WO2022203043A1 - 神経系血管バリアー破綻の抑制剤、及び神経系疾患治療剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an inhibitor of nervous system vascular barrier breakdown and a therapeutic agent for nervous system diseases.
- Nervous system tissues such as the adult brain, spinal cord, and retina form an optimal tissue microstructure that allows nerve cells to function normally by forming a nervous system vascular barrier such as the blood-brain barrier and the blood-retinal barrier between blood and nervous system tissues. environment is maintained. After being induced in the process of ontogeny, the nervous system vascular barrier is basically maintained in adults, that is, the 'nervous vascular barrier closed state'. It is under variable dynamic regulation. The involvement of the nervous system vascular barrier in the pathology and treatment of intractable nervous system diseases includes the following two factors.
- An object of the present invention is to provide an inhibitor of disruption of the nervous system vascular barrier.
- Basigin is known to have multiple important physiological functions, such as involvement in nerve cell function, as well as involvement in the nervous system vascular barrier. Therefore, there is concern that non-specific suppression or stimulation of physiological functions by basigin may lead to serious side effects. Therefore, the present inventors conducted a detailed analysis of the molecular structure of Basidin from the aspect of the nervous system vascular barrier. Basigin is a molecule with sugar chain modification, and there are two different types: high sugar chain modified Basigin (hereinafter also referred to as "Basigin-HG”) and low sugar chain modified Basigin (hereinafter also referred to as "Basigin-LG”). The existence of N-linked glycosylation molecules is known.
- Basigin-HG high sugar chain modified Basigin
- Basigin-LG low sugar chain modified Basigin
- Basign-LG is an essential molecule for regulation of the nervous system vascular barrier
- Basigin-LG is a glycoprotein modified with a high-mannose sugar chain
- Basigin-LG is a nervous system vascular barrier.
- the inventors have found that it is useful as a specific target for artificial control of , and completed the present invention. Since Basigin-HG has various physiological activities, there is concern that various side effects may occur when Basigin-HG is targeted and its physiological activity is suppressed. On the other hand, it is thought that side effects can be reduced by targeting Basigin-LG as the main target.
- Basigin-LG as the main target.
- Basigin-LG it is possible to provide an epoch-making inhibitor of nervous system vascular barrier breakdown and a therapeutic agent for nervous system diseases.
- the present invention is as follows. [1] (a) an enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of low-glycosylation-modified Basidin; (b) an antibody, an aptamer, or a lectin that specifically binds to low-sugar chain-modified basigin and suppresses disruption of the nervous system vascular barrier by basigin; (a) or (b) as an active ingredient, an inhibitor of nervous system vascular barrier disruption. [2] The inhibitor of nervous system vascular barrier disruption according to [1] above, wherein the sugar chain of the low-sugar chain-modified Basidin is a high-mannose sugar chain. [3] [1] or [ 2], the inhibitor of nervous system vascular barrier disruption.
- [4] The nervous system of [3] above, wherein the molecular weight of the low-sugar chain-modified basis is 35,000 or less, and the molecular weight of the high-sugar chain-modified basis is 40,000 to 60,000. Suppressor of vascular barrier disruption.
- [5] The enzyme according to any one of [1] to [4] above, wherein the enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of the low-glycosylation-modified Basidin is endoglycosidase F1 or endoglycosidase H. Suppressor of nervous system vascular barrier disruption.
- [6] (a) an enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of low-glycosylation-modified Basidin; (b) an antibody, an aptamer, or a lectin that specifically binds to low-sugar chain-modified basigin and suppresses disruption of the nervous system vascular barrier by basigin; (a) or (b) as an active ingredient, a therapeutic agent for nervous system diseases caused by nervous system vascular barrier disruption.
- the therapeutic agent for a nervous system disease of the above [7] wherein the neurological disease is cerebral edema.
- the therapeutic agent for nervous system disease of the above [7] wherein the retinal nervous system disease is retinal edema.
- the therapeutic agent for nervous system diseases of the present invention [i] (a) an enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of low-sugar-modified basigin; (b) an antibody that specifically binds to low-sugar-modified basigin and suppresses disruption of the nervous system vascular barrier by basigin , an aptamer, or a lectin; [ii] (a) an enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of low-glycosylation-modified Basidin or (b) low-sugar chain, for use as a therapeutic agent for nervous system diseases caused by disruption of nervous system vascular barrier function An antibody, aptamer or lectin that specifically binds to modified Basidin and suppresses nervous system vascular barrier breakdown caused by Basidin, [iii] (a) an enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of low-sugar-modified basigin; (b) an antibody that specifically binds to low-sugar-modified
- the present invention it is possible to suppress the breakdown of the nervous system vascular barrier and treat nervous system diseases caused by the breakdown of the nervous system vascular barrier.
- FIG. 2 shows an image of Basidin having three N-linked glycosylation sites in its extracellular domain.
- 1 is a diagram showing the results of Western blot analysis in Example 1.
- bEnd.3 cells mouse cerebrovascular endothelial cell line
- NC siRNA Non-silence siRNA
- FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring transcutaneous electrical resistance (TEER) under Normoxia).
- TEER transcutaneous electrical resistance
- Example 3 shows the results of Western blot analysis after treating Basigin expressed in 3 cells with Endoglycosidase H (Endo H) or Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F).
- Endoglycosidase H Endoglycosidase H
- PNGase F Peptide-N-Glycosidase F
- bEnd. 3 cells were grown as a monolayer and the Claudin-5 expression level after treatment with Endo H was observed by fluorescence immunostaining.
- bEnd. 3 shows a graph quantifying Claudin-5 expression levels after 3 cells grown as monolayers and treated with Endo H.
- FIG. In Example 4, bEnd. 3 shows the results of measuring TEER after 3 cells were grown as a monolayer and treated with Endo H.
- Example 5 tracer leakage was observed under a confocal microscope after tracer administration to mice bred under normoxic conditions (under Normoxia) and mice bred under 7-8% hypoxic conditions (under Hypoxia). It is a figure which shows a result.
- Example 6 an EndoH-administered group and an EndoH-non-administered group were provided in diabetic mice and non-diabetic mice, respectively, and tracer leakage was observed with a confocal microscope after tracer administration.
- One aspect of the inhibitor of nervous system vascular barrier disruption of the present invention includes (a) an enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of low-glycosylation-modified basigin; and an antibody, aptamer, or lectin that suppresses the nervous system vascular barrier disruption caused by basidin; It is also referred to as an "inhibitor of the vascular barrier disruption of the nervous system".
- one aspect of the present invention includes (a) an enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of low-sugar chain-modified basingin; Antibody, aptamer or lectin that inhibits barrier disruption; ” is also called.
- the nervous system vascular barrier means a mechanism that restricts material exchange between blood and tissue fluid of the nervous system. Preference may be given to the blood-retinal barrier, which limits the exchange of substances with the interstitial fluid.
- the inhibition of vascular barrier disruption in the nervous system means that the mechanism that restricts substance exchange between the blood and tissue fluid of the nervous system does not function, resulting in tissue penetration of neurotoxic molecules and exudation of plasma components. It means to suppress what is happening.
- Basidin herein is a glycoprotein belonging to the immunoglobulin superfamily localized in the cell membrane, EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer), CD147 (cluster of differentiation 147), M6, GP42, HT7, OX-47, MC31, Also referred to as CE9 or forth22.
- Basidin is known to be a receptor for cyclophilin A (CypA), a member of the cyclophilins with peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) activity.
- the basisgin is preferably human basisgin, and the amino acid sequence of human basisgin can be exemplified by SEQ ID NO: 1, which is published as accession number NP_940991.1 in the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
- Basidin is a glycoprotein with glycosylation, and the nitrogen (N) of the side chain amide group of the asparagine (Asn) residue at positions 44, 152, and/or 186 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It has an N-linked sugar chain in which N-acetylglucosamine (GlcNAc) is glycoside-linked.
- the molecular weight of basidin varies depending on the type and number of sugars added during extension of N-acetylglucosamine.
- low-glycosylation-type Basigin means a Basigin containing a low-glycosylation N-linked sugar chain and having a molecular weight of 35,000 or less.
- Basigin-HG means Basigin whose N-linked sugar chain is highly glycosylated and has a molecular weight of 40,000 to 60,000.
- the molecular weight of the core protein in low-sugar-modified basis or high-sugar-modified basis is about 27,000.
- a high-mannose sugar chain means a sugar chain in which only mannose is bound to a trimannosyl core structure composed of two molecules of N-acetyl-D-glucosamine and three molecules of mannose, which is an N-linked sugar chain.
- a complex sugar chain means a hybrid sugar chain in which mannose and N-acetylglucosamine are bound to the trimannosyl core structure.
