋白质结构简介》)(C.Branden和J.Tooze编，加兰出版公司(Garland Publishing)，纽约州纽约(1991))；以及Thornton等，Nature 354:105(1991)。
本文所用术语“多肽片段”指具有氨基端和/或羧基端缺失和/或一个或多个内部缺失的多肽，但剩余的氨基酸序列与例如全长cDNA序列推导出的天然形成序列的相应位置相同。片段的长度通常为至少5、6、8或10个氨基酸，在一些实施方式中，为至少14个氨基酸，在一些实施方式中，为至少20个氨基酸，通常至少50个氨基酸，且在一些实施方式中，为至少70个氨基酸。本文所用术语“类似物”指由至少25个氨基酸的区段组成的多肽，其与推导出氨基酸序列的部分基本相同且在适当结合条件下特异性结合靶标。通常，多肽类似物包括相对于天然形成序列的保守性氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物的长度通常为至少20个氨基酸，在一些实施方式中，为至少50个氨基酸或更长，且经常与全长的天然形成多肽一样长。
本文所用术语“试剂”表示化学化合物、化学化合物混合物、生物大分子或由生物材料制得的提取物。
本文所用术语“标记物”或“带标记的”表示整合可检测标志物，例如通过整合带放射标记的氨基酸或将多肽连接至能够被标志的亲和素(例如包含可由光学或量热法检测的含荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)检测到的生物素部分。在某些情况中，标记物或标志物可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法为本领域已知并可使用。多肽标记物的示例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记物(如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记物(如辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光试、生物素基团、由第二报告物识别的预定多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方式中，标记物通过长度各异的间隔臂连接以减少潜在的空间位阻。本文所用术语“药剂或药物”表示适当地给予患者后能够诱导产生所需治疗效果的化学化合物或组合物。
本文中的其他化学术语根据本领域的常规用法使用，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(《麦格劳-希尔化学术语词典》)(Parker,S.编，格劳-希尔公司(McGraw-Hill)，旧金山(1985))。
在本文中，“基本纯的”表示目标物质是存在的主要物质(即与组合物中的任意其他单独物质相比，其摩尔基准更大)，在一些实施方式中，基本纯的馏分是目标物质构成存在的所有大分子物质的至少约50％(摩尔基准)的组合物。
通常，基本纯的组合物可包括组合物中存在的所有大分子物质中的约80％以上，在一些实施方式中，约85％、90％、95％和99％以上。在一些实施方式中，所述目标物质纯化成基本同质的(通过常规检测方法在组合物中无法检测到污染物质)，其中所述组合物基本上由单一的大分子物质构成。
术语患者包括人和兽医对象。
CD147抗体
本文提供了特异性结合哺乳动物CD147的抗体及其抗原结合片段(AB)。在一些实施方式中，AB特异性地结合人CD147和食蟹猴CD147。
本文所提供的结合CD147的AB包括单克隆抗体，结构域抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab’)2片段，scFv，scAb，dAb，单域重链抗体或单域轻链抗体。在一些实施方式中，结合CD147的这类AB是小鼠，其他啮齿动物，嵌合，人源化或完整人单克隆抗体。
本文还提供了含有这样的抗体或其抗原结合片段(AB)的可激活CD147抗体，所述AB特异性结合与掩蔽部分(MM)偶联的CD147，因此MM的偶联减少抗体或其抗原结合片段结合CD147的能力。在一些实施方式中，MM通过序列偶联，所述序列包含针对蛋白酶(例如，与CD147共定位于对象处理位点的蛋白酶)的底物(可切割部分，CM)。本公开的可激活CD147抗体在下述部分详述。
本公开的CD147抗体特异性地结合哺乳动物CD147靶标，例如，人CD147。本公开还包括的是结合与本公开抗体和/或本文所述激活的可激活抗体相同CD147表位的CD147抗体和AB。本公开还包括与本文所述CD147抗体竞争结合CD147靶标(例如，人CD147)的CD147抗体。本公开还包括与本文所述CD147抗体和/或激活的CD147可激活抗体交叉竞争结合CD147靶标(例如，人CD147)的CD147抗体。
本公开的抗体和/或可激活抗体特异性地结合哺乳动物CD147，例如，人CD147和食蟹猴CD147。本公开还包括的是结合与本文所述抗体和/或可激活抗体中任一种相同表位的抗体和/或可激活抗体。本公开还包括的是与本文所述CD147抗体(抑制其结合)和/或CD147可激活抗体竞争结合CD147(例如，人CD147)的抗体和/或抗体可激活抗体。本公开还包括的是与本文所述CD147抗体和/或CD147可激活抗体交叉竞争结合CD147(抑制其结合CD147)例如人CD147的抗体和/或抗体可激活抗体。
在一些实施方式中，哺乳动物CD147选自人CD147，鼠CD147，大鼠CD147和食蟹猴CD147.在一些实施方式中，AB以小于1nM的解离常数特异性地结合人CD147，鼠CD147或食蟹猴CD147。在一些实施方式中，哺乳动物CD147是人CD147。
在一些实施方式中，AB具有下述一种或多种特征：(a)AB特异性地结合人CD147；和(b)AB特异性地结合人CD147和食蟹猴CD147。
在一些实施方式中，AB具有下述一种或多种特征：(a)AB特异性地结合人CD147和食蟹猴CD147；(b)AB抑制CD147的一种或多种天然哺乳动物配体与哺乳动物CD147的结合；(c)AB抑制CD147的一种或多种天然人配体与人CD147的结合；和(d)AB抑制CD147的一种或多种天然食蟹猴配体与食蟹猴CD147的结合。
在一些实施方式中，AB结合CD147的糖基化和去糖基化形式。
在一些实施方式中，AB以这样的EC50阻断天然配体结合哺乳动物CD147的能力，所述EC50小于或等于5nM，小于或等于10nM，小于或等于50nM，小于或等于100nM，小于或等于500nM，和/或小于或等于1000nM。在一些实施方式中，AB以这样的EC50阻断天然配体结合哺乳动物CD147的能力，所述EC50小于或等于5nM，小于或等于10nM，小于或等于50nM，小于或等于100nM，小于或等于500nM，和/或小于或等于1000nM。
在一些实施方式中，AB以这样的EC50阻断天然配体结合哺乳动物CD147的能力，所述EC50为5nM-1000nM、5nM-500nM、5nM-100nM 5nM-50nM、5nM-10nM、10nM-1000nM、10nM-500nM、10nM-100nM 10nM-50nM、50nM-1000nM、50nM-500nM、50nM-100nM、100nM-1000nM、100nM-500nM、500nM-1000nM。在一些实施方式中，AB以这样的EC50阻断天然配体结合哺乳动物CD147的能力，所述EC50为5nM-1000nM、5nM-500nM、5nM-100nM 5nM-50nM、5nM-10nM、10nM-1000nM、10nM-500nM、10nM-100nM10nM-50nM、50nM-1000nM、50nM-500nM、50nM-100nM、100nM-1000nM、100nM-500nM、500nM-1000nM。
在一些实施方式中，本公开的AB抑制或降低表达哺乳动物CD147的细胞的生长、增殖和/或转移。并不旨在限于理论，通过特异性地结合CD147并抑制、阻断和/或预防天然配体与哺乳动物CD147的结合，本公开的AB可以抑制或降低表达哺乳动物CD147的细胞的生长、增殖和/或转移。
在一些实施方式中，AB对于结合哺乳动物CD147的解离常数为约100nM或更少。在一些实施方式中，AB对于结合哺乳动物CD147的解离常数为约10nM或更少。在一些实施方式中，AB对于结合CD147的解离常数为约5nM或更少。在一些实施方式中，AB对于结合CD147的解离常数为约1nM或更少。在一些实施方式中，AB对于结合CD147的解离常数为约0.5nM或更少。在一些实施方式中，AB对于结合CD147的解离常数为约0.1nM或更少。在一些实施方式中，AB对于结合哺乳动物CD147的解离常数为0.01nM-100nM、0.01nM-10nM、0.01nM-5nM、0.01nM-1nM、0.01-0.5nM、0.01nm-0.1nM、0.01nm-0.05nM、0.05nM-100nM、0.05nM-10nM、0.05nM-5nM、0.05nM-1nM、0.05-0.5nM、0.05nm-0.1nM、0.1nM-100nM、0.1nM-10nM、0.1nM-5nM、0.1nM-1nM、0.1-0.5nM、0.5nM-100nM、0.5nM-10nM、0.5nM-5nM、0.5nM-1nM、1nM-100nM、1nM-10nM、1nM-5nM、5nM-100nM、5nM-10nM或10nM-100nM。
本发明示例性的CD147抗体和可激活CD147抗体可以包含这样的重链和轻链，所述重链和轻链是或源自下示的重链可变和轻链可变序列(CDR序列以粗体和下划线示出)：
mu 3A11 VH:
mu 3A11 VL:
Figure BDA0002266538730000172
3A11 hu Hc1
Figure BDA0002266538730000173
3A11 hu Hc2
3A11 hu Hc3
Figure BDA0002266538730000175
3A11 hu Lc1
Figure BDA0002266538730000181
3A11 hu Lc2
Figure BDA0002266538730000182
3A11 hu Lc3
Figure BDA0002266538730000183
3A11 hu Lc4
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:1-3的重链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:5-8的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-4，而所述轻链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-9。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-3，而所述轻链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-8。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的重链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的重链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含与选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性，而所述轻链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活抗体的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性，而所述轻链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
本发明的示例性CD147抗体和可激活CD147抗体包括这样的组合：可变重链互补决定区1(VH CDR1，本文也称之为CDRH1)序列，可变重链互补决定区2(VH CDR2，本文也称之为CDRH2)序列，可变重链互补决定区3(VH CDR3，本文也称之为CDRH3)序列，可变轻链互补决定区1(VL CDR1，本文也称之为CDRL1)序列，可变轻链互补决定区2(VL CDR2，本文也称之为CDRL2)序列，和可变轻链互补决定区3(VL CDR3，本文也称之为CDRL3)序列，其中，至少一种CDR序列选自：包含氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VH CDR1序列；包含氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2序列；包含氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列；包含氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列；包含氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列；和包含氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ IDNO:18)的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段包括这样的组合：可变重链互补决定区1(VH CDR1，本文也称之为CDRH1)序列，可变重链互补决定区2(VH CDR2，本文也称之为CDRH2)序列，可变重链互补决定区3(VH CDR3，本文也称之为CDRH3)序列，可变轻链互补决定区1(VL CDR1，本文也称之为CDRL1)序列，可变轻链互补决定区2(VL CDR2，本文也称之为CDRL2)序列，和可变轻链互补决定区3(VL CDR3，本文也称之为CDRL3)序列，其中，至少一个互补决定区(CDR)序列选自：包含氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VH CDR1序列；包含氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2序列；包含氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列；包含氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列；包含氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列；和包含氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中至少一种CDR序列选自：含有下述序列的VH CDR1序列，所述序列与含有氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VH CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；含有下述序列的VH CDR2序列，所述序列与含有氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；含有下述序列的VH CDR3序列，所述序列与含有氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；含有下述序列的VL CDR1序列，所述序列与含有氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；含有下述序列的VL CDR2序列，所述序列与含有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；和含有下述序列的VL CDR3序列，所述序列含有与氨基酸QQDYSSPFT(SEQ IDNO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)的VL CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，VH CDR1序列包含氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列包含氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列包含氨基酸序列AGTDY(SEQ IDNO:13)；VL CDR1序列包含氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ IDNO:15)；VL CDR2序列包含氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列包含氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下述的氨基酸序列：(a)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ IDNO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VLCDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)；(b)VH CDR1序列GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列RASQSVRTDVG(SEQ IDNO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)；和(c)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)；VLCDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，VH CDR1序列包含与氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR2序列包含与氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR3序列包含与氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR1序列包含与氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR2序列包含与氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；和VL CDR3序列包含与氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
本公开合适的CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原与包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列的CD147抗体结合片段结合人CD147和/或食蟹猴CD147上相同的表位。
本公开合适的CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片断与下述CD147抗体结合人CD147和/或食蟹猴CD147上相同的表位，所述CD147抗体包含具有氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VHCDR1序列；具有氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2；具有氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列；具有氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列；具有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列；和具有氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)的VL CDR3序列。
本公开合适的CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列的CD147抗体交叉竞争结合(抑制其结合)人CD147和/或食蟹猴CD147。
本公开合适的CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合与下述CD147交叉竞争(抑制其结合)人CD147和/或食蟹猴CD147，所述的CD147抗体包含具有氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VH CDR1序列；具有氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2；具有氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列；具有氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列；具有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列；和具有氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，本公开的CD147抗体包含特异性结合哺乳动物CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB特异性结合人CD147和食蟹猴CD147。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ IDNO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VLCDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，分离抗体或其抗原结合片段与下述分离抗体结合人CD147和/或食蟹猴CD147上相同的表位，所述分离抗体包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，分离抗体或其抗原结合片段与下述分离抗体结合人CD147和/或食蟹猴CD147上相同的表位，所述分离抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，分离抗体或其抗原结合片段与下述分离抗体交叉竞争(抑制其结合)，所述分离抗体包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQID NO:18)。在一些实施方式中，分离抗体或其抗原结合片段与下述分离抗体交叉竞争(抑制其结合)，所述分离抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ IDNO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，分离抗体或其抗原结合片段与下述分离抗体交叉竞争(抑制其结合)，上述分离抗体包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQID NO:18)。在一些实施方式中，分离抗体或其抗原结合片段与下述分离抗体交叉竞争(抑制其结合)，所述分离抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ IDNO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含这样的重链，所述重链包含或源自表1所示的重链氨基酸序列。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含这样的轻链，所述轻链包含或源自表1所示的轻链氨基酸序列。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含这样的重链和轻链，所述重链包含或源自表1所示的重链氨基酸序列，而所述轻链包含或源自表1所示的轻链氨基酸序列。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组A所示组合的重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组B所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组C所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组D所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含表1中组E所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含表1中组F所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组G所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组H所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含表1中组I所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含表1中组J所示重链可变区序列。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含表1中组J所示重链可变区，或表1中组K所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组L所示重链可变区和轻链可变区序列的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组A所示重链序列的重链序列互补决定区(CDR)的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组A所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组A所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组A所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组B所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组B所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组B所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组B所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组C所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组C所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组C所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组C所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组D所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组D所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组D所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组D所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组E所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组E所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组E所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组E所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组F所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组F所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组F所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组F所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组G所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组G所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组G所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组G所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组H所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组H所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组H所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组H所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组I所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组I所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组I所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组I所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组J所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组J所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组J所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组J所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组K所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组K所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组K所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组K所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组L所示重链序列的重链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组L所示轻链序列的轻链序列CDR的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含来自表1中组L所示重链序列的重链序列CDR和来自表1中组L所示重链序列的轻链序列CDR的组合。
表1.结合CD147的抗体或可激活抗体的可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)序列
Figure BDA0002266538730000291
Figure BDA0002266538730000311
Figure BDA0002266538730000321
Figure BDA0002266538730000331
Figure BDA0002266538730000341
Figure BDA0002266538730000351
Figure BDA0002266538730000361
Figure BDA0002266538730000371
*组G中提供的命名为“HC”的序列是重链氨基酸序列，组L中提供的命名为“LC”的序列是轻链氨基酸序列；表1中所有其他序列的可变重链和可变轻链序列各不相同。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含表2中所示CDR序列，选自表2中一行所示那些组合的VL CDR序列(VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)的组合，选自表2中所示那些组合的VH CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)的组合，或选自表2中所示那些组合的VL CDR和VH CDR序列(VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组A所示组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组A所示组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组A所示组合的重链CDR序列的组合以及选自表2中组A所示组合的轻链CDR序列的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组B所示组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组B所示组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组B所示组合的重链CDR序列的组合以及选自表2中组B所示组合的轻链CDR序列的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组C所示组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组C所示组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自表2中组C所示组合的重链CDR序列的组合以及选自表2中组C所示组合的轻链CDR序列的组合。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自组E的重链CDR序列的组合，所述组E由表2中组E所示的组合组成。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自组E的轻链CDR序列的组合，所述组E由表2中组E所示的组合组成。在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含选自组E的重链CDR序列的组合以及选自组E的轻链CDR序列的组合，所述组E由表2中组E所示的组合组成。
表2.结合CD147的抗体和可激活抗体的CDR序列
Figure BDA0002266538730000381
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含或源自由杂交瘤(例如，美国专利号5,330,896公开并以HB 8214保藏号保藏于ATCC的杂交瘤)制造、分泌或以其他方式产生的抗体。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含或源自这样的抗体，所述抗体由杂交瘤制造、分泌或以其他方式产生，例如，美国专利号7,736,647中公开并于2005年6月14日以保藏号CNCM I-3449保藏于国家微生物保藏中心(Collection Nationale deCultures de Microorganismes，CNCM)(法国巴黎巴斯德研究所(Institut Pasteur)，地址：Paris,France,25,Rue du Docteur Roux,F-75724,Paris,Cedex 15)名为BA120的杂交瘤；美国专利号7,572,895中公开并以PTA-6055保藏于ATCC的杂交瘤；PCT公开号WO 2014/020140和WO 2005/111082中公开并于2001年5月10日以保藏号1-2665保藏于CNCM的杂交瘤；美国专利号4,434,156中公开并以HB-8094保藏于ATCC的杂交瘤；美国专利号5,648,469中公开并以HB-11011和HB-11010保藏于ATCC的杂交瘤。
在一些实施方式中，CD147抗体/可激活CD147抗体包含这样的重链，所述重链包含或源自示于下述的重链氨基酸序列：PCT公开号WO 2014/144060、WO 2014/189973、WO2014/020140，美国专利号8,663,598；8,129,503；7,736,647；7,572,895；4,434,156；美国专利申请公开号US2014114054、US20140212423、US2013177579、US2013045206、US20130216476、US20120282176，和/或中国专利号CN101245107B，其各自内容通过引用其全文纳入本文。
本公开还提供了用于通过在导致抗体或其片段表达的条件下培养细胞产生本公开CD147 AB的方法，其中，所述细胞包含本公开的核酸分子或本公开的载体。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码重链氨基酸序列的核酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码重链氨基酸序列的核酸序列编码，所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码轻链氨基酸序列的核酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码轻链氨基酸序列的核酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码重链氨基酸序列的核酸序列和编码轻链氨基酸序列的核酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码重链氨基酸序列的核酸序列和编码轻链氨基酸序列的核酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码重链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码重链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码轻链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码轻链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码重链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列以及与编码轻链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ IDNO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD147抗体或其抗原结合片段由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码重链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列以及与编码轻链氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链氨基酸序列包含选自SEQ IDNO:5-8的氨基酸序列。
可激活CD147抗体
如上所述，本公开还提供了含有这样的抗体或其抗原结合片段的可激活抗体，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合与掩蔽部分(MM)偶联的CD147，因此MM的偶联减少抗体或其抗原结合片段结合CD147的能力。在一些实施方式中，MM通过序列偶联，所述序列包含针对蛋白酶(例如，在疾病组织中具有活性的蛋白酶和/或与CD147共定位于对象治疗部位的蛋白酶)的底物(CM，可切割部分)。本文所提供的可激活CD147抗体在循环中是稳定的，在疗法和/或诊断的预期部位是激活的，但在治疗和/或诊断并不靶向的正常的例如健康的组织或其他组织中并不是激活的，并且当激活时，展现出与对应的未修饰抗体(在本文也称之为亲本抗体)至少相当的CD147结合。
本文所述可激活CD147抗体克服了抗体疗法的限制，特别是已知至少在某种程度上在体内具有毒性的抗体疗法。靶标介导的毒性构成了治疗性抗体研发的主要限制。本文所提供的可激活CD147抗体被设计成解决与正常组织中通过传统治疗性抗体的靶标抑制相关的毒性。这些可激活CD147抗体将保持掩蔽，直到在疾病部位被蛋白质水解激活。以CD147抗体作为亲本治疗性抗体开始，通过用纳入了蛋白酶底物的接头将抗体与抑制性掩蔽物(mask)偶联工程改造本发明的可激活CD147抗体。
本文所使用术语可激活抗体的切割状态指通过至少一种蛋白酶修饰CM后可激活抗体的情况。本文所用术语未切割状态指在不存在通过蛋白酶切割CM的情况下的可激活抗体的情况。如上所述，本文所用术语“可激活抗体”指处于其未切割(天然)状态以及其切割状态的可激活抗体。本领域普通技术人员应当清楚的是，在一些实施方式中，由于通过蛋白酶切割CM，切割的可激活抗体可能缺少MM，导致至少释放MM(例如，其中MM并不通过共价键(例如，半胱氨酸残基之间的二硫键)与可激活抗体连接)。
述及可激活或可转换(switchable)旨在表示，当可激活抗体处于抑制、掩蔽或未切割状态(即第一构象)时，可激活抗体展示出与靶标结合的第一水平，以及处于未抑制、未掩蔽和/或切割状态(即第二构象)下与靶标结合的第二水平，其中靶标结合的第二水平大于结合的第一水平。通常，靶标对可激活抗体AB的可及性在存在能够切割CM的切割剂(即，蛋白酶)的情况下大于不存在这类切割剂的情况。因此，当可激活抗体处于未切割状态时，AB的靶标结合被抑制并且其靶标结合可以被掩蔽(即，这样的第一构象使得AB不可以结合靶标)，并且处于切割状态时，AB的靶标结合不被抑制或掩蔽。
选择可激活抗体的AB和CM，从而使AB表示给定靶标的结合部分，而CM表示蛋白酶的底物。在一些实施方式中，蛋白酶与靶标共定位于对象中的治疗部位或诊断部位。本文所用共定位指处于相同部位或相对比较近。在一些实施方式中，蛋白酶切割CM产生激活的抗体，其结合位于切割部位附近的靶标。本文所公开的可激活抗体特别适用于，例如，能够切割CM中位点的蛋白酶，即蛋白酶，在治疗部位或诊断部位含有靶标的组织中以比未治疗部位组织中(例如，健康组织中)相对较高的水平存在的情况。在一些实施方式中，本公开的CM还被一种或多种其他蛋白酶切割。在一些实施方式中，一种或多种其他蛋白酶与靶标共定位并且负责体内切割CM。
在一些实施方式中，可激活抗体提供了降低的毒性和/或不良副作用，如果AB未被掩蔽或以其他方式被抑制与靶标结合，所述毒性和/或不良作用可能是由于非治疗部位处的AB结合所导致。
通常，可以通过选择感兴趣的AB(如本文所述的任何CD147抗体或其片段)并构建可激活抗体的剩余部分设计可激活抗体，因此，当构象受限时，MM提供了AB的掩蔽或者减少AB与其靶标的结合。可以考虑结构设计标准以提供所述功能特征。
提供了这样的可激活抗体，所述可激活抗体展现出针对抑制构象相对未抑制构象中靶标结合的所需动态范围的可转换表型。动态范围通常指(a)第一组条件下检测到的参数水平的最大值与(b)第二组条件下检测到的参数水平的最小值的比例。例如，在可激活抗体的上下文中，动态范围指(a)在存在至少一种能够切割可激活抗体CM的蛋白酶的情况下检测到的靶蛋白与可激活抗体结合水平的最大值与(b)在不存在的情况下检测到的靶蛋白与可激活抗体结合水平的最小值的比例。可激活抗体的动态范围可由可激活抗体切割剂(例如，酶)处理的解离常数与可激活抗体切割剂处理的解离常数的比例计算。可激活抗体动态范围越大，可激活抗体的可转换表型越好。具有相对较高的动态范围值(例如，大于1)的可激活抗体展现出更需要的可转换表型，因此相比不存在切割剂的情况，通过可激活抗体的靶蛋白结合在存在能够切割可激活抗体CM的切割剂(例如，酶)的情况下更大程度地发生。
如上所述，本文所提供的可激活CD147抗体包含掩蔽部分(MM)。在一些实施方式中，掩蔽部分是这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与CD147抗体偶联或以其他方式连接并且位于可激活CD147抗体构建体内，从而使掩蔽部分降低CD147抗体特异性结合CD147的能力。使用已知的各种技术中的任一种鉴定合适的掩蔽部分。例如，使用Daugherty等的PCT公开号WO 2009/025846中所述方法鉴定肽掩蔽部分，其内容通过引用其全文纳入本文。
如上所述，本文所提供的可激活CD147抗体包含可切割部分(CM)。在一些实施方式中，可切割部分包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列是蛋白酶(通常是胞外蛋白酶)的底物。使用已知的各种技术中的任一种鉴定合适的底物。例如，使用Daugherty等的美国专利号7,666,817中，Stagliano等的美国专利号8,563,269中，La Porte等的PCT公开号WO2014/026136中所述方法鉴定肽底物，其各自内容通过引用其全文纳入(同样参见，Boulware等.“进化优化展现出快速水解动力学的蛋白酶的肽底物(Evolutionaryoptimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapidhydrolysis kinetics.)”Biotechnol Bioeng.106.3(2010):339-46)。
示例性的底物包括但不限于，可以通过表3中所列一种或多种下述酶或蛋白酶切割的底物。
表3：示例性蛋白酶和/或酶
Figure BDA0002266538730000451
处于激活状态的可激活抗体结合CD147并且包括(i)特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)；(ii)掩蔽部分(MM)，其中当可激活抗体处于未切割状态时，抑制AB与CD147的结合；和(c)与AB偶联的可切割部分(CM)，其中CM是作为蛋白酶底物的多肽。
在一些实施方式中，处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
在一些实施方式中，可激活抗体包含介于MM和CM之间的连接肽。
在一些实施方式中，可激活抗体包含介于CM和AB之间的连接肽。
在一些实施方式中，可激活抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方式中，2个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方式中，LP1或LP2中的至少一种包含选自下述的氨基酸序列：(GS)n,(GGS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:339)和(GGGS)n(SEQ ID NO:340)，其中n是至少为1的整数。
在一些实施方式中，LP1或LP2中的至少一种包含选自下述的氨基酸序列：GGSG(SEQ ID NO:341)、GGSGG(SEQ ID NO:342)、GSGSG(SEQ ID NO:343)、GSGGG(SEQ ID NO:344)、GGGSG(SEQ ID NO:345)和GSSSG(SEQ ID NO:346)。
在一些实施方式中，LP1包含氨基酸序列：GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO:347)、GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO:348)、GSSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:349)、GSSGGSGGSGGSGGGS(SEQID NO:350)、GSSGGSGGSG(SEQ ID NO:351)或GSSGGSGGSGS(SEQ ID NO:352)。
在一些实施方式中，LP2包含氨基酸序列GSS、GGS、GGGS(SEQ ID NO:353)、GSSGT(SEQ ID NO:354)或GSSG(SEQ ID NO:355)。
在一些实施方式中，结合CD147的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体，结构域抗体，单链，Fab片段，F(ab’)2片段，scFv，scAb，dAb，单域重链抗体或单域轻链抗体。在一些实施方式中，结合CD147的这类抗体或其抗原结合片段是小鼠，其他啮齿动物，嵌合，人源化或完整人单克隆抗体。
在一些实施方式中，处于未切割状态的可激活抗体以小于或等于1nM、小于或等于5nM、小于或等于10nM、小于或等于15nM、小于或等于20nM、小于或等于25nM、小于或等于50nM、小于或等于100nM、小于或等于150nM、小于或等于250nM、小于或等于500nM、小于或等于750nM、小于或等于1000nM和/或小于或等于2000nM的解离常数特异性地结合哺乳动物CD147。
在一些实施方式中，处于未切割状态的可激活抗体以1nM-2000nM、1nM-1000nM、1nM-750nM、1nM-500nM、1nM-250nM、1nM-150nM、1nM-100nM、1nM-50nM、1nM-25nM、1nM-15nM、1nM-10nM、1nM-5nM、5nM-2000nM、5nM-1000nM、5nM-750nM、5nM-500nM、5nM-250nM、5nM-150nM、5nM-100nM、5nM-50nM、5nM-25nM、5nM-15nM、5nM-10nM、10nM-2000nM、10nM-1000nM、10nM-750nM、10nM-500nM、10nM-250nM、10nM-150nM、10nM-100nM、10nM-50nM、10nM-25nM、10nM-15nM、15nM-2000nM、15nM-1000nM、15nM-750nM、15nM-500nM、15nM-250nM、15nM-150nM、15nM-100nM、15nM-50nM、15nM-25nM、25nM-2000nM、25nM-1000nM、25nM-750nM、25nM-500nM、25nM-250nM、25nM-150nM、25nM-100nM、25nM-50nM、50nM-2000nM、50nM-1000nM、50nM-750nM、50nM-500nM、50nM-250nM、50nM-150nM、50nM-100nM、100nM-2000nM、100nM-1000nM、100nM-750nM、100nM-500nM、100nM-250nM、100nM-150nM、150nM-2000nM、150nM-1000nM、150nM-750nM、150nM-500nM、150nM-250nM、250nM-2000nM、250nM-1000nM、250nM-750nM、250nM-500nM、500nM-2000nM、500nM-1000nM、500nM-750nM、500nM-500nM、500nM-250nM、500nM-150nM、500nM-100nM、500nM-50nM、750nM-2000nM、750nM-1000nM或1000nM-2000nM范围内的解离常数特异性地结合哺乳动物CD117。
在一些实施方式中，处于激活状态的可激活抗体以小于或等于0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM或10nM的解离常数特异性地结合哺乳动物CD147。
在一些实施方式中，处于激活状态的可激活抗体以0.01nM-100nM、0.01nM-10nM、0.01nM-5nM、0.01nM-1nM、0.01-0.5nM、0.01nm-0.1nM、0.01nm-0.05nM、0.05nM-100nM、0.05nM-10nM、0.05nM-5nM、0.05nM-1nM、0.05-0.5nM、0.05nm-0.1nM、0.1nM-100nM、0.1nM-10nM、0.1nM-5nM、0.1nM-1nM、0.1-0.5nM、0.5nM-100nM、0.5nM-10nM、0.5nM-5nM、0.5nM-1nM、1nM-100nM、1nM-10nM、1nM-5nM、5nM-100nM、5nM-10nM或10nM-100nM的解离常数特异性地结合哺乳动物CD147。
当AB经MM修饰并且存在靶标时，相较于未经MM修饰的AB或亲本AB与靶标的特异性结合，所述AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。
经MM修饰的AB对CD147靶标的Kd比未经MM修饰的AB的Kd或者亲本AB对CD147靶标的Kd大至少5，10，25，50，100，250，500，1,000，2,500，5,000，10,000，50,000，100,000，500,000，1,000,000，5,000,000，10,000,000，50,000,000或更多倍，或介于5-10，10-100，10-1,000，10-10,000，10-100,000，10-1,000,000，10-10,000,000，100-1,000，100-10,000，100-100,000，100-1,000,000，100-10,000,000，1,000-10,000，1,000-100,000，1,000-1,000,000，1000-10,000,000，10,000-100,000，10,000-1,000,000，10,000-10,000,000，100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。相反，经MM修饰的AB对CD147靶标的结合亲和力比未经MM修饰的AB的结合亲和力或者亲本AB对CD147靶标的结合亲和力小至少5，10，25，50，100，250，500，1,000，2,500，5,000，10,000，50,000，100,000，500,000，1,000,000，5,000,000，10,000,000，50,000,000或更多倍，或介于5-10，10-100，10-1,000，10-10,000，10-100,000，10-1,000,000，10-10,000,000，100-1,000，100-10,000，100-100,000，100-1,000,000，100-10,000,000，1,000-10,000，1,000-100,000，1,000-1,000,000，1000-10,000,000，10,000-100,000，10,000-1,000,000，10,000-10,000,000，100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。
