CN113677372A - 可活化免疫检查点抑制剂和经缀合可活化抗体的组合疗法 - Google Patents

可活化免疫检查点抑制剂和经缀合可活化抗体的组合疗法 Download PDF

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Abstract

本文提供了与将在活化时特异性结合CD166的经缀合可活化抗CD166抗体和可活化免疫检查点抑制剂组合的疗法相关的组合物和方法。本文还提供了与将在活化时特异性结合免疫检查点的可活化抗免疫检查点抗体和经缀合可活化抗体组合的疗法相关的组合物和方法，其中所述免疫检查点是哺乳动物PD‑1或哺乳动物PD‑L1。

Description

可活化免疫检查点抑制剂和经缀合可活化抗体的组合疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月26日提交的美国临时申请第62/810,68号和2019年3月28日提交的美国临时申请第62/825,228号的权益，所述美国临时申请的内容通过引用以它们的整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于治疗癌症的经缀合可活化抗体和可活化免疫检查点抑制剂的施用方法和组合物组合。
序列表的引用
依据37C.F.R.§1.821通过EFS网以文件名“CYTX-060-PCT_ST25”以计算机可读形式(CFR)以电子方式同时随同提交的“序列表”通过引用并入本文。序列表的电子拷贝于2020年2月13日创建，并且磁盘大小是85千字节。
背景技术
基于抗体的疗法已被证明是对于包括癌症的若干疾病有效的治疗，但在一些情况下，归因于广泛靶标表达的毒性已限制了它们的治疗有效性。此外，基于抗体的治疗剂已展现其他限制，诸如在施用之后从循环快速清除。
已开发用以提供包括抗体药物缀合物的治疗性抗体的前药的策略。此类抗体前药以相对非活性(或显著较小活性)形式施用，此可增加亲本抗体的治疗指数。一旦施用，前药抗体即在体内代谢成活性化合物。此类前药策略可提供药物对它的预定靶标的选择性的增加以及不利影响的降低。一些抗体前药可靶向免疫检查点家族的成员。一些抗体前药可靶向在癌细胞中高度表达的分子。一些抗体前药可缀合于细胞毒性化合物，因此产生抗体药物缀合物的前药形式。
因此，在本领域中仍旧需要基于抗体的治疗性抗体和抗体药物缀合物的具有增加的治疗指数的前药。
发明内容
在本发明的一个方面，本文提供了一种治疗受试者中的癌症，缓和所述癌症的症状，或延迟所述癌症的进展的方法，所述方法包括(a)向所述受试者施用经缀合可活化抗CD166抗体，以及(b)向所述受试者施用可活化免疫检查点抑制剂，其中所述经缀合可活化抗CD166抗体包含(i)可活化抗CD166抗体，所述可活化抗CD166抗体包含特异性结合哺乳动物CD166的抗体或其抗原结合片段(AB1)、当所述可活化抗CD166抗体处于未裂解状态时抑制所述AB1与所述哺乳动物CD166的结合的掩蔽部分(MM1)、以及偶联于所述AB1的可裂解部分(CM1)，其中所述CM1是充当蛋白酶的底物的多肽，和(ii)缀合于所述可活化抗CD166抗体的毒素或其毒性片段。在一些实施方案中，免疫检查点选自由以下组成的组：A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4、BTLA(CD272)、CSF-1R、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TDO、TIGIT、TIM-3、SIGLEC7(CD328)和VISTA。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是特异性结合免疫检查点的抗体。在一些实施方案中，可活化免疫检查点抑制剂是可活化抗免疫检查点抗体，所述可活化抗免疫检查点抗体包含特异性结合免疫检查点的抗体或其抗原结合片段(AB2)、当所述可活化抗免疫检查点抗体处于未裂解状态时抑制所述AB2与所述免疫检查点的结合的掩蔽部分(MM2)、以及偶联于所述AB2的可裂解部分(CM2)，其中所述CM2是充当蛋白酶的底物的多肽。在一些实施方案中，AB1和/或AB2的其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，MM1连接于CM1，以致处于未裂解状态的可活化抗体包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM1-CM1-AB1或AB1-CM1-MM1。在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于未裂解状态的可活化抗体具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM1-LP1-CM1-LP2-AB1或AB1-LP2-CM1-LP1-MM1。在一些实施方案中，剂是毒素或其毒性片段。在一些实施方案中，剂是微管抑制剂或核酸损害剂。在一些实施方案中，剂选自由以下组成的组：多拉司他汀(dolastatin)或其衍生物、澳瑞他汀(auristatin)或其衍生物、类美登素(maytansinoid)或其衍生物、倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物、卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物、吡咯并苯并二氮
Figure BDA0003297387640000031
(pyrrolobenzodiazepine)或其衍生物、以及长春花生物碱(vinca alkaloid)或其衍生物。在一些实施方案中，剂是澳瑞他汀E、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、倍癌霉素、选自由DM1和DM4组成的组的类美登素、或选自由以下组成的组的长春花生物碱：长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春胺醇(vincaminol)、长春内日定(vineridine)、长春布宁(vinburnine)、长春西汀(vinpocetine)、长春胺(vincamine)、阿朴长春胺(apovincamine)、小长春蔓辛(minovincine)、甲氧基小长春蔓辛(methoxyminovincine)、小长春蔓辛宁(minovincinine)、长春蔓佛明(vincadifformine)、脱氧长春胺醇(desoxyvincaminol)和长春蔓晶(vincamajine)。在一些实施方案中，剂通过接头缀合于AB1，所述接头可为可裂解的或非可裂解的。在一些实施方案中，剂缀合于AB1所采用的接头包含SPDB部分、缬氨酸-瓜氨酸部分、或PEG2-vc部分。
在一些实施方案中，在施用可活化免疫检查点抑制剂之前、之后，或与施用可活化免疫检查点抑制剂并行施用经缀合可活化抗CD166抗体。在一些实施方案中，与施用可活化免疫检查点抑制剂并行施用经缀合可活化抗CD166抗体，其中并行施用采用单一组合物或单独组合物。在一些实施方案中，在施用可活化免疫检查点抑制剂之前约1天施用经缀合可活化抗CD166抗体。在一些实施方案中，经缀合可活化抗CD166抗体的施用和可活化免疫检查点抑制剂的施用作为同一给药时程的一部分施用。在一些实施方案中，将经缀合可活化抗CD166抗体和/或可活化免疫检查点抑制剂以静脉内、腹膜内或肿瘤内方式施用至受试者。在一些实施方案中，通过输注疗法将经缀合可活化抗CD166抗体和/或可活化免疫检查点抑制剂施用至受试者。在一些实施方案中，将经缀合可活化抗CD166抗体施用至受试者包括诱导受试者的靶标组织中的免疫原性细胞死亡。在一些实施方案中，将经缀合可活化抗CD166抗体施用至受试者包括诱导受试者中的树突细胞成熟和/或活化。在一些实施方案中，通过输注疗法将经缀合可活化抗CD166抗体和/或可活化免疫检查点抑制剂施用至受试者。在一些实施方案中，将经缀合可活化抗CD166抗体和/或可活化免疫检查点抑制剂以亚治疗剂量施用。在一些实施方案中，将经缀合可活化抗CD166抗体和/或可活化免疫检查点抑制剂以治疗有效剂量施用。在一些实施方案中，经治疗受试者在肿瘤再激发测定中展现记忆T细胞应答。在一些实施方案中，来自经治疗受试者的CD8+T细胞在肿瘤再激发测定中展现产生IFN-γ。在一些实施方案中，来自经治疗受试者的CD4+T细胞展现产生IFN-γ、IL-2和/或TNF-α；在一些实施方案中，CD4+T细胞来自受试者的肿瘤。在一些实施方案中，免疫检查点是哺乳动物、人和/或食蟹猴PD-1。在一些实施方案中，可活化免疫检查点抑制剂是可活化抗哺乳动物PD-1抗体，所述可活化抗哺乳动物PD-1抗体包含特异性结合哺乳动物PD-1的抗体或其抗原结合片段(AB2)、当所述可活化抗哺乳动物PD-1抗体处于未裂解状态时抑制所述AB2与所述哺乳动物PD-1的结合的掩蔽部分(MM2)、以及偶联于所述AB2的可裂解部分(CM2)，其中所述CM2是充当蛋白酶的底物的多肽。在一些实施方案中，免疫检查点是哺乳动物、人和/或食蟹猴PD-L1。在一些实施方案中，可活化免疫检查点抑制剂是可活化抗哺乳动物PD-L1抗体，所述可活化抗哺乳动物PD-L1抗体包含特异性结合哺乳动物PD-L1的抗体或其抗原结合片段(AB2)、当所述可活化抗哺乳动物PD-1抗体处于未裂解状态时抑制所述AB2与所述哺乳动物PD-L1的结合的掩蔽部分(MM2)、以及偶联于所述AB2的可裂解部分(CM2)，其中所述CM2是充当蛋白酶的底物的多肽。在一些实施方案中，MM2连接于CM2，以致处于未裂解状态的可活化抗体包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM2-CM2-AB2或AB2-CM2-MM2。在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP3)和第二连接肽(LP4)，并且其中处于未裂解状态的可活化抗体具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM2-LP3-CM2-LP4-AB2或AB2-LP3-CM2-LP4-MM2。
附图说明
图1A、图1B和图1C描绘各种人免疫细胞中的CD166表达水平的研究的示例性结果。这些结果显示CD166在血液髓系树突细胞(mDC)和浆细胞样树突细胞(pDC)以及单核细胞和B细胞中高度表达，并且可在刺激CD4+T细胞之后得到诱导。
图2A、图2B和图2C描绘表达人CD166的转基因CT26小鼠细胞系的研究的示例性结果。
图3A至图3D描绘抗CD166经缀合可活化抗体和抗PD-1可活化抗体的组合在同种同基因小鼠模型中的体内功效的示例性结果。
图4A、图4B和图4C描绘小鼠的再激发测定的示例性结果，其显示在再激发测定期间受保护的小鼠已建立由组合治疗所致的免疫记忆应答。
图5A至图5G描绘显示消减携带肿瘤的小鼠的CD8+T细胞导致呈单药疗法形式或与可活化抗PD-1抗体组合的可活化抗CD166抗体药物缀合物的抗肿瘤体内功效较低的示例性结果。
图6描绘在这些示例性研究中小鼠中的CD8+T细胞消减的程度。
图7A和图7B描绘各种测试物品对成熟树突细胞和活化的T细胞的细胞毒性的示例性结果。
图8A和图8B描绘抗CD166抗体药物缀合物促进树突细胞成熟和T细胞共刺激的作用的示例性结果。
图9A、图9B和图9C描绘显示游离DM4和抗CD166 ADC可增加癌细胞和CD166表达性细胞中与免疫原性细胞死亡相关的信号的示例性结果。
具体实施方式
本发明提供了特异性结合CD166的可活化单克隆抗体，所述CD166也被称为活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM)。在一些实施方案中，可活化单克隆抗体由含有CD166的细胞内化。CD166是一种结合CD6的细胞粘附分子，所述CD6是一种属于清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)蛋白质超家族(SRCRSF)的细胞表面受体。已知的是CD166与细胞-细胞和细胞-基质相互作用、细胞粘附、细胞迁移、以及T细胞活化和增殖相关联。CD166和CD166相关信号传导的异常表达和/或活性已牵涉于许多疾病和病症诸如癌症、炎症和自体免疫性的发病机理中。举例来说，CD166在多种癌症类型中高度表达，所述多种癌症类型诸如像前列腺癌、乳腺癌、肺癌诸如NSCLC和/或SCLC、口咽癌、子宫颈癌、以及头颈部癌诸如HNSCC。
本公开提供了可用于治疗、预防与异常CD166表达和/或活性相关的疾病或病症，延迟所述疾病或病症的进展，改善和/或缓和所述疾病或病症的症状的方法中的可活化抗CD166抗体。举例来说，可活化抗CD166抗体用于治疗、预防癌症或其他赘生性疾患，延迟癌症或其他赘生性疾患的进展，改善和/或缓和癌症或其他赘生性疾患的症状的方法中。
本公开提供了可用于治疗、预防与表达CD166的细胞相关的疾病或病症，延迟所述疾病或病症的进展，改善和/或缓和所述疾病或病症的症状的方法中的可活化抗CD166抗体。在一些实施方案中，细胞与异常CD166表达和/或活性相关。在一些实施方案中，细胞与正常CD166表达和/或活性相关。举例来说，可活化抗CD166抗体用于治疗、预防癌症或其他赘生性疾患，延迟癌症或其他赘生性疾患的进展，改善和/或缓和癌症或其他赘生性疾患的症状的方法中。
本公开提供了可用于治疗、预防其中患病细胞表达CD166的疾病或病症，延迟所述疾病或病症的进展，改善和/或缓和所述疾病或病症的症状的方法中的可活化抗CD166抗体。在一些实施方案中，患病细胞与异常CD166表达和/或活性相关。在一些实施方案中，患病细胞与正常CD166表达和/或活性相关。举例来说，可活化抗CD166抗体用于治疗、预防癌症或其他赘生性疾患，延迟癌症或其他赘生性疾患的进展，改善和/或缓和癌症或其他赘生性疾患的症状的方法中。
可活化抗CD166抗体包括偶联于掩蔽部分(MM)的特异性结合CD166的抗体或其抗原结合片段，以致所述MM的偶联降低所述抗体或其抗原结合片段结合CD166的能力。MM通过包括蛋白酶的底物(可裂解部分，CM)的序列偶联于抗体/抗原结合片段，所述蛋白酶例如是与CD166共定位在受试者中的治疗部位处的蛋白酶。
定义
除非另外定义，否则与本公开关联使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。术语“一个(种)(a/an)实体”是指一个(种)或多个(种)所述实体。举例来说，一个(种)化合物是指一个(种)或多个(种)化合物。因此，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”可互换使用。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语将包括复数，并且复数术语将包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交关联利用的命名法以及本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交的技术是本领域中熟知以及通常使用的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)。根据制造商说明书或如本领域中通常所达成或如本文所述来进行酶促反应和纯化技术。通常根据本领域中熟知以及如本说明书整篇引用和讨论的各种一般性和更特定参考文献中所述的常规方法进行前述技术和程序。参见例如Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联利用的命名法以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知以及通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及受试者治疗。
如根据本公开所用，除非另外指示，否则以下术语应被理解为具有以下含义：
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性例如抗原结合部分，即含有特异性结合抗原(与抗原进行免疫反应)的抗原结合位点的分子。就“特异性结合”或“与……进行免疫反应”或“免疫特异性结合”来说，其意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应，并且不与其他多肽反应或在低得多的亲和力(Kd>10-6)下结合。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、结构域抗体、单链、Fab、以及F(ab’)2片段、scFv、和Fab表达文库。
已知的是基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同多肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分包括具有约100至110个或更多个氨基酸，主要负责抗原识别的可变区。每个链的羧基末端部分界定主要负责效应子功能的恒定区。一般来说，从人获得的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任一者，所述类别彼此不同之处在于存在于分子中的重链的性质。某些类别还具有子类，诸如IgG1、IgG2以及其他子类。此外，在人中，轻链可为κ链或λ链。
如本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”是指仅含有由独特轻链基因产物和独特重链基因产物组成的一个分子种类的抗体分子的抗体分子群体。具体地说，在群体的所有分子中，单克隆抗体的互补决定区(CDR)都是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位进行免疫反应的抗原结合位点，所述特定表位的特征在于对所述抗原结合位点具有独特结合亲和力。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子的参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度相异的链段，被称为“高变区”，插入在被称为“框架区”或“FR”的更保守侧接链段之间。因此，术语“FR”是指免疫球蛋白中天然地见于高变区之间，并且邻近于高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区相对于彼此在三维空间中安置以形成抗原结合表面。抗原结合表面互补于结合的抗原的三维表面，并且重链和轻链中的每一者的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。对每个结构域的氨基酸指定根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))，或Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等人Nature 342:878-883(1989)的定义。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面集团组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。举例来说，抗体可针对多肽的N末端或C末端肽而产生。当解离常数≤1μM；在一些实施方案中≤100nM，并且在一些实施方案中≤10nM时，抗体被称为特异性结合抗原。
如本文所用，术语“特异性结合”、“免疫结合”和“免疫结合性质”是指在免疫球蛋白分子与免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生的非共价相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的解离常数(Kd)表示，其中较小Kd代表较大亲和力。可使用本领域中熟知的方法定量所选多肽的免疫结合性质。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力、以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可通过计算浓度以及缔合和解离的实际速率来确定“缔合速率常数”(K缔合)与“解离速率常数”(K解离)两者。(参见Nature 361:186-87(1993))。K解离/K缔合的比率使得能够约消与亲和力不相关的所有参数，并且等于解离常数Kd。(一般地参见Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。如通过测定诸如放射性配体结合测定或为本领域技术人员所知的类似测定所测量，当结合常数(Kd)≤1μM，在一些实施方案中≤100nM，在一些实施方案中≤10nM，并且在一些实施方案中≤100pM至约1pM时，本公开的抗体被称为特异性结合靶标。
如本文所用的术语“经分离多核苷酸”将意指基因组、cDNA或合成来源或它们的某一组合的多核苷酸，就它的来源而言，“经分离多核苷酸”(1)不伴有“经分离多核苷酸”在自然界中见于其中的多核苷酸的全部或一部分，(2)可操作地连接于它在自然界中不连接于的多核苷酸，或(3)不作为较大序列的一部分存在于自然界中。本公开的多核苷酸包括编码本文所示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子，以及编码本文所示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文提及的术语“经分离蛋白质”意指cDNA、重组RNA或合成来源或它们的某一组合的蛋白质，就它的来源或获得来源而言，“经分离蛋白质”(1)不伴有见于自然界中的蛋白质，(2)不含来自相同来源的其他蛋白质，例如不含鼠蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中。
术语“多肽”在本文中作为通用术语用于指代具有多肽序列的天然蛋白质、片段或类似物。因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属的种类。本公开的多肽包含本文所示的重链免疫球蛋白分子和本文所示的轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子诸如κ轻链免疫球蛋白分子，并且反之亦然，的组合形成的抗体分子，以及它们的片段和类似物。
如应用于某一对象的如本文所用的术语“天然存在”是指对象可见于自然界中的事实。举例来说，可从自然界中的来源分离，并且尚未由人在实验室中或以其他方式进行故意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指如此描述的组分的位置处于容许它们以它们的预定方式起作用的关系。以在可与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接“可操作地连接”于编码序列的控制序列。
如本文所用的术语“控制序列”是指为影响它们所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质视宿主生物体而不同，在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意图至少包括其存在为表达和加工所必需的所有组分，并且还可包括其存在是有利的额外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。如本文提及的术语“多核苷酸”意指在长度方面是至少10个碱基的核苷酸，是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的经修饰形式。所述术语包括单链和双链形式的DNA。
本文提及的术语寡核苷酸包括由天然存在的和非天然存在的寡核苷酸键联连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包含200个碱基或更少个碱基的长度的多核苷酸子组。在一些实施方案中，寡核苷酸在长度方面是10至60个碱基，并且在一些实施方案中，在长度方面是12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40个碱基。寡核苷酸通常是单链的，例如对于探针来说，但寡核苷酸可为双链的，例如对于在基因突变体的构建中使用来说。本公开的寡核苷酸是有义或反义寡核苷酸。
本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“经修饰核苷酸”包括具有经修饰或经取代糖基团等的核苷酸。本文提及的术语“寡核苷酸键联”包括诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等的寡核苷酸键联。参见例如LaPlanche等人Nucl.Acids Res.14:9081(1986)；Stec等人J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984)，Stein等人Nucl.Acids Res.16:3209(1988)，Zon等人Anti Cancer Drug Design 6:539(1991)；Zon等人Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,第87-108页(F.Eckstein编,Oxford University Press,Oxford England(1991))；Stec等人美国专利第5,151,510号；Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)。如果需要，那么寡核苷酸可包括检测标记。
如本文所用，二十种常规氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Green编,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如α-,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常规氨基酸也可为本公开的多肽的适合组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸以及其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽记法中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向而右手方向是羧基末端方向。
类似地，除非另外指定，否则单链多核苷酸序列的左手端是5'末端，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'方向。5’至3’添加新生RNA转录物的方向被称为转录方向，在与RNA具有相同序列的DNA链上，并且在RNA转录物的5’末端的5’的序列区域被称为“上游序列”，在与RNA具有相同序列的DNA链上，并且在RNA转录物的3’末端的3’的序列区域被称为“下游序列”。
如对多肽所应用，术语“大致上同一性”意指两个肽序列在诸如通过程序GAP或BESTFIT，使用缺省空位权重加以最优比对时，共有至少80％序列同一性，在一些实施方案中至少90％序列同一性，在一些实施方案中至少95％序列同一性，并且在一些实施方案中至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，不相同的残基位置的差异在于保守性氨基酸取代。
如本文所讨论，考虑抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的较小变化由本公开涵盖，前提是氨基酸序列的变化维持至少75％，在一些实施方案中至少80％、90％、95％，并且在一些实施方案中99％。特别地，考虑保守性氨基酸替换。保守性替换是于在它们的侧链方面相关的氨基酸的家族内发生的那些替换。遗传编码的氨基酸通常分成以下家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，并且(4)不带电荷极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他氨基酸家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其是脂族-羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其是含酰胺家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其是脂族家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其是芳族家族。举例来说，合理的是预期用异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸，用谷氨酸对天冬氨酸，用丝氨酸对苏氨酸的孤立替换，或用结构相关氨基酸对氨基酸的类似替换对所得分子的结合或性质将不具有重大影响，尤其是如果替换不涉及框架位点内的氨基酸。通过测定多肽衍生物的特定活性，可易于确定氨基酸变化是否产生功能性肽。本文详细描述了测定。本领域普通技术人员可易于制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的适合氨基和羧基末端存在于功能性结构域的边界附近。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构性和功能性结构域。在一些实施方案中，计算机化比较方法用于鉴定存在于结构和/或功能已知的其他蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。用以鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253:164(1991)。因此，前述实例说明本领域技术人员可辨认可用于确定本公开的结构性和功能性结构域的序列基序和结构构象。
适合氨基酸取代是此类类似物的(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，以及(5)赋予或改进其他物理化学或功能性质的那些氨基酸取代。类似物可包括具有除天然存在的肽序列以外的序列的各种突变蛋白。举例来说，可在天然存在的序列中(例如在多肽的在一个或多个形成分子间接触的结构域的外部的部分中)进行单一或多个氨基酸取代(例如保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代不应实质上改变亲本序列的结构特征(例如替换氨基酸不应倾向于破坏存在于亲本序列中的螺旋或破坏是亲本序列的特征的其他类型的二级结构)。本领域公知的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures andMolecular Principles(Creighton编,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编,Garland Publishing,NewYork,N.Y.(1991))；以及Thornton等人Nature 354:105(1991)中。
如本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或一个或多个内部缺失，但其中剩余氨基酸序列与例如从全长cDNA序列推导的天然存在的序列中的相应位置相同的多肽。片段通常是至少5、6、8或10个氨基酸长的，在一些实施方案中至少14个氨基酸长的，在一些实施方案中至少20个氨基酸长的，通常是至少50个氨基酸长的，并且在一些实施方案中至少70个氨基酸长的。如本文所用的术语“类似物”是指包含至少25个氨基酸的区段的多肽，所述区段与推导氨基酸序列的一部分具有大致上同一性，并且在适合结合条件下与靶标具有特异性结合。通常，相对于天然存在的序列，多肽类似物包含保守性氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物通常是至少20个氨基酸长的，在一些实施方案中至少50个氨基酸长的或更长的，并且可经常长达全长的天然存在多肽。
术语“剂”在本文中用于表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、或由生物材料制得的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“经标记”是指例如通过并入经放射性标记氨基酸或使生物素基部分附接于多肽来并入可检测标记物，所述生物素基部分可通过标记化亲和素(例如含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)检测。在某些情况下，标记或标记物还可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域中是已知的，并且可加以使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由二级报告体识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记由各种长度的间隔臂附接以降低潜在空间位阻。如本文所用的术语“药剂或药物”是指当适当地施用至受试者时能够诱导所需治疗作用的化学化合物或组合物。
本文其他化学术语根据本领域中的常规用法使用，如由The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker,S.编,McGraw-Hill,San Francisco(1985))所例示。
如本文所用，“大致上纯净”意指目标种类是存在的主要种类(即基于摩尔数，相比于组合物中的任何其他单个种类，它是更加丰富的)，并且在一些实施方案中，大致上纯化级分是其中目标种类占存在的所有大分子种类的至少约50％(基于摩尔数)的组合物。
通常，大致上纯净组合物将包含存在于组合物中的所有大分子种类的超过约80％，在一些实施方案中超过约85％、90％、95％和99％。在一些实施方案中，目标种类被纯化至基本同质(即通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语受试者包括人受试者与兽医学受试者两者。
可活化抗体(AA)
本公开提供了包括特异性结合哺乳动物靶标的抗体或其抗原结合片段的AA。在一些实施方案中，靶标是哺乳动物CD166(ALCAM)。在一些实施方案中，靶标是哺乳动物PD-1。在一些实施方案中，靶标是哺乳动物PD-L1。
在一些实施方案中，哺乳动物靶标选自由人靶标和食蟹猴靶标组成的组。在一些实施方案中，AB以小于1nM的解离常数特异性结合人靶标或食蟹猴靶标。在一些实施方案中，哺乳动物靶标是人靶标。在一些实施方案中，哺乳动物靶标是食蟹猴靶标。在一些实施方案中，AB具有以下特征中的一者或多者：(a)AB特异性结合人靶标；和(b)AB特异性结合人靶标和食蟹猴靶标。
在一些实施方案中，AB具有以下特征中的一者或多者：(a)AB特异性结合人CD166和食蟹猴CD166；(b)AB抑制哺乳动物CD6与哺乳动物CD166的结合；(c)AB抑制人CD6与人CD166的结合；和(d)AB抑制食蟹猴CD6与食蟹猴CD166的结合。
在一些实施方案中，AB具有以下特征中的一者或多者：(a)AB特异性结合人PD-1和/或食蟹猴PD-1；(b)AB特异性结合人PD-L1和/或食蟹猴PD-L1；(c)AB抑制哺乳动物PD-L1或PD-L2与哺乳动物PD-1的结合；(d)AB抑制人PD-L1或PD-L2与人PD-1的结合；和(e)AB抑制食蟹猴PD-L1或PD-L2与食蟹猴PD-1的结合。
在一些实施方案中，AB以小于或等于5nM、小于或等于10nM、小于或等于50nM、小于或等于100nM、小于或等于500nM以及/或者小于或等于1000nM的EC50阻断天然配体或受体结合哺乳动物靶标的能力。在一些实施方案中，AB以小于或等于5nM、小于或等于10nM、小于或等于50nM、小于或等于100nM、小于或等于500nM以及/或者小于或等于1000nM的EC50阻断哺乳动物CD6结合哺乳动物CD166的能力。在一些实施方案中，CD166的天然配体或受体是CD6。在一些实施方案中，PD-1的天然配体或受体是PD-L1或PD-L2。
在一些实施方案中，AB以5nM至1000nM、5nM至500nM、5nM至100nM、5nM至50nM、5nM至10nM、10nM至1000nM、10nM至500nM、10nM至100nM、10nM至50nM、50nM至1000nM、50nM至500nM、50nM至100nM、100nM至1000nM、100nM至500nM、150nM至400nM、200nM至300nM、500nM至1000nM的EC50阻断天然配体结合哺乳动物靶标的能力。在一些实施方案中，AB以5nM至1000nM、5nM至500nM、5nM至100nM、5nM至50nM、5nM至10nM、10nM至1000nM、10nM至500nM、10nM至100nM、10nM至50nM、15nM至75nM、30nM至80nM、40nM至150nM、50nM至1000nM、50nM至500nM、50nM至100nM、100nM至1000nM、100nM至500nM、150nM至400nM、200nM至300nM、500nM至1000nM的EC50阻断哺乳动物CD6结合哺乳动物CD166的能力。在一些实施方案中，CD166的天然配体或受体是CD6。在一些实施方案中，PD-1的天然配体或受体是PD-L1或PD-L2。
在一些实施方案中，本公开的AB抑制或降低表达哺乳动物靶标的细胞的生长、增殖和/或转移。在不意图受任何理论束缚的情况下，本公开的AB可通过特异性结合靶标，以及抑制、阻断和/或阻止天然配体或受体与哺乳动物靶标的结合来抑制或降低表达哺乳动物靶标的细胞的生长、增殖和/或转移。
AA的抗体或其抗原结合片段偶联于掩蔽部分(MM)，以致所述MM的偶联降低抗体或其抗原结合片段结合它的靶标的能力。在一些实施方案中，MM通过包括蛋白酶的底物的序列偶联，所述蛋白酶例如是在患病组织中具有活性的蛋白酶和/或与靶标共定位在受试者中的治疗部位处的蛋白酶。本文提供的可活化抗体，在本文中也可互换地称为AA或可活化抗体，在循环中是稳定的，在预定治疗和/或诊断部位处而非在正常例如健康组织或不被靶向用于治疗和/或诊断的其他组织中活化，并且当活化时，展现与靶标的结合，所述结合至少类似于在本文中也被称为亲本抗体的相应未修饰抗体。在一些实施方案中，靶标是CD166、PD-L1或PD-1。
本公开提供了用于AA中的特异性结合它的哺乳动物靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)。在一些实施方案中，抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合CD166的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，此种结合靶标的抗体或其抗原结合片段是小鼠单克隆抗体、其他啮齿动物单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体或完全人单克隆抗体。
因此，本文提供了可活化抗体(AA)，所述可活化抗体包含：(1)特异性结合哺乳动物CD166的抗体或其抗原结合片段(AB)；偶联于所述AB的掩蔽部分(MM)，其中当所述AA处于未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与哺乳动物靶标的结合；以及偶联于所述AB的可裂解部分(CM)，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽。
在一些实施方案中，本公开的AA中的抗体(AB)特异性结合CD166靶标，诸如像哺乳动物CD166和/或人CD166。在一些实施方案中，本公开的AA中的抗体(AB)特异性结合PD-1靶标，诸如像哺乳动物PD-1和/或人PD-1。在一些实施方案中，本公开的AA中的抗体(AB)特异性结合PD-L1靶标，诸如像哺乳动物PD-L1和/或人PD-L1。
在一些实施方案中，关于与哺乳动物靶标的结合，AB具有约100nM或更小的解离常数。在一些实施方案中，关于与哺乳动物靶标的结合，AB具有约10nM或更小的解离常数。在一些实施方案中，关于与靶标的结合，AB具有约5nM或更小的解离常数。在一些实施方案中，关于与靶标的结合，AB具有约1nM或更小的解离常数。在一些实施方案中，关于与靶标的结合，AB具有约0.5nM或更小的解离常数。在一些实施方案中，关于与靶标的结合，AB具有约0.1nM或更小的解离常数。在一些实施方案中，关于与哺乳动物靶标的结合，AB具有0.01nM至100nM、0.01nM至10nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.01至0.5nM、0.01nm至0.1nM、0.01nm至0.05nM、0.05nM至100nM、0.05nM至10nM、0.05nM至5nM、0.05nM至1nM、0.05至0.5nM、0.05nm至0.1nM、0.1nM至100nM、0.1nM至10nM、0.1nM至5nM、0.1nM至1nM、0.1至0.5nM、0.5nM至100nM、0.5nM至10nM、0.5nM至5nM、0.5nM至1nM、1nM至100nM、1nM至10nM、1nM至5nM、5nM至100nM、5nM至10nM、或10nM至100nM的解离常数。在一些实施方案中，靶标是CD166、PD-L1或PD-1。
在一些实施方案中，处于未裂解状态的AA以小于或等于1nM、小于或等于5nM、小于或等于10nM、小于或等于15nM、小于或等于20nM、小于或等于25nM、小于或等于50nM、小于或等于100nM、小于或等于150nM、小于或等于250nM、小于或等于500nM、小于或等于750nM、小于或等于1000nM以及122./或者小于或等于2000nM的解离常数特异性结合哺乳动物靶标。在一些实施方案中，靶标是靶标、PD-L1或PD-1。
在一些实施方案中，处于未裂解状态的AA以大于或等于1nM、大于或等于5nM、大于或等于10nM、大于或等于15nM、大于或等于20nM、大于或等于25nM、大于或等于50nM、大于或等于100nM、大于或等于150nM、大于或等于250nM、大于或等于500nM、大于或等于750nM、大于或等于1000nM以及122./或者大于或等于2000nM的解离常数特异性结合哺乳动物靶标。在一些实施方案中，靶标是靶标、PD-L1或PD-1。
