CN112341544A - 一种抗cd147的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗CD147的抗体及其制备方法和应用，属于生物领域。一种抗CD147的抗体，所述抗CD147的抗体是由抗体重链的可变区和轻链的可变区通过短肽连接而成的；包含由SEQ ID NO：1所示的CDR1、由SEQ ID NO:2所示的CDR2、由SEQ ID NO:3所示的CDR3、由SEQ ID NO：4所示的CDR1、由SEQ ID NO：5所示的CDR2以及由SEQ ID NO：6所示的CDR3；本发明其能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强、半衰期短和抗原性弱等特点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。

Description

一种抗CD147的抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗CD147的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
CD147属免疫球蛋白超家族(IgsF)成员，已被确认为是黏附分子家族的新成员，人的CD147基因定位于染色体19p13.3，编码区编码269个氨基酸，21个氨基酸为信号肽，中间185个氨基酸构成胞外结构域，接下来24个氨基酸为跨膜区，C端39个氨基酸为胞内结构域；CD147蛋白相对分子质量为50-60kDa，广泛表达于细胞表面；CD147蛋白糖基化的方式和程度具有组织特异性和种属特异性，使CD147的相对分子质量在44-66kDa之间变动；CD147高糖基化分子量为45-65kDa，一般认为是成熟蛋白；低糖基化分子量为约35kDa，一般认为是翻译后修饰过程中的过渡形式。
目前市面上的人CD147抗体主要有鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体；鼠源单克隆抗体的制备需要大量的免疫原、长达2个月的免疫周期、至少两个月的融合筛选时间以及后期各种验证；过程复杂，费时费工、成本高，且抗体需要依靠杂交瘤细胞株的存活传代来保存，杂交瘤细胞的退化或死亡都会导致抗体丢失；此外小鼠自身携带的IgG会干扰抗体的验证结果且实验过程中实验人员有被小鼠病毒感染的风险；兔源多克隆抗体制备周期短，成本低，但是多克隆抗体的批次间差异大，非特异性抗体含量高，某些验证中会产生较强的背景信号影响结果判断。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中鼠源单克隆抗体制备周期长、成本高、细胞株易丢失问题，多克隆抗体的批次间差异大、非特异性抗体含量高问题，而提出的一种抗CD147的抗体及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种抗CD147的抗体，所述抗CD147的抗体是由抗体重链的可变区和轻链的可变区通过短肽连接而成的。
优选的，包含由SEQ ID NO：1所示的CDR1、由SEQ ID NO:2所示的CDR2、由SEQ IDNO:3所示的CDR3、由SEQ ID NO：4所示的CDR1、由SEQ ID NO：5所示的CDR2以及由SEQ IDNO：6所示的CDR3。
优选的，包含由SEQ ID NO：7所示的CDR1、由SEQ ID NO:8所示的CDR2、由SEQ IDNO:9所示的CDR3、由SEQ ID NO：10所示的CDR1、由SEQ ID NO：11所示的CDR12以及由SEQ IDNO：6所示的CDR3。
优选的，包含由SEQ ID NO：13所示的CDR1、由SEQ ID NO:14所示的CDR2、由SEQ IDNO:15所示的CDR3、由SEQ ID NO：16所示的CDR1、由SEQ ID NO：17所示的CDR12以及由SEQID NO：18所示的CDR3。
一种所述的抗CD147的抗体的阳性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
一种所述的抗CD147的抗体的阳性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
一种所述的抗CD147的抗体的阳性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。
一种所述的抗CD147的抗体的制备方法，其特征在于，主要采用噬菌体展示技术筛选出特异性识别人CD147的抗体，具体的主要包括以下步骤：
S1、构建噬菌体展示抗体库；
S2、拯救噬菌体表面展示抗体库；
S3、淘选识别CD147蛋白的单链抗体；
S4、挑选识别CD147蛋白的阳性克隆。
