CN117624361A - 抗meEGFR抗体、其抗原结合片段及其用途 - Google Patents

抗meEGFR抗体、其抗原结合片段及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种抗meEGFR抗体或其抗原结合片段、检测套组、检测meEGFR阳性癌症的方法、治疗癌症的医药组合物、meEGFR特异性嵌合抗原受体、编码meEGFR特异性嵌合抗原受体的核酸、meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞、先天细胞衔接体及抗体偶联物。抗meEGFR抗体或其抗原结合片段与甲基化表皮生长因子受体(meEGFR)专一性结合，且所述meEGFR于R198和R200位点带有不对称二甲基化修饰，因此抗meEGFR抗体或其抗原结合片段可做为检测套组，用以检测meEGFR阳性癌症，并可应用于治疗meEGFR阳性癌症。

Description

抗meEGFR抗体、其抗原结合片段及其用途
技术领域
本发明是有关于一种抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体或其抗原结合片段及其用途，特别是一种抗甲基化表皮生长因子受体(meEGFR)抗体或其抗原结合片段及其用途。
背景技术
癌症又名为恶性肿瘤，为细胞不正常增生，且这些增生的细胞可能侵犯身体的其他部分，为控制细胞分裂增殖机制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不断增加的趋势，且癌症已连续二十七年为居十大死因的榜首。癌症治疗主要以放射治疗、化学治疗、标靶治疗与手术为主。尽管近年药物与手术技术的进步，晚期患者五年存活率仍然相当低，显示开发新治疗策略的重要性。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为一类受体型酪胺酸激酶，在多种癌症类型中可观察到EGFR的突变或过度表达，其与肿瘤增殖、血管新生、肿瘤转移等相关。目前已被开发并应用于临床的EGFR靶向疗法，包含如吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)的EGFR-酪胺酸激酶抑制剂(tyrosine kinaseinhibitor,TKI)，以及如西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的单株抗体。在三阴性乳癌(triple negative breast cancer,TNBC)肿瘤中EGFR的过度表达率高达70％，远高于其他乳癌分子亚型。EGFR的高表达量还与TNBC较差的无恶化存活期和整体存活期有显著地相关性，因此，EGFR为TNBC和晚期乳癌的潜在性治疗靶点。
针对EGFR目前已有多种EGFR-TKI获批，但继发的耐药性突变是治疗过程中非常重要的问题。前3代TKI均靶向胞内ATP结合位点，通过阻断EGFR磷酸化来抑制其活性。但迄今为止，许多评估EGFR靶向药物治疗TNBC患者效果的临床试验，未能显示或证实其治疗益处，因此需要开发新的治疗策略来替代传统的EGFR靶向药物。转译后修饰是调控蛋白质生理功能的重要机转，然而，目前的临床治疗与市场上尚未有靶向特定蛋白转译后修饰的抗体药物，而靶向EGFR其他转译后修饰途径为改进对EGFR-TKI耐药性的潜在开发方向。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在提供一种抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其对甲基化表皮生长因子受体(methylated epidermal growth factor receptor,meEGFR)具有高度专一性和高亲和力，可做为理想的meEGFR阳性癌症的临床检测工具，借此，包含本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的检测套组，以及利用本发明的检测套组的检测meEGFR阳性癌症的方法，可做为后续医疗决策的辅助。此外，通过本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段具备对meEGFR的高度专一性和潜在毒性低的特点，可以抗meEGFR抗体或其抗原结合片段基础，做为治疗癌症的医药组合物、meEGFR特异性嵌合抗原受体、编码meEGFR特异性嵌合抗原受体的核酸、meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞、先天细胞衔接体及抗体偶联物，应用于治疗meEGFR阳性癌症，以突破目前临床上治疗meEGFR阳性癌症的困境。
本发明的一态样是在提供一种抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其与甲基化表皮生长因子受体(methylated epidermal growth factor receptor,meEGFR)专一性结合，且meEGFR于R198和R200位点带有不对称二甲基化修饰。所述抗meEGFR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)及重链互补决定区3(HCDR3)，VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)及轻链互补决定区3(LCDR3)。