在一些实施方案中，处于未裂解状态的AA以在1nM至2000nM、1nM至1000nM、1nM至750nM、1nM至500nM、1nM至250nM、1nM至150nM、1nM至100nM、1nM至50nM、1nM至25nM、1nM至15nM、1nM至10nM、1nM至5nM、5nM至2000nM、5nM至1000nM、5nM至750nM、5nM至500nM、5nM至250nM、5nM至150nM、5nM至100nM、5nM至50nM、5nM至25nM、5nM至15nM、5nM至10nM、10nM至2000nM、10nM至1000nM、10nM至750nM、10nM至500nM、10nM至250nM、10nM至150nM、10nM至100nM、10nM至50nM、10nM至25nM、10nM至15nM、15nM至2000nM、15nM至1000nM、15nM至750nM、15nM至500nM、15nM至250nM、15nM至150nM、15nM至100nM、15nM至50nM、15nM至25nM、25nM至2000nM、25nM至1000nM、25nM至750nM、25nM至500nM、25nM至250nM、25nM至150nM、25nM至100nM、25nM至50nM、50nM至2000nM、50nM至1000nM、50nM至750nM、50nM至500nM、50nM至250nM、50nM至150nM、50nM至100nM、100nM至2000nM、100nM至1000nM、100nM至750nM、100nM至500nM、100nM至250nM、100nM至150nM、150nM至2000nM、150nM至1000nM、150nM至750nM、150nM至500nM、150nM至250nM、250nM至2000nM、250nM至1000nM、250nM至750nM、250nM至500nM、500nM至2000nM、500nM至1000nM、500nM至750nM、500nM至500nM、500nM至250nM、500nM至150nM、500nM至100nM、500nM至50nM、750nM至2000nM、750nM至1000nM、或1000nM至2000nM的范围内的解离常数特异性结合哺乳动物靶标。在一些实施方案中，靶标是靶标、PD-L1或PD-1。
在一些实施方案中，处于活化状态的AA以小于或等于0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM或10nM的解离常数特异性结合哺乳动物靶标。在一些实施方案中，处于活化状态的AA以大于或等于0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM或10nM的解离常数特异性结合哺乳动物靶标。在一些实施方案中，靶标是靶标、PD-L1或PD-1。
在一些实施方案中，处于活化状态的AA以在0.01nM至100nM、0.01nM至10nM、0.01nM至5nM、0.01nM至1nM、0.01至0.5nM、0.01nm至0.1nM、0.01nm至0.05nM、0.05nM至100nM、0.05nM至10nM、0.05nM至5nM、0.05nM至1nM、0.05至0.5nM、0.05nm至0.1nM、0.1nM至100nM、0.1nM至10nM、0.1nM至5nM、0.1nM至1nM、0.1至0.5nM、0.5nM至100nM、0.5nM至10nM、0.5nM至5nM、0.5nM至1nM、1nM至100nM、1nM至10nM、1nM至5nM、5nM至100nM、5nM至10nM、或10nM至100nM的范围内的解离常数特异性结合哺乳动物靶标。
本发明的示例性可活化抗CD166抗体包括例如包括重链和轻链的可活化抗体(AA)，所述重链和所述轻链包含、是或源于以下显示的重链和轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列、全长氨基酸序列和可变区氨基酸序列：
Figure BDA0003297387640000251
Figure BDA0003297387640000261
Figure BDA0003297387640000262
Figure BDA0003297387640000271
Figure BDA0003297387640000272
Figure BDA0003297387640000273
Figure BDA0003297387640000274
在一些实施方案中，AA的血清半衰期长于相应抗体的血清半衰期；例如AA的pK长于相应抗体的pK。在一些实施方案中，AA的血清半衰期类似于相应抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少15天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少12天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少11天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少10天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少9天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少8天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少7天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少6天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少5天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少4天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少3天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少2天。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少24小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少20小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少18小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少16小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少14小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少12小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少10小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少8小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少6小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少4小时。在一些实施方案中，当施用至生物体时，AA的血清半衰期是至少3小时。
示例性可活化抗体
在示例性实施方案中，本公开的AA包含以下序列中的任何一者或多者：
Figure BDA0003297387640000291
Figure BDA0003297387640000292
Figure BDA0003297387640000293
Figure BDA0003297387640000294
Figure BDA0003297387640000301
Figure BDA0003297387640000302
Figure BDA0003297387640000303
Figure BDA0003297387640000311
Figure BDA0003297387640000312
Figure BDA0003297387640000313
Figure BDA0003297387640000314
Figure BDA0003297387640000315
Figure BDA0003297387640000316
Figure BDA0003297387640000321
Figure BDA0003297387640000322
Figure BDA0003297387640000323
Figure BDA0003297387640000331
Figure BDA0003297387640000332
Figure BDA0003297387640000333
Figure BDA0003297387640000341
Figure BDA0003297387640000342
Figure BDA0003297387640000343
Figure BDA0003297387640000344
Figure BDA0003297387640000351
Figure BDA0003297387640000352
Figure BDA0003297387640000353
Figure BDA0003297387640000354
Figure BDA0003297387640000355
Figure BDA0003297387640000356
Figure BDA0003297387640000361
Figure BDA0003297387640000362
Figure BDA0003297387640000363
Figure BDA0003297387640000364
Figure BDA0003297387640000365
Figure BDA0003297387640000371
Figure BDA0003297387640000372
Figure BDA0003297387640000373
Figure BDA0003297387640000381
Figure BDA0003297387640000382
Figure BDA0003297387640000383
Figure BDA0003297387640000384
Figure BDA0003297387640000391
Figure BDA0003297387640000392
Figure BDA0003297387640000393
Figure BDA0003297387640000401
Figure BDA0003297387640000402
Figure BDA0003297387640000403
Figure BDA0003297387640000404
Figure BDA0003297387640000405
在一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物CD166的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链；(b)偶联于所述AB的掩蔽部分(MM)，其中当所述AA处于未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与所述哺乳动物CD166的结合，其中所述MM包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和(c)偶联于所述AB的可裂解部分(CM)，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽，并且其中所述CM包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物CD166的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链，并且通过spdb接头缀合于DM4(这个示例性经缀合AA在本文中被称为“间隔体-7614.6-3001-HcCD166-SPDB-DM4”，也被称为“组合55”)。接头毒素SPDB-DM4也被称为4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二酰亚胺酯-N2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(maytansine)。
在另一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物CD166的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链，并且进一步通过spdb接头缀合于DM4(这个示例性经缀合AA在本文中被称为“7614.6-3001-HcCD166-SPDB-DM4”，也被称为“组合60”)。
在一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物PD-1的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的轻链；(b)偶联于所述AB的掩蔽部分(MM)，其中当所述AA处于未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与所述哺乳动物PD-1的结合，其中所述MM包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列；和(c)偶联于所述AB的可裂解部分(CM)，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽，并且其中所述CM包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列
在一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物PD-1的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链。在一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物PD-1的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的氨基酸序列的轻链可变区。
在一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物PD-L1的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链；(b)偶联于所述AB的掩蔽部分(MM)，其中当所述AA处于未裂解状态时，所述MM抑制所述AB与所述哺乳动物PD-L1的结合，其中所述MM包含SEQID NO:83的氨基酸序列；和(c)偶联于所述AB的可裂解部分(CM)，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽，并且其中所述CM包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
在一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物PD-L1的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链。在一示例性实施方案中，AA包含：(a)特异性结合哺乳动物PD-L1的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中所述AB包含含有SEQ IDNO:77的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列的轻链可变区。
掩蔽部分(MM)
本文所述的可活化抗体克服了抗体治疗剂特别是已知在体内在至少某一程度上具有毒性的抗体治疗剂的限制。靶标介导的毒性构成开发治疗性抗体的主要限制。本文提供的可活化抗体被设计来解决与由传统治疗性抗体抑制正常组织中的靶标相关的毒性。这些可活化抗体保持掩蔽直至在疾病部位处被蛋白水解活化。以作为亲本治疗性抗体的抗体起始，通过使抗体通过并有蛋白酶底物(CM)的接头偶联于抑制性掩蔽物(掩蔽部分，MM)来工程改造本发明的可活化抗CD166抗体。
因此，本文提供的可活化抗体包括掩蔽部分(MM)。在一些实施方案中，MM是偶联或以其他方式附接于抗体，并且位于可活化抗体构建体内以致MM降低抗体特异性结合它的靶标的能力的氨基酸序列。使用多种已知技术中的任一者鉴定适合掩蔽部分。举例来说，使用由Daugherty等人在PCT公布第WO 2009/025846号中描述的方法鉴定肽掩蔽部分，所述公布的内容据此通过引用以它们的整体并入本文。
在一些实施方案中，当使用靶标置换测定诸如像PCT公布第WO2010/081173号中所述的测定在体外测定时，相较于当CM被裂解时，在靶标存在下，当CM未裂解时，MM使AB结合它的靶标的能力降低至少90％，所述公布的内容据此通过引用以它们的整体并入本文。
在一些实施方案中，MM是在长度方面是约2至40个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，MM是在长度方面多达约40个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，MM多肽序列不同于AB的靶标的序列。在一些实施方案中，MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体至多50％同一。在一些实施方案中，MM多肽序列不同于AB的靶标的序列，并且与AB的任何天然结合配偶体至多40％、30％、25％、20％、15％或10％同一。
在一个示例性实施方案中，本文提供的AA包含MM，其氨基酸序列阐述为：
Figure BDA0003297387640000441
相较于未用MM修饰的AB与靶标的特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合，当用MM修饰AB，并且在靶标存在下时，AB与它的靶标的特异性结合降低或受抑制。
相比于未用MM修饰的AB或亲本AB对靶标的Kd，用MM修饰的AB对靶标的Kd是至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更多倍大的，或在5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、25-50、50-250、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、500-2,500、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、2,500-5,000、5,000-50,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、50,000-5,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之间大的。相反，相比于未用MM修饰的AB或亲本AB对靶标的结合亲和力，用MM修饰的AB对靶标的结合亲和力至少低至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/50,000、1/100,000、1/500,000、1/1,000,000、1/5,000,000、1/10,000,000、1/50,000,000或更低，或低至1/5-1/10、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/10-1/10,000、1/10-1/100,000、1/10-1/1,000,000、1/10-1/10,000,000、1/25-1/50、1/50-1/250、1/100-1/1,000、1/100-1/10,000、1/100-1/100,000、1/100-1/1,000,000、1/100-1/10,000,000、1/500-1/2,500、1/1,000-1/10,000、1/1,000-1/100,000、1/1,000-1/1,000,000、1/1000-1/10,000,000、1/2,500-1/5,000、1/5,000-1/50,000、1/10,000-1/100,000、1/10,000-1/1,000,000、1/10,000-1/10,000,000、1/50,000-1/5,000,000、1/100,000-1/1,000,000、或1/100,000-1/10,000,000之间。
在一些实施方案中，MM偶联于AB使AB结合它的靶标的能力降低，以致相比于AB在未偶联于MM时对它的靶标的Kd，AB在偶联于MM时对它的靶标的解离常数(Kd)是至少两倍大的。
在一些实施方案中，MM偶联于AB使AB结合它的靶标的能力降低，以致相比于AB在未偶联于MM时对它的靶标的Kd，AB在偶联于MM时对它的靶标的解离常数(Kd)是至少五倍大的。
在一些实施方案中，MM偶联于AB使AB结合它的靶标的能力降低，以致相比于AB在未偶联于MM时对它的靶标的Kd，AB在偶联于MM时对它的靶标的解离常数(Kd)是至少10倍大的。
在一些实施方案中，MM偶联于AB使AB结合它的靶标的能力降低，以致相比于AB在未偶联于MM时对它的靶标的Kd，AB在偶联于MM时对它的靶标的解离常数(Kd)是至少20倍大的。
在一些实施方案中，MM偶联于AB使AB结合它的靶标的能力降低，以致相比于AB在未偶联于MM时对它的靶标的Kd，AB在偶联于MM时对它的靶标的解离常数(Kd)是至少40倍大的。
在一些实施方案中，MM偶联于AB使AB结合它的靶标的能力降低，以致相比于AB在未偶联于MM时对它的靶标的Kd，AB在偶联于MM时对它的靶标的解离常数(Kd)是至少100倍大的。
在一些实施方案中，MM偶联于AB使AB结合它的靶标的能力降低，以致相比于AB在未偶联于MM时对它的靶标的Kd，AB在偶联于MM时对它的靶标的解离常数(Kd)是至少1000倍大的。
在一些实施方案中，MM偶联于AB使AB结合它的靶标的能力降低，以致相比于AB在未偶联于MM时对它的靶标的Kd，AB在偶联于MM时对它的靶标的解离常数(Kd)是至少10,000倍大的。
MM对AB的解离常数(Kd)通常大于AB对靶标的Kd。相比于AB对靶标的Kd，MM对AB的Kd可为至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍大的。相反，MM对AB的结合亲和力通常低于AB对靶标的结合亲和力。相比于AB对靶标的结合亲和力，MM对AB的结合亲和力至少低至1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000或甚至1/10,000,000。
在一些实施方案中，MM对AB的解离常数(Kd)近似等于AB对靶标的Kd。在一些实施方案中，MM对AB的解离常数(Kd)不大于AB对靶标的解离常数。
在一些实施方案中，MM对AB的解离常数(Kd)小于AB对靶标的解离常数。
在一些实施方案中，MM对AB的解离常数(Kd)大于AB对靶标的解离常数。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的Kd不大于关于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的Kd小于关于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的Kd近似等于关于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的Kd不小于关于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的Kd大于关于AB与靶标的结合的Kd。
在一些实施方案中，相比于关于AB与靶标的结合的Kd，MM对AB的解离常数(Kd)是至多2、3、4、5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更多倍大的，或在1-5、5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、25-50、50-250、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、25-500、500-2,500、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、2,500-5,000、5,000-50,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、50,000-5,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之间大的。在一些实施方案中，相比于关于AB与靶标的结合的Kd，MM关于与AB的结合所具有的Kd是在1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000、或100-1,000倍之间大的。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的亲和力小于AB与靶标的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的亲和力不大于AB与靶标的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的亲和力近似等于AB与靶标的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的亲和力不小于AB与靶标的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM关于与AB的结合所具有的亲和力大于AB与靶标的结合的亲和力。
在一些实施方案中，相比于AB与靶标的结合的亲和力，MM关于与AB的结合所具有的亲和力小至1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500或1/1,000。在一些实施方案中，相比于AB与靶标的结合的亲和力，MM关于与AB的结合所具有的亲和力小至1/1-1/5、1/2-1/5、1/2-1/10、1/5-1/10、1/5-1/20、1/5-1/25、1/5-1/50、1/5-1/100、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/20-1/100、1/20-1/1000、1/25-1/250、1/50-1/500、或1/100-1/1,000之间。在一些实施方案中，相比于AB与靶标的结合的亲和力，MM关于与AB的结合所具有的亲和力小至1/2至1/20。在一些实施方案中，未共价连接于AB，并且处于与AB等摩尔浓度的MM不抑制AB与靶标的结合。
相较于未用MM修饰的AB与靶标的特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合，当用MM修饰AB，并且在靶标存在下时，AB与它的靶标的特异性结合降低或受抑制。当在体内或在体外测定中测量时，当相较于未用MM修饰的AB与靶标的结合或亲本AB与靶标的结合时，当用MM修饰时，AB结合靶标的能力可降低至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及甚至100％，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更久。
MM抑制AB与靶标的结合。MM结合AB的抗原结合结构域，并且抑制AB与靶标的结合。MM可在空间上抑制AB与靶标的结合。MM可变构抑制AB与它的靶标的结合。在这些实施方案中，当在体内或在体外测定中测量时，相较于未用MM修饰的AB、亲本AB、或未偶联于MM的AB与靶标的结合，当AB通过MM加以修饰或偶联于MM，并且在靶标存在下时，不存在或大致上不存在AB与靶标的结合，或存在至多0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％AB与靶标的结合，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更久。
当AB偶联于MM或通过MM加以修饰时，MM‘掩蔽物’降低或以其他方式抑制AB与靶标的特异性结合。当AB偶联于MM或通过MM加以修饰时，此偶联或修饰可实现降低或抑制AB特异性结合它的靶标的能力的结构变化。
偶联于MM或用MM修饰的AB可由下式(按照从氨基(N)末端区域至羧基(C)末端区域的顺序)表示：
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
其中MM是掩蔽部分，AB是抗体或其抗体片段，并且L是接头。在许多实施方案中，可合乎需要的是将一个或多个接头例如柔性接头插入至组合物中以便提供柔性。
在某些实施方案中，MM不是AB的天然结合配偶体。在一些实施方案中，MM不含有或大致上不含有与AB的任何天然结合配偶体的同源性。在一些实施方案中，MM至多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％类似于AB的任何天然结合配偶体。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体至多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％同一。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体至多25％同一。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体至多50％同一。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体至多20％同一。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体至多10％同一。
可裂解部分(CM)
本文提供的可活化抗体包括可裂解部分(CM)。在一些实施方案中，CM包括是蛋白酶通常是细胞外蛋白酶的底物的氨基酸序列。可使用多种已知技术中的任一者鉴定适合底物。举例来说，使用由Daugherty等人在美国专利第7,666,817号中；由Stagliano等人在美国专利第8,563,269号中；以及由La Porte等人在PCT公布第WO2014/026136号中描述的方法鉴定肽底物，所述美国专利和PCT公布中的每一者的内容据此通过引用以它们的整体并入本文。(还参见Boulware等人“Evolutionary optimization of peptide substratesfor proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics.”Biotechnol Bioeng.106.3(2010):339-46)。
在一些实施方案中，裂解CM的蛋白酶在患病组织中具有活性，例如上调或以其他方式不受调控，并且当AA暴露于蛋白酶时，蛋白酶裂解AA中的CM。在一些实施方案中，蛋白酶与靶标共定位在组织中，并且当AA暴露于蛋白酶时，蛋白酶裂解AA中的CM。图1描绘可活化抗体药物缀合物在肿瘤特异性蛋白酶所存在的肿瘤微环境中优先活化。
在一些实施方案中，AA包括通过MM加以修饰，并且还包括一个或多个可裂解部分(CM)的AB。此类AA展现与AB的靶标的可活化/可转换结合。AA通常包括通过掩蔽部分(MM)和可修饰或可裂解部分(CM)加以修饰或偶联于掩蔽部分(MM)和可修饰或可裂解部分(CM)的抗体或抗体片段(AB)。在一些实施方案中，CM含有充当至少一种蛋白酶的底物的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CM是在长度方面多达15个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，CM是包括是至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的第一可裂解部分(CM1)和是至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物的第二可裂解部分(CM2)的多肽。在一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM1底物序列和CM2底物序列中的每一者独立地是在长度方面多达15个氨基酸的多肽。
在一些实施方案中，CM是CM1-CM2底物，其氨基酸序列阐述为：
Figure BDA0003297387640000521
排列AA的元件以使MM和CM被定位以致在裂解(或相对活性)状态下以及在靶标存在下，AB结合靶标，当AA处于未裂解(或相对非活性)状态，在靶标存在下时，AB与它的靶标的特异性结合降低或受抑制。AB与它的靶标的特异性结合可由于由MM抑制或掩蔽AB特异性结合它的靶标的能力而降低。
相比于未用MM和CM修饰的AB或亲本AB对靶标的Kd，用MM和CM修饰的AB对靶标的Kd是至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更多倍大的，或在5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、25-50、50-250、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、25-500、500-2,500、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、2,500-5,000、5,000-50,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、50,000-5,000,000、100,000-1,000,000、或100,000-10,000,000倍之间大的。相反，相比于未用MM和CM修饰的AB或亲本AB对靶标的结合亲和力，用MM和CM修饰的AB对靶标的结合亲和力至少低至1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/50,000、1/100,000、1/500,000、1/1,000,000、1/5,000,000、1/10,000,000、1/50,000,000或更低，或低至1/5-1/10、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/10-1/10,000、1/10-1/100,000、1/10-1/1,000,000、1/10-1/10,000,000、1/25-1/50、1/50-1/250、1/100-1/1,000、1/100-1/10,000、1/100-1/100,000、1/100-1/1,000,000、1/100-1/10,000,000、1/25-1/500、1/500-1/2,500、1/1,000-1/10,000、1/1,000-1/100,000、1/1,000-1/1,000,000、1/1000-1/10,000,000、1/2,500-1/5,000、1/5,000-1/50,000、1/10,000-1/100,000、1/10,000-1/1,000,000、1/10,000-1/10,000,000、1/50,000-1/5,000,000、1/100,000-1/1,000,000、或1/100,000-1/10,000,000之间。
相较于未用MM和CM修饰的AB或亲本AB与靶标的特异性结合，当用MM和CM修饰AB，并且在靶标存在下，但不存在修饰剂(例如至少一种蛋白酶)时，AB与它的靶标的特异性结合降低或受抑制。当在体内或在体外测定中测量时，当相较于亲本AB与它的靶标的结合或未用MM和CM修饰的AB与它的靶标的结合时，当用MM和CM修饰时，AB结合靶标的能力可降低至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及甚至100％，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更久。
如本文所用，术语“裂解状态”是指在由至少一种蛋白酶修饰CM之后，AA的状况。如本文所用的术语“未裂解状态”是指在不存在由蛋白酶对CM的裂解下，AA的状况。如上所讨论，术语“可活化抗体”在本文中用于指代处于它的未裂解(天然)状态以及处于它的裂解状态的AA。将为普通技术人员显而易知的是，在一些实施方案中，经裂解AA可由于由蛋白酶对CM的裂解而缺乏MM，从而导致释放至少MM(例如当MM未通过共价键(例如半胱氨酸残基之间的二硫键)接合于AA时)。
就可活化或可转换来说，其意指当AA处于抑制、掩蔽或未裂解状态(即第一构象)时，AA展现与靶标的第一结合水平，并且在未抑制、未掩蔽和/或裂解状态(即第二构象)下，AA展现与所述靶标的第二结合水平，其中所述第二靶标结合水平大于所述第一结合水平。一般来说，相比于在不存在能够裂解CM的裂解剂即蛋白酶下，在存在此种裂解剂下，靶标接近AA的AB的机会是更大的。因此，当AA处于未裂解状态时，AB受抑制而免于靶标结合，并且可被掩蔽而免于靶标结合(即第一构象使得AB不能结合靶标)，而在裂解状态下，AB不受抑制或未被掩蔽以进行靶标结合。
选择AA的CM和AB以使AB代表给定靶标的结合部分，并且CM代表蛋白酶的底物。在一些实施方案中，蛋白酶与靶标共定位在受试者中的治疗部位或诊断部位处。如本文所用，共定位是指在相同部位处或相对紧密邻近。在一些实施方案中，蛋白酶裂解CM，从而产生结合位于裂解位点附近的靶标的活化抗体。本文公开的AA特别用于例如相比于非治疗部位的组织中(例如健康组织中)，能够裂解CM中的位点的蛋白酶，即蛋白酶，以相对较高水平存在于治疗部位或诊断部位的含有靶标的组织中的情况。在一些实施方案中，本公开的CM还由一种或多种其他蛋白酶裂解。在一些实施方案中，正是一种或多种其他蛋白酶与靶标共定位，并且负责在体内裂解CM。
在一些实施方案中，AA提供降低的毒性和/或不利副作用，如果AB未被掩蔽或以其他方式受抑制而免于结合靶标，那么所述毒性和/或不利副作用否则可由AB在非治疗部位处的结合产生。
一般来说，可通过以下方式设计AA：选择目标AB以及构建AA的其余部分，以使当构象受约束时，MM提供对AB的掩蔽或AB与它的靶标的结合的降低。可考虑结构设计准则以提供这个功能性特征。
提供了在受抑制构象相对于未抑制构象的情况下，关于靶标结合展现所需动态范围的可转换表型的AA。动态范围通常是指(a)在第一组条件下参数的最大检测水平与(b)在第二组条件下那个参数的最小检测值的比率。举例来说，在可活化抗体的情形下，动态范围是指(a)在至少一种能够裂解AA的CM的蛋白酶存在下，靶标蛋白质与AA的结合的最大检测水平与(b)在不存在蛋白酶下，靶标蛋白质与AA的结合的最小检测水平的比率。AA的动态范围可计算为AA裂解剂(例如酶)处理的解离常数与AA裂解剂处理的解离常数的比率。可活化抗体的动态范围越大，可活化抗体的可转换表型越好。具有相对较高动态范围值(例如大于1)的AA展现更加合乎需要的转换表型，以致相比于在不存在裂解剂下，在能够裂解AA的CM的裂解剂(例如酶)存在下，在更大程度上发生(例如显著地发生)由AA达成的靶标蛋白质结合。
CM由至少一种蛋白酶以约0.001-1500x104M-1S-1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500x104M-1S-1速率特异性裂解。在一些实施方案中，CM以约100,000M-1S-1的速率被特异性裂解。在一些实施方案中，CM以约1x10E2至约1x10E6 M-1S-1(即约1x102至约1x106M-1S-1)的速率被特异性裂解。
对于由酶达成的特异性裂解，在所述酶与CM之间进行接触。当包含偶联于MM和CM的AB的AA处于靶标和足够酶活性存在下时，所述CM可被裂解。足够酶活性可指酶与CM接触，并且实现裂解的能力。可易于设想酶可在CM附近，但由于其他细胞因素或所述酶的蛋白质修饰而不能裂解。
可活化抗体的结构构型
本公开的AA可以多种结构构型提供。以下提供AA的示例性结构式。特别考虑的是，在可活化抗体内，AB、MM并CM的N末端至C末端顺序可逆转。还特别考虑的是，CM和MM在氨基酸序列方面可重叠，例如以致CM含于MM内。
举例来说，AA可由下式(按照从氨基(N)末端区域至羧基(C)末端区域的顺序)表示：
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
其中MM是掩蔽部分，CM是可裂解部分，并且AB是抗体或其片段。应注意尽管MM和CM在上式中被指示为个别组分，但在本文公开的所有示例性实施方案(包括结构式)中，预期MM和CM的氨基酸序列可重叠，例如以致CM完全或部分含于MM内。此外，上式提供可位于AA元件的N末端或C末端的额外氨基酸序列。
在许多实施方案中，可合乎需要的是将一个或多个接头例如柔性接头插入至AA构建体中，以便在MM-CM接合部、CM-AB接合部、或两者处提供柔性。举例来说，AB、MM和/或CM可能不含有用以提供所需柔性的足够数目的残基(例如Gly、Ser、Asp、Asn，尤其是Gly和Ser，特别是Gly)。因此，此类AA构建体的可转换表型可受益于引入一个或多个氨基酸以提供柔性接头。此外，如下所述，当AA以构象受约束构建体形式提供时，可将柔性接头可操作地插入以有助于未裂解可活化抗体中环状结构的形成和维持。
在一些实施方案中，AA包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于未裂解状态的AA具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方案中，两个连接肽无需彼此相同。
在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一者包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:22)和(GGGS)n(SEQ ID NO:23)，其中n是至少是1的整数。
在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一者包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GGSG(SEQ ID NO:24)、GGSGG(SEQ ID NO:25)、GSGSG(SEQ ID NO:26)、GSGGG(SEQ IDNO:27)、GGGSG(SEQ ID NO:28)和GSSSG(SEQ ID NO:29)。
在一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO:30)、GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO:31)、GSSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:32)、GSSGGSGGSGGSGGGS(SEQ IDNO:33)、GSSGGSGGSG(SEQ ID NO:34)或GSSGGSGGSGS(SEQ ID NO:35)。
在一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSS、GGS、GGGS(SEQ ID NO:36)、GSSGT(SEQ ID NO:37)或GSSG(SEQ ID NO:38)。
在一些实施方案中，关于与它的靶标的结合，AB具有约100nM或更小的解离常数。
举例来说，在某些实施方案中，AA包含下式中的一者(其中下式代表在N末端至C末端方向或C末端至N末端方向上的氨基酸序列)：
(MM)-LP1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-LP2-(AB)
(MM)-LP1-(CM)-LP2-(AB)
其中MM、CM和AB如上所定义；其中LP1和LP2各自独立地和任选地存在或不存在，是相同的或不同的包括至少1个柔性氨基酸(例如Gly)的柔性接头。此外，上式提供可位于AA元件的N末端或C末端的额外氨基酸序列。实例包括但不限于靶向部分(例如存在于靶标组织中的细胞的受体的配体)和血清半衰期延长部分(例如结合血清蛋白质的多肽，诸如免疫球蛋白(例如IgG)或血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HAS)))。