一种所述的抗CD147的抗体在恶性肿瘤、炎症、新冠病毒的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种抗CD147的抗体及其制备方法和应用，具备以下有益效果：
1、该抗CD147的抗体，其能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强、半衰期短和抗原性弱等特点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明CD147 CSB-MP002831HU重组蛋白检测结果图；
图2为本发明CD147 CSB-MP002831HUf3重组蛋白检测结果图；
图3为本发明CD147 CSB-MP002831HU1重组蛋白检测结果图；
图4为本发明抗体纯化后SDS-PAGE的示意图；
图5为本发明抗体WesternBlot验证结果图；
图6为本发明抗体Immunofluorescence Hela细胞验证结果图；
图7为本发明抗体Immunofluorescence Hepg2细胞验证结果图
图8为本发明抗体Immunofluorescence Jurkat细胞验证结果图
图9为本发明抗体Immunohistochemistry人睾丸石蜡切片图；
图10为本发明抗体Immunohistochemistry人肾石蜡切片图；
图11为本发明抗体Immunohistochemistry人胎盘石蜡切片图；
图12为本发明抗体Immunohistochemistry人胃石蜡切片图；
图13为本发明抗体Flow Cytometry Hela细胞验证结果图；
图14为本发明抗体Flow Cytometry Jurkat细胞验证结果图；
图15为本发明抗体Flow Cytometry Hepg2细胞验证结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
一种抗CD147的抗体，所述抗CD147的抗体是由抗体重链的可变区和轻链的可变区通过短肽连接而成的，能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强、半衰期短和抗原性弱等特点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。
一种抗CD147的抗体的制备方法，采用噬菌体展示技术筛选出特异性识别人CD147的抗体，具体步骤如下：
S1、构建噬菌体展示抗体库
取一支15mL离心管，先加入与血液样本等量的分离
液，小心吸取血液样本加于分离液之液面上，450-650g，
离心20-30min；离心后，此时离心管中由上至下分为四层，
依次为血浆层，环状乳白色淋巴细胞层，透明分离液层和
红细胞层；用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层
到另一15mL离心管中，向所得离心管中加入10mL清洗液，
混匀细胞，250g，离心10min；离心完看上清液是否澄清，
不够澄清加长离心时间；用PBS清洗细胞2次，加trizol裂解
细胞-80℃保存。
取-80℃保存的外周淋巴细胞裂解液在室温中融化；加
入0.2mL氯仿，盖上盖子，剧烈振荡15s，室温放置2min
后，于12000g、4℃离心15min；将上清小心转至另一离心
管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min；于12000
g，4℃离心15min；离心后弃上清，沉淀用75％的酒精漂洗，
再次于12000g，4℃离心5min；离心后弃上清，将离心管
置于室温，待其干燥用无RNase的水溶解RNA；取少许溶
解的RNA跑琼脂糖胶，并测定浓度，判断RNA是否降解。
从-80℃取出总RNA于冰上融化；PCR仪上65℃、5min打开RNA的二级结构；放置冰上2min；依次加入buffer和逆转录酶及引物37℃、15min，98℃、5min；用内参引物验证得到的cDNA；-20℃保存，长期保存需-80℃。
配制PCR反应体系，用小鼠抗体库引物，从cDNA中扩增出抗体重链和轻链可变区；PCR反应条件94℃、4min，25个循环，72℃、4min；将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下约350bp左右的目的条带，用胶回收柱回收目的片段扩增产物。
将重链和轻链回收的抗体基因，分别用PCR方法添加linker，跑胶回收后按照等物质量混合，加入酶切位点引物，通过PCR扩增反应，反应条件同可变区扩增，实现重链和轻链通过linker连接。
按如下体系将各试剂加入到PCR管中：
Figure BDA0002698524150000061
在PCR仪上50℃过夜进行SfiⅠ酶切；取出后冷却至室温，继续向体系中加入以下成分：
10xBuffer 5μl
NotⅠ 1μl
加水至 50μl