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3的序列选自由以下组成的群组：SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2、SEQ ID NO:9的HCDR3、SEQ ID NO:10的LCDR1、SEQ ID NO:11的LCDR2及SEQ ID NO:12的LCDR3；SEQ ID NO:13的HCDR1、SEQ ID NO:14的HCDR2、SEQ ID NO:15的HCDR3、SEQ ID NO:16的LCDR1、SEQ IDNO:17的LCDR2及SEQ ID NO:18的LCDR3；及SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2、SEQ ID NO:21的HCDR3、SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23所示的LCDR2及SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
依据前述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其中VH和VL的序列可选自由以下组成的群组：包含SEQ ID NO:1的VH和包含SEQ ID NO:2的VL；包含SEQ ID NO:3的VH和包含SEQID NO:4的VL；以及包含SEQ ID NO:5的VH和包含SEQ ID NO:6的VL。
依据前述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其中抗meEGFR抗体或其抗原结合片段可选自由单域抗体、人源化抗体、多聚体抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab’片段及F(ab’)2片段组成的群组。
本发明的另一态样是在提供一种检测套组，用以检测meEGFR阳性癌症，所述检测套组包含如前段所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段。
依据前述的检测套组，其中所述抗meEGFR抗体或其抗原结合片段可与标记物结合，标记物可为荧光标记物、化学发光标记物、放射线同位素标记物、酶标记物、生物素标记物或其组合。
本发明的又一态样是在提供一种检测meEGFR阳性癌症的方法，包含以下步骤：提供待测样本、提供如前段所述的检测套组、进行结合步骤和进行检测步骤。结合步骤为将待测样本与抗meEGFR抗体或其抗原结合片段接触并进行结合反应，检测步骤为检测待测样本是否有抗体癌细胞复合体。
依据前述的检测meEGFR阳性癌症的方法，其中所述meEGFR阳性癌症可为乳癌、大肠直肠癌、前列腺癌、肺癌或胰腺癌。
本发明的再一态样是在提供一种治疗癌症的医药组合物，包含如前段所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段和医药上可接受载剂。
依据前述的治疗癌症的医药组合物，可还包含化学治疗剂、免疫调节剂、靶向治疗药物、抗体药物或其组合，其中所述抗体药物与抗meEGFR抗体或其抗原结合片段不同。
本发明的又一态样是在提供一种meEGFR特异性嵌合抗原受体，包含胞外域和细胞内信息传递域。所述胞外域用以辨识甲基化表皮生长因子受体(methylated epidermalgrowth factor receptor,meEGFR)，且meEGFR于R198和R200位点带有不对称二甲基化修饰，所述胞外域包含如前段所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段。
依据前述的meEGFR特异性嵌合抗原受体，可还包含跨膜域，其连接胞外域和细胞内信息传递域。
依据前述的meEGFR特异性嵌合抗原受体，其中所述细胞内信息传递域可包含共刺激域和初级信息传递域。
本发明的再一态样是在提供一种核酸，其编码如前段所述的meEGFR特异性嵌合抗原受体。
本发明的又一态样是在提供一种meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞，包含免疫细胞和如前段所述的核酸，所述meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞为将核酸转染至免疫细胞而得到。
依据前述的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞，其中免疫细胞可为T细胞或自然杀手细胞。
本发明的再一态样是在提供一种治疗癌症的医药组合物，包含如前段所述的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞和医药上可接受载剂。
本发明的又一态样是在提供一种先天细胞衔接体，包含meEGFR抗原辨识域和至少一免疫细胞受体结合域，meEGFR抗原辨识域包含如前段所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，至少一免疫细胞受体结合域对CD3、CD8、CD16、CD19或NKG2D中的一或多者具有结合专一性。
依据前述的先天细胞衔接体，其中先天细胞衔接体可为双特异性T细胞衔接体、三特异性T细胞衔接体或多特异性T细胞衔接体。
依据前述的先天细胞衔接体，其中先天细胞衔接体可为双特异性自然杀手细胞衔接体、三特异性自然杀手细胞衔接体或多特异性自然杀手细胞衔接体。
本发明的再一态样是在提供一种抗体偶联物，包含如前段所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段和效应分子，效应分子通过化学键或连接符偶联至抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其中效应分子为毒素、生长抑制剂、毒性蛋白质、放射性核素、放射性同位素、化学治疗药物或其组合。