在一些实施方案中，AA暴露于蛋白酶，并且由所述蛋白酶裂解，以致在所述蛋白酶已裂解CM之后，在活化或裂解状态下，活化抗体包括包含LP2和/或CM序列的至少一部分的轻链氨基酸序列。
适用于本文所述的组合物中的接头通常是提供经修饰AB或AA的柔性以有助于抑制AB与靶标的结合的接头。此类接头通常被称为柔性接头。适合接头可易于选择，并且可具有任何适合的不同长度，诸如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且在长度方面可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如：(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:22)和(GGGS)n(SEQ ID NO:23，其中n是至少是1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、以及本领域中已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可能够充当组分之间的中性系链。甘氨酸即使相比于丙氨酸也会获取显著更多
Figure BDA0003297387640000591
空间，并且相比于具有较长侧链的残基，受到的限制少得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性柔性接头包括但不限于Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:24)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:25)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:26)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:27)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:28)、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO:29)等。普通技术人员将认识到AA的设计可包括完全或部分柔性的接头，以致接头可包括柔性接头以及一个或多个赋予柔性较小的结构的部分以提供所需AA结构。
在一些实施方案中，AA还包括信号肽。在一些实施方案中，信号肽通过间隔体缀合于AA。在一些实施方案中，间隔体在不存在信号肽下缀合于AA。在一些实施方案中，间隔体直接接合于可活化抗体的MM。在一些实施方案中，间隔体以从N末端至C末端的结构排列间隔体-MM-CM-AB直接接合于AA的MM。直接接合于AA的MM的N末端的间隔体的一实例是QGQSGQ(SEQ ID NO:39)。直接接合于AA的MM的N末端的间隔体的其他实例包括QGQSGQG(SEQ IDNO:14)、QGQSG(SEQ ID NO:40)、QGQS(SEQ ID NO:41)、QGQ、QG和Q。直接接合于AA的MM的N末端的间隔体的其他实例包括GQSGQG(SEQ ID NO:87)、QSGQG(SEQ ID NO:88)、SGQG(SEQ IDNO:117)、GQG和G。在一些实施方案中，无间隔体接合于MM的N末端。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列QGQSGQ(SEQ ID NO:39)。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列QGQSGQG(SEQ ID NO:14)。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列QGQSG(SEQ ID NO:40)。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列QGQS(SEQ ID NO:41)。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列QGQ。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列QG。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸残基Q。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列GQSGQG(SEQ ID NO:42)。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列QSGQG(SEQ ID NO:43)。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列SGQG(SEQ IDNO:44)。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列GQG。在一些实施方案中，间隔体至少包括氨基酸序列G。在一些实施方案中，间隔体是不存在的。
经缀合可活化抗体
本文提供的AA组合物和方法使得能够将一种或多种剂附接于AB中的一个或多个半胱氨酸残基(例如半胱氨酸、赖氨酸)，而不损害可活化抗靶标抗体的活性(例如掩蔽、活化或结合活性)。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种剂附接于AB中的一个或多个半胱氨酸残基，而不还原或以其他方式干扰MM内的一个或多个二硫键。本文提供的组合物和方法产生可活化抗靶标抗体，所述可活化抗靶标抗体缀合于一种或多种剂，例如多种治疗剂、诊断剂和/或防治剂中的任一者，例如在一些实施方案中，一种或多种剂中的任一者都不缀合于所述可活化抗靶标抗体的MM。本文提供的组合物和方法产生经缀合可活化抗靶标抗体，其中MM保留有效和高效掩蔽处于未裂解状态的AA的AB的能力。本文提供的组合物和方法产生经缀合可活化抗靶标抗体，其中在可裂解CM的蛋白酶存在下，AA仍然被活化，即被裂解。
在一些实施方案中，本文所述的AA还包括缀合于可活化抗体的剂。在一些实施方案中，所缀合剂是治疗剂，诸如消炎剂和/或抗赘生剂。在此类实施方案中，剂缀合于可活化抗体的碳水化合物部分，例如在一些实施方案中，其中所述碳水化合物部分位于可活化抗体中的抗体或抗原结合片段的抗原结合区的外部。在一些实施方案中，剂缀合于可活化抗体中的抗体或抗原结合片段的氢硫基。
在一些实施方案中，剂是细胞毒性剂诸如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
在一些实施方案中，剂是可检测部分，诸如像标记或其他标记物。举例来说，剂是或包括经放射性标记氨基酸、一种或多种可通过标记化亲和素(例如含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分、一种或多种放射性同位素或放射性核素、一种或多种荧光标记、一种或多种酶标记、和/或一种或多种化学发光剂。在一些实施方案中，可检测部分由间隔体分子附接。
本公开还涉及包含缀合于细胞毒性剂诸如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)的抗体的免疫缀合物。适合细胞毒性剂包括例如多拉司他汀及其衍生物(例如澳瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE、MMAD、DMAF、DMAE)。举例来说，剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。在一些实施方案中，剂是选自表1中所列的群组的剂。在一些实施方案中，剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，剂是澳瑞他汀或其衍生物。在一些实施方案中，剂是澳瑞他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。在一些实施方案中，剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，剂是倍癌霉素或其衍生物。在一些实施方案中，剂是卡奇霉素或其衍生物。在一些实施方案中，剂是吡咯并苯并二氮
Figure BDA0003297387640000621
在一示例性实施方案中，剂是DM4。
在一些实施方案中，使用顺丁烯二酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头或顺丁烯二酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头使剂连接于AB。在一些实施方案中，使用顺丁烯二酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头使剂连接于AB。在一些实施方案中，使用顺丁烯二酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头使剂连接于AB。在一些实施方案中，剂是使用顺丁烯二酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基氧基羰基接头连接于AB的单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，并且这个接头有效载荷构建体在本文中被称为“vc-MMAD”。在一些实施方案中，剂是使用顺丁烯二酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基氧基羰基接头连接于AB的单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，并且这个接头有效载荷构建体在本文中被称为“vc-MMAE”。在一些实施方案中，使用顺丁烯二酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头使剂连接于AB。在一些实施方案中，剂是使用顺丁烯二酰亚胺双PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基氧基羰基接头连接于AB的单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，并且这个接头有效载荷构建体在本文中被称为“PEG2-vc-MMAD”。以下显示vc-MMAD、vc-MMAE和PEG2-vc-MMAD的结构：
vc-MMAD：
Figure BDA0003297387640000631
vc-MMAE：
Figure BDA0003297387640000641
PEG2-vc-MMAD：
Figure BDA0003297387640000642
在一示例性实施方案中，剂通过赖氨酸缀合于AA。在一示例性实施方案中，SPDB-DM4通过AA上的赖氨酸的ε-氨基例如赖氨酸的ε-氨基附接于可活化抗体。
在一示例性实施方案中，剂是DM4，并且接头-DM如下：
Figure BDA0003297387640000643
本公开还提供了包括连接于单甲基澳瑞他汀D(MMAD)有效载荷的AA的经缀合AA，其中所述AA包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)、抑制处于未裂解状态的所述AA的所述AB与所述靶标的结合的掩蔽部分(MM)、以及偶联于所述AB的可裂解部分(CM)，并且所述CM是充当至少一种MMP蛋白酶的底物的多肽。
在一些实施方案中，可使用用于使剂附接于AB的以下若干方法中的任一者来缀合MMAD缀合的AA：(a)附接于AB的碳水化合物部分，或(b)附接于AB的氢硫基，或(c)附接于AB的氨基，或(d)附接于AB的羧酸酯基团。
在一些实施方案中，MMAD有效载荷通过接头缀合于AB。在一些实施方案中，MMAD有效载荷通过接头缀合于AB中的半胱氨酸。在一些实施方案中，MMAD有效载荷通过接头缀合于AB中的赖氨酸。在一些实施方案中，MMAD有效载荷通过接头缀合于AB的另一残基，诸如本文公开的那些残基。在一些实施方案中，接头是含硫醇接头。在一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，接头是非可裂解接头。在一些实施方案中，接头选自由表6和表7中所示的接头组成的组。在一些实施方案中，AA和MMAD有效载荷通过顺丁烯二酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施方案中，AA和MMAD有效载荷通过顺丁烯二酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施方案中，AA和MMAD有效载荷通过顺丁烯二酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基氧基羰基接头连接。在一些实施方案中，AA和MMAD有效载荷通过顺丁烯二酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基氧基羰基接头连接。在一些实施方案中，使用本文公开的部分还原和缀合技术使MMAD有效载荷缀合于AB。
在一些实施方案中，本公开的接头的聚乙二醇(PEG)组分由2个乙二醇单体、3个乙二醇单体、4个乙二醇单体、5个乙二醇单体、6个乙二醇单体、7个乙二醇单体、8个乙二醇单体、9个乙二醇单体、或至少10个乙二醇单体形成。在本公开的一些实施方案中，PEG组分是分支聚合物。在本公开的一些实施方案中，PEG组分是未分支聚合物。在一些实施方案中，PEG聚合物组分用氨基或其衍生物、羧基或其衍生物、或氨基或其衍生物与羧基或其衍生物两者官能化。
在一些实施方案中，本公开的接头的PEG组分是氨基-四乙二醇-羧基或其衍生物。在一些实施方案中，本公开的接头的PEG组分是氨基-三乙二醇-羧基或其衍生物。在一些实施方案中，本公开的接头的PEG组分是氨基-二乙二醇-羧基或其衍生物。在一些实施方案中，氨基衍生物是在氨基与它所缀合的羧基之间形成酰胺键。在一些实施方案中，羧基衍生物是在羧基与它所缀合的氨基之间形成酰胺键。在一些实施方案中，羧基衍生物是在羧基与它所缀合的羟基之间形成酯键。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉(diphtheria)A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素(exotoxin)A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A链、相思子毒素(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和新月毒素(tricothecene)。多种放射性核素可用于产生放射性缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
使用多种双官能蛋白质偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述偶联剂诸如是3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺基酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮鎓衍生物(诸如双(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。举例来说，可如Vitetta等人,Science238:1098(1987)中所述制备篦麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸缀合于抗体的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。
表1列出可在本文所述的公开内容中采用，但绝不意图是详尽清单的一些示例性药剂。
表1:用于缀合的示例性药剂
Figure BDA0003297387640000671
Figure BDA0003297387640000681
Figure BDA0003297387640000691
Figure BDA0003297387640000701
Figure BDA0003297387640000711
本领域普通技术人员将认识到多种可能的部分可偶联于本公开的所得抗体。(参见例如"Conjugate Vaccines",Contributions to Microbiology and Immunology,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr(编),Carger Press,New York,(1989)，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，AA缀合于一当量或多当量的剂。在一些实施方案中，AA缀合于一当量的剂。在一些实施方案中，AA缀合于二、三、四、五、六、七、八、九、十当量或或大于十当量的剂。在一些实施方案中，AA是具有同质当量数的所缀合剂的AA的混合物的一部分。在一些实施方案中，AA是具有异质当量数的所缀合剂的AA的混合物的一部分。在一些实施方案中，AA的混合物是如此以致缀合于每个AA的剂的平均数目在零至一之间，在一至二之间，在二与三之间，在三与四之间，在四与五之间，在五与六之间，在六与七之间，在七与八之间，在八与九之间，在九与十之间，以及是十以及更大。在一些实施方案中，AA混合物是如此以致缀合于每个AA的剂的平均数目是一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更大。在一些实施方案中，存在AA混合物以致缀合于每个AA的剂的平均数目在三与四之间。在一些实施方案中，存在AA混合物以致缀合于每个AA的剂的平均数目在3.4与3.8之间。在一些实施方案中，存在AA混合物以致缀合于每个AA的剂的平均数目在3.4与3.6之间。在一些实施方案中，AA包含一个或多个位点特异性氨基酸序列修饰，以致相对于可活化抗体的原始氨基酸序列，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的数目增加或降低，因此，在一些实施方案中，相应地增加或降低了可缀合于可活化抗体的剂的数目，或在一些实施方案中，以位点特异性方式限制了剂与AA的缀合。在一些实施方案中，以位点特异性方式用一个或多个非天然氨基酸修饰经修饰AA，因此，在一些实施方案中，使得剂的缀合仅限于非天然氨基酸的位点。
用以产生经缀合可活化抗体的组合物和方法
可活化抗靶标抗体具有至少一个用于剂的缀合点(以产生经缀合AA)。在一些实施方案中，并非所有可能的缀合点都被使用。在一些实施方案中，一些天然接触点被修饰或移除以不再可用于与剂缀合。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是氮原子，诸如赖氨酸的ε氨基。
在一些实施方案中，一个或多个缀合点是二硫键中涉及的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是链间二硫键中涉及的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是链间硫键中涉及的硫原子，而非链内二硫键中涉及的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是半胱氨酸或含有硫原子的其他氨基酸残基的硫原子。此类残基可天然地存在于抗体结构中，或可通过定点诱变、化学转化、或非天然氨基酸的错误并入来并入至抗体中。
还提供了制备具有一个或多个在AB中的链间二硫键和一个或多个在MM中的链内二硫键的可活化抗靶标抗体的缀合物的方法，并且提供了与游离硫醇具有反应性的药物。方法通常包括用还原剂诸如像TCEP部分还原AA中的链间二硫键；以及使与游离硫醇具有反应性的药物缀合于部分还原的可活化抗体。如本文所用，术语部分还原是指其中使可活化抗靶标抗体与还原剂接触，并且少于所有二硫键例如少于所有可能的缀合位点被还原的情形。在一些实施方案中，所有可能的缀合位点中有少于99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或少于5％被还原。
在其他实施方案中，提供了一种还原以及使剂例如药物缀合于可活化抗靶标抗体，从而导致在所述剂的放置方面具有选择性的方法。方法通常包括用还原剂部分还原可活化抗靶标抗体，以致AA的掩蔽部分或其他非AB部分中的任何缀合位点都不被还原，以及使剂缀合于AB中的链间硫醇。选择一个或多个缀合位点以便允许达成剂的所需放置以允许在所需位点处发生缀合。还原剂是例如TCEP。通过鉴定产生其中MM保留有效和高效掩蔽处于未裂解状态的AA的AB的能力的经缀合AA的条件来确定还原反应条件，诸如像还原剂与可活化抗体的比率、孵育时长、在孵育期间的温度、还原反应溶液的pH等。还原剂与可活化抗靶标抗体的比率将视可活化抗体而变化。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗靶标抗体的比率将在约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5、或约1:1至1:1.5的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
在一些实施方案中，提供了一种还原可活化抗靶标抗体的AB中的链间二硫键，以及使剂例如含硫醇剂诸如药物缀合于所得链间硫醇以使一个或多个剂选择性位于AB上的方法。方法通常包括用还原剂部分还原AB以在可活化抗体中形成至少两个链间硫醇，而不形成所有可能的链间硫醇；以及使剂缀合于部分还原的AB的所述链间硫醇。举例来说，在约37℃下在还原剂:可活化抗体的所需比率下部分还原AA的AB约1小时。在一些实施方案中，还原剂与AA的比率将在约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5、或约1:1至1:1.5的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
含硫醇试剂可为例如半胱氨酸或N-乙酰基半胱氨酸。还原剂可为例如TCEP。在一些实施方案中，可在缀合之前使用例如柱色谱法、透析或透滤来纯化经还原AA。或者，在部分还原之后以及在缀合之前不纯化经还原抗体。
本发明还提供了部分还原的可活化抗靶标抗体，其中AA中的至少一个链间二硫键已用还原剂还原，而不干扰可活化抗体中的任何链内二硫键，其中所述AA包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)、抑制处于未裂解状态的所述AA的所述AB与所述靶标的结合的掩蔽部分(MM)、以及偶联于所述AB的可裂解部分(CM)，其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽。在一些实施方案中，MM通过CM偶联于AB。在一些实施方案中，AA的一个或多个链内二硫键未受还原剂干扰。在一些实施方案中，AA内的MM的一个或多个链内二硫键未受还原剂干扰。在一些实施方案中，处于未裂解状态的AA具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方案中，还原剂是TCEP。
本公开还提供了部分还原的AA，其中AA中的至少一个链间二硫键已用还原剂还原，而不干扰可活化抗体中的任何链内二硫键，其中所述AA包括特异性结合靶标例如CD166的抗体或其抗原结合片段(AB)、抑制处于未裂解状态的所述AA的所述AB与所述靶标的结合的掩蔽部分(MM)、以及偶联于所述AB的可裂解部分(CM)，其中所述CM是充当至少一种蛋白酶的底物的多肽。在一些实施方案中，MM通过CM偶联于AB。在一些实施方案中，AA的一个或多个链内二硫键未受还原剂干扰。在一些实施方案中，AA内的MM的一个或多个链内二硫键未受还原剂干扰。在一些实施方案中，处于未裂解状态的AA具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方案中，还原剂是TCEP。
在其他实施方案中，提供了一种还原以及使剂例如药物缀合于可活化抗靶标抗体，从而导致在所述剂的放置方面具有选择性的方法，所述方法通过提供具有确定数目和位置的赖氨酸和/或半胱氨酸残基的可活化抗靶标抗体来达成。在一些实施方案中，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的确定数目高于或低于亲本抗体或可活化抗体的氨基酸序列中相应残基的数目。在一些实施方案中，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的数目确定可导致可缀合于抗靶标抗体或可活化抗靶标抗体的剂的当量数确定。在一些实施方案中，赖氨酸和/或半胱氨酸残基的数目确定可导致可以位点特异性方式缀合于抗靶标抗体或可活化抗靶标抗体的剂的当量数确定。在一些实施方案中，以位点特异性方式用一个或多个非天然氨基酸修饰经修饰A，因此，在一些实施方案中，使得剂的缀合仅限于非天然氨基酸的位点。在一些实施方案中，可用如本文讨论的还原剂部分还原具有确定数目和位置的赖氨酸和/或半胱氨酸残基的抗靶标抗体或可活化抗靶标抗体，以致AA的掩蔽部分或其他非AB部分中的任何缀合位点都不被还原，以及使剂缀合于AB中的链间硫醇。
可通过将使两个分子结合的任何化学反应实现偶联，只要抗体和其他部分保留它们的相应活性即可。这个连接可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。然而，在一些实施方案中，结合是共价结合。可通过现有侧链的直接缩合或通过并入外部桥接分子实现共价结合。许多二价或多价连接剂可用于使蛋白质分子诸如本公开的抗体偶联于其他分子。举例来说，代表性偶联剂可包括有机化合物，诸如硫酯、碳二亚胺、丁二酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。这个清单不意图穷举本领域中已知的各种类别的偶联剂，而是例示更常见的偶联剂。(参见Killen和Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等人,Immunological Reviews 62:185-216(1982)；以及Vitetta等人,Science238:1098(1987)。
在一些实施方案中，除本文提供的组合物和方法之外，还可通过插入或以其他方式包括在AA序列中的经修饰氨基酸序列修饰经缀合AA以达成位点特异性缀合。这些经修饰氨基酸序列被设计来允许控制所缀合剂在经缀合可活化抗体内的放置和/或剂量。举例来说，AA可被工程改造来在轻链和重链上的位置处包括半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代提供反应性硫醇基团，并且不负性影响蛋白质折叠和组装，也不改变抗原结合。在一些实施方案中，AA可被工程改造来在AA内包括或以其他方式引入一个或多个非天然氨基酸残基以提供适合缀合位点。在一些实施方案中，AA可被工程改造来在AA序列内包括或以其他方式引入酶可活化肽序列。
适合接头描述于文献中。(参见例如Ramakrishnan,S.等人,Cancer Res.44:201-208(1984)，其描述MBS(间顺丁烯二酰亚胺苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯)的使用)。还参见美国专利第5,030,719号，其描述经由寡肽接头偶联于抗体的卤化乙酰基酰肼衍生物的使用。在一些实施方案中，适合接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-丁二酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem.Co.,目录号(21558G)；(iii)SPDP(6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸丁二酰亚胺酯(Pierce Chem.Co.,目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(6-[3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰胺基]己酸磺基丁二酰亚胺酯(Pierce Chem.Co.目录号2165-G)；和(v)缀合于EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-丁二酰亚胺：Pierce Chem.Co.,目录号24510)。额外接头包括但不限于SMCC((4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸丁二酰亚胺酯)、磺基-SMCC(4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基丁二酰亚胺酯)、SPDB(4-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-丁二酰亚胺酯)、或磺基-SPDB(4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸N-丁二酰亚胺酯)。
上述接头含有具有不同属性的组分，因此导致缀合物具有不同生理化学性质。举例来说，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基-NHS酯更稳定。相比于磺基-NHS酯，含有NHS酯的接头的可溶性较小。此外，接头SMPT含有空间位阻化二硫键，并且可形成具有增加的稳定性的缀合物。一般来说，相比于其他键联，二硫键的稳定性较小，因为二硫键在体外被裂解，从而导致可用的缀合物较少。磺基-NHS特别可增强碳二亚胺偶联的稳定性。相比于单独碳二亚胺偶联反应，碳二亚胺偶联(诸如EDC)在与磺基-NHS联合使用时形成对水解更加具有抗性的酯。在一示例性实施方案中，接头是SPDB。在另一示例性实施方案中，接头是SPDB，剂是DM4。
在一些实施方案中，接头是可裂解的。在一些实施方案中，接头是非可裂解的。在一些实施方案中，存在两个或更多个接头。两个或更多个接头全都是相同的，即可裂解或非可裂解，或两个或更多个接头是不同的，即至少一个可裂解，并且至少一个非可裂解。
本公开利用用于使剂附接于AB的以下若干方法：(a)附接于AB的碳水化合物部分，或(b)附接于AB的氢硫基，或(c)附接于AB的氨基，或(d)附接于AB的羧酸酯基团。根据本公开，AB可通过具有至少两个反应性基团的中间接头共价附接于剂，一个反应性基团与AB反应，并且一个反应性基团与所述剂反应。可选择可包括任何可相容有机化合物的接头以致与AB(或剂)的反应不会不利地影响AB反应性和选择性。此外，接头与剂的附接可能不破坏剂的活性。用于与氧化抗体或氧化抗体片段的反应的适合接头包括含有选自由以下组成的组的胺的那些：伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和氨基硫脲基团。此类反应性官能团可作为接头的结构的一部分存在，或可通过对不含有此类基团的接头的适合化学修饰引入。
根据本公开，用于附接于经还原AB的适合接头包括具有能够与经还原抗体或片段的氢硫基反应的某些反应性基团的那些。此类反应性基团包括但不限于：反应性卤代烷基(包括例如卤代乙酰基)、对汞苯甲酸酯基团和能够进行迈克尔(Michael)型加成反应的基团(包括例如顺丁烯二酰亚胺和由Mitra和Lawton,1979,J.Amer.Chem.Soc.101:3097-3110所述的类型的基团)。
根据本公开，用于附接于既未氧化也未还原的Ab的适合接头包括具有能够与存在于Ab中的未修饰赖氨酸残基中的伯氨基反应的某些官能团的那些。此类反应性基团包括但不限于NHS羧酸酯或碳酸酯、磺基-NHS羧酸酯或碳酸酯、4-硝基苯基羧酸酯或碳酸酯、五氟苯基羧酸酯或碳酸酯、酰基咪唑、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
根据本公开，用于附接于既未氧化也未还原的Ab的适合接头包括具有能够与存在于Ab中的天冬氨酸或谷氨酸残基中的羧酸基团反应的某些官能团的那些，所述官能团已用适合试剂活化。适合活化性试剂包括具有或不具有添加的NHS或磺基-NHS的EDC，以及用于羧酰胺形成的其他脱水剂。在这些情况下，存在于适合接头中的官能团将包括伯胺和仲胺、肼、羟胺和酰肼。
可在使接头附接于AB之前或之后使剂附接于接头。在某些应用中，可合乎需要的是首先产生AB-接头中间体，其中接头不含相关剂。视特定应用而定，可接着使特定剂共价附接于接头。在一些实施方案中，首先使AB附接于MM、CM和相关接头，接着附接于接头以达成缀合目的。
分支接头：在具体实施方案中，利用具有用于剂的附接的多个位点的分支接头。对于多位点接头，与AB的单一共价附接将产生能够在许多位点处结合剂的AB-接头中间体。位点可为醛或氢硫基基团，或剂可附接的任何化学位点。
在一些实施方案中，可通过在AB上的多个位点处附接单位点接头实现较高比活性(或剂与AB的较高比率)。可通过两种方法中的任一者将这多个位点引入至AB中。第一，可在同一AB中产生多个醛基团和/或氢硫基。第二，可使具有用于后续附接于接头的多个官能位点的“分支接头”附接于AB的醛或氢硫基。分支接头或多位点接头的官能位点可为醛或氢硫基基团，或可为接头可附接的任何化学位点。可通过组合这两种方法，即在AB上的若干位点处附接多位点接头获得还要更高的比活性。
可裂解接头：易经受由补体系统的酶达成的裂解的肽接头可用于本公开的一个实施方案中，所述酶诸如但不限于u-纤溶酶原激活物、组织纤溶酶原激活物、胰蛋白酶、纤溶酶、或具有蛋白水解活性的另一酶。根据本公开的一种方法，通过易经受由补体达成的裂解的接头来附接剂。抗体选自可活化补体的类别。因此，抗体-剂缀合物活化补体级联，并且在靶标部位处释放剂。根据本公开的另一方法，通过易经受由具有蛋白水解活性的酶达成的裂解的接头来附接剂，所述酶诸如是u-纤溶酶原激活物、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶或胰蛋白酶。这些可裂解接头可用于包括细胞外毒素例如非限制性地举例来说表1中所示的任何细胞外毒素的经缀合AA中。
可裂解接头序列的非限制性实例提供在表2中。
表2:用于缀合的示例性接头序列
Figure BDA0003297387640000811
Figure BDA0003297387640000821
此外，剂可通过二硫键(例如半胱氨酸分子上的二硫键)附接于AB。因为许多肿瘤天然地释放高水平的谷胱甘肽(还原剂)，所以这可还原二硫键，随后在递送部位处释放剂。在一些实施方案中，将修饰CM的还原剂还将修饰经缀合可活化抗体的接头。
间隔体和可裂解元件：在一些实施方案中，可必要的是以使剂与可活化抗体的AB之间的间隔最优化的方式构建接头。这可通过使用具有以下一般性结构的接头实现：
W–(CH2)n–Q
其中
W是--NH--CH2--或--CH2--；
Q是氨基酸、肽；并且
n是0至20的整数。
在一些实施方案中，接头可包含间隔元件和可裂解元件。间隔元件用于使可裂解元件远离AB的核心定位，以致导致裂解的酶更可到达可裂解元件。上述分支接头中的某些可充当间隔元件。
在整篇本讨论中，应了解接头与剂(或间隔元件与可裂解元件，或可裂解元件与剂)的附接无需是特定附接或反应模式。提供具有适合稳定性和生物相容性的产物的任何反应都是可接受的。
血清补体以及接头的选择：根据本公开的一种方法，当需要释放剂时，使用是可活化补体的类别的抗体的AB。所得缀合物保留结合抗原的能力与活化补体级联的能力两者。因此，根据本公开的这个实施方案，使剂接合于可裂解接头或可裂解元件的一个末端，并且使接头基团的另一末端附接于AB上的特定位点。举例来说，如果剂具有羟基或氨基，那么可分别通过酯或酰胺键使它附接于肽、氨基酸或其他适合选择的接头的羧基末端。举例来说，可通过碳二亚胺反应使此类剂附接于接头肽。如果剂含有将干扰与接头的附接的官能团，那么可在附接之前封闭这些干扰官能团，并且一旦制得产物缀合物或中间体即加以去封闭。接头的相对或氨基末端接着直接或在进一步修饰之后用于与能够活化补体的AB的结合。
接头(或接头的间隔元件)可具有任何所需长度，其一个末端可共价附接于可活化抗体的AB上的特定位点。接头或间隔元件的另一末端可附接于氨基酸或肽接头。
因此，当这些缀合物在补体存在下结合抗原时，使剂附接于接头的酰胺或酯键将被裂解，从而导致释放呈它的活性形式的剂。当施用至受试者时，这些缀合物将实现在靶标部位处递送和释放剂，并且特别有效用于体内递送如以但不限于表1中的那些呈现的药剂、抗生素、抗代谢物、抗增生剂等。
用于在无补体活化的情况下释放的接头：在靶向递送的另一应用中，需要在无补体活化的情况下释放剂，因为补体级联的活化将最终使靶标细胞溶解。因此，这个方法在剂的递送和释放应在不杀灭靶标细胞的情况下实现时是有用的。当需要将细胞介体诸如激素、酶、皮质类固醇、神经递质、基因或酶递送至靶标细胞时，这就是目标。可通过使剂通过适度经受由血清蛋白酶达成的裂解的接头附接于不能够活化补体的AB来制备这些缀合物。当将这个缀合物施用至个体时，抗原-抗体复合物将快速形成，而剂的裂解将缓慢发生，因此导致在靶标部位处释放化合物。
生物化学交联剂：在一些实施方案中，可使用某些生物化学交联剂使AA缀合于一种或多种治疗剂。交联试剂形成将两个不同分子的官能团栓系在一起的分子桥。为以逐步方式连接两种不同蛋白质，可使用消除非所要均聚物形成的异双官能交联剂。
可由溶酶体蛋白酶裂解的肽基连接体也是有用的，例如Val-Cit、Val-Ala或其他二肽。此外，可使用可在溶酶体的低pH环境中裂解的酸不稳定接头，例如：双唾液酰基醚。其他适合接头包括组织蛋白酶不稳定底物，特别是在酸性pH下显示最优功能的那些。
表3中提供示例性异双官能交联剂作为参考。
表3:示例性异双官能交联剂
Figure BDA0003297387640000851
Figure BDA0003297387640000861
非可裂解接头或直接附接：在本公开的一些实施方案中，可设计缀合物以使剂被递送至靶标，但不释放。这可通过使剂直接或通过非可裂解接头附接于AB来实现。
这些非可裂解接头可包括氨基酸、肽、D-氨基酸或可被修饰来包括可随后用于通过本文所述的方法附接于AB的官能团的其他有机化合物。此种有机接头的通式可为
W–(CH2)n–Q
其中
W是--NH--CH2--或--CH2--；
Q是氨基酸、肽；并且
n是0至20的整数。
非可裂解缀合物：在一些实施方案中，化合物可附接于不活化补体的AB。当使用不能进行补体活化的AB时，可使用易经受由活化的补体达成的裂解的接头或使用不易经受由活化的补体达成的裂解的接头实现这个附接。
本文公开的抗体还可被配制成免疫脂质体。通过本领域中已知的方法，诸如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.NatlAcad.Sci.USA,77:4030(1980)；以及美国专利第4,485,045和4,544,545号中所述的方法制备含有抗体的脂质体。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利第5,013,556号中。
可通过反相蒸发方法，用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。通过具有确定孔尺寸的过滤器挤出脂质体以产生具有所需直径的脂质体。可通过二硫键互换反应使本公开的抗体的Fab’片段缀合于脂质体，如Martin等人,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中所述。
具有非结合空间部分或非结合空间部分的结合配偶体的可活化抗体
本公开还提供了包括非结合空间部分(NB)或非结合空间部分的结合配偶体(BP)的AA，其中所述BP将NB募集或以其他方式吸引至可活化抗体。本文提供的AA包括例如包括非结合空间部分(NB)、可裂解接头(CL)和结合靶标的抗体或抗体片段(AB)的AA；包括非结合空间部分的结合配偶体(BP)、CL和AB的AA；以及包括NB已被募集至其的BP、CL和结合靶标的AB的AA。其中NB共价连接于AA的CL和AB，或通过与共价连接于AA的CL和AB的BP的相互作用来缔合的AA在本文中被称为“含有NB的可活化抗体”。就可活化或可转换来说，其意指当AA处于抑制、掩蔽或未裂解状态(即第一构象)时，AA展现与靶标的第一结合水平，并且当AA处于未抑制、未掩蔽和/或裂解状态(即第二构象，即活化抗体)时，AA展现与所述靶标的第二结合水平，其中所述第二靶标结合水平大于所述第一靶标结合水平。相较于常规抗体治疗剂，AA组合物可展现增加的生物可用度和更有利的生物分布。
在一些实施方案中，AA提供降低的毒性和/或不利副作用，如果AB未被掩蔽或以其他方式受抑制而免于结合非治疗部位和/或非诊断部位，那么所述毒性和/或不利副作用否则可由在此种部位处的结合产生。
可使用PCT公布第WO 2013/192546号中阐述的方法制备包括非结合空间部分(NB)的AA，所述PCT公布的内容据此通过引用以它们的整体并入本文。
可活化抗体的产生
本公开还提供了通过在导致可活化抗靶标抗体多肽的表达的条件下培养细胞来产生所述多肽的方法，其中所述细胞包含编码本文所述的抗体和/或AA的经分离核酸分子，和/或包括这些经分离核酸序列的载体。本公开提供了通过在导致抗体和/或可活化抗体的表达的条件下培养细胞来产生所述抗体和/或AA的方法，其中所述细胞包含编码本文所述的抗体和/或AA的经分离核酸分子，和/或包括这些经分离核酸序列的载体。
本发明还提供了一种通过以下方式来制造在活化状态下结合靶标的AA的方法：(a)在导致所述可活化抗体的表达的条件下培养包含编码所述AA的核酸构建体的细胞，其中所述AA包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)、以及特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)，(i)其中所述CM是充当蛋白酶的底物的多肽；并且(ii)其中所述CM位于所述AA中以致当所述AA处于未裂解状态时，所述MM干扰所述AB与靶标的特异性结合，并且在裂解状态下，所述MM不干扰或竞争所述AB与靶标的特异性结合；以及(b)回收所述可活化抗体。适合AB、MM和/或CM包括本文公开的任何AB、MM和/或CM。
提供以下示例性核苷酸序列以用于制备和使用本文提供的AA和经缀合AA。还提供了与以下提供的核苷酸序列至少90％、95％或甚至99％同源的核苷酸序列。
Figure BDA0003297387640000891
Figure BDA0003297387640000901
Figure BDA0003297387640000911
Figure BDA0003297387640000921
Figure BDA0003297387640000922
Figure BDA0003297387640000931
Figure BDA0003297387640000932
Figure BDA0003297387640000941
Figure BDA0003297387640000942
可活化抗体和经缀合可活化抗体的治疗用途
本公开提供了使用结合靶标的AA，特别是结合和中和或以其他方式抑制靶标和/或靶标介导的信号传导的至少一种生物活性的AA治疗、预防受试者中的与靶标的异常表达和/或活性相关的症状，以及/或者延迟所述症状的发作或进展，或缓和所述症状的方法。