MM对AB的解离常数(Kd)通常大于AB对CD147靶标的Kd。MM对AB的Kd可以比AB对CD147靶标的Kd大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或者甚至10,000,000倍。相反，MM对AB的结合亲和力通常小于AB对CD147靶标的结合亲和力。MM对AB的结合亲和力可以比AB对CD147靶标的结合亲和力小至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或者甚至10,000,000倍。
在一些实施方式中，MM对AB的解离常数(Kd)大致等于AB对CD147靶标的Kd。在一些实施方式中，MM对AB的解离常数(Kd)不超过AB对CD147靶标的解离常数。在一些实施方式中，MM对AB的解离常数(Kd)等于AB对CD147靶标的解离常数。
在一些实施方式中，MM对AB的解离常数(Kd)小于AB对CD147靶标的解离常数。
在一些实施方式中，MM对AB的解离常数(Kd)大于AB对CD147靶标的解离常数。
在一些实施方式中，MM结合AB的Kd不超过AB与靶标结合的Kd。
在一些实施方式中，MM结合AB的Kd不小于AB与靶标结合的Kd。
在一些实施方式中，MM结合AB的Kd大致等于AB与靶标结合的Kd。
在一些实施方式中，MM结合AB的Kd小于AB与靶标结合的Kd。
在一些实施方式中，MM结合AB的Kd大于AB与靶标结合的Kd。
在一些实施方式中，MM结合AB的Kd比AB与靶标结合的Kd大不超过2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。在一些实施方式中，MM结合AB的Kd比AB与靶标结合的Kd大1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000或100-1,000倍。
在一些实施方式中，MM结合AB的亲和力小于AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施方式中，MM结合AB的亲和力不超过AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施方式中，MM结合AB的亲和力大致等于AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施方式中，MM结合AB的亲和力不少于AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施方式中，MM结合AB的亲和力大于AB与靶标结合的亲和力。
在一些实施方式中，MM结合AB的亲和力比AB与靶标结合的亲和力小2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。在一些实施方式中，MM结合AB的亲和力比AB与靶标结合的亲和力小1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000或100-1,000倍。在一些实施方式中，MM结合AB的亲和力比AB与靶标结合的亲和力小2-20倍。在一些实施方式中，不共价连接AB并且处于与AB等摩尔浓度的MM并不抑制AB与靶标的结合。
当AB经MM修饰并且存在靶标时，相较于未经MM修饰的AB或亲本AB与靶标的特异性结合，所述AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当与未经MM修饰的AB的结合或亲本AB与靶标的结合比较时，AB结合靶标的能力在经MM修饰时可以减少至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％甚至100％，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长，当体内测量或在体外试验中测量时。
MM抑制AB与靶标的结合。MM结合AB的抗原结合结构域并抑制AB与靶标的结合。MM可以在空间上抑制AB与靶标的结合。MM可以别构性地抑制AB与其靶标的结合。在这些实施方式中，相较于未经MM修饰的AB、亲本AB或未偶联MM的AB与靶标的结合，当AB经修饰或偶联MM并存在靶标时，AB与靶标不存在结合或基本上不存在结合，或者不超过0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％的AB与靶标的结合，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长，当体内测量或在体外试验中测量时。
当AB偶联于MM或经MM修饰，MM“掩蔽”或减少或以其他方式抑制AB与靶标的特异性结合。当AB偶联于MM或经MM修饰，这样的偶联或修饰可以产生这样的结构改变，所述结构改变减少或抑制AB特异性结合其靶标的能力。
偶联于MM或经MM修饰的AB可以下述结构表示(以从氨基(N)末端区到羟基(C)末端区的顺序)：
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
其中MM是掩蔽部分，AB是抗体或其抗体片段，L是接头。在许多实施方式中，可能需要的是将一个或多个接头，例如，柔性接头插入组合物，从而提供柔韧性。
在某些实施方式中，MM不是AB的天然结合伴侣。在一些实施方式中，MM不包含或基本上不包含与AB的任何天然结合伴侣的同源性。在一些实施方式中，MM与AB的任何结合伴侣的相似性不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方式中，MM与AB的任何结合伴侣的相同性不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方式中，MM与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过25％。在一些实施方式中，MM与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过50％。在一些实施方式中，MM与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过20％。在一些实施方式中，MM与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过10％。
在一些实施方式中，可激活抗体包含经MM修饰的AB并且还包含一个或多个可切割部分(CM)。这类可激活抗体展现出对AB的靶标的可激活/可转换结合。可激活抗体通常包含抗体或抗体片段(AB)，其经掩蔽部分(MM)修饰或与MM偶联，和可修饰或可切割部分(CM)。在一些实施方式中，CM包含作为至少一种蛋白酶的底物的氨基酸序列。
排列可激活抗体的元件，从而使MM和CM定位，因此在其处于切割(或相对活化)状态并存在靶标的情况下，AB结合靶标，而在可激活抗体处于未切割(或相对失活)状态并存在靶标的情况下，AB与其靶标的特异性结合被减少或抑制。由于抑制或掩蔽AB通过MM特异性地结合其靶标的能力，可以减少AB与其靶标的特异性结合。
经MM和CM修饰的AB对CD147靶标的Kd比未MM和CM修饰的AB或亲本AB对CD147靶标的Kd大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更多倍，或5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。相反，经MM和CM修饰的AB对CD147靶标的结合亲和力比未经MM和CM修饰的AB和亲本AB对CD147靶标的结合亲和力小至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更多倍，或5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。
当AB经MM和CM修饰并且存在靶标但不存在修饰剂(例如，至少一种蛋白酶)时，相较于未经MM和CM修饰的AB或亲本AB与靶标的特异性结合，所述AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当与亲本AB的结合或未进MM和CM修饰的AB与其靶标的结合比较时，AB结合靶标的能力在MM和CM修饰时可以减少至少50％,60％,70％,80％,90％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％甚至100％，持续至少2,4,6,8,12,28,24,30,36,48,60,72,84或96小时或5,10,15,30,45,60,90,120,150,或180天，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月或更长，当体内测量或在体外试验中测量时。
可激活抗体可以各种结构构型提供。下文提供了可激活抗体的示例性结构式。本文特别考虑，AB、MM和CM从N-末端至C-末端顺序可在可激活抗体内反转。本文还特别考虑了，CM和MM可能在氨基酸序列中重叠，例如，MM内包含CM。
例如，可激活抗体可以下述结构式表示(以从氨基(N)末端区到羟基(C)末端区的顺序)：
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
其中MM是掩蔽部分，CM是可切割部分，AB是抗体或其片段。应当注意的是，虽然将MM和CM在上述结构式中表示为不同的组分，在本文所公开的所有示例性实施方式(包括结构式)中，本文特别考虑，MM和CM的氨基酸序列可以重叠，例如，从而使CM完整地或部分地包含于MM内。此外，上述结构式提供了可以定位于可激活抗体元件N-末端或C-末端的其他氨基酸序列。
在某些实施方式中，MM不是AB的天然结合伴侣。在一些实施方式中，MM不包含或基本上不包含与AB的任何天然结合伴侣的同源性。在一些实施方式中，MM与AB的任何结合伴侣的相似性不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方式中，MM与AB的任何结合伴侣的相同性不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方式中，MM与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过50％。在一些实施方式中，MM与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过25％。在一些实施方式中，MM与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过20％。在一些实施方式中，MM与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过10％。
在许多实施方式中，可能需要的是将一个或多个接头，例如，柔性接头插入可激活抗体构建体，从而在MM-CM连接、CM-AB连接或两者中的一处或多处提供柔韧性。例如，AB、MM和/或CM可能不包含足够数量的残基(例如，Gly，Ser，Asp，Asn，特别是Gly和Ser，特别是Gly)以提供所需的柔韧性。因此，这类可激活抗体构建体的可转换表型可能受益于一个或多个氨基酸的导入，以提供柔性接头。此外，如下所述，当可激活抗体以构象受限的结构体提供时，柔性接头可以可操作地插入以促进形成和维持未切割可激活抗体中的环状结构。
例如，在某些实施方式中，可激活抗体包含一种或多种下述结构式(其中下述结构式表示以N-末端至C-末端方向或C-末端至N-末端方向的氨基酸序列)：
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
其中，MM、CM和AB如上所定义，其中L1和L2各自独立并且任选地存在或不存在，是相同或不同的柔性接头，所述柔性接头包含至少1个柔性氨基酸(例如，Gly)。此外，上述结构提供了可以定位于可激活抗体元件N-末端或C-末端的其他氨基酸序列。示例包括但不限于，靶向部分(例如，存在于靶组织中细胞的受体的配体)和血清半衰期延长部分(例如，结合血清蛋白的多肽，如免疫球蛋白(例如，IgG)或血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HAS))。
CM被至少一种蛋白酶以约0.001-1500x 104M-1S-1的速率或至少0.001,0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500x 104M-1S-1的速率特异性地切割。在一些实施方式中，以约100,000M-1S-1的速率特异性地切割CM。在一些实施方式中，以约1x10E2至约1x10E6 M-1S-1(即，约1x102至约1x106M-1S-1)的速率特异性地切割CM。
对于通过酶的特异性切割，进行酶和CM之间的接触。当包含与MM和CM偶联的AB的可激活抗体处于靶标存在的情况且具有足够酶活性时，CM可以被切割。足够的酶活性可以指酶与CM进行接触并产生切割的能力。可以容易地预期的是，因为酶的其他细胞因子或蛋白质修饰，酶可能在CM的附近，但是无法切割。
适合用于本文所述组合物的接头通常是在这样的接头，其提供可激活抗体或修饰的AB的柔韧性，以促进抑制AB与靶标的结合。这类接头通常被称之为柔性接头。合适的接头可以容易地选择并且可以是任何适合的不同长度，如1个氨基酸(例如，Gly)-20个氨基酸，2个氨基酸-15个氨基酸，3个氨基酸-12个氨基酸，包括4个氨基酸-10个氨基酸，5个氨基酸-9个氨基酸，6个氨基酸-8个氨基酸，或7个氨基酸-8个氨基酸，并且长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n，(GSGGS)n(SEQ ID NO:339)和(GGGS)n(SEQ ID NO:340)，其中n是至少1的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链。甘氨酸比甚至丙氨酸获得显着更多的
Figure BDA0002266538730000541
空间，并且比更长侧链的残基受到少得多的限制(参见Scheraga，Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性柔性接头包括但不限于，Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:341)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:342)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:343)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:344)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ IDNO:345)、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO:346)等。本领域普通技术人员将认识到，可激活抗体的设计可以包括具有全部或部分柔韧性的接头，从而使接头可以包含柔性接头以及具有较少柔性结构的一个或多个部分，以提供所需的可激活抗体结构。
本公开还提供了包含可激活CD147抗体的组合物和方法，所述可激活CD147抗体包含特异性结合CD147的抗体或抗体片段(AB)，其中所述AB与降低AB与其靶标结合能力的掩蔽部分(MM)偶联。在一些实施方式中，可激活CD147抗体还包含可切割部分(CM)，所述CM是蛋白酶的底物。本文所提供的组合物和方法能够在不损害可激活CD147抗体的活性(例如，掩蔽、激活或结合活性)的情况下将一种或多种试剂与AB中的一个或多个半胱氨酸残基连接。在一些实施方式中，本文所提供的组合物和方法能够在不降低或以其他方式干扰MM内一个或多个二硫键的情况下将一种或多种试剂与AB中的一个或多个半胱氨酸残基连接。本文所提供的组合物和方法产生与一种或多种试剂(例如，多种治疗剂、诊断剂和/或预防剂中的任意试剂)偶联的可激活CD147抗体，例如，在一些实施方式中，不存在与可激活CD147抗体MM偶联的任何试剂。本文所提供的组合物和方法产生偶联的可激活CD147抗体，其中MM保留有效且高效地掩蔽处于未切割状态的可激活抗体的AB的能力。本文所提供的组合物和方法产生偶联的可激活CD147抗体，其中可激活抗体在可以切割CM的蛋白酶存在的情况下仍然是激活的(即，切割的)。
在一些实施方式中，可激活抗体包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体包含选自SEQ ID NO:1-3的重链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体包含选自SEQ ID NO:5-8的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含选自SEQ ID NO:1-3的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO:5-8的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些实施方式中，可激活抗体包含重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
在一些实施方式中，可激活抗体包含轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些实施方式中，可激活抗体包含轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
在一些实施方式中，可激活抗体包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性，而所述轻链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。
在一些实施方式中，可激活抗体包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性，而所述轻链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。
在一些实施方式中，可激活抗体包含这样的组合：可变重链互补决定区1(VHCDR1，本文也称之为CDRH1)序列，可变重链互补决定区2(VH CDR2，本文也称之为CDRH2)序列，可变重链互补决定区3(VH CDR3，本文也称之为CDRH3)序列，可变轻链互补决定区1(VLCDR1，本文也称之为CDRL1)序列，可变轻链互补决定区2(VL CDR2，本文也称之为CDRL2)序列，和可变轻链互补决定区3(VL CDR3，本文也称之为CDRL3)序列，其中，至少一种CDR序列选自：包含氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VHCDR1序列；包含氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2序列；包含氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列；包含氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列；包含氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列；和包含氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中至少一种CDR序列选自：含有下述序列的VH CDR1序列，所述序列与含有氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VH CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；含有下述序列的VH CDR2序列，所述序列与含有氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；含有下述序列的VH CDR3序列，所述序列与含有氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；含有下述序列的VL CDR1序列，所述序列与含有氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；含有下述序列的VL CDR2序列，所述序列与含有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性；和含有下述序列的VL CDR3序列，所述序列含有与氨基酸QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)的VL CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相同性。
在一些实施方式中，可激活抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，VH CDR1序列包含氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列包含氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列包含氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VLCDR1序列包含氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VLCDR2序列包含氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列包含氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方式中，可激活抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，VH CDR1序列包含与氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR2序列包含与氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR3序列包含与氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR1序列包含与氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ IDNO:15)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％更多相同性的序列；VL CDR2序列包含与氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；和VL CDR3序列包含与氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，可激活CD147抗体的AB包含选自表1中所示重链可变区序列的重链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，可激活CD147抗体的AB包含选自表1中所示轻链可变区序列的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，可激活CD147抗体的AB包含选自表1中所示重链可变区序列的重链可变区氨基酸和选自表1中所示轻链可变区序列的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活CD147抗体的AB包含重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自表1中所示重链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些实施方式中，可激活CD147抗体的AB包含轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与选自表1中所示轻链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些实施方式中，可激活C147抗体的AB包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自表1中所示重链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性，而所述轻链可变区氨基酸序列与选自表1中所示轻链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。
在一些实施方式中，可激活抗体包含这样的组合：可变重链互补决定区1(VHCDR1，本文也称之为CDRH1)序列，可变重链互补决定区2(VH CDR2，本文也称之为CDRH2)序列，可变重链互补决定区3(VH CDR3，本文也称之为CDRH3)序列，可变轻链互补决定区1(VLCDR1，本文也称之为CDRL1)序列，可变轻链互补决定区2(VL CDR2，本文也称之为CDRL2)序列，和可变轻链互补决定区3(VL CDR3，本文也称之为CDRL3)序列，其中至少一种CDR序列选自表2中所示的VH CDR1序列；表2中所示的VH CDR2序列；表2中所示的VH CDR3序列；表2中所示的VL CDR1序列；表2中所示的VL CDR2序列；和表2中所示的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中至少一种CDR序列选自含有与表2中所示VH CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VH CDR1序列；含有与表2中所示VH CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VH CDR2序列；含有与表2中所示VH CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VH CDR3序列；含有与表2中所示VL CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VL CDR1序列；含有与表2中所示VL CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VL CDR2序列；和含有与表2中所示VL CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，所述组合是在表2中一行所示的6种CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。
在一些实施方式中，可激活抗体包含含有VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列的组合的重链，其中，所述组合是在表2中一行所示的3种重链CDR序列(VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3)的组合。
在一些实施方式中，可激活抗体包含含有VL CDR1序列、VL CDR2序列、VL CDR3序列的组合的轻链，其中，所述组合是在表2中一行所示的3种轻链CDR序列(VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3)的组合。
在一些实施方式中，可激活抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示的6种CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含含有VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合的重链可变区，其中组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示的3种重链CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合的轻链可变区，其中组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示的3种轻链CDR序列(VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，MM结合AB的解离常数大于AB与CD147的解离常数。
在一些实施方式中，MM结合AB的解离常数不超过AB与CD147的解离常数。
在一些实施方式中，MM结合AB的解离常数等于AB与CD147的解离常数。
在一些实施方式中，MM结合AB的解离常数小于AB与CD147的解离常数。
在一些实施方式中，MM对AB的解离常数(Kd)比AB对CD147靶标的解离常数大不超过2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大倍数，或1-5、5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍或更大倍数。
在一些实施方式中，当可激活抗体处于切割状态时，MM不干扰也不竞争AB与CD147结合。
在一些实施方式中，MM是长度为约2-40个氨基酸的多肽。在一些实施方式中，MM是长度上至约40个氨基酸的多肽。
在一些实施方式中，MM多肽序列不同于CD147。在一些实施方式中，MM多肽序列与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过50％。在一些实施方式中，MM多肽序列不同于CD147并且与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过40％、30％、25％、20％、15％或10％。
在一些实施方式中，MM与AB的偶联降低AB结合CD147的能力，因此AB与MM偶联时对CD147的解离常数(Kd)比AB未与MM偶联时对CD147的Kd大至少2倍。
在一些实施方式中，MM与AB的偶联降低AB结合CD147的能力，因此AB与MM偶联时对CD147的解离常数(Kd)比AB未与MM偶联时对CD147的Kd大至少5倍。
在一些实施方式中，MM与AB的偶联降低AB结合CD147的能力，因此AB与MM偶联时对CD147的解离常数(Kd)比AB未与MM偶联时对CD147的Kd大至少10倍。
在一些实施方式中，MM与AB的偶联降低AB结合CD147的能力，因此AB与MM偶联时对CD147的解离常数(Kd)比AB未与MM偶联时对CD147的Kd大至少20倍。
在一些实施方式中，MM与AB的偶联降低AB结合CD147的能力，因此AB与MM偶联时对CD147的解离常数(Kd)比AB未与MM偶联时对CD147的Kd大至少40倍。
在一些实施方式中，MM与AB的偶联降低AB结合CD147的能力，因此AB与MM偶联时对CD147的解离常数(Kd)比AB未与MM偶联时对CD147的Kd大至少100倍。
在一些实施方式中，MM与AB的偶联降低AB结合CD147的能力，因此AB与MM偶联时对CD147的解离常数(Kd)比AB未与MM偶联时对CD147的Kd大至少1000倍。
在一些实施方式中，MM与AB的偶联降低AB结合CD147的能力，因此AB与MM偶联时对CD147的解离常数(Kd)比AB未与MM偶联时对CD147的Kd大至少10,000倍。
在一些实施方式中，在CD147存在的情况下，当使用靶标置换试验例如PCT公开号WO 2010/081173(其内容通过引用其全文纳入)中所述试验进行体外试验时，相较于CM被切割时，CM未被切割时MM将AB结合CD147的能力减少至少90％
在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83、86-89和90-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75、76、77、78、79、80、82、83、86、87、88、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99和100的氨基酸序列。
在一些实施方式中，切割CM的蛋白酶在疾病组织中具有活性，例如，上调或以未调节，并且蛋白酶在可激活抗体暴露于蛋白酶时切割可激活抗体中的CM。
在一些实施方式中，蛋白酶与CD147共定位于组织中，并且蛋白酶在可激活抗体暴露于蛋白酶时切割可激活抗体中的CM。
在一些实施方式中，CM位于可激活抗体中，从而当可激活抗体处于未切割状态时，可激活抗体与CD147的结合减少至以比未修饰的AB结合CD147的解离常数大至少两倍的解离常数发生，然而当其处于切割状态(即当可激活抗体处于切割状态时)时，AB结合CD147。
在一些实施方式中，CM位于可激活抗体中，从而当可激活抗体处于未切割状态时，可激活抗体与CD147的结合减少至以比未修饰的AB结合CD147的解离常数大至少五倍的解离常数发生，然而当其处于切割状态(即当可激活抗体处于切割状态时)时，AB结合CD147。
在一些实施方式中，CM位于可激活抗体中，从而当可激活抗体处于未切割状态时，可激活抗体与CD147的结合减少至以比未修饰的AB结合CD147的解离常数大至少10倍的解离常数发生，然而当其处于切割状态(即当可激活抗体处于切割状态时)时，AB结合CD147。
在一些实施方式中，CM位于可激活抗体中，从而当可激活抗体处于未切割状态时，可激活抗体与CD147的结合减少至以比未修饰的AB结合CD147的解离常数大至少20倍的解离常数发生，然而当其处于切割状态(即当可激活抗体处于切割状态时)时，AB结合CD147。
在一些实施方式中，CM位于可激活抗体中，从而当可激活抗体处于未切割状态时，可激活抗体与CD147的结合减少至以比未修饰的AB结合CD147的解离常数大至少40倍的解离常数发生，然而当其处于切割状态时，AB结合CD147。
在一些实施方式中，CM位于可激活抗体中，从而当可激活抗体处于未切割状态时，可激活抗体与CD147的结合减少至以比未修饰的AB结合CD147的解离常数大至少50倍的解离常数发生，然而当其处于切割状态时，AB结合CD147。
在一些实施方式中，CM位于可激活抗体中，从而当可激活抗体处于未切割状态时，可激活抗体与CD147的结合减少至以比未修饰的AB结合CD147的解离常数大至少100倍的解离常数发生，然而当其处于切割状态时，AB结合CD147。
在一些实施方式中，CM位于可激活抗体中，从而当可激活抗体处于未切割状态时，可激活抗体与CD147的结合减少至以比未修饰的AB结合CD147的解离常数大至少200倍的解离常数发生，然而当其处于切割状态时，AB结合CD147。
在一些实施方式中，CM是长度上至15个氨基酸的多肽。
在一些实施方式中，CM是包含第一可切割部分(CM1)和第二可切割部分(CM2)的多肽，所述CM1是至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物，而CM2是至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物。在一些实施方式中，CM1-CM2底物各自的CM1底物序列和CM2底物序列独立地是长度为上至15个氨基酸的多肽。
在一些实施方式中，CM是在癌症中将或据信将被上调或以其他方式不被调节的至少一种蛋白酶的底物。
在一些实施方式中，CM是选自下述的至少一种蛋白酶的底物：基质金属蛋白酶(MMP)，凝血酶、中性粒细胞弹性酶、半胱氨酸蛋白酶、豆荚蛋白(Legumain)和丝氨酸蛋白酶，如间质蛋白酶(MT-SP1)和尿激酶(uPA)。不受理论限制，据信这些蛋白酶在至少一种癌症中被上调或以其他方式不被调节。
示例性的底物包括但不限于，可以通过表3中所列一种或多种下述酶或蛋白酶切割的底物。
在一些实施方式中，选择CM与特定蛋白酶使用，例如，已知将与可激活抗体的靶标共定位的蛋白酶。
在一些实施方式中，CM是至少一种MMP的底物。MMP的示例包括表3中所列的MMP。在一些实施方式中，CM是选自下述的蛋白酶的底物：MMP 9、MMP14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP17、MMP11和MMP19。在一些实施方式中，CM是MMP9的底物。在一些实施方式中，CM是MMP14的底物。
在一些实施方式中，CM是包含下述序列的底物：TGRGPSWV(SEQ ID NO:356)；SARGPSRW(SEQ ID NO:357)；TARGPSFK(SEQ ID NO:358)；LSGRSDNH(SEQ ID NO:359)；GGWHTGRN(SEQ ID NO:360)；HTGRSGAL(SEQ ID NO:361)；PLTGRSGG(SEQ ID NO:362)；AARGPAIH(SEQ ID NO:363)；RGPAFNPM(SEQ ID NO:364)；SSRGPAYL(SEQ ID NO:365)；RGPATPIM(SEQ ID NO:366)；RGPA(SEQ ID NO:367)；GGQPSGMWGW(SEQ ID NO:368)；FPRPLGITGL(SEQ ID NO:369)；VHMPLGFLGP(SEQ ID NO:370)；SPLTGRSG(SEQ ID NO:371)；SAGFSLPA(SEQ ID NO:372)；LAPLGLQRR(SEQ ID NO:373)；SGGPLGVR(SEQ ID NO:374)；PLGL(SEQ ID NO:375)；LSGRSGNH(SEQ ID NO:789)；SGRSANPRG(SEQ ID NO:790)；LSGRSDDH(SEQID NO:791)；LSGRSDIH(SEQ ID NO:792)；LSGRSDQH(SEQ ID NO:793)；LSGRSDTH(SEQ IDNO:794)；LSGRSDYH(SEQ ID NO:795)；LSGRSDNP(SEQ ID NO:796)；LSGRSANP(SEQ ID NO:797)；LSGRSANI(SEQ ID NO:798)；LSGRSDNI(SEQ ID NO:799)；MIAPVAYR(SEQ ID NO:800)；RPSPMWAY(SEQ ID NO:801)；WATPRPMR(SEQ ID NO:802)；FRLLDWQW(SEQ ID NO:803)；ISSGL(SEQ ID NO:804)；ISSGLLS(SEQ ID NO:805)；和/或ISSGLL(SEQ ID NO:806)。
在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSDNH(SEQ ID NO:359)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列TGRGPSWV(SEQ ID NO:356)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列PLTGRSGG(SEQ ID NO:362)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列GGQPSGMWGW(SEQ IDNO:368)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列FPRPLGITGL(SEQ ID NO:369)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列VHMPLGFLGP(SEQ ID NO:370)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列PLGL(SEQ ID NO:375)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列SARGPSRW(SEQ IDNO:357)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列TARGPSFK(SEQ ID NO:358)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列GGWHTGRN(SEQ ID NO:360)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列HTGRSGAL(SEQ ID NO:361)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列AARGPAIH(SEQ IDNO:363)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列RGPAFNPM(SEQ ID NO:364)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列SSRGPAYL(SEQ ID NO:365)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列RGPATPIM(SEQ ID NO:366)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列RGPA(SEQ ID NO:367)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSGNH(SEQ ID NO:789)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列SGRSANPRG(SEQ ID NO:790)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSDDH(SEQ ID NO:791)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSDIH(SEQ ID NO:792)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSDQH(SEQ ID NO:793)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSDTH(SEQ ID NO:794)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSDYH(SEQ ID NO:795)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSDNP(SEQ ID NO:796)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSANP(SEQ ID NO:797)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSANI(SEQ ID NO:798)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LSGRSDNI(SEQ ID NO:799)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列MIAPVAYR(SEQ ID NO:800)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列RPSPMWAY(SEQ ID NO:801)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列WATPRPMR(SEQ ID NO:802)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列FRLLDWQW(SEQ ID NO:803)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列ISSGL(SEQ ID NO:804)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列ISSGLLS(SEQ ID NO:805)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列和/或ISSGLL(SEQ ID NO:806)。
在一些实施方式中，CM是MMP的底物并且包含序列ISSGLSS(SEQ ID NO:376)；QNQALRMA(SEQ ID NO:377)；AQNLLGMV(SEQ ID NO:378)；STFPFGMF(SEQ ID NO:379)；PVGYTSSL(SEQ ID NO:380)；DWLYWPGI(SEQ ID NO:381)，ISSGLLSS(SEQ ID NO:382)，LKAAPRWA(SEQ ID NO:383)；GPSHLVLT(SEQ ID NO:384)；LPGGLSPW(SEQ ID NO:385)；MGLFSEAG(SEQ ID NO:386)；SPLPLRVP(SEQ ID NO:387)；RMHLRSLG(SEQ ID NO:388)；LAAPLGLL(SEQ ID NO:389)；AVGLLAPP(SEQ ID NO:390)；LLAPSHRA(SEQ ID NO:391)；和/或PAGLWLDP(SEQ ID NO:392)。
在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列ISSGLSS(SEQ ID NO:376)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列QNQALRMA(SEQ ID NO:377)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列AQNLLGMV(SEQ ID NO:378)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列STFPFGMF(SEQ IDNO:379)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列PVGYTSSL(SEQ ID NO:380)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列DWLYWPGI(SEQ ID NO:381)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列ISSGLLSS(SEQ ID NO:382)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LKAAPRWA(SEQ IDNO:383)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列GPSHLVLT(SEQ ID NO:384)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LPGGLSPW(SEQ ID NO:385)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列MGLFSEAG(SEQ ID NO:386)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列SPLPLRVP(SEQ IDNO:387)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列RMHLRSLG(SEQ ID NO:388)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LAAPLGLL(SEQ ID NO:389)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列AVGLLAPP(SEQ ID NO:390)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列LLAPSHRA(SEQ IDNO:391)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列PAGLWLDP(SEQ ID NO:392)。
在一些实施方式中，CM是凝血酶的底物。在一些实施方式中，CM是凝血酶的底物并且包含序列GPRSFGL(SEQ ID NO:393)或GPRSFG(SEQ ID NO:394)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列GPRSFGL(SEQ ID NO:393)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列GPRSFG(SEQ ID NO:394)。
在一些实施方式中，MM包含选自下述的氨基酸序列：NTLSGRSENHSG(SEQ ID NO:395)；NTLSGRSGNHGS(SEQ ID NO:396)；TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:397)；TSGRSANP(SEQ IDNO:398)；VAGRSMRP(SEQ ID NO:399)；VVPEGRRS(SEQ ID NO:400)；ILPRSPAF(SEQ ID NO:401)；MVLGRSLL(SEQ ID NO:402)；QGRAITFI(SEQ ID NO:403)；SPRSIMLA(SEQ ID NO:404)；和SMLRSMPL(SEQ ID NO:405)。
在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列NTLSGRSENHSG(SEQ ID NO:395)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列NTLSGRSGNHGS(SEQ ID NO:396)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:397)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列TSGRSANP(SEQ ID NO:398)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列VAGRSMRP(SEQ ID NO:399)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列VVPEGRRS(SEQ ID NO:400)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列ILPRSPAF(SEQ ID NO:401)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列MVLGRSLL(SEQ ID NO:402)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列QGRAITFI(SEQ ID NO:403)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列SPRSIMLA(SEQ ID NO:404)。在一些实施方式中，CM包含氨基酸序列SMLRSMPL(SEQ ID NO:405)。
在一些实施方式中，CM是中性粒细胞弹性酶的底物。在一些实施方式中，CM是丝氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方式中，CM是uPA的底物。在一些实施方式中，CM是豆荚蛋白(Legumain)的底物。在一些实施方式中，CM是间质蛋白酶的底物。在一些实施方式中，CM是半胱氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方式中，CM是半胱氨酸蛋白酶如组织蛋白酶的底物。
在一些实施方式中，CM是CM1-CM2底物并且包含序列
ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO:406)；ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO:407)；AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:408)；
TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(SEQ ID NO:409)；
VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:410)；
TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO:411)；
AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO:412)；LSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO:413)；VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO:414)；
LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO:415)；
LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO:416)；
LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO:417)；
ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO:418)；
LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO:419)；
QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO:420)；
LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO:421)；
QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO:422)；ISSGLLSGRSGNH(SEQ ID NO:423)；ISSGLLSGRSANPRG(SEQ ID NO:680)；
AVGLLAPPTSGRSANPRG(SEQ ID NO:681)；AVGLLAPPSGRSANPRG(SEQ ID NO:682)；ISSGLLSGRSDDH(SEQ ID NO:683)；ISSGLLSGRSDIH(SEQ ID NO:684)；ISSGLLSGRSDQH(SEQID NO:685)；ISSGLLSGRSDTH(SEQ ID NO:686)；ISSGLLSGRSDYH(SEQ ID NO:687)；ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO:688)；ISSGLLSGRSANP(SEQ ID NO:689)；ISSGLLSGRSANI(SEQID NO:690)；AVGLLAPPGGLSGRSDDH(SEQ ID NO:691)；AVGLLAPPGGLSGRSDIH(SEQ ID NO:692)；AVGLLAPPGGLSGRSDQH(SEQ ID NO:693)；
AVGLLAPPGGLSGRSDTH(SEQ ID NO:694)；AVGLLAPPGGLSGRSDYH(SEQ ID NO:695)；AVGLLAPPGGLSGRSDNP(SEQ ID NO:696)；
AVGLLAPPGGLSGRSANP(SEQ ID NO:697)；AVGLLAPPGGLSGRSANI(SEQ ID NO:698)、ISSGLLSGRSDNI(SEQ ID NO:713)；AVGLLAPPGGLSGRSDNI(SEQ ID NO:714)；GLSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO:807)；和/或GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO:808)。
在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO:406)，其在本文还被称为底物2001。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO:407)，其在本文还被称为底物1001/LP′/0001，其中用于该CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO:1037)。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:408)，其在本文还被称为底物2015和/或底物1004/LP′/0003，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(SEQ ID NO:409)，其在本文还被称为底物0003/LP′/1004，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:410)，其在本文还被称为底物1003/LP′/0003，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO:411)，其在本文还被称为底物0003/LP′/1003，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO:412)，其在本文还被称为底物3001和/或底物1004/LP′/0001，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列LSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO:413)，其在本文还被称为底物0001/LP′/1004，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO:414)，其在本文还被称为底物1003/LP’/0001，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO:415)，其在本文还被称为底物0001/LP′/1003，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO:416)，其在本文还被称为底物0001/LP′/1001，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO:1037)。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO:417)，其在本文还被称为底物0002/LP′/1001，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO:1037)。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO:418)，其在本文还被称为底物1001/LP′/0002，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO:1037)。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO:419)，其在本文还被称为底物0001/LP′/1002，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO:1037)。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO:420)，其在本文还被称为底物1002/LP′/0001，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO:1037)。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO:421)，其在本文还被称为底物0002/LP′/1002，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO:1037)。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO:422)，其在本文还被称为底物1002/LP′/0002，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GGSGGS(SEQ ID NO:1037)。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSGNH(SEQ ID NO:423)，其在本文还被称为底物2002。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSANPRG(SEQ ID NO:680)，其在本文还被称为底物2003。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPTSGRSANPRG(SEQ ID NO:681)，其在本文还被称为底物2004。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPSGRSANPRG(SEQ ID NO:682)，其在本文还被称为底物2005。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSDDH(SEQ ID NO:683)，其在本文还被称为底物2006。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSDIH(SEQ ID NO:684)，其在本文还被称为底物2007。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSDQH(SEQ ID NO:685)，其在本文还被称为底物2008。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSDTH(SEQ ID NO:686)，其在本文还被称为底物2009。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSDYH(SEQ ID NO:687)，其在本文还被称为底物2010。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO:688)，其在本文还被称为底物2011。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSANP(SEQ IDNO:689)，其在本文还被称为底物2012。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSANI(SEQ ID NO:690)，其在本文还被称为底物2013。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDDH(SEQ ID NO:691)，其在本文还被称为底物3006。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDIH(SEQ ID NO:692)，其在本文还被称为底物3007。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDQH(SEQID NO:693)，其在本文还被称为底物3008。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列
AVGLLAPPGGLSGRSDTH(SEQ ID NO:694)，其在本文还被称为底物3009。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDYH(SEQ ID NO:695)，其在本文还被称为底物3010。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDNP(SEQ ID NO:696)，其在本文还被称为底物3011。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列
AVGLLAPPGGLSGRSANP(SEQ ID NO:697)，其在本文还被称为底物3012。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGLSGRSANI(SEQ ID NO:698)，其在本文还被称为底物3013。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列ISSGLLSGRSDNI(SEQ ID NO:713)，其在本文还被称为底物2014。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列AVGLLAPPGGLSGRSDNI(SEQ ID NO:714)，其在本文还被称为底物3014。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列GLSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO:807)，其在本文还被称为底物0001/LP′/1004，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。在一些实施方式中，CM1-CM2底物包含序列GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO:808)，其在本文还被称为底物0001/LP′/1003，其中用于所述CM1-CM2底物的LP′是氨基酸序列GG。
在一些实施方式中，CM是至少两种蛋白酶的底物。在一些实施方式中，各蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方式中，CM是至少两种蛋白酶的底物，其中蛋白酶之一选自：MMP，凝血酶、中性粒细胞弹性酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA，豆荚蛋白和间质蛋白酶并且另一个蛋白酶选自表2中所示的那些。在一些实施方式中，CM是选自下述的至少两种蛋白酶的底物：MMP，凝血酶、中性粒细胞弹性酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA、豆荚蛋白和间质蛋白酶。
在一些实施方式中，可激活抗体包含至少第一CM和第二CM。在一些实施方式中，第一CM和第二CM各自为长度为不超过15个氨基酸的多肽。在一些实施方式中，处于未切割状态的可激活抗体中第一CM和第二CM从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-CM1-CM2-AB或AB-CM2-CM1-MM。在一些实施方式中，第一CM和第二CM中的至少一种是作为选自下述蛋白酶的底物的多肽：MMP，凝血酶、中性粒细胞弹性酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA、豆荚蛋白和间质蛋白酶。在一些实施方式中，第一CM被靶组织中选自下述的第一切割剂切割：MMP，凝血酶、中性粒细胞弹性酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA、豆荚蛋白和间质蛋白酶，而第二CM被靶组织中的第二切割剂切割。在一些实施方式中，其他蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方式中，第一切割剂和第二切割剂是选自下述的相同蛋白酶：MMP，凝血酶、中性粒细胞弹性酶、半胱氨酸蛋白酶、uPA、豆荚蛋白和间质蛋白酶，而第一CM和第二CM是酶的不同底物。在一些实施方式中，第一切割剂和第二切割剂是选自表3中所示的相同的蛋白酶。在一些实施方式中，第一切割剂和第二切割剂是不同的蛋白酶。在一些实施方式中，第一切割剂和第二切割剂共定位于靶组织中。在一些实施方式中，第一CM和第二CM被靶组织中至少一种切割剂切割。
在一些实施方式中，可激活抗体暴露于并被蛋白酶切割，因此处于激活或未激活状态的可激活抗体包含这样的轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列在蛋白酶切割CM后包含至少部分LP2和/或CM序列。
本公开的合适可激活CD147抗体还包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列的CD147抗体结合人CD147和/或食蟹猴CD147上相同的表位。
本公开合适的可激活CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片断与下述CD147抗体结合相同的人CD147和/或食蟹猴CD147上的表位，如上所述的CD147抗体包含具有氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ IDNO:11)的VH CDR1序列；具有氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2；具有氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列；具有氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列；具有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列；和具有氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ IDNO:18)的VL CDR3序列。
本公开的合适可激活CD147抗体还包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与下述CD147抗体结合人CD147和/或食蟹猴CD147上相同的表位，所述CD147抗体包含选自表1中所示重链可变区序列的重链可变区氨基酸序列和选自表1中所示轻链可变区序列的轻链可变区氨基酸序列。
本公开的合适可激活CD147抗体还包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原与下述CD147抗体结合片段结合人CD147和/或食蟹猴CD147上相同的表位，所述CD147抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中所述组合是表2一行中所示的6种CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。
本公开合适的CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列的CD147抗体交叉竞争结合(抑制其结合)人CD147和/或食蟹猴CD147。
本公开的合适可激活CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片断结合与下述CD147交叉竞争(抑制其结合)人CD147和/或食蟹猴CD147，如上所述的CD147抗体包含具有氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQID NO:11)的VH CDR1序列；具有氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2；具有氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列；具有氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ IDNO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列；具有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ IDNO:16)的VL CDR2序列；和具有氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ IDNO:18)的VL CDR3序列。
本公开的合适可激活CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段如下所述CD147抗体交叉竞争结合(抑制其结合)人CD147和/或食蟹猴CD147，上述CD147抗体包含选自表1中所示重链可变区序列的重链可变区氨基酸序列和选自表1中所示轻链可变区序列的轻链可变区氨基酸序列。
本公开的合适可激活CD147抗体还包含这样的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段如下所述CD147抗体交叉竞争结合(抑制其结合)人CD147和/或食蟹猴CD147，上述CD147抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中所述组合是表2一行中所示的6种CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。
在一些实施方式中，可激活CD147抗体是处于激活状态的可激活抗体，其结合这样的CD147，所述CD147包含：特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB特异性地结合人CD147和食蟹猴CD147；掩蔽部分(MM)，当可激活抗体处于未切割状态时，其抑制AB与CD147的结合；和与AB偶联的可切割部分(CM)，其中，CM是作为蛋白酶底物的多肽。
在一些实施方式中，MM结合AB的解离常数大于AB与CD147的解离常数。在一些实施方式中，当可激活抗体处于切割状态时，MM不干扰也不竞争AB与CD147结合。在一些实施方式中，MM是长度不超过40个氨基酸的多肽。在一些实施方式中，MM多肽序列不同于人CD147。在一些实施方式中，MM多肽序列与AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过50％。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83、86-89和90-100的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CM是在疾病组织中具有活性的蛋白酶的底物。在一些实施方式中，CM包含选自SEQ ID NO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列。在一些实施方式中，CM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含选自下述的其抗原结合片段：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单域重链抗体和单域轻链抗体。在一些实施方式中，可激活抗体的AB特异性地结合人CD147。在一些实施方式中，AB包含VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ IDNO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VHCDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ IDNO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，AB连接CM。在一些实施方式中，AB直接连接CM。在一些实施方式中，AB经由连接肽连接CM。在一些实施方式中，MM连接CM，从而使处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方式中，可激活抗体包含介于MM和CM之间的连接肽。在一些实施方式中，可激活抗体包含介于CM和AB之间的连接肽。在一些实施方式中，可激活抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方式中，2种连接肽不需要彼此相同。在一些实施方式中，LP1和LP2各自是长度为约1-20个氨基酸的肽。
在一些实施方式中，可激活抗体包含重链序列和轻链，所述重链序列选自SEQ IDNO:1-4和19-22，而所述轻链包含选自SEQ ID NO:5-9、23-27、140-182、185-227、230-272和275-317的氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体包含氨基酸序列的组合，其中所述氨基酸序列的组合选自表4中的各单行，其中对于给定组合，(a)AB的重链包含VH CDR序列的氨基酸序列，其对应表4一行中给定组合，(b)AB的轻链包含VL CDR序列的氨基酸序列，其对应表4中所列一行中给定组合，(c)MM包含掩蔽序列(MM)的氨基酸序列，其对应表4中所列一行中给定组合，和(d)CM包含底物序列(CM)的氨基酸序列，其对应表4中所列一行中给定组合。
在一些实施方式中，可激活抗体包含氨基酸序列的组合，其中对于给定组合，(a)AB的重链包含选自下述VH序列或VH CDR序列的氨基酸序列：表5对应列中所列的VH序列或VH CDR序列，(b)AB的轻链包含选自下述的VL序列或VL CDR序列的氨基酸序列：表5对应列中所列的VL序列或VL CDR序列，(c)MM包含选自下述的掩蔽序列(MM)的氨基酸序列：表5对应列中所列的MM序列，和(d)CM包含选自下述的底物序列(CM)的氨基酸序列：表5对应列中所列的CM序列。
在一些实施方式中，可激活CD147抗体包含特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段、MM和CM，其中可激活抗体包含：SEQ ID NO:19-22的重链序列；和包含选自SEQ ID NO:5-9和23-27的氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列，而CM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列。在一些实施方式中，AB包含VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活CD147抗体包含特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列的MM，和包含选自SEQ IDNO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列的CM。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列，而CM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。在一些实施方式中，AB包含VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ IDNO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活CD147抗体包含：特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB特异性地与本公开的分离抗体结合人CD147和/或食蟹猴CD147上相同的表位；掩蔽部分(MM)，当可激活抗体处于未切割状态时，抑制AB与CD147的结合；和偶联AB的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽。
在一些实施方式中，本公开的CD147可激活抗体包含特异性结合哺乳动物CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB特异性结合人CD147和食蟹猴CD147。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ IDNO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，可激活抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活CD147抗体包含：特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB与本公开的分离抗体交叉竞争(抑制其结合)结合人CD147和/或食蟹猴CD147；掩蔽部分(MM)，当可激活抗体处于未切割状态时，抑制AB与CD147的结合；和偶联AB的可切割部分(CM)，其中CM是作为蛋白酶底物的多肽。
在一些实施方式中，本公开的CD147可激活抗体包含特异性结合哺乳动物CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB特异性结合人CD147和食蟹猴CD147。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ IDNO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，可激活抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体还包含与AB偶联的试剂。在一些实施方式中，与AB或者可激活抗体的AB偶联的试剂是治疗剂。在一些实施方式中，试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方式中，试剂是毒素或其片段。本文所用毒素的片段是保留毒性的片段。在一些实施方式中，试剂经由可切割接头与AB偶联。在一些实施方式中，试剂经由接头与AB偶联，所述接头包含至少一种CM1-CM2底物序列。在一些实施方式中，试剂经由不可切割接头与AB偶联。在一些实施方式中，试剂经由接头与AB偶联，所述接头在胞内或溶酶体环境中是可切割的。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方式中，试剂是核酸破坏剂，如DNA烷化剂，DNA切割剂，DNA交联剂，DNA嵌入剂或其他DNA破坏剂。在一些实施方式中，试剂是选自表5中所列的试剂。在一些实施方式中，试剂是尾海兔素。在一些实施方式中，试剂是澳瑞他汀(auristatin)或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是澳瑞他汀E或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。在一些实施方式中，试剂是美登木素(maytansinoid)或美登木素衍生物。在一些实施方式中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方式中，试剂是多卡霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000781
(pyrrolobenzodiazepine)。在一些实施方式中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000782
二聚体。
在一些实施方式中，可激活抗体与一个或多个当量的试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体与一个当量的试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体与2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个当量的试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体是这样的可激活抗体的混合物的部分，所述可激活抗体的混合物具有均等当量数的偶联试剂。在一些实施方式中，可激活抗体是这样的可激活抗体的混合物的部分，所述可激活抗体的混合物具有不均等当量数的偶联试剂。在一些实施方式中，可激活抗体的混合物使得与各可激活抗体偶联的试剂的平均数量为0-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10和10-更大。在一些实施方式中，可激活抗体的混合物使得与各可激活抗体偶联的试剂的平均数量为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
在一些实施方式中，可激活抗体包含一个或多个位点特异性氨基酸序列修饰，因此赖氨酸和/或半胱氨酸残基的数量相对于可激活抗体的原始氨基酸序列增加或减少，因此在一些实施方式中，相应地增加或减少可以与可激活抗体偶联的试剂的数量，或者在一些实施方式中，限制试剂与可激活抗体以位点特异性的方式的偶联。在一些实施方式中，修饰的可激活抗体经一种或多种非天然氨基酸以位点特异性的方式修饰，因此在一些实施方式中，限制试剂仅与非天然氨基酸的位点偶联。
在一些实施方式中，试剂是抗炎剂。
在一些实施方式中，可激活抗体还包含可检测部分。在一些实施方式中，可检测部分是诊断剂。
在一些实施方式中，可激活抗体还包含信号肽。在一实施方式中，信号肽经由间隔子与可激活抗体偶联。在一实施方式中，间隔子在信号肽不存在的情况下与可激活抗体偶联。在一些实施方式中，间隔子与可激活抗体的MM直接连接。在一些实施方式中，间隔子以从N-末端到C-末端这样的结构排布直接连接可激活抗体的MM：间隔子-MM-CM-AB。直接连接可激活抗体的MM的N-末端的间隔子的示例是QGQSGQ(SEQ ID NO:424)。直接连接可激活抗体的MM的N-末端的间隔子的其他示例包括：QGQSGQG(SEQ ID NO:645)、QGQSG(SEQ ID NO:646)、QGQS(SEQ ID NO:647)、QGQ(SEQ ID NO:648)、QG(SEQ ID NO:649)和Q。直接连接可激活抗体的MM的N-末端的间隔子的其他示例包括：GQSGQG(SEQ ID NO:666)、QSGQG(SEQ IDNO:667)、SGQG(SEQ ID NO:668)、GQG(SEQ ID NO:669)和G。在一些实施方式中，没有间隔子与MM的N-末端连接。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO:424)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列QGQSGQG(SEQ ID NO:645)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列QGQSG(SEQ ID NO:646)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列QGQS(SEQ ID NO:647)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列QGQ(SEQ ID NO:648)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列QG(SEQ ID NO:649)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸残基Q。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列GQSGQG(SEQ ID NO:666)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列QSGQG(SEQ ID NO:667)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列SGQG(SEQ ID NO:668)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列GQG(SEQ ID NO:669)。在一些实施方式中，间隔子至少包括氨基酸序列G。在一些实施方式中，间隔子不存在。
在一些实施方式中，可激活抗体的AB天然地包含一个或多个二硫键。在一些实施方式中，AB可以经工程改造以包含一个或多个二硫键。
在一些实施方式中，可激活抗体或其抗原结合片段与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与下述分离抗体交叉竞争(抑制其结合)，上述分离抗体包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ IDNO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，可激活抗体包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与下述分离抗体交叉竞争(抑制其结合)，上述分离抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。在一些实施方式中，试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方式中，试剂是核酸破坏剂。在一些实施方式中，试剂选自尾海兔素或其衍生物，澳瑞他汀或其衍生物，美登木素或其衍生物，多卡霉素或其衍生物，卡奇霉素或其衍生物，和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000801
或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是澳瑞他汀E或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。在一些实施方式中，试剂是选自包含DM1和DM4的美登木素。在一些实施方式中，试剂是美登木素DM4。在一些实施方式中，试剂是多卡霉素。在一些实施方式中，试剂经由接头与AB偶联。在一些实施方式中，偶联所述试剂与所述AB的接头包含SPDB部分、vc部分或PEG2-vc部分。在一些实施方式中，与AB偶联的接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-多卡霉素或PEG2-vc-MMAD部分。在一些实施方式中，接头是可切割接头。在一些实施方式中，接头是不可切割接头。在一些实施方式中，试剂是可检测部分。在一些实施方式中，可检测部分是诊断剂。
在一些实施方式中，偶联可激活抗体包含处于激活状态时结合CD147的偶联可激活抗体，其包含：特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB特异性地结合人CD147和食蟹猴CD147；掩蔽部分(MM)，当可激活抗体处于未切割状态时，其抑制AB与CD147的结合；与AB偶联的可切割部分(CM)，其中CM是作为蛋白酶底物的多肽；和与AB偶联的试剂。在一些实施方式中，试剂选自尾海兔素或其衍生物，澳瑞他汀或其衍生物，美登木素或其衍生物，多卡霉素或其衍生物，卡奇霉素或其衍生物，和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000811
或其衍生物。在一些实施方式中，试剂选自澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，多卡霉素，吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000812
和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000813
二聚物。在一些实施方式中，试剂经由接头与AB偶联。在一些实施方式中，偶联所述试剂与所述AB的接头包含SPDB部分、vc部分或PEG2-vc部分。在一些实施方式中，与AB偶联的接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-多卡霉素或PEG2-vc-MMAD部分。在一些实施方式中，偶联可激活抗体或其抗原结合片段的AB包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VHCDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。在一些实施方式中，可激活抗体或其抗原结合片段的AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，CM包含选自SEQ ID NO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列。在一些实施方式中，CM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体包含氨基酸序列的组合，其中所述氨基酸序列的组合选自表4中的各单行，其中对于给定组合，(a)AB的重链包含VH CDR序列的氨基酸序列，其对应表4一行中给定组合，(b)AB的轻链包含VL CDR序列的氨基酸序列，其对应表4中所列一行中给定组合，(c)MM包含掩蔽序列(MM)的氨基酸序列，其对应表4中所列一行中给定组合，和(d)CM包含底物序列(CM)的氨基酸序列，其对应表4中所列一行中给定组合。在一些实施方式中，可激活抗体包含氨基酸序列的组合，其中对于给定组合，(a)AB的重链包含选自下述VH序列或VH CDR序列的氨基酸序列：表5对应列中所列的VH序列或VH CDR序列，(b)AB的轻链包含选自下述的VL序列或VL CDR序列的氨基酸序列：表5对应列中所列的VL序列或VL CDR序列，(c)MM包含选自下述的掩蔽序列(MM)的氨基酸序列：表5对应列中所列的MM序列，和(d)CM包含选自下述的底物序列(CM)的氨基酸序列：表5对应列中所列的CM序列。在一些实施方式中，可激活抗体包含：含有选自SEQ ID NO:1-4或19-22的氨基酸序列的重链；和含有选自SEQ ID NO:5-9、23-27、140-182、185-227、230-272和275-317的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方式中，偶联可激活抗体包含处于激活状态时结合CD147的偶联可激活抗体，其包含：与哺乳动物CD147特异性结合的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中，所述AB特异性地结合人CD147和食蟹猴CD147；掩蔽部分(MM)，当可激活抗体处于未切割状态时，其抑制AB与CD147的结合；与AB偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽；和与AB偶联的试剂，其中所述AB包含：(i)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ IDNO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，或(ii)含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的重链可变区，和含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列的轻链可变区，或(iii)含有选自SEQ ID NO:1-4或19-22的氨基酸序列的重链，和含有选自SEQ ID NO:5-9、23-27、140-182、185-227、230-272和275-317的氨基酸序列的轻链；并且其中所述试剂选自澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，多卡霉素，吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000831
和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000832
二聚物。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，MM包含选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100的氨基酸序列。在一些实施方式中，CM包含选自SEQ IDNO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列。在一些实施方式中，CM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。在一些实施方式中，试剂经由接头偶联AB，并且其中偶联所述试剂与所述AB的接头包含SPDB部分、vc部分或PEG2-vc部分。在一些实施方式中，与AB偶联的接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-多卡霉素或PEG2-vc-MMAD部分。
在一些实施方式中，偶联可激活抗体包含含有下述的偶联可激活抗体或偶联抗体：抗体或其抗原结合片段(AB)，当处于激活状态时，其结合CD147；和经由接头偶联AB的毒素，其中偶联可激活抗体或偶联抗体包含选自表9中一行的氨基酸序列、接头和毒素，其中对于给定组合：(a)AB包含重链，所述重链包含对应表9一行中给定组合的重链序列或重链可变结构域序列的氨基酸序列，(b)AB包含轻链，所述轻链包含对应表9一行中给定组合的轻链序列或轻链可变结构域序列的氨基酸序列，和(c)接头和毒素包含对应表9一行中给定组合的接头和毒素。
在一些实施方式中，可激活抗体由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自SEQ ID NO:1-3的重链可变区氨基酸序列的核酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自SEQ ID NO:5-8的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自SEQID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列的核酸序列以及编码选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自SEQID NO:1-3的重链可变区氨基酸序列的核酸序列以及编码选自SEQ ID NO:5-8的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码包含选自SEQ ID NO:1-3的重链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码选自SEQ ID NO:5-8的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码重链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列以及与编码轻链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，所述重链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-4，而所述轻链可变氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-9。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含与编码重链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列以及与编码轻链可变区氨基酸序列的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核酸序列，所述重链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-3，而所述轻链可变氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-8。
在一些实施方式中，可激活抗体由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自表1所示重链可变区序列的重链可变区氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体由这样的核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自表1所示轻链可变区序列的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码选自表1所示重链可变区序列的重链可变区氨基酸序列的核酸序列以及编码选自表1所示轻链可变区序列的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码与选自表1所示重链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的重链可变区氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码与选自表1所示轻链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的轻链可变区氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码重链可变区氨基酸序列的核酸序列以及编码轻链可变区氨基酸序列的核酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自表1所示重链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性，而所述轻链可变区氨基酸序列与选自表1所示轻链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码下述组合的核酸序列：可变重链互补决定区1(VH CDR1，本文也称之为CDRH1)序列，可变重链互补决定区2(VH CDR2，本文也称之为CDRH2)序列，可变重链互补决定区3(VH CDR3，本文也称之为CDRH3)序列，可变轻链互补决定区1(VL CDR1，本文也称之为CDRL1)序列，可变轻链互补决定区2(VL CDR2，本文也称之为CDRL2)序列，和可变轻链互补决定区3(VL CDR3，本文也称之为CDRL3)序列，其中至少一种CDR序列选自表2中所示的VH CDR1序列；表2中所示的VHCDR2序列；表2中所示的VH CDR3序列；表2中所示的VL CDR1序列；表2中所示的VL CDR2序列；和表2中所示的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合的核酸序列，其中至少一种CDR序列选自含有与表2中所示VH CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VH CDR1序列；含有与表2中所示VH CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VH CDR2序列；含有与表2中所示VH CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VH CDR3序列；含有与表2中所示VL CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VL CDR1序列；含有与表2中所示VL CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VL CDR2序列；和含有与表2中所示VL CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码下述组合的核酸序列：VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VLCDR3序列，其中，所述组合是在表2中一行所示的6种CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码含有VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合的轻链可变区的核酸序列，其中，所述组合是表2中一行所示3种轻链CDR序列(VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)的组合。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码含有VHCDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合的重链可变区的核酸序列，其中，所述组合是表2中一行所示3种重链CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)的组合。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合的核酸序列，其中组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示6种CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码含有VHCDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合的重链可变区的核酸序列，其中组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示的3种重链CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，可激活抗体由核酸序列编码，所述核酸序列包含编码含有VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合的轻链可变区的核酸序列，其中组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示的3种轻链CDR序列(VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
本公开还提供了用于通过在导致可激活抗体表达的条件下培养细胞产生本公开可激活抗体的方法，其中，所述细胞包含本公开的核酸分子或本公开的载体。
本公开还提供了制造在其处于激活状态时结合CD147的可激活抗体的方法，所述方法包括：(a)在导致可激活抗体表达的条件下培养含有编码可激活抗体的核酸构建体的细胞，其中可激活抗体包含本公开的可激活抗体；和(b)回收可激活抗体。
在一些实施方式中，可激活抗体包含一种或多种多肽，其包含表4给定行中序列的组合或者表5的掩蔽序列(MM)、底物序列(CM)、轻链可变结构域序列或轻链可变结构域CDR序列和重链可变结构域序列或重链可变结构域CDR序列的组合。
表4：CD147可激活抗体组合
Figure BDA0002266538730000871
Figure BDA0002266538730000881
Figure BDA0002266538730000891
Figure BDA0002266538730000901
Figure BDA0002266538730000911
Figure BDA0002266538730000921
Figure BDA0002266538730000931
Figure BDA0002266538730000941
表5：CD147可激活抗体组分
Figure BDA0002266538730000952
Figure BDA0002266538730000961
Figure BDA0002266538730000981