- the enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of the low-sugar chain-modified basis is an enzyme that specifically acts on the sugar chain of the low-sugar chain-modified basis and releases the sugar chain of the low-sugar chain-modified basis. Or it is not particularly limited as long as it is an enzyme that decomposes.
- Such an enzyme is preferably an enzyme that specifically acts on the high-mannose sugar chain of the low-sugar-chain-modified basisgin to release or degrade the high-mannose-type sugar chain of the low-sugar-chain-modified basisidin.
- specifically liberating or decomposing the sugar chain of low-glycosylation-modified basisgin means releasing or decomposing the sugar chain of low-glycosylation-modified basisidin, for example, the high-mannose sugar chain of low-glycosylation-modified basisidin.
- an enzyme that does not substantially liberate or degrade the sugar chain of highly glycosylated basisgin for example, the complex-type sugar chain of highly glycosylated basisgin, or the sugar chain of highly glycosylated basisisin, such as highly glycosylated type
- the activity of releasing or decomposing the sugar chain of the low-sugar chain-modified Basidin for example, the high-mannose sugar chain of the low-sugar chain-modified Basidin is 3 times or more, preferably 5 times or more, or more. Enzymes that are preferably 10-fold or more can be mentioned.
- Examples of the enzyme that specifically releases or degrades the sugar chain of the low sugar chain-modified baseidin include glycosidase that specifically acts on the sugar chain of the low sugar chain-modified baseidin to release the sugar chain of the low sugar chain-modified baseidin.
- ⁇ -mannosidase that specifically acts on the sugar chain of low-sugar-chain-modified basigin to degrade the sugar chain of the low-sugar-chain-modified basidin preferably endoglycosidase H or endoglycosidase F1. are not limited to these.
- binding to low-glycosylation-modified basis means binding to the sugar chain portion and/or protein portion (core protein portion) of low-glycosylation-modified basis, and It means not substantially attached to the chain portion.
- the antibody, aptamer, or lectin in the present specification that specifically binds to the sugar chain of low-glycosylation-modified basigin and suppresses basigin-induced disruption of the nervous system vascular barrier is inhibited by basidin.
- basidin For example, as shown in the Examples below, by measuring the Claudin-5 expression level and TEER of the cerebrovascular endothelial cell line monolayer, and / or by evaluating tracer leakage after administering the tracer to mice. It becomes possible.
- an antibody that specifically binds to low-glycosylation-modified Basidin and suppresses nervous system vascular barrier breakdown by Basidin in the present specification it binds to the sugar chain portion and/or protein portion of low-sugar-chain-modified Basidin, and It has the characteristic of not binding to or not substantially binding to the sugar chain portion of high-sugar-chain-modified Basidin, and when bound to low-sugar-chain-modified Basidin, it has the effect of suppressing breakdown of the nervous system vascular barrier caused by Basidin.
- Basidin There is no particular limitation if any.
- Such antibodies may be of any type, including human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and the like, as well as F(ab') 2 , Fab, diabodies, Fv, ScFv, or Sc Antibody fragments such as (Fv) 2 can be mentioned.
- the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
- Chimeric antibodies or humanized antibodies can be produced by genetic engineering according to standard methods.
- Antibody fragments can also be produced by methods such as digesting full-length antibodies with pepsin or papain.
- the sugar chain of low-glycosylation-modified basis is a high-mannose sugar chain. Therefore, the antibody that binds to low-glycosylation-modified basis It can also be said to be an antibody whose epitope is a polysaccharide chain and/or protein portion.
- a cerebrovascular endothelial cell line such as bEnd. 3 cells
- living cells such as cerebrovascular endothelial cells expressing low-sugar chain-modified Basidin by genetic engineering methods, or purified low-sugar chain-modified Basidin as an immunogen, using a known antibody production method, such as a hybridoma. It can be prepared by a method, a phage display method, or the like.
- an antibody specific to the low sugar chain-modified Basidin which maintains a three-dimensional structure closer to that in vivo, can be obtained.
- Antibodies useful for the therapeutic agents for nervous system diseases particularly antibodies that specifically bind to low-sugar chain-modified basis, include high-sugar-chain-modified basis and low-sugar-modified basis.
- selection can be made based on the property of preferentially binding to low sugar chain-modified basisidin.
- the lectin that binds to low-sugar chain-modified basis and does not bind to high-sugar chain-modified basis is a lectin that binds to low-sugar chain-modified basis and does not bind to high-sugar chain-modified basis, or substantially It is not particularly limited as long as it has the characteristic of not binding and, when bound to low-sugar chain-modified basigin, has an effect of suppressing the breakdown of the nervous system vascular barrier caused by basigin.
- the lectin mentioned above means a protein other than an antibody or an enzyme that binds to a sugar chain. Such lectins can be selected from lectins that recognize ⁇ -mannosyl residues.
- ConA concanavalin A
- PSA pea lectin
- LCDA lentil lectin
- snowdrop lectin derived from Galanthus nivalis.
- NPL NPL from Narcissus pseudonarcissus
- banana lectin BanLec
- BMA West African bean lectin
- BMA Bowringia midbraedii
- Tway blade LOA
- a lectin that specifically binds to the sugar chain of low-glycosylation-modified Basidin, preferably to the high-mannose sugar chain may be selected.
- the above-mentioned "does not substantially bind to the sugar chain of the highly glycosylated basis" means that even if it has binding or affinity to the sugar chain of the highly glycosylated basis, the effect of the highly glycosylated basis is This includes cases where there is no impact on
- the interaction strength with the high-mannose sugar chain measured by frontal affinity chromatography is higher than the interaction strength with the non-high-mannose sugar chain. 5 times more, preferably 10 times more, more preferably 100 times more lectins can be mentioned.
- Whether or not the above-mentioned antibody or lectin has the characteristic of specifically binding to the sugar chain of low-sugar chain-modified basesigin can be determined, for example, by separating basigin into low-sugar chain-modified baseidin and high sugar-chain-modified baseidin based on molecular weight. It can be confirmed by examining whether an antibody, aptamer, or lectin binds. SDS-PAGE and gel filtration chromatography can be mentioned as a method for separating low-sugar-chain-modified Basidin and high-sugar-chain-modified Basidin.
- Whether an antibody, aptamer, or lectin binds to the separated low-glycosylation-modified or high-glycosylation-modified basidin can be determined by using an antibody, aptamer, or lectin labeled with a fluorescent dye, fluorescent protein, biotin, or the like. It can be confirmed by binding to the separated low-sugar-chain-modified or high-sugar-chain-modified basis and detecting the label. Also, lectins that bind to high-mannose sugar chains can be obtained, for example, by the method described in Japanese Patent No. 4051030 using affinity chromatography, and can be further purified and selected as necessary.
- the nervous system disease caused by disruption of the vascular barrier function of the nervous system preferably includes diseases caused by disturbance of the tissue microenvironment due to disruption of the vascular barrier function.
- Cerebral nervous system diseases such as edema, cerebral infarction, degenerative dementia such as Alzheimer's disease, vascular dementia, ischemic brain disease, or retinal nervous system diseases such as retinal edema, particularly preferably cerebral edema or Mention may be made of retinal edema.
- the nervous system blood vessels are blood vessels of the nervous system tissue, and do not include blood vessels in tissues other than the nervous system tissue.
- the administration method of the therapeutic agent for nervous system diseases of the present invention is not particularly limited as long as the desired therapeutic effect for nervous system diseases can be obtained. Examples include administration, transpulmonary administration, and particularly intravitreal administration for retinal nervous system diseases.
- the dosage of the therapeutic agent for nervous system diseases of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately adjusted depending on the physical condition, disease state, body weight, age, sex, etc. of the subject or test animal.
- the dosage is, for example, 0.01 ⁇ g to 100 g/kg body weight, more preferably 0.1 ⁇ g to 10 g/kg body weight, still more preferably 1 ⁇ g to 1 g/kg as active ingredient enzyme, antibody, aptamer or lectin per day.
- Body weight can be increased, and the therapeutic agent for nervous system diseases of the present invention may be used in combination with other therapeutic agents for nervous system diseases.
- the administration frequency and administration period of the therapeutic agent for nervous system diseases of the present invention are not particularly limited, and the daily dose can be administered once or divided into several times a day.
- the origin and living body of cells and tissues to be administered are not particularly limited, and are preferably mammals, such as humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, dogs, cats, rats, mice, and hamsters. Humans are particularly preferred.
- Mouse cerebrovascular endothelial cell line (bEnd.3 cells: obtained from American Type Culture Collection) was cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (Sigma-Aldrich) containing 4500 mg/L glucose supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum). and cultured in monolayer at 37° C. under 5% CO 2 . On the 6th day after the start of the culture and reaching a confluent state, tunicamycin, an N-linked sugar chain inhibitor, was added to the medium at a concentration of 2.5 ⁇ g/ml, and culture was continued for 24 hours. 7 days after becoming confluent, bEnd.