本公开还提供了使用结合靶标的AA，特别是结合、靶向、中和、杀灭或以其他方式抑制正在表达或异常表达靶标的细胞的至少一种生物活性的AA治疗、预防受试者中的与正在表达靶标或异常表达靶标的细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的症状，以及/或者延迟所述症状的发作或进展，或缓和所述症状的方法。
本公开还提供了使用结合靶标的AA，特别是结合、靶向、中和、杀灭或以其他方式抑制正在表达靶标的细胞的至少一种生物活性的AA治疗、预防受试者中的与正在表达靶标的细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的症状，以及/或者延迟所述症状的发作或进展，或缓和所述症状的方法。
本公开还提供了使用结合靶标的AA，特别是结合、靶向、中和、杀灭或以其他方式抑制正在异常表达靶标的细胞的至少一种生物活性的AA治疗、预防受试者中的与正在异常表达靶标的细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的症状，以及/或者延迟所述症状的发作或进展，或缓和所述症状的方法。
本公开还提供了通过以下方式来预防受试者中的癌症，延迟所述癌症的进展，治疗所述癌症，缓和所述癌症的症状，或以其他方式改善所述癌症的方法：将治疗有效量的本文所述的抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至有需要的受试者。
本公开还提供了用于治疗、预防受试者中的与靶标的异常表达和/或活性相关的症状，以及/或者延迟所述症状的发作或进展，或缓和所述症状的结合靶标的AA，特别是结合和中和或以其他方式抑制靶标和/或靶标信号传导的至少一种生物活性的AA。
本公开还提供了用于治疗、预防受试者中的与正在表达或异常表达靶标的细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的症状，以及/或者延迟所述症状的发作或进展，或缓和所述症状的结合靶标的AA，特别是结合、靶向、中和、杀灭或以其他方式抑制正在表达或异常表达靶标的细胞的至少一种生物活性的AA。
本公开还提供了一种用于预防受试者中的癌症，延迟所述癌症的进展，治疗所述癌症，缓和所述癌症的症状，或以其他方式改善所述癌症的本文所述的抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体，其中所述抗体用于以治疗有效量施用。
非限制性地举例来说，本公开的AA可用于治疗、预防上皮或鳞状细胞癌、类癌和/或神经内分泌癌，以及/或者延迟上皮或鳞状细胞癌、类癌和/或神经内分泌癌的发作或进展。癌症的实例包括但不限于腺癌、胆管(胆道)癌(bile duct(biliary)cancer)、膀胱癌、乳腺癌例如三阴性乳腺癌、Her2阴性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌；类癌；子宫颈癌；胆管癌(cholangiocarcinoma)；结肠直肠癌；子宫内膜癌；神经胶质瘤；头颈部癌，例如头颈部鳞状细胞癌；白血病；肝癌；肺癌，例如NSCLC、SCLC；淋巴瘤；黑素瘤；口咽癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌，例如转移性去势抗性前列腺癌；肾癌；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；以及尿路上皮癌。
在一些实施方案中，癌症是任何上皮或鳞状癌。在一些实施方案中，癌症是前列腺癌、乳腺癌、肺癌、子宫颈癌、口咽癌和/或头颈部癌。
在一些实施方案中，癌症是膀胱癌、骨癌、乳腺癌、类癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、上皮癌、神经胶质瘤、头颈部癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿生殖系统癌症和/或尿路上皮癌。
在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌(TNBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、Ras突变结肠直肠癌、罕见上皮癌、口咽癌、子宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和/或前列腺癌。在一些实施方案中，癌症与表达靶标的肿瘤相关。在一些实施方案中，癌症归因于表达靶标的肿瘤。
用于这些方法和用途的任何实施方案中的抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体可在疾病的任何阶段施用。举例来说，可将此种抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至罹患从早期至转移性的任何阶段的癌症的受试者。
在示例性实施方案中，受试者罹患或被怀疑罹患乳腺癌、去势抗性前列腺癌(CPRC)、胆管癌、子宫内膜癌、上皮卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。
在示例性实施方案中，受试者罹患或被怀疑罹患皮肤病变。在一些实施方案中，皮肤病变是皮肤转移瘤。
如本文所提供，待治疗的受试者是哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物、伴侣动物(例如猫、狗、马)、农场动物、役用动物或动物园动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物。在一些实施方案中，受试者是处于兽医的护理下的动物。
在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患乳腺癌的受试者患有雌激素受体表达性(ER+)肿瘤，并且在用本公开的所述AA治疗之前应已接受抗激素疗法，并且已经历疾病进展。在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患乳腺癌的受试者患有三阴性乳腺癌(TNBC)，并且在用本公开的所述AA治疗之前已接受≥2条线的先前疗法。
在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患去势抗性前列腺癌的受试者在用本公开的所述AA治疗之前已接受≥1种先前疗法。
在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患胆管癌的受试者在用本公开的所述AA治疗之前已经历≥1条线的先前含吉西他滨(gemcitabine)方案失败。
在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患子宫内膜癌的受试者在用本公开的所述AA治疗之前已接受≥1种用于子宫外或晚期疾病的含铂方案。
在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患上皮卵巢癌的受试者具有非乳腺癌(BRCA)突变(种系或体细胞)，或具有未知的BRCA突变状况，并且患有铂抗性或铂难治性卵巢癌。在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患上皮卵巢癌的受试者具有BRCA突变，并且为PARP抑制剂所难治，或在其他方面不适宜采用PARP抑制剂。
在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患HNSCC的受试者在用本公开的所述AA治疗之前已接受≥1种含铂方案和PD-1/PD-L1抑制剂(如果被核准用于所述受试者的适应症和地区)。
在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患NSCLC的受试者在用本公开的所述AA治疗之前已接受≥1种含铂方案。在一些实施方案中，接受本公开的AA例如组合55或组合60的罹患或被怀疑罹患NSCLC的受试者在用本公开的所述AA治疗之前已先前施用了检查点抑制剂(如果在他们的地区被核准用于受试者的适应症)。
在一些实施方案中，具有以下情况中的任一者的受试者可能不适宜接受本公开的AA以治疗乳腺癌、去势抗性前列腺癌(CPRC)、胆管癌、子宫内膜癌、上皮卵巢癌、HNSCC和NSCLC：活动性或慢性角膜病症、角膜移植史、活动性疱疹性角膜炎以及需要持续治疗/监测的活动性眼部疾患；严重并发疾病，包括临床相关的活动性感染；活动性自体免疫疾病史或当前活动性自体免疫疾病；重大心脏病诸如新近心肌梗塞；多发性硬化症或其他脱髓鞘疾病的历史、伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambert syndrome)(副肿瘤综合征)、在过去6个月内的出血性或缺血性中风史、或酒精性肝病；难愈性的一个或多个伤口或一个或多个溃疡，除由潜伏赘瘤引起的溃疡性病变之外；对先前单克隆抗体疗法的重度过敏性或过敏反应史；当前正在接受用华法林(warfarin)进行的抗凝疗法；或在给药之前3个月内的大手术(需要全身麻醉)。
将可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及它们的治疗性制剂施用至罹患或易患与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的受试者。使用本领域中已知的多种方法中的任一者鉴定罹患或易患与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的受试者。举例来说，使用用以评估健康状况的多种临床和/或实验室测试诸如体格检查以及血液、尿和/或粪便分析中的任一者鉴定罹患癌症或其他赘生性疾患的受试者。举例来说，使用用以评估健康状况的多种临床和/或实验室测试诸如体格检查和/或体液分析例如血液、尿和/或粪便分析中的任一者鉴定罹患炎症和/或炎症性病症的受试者。
如果实现了多种实验室或临床目标中的任一者，那么将抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至罹患与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的受试者被视为是成功的。举例来说，如果与疾病或病症相关的症状中的一者或多者被缓和、减轻、抑制，或不进展至进一步即更糟状态，那么将抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至罹患与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的受试者被视为是成功的。如果疾病或病症进入缓解期或不进展至进一步即更糟状态，那么将抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至罹患与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的受试者被视为是成功的。
在一些实施方案中，将可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及它们的治疗性制剂施用至罹患或易患疾病或病症的受试者，诸如罹患癌症或其他赘生性疾患的受试者，其中所述受试者的患病细胞正在表达靶标。在一些实施方案中，患病细胞与异常靶标表达和/或活性相关。在一些实施方案中，患病细胞与正常靶标表达和/或活性相关。使用本领域中已知的多种方法中的任一者鉴定罹患或易患疾病或病症的受试者，其中所述受试者的患病细胞表达靶标。举例来说，使用用以评估健康状况的多种临床和/或实验室测试诸如体格检查以及血液、尿和/或粪便分析中的任一者鉴定罹患癌症或其他赘生性疾患的受试者。举例来说，使用用以评估健康状况的多种临床和/或实验室测试诸如体格检查和/或体液分析例如血液、尿和/或粪便分析中的任一者鉴定罹患炎症和/或炎症性病症的受试者。
在一些实施方案中，将可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及它们的治疗性制剂施用至罹患或易患与表达靶标的细胞或此类细胞的存在、生长、增殖、转移和/或活性相关的疾病或病症的受试者，诸如罹患癌症或其他赘生性疾患的受试者。在一些实施方案中，细胞与异常靶标表达和/或活性相关。在一些实施方案中，细胞与正常靶标表达和/或活性相关。使用本领域中已知的多种方法中的任一者鉴定罹患或易患与表达靶标的细胞相关的疾病或病症的受试者。举例来说，使用用以评估健康状况的多种临床和/或实验室测试诸如体格检查以及血液、尿和/或粪便分析中的任一者鉴定罹患癌症或其他赘生性疾患的受试者。举例来说，使用用以评估健康状况的多种临床和/或实验室测试诸如体格检查和/或体液分析例如血液、尿和/或粪便分析中的任一者鉴定罹患炎症和/或炎症性病症的受试者。
如果实现了多种实验室或临床目标中的任一者，那么将抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至罹患与表达靶标的细胞相关的疾病或病症的受试者被视为是成功的。举例来说，如果与疾病或病症相关的症状中的一者或多者被缓和、减轻、抑制，或不进展至进一步即更糟状态，那么将抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至罹患与表达靶标的细胞相关的疾病或病症的受试者被视为是成功的。如果疾病或病症进入缓解期或不进展至进一步即更糟状态，那么将抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至罹患与表达靶标的细胞相关的疾病或病症的受试者被视为是成功的。
在一些实施方案中，在治疗期间和/或之后，将可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体与一种或多种额外剂诸如像化学治疗剂、消炎剂和/或免疫抑制剂组合施用。在一些实施方案中，同时施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及一种或多种额外剂。举例来说，可将可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及一种或多种额外剂配制在单一组合物中，或以两种或更多种单独组合物形式施用。在一些实施方案中，依序施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及一种或多种额外剂。
在一些实施方案中，本文所述的可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体与一种或多种额外剂或额外剂的组合联合使用。适合额外剂包括用于预定应用诸如像癌症的当前药物和/或手术疗法。举例来说，抗靶标抗体、经缀合抗靶标抗体、可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体可与额外化学治疗剂或抗赘生剂联合使用。
在一些实施方案中，一种或多种额外剂是化学治疗剂，诸如选自由以下组成的组的化学治疗剂：多西他赛(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、凯素(abraxane)(即白蛋白缀合的太平洋紫杉醇)、多柔比星(doxorubicin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)和吉西他滨(gemcitabine)。
在一些实施方案中，一种或多种额外剂是检查点抑制剂、激酶抑制剂、靶向肿瘤微环境中的抑制剂的剂、和/或T细胞或NK激动剂。在一些实施方案中，一种或多种额外剂是单独或与另外一种或多种额外剂诸如化学治疗剂或抗赘生剂组合的放射疗法。在一些实施方案中，一种或多种额外剂是疫苗、致癌病毒和/或DC活化剂，诸如非限制性地举例来说，toll样受体(TLR)激动剂和/或α-CD40。在一些实施方案中，一种或多种额外剂是被设计来通过ADCC或通过直接缀合于毒素(例如抗体药物缀合物(ADC))杀灭肿瘤的肿瘤靶向抗体。
在一些实施方案中，检查点抑制剂是选自由以下组成的组的靶标的抑制剂：CTLA-4、LAG-3、PD-1、靶标、TIGIT、TIM-3、B7H4和Vista。在一些实施方案中，激酶抑制剂选自由以下组成的组：B-RAFi、MEKi和Btk抑制剂，诸如依布替尼(ibrutinib)。在一些实施方案中，激酶抑制剂是克唑替尼(crizotinib)。在一些实施方案中，肿瘤微环境抑制剂选自由以下组成的组：IDO抑制剂、α-CSF1R抑制剂、α-CCR4抑制剂、TGF-β、髓源性抑制细胞或T调控性细胞。在一些实施方案中，激动剂选自由以下组成的组；Ox40、GITR、CD137、ICOS、CD27和HVEM。
在一些实施方案中，抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是LAG-3抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是靶标抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是TIGIT抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是B7H4抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是Vista抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是B-RAFi抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是MEKi抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是Btk抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是依布替尼。在一些实施方案中，抑制剂是克唑替尼。在一些实施方案中，抑制剂是IDO抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是α-CSF1R抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是α-CCR4抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是TGF-β。在一些实施方案中，抑制剂是髓源性抑制细胞。在一些实施方案中，抑制剂是T调控性细胞。
在一些实施方案中，激动剂是Ox40。在一些实施方案中，激动剂是GITR。在一些实施方案中，激动剂是CD137。在一些实施方案中，激动剂是ICOS。在一些实施方案中，激动剂是CD27。在一些实施方案中，激动剂是HVEM。
在一些实施方案中，在治疗期间和/或之后，将AA和/或经缀合AA与一种或多种额外剂诸如像化学治疗剂、消炎剂和/或免疫抑制剂组合施用。在一些实施方案中，将可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及额外剂配制成单一治疗性组合物，并且同时施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及额外剂。或者，可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体与额外剂彼此分开，例如将各自配制成单独治疗性组合物，并且同时施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及额外剂，或在治疗方案期间在不同时间施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及额外剂。举例来说，在施用额外剂之前施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体，在施用额外剂之后施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体，或以交替方式施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及额外剂。如本文所述，以单次剂量或以多次剂量施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及额外剂。
在一些实施方案中，同时施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及一种或多种额外剂。举例来说，可将可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及一种或多种额外剂配制在单一组合物中，或以两种或更多种单独组合物形式施用。在一些实施方案中，依序施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及一种或多种额外剂，或在治疗方案期间在不同时间施用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体以及额外剂。
在一些实施方案中，在治疗期间和/或之后将可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体与一种或多种额外剂组合施用，所述一种或多种额外剂诸如非限制性地举例来说是化学治疗剂、消炎剂和/或免疫抑制剂，诸如烷基化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素和/或任何其他核酸损害剂。在一些实施方案中，额外剂是紫杉烷，诸如太平洋紫杉醇(例如
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)。在一些实施方案中，额外剂是抗代谢物，诸如吉西他滨。在一些实施方案中，额外剂是烷基化剂，诸如基于铂的化学疗法，诸如卡铂或顺铂。在一些实施方案中，额外剂是靶向剂，诸如激酶抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)或埃罗替尼(erlotinib)。在一些实施方案中，额外剂是靶向剂，诸如另一抗体，例如单克隆抗体(例如贝伐珠单抗(bevacizumab))、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，额外剂是蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米(bortezomib)或卡非佐米(carfilzomib)。在一些实施方案中，额外剂是免疫调节剂，诸如来那度胺(lenolidominde)或IL-2。在一些实施方案中，额外剂是放射。在一些实施方案中，额外剂是由本领域技术人员视为护理标准的剂。在一些实施方案中，额外剂是为本领域技术人员熟知的化学治疗剂。
在一些实施方案中，额外剂是另一抗体或其抗原结合片段、另一经缀合抗体或其抗原结合片段、另一AA或其抗原结合片段和/或另一经缀合AA或其抗原结合片段。在一些实施方案中，额外剂是与第一抗体或其抗原结合片段、第一经缀合抗体或其抗原结合片段、AA或其抗原结合片段和/或经缀合AA或其抗原结合片段针对相同靶标，例如针对靶标的另一抗体或其抗原结合片段、另一经缀合抗体或其抗原结合片段、另一AA或其抗原结合片段和/或另一经缀合AA或其抗原结合片段。在一些实施方案中，额外剂是针对不同于第一抗体或其抗原结合片段、第一经缀合抗体或其抗原结合片段、AA或其抗原结合片段和/或经缀合AA或其抗原结合片段的靶标的靶标的另一抗体或其抗原结合片段、另一经缀合抗体或其抗原结合片段、另一AA或其抗原结合片段和/或另一经缀合AA或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，额外抗体或其抗原结合片段、经缀合抗体或其抗原结合片段、AA或其抗原结合片段和/或经缀合AA或其抗原结合片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体或单结构域轻链抗体。在一些实施方案中，额外抗体或其抗原结合片段、经缀合抗体或其抗原结合片段、AA或其抗原结合片段和/或经缀合AA或其抗原结合片段是小鼠单克隆抗体、其他啮齿动物单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体或完全人单克隆抗体。
应了解本公开的治疗性实体的施用将与适合载体、赋形剂以及并入至制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的其他剂一起施用。众多适当制剂可见于为所有药物化学家所知的配方手册：Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版,Mack PublishingCompany,Easton,PA(1975))，特别是其中由Blaug,Seymour所著的第87章中。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏剂、胶冻剂、蜡状物、油剂、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)囊泡(诸如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂卡波蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂和含有卡波蜡的半固体混合物。前述混合物中的任一者都可适用于本公开的治疗和疗法中，前提是制剂中的活性成分不因配制而失活，并且制剂关于施用途径是生理上可相容的和可耐受的。对于与为药物化学家所熟知的制剂、赋形剂和载体相关的额外信息，还参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development:theneed for preclinical guidance.”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2):210-8(2000)，WangW.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000)，Charman WN“Lipids,lipophilic drugs,and oraldrug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8):967-78(2000)，Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm SciTechnol.52:238-311(1998)以及它们中的引文。
包括可活化抗靶标抗体诸如非限制性地举例来说AA和/或经缀合AA的本公开的治疗性制剂用于预防、治疗或以其他方式改善与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症。举例来说，包括AA和/或经缀合可活化抗体的本公开的治疗性制剂用于治疗或以其他方式改善癌症或其他赘生性疾患、炎症、炎症性病症和/或自体免疫疾病。在一些实施方案中，癌症是其中表达靶标的实体肿瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是其中表达靶标的实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症是其中表达靶标的血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，靶标在实质(例如在癌症中，器官或组织的经常执行所述器官或组织的一种或多种功能的部分)上表达。在一些实施方案中，靶标在细胞、组织或器官上表达。在一些实施方案中，靶标在基质(即细胞、组织或器官的连接支持框架)上表达。在一些实施方案中，靶标在骨母细胞上表达。在一些实施方案中，靶标在内皮(血管结构)上表达。在一些实施方案中，靶标在癌干细胞上表达。在一些实施方案中，AA所缀合的剂是微管抑制剂。在一些实施方案中，AA所缀合的剂是核酸损害剂。
与用于诊断或治疗与靶标表达和/或活性诸如像异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的任何已知方法联合来确定预防、改善或治疗的有效性。延长受试者的存活期或以其他方式延迟受试者中的与靶标表达和/或活性例如异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的进展指示AA和/或经缀合AA赋予临床益处。
可以药物组合物形式施用AA和/或经缀合AA。制备此类组合物中涉及的原则和考虑事项以及在选择组分方面的指导例如提供在Remington:The Science And Practice OfPharmacy第19版(Alfonso R.Gennaro等人编)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.:1995；DrugAbsorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,HarwoodAcademic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences,第4卷),1991,M.Dekker,New York中。
在其中使用抗体片段的一些实施方案中，选择特异性结合靶标蛋白质的结合结构域的最小片段。举例来说，基于抗体的可变区序列，可设计保留结合靶标蛋白质序列的能力的肽分子。可化学合成以及/或者通过重组DNA技术产生此类肽。(参见例如Marasco等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993))。制剂还可含有超过一种如为所治疗的特定适应症所必需的活性化合物，例如在一些实施方案中是不会不利地彼此影响的具有补充活性的那些。在一些实施方案中，或此外，组合物可包含增强它的功能的剂，诸如像细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。此类分子适合地以有效达成预定目的的量组合存在。
还可将活性成分包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中；胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或粗乳液中。
待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过经无菌过滤膜过滤而易于实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物半渗透性基质，所述基质呈成形物品例如薄膜或微胶囊的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、非可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)组成的可注射微球体)、以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能够持续超过100天释放分子，但某些水凝胶持续较短时期释放蛋白质。
诊断用途
本发明还提供了用于在多种诊断和/或防治适应症中使用可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗CD166抗体的方法和试剂盒。举例来说，本发明提供了用于通过以下方式来检测受试者或样品中裂解剂和目标靶标的存在或不存在的方法和试剂盒：(i)使受试者或样品与抗靶标可活化抗体接触，其中所述抗靶标AA包含掩蔽部分(MM)、由所述裂解剂裂解的可裂解部分(CM)、以及特异性结合所述目标靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中处于未裂解未活化状态的所述抗靶标AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中所述MM是抑制所述AB与靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列，并且不是所述AB的天然结合配偶体的经修饰形式；并且(b)其中当所述AB处于未裂解非活化状态时，所述MM干扰所述AB与靶标的特异性结合，并且当所述AB处于经裂解活化状态时，所述MM不干扰或竞争所述AB与靶标的特异性结合；以及(ii)测量所述受试者或样品中活化抗靶标AA的水平，其中所述受试者或样品中有可检测水平的活化抗靶标AA指示所述裂解剂和所述靶标存在于所述受试者或样品中，并且其中所述受试者或样品中无可检测水平的活化抗靶标AA指示所述裂解剂、所述靶标、或所述裂解剂与所述靶标两者不存在于所述受试者或样品中。
在一些实施方案中，可活化抗靶标抗体是缀合了治疗剂的可活化抗靶标抗体。在一些实施方案中，可活化抗靶标抗体未缀合于剂。在一些实施方案中，可活化抗靶标抗体包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，使用特异性结合活化抗体的二级试剂实现测量受试者或样品中可活化抗靶标抗体的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，可活化抗靶标抗体包括可检测标记。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子、或基于配体的标记。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，成像剂包括放射性同位素。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，放射性同位素是铟或锝。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，造影剂包括碘、钆或氧化铁。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，荧光标记包括黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、经修饰红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，发光标记包括N-甲基吖啶鎓衍生物。在这些方法的一些实施方案中，标记包括Alexa
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标记，诸如Alex
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680或Alexa
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750。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，基于配体的标记包括生物素、亲和素、链霉亲和素或一种或多种半抗原。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在这些方法的一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如猫、狗、马)、农场动物、役用动物或动物园动物。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，方法是体内方法。在这些方法的一些实施方案中，方法是原位方法。在这些方法的一些实施方案中，方法是离体方法。在这些方法的一些实施方案中，方法是体外方法。
在方法和试剂盒的一些实施方案中，方法用于鉴定或以其他方式细化适于用本公开的抗靶标AA治疗的患者群体，随后通过将那个可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体施用至有需要的受试者来治疗。举例来说，将靶标(例如CD166)与裂解在这些方法中所测试的抗靶标AA的CM(CM)中的底物的蛋白酶两者均测试为阳性的患者鉴定为适于用包含此种CM的此种抗靶标AA治疗的候选者，并且接着向患者施用治疗有效量的所测试可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体。同样，靶标(例如CD166)和裂解使用这些方法所测试的AA中的CM中的底物的蛋白酶中的任一者或两者测试为阴性的患者可能被鉴定为适于另一形式的疗法的候选者。在一些实施方案中，可用其他抗靶标AA测试此类患者直至鉴定适于治疗的抗靶标AA(例如包含在疾病部位处由患者裂解的CM的抗靶标AA)。在一些实施方案中，接着向患者施用治疗有效量的患者关于其被测试为阳性的可活化抗靶标抗体和/或经缀合可活化抗靶标抗体。适合AB、MM和/或CM包括本文公开的任何AB、MM和/或CM。
在一些实施方案中，AA和/或经缀合AA含有可检测标记。使用完整抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab)2)。关于探针或抗体的术语“标记”意图涵盖通过使可检测物质偶联(即以实体方式连接)于探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与经直接标记的另一试剂的反应性来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用经荧光标记的二级抗体检测初级抗体，以及用生物素对DNA探针的末端标记以致它可用经荧光标记的链霉亲和素检测。术语“生物样品”意图包括从受试者分离的组织、细胞和生物液体，以及存在于受试者内的组织、细胞和液体。因此，包括在术语“生物样品”的用法内的是血液以及血液的级分或组分，包括血清、血浆或淋巴液。也就是说，本公开的检测方法可用于在体外以及在体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。举例来说，用于检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、免疫化学染色和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。用于进行免疫测定的程序例如描述于“ELISA:Theory andPractice:Methods in Molecular Biology”,第42卷,J.R.Crowther(编)Human Press,Totowa,NJ,1995；“Immunoassay”,E.Diamandis和T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1996；以及“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985中。此外，用于检测分析物蛋白质的体内技术包括向受试者中引入经标记抗分析物蛋白质抗体。举例来说，可用其在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术检测的放射性标记物标记抗体。
因此，本公开的AA和经缀合AA还可用于多种诊断性和防治性制剂中。在一个实施方案中，将AA和/或经缀合AA施用至处于显现以上提及的病症中的一者或多者的风险下的受试者。可使用基因型、血清学或生物化学标志物来确定受试者或器官对以上提及的病症中的一者或多者的易患性。
在本公开的一些实施方案中，将AA和/或经缀合AA施用至被诊断有与以上提及的病症中的一者或多者相关的临床适应症的人个体。在诊断后，施用AA和/或经缀合AA以缓解或逆转临床适应症的影响。
本公开的可活化抗体和/或经缀合AA还可用于检测受试者样品中的靶标，因此，可用作诊断剂。举例来说，本公开的抗体和/或可活化抗体以及它们的经缀合形式在体外测定例如ELISA中用于检测受试者样品中的靶标水平。
在一个实施方案中，将本公开的AA和/或经缀合AA固定在固体载体(例如微量滴定板的一个或多个孔)上。经固定AA和/或经缀合AA充当可存在于测试样品中的任何靶标的捕集抗体。在使经固定可活化抗体和/或其经缀合形式与受试者样品接触之前，冲洗固体载体，并且用封闭剂诸如乳蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异性吸附。
随后，用被怀疑含有抗原的测试样品，或用含有标准量的抗原的溶液处理孔。此种样品是例如来自被怀疑具有被视为可诊断病变的循环抗原水平的受试者的血清样品。在冲洗掉测试样品或标准物之后，用以可检测方式标记的第二抗体处理固体载体。经标记第二抗体充当检测抗体。测量可检测标记的水平，并且通过与由标准样品产生的标准曲线比较来确定测试样品中靶标抗原的浓度。
应了解，基于在体外诊断测定中使用本公开的AA及其经缀合形式获得的结果，有可能基于靶标抗原的表达水平对受试者中的疾病分期。对于给定疾病，从被诊断为处于所述疾病的进展中的各个阶段，以及/或者处于对所述疾病的治疗性治疗中的各个点的受试者获取血液样品。使用提供进展或疗法的每个阶段的统计显著结果的样品群体，指定可被视为是每个阶段所特有的抗原浓度范围。
AA和/或经缀合AA还可用于诊断和/或成像方法中。在一些实施方案中，此类方法是体外方法。在一些实施方案中，此类方法是体内方法。在一些实施方案中，此类方法是原位方法。在一些实施方案中，此类方法是离体方法。举例来说，具有酶可裂解CM的AA可用于检测能够裂解所述CM的酶的存在或不存在。此类AA可用于诊断中，此可包括通过对给定宿主生物体的给定细胞或组织中活化抗体(即由裂解可活化抗体产生的抗体)的积累的测量来体内检测(例如定性或定量)酶活性(或在一些实施方案中，具有增加的还原电位的环境，诸如可提供二硫键的还原的环境)。活化抗体的这种积累不仅指示组织表达酶活性(或增加的还原电位，视CM的性质而定)，而且还指示组织表达活化抗体所结合的靶标。
举例来说，可将CM选择为至少一种见于肿瘤部位处、病毒性或细菌性感染部位处、生物局限部位处(例如像在脓肿中，在器官中等)等的蛋白酶的底物。AB可为结合靶标抗原的AB。使用如本文公开的方法或当适当时的为本领域技术人员所熟悉的方法，可使可检测标记(例如荧光标记或放射性标记或放射性示踪剂)缀合于抗体和/或可活化抗体的AB或其他区域。在以上筛选方法的情形下讨论了适合可检测标记，并且以下提供额外具体实例。使用对疾病状态的蛋白质或肽具有特异性的AB以及至少一种其活性在目标疾病组织中升高的蛋白酶，相对于其中CM特异性酶不以可检测水平存在，或相比于在疾病组织中以较低水平存在，或是非活性(例如呈酶原形式或与抑制剂复合)的组织，AA将展现与疾病组织的结合率增加。因为小蛋白质和肽通过肾过滤系统从血液快速清除，以及因为对CM具有特异性的酶不以可检测水平存在(或以较低水平存在于非疾病组织中，或以非活性构象存在)，所以相对于非疾病组织，在疾病组织中活化抗体的积累得到增强。
在另一实例中，AA可用于检测样品中裂解剂的存在或不存在。举例来说，当AA含有易经受由酶达成的裂解的CM时，AA可用于检测(定性或定量)样品中酶的存在。在另一实例中，当AA含有易经受由还原剂达成的裂解的CM时，AA可用于检测(定性或定量)样品中还原性条件的存在。为有助于这些方法中的分析，可将AA以可检测方式标记，并且可使其结合于载体(例如固体载体，诸如载片或珠粒)。可使可检测标记位于AA的在裂解之后不释放的部分上，例如可检测标记可为经淬灭荧光标记或不可检测直至已发生裂解的其他标记。可通过例如以下方式来进行测定：使经固定的以可检测方式标记的AA与被怀疑含有酶和/或还原剂的样品接触足以发生裂解的时间，接着洗涤以移除过量样品和污染物。接着通过在与样品接触之前AA的可检测信号的变化评估样品中裂解剂(例如酶或还原剂)的存在或不存在，所述变化例如是由于由样品中的裂解剂对AA的裂解，可检测信号存在和/或增加。