上述发明内容旨在提供本发明内容的简化摘要，以使阅读者对本发明内容具备基本的理解。此发明内容并非本发明内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图的说明如下：
图1绘示筛选本发明的一态样的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的噬菌体展示技术示意图；
图2A和图2B为本发明的一态样的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果图；
图3A、图3B和图3C为本发明的一实施方式的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段与标靶胜肽的结合亲和力分析结果图；
图4为本发明的另一态样的检测meEGFR阳性癌症的方法的步骤流程图；
图5A和图5B为本发明的又一态样的检测套组的结合专一性分析结果图；
图6A、图6B和图6C为乳癌患者的meEGFR表达的分析结果图；
图6D为meEGFR阳性和meEGFR阴性的乳癌患者的整体存活期的分析结果图；
图6E为meEGFR阳性和meEGFR阴性的乳癌患者的无疾病存活期的分析结果图；
图7A、图7B、图7C、图7D、图7E和图7F为本发明的又一态样的一实施方式的治疗癌症的医药组合物诱导肿瘤细胞死亡的分析结果图；
图8A和图8B为本发明的又一态样的另一实施方式的治疗癌症的医药组合物诱导肿瘤细胞死亡的分析结果图；
图9绘示本发明的再一态样的meEGFR特异性嵌合抗原受体的理论结构示意图；
图10A和图10B为本发明的又一态样的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞对肿瘤细胞特异性裂解的分析结果图；
图11A和图11B为本发明的再一态样的一实施例的抗体偶联物被肿瘤细胞内化的分析结果图；以及
图12为本发明的再一态样的另一实施例的抗体偶联物诱导肿瘤细胞死亡的分析结果图。
其中，附图标记：
100:检测meEGFR阳性癌症的方法
110,120,130,140:步骤
200:meEGFR特异性嵌合抗原受体
210:胞外域
220:跨膜域
230:细胞内信息传递域
231:共刺激域
232:初级信息传递域
具体实施方式
除非另有说明，本说明书中所使用的所有专门术语、符号或其他科学名词或术语具有本发明所属领域中熟谙此技艺者习知的含意，除非使用它们的上下文另有说明。在某些情况下，具有习知含意的术语在本文中界定以达到明确及/或实时参考的目的，且本说明书中所纳入的这些定义应被解释为不一定与该领域中习知的意义有实质差异。本文中所叙述或引用的许多技术与程序均为大众所习知且时常为本领域中的技术人员以常规方法使用。在适当情况下，除非另有说明，市售套组和试剂的使用程序一般均根据制造商界定的使用说明及/或参数来进行。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的胞外结构区域中2个特定精胺酸(R198和R200)位点可被蛋白精胺酸甲基转移酶1(Protein argininemethyltransferase 1,PRMT1)甲基化修饰，本说明书中所述的「甲基化表皮生长因子受体(meEGFR)」为于胞外结构区域的R198和R200位点带有不对称二甲基化修饰的EGFR，R198和R200的不对称甲基化修饰会导致meEGFR持续激活，因此加速癌细胞增生和对各种EGFR抑制剂产生耐药性，例如有些癌症患者使用FDA批准的抗EGFR抗体-西妥昔单抗(Cetuximab)进行治疗的临床试验失败，并在这些癌症患者产生对西妥昔单抗的耐药性。
本说明书中所述的「抗体」是指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的胺基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区的胺基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段包含「功能性部分」，功能性部分是指的是与抗体在性质上具有至少一个共享特征的部分，数量不一定相同。功能性部分能够与相同抗原结合，尽管程度可能不同。功能性部分通常包含至少一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。在某些情况下，功能性部分只包含一个VH。
本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段为人源抗体(human antibody)，其中VH可进一步包含CH，所述的CH包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。VL可进一步包含轻链恒定区(CL)，所述的CL包含人源的κ、λ链或其变体。
本发明的抗meEGFR抗体可包含鼠源抗体(murine antibody)、嵌合抗体(chimericantibody)、人源化抗体(humanized antibody)，较佳地为人源化抗体。
技术用语「鼠源抗体」在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人meEGFR具专一性的单株抗体。制备时用meEGFR作为抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个较佳的实施方案中，所述的鼠源抗meEGFR抗体，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的CL，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的CH。