- Dulbecco's modified Eagle medium Sigma-Aldrich
- FBS fetal bovine serum
- Blocking was performed by incubating the PVDF membrane in a blocking solution (5% skimmed milk) for 1 hour. Next, a rabbit anti-basigin antibody (1 ⁇ g/ml: Scrum) was used as a primary antibody and incubated overnight at 4°C. After washing with TBS-T (0.05% Tween-20, TBS), the cells were incubated in a secondary antibody (HRP labeled anti-rabbitk IgG, Dako) at room temperature for 1 hour. After washing with TBS-T, chemiluminescence was detected using an Amersham Imager (GE Healthcare).
- Example 2 (Relationship between Expression of Basigin-HG or Basigin-LG and Vascular Barrier Function)
- Example 1 confirmed that Basigin-HG and Basigin-LG are expressed in Basigin. Therefore, the involvement of Basigin-HG and Basigin-LG in nervous system vascular barrier regulation was analyzed using a Basigin expression suppression system by introduction of Basigin-specific siRNAs (two kinds of #1 and #2) in an in vitro experimental system.
- Basigin siRNA #1 (sense strand sequence: SEQ ID NO: 2, antisense strand sequence: SEQ ID NO: 3), Basigin siRNA #2 ( Sense strand sequence: SEQ ID NO: 4, antisense strand sequence: SEQ ID NO: 5), and non-silence siRNA (Silencer (registered trademark) Select Negative Control #1 siRNA (NC siRNA) catalog number 4390843: Thermo Fisher Scientific ) was used.
- SEQ ID NOS: 2-5 base sequences represented by lower case letters represent overhang sequences.
- the mouse cerebrovascular endothelial cell line bEnd. 3 cells obtained from ATCC were prepared in 2 dishes and grown at 5% CO 2 in Dulbecco's modified Eagle medium (Sigma-Aldrich) containing 4500 mg/L glucose supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum). was grown as a monolayer at °C.
- Dulbecco's modified Eagle medium Sigma-Aldrich
- FBS fetal bovine serum
- Fluorescent immunostaining was performed by the following method. First, cells 7 days after the start of culture and becoming confluent were cultured under Hypoxia or Normoxia for about 45 minutes, respectively. 3 cells were fixed with 100% methanol for 5 minutes at room temperature and incubated with 10% Non-Immune Goat Serum (Invitrogen) for 30 minutes to block non-specific antibody binding. Next, the cells were reacted with a rabbit polyclonal antibody against claudin-5 (1/25 dilution, Invitrogen) overnight at 4°C.
- the cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and incubated with Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (1/200 dilution Eugene) for 1 hour at room temperature under protection from light. Furthermore, the stained cells were mounted on Fluoromount (Diagnostic BioSystems) and observed under a Zeiss LSM5 Pascal laser confocal microscope (Carl Zeiss).
- PBS phosphate-buffered saline
- Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 1/200 dilution Eugene
- FIG. 3A shows the results of Western blot analysis.
- Basigin-LG expression almost disappeared 36 hours after siRNA introduction, whereas Basigin-HG expression level did not significantly decrease. From this result, the bEnd.
- the Basigin contained in the 3 cells has only Basigin-HG and does not have Basigin-LG.
- FIG. 3B shows the results of fluorescent immunostaining.
- FIG. 3C shows the results of measuring the TEER of the 3-cell monolayer.
- Basigin-LG almost disappeared, and under the condition that the expression of Basigin-HG remained, a significant decrease in Claudin-5 from the cell membrane was detected even under 1% hypoxia (under Hypoxia). was not Furthermore, as shown in FIG. 3C, the expression of Basigin-LG almost disappeared, indicating that the ability to form a neurovascular barrier was not lost under the condition that the expression of Basigin-HG remained. Therefore, it was clarified that Basigin-LG is involved in the decrease of Claudin-5 from the cell membrane and neurovascular barrier disruption under 1% hypoxia.
- Example 3 (Glycan analysis of Basidin) Based on the results of Example 2 above, it was hypothesized that at least Basigin-LG is an essential molecule for regulation of the nervous system vascular barrier. If Basigin-LG is an essential molecule, it will be possible to establish a method of artificially controlling the nervous system vascular barrier by specifically targeting only Basigin-LG. As a result, it is thought that the suppression of the expression of Basigin-HG, which is responsible for many of the physiological functions of Basigin, can reduce side effects.
- Endoglycosidase H an enzyme that specifically degrades high-mannose sugar chains among N-linked sugar chains, and all N-linked sugar chains Analysis was performed using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F), which is an enzyme that
- bEnd.3 cells obtained from ATCC was cultured. 7 days after the start of the culture and reaching a confluent state, bEnd. 3 Cells were lysed with tissue lysis buffer (100 ⁇ l PBS containing 0.5% Triton X-100, 1% SDS and 1% Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher Scientific)) and rotated at 15,000 rpm for 15 minutes. The supernatant was obtained by centrifugation.
- tissue lysis buffer 100 ⁇ l PBS containing 0.5% Triton X-100, 1% SDS and 1% Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher Scientific)
- BEnd. 3 cells were cultured to form a monolayer. Seven days after the culture was started and the cells became confluent, they were treated with Endo H at 1,000 units for 60 minutes in the same manner as in Example 3.
- reaction was performed with a control without buffer or with the above buffer alone (without enzyme). Furthermore, one was under 1% hypoxia (under Hypoxia) and the other was left as is (under 20% normoxia: under Normoxia). Then, changes in expression of claudin-5 were observed by fluorescent immunostaining, and bEnd. TEER of 3-cell monolayers was measured. According to the method of Cui D et al.
- FIG. 5A shows the results of fluorescent immunostaining
- FIG. 5B shows a graph quantifying the results of fluorescent immunostaining
- bEnd The results of measuring the TEER of the 3-cell monolayer are shown in FIG. 5C.
- FIG. 5A and B show that the Endo H pretreated bEnd. 3 cell layer, no significant decrease in cell membrane Claudin-5 was detected even under hypoxic stimulation, FIG. It was shown that the 3-cell layer does not lose its ability to form a nervous system vascular barrier even under hypoxic stimulation. These results revealed that Basigin-LG is an essential molecule for regulation of the nervous system vascular barrier.
- Example 5 (Basigin-LG and its relationship to regulation of the nervous system vascular barrier-in vivo) Regarding whether the analysis result of the in vitro experimental system that "Basigin-LG is a molecule essential for the regulation of the nervous system vascular barrier" in Example 4 above can be reproduced in the in vivo experimental system using the mouse retina.
- the retina is a tissue formed by sprouting from the central nervous system during the process of ontogeny, and is a part of the central nervous system like the brain. Since the vascular system of the retina can be two-dimensionally observed and evaluated over the entire length in the longitudinal direction, the retina was used as an analysis material as a representative of the central nervous system in this example.
- tracers As tracers, two fluorescent dyes, tetramethylrhodamine-conjugated lysine fixable dextran (10 kDa; Thermo Fisher Scientific) and Hoechst (registered trademark) stain H33252 (534 Da; Thermo Fisher Scientific) were used.
- Example 6 (Restoration of vascular barrier by intravenous administration of Endo H to diabetic mice) Is the analysis result of the in vitro experimental system that "Basigin-LG is a molecule essential for the regulation of the nervous system vascular barrier" in Example 4 above also reproduced in an in vivo experimental system using the retina of diabetic mice? was analyzed.
- mice 7-week-old C57B6/N mice were fasted for 4 hours, and their blood sugar and body weight were measured.
- 150 mg/kg of streptozotocin streptozotocin dissolved in citrate buffer
- streptozotocin injection 4 days after streptozotocin injection, the mice were fasted for 4 hours, blood sugar and body weight were measured, and diabetic mice with a blood sugar level of 250 mg/dl or more were used as blood-retinal barrier disruption model mice.
- Basign-LG is an essential molecule for regulation of the nervous system vascular barrier
- Basigin-LG is a protein modified with a high-mannose sugar chain
- Basigin-LG is a nervous system vascular barrier. It became clear that it is useful as a specific target for establishing an artificial control method for In addition, it has been reported that Basigin-HG is responsible for physiological functions other than nervous system vascular barrier regulation. It is expected that the establishment of an artificial control method will be realized.
- the 'open state' of the nervous system vascular barrier is used to treat nervous system diseases that play a central role in aggravating the condition.