此类检测方法可还适合于提供检测能够结合当被裂解时的AA的AB的靶标的存在或不存在。因此，测定可适合于评估裂解剂的存在或不存在以及目标靶标的存在或不存在。可如上所述通过AA的可检测标记的存在和/或增加来检测裂解剂的存在或不存在，并且可通过例如通过使用以可检测方式标记的抗靶标抗体检测靶标-AB复合物来检测靶标的存在或不存在。
AA还可用于原位成像中以验证例如通过蛋白酶裂解达成的AA活化，以及与特定靶标的结合。原位成像是一种使得能够定位生物样品诸如细胞培养物或组织切片中的蛋白水解活性和靶标的技术。使用这个技术，有可能基于可检测标记(例如荧光标记)的存在确认与给定靶标的结合与蛋白水解活性两者。
这些技术可用于源于疾病部位(例如肿瘤组织)或健康组织的任何冷冻细胞或组织。这些技术还可用于新鲜细胞或组织样品。
在这些技术中，将AA用可检测标记加以标记。可检测标记可为荧光染料(例如荧光团、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(TRITC)、Alexa
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标记)、近红外(NIR)染料(例如
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纳米晶体)、胶体金属、半抗原、放射性标记物、生物素和放大试剂诸如链霉亲和素、或酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
在已与经标记AA一起孵育的样品中检测到标记指示所述样品含有靶标，并且含有对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施方案中，可使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文所述的那些，以及/或者通过使用对蛋白酶具有特异性的剂例如对蛋白酶基质蛋白酶具有特异性，并且抑制基质蛋白酶的蛋白水解活性的抗体诸如A11确认蛋白酶的存在；参见例如2010年11月11日公布的国际公布第WO 2010/129609号。使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文所述的那些，以及/或者通过使用更具选择性的抑制剂进行的相同方法可用于鉴定对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施方案中，可使用对靶标具有特异性的剂例如另一抗体确认靶标的存在，或可使可检测标记与未标记靶标竞争。在一些实施方案中，可使用未标记AA，其中通过经标记二级抗体或更复杂的检测系统进行检测。
类似技术还可用于体内成像，其中在受试者例如包括人的哺乳动物中检测到荧光信号指示疾病部位含有靶标，并且含有对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。
这些技术还可用于试剂盒中以及/或者作为试剂，以基于可活化抗体中的蛋白酶特异性CM来检测、鉴定或表征多种细胞、组织和生物体中的蛋白酶活性。
本公开提供了在多种诊断和/或防治适应症中使用AA的方法。举例来说，本公开提供了通过以下方式来检测受试者或样品中裂解剂和目标靶标的存在或不存在的方法：(i)使受试者或样品与可活化抗体接触，其中所述AA包含掩蔽部分(MM)、由所述裂解剂例如蛋白酶裂解的可裂解部分(CM)、以及特异性结合所述目标靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中处于未裂解非活化状态的所述AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中所述MM是抑制所述AB与所述靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列，并且不是所述AB的天然结合配偶体的经修饰形式；并且(b)其中在未裂解非活化状态下，所述MM干扰所述AB与所述靶标的特异性结合，并且在经裂解活化状态下，所述MM不干扰或竞争所述AB与所述靶标的特异性结合；以及(ii)测量所述受试者或样品中活化AA的水平，其中所述受试者或样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂和所述靶标存在于所述受试者或样品中，并且其中所述受试者或样品中无可检测水平的活化AA指示所述裂解剂、所述靶标、或所述裂解剂与所述靶标两者不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或样品中。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，AA包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，使用特异性结合活化抗体的二级试剂实现测量受试者或样品中AA的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了通过以下方式来检测受试者或样品中裂解剂的存在或不存在的方法：(i)在目标靶标例如靶标存在下使受试者或样品与AA接触，其中所述AA包含掩蔽部分(MM)、由所述裂解剂例如蛋白酶裂解的可裂解部分(CM)、以及特异性结合所述目标靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中处于未裂解非活化状态的所述AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中所述MM是抑制所述AB与所述靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列，并且不是所述AB的天然结合配偶体的经修饰形式；并且(b)其中在未裂解非活化状态下，所述MM干扰所述AB与所述靶标的特异性结合，并且在经裂解活化状态下，所述MM不干扰或竞争所述AB与所述靶标的特异性结合；以及(ii)测量所述受试者或样品中活化AA的水平，其中所述受试者或样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂存在于所述受试者或样品中，并且其中所述受试者或样品中无可检测水平的活化AA指示所述裂解剂不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或样品中。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，AA包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，使用特异性结合活化抗体的二级试剂实现测量受试者或样品中AA的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了用于检测受试者或样品中裂解剂和靶标的存在或不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括AA，所述AA包含掩蔽部分(MM)、由所述裂解剂例如蛋白酶裂解的可裂解部分(CM)、以及特异性结合所述目标靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中处于未裂解非活化状态的所述AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中所述MM是抑制所述AB与所述靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列，并且不是所述AB的天然结合配偶体的经修饰形式；并且(b)其中在未裂解非活化状态下，所述MM干扰所述AB与所述靶标的特异性结合，并且在经裂解活化状态下，所述MM不干扰或竞争所述AB与所述靶标的特异性结合；以及(ii)测量所述受试者或样品中活化AA的水平，其中所述受试者或样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂存在于所述受试者或样品中，并且其中所述受试者或样品中无可检测水平的活化AA指示所述裂解剂不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或样品中。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，AA包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，使用特异性结合活化抗体的二级试剂实现测量受试者或样品中AA的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了通过以下方式来检测受试者或样品中裂解剂的存在或不存在的方法：(i)使受试者或样品与可活化抗体接触，其中所述AA包含掩蔽部分(MM)、由所述裂解剂例如蛋白酶裂解的可裂解部分(CM)、特异性结合靶标的抗原结合结构域(AB)、以及可检测标记，其中处于未裂解非活化状态的所述AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；其中所述MM是抑制所述AB与所述靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列，并且不是所述AB的天然结合配偶体的经修饰形式；其中在未裂解非活化状态下，所述MM干扰所述AB与所述靶标的特异性结合，并且在经裂解活化状态下，所述MM不干扰或竞争所述AB与所述靶标的特异性结合；并且其中所述可检测标记位于所述AA的在裂解所述CM之后释放的部分上；以及(ii)测量所述受试者或样品中可检测标记的水平，其中所述受试者或样品中有可检测水平的所述可检测标记指示所述裂解剂不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或样品中，并且其中所述受试者或样品中无可检测水平的所述可检测标记指示所述裂解剂存在于所述受试者或样品中。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，AA包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，使用特异性结合活化抗体的二级试剂实现测量受试者或样品中AA的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了用于检测受试者或样品中裂解剂和靶标的存在或不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括用于接触受试者或生物样品的本文所述的AA和/或经缀合AA(例如缀合了治疗剂的AA)以及用于检测所述受试者或生物样品中活化AA和/或经缀合AA的水平的装置，其中所述受试者或生物样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中，并且其中所述受试者或生物样品中无可检测水平的活化AA指示所述裂解剂、所述靶标、或所述裂解剂与所述靶标两者不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或生物样品中，以致不能在所述受试者或生物样品中检测到所述AA的靶标结合和/或蛋白酶裂解。
本公开还提供了通过以下方式来检测受试者或样品中裂解剂的存在或不存在的方法：(i)在靶标存在下使受试者或生物样品与AA接触，以及(ii)测量所述受试者或生物样品中活化AA的水平，其中所述受试者或生物样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂存在于所述受试者或生物样品中，并且其中所述受试者或生物样品中无可检测水平的活化AA指示所述裂解剂不存在以及/或者不以可检测水平充分存在于所述受试者或生物样品中，以致不能在所述受试者或生物样品中检测到所述AA的蛋白酶裂解。此种AA包括掩蔽部分(MM)、由裂解剂例如蛋白酶裂解的可裂解部分(CM)、以及特异性结合靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中处于未裂解(即非活化)状态的所述AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中所述MM是抑制所述AB与所述靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；并且(b)其中处于未裂解状态的所述AA的所述MM干扰所述AB与所述靶标的特异性结合，并且其中处于裂解(即活化)状态的AA的所述MM不干扰或竞争所述AB与所述靶标的特异性结合。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，可检测标记附接于掩蔽部分。在一些实施方案中，可检测标记在蛋白酶裂解位点的N末端附接于CM。在一些实施方案中，AB的单一抗原结合位点被掩蔽。在其中本公开的抗体具有至少两个抗原结合位点的一些实施方案中，至少一个抗原结合位点被掩蔽，并且至少一个抗原结合位点未被掩蔽。在一些实施方案中，所有抗原结合位点都被掩蔽。在一些实施方案中，测量步骤包括使用包含可检测标记的二级试剂。
本公开还提供了用于检测受试者或样品中裂解剂和靶标的存在或不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括本文所述的AA和/或经缀合AA，所述AA和/或经缀合AA用于在所述靶标存在下使受试者或生物样品与AA接触，以及测量所述受试者或生物样品中活化AA的水平，其中所述受试者或生物样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂存在于所述受试者或生物样品中，并且其中所述受试者或生物样品中无可检测水平的活化AA指示所述裂解剂不存在以及/或者不以可检测水平充分存在于所述受试者或生物样品中，以致不能在所述受试者或生物样品中检测到所述AA的蛋白酶裂解。此种AA包括掩蔽部分(MM)、由裂解剂例如蛋白酶裂解的可裂解部分(CM)、以及特异性结合靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中处于未裂解(即非活化)状态的所述AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中所述MM是抑制所述AB与所述靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；并且(b)其中处于未裂解状态的所述AA的所述MM干扰所述AB与所述靶标的特异性结合，并且其中处于裂解(即活化)状态的AA的所述MM不干扰或竞争所述AB与所述靶标的特异性结合。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，可检测标记附接于掩蔽部分。在一些实施方案中，可检测标记在蛋白酶裂解位点的N末端附接于CM。在一些实施方案中，AB的单一抗原结合位点被掩蔽。在其中本公开的抗体具有至少两个抗原结合位点的一些实施方案中，至少一个抗原结合位点被掩蔽，并且至少一个抗原结合位点未被掩蔽。在一些实施方案中，所有抗原结合位点都被掩蔽。在一些实施方案中，测量步骤包括使用包含可检测标记的二级试剂。
本公开还提供了用于检测受试者或样品中裂解剂的存在或不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括用于接触受试者或生物样品的本文所述的AA和/或经缀合AA以及用于检测所述受试者或生物样品中活化AA和/或经缀合AA的水平的装置，其中所述AA包括位于所述AA的在裂解CM之后释放的部分上的可检测标记，其中所述受试者或生物样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或生物样品中，以致不能在所述受试者或生物样品中检测到所述AA的靶标结合和/或蛋白酶裂解，并且其中所述受试者或生物样品中无可检测水平的活化AA指示所述裂解剂以可检测水平存在于所述受试者或生物样品中。
本公开提供了通过以下方式来检测受试者或样品中裂解剂和靶标的存在或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体接触，其中所述AA包括位于所述AA的在裂解CM之后释放的部分上的可检测标记，以及(ii)测量所述受试者或生物样品中活化AA的水平，其中所述受试者或生物样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂、所述靶标、或所述裂解剂与所述靶标两者不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或生物样品中，以致不能在所述受试者或生物样品中检测到所述AA的靶标结合和/或蛋白酶裂解，并且其中所述受试者或生物样品中有降低的可检测水平的活化AA指示所述裂解剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中。可检测标记的降低水平是例如降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。此种AA包括掩蔽部分(MM)、由裂解剂裂解的可裂解部分(CM)、以及特异性结合靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中处于未裂解(即非活化)状态的所述AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中所述MM是抑制所述AB与所述靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；并且(b)其中处于未裂解状态的所述AA的所述MM干扰所述AB与所述靶标的特异性结合，并且其中处于裂解(即活化)状态的AA的所述MM不干扰或竞争所述AB与所述靶标的特异性结合。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，AA包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，使用特异性结合活化抗体的二级试剂实现测量受试者或样品中AA的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了用于检测受试者或样品中裂解剂和靶标的存在或不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括用于接触受试者或生物样品的本文所述的AA和/或经缀合AA以及用于检测所述受试者或生物样品中活化AA和/或经缀合AA的水平的装置，其中所述受试者或生物样品中有可检测水平的活化AA指示所述裂解剂、所述靶标、或所述裂解剂与所述靶标两者不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或生物样品中，以致不能在所述受试者或生物样品中检测到所述AA的靶标结合和/或蛋白酶裂解，并且其中所述受试者或生物样品中有降低的可检测水平的活化AA指示所述裂解剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中。可检测标记的降低水平是例如降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。
本公开还提供了通过以下方式来检测受试者或样品中裂解剂的存在或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体接触，其中所述AA包括位于所述AA的在裂解CM之后释放的部分上的可检测标记；以及(ii)测量所述受试者或生物样品中可检测标记的水平，其中所述受试者或生物样品中有可检测水平的所述可检测标记指示所述裂解剂不存在以及/或者不以可检测水平充分存在于所述受试者或生物样品中，以致不能在所述受试者或生物样品中检测到所述AA的蛋白酶裂解，并且其中所述受试者或生物样品中有降低的可检测水平的所述可检测标记指示所述裂解剂存在于所述受试者或生物样品中。可检测标记的降低水平是例如降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。此种AA包括掩蔽部分(MM)、由裂解剂裂解的可裂解部分(CM)、以及特异性结合靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中处于未裂解(即非活化)状态的所述AA包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM；(a)其中所述MM是抑制所述AB与所述靶标的结合的肽，并且其中所述MM不具有所述AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；并且(b)其中处于未裂解状态的所述AA的所述MM干扰所述AB与所述靶标的特异性结合，并且其中处于裂解(即活化)状态的AA的所述MM不干扰或竞争所述AB与所述靶标的特异性结合。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，AA包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，使用特异性结合活化抗体的二级试剂实现测量受试者或样品中AA的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
本公开还提供了用于检测受试者或样品中目标裂解剂的存在或不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒至少包括用于接触受试者或生物样品的本文所述的AA和/或经缀合AA以及用于检测所述受试者或生物样品中活化AA和/或经缀合AA的水平的装置，其中所述AA包括位于所述AA的在裂解CM之后释放的部分上的可检测标记，其中所述受试者或生物样品中有可检测水平的所述可检测标记指示所述裂解剂、靶标、或所述裂解剂与所述靶标两者不存在以及/或者不充分存在于所述受试者或生物样品中，以致不能在所述受试者或生物样品中检测到所述AA的靶标结合和/或蛋白酶裂解，并且其中所述受试者或生物样品中有降低的可检测水平的所述可检测标记指示所述裂解剂和所述靶标存在于所述受试者或生物样品中。可检测标记的降低水平是例如降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，AA包括可检测标记。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子、或基于配体的标记。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，成像剂包括放射性同位素。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，放射性同位素是铟或锝。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，造影剂包括碘、钆或氧化铁。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，荧光标记包括黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、经修饰红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，发光标记包括N-甲基吖啶鎓衍生物。在这些方法的一些实施方案中，标记包括Alexa
Figure BDA0003297387640001271
标记，诸如Alex
Figure BDA0003297387640001272
680或Alexa
Figure BDA0003297387640001281
750。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，基于配体的标记包括生物素、亲和素、链霉亲和素或一种或多种半抗原。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如猫、狗、马)、农场动物、役用动物或动物园动物。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物。
在这些方法的一些实施方案中，方法是体内方法。在这些方法的一些实施方案中，方法是原位方法。在这些方法的一些实施方案中，方法是离体方法。在这些方法的一些实施方案中，方法是体外方法。
在一些实施方案中，原位成像和/或体内成像可用于用以鉴定哪些受试者待治疗的方法中。举例来说，在原位成像中，AA用于筛选受试者样品以鉴定在适当位置处例如在肿瘤部位处具有适当的一种或多种蛋白酶和一种或多种靶标的那些受试者。
在一些实施方案中，原位成像用于鉴定或以其他方式细化适于用本公开的AA治疗的受试者群体。举例来说，将靶标(例如靶标)与裂解所测试的AA的CM(CM)中的底物的蛋白酶两者均测试为阳性(例如在疾病部位处积累活化抗体)的受试者鉴定为适于用包含此种CM的此种AA治疗的候选者。同样，靶标(例如靶标)和裂解使用这些方法所测试的AA中的CM中的底物的蛋白酶中的任一者或两者测试为阴性的受试者可能被鉴定为适于另一形式的疗法的候选者。在一些实施方案中，可用包含不同CM的其他AA测试关于第一AA测试为阴性的此类受试者，直至鉴定适于治疗的AA(例如包含在疾病部位处由受试者裂解的CM的AA)。在一些实施方案中，接着向受试者施用治疗有效量的受试者关于其被测试为阳性的AA。
在一些实施方案中，体内成像用于鉴定或以其他方式细化适于用本公开的AA治疗的受试者群体。举例来说，将靶标(例如靶标)与裂解所测试的AA的CM(CM)中的底物的蛋白酶两者均测试为阳性(例如在疾病部位处积累活化抗体)的受试者鉴定为适于用包含此种CM的此种AA治疗的候选者。同样，测试为阴性的受试者可能被鉴定为适于另一形式的疗法的候选者。在一些实施方案中，可用包含不同CM的其他AA测试关于第一AA测试为阴性的此类受试者，直至鉴定适于治疗的AA(例如包含在疾病部位处由受试者裂解的CM的AA)。在一些实施方案中，接着向受试者施用治疗有效量的受试者关于其被测试为阳性的AA。
在方法和试剂盒的一些实施方案中，方法或试剂盒用于鉴定或以其他方式细化适于用本公开的AA治疗的受试者群体。举例来说，将靶标(例如靶标)与裂解在这些方法中所测试的AA的CM(CM)中的底物的蛋白酶两者均测试为阳性的受试者鉴定为适于用包含此种CM的此种AA治疗的候选者。同样，靶标(例如靶标)与裂解使用这些方法所测试的AA中的CM中的底物的蛋白酶两者均测试为阴性的受试者可能被鉴定为适于另一形式的疗法的候选者。在一些实施方案中，可用其他AA测试此类受试者直至鉴定适于治疗的AA(例如包含在疾病部位处由受试者裂解的CM的AA)。在一些实施方案中，将靶标(例如靶标)中的任一者测试为阴性的受试者鉴定为适于用包含此种CM的此种AA治疗的候选者。在一些实施方案中，将靶标(例如靶标)中的任一者测试为阴性的受试者鉴定为不是适于用包含此种CM的此种AA治疗的候选者。在一些实施方案中，可用其他AA测试此类受试者直至鉴定适于治疗的AA(例如包含在疾病部位处由受试者裂解的CM的AA)。在一些实施方案中，AA是缀合了治疗剂的AA。在一些实施方案中，AA未缀合于剂。在一些实施方案中，AA包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，使用特异性结合活化抗体的二级试剂实现测量受试者或样品中AA的水平，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，二级试剂是包含可检测标记的抗体。
在一些实施方案中，方法或试剂盒用于鉴定或以其他方式细化适于用本公开的抗靶标AA和/或经缀合AA(例如缀合了治疗剂的AA)治疗的受试者群体，随后通过将那个AA和/或经缀合AA施用至有需要的受试者来治疗。举例来说，将靶标(例如靶标)与裂解在这些方法中所测试的AA和/或经缀合AA的CM(CM)中的底物的蛋白酶两者均测试为阳性的受试者鉴定为适于用包含此种CM的此抗体和/或此种经缀合AA治疗的候选者，并且接着向受试者施用治疗有效量的所测试的AA和/或经缀合AA。同样，靶标(例如靶标)和裂解使用这些方法所测试的AA中的CM中的底物的蛋白酶中的任一者或两者测试为阴性的受试者可能被鉴定为适于另一形式的疗法的候选者。在一些实施方案中，可用其他抗体和/或经缀合AA测试此类受试者直至鉴定适于治疗的抗体和/或经缀合AA(例如包含在疾病部位处由受试者裂解的CM的AA和/或经缀合AA)。在一些实施方案中，接着向受试者施用治疗有效量的受试者关于其被测试为阳性的AA和/或经缀合AA。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，MM是具有约4至40个氨基酸的长度的肽。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，AA包含接头肽，其中所述接头肽位于MM与CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，AA包含接头肽，其中所述接头肽位于AB与CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，AA包含第一接头肽(LP1)和第二接头肽(LP2)，其中所述第一接头肽位于MM与CM之间，并且所述第二接头肽位于AB与CM之间。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，LP1和LP2中的每一者是在长度方面是约1至20个氨基酸的肽，并且其中LP1和LP2中的每一者无需是相同接头。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，LP1和LP2中的一者或两者包含甘氨酸-丝氨酸聚合物。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，LP1和LP2中的至少一者包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(GS)n、(GSGGS)n(SEQID NO:22)和(GGGS)n(SEQ ID NO:23)，其中n是至少是1的整数。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，LP1和LP2中的至少一者包含具有式(GGS)n的氨基酸序列，其中n是至少是1的整数。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，LP1和LP2中的至少一者包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:24)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ IDNO:25)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:26)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:27)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:28)和Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO:29)。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，AB包含选自本文呈现的交叉反应性抗体序列的抗体或抗体片段序列。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，AB包括Fab片段、scFv或单链抗体(scAb)。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，裂解剂是与靶标共定位在受试者或样品中的蛋白酶，并且CM是充当所述蛋白酶的底物的多肽，其中当AA暴露于所述蛋白酶时，所述蛋白酶裂解所述AA中的所述CM。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，CM是在长度方面多达15个氨基酸的多肽。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，CM偶联于AB的N末端。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，CM偶联于AB的C末端。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，CM偶联于AB的VL链的N末端。
本公开的抗体、经缀合抗体、AA和经缀合AA用于诊断性和防治性制剂中。在一个实施方案中，将AA施用至处于显现以上提及的炎症、炎症性病症、癌症或其他病症中的一者或多者的风险下的受试者。
可使用基因型、血清学或生物化学标志物来确定受试者或器官对以上提及的病症中的一者或多者的易患性。
在本公开的一些实施方案中，将AA和/或经缀合AA施用至被诊断有与以上提及的病症中的一者或多者相关的临床适应症的人个体。在诊断后，施用AA和/或经缀合AA以缓解或逆转临床适应症的影响。
本公开的抗体、经缀合抗体、AA和经缀合AA还可用于检测受试者样品中的靶标，因此，可用作诊断剂。举例来说，本公开的抗体、经缀合抗体、AA和经缀合AA在体外测定例如ELISA中用于检测受试者样品中的靶标水平。
在一个实施方案中，将本公开的抗体和/或AA固定在固体载体(例如微量滴定板的一个或多个孔)上。经固定抗体和/或AA充当可存在于测试样品中的任何靶标的捕集抗体。在使经固定抗体和/或AA与受试者样品接触之前，冲洗固体载体，并且用封闭剂诸如乳蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异性吸附。
随后，用被怀疑含有抗原的测试样品，或用含有标准量的抗原的溶液处理孔。此种样品是例如来自被怀疑具有被视为可诊断病变的循环抗原水平的受试者的血清样品。在冲洗掉测试样品或标准物之后，用以可检测方式标记的第二抗体处理固体载体。经标记第二抗体充当检测抗体。测量可检测标记的水平，并且通过与由标准样品产生的标准曲线比较来确定测试样品中靶标抗原的浓度。
应了解，基于在体外诊断测定中使用本公开的抗体和/或AA获得的结果，有可能基于靶标抗原的表达水平对受试者中的疾病分期。对于给定疾病，从被诊断为处于所述疾病的进展中的各个阶段，以及/或者处于对所述疾病的治疗性治疗中的各个点的受试者获取血液样品。使用提供进展或疗法的每个阶段的统计显著结果的样品群体，指定可被视为是每个阶段所特有的抗原浓度范围。
抗体、经缀合抗体、AA和经缀合AA还可用于诊断和/或成像方法中。在一些实施方案中，此类方法是体外方法。在一些实施方案中，此类方法是体内方法。在一些实施方案中，此类方法是原位方法。在一些实施方案中，此类方法是离体方法。举例来说，具有酶可裂解CM的AA可用于检测能够裂解所述CM的酶的存在或不存在。此类AA可用于诊断中，此可包括通过对给定宿主生物体的给定细胞或组织中活化抗体(即由裂解可活化抗体产生的抗体)的积累的测量来体内检测(例如定性或定量)酶活性(或在一些实施方案中，具有增加的还原电位的环境，诸如可提供二硫键的还原的环境)。活化抗体的这种积累不仅指示组织表达酶活性(或增加的还原电位，视CM的性质而定)，而且还指示组织表达活化抗体所结合的靶标。
举例来说，可将CM选择为见于肿瘤部位处、病毒性或细菌性感染部位处、生物局限部位处(例如像在脓肿中，在器官中等)等的蛋白酶的蛋白酶底物。AB可为结合靶标抗原的AB。使用为本领域技术人员所熟悉的方法，可使可检测标记(例如荧光标记或放射性标记或放射性示踪剂)缀合于可活化抗体的AB或其他区域。在以上筛选方法的情形下讨论了适合可检测标记，并且以下提供额外具体实例。使用对疾病状态的蛋白质或肽具有特异性的AB以及其活性在目标疾病组织中升高的蛋白酶，相对于其中CM特异性酶不以可检测水平存在，或相比于在疾病组织中以较低水平存在，或是非活性(例如呈酶原形式或与抑制剂复合)的组织，AA将展现与疾病组织的结合率增加。因为小蛋白质和肽通过肾过滤系统从血液快速清除，以及因为对CM具有特异性的酶不以可检测水平存在(或以较低水平存在于非疾病组织中，或以非活性构象存在)，所以相对于非疾病组织，在疾病组织中活化抗体的积累得到增强。
在另一实例中，AA可用于检测样品中裂解剂的存在或不存在。举例来说，当AA含有易经受由酶达成的裂解的CM时，AA可用于检测(定性或定量)样品中酶的存在。在另一实例中，当AA含有易经受由还原剂达成的裂解的CM时，AA可用于检测(定性或定量)样品中还原性条件的存在。为有助于这些方法中的分析，可将AA以可检测方式标记，并且可使其结合于载体(例如固体载体，诸如载片或珠粒)。可使可检测标记位于AA的在裂解之后不释放的部分上，例如可检测标记可为经淬灭荧光标记或不可检测直至已发生裂解的其他标记。可通过例如以下方式来进行测定：使经固定的以可检测方式标记的AA与被怀疑含有酶和/或还原剂的样品接触足以发生裂解的时间，接着洗涤以移除过量样品和污染物。接着通过在与样品接触之前AA的可检测信号的变化评估样品中裂解剂(例如酶或还原剂)的存在或不存在，所述变化例如是由于由样品中的裂解剂对AA的裂解，可检测信号存在和/或增加。
此类检测方法可还适合于提供检测能够结合当被裂解时的AA的AB的靶标的存在或不存在。因此，测定可适合于评估裂解剂的存在或不存在以及目标靶标的存在或不存在。可如上所述通过AA的可检测标记的存在和/或增加来检测裂解剂的存在或不存在，并且可通过例如通过使用以可检测方式标记的抗靶标抗体检测靶标-AB复合物来检测靶标的存在或不存在。
AA还可用于原位成像中以验证例如通过蛋白酶裂解达成的AA活化，以及与特定靶标的结合。原位成像是一种使得能够定位生物样品诸如细胞培养物或组织切片中的蛋白水解活性和靶标的技术。使用这个技术，有可能基于可检测标记(例如荧光标记)的存在确认与给定靶标的结合与蛋白水解活性两者。
这些技术可用于源于疾病部位(例如肿瘤组织)或健康组织的任何冷冻细胞或组织。这些技术还可用于新鲜细胞或组织样品。
在这些技术中，将AA用可检测标记加以标记。可检测标记可为荧光染料(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(TRITC))、近红外(NIR)染料(例如
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纳米晶体)、胶体金属、半抗原、放射性标记物、生物素和放大试剂诸如链霉亲和素、或酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
在已与经标记AA一起孵育的样品中检测到标记指示所述样品含有靶标，并且含有对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。在一些实施方案中，可使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文所述的那些，以及/或者通过使用对蛋白酶具有特异性的剂例如对蛋白酶基质蛋白酶具有特异性，并且抑制基质蛋白酶的蛋白水解活性的抗体诸如A11确认蛋白酶的存在；参见例如2010年11月11日公布的国际公布第WO 2010/129609号。使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文所述的那些，以及/或者通过使用更具选择性的抑制剂进行的相同方法可用于鉴定对可活化抗体的CM具有特异性的一种蛋白酶或一类蛋白酶。在一些实施方案中，可使用对靶标具有特异性的剂例如另一抗体确认靶标的存在，或可使可检测标记与未标记靶标竞争。在一些实施方案中，可使用未标记AA，其中通过经标记二级抗体或更复杂的检测系统进行检测。
类似技术还可用于体内成像，其中在受试者例如包括人的哺乳动物中检测到荧光信号指示疾病部位含有靶标，并且含有对可活化抗体的CM具有特异性的蛋白酶。
这些技术还可用于试剂盒中以及/或者作为试剂，以基于可活化抗体中的蛋白酶特异性CM来检测、鉴定或表征多种细胞、组织和生物体中的蛋白酶活性。
在一些实施方案中，原位成像和/或体内成像可用于用以鉴定哪些受试者待治疗的方法中。举例来说，在原位成像中，AA用于筛选受试者样品以鉴定在适当位置处例如在肿瘤部位处具有适当的一种或多种蛋白酶和一种或多种靶标的那些受试者。
在一些实施方案中，原位成像用于鉴定或以其他方式细化适于用本公开的AA治疗的受试者群体。举例来说，将靶标与裂解所测试的AA的CM(CM)中的底物的蛋白酶两者均测试为阳性(例如在疾病部位处积累活化抗体)的受试者鉴定为适于用包含此种CM的此种AA治疗的候选者。同样，将靶标和裂解使用这些方法所测试的AA中的CM中的底物的蛋白酶中的任一者或两者测试为阴性的受试者鉴定为适于另一形式的疗法(即不适于用所测试的AA治疗)的候选者。在一些实施方案中，可用包含不同CM的其他AA测试关于第一AA测试为阴性的此类受试者，直至鉴定适于治疗的AA(例如包含在疾病部位处由受试者裂解的CM的AA)。
在一些实施方案中，体内成像用于鉴定或以其他方式细化适于用本公开的AA治疗的受试者群体。举例来说，将靶标与裂解所测试的AA的CM(CM)中的底物的蛋白酶两者均测试为阳性(例如在疾病部位处积累活化抗体)的受试者鉴定为适于用包含此种CM的此种AA治疗的候选者。同样，将测试为阴性的受试者鉴定为适于另一形式的疗法(即不适于用所测试的AA治疗)的候选者。在一些实施方案中，可用包含不同CM的其他AA测试关于第一AA测试为阴性的此类受试者，直至鉴定适于治疗的AA(例如包含在疾病部位处由受试者裂解的CM的AA)。
药物组合物
可将本公开的AA和经缀合AA(在本文中也被称为“活性化合物”)以及它们的衍生物、片段、类似物和同源物并入至适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含AA和/或经缀合AA以及药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意图包括可与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。适合载体描述于作为本领域中的标准参考教科书的最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences中，所述教科书通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的适合实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(ringer’s solution)、右旋糖溶液、以及5％人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水性媒介物诸如不挥发性油。将此类介质和剂用于药物活性物质在本领域中是熟知的。除非任何常规介质或剂与活性化合物不相容，否则考虑其用于组合物中。还可将补充性活性化合物并入至组合物中。
配制本公开的药物组合物以可与它的预定施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、真皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(即表面)、经粘膜和经直肠施用。在一示例性实施方案中，施用途径是静脉内。