在一些实施方式中，本公开的可激活抗体包含一种或多种多肽，其包含选自表4或表5的序列的组合，其中多肽包含这样的组合：选自表4或表5名为“掩蔽序列(MM)”一列的掩蔽序列，选自表4或表5名为“底物序列(CM)”一列的底物序列，选自表4或表5名为“VL或VLCDR”或“VL CDR SEQ ID NO”一列的轻链可变结构域或轻链CDR，和选自表4或表5名为“VH或VH CDR”或“VH CDR SEQ ID NO”一列的重链可变结构域或重链CDR。例如，本公开的可激活抗体可以包含组合号147的氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:17的掩蔽序列，SEQ ID NO:412的底物序列，含有SEQ ID NO:15、16和18VL CDR序列的轻链可变结构域，和含有11、12和13VH CDR序列的重链可变结构域。因此，本文描述了这样的可激活抗体，其至少包含表4任意给定行中序列的组合。相似地，本文描述了表5的掩蔽序列(MM)、底物序列(CM)、轻链可变结构域序列或轻链可变结构域CDR序列和重链可变结构域序列或重链可变结构域CDR序列的任何组合。本文还描述了可激活抗体，其至少包含选自表4或表5对应列的掩蔽序列、底物序列、可变重链或可变重链CDR和可变轻链或可变轻链CDR的任何组合。在一些示例性实施方式中，可激活抗体至少包含表4任意给定行中序列的组合或者表5的掩蔽序列(MM)、底物序列(CM)、轻链可变结构域序列或轻链可变结构域CDR序列和重链可变结构域序列或重链可变结构域CDR序列的任意组合，这样的可激活抗体可以与一种或多种毒素组合，所述毒素包括尾海兔素或其衍生物，澳瑞他汀或其衍生物，美登木素或其衍生物，多卡霉素或其衍生物，卡奇霉素或其衍生物，和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000991
或其衍生物。在一些示例性实施方式中，可激活抗体至少包含表4任意给定行中序列的组合或者表5的掩蔽序列(MM)、底物序列(CM)、轻链可变结构域序列或轻链可变结构域CDR序列和重链可变结构域序列或重链可变结构域CDR序列的任意组合，这样的可激活抗体可以与一种或多种毒素组合，所述毒素包括澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，吡咯并苯并二氮杂吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730000993
二聚物，和/或多卡霉素。
如上所述表4或表5的任意组合可以与人免疫球蛋白恒定区组合以生产完整人IgG，包括IgG1、IgG2、IgG4，或与突变的恒定区组合以产生具有改变的功能的IgG，例如，IgG1 N297A、IgG1 N297Q或IgG4 S228P。表4或表5中所述的组合并不限于任何给定行中所示的特定组合，并且因此可以包括来自表4第2列(或表5第1列)的任何掩蔽序列，与来自表4第3列(或表5的第2列)的任何底物序列组合，与来自表4第4列(或表5的第3列)的任何VL序列或VL CDR序列组组合，与来自表4第5列(或表5的第4列)的任何VH序列或VH CDR序列组组合。除了表4第2列或表5第1列中所公开的掩蔽序列，本文所公开的任何掩蔽序列都可以用于组合。除了表4第3列或表5第2列中所公开的底物序列，本文所公开的任何CM序列都可以用于组合。除了表4第4列或表5第3列中所公开的轻链可变区序列或轻链CDR序列，本文所公开的任何轻链可变区序列或轻链CDR序列都可以用于组合。除了表4第5列或表5第4列中所公开的重链可变区序列或重链CDR序列，本文所公开的任何重链可变区序列或重链CDR序列都可以用于组合。
在一些实施方式中，可激活抗体的血清半衰期比相应的抗体长，例如，可激活抗体的pK长于相应的抗体的pK。在一些实施方式中，可激活抗体的血清半衰期与相应的抗体类似。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少15天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少12天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少11天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少10天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少9天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少8天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少7天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少6天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少5天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少4天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少3天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少2天。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少24小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少20小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少18小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少16小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少14小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少12小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少10小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少8小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少6小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少4小时。在一些实施方式中，当给予生物体时，可激活抗体的血清半衰期是至少3小时。
本公开还提供了通过在导致可激活CD147抗体多肽表达的条件下培养细胞产生该多肽的方法，其中，所述细胞包含编码本文所述抗体和/或可激活抗体的分离核酸分子，和/或包含这些分离核酸序列的载体。本公开还提供了通过在导致抗体和/或可激活抗体表达的条件下培养细胞产生抗体和/或可激活抗体的方法，其中，所述细胞包含编码本文所述抗体和/或可激活抗体的分离核酸分子，和/或包含这些分离核酸序列的载体。
本发明还提供了制造在其处于激活状态时结合CD147的可激活抗体的方法，所述方法通过(a)在导致可激活抗体表达的条件下培养这样的细胞，所述细胞包含编码可激活抗体的核酸构建体，其中所述可激活抗体包含掩蔽序列(MM)、可激活部分(CM)和特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段，(i)其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽；和(ii)其中所述CM位于可激活抗体内，从而使得当可激活抗体处于未切割状态时，MM干扰AB与CD147的特异性结合，而当其处于切割状态时，MM不干扰也不竞争AB与CD147的特异性结合；和(b)回收可激活抗体。合适的AB、MM和/或CM包含本文所公开的任一种AB、MM和/或CM。
在一些实施方式中，处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方式中，可激活抗体包含介于MM和CM之间的连接肽。在一些实施方式中，可激活抗体包含介于CM和AB之间的连接肽。在一些实施方式中，可激活抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方式中，2个连接肽不需要彼此相同。在一些实施方式中，处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：间隔子-MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM-间隔子。
在一些实施方式中，LP1或LP2中的至少一种包含选自下述的氨基酸序列：(GS)n,(GGS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:339)和(GGGS)n(SEQ ID NO:340)，其中n是至少为1的整数。
在一些实施方式中，LP1或LP2中的至少一种包含选自下述的氨基酸序列：GGSG(SEQ ID NO:341)、GGSGG(SEQ ID NO:342)、GSGSG(SEQ ID NO:343)、GSGGG(SEQ ID NO:344)、GGGSG(SEQ ID NO:345)和GSSSG(SEQ ID NO:346)。
在一些实施方式中，LP1包含氨基酸序列：GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO:347)、GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO:348)、GSSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:349)、GSSGGSGGSGGSGGGS(SEQID NO:350)、GSSGGSGGSG(SEQ ID NO:351)或GSSGGSGGSGS(SEQ ID NO:352)。
在一些实施方式中，LP2包含氨基酸序列GSS、GGS、GGGS(SEQ ID NO:353)、GSSGT(SEQ ID NO:354)或GSSG(SEQ ID NO:356)。
偶联CD147抗体和可激活抗体
在一些实施方式中，本文所述CD147抗体和可激活抗体还包含与抗体/可激活抗体偶联的试剂。在一些实施方式中，偶联试剂是治疗剂，如抗炎剂和/或抗肿瘤剂。在这些实施方式中，试剂偶联抗体/可激活抗体的糖部分，例如，在一些实施方式中，糖部分位于可激活抗体中的抗原结合片段或抗体的抗原结合区外侧。在一些实施方式中，试剂偶联抗体/可激活抗体中抗体或抗原结合片段的巯基基团。
在一些实施方式中，试剂是细胞毒性试剂如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)。
在一些实施方式中，试剂是可检测部分，例如，标记物或其他标志物。例如，试剂是或包括放射性标记物标记的氨基酸，可以通过标记的亲和素检测的一种或多种生物素基部分(例如，包含可由光学或量热法检测的含荧光标志物或酶活性的链霉亲和素)，一种或多种放射性同位素和放射性核素，一种或多种荧光标记物，一种或多种酶促标记物，和/或一种或多种化学发光剂。在一些实施方式中，可检测部分通过间隔子分子连接。
本公开还涉及免疫偶联物，所述免疫偶联物包括偶联有细胞毒性试剂如毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)的抗体。合适的细胞毒性试剂包括例如，尾海兔素和其衍生物(例如，澳瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE、MMAD、DMAF、DMAE)。例如，试剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。在一些实施方式中，试剂是选自表5中所列的试剂。在一些实施方式中，试剂是尾海兔素。在一些实施方式中，试剂是澳瑞他汀或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是澳瑞他汀E或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。在一些实施方式中，试剂是美登木素或美登木素衍生物。在一些实施方式中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方式中，试剂是多卡霉素或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是卡奇霉素或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730001031
在一些实施方式中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730001032
二聚体。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、分裂毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于放射性偶联抗体的产生。示例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
在一些实施方式中，试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方式中，试剂是核酸破坏剂。在一些实施方式中，试剂选自尾海兔素或其衍生物，澳瑞他汀或其衍生物，美登木素或其衍生物，多卡霉素或其衍生物，卡奇霉素或其衍生物，和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730001033
或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是澳瑞他汀E或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。在一些实施方式中，试剂是选自包含DM1和DM4的美登木素。在一些实施方式中，试剂是美登木素DM4。在一些实施方式中，试剂是多卡霉素。在一些实施方式中，试剂经由接头与AB偶联。在一些实施方式中，偶联所述试剂与所述AB的接头包含SPDB部分、vc部分或PEG2-vc部分。在一些实施方式中，与AB偶联的接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-多卡霉素或PEG2-vc-MMAD部分。在一些实施方式中，接头是可切割接头。在一些实施方式中，接头是不可切割接头。在一些实施方式中，试剂是可检测部分。在一些实施方式中，可检测部分是诊断剂。
在一些实施方式中，偶联抗体包含这样的偶联抗体，所述偶联抗体包含：(a)特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含：(i)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ IDNO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，或(ii)重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列的重链可变区和选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列的轻链可变区；(b)与AB偶联的试剂，其中所述试剂选自澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730001041
和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730001042
二聚物，和多卡霉素。
本公开的可激活抗体和CD147抗体具有针对试剂的至少一个偶联点，但在本文所提供的方法和组合物中，并不是所有可能的偶联点能够用于与试剂偶联。在一些实施方式中，一个或多个偶联点是二硫键中包含的硫原子。在一些实施方式中，一个或多个偶联点是链间二硫键中包含的硫原子。在一些实施方式中，一个或多个偶联点是链间硫化键中包含的硫原子，而不是链内二硫键中包含的硫原子。在一些实施方式中，一个或多个偶联点是半胱氨酸或含有硫原子的其他氨基酸残基的硫原子。这类残基可以天然的存在于抗体结构中或者可以通过定点诱变、化学转化或非天然氨基酸的错误纳入被纳入抗体中。
还提供了制备在AB中具有一个或多个链间二硫键并在MM中具有一个或多个链内二硫键的CD147抗体/CD147可激活抗体的偶联物的方法，并提供了与游离巯基反应的药物。所述方法通常包括用还原剂诸如TCEP部分还原可激活抗体中的链间二硫键；并将与游离巯基反应的药物和部分还原的抗体/可激活抗体偶联。本文所用术语部分还原指这样的情况，其中作用抗体/可激活抗体与还原剂接触并且少于全部的二硫键例如少于所有可能的偶联位点被还原。在一些实施方式中，少于99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或少于5％的所有可能的偶联位点被还原。
在其他实施方式中，提供了还原和偶联试剂(例如药物)与CD147抗体/CD147可激活抗体产生放置试剂的选择性的方法。所述方法通常包括用还原剂部分还原CD147抗体/CD147可激活抗体，因此CD147抗体/CD147可激活抗体掩蔽部分或其他非AB部分中的任何偶联位点不被还原，并将试剂与AB中的链间巯基偶联。选择偶联位点，从而允许试剂的所需放置，以允许偶联在所需位点发生。还原剂是例如TCEP。还原反应条件，例如，还原剂与抗体/可激活抗体的比例，孵育的长度，孵育期间的温度，还原反应溶液的pH等通过鉴定产生偶联抗体/可激活抗体的条件确定，例如，在产生偶联可激活抗体的条件下，其中MM保留有效且高效地掩蔽处于未切割状态的可激活抗体的AB的能力。还原剂与抗体/可激活抗体的比例将根据抗体/可激活抗体变化。在一些实施方式中，还原剂与抗体/可激活抗体的比例的范围为约20:1-1:1、约10:1-1:1、约9:1-1:1、约8:1-1:1、约7:1-1:1、约6:1-1:1、约5:1-1:1、约4:1-1:1、约3:1-1:1、约2:1-1:1、约20:1-1:1.5、约10:1-1:1.5、约9:1-1:1.5、约8:1-1:1.5、约7:1-1:1.5、约6:1-1:1.5、约5:1-1:1.5、约4:1-1:1.5、约3:1-1:1.5、约2:1-1:1.5、约1.5:1-1:1.5或约1:1-1:1.5。在一些实施方式中，比例的范围为约5:1至1:1。在一些实施方式中，比例的范围为约5:1至1.5:1。在一些实施方式中，比例的范围为约4:1至1:1。在一些实施方式中，比例的范围为约4:1至1.5:1。在一些实施方式中，比例的范围为约8:1至约1:1。在一些实施方式中，比例的范围为约2.5:1至1:1。
在一些实施方式中，CD147首先经历偶联，然后经进一步修饰以包含CM和MM(产生可激活抗体)。在一些实施方式中，CD147可激活抗体是偶联的。
在一些实施方式中，提供了还原可激活CD147抗体AB中链间二硫键并偶联试剂(例如，含有巯基的试剂诸如药物)与所得链间巯基以选择性定位试剂于AB的方法。所述方法通常包括用还原剂分还原AB以在不形成所有可能的链间巯基的情况下形成至少两个链间巯基；并将试剂与部分还原的AB的链间巯基偶联。例如，在约37℃，以所需比例的还原剂:可激活抗体部分还原可激活抗体的AB约1小时。在一些实施方式中，还原剂与可激活抗体的比例的范围为约20:1-1:1、约10:1-1:1、约9:1-1:1、约8:1-1:1、约7:1-1:1、约6:1-1:1、约5:1-1:1、约4:1-1:1、约3:1-1:1、约2:1-1:1、约20:1-1:1.5、约10:1-1:1.5、约9:1-1:1.5、约8:1-1:1.5、约7:1-1:1.5、约6:1-1:1.5、约5:1-1:1.5、约4:1-1:1.5、约3:1-1:1.5、约2:1-1:1.5、约1.5:1-1:1.5或约1:1-1:1.5。在一些实施方式中，比例的范围为约5:1至1:1。在一些实施方式中，比例的范围为约5:1至1.5:1。在一些实施方式中，比例的范围为约4:1至1:1。在一些实施方式中，比例的范围为约4:1至1.5:1。在一些实施方式中，比例的范围为约8:1至约1:1。在一些实施方式中，比例的范围为约2.5:1至1:1。
所述含巯基的试剂可以是，例如，半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸。还原剂可以是例如TCEP。在一些实施方式中，可以使用例如，柱层析、透析或透析过滤在偶联之前纯化还原的可激活抗体。或者，部分还原之后和偶联之前不纯化还原的抗体。
本发明还提供了部分还原的抗体/可激活抗体，其中在没有干扰抗体/可激活抗体中任何链内二硫键的情况下，抗体/可激活抗体中至少一个链间二硫键已经用还原剂还原，其中可激活抗体包含：特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，抑制处于未切割状态的可激活抗体的AB与CD147靶标结合的掩蔽部分(MM)，和与AB偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽。在一些实施方式中，MM由CM与AB偶联。在一些实施方式中，抗体/可激活抗体的一个或多个链间二硫键不受还原剂干扰。在一些实施方式中，抗体/可激活抗体内MM的一个或多个链内二硫键不受还原剂干扰。在一些实施方式中，处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方式中，还原剂是TCEP。
在其他实施方式中，还原和偶联试剂(例如药物)与CD147抗体/CD147可激活抗体产生放置试剂的选择性的方法通过提供具有限定数量和位置的赖氨酸和/或半胱氨酸残基的可激活CD147抗体。在一些实施方式中，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的限定数量高于或低于亲本抗体或可激活抗体氨基酸序列中相应残基的数量。在一些实施方式中，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的限定数量可能产生可以与CD147抗体或可激活CD147抗体偶联的限定数量的试剂当量。在一些实施方式中，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的限定数量可能产生可以位点特异性的方式与CD147抗体或可激活CD147抗体偶联的限定数量的试剂当量。在一些实施方式中，修饰的可激活抗体经一种或多种非天然氨基酸以位点特异性的方式修饰，因此在一些实施方式中，限制试剂仅与非天然氨基酸的位点偶联。在一些实施方式中，具有限定数量和位置的赖氨酸和/或半胱氨酸残基的CD147抗体或可激活CD147抗体可以用本文所讨论的还原剂部分还原，因此可激活抗体掩蔽部分或其他非AB部分中的任何偶联位点不被还原，并将试剂与AB中的链间巯基偶联。
本公开还提供了部分还原的可激活抗体，其中在没有干扰可激活抗体中任何链内二硫键的情况下，可激活抗体中至少一个链间二硫键已经用还原剂还原，其中可激活抗体包含：特异性结合靶标(例如，CD147)的抗体或其抗原结合片段(AB)，抑制处于未切割状态的可激活抗体的AB与靶标结合的掩蔽部分(MM)，和与AB偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为至少一种蛋白酶底物的多肽。在一些实施方式中，MM由CM与AB偶联。在一些实施方式中，可激活抗体的一个或多个链内二硫键不受还原剂干扰。在一些实施方式中，可激活抗体内MM的一个或多个链内二硫键不受还原剂干扰。在一些实施方式中，处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方式中，还原剂是TCEP。
在一些实施方式中，使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头或马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头连接试剂与AB。在一些实施方式中，使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头连接试剂与AB。在一些实施方式中，使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头连接试剂与AB。在一些实施方式中，试剂是使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头与AB连接的单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，并且该接头负载结构在本文被称之为“vc-MMAD”。在一些实施方式中，试剂是使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头与AB连接的单甲基澳瑞他汀E(MMAE),并且所述接头负载结构在本文被称之为“vc-MMAE”。在一些实施方式中，使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头连接试剂与AB。在一些实施方式中，试剂是使用马来酰亚胺二-PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头与AB连接的单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，并且所述接头负载结构在本文被称之为“PEG2-vc-MMAD”。
vc-MMAD、vc-MMAE和PEG2-vc-MMAD的结构如下所示：
vc-MMAD：
Figure BDA0002266538730001071
vc-MMAE：
Figure BDA0002266538730001081
PEG2-vc-MMAD：
Figure BDA0002266538730001082
本公开还提供了偶联可激活抗体，其包含与单甲基澳瑞他汀D(MMAD)负载连接的可激活抗体，其中可激活抗体包含特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)，抑制处于未切割状态的可激活抗体的AB与靶标的结合的掩蔽部分(MM)，和与AB偶联的可切割部分(CM)，并且所述CM是作为至少一种MMP蛋白酶的底物的多肽。
在一些实施方式中，MMAD偶联的可激活抗体可以使用将试剂与AB连接的多种方法中的任一种偶联：(a)连接AB的糖部分，或(b)连接AB的巯基基团，或(c)连接AB的氨基基团，或(d)连接AB的羧酸基团。
在一些实施方式中，MMAD负载经由接头与AB偶联。在一些实施方式中，MMAD负载经由接头与AB中的半胱氨酸偶联。在一些实施方式中，MMAD负载经由接头与AB中的赖氨酸偶联。在一些实施方式中，MMAD负载经由接头与AB中的另一残基偶联，诸如本文所公开的那些残基。在一些实施方式中，接头是包含巯基的接头。在一些实施方式中，接头是可切割接头。在一些实施方式中，接头是不可切割接头。在一些实施方式中，接头选自表7和8中所示的接头。在一些实施方式中，可激活抗体和MMAD负载经由马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施方式中，可激活抗体和MMAD负载经由马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施方式中，可激活抗体和MMAD负载经由马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头连接。在一些实施方式中，可激活抗体和MMAD负载经由马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头连接。在一些实施方式中，MMAD负载使用本文所公开的部分还原和偶联技术与AB偶联。
在一些实施方式中，本公开接头的聚乙二醇(PEG)组分由2个乙二醇单体、3个乙二醇单体、4个乙二醇单体、5个乙二醇单体、6个乙二醇单体、7个乙二醇单体、8个乙二醇单体、9个乙二醇单体或至少10个乙二醇单体形成。在本公开的一些实施方式中，PEG组分是支化聚合物。在本公开的一些实施方式中，PEG组分是未支化聚合物。在一些实施方式中，PEG聚合物组分经氨基基团或其衍生物、羧基基团或其衍生物或氨基基团或其衍生物和羧基基团或其衍生物两种官能化。
在一些实施方式中，本公开接头的PEG组分是氨基-4-乙二醇-羧基基团或其衍生物。在一些实施方式中，本公开接头的PEG组分是氨基-3-乙二醇-羧基基团或其衍生物。在一些实施方式中，本公开接头的PEG组分是氨基-2-乙二醇-羧基基团或其衍生物。在一些实施方式中，氨基衍生物是在氨基基团和其偶联的羧基基团之间形成酰胺键。在一些实施方式中，羧基衍生物在羧基基团和其偶联的氨基基团之间形成酰胺键。在一些实施方式中，羧基衍生物是在羧基基团和其偶联的羟基基团之间形成酯键。
所述抗体与细胞毒剂的偶联可利用多种双功能蛋白偶联剂完成，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸盐(SPDP)、亚氨基四氢噻吩(IT)、亚胺酸酯的双功能衍生物(如己二酸亚氨酸二甲酯HCL)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按Vitetta等Science,238:1098(1987)所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰苄基-3-亚甲二氧基三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于偶联放射性核素与抗体的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。
表6列出了可以用于本文所述公开的示例性药剂，但并不旨在表示穷尽式列表。
表6：用于偶联的示例性药剂
Figure BDA0002266538730001101
Figure BDA0002266538730001111
本领域普通技术人员应认识到可将大量可能的部分偶联至本公开的所得抗体。(参加例如“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology and Immunology(《“偶联疫苗”，对微生物学和免疫学的贡献》)，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr编，卡吉尔出版社(Carger Press)，纽约，(1989)，其全部内容通过引用全文纳入本文)。
可通过能够使两种分子结合的任意化学反应完成偶联，前提是抗体和其他部分保持其各自的活性。该连接可以包括许多化学机制，例如，共价结合、亲和结合、插入、配位结合和络合。在一些实施方式中，然而，结合是共价结合。可通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的整合完成共价结合。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子(如本公开的抗体)偶联至其他分子。例如，代表性偶联剂可包括有机化合物，如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和1,6-己二胺。该列表并不旨在穷尽本领域已知的各种类型的偶联剂，而是多种常见偶联剂的示例。参见Killen和Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等，Immunological Reviews 62:185-216(1982)；以及Vitetta等，Science 238:1098(1987)。
在一些实施方式中，除了本文所提供的组合物和方法，还可以通过插入修饰的氨基酸序列或以其他方式包含在可激活抗体序列中修饰可激活抗体用于位点特异性偶联。这些修饰的氨基酸序列被设计成允许偶联的可激活抗体内偶联的试剂的受控放置和/或剂量。例如，可激活抗体可以经工程改造以在轻链和重链上的位置包含半胱氨酸取代，所述轻链和重链提供反应性巯基基团并且不对蛋白质折叠和组装有负面影响或改变抗原结合。在一些实施方式中，可激活抗体可以经工程改造以包含或以其他方式导入可激活抗体内一个或多个非天然氨基酸残基以提供合适的位点用于偶联。在一些实施方式中，可激活抗体可以经工程改造以包含或以其他方式导入可激活抗体序列内酶促可激活的肽序列。
合适的接头在文献中描述。(参见例如，Ramakrishnan,S.等Cancer Res.44:201-208(1984)描述了MBS(M-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途。同样参见美国专利号5,030,719，描述了通过寡肽接头的方式与抗体偶联的卤化乙酰基酰肼衍生物的用途。在一些实施方式中，合适的接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(Pierce化学公司(Pierce Chem.Co.)，目录号(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce化学公司，目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸盐(Pierce化学公司，目录号2165-G)；和(v)与EDC偶联的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce化学公司，目录号24510)。其他接头包括但不限于，SMCC((琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)，磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)，SPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)，或磺基-SPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯)。
上述接头包含具有不同属性的组分，因此导致偶联物具有不同物理化学性质。例如，烷基羧化物的磺基-NHS酯比芳香族羧化物的磺基-NHS酯更稳定。包含接头的NHS-酯的溶解性低于磺基-NHS酯。此外，接头SMPT包含空间位阻的二硫键，并可形成稳定性增加的偶联物。二硫连接通常不如其他键稳定，因为二硫连接被体外切割，产生较少的偶联物。磺基-NHS特别能够增强碳二亚胺偶联的稳定性。与磺基-NHS联用时碳二亚胺偶联(如EDC)形成对水解的耐受力大于单独碳二亚胺偶联反应的酯。
在一些实施方式中，接头是可切割的。在一些实施方式中，接头是不可切割的。在一些实施方式中，存在两种或更多种接头。两种或更多种接头都是相同的，即，可切割的或不可切割的，或者两种或更多种接头是不同的，即，至少一种为可切割的并且至少一种为不可切割的。
本公开利用多种方法连接试剂与AB：(a)连接AB的糖部分，或(b)连接AB的巯基基团，或(c)连接AB的氨基基团，或(d)连接AB的羧酸基团。根据本公开，AB可以通过中间体接头共价连接试剂，所述中间体接头具有至少两个反应基团，一个与AB反应而一个与试剂反应。可以选择包含任何相容有机化合物的接头，从而使与AB(或试剂)的反应不对AB反应性和选择性产生负面影响。此外，接头与试剂的连接可能并不破坏试剂的活性。与氧化的抗体或氧化的抗体片段反应的合适接头包括含有选自下述胺的那些：伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和硫代氨基脲基团。这类反应性官能团可能作为接头结构的部分存在，或者可以通过适当化学修饰不含这类基团的接头导入。
根据本公开，用于连接还原的AB的合适接头包括具有能够与还原的抗体或片段的巯基基团反应的某些反应性基团的那些。这些反应性接团包括但不限于：反应性卤代烷基基团(包括，例如，卤代乙酰基)，对巯基苯甲酸酯基团和能够进行迈克尔型加成反应的基团(包括例如，Mitra和Lawton,1979,J.Amer.Chem.Soc.101:3097-3110所述类型的基团和马来酰亚胺)。
根据本公开，用于连接非氧化的或还原的Ab的合适接头包括具有能够与Ab中未修饰的赖氨酸残基中存在的伯氨基基团反应的某些官能团的那些。这类反应性基团包括但不限于，NHS羧酸或碳酸酯，磺基-NHS羧酸或碳酸酯，4-硝基苯基羧酸或碳酸酯，五氟苯基羧酸或碳酸酯，酰基咪唑，异氰酸酯和异硫氰酸酯。
根据本公开，用于连接非氧化的或还原的Ab的合适接头包括具有能够与Ab中天冬氨酸或谷氨酸残基中存在的羧酸基团反应的某些官能团的那些。合适的激活试剂包括EDC，添加或不添加NHS或磺基-NHS，和其他用于羧酰胺形成的脱水剂。在这些示例中，存在于合适接头的官能团将包括伯和仲胺，肼，羟胺，和肼。
接头连接AB之前或之后，试剂可以连接接头。在某些应用中，可能需要首先产生AB-接头中间体，其中接头不含有相关的试剂。取决于具体应用，然后特定试剂可以与接头共价连接。在一些实施方式中，出于偶联目的，AB首先连接MM、CM和相关接头，然后连接接头。
支化接头：在特定实施方式中，利用支化接头，所述支化接头具有多个位点用于连接试剂。对于多位点接头，单一共价连接AB将产生能够在多个位点结合试剂的AB-接头中间物。该位点可以是试剂可以连接的醛或巯基基团或任何化学位点。
在一些实施方式中，较高的特异性活性(或试剂与AB较高的比例)可以通过在AB上的多个位点连接单一位点实现。可以通过两种方法之一将所述多个位点导入AB。第一种，可以在相同的AB中生成多个醛基团和/或巯基基团。第二种，可以将AB的醛或巯基与具有用于后续连接接头的多个功能性位点的“支化接头”连接。多位点接头或支化接头的功能性位点可以是醛或巯基基团，或者可以是接头可以与其连接的任何化学位点。通过将这两种方式组合，也就是在AB的数个位点上连接多位点接头可以获得仍然较高的特异性活性。
可切割接头：肽接头易被补体系统的酶切割，例如但不限于，u-纤溶酶原激活物，组织纤溶酶原激活物，胰蛋白酶，纤溶酶或具有蛋白水解活性的其他酶可以用于本公开的一个实施方式。根据本公开的一种方法，试剂经由易被补体切割的接头连接。抗体选自可激活补体的类别。因此，抗体-试剂偶联物激活补体级联并在靶位点释放试剂。根据本公开的另一种方法，试剂经由接头连接，所述接头易被具有蛋白质水解活性的酶切割，诸如u-纤溶酶原激活物，组织纤溶酶原激活物，胰蛋白酶或纤溶酶。这些可切割接头能够用于含有胞外毒素(例如，作为非限制性示例，表6中示出的任何胞外毒素)的偶联可激活抗体。
表7中提供了可切割接头序列的非限制性示例。
表7：用于偶联的示例性接头序列
Figure BDA0002266538730001151
此外，试剂可以经由二硫键(例如，半胱氨酸分子上的二硫键)与AB连接。因为许多肿瘤自然释放高水平的谷胱甘肽(一种还原剂)，这可以还原二硫键，并随后在递送的位点释放试剂。在一些实施方式中，将修饰CM的还原剂还将修饰偶联可激活抗体的接头。
间隔子和可切割元件：在一些实施方式中，可能有必要以这样的方式构建接头以优化试剂和可激活抗体的AB之间的间隔。这可以通过使用通用结构的接头实现：
W–(CH2)n–Q
其中，
W是--NH--CH2--或者--CH2--；
Q是氨基酸，肽；并且
n是0-20的整数。
在一些实施方式中，接头可以包含间隔子元件和可切割元件。间隔子元件用作将可切割元件放置于远离AB的核心位置，从而使可切割元件更易于接近负责切割的酶。上述某些支化接头可以用作间隔子元件。
该讨论的内容中，应当理解的是接头与试剂(或间隔子元件与可切割元件，或可切割元件与试剂)的连接不需要是特定模式的连接或反应。提供具有合适稳定性和生物相同性的产品的任何反应都是可以接受的。
接头的选择和血清补体：根据本公开的一种方法，当需要释放试剂时，使用这样的AB，所述AB是可以激活补体的一类抗体。所得偶联物保留结合抗原并激活补体级联的能力。因此，根据本公开的该实施方式，试剂与可切割接头或可切割元件的一端连接，而接头基团的另一端与AB上的特定位点连接。例如，如果试剂具有羟基基团或氨基基团，其可以经由酯键或酰胺键分别连接肽，氨基酸或其他合适选择接头的羧基末端。例如，这类试剂可以经由二亚胺反应与接头肽连接。如果试剂包含将干扰接头连接的官能团，那么可以在连接前阻断这些干扰性官能团并在偶联物或中间体产物产生后去阻断。然后直接使用接头的相对或氨基末端或在进一步修饰后用于与能够激活补体的AB结合。
接头(或接头的间隔子元件)可以是任何所需长度，其一端可以共价连接可激活抗体AB上的特定位点。接头或间隔子元件的另一端可以连接氨基酸或肽接头。
因此，当这些偶联物在补体存在的情况下结合抗原时，将试剂与接头连接的酰胺或酯键将被切割，导致试剂以其活化形式释放。当给予对象时，这些偶联物将实现在靶位点递送和释放试剂，并且对体内递送药剂、抗生素、抗代谢物、抗增殖剂等(如表6中所示的那些，但不限于此)特别有效
无需补体激活即可释放的接头：靶向递送的另一应用中，需要在不不存在补体激活的情况下释放试剂，因为补体级联的激活将最终裂解靶细胞。因此，所述方法能够用于当递送和释放试剂应当在不存在杀伤靶细胞的情况下完成时。当需要递送细胞介导物诸如激素、酶、类固醇、神经传递素、基因或酶至靶细胞时，这便是目标。这些偶联物可以通过将试剂与不能够激活补体的AB经由接头连接制备，所述接头对于被血清蛋白酶切割中度易感。当将所述偶联物给予个体时，抗原-抗体复合物将快速形成，然后试剂的切割将缓慢发生，因此导致靶位点处化合物的释放。
生化交联接头：在一些实施方式中，可激活抗体可以使用某些生化交联接头与一种或多种治疗剂偶联。交联试剂形成将两种不同分子的官能团栓系在一起的分子桥。为了以分步的方式连接两种不同的蛋白质，可以使用将消除不需要的均聚物形成的异-双功能性交联剂。
还可以使用能够被溶酶体蛋白酶切割的肽基接头，例如，Val-Cit、Val-Ala或其他二肽。此外，可以使用在溶酶体的低-pH环境中可切割的酸不稳定的接头，例如：双-唾液酸化醚。其他合适的接头包括组织蛋白酶-不稳定的底物，特别是在酸性pH下显示优化功能的那些。
示例性的异-双功能性交联接头参照表8。
表8：示例性的异-双功能性交联接头
Figure BDA0002266538730001171
Figure BDA0002266538730001181
不可切割接头或直接连接：在本公开的一些实施方式中，可以设计偶联，从而将试剂递送至靶标但是不释放。这可以通过将试剂与AB直接连接或经由不可切割接头连接实现。
这些不可切割接头可以包含氨基酸、肽、D-氨基酸或可以经修饰以包含官能团的其他有机化合物，所述官能团后续可以被用于通过本文所述的方法连接AB。有机接头的通式可以是：
W–(CH2)n–Q
其中，
W是--NH--CH2--或者--CH2--；
Q是氨基酸，肽；并且
n是0-20的整数。
不可切割偶联：在一些实施方式中，化合物可以与不激活补体的AB连接。当使用不能够实现补体激活的AB时，所述连接可以使用易于被激活的补体切割的接头或者使用不易于被激活的补体切割的接头实现。
本文所公开的抗体还可以配制成免疫脂质体。可通过本领域已知方法制备含有抗体的脂质体，这些方法参见例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545。美国专利号5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。
可通过反相蒸发方法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。使脂质体通过孔隙大小确定的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。可以如Martin等，J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)所述，通过二硫互换反应将本公开抗体的Fab’片段偶联于脂质体。
CD147抗体药物偶联物和CD147可激活抗体药物偶联物
在一些实施方式中，抗体药物偶联物(ADC)和可激活抗体药物偶联物(AADC)可以包含一种或多种多肽，所述多肽包含表9给定行中轻链序列或轻链可变结构域序列、和重链序列或重链可变结构域序列、接头、和毒素的组合，或者表9的轻链序列或轻链可变结构域序列、和重链序列或重链可变结构域序列、接头和毒素的任何组合。例如，组合序号1包含重链SEQ ID No.1、轻链SEQ ID No.5、vc接头、偶联于MMAD毒素。
表9:CD147 ADC和CD147可激活ADC组合
Figure BDA0002266538730001191
Figure BDA0002266538730001201
Figure BDA0002266538730001211
Figure BDA0002266538730001221
Figure BDA0002266538730001241
Figure BDA0002266538730001251
本公开的抗体药物偶联物(ADC)或本公开的可激活抗体药物偶联物(AADC)可以包含一种或多种多肽，所述多肽包含表9给定行中的氨基酸序列、接头和毒素的组合。因此，本文提供了本公开的抗体药物偶联物(ADC)或本公开的可激活抗体药物偶联物(AADC)，其包含给定行中所列或以特定组合提供的氨基酸序列、接头和毒素的组合。例如，本公开的可激活抗体偶联物可以包含组合序号20的氨基酸序列，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:19的重链、具有氨基酸序列SEQ ID NO:262的轻链，和spdb-DM4接头-毒素。在本文所述并公开的AADC的另一示例中，本公开的可激活抗体偶联物可以包含组合序号70的氨基酸序列，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:19的重链、具有氨基酸序列SEQ ID NO:261的轻链，和spdb-DM4接头-毒素。
列出重链和轻链可变区的表9中的任意组合可以与人免疫球蛋白恒定区组合以生产完整人IgG，包括IgG1、IgG2、IgG4，或与突变的恒定区组合以产生具有改变的功能的IgG，例如，IgG1 N297A、IgG1 N297Q或IgG4 S228P。表9中所述组合并不限于任何给定行中所示的特定组合，并且因此可以包含来自表9第2列的任何重链序列或重链可变区序列，与来自表9第3列的任何轻链序列或轻链可变区序列组合，与来自第4列的任何接头组合，与来自第5列的任何毒素组合。除了第2列中所列的重链序列或重链可变区序列，本文所公开的任何重链序列或重链可变区序列都可以用于组合。除了第3列中所列的轻链序列或轻链可变区序列，本文所公开的任何轻链序列或轻链可变区序列都可以用于组合。除了第4列中所列的接头，本文所公开的任何接头都可以用于组合。除了第5列中所列的毒素，本文所公开的任何毒素都可以用于组合。
多特异性抗体和可激活抗体
在一些实施方式中，可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体是单特异性的。在一些实施方式中，可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体是多特异性的，例如，作为非限制性的示例，双特异性或三功能性。
在一些实施方式中，将可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体配制成促双特异性T细胞接合(BITE)分子的部分。在一些实施方式中，将可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体配制成促嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞或其他工程改造的受体的部分。
本公开相应地还提供了多特异性CD147抗体。本文所提供的多特异性抗体是识别CD147和至少一种或多种不同抗原或表位的多特异性抗体。
本公开相应地还提供了多特异性可激活CD147抗体。本文所提供的多特异性可激活抗体是多特异性抗体，其识别CD147和至少一种或多种不同的抗原或表位，并且其包含与多特异性抗体的至少一个抗原-或表位-结合结构域连接的至少一个掩蔽部分(MM)，因此MM的偶联降低抗原-或表位-结合结构域与其靶标结合的能力。在一些实施方式中，MM经由作为至少一种蛋白酶底物的可切割部分(CM)与多特异性抗体的抗原-或表位-结合结构域偶联。本文所提供的可激活多特异性抗体在循环中是稳定的，在疗法和/或诊断的预期部位是激活的，但在正常的即健康组织中并不是激活的，并且当激活时，展现出与对应的未修饰的多特异性抗体至少相当的靶标结合。
在一些实施方式中，可激活抗体或其抗原结合片段被纳入多特异性可激活抗体或其抗原结合片段，其中多特异性可激活抗体的至少一个臂特异性地结合CD147。在一些实施方式中，可激活抗体或其抗原结合片段被纳入双特异性抗体或其抗原结合片段，其中双特异性可激活抗体的至少一个臂特异性地结合CD147。