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Abstract
本発明の課題は、神経系血管バリアーの破綻の抑制剤を提供することにある。 （ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素； （ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン； の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする神経系血管バリアー破綻の抑制剤を作製する。 低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖が、高マンノース型糖鎖であることが好ましい。
Description
本発明は神経系血管バリアー破綻の抑制剤や、神経系疾患治療剤に関する。
成体の脳、脊髄、網膜等の神経系組織では、血液と神経系組織の間に血液脳関門、血液網膜関門等の神経系血管バリアーが形成され、神経細胞が正常に機能できる至適組織微小環境が維持されている。神経系血管バリアーは、個体発生過程において誘導後、成体では基本的に維持されている状態、すなわち‘神経系血管バリアーが閉じた状態’となっているが、環境変化や何らかの刺激に反応して変化する動的調節下にある。難治性神経系疾患の病態・治療への神経系血管バリアーの関与は、次の２つがあげられる。１）神経系血管バリアーの存在（‘神経系血管バリアーが閉じた状態’）により、全身投与した治療薬が神経組織実質に到達できず、その結果、脳腫瘍、神経感染症等の治療の妨げになる。この場合、神経系血管バリアーを人為的に‘開いた状態’にすることが、難治性神経系疾患を克服する新規治療となる。２）神経系血管バリアーが‘開いた状態’になることが病態悪化の中枢を担う神経系疾患が多く存在する（虚血性脳疾患、糖尿病網膜症など）。この場合、神経系血管バリアーを人為的に‘閉じた状態’にすることが、難治性神経系疾患を克服する新規治療となる。したがって、神経系血管バリアーの人為的制御として‘閉じた状態’と‘開いた状態’が制御可能となれば、現在の医学では有用な治療法のない難治性神経系疾患の予後改善あるいは完治が期待される。
“神経系血管バリアーはどのような機構によって調節されているのか”を明らかにすべく、国内外の多くの研究者が半世紀以上にわたり研究を行ってきたが、未だトランスレーショナル研究として臨床現場に応用が期待される成果は得られていない。未だ有用な治療法のない多くの難治性神経系疾患に対して、新規治療薬の開発が進められているが、その創薬過程において最も大きな障壁の１つとなるのが神経系血管バリアーの存在である。いかにして神経系血管バリアーを通過させて薬剤を神経組織実質に到達させるかについて、多くの試みがなされてきた。そのなかで、神経系血管バリアーを‘閉じた状態’から‘開いた状態’にする手法に関しては、現状の臨床現場では、高張液マンニトール血管内投与により人為的に神経系血管バリアーを‘開いた状態’にする手法があるが、脱水により内皮細胞を変形させて細胞同士を物理的かつ不可逆的に解離させる手法である。この手法のほか、多くの研究者が進めている研究についても、神経系血管バリアーの構造自体、すなわち血管内皮細胞間のタイトな結合の破壊に繋がる戦略であり、高張液マンニトール血管内投与法とともに組織障害が大きな問題となる。また、神経系血管バリアーに関し、マトリックスメタロプロテイナーゼのようなプロテイナーゼによって開口する方法（非特許文献１参照）も開示されているが、神経系血管バリアー形成分子を破壊してしまい、神経系血管バリアーの一時的かつ可逆的な開口は難しかった。
さらに、神経系血管バリアーを‘開いた状態’から‘閉じた状態’にする手法については、未だ期待される研究成果の報告はなかった。そのような状況のなか、本発明者らは、約四半世紀の年月をかけ研究を進めた結果、近年、神経系血管バリアーの人為的制御系の確立・臨床応用に繋がる可能性の高い興味深い知見を得た。すなわち、神経系血管バリアーの調節責任分子として、神経系血管内皮細胞の細胞膜に発現・局在しているａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＤＡＭ）１２、ＡＤＡＭ１７、及びベイシジン（Ｂａｓｉｇｉｎ）を特定した（特許文献１、２、非特許文献２、３参照）。特に、ベイシジンについては、その発現抑制によりバリアーが‘開いた状態’から‘閉じた状態’となる現象を見出した。一方、ベイシジンには高糖鎖修飾型ベイシジンと低糖鎖修飾型ベイシジンが存在していることが知られている。そして、高糖鎖修飾型ベイシジンが、タンパク分解酵素Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）の発現誘導、白血球の血管内皮細胞への接着と血管外への遊走、及び糖尿病関連の血液脳関門破綻に関与するベイシジンとして特定されている（非特許文献４参照）。しかしながら、低糖鎖修飾型ベイシジンについては着目されておらず、そのため未だ研究が進んでなく、その機能も不明な点が多い。
Pengyu Pan et al., Neuroscience Letters Volume 649, 10 Pages 7-13, 2017
Cui, D et al., Sci Rep 5, 12796; doi: 10.1038/srep12796, 2015.
Mitsuru Arima et al., Sci Rep 6, 38445; doi: 10.1038/srep38445, 2016.
Yanan Xie et al. Journal of Neuroinflammation (2019) 16:72 https://doi.org/10.1186/s12974-019-1460-1
本発明の課題は、神経系血管バリアーの破綻の抑制剤を提供することにある。
ベイシジンには、神経系血管バリアーへの関与とともに、神経細胞機能への関与など複数の重要な生理機能が知られている。したがって、ベイシジンによる非特異的な生理機能の抑制や刺激は、重篤な副作用に繋がる可能性が懸念される。そこで本発明者らは、神経系血管バリアーという側面からベイシジンの分子構造の詳細な解析を行った。ベイシジンは糖鎖修飾を伴った分子であり、高糖鎖修飾型ベイシジン（以下、「Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧ」ともいう）と低糖鎖修飾型ベイシジン（以下、「Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧ」ともいう）という２つの異なるＮ－結合型糖鎖修飾分子の存在が知られている。本発明者らは、Ｂａｓｉｇｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節の必須分子であること、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧは高マンノース型糖鎖が修飾した糖タンパク質であること、及びＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧは神経系血管バリアーの人為的制御のための特異的標的として有用であることを見出し、本発明を完成した。なお、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧは多様な生理活性を有するため、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧを標的としてその生理活性を抑制すると様々な副作用が懸念される。これに対して、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧを主な標的とすることで副作用を軽減することができると考えられる。また、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧを主な標的とする分子を用いることで、画期的な神経系血管バリアー破綻の抑制剤、及び神経系疾患治療剤を提供することができる。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；
（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；
の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする、神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔２〕低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖が、高マンノース型糖鎖であることを特徴とする上記〔１〕に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔３〕低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素が、高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を実質的に遊離又は分解しないことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔４〕低糖鎖修飾型ベイシジンの分子量が３５，０００以下であり、高糖鎖修飾型ベイシジンの分子量が４０，０００～６０，０００であることを特徴とする上記〔３〕に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔５〕低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素が、エンドグリコシダーゼＦ１又はエンドグリコシダーゼＨであることを特徴とする上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔６〕（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；
（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；
の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする、神経系血管バリアー破綻に起因する神経系疾患治療剤。
〔７〕神経系疾患が、脳神経系疾患又は網膜神経系疾患であることを特徴とする上記〔６〕に記載の神経系疾患治療剤。
〔８〕脳神経系疾患が、脳浮腫であることを特徴とする上記〔７〕に記載の神経系疾患治療剤。
〔９〕網膜神経系疾患が、網膜浮腫であることを特徴とする上記〔７〕に記載の神経系疾患治療剤。
〔１〕（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；
（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；
の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする、神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔２〕低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖が、高マンノース型糖鎖であることを特徴とする上記〔１〕に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔３〕低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素が、高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を実質的に遊離又は分解しないことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔４〕低糖鎖修飾型ベイシジンの分子量が３５，０００以下であり、高糖鎖修飾型ベイシジンの分子量が４０，０００～６０，０００であることを特徴とする上記〔３〕に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔５〕低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素が、エンドグリコシダーゼＦ１又はエンドグリコシダーゼＨであることを特徴とする上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
〔６〕（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；
（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；
の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする、神経系血管バリアー破綻に起因する神経系疾患治療剤。
〔７〕神経系疾患が、脳神経系疾患又は網膜神経系疾患であることを特徴とする上記〔６〕に記載の神経系疾患治療剤。
〔８〕脳神経系疾患が、脳浮腫であることを特徴とする上記〔７〕に記載の神経系疾患治療剤。
〔９〕網膜神経系疾患が、網膜浮腫であることを特徴とする上記〔７〕に記載の神経系疾患治療剤。
さらに、本発明の神経系疾患治療剤の別の態様としては、
〔ｉ〕（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；の（ａ）又は（ｂ）のいずれかを対象に投与することを特徴とする神経系血管バリアー機能の破綻に起因する神経系疾患治療方法や、
〔ｉｉ〕神経系血管バリアー機能の破綻に起因する神経系疾患治療剤として使用するための、（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素又は（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチンや、