用于胃肠外、真皮内或皮下施加的溶液或混悬剂可包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整张力的剂，诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调整pH。可将胃肠外制剂封装在由玻璃或塑料制得的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当可溶于水时)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合载体包括生理食盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须无菌，并且就存在容易可注射性而言应为流体。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用进行防腐。载体可为溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、以及它们的适合混合物。可例如通过使用包覆剂诸如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。可通过各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等来实现对微生物作用的防止。在一些实施方案中，将合乎需要的是在组合物中包括等张剂，例如糖；多元醇，诸如甘露糖醇、山梨糖醇；氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的剂，例如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射组合物的吸收延长。
可通过将活性化合物以所需量与如所需的以上列举的一种成分或成分的组合一起并入适当溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入至含有基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可将它们封装在明胶胶囊中或压制成片剂。出于口服治疗性施用的目的，可将活性化合物与赋形剂合并，并且以片剂、锭剂或胶囊形式使用。还可使用流体载体制备用作嗽口剂的口服组合物，其中化合物于流体载体中口服施加，并且漱口并吐出或吞咽。药学上相容的粘合剂和/或佐剂物质可作为组合物的一部分加以包括。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如海藻酸、淀粉羟乙酸钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于通过吸入进行的施用，以气雾喷雾剂形式从含有适合推进剂例如气体诸如二氧化碳的加压容器或分配器、或雾化器递送化合物。
还可通过经粘膜或经皮手段进行全身性施用。对于经粘膜或经皮施用，适合于待透过的屏障的穿透剂用于制剂中。此类穿透剂在本领域中是普遍已知的，并且对于经粘膜施用，包括例如清洁剂、胆汁盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。可通过使用鼻用喷雾剂或栓剂实现经粘膜施用。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域中普遍已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
还可将化合物制备成栓剂(例如具有常规栓剂基质诸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式以进行经直肠递送。
在一个实施方案中，将活性化合物与将保护化合物免遭从身体的快速消除的载体一起制备，所述载体诸如是控制释放制剂，包括植入物和微囊封递送系统。可使用可生物降解的生物可相容聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法将为本领域技术人员显而易知。还可从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.商购获得材料。脂质体悬浮液(包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向受感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。可根据例如如美国专利第4,522,811号中所述的为本领域技术人员所知的方法制备这些脂质体悬浮液。
尤其有利的是以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物以易于施用和达成剂量统一性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有被计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需药物载体。本公开的剂量单位形式的规格由以下支配并且直接取决于以下：活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗作用，以及混配此种活性化合物以治疗个体的领域中固有的限制。
药物组合物可连同施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
给药
如本文所提供，以约1ng/kg至100g/kg的任何剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在示例性实施方案中，以大于6mg/kg至约10mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在一个实施方案中，以大于6mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约7mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约8mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约9mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约10mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于6mg/kg至约7mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约7mg/kg至约8mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约8mg/kg至约9mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约9mg/kg至约10mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于6mg/kg至约8mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约7mg/kg至约9mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约8mg/kg至约10mg/kg的剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于240mg至约1000mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于240mg至约400mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于600mg至约1000mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于240mg至大于600mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于240mg至约280mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约280mg至约320mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约320mg至约360mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约360mg至约400mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于240mg至约320mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约280mg至约360mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约320mg至约400mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于600mg至约700mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约700mg至约800mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约800mg至约900mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约900mg至约1000mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以大于600mg至约800mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约700mg至约900mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。在另一实施方案中，以约800mg至约1000mg的固定剂量向受试者施用AA或经缀合AA。
在一些实施方案中，基于受试者的重量向受试者施用经缀合AA。
在一些实施方案中向受试者施用经缀合AA，其中当以mg/kg测量时，剂量基于受试者的实际体重。
在一些实施方案中，向受试者施用经缀合AA，其中当以mg/kg测量时，剂量基于受试者的调整理想体重(AIBW)。在一些实施方案中，基于给定受试者的实际体重与如对应于受试者的男性和女性受试者的预定理想体重(IBW)之间的差异计算调整理想体重。在一些实施方案中，给定受试者的理想体重基于受试者的身高。在一些实施方案中，给定男性受试者的以千克计的理想体重(IBW)确定为IBW＝0.9x(以cm计的身高)–88，并且给定女性受试者的以千克计的IBW确定为IBW＝0.9x(以cm计的身高)–92。在一些实施方案中，给定受试者的以千克计的调整理想体重(AIBW)通过AIBW＝IBW+0.4x(实际重量–IBW)来确定，其中IBW基于他们的给定身高和性别。在一些实施方案中，男性和女性受试者是人受试者。在一些实施方案中，人受试者的AIBW是约40kg至约100kg。
在一些实施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天、每10天、每11天、每12天、每13天、每14天、每15天、每16天、每17天、每18天、每19天、每20天、每21天或甚至每30天以静脉内方式向受试者施用AA或经缀合AA。在一些实施方案中，只要AA和/或剂有效，就以静脉内方式向受试者施用AA或经缀合AA。
在一些实施方案中，每日一次向受试者施用AA或经缀合AA。在一些实施方案中，一天多次，例如每4小时、每6小时、每4-6小时、每8小时、或每12小时向受试者施用AA或经缀合AA。
在本公开的一些实施方案中，与施用本公开的AA联合，可用一种或多种意图缓解或预防眼部毒性的治疗方案和/或预防措施防治性治疗受试者。在不受理论束缚下，这些防治性措施意图缓解和/或预防与和本公开的经缀合AA相关的类美登素诸如DM4相关的眼部毒性。用以缓解和/或预防眼部毒性的示例性防治性措施包括使用UV A/B护目用具(例如太阳眼镜)，使用人工泪液滴眼剂、表面血管收缩剂滴眼剂(例如酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate)眼用溶液、四氢唑啉滴眼剂)和/或表面类固醇滴眼剂(例如乙酸泼尼松龙滴眼剂)。在一些实施方案中，将眼部防治性措施施用至所治疗受试者是任选的。在一些实施方案中，将眼部防治性措施施用至所治疗受试者是强制的。
本发明将进一步描述于以下实施例中，所述实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
实施例
实施例1:免疫细胞和活化的T细胞上的CD166表达
在这个示例性研究中，显示了来自人供者的免疫细胞(外周血液单个核细胞；PBMC)表达CD166。这些示例性结果证明免疫细胞可由特异性结合CD166的抗体和在活化时特异性结合CD166的可活化抗体选择性靶向。
为探询免疫细胞的表面上的CD166表达，从四名健康供者的血液(Leuko Pak，StemCell Technologies,Cambridge,MA)分离人PBMC。使用Ficoll-Paque PLUS密度梯度介质(GE Healthcare Life Sciences目录号17 1440 02)分离PBMC。通过流式细胞计量术分析经分离PBMC的膜标志物以检测免疫细胞的CD166表达。对于在本文所述的这个和其他研究中的流式细胞计量术分析，使细胞与Fc封闭试剂一起在冰上预孵育10分钟，接着用经缀合抗体溶液(抗人CD166抗体3A6，BD Biosciences)在染色缓冲液(BioLegend#420201或BDBiosciences#563794)中在冰上染色30分钟(或对于细胞内染色，在室温下一小时)。在染色缓冲液(400g，5分钟，4C)中洗涤细胞3次。活体/死体可固定活力染料eFluorTM 780(eBioScience#65-0865-14)用于排除死细胞。
参考图1A，相较于荧光减一(FMO)对照，在单核细胞、B细胞和血液髓系树突细胞(mDC)上测量的CD166表达。这些示例性结果显示mDC中的CD166表达水平最高。
参考图1B，流式细胞计量术分析用于测量表达CD166的不同免疫细胞亚型的群体的百分比。这些示例性结果显示血液髓系树突细胞(mDC)和浆细胞样树突细胞(pDC)显示最高百分比的表达CD166的细胞，随后是单核细胞和B细胞。天然杀伤(NK)细胞、原初CD4+T细胞、原初CD8+细胞和Treg细胞基本上不显示CD166表达。
参考图1C，可在CD3/CD28刺激后诱导原初CD4+T细胞上的CD166表达。在这个示例性研究中，通过Ficoll和磁性珠粒(#17952，Stem Cell Technology)分离从来自健康人供者的PBMC分离的CD4+T细胞。用aCD3/aCD28珠粒刺激CD4+T细胞4天，并且每天通过流式细胞计量术分析细胞以检测CD166表达。图1C中的结果来自两名独立供者，两者均显示在刺激之后第3和第4天时，存在CD4+T细胞中的CD166表达。其他示例性研究显示也可在植物血球凝集素(PHA)或葡萄球菌肠毒素B(SEB)处理之后，在T细胞和天然杀伤(NK)细胞中诱导CD166。
这些结果显示树突细胞(mDC和pDC)以及活化的T细胞可由在活化时结合CD166的可活化抗体靶向。
实施例2:人CD166同种同基因肿瘤小鼠模型
在这个示例性研究中，开发了同种同基因小鼠模型，因为用于这些研究中的抗CD166抗体和可活化抗体不结合小鼠CD166。这些结果显示表达人CD166的小鼠细胞系在体外对蛋白酶活化的可活化抗CD166抗体药物缀合物敏感，并且可用于在有免疫能力的小鼠中建立huCD166表达性肿瘤模型。
CT26细胞从ATCC获得。在补充以10％(v/v)胎牛血清(FBS；Life Technologies,Inc，目录号16140-071)的RPMI-1640TM培养基(Life Technologies,Inc，目录号72400120)中培养细胞。在37℃下在5％CO2的含湿气氛围中维持细胞。用人CD166慢病毒载体转导CT26鼠结肠癌亲本细胞。用嘌呤霉素选择过度表达人CD166的CT26细胞。参考图2A，通过流式细胞计量术分析这些转基因CT26以确认人CD166的表达。
进行了一示例性研究以证明CT26 huCD166细胞对缀合于DM4的可活化抗CD166抗体(组合55)敏感。参考图2B，在缀合于DM4的同种型(西那吉斯(Synagis))或由基质蛋白酶活化的组合55可活化抗体药物缀合物(AADC)存在下培养亲本CT26细胞和转基因CT26huCD166细胞四天。用MUGB(Sigma Aldrich目录号51010)滴定重组人基质蛋白酶(R&DSystems目录号3946-SE)的活性位点，并且在50mM Tris/HCl、150mM NaCl、0.05％吐温20(Tween 20)(pH 7.4)中稀释。使用Cell Titer Glo测量细胞活力。这些示例性数据证明转基因CT26 huCD166细胞对蛋白酶活化的抗CD166 AADC敏感。
进行了一示例性研究以显示CT26 huCD166细胞可植入小鼠中，并且形成肿瘤。参考图2C，用指示数目的CT26 huCD166细胞对7周龄的BALB/C小鼠进行植入，并且随时间测量肿瘤体积。
实施例3:抗CD166经缀合可活化抗体和抗PD-1可活化抗体的组合在同种同基因小 鼠模型中的体内功效
在这个示例性研究中，使用同种同基因小鼠模型测定抗CD166经DM4缀合可活化抗体(组合55AADC)和可活化抗PD-1抗体(muPD-1AA)的体内功效。这些结果显示这两种药物均显示针对小鼠模型中的huCD166表达性肿瘤的体内功效，并且组合施用两种药物显示了更高水平的体内功效。
对于体内功效研究，将有免疫能力的雌性(BALB/C)小鼠(7周龄；Charles RiverLaboratories,Hollister,CA)各自用处于0.1mL体积的无血清RPMI 1640细胞培养基中的106个CT26 huCD166细胞皮下接种至右后侧腹中。在接种之后每周两次记录肿瘤体积和体重。通过测径规测量来测定肿瘤尺寸，并且使用公式(a x b2)/2计算肿瘤体积，其中a是最长直径，并且b是最短直径。当肿瘤大小达到100-175mm3时，将小鼠随机化(第0天)，并且根据以下方案给药。一周一次，持续2周(第0天和第7天)，以5mg/kg用抗CD166 AADC(组合55)静脉内给药。一周两次，持续2.5周(第1天、第5天、第8天、第12天和第15天)，以10mg/kg通过腹膜内注射来施用可活化抗小鼠PD-1抗体(muPD-1AA)。在一些实验中，在末次剂量的药物之后2周，用CT-26huCD166肿瘤细胞对展现完全肿瘤消退的小鼠进行再激发。用媒介物对照(PBS)对对照组进行施用。
组合55的可活化抗CD166抗体包括SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的重链和SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:15的轻链。经缀合可活化抗CD166抗体可通过SPDB接头缀合于DM4。
人CD166的一示例性氨基酸序列是：
Figure BDA0003297387640001481
Figure BDA0003297387640001491
参考图3A至图3D，显示了三(3)个独立研究的肿瘤生长曲线。相较于媒介物对照(图3A)，作为单一剂，huCD166 AADC(图3C)与muPD-1AA(图3B)两者均仅减缓肿瘤生长，但它们不诱导完全肿瘤消退。相比之下，当将两种药物组合时(图3D)，相较于单一药物中的任一者，存在抗肿瘤活性的显著增加(单独huCD166 AADC相对于组合：Log10差异：-0.7699，p<0.0001)，其中仅以两种药物的组合观察到多个完全响应(在初始剂量后20天时的肿瘤体积低于在第0天时的测量结果)。对3个独立研究的分析显示huCD166 AADC加muPD-1AA的组合导致51％总体响应率(ORR)。
这些结果显示相比于任一单独药物，抗PD-1可活化抗体和抗CD166可活化抗体药物缀合物的组合的体内功效显示显著更高功效。
实施例4:抗CD166经缀合可活化抗体和抗PD-1可活化抗体的组合诱导记忆T细胞 应答
在这个示例性研究中，结果证明实施例3中研究的在治疗之后保持无肿瘤的小鼠被保护以免遭肿瘤再激发，从而指示已在小鼠中建立免疫记忆应答。
在末次剂量的组合治疗之后15天，用CT-26huCD166肿瘤细胞对来自实施例3的保持无肿瘤的经治疗小鼠进行再激发。如图4B中所示，50％(3/6)的无肿瘤小鼠被保护以免遭肿瘤再激发，而所有原初小鼠(0/10)都快速显现肿瘤(图4A)。
在肿瘤再激发之后两周，在布雷菲德菌素(brefeldin)存在下用CT26特异性肽(Eurogentec#AS-64798)AH1刺激源于这些受保护小鼠的脾细胞，并且通过流式细胞计量术评估以测定由外周CD8+T细胞对IFN-γ的产生。参考图4C，从在肿瘤再激发测定中受保护的小鼠分离的CD8+T细胞产生IFN-γ(图4C，底部图版)，而从不受保护的小鼠分离的CD8+T细胞不应答于AH1肽而产生IFN-γ(图4C，顶部图版)。这些结果指示huCD166 AADC加小鼠PD-1AA的组合在用所述组合治疗的小鼠中诱导以T细胞为中心的免疫记忆应答。
为提供这些结果中CD8+细胞的作用的进一步证据，测定了CD8+T细胞消减对huCD166 AADC、huCD166 AADC和muPD-1AA的组合治疗、或媒介物对照(PBS)在有免疫能力的小鼠肿瘤模型中的体内功效的影响。在这个示例性研究中，如实施例3中所述通过在有免疫能力的BALB/C小鼠中植入CT26 huCD166来形成肿瘤。对于经受CD8+T细胞消减的小鼠，在第-2天、第0天、第7天和第8天时以10mg/kg将抗CD8消减抗体(53-6.72；大鼠IgG2a，Bio XCell)施用至小鼠。参考图6，通过对在第10天时获得的血液样品的流式细胞计量术分析来确认CD8+T细胞消减。用huCD166 AADC、huCD166AADC与muPD-1AA两者、或媒介物对照(PBS)治疗CD8+T细胞经消减和非消减的携带肿瘤的小鼠。一周一次，持续2周(第0天和第7天)，以5mg/kg静脉内施用抗huCD166 AADC(组合55)。一周两次，持续2.5周(第1天、第5天、第8天、第12天和第15天)，以10mg/kg通过腹膜内注射来施用可活化抗小鼠PD-1抗体(muPD-1AA)。
参考图5A至图5C，相比于huCD166 AADC单药疗法(图5B)或媒介物对照(图5A)，在CD8+T细胞未消减的携带肿瘤的小鼠中，huCD166 AADC和muPD-1AA的组合治疗显示更大功效(图5C)。参考图5D至图5F，在CD8+T细胞经消减小鼠中，huCD166 AADC单药疗法(图5E)或huCD166 AADC和muPD-1AA的组合(图5F)的功效显示抗肿瘤功效显著降低。
这些结果显示huCD166 AADC的抗肿瘤功效以及huCD166AADC和muPD-1AA的组合的抗肿瘤功效部分地取决于所治疗受试者中的CD8+T细胞。
实施例5:huCD166 AADC对成熟树突细胞和活化的T细胞的细胞毒性活性
在这个示例性研究中，结果证明尽管抗CD166抗体药物缀合物(huCD166 ADC，SEQID NO:12的VH和SEQ ID NO:13的VL)显示针对两者均表达CD166的人树突细胞和活化的人T细胞的适度细胞毒性活性，但这个细胞毒性低于它针对肿瘤细胞例如表达huCD166的转基因CT26的功效。
在这个示例性研究中测试经DM4缀合抗CD166抗体(huCD166ADC)对免疫细胞的细胞毒性。根据制造商说明书，使用Stem Cell Technology磁性珠粒(用于CD4+T细胞的是#17952，并且用于单核细胞的是#119359)从PBMC分离CD4+T细胞和单核细胞。根据制造商说明书，使用Stem Cell Technology树突细胞分化试剂盒(#10988)使经分离单核细胞分化成树突细胞(MoDC)。在一些测定中，接着使用Stem Cell Technology DC成熟试剂盒(#10989)使树突细胞成熟以获得完全活化的MoDC。使用ImmunoCult树突细胞培养基(StemCellTechnologies#10987)培养MoDC。在某一测定中，在一个T细胞对一个珠粒的比率下，用共价偶联于抗CD3抗体和抗CD28抗体的Dynabeads(Gibco目录号11132D)活化经纯化CD4+T细胞。
将T细胞预活化24小时以允许在用测试物品处理之前表达CD166。参考图7A，用所指示测试物品(缀合于DM4的西那吉斯同种型抗体(同种型-DM4 ADC)、缀合于DM4的抗人CD166抗体(CD166-DM4 ADC)、或抗人CD166抗体(CD166 mAb))在所指示浓度下处理活化的T细胞72小时。使用CellTiter-Glo发光活力测定(Promega#G7570)测量每种处理的细胞活力。参考图7B，使完全活化的MoDC与所指示浓度的所指示处理剂一起孵育48小时。使用CytoTox-Glo细胞毒性测定(Promega#G92901)测量细胞活力。这些示例性结果证明抗CD166ADC对MoDC与活化的T细胞两者均具有最小细胞毒性活性。仅在高于10nM的剂量下观察到细胞毒性，这类似于缀合于DM4的同种型对照的活性。
这些示例性结果表明抗CD166 ADC对这些免疫细胞具有适度和脱靶细胞毒性活性，而非靶标介导的毒性，尽管在这些细胞上存在各种水平的CD166表达。
实施例6:huCD166 ADC对树突细胞成熟和T细胞刺激的影响
在这个示例性研究中，结果证明抗CD166抗体药物缀合物(huCD166 ADC，SEQ IDNO:12的VH和SEQ ID NO:13的VL)在体外促进树突细胞的成熟。
在这个研究中，使树突细胞与10mM缀合于DM4的抗CD166抗体(CD166-DM4 ADC)或树突细胞成熟混合物(Stem Cell Technology DC成熟试剂盒(#10989))一起培养48小时。还将树突细胞用10mM游离DM4、西那吉斯同种型-DM4 ADC处理，或不处理，作为对照。接着通过流式细胞计量测量树突细胞成熟标志物CD80(2D10抗体，BioLegend)、CD83(HB15e抗体，BioLegend)、HLA-DR(L243抗体，BioLegend)和CD86(IT2.2抗体，BioLegend)来评估MoDC的成熟。
参考图8A，相较于未处理细胞，在抗CD166-DM4 ADC或游离DM4处理的细胞中，CD83和CD86的表达略微增加。这些示例性结果指示DM4可促进树突细胞活化，但程度小于已知会完全诱导树突细胞成熟的细胞因子的成熟混合物。
测定了这些经处理树突细胞对它们的活化T细胞的能力的影响。在这个示例性研究中，接着将用测试物品如上所指示加以处理的MoDC与同种异体CD4+T细胞在树突细胞与T细胞的1:25比率下共培养2天。如通过ELISA所测定，通过测量IL-2产生来评估在48小时之后的T细胞活化。参考图8B，用CD166-DM4 ADC、缀合于DM4的同种型、或游离DM4预处理的MoDC仅略微增加了由同种异体T细胞对IL-2的产生。然而，相较于仅以成熟混合物观察的与仅用成熟混合物处理的树突细胞共培养的T细胞，当用与树突细胞成熟混合物组合的先前药物预处理MoDC时，IL-2产生是显著更高的。
总之，这些示例性数据表明不同于它对CD166+肿瘤细胞的细胞毒性活性，CD166ADC不伤害T细胞和树突细胞，并且可增强T细胞致敏。类似地，这些结果表明活化的可活化抗CD166药物缀合物(抗CD166 AADC)可通过树突细胞的成熟来在体内增强T细胞致敏，并且在不受理论束缚下，将为所观察到的抗CD166 AADC和抗PD-1AA的组合疗法的协同作用提供理论依据。
实施例7:huCD166 AADC诱导细胞系的免疫原性细胞死亡
在这个示例性研究中，结果证明抗CD166抗体药物缀合物(缀合于DM4的huCD166ADC，SEQ ID NO:12的VH和SEQ ID NO:13的VL)在体外诱导免疫原性细胞死亡(ICD)。这些示例性结果显示抗huCD166 ADC可增加癌细胞和CD166表达性细胞中与ICD相关的信号。
免疫原性细胞死亡(ICD)是一种某些细胞毒性药物可以刺激免疫系统的方式诱导肿瘤细胞的凋亡所采用的过程。诸如肿瘤细胞的细胞在用药物缀合物处理时可通过释放细胞危险信号诸如损害相关分子样式(DAMPS)来增加它们的免疫原性潜力。DAMP可转而活化抗原递呈细胞诸如树突细胞，此可引发靶向肿瘤的免疫应答和免疫记忆。
可通过诸如癌细胞的表面上钙网蛋白(calreticulin)的表达以及HMGB1的分泌的标志来度量ICD。在这个示例性研究中，在所指示量的药物存在下，在具有10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640TM培养基中培养源于人恶性黑素瘤的A375细胞(ATCC)48小时。在所指示量的药物存在下，在DME培养基中培养源于人乳腺癌的HCC1806细胞(ATCC)48小时。在所指示量的药物存在下，在具有10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640TM培养基中培养CT26细胞和CT26huCD166细胞(如本文讨论的表达人CD166多肽的CT26细胞)72小时。在孵育之后，使用FITC缀合的钙网蛋白抗体(Novus Bio，克隆1G6A7；#NBP1-47518F)，通过流式细胞计量术检测钙网蛋白表达。通过ELISA(Tecan HMGB1 ELISA试剂盒，#NC9959947)检测HMGB1蛋白。
参考图9A和图9B，在这个示例性研究中，所指示量的游离DM4(图9A)或抗CD166ADC(图9B)显示黑素瘤细胞A375和乳腺癌细胞HCC1806显示钙网蛋白(CRT)的表达增加以及分泌的HMGB1的量增加。参考图9C，在这个示例性研究中，所指示量的游离DM4或CD166ADC还诱导CT26或CT26 huCD166细胞上钙网蛋白(CRT)的表面表达增加。
这些示例性数据表明抗CD166 ADC诱导癌细胞和表达CD166的细胞中的ICD相关信号。这些示例性结果显示抗肿瘤功效可通过ICD发生。
其他实施方案
尽管本发明已与其具体实施方式联合加以描述，但先前描述意图说明而非限制由随附权利要求的范围限定的本发明的范围。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 西托姆克斯治疗公司(CytomX Therapeutics, Inc.)
<120> 可活化免疫检查点抑制剂和经缀合可活化抗体的组合疗法
<130> CYTX-060-PCT
<150> US62/810698
<151> 2019-02-26
<150> US62/825228
<151> 2019-03-28
<160> 117
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Ser Glu Asp Lys His Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Ile Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Gln Ile Asp Tyr Gly Asn Asp Tyr Ala Phe Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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385 390 395 400
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Val Leu Thr Ile Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
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Cys Val Gln Ile Asp Tyr Gly Asn Asp Tyr Ala Phe Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Ser Glu Asp Lys His Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Ile Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Gln Ile Asp Tyr Gly Asn Asp Tyr Ala Phe Thr Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly
1 5
<210> 15
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Leu Cys His Pro Ala Val Leu Ser Ala Trp Glu Ser Cys Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly
20 25 30
Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Ser Asp Ile Val Met
35 40 45
Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser
50 55 60
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr
65 70 75 80
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu
85 90 95
Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
115 120 125
Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro
130 135 140
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
145 150 155 160
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
165 170 175
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
180 185 190
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
195 200 205
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
210 215 220
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
225 230 235 240
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
245 250 255
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
260
<210> 16
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Leu Cys His Pro Ala Val Leu Ser Ala
1 5 10 15
Trp Glu Ser Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala Val
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His
35 40 45
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
50 55 60
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
65 70 75 80
Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
85 90 95
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
100 105 110
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
115 120 125
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
130 135 140
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
165 170 175
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
180 185 190
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
195 200 205
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
210 215 220
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
245 250 255
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
260 265 270
<210> 17
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Leu Cys His Pro Ala Val Leu Ser Ala Trp Glu Ser Cys Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly
20 25 30
Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Ser Asp Ile Val Met
35 40 45
Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser
50 55 60
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr
65 70 75 80
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu
85 90 95
Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
115 120 125
Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro
130 135 140
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
145 150 155
<210> 18
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Leu Cys His Pro Ala Val Leu Ser Ala
1 5 10 15
Trp Glu Ser Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala Val
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His
35 40 45
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
50 55 60
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
65 70 75 80
Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
85 90 95
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
100 105 110
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
115 120 125
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
130 135 140
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ile Lys
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Leu Cys His Pro Ala Val Leu Ser Ala Trp Glu Ser Cys Ser Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp
1 5 10 15
Asn His
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Gly Ser Ser Gly Thr
1 5
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Gly Ser Ser Gly
1
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Gln Gly Gln Ser Gly Gln
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Gln Gly Gln Ser Gly
1 5
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Gln Gly Gln Ser
1
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Gly Gln Ser Gly Gln Gly
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Gln Ser Gly Gln Gly
1 5
<210> 44
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Ser Gly Gln Gly
1
<210> 45
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 45
cagatcaccc tgaaagagtc cggccccacc ctggtgaaac ccacccagac cctgaccctg 60
acatgcacct tctccggctt cagcctgtcc acctacggca tgggcgtggg ctggatcagg 120
cagcctcctg gcaaggccct ggaatggctg gccaacatct ggtggtccga ggacaagcac 180
tactccccca gcctgaagtc ccggctgacc atcaccaagg acacctccaa gaaccaggtg 240
gtgctgacaa tcacaaacgt ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgtgcagatc 300