在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段被纳入多特异性抗体或其抗原结合片段，其中多特异性抗体或其抗原结合片段的至少一个臂特异性地结合CD147。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段被纳入双特异性抗体或其抗原结合片段，其中双特异性抗体或其抗原结合片段的至少一个臂特异性地结合CD147。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含选自SEQ ID NO:1-3的重链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含选自SEQ ID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含选自SEQ ID NO:5-8的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含选自SEQ ID NO:1-4的重链可变区氨基酸序列和选自SEQID NO:5-9的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含选自SEQ ID NO:1-3的重链可变区氨基酸序列和选自SEQID NO:5-8的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含与选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的重链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含与选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的重链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含与选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含与选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性，而所述轻链可变区氨基酸序列与选自SEQ IDNO:5-9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性，而所述轻链可变区氨基酸序列与选自SEQ IDNO:5-8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含这样的组合：可变重链互补决定区1(VH CDR1，本文也称之为CDRH1)序列，可变重链互补决定区2(VH CDR2，本文也称之为CDRH2)序列，可变重链互补决定区3(VH CDR3，本文也称之为CDRH3)序列，可变轻链互补决定区1(VL CDR1，本文也称之为CDRL1)序列，可变轻链互补决定区2(VL CDR2，本文也称之为CDRL2)序列和可变轻链互补决定区3(VL CDR3，本文也称之为CDRL3)序列，其中至少一个互补决定区(CDR)序列选自：具有氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VH CDR1序列；具有氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2序列；具有氨基酸序列AGTDY(SEQID NO:13)的VH CDR3序列；具有氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)的VL CDR1序列；具有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列；和具有氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)的VL CDR3。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中至少一个CDR序列选自：VH CDR1序列，其包含与具有氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)的VH CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VHCDR2序列，其包含与具有氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)的VH CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR3序列，其包含与具有氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)的VH CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR1序列，其包含与具有氨基酸序列ASSSVYYMY(SEQ ID NO:12)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO:13)的VL CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR2序列，其包含与具有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)的VL CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；和VLCDR3序列，其包含与具有氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)的VL CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，VH CDR1序列包含氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ IDNO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列包含氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQ IDNO:12)；VH CDR3序列包含氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列包含氨基酸序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列包含氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列包含氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列包含与氨基酸序列GFTFSNYWMN(SEQ IDNO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR2序列包含与氨基酸序列EIRLKSYNYATH(SEQID NO:12)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR3序列包含与氨基酸序列AGTDY(SEQ ID NO:13)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR1序列包含与具有氨基酸序列ASSSVYYMY(SEQ ID NO:14)或CRASSSVYYMY(SEQ ID NO:15)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR2序列包含与具有氨基酸序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；和VL CDR3序列包含与具有氨基酸序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含重链或重链可变区，其包含或源自表1中所示的重链氨基酸序列或重链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含轻链或轻链可变区，其包含或源自表1中所示的轻链氨基酸序列或轻链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含重链或重链可变区氨基酸序列和轻链或轻链可变区氨基酸序列，所述重链或重链可变区氨基酸序列包含或源自表1中所示的重链氨基酸序列或重链可变区氨基酸序列，而所述轻链或轻链可变区氨基酸序列包含或源自表1中所示的轻链氨基酸序列或轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含与选自表1中所示重链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的重链可变区氨基酸序列。在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含与选自表1中所示轻链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含与选自表1所示重链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性的氨基酸序列以及与选自表1所示轻链可变区序列的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含这样的组合：可变重链互补决定区1(VH CDR1，本文也称之为CDRH1)序列，可变重链互补决定区2(VH CDR2，本文也称之为CDRH2)序列，可变重链互补决定区3(VH CDR3，本文也称之为CDRH3)序列，可变轻链互补决定区1(VL CDR1，本文也称之为CDRL1)序列，可变轻链互补决定区2(VL CDR2，本文也称之为CDRL2)序列，和可变轻链互补决定区3(VL CDR3，本文也称之为CDRL3)序列，其中至少一种CDR序列选自表2中所示的VHCDR1序列；表2中所示的VH CDR2序列；表2中所示的VH CDR3序列；表2中所示的VL CDR1序列；表2中所示的VL CDR2序列；和表2中所示的VL CDR3序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中至少一个CDR序列选自：VH CDR1序列，其包含与表2中所示VH CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR2序列，其包含与与表2中所示VH CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VH CDR3序列，其包含与与表2中所示VH CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR1序列，其包含与与表2中所示VL CDR1序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；VL CDR2序列，其包含与与表2中所示VL CDR2序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列；和VL CDR3序列，其包含与表2中所示VL CDR3序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，所述组合是在表2中一行所示的6种CDR序列(VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含轻链可变区，所述轻链可变区含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，所述组合是表2中一行所示3种轻链CDR序列(VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3)的组合。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含重链可变区，所述轻链可变区含有VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中，所述组合是表2中一行所示3种重链CDR序列(VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3)的组合。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，所述组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示的6种CDR序列(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含重链可变区，所述重链可变区含有VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中，所述组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示的3种重链CDR序列(VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体或其抗原结合片段(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)的至少一个臂包含轻链可变区，所述轻链可变区含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中，所述组合中的各CDR序列包含与表2中一行所示的3种轻链CDR序列(VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合中对应的CDR序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的序列。
在一些实施方式中，多特异性抗体/可激活抗体被设计成接合(engage)免疫效应细胞，在本文也称之为接合免疫-效应细胞的多特异性可激活抗体。在一些实施方式中，多特异性抗体/可激活抗体被设计成接合白细胞，在本文也称之为接合白细胞的多特异性可激活抗体。在一些实施方式中，多特异性抗体/可激活抗体被设计成接合T细胞，在本文也称之为接合T细胞的多特异性抗体/可激活抗体。在一些实施方式中，多特异性抗体/可激活抗体接合白细胞上诸如T细胞上、天然杀伤(NK)细胞上、骨髓单核细胞上、巨噬细胞上和/或另一免疫效应细胞上的表面抗原。在一些实施方式中，免疫效应细胞是白细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是单核细胞，诸如骨髓单核细胞。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体被设计成结合或以其他方式与超过一种靶标和/或超过一种表位(在本文中也称之为靶向多重抗原的可激活抗体)相互作用。本文所用术语“靶标”和“抗原”可以互换使用。
在一些实施方式中，本公开接合免疫效应物细胞的多特异性可激活抗体包含结合C147的靶向抗体或其抗原结合片段和接合免疫效应细胞的抗体或其抗原结合部分，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或接合抗体或其抗原结合部分的免疫效应物细胞中的至少一种被掩蔽。在一些实施方式中，接合免疫效应物细胞的抗体或其抗原结合片段包含第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一接合免疫效应细胞的靶标，其中AB1连接掩蔽部分(MM1)，从而使MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力。在一些实施方式中，靶向抗体或其抗原结合片段包含第二抗体或其片段，其包含结合CD147的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2连接掩蔽部分(MM2)，从而使MM2的偶联降低AB2结合CD147的能力。在一些实施方式中，接合免疫效应细胞的抗体或其抗原结合片段包含第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合接合第一免疫效应细胞，其中所述AB1连接掩蔽部分(MM1)，从而使MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，并且靶向抗体或其抗原结合片段包含第二抗体或其片段，其包含结合CD147的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2连接掩蔽部分(MM2)，从而使MM2的偶联降低AB2结合CD147的能力。在一些实施方式中，接合非免疫效应细胞的抗体是癌症靶抗体。在一些实施方式中，非免疫细胞效应抗体是IgG。在一些实施方式中，接合抗体的免疫效应细胞是scFv。在一些实施方式中，CD147-靶抗体(例如，非免疫细胞效应抗体)是IgG，而接合抗体的免疫效应细胞是scFv。在一些实施方式中，免疫效应细胞是白细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是骨髓单核细胞。
在一些实施方式中，本公开的接合T细胞的多特异性可激活抗体包含CD147-靶向抗体或其抗原结合片段和接合T细胞的抗体或其抗原结合部分，其中CD147-靶向抗体或其抗原结合片段和/或接合T细胞的抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方式中，接合T细胞的抗体或其抗原结合片段包含第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一接合T细胞的靶标，其中AB1连接掩蔽部分(MM1)，从而使MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力。在一些实施方式中，靶向抗体或其抗原结合片段包含第二抗体或其片段，其包含结合CD147的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2连接掩蔽部分(MM2)，从而使MM2的偶联降低AB2结合CD147的能力。在一些实施方式中，接合T细胞的抗体或其抗原结合片段包含第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一接合T细胞的靶标，其中所述AB1连接掩蔽部分(MM1)，从而使MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，并且靶向抗体或其抗原结合片段包含第二抗体或其片段，其包含结合CD147的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2连接掩蔽部分(MM2)，从而使MM2的偶联降低AB2结合CD147的能力。
在接合免疫效应物细胞的多特异性抗体/可激活抗体的一些实施方式中，一种抗原是CD147，而另一种抗原通常是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其他免疫效应细胞表面存在的刺激性或抑制性受体，诸如但不限于B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA。在一些实施方式中，抗原是T细胞或NK细胞表面存在的刺激性受体；这类刺激性受体的示例包括但不限于CD3、CD27、CD28、CD137(也称之为4-1BB)、GITR、HVEM、ICOS、NKG2D和OX40。在一些实施方式中，抗原是T细胞表面存在的抑制性受体；这类抑制性受体的示例包括但不限于，BTLA、CTLA-4、LAG3、PD-1、TIGIT、TIM3和NK表达的KIR。赋予T细胞表面抗原特异性的抗体结构域还可以被配体或配体结构域取代，所述配体或配体结构域结合T细胞受体、NK细胞受体、巨噬细胞受体和/或免疫效应细胞受体，例如但不限于，B7-1、B7-2、B7H3、PDL1、PDL2或TNFSF9。
在一些实施方式中，接合T细胞的多特异性可激活抗体包含抗-CD3ε(CD3ε，本文也称之为CD3e和CD3)scFv和靶向抗体或其抗原结合片段，其中抗-CD3εscFv和/或靶向抗体或其抗原结合部分中的至少一个被掩蔽。在一些实施方式中，CD3εscFv包含结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1连接掩蔽部分(MM1)，因此MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方式中，靶向抗体或其抗原结合片段包含第二抗体或其片段，其包含结合CD147的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2连接掩蔽部分(MM2)，从而使MM2的偶联降低AB2结合CD147的能力。在一些实施方式中，CD3εscFv包含结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中所述AB1连接掩蔽部分(MM1)，从而使MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，并且靶向抗体或其抗原结合片段包含第二抗体或其片段，其包含结合CD147的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2连接掩蔽部分(MM2)，从而使MM2的偶联降低AB2结合CD147的能力。
在一些实施方式中，多重靶向抗体和/或多重抗原靶向可激活抗体至少包含结合第一靶标和/或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段以及结合第二靶标和/或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，多重抗原靶向抗体和/或多重抗原靶向可激活抗体结合两种或更多种不同靶标。在一些实施方式中，多重抗原靶向抗体和/或多重抗原靶向可激活抗体结合相同靶标上的两种或更多种不同表位。在一些实施方式中，多重抗原靶向抗体和/或多重抗原靶向可激活抗体结合相同靶标上的两种或更多种不同表位和两种或更多种不同靶标的组合。
在一些实施方式中，包含IgG的多特异性可激活抗体具有掩蔽的IgG可变结构域。在一些实施方式中，包含scFv的多特异性可激活抗体具有掩蔽的scFv结构域。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域，其中至少一个IgG可变结构域偶联掩蔽部分。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体具有IgG可变结构域和scFv抗体，其中至少一个scFv结构域偶联掩蔽部分。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域，其中至少一个IgG可变结构域偶联掩蔽部分并且至少一个scFv结构域偶联掩蔽部分。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域，其中IgG可变结构域和scFv结构域各自偶联其各自的掩蔽部分。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体的一个抗体结构域对靶抗原具有特异性，而另一个抗体结构域对T细胞表面抗原具有特异性。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体的一个抗体结构域对靶抗原具有特异性，而另一个抗体结构域对另一个靶抗原具有特异性。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体的一个抗体结构域对靶抗原的表位具有特异性，而另一个抗体结构域对该靶抗原的另一表位具有特异性。
在多特异性可激活抗体中，scFv可以融合IgG可激活抗体重链的羧基末端，融合IgG可激活抗体轻链的羧基末端，或者融合IgG可激活抗体重链和轻链的羧基末端。在多特异性可激活抗体中，scFv可以融合IgG可激活抗体重链的氨基末端，融合IgG可激活抗体轻链的氨基末端，或者融合IgG可激活抗体重链和轻链的氨基末端。在多特异性可激活抗体中，scFv可以融合IgG可激活抗体的一个或多个羧基末端和一个或多个氨基末端的任意组合。在一些实施方式中，连接可切割部分(CM)的掩蔽部分(MM)连接并掩蔽IgG的抗原结合结构域。在一些实施方式中，连接可切割部分(CM)的掩蔽部分(MM)连接并掩蔽至少一个scFv的抗原结合结构域。在一些实施方式中，连接可切割部分(CM)的掩蔽部分(MM)连接并掩蔽IgG的抗原结合结构域，而连接可切割部分(CM)的掩蔽部分(MM)连接并掩蔽至少一个scFv的抗原结合结构域。
本公开提供了多特异性可激活抗体结构的示例，其包括但不限于下述：
(VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2；
(VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2；
(MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2；
(MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2；
(VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2；
(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2；
(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:
(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:
(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:
(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:
(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:
(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:
(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:
(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2:
(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:
(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:
(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；
(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:
(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2；或
(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2，其中：VL和VH表示IgG中包含的第一特异性的轻和重可变结构域；VL*和VH*表示scFv中包含的第二特异性的可变结构域；L1是连接掩蔽部分(MM)和可切割部分(CM)的接头肽；L2是连接可切割部分(CM)和抗体的接头肽；L3是连接scFv可变结构域的接头肽；L4是连接第一特异性的抗体与第二特异性的抗体的接头肽；CL是轻链恒定结构域；而CH1、CH2、CH3是重链恒定结构域。第一和第二特异性可以针对任何抗原或表位。
在接合T细胞的多特异性抗体/可激活抗体的一些实施方式中，一种抗原是CD147，而另一种抗原通常是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其他免疫效应细胞表面存在的刺激性(在本文中也称之为激活)或抑制性受体，诸如但不限于B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137(也称之为TNFRSF9)、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA。赋予T细胞表面抗原特异性的抗体结构域还可以被配体或配体结构域取代，所述配体或配体结构域结合T细胞受体、NK细胞受体、巨噬细胞受体和/或其他免疫效应细胞受体。
在一些实施方式中，靶向抗体是本文所公开的CD147抗体。在一些实施方式中，靶向抗体可以处于可激活抗体形式。在一些实施方式中，scFv可以处于Pro-scFv形式(参见例如，WO 2009/025846、WO 2010/081173)。
在一些实施方式中，scFv对结合CD3ε具有特异性并且包含或者源自结合CD3ε的抗体或其片段，例如，CH2527、FN18、H2C、OKT3、2C11、UCHT1或V9。在一些实施方式中，scFv对结合CTLA-4(本文也称之为CTLA和CTLA4)具有特异性。
在一些实施方式中，抗-CTLA-4scFv包括氨基酸序列：
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS(SEQ ID NO:643)
在一些实施方式中，抗-CTLA-4scFv包括与氨基酸序列SEQ ID NO:643具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，抗-CD3εscFv包括氨基酸序列：
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR(SEQ ID NO:644)
在一些实施方式中，抗-CD3εscFv包括与氨基酸序列SEQ ID NO:644具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，scFv对结合一种或多种T细胞、一种或多种NK细胞和/或一种或多种巨噬细胞具有特异性。在一些实施方式中，scFv对结合下述靶标具有特异性：B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA。
在一些实施方式中，多特异性抗体/可激活抗体还包含与AB偶联的试剂。在一些实施方式中，试剂是治疗剂。在一些实施方式中，试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方式中，试剂是毒素或其片段。在一些实施方式中，试剂经由接头与多特异性抗体/可激活抗体偶联。在一些实施方式中，试剂经由可切割接头与AB偶联。在一些实施方式中，接头是不可切割接头。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方式中，试剂是核酸破坏剂，如DNA烷化剂或DNA嵌入剂或其他DNA破坏剂。在一些实施方式中，接头是可切割接头。在一些实施方式中，试剂是选自表6中所列的试剂。在一些实施方式中，试剂是尾海兔素。在一些实施方式中，试剂是澳瑞他汀或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是澳瑞他汀E或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方式中，试剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。在一些实施方式中，试剂是美登木素或美登木素衍生物。在一些实施方式中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方式中，试剂是多卡霉素或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是卡奇霉素或其衍生物。在一些实施方式中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730001401
在一些实施方式中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730001402
二聚体。
在一些实施方式中，多特异性抗体/可激活抗体还包含可检测部分。在一些实施方式中，可检测部分是诊断剂。
在一些实施方式中，多特异性抗体/可激活抗体天然地包含一个或多个二硫键。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体可以经工程改造以包含一个或多个二硫键。
本公开还提供了编码本文所述多特异性抗体/可激活抗体的分离核酸分子，以及包含这些分离核酸序列的载体。本公开提供了通过在导致抗体/可激活抗体表达的条件下培养细胞产生多特异性抗体/可激活抗体的方法，其中所述细胞包含这类的核酸分子。在一些实施方式中，细胞包含这类载体。
本公开还提供了通过(a)在导致多特异性抗体表达的条件下培养含有编码多特异性抗体的核酸构建体的细胞来制造本公开多特异性CD147抗体的方法。
本公开还提供了制造本公开多特异性可激活CD147抗体的方法，所述方法通过(a)在导致多特异性可激活抗体表达的条件下培养含有编码多特异性可激活抗体的核酸构建体的细胞，和(b)回收多特异性可激活抗体。合适的AB、MM和/或CM包含本文所公开的任一种AB、MM和/或CM。
本公开还提供了多特异性可激活抗体和/或多特异性可激活抗体组合物，其包含至少一种特异性结合第一靶标或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)以及结合第二靶标或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中至少一种AB1偶联或以其他方式连接掩蔽部分(MM1)，从而使MM1的偶联降低AB1结合其靶标的能力。在一些实施方式中，MM1经由第一可切割部分(CM1)序列偶联AB1，所述CM1序列包含针对蛋白酶(例如，与AB1的靶标共定位于对象治疗部位或诊断部位的蛋白酶)的底物。本文所提供的多特异性可激活抗体在循环中是稳定的，在疗法和/或诊断的预期部位是激活的，但在正常的即健康组织中并不是激活的，并且当激活时，展现出与对应的未修饰的多特异性抗体至少相当的与AB1的靶标结合。合适的AB、MM和/或CM包含本文所公开的任一种AB、MM和/或CM。
本公开还提供了包含多特异性可激活抗体的组合物和方法，所述多特异性可激活抗体包含至少特异性结合靶标的第一抗体或抗体片段(AB1)和第二抗体或抗体片段(AB2)，其中多特异性可激活抗体中至少所述第一AB与降低AB1与其靶标结合能力的掩蔽部分(MM1)偶联。在一些实施方式中，各AB与降低其对应AB与各自靶标结合能力的掩蔽部分(MM)偶联。例如，在双特异性可激活抗体实施方式中，AB1与降低AB1与其靶标结合能力的第一掩蔽部分(MM1)偶联，而AB2与降低AB2与其靶标结合能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体包含超过两种AB区域；在一些是实施方式中，AB1与降低AB1与其靶标结合能力的第一掩蔽部分(MM1)偶联，AB2与降低AB2与其靶标结合能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联，AB3与降低AB3与其靶标结合能力的第三掩蔽部分(MM3)偶联，多特异性可激活抗体中各AB以此类推。合适的AB、MM和/或CM包含本文所公开的任一种AB、MM和/或CM。
在一些实施方式中，多特异性可激活抗体还包含至少一种可切割部分(CM)，所述CM是蛋白酶的底物，其中CM将MM连接到AB。例如，在一些实施方式中，多特异性可激活抗体包含至少特异性结合靶标的第一抗体或抗体片段(AB1)和第二抗体或抗体片段(AB2)，其中多特异性可激活抗体中至少所述第一AB经由第一可切割部分与降低AB1与其靶标结合能力的掩蔽部分(MM1)偶联。在一些双特异性可激活抗体实施方式中，AB1经由CM1与MM1偶联，而AB2经由第二可切割部分(CM2)与降低AB2与其靶标结合能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联。在一些实施方式中，多特异性可激活抗体包含超过两种AB区域；在一些是实施方式中，AB1经由CM1与MM1偶联，AB2经由CM2与MM2偶联，AB3经由第三可切割部分(MM3)与降低AB3与其靶标结合能力的第三掩蔽部分(MM3)偶联，多特异性可激活抗体中各AB以此类推。合适的AB、MM和/或CM包含本文所公开的任一种AB、MM和/或CM。
具有非结合空间部分或针对非结合空间部分结合伴侣的可激活抗体
本公开还提供了可激活抗体，其包含非结合空间部分(NB)或针对非结合空间部分的结合伴侣(BP)，其中BP将NB招募或吸引至可激活抗体。本文所提供的可激活抗体包括，例如，包含非结合空间部分(NB)、可切割接头(CL)或结合靶标的抗体或抗体片段(AB)的可激活抗体；包含针对非结合空间部分的结合伴侣、CL和AB的可激活抗体；和包含已招募NB的BP、CL、结合靶标的AB的可激活抗体。本文将这样的可激活抗体称之为“含有NB的可激活抗体”，其中的NB共价连接可激活抗体的CL和AB或者通过与共价连接可激活抗体的CL和AB的BP相互作用关联。述及可激活或可转换旨在表示，当可激活抗体处于抑制、掩蔽或未切割状态(即第一构象)时，可激活抗体展示出与靶标结合的第一水平，以及当可激活抗体处于未抑制、未掩蔽和/或切割状态(即第二构象，即激活的抗体)时与靶标结合的第二水平，其中靶标结合的第二水平大于靶标结合的第一水平。相较于常规抗体治疗，所述可激活抗体组合物可以展现出增强的生物利用度和更有利的生物分步。
在一些实施方式中，可激活抗体提供降低的毒性和/或不良副作用，如果AB未被掩蔽或以其他方式被抑制与这类部位结合，所述毒性和/或不良副作用可能由于非治疗部位和/或非诊断部位处的结合所导致。
包含非结合空间部分(NB)的CD147可激活抗体可以使用PCT公开号WO 2013/192546中所示方法制备，其内容通过引用其全文纳入。
抗体和可激活抗体的治疗性应用
本发明提供了预防对象中CD147介导的疾病，延缓其进展，对其治疗、减轻其症状或者以其他方式使其改善的方法，所述方法通过向有此需要的对象给予治疗有效量的本文所述的CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体。
本文提供了CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体用于预防CD147介导的疾病，延缓其进展、对其治疗、减轻其症状或者以其他方式使其改善。
本发明还提供了预防对象中癌症，延缓其进展，对其治疗，减轻其症状或者以其他方式使其改善的方法，所述方法通过向有此需要的对象给予治疗有效量的本文所述的CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体。
本文提供了CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体用于预防癌症，延缓其进展，对其治疗，减轻其症状或者以其他方式使其改善。
本发明还提供了治疗与对象中CD147异常表达和/或活性相关的症状，预防和/或延缓其发作或进展或减轻的方法，所述方法使用结合CD147的抗体/可激活抗体，特别是结合并中和或以其他方式抑制CD147和/或CD147介导的信号转导中至少一种生物活性的可激活抗体。
因此，本文提供了结合CD147的抗体/可激活抗体，用于治疗与CD147异常表达和/或活性相关的症状，预防和/或延缓其发作或进展，改善或减轻。
本发明还提供了治疗与对象中表达CD147或异常表达CD147的细胞的存在、生长、增殖、代谢和/或活性相关的症状，预防和/或延缓其发作或进展或减轻的方法，所述方法使用结合CD147的抗体/可激活抗体，特别是结合、靶向、中和、杀伤或以其他方式抑制表达或异常表达CD147的细胞中至少一种生物活性的可激活抗体。
本发明还提供了治疗与对象中表达CD147的细胞的存在、生长、增殖、代谢和/或活性相关的症状，预防和/或延缓其发作或进展或减轻的方法，所述方法使用结合CD147的抗体/可激活抗体，特别是结合、靶向、中和、杀伤或以其他方式抑制表达CD147的细胞中至少一种生物活性的抗体/可激活抗体。
本发明还提供了治疗与对象中异常表达CD147的细胞的存在、生长、增殖、代谢和/或活性相关的症状，预防和/或延缓其发作或进展或减轻的方法，所述方法使用结合CD147的抗体/可激活抗体，特别是结合、靶向、中和、杀伤或以其他方式抑制异常表达CD147的细胞中至少一种生物活性的抗体/可激活抗体。
已知CD147在各种癌症中表达，例如，但非限制性的示例，腺癌，胆管癌，膀胱癌，乳腺癌，例，如三阴性乳腺癌和Her2阴性乳腺癌；类癌；宫颈癌；胆管癌；大肠癌；子宫内膜；食道癌；神经胶质瘤；头颈癌，例如，头颈鳞状细胞癌；白血病；肝癌；肺癌，例如，NSCLC，SCLC；淋巴瘤；黑色素瘤；口咽癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌，例如，转移性去势抵抗性前列腺癌；肾癌；皮肤癌；鳞状细胞癌，胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；和尿路上皮癌。
在一些实施方式中，癌症与表达CD147的肿瘤相关。在一些实施方式中，癌症由表达CD147的肿瘤所引起。
在这些方法和应用的任何实施方式中使用的CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体可以在疾病的任何阶段给予。例如，这类CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体可以给予患有任何阶段(从早期到转移期)的癌症的患者。术语对象和患者在本文中可互换使用。
在一些实施方式中，对象是哺乳动物，如人、非人灵长类动物、同伴动物(如猫、狗、马)、农场动物、工作动物或动物园动物。在一些实施方式中，对象是人。在一些实施方式中，对象是同伴动物。在一些实施方式中，对象是处于兽医护理的动物。
将CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其治疗性制剂给予患有或对与异常CD147表达和/或活性相关的疾病或紊乱易感的患者。使用本领域已知的各种方法中的任一种鉴定患有或对与异常CD147表达和/或活性相关的疾病或紊乱易感的对象。例如，使用多种临床和/或实验室测试中的任一种鉴定患有癌症或其他肿瘤病症的对象，例如，体检及血液、尿液及/或粪便分析，以评估健康状况。例如，使用多种临床和/或实验室测试中的任一种鉴定患有炎症和/或炎性紊乱的对象，例如，体检和/或体液分析，例如，血液、尿液及/或粪便分析，以评估健康状况。
如果实现了各种实验室或临床目标中的任一种，那么认为向患有与异常CD147表达和/或活性相关的疾病或紊乱的患者给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体是成功的。例如，如果与疾病或紊乱相关的一种或多种症状被减缓、降低、抑制或不再进展到进一步的(即恶化)状态，那么认为向患有与异常CD147表达和/或活性相关的疾病或紊乱的患者给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体是成功的。如果疾病或紊乱进入缓解状态或者不再进展到进一步(即恶化)状态，那么认为向患有与异常CD147表达和/或活性相关的疾病或紊乱的患者给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体是成功的。
在一些实施方式中，将CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其治疗性制剂给予患有或对疾病或紊乱易感的患者，例如患有癌症或其他肿瘤病症的患者，其中所述对象的疾病细胞表达CD147。在一些实施方式中，疾病细胞与异常CD147表达和/或活性相关。在一些实施方式中，疾病细胞与正常CD147表达和/或活性相关。使用本领域已知的各种方法中的任一种鉴定患有或对这样疾病或紊乱易感的对象，其中所述对象的疾病细胞表达CD147。例如，使用多种临床和/或实验室测试中的任一种鉴定患有癌症或其他肿瘤病症的对象，例如，体检及血液、尿液及/或粪便分析，以评估健康状况。例如，使用多种临床和/或实验室测试中的任一种鉴定患有炎症和/或炎性紊乱的对象，例如，体检和/或体液分析，例如，血液、尿液及/或粪便分析，以评估健康状况。
在一些实施方式中，将CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其治疗性制剂给予患有或对与表达CD147的细胞或这类细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的疾病或紊乱易感的患者，例如患有癌症或其他肿瘤病症的患者。在一些实施方式中，细胞与异常CD147表达和/或活性相关。在一些实施方式中，细胞与正常CD147表达和/或活性相关。使用本领域已知的各种方法中的任一种鉴定患有或对与表达CD147的细胞相关的疾病或紊乱易感的对象。例如，使用多种临床和/或实验室测试中的任一种鉴定患有癌症或其他肿瘤病症的对象，例如，体检及血液、尿液及/或粪便分析，以评估健康状况。例如，使用多种临床和/或实验室测试中的任一种鉴定患有炎症和/或炎性紊乱的对象，例如，体检和/或体液分析，例如，血液、尿液及/或粪便分析，以评估健康状况。
如果实现了各种实验室或临床目标中的任一种，那么认为向患有与表达CD147的细胞相关的疾病或紊乱的患者给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体是成功的。例如，如果与疾病或紊乱相关的一种或多种症状被减缓、降低、抑制或不再进展到进一步的(即恶化)状态，那么认为向患有与表达CD147的细胞相关的疾病或紊乱的患者给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体是成功的。如果疾病或紊乱进入缓解状态或者不再进展到进一步(即恶化)状态，那么认为向患有与表达CD147的细胞相关的疾病或紊乱的患者给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体是成功的。
在一些实施方式中，CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体在治疗期间和/或之后与一种或多种其他试剂联用，例如，化疗剂、抗炎剂和/或免疫抑制剂。在一些实施方式中，同时给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其他试剂。在一些实施方式中，可以将CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其他试剂配制成单一组合物或者以两种或更多种分开的组合物给予。在一些实施方式中，依次给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其他试剂。
本公开还提供了治疗其中疾病细胞表达CD147的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体或者含有本公开抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体的药物组合物。在一些实施方式中，所述病症或疾病是癌症。
本公开还提供了治疗与表达CD147的细胞相关的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体或者含有本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体的药物组合物。在一些实施方式中，与表达CD147的细胞相关的紊乱或疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是腺癌，胆道(胆汁)癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，三阴性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，类癌，宫颈癌，胆管癌，结直肠癌，结肠癌，子宫内膜癌，食道癌，胶质瘤，头颈癌，头颈部鳞状细胞癌，白血病，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，口咽癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，转移性去势抵抗性前列腺癌，肾癌，肉瘤，皮肤癌，鳞状细胞癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，泌尿生殖系统癌或尿路上皮癌。在一些实施方式中，哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的。在一些实施方式中，所述方法包含给予其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
本公开还提供了抑制或降低表达哺乳动物CD147的细胞的生长、增殖或转移的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体或者含有本公开抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体的药物组合物。在一些实施方式中，哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的。在一些实施方式中，所述方法包括给予其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
本公开还提供了抑制、阻断或预防天然配体与哺乳动物CD147的结合的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体或者含有本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体的药物组合物。在一些实施方式中，哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的。在一些实施方式中，所述方法包括给予其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
本公开还提供了治疗其中疾病细胞表达CD147的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体或者含有本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体的药物组合物。在一些实施方式中，所述病症或疾病是癌症。
本公开还提供了治疗与表达CD147的细胞相关的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体或者含有本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体的药物组合物。在一些实施方式中，与表达CD147的细胞相关的紊乱或疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是腺癌，胆道(胆汁)癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，三阴性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，类癌，宫颈癌，胆管癌，结直肠癌，结肠癌，子宫内膜癌，食道癌，胶质瘤，头颈癌，头颈部鳞状细胞癌，白血病，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，口咽癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，转移性去势抵抗性前列腺癌，肾癌，肉瘤，皮肤癌，鳞状细胞癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，泌尿生殖系统癌或尿路上皮癌。在一些实施方式中，哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的。在一些实施方式中，所述方法包括给予其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
本公开还提供了抑制或降低表达哺乳动物CD147的细胞的生长、增殖或转移的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体或者含有本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体的药物组合物。在一些实施方式中，哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的。在一些实施方式中，所述方法包括给予其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
本公开还提供了抑制、阻断或预防天然配体与哺乳动物CD147的结合的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体或者含有本公开的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体的药物组合物。在一些实施方式中，哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的。在一些实施方式中，所述方法包括给予其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
制剂
应当理解的是，根据本公开给予治疗实体将藉由合适的运载体、赋形剂以及纳入制剂以提供改善的转移、递送、耐受等的其他试剂给予。可从所有药物化学家已知的配方中找到许多合适的配方：Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)(第15版，马克出版公司(Mack Publishing Company)，宾西马尼亚州伊斯顿，(1975))，特别是其中Blaug,Seymour所著的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊剂、油膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LipofectinTM)、DNA偶联物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡的半固体混合物。前述混合物中的任意一个均适用于根据本公开的治疗和疗法，前提是制剂中的活性成分并未受制剂影响而失活且该制剂是生理相容的且对给药途径耐受。同样参见Baldrick P.“药物赋形剂研发：临床前指导的需求(Pharmaceutical excipient development:the needfor preclinical guidance).”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2):210-8(2000)，Wang W.“固体蛋白药物的冻干与开发(Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals.)”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000)，Charman WN“脂类、亲脂药物和口服药物递送——一些新兴的概念(Lipids,lipophilic drugs,and oral drugdelivery-some emerging concepts).”J Pharm Sci.89(8):967-78(2000)，Powell等“非肠道制剂的赋形剂概述(Compendium of excipients for parenteral formulations)”PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311(1998)以及本文中引用的关于药物化学家所熟知的制剂、赋形剂和运载体的其他信息。
本公开的治疗性制剂包含CD147抗体和/或可激活CD147抗体，例如，非限制性示例，抗体，偶联抗体，可激活抗体和/或偶联可激活抗体，所述治疗性制剂用于预防、治疗或以其他方式减缓与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或紊乱。例如，本公开的治疗性制剂包含抗体，偶联抗体，可激活抗体和/或偶联可激活抗体，所述治疗性制剂用于治疗或以其他方式减缓癌症或其他肿瘤、炎症、炎性疾病和/或自身免疫性疾病。在一些实施方式中，癌症是其中表达了靶标的血液恶性肿瘤或实体瘤。在一些实施方式中，癌症是其中表达了靶标的实体瘤。在一些实施方式中，癌症是其中表达了靶标的血液恶性肿瘤。在一些实施方式中，靶标表达于实质(例如，在癌症中，通常执行器官或组织功能的组织或器官的部分)。在一些实施方式中，靶标表达于细胞、组织或器官。在一些实施方式中，靶标表达于基质(即细胞、组织或器官的结缔支持组织)。在一些实施方式中，靶标表达于成骨细胞。在一些实施方式中，靶标表达于内皮(脉管系统)。在一些实施方式中，靶标表达于癌症干细胞。在一些实施方式中，偶联抗体和/或可激活抗体的试剂是微管抑制剂。在一些实施方式中，偶联抗体和/或可激活抗体的试剂是核酸破坏剂。
预防、减缓或治疗的有效性关于用于诊断或治疗与靶标表达和/或活性(例如，异常靶标表达和/或活性)相关的疾病或紊乱的任何已知方法确定。延长对象的存活或者以其他方式延缓与靶标表达和/或活性(例如，异常靶标表达和/或活性)相关的疾病或紊乱的进展表明抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体赋予临床益处。
抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体可以药物组合物的形式给予。制备这类组合物所涉及的原则和考虑因素以及关于组分选择的指导提供自，例如，Remington:The Science And Practice Of Pharmacy(《雷明顿：药学科学和实践》)第19版(Alfonso R.Gennaro,等编辑)Mack出版社公司，费城伊斯顿:1995；Drug AbsorptionEnhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends(《药物吸收增强：概念、可能性、限制和趋势》)，哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers)，费城郎湾,1994；和Peptide And Protein Drug Delivery(《肽和蛋白质药物递送》)(Advances InParenteral Sciences,第4卷),1991,M.Dekker,纽约。
在一些实施方式中，使用抗体片段时，选择特异性结合靶蛋白结合结构域的最小片段。例如，基于抗体的可变区序列，肽分子可以被设计成保留结合靶蛋白序列的能力。可化学合成和/或通过重组DNA技术产生这类肽。(参见例如，Marasco等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993)))。根据所治疗特定适应症的需要，该制剂也可含有一种以上活性化合物，例如，在一些实施方式中，相互间不会产生不良影响的具有补充活性的化合物。在一些实施方式中，或者此外，组合物可以包含增强其功能的试剂，例如，细胞毒性剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。这些分子适合以目标效果有效量存在于组合中。
活性成分还可包入微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或界面聚合制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或可包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入巨乳液(macroemulsion)。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含抗体固体疏水性聚合物半渗透基质，其中基质是成型制品的形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的例子包括：聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物释放分子的时间能够超过100天，某些水凝胶释放蛋白质的时间则较短。
组合治疗