〔ｉｉｉ〕（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；の（ａ）又は（ｂ）の、神経系血管バリアー機能の破綻に起因する神経系疾患治療剤の調製における使用、の〔ｉ〕～〔ｉｉｉ〕を挙げることができる。
〔ｉ〕（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；の（ａ）又は（ｂ）のいずれかを対象に投与することを特徴とする神経系血管バリアー機能の破綻に起因する神経系疾患治療方法や、
〔ｉｉ〕神経系血管バリアー機能の破綻に起因する神経系疾患治療剤として使用するための、（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素又は（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチンや、
〔ｉｉｉ〕（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；の（ａ）又は（ｂ）の、神経系血管バリアー機能の破綻に起因する神経系疾患治療剤の調製における使用、の〔ｉ〕～〔ｉｉｉ〕を挙げることができる。
本発明により、神経系血管バリアーの破綻を抑制することや、神経系血管バリアー破綻に起因する神経系疾患の治療が可能となる。
本発明の神経系血管バリアー破綻の抑制剤の一態様は、（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする神経系血管バリアー破綻の抑制剤であれば特に制限されず、以下、「本件神経系血管バリアー破綻の抑制剤」ともいう。また、本発明の一態様は、（ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする、神経系血管バリアー破綻に起因する神経系疾患治療剤であり、以下、「本件神経系疾患治療剤」ともいう。
本明細書において、神経系血管バリアーとは、血液と神経系の組織液との物質交換を制限する機構を意味し、血液と脳の組織液との物質交換を制限する血液脳関門や、血液と網膜の組織液との物質交換を制限する血液網膜関門を好適に挙げることができる。
本明細書において、神経系血管バリアー破綻の抑制とは、血液と神経系の組織液との物質交換を制限する機構が機能せず、その結果、神経毒性分子の組織内侵入や血漿成分の浸出が生じることを抑制することを意味する。
本明細書におけるベイシジンは細胞膜に局在するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、ＥＭＭＰＲＩＮ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＣＤ１４７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １４７）、Ｍ６、ＧＰ４２、ＨＴ７、ＯＸ－４７、ＭＣ３１、ＣＥ９又はｆｏｒｔｈ２２とも称されている。ベイシジンは、ペプチジル－プロリル シス－トランス イソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性を有するシクロフィリンの一員であるシクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）の受容体であることが知られている。ベイシジンとしてはヒトのベイシジンであることが好ましく、ヒトのベイシジンのアミノ酸配列は配列番号１を挙げることができ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）においてアクセッション番号ＮＰ＿９４０９９１．１として公開されている。
ベイシジンは糖鎖修飾を伴った糖タンパク質であり、配列番号１に示すアミノ酸配列における４４番目、１５２番目、及び／又は１８６番目のアスパラギン（Ａｓｎ）残基の側鎖のアミド基の窒素（Ｎ）にＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がグリコシド結合したＮ－結合型糖鎖を有している。そして、かかるＮ－アセチルグルコサミンに伸長する際に付加される糖の種類及び個数によりベイシジンの分子量が異なっている。
本明細書において、低糖鎖修飾型ベイシジン（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧ）とは、含有するＮ－結合型糖鎖が低糖鎖修飾しており、分子量が３５，０００以下のベイシジンを意味し、高糖鎖修飾型ベイシジン（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧ）とは、含有するＮ－結合型糖鎖が高糖鎖修飾しており、分子量が４０，０００～６０，０００のベイシジンを意味する。なお、低糖鎖修飾型ベイシジン又は高糖鎖修飾型ベイシジンにおけるコアプロテインの分子量はおよそ２７，０００である。
本明細書において、高マンノース型糖鎖とは、Ｎ－結合型糖鎖のＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン２分子とマンノース３分子からなるトリマンノシルコア構造にマンノースのみが結合した糖鎖を意味する。また、コンプレックス型糖鎖とは、上記トリマンノシルコア構造にマンノースとＮ－アセチルグルコサミンが結合した混成型糖鎖を意味する。
本明細書における低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素としては、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖へ特異的に作用し、前記低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を遊離又は分解する酵素であれば特に制限されない。かかる酵素としては、低糖鎖修飾型ベイシジンの高マンノース型糖鎖へ特異的に作用し、前記低糖鎖修飾型ベイシジンの高マンノース型糖鎖を遊離又は分解する酵素であることが好ましい。ここで、「低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する」とは、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖、たとえば低糖鎖修飾型ベイシジンの高マンノース型糖鎖を遊離又は分解し、高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖、たとえば高糖鎖修飾型ベイシジンのコンプレックス型糖鎖を実質的に遊離又は分解しない酵素や、高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖、たとえば高糖鎖修飾型ベイシジンのコンプレックス型糖鎖と比較して、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖、たとえば低糖鎖修飾型ベイシジンの高マンノース型糖鎖を遊離又は分解する活性が３倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上である酵素を挙げることができる。かかる低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素としては、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖へ特異的に作用し、前記低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を遊離するグリコシダーゼや、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖へ特異的に作用し、前記低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を分解するαマンノシダーゼを挙げることができ、好ましくはエンドグリコシダーゼＨ又はエンドグリコシダーゼＦ１を挙げることができるがこれらに制限されない。
低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖又は高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を遊離又は分解する活性の測定方法としては、たとえば、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖又は高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖と活性測定対象の酵素を反応させて、反応生成物の量をＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量の変化、ＨＰＬＣによるリテンションタイムの変化、あるいはＴＬＣによるサイズの変化として検出する方法を挙げることができる。
本明細書において、低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合とは、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖部分、及び／又はタンパク質部分（コアプロテイン部分）へ結合し、高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖部分には実質的に結合しないことを意味する。
本明細書における低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖に特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチンにおいて、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制するか否かは、たとえば後述の実施例で示すように、脳血管内皮細胞株単層のＣｌａｕｄｉｎ－５発現レベルやＴＥＥＲの測定、及び／又はマウスにトレーサーを投与後にトレーサーの漏出を評価することによって判断することが可能となる。
本明細書における低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体としては、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖部分、及び／又はタンパク質部分に結合し、かつ高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖部分に結合しない若しくは実質的に結合しない特徴を有し、かつ低糖鎖修飾型ベイシジンに結合した場合にベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する作用を有するものであれば特に制限されない。また、上記「高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖部分に結合しない若しくは実質的に結合しない」とは、高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖部分と結合又は親和性を有しても高糖鎖修飾型ベイシジンの作用に影響を与えない場合も含まれる。
かかる抗体の種類としては、どのような種類の抗体であってもよく、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体等のほか、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、又はＳｃ（Ｆｖ）２等の抗体断片を挙げることができる。また、上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。キメラ抗体、又はヒト化抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、抗体断片は、完全長抗体をペプシン又はパパインで消化する方法等によって作製することができる。なお、後述の実施例に記載のように低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖は高マンノース型糖鎖であることから、低糖鎖修飾型ベイシジンに結合する抗体とは、低糖鎖修飾型ベイシジンにおける高マンノース型糖鎖及び／又はタンパク質部分をエピトープとする抗体ともいえる。
上記低糖鎖修飾型ベイシジンに結合する抗体の作製方法としては、脳血管内皮細胞株、たとえばｂＥｎｄ．３細胞や、遺伝子工学的手法により低糖鎖修飾型ベイシジンを発現させた脳血管内皮細胞等の生細胞、あるいは精製した低糖鎖修飾型ベイシジンを免疫源として利用し、公知の抗体作製手法、例えばハイブリドーマ法やファージディスプレイ法等により作製することができる。特に上記低糖鎖修飾型ベイシジンを高発現させた生細胞を利用することで、より生体内に近い立体構造を維持した、低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的な抗体を得ることができる。本件神経系疾患治療剤に有用な抗体、特に低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合する抗体は、高糖鎖修飾型ベイシジン並びに低糖鎖修飾型ベイシジンの精製物もしくは高糖鎖修飾型ベイシジン並びに低糖鎖修飾型ベイシジンを発現した細胞を用いたＥＬＩＳＡ法等のスクリーニング法において、低糖鎖修飾型ベイシジンに優位に結合する性質を基準に選択できる。