技术用语「嵌合抗体」，是将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源抗体诱发的免疫反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源特异性单株抗体的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中选殖可变区基因，再根据需要选殖人源抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人源恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个较佳的实施方案中，所述的嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的CL。所述的嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的CH。人源抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的CH，较佳地包含人源IgG2或IgG4的CH。
技术用语「人源化抗体」，亦称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将小鼠的互补决定区(complementary determining region,CDR)序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导强烈的免疫反应。此类构架序列可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免人源化抗体免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人源化抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包含进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。
技术用语「多聚体抗体(polymeric antibody)」是指包含两个以上基本单元的抗meEGFR抗体的抗体，其可为二聚体、三聚体或四聚体。
本发明中所述的「抗原结合片段」，指具有抗原结合活性的Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段，以及可与meEGFR结合的可变片段(fragment variable,Fv)、单链可变片段(single-chain variable fragment,scFv)；其包含本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的选自SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:24的一个或多个CDR。
技术用语「Fab片段」是指由一条轻链及一条重链的CH1及可变区组成。Fab片段的重链不能与另一个重链分子形成双硫键。
技术用语「Fab’片段」是指含有一条轻链及包含VH结构域及CH1结构域以及CH1结构域及CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间双硫键以形成F(ab’)2片段。
技术用语「F(ab’)2片段」是指含有两条轻链及两条重链，其中两条重链包含CH1结构域及CH2结构域之间的恒定区的部分，由此在两条重链间形成链间双硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链间的双硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
技术用语「可变片段(Fv)」是指包含抗体的VH和VL，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接符将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链可变片段(scFv)或单链Fv(sFv)。
技术用语「单域抗体(singledomain antibody,sdAb)」是指缺失抗体轻链而只有VH的一类抗体。因为完整抗体包含两条免疫球蛋白轻链和两条重链，完整抗体的分子量大约150-160kDa。相比之下单域抗体的分子量大约只有12-15kDa，因单域抗体的分子量小，也被称为纳米抗体(nanobody)。单域抗体虽然结构简单，但仍然可以达到与完整抗体相当甚至更高的特异抗原结合亲和力。
术语用语「与meEGFR结合」，指能与人meEGFR相互作用，另术语用语「抗原结合位点」指抗原上不连续的，由本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段识别的三维空间位点。
本说明书中所述「医药组合物」表示含有一种或多种本文所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段与医药上可接受载剂的混合物，所述医药上可接受载剂例如生理学/可药用的载体和赋形剂。医药组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
兹以下列具体试验例进一步示范说明本发明，用以有利于本发明所属技术领域公知常识者，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些试验例视为对本发明范围的限制，但用于说明如何实施本发明的材料及方法。