在一些实施方式中，本文所述CD47抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体与一种或多种其他试剂或其他试剂组合联用。合适的其他试剂包括现有的用于特定应用(如癌症)的药物和/或手术疗法。例如，CD47抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体可以与其他化学治疗剂，抗肿瘤剂，抗炎剂，免疫抑制剂，烷化剂，抗代谢物，抗微管剂，拓扑异构酶抑制剂，细胞毒性抗生素和/或任何其他核酸破坏剂联用。
在一些实施方式中，其他试剂是化疗剂，诸如选自下述的化疗剂：多西紫杉醇，紫杉醇，阿布拉生(即，与白蛋白偶联的紫杉醇)，阿霉素，奥沙利铂，卡铂，顺铂，伊立替康和吉西他滨。
在一些实施方式中，其他试剂是检查点抑制剂，激酶抑制剂，靶向肿瘤微环境中抑制剂的试剂，和/或T细胞或NK激动剂。在一些实施方式中，其他试剂是放射治疗，其单独存在或与另一其他试剂诸如化疗或抗肿瘤剂组合。在一些实施方式中，其他试剂是疫苗，致癌病毒和/或DC激活剂，例如，但非限制性的示例，toll样受体(TLR)激动剂和/或α-CD40。在一些实施方式中，其他试剂是靶向肿瘤的抗体，旨在经由ADCC或经由与毒素(例如，抗体药物偶联物(ADC))直接偶联杀伤肿瘤。
在一些实施方式中，检查点抑制剂是选下述靶标的抑制剂：CTLA-4、LAG-3、PD-1、CD147、TIGIT、TIM-3、B7H4和Vista。在一些实施方式中，激酶抑制剂选自B-RAFi、MEKi和Btk抑制剂，诸如依鲁替尼(ibrutinib)。在一些实施方式中，激酶抑制剂是克里唑蒂尼(crizotinib)。在一些实施方式中，肿瘤微环境抑制剂选自：IDO抑制剂、α-CSF1R抑制剂、α-CCR4抑制剂、TGF-β、骨髓来源的抑制性细胞和T调节细胞。在一些实施方式中，激动剂选自：Ox40、GITR、CD137、ICOS、CD27和HVEM。
在一些实施方式中，抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是LAG-3抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是CD147抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是TIGIT抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是TIM-3抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是B7H4抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是Vista抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是B-RAFi抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是MEKi抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是Btk抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方式中，抑制剂是克里唑蒂尼。在一些实施方式中，抑制剂是IDO抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是α-CSF1R抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是α-CCR4抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂是TGF-β。在一些实施方式中，抑制剂是骨髓来源的抑制性细胞。在一些实施方式中，抑制剂是T调节细胞。
在一些实施方式中，激动剂是Ox40。在一些实施方式中，激动剂是GITR。在一些实施方式中，激动剂是CD137。在一些实施方式中，激动剂是ICOS。在一些实施方式中，激动剂是CD27。在一些实施方式中，激动剂是HVEM。
在一些实施方式中，CD147抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体在治疗期间和/或之后与一种或多种其他试剂联用，例如，化疗剂、抗炎剂和/或免疫抑制剂。在一些实施方式中，CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体以及其他试剂被配制成单个治疗组合物，并且同时给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体以及其他试剂。或者，CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体以及其他试剂彼此分离，例如，各自配制成单独的治疗组合物，并且同时给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体以及其他试剂，或者CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体以及其他试剂在治疗方案中的不同时间给予。例如，在给予其他试剂之前给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体，在给予其他试剂之后给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体，或者以交替的方式给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其他试剂。如本文所述，以单个剂量或多个剂量给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其他试剂。
在一些实施方式中，同时给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其他试剂。在一些实施方式中，可以将CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体和其他试剂配制成单一组合物或者以两种或更多种分开的组合物给予。在一些实施方式中，依次给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体以及其他试剂，或者在治疗方案的不同时间给予CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体以及其他试剂。
在一些实施方式中，CD147抗体、偶联CD147抗体、可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体在治疗期间和/或之后与一种或多种其他试剂联用，例如但非限制性的示例，化疗剂、抗炎剂和/或免疫抑制剂，例如，烷化剂，抗代谢物，抗微管剂，拓扑异构酶抑制剂，细胞毒性抗生素和/或任何其他核酸破坏剂。在一些实施方式中，其他试剂是紫杉烷(taxane)，如紫杉醇(paclitaxel)(例如，
Figure BDA0002266538730001531
)。在一些实施方式中，其他试剂是抗代谢物，如吉西他滨(gemcitabine)。在一些实施方式中，其他试剂是烷化剂，如基于铂的化疗，如卡铂或顺铂。在一些实施方式中，其他治疗剂是靶向剂，如激酶抑制剂，例如，索拉非尼(sorafenib)和埃罗替尼(erlotinib)。在一些实施方式中，其他治疗剂是靶向剂，如另一抗体，例如，单克隆抗体(例如，贝伐单抗(bevacizumab))，双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方式中，其他试剂是蛋白酶体抑制剂，如硼替佐米(bortezomib)或卡非佐米(carfilzomib)。在一些实施方式中，其他试剂是免疫调节剂，诸如来那度胺(lenolidominde)或IL-2。在一些实施方式中，其他试剂是放射。在一些实施方式中，其他试剂是本领域技术人员认为护理标准的试剂。在一些实施方式中，其他试剂是本领域技术人员已知的化疗剂。
在一些实施方式中，其他试剂是另一抗体或其抗原结合片段，另一偶联抗体或其抗原结合片段，另一可激活抗体或其抗原结合片段和/或另一偶联可激活抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，其他试剂是针对与第一抗体或其抗原结合片段、第一偶联抗体或其抗原结合片段、可激活抗体或其抗原结合片段和/或偶联可激活抗体或其结合片段相同的靶标(例如，针对CD147)的另一抗体或其抗原结合片段，另一偶联抗体或其抗原结合片段，另一可激活抗体或其可抗原结合片段，和/或另一偶联可激活抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，其他试剂是针对与第一抗体或其抗原结合片段、第一偶联抗体或其抗原结合片段、可激活抗体或其抗原结合片段和/或偶联可激活抗体或其结合片段不同的靶标的另一抗体或其抗原结合片段，另一偶联抗体或其抗原结合片段，另一可激活抗体或其可抗原结合片段，和/或另一偶联可激活抗体或其抗原结合片段。
作为一个非限制示例，抗体、抗原结合片段和/或可激活抗体(其他试剂)的AB是针对表10中所列任何靶标的结合伴侣。
表10：示例性靶标
Figure BDA0002266538730001541
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作为一个非限制示例，抗体、抗原结合片段和/或可激活抗体(其他试剂)的AB是或源自表11中所列的抗体。
表11：Ab的示例性来源
Figure BDA0002266538730001552
在一些实施方式中，其他抗体或其抗原结合片段、偶联抗体或其抗原结合片段、可激活抗体或其抗原结合片段和/或偶联可激活抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体，结构域抗体，单链，Fab片段，F(ab’)2片段，scFv，scAb，dAb，单域重链抗体或单域轻链抗体。在一些实施方式中，其他抗体或其抗原结合片段，偶联抗体或其抗原结合片段，可激活抗体或其抗原结合片段和/或偶联可激活抗体或其抗原结合片段是小鼠、其它啮齿动物、嵌合的、人源化的或完全人的单克隆抗体。
检测、诊断、成像、患者选择
本发明还提供了将本文所提供的抗体/偶联抗体/可激活抗体/偶联可激活抗体用于各种诊断和/或预防性指示的方法和试剂盒。例如，本发明提供了方法和试剂盒，用于检测对象或样品中感兴趣的靶标和切割剂的存在与否，其通过(i)将对象或样品与CD147可激活抗体接触，其中所述CD147可激活抗体包含掩蔽部分(MM)，可切割部分(CM)，其经切割剂切割，和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合感兴趣的靶标，其中处于未切割、未激活状态的CD147可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中，MM是抑制AB与CD147结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列并且不是AB天然结合伴侣的修饰形式；和(b)其中，当AB处于未切割、未激活状态时，MM干扰AB与CD147的特异性结合，并且当AB处于切割、激活状态时，MM不干扰也不竞争AB与CD147的特异性结合；和(ii)测量对象或样品中激活的CD147可激活抗体的水平，其中对象或样品中可检测水平的激活的CD147可激活抗体表明对象或样品中存在切割剂和CD147，并且其中对象或样品中无可检测水平的激活的CD147可激活抗体表明对象或样品中不存在切割剂、CD147或切割剂和CD147两者。本文所提供的CD147可激活抗体可以结合人和食蟹猴CD147。
在一些实施方式中，可激活CD147抗体是偶联治疗剂的可激活CD147抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活CD147抗体包含可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物位于AB上。在一些实施方式中，测量对象或样品中可激活抗体的水平使用与激活的抗体特异性结合的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记物。在一些实施方式中，第二试剂是含有可检测标记物的抗体。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，可激活CD147抗体包括可检测标记物。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，可检测标记物包含成像剂，对比剂，酶，荧光标记物，发色团，染料，一种或多种金属离子，或基于配体的标记物。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，成像剂包括放射性同位素。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，放射性同位素是铟或锝。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，对比剂包括碘、钆或氧化铁。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，荧光标记物包含黄色荧光蛋白(YFP)，青色荧光蛋白(CFP)，绿色荧光蛋白(GFP)，修饰的红色荧光蛋白(mRFP)，红色荧光蛋白tdimer2(RFPtdimer2)，HCRED，或铕衍生物。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，荧光标记包含N-甲基丙烯酸衍生物。在这些方法的一些实施方式中，标记物包括Alexa
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标记物，如Alex
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680或Alexa750。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，基于配体的标记物包括生物素，亲和素，链霉亲和素或一个或多个半抗原。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，对象是哺乳动物。在这些方法的一些实施方案中，对象是人。在一些实施方式中，对象是非人哺乳动物，如非人灵长类动物、同伴动物(如猫、狗、马)、农场动物、工作动物或动物园动物。在一些实施方式中，该对象是啮齿动物。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法是体内方法。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法是原位方法。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法是离体方法。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法是体外方法。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法用于鉴定或以其他方式细化这样的患者群体，所述患者群体适合用本公开的CD147可激活抗体处理，然后通过向有此需要的对象给予可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体处理。例如，将这样的患者鉴定为适合用含有这样可切割部分(CM)的这类CD147可激活抗体治疗的候选者，所述患者经测试对蛋白酶和靶标(例如，CD147)呈阳性，所述蛋白酶切割在这些方法中测试的CD147可激活抗体的CM中的底物，然后向患者给予治疗有效量的经测试的可激活CD147抗体和/或偶联可激活CD147抗体。同样，将这样的患者鉴定为对另一形式的疗法合适的候选者，所述患者经测试对蛋白酶和靶标(例如，CD147)之一或两者呈阴性，所述蛋白酶切割这些方法中测试的可激活抗体中CM的底物。在一些实施方式中，可以用其他CD147可激活抗体测试这类患者直到鉴定到对于治疗合适的CD147可激活抗体(例如，含有在疾病部位被患者切割的CM的CD147可激活抗体)。在一些实施方式中，然后向经测试呈阳性的患者给予治疗有效量的可激活CD147抗体和/或偶联物。合适的AB、MM和/或CM包含本文所公开的任一种AB、MM和/或CM。
在一些实施方式中，抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体包含可检测标记物。使用了完整抗体或其片段(如Fab、scFv或F(ab’)2)。关于探针或抗体的术语“标记的”，旨在包含通过偶联(即物理连接)可检测物质与探针或抗体的探针或抗体直接标记，和通过与直接标记的另一试剂反应的探针或抗体间接标记。间接标记的示例包括使用荧光标记的二抗检测一抗和使用生物素标记DNA探针末端使得可使用荧光标记的链霉亲和素对其进行检测。术语“生物样品”旨在包括从对象中分离的组织、细胞和生物液体，以及对象中存在的组织、细胞和液体。术语“生物样品”的使用中因此包括的是血液或血液部分或组分，包括血清、血浆或淋巴。换言之，本公开的检测方法可用于在体外及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于体外检测分析物mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。用于体外检测分析物蛋白质的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、荧光化学染色和免疫荧光。用于体外检测分析物基因组DNA的技术包括Southern杂交。进行免疫测定的步骤述于例如，“《ELISA理论和实践：分子生物学方法》(ELISA:Theory and Practice:Methods in Molecular Biology)”,第42卷,J.R.Crowther(编著)Human出版社,纽约州托托瓦,1995；“《免疫测定》(Immunoassay)”,E.Diamandis和T.Christopoulus,学术出版社有限公司,加利福尼亚州圣地亚哥,1996；和“《酶免疫测定的实践和理论》(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)”,P.Tijssen,爱思唯尔科学出版社,阿姆斯特丹1985。此外，用于检测分析物蛋白质的体内技术包括向对象导入标记的抗-分析物蛋白抗体。例如，可以用放射性标志物标记抗体，所述放射性标志物在对象中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。
本公开的抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体还能够用于各种诊断和预防制剂。在一实施方式中，将抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体给予处于发展出前述紊乱中一种或多种风险中的患者。可以使用基因型、血清学或生化标志物确定患者或器官对一种或多种上述病症的易感性。
在本公开的一些实施方式中，将抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体给予经与一种或多种上述病症相关的临床适应症诊断的人类个体。诊断后，给予抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体以减轻或逆转临床适应症的影响。
本公开的抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体还能够用于检测患者样品中的靶标并且因此能够用于诊断。例如，本公开的抗体和/或可激活抗体和其偶联形式用于体外试验，例如，ELISA，以检测患者样品中的靶标水平。
在一实施方式中，本公开的抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体固定在固体支持物(如微量滴定板的孔)上。固定的抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体作为针对测试样品中可能存在的任何靶标的捕获抗体。在固定的抗体和/或可激活抗体和/或其偶联的形式与患者样品接触之前，清洗并用阻断剂诸如乳蛋白或白蛋白处理固体支持物以预防分析物的非特异性吸收。
然后，用疑似含有抗原的测试样品，或用含有标准量的抗原的溶液处理孔。这类样品是例如是疑似具有被认为是病理学诊断的循环抗原水平的对象的血清样品。清洗掉测试样品或标准物后，用可检测标记的二抗处理固体支持物。标记的二抗作为检测抗体。测量可检测标记物的水平，测试样品中靶抗原的浓度通过与发展自标准样品的标准曲线比较确定。
应当理解的是，基于使用本公开的抗体和可激活抗体及其偶联形式获得的结果，在体外诊断试验中，有可能基于靶抗原的表达水平区分对象中疾病的阶段。对于特定的疾病，从被诊断处于疾病发展的多个阶段和/或处于疾病治疗的多个点上的对象中提取血液样品。使用对治疗或进展的各阶段提供统计学显著性结果的样品群体，指定了表征各阶段的抗原浓度范围。
抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体还可以用于诊断和/或成像方法。在一些实施方式中，这类方法是体外方法。在一些实施方式中，这类方法是体内方法。在一些实施方式中，这类方法是原位方法。在一些实施方式中，这类方法是离体方法。例如，具有酶促可切割CM的可激活抗体可以用于检测能够切割CM的酶的存在与否。这类可激活抗体可以用于诊断，其可以包括在给定宿主生物体的给定细胞或组织中通过测量的激活的抗体(即，可激活抗体切割产生的抗体)的累积，体内检测(例如，定性或定量)酶活性(或者在一些实施方式中，还原电位增加的环境，如可以提供二硫键还原的环境)。激活的抗体的这类累积不仅仅表明组织表达酶活性(或者取决于CM的性质，增加还原电位)，而且表明组织表达激活的抗体结合的靶标。
例如，可以选择CM成为针对存在于肿瘤部位，病毒或细菌感染部位，生物限制部位(例如，在脓肿中，在器官中等)等的至少一种蛋白酶的底物。AB可以是结合靶抗原的一种AB。使用本文所公开的方法，或者当适用时，本领域技术人员熟悉的方法，可检测标记物(例如，荧光标记物或放射性标记物或放射示踪物)可以与AB或抗体和/或可激活抗体的其他区域偶联。合适的可检测标记物讨论于上述筛选方法的上下文中并且下文提供了其他具体示例。使用对疾病阶段的蛋白质或肽具有特异性的AB，以及其活性在感兴趣的疾病组织中升高的至少一种蛋白酶，相对于其中CM特异性酶未以可检测水平存在或以比疾病组织低的水平存在或处于失活(例如，处于酶原形式或与抑制剂复合)的组织，可激活抗体将展现出与疾病组织结合的速率增加。由于肾脏过滤系统会从血液中快速清除小蛋白质和肽，并且因为对CM具有特异性的酶未以可检测的水平存在(或以较低的水平存在于非疾病组织中或无活性构象存在)，相对于非疾病组织，疾病组织中激活的抗体的积累增强。
在另一示例中，可激活抗体可以用于检测样品中切割剂的存在与否。例如，在可激活抗体包含疑似被酶切割的CM的情况中，可激活抗体可以用于检测(定量或定性地)样品中酶的存在。在另一示例中，在可激活抗体包含疑似被还原剂切割的CM的情况中，可激活抗体可以用于检测(定量或定性地)样品中还原条件的存在。为了促进这些方法中的分析，可激活抗体可以经可检测地标记，或者可以与支持物(例如，固体支持物，如载玻片或珠)结合。可检测标记物可以位于切割后不释放的可激活抗体的部分，例如，可检测标记物可以是淬灭的荧光标记物或直到发生切割才不可检测的其他标记物。试验可以通过例如将固定的、可检测标记的可激活抗体与疑似含有酶和/或还原剂的样品接触足以使切割发生的时间，然后洗涤以去除过量的样品和污染物。样品中切割剂(例如，酶或还原剂)的存在与否然后通过在与样品接触前可激活抗体可检测信号中的改变评估，例如，由于样品中切割剂而导致的可激活抗体的切割，可检测信号的存在和/或增加。
这类检测方法也适用于检测靶标的存在与否，所述靶标当切割时能够结合可激活抗体的AB。因此，该试验适用于评估切割剂的存在与否以及感兴趣靶标的存在与否。切割剂的存在与否可以通过上述可激活抗体的可检测标记物的存在和/或增加检测，并且靶标的存在与否可以通过检测靶标-AB复合物检测，例如，通过使用可检测标记的抗-靶标抗体。
可激活抗体还能够用于原位成像，用于确认可激活抗体激活，例如，通过蛋白酶切割，和与特定靶标的结合。原位成像是使蛋白水解活性和靶标能够定位在生物样品(如细胞培养物或组织切片)中的技术。使用该技术，有可能基于可检测标记物(例如，荧光标记物)的存在确认与给定靶标的结合以及蛋白水解活性。
这些技术能够用于源自疾病部位(例如，肿瘤组织)或健康组织的任何冷冻细胞或组织。这些技术还能够用于新鲜细胞或组织样品。
在这些技术中，可激活抗体经可检测标记物标记。可检测标记物可以是荧光染料，(例如，荧光团，荧光素异硫氰酸酯(FITC)，若丹明异硫氰酸酯(TRITC)，Alexa
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标记物)，近红外(NIR)染料(例如，
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纳米晶体)，胶体金属，半抗原，放射性标志物，生物素和扩增试剂如链霉亲和素，或酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
检测已经用标记的、可激活抗体孵育的样品中标志物表明样品包含靶标并且包含对可激活抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶的存在可以使用广谱蛋白酶抑制剂确认，诸如本文所述的那些，和/或通过使用对蛋白酶具有特异性的试剂，例如，抗体如A11，其对蛋白酶间质蛋白酶具有特异性并且抑制间质蛋白酶的蛋白水解活性；参见例如，国际专利申请号WO2010/129609，2010年11月11日公开。使用如本文所述的那些的广谱蛋白酶抑制剂和/或通过使用更具选择性的抑制剂的相同方法可以用于鉴定对可激活抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施方式中，靶标的存在可以使用对靶标具有特异性的试剂确认，例如，另一抗体，或者可检测标记物可以与未标记的靶标竞争。在一些实施方式中，未标记的可激活抗体可以与通过标记的二抗的检测或更复杂的检测系统联用。
相似的技术还能够用于体内成像，其中在对象，例如，哺乳动物，包括人中检测荧光信号表明疾病部位包含靶标并且包含对可激活抗体的CM具有特异性的蛋白酶。
这些技术还能够用于试剂盒和/或试剂，用于基于可激活抗体中的蛋白酶特异性CM检测、鉴定或表征各种细胞、组织和生物体中的蛋白酶活性。
本公开提供了在各种诊断和/或预防性指示中使用抗体和/或可激活抗体的方法。例如，本发明提供了检测对象或样品中感兴趣的靶标和切割剂的存在与否的方法，其通过(i)将对象或样品与可激活抗体接触，其中所述可激活抗体包含掩蔽部分(MM)，可切割部分(CM)，其经切割剂(例如，蛋白酶)切割，和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合感兴趣的靶标，其中处于未切割、未激活状态的可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中，MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列并且不是AB天然结合伴侣的修饰形式；和(b)其中，当处于未切割、未激活状态时，MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且当处于切割、激活状态时，MM不干扰也不竞争AB与靶标的特异性结合；和(ii)测量对象或样品中激活的可激活抗体的水平，其中对象或样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明对象或样品中存在切割剂和靶标，并且其中对象或样品中无可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂、靶标或切割剂和靶标两者不存在于对象或样品中和/或在对象或样品中含量不足。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体包含可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物位于AB上。在一些实施方式中，测量对象或样品中可激活抗体的水平使用与激活的抗体特异性结合的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记物。在一些实施方式中，第二试剂是含有可检测标记物的抗体。
本公开还提供了检测对象或样品中切割剂存在与否的方法，其通过(i)在感兴趣靶标例如靶标存在的情况下，将对象或样品与可激活抗体接触，其中所述可激活抗体包含掩蔽部分(MM)，可切割部分(CM)，其经切割剂(例如，蛋白酶)切割，和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合感兴趣的靶标，其中处于未切割、未激活状态的可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中，MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列并且不是AB天然结合伴侣的修饰形式；和(b)其中，当处于未切割、未激活状态时，MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且当处于切割、激活状态时，MM不干扰也不竞争AB与靶标的特异性结合；和(ii)测量对象或样品中激活的可激活抗体的水平，其中对象或样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明对象或样品中存在切割剂，并且其中对象或样品中无可检测水平的激活的可激活抗体表明对象或样品中不存在切割剂和/或在对象或样品中含量不足。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体包含可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物位于AB上。在一些实施方式中，测量对象或样品中可激活抗体的水平使用与激活的抗体特异性结合的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记物。在一些实施方式中，第二试剂是含有可检测标记物的抗体。
本公开还提供了试剂盒，用于在检测对象或样品中切割剂和靶标存在与否的方法中使用，其中所述试剂盒包括至少可激活抗体，所述可激活抗体包含掩蔽部分(MM)，可切割部分(CM)，其经切割剂(例如，蛋白酶)切割，和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合感兴趣的靶标，其中处于未切割、未激活状态的可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中，MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列并且不是AB天然结合伴侣的修饰形式；和(b)其中，当处于未切割、未激活状态时，MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且当处于切割、激活状态时，MM不干扰也不竞争AB与靶标的特异性结合；和(ii)测量对象或样品中激活的可激活抗体的水平，其中对象或样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明对象或样品中存在切割剂，并且其中对象或样品中无可检测水平的激活的可激活抗体表明对象或样品中不存在切割剂和/或在对象或样品中含量不足。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体包含可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物位于AB上。在一些实施方式中，测量对象或样品中可激活抗体的水平使用与激活的抗体特异性结合的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记物。在一些实施方式中，第二试剂是含有可检测标记物的抗体。
本公开还提供了检测对象或样品中切割剂存在与否的方法，其通过(i)将对象或样品与可激活抗体接触，其中所述可激活抗体包含掩蔽部分(MM)，可切割部分(CM)，其经切割剂(例如，蛋白酶)切割，和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合感兴趣的靶标，其中处于未切割、未激活状态的可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；其中，MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列并且不是AB天然结合伴侣的修饰形式；其中，当处于未切割、未激活状态时，MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且当处于切割、激活状态时，MM不干扰也不竞争AB与靶标的特异性结合；和(ii)测量对象或样品中激活的可激活抗体的水平，其中对象或样品中可检测水平的可检测标记物表明切割剂不存在于对象或样品中和/或在对象或样品中含量不足，并且其中对象或样品中无可检测水平的可检测标记物表明对象或样品中存在切割剂。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体包含可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物位于AB上。在一些实施方式中，测量对象或样品中可激活抗体的水平使用与激活的抗体特异性结合的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记物。在一些实施方式中，第二试剂是含有可检测标记物的抗体。
本公开还提供了试剂盒，用于在检测对象或样品中切割剂和靶标存在与否的方法中使用，其中所述试剂盒至少包括本文所述的可激活抗体和/或偶联可激活抗体(例如，治疗剂与之偶联的可激活抗体)，用于接触对象或生物样品并且旨在检测对象或生物样品中激活的可激活抗体和/或偶联可激活抗体的水平，其中对象或生物样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂和靶标存在于对象或生物样品中并且对象或生物样品中无可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂、靶标或切割剂和靶标两者不存在于对象或生物样品中和/或在对象或样品中含量不足，因此无法在对象或生物样品中检测到可激活抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割。
本公开还提供了检测对象或样品中切割剂存在与否的方法，其通过(i)在靶标存在的情况下，将对象或生物样品与可激活抗体接触，和(ii)测量对象或生物样品中激活的可激活抗体的水平，其中对象或生物样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明对象或生物样品中存在切割剂并且其中无可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂不存在于对象或生物样品中和/或在对象或样品中含量不足，因此无法在对象或生物样品中检测到可激活抗体的蛋白酶切割。这类的可激活抗体包含掩蔽部分(MM)、可切割部分(CM)，其经切割剂(例如，蛋白酶)切割、和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合靶标，其中处于未切割(即，未激活)状态的可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列；和(b)其中处于未切割状态的可激活抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且其中处于切割(即，激活)状态的可激活抗体的MM不干扰也不竞争AB与靶标的特异性结合。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可检测标记物与掩蔽部分连接。在一些实施方式中，可检测标记物与蛋白酶切割位点的N-末端的可切割部分连接。在一些实施方式中，AB的单一抗原结合位点被掩蔽。在一些实施方式中，其中本公开的抗体具有至少两个抗原结合位点，至少一个抗原结合位点被掩蔽并且至少一个抗原结合位点未被掩蔽。在一些实施方式中，所有抗原结合位点被掩蔽。在一些实施方式中，测量步骤包括使用含有可检测标记物的第二试剂。
本公开还提供了试剂盒，用于在检测对象或样品中切割剂和靶标存在与否的方法中使用，其中所述试剂盒至少包括本文所述的可激活抗体和/或偶联可激活抗体，用于在靶标存在的情况下，将对象或生物样品与可激活抗体接触，并且测量对象或生物样品中激活的可激活抗体的水平，其中对象或生物样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂存在于对象或生物样品中并且其中对象或生物样品中无可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂不存在于对象或生物样品中和/或在对象或样品中含量不足，因此无法在对象或生物样品中检测到可激活抗体的蛋白酶切割。这类的可激活抗体包含掩蔽部分(MM)、可切割部分(CM)，其经切割剂(例如，蛋白酶)切割、和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合靶标，其中处于未切割(即，未激活)状态的可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列；和(b)其中处于未切割状态的可激活抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且其中处于切割(即，激活)状态的可激活抗体的MM不干扰也不竞争AB与靶标的特异性结合。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可检测标记物与掩蔽部分连接。在一些实施方式中，可检测标记物与蛋白酶切割位点的N-末端的可切割部分连接。在一些实施方式中，AB的单一抗原结合位点被掩蔽。在一些实施方式中，其中本公开的抗体具有至少两个抗原结合位点，至少一个抗原结合位点被掩蔽并且至少一个抗原结合位点未被掩蔽。在一些实施方式中，所有抗原结合位点被掩蔽。在一些实施方式中，测量步骤包括使用含有可检测标记物的第二试剂。
本公开还提供了试剂盒，用于在检测对象或样品中切割剂存在与否的方法中使用，其中所述试剂盒至少包括本文所述的可激活抗体和/或偶联可激活抗体，用于接触对象或生物样品并且旨在检测对象或生物样品中激活的可激活抗体和/或偶联可激活抗体的水平，其中所述可激活抗体包括可检测标记物，所述可检测标记物位于CM切割后释放的可激活抗体的部分上，其中对象或生物样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂不存在于对象或生物样品中和/或在对象或样品中含量不足，因此无在对象或生物样品中检测到可激活抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割，并且其中对象或生物样品中无可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂以可检测的水平存在于对象或生物样品中。
本公开还提供了检测对象或样品中切割剂和靶标存在与否的方法，其通过(i)将对象或生物样品与可激活抗体接触，其中可激活抗体包括可检测标记物，所述可检测标记物位于CM切割后释放的可激活抗体的部分上，和(ii)测量对象或生物样品中激活的可激活抗体的水平，其中对象或生物样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂、靶标或切割剂和靶标两者不存在于对象或生物样品中和/或在对象或样品中含量不足，因此无法在对象或生物样品中检测到可激活抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割，并且其中对象或生物样品中激活的可激活抗体的可检测水平下降表明切割剂和靶标存在于对象或生物样品中。可检测标记物的水平下降是，例如，下降约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。这类的可激活抗体包含掩蔽部分(MM)、可切割部分(CM)，其经切割剂切割、和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合靶标，其中处于未切割(即，未激活)状态的可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列；和(b)其中处于未切割状态的可激活抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且其中处于切割(即，激活)状态的可激活抗体的MM不干扰也不竞争AB与靶标的特异性结合。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体包含可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物位于AB上。在一些实施方式中，测量对象或样品中可激活抗体的水平使用与激活的抗体特异性结合的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记物。在一些实施方式中，第二试剂是含有可检测标记物的抗体。
本公开还提供了试剂盒，用于在检测对象或样品中切割剂和靶标存在与否的方法中使用，其中所述试剂盒至少包括本文所述的可激活抗体和/或偶联可激活抗体，用于接触对象或生物样品并且旨在检测对象或生物样品中激活的可激活抗体和/或偶联可激活抗体的水平，其中对象或生物样品中可检测水平的激活的可激活抗体表明切割剂、靶标或切割剂和靶标两者不存在于对象或生物样品中和/或在对象或样品中含量不足，因此无法在对象或生物样品中检测到可激活抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割，并且其中对象或生物样品中激活的可激活抗体的可检测水平下降表明切割剂和靶标存在于对象或生物样品中。可检测标记物水平下降是，例如，下降约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。
本公开还提供了检测对象或样品中切割剂存在与否的方法，其通过(i)将对象或生物样品与可激活抗体接触，其中可激活抗体包括可检测标记物，所述可检测标记物位于CM切割后释放的可激活抗体的部分上；和(ii)测量对象或生物样品中可检测标记物的水平，其中对象或生物样品中可检测水平的可检测标记物表明切割剂不存在于对象或生物样品中和/或在对象或样品中含量不足，因此无法在对象或生物样品中检测到可激活抗体的蛋白酶切割，并且其中对象或生物样品中可检测标记物的可检测水平下降表明切割剂存在于对象或生物样品中。可检测标记物的水平下降是，例如，下降约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。这类的可激活抗体包含掩蔽部分(MM)、可切割部分(CM)，其经切割剂切割、和抗原结合结构域或其片段(AB)，其特异性结合靶标，其中处于未切割(即，未激活)状态的可激活抗体从N-末端至C-末端包含下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标结合的肽，并且其中MM不具有AB天然产生的结合伴侣的氨基酸序列；和(b)其中处于未切割状态的可激活抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合，并且其中处于切割(即，激活)状态的可激活抗体的MM不干扰也不竞争AB与靶标的特异性结合。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体包含可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物位于AB上。在一些实施方式中，测量对象或样品中可激活抗体的水平使用与激活的抗体特异性结合的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记物。在一些实施方式中，第二试剂是含有可检测标记物的抗体。
本公开还提供了试剂盒，用于在检测对象或样品中感兴趣切割剂存在与否的方法中使用，其中所述试剂盒至少包括本文所述的可激活抗体和/或偶联可激活抗体，用于接触对象或生物样品并且旨在检测对象或生物样品中激活的可激活抗体和/或偶联可激活抗体的水平，其中所述可激活抗体包括可检测标记物，所述可检测标记物位于CM切割后释放的可激活抗体的部分上，其中对象或生物样品中可检测水平的可检测标记物表明切割剂、靶标、或切割剂和靶标两者不存在于对象或生物样品中和/或在对象或样品中含量不足，因此无法在对象或生物样品中检测到可激活抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割，并且其中对象或生物样品中可检测标记物的可检测水平下降表明切割剂和靶标存在于对象或生物样品中。可检测标记物的水平下降是，例如，下降约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，可激活抗体包括可检测标记物。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，可检测标记物包含成像剂，对比剂，酶，荧光标记物，发色团，染料，一种或多种金属离子，或基于配体的标记物。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，成像剂包括放射性同位素。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，放射性同位素是铟或锝。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，对比剂包括碘、钆或氧化铁。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，荧光标记物包含黄色荧光蛋白(YFP)，青色荧光蛋白(CFP)，绿色荧光蛋白(GFP)，修饰的红色荧光蛋白(mRFP)，红色荧光蛋白tdimer2(RFPtdimer2)，HCRED，或铕衍生物。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，荧光标记包含N-甲基丙烯酸衍生物。在这些方法的一些实施方式中，标记物包括Alexa
Figure BDA0002266538730001701
标记物，如Alex
Figure BDA0002266538730001702
680或Alexa
Figure BDA0002266538730001703
750。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，基于配体的标记物包括生物素，亲和素，链霉亲和素或一个或多个半抗原。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法是体内方法。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法是原位方法。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法是离体方法。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，方法是体外方法。
在一些实施方式中，原位成像和/或体内成像能够用于确定治疗哪些患者的方法。例如，在原位成像中，可激活抗体用于筛选患者样品以鉴定在适当位置(例如，在肿瘤部位)具有适当蛋白酶和靶标的那些患者。
在一些实施方式中，原位成像用于鉴定或以其他方式细化适合使用本公开的可激活抗体治疗的患者群体。例如，将这样的患者鉴定为适合用包含这样可切割部分(CM)的这类可激活抗体治疗的候选者，所述患者经测试对靶标(例如，靶标)和蛋白酶呈阳性，所述蛋白酶切割进行测试的可激活抗体中CM的底物(例如，在疾病部位累积激活的抗体)。同样，将这样的患者鉴定为对另一形式的疗法合适的候选者，所述患者经测试对蛋白酶和靶标(例如，靶标)之一或两者呈阴性，所述蛋白酶切割这些方法中测试的可激活抗体中CM的底物。在一些实施方式中，可以用其他可激活抗体测试相对于第一可激活抗体经测试呈阴性的这类患者直到鉴定到对于治疗合适的可激活抗体(例如，含有在疾病部位被患者切割的CM的可激活抗体)。在一些实施方式中，然后向经测试对其呈阳性的患者给予治疗有效量的可激活抗体。
在一些实施方式中，体内成像用于鉴定或以其他方式细化适合用本公开的可激活抗体治疗的患者群体。例如，将这样的患者鉴定为适合用包含这样可切割部分(CM)的这类可激活抗体治疗的候选者，所述患者经测试对靶标(例如，靶标)和蛋白酶呈阳性，所述蛋白酶切割进行测试的可激活抗体中CM的底物(例如，在疾病部位累积激活的抗体)。此外，经测试呈阴性的患者可以被鉴定为对于其他形式的治疗合适的候选者。在一些实施方式中，可以用其他可激活抗体测试相对于第一可激活抗体经测试呈阴性的这类患者直到鉴定到对于治疗合适的可激活抗体(例如，含有在疾病部位被患者切割的CM的可激活抗体)。在一些实施方式中，然后向经测试对其呈阳性的患者给予治疗有效量的可激活抗体。
在方法和试剂盒的一些实施方式中，所述方法和试剂盒用于鉴定或以其他方式细化适合用本公开可激活抗体治疗的患者群体。例如，将这样的患者鉴定为适合用包含这样可切割部分(CM)的这类可激活抗体治疗的候选者，所述患者经测试对靶标(例如，靶标)和蛋白酶呈阳性，所述蛋白酶切割进行测试的可激活抗体中CM的底物。同样，将这样的患者鉴定为对另一形式的疗法合适的候选者，所述患者经测试对蛋白酶和靶标(例如，靶标)两者呈阴性，所述蛋白酶切割这些方法中测试的可激活抗体中CM的底物。在一些实施方式中，可以用其他可激活抗体测试这类患者直到鉴定到对于治疗合适的可激活抗体(例如，含有在疾病部位被患者切割的CM的可激活抗体)。在一些实施方式中，将这样的患者鉴定为适合用含有这样CM的这类可激活抗体治疗的候选者，所述患者经测试对靶标(例如，靶标)之一呈阴性。在一些实施方式中，将这样的患者鉴定为不适合用含有这样CM的这类可激活抗体治疗的候选者，所述患者经测试对靶标(例如，靶标)之一呈阴性。在一些实施方式中，可以用其他可激活抗体测试这类患者直到鉴定到对于治疗合适的可激活抗体(例如，含有在疾病部位被患者切割的CM的可激活抗体)。在一些实施方式中，可激活抗体是偶联治疗剂的可激活抗体。在一些实施方式中，可激活抗体不与试剂偶联。在一些实施方式中，可激活抗体包含可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物位于AB上。在一些实施方式中，测量对象或样品中可激活抗体的水平使用与激活的抗体特异性结合的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记物。在一些实施方式中，第二试剂是含有可检测标记物的抗体。
在一些实施方式中，方法或试剂盒用于鉴定或以其他方式细化这样的患者群体，所述患者群体适合用本公开的抗-靶标可激活抗体和/或偶联可激活抗体(例如，治疗剂与之偶联的可激活抗体)治疗，然后通过向有此需要的对象给予可激活抗体和/或偶联可激活抗体治疗。例如，将这样的患者鉴定为适合用含有这样可切割部分(CM)的这类偶联可激活抗体和/或这类抗体治疗的候选者，所述患者经测试对蛋白酶和靶标(例如，靶标)呈阳性，所述蛋白酶切割在这些方法中测试的激活抗体和/或偶联可激活抗体的CM中的底物，然后向患者给予治疗有效量的经测试的可激活抗体和/或偶联可激活抗体。同样，将这样的患者鉴定为对另一形式的疗法合适的候选者，所述患者经测试对蛋白酶和靶标(例如，靶标)之一或两者呈阴性，所述蛋白酶切割这些方法中测试的可激活抗体中CM的底物。在一些实施方式中，可以用其他抗体和/或偶联可激活抗体测试这类患者直到鉴定到对于治疗合适的抗体和/或偶联可激活抗体(例如，含有在疾病部位被患者切割的CM的可激活抗体和/或偶联可激活抗体)。在一些实施方式中，然后向经测试呈阳性的患者给予治疗有效量的可激活抗体和/或偶联可激活抗体。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，MM是长度为约4-40个氨基酸的肽。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，可激活抗体包含接头肽，其中所述接头肽位于MM和CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，可激活抗体包含接头肽，其中所述接头肽位于AB和CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，可激活抗体包含第一接头肽(L1)和第二接头肽(L2)，其中所述第一接头肽位于MM和CM之间，而第二接头肽位于AB和CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，L1和L2各自是长度为约1-20个氨基酸的肽，并且其中L1和L2各自不需要是相同的接头。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，L1和L2各自或者两者包含甘氨酸-丝氨酸聚合物。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，L1和L2中的至少一种包含选自下述的氨基酸序列：(GS)n，(GSGGS)n(SEQ ID NO:339)和(GGGS)n(SEQID NO:340)，其中n是至少为1的整数。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，L1和L2中的至少一种包含具有式(GGS)n的氨基酸序列，其中n是至少为1的整数。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，L1或L2中的至少一种包含选自下述的氨基酸序列：Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:341，Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:342)，Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ IDNO:343，Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:344)，Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:345)和Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO:346)。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，AB包含选自本文所示交叉反应性抗体序列的抗体或抗体片段序列。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，AB包含Fab片段，scFv或单链抗体(scAb)。