本明細書における低糖鎖修飾型ベイシジンに結合し、かつ高糖鎖修飾型ベイシジンに結合しないレクチンとしては、低糖鎖修飾型ベイシジンに結合し、かつ高糖鎖修飾型ベイシジンに結合しない若しくは実質的に結合しない特徴を有し、かつ低糖鎖修飾型ベイシジンに結合した場合にベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する作用を有するものであれば特に制限されない。なお、上記レクチンとは、糖鎖に対して結合する抗体又は酵素以外のタンパク質を意味する。かかるレクチンの種類としては、α－マンノシル残基を認識するレクチンから選択することができる。α－マンノシル残基を認識するレクチンとしては、たとえばタチナタマメ由来のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のエンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のレンズマメレクチン（ＬＣＡ）、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ由来のスノードロップレクチン（ＧＮＬ）、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ由来のＮＰＬ、Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ（ｂａｎａｎａ）由来のバナナレクチン（ＢａｎＬｅｃ）、Ｂｏｗｒｉｎｇｉａ ｍｉｄｂｒａｅｄｉｉ由来の西アフリカマメレクチン（ＢＭＡ）、Ｌｉｓｔｅｒａ ｏｖａｔａ由来のトウェイブレード（ＬＯＡ）を挙げることができる。かかるレクチンから、低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖、好ましくは高マンノース型糖鎖に特異的に結合するレクチンを選択すればよい。また、上記「高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖に実質的に結合しない」とは、高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖と結合又は親和性を有しても高糖鎖修飾型ベイシジンの作用に影響を与えない場合も含まれる。
低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖に特異的に結合するレクチンとしては、たとえばフロンタルアフィニティクロマトグラフィーにより測定した高マンノース型糖鎖との相互作用強度が、非高マンノース型糖鎖との相互作用強度の５倍以上、好ましくは１０倍、より好ましくは１００倍以上のレクチンを挙げることができる。
上記抗体又はレクチンが低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖に特異的に結合する特徴を有するか否かは、たとえば分子量に基づいてベイシジンを低糖鎖修飾型ベイシジンと高糖鎖修飾型ベイシジンに分離して抗体、アプタマー、又はレクチンが結合するか否かを調べることによって確認することが可能となる。低糖鎖修飾型ベイシジンと高糖鎖修飾型ベイシジンに分離する方法としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ゲルろ過クロマトグラフィーを挙げることができる。また、分離した低糖鎖修飾型ベイシジン又は高糖鎖修飾型ベイシジンに対して、抗体、アプタマー又はレクチンが結合するか否かは、蛍光色素、蛍光タンパク質、ビオチン等で標識した抗体、アプタマー又はレクチンを分離した低糖鎖修飾型ベイシジン又は高糖鎖修飾型ベイシジンに対して結合させて、前記標識を検出することで確認することができる。また、高マンノース型糖鎖に結合するレクチンは、たとえばアフィニティークロマトグラフィーを用いた特許第４０５１０３０号公報に記載の方法で得ることができ、必要に応じてさらに精製、選択することができる。
本明細書において、神経系血管バリアー機能の破綻に起因する神経系疾患としては、好ましくは血管バリアー機能が破綻して組織微小環境の攪乱が生じることによる疾患を挙げることができ、より好ましくは脳浮腫、脳梗塞、アルツハイマー病等の変性性認知症、血管性認知症、虚血性脳疾患などの脳神経系疾患、又は網膜浮腫などの網膜神経系疾患を挙げることができ、特に好ましくは脳浮腫又は網膜浮腫を挙げることができる。なお、神経系血管とは、神経系組織の血管であり、神経系組織以外の組織における血管は含まれない。
本発明の神経系疾患治療剤の投与方法としては、所望の神経系疾患治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与などを挙げることができ、特に網膜神経系疾患においては、硝子体内投与を挙げることができる。また、本発明の神経系疾患治療剤の投与量は特に制限されず、被検者や被検動物の体調、病状、体重、年齢、性別などによって適宜調整することができる。投与量としては、例えば１日あたり、有効成分の酵素、抗体、アプタマー又はレクチンとして０．０１μｇ～１００ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ～１０ｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１μｇ～１ｇ／ｋｇ体重を挙げることができ、本発明の神経系疾患治療剤を他の神経系疾患治療剤と併用してもよい。本発明の神経系疾患治療剤の投与回数や投与期間なども特に制限されず、１日あたりの投与量を１日１回又は数回に分けて投与することもできる。また投与対象の細胞、組織の由来や生体は特に制限されず、好ましくは哺乳類であり、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスターなどを例示することができ、特に好ましくはヒトを例示することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］
（ウェスタンブロット解析）
ベイシジンは、細胞外ドメインに３個のＮ－結合型糖鎖修飾部位（図１）を有する糖タンパク質であり、高糖鎖修飾型ベイシジン（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧ）と低糖鎖修飾型ベイシジン（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧ）の存在が知られている。そこで、それぞれの糖鎖修飾をウェスタンブロットにより解析した。
（ウェスタンブロット解析）
ベイシジンは、細胞外ドメインに３個のＮ－結合型糖鎖修飾部位（図１）を有する糖タンパク質であり、高糖鎖修飾型ベイシジン（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧ）と低糖鎖修飾型ベイシジン（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧ）の存在が知られている。そこで、それぞれの糖鎖修飾をウェスタンブロットにより解析した。
マウス脳血管内皮細胞株（ｂＥｎｄ．３細胞：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加した４５００ｍｇ／Ｌグルコースを含むダルベッコ変法Ｅａｇｌｅ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で５％ ＣＯ２下に３７℃で単層となるように培養した。培養開始してコンフルエント状態になってから６日目にＮ－結合型糖鎖の阻害剤であるツニカマイシンを培地中の濃度が２．５μg／ｍｌとなるように加えて引き続き２４時間培養した。コンフルエント状態になってから７日目のｂＥｎｄ．３細胞を組織溶解バッファー（１００μｌ ＰＢＳに０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）及び１％Ｐｒｏｔｅａｓｅ／Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含有）で溶解し、１５，０００回転で１５分遠心機にかけて上清を得た。続いて、２ｘＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒで９９℃、５分ほど変性処理した後、これらのサンプルを１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ）に転写した。ＰＶＤＦ膜をブロッキング溶液（５％スキムミルク）中、１時間インキュベートすることによりブロッキングを行った。次に、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ｂａｓｉｇｉｎ抗体（１μｇ／ｍｌ：Ｓｃｒｕｍ社）を一次抗体として４℃、一晩インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０，ＴＢＳ）で洗浄後、二次抗体（ＨＲＰ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔｋ ＩｇＧ，Ｄａｋｏ社）中、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて化学発光を検出した。
上記ウェスタンブロット解析の結果を図２に示す。右レーン（＋）は培養開始してコンフルエント状態になってから６日目にツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）を加えた場合、左レーン（－）はコントロ－ルのツニカマイシンなしで７日目まで培養した場合である。糖鎖修飾阻害剤であるＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎなしの場合には、サイズの異なる２つの比較的幅のあるバンドが検出された。一方、Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ存在下では２つの比較的幅のあるバンドがいずれも消失しコアプロテインと判断される１つのバンドに集束した。したがって、左レーン（－）のそれぞれのバンドがＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧとＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧに対応することが示され、両者の発現が確認された。
［実施例２］
（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧ又はＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの発現と血管バリアー機能の関係）
実施例１によりＢａｓｉｇｉｎにはＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧとＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧが発現することが確認された。そこで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系においてＢａｓｉｇｉｎ特異的ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２の２種）の導入によるＢａｓｉｇｉｎ発現抑制系を用い、神経系血管バリアー調節に対するＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧ及びＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの関与を解析した。
（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧ又はＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの発現と血管バリアー機能の関係）
実施例１によりＢａｓｉｇｉｎにはＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧとＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧが発現することが確認された。そこで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系においてＢａｓｉｇｉｎ特異的ｓｉＲＮＡ（＃１、＃２の２種）の導入によるＢａｓｉｇｉｎ発現抑制系を用い、神経系血管バリアー調節に対するＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧ及びＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの関与を解析した。
まず、ベイシジンに対するｓｉＲＮＡ（ベイシジン特異的ｓｉＲＮＡ：Ｂａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡ）として、以下の表１に示すＢａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡ＃１（センス鎖配列：配列番号２、アンチセンス鎖配列：配列番号３）、Ｂａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡ＃２（センス鎖配列：配列番号４、アンチセンス鎖配列：配列番号５）の２種類、及びＮｏｎ－ｓｉｌｅｎｃｅ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標） Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１ ｓｉＲＮＡ（ＮＣ ｓｉＲＮＡ） カタログ番号４３９０８４３：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。なお、配列番号２－５中、小文字で表される塩基配列はオーバーハング配列を表す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において、マウス脳血管内皮細胞株ｂＥｎｄ．３細胞（ＡＴＣＣから入手）を２ディッシュ用意し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加した４５００ｍｇ／Ｌグルコースを含むダルベッコ変法Ｅａｇｌｅ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で５％ ＣＯ２下に３７℃で単層として増殖させた。培養開始してコンフルエント状態になってから５．５日目に上記各ｓｉＲＮＡを終濃度が１０ｎＭとなるように導入した。Ｂａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡ導入から３６時間後に、１ディッシュは４５分間ほど１％低酸素状態下（Ｈｙｐｏｘｉａ下）とし、他方はそのまま（２０％正常酸素状態下：Ｎｏｒｍｏｘｉａ下）とした。