一、抗meEGFR抗体或其抗原结合片段
本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段与meEGFR专一性结合，且所述meEGFR于R198和R200位点带有不对称二甲基化修饰。所述抗meEGFR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)及重链互补决定区3(HCDR3)，VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)及轻链互补决定区3(LCDR3)。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3的序列选自由以下组成的群组：SEQ ID NO:7的HCDR1、SEQ ID NO:8的HCDR2、SEQ ID NO:9的HCDR3、SEQ ID NO:10的LCDR1、SEQ ID NO:11的LCDR2及SEQ ID NO:12的LCDR3；SEQ ID NO:13的HCDR1、SEQ ID NO:14的HCDR2、SEQ ID NO:15的HCDR3、SEQ ID NO:16的LCDR1、SEQ ID NO:17的LCDR2及SEQ ID NO:18的LCDR3；以及SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2、SEQ ID NO:21的HCDR3、SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23所示的LCDR2及SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
进一步地，本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其中VH和VL的序列可选自由以下组成的群组：包含SEQ ID NO:1的VH和包含SEQ ID NO:2的VL；包含SEQ ID NO:3的VH和包含SEQ ID NO:4的VL；以及包含SEQ ID NO:5的VH和包含SEQ ID NO:6的VL。
本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段可选自由单域抗体、人源化抗体、多聚体抗体、单链可变片段、Fab片段、Fab’片段及F(ab’)2片段组成的群组。此外，本发明的抗meEGFR抗体可为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE同型抗体。
请参考图1，其绘示筛选本发明的一态样的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的噬菌体展示技术示意图。如图1所示，试验上利用人类IgG库衍生的噬菌体展示技术，通过以R198/R200不对称二甲基化胜肽(以下简称「标靶胜肽」)逐步筛选，共分离出3个对meEGFR具有专一性的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段(以下分别以「实施例1」、「实施例2」、和「实施例3」简称)，实施例1-3的VH和VL的序列如表一所示，而实施例1-3的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的序列如表二所示。
表一、实施例1-3的VH和VL的序列
表二、实施例1-3的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3的序列
请参照图2A和图2B为实施例1-3的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果图，其中『M』为蛋白质分子量标记，图左所示的数字为相对应的分子量大小，泳道(lane)1-3分别为实施例1-3的结果，图2A为实施例1-3的VH和VL的还原SDS-PAGE结果，图2B为实施例1-3的非还原SDS-PAGE结果。
为进一步验证实施例1-3对于meEGFR的亲和力，试验上通过ELISA分析进一步测试实施例1-3与标靶胜肽和多个不同的对照胜肽的结合亲和力。标靶胜肽和对照胜肽1-5的序列和甲基化修饰位置如表三所示，其中标靶胜肽在R198和R200位点有不对称二甲基化修饰，对照胜肽1不具有甲基化修饰，对照胜肽2在R198位点有单甲基化修饰，对照胜肽3在R200位点有单甲基化修饰，对照胜肽4在R198位点有对称二甲基化修饰，对照胜肽5在R200位点有对称二甲基化修饰。
表三、标靶胜肽和对照胜肽的序列
请参照图3A至图3C和表四，图3A为实施例1与标靶胜肽的结合亲和力分析结果图，图3B为实施例2与标靶胜肽的结合亲和力分析结果图，图3C为实施例3与标靶胜肽的结合亲和力分析结果图，表四为实施例1-3与标靶胜肽的专一性和亲和力分析结果。
表四、实施例1-3与标靶胜肽的专一性和亲和力分析结果
结果显示，实施例1、实施例2和实施例3对于标靶胜肽皆具有高专一性，而对于对照胜肽4(于R198有对称二甲基化修饰)和对照胜肽5(于R200有对称二甲基化修饰)则为极低专一性、低专一性或中等专一性，且实施例1、实施例2和实施例3对于标靶胜肽的EC50分别为1.712nM、0.03589nM和0.02582nM，显示实施例1、实施例2和实施例3对于meEGFR具有高专一性和高亲和力。而因实施例1具有最佳的专一性，因此后续选择实施例1进行试验。
二、检测套组及检测meEGFR阳性癌症的方法