在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，切割剂是与靶标共定位于对象或样品中的蛋白酶，并且CM是作为蛋白酶的底物的多肽，其中蛋白酶在可激活抗体暴露于蛋白酶时切割可激活抗体中的CM。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，CM是长度上至15个氨基酸的多肽。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，CM与AB的N-末端偶联。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，CM与AB的C-末端偶联。在这些方法和试剂盒的一些实施方式中，CM与AB的VL链N-末端偶联。
本公开的抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体用于诊断和预防制剂。在一实施方式中，将可激活抗体给予处于患一种或多种前述炎症、炎性疾病、癌症或其他疾病风险的患者。
可以使用基因型、血清学或生化标志物确定患者或器官对一种或多种上述病症的易感性。
在本公开的一些实施方式中，将抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体给予经与一种或多种上述病症相关的临床适应症诊断的人类个体。诊断后，给予抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体以减轻或逆转临床适应症的影响。
本公开的抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体还能够用于检测患者样品中的靶标并且因此能够用于诊断。例如，本公开的抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体用于体外试验，例如，ELISA，以检测患者样品中的靶标水平。
在一实施方式中，本公开的抗体和/或可激活抗体固定在固体支持物(如微量滴定板的孔)上。固定的抗体和/或可激活抗体作为针对测试样品中可能存在的任何靶标的捕获抗体。在固定的抗体和/或可激活抗体与患者样品接触之前，清洗并用阻断剂诸如乳蛋白或白蛋白处理固体支持物以防止分析物的非特异性吸附。
然后，用疑似含有抗原的测试样品，或用含有标准量的抗原的溶液处理孔。这类样品是例如是疑似具有被认为是病理学诊断的循环抗原水平的对象的血清样品。清洗掉测试样品或标准物后，用可检测标记的二抗处理固体支持物。标记的二抗作为检测抗体。测量可检测的水平，测试样品中靶标抗原的浓度通过与发展自标准样品的标准曲线比较确定。
应当理解的是，基于使用本公开的抗体和/或可激活抗体获得的结果，在体外诊断试验中，有可能基于靶抗原的表达水平区分对象中疾病的阶段。对于特定的疾病，从被诊断处于疾病发展的多个阶段和/或处于疾病治疗的多个点上的对象中提取血液样品。使用对治疗或进展的各阶段提供统计学显著性结果的样品群体，指定了表征各阶段的抗原浓度范围。
抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体还可以用于诊断和/或成像方法。在一些实施方式中，这类方法是体外方法。在一些实施方式中，这类方法是体内方法。在一些实施方式中，这类方法是原位方法。在一些实施方式中，这类方法是离体方法。例如，具有酶促可切割CM的可激活抗体可以用于检测能够切割CM的酶的存在与否。这类可激活抗体可以用于诊断，其可以包括在给定宿主生物体的给定细胞或组织中通过测量的激活的抗体(即，导致可激活抗体切割的抗体)的累积，体内检测(例如，定性或定量)酶活性(或者在一些实施方式中，还原电位增加的环境，如可以提供二硫键还原的环境)。激活的抗体的这类累积不仅仅表明组织表达酶活性(或者取决于CM的性质，增加还原电位)，而且表明组织表达激活的抗体结合的靶标。
例如，可以选择CM成为针对存在于肿瘤部位，病毒或细菌感染部位，生物限制部位(例如，在脓肿中，在器官中等)等的蛋白酶的蛋白酶底物。AB可以是结合靶抗原的一种AB。使用本领域技术人员熟悉的方法，可检测标记物(例如，荧光标记物或放射性标记物或放射示踪物)可以与AB或可激活抗体的其他区域偶联。合适的可检测标记物讨论于上述筛选方法的上下文中并且下文提供了其他具体示例。使用对疾病阶段的蛋白质或肽具有特异性的AB，以及其活性在感兴趣的疾病组织中升高的蛋白酶，相对于其中CM特异性酶未以可检测水平存在或以比疾病组织低的水平存在或处于失活(例如，处于酶原形式或与抑制剂复合)的组织，可激活抗体将展现出与疾病组织结合的速率增加。由于肾脏过滤系统会从血液中快速清除小蛋白质和多肽，并且因为对CM具有特异性的酶未以可检测的水平存在(或以较低的水平存在于非疾病组织中或无活性构象存在)，相对于非疾病组织，疾病组织中活化的抗体的积累增强。
在另一示例中，可激活抗体可以用于检测样品中切割剂的存在与否。例如，在可激活抗体包含疑似被酶切割的CM的情况中，可激活抗体可以用于检测(定量或定性地)样品中酶的存在。在另一示例中，在可激活抗体包含疑似被还原剂切割的CM的情况中，可激活抗体可以用于检测(定量或定性地)样品中还原条件的存在。为了促进这些方法中的分析，可激活抗体可以经可检测地标记，或者可以与支持物(例如，固体支持物，如载玻片或珠)结合。可检测标记物可以位于切割后不释放的可激活抗体的部分，例如，可检测标记物可以是淬灭的荧光标记物或直到发生切割才不可检测的其他标记物。试验可以通过例如将固定的、可检测标记的可激活抗体与疑似含有酶和/或还原剂的样品接触足以使切割发生的时间，然后洗涤以去除过量的样品和污染物。样品中切割剂(例如，酶或还原剂)的存在与否然后通过在与样品接触前可激活抗体可检测信号中的改变评估，例如，由于样品中切割剂而导致的可激活抗体的切割，可检测信号的存在和/或增加。
这类检测方法也适用于检测靶标的存在与否，所述靶标当切割时能够结合可激活抗体的AB。因此，该试验适用于评估切割剂的存在与否以及感兴趣靶标的存在与否。切割剂的存在与否可以通过上述可激活抗体的可检测标记物的存在和/或增加检测，并且靶标的存在与否可以通过检测靶标-AB复合物检测，例如，通过使用可检测标记的抗-靶标抗体。
可激活抗体还能够用于原位成像，用于确认可激活抗体激活，例如，通过蛋白酶切割，和与特定靶标的结合。原位成像是使蛋白水解活性和靶标能够定位在生物样品(如细胞培养物或组织切片)中的技术。使用该技术，有可能基于可检测标记物(例如，荧光标记物)的存在确认与给定靶标的结合以及蛋白水解活性。
这些技术能够用于源自疾病部位(例如，肿瘤组织)或健康组织的任何冷冻细胞或组织。这些技术还能够用于新鲜细胞或组织样品。
在这些技术中，可激活抗体经可检测标记物标记。可检测标记物可以是荧光染料，(例如，荧光素异硫氰酸酯(FITC)，若丹明异硫氰酸酯(TRITC)，近红外(NIR)染料(例如，
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纳米晶体)，胶体金属，半抗原，放射性标志物，生物素和扩增试剂如链霉亲和素，或酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
检测已经用标记的、可激活抗体孵育的样品的标签表明样品包含靶标并且包含对可激活抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶的存在可以使用如本文所述的那些的广谱蛋白酶抑制剂确认，诸如本文所述的那些，和/或通过使用对蛋白酶具有特异性的试剂，例如，抗体如A11，其对蛋白酶间质蛋白酶具有特异性并且抑制间质蛋白酶的蛋白水解活性；参见例如，国际专利申请号WO 2010/129609，2010年11月11日公开。使用如本文所述的那些的广谱蛋白酶抑制剂和/或通过使用更具选择性的抑制剂的相同方法可以用于鉴定对可激活抗体的CM具有特异性的蛋白酶或蛋白酶类型。在一些实施方式中，靶标的存在可以使用对靶标具有特异性的试剂确认，例如，另一抗体，或者可检测标记物可以与未标记的靶标竞争。在一些实施方式中，未标记的可激活抗体可以与通过标记的二抗的检测或更复杂的检测系统联用。
相似的技术还能够用于体内成像，其中在对象，例如，哺乳动物，包括人中检测荧光信号表明疾病部位包含靶标并且包含对可激活抗体的CM具有特异性的蛋白酶。
这些技术还能够用于试剂盒和/或试剂，用于基于可激活抗体中的蛋白酶特异性CM检测、鉴定或表征各种细胞、组织和生物体中的蛋白酶活性。
在一些实施方式中，原位成像和/或体内成像能够用于确定治疗哪些患者的方法。例如，在原位成像中，可激活抗体能够用于是筛选患者样品以鉴定在适当位置(例如，在肿瘤部位)具有适当蛋白酶和靶标的那些患者。
在一些实施方式中，原位成像用于鉴定或以其他方式细化适合使用本公开可激活抗体治疗的患者群体。例如，将这样的患者鉴定为适合用包含这样可切割部分(CM)的这类可激活抗体治疗的候选者，所述患者经测试对靶标和蛋白酶呈阳性，所述蛋白酶切割进行测试的可激活抗体中CM的底物(例如，在疾病部位累积激活的抗体)。同样，将这样的患者鉴定为对另一形式的疗法合适的候选者(即不适用用正在测试的可激活抗体治疗)，所述患者经测试对蛋白酶和靶标之一或两者呈阴性，所述蛋白酶切割这些方法中测试的可激活抗体中CM的底物。在一些实施方式中，可以用其他可激活抗体测试相对于第一可激活抗体经测试呈阴性的这类患者直到鉴定到对于治疗合适的可激活抗体(例如，含有在疾病部位被患者切割的CM的可激活抗体)。
在一些实施方式中，体内成像用于鉴定或以其他方式细化适合用本公开的可激活抗体治疗的患者群体。例如，将这样的患者鉴定为适合用包含这样可切割部分(CM)的这类可激活抗体治疗的候选者，所述患者经测试对靶标和蛋白酶呈阳性，所述蛋白酶切割进行测试的可激活抗体中CM的底物(例如，在疾病位点累积激活的抗体)。同样，将经测试呈阴性的患者鉴定为对另一形式的疗法合适的候选者(即不适合用正在测试的可激活抗体治疗)。在一些实施方式中，可以用其他可激活抗体测试相对于第一可激活抗体经测试呈阴性的这类患者直到鉴定到对于治疗合适的可激活抗体(例如，含有在疾病部位被患者切割的CM的可激活抗体)。
药物组合物
本公开的抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体(在本文也称之为“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物和同源物可以被纳入适合给药的药物组合物中。这类组合物通常包含抗体、偶联抗体、可激活抗体和/或偶联可激活抗体和药学上可接受的运载体。本文所用术语“药学上可接受的运载体”旨在包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的运载体述于Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)的最新版本中，该书为该领域的标准参考文献，通过引用将其纳入本文。这类运载体或稀释剂的合适示例包括但不限于水、盐水、林格溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。还可用脂质体和非水性载剂如非挥发油。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则应考虑在组合物中使用这些介质或试剂。补充性活性化合物也可掺入所述组合物。
根据本发明的药物组合物可以包括本发明的抗体/可激活抗体和运载体。这些药物组合物可以包括在试剂盒中，例如，诊断试剂盒。
在一些实施方式中，药物组合物包含本公开的抗体、本公开的可激活抗体、本公开的偶联抗体和/或本公开的偶联可激活抗体，以及运载体。在一些实施方式中，药物组合物包含其他试剂。在一些实施方式中，其他试剂是治疗剂。
本公开的药物组合物配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的示例包括胃肠道外给药，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、透皮(即局部)、经粘膜和直肠给药。用于胃肠道外、皮内或皮下应用的溶液或悬液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF)，新泽西州帕西潘尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所有情况下，所述组合物必须无菌，并应该是达到存在易注射性(easy syringability)程度的流体。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)实现防止微生物的作用。在一些实施方式中，可能希望组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可在组合物中包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)以延长可注射组合物的吸收。
可将所需量的活性化合物和一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后过滤灭菌，从而制备无菌注射液。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散剂。在用于制备无菌注射液的无菌粉末情况中，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，得到由其之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用运载体。可以将其包封在凝胶胶囊中或压制成片剂。对于口服治疗给药目的，可用赋形剂将活性化合物掺入并以片剂、含片或胶囊的形式使用。口服组合物也可使用液体运载体制备以用作漱口水，其中液体运载体中的所述化合物口服使用以及冲刷并吐出或吞咽。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或完全氢化植物油(Sterotes)；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂。
就吸入给药而言，所述化合物以来自含合适推进剂(例如，如二氧化碳气体)或喷雾剂的受压容器或分配器的气雾剂喷雾形式递送。
也可通过经粘膜或透皮方法进行全身给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域已知，并包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻喷雾或栓剂实现。对于透皮给药，将活性化合物配制成药膏、软膏、凝胶或霜剂，如本领域通常已知的那样。
还可以栓剂(例如使用常规的栓剂基料，如可可油或其他甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备化合物用于直肠递送。
在一实施方式中，可使用运载体制备所述活性化合物，所述运载体保护所述化合物不被身体快速清除，如控释制剂，包括植入和微囊化递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备该制剂的方法是本领域技术人员显而易见的。所述材料还可购自阿尔扎公司(AlzaCorporation)和诺华制药股份有限公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)。脂质体悬浮液(包含用单克隆抗体对病毒抗原靶向感染的细胞的脂质体)还可以用作药学上可接受的运载体。这些可按本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。
尤其有益处的是配制成单位剂型的口服或肠道外组合物以便于给药和使剂量均一。本文所用的单位剂量形式指作为单一剂量用于待治疗对象的物理离散单位，每个单位包含预定量的活性化合物与所需药物运载体，所述预定量经计算能够产生所需治疗效果。本公开中剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，以及合成这种活性化合物用于治疗个体的领域中的固有限制。
这些药物组合物可与给药说明书一同包括在容器、包装或分配器内。
以下通过实施例进一步说明本发明，这些实施例对于权利要求书描述的本发明范围不构成约束。
实施例
实施例1.抗-人CD147抗体的表征
本文所提供的研究旨在评估本公开所提供的抗-人CD147抗体的结合。
使用根据本领域所熟知的小鼠杂交瘤技术获得本公开的抗-人CD147单克隆抗体。小鼠用人CD147胞外结构域(ECD)免疫，随后通过ELISA筛选杂交瘤对人CD147 ECD的结合，然后在背驮试验(piggyback assay)中确认具有细胞毒性，并通过FACS确认结合细胞表面。本公开的小鼠CD147 3A11单克隆抗体包含SEQ ID NO:4的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:9的轻链可变区(VL)，并且在本文所述的情况中用作阳性对照。
小鼠抗-人CD147单克隆抗体3A11经人源化以形成人源化抗-人CD147重链hu 3A11Hc1(VH of SEQ ID NO:1)、hu 3A11 Hc2(VH of SEQ ID NO:2)和hu 3A11 Hc3(VH of SEQID NO:3)，以及人源化抗-3A11轻链hu 3A11 Lc1(VL of SEQ ID NO:5)、hu 3A11 Lc2(VLof SEQ ID NO:6)、hu 3A11 Lc3(VL of SEQ ID NO:7)和hu 3A11 Lc4(VL of SEQ ID NO:8)。
如图1所示，本公开的人源化抗-人CD147单克隆抗体与人CD147多肽的结合亲和力使用ELISA测试。在该示例性研究中测试的本公开的抗体是hu3A11 Lc1/Hc1(SEQ ID NO:5的VL和SEQ ID NO:1的VH)。小鼠抗-人CD147单克隆抗体3A11(SEQ ID NO:8的VL和SEQ IDNO:4的VH)作为参照进行测试。使用标准ELISA方案，人CD147蛋白被吸收到ELISA板，然后用指定浓度的本公开的抗体孵育。本公开结合的人源化抗体用抗-人Fab-过氧化酶二抗检测且小鼠3A11单克隆抗体用抗-小鼠Fc-过氧化酶二抗检测，以及超级TMB检测(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))。表12中示出该示例性结合研究的表观平衡解离常数(KD)。
表12：小鼠抗-人CD147抗体对人CD147的平衡解离常数
细胞种类 K<sub>D</sub>(nM)
hu 3A11(hu Lc1/hu Hc1) 0.7099
小鼠3A11 0.2930
如图2所示，本公开的人源化抗-人CD147单克隆抗体与人CD147多肽的结合亲和力使用ELISA测试。在该示例性研究中测试的本公开的抗体是hu3A11 Lc1/hu 3A11 Hc1(SEQID NO:5的VL和SEQ ID NO:1和VH)、hu 3A11Lc2/hu 3A11 Hc2(SEQ ID NO:6的VL和SEQ IDNO:2的VH)、hu 3A11 Lc4/hu 3A11 Hc2(SEQ ID NO:8的VL和SEQ ID NO:2的VH)。使用标准ELISA方案，人CD147蛋白被吸收到ELISA板，然后用指定浓度的本公开的抗体孵育。本公开的结合的人源化抗体用抗-人Fab-过氧物酶二抗检测，和超级TMB检测(赛默飞世尔科技公司)。表13中示出该示例性结合研究的表观平衡解离常数(KD)。
表13：人源化抗-人CD147抗体对人CD147的平衡解离常数
细胞种类 K<sub>D</sub>(nM)
hu 3A11(hu Lc1/hu Hc1) 0.8518
hu 3A11(hu Lc2/hu Hc2) 0.7261
hu 3A11(hu Lc4/hu Hc2) 0.9017
实施例2.抗-人CD147介导的细胞系细胞毒性
该实施例显示了示例性人细胞系展现出对抗-人CD147-靶向的细胞毒性的敏感性。
图3A-3H显示了本公开的人源化抗-人CD147 hu 3A11 Lc1/Hc1抗体诱导某些细胞系中细胞毒性的能力。在该示例性试验中测试的细胞系源自多种瘤(Detroit 562、KYSE150、A253、SCC25、SCC9、BHY、KYSE70和SCC1)。在该示例性试验中，使用标准细胞培养技术培养指定的细胞系，并以各孔500-1000个细胞的密度铺板。本公开的人源化抗-人CD1473A11 Lc1/Hc1单克隆抗体(SEQ ID NO:1的VH；SEQ ID NO:5的VL)和抗-人小鼠IgG1-MMAE对照以指定浓度施用于细胞系，并且将vc-MMAE偶联的二抗(与vc-MMAE偶联的小鼠抗-人二抗)以与抗-人CD147抗体相等的浓度添加。目视监测平板的细胞死亡并在3-7天后使用Celltiter Glo(普洛麦格公司(Promega))评估细胞毒性。单独与vc-MMAE偶联的二抗用作对照。如图3A-3H所示，描述了示例性的图表，其显示了相对于未处理的细胞，通过抗-人CD147抗体和vc-MMAE偶联的二抗处理的细胞活力。表14示出了通过本公开的抗-人CD147抗体处理的多种示例性细胞系的EC50。
表14：抗-人CD147介导的细胞毒性
Figure BDA0002266538730001831
Figure BDA0002266538730001841
实施例3.掩蔽发现
本文所提供的研究旨在鉴定并表征用于本公开可激活抗-人CD147抗体的掩蔽部分。
将本公开的人源化抗-人CD147 3A11小鼠单克隆抗体huHc1/huLc1(SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:5的VL)用于以4x 1010的总多样性筛选随机的X15肽文库，其中X是任何氨基酸，其使用与PCT国际公开号WO 2010/081173(公开于2010年07月15日)中所述相似的方法。该筛选包括1个磁性活化细胞分选(MACS)循环和3个荧光活化细胞分选(FACS)循环。MACS和FACS分选方案示意性地示于图4。MACS分选用蛋白质-A(英杰公司(Invitrogen))实现且抗-人CD147 3A11抗体以200nM的浓度使用。对于MACS循环，筛选大约1x 1012个细胞的结合并收集1x 107个细胞。
本公开的抗-人CD147 3A11使用标准方法与AlexaFluor-488(英杰公司)偶联。确认CD147结合活性并将与AlexaFluor-488(Ab-488)偶联的抗-人CD1473A11用作所有FACS循环的荧光探针。收集自FACS循环的细菌细胞然后经染色并标记阳性克隆且如下所示进行分选：(并且如美国专利申请公开号US2009/0062142中所进一步详述)：FACS循环1中10nM3A11-488，收集最亮的2％细胞(M1F1)，FACS循环2.1中1nM 3A11-488，收集前最亮的0.2％细胞(M1F2.1)或最亮的12％细胞(M1F2.2)，在FACS循环3.1中100pM3A11-488，在PBS中以室温解离筛选8分钟，收集前0.1％的细胞。对来自M1F2.1、M1F2.2和M1F3.1群的各个克隆进行测序并示于表15。
表15.抗-人CD147掩蔽部分(MM)
MACS循环M1F2.1
Figure BDA0002266538730001843
Figure BDA0002266538730001851
MACS循环M1F2.2
Figure BDA0002266538730001852
Figure BDA0002266538730001861
MACS循环M1F3.1
Figure BDA0002266538730001862
如图5中所示，本公开的人源化抗-人CD147 3A11单克隆抗体的结合亲和力针对展示某些抗-人CD147掩蔽部分克隆的各个细菌克隆测试。在该示例性试验中，细菌克隆各自与10nM、1nM或0.1nM的AlexaFluor-488标记的本公开的人源化3A11抗体(SEQ ID NO:1的VH和SEQ ID NO:5的VL)偶联。用yPet(100nM)标记细胞以测量各克隆的表面表达。测试的掩蔽部分用如上所示的克隆编码表示。
将这些掩蔽肽用于生成本公开的抗-人CD147可激活抗体。对于这些抗-人CD147可激活抗体中的某些的序列示于下表7中。在一些实施方式中，这些抗-人CD147可激活抗体包含可切割部分2001(ISSGLLSGRSDNH；SEQ ID NO:406)、可切割部分3001(AVGLLAPPGGLSGRSDNH；SEQ ID NO:412)、可切割部分2007(ISSGLLSGRSDIH；SEQ ID NO:684)、可切割部分2008(ISSGLLSGRSDQH；SEQ ID NO:685)、可切割部分2011(ISSGLLSGRSDNP；SEQ ID NO:688)、可切割部分2012(ISSGLLSGRSANP；SEQ ID NO:689)、可切割部分2013(ISSGLLSGRSANI；SEQ ID NO:690)、可切割部分3007(AVGLLAPPGGLSGRSDIH；SEQ ID NO:692)、可切割部分3008(AVGLLAPPGGLSGRSDQH；SEQ ID NO:693)、可切割部分3011(AVGLLAPPGGLSGRSDNP；SEQ ID NO:696)、可切割部分3012(AVGLLAPPGGLSGRSANP；SEQID NO:697)或可切割部分3013(AVGLLAPPGGLSGRSANI；SEQ ID NO:698)，如所示。
虽然下示的某些序列包含SEQ ID NO:645的间隔子序列，但是本领域普通技术人员将理解的是，本公开的可激活抗-人CD147抗体可以包含任何合适的间隔子序列，例如，选自下述的间隔子序列：QGQSGQG(SEQ ID NO:645)、QGQSGQ(SEQ ID NO:424)、QGQSG(SEQ IDNO:646)、QGQS(SEQ ID NO:647)、QGQ(SEQ ID NO:648)、QG(SEQ ID NO:649)、GQSGQG(SEQID NO:666)、QSGQG(SEQ ID NO:667)、SGQG(SEQ ID NO:668)、GQG(SEQ ID NO:669)、G或Q。在一些实施方式中，本公开的可激活抗-人CD147抗体可以不具有与其N-末端连接的间隔子序列。
表16.抗-人CD147抗体序列
1.huCD147 3A11 Hc1重链:
氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMDWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSYNYATHYAASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAAGTDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:19)
2.huCD147 3A11 Hc2重链:
氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSYNYATHYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARAGTDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:20)
3.huCD147 3A11 Hc3轻链
氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSYNYATHYVASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAAGTDYWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:21)
4.huCD147 3A11 Lc1轻链:
氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:23)
5.huCD147 3A11 Lc2轻链:
氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVRTDVAWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:24)
6.huCD147 3A11 Lc3轻链:
氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSVSVGDRVTITCKASQSVRTDVAWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDFATYYCQQDYSSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:25)
7.huCD147 3A11 Lc4轻链:
氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSVSVGDRVTITCKASQSVRTDVAWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTFTISSVQPEDFATYYCQQDYSSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:26)
10.huCD147 3A11 Hc1 VH结构域:
氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMDWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSYNYATHYAASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAAGTDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)
11.huCD147 3A11 Hc2 VH结构域:
氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSYNYATHYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARAGTDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)
12.huCD147 3A11 Hc3 VH结构域:
氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSYNYATHYVASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTAVYYCTAAGTDYWGQGTLLTVSS(SEQ ID NO:3)
13.huCD147 3A11 Lc1 VL结构域:
氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:5)
14.huCD147 3A11 Lc2 VL结构域:
氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVRTDVAWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:6)
15.huCD147 3A11 Lc3 VL结构域:
氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSVSVGDRVTITCKASQSVRTDVAWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDFATYYCQQDYSSPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:7)
16.huCD147 3A11 Lc4 VL结构域:
氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSVSVGDRVTITCKASQSVRTDVAWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTFTISSVQPEDFATYYCQQDYSSPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:8)
17.小鼠3A11 VH结构域:
氨基酸序列
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVGEIRLKSYNYATHYVESVEGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTAAGTDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:4)
18.小鼠3A11 VL结构域:
氨基酸序列
SIVMTQIPKILLVSAGDRVTITCKASQSVRTDVAWYQQKPGQSPKLLIYYSSNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:9)
表17.抗-人CD147可激活抗体序列
19.[间隔子(SEQ ID NO:645)][huCD147 3A11 Lc1-215-3001VL结构域(SEQ IDNO:140)]
氨基酸序列
[QGQSGQG][RYQSCHSYWCTEGNHGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIK](SEQ ID NO:185)
21.[间隔子(SEQ ID NO:645)][huCD147 3A11 Lc1-216-3001VL结构域(SEQ IDNO:141)]
氨基酸序列
[QGQSGQG][HGPCHYNFNSGCAQFGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIK](SEQ ID NO:186)
22.[间隔子(SEQ ID NO:645)][huCD147 3A11 Lc1-217-3001VL结构域(SEQ IDNO:142)]
氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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35.[间隔子(SEQ ID NO:645)][huCD147 3A11 Lc1-444-3001VL结构域(SEQ IDNO:155)]
氨基酸序列
[QGQSGQG][THGPCHYKECDWMTIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIK](SEQ ID NO:200)
36.[间隔子(SEQ ID NO:645)][huCD147 3A11 Lc1-445-3001VL结构域(SEQ IDNO:156)]
氨基酸序列
[QGQSGQG][SHGPCHFDYQCINNTGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNHGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIK](SEQ ID NO:201)
如图6A和6B所示，本公开的抗-人CD147可激活抗体与人CD147多肽的结合亲和力使用ELISA测试。在该示例性研究中测试的本公开的可激活抗体是(a)hu 3A11 Hc1/Lc1-215-3001(SEQ ID NO:140的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(b)hu 3A11 Hc1/Lc1-216-3001(SEQID NO:141的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(c)hu 3A11 Hc1/Lc1-217-3001(SEQ ID NO:142的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(d)hu 3A11 Hc1/Lc1-221-3001(SEQ ID NO:143的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(e)hu 3A11 Hc1/Lc1-253-3001(SEQ ID NO:144的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(f)hu3A11 Hc1/Lc1-414-3001(SEQ ID NO:145的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(g)hu 3A11 Hc1/Lc1-415-3001(SEQ ID NO:146的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(h)hu 3A11 Hc1/Lc1-416-3001(SEQID NO:147的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(i)hu 3A11 Hc1/Lc1-419-3001(SEQ ID NO:148的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(j)hu 3A11 Hc1/Lc1-422-3001(SEQ ID NO:149的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(k)hu 3A11 Hc1/Lc1-428-3001(SEQ ID NO:152的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(l)hu3A11 Hc1/Lc1-445-3001(SEQ ID NO:156的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(m)hu 3A11 Hc1/Lc1-443-3001(SEQ ID NO:154的VL和SEQ ID NO:1)和(n)hu 3A11 Hc1/Lc1-440-3001(SEQ IDNO:153的VL和SEQ ID NO:1)。本公开的人源化抗-人CD147抗体hu 3A11 Hc1/Lc1(SEQ IDNO:5的VL和SEQ ID NO:1的VL)作为参照。
使用标准ELISA方案，人CD147蛋白被吸收到ELISA板，然后用指定浓度的本公开的抗体孵育。本公开的结合的人源化可激活抗体用抗-人Fab-过氧物酶二抗检测，和超级TMB检测(赛默飞世尔科技公司)。表18中示出该示例性结合研究的表观解离常数。
表18：抗-人CD147可激活抗体对人CD147的平衡解离常数
Figure BDA0002266538730001941
Figure BDA0002266538730001951
实施例4.掩蔽糖基化突变体和截短评价
本文所提供的研究旨在鉴定并表征用于本公开可激活抗-人CD147抗体的具有糖基化突变体的掩蔽部分和截短的掩蔽部分。
如表19所示，构建JS10414和JS10419掩蔽突变体的变体，其包含氨基酸取代以去除潜在的糖基化位点，或者是分离的掩蔽部分的截短形式的变体。
表19.抗-人CD147截短的掩蔽部分(MM)
Figure BDA0002266538730001952
如表20所示，构建本发明的可激活抗体以包含本发明掩蔽部分变体中的某一些。
表20.抗-人CD147可激活抗体序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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39.[间隔子(SEQ ID NO:645)][huCD147 3A11 Lc1-414.3-3001VL结构域(SEQ IDNO:159)]
氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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42.[间隔子(SEQ ID NO:645)][huCD147 3A11 Lc1-419.3-3001VL结构域(SEQ IDNO:162)]
氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
[QGQSGQG][LHGPCHYDLKCGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIK](SEQ ID NO:213)
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氨基酸序列
[QGQSGQG][LHGPCHYDLRCGGGSSGGSISSGLLSGRSANPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIK](SEQ ID NO:214)
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氨基酸序列
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50.[间隔子(SEQ ID NO:645)][huCD147 3A11 Lc1-440.1-2012VL结构域(SEQ IDNO:171)]
氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
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氨基酸序列
[QGQSGQG][TCLHLTRFNYLSCGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSANIGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRTDVGWYQQKPGKAPKLLIYYSSNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC](SEQ ID NO:317)
如图7A、7B和7C所示，本公开的抗-人CD147可激活抗体与人CD147多肽的结合亲和力使用ELISA测试。在图7A中描述的示例性研究中通过ELISA测试与人CD147多肽结合的本公开的可激活抗体是(a)hu 3A11 Hc1/Lc1-414-3001(SEQ ID NO:145的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(b)hu 3A11 Hc1/Lc1-414.1-3001(SEQ ID NO:157的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(c)hu3A11Hc1/Lc1-414.2-3001(SEQ ID NO:158的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(d)hu3A11 Hc1/Lc1-414.3-3001(SEQ ID NO:159的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(e)hu 3A11 Hc1/Lc1-419.1-3001(SEQ ID NO:160的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(f)hu 3A11 Hc1/Lc1-419.2-3001(SEQ ID NO:161的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(g)hu 3A11 Hc1/Lc1-419.3-3001(SEQ ID NO:162的VL和SEQ ID NO:1的VH)，并且还测试了本公开的人源化抗-人CD147 3A11抗体(SEQ ID NO:5的VL和SEQ ID NO:1的VH)。
在图7B中描述的示例性研究中通过ELISA测试与人CD147多肽结合的本公开的可激活抗体是(a)hu 3A11 Hc1/Lc1-414.3-2012(SEQ ID NO:163的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(b)hu 3A11 Hc1/Lc1-414.4-2012(SEQ ID NO:164的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(c)hu 3A11Hc1/Lc1-415-2012(SEQ ID NO:165的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(d)hu 3A11 Hc1/Lc1-415.1-2012(SEQ ID NO:166的VL和SEQ ID NO:1的VH)和(e)hu 3A11 Hc1/Lc1-419.3-2012(SEQ ID NO:167的VL和SEQ ID NO:1的VH)，并且还测试了本公开的人源化抗-人CD1473A11抗体(SEQ ID NO:5的VL和SEQ ID NO:1的VH)。
在图7C中描述的示例性研究中通过ELISA测试与人CD147多肽结合的本公开的可激活抗体是(a)hu 3A11 Hc1/Lc1-419.4-2012(SEQ ID NO:168的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(b)hu 3A11 Hc1/Lc1-419.5-2012(SEQ ID NO:169的VL和SEQ ID NO:1的VH)、(c)hu 3A11Hc1/Lc1-440-2012(SEQ ID NO:170的VL和SEQ ID NO:1的VH)、and(d)hu 3A11 Hc1/Lc1-440.1-2012(SEQ ID NO:171的VL和SEQ ID NO:1)，并且还测试了本公开的人源化抗-人CD1473A11抗体(SEQ ID NO:5的VL和SEQ ID NO:1的VH)。
对于图7A-7C所所述示例性试验，使用标准ELISA方案，其中人CD147蛋白被吸收到ELISA板，然后用指定浓度的本公开的抗体孵育。本公开的结合的人源化可激活抗体用抗-人Fab-过氧物酶二抗检测，和超级TMB检测(赛默飞世尔科技公司)。表21中示出该示例性结合研究的表观解离常数。
表21：抗-人CD147可激活抗体对人CD147的平衡解离常数
Figure BDA0002266538730002141
Figure BDA0002266538730002151
实施例5.多种原发性和转移性肿瘤中的CD147表达
该实施例通过使用抗-人CD147抗体的免疫组织化学(IHC)染色显示了CD147表达于许多原发性和转移性肿瘤类型中。
使用抗-人CD147抗体对多种原发性肿瘤和转移性组织微阵列(TMA)进行IHC染色，表22显示了CD147高度表达于许多原发性和转移性肿瘤样品中。在该示例性研究中，在柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠，0.05％吐温-20，pH6.0)中标准热-诱导的表位检索方法后，使用小鼠单克隆抗-人CD147抗体(克隆MEM-M6/1,阿柏堪穆公司(Abcam)编号ab78106)，以10ug/ml检测人CD147。
表22：通过免疫组织化学(IHC)的CD147表达水平
Figure BDA0002266538730002152
实施例6.多种原发性和转移性肿瘤中的CD147表达
该实施例通过使用抗-人CD147抗体的免疫组织化学(IHC)染色显示了CD147表达于多种患者源性原发性肿瘤类型中。
使用商购的抗-人CD147抗体对多种原发性肿瘤和转移性组织微阵列(TMA)进行IHC染色，图8A、8B、8C和8D显示了CD147高度表达于许多原发性和转移性肿瘤样品中。使用商购的抗-人CD147小鼠单克隆抗体(克隆MEM-M6/1，阿柏堪穆公司编号ab78106)对多种患者源性肿瘤组织微阵列(TMA)进行IHC染色，图8A显示了CD147中度或高度表达于大量和许多患者源性转移性肿瘤样品中。图8A显示了TMA的CD147的IHC染色水平的总结，显示了源自多个患者源性转移性样品的多个核心显示出强CD147信号。
图8B、8C和8D显示了使用商购的抗-人CD147小鼠单克隆抗体(克隆MEM-M6/1，阿柏堪穆公司编号ab78106)在头颈鳞状细胞癌肿瘤(图8B)、食道癌(图8C)和非小细胞肺癌(图8D)中的IHC染色。图8B、8C和8D显示了这些示例性癌症类型展现出高水平的CD147信号。
实施例7：多种细胞系中对抗-人CD147介导的细胞毒性的敏感性和CD147表达
该实施例显示了CD147在多种肿瘤源性细胞系中以高水平表达，并且这些细胞系中的许多展现出对抗-人CD147-靶向的细胞毒性的敏感性。
图9显示了指定细胞系中通过FACS分析的CD147相对表达或最大结合。FACS染色使用本公开的3A11抗-人CD147抗体(SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:5的VL)进行，然后通过偶联Alexa Fluor 647的山羊抗小鼠二抗，给定细胞系的柱高度对应CD147源性信号的相对量以及该细胞系抗-人CD147的细胞表面受体数量。给定细胞系的柱颜色显示了体外细胞毒性试验中对应细胞系的相对敏感性，其中细胞在与vc-MMAE毒素偶联的抗-人二抗存在的情况下用本公开的抗-人CD147抗体(SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:5的VL)处理。如果在用组合的抗体药物偶联物处理后观察到小于1nM的EC50，那么将细胞系分类为当用组合的抗-人CD147抗体和二抗药物偶联物处理时显示出“强烈的”细胞毒性。如果在用组合的抗体药物偶联物处理后观察到5nM-1nM的EC50，那么将细胞系分类为当用组合的抗-人CD147抗体和二抗药物偶联物处理时显示出“中度的”细胞毒性。图9显示了本公开的抗-人CD147药物偶联物展现出针对多种癌症源性细胞系强烈的或中度的细胞毒性。在某些实施方式中，本公开的抗-人CD147药物偶联物展现出针对测试的五十九(59)种癌症源性细胞系中四十四(44)种强烈的或中度的细胞毒性。在某些实施方式中，本发明的抗-人CD147抗体药物偶联物展现出针对源自乳腺癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、头颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、食道癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的癌症细胞系强烈的或中度的细胞毒性。下表23中示出测试的细胞系、其来源的组织以及观测的EC50的列表。
表23：抗-人CD147抗体药物偶联物对多种细胞系的体外细胞毒性
Figure BDA0002266538730002171
Figure BDA0002266538730002181
TNBC＝三阴性乳腺癌；NSCLC＝非小细胞肺癌；SCLC＝小细胞肺癌；HNSCC＝头颈鳞状细胞癌；CRC＝结直肠癌
实施例8：抗-人CD147结合人和食蟹猴CD147
该实施例显示了本公开的抗-人CD147抗体以相似的亲和力结合人和食蟹猴细胞系上的CD147。
图10显示了本公开的hu3A11抗-人CD147抗体(SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:5的VL)与人KYSE-70食道上皮细胞系和食蟹猴原肾上皮细胞系的结合亲和力。在该研究中，本公开的人源化抗-人CD147抗体与指定细胞系的结合使用标准FACS标记方法进行。简言之，用本公开指定的抗体——抗-人CD147抗体(人源化抗-人CD147 hu3A11抗体；SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:5的VL)以指定浓度标记细胞，然后用Alexa Fluor 647标记的山羊抗-人IgG二抗检测。这些结果显示抗-人CD147 hu3A11抗体以1.654nM的KD结合人细胞系，这与抗体与食蟹猴细胞系的亲和力(1.297nM的KD)相似。
实施例9：抗-人CD147可激活抗体药物偶联物结合活性和细胞毒性本公开的抗-人CD147可激活抗体药物偶联物与NCI H292(本文也称之为H292)细胞的结合使用FACS评价。简言之，细胞用huCD147可激活抗体药物偶联物(或可激活抗体以指定浓度孵育，随后用Alexa Fluor 647标记的山羊抗-人IgG二抗检测。如图11A所示，本公开的完整抗-人CD147可激活抗体药物偶联物(抗-人CD147 hu3A11-440.1-2012-spdb-DM4，SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:171的VL)对H292细胞显示出的亲和力Kd>100nM(图11A)。当本公开的抗-人CD147 AADC经蛋白酶(间质蛋白酶)处理时，蛋白酶水解活化的抗-人CD147AADC的结合亲和力显著增加。
图11B显示了偶联DM4的抗-人CD147可激活抗体(抗-人CD147hu3A11-440.1-2012-spdb-DM4，SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:171的VL)以比偶联DM4的完整抗-人CD147可激活抗体高的EC50体外杀伤细胞的能力。偶联DM4的完整抗-人CD147可激活抗体的细胞毒性与偶联DM4的同种型抗体的细胞毒性相似。EC50总结于以下表24中。
表24：抗-人CD147可激活抗体对人H292细胞的体外细胞毒性
Figure BDA0002266538730002191
实施例10：HT29和H292异种移植模型中的可激活抗-人CD147-AADC体内功效
该实施例显示了具有本公开偶联的毒素(AADC)的抗-人CD147可激活抗体相较于载剂对照在小鼠异种移植模型中是有效的。