その後、ｂＥｎｄ．３細胞におけるウェスタンブロット解析を行うと共に、ｃｌａｕｄｉｎ－５の発現変化を蛍光免疫染色にて観察し、さらに血管バリアー機能の指標であるｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲをＫｏｔｏ Ｔらの方法（Am. J. Pathol. (2007) 170:1389-1397）に従って測定した。
ウェスタンブロット解析は次の方法で行った。上記Ｂａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡ導入から３６時間後（培養開始してコンフルエント状態になってからから７日目：Ｎｏｒｍｏｘｉａ下）のＢａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡ処理、ＮＣ ｓｉＲＮＡ処理、又はｓｉＲＮＡなしのコントロールそれぞれのｂＥｎｄ．３細胞を組織溶解バッファー（１００μｌ ＰＢＳに０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１％ ＳＤＳ及び１％Ｐｒｏｔｅａｓｅ／Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含有）で溶解し、１５，０００回転で１５分遠心機にかけて、上清を得た。次いで、上記実施例１と同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦへの転写、抗体処理、及び化学発光の検出を行った。
蛍光免疫染色は、次の方法で行った。まず、培養開始してコンフルエント状態になってから７日目の細胞を、Ｈｙｐｏｘｉａ下もしくはＮｏｒｍｏｘｉａ下にそれぞれ４５分ほど培養し、それぞれのｂＥｎｄ．３細胞を１００％メタノールによって５分間室温で固定し、１０％ Ｎｏｎ－Ｉｍｍｕｎｅ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３０分間インキュベートし、抗体の非特異的結合を遮断した。次に、細胞をｃｌａｕｄｉｎ－５に対するウサギポリクローナル抗体（１／２５希釈 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と４℃で一晩反応させた。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２００希釈 Ｅｕｇｅｎｅ社）と共に、光からの保護下、室温で１時間インキュベートした。さらに、染色細胞をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）にマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５ Ｐａｓｃａｌレーザー共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）下で観察した。
図３Ａにウェスタンブロット解析の結果を示す。図３Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ導入から３６時間後ではＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの発現はほぼ消失するのに対しＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧの発現レベルの有意な低下はみられなかった。この結果から、蛍光免疫染色に用いたｂＥｎｄ．３細胞に含むＢａｓｉｇｉｎはＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧのみを有しており、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧは有さない状態といえる。また、蛍光免疫染色結果を図３Ｂに、ｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲを測定した結果を図３Ｃに示す。図３Ｂに示すように、Ｂａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡ無しのコントロールもしくはＮｏｎ－ｓｉｌｅｎｃｅ ｓｉＲＮＡを導入した場合には、１％低酸素状態下（Ｈｙｐｏｘｉａ下）によってｂＥｎｄ．３細胞の細胞膜からのｃｌａｕｄｉｎ－５の消失現象が観察された。一方、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧの発現はほぼ消失し、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧの発現が残っている状況下において、１％低酸素状態下（Ｈｙｐｏｘｉａ下）においても細胞膜からのＣｌａｕｄｉｎ－５の有意な減少が検出されていなかった。さらに、図３Ｃに示すように、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧの発現はほぼ消失し、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧの発現が残っている状況下においては、神経血管バリアー形成能が失われないことが示された。したがって、１％低酸素状態下（Ｈｙｐｏｘｉａ下）による細胞膜からのＣｌａｕｄｉｎ－５の減少や神経血管バリアー破綻には、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが関与していることが明らかとなった。なお、ｓｉＲＮＡ導入から７２間後のＢａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡ処理、ＮＣ ｓｉＲＮＡ処理、又はｓｉＲＮＡなしのコントロールそれぞれのｂＥｎｄ．３細胞を上記と同様に組織溶解バッファーで溶解し、上清を得てウェスタンブロット解析を行ったところ、ｓｉＲＮＡ導入から３６時間後の場合と比較してＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧの発現レベルが低下するのが確認された（図示なし）。そのため、図３Ａにおいて、Ｂａｓｉｇｉｎ ｓｉＲＮＡで処理してＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの発現はほぼ消失したにも関わらずＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧの発現レベルが低下していないのは、それぞれのタンパク質の半減期の差によるものと思われる。
［実施例３］
（ベイシジンの糖鎖解析）
上記実施例２の結果から、神経系血管バリアーの調節には少なくともＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧが必須の分子であるという仮説を立てた。Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが必須分子であれば、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧのみを特異的標的とした神経系血管バリアーの人為的制御手法の確立が可能となる。その結果、ベイシジンの多くの生理機能を担っているＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧの発現抑制によって懸念される副作用を低減できると考えられる。
（ベイシジンの糖鎖解析）
上記実施例２の結果から、神経系血管バリアーの調節には少なくともＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧが必須の分子であるという仮説を立てた。Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが必須分子であれば、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧのみを特異的標的とした神経系血管バリアーの人為的制御手法の確立が可能となる。その結果、ベイシジンの多くの生理機能を担っているＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧの発現抑制によって懸念される副作用を低減できると考えられる。
そこでＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧ及びＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの糖鎖構造の検索を行った。ｂＥｎｄ．３細胞に発現するＢａｓｉｇｉｎの糖鎖構造について、Ｎ－結合型糖鎖のうち高マンノース型糖鎖を特異的に分解する酵素であるＥｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｈ（Ｅｎｄｏ Ｈ）及びＮ－結合型糖鎖を全て分解する酵素であるＰｅｐｔｉｄｅ－Ｎ－Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用い解析を行った。
マウス脳血管内皮細胞株（ｂＥｎｄ．３細胞：ＡＴＣＣから入手）を培養した。培養開始してコンフルエント状態になってから７日目のｂＥｎｄ．３細胞を組織溶解バッファー（１００μｌ ＰＢＳに０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１％ ＳＤＳ及び１％Ｐｒｏｔｅａｓｅ／Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む）で溶解し、１５，０００回転で１５分ほど遠心機にかけて、上清を得た。次に、Ｅｎｄｏ Ｈ又はＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）と酵素反応を行うために、５５μｌの前記上清に対してＥｎｄｏ Ｈ及びＰＮＧａｓｅ Ｆに付属のＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇバッファー（１０ｘ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を加え、１００℃で１０分間反応させて反応産物を得た。その後、得られた反応産物に対して付属のＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ（１０ｘ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）及び１，０００ユニットの Ｅｎｄｏ Ｈ又はＰＮＧａｓｅ Ｆを加え、３７℃で６０分反応させた。対照としてバッファーなしのコントロール、あるいは上記バッファーのみ（酵素無し）と反応させた。次に、上記実施例１と同様にそれぞれの反応液によりＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦへの転写、抗体処理、及び化学発光の検出を行った。
ウェスタンブロット解析の結果を図４に示す。Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧの糖鎖はＰＮＧａｓｅ Ｆにより分解されるがＥｎｄｏ Ｈでは分解されないこと、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧの糖鎖はＰＮＧａｓｅ ＦとＥｎｄｏ Ｈの両方により分解されることが示された。すなわち、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＨＧとＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの糖鎖はともにＮ－結合型糖鎖であること、及びＢａｓｉｇｉｎ－ＬＧの糖鎖は高マンノース型糖鎖であることが明らかとなった。
［実施例４］
（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧと神経系血管バリアーの調節との関係－ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが、神経系血管バリアーの調節に必須の糖鎖修飾型Ｂａｓｉｇｉｎであるか否かをｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系で調べた。
（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧと神経系血管バリアーの調節との関係－ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが、神経系血管バリアーの調節に必須の糖鎖修飾型Ｂａｓｉｇｉｎであるか否かをｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系で調べた。
実施例１と同様の方法でｂＥｎｄ．３細胞を単層となるように培養した。培養を開始してコンフルエント状態になってから７日目に実施例３と同様にＥｎｄｏ Ｈを１，０００ユニットで６０分処理した。対照としてバッファーなしのコントロール、あるいは上記バッファーのみ（酵素無し）と反応させた。さらに一方は１％低酸素状態下（Ｈｙｐｏｘｉａ下）とし、他方はそのまま（２０％正常酸素状態下：Ｎｏｒｍｏｘｉａ下）とした。そして、ｃｌａｕｄｉｎ－５の発現変化を蛍光免疫染色にて観察し、さらに血管バリアー機能の指標であるｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲを測定した。蛍光免疫染色結果は、Ｃｕｉ Ｄらの方法（Sci. Rep. 5:12796(2015) doi:10.1038/srep12796）に従い、１検体あたり、３視野を無作為に選出して写真を撮影し、１枚の写真につき３本のラインを引き、細胞膜との交点におけるｃｌａｕｄｉｎ－５の蛍光強度を測定し、平均値を算出して定量化した。同様に１群あたり３検体ずつ測定を行い、平均値を比較した。蛍光免疫染色結果を図５Ａに、蛍光免疫染色結果を定量化したグラフを図５Ｂに、ｂＥｎｄ．３細胞単層のＴＥＥＲを測定した結果を図５Ｃに示す。