在PCR仪上37℃保温过夜进行NotⅠ酶切；跑1.5％的琼脂糖胶切胶，DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用；配制反应体系，将抗体基因连入酶切后的pCANTAB5E载体。
按下列体系配制连接体系
Figure BDA0002698524150000071
在PCR仪上16℃连接过夜。
划线Minimal培养板37℃培养过夜；接种TG1单菌落至5mL的2YT培养液中于37℃振荡培养过夜；次日将接种过夜培养的菌液5mL加至300mL的2YT培养液中，振荡培养至OD600nm达到0.4-0.5；将菌液冰浴30min后，在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；用300mL预冷的灭菌去离子水于冰水中轻柔重悬沉淀，至沉淀细胞完全均匀地分散于水中；在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；再依次用150mL预冷的灭菌去离子水和30mL预冷的10％的甘油，如上所述重悬细胞两次；最后将细胞重悬于1mL预冷的10％的甘油中，置于冰上立即使用或分装；冻存于-80℃中待用；向100μl感受态中加入5μl连接产物，放于冰上预冷，转入预冷后的电转杯中；调节电转仪电压2.5KV电击时间5ms，电击后，迅速加入0.9mL的2YT培养基，37℃振荡培养1.5h；取10μl梯度稀释，涂布于SOBAG平板上，计算库容，剩余菌液涂布于10个SOBAG平板上，37℃培养过夜。
对梯度稀释的菌落计数，计算出本次建成的抗体库的库容；从SOBAG平板上随机挑取20个克隆，用菌落PCR检测抗体基因插入载体的效率；将随机挑选的20个克隆送测序分析，检测抗体库容，抗体基因的完整性及多样性。
S2、拯救噬菌体表面展示抗体库
将构建好的纳米抗体库以噬菌粒的形式保存在宿主菌中，在淘选过程开始前，应当先拯救文库，使其成为噬菌体展示的抗体库，具体方法如下：
将1.5mL带E-tag标签的抗体库接种到300mL的2YT-AG培养基中，至OD600nm约0.3-0.4；37℃振荡培养约1.5h至OD600nm＝0.5-0.6；按细菌：phage＝1:5加入helper phage辅助噬菌体(M13K07)，37℃振荡培养约1h；4000rpm、15℃离心15min，去除培养基；加入200mL的2YT-AK(100μg/mLAmp，50μg/mLKan)培养基重悬细菌，37℃培养2h；10000rpm离心20min去除沉淀；上清加入40mL PEG/NaCl沉淀phage，冰浴过夜；10000rpm离心20min，去掉上清；用0.6mL的2YT培养基重悬phage，4℃备用。若需要大量制备phage，更换kan抗性的培养基以后，培养时间从两小时延长至过夜培养。获得的噬菌体经过梯度稀释，感染TG1菌，涂布SOBAG平板，通过菌落计数计算噬菌体库滴度。
本实验利用His Bind Resin结合抗原蛋白，从噬菌体展示的抗体库中淘选抗体，具体过程如下：活化His Bind Resin：取200μL的His Bind Resin于1.5mL离心管中，1000g离心1min，去掉保存溶液；加入200μL的ddH2O清洗一次，1000g离心1min，去掉上清，重复此步骤一次；加入200μL离子化缓冲液，重悬，静置10min，离心去掉上清；加入200μL结合缓冲液，重悬，静置10min；取40μL His Bind Resin加入1.5mL离心管中，离心去掉上清。
S3、淘选识别CD147蛋白的单链抗体
取CD147重组蛋白(CSB-MP002831HUf3)10μg，加入165μL的PBS中，混匀后加入装有活化后的His Bind Resin的EP管中，旋转混匀1h，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL漂洗缓冲液，重悬，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复一次；取拯救后的噬菌体展示抗体库溶液300μL，加入0.3μL的Triton X-100，用微量移液器轻轻混匀；加入40μL未活化的HisBind Resin，轻微旋转反应1h；1000g离心1min，取上清加入40μL已包被CD147蛋白的HisBind Resin，轻微旋转反应2h；1000g离心1min，去掉上清；加入500μL漂洗缓冲液(含0.1％Triton X-100)，重悬，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；
加入500μL漂洗缓冲液含(0.1％Tween-20)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；最后一次漂洗后，将His Bind Resin转移到新的EP管中，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL洗脱缓冲液，轻微旋转洗脱20min；1000g离心1min，取上清，加入5mL TG1菌液中，37℃感染1h；将感染的菌液涂布SOBAG平板，30℃倒置培养过夜；次日，用2YT-AG培养基刮下平板上的菌落，并拯救成噬菌体进行下一轮淘选。