gactacggca acgactacgc cttcacctac tggggccagg gcacactggt gacagtgtcc 360
tccgcctcca ccaagggccc ctccgtgttc cctctggccc cttccagcaa gtccacctct 420
ggcggcacag ctgccctggg ctgcctggtg aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaact ctggcgccct gaccagcgga gtgcacacct tccctgccgt gctgcagtcc 540
tccggcctgt actccctgtc ctccgtggtg accgtgccct ccagctctct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 660
cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgt cccccctgcc ctgcccctga actgctgggc 720
ggaccttccg tgtttctgtt ccccccaaag cctaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 900
aactccacct accgggtggt gtctgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccccatcga aaagaccatc 1020
tccaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caggtgtaca cactgccccc tagccgggaa 1080
gagatgacca agaatcaggt gtccctgacc tgtctggtga aaggcttcta cccctccgat 1140
atcgccgtgg aatgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggact ccgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgtccct gagccccggc aag 1353
<210> 46
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 46
cagatcaccc tgaaagagtc cggccccacc ctggtgaaac ccacccagac cctgaccctg 60
acatgcacct tctccggctt cagcctgtcc acctacggca tgggcgtggg ctggatcagg 120
cagcctcctg gcaaggccct ggaatggctg gccaacatct ggtggtccga ggacaagcac 180
tactccccca gcctgaagtc ccggctgacc atcaccaagg acacctccaa gaaccaggtg 240
gtgctgacaa tcacaaacgt ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgtgcagatc 300
gactacggca acgactacgc cttcacctac tggggccagg gcacactggt gacagtgtcc 360
tccgcctcca ccaagggccc ctccgtgttc cctctggccc cttccagcaa gtccacctct 420
ggcggcacag ctgccctggg ctgcctggtg aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaact ctggcgccct gaccagcgga gtgcacacct tccctgccgt gctgcagtcc 540
tccggcctgt actccctgtc ctccgtggtg accgtgccct ccagctctct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 660
cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgt cccccctgcc ctgcccctga actgctgggc 720
ggaccttccg tgtttctgtt ccccccaaag cctaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 900
aactccacct accgggtggt gtctgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccccatcga aaagaccatc 1020
tccaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caggtgtaca cactgccccc tagccgggaa 1080
gagatgacca agaatcaggt gtccctgacc tgtctggtga aaggcttcta cccctccgat 1140
atcgccgtgg aatgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggact ccgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgtccct gagccccggc 1350
<210> 47
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 47
cagggacagt ctggccaggg cctgtgtcac cctgctgtgc tgtctgcctg ggagtcctgt 60
tccagcggcg gaggctcctc tggcggctct gctgtgggcc tgctggctcc acctggcggc 120
ctgtccggca gatctgacaa ccacggcggc tccgacatcg tgatgaccca gtcccccctg 180
tccctgcccg tgactcctgg cgagcctgcc tccatctcct gccggtcctc caagtccctg 240
ctgcactcca acggcatcac ctacctgtac tggtatctgc agaagcccgg ccagtcccct 300
cagctgctga tctaccagat gtccaacctg gcctccggcg tgcccgacag attctccggc 360
tctggctccg gcaccgactt caccctgaag atctcccggg tggaagccga ggacgtgggc 420
gtgtactact gcgcccagaa cctggaactg ccctacacct tcggccaggg caccaagctg 480
gaaatcaagc ggaccgtggc cgctccctcc gtgttcatct tcccaccctc cgacgagcag 540
ctgaagtccg gcaccgcctc cgtggtctgc ctgctgaaca acttctaccc ccgcgaggcc 600
aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg cagtccggca actcccagga atccgtcacc 660
gagcaggact ccaaggacag cacctactcc ctgtcctcca ccctgaccct gtccaaggcc 720
gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc gaagtgaccc accagggact gagcagcccc 780
gtgaccaagt ccttcaaccg gggcgagtgc 810
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<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 48
ctgtgtcacc ctgctgtgct gtctgcctgg gagtcctgtt ccagcggcgg aggctcctct 60
ggcggctctg ctgtgggcct gctggctcca cctggcggcc tgtccggcag atctgacaac 120
cacggcggct ccgacatcgt gatgacccag tcccccctgt ccctgcccgt gactcctggc 180
gagcctgcct ccatctcctg ccggtcctcc aagtccctgc tgcactccaa cggcatcacc 240
tacctgtact ggtatctgca gaagcccggc cagtcccctc agctgctgat ctaccagatg 300
tccaacctgg cctccggcgt gcccgacaga ttctccggct ctggctccgg caccgacttc 360
accctgaaga tctcccgggt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cgcccagaac 420
ctggaactgc cctacacctt cggccagggc accaagctgg aaatcaagcg gaccgtggcc 480
gctccctccg tgttcatctt cccaccctcc gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc 540
gtggtctgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 600
aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa tccgtcaccg agcaggactc caaggacagc 660
acctactccc tgtcctccac cctgaccctg tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 720
tacgcctgcg aagtgaccca ccagggactg agcagccccg tgaccaagtc cttcaaccgg 780
ggcgagtgc 789
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 49
cagggacagt ctggccaggg c 21
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Met Glu Ser Lys Gly Ala Ser Ser Cys Arg Leu Leu Phe Cys Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ser Ala Thr Val Phe Arg Pro Gly Leu Gly Trp Tyr Thr Val Asn
20 25 30
Ser Ala Tyr Gly Asp Thr Ile Ile Ile Pro Cys Arg Leu Asp Val Pro
35 40 45
Gln Asn Leu Met Phe Gly Lys Trp Lys Tyr Glu Lys Pro Asp Gly Ser
50 55 60
Pro Val Phe Ile Ala Phe Arg Ser Ser Thr Lys Lys Ser Val Gln Tyr
65 70 75 80
Asp Asp Val Pro Glu Tyr Lys Asp Arg Leu Asn Leu Ser Glu Asn Tyr
85 90 95
Thr Leu Ser Ile Ser Asn Ala Arg Ile Ser Asp Glu Lys Arg Phe Val
100 105 110
Cys Met Leu Val Thr Glu Asp Asn Val Phe Glu Ala Pro Thr Ile Val
115 120 125
Lys Val Phe Lys Gln Pro Ser Lys Pro Glu Ile Val Ser Lys Ala Leu
130 135 140
Phe Leu Glu Thr Glu Gln Leu Lys Lys Leu Gly Asp Cys Ile Ser Glu
145 150 155 160
Asp Ser Tyr Pro Asp Gly Asn Ile Thr Trp Tyr Arg Asn Gly Lys Val
165 170 175
Leu His Pro Leu Glu Gly Ala Val Val Ile Ile Phe Lys Lys Glu Met
180 185 190
Asp Pro Val Thr Gln Leu Tyr Thr Met Thr Ser Thr Leu Glu Tyr Lys
195 200 205
Thr Thr Lys Ala Asp Ile Gln Met Pro Phe Thr Cys Ser Val Thr Tyr
210 215 220
Tyr Gly Pro Ser Gly Gln Lys Thr Ile His Ser Glu Gln Ala Val Phe
225 230 235 240
Asp Ile Tyr Tyr Pro Thr Glu Gln Val Thr Ile Gln Val Leu Pro Pro
245 250 255
Lys Asn Ala Ile Lys Glu Gly Asp Asn Ile Thr Leu Lys Cys Leu Gly
260 265 270
Asn Gly Asn Pro Pro Pro Glu Glu Phe Leu Phe Tyr Leu Pro Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Gly Ile Arg Ser Ser Asn Thr Tyr Thr Leu Met Asp Val Arg
290 295 300
Arg Asn Ala Thr Gly Asp Tyr Lys Cys Ser Leu Ile Asp Lys Lys Ser
305 310 315 320
Met Ile Ala Ser Thr Ala Ile Thr Val His Tyr Leu Asp Leu Ser Leu
325 330 335
Asn Pro Ser Gly Glu Val Thr Arg Gln Ile Gly Asp Ala Leu Pro Val
340 345 350
Ser Cys Thr Ile Ser Ala Ser Arg Asn Ala Thr Val Val Trp Met Lys
355 360 365
Asp Asn Ile Arg Leu Arg Ser Ser Pro Ser Phe Ser Ser Leu His Tyr
370 375 380
Gln Asp Ala Gly Asn Tyr Val Cys Glu Thr Ala Leu Gln Glu Val Glu
385 390 395 400
Gly Leu Lys Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Ile Val Glu Gly Lys Pro
405 410 415
Gln Ile Lys Met Thr Lys Lys Thr Asp Pro Ser Gly Leu Ser Lys Thr
420 425 430
Ile Ile Cys His Val Glu Gly Phe Pro Lys Pro Ala Ile Gln Trp Thr
435 440 445
Ile Thr Gly Ser Gly Ser Val Ile Asn Gln Thr Glu Glu Ser Pro Tyr
450 455 460
Ile Asn Gly Arg Tyr Tyr Ser Lys Ile Ile Ile Ser Pro Glu Glu Asn
465 470 475 480
Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Glu Asn Gln Leu Glu Arg Thr Val Asn
485 490 495
Ser Leu Asn Val Ser Ala Ile Ser Ile Pro Glu His Asp Glu Ala Asp
500 505 510
Glu Ile Ser Asp Glu Asn Arg Glu Lys Val Asn Asp Gln Ala Lys Leu
515 520 525
Ile Val Gly Ile Val Val Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly
530 535 540
Val Val Tyr Trp Leu Tyr Met Lys Lys Ser Lys Thr Ala Ser Lys His
545 550 555 560
Val Asn Lys Asp Leu Gly Asn Met Glu Glu Asn Lys Lys Leu Glu Glu
565 570 575
Asn Asn His Lys Thr Glu Ala
580
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<212> PRT
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<223> 合成的
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Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Met Ser
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
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Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Gly Asn Ala His
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
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Glu Asp Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr
1 5 10
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<220>
<223> 合成的
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Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ala Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
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Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
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<212> PRT
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<223> 合成的
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Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp Thr
1 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Gly Asn Ala His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Asp Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
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<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Gly Asn Ala His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Asp Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 59
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ala Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 60
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Gly Asn Ala His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Asp Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 61
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ala Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Thr Ser Tyr Cys Ser Ile Glu His Tyr
1 5 10 15
Pro Cys Asn Thr His His Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn Pro Gly Gly Gly Ser Asp
35 40 45
Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
50 55 60
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
85 90 95
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg
100 105 110
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
115 120 125
Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Asp
130 135 140
Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
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Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
165 170 175
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
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Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
195 200 205
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
210 215 220
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
225 230 235 240
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
260 265
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<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 63
Thr Ser Tyr Cys Ser Ile Glu His Tyr Pro Cys Asn Thr His His Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg
20 25 30
Ser Asp Asn Pro Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
35 40 45
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
50 55 60
Ala Ser Glu Ser Val Asp Ala Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe
65 70 75 80
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
85 90 95
Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
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Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
165 170 175
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
180 185 190
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
195 200 205
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
225 230 235 240
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
245 250 255
Glu Cys
<210> 64
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Thr Ser Tyr Cys Ser Ile Glu His Tyr
1 5 10 15
Pro Cys Asn Thr His His Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn Pro Gly Gly Gly Ser Asp
35 40 45
Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
50 55 60
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
85 90 95
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg
100 105 110
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
115 120 125
Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Asp
130 135 140
Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
145 150 155
<210> 65
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 65
Thr Ser Tyr Cys Ser Ile Glu His Tyr Pro Cys Asn Thr His His Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg
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Ser Asp Asn Pro Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
50 55 60
Ala Ser Glu Ser Val Asp Ala Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe
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Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
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Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala
115 120 125
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130 135 140
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
145 150
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Thr Ser Tyr Cys Ser Ile Glu His Tyr Pro Cys Asn Thr His His
1 5 10 15
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 67
Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn Pro
1 5 10
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 69
Ser Ser Ile Trp Arg Asn Gly Ile Val Thr Val Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Trp Ser Ala Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 71
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Asp Asn Gly Tyr Pro Ser Thr
1 5
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<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Trp Arg Asn Gly Ile Val Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Ser Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 75
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Trp Arg Asn Gly Ile Val Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Ser Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Gly Tyr Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 77
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Trp Arg Asn Gly Ile Val Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Trp Ser Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Gly Tyr Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 79
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 79
Gln Gly Gln Ser Gly Ser Gly Ile Ala Leu Cys Pro Ser His Phe Cys
1 5 10 15
Gln Leu Pro Gln Thr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
85 90 95
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
115 120 125
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Gly Tyr
130 135 140
Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
165 170 175
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
180 185 190
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
195 200 205
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
210 215 220
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
225 230 235 240
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
245 250 255
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
260
<210> 80
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Gly Ile Ala Leu Cys Pro Ser His Phe Cys Gln Leu Pro Gln Thr Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
35 40 45
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
50 55 60
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Gly Tyr Pro Ser Thr Phe Gly Gly
130 135 140
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
165 170 175
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
180 185 190
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
195 200 205
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
225 230 235 240
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
245 250 255
Glu Cys
<210> 81
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 81
Gln Gly Gln Ser Gly Ser Gly Ile Ala Leu Cys Pro Ser His Phe Cys
1 5 10 15
Gln Leu Pro Gln Thr Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
85 90 95
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
115 120 125
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Gly Tyr
130 135 140
Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
165 170 175
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
180 185 190
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
195 200 205
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
210 215 220
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
225 230 235 240
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
245 250 255
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
260
<210> 82
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Gly Ile Ala Leu Cys Pro Ser His Phe Cys Gln Leu Pro Gln Thr Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
35 40 45
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
50 55 60
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asn Gly Tyr Pro Ser Thr Phe Gly Gly
130 135 140
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
145 150
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 83
Gly Ile Ala Leu Cys Pro Ser His Phe Cys Gln Leu Pro Gln Thr
1 5 10 15
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 84
Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His
1 5 10
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 85
Gln Gly Gln Ser Gly Ser
1 5
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 86
Tyr Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 87
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 87
Gly Gln Ser Gly Gln Gly
1 5
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Gln Ser Gly Gln Gly
1 5
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 89
Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly
1 5
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Pro Arg Phe Arg Ile Ile Gly Gly
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 91
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp
1 5
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Arg Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu
1 5 10
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 93
Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala
1 5 10 15
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg Gly Asp Asp Ala
1 5 10 15
<210> 95
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 95
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 96
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Ile Asp Gly Arg
1
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 97
Gly Gly Ser Ile Asp Gly Arg
1 5
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 99
Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln
1 5
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala
1 5
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 101
Gly Ile Ala Gly Gln
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 103
Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Val Val
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 105
Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Arg