図５Ａ及びＢにより、Ｅｎｄｏ Ｈ前処理されたｂＥｎｄ．３細胞層では、低酸素刺激下においても細胞膜Ｃｌａｕｄｉｎ－５の有意な減少が検出されないこと、図５Ｃにより、Ｅｎｄｏ Ｈ前処理されたｂＥｎｄ．３細胞層では、低酸素刺激下においても神経系血管バリアー形成能が失われないことが示された。これらの結果から、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節に必須の分子であるということが明らかとなった。
［実施例５］
（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧと神経系血管バリアーの調節との関係－ｉｎ ｖｉｖｏ）
上記実施例４における、「Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節に必須の分子である」というｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系の解析結果が、マウスの網膜を用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験系でも再現されるかについて解析を行った。なお、網膜は、個体発生の過程で中枢神経系が出芽する形で形成される組織であり、脳と同様に中枢神経系の一部である。網膜の血管系は、長軸方向に全長に渡って２次元的に観察・評価することが可能であるため、本実施例では、中枢神経系の代表として網膜を解析材料として用いた。
（Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧと神経系血管バリアーの調節との関係－ｉｎ ｖｉｖｏ）
上記実施例４における、「Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節に必須の分子である」というｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系の解析結果が、マウスの網膜を用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験系でも再現されるかについて解析を行った。なお、網膜は、個体発生の過程で中枢神経系が出芽する形で形成される組織であり、脳と同様に中枢神経系の一部である。網膜の血管系は、長軸方向に全長に渡って２次元的に観察・評価することが可能であるため、本実施例では、中枢神経系の代表として網膜を解析材料として用いた。
マウス尾静脈からＥｎｄｏ Ｈを３，０００ユニット投与し、対照（Ｅｎｄｏ Ｈ投与なし）マウスとともに２０％正常酸素状態下（Ｎｏｒｍｏｘｉａ下）あるいは７～８％低酸素状態下（Ｈｙｐｏｘｉａ下）で４０時間飼育した。その後、トレーサーとして蛍光色素を心臓内投与した後、網膜伸展標本を作製し、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡にて観察することで網膜血管の透過性（血液網膜関門機能の指標）を評価した。トレーサーとしては、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｙｓｉｎｅ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｅｘｔｒａｎ（１０ｋＤａ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）ｓｔａｉｎ Ｈ３３２５２（５３４Ｄａ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の２つの蛍光色素を用いた。
図６に示すように、Ｅｎｄｏ Ｈ非投与マウスでは、低酸素状態の網膜において血管からの色素の漏れが検出され、神経系血管バリアーが‘開いた状態’であることが観察された。これに対し、Ｅｎｄｏ Ｈ投与マウスでは、低酸素状態の網膜においても血管からの有意な色素の漏れは検出されない、つまり神経系血管バリアーが‘閉じた状態’であることが観察された。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏ実験系においても、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節の必須分子であることが示された。
［実施例６］
（糖尿病マウスへのＥｎｄｏ Ｈ静脈内投与による血管バリアーの修復）
上記実施例４における、「Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節に必須の分子である」というｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系の解析結果が、糖尿病マウスの網膜を用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験系でも再現されるかについて解析を行った。
（糖尿病マウスへのＥｎｄｏ Ｈ静脈内投与による血管バリアーの修復）
上記実施例４における、「Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節に必須の分子である」というｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系の解析結果が、糖尿病マウスの網膜を用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験系でも再現されるかについて解析を行った。
７週齢のＣ５７Ｂ６／Ｎマウスを４時間絶食し、血糖と体重を測定した。次に、１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Streptozotocin：クエン酸緩衝液に溶解）を腹腔内注射した。さらにストレプトゾトシン注射から４日後に４時間絶食し、血糖と体重を測定し、血糖値が２５０ｍｇ／ｄｌ以上の糖尿病マウスを血液網膜関門破綻モデルマウスとした。
上記で得られた糖尿病マウス及び正常マウスとして非糖尿病マウス（クエン酸緩衝液を腹腔内注射したＣ５７Ｂ６／Ｎマウス）のそれぞれにおいて、尾静脈からＥｎｄｏ Ｈを３，０００ユニット投与あり（＋）群、又はＥｎｄｏ Ｈ投与なし群（－）に分けて４０時間飼育した。その後、トレーサーとして蛍光色素を心臓内投与した後、網膜伸展標本を作製し、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡にて観察することで網膜血管の透過性（血液網膜関門機能の指標）を評価した。トレーサーとしては、実施例５と同様の蛍光色素を用いた。結果を図７に示す。
Ｅｎｄｏ Ｈ非投与の糖尿病マウスでは、網膜において血管からの色素の漏れが検出され、神経系血管バリアーが‘開いた状態’であることが観察された。これに対し、Ｅｎｄｏ Ｈ投与により、網膜における血管からの有意な色素の漏れは検出されなくなった、つまり、Ｅｎｄｏ Ｈ投与により神経系血管バリアーが‘閉じた状態’になることが観察された。したがって、糖尿病マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験系においても、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節の必須分子であることが示された。
以上の実施例をまとめると、Ｂａｓｉｇｎ－ＬＧが神経系血管バリアーの調節の必須分子であること、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧは高マンノース型糖鎖が修飾したタンパク質であること、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧは神経系血管バリアーの人為的制御手法確立のための特異的標的として有用であることが明らかになった。また、神経系血管バリアー調節以外の生理機能はＢａｓｉｇｉｎ－ＨＧにより担われていると報告されていることから、Ｂａｓｉｇｉｎ－ＬＧを特異的標的とすれば、副作用を最小限に抑えた神経系血管バリアーの人為的制御手法の確立が実現することが期待される。
神経系血管バリアーが‘開いた状態’になることが病態悪化の中枢を担う神経系疾患に対する治療に利用される。
Claims (9)
- （ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；
（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；
の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする、神経系血管バリアー破綻の抑制剤。 - 低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖が、高マンノース型糖鎖であることを特徴とする請求項１に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
- 低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素が、高糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を実質的に遊離又は分解しないことを特徴とする請求項１又は２に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
- 低糖鎖修飾型ベイシジンの分子量が３５，０００以下であり、高糖鎖修飾型ベイシジンの分子量が４０，０００～６０，０００であることを特徴とする請求項３に記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
- 低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素が、エンドグリコシダーゼＦ１又はエンドグリコシダーゼＨであることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の神経系血管バリアー破綻の抑制剤。
- （ａ）低糖鎖修飾型ベイシジンの糖鎖を特異的に遊離又は分解する酵素；
（ｂ）低糖鎖修飾型ベイシジンに特異的に結合し、ベイシジンによる神経系血管バリアー破綻を抑制する抗体、アプタマー又はレクチン；
の（ａ）又は（ｂ）を有効成分とする、神経系血管バリアー破綻に起因する神経系疾患治療剤。 - 神経系疾患が、脳神経系疾患又は網膜神経系疾患であることを特徴とする請求項６に記載の神経系疾患治療剤。
- 脳神経系疾患が、脳浮腫であることを特徴とする請求項７に記載の神経系疾患治療剤。
- 網膜神経系疾患が、網膜浮腫であることを特徴とする請求項７に記載の神経系疾患治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023509328A JPWO2022203043A1 (ja) | 2021-03-25 | 2022-03-25 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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|---|---|
| WO2022203043A1 true WO2022203043A1 (ja) | 2022-09-29 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| PCT/JP2022/014394 WO2022203043A1 (ja) | 2021-03-25 | 2022-03-25 | 神経系血管バリアー破綻の抑制剤、及び神経系疾患治療剤 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2017073232A1 (ja) * | 2015-10-29 | 2017-05-04 | 国立大学法人山口大学 | 神経系血管バリアー破綻抑制剤及び神経系疾患治療剤 |
| JP2020511130A (ja) * | 2017-03-09 | 2020-04-16 | サイトメックス セラピューティクス インコーポレイテッド | Ｃｄ１４７抗体、活性化可能ｃｄ１４７抗体、ならびにその作製および使用の方法 |
-
2022
- 2022-03-25 JP JP2023509328A patent/JPWO2022203043A1/ja active Pending
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ARIMA MITSURU, CUI DAN, KIMURA TOKUHIRO, SONODA KOH-HEI, ISHIBASHI TATSURO, MATSUDA SATOSHI, IKEDA EIJI: "Basigin can be a therapeutic target to restore the retinal vascular barrier function in the mouse model of diabetic retinopathy", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 6, no. 1, 1 December 2016 (2016-12-01), XP055968976, DOI: 10.1038/srep38445 * |
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