S4、挑选识别CD147蛋白的阳性克隆
从SOBAG平板上随机挑取单菌落接种到96孔细菌培养板中，每孔加入200μL的2YT-AG，37℃培养过夜；吸取25μL菌液到新的细菌培养板中，加入175μL的2YT-AG培养基，37℃培养3h；3500rpm离心10min，去上清，菌沉淀重悬于200μL的2YT-AI(100μg/mLAmp，1mM IPTG)培养基中，30℃诱导过夜；3500rpm离心10min，上清4℃保存备用；将CD147重组蛋白(CSB-MP002831HUf3)加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入50μL以上制备好的单链抗体上清和50μL4％PBSM，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL anti-E/HRP conjμgation(以4％PBSM按1：5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤三次，加入100μL TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL 2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450nm值判定目的蛋白的浓度。
S5、阳性克隆测序和序列分析
将上述淘选得到的OD450nm值较大的目的蛋白经ELISA鉴定，将鉴定为阳性的单克隆送金开瑞测序，测序的通用引物为S1：5’-GACCATGATTACGCCAAGC-3’，用DNAstar和Clustalw1.8分析抗体的重链与轻链可变区序列。
S6、质粒制备流程
1.PCR扩增产物跑胶
根据测序结果，用引物(参考表1)PCR扩增抗体基因，
根据目的片段的大小切胶，放置干净离心管；离心管放置-80℃冰箱，15min后取出室温溶解，用1mL蓝色枪头将胶捣碎，12000r/min，2min；离心后上清移至的新空白EP管，备用。
表1
Figure BDA0002698524150000111
Figure BDA0002698524150000121
2.载体的酶切与连接
pSecTag2A/pcDNA3.1等载体使用的双酶切体系(150μl)如下表2(单位：μL)
表2
Figure BDA0002698524150000122
用枪轻轻吹吸混合均匀，37℃水浴酶切20h以上为佳
3载体回收
4.连接反应
外源DNA片段和载体的酶切产物分别经过回收后做连接反应，反应体系(10μL)如下
Figure BDA0002698524150000131
冰上15min后转化。
5.转化和阳性克隆筛选
从-80℃冰箱中取出感受态细胞，打开盖子，加入质粒(2μl)或连接产物(10μl)；轻轻吹吸并旋转小枪头，使DNA与感受态细胞充分混匀，冰上30min，42℃热击90s，冰上1min；加入700μl预热的NZY培养基，置37℃摇床中158r/1.5h。
6000r离心4min，在超净台里面吸掉700μl上清，剩余菌液混匀，涂至含有相应抗生素的平板上；倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～16h后可出现菌落。
对于阳性克隆的筛选，分装40μl不加抗生素的LB培养基至PCR管，每种克隆挑取6个单菌落至PCR管混匀，放置于37℃摇床中220r/2h。每管取2μl作为模板进行菌液PCR，其中PCR回收产物和H2O分别作为阳性和阴性对照的模板；PCR反应完后进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果呈阳性，则选择3个呈阳性结果的相应PCR管的单克隆菌液接种至3mL加相应抗生素的LB培养基中培养过夜，第二天进行保种，提取质粒同时将该克隆送测序。
测序结果
将阳性克隆进行测序分析，得到的序列如表3所示
表3
Figure BDA0002698524150000141
Figure BDA0002698524150000151
Figure BDA0002698524150000161
Figure BDA0002698524150000171
单链抗体CDR区的氨基酸序列如下表4所示
表4
Figure BDA0002698524150000172
Figure BDA0002698524150000181
6.筛选过程