1 5
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 106
Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr
1 5
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 107
Glu Pro Gln Ala Leu Ala Met Ser
1 5
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 108
Gln Ala Leu Ala Met Ser Ala Ile
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 109
Ala Ala Tyr His Leu Val Ser Gln
1 5
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 110
Met Asp Ala Phe Leu Glu Ser Ser
1 5
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 111
Glu Ser Leu Pro Val Val Ala Val
1 5
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 112
Ser Ala Pro Ala Val Glu Ser Glu
1 5
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 113
Asp Val Ala Gln Phe Val Leu Thr
1 5
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 114
Val Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu
1 5
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 115
Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly
1 5
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 116
Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro Gln
1 5
<210> 117
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 117
Ser Gly Gln Gly
1

Claims (179)

1.一种治疗受试者中的癌症，缓和所述癌症的症状，或延迟所述癌症的进展的方法，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用经缀合可活化抗CD166抗体，以及
(b)向所述受试者施用可活化免疫检查点抑制剂，
其中所述经缀合可活化抗CD166抗体包含
(i)可活化抗CD166抗体，所述可活化抗CD166抗体包含特异性结合哺乳动物CD166的抗体或其抗原结合片段(AB1)、当所述可活化抗CD166抗体处于未裂解状态时抑制所述AB1与所述哺乳动物CD166的结合的掩蔽部分(MM1)、以及偶联于所述AB1的可裂解部分(CM1)，其中所述CM1是充当蛋白酶的底物的多肽，和
(ii)缀合于所述可活化抗CD166抗体的毒素或其毒性片段。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述AB1包含VH CDR1氨基酸序列GFSLSTYGMGVG(SEQID NO:1)；VH CDR2氨基酸序列NIWWSEDKH(SEQ ID NO:2)；VH CDR3氨基酸序列IDYGNDYAFTY(SEQ ID NO:3)；VL CDR1氨基酸序列RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:4)或RSSQSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:5)；VL CDR2氨基酸序列QMSNLAS(SEQ ID NO:6)或QMSNRAS(SEQ ID NO:7)；以及VL CDR3氨基酸序列AQNLELPYT(SEQ ID NO:8)。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述免疫检查点选自由以下组成的组：A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4、BTLA(CD272)、CSF-1R、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TDO、TIGIT、TIM-3、SIGLEC7(CD328)和VISTA。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点选自由以下组成的组：CTLA-4、PD-1和PD-L1。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是特异性结合所述免疫检查点的抗体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述可活化免疫检查点抑制剂是可活化抗免疫检查点抗体，所述可活化抗免疫检查点抗体包含：
特异性结合所述免疫检查点的抗体或其抗原结合片段(AB2)、当所述可活化抗免疫检查点抗体处于未裂解状态时抑制所述AB2与所述免疫检查点的结合的掩蔽部分(MM2)、以及偶联于所述AB2的可裂解部分(CM2)，其中所述CM2是充当蛋白酶的底物的多肽。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述MM1是在长度方面是至多40个氨基酸的多肽。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述AB1特异性结合人或食蟹猴CD166。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中MM1多肽序列与所述AB1的任何天然结合配偶体至多50％同一。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述MM1包含氨基酸序列LCHPAVLSAWESCSS(SEQ ID NO:19)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述CM1包含氨基酸序列AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO:20)。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中AB1的所述其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述AB1连接于所述CM1。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述AB1直接连接于所述CM1。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述AB1通过连接肽连接于所述CM1。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述MM1连接于所述CM1，以致处于未裂解状态的所述可活化抗体包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM1-CM1-AB1或AB1-CM1-MM1。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含在所述MM1与所述CM1之间的连接肽。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含在所述CM1与所述AB1之间的连接肽。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于所述未裂解状态的所述可活化抗体具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM1-LP1-CM1-LP2-AB1或AB1-LP2-CM1-LP1-MM1。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述两个连接肽不是彼此相同的。
21.如权利要求19或权利要求20所述的方法，其中LP1和LP2中的每一者是在长度方面是约1至20个氨基酸的肽。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述可活化抗CD166抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的轻链可变区。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述可活化抗CD166抗体包含含有选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和含有选自SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16的氨基酸序列的轻链。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中剂是毒素或其毒性片段。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂是微管抑制剂。
26.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂是核酸损害剂。
27.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂选自由以下组成的组：多拉司他汀或其衍生物、澳瑞他汀或其衍生物、类美登素或其衍生物、倍癌霉素或其衍生物、卡奇霉素或其衍生物、吡咯并苯并二氮
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或其衍生物、以及长春花生物碱或其衍生物。
28.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂是澳瑞他汀E或其衍生物。
29.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
30.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。
31.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂是选自由DM1和DM4组成的组的类美登素。
32.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂是选自由以下组成的组的长春花生物碱：长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春胺醇、长春内日定、长春布宁、长春西汀、长春胺、阿朴长春胺、小长春蔓辛、甲氧基小长春蔓辛、小长春蔓辛宁、长春蔓佛明、脱氧长春胺醇和长春蔓晶。
33.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述剂是倍癌霉素。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述剂通过接头缀合于所述AB1。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述剂缀合于所述AB1所采用的所述接头包含SPDB部分、缬氨酸-瓜氨酸部分、或PEG2-vc部分。
36.如权利要求34或权利要求35所述的方法，其中缀合于AB的所述接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-倍癌霉素部分、或PEG2-vc-MMAD部分。
37.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述接头是可裂解接头。
38.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述接头是非可裂解接头。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中在施用所述可活化免疫检查点抑制剂之前、之后，或与施用所述可活化免疫检查点抑制剂并行施用所述经缀合可活化抗CD166抗体。
40.如权利要求39所述的方法，其中与施用所述可活化免疫检查点抑制剂并行施用所述经缀合可活化抗CD166抗体，其中所述并行施用采用单一组合物或单独组合物。
41.如权利要求40所述的方法，其中在施用所述可活化免疫检查点抑制剂之前约1天施用所述经缀合可活化抗CD166抗体。
42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述经缀合可活化抗CD166抗体的施用和所述可活化免疫检查点抑制剂的施用作为同一给药时程的一部分施用。
43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗CD166抗体以静脉内、腹膜内或肿瘤内方式施用至所述受试者。
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以静脉内、腹膜内或肿瘤内方式施用至所述受试者。
45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中通过输注疗法将所述经缀合可活化抗CD166抗体施用至所述受试者。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中通过输注疗法将所述可活化免疫检查点抑制剂施用至所述受试者。
47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗CD166抗体施用至所述受试者包括诱导所述受试者的靶标组织中的免疫原性细胞死亡。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗CD166抗体施用至所述受试者包括诱导所述受试者中的树突细胞成熟和/或活化。
49.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗CD166抗体以亚治疗剂量施用至所述受试者。
50.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以亚治疗剂量施用至所述受试者。
51.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗CD166抗体和所述可活化免疫检查点抑制剂以亚治疗剂量施用至所述受试者。
52.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗CD166抗体以治疗有效剂量施用至所述受试者。
53.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以治疗有效剂量施用至所述受试者。
54.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂和所述可活化免疫检查点抑制剂以治疗有效剂量施用。
55.如权利要求1至54中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以大于施用所述可活化免疫检查点抑制剂所处的剂量的剂量施用。
56.如权利要求1至54中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以小于施用所述可活化免疫检查点抑制剂所处的剂量的剂量施用。
57.如权利要求1至54中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以与施用所述可活化免疫检查点抑制剂所处的剂量相同的剂量施用。
58.如权利要求1至57中任一项所述的方法，其中经治疗受试者在肿瘤再激发测定中展现记忆T细胞应答。
59.如权利要求1至58中任一项所述的方法，其中来自所述经治疗受试者的CD8+ T细胞在肿瘤再激发测定中展现产生IFN-γ。
60.如权利要求1至59中任一项所述的方法，其中来自所述经治疗受试者的CD4+ T细胞展现产生IFN-γ、IL-2和/或TNF-α。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述CD4+ T细胞来自所述受试者的肿瘤。
62.如权利要求1至61中任一项所述的方法，其中来自所述经治疗受试者的CD8+ T细胞展现产生IFN-γ和/或TNF-α。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述CD8+ T细胞来自所述受试者的肿瘤。
64.如权利要求1至63中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点是哺乳动物PD-1。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述AB2特异性结合人或食蟹猴PD-1。
66.如权利要求64或权利要求65所述的方法，其中所述可活化免疫检查点抑制剂是可活化抗哺乳动物PD-1抗体，所述可活化抗哺乳动物PD-1抗体包含：
特异性结合哺乳动物PD-1的抗体或其抗原结合片段(AB2)、当所述可活化抗哺乳动物PD-1抗体处于未裂解状态时抑制所述AB2与所述哺乳动物PD-1的结合的掩蔽部分(MM2)、以及偶联于所述AB2的可裂解部分(CM2)，其中所述CM2是充当蛋白酶的底物的多肽。
67.如权利要求64至66中任一项所述的方法，其中所述AB2包含VH CDR1氨基酸序列GFTFSGYAMS(SEQ ID NO:51)；包含YISNSGGNAH(SEQ ID NO:52)的VH CDR2序列；包含EDYGTSPFVY(SEQ ID NO:53)的VH CDR3序列；包含RASESVDAYGISFMN(SEQ ID NO:54)的VLCDR1序列；包含AASNQGS(SEQ ID NO:55)的VL CDR2序列；以及包含QQSKDVPWT(SEQ ID NO:56)的VL CDR3序列。
68.如权利要求64至67中任一项所述的方法，其中所述MM2包含氨基酸序列TSYCSIEHYPCNTHH(SEQ ID NO:66)。
69.如权利要求64至68中任一项所述的方法，其中所述可活化免疫检查点抑制剂是可活化抗免疫检查点抗体，所述可活化抗免疫检查点抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的轻链可变区。
70.如权利要求64至69中任一项所述的方法，其中所述可活化免疫检查点抑制剂是可活化抗免疫检查点抗体，所述可活化抗免疫检查点抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的重链、含有氨基酸序列SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63的轻链。
71.如权利要求1至63中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点是哺乳动物PD-L1。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述AB2特异性结合人或食蟹猴PD-L1。
73.如权利要求71或权利要求72所述的方法，其中可活化抗哺乳动物PD-L1抗体包含：
特异性结合哺乳动物PD-L1的抗体或其抗原结合片段(AB2)、当所述可活化哺乳动物PD-1抗体处于未裂解状态时抑制所述AB2与所述哺乳动物PD-L1的结合的掩蔽部分(MM2)、以及偶联于所述AB2的可裂解部分(CM2)，其中所述CM2是充当蛋白酶的底物的多肽。
74.如权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述AB2包含VH CDR1氨基酸序列SYAMS(SEQ ID NO:68)；包含SSIWRNGIVTVYADS(SEQ ID NO:69)的VH CDR2序列；包含WSAAFDY(SEQ ID NO:70)的VH CDR3序列；包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:71)的VL CDR1序列；包含AASSLQS(SEQ ID NO:72)或YASTLQS(SEQ ID NO:86)的VL CDR2序列；以及包含DNGYPST(SEQ ID NO:73)的VL CDR3序列。
75.如权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述MM2包含氨基酸序列GIALCPSHFCQLPQT(SEQ ID NO:83)。
76.如权利要求71至75中任一项所述的方法，其中所述可活化抗免疫检查点抑制剂抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:77的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:81或SEQID NO:82的轻链可变区。
77.如权利要求71至76中任一项所述的方法，其中所述可活化抗检查点抑制剂抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80的轻链。
78.如权利要求64至77中任一项所述的方法，其中所述MM2是在长度方面是至多40个氨基酸的多肽。
79.如权利要求64至78中任一项所述的方法，其中MM2多肽序列与所述AB2的任何天然结合配偶体至多50％同一。
80.如权利要求64至79中任一项所述的方法，其中所述CM2包含氨基酸序列ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO:67)或ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO:85)。
81.如权利要求64至80中任一项所述的方法，其中AB2的所述其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
82.如权利要求64至81中任一项所述的方法，其中所述AB2连接于所述CM2。
83.如权利要求64至82中任一项所述的方法，其中所述AB2直接连接于所述CM2。
84.如权利要求64至83中任一项所述的方法，其中所述AB2通过连接肽连接于所述CM2。
85.如权利要求64至84中任一项所述的方法，其中所述MM2连接于所述CM2，以致处于未裂解状态的所述可活化抗体包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM2-CM2-AB2或AB2-CM2-MM2。
86.如权利要求64至85中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含在所述MM2与所述CM2之间的连接肽。
87.如权利要求64至86中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含在所述CM2与所述AB2之间的连接肽。
88.如权利要求64至87中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含第一连接肽(LP3)和第二连接肽(LP4)，并且其中处于所述未裂解状态的所述可活化抗体具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM2-LP3-CM2-LP4-AB2或AB2-LP3-CM2-LP4-MM2。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述两个连接肽不是彼此相同的。
90.如权利要求88或权利要求89所述的方法，其中LP3和LP4中的每一者是在长度方面是约1至20个氨基酸的肽。
91.如权利要求88至90中任一项所述的方法，其中LP3和LP3选自由SEQ ID NO:21-38以及GGS组成的组。
92.如权利要求91所述的方法，其中LP3是GGGSSGGS(SEQ ID NO:21)，并且LP4是GGGS(SEQ ID NO:36)。
93.如权利要求91所述的方法，其中LP3是GGGSSGGS(SEQ ID NO:21)，并且LP4是GGS。
94.一种治疗受试者中的癌症，缓和所述癌症的症状，或延迟所述癌症的进展的方法，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用可活化抗免疫检查点抗体；以及
(b)向所述受试者施用经缀合可活化抗体，
其中所述可活化抗免疫检查点抗体包括
包含以下的可活化抗体：特异性结合哺乳动物免疫检查点的抗体或其抗原结合片段(AB2)、当所述可活化抗免疫检查点抗体处于未裂解状态时抑制所述AB2与所述哺乳动物免疫检查点抑制剂的结合的掩蔽部分(MM2)、以及偶联于所述AB2的可裂解部分(CM2)，其中所述CM2是充当蛋白酶的底物的多肽，并且
其中所述免疫检查点是哺乳动物PD-L1或哺乳动物PD-1。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述AB2特异性结合人或食蟹猴PD-1。
96.如权利要求94或权利要求95所述的方法，
其中所述AB2包含VH CDR1氨基酸序列GFTFSGYAMS(SEQ ID NO:51)；包含YISNSGGNAH(SEQ ID NO:52)的VH CDR2序列；包含EDYGTSPFVY(SEQ ID NO:53)的VH CDR3序列；包含RASESVDAYGISFMN(SEQ ID NO:54)的VL CDR1序列；包含AASNQGS(SEQ ID NO:55)的VL CDR2序列；以及包含QQSKDVPWT(SEQ ID NO:56)的VL CDR3序列。
97.如权利要求94至96中任一项所述的方法，其中所述MM2包含氨基酸序列TSYCSIEHYPCNTHH(SEQ ID NO:66)。
98.如权利要求94至97中任一项所述的方法，其中所述CM2包含氨基酸序列ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO:67)或ISSGLLSGRSDNH(SEQ ID NO:85)。
99.如权利要求94至98中任一项所述的方法，其中所述可活化抗检查点抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:60的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65的轻链可变区。
100.如权利要求94至99中任一项所述的方法，其中所述可活化抗检查点抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58的重链、含有氨基酸序列SEQ ID NO:62或SEQ IDNO:63的轻链。
101.如权利要求94所述的方法，其中所述AB2特异性结合人或食蟹猴PD-L1。
102.如权利要求101所述的方法，
其中所述AB2包含VH CDR1氨基酸序列SYAMS(SEQ ID NO:68)；包含SSIWRNGIVTVYADS(SEQ ID NO:69)的VH CDR2序列；包含WSAAFDY(SEQ ID NO:70)的VH CDR3序列；包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:71)的VL CDR1序列；包含AASSLQS(SEQ ID NO:72)或YASTLQS(SEQID NO:86)的VL CDR2序列；以及包含DNGYPST(SEQ ID NO:73)的VL CDR3序列。
103.如权利要求100或权利要求101所述的方法，其中所述MM2包含氨基酸序列GIALCPSHFCQLPQT(SEQ ID NO:83)。
104.如权利要求100至103中任一项所述的方法，其中所述可活化抗检查点抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:77的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的轻链可变区。
105.如权利要求100至104中任一项所述的方法，其中所述可活化抗检查点抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:79或SEQID NO:80的轻链。
106.如权利要求94至105中任一项所述的方法，其中所述经缀合可活化抗体包含：
(i)可活化抗体，所述可活化抗体包含特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB1)、当所述可活化抗体处于未裂解状态时抑制所述AB1与所述靶标的结合的掩蔽部分(MM1)、以及偶联于所述AB1的可裂解部分(CM1)，其中所述CM1是充当蛋白酶的底物的多肽，和
(ii)缀合于所述可活化抗体的毒素或其毒性片段。
107.如权利要求106所述的方法，其中AB1特异性结合见于肿瘤细胞上的抗原。
108.如权利要求106或权利要求107所述的方法，其中AB1特异性结合见于树突细胞上的抗原。
109.如权利要求106至108中任一项所述的方法，其中AB1特异性结合哺乳动物CD166。
110.如权利要求109所述的方法，其中AB1特异性结合人或食蟹猴CD166。
111.如权利要求94至110中任一项所述的方法，其中所述MM2是在长度方面是至多40个氨基酸的多肽。
112.如权利要求94至111中任一项所述的方法，其中MM2多肽序列与所述AB2的任何天然结合配偶体至多50％同一。
113.如权利要求94至112中任一项所述的方法，其中AB2的所述其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
114.如权利要求94至113中任一项所述的方法，其中所述AB2连接于所述CM2。
115.如权利要求94至114中任一项所述的方法，其中所述AB2直接连接于所述CM2。
116.如权利要求94至115中任一项所述的方法，其中所述AB2通过连接肽连接于所述CM2。
117.如权利要求94至116中任一项所述的方法，其中所述MM2连接于所述CM2，以致处于未裂解状态的所述可活化抗体包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM2-CM2-AB2或AB2-CM2-MM2。
118.如权利要求94至117中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含在所述MM2与所述CM2之间的连接肽。
119.如权利要求94至118中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含在所述CM2与所述AB2之间的连接肽。
120.如权利要求94至119中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含第一连接肽(LP3)和第二连接肽(LP4)，并且其中处于所述未裂解状态的所述可活化抗体具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM2-LP3-CM2-LP4-AB2或AB2-LP4-CM2-LP3-MM2。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述两个连接肽不是彼此相同的。
122.如权利要求120或权利要求121所述的方法，其中LP3和LP4中的每一者是在长度方面是约1至20个氨基酸的肽。
123.如权利要求94至122中任一项所述的方法，其中所述MM1是在长度方面是至多40个氨基酸的多肽。
124.如权利要求94至123中任一项所述的方法，其中所述AB1特异性结合人或食蟹猴CD166。
125.如权利要求94至124中任一项所述的方法，其中MM1多肽序列与所述AB1的任何天然结合配偶体至多50％同一。
126.如权利要求94至125中任一项所述的方法，其中所述靶标是人或食蟹猴CD166，并且其中所述MM1包含氨基酸序列LCHPAVLSAWESCSS(SEQ ID NO:19)。
127.如权利要求94至126中任一项所述的方法，其中所述CM1包含氨基酸序列AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO:20)。
128.如权利要求94至127中任一项所述的方法，其中AB1的所述其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
129.如权利要求94至128中任一项所述的方法，其中所述AB1连接于所述CM1。
130.如权利要求94至129中任一项所述的方法，其中所述AB1直接连接于所述CM1。
131.如权利要求94至130中任一项所述的方法，其中所述AB1通过连接肽连接于所述CM1。
132.如权利要求94至131中任一项所述的方法，其中所述MM1连接于所述CM1，以致处于未裂解状态的所述可活化抗体包含如下从N末端至C末端的结构排列：MM1-CM1-AB1或AB1-CM1-MM1。
133.如权利要求94至132中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含在所述MM1与所述CM1之间的连接肽。
134.如权利要求94至133中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含在所述CM1与所述AB1之间的连接肽。
135.如权利要求94至134中任一项所述的方法，其中所述可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，并且其中处于所述未裂解状态的所述可活化抗体具有如下从N末端至C末端的结构排列：MM1-LP1-CM1-LP2-AB1或AB1-LP2-CM1-LP1-MM1。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述两个连接肽不是彼此相同的。
137.如权利要求135或权利要求136所述的方法，其中LP1和LP2中的每一者是在长度方面是约1至20个氨基酸的肽。
138.如权利要求94至137中任一项所述的方法，其中所述靶标是人或食蟹猴CD166，并且其中可活化抗CD166抗体包含VH CDR1氨基酸序列GFSLSTYGMGVG(SEQ ID NO:1)；VH CDR2氨基酸序列NIWWSEDKH(SEQ ID NO:2)；VH CDR3氨基酸序列IDYGNDYAFTY(SEQ ID NO:3)；VLCDR1氨基酸序列RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:4)或RSSQSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO:5)；VLCDR2氨基酸序列QMSNLAS(SEQ ID NO:6)或QMSNRAS(SEQ ID NO:7)；以及VL CDR3氨基酸序列AQNLELPYT(SEQ ID NO:8)。
139.如权利要求94至138中任一项所述的方法，其中所述靶标是人或食蟹猴CD166，并且
其中所述可活化抗CD166抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的轻链可变区；或
其中所述可活化抗CD166抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的轻链。
140.如权利要求94至139中任一项所述的方法，其中剂是毒素或其毒性片段。
141.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂是微管抑制剂。
142.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂是核酸损害剂。
143.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂选自由以下组成的组：多拉司他汀或其衍生物、澳瑞他汀或其衍生物、类美登素或其衍生物、倍癌霉素或其衍生物、卡奇霉素或其衍生物、吡咯并苯并二氮
Figure FDA0003297387630000201
或其衍生物、以及长春花生物碱或其衍生物。
144.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂是澳瑞他汀E或其衍生物。
145.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
146.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂是单甲基澳瑞他汀D(MMAD)。
147.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂是选自由DM1和DM4组成的组的类美登素。
148.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂是选自由以下组成的组的长春花生物碱：长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春胺醇、长春内日定、长春布宁、长春西汀、长春胺、阿朴长春胺、小长春蔓辛、甲氧基小长春蔓辛、小长春蔓辛宁、长春蔓佛明、脱氧长春胺醇和长春蔓晶。
149.如权利要求94至140中任一项所述的方法，其中所述剂是倍癌霉素。
150.如权利要求94至149中任一项所述的方法，其中所述剂通过接头缀合于所述AB1。
151.如权利要求149所述的方法，其中所述剂缀合于所述AB1所采用的所述接头包含SPDB部分、缬氨酸-瓜氨酸部分、或PEG2-vc部分。
152.如权利要求150或权利要求151所述的方法，其中缀合于AB的所述接头和毒素包含SPDB-DM4部分、vc-MMAD部分、vc-MMAE部分、vc-倍癌霉素部分、或PEG2-vc-MMAD部分。
153.如权利要求150至152中任一项所述的方法，其中所述接头是可裂解接头。
154.如权利要求150至152中任一项所述的方法，其中所述接头是非可裂解接头。
155.如权利要求94至154中任一项所述的方法，其中在施用所述可活化抗免疫检查点抑制剂抗体之前、之后，或与施用所述可活化抗免疫检查点抑制剂抗体并行施用所述经缀合可活化抗体。
156.如权利要求155所述的方法，其中与施用所述可活化抗免疫检查点抑制剂抗体并行施用所述经缀合可活化抗体，其中所述并行施用采用单一组合物或单独组合物。
157.如权利要求156所述的方法，其中在施用所述可活化抗免疫检查点抑制剂抗体之前约1天施用所述经缀合可活化抗体。
158.如权利要求94至157中任一项所述的方法，其中所述经缀合可活化抗体的施用和所述可活化抗免疫检查点抑制剂抗体的施用作为同一给药时程的一部分施用。
159.如权利要求94至158中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗体以静脉内、腹膜内或肿瘤内方式施用至所述受试者。
160.如权利要求94至159中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以静脉内、腹膜内或肿瘤内方式施用至所述受试者。
161.如权利要求94至160中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗体以静脉内、腹膜内或肿瘤内方式施用至所述受试者。
162.如权利要求94至161中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以静脉内、腹膜内或肿瘤内方式施用至所述受试者。
163.如权利要求94至162中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗体施用至所述受试者包括诱导所述受试者的靶标组织中的免疫原性细胞死亡。
164.如权利要求94至163中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗体施用至所述受试者包括诱导所述受试者中的树突细胞成熟和/或活化。
165.如权利要求94至163中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗体以亚治疗剂量施用至所述受试者。
166.如权利要求94至163中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以亚治疗剂量施用至所述受试者。
167.如权利要求94至163中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗体和所述可活化免疫检查点抑制剂以亚治疗剂量施用至所述受试者。
168.如权利要求94至163中任一项所述的方法，其中将所述经缀合可活化抗体以治疗有效剂量施用至所述受试者。
169.如权利要求94至163中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以治疗有效剂量施用至所述受试者。
170.如权利要求94至163中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂和所述可活化免疫检查点抑制剂以治疗有效剂量施用。
171.如权利要求94至170中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以大于施用所述可活化免疫检查点抑制剂所处的剂量的剂量施用。
172.如权利要求94至171中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以小于施用所述可活化免疫检查点抑制剂所处的剂量的剂量施用。
173.如权利要求94至172中任一项所述的方法，其中将所述可活化免疫检查点抑制剂以与施用所述可活化免疫检查点抑制剂所处的剂量相同的剂量施用。
174.如权利要求94至173中任一项所述的方法，其中经治疗受试者在肿瘤再激发测定中展现记忆T细胞应答。
175.如权利要求94至174中任一项所述的方法，其中来自所述经治疗受试者的CD8+ T细胞在肿瘤再激发测定中展现产生IFN-γ。
176.如权利要求94至175中任一项所述的方法，其中来自所述经治疗受试者的CD4+ T细胞展现产生IFN-γ、IL-2和/或TNF-α。
177.如权利要求176所述的方法，其中所述CD4+ T细胞来自所述受试者的肿瘤。
178.如权利要求94至177中任一项所述的方法，其中来自所述经治疗受试者的CD8+ T细胞展现产生IFN-γ和/或TNF-α。
179.如权利要求178所述的方法，其中所述CD8+ T细胞来自所述受试者的肿瘤。
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