本发明的检测套组用以检测meEGFR阳性癌症，所述检测套组包含如前段所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段。其中抗meEGFR抗体或其抗原结合片段可与标记物结合，所述标记物是指可与本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段共价结合，或以物理吸附在本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段上，并可借以检测抗meEGFR抗体或其抗原结合片段存在的物质。标记物可为荧光标记物、化学发光标记物、放射线同位素标记物、酶标记物、生物素标记物或其组合。进一步地说，荧光标记物包含但不限于FAM、JOE或VIC等荧光基团。化学发光标记物包含但不限于电化学发光化合物或化学发光化合物，例如：发光胺(luminol)、异发光胺(isoluminol)或吖锭盐(acridinium salts)。放射线同位素标记物包含但不限于3H、14C、32P、35S、125(131)I、75Se。酶标记物包含但不限于具有可检测性产物的酶，例如：荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶以及类似物。
因本发明的检测套组包含抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其可被应用于检测meEGFR阳性癌症，所述的meEGFR阳性癌症可为乳癌、大肠直肠癌、前列腺癌、肺癌或胰腺癌。请参照图4，为本发明的另一态样的检测meEGFR阳性癌症的方法100的步骤流程图，检测meEGFR阳性癌症的方法100包含步骤110、步骤120、步骤130和步骤140。
步骤110是提供待测样本，自受试者取得待测样本，其中待测样本可以为冷冻组织切片、组织蜡块切片或组织微数组。
步骤120是提供本发明的检测套组，检测套组中包含抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其中抗meEGFR抗体或其抗原结合片段可与标记物结合，所述标记物可为荧光标记物、化学发光标记物、放射线同位素标记物、酶标记物、生物素标记物或其组合。
步骤130是进行结合步骤，将待测样本与抗meEGFR抗体或其抗原结合片段接触并进行结合反应。
步骤140是进行检测步骤，检测待测样本是否有一抗体癌细胞复合体。当待测样本中具有抗体癌细胞复合体，可判断提供待测样本的受试者为meEGFR阳性癌症患者。其中「抗体癌细胞复合体」是指本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段与表达meEGFR的癌细胞专一性结合后所形成的复合体。而检测抗体癌细胞复合体是否存在的方式包含但不限于免疫荧光法、免疫组织化学染色法、西方墨点法、酵素连结免疫吸附法(ELISA)或自动放射显影术。
经由本发明的检测meEGFR阳性癌症的方法100判断后，若受试者非为meEGFR阳性癌症患者时，其后续仍可考虑以临床上已核准的EGFR-TKI进行治疗；然若受试者被判断为meEGFR阳性癌症患者时，则需使用其他治疗方式，例如使用本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段、治疗癌症的医药组合物、meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞、先天细胞衔接体及/或抗体偶联物进行治疗。
试验上进一步利用本发明的检测套组检测待测样本是否具有抗体癌细胞复合体，以作为受试者是否为meEGFR阳性癌症患者的依据。于下述试验例中，检测套组中的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段为实施例1，并通过免疫组织化学染色和免疫荧光染色检测待测样本是否存在抗体癌细胞复合体。
请参照图5A和图5B，为本发明的又一态样的检测套组的结合专一性分析结果图，图5A为在不存在或存在meEGFR(热肽)或非甲基化EGFR(冷肽)的情况下，以本发明的检测套组于人类乳癌患者的组织样本上进行免疫组织化学染色的分析结果图，图5B为转染载体、编码野生型EGFR的质粒或编码R198/200K突变型EGFR(非甲基化突变型)的质粒至293FT细胞后，以本发明的检测套组进行免疫荧光染色的分析结果图。图5A的结果显示，本发明的检测套组对于存在meEGFR的组别可检测到抗体癌细胞复合体，而图5B的结果显示，当EGFR为非甲基化突变型时，则无法检测到抗体癌细胞复合体。上述结果显示，本发明的检测套组对于meEGFR具有高专一性和高亲和力。
三、治疗癌症的医药组合物
本发明的治疗癌症的医药组合物，包含本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段以及医药上可接受载剂。此外，治疗癌症的医药组合物可还包含化学治疗剂、免疫调节剂、靶向治疗药物、抗体药物或其组合，其中所述抗体药物与抗meEGFR抗体或其抗原结合片段不同。
试验上招募了共785位乳癌患者，并将乳癌患者提供的肿瘤组织使用本发明的检测套组以本发明的检测meEGFR阳性癌症的方法进行检测。请参照图6A至图6C，为乳癌患者的meEGFR表达的分析结果图，图6A的结果显示，约33.8％的乳癌患者的肿瘤组织中的meEGFR表达呈阳性，而进一步分析不同乳癌患者的meEGFR表达，由图6B搭配图6C的结果显示，可见管状A型乳癌患者中meEGFR阳性和meEGFR阴性的比率为17.8％:43.7％，但管状B型的乳癌患者、第二型人类上皮因子接受器蛋白(human epidermal growth factorreceptor 2,HER2)阳性(HER2+)的乳癌患者和三阴性乳癌(triple negative breastcancer,TNBC)患者中，meEGFR阳性和meEGFR阴性的比率则分别为5.4％:6.1％、5.5％:6.9％和5.1％:9.6％。上述结果支持meEGFR为乳癌患者重要的促癌标志物。