准备两支15mL的无菌离心管，在其中一支中加入5mL培养基和100μg无菌质粒DNA，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5mL培养基和500μl转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置10min制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出指数期细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中震荡培养。3小时后可根据需要加入适量抗生素。
转染24小时后可加入600μl 293细胞蛋白表达增强剂，以增加产物表达量；瞬时转染营养添加剂可提高产物的表达量，可在转染24小时后添加一次；转染后第6天SDS-PAGE及Western Blot测定产物表达量，以及上清分泌的抗体对重组蛋白的识别情况，并离心收集培养基上清准备纯化。
scFv+Fc融合纯化方式：准备Protein G柱，用20mM PB(pH7.0)平衡；培养基上清用0.45μm滤器过滤，上柱2遍。用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱，直至用G250接1滴无色；洗脱时用饱和Na2CO3中和洗脱液至pH中性，洗脱液过夜透析PBS(pH7.4)，透析2h后换液。或者第二天早上换液，透析到中午，超滤；SDS-PAGE及Bradford分析抗体浓度及纯度。
scFv+his tag纯化方式：准备镍柱，用NTA-0缓冲平衡镍柱，培养基上清用0.45μm滤器过滤，上柱2遍。分别用含20mM、60mM、200mM、500mM咪唑浓度的NTA-0缓冲洗脱，超滤。SDS-PAGE及Bradford分析抗体浓度及纯度。
对抗CD147的抗体进行试验验证
1.ELISA实验流程
将CD147重组蛋白(CSB-MP002831HUf3、CSB-MP002831HU、CSB-MP002831HU1三种)用CB缓冲稀释成2μg/ml后加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入100μL 4％PBSM稀释后的CD147单链抗体(CD147单链抗体从10μg/ml开始2倍梯度稀释18个梯度)，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL GoatAnti-Mouse IgG(H+L)Antibody；HRP conjugated(Cusabio，CSB-PA573747，以4％PBSM按1：5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤三次，加入100μL TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL H2SO4(2mol/L)终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。
吸光度值读出后，导出EXCEL表格。将对应分组标记好，然后将实验组浓度1-浓度18数据复制到Graphpad软件里面，作图，读取EC50数据，最后导出曲线图。
抗体ELISA验证结果如下：
CD147 CSB-MP002831HU重组蛋白检测结果如表5和图1
表5
Figure BDA0002698524150000201
Figure BDA0002698524150000211
CD147 CSB-MP002831HUf3重组蛋白检测结果如表6和图2
表6
Figure BDA0002698524150000221
Figure BDA0002698524150000231
CD147 CSB-MP002831HU1重组蛋白检测结果如表7图3
表7
Figure BDA0002698524150000232
Figure BDA0002698524150000241
CD147重组蛋白包被2μg/mL，对照组正常的情况下，ELISA结果显示：CD147单链抗体与三个哺乳载体表达的CD147重组蛋白的EC50如表8所示。
表8
Figure BDA0002698524150000242
抗体表达上清ELISA结果
选择mFC标签融合表达后，使用哺乳表达CD147
(CSB-MP002831HU、CSB-MP002831HU1、CSB-MP002831HUf3)蛋白包板，三组小试上清进行ELISA验证，结果如表9所示，根据ELISA结果选择第一组上清进行纯化验证。
表9
Figure BDA0002698524150000251
抗体纯化后SDS如图4
第1组放大50mL，纯化后体积为1.2mL，浓度为3mg/mL，产量为72mg/L。
2.WesternBlot实验流程
预冷RIPA(强裂解液)蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂(按照100:1的比例添加)。以细胞数量1×107加入1mL裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，超声破碎细胞，完成后在冰上孵育20min，4℃离心，12000rpm，20min。离心完成后取上清，BCA法检测蛋白含量；