图12A和12B显示了抗-人CD147可激活抗体药物偶联物(抗-人CD147hu3A11-440.1-2012-DM4，SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:171的VL)在小鼠H292(NSCLC)异种移植模型(图12A)和小鼠HT29(CRC)异种移植模型(图12B)中的功效。肿瘤生长至平均150mm3；然后将小鼠随机分入不同的组中，并在第0天用指定的测试物质给药。绘制各组的平均肿瘤体积±SEM。以2.5mg/kg或5mg/kg给药的本公开的可激活抗体药物偶联物(抗-人CD147hu3A11-440.1-2012-DM4，SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:171的VL)相较于载剂对照显示出显著较高的功效。绘制各组的平均肿瘤体积±SEM。ADC和AADC两者都诱导肿瘤消退。
实施例11：食蟹猴中抗-人CD147-AADC的体内毒性在单个5mg/kg剂量后评价与DM4偶联的完整抗-人CD147可激活抗体(AADC)和与DM4偶联的抗-人CD147抗体(ADC)在食蟹猴中的耐受(图13A-13D)。
图13A-13D中描述的研究作为3周耐受研究(非终结的)的部分进行；单个剂量n＝2。在该研究中，将具有约4.1药物-抗体比(DAR)的本公开的完整可激活抗-人CD147hu3A11-440.1-2012-spdb-DM4(“AADC”)(抗-人CD147hu3A11-440.1-2012-spdb-DM4，SEQID NO:1的VH，SEQ ID NO:171的VL)的单个剂量以4.4mg/kg给药到食蟹猴中，而具有约3.6DAR的本公开的抗-人CD147 hu3A11-spdb-DM4(“ADC”)(抗-人CD147 hu3A11-spdb-DM4，SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:5的VL)以5mg/kg给药。偶联的可激活抗体在5mg/mg良好耐受。未观测到上靶或脱靶毒性的证据。没有临床症状，体重减轻，临床化学或血液学发现。
图13A-13D显示了相较于用对应亲本抗-人CD147 ADC(抗-人CD147hu3A11-spdb-DM4，SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:5的VL)处理的猴子，基于每次血液学读数和肝毒性均无明显变化，本公开的抗-人CD147可激活抗体药物偶联物(AADC)(抗-人CD147 hu3A11-440.1-2012-spdb-DM4，SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:171的VL)在食蟹猴中展现了较高的耐受。具体地，相较于用本公开的可激活抗-人CD147 AADC处理的猴子在所有这些血液学毒素中没有显示出显著的变化(图13A-13D)，用5mg/kg亲本抗-人CD147 ADC处理的猴子显示出：基于丙氨酸转氨酶(ALT)水平的较高水平肝毒性(图13A)，基于嗜中性粒细胞计数的严重的嗜中性白血球减少症(图13B)，以及网织红细胞和单核细胞减少(图13C和13D)。
实施例12：食蟹猴中抗-人CD147-AADC和抗-人CD147 ADC的体内药代动力学和耐受
在将每个单个5mg/kg剂量给予雄性和雌性猴子后评价本公开的与DM4偶联的完整抗-人CD147可激活抗体(AADC)以及本公开的与DM4偶联的抗-人CD147抗体(ADC)在食蟹猴中的药代动力学和耐受。使用采用标准方法的抗-人IgG夹心ELISA测量人IgG的总血清水平。
图14显示了本公开的hu3A11-440.1-2012-DM4(SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:171的VL)可激活抗体药物偶联物(AADC)和hu3A11-DM4(SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO:5的VL)抗体药物偶联物(ADC)在食蟹猴中的药代动力学，证明了AADC相对于ADC在研究的雄性和雌性动物中都具有显著较长的半衰期。使用采用标准方法的抗-人IgG夹心ELISA测量人IgG的总血清水平。图15A和15B显示了相较于经测试的偶联的抗-人CD147抗体(ADC)，经测试的本公开的偶联的可激活抗-人CD147抗体(AADC)在其中良好耐受，其并不引发嗜中性白血球减少症(基于嗜中性粒细胞计数)或肝功能标志物(基于丙氨酸转氨酶(ALT)水平)的增加。
实施例13：抗-CD147抗体与糖基化和去糖基化的CD147的体外结合亲和力
本文提供了本公开的抗-人CD147抗体与CD147抗原体外结合亲和力的示例性研究。原始人CD147包含3个精氨酸(N-)糖基化位点。这些位点的糖基化可以导致高-糖基化CD147同种型(约40-60kDa，复合糖)和低-糖基化形式(约32kDa，甘露糖)。
在该实施例中，使用蛋白质去糖基化混合物II(Protein Deglycosylation MixII)(约16小时孵育，37℃；新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，目录号P6044S)或酶促蛋白质去糖基化试剂盒(Enzymatic Protein Deglycosylation Kit)(约1.5天+孵育，37℃；西格玛奥利奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号EDEGLY)按照其各自的方案将重组人CD147-Fc嵌合蛋白质(R&D系统公司(R&D Systems)，目录号927-EMN-050)N-和简单O-连接的糖去糖基化。观测到糖基化的CD147-Fc融合蛋白在约62kDa迁移，同时观测到经任一去糖基化试剂盒处理的CD147-Fc融合蛋白在52和48kDa迁移。将含有N-和O-连接的糖的牛胎球蛋白用作去糖基化程度的对照。
用PBS缓冲液交换后，去糖基化或糖基化蛋白以1μg/mL被吸附到ELISA上。如图16所示，本公开的人源化抗-CD147单克隆抗体(3A11 Lc1/Hc1，具有SEQ ID NO:5的VL和SEQID NO:1的VH)的体外结合亲和力使用标准ELISA方案通过将吸附的蛋白质与指定浓度的本公开的抗-CD147人源化抗体孵育确定。本公开结合的人源化抗体用抗-人Fab-过氧化酶二抗检测且小鼠3A11单克隆抗体用抗-小鼠Fc-过氧化酶二抗检测，以及超级TMB检测(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))。表25中示出该示例性结合研究的表观平衡解离常数(KD)。
表25：抗-人CD147抗体与糖基化和去糖基化的人CD147的体外结合亲和力
抗原 B<sub>最大</sub> K<sub>D</sub>(nM)
CD147-Fc(糖基化的) 3.095 0.1914
CD147-Fc(去糖基-NEB) 2.997 0.1851
CD147-Fc(去糖基化-西格玛) 3.050 0.1753
这些示例性数据证明本公开的抗-CD147人源化抗体以相当的亲和力结合糖基化和去糖基化的CD147抗原。
说明性实施方式
将通过参照下述条款来说明本发明：
1.一种特异性结合哺乳动物CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)。一种特异性结合哺乳动物CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB特异性结合人CD147和食蟹猴CD147。一种特异性结合人CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)。一种特异性结合食蟹猴CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)。一种特异性结合人CD147和食蟹猴CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)。一种特异性结合糖基化和去糖基化的人和/或食蟹猴CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)。
2.如条款1所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下述的氨基酸序列：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VHCDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，或
(b)抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下述的氨基酸序列：VH CDR1序列GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ IDNO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VLCDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，或
(b)抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下述的氨基酸序列：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ IDNO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)；VLCDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)；和/或
(d)抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:5-9、140-182和185-227的氨基酸序列，优选具有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列的轻链可变区；和/或
(e)其抗原结合片段选自：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单域重链抗体和单域轻链抗体。
3.如条款1或2中任一项所述的分离抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)其中所述AB特异性地结合人CD147；或
(ii)所述分离抗体或其抗原结合片段特异性地结合去糖基化的哺乳动物CD147和哺乳动物糖基化的CD147，任选地，其中哺乳动物CD147是人。
4.一种分离抗体或其抗原结合片段，其与条款1-3中任一项所述分离抗体结合人CD147和/或食蟹猴CD147上的相同表位，或者其与条款1-3中任一项所述分离抗体交叉竞争结合人CD147和/或食蟹猴CD147(抑制条款1-3中任一项所述分离抗体的结合)。
5.一种在其激活状态时结合CD147的可激活抗体，其包含：
根据条款1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段(AB)；
偶联AB的掩蔽部分(MM)，其中当所述可激活抗体处于未切割(未激活)状态时，所述MM抑制所述AB与CD147的结合；和
偶联AB的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽。
6.如条款5所述的可激活抗体，其中：
(a)所述MM：
(i)对于结合所述AB具有大于所述AB与CD147解离常数的解离常数；和/或
(ii)当所述可激活抗体处于切割状态时，不干扰也不竞争所述AB与CD147结合；和/或
(iii)是长度不超过40个氨基酸的多肽；和/或
(iv)多肽序列不同于人CD147的多肽序列；和/或
(v)多肽序列与所述AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过50％；和/或
(vi)包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列；优选选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100；和/或
(b)所述CM：
(i)是在疾病组织中具有活性的蛋白酶的底物；和/或
(ii)包含选自SEQ ID NO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列；优选选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808。
7.如条款5-6中任一项所述的可激活抗体，其中：
(i)所述AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列；和/或
(ii)所述AB连接所述CM；优选其中所述AB直接连接所述CM或者其中所述AB经由连接肽连接所述CM；和/或
(iii)所述MM连接所述CM，从而使处于未切割状态的所述可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM；和/或
(iv)所述可激活抗体包含介于所述MM和所述CM之间的连接肽，或者包含介于所述CM和所述AB之间的连接肽；和/或
(v)所述可激活抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于未切割状态的可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM，任选地，其中所述两个连接肽不需要彼此相同，和/或任选地，其中LP1和LP2各自是长度为约1-20个氨基酸的肽。
8.如条款5-7中任一项所述的可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含：
(i)选自SEQ ID NO:1-4和19-22的重链序列和含有选自SEQ ID NO:5-9、23-27、140-182、185-227、230-272和275-317的氨基酸序列的轻链序列；或
(ii)氨基酸序列的组合，其中所述氨基酸序列的组合选自表4中的各单行，
其中对于给定组合，
(a)所述AB的重链包含对应表4所列一行中给定组合的VH CDR序列的氨基酸序列，
(b)所述AB的轻链包含对应表4所列一行中给定组合的VL CDR序列的氨基酸序列，
(c)所述MM包含对应表4所列一行中给定组合的所述掩蔽序列(MM)的氨基酸序列，和
(d)所述CM包含对应表4所列一行中给定组合的底物序列(CM)的氨基酸序列；或
(iii)氨基酸序列的组合，其中，对于氨基酸序列的给定组合，
(a)所述AB的重链包含选自表5对应列中所列VH序列或VH CDR序列的VH序列或VHCDR序列的氨基酸序列，
(b)所述AB的轻链包含选自表5对应列中所列VL序列或VL CDR序列的VL序列或VLCDR序列的氨基酸序列，
(c)所述MM包含选自表5对应列中所列掩蔽序列(MM)的MM序列的氨基酸序列，和
(d)所述CM包含选自表5对应列中所列底物序列(CM)的CM序列的氨基酸序列。
9.如条款5-8中任一项所述的可激活抗体，其包含MM和CM，所述MM包含选自SEQ IDNO:30-100的氨基酸序列，而CM包含选自SEQ ID NO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列；优选地
其中，所述MM包含选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100的氨基酸序列，而CM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列；和/或任选地
其中，所述AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ IDNO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-8、140-182和185-227的氨基酸序列。
10.一种偶联抗体或偶联可激活抗体，其包含与试剂偶联的条款1-4中任一项所述的抗体或者与试剂偶联的条款5-9中任一项所述的可激活抗体，任选地，其中
(i)所述试剂是毒素或其片段和/或微管抑制剂，并且任选地
(a)所述试剂是核酸破坏剂；或
(b)所述试剂选自尾海兔素或其衍生物，澳瑞他汀或其衍生物，美登木素或其衍生物，多卡霉素或其衍生物，卡奇霉素或其衍生物，吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730002271
或其衍生物，澳瑞他汀E或其衍生物，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM1，美登木素DM4，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，或吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730002272
二聚物；和/或
(c)其中所述试剂经由接头偶联AB，任选地其中，偶联所述试剂与所述AB的接头包含SPDB部分，vc部分或PEG2-vc部分，并且任选地其中，所述偶联AB的接头和毒素包含SPDB-DM4部分，vc-MMAD部分，vc-MMAE部分，vc-多卡霉素部分或PEG2-vc-MMAD部分；或
(d)其中所述试剂经由接头偶联所述AB，其中所述接头是可切割接头或不可切割接头；或
(ii)其中所述试剂是可检测部分，任选地其中所述可检测部分是诊断剂。
11.一种偶联抗体，其包含：
(a)特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含：
(i)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VHCDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，或
(ii)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9、140-182和185-227的氨基酸序列；
(b)与所述AB偶联的试剂，其中所述试剂选自澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730002281
吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730002282
二聚物，多卡霉素和卡奇霉素。
12.一种在其激活状态时结合CD147的偶联可激活抗体，其包含：
根据条款1所述的抗体或其抗原结合片段(AB)；
掩蔽部分(MM)，其当所述可激活抗体处于未切割状态时抑制AB与CD147的结合；优选其中所述MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列；更优选其中所述MM包含选自SEQID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100的氨基酸序列；
偶联所述AB的可切割部分(MM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽；优选其中所述CM包含选自SEQ ID NO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列；更优选其中所述CM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列；和
与所述AB偶联的试剂，
其中所述AB包含：
(i)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VHCDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，或
(ii)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9、140-182和185-227的氨基酸序列；或
(iii)重链和轻链，所述重链含有选自SEQ ID NO:19-22的氨基酸序列，而所述轻链含有选自SEQ ID NO:23-27、230-272和275-317的氨基酸序列；和
其中所述试剂选自澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730002283
吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002266538730002284
二聚物，多卡霉素和卡奇霉素；并且任选地，其中所述试剂经由接头与所述AB偶联，优选地其中，所述试剂偶联所述AB所采用的所述接头包含SPDB部分，vc部分或PEG2-vc部分，更优选地其中，所述偶联AB的接头和毒素包含SPDB-DM4部分，vc-MMAD部分，vc-MMAE部分，vc-多卡霉素部分或PEG2-vc-MMAD部分。
13.一种偶联可激活抗体或偶联抗体，其包含：
在其处于激活状态时结合CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)；和
经由接头偶联所述AB的毒素，
其中所述偶联可激活抗体或所述偶联抗体包含选自表9中一行的氨基酸序列、接头和毒素，其中对于给定组合：
(a)所述AB包含重链，所述重链包含对应表9所列一行中给定组合的重链可变结构域序列或重链序列的氨基酸序列，
(b)所述AB包含轻链，所述轻链包含对应表9所列一行中给定组合的轻链可变结构域序列或轻链序列的氨基酸序列，和
(c)所述接头和毒素包含对应表9所列一行中给定组合的所述接头和所述毒素。
14.一种药物组合物，其包含条款1-4中任一项所述的抗体，条款5-9中任一项所述的可激活抗体，或条款10-13中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体；和运载体。
15.如条款14所述的药物组合物，其包含其他试剂；任选地其中所述其他试剂是治疗剂。
16.一种编码条款1-4中任一项所述分离抗体或条款5-9中任一项所述可激活抗体的分离核酸分子。
17.一种包含条款16所述分离核酸分子的载体。
18.一种通过在导致抗体或可激活抗体表达的条件下培养细胞产生所述抗体或可激活抗体的方法，其中，所述细胞包含条款16所述的核酸分子或条款17所述的载体。
19.一种制造在其激活状态下结合CD147的可激活抗体的方法，所述方法包括：
(a)在导致所述可激活抗体表达的条件下培养含有编码所述可激活抗体的核酸构建体的细胞，其中所述可激活抗体包含条款5-9中任一项所述的可激活抗体；
和
(b)回收所述可激活抗体。
20.条款1-4中任一项所述的抗体、条款5-9中任一项所述的可激活抗体、条款10-13中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体或条款14或15中任一项所述的药物组合物，用于治疗与表达CD147的细胞相关的或其中疾病细胞表达CD147的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法。
21.如条款20所述用途的抗体、可激活抗体、偶联抗体、偶联可激活抗体或药物组合物，其中，
(i)所述紊乱或疾病是癌症；任选地其中，所述癌症是腺癌，胆道(胆汁)癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，三阴性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，类癌，宫颈癌，胆管癌，结直肠癌，结肠癌，子宫内膜癌，食道癌，胶质瘤，头颈癌，头颈部鳞状细胞癌，白血病，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，口咽癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，转移性去势抵抗性前列腺癌，肾癌，肉瘤，皮肤癌，鳞状细胞癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，泌尿生殖系统癌或尿路上皮癌；或
(ii)其中所述方法用于抑制或降低表达哺乳动物CD147的细胞的生长、增殖或转移，任选地其中所述哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的，或
(iii)其中所述方法用于抑制、阻断或预防天然配体与哺乳动物CD147的结合，任选地其中所述哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的；和/或
(iv)其中所述方法包括给予其他试剂，任选地其中所述其他试剂是治疗剂。
虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书所限定。其他方面、优势和修改将在下述范围内。

Claims (102)

1.一种特异性结合人CD147和食蟹猴CD147的分离抗体或其抗原结合片段(AB)。
2.如权利要求1所述的分离抗体，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含含有选自下述的氨基酸序列的氨基酸序列：
(a)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，
(b)VH CDR1序列GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VLCDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，和
(c)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)；VLCDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)。
3.如权利要求1或2所述的分离抗体，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列。
4.一种与权利要求1-4中任一项所述分离抗体结合人CD147和/或食蟹猴CD147上的相同表位的分离抗体或其抗原结合片段。
5.一种抑制权利要求1-3中任一项所述的分离抗体与人CD147和/或食蟹猴CD147结合的分离抗体或其抗原结合片段。
6.一种在其激活状态时结合CD147的可激活抗体，其包含：
特异性结合人CD147和食蟹猴CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)；
偶联所述AB的掩蔽部分(MM)，其中当所述可激活抗体处于未切割状态时，所述MM抑制所述AB与CD147的结合；和
偶联所述AB的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽。
7.如权利要求6所述的可激活抗体，其中，所述MM结合所述AB的解离常数大于所述AB与CD147的解离常数。
8.如权利要求6或7所述的可激活抗体，其中，当所述可激活抗体处于切割状态时，所述MM不干扰也不竞争所述AB与CD147结合。
9.如权利要求6-8中任一项所述的可激活抗体，其中，所述MM是长度不超过40个氨基酸的多肽。
10.如权利要求6-9中任一项所述的可激活抗体，其中，所述MM多肽序列与人CD147不同。
11.如权利要求6-10中任一项所述的可激活抗体，其中，所述MM多肽序列与所述AB的任何天然结合伴侣的相同性不超过50％。
12.如权利要求6-11中任一项所述的可激活抗体，其中，所述MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列。
13.如权利要求6-12中任一项所述的可激活抗体，其中，所述MM包含选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100的氨基酸序列。
14.如权利要求6-13中任一项所述的可激活抗体，其中，所述CM是在疾病组织中具有活性的蛋白酶的底物。
15.如权利要求6-14中任一项所述的可激活抗体，其中，所述CM包含选自SEQ ID NO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列。
16.如权利要求6-15中任一项所述的可激活抗体，其中，所述MM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。
17.如权利要求1-5、99和100中任一项所述的抗体或权利要求6-16中任一项所述的可激活抗体，其中，所述其抗原结合片段选自：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单域重链抗体和单域轻链抗体。
18.如权利要求1-5、99和100中任一项所述的抗体或权利要求6-17中任一项所述的可激活抗体，其中，所述AB特异性地结合人CD147。
19.如权利要求6-18中任一项所述的可激活抗体，其中，所述AB包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ IDNO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。
20.如权利要求6-19中任一项所述的可激活抗体，其中，所述AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-8的氨基酸序列。
21.如权利要求6-20中任一项所述的可激活抗体，其中，所述AB连接所述CM。
22.如权利要求6-21中任一项所述的可激活抗体，其中，所述AB直接连接所述CM。
23.如权利要求6-21中任一项所述的可激活抗体，其中，所述AB经由连接肽连接所述CM。
24.如权利要求6-23中任一项所述的可激活抗体，其中，所述MM连接所述CM，从而使处于未切割状态的所述可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
25.如权利要求6-24中任一项所述的可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含介于所述MM和所述CM之间的连接肽。
26.如权利要求6-24中任一项所述的可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含介于所述CM和所述AB之间的连接肽。
27.如权利要求6-26中任一项所述的可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于未切割状态的所述可激活抗体从N-末端到C-末端具有下述结构排布：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。
28.如权利要求27所述的可激活抗体，其中，所述2个连接肽不需要彼此相同。
29.如权利要求27或28所述的可激活抗体，其中，LP1和LP2各自是长度为约1-20个氨基酸的肽。
30.如权利要求6-29中任一项所述的可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含重链序列和轻链序列，所述重链序列选自SEQ ID NO:1-4和19-22，而所述轻链序列包含选自SEQ IDNO:5-9、23-27、140-182、185-227、230-272和275-317的氨基酸序列。
31.如权利要求6-29中任一项所述的可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含氨基酸序列的组合，其中所述氨基酸序列的组合选自表4中的各单行，
其中对于给定组合，
(a)所述AB的重链包含对应表4所列一行中给定组合的VH CDR序列的氨基酸序列，
(b)所述AB的轻链包含对应表4所列一行中给定组合的VL CDR序列的氨基酸序列，
(c)所述MM包含对应表4所列一行中给定组合的掩蔽序列(MM)的氨基酸序列，和
(d)所述CM包含对应表4所列一行中给定组合的底物序列(CM)的氨基酸序列。
32.如权利要求6-29中任一项所述的可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含氨基酸序列的组合，其中对于氨基酸序列的给定组合，
(a)所述AB的重链包含选自表5对应列中所列VH序列或VH CDR序列的VH序列或VH CDR序列的氨基酸序列，
(b)所述AB的轻链包含选自表5对应列中所列VL序列或VL CDR序列的VL序列或VL CDR序列的氨基酸序列，
(c)所述MM包含选自表5对应列中所列掩蔽序列(MM)的MM序列的氨基酸序列，和
(d)所述CM包含选自表5对应列中所列底物序列(CM)的CM序列的氨基酸序列。
33.一种可激活抗体，其包含特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，MM和CM，其中所述可激活抗体包含：
重链序列，所述重链序列包含选自SEQ ID NO:1-4和19-22的氨基酸序列；和
轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:5-9、23-27、140-182、185-227、230-272和275-317的氨基酸序列。
34.一种可激活抗体，其包含特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列的MM，和包含选自SEQ ID NO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列的CM。
35.如权利要求34所述的可激活抗体，其中，所述MM包含选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100的氨基酸序列，而所述CM包含选自SEQ ID NO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。
36.如权利要求34或35所述的可激活抗体，其中，所述AB包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。
37.如权利要求34-36中任一项所述的可激活抗体，其中，所述AB包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-8、140-182和185-227的氨基酸序列。
38.一种可激活抗-人CD147抗体，其包含：
特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB特异性地结合人CD147和/或食蟹猴CD147上与权利要求1-5、99和100中任一项所述分离抗体的相同表位；
掩蔽部分(MM)，当所述可激活抗体处于未切割状态时，其抑制所述AB与CD147的结合；和
偶联所述AB的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽。
39.一种可激活抗-人CD147抗体，其包含：
特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB与权利要求1-5、99和100中任一项所述的分离抗体特异性地交叉竞争结合人CD147和/或食蟹猴CD147；
掩蔽部分(MM)，当所述可激活抗体处于未切割状态时，其抑制所述AB与CD147的结合；和
偶联所述AB的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽。
40.一种偶联抗体或偶联可激活抗体，其包含与试剂偶联的权利要求1-5、99和100中任一项所述的抗体或者与试剂偶联的权利要求6-39中任一项所述的可激活抗体。
41.如权利要求40所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是毒素或其片段。
42.如权利要求40或41所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是微管抑制剂。
43.如权利要求40或41所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是核酸破坏剂。
44.如权利要求40或41所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂选自尾海兔素或其衍生物，澳瑞他汀或其衍生物，美登木素或其衍生物，多卡霉素或其衍生物，卡奇霉素或其衍生物，和吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0002266538720000081
或其衍生物。
45.如权利要求40-42和44中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是澳瑞他汀E或其衍生物。
46.如权利要求40-42和44中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
47.如权利要求40-42和44中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。
48.如权利要求40-42和44中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是选自DM1和DM4的美登木素。
49.如权利要求40-42和44中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是美登木素DM4。
50.如权利要求40、41、43和44中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是多卡霉素。
51.如权利要求40-50中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂经由接头偶联所述AB。
52.如权利要求40-51中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述偶联所述试剂与所述AB的接头包含SPDB部分、vc部分或PEG2-vc部分。
53.如权利要求40-52中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，与所述AB偶联的接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-多卡霉素部分或PEG2-vc-MMAD部分。
54.如权利要求51所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述接头是可切割接头。
55.如权利要求51所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述接头是不可切割接头。
56.如权利要求40和51-55中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述试剂是可检测部分。
57.如权利要求56所述的偶联抗体或偶联可激活抗体，其中，所述可检测部分是诊断剂。
58.一种在其激活状态时结合CD147的偶联可激活抗体，其包含：
特异性结合人CD147和食蟹猴CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)；
掩蔽部分(MM)，当所述可激活抗体处于未切割状态时，其抑制所述AB与CD147的结合；和
偶联AB的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽；和
与所述AB偶联的试剂。
59.如权利要求58所述的偶联可激活抗体，其中，所述试剂选自尾海兔素或其衍生物，澳瑞他汀或其衍生物，美登木素或其衍生物，多卡霉素或其衍生物，卡奇霉素或其衍生物，和吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0002266538720000101
或其衍生物。
60.如权利要求58或59所述的偶联可激活抗体，其中，所述试剂选自澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，卡奇霉素，多卡霉素，吡咯并苯并二氮杂和吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0002266538720000103
二聚物。
61.如权利要求58-60中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述试剂经由接头偶联所述AB。
62.如权利要求58-61中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述偶联所述试剂与所述AB的接头包含SPDB部分、vc部分或PEG2-vc部分。
63.如权利要求58-62中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述与所述AB偶联的接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-多卡霉素部分或PEG2-vc-MMAD部分。
64.如权利要求58-63中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VHCDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)。
65.如权利要求58-64中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9、140-182和185-227的氨基酸序列。
66.如权利要求58-65中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述MM包含选自SEQ IDNO:30-100的氨基酸序列。
67.如权利要求58-66中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述MM包含选自SEQ IDNO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100的氨基酸序列。
68.如权利要求58-67中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述CM包含选自SEQ IDNO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列。
69.如权利要求58-68中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述CM包含选自SEQ IDNO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。
70.如权利要求58-69中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含氨基酸序列的组合，其中所述氨基酸序列的组合选自表4中的各单行，
其中对于给定组合，
(a)所述AB的重链包含对应表4所列一行中给定组合的VH CDR序列的氨基酸序列，
(b)所述AB的轻链包含对应表4所列一行中给定组合的VL CDR序列的氨基酸序列，
(c)所述MM包含对应表4所列一行中给定组合的掩蔽序列(MM)的氨基酸序列，和
(d)所述CM包含对应表4所列一行中给定组合的底物序列(CM)的氨基酸序列。
71.如权利要求58-70中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含氨基酸序列的组合，其中对于氨基酸序列的给定组合，
(a)所述AB的重链包含选自表5对应列中所列VH序列或VH CDR序列的VH序列或VH CDR序列的氨基酸序列，
(b)所述AB的轻链包含选自表5对应列中所列VL序列或VL CDR序列的VL序列或VL CDR序列的氨基酸序列，
(c)所述MM包含选自表5对应列中所列掩蔽序列(MM)的MM序列的氨基酸序列，和
(d)所述CM包含选自表5对应列中所列底物序列(CM)的CM序列的氨基酸序列。
72.如权利要求58-71中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述可激活抗体包含：
重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:1-4和19-22的氨基酸序列；和
轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:5-9、23-27、140-182、185-227、230-272和275-317的氨基酸序列。
73.一种偶联抗体，其包含：
(a)特异性结合哺乳动物CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含：
(i)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，或
(ii)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9、140-182和185-227的氨基酸序列；
(b)与所述AB偶联的试剂，其中所述试剂选自澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0002266538720000131
吡咯并苯并二氮杂二聚物，多卡霉素和卡奇霉素。
74.一种在其激活状态时结合CD147的偶联可激活抗体，其包含：
特异性结合人CD147和食蟹猴CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)；
掩蔽部分(MM)，当所述可激活抗体处于未切割状态时，其抑制所述AB与CD147的结合；和
偶联AB的可切割部分(CM)，其中所述CM是作为蛋白酶底物的多肽；和
与所述AB偶联的试剂，
其中所述AB包含：
(i)VH CDR1序列GFTFSNYWMN(SEQ ID NO:10)或GFTFSNYWMD(SEQ ID NO:11)；VH CDR2序列EIRLKSYNYATH(SEQ ID NO:12)；VH CDR3序列AGTDY(SEQ ID NO:13)；VL CDR1序列KASQSVRTDVA(SEQ ID NO:14)或RASQSVRTDVG(SEQ ID NO:15)；VL CDR2序列YSSNRYT(SEQID NO:16)；和VL CDR3序列QQDYSSPFT(SEQ ID NO:17)或QQDYSSPYT(SEQ ID NO:18)，或
(ii)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有选自SEQ ID NO:1-4的氨基酸序列，而所述轻链可变区含有选自SEQ ID NO:5-9、140-182和185-227的氨基酸序列；或
(iii)重链和轻链，所述重链含有选自SEQ ID NO:19-22的氨基酸序列，而所述轻链含有选自SEQ ID NO:23-27、230-272和275-317的氨基酸序列；和
其中所述试剂选自澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，美登木素DM4，美登木素DM1，吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0002266538720000143
吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0002266538720000142
二聚物，多卡霉素和卡奇霉素。
75.如权利要求74所述的偶联可激活抗体，其中，所述MM包含选自SEQ ID NO:30-100的氨基酸序列。
76.如权利要求74或75所述的偶联可激活抗体，其中，所述MM包含选自SEQ ID NO:30、31、33、44、46、75-80、82、83和86-100的氨基酸序列。
77.如权利要求74-76中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述CM包含选自SEQ IDNO:356-423、680-698、713、714和789-808的氨基酸序列。
78.如权利要求74-77中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述CM包含选自SEQ IDNO:359、370、377、382、390、397、406-423、680-698、713、714和807-808的氨基酸序列。
79.如权利要求74-78中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述试剂经由接头偶联所述AB，并且其中偶联所述试剂与所述AB的接头包含SPDB部分、vc部分或PEG2-vc部分。
80.如权利要求74-79中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述与所述AB偶联的接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-多卡霉素部分或PEG2-vc-MMAD部分。
81.一种偶联可激活抗体或偶联抗体，其包含：
在其处于激活状态时结合CD147的抗体或其抗原结合片段(AB)；和
经由接头偶联所述AB的毒素，
其中所述偶联可激活抗体或所述偶联抗体包含选自表9中一行的氨基酸序列、接头和毒素，其中对于给定组合：
(a)所述AB包含重链，所述重链包含对应表9所列一行中给定组合的重链可变结构域序列或重链序列的氨基酸序列，
(b)所述AB包含轻链，所述轻链包含对应表9所列一行中给定组合的轻链可变结构域序列或轻链序列的氨基酸序列，和
(c)所述接头和毒素包含对应表9所列一行中给定组合的所述接头和所述毒素。
82.一种药物组合物，其包含权利要求1-5、99和100中任一项所述的抗体，权利要求6-39中任一项所述的可激活抗体，或权利要求40-81中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体；和运载体。
83.如权利要求82所述的药物组合物，其包含其他试剂。
84.如权利要求83所述的药物组合物，其中，所述其他试剂是治疗剂。
85.一种编码权利要求1-5、99和100中任一项所述的分离抗体或权利要求6-39中任一项所述可激活抗体的分离核酸分子。
86.一种包含权利要求85所述的分离核酸分子的载体。
87.一种通过在导致抗体或可激活抗体表达的条件下培养细胞产生所述抗体或可激活抗体的方法，其中，所述细胞包含权利要求85所述的核酸分子或权利要求86所述的载体。
88.一种制造在其激活状态下结合CD147的可激活抗体的方法，所述方法包括：
(a)在导致所述可激活抗体表达的条件下培养含有编码所述可激活抗体的核酸构建体的细胞，其中所述可激活抗体包含权利要求6-39中任一项所述的可激活抗体；
和
(b)回收所述可激活抗体。
89.一种治疗其中疾病细胞表达CD147的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的权利要求1-5、99和100中任一项所述的抗体、权利要求6-39中任一项所述的可激活抗体、权利要求40-81中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体或权利要求82-84中任一项所述的药物组合物。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述紊乱或疾病是癌症。
91.一种治疗与表达CD147的细胞相关的紊乱或疾病、减轻其症状、或延缓其发展的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的权利要求1-5、99和100中任一项所述的抗体、权利要求6-39中任一项所述的可激活抗体、权利要求40-81中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体或权利要求82-84中任一项所述的药物组合物。
92.如权利要求91所述的方法，其中，所述与表达CD147的细胞相关的紊乱或疾病是癌症。
93.如权利要求90或92所述的方法，其中，所述癌症是腺癌，胆道(胆汁)癌，膀胱癌，骨癌，乳腺癌，三阴性乳腺癌，Her2阴性乳腺癌，类癌，宫颈癌，胆管癌，结直肠癌，结肠癌，子宫内膜癌，食道癌，胶质瘤，头颈癌，头颈部鳞状细胞癌，白血病，肝癌，肺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，淋巴瘤，黑色素瘤，口咽癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，转移性去势抵抗性前列腺癌，肾癌，肉瘤，皮肤癌，鳞状细胞癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，泌尿生殖系统癌或尿路上皮癌。
94.一种抑制或降低表达哺乳动物CD147的细胞的生长、增殖或转移的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的权利要求1-5中任一项所述的抗体、权利要求6-39中任一项所述的可激活抗体、权利要求40-81中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体或权利要求82-84中任一项所述的药物组合物。
95.一种抑制、阻断或预防天然配体与哺乳动物CD147结合的方法，其包括向有此需要的对象给予治疗有效量的权利要求1-5、99和100中任一项所述的抗体、权利要求6-39中任一项所述的可激活抗体、权利要求40-81中任一项所述的偶联抗体或偶联可激活抗体或权利要求82-84中任一项所述的药物组合物。
96.如权利要求94或95中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物CD147的表达和/或活性是异常的。
97.如权利要求89-96中任一项所述的方法，其中，所述方法包括给予其他试剂。
98.如权利要求97所述的方法，其中，所述其他试剂是治疗剂。
99.如权利要求1-5中任一项所述的分离抗体，其中，所述分离抗体或其抗原结合片段特异性地结合去糖基化的CD147和糖基化的CD147。
100.如权利要求99所述的分离抗体，其中，所述CD147是人CD147。
101.如权利要求6-39中任一项所述的可激活抗体或权利要求40-57、73和81中任一项所述的偶联抗体或权利要求40-72和74-81中任一项所述的偶联可激活抗体，其中，所述AB特异性地结合去糖基化的CD147和糖基化的CD147。
102.如权利要求101所述的可激活抗体，其中，所述CD147是人CD147。
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