试验上进一步将上述meEGFR表达与临床预后的相关性进行分析，在本试验例中使用两种时间变量评估指针，分别为整体存活期(overall survival,OS)和无疾病存活期(disease free survival,DFS)。其中整体存活期的评估指标是将「死亡」定为事件，观察受试者从进入临床试验到死亡的时间，而无疾病存活期的评估指标是将「肿瘤复发」定为事件，观察受试者从进入临床试验到肿瘤复发的时间。
请参照图6D和图6E，图6D为meEGFR阳性的乳癌患者和meEGFR阴性的乳癌患者的整体存活期的分析结果图，图6E为meEGFR阳性的乳癌患者和meEGFR阴性的乳癌患者的无疾病存活期的分析结果图，其中所分析的meEGFR阳性的乳癌患者人数共265位，meEGFR阴性的乳癌患者人数共520位。图6D和图6E的结果显示，meEGFR阴性的乳癌患者无论是在整体存活时间或无疾病存活时间皆高于meEGFR阳性的乳癌患者，以对数等级检定方法评估，在整体存活期的p值为0.003，在无疾病存活期的p值为0.002。上述结果再次验证meEGFR为乳癌患者重要的促癌标志物。
试验上进一步地验证本发明的治疗癌症的医药组合物对meEGFR阳性癌症的治疗效果。于下述试验例中，治疗癌症的医药组合物的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段为实施例1，将不同的肿瘤细胞分别处理实施例1或西妥昔单抗，并分析肿瘤细胞的细胞存活率。所使用的肿瘤细胞为不同的人类乳癌细胞株，分别为SUM159PT、BT549、MCF7、MDA-MB-468、HCC1806和HCC1954，其中SUM159PT、BT549、MDA-MB-468和HCC1806为雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、黄体素受体(progesterone receptor,PR)和HER2的表达皆呈阴性的三阴性乳癌细胞；MCF7为ER表达呈阳性的管状型乳癌细胞，但其EGFR为低度表达；HCC1954为HER2过度表达但ER和PR的表达呈阴性的乳癌细胞。所使用的肿瘤细胞株皆购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。
试验上将SUM159PT和BT549以5×103细胞/每孔、HCC1954、HCC1806和MDA-MB-468以8×103细胞/每孔，以及MCF7以1×104细胞/每孔的密度种于96孔盘中，培养16-18小时后，将孔洞内培养基清除，加入含有不同浓度的实施例1或西妥昔单抗(浓度分别为1nM、10nM、100nM和1000nM)的DMEM-F12培养基，培养48小时后进行MTT试验。MTT试验的步骤为去除96孔盘内培养基，加入100μl含5μg/mL MTT的DMEM-F12，于培养箱内培养4小时后，完全去除孔盘内溶液，加入100μL的DMSO待结晶溶解后，以酵素免疫分析仪读取波长570nm下的吸光值。
请参照图7A至图7F，为本发明的又一态样的一实施方式的治疗癌症的医药组合物诱导肿瘤细胞死亡的分析结果图，其中图7A为SUM159PT的分析结果图，图7B为BT549的分析结果图，图7C为MCF7的分析结果图，图7D为MDA-MB-468的分析结果图，图7E为HCC1806的分析结果图，图7F为HCC1954的分析结果图。结果显示，当实施例1的浓度为1000nM时，在SUM159PT、BT549和MCF7中，本发明的治疗癌症的医药组合物可达到优于西妥昔单抗的抑制肿瘤细胞生长效果，而在MDA-MB-468、HCC1806和HCC1954中，则可达到与西妥昔单抗相当的抑制肿瘤细胞生长效果。
试验上进一步将实施例1搭配化疗药物作为本发明的另一实施方式的治疗癌症的医药组合物，并分析其抑制肿瘤细胞生长的效果，所使用的肿瘤细胞为SUM159PT，所使用的化疗药物为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和吉西他滨(gemcitabine)。试验上另以单独处理化疗药物或西妥昔单抗搭配化疗药物的组别作为比较例，实施例4-7和比较例1-6的治疗策略如表五所示，对照组为未处理任何抗体和化疗药物的SUM159PT。SUM159PT在分别处理比较例1-6和实施例4-7后，进行细胞存活率试验。
表五、实施例4-7和比较例1-6的治疗策略
请参照图8A和图8B，为本发明的又一态样的另一实施方式的治疗癌症的医药组合物诱导SUM159PT死亡的分析结果图，于图8A的结果可见，合并处理西妥昔单抗和5-氟尿嘧啶的比较例2和比较例3，在西妥昔单抗浓度提高时，未见相应的抑制效果，而合并处理实施例1和5-氟尿嘧啶的实施例4和实施例5，可见抑制SUM159PT生长的效果具有浓度依赖性，且在所有组别中，实施例5抑制SUM159PT生长的效果最好。而在图8B的结果显示，合并处理西妥昔单抗和吉西他滨的比较例5和比较例6，在西妥昔单抗浓度提高时，可见抑制SUM159PT生长的效果具有浓度依赖性，而合并处理实施例1和吉西他滨的实施例6和实施例7，亦可见抑制SUM159PT生长的效果具有浓度依赖性，且在所有组别中，实施例7抑制SUM159PT生长的效果最好。上述结果显示，同时施用本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段和化疗药物具有协同作用，可更显著地抑制肿瘤细胞生长。
四、meEGFR特异性嵌合抗原受体、核酸、meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞及治疗癌症的医药组合物