制备聚丙烯酰胺凝胶，将样品(10μL)和2×loading buffer(10μL)混合，沸水煮5min，用移液枪慢慢将10μL混合物加至样品槽中，预染Maker一般加10μL；上样完成后，连接好电泳仪，用80V的电压跑浓缩胶30min，调电压120V电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部。
取胶后去掉上层浓缩胶，将分离胶浸入转膜buffer中；将PVDF膜浸泡于异丙醇1min后转入转膜buffer中，将滤纸也浸入转膜buffer中；用转膜buffer淋洗石墨电极，铺三张滤纸，滴少许转膜buffer；铺上分离胶，滴少许转膜buffer；铺上膜，再滴少许转膜buffer；最后铺三张滤纸，滴少许转膜buffer，用涂棒赶出气泡；盖上电极，电压调至最大，以1.5mA/cm2凝胶体积转膜1.5h(负载电压不宜超过1V/cm2)。
将膜从转膜仪中取出，PBST漂洗5min(水平摇床上震荡)；将膜取出，浸没于封闭液中37℃，2h或4℃过夜(封闭液为1％酪蛋白或2％OVA)。
将膜取出，PBST洗三次，每次10min(水平摇床上震荡)；将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的CD147单链抗体稀释液中，25℃，1h。将膜取出，PBST洗三次，每次10min(水平摇床上震荡)；将膜取出，浸泡于用1％酪蛋白稀释的二抗稀释液中，25℃，1h。
将A、B发光液等比例稀释混合均匀(各500mL)，将膜平铺于保鲜膜上，混合液均匀滴至膜上，盖上保鲜膜，避光静置3min；打开保鲜膜，用滤纸小心吸干膜表面残留液体，置于保鲜膜内，不要产生气泡与皱褶，平铺并固定于暗盒中；将暗盒至于暗室中，取出胶片迅速置于暗盒内膜上，不要移动胶片，避免产生重影，关闭暗盒(一般曝光时间为4min，若条带较弱可延长压片时间或者过夜或采用增强显影液重新显影)；打开暗盒，取出胶片立即完全侵入显影液中4min；取出胶片，清水漂洗后侵入至定影液中1min，取出胶片，用水漂洗后烘干，拍照。抗体WesternBlot验证结果如图5所示。
CD147单链抗体(使用浓度3μg/mL)在1：Hepg2细胞，2：Ntera2细胞，3：A549细胞，4：U251细胞，5：CD147重组蛋白CSB-MP002831HU，6：CD147重组蛋白CSB-MP002831HU1上进行Western Blot验证，结果显示：1：Hepg2细胞、3：A549细胞在50-60kDa左右检测到糖基化双带，2：Ntera2细胞、4：U251细胞在50-60kDa左右检测到糖基化双带，在35kDa左右检测到非糖基化条带，5：CD147重组蛋白CSB-MP002831HU，6：CD147重组蛋白CSB-MP002831HU1检测到阳性条带。
3.Immunofluorescence实验流程
细胞固定：取出指数期细胞，接种96孔板后，37℃培养过夜，PBS洗涤细胞1次，加入常温的4％多聚甲醛(50μL)室温固定15min；吸去多余的多聚甲醛，用PBS(150μL)洗涤4遍，每次静止3min；
封闭：10％的山羊血清37度封闭40min，加入封闭液体积为50μL，封闭时间不宜过长，防止干片；
CD147单链抗体孵育：用5％正常山羊血清稀释CD147单链抗体，至终浓度为20μg/mL。加入50μL一抗覆盖细胞，4℃孵育过夜；
取出96孔板复温至室温大约15min，用PBS洗涤4遍，每次4min；配制荧光标记二抗：5％正常山羊血清稀释二抗，稀释比1:200，37℃孵育45min；
孵育完毕后用PBS洗涤3遍，每次3min。洗涤完毕后DAPI染核，根据DAPI母液浓度，将其稀释至1mg/mL，稀释液50μL覆盖细胞10分钟；染核后PBS洗涤一遍，加入抗荧光淬灭剂(稀释比1:3)，覆盖细胞即可约20μL，荧光显微镜拍照。
抗体Immunofluorescence验证结果如图6-8
CD147单链抗体(使用浓度：20μg/mL)在图6Hela细胞、图7Hepg2细胞、图8Jurkat细胞上进行Immunofluorescence验证结果为阳性。
4.Immunohistochemistry实验流程
用2％APES-丙酮溶液固定玻片2分钟，烘箱60℃，15min。将石蜡切片浸入二甲苯中15min进行脱蜡；然后依次放入浓度比为100％，100％，100％，95％，95％，75％，75％的200mL的酒精中，进行水化处理；500mL柠檬酸-柠檬酸钠溶液高压修复，0.3％Triton-100溶液中打孔，5min。滴加过氧化物酶阻断剂，阻断内源性过氧化物酶。
CD147单链抗体按体积稀释比1/500稀释，4℃过夜。PBST洗涤3次，每次5分钟，二抗孵育，滴加超敏酶标山羊抗小鼠IgG聚合物于玻片上，100μl/片，室温20min。
洗涤，PBST洗涤3次，每次5min，DAB染色，待组织颜色染至黄棕色停止。染色时间最多8min。PBS洗涤2次，每次3min，苏木素染色，静置30min后放入淡氨水溶液中，室温静置4min。纯水洗涤3次，每次3min，然后依次放入浓度比为75％，75％，95％，95％，100％，100％，100％的乙醇中静置3min。再置于脱蜡剂中静置30分钟透明。沥干，封片，拍照。
抗体Immunohistochemistry验证结果如图9-12
Immunohistochemistry结果显示：CD147单链抗体(使用浓度：6μg/mL)在图9人睾丸石蜡切片、图10人肾石蜡切片、图11人胎盘石蜡切片、图12人胃石蜡切片上进行Immunohistochemistry验证，结果显示在人睾丸输精管中的细胞、人肾小管、人胎盘滋养细胞层、人胃腺细胞细胞上检测结果为阳性。
5.Flow Cytometry实验流程
使用75％预冷的乙醇固定细胞，4℃过夜。固定后，1000rmp/min，3min离心细胞，弃上清，用PBS重悬，1000rmp/min，3min离心，弃上清。10％正常非免疫山羊血清(PBS稀释)重悬，4℃孵育45min，(在静音混合器上孵育)，经1000rmp/min，3min离心，弃上清。
用5％正常山羊血清稀释CD147单链抗体，至终浓度为0.01μg/μL，加入一抗稀释液100μL，4℃孵育45min，(在静音混合器上孵育)；经1000rmp/min，3min离心，弃上清。用PBS重悬后，静置2min。经1000rmp/min，3min离心，弃上清，重复两次。
用5％正常山羊血清稀释二抗，稀释比例为1:100。加入二抗稀释液50μL，4℃孵育30min，(在静音混合器上孵育，注意避光)，经1000rmp/min，3min离心，弃上清。用PBS重悬，1000rmp/min，3min离心，弃上清。加入400μL的PBS重悬细胞，转移液体至流式上样管，立即上流式仪检测。
抗体Flow Cytometry验证结果如图13-15
CD147单链抗体(使用浓度：10μg/mL)在图13Hela细胞、图14Jurkat细胞、图15Hepg2细胞膜上进行Flow Cytometry验证，相同载体表达的mFC蛋白为对照，结果显示：CD147单链抗体在Hela细胞、Jurkat细胞上检测结果为阳性，在Hepg2细胞上检测结果为弱阳性。
本发明的抗人CD147的单链抗体使用噬菌体展示技术筛选，通过哺乳表达载体表达，再经过哺乳表达的重组蛋白进行ELISA筛选，最后使用Western Blot、Immunofluorescence、Immunohistochemistry以及Flow Cytometry验证，结果与预期相符，可以用于人CD147天然蛋白及重组蛋白的验证及检测。
该CD147单链抗体的scFv序列是使用3种哺乳系统表达的蛋白筛选出来的，哺乳系统表达的蛋白的结构更接近天然蛋白结构，因此我们的抗体能识别天然细胞及组织表达的人CD147蛋白。而其他现有使用大肠杆菌系统表达的蛋白进行筛选，此蛋白结构单一，修饰较少，筛选出的抗体仅能识别重组蛋白，很少能识别天然蛋白,该CD147单链抗体使用优化后的哺乳系统表达，批次间稳定性好，产量高。
一种抗CD147的抗体在恶性肿瘤、炎症、新冠病毒的应用；
在肿瘤研究中，CD147表达于各种肿瘤组织特别是恶性肿瘤，如乳腺癌、肺癌、肾癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤等，表达量较正常组织明显要高，肿瘤细胞中CD147可刺激成纤维细胞产生各种基质金属蛋白酶(MMPs)，而MMPs中大部分是由与肿瘤相关的间质成纤维细胞产生，而且这些间质产生的MMPs会促进肿瘤的浸润及转移，加速肿瘤的进展；因此，CD147及相应抑制剂研究已成为癌症诊断和治疗的热点之一。
CD147在炎症中发挥重要作用，在此过程中CD147通过与细胞膜上的其他分子相互作用发挥调节机制。当有炎性反应时，环亲和素A(CyPA)分泌到细胞外；分泌的CyPA可以趋化中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞；CD147可能是CyPA的受体，结合于CyPA，转导信号，激发趋化过程。
最新研究CD147在新冠病毒对人体的感染过程中也起到重要的作用；陈志南研究团队对CD147在SARS-CoV-2侵袭宿主细胞中的可能作用进行了研究；实验表明，CD147可能作为SARS-CoV-2Spike蛋白的宿主受体，参与病毒与细胞之间的相互作用，抗CD147的人源化抗体Meplazumab可显著抑制病毒入侵宿主细胞；因此，对于治疗COVID-19的特定抗病毒药物开发而言，CD147也是值得关注的靶点。
单链抗体是由抗体重链的可变区和轻链的可变区通过短肽连接而成的；其能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强、半衰期短和抗原性弱等特点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。
因此结合scFv的优势开发抗CD147的单链抗体对于相关疾病研究诊断，特别是对目前的新冠病毒药物筛选和疫苗研究具有重要意义。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗CD147的抗体，其特征在于，所述抗CD147的抗体是由抗体重链的可变区和轻链的可变区通过短肽连接而成的。
2.根据权利要求1所述的抗CD147的抗体，其特征在于，包含由SEQ ID NO：1所示的CDR1、由SEQ ID NO:2所示的CDR2、由SEQ ID NO:3所示的CDR3、由SEQ ID NO：4所示的CDR1、由SEQ ID NO：5所示的CDR2以及由SEQ ID NO：6所示的CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗CD147的抗体，其特征在于，包含由SEQ ID NO：7所示的CDR1、由SEQ ID NO:8所示的CDR2、由SEQ ID NO:9所示的CDR3、由SEQ ID NO：10所示的CDR1、由SEQ ID NO：11所示的CDR12以及由SEQ ID NO：6所示的CDR3。
4.根据权利要求1所述的抗CD147的抗体，其特征在于，包含由SEQ ID NO：13所示的CDR1、由SEQ ID NO:14所示的CDR2、由SEQ ID NO:15所示的CDR3、由SEQ ID NO：16所示的CDR1、由SEQ ID NO：17所示的CDR12以及由SEQ ID NO：18所示的CDR3。
5.一种如权利要求2所述的抗CD147的抗体的阳性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
6.一种如权利要求3所述的抗CD147的抗体的阳性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
7.一种如权利要求4所述的抗CD147的抗体的阳性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。
8.一种如权利要求1所述的抗CD147的抗体的制备方法，其特征在于，主要采用噬菌体展示技术筛选出特异性识别人CD147的抗体，具体的主要包括以下步骤：
S1、构建噬菌体展示抗体库；
S2、拯救噬菌体表面展示抗体库；
S3、淘选识别CD147蛋白的单链抗体；
S4、挑选识别CD147蛋白的阳性克隆。
9.一种如权利要求1所述的抗CD147的抗体在恶性肿瘤、炎症、新冠病毒的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115109794A (zh) * 2022-06-30 2022-09-27 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种噬菌粒载体及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110662766A (zh) * 2017-03-09 2020-01-07 赛托姆克斯治疗学股份有限公司 Cd147抗体、可激活cd147抗体及其制备和使用方法
CN110746509A (zh) * 2019-10-10 2020-02-04 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人cd147 car-t细胞、制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110662766A (zh) * 2017-03-09 2020-01-07 赛托姆克斯治疗学股份有限公司 Cd147抗体、可激活cd147抗体及其制备和使用方法
CN110746509A (zh) * 2019-10-10 2020-02-04 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人cd147 car-t细胞、制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘妍 等: "抗CD147人源单链抗体的筛选及生物特性初步鉴定", 《免疫学杂质》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115109794A (zh) * 2022-06-30 2022-09-27 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种噬菌粒载体及其制备方法和应用

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