请参照图9，其绘示本发明的再一态样的meEGFR特异性嵌合抗原受体200的理论结构示意图。本发明的meEGFR特异性嵌合抗原受体200，包含胞外域210和细胞内信息传递域230。
胞外域210用以辨识meEGFR，且meEGFR于R198和R200位点带有不对称二甲基化修饰，胞外域210包含本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段。
进一步地，meEGFR特异性嵌合抗原受体200可还包含跨膜域220，跨膜域220连接胞外域210和细胞内信息传递域230。跨膜域220可包含共刺激分子的跨膜部分，例如T细胞共刺激分子的跨膜部分。详细地说，跨膜域220可为CD137(4-1BB)、T细胞受体α链、T细胞受体β链、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A、CD79B、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fcγ受体、MHC I类分子、MHC II类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、白细胞介素受体、整联蛋白、活化的NK细胞受体、Toll配体受体或其组合。
细胞内信息传递域230可包含共刺激域231和初级信息传递域232。而细胞内信息传递域230可为CD137(4-1BB)、激活的NK细胞受体、CD276(B7-H3)、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96(Tactile)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRTAM、白介素受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、免疫球蛋白样蛋白、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、特异性结合CD83的配体、LIGHT(TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴抗原-1(LFA-1(CD11a/CD18))、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、CD279(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、SLAMF1(CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6或其组合。
本发明的核酸，其编码如前段所述的meEGFR特异性嵌合抗原受体，所述「核酸」可包含天然及/或非天然存在的核苷酸及碱基的核酸，例如包含具有主链修饰的彼等物，可含有天然及/或非天然核苷酸且包含但不限于DNA、RNA及PNA。「核苷酸序列」是指组成核酸分子或聚核苷酸的核苷酸的线性序列。
本发明的核酸从5’端至3’端依序包含编码胞外域片段和编码细胞内信息传递域片段。编码胞外域片段中包含编码本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的核酸，其包含编码VH片段和编码VL片段，编码VH片段包含如SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列，编码VL片段包含如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列。此外，编码本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的核酸包含选自SEQID NO:50至SEQ ID NO:67中的一个或多个编码CDR片段。
进一步地，所述核酸可还包含编码跨膜域片段，其连接编码胞外域片段和编码细胞内信息传递域片段。而编码细胞内信息传递域片段可包含编码共刺激域片段和编码初级信息传递域片段。
本发明的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞包含免疫细胞和本发明的核酸，所述meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞为将本发明的核酸转染至免疫细胞而得到。而免疫细胞可为T细胞或自然杀手细胞。本发明的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞可专一性的辨识肿瘤细胞膜上的meEGFR，进而对肿瘤细胞进行毒杀作用。是以本发明的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞可搭配医药上可接受载剂，作为本发明的另一态样的治疗癌症的医药组合物。
试验上制备实施例8的meEGFR特异性嵌合抗原受体(以下简称「实施例8」)为示例，其包含IgGκ前导序列(序列如SEQ ID NO:31所示)、本发明的抗meEGFR抗体的scFv(序列如SEQ ID NO:32所示)、CD28铰链区(序列如SEQ ID NO:33所示)、CD28跨膜域(序列如SEQ IDNO:34所示)、CD28共刺激域(序列如SEQ ID NO:35所示)和CD3ζ初级信息传递域(序列如SEQID NO:36所示)，并将编码实施例8的核酸利用慢病毒载体进行构筑，随后将其包装成相应的慢病毒颗粒。利用慢病毒颗粒将编码实施例8的核酸转导至NK-92细胞株(以下简称「NK-92」)中，以得到实施例9的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞(以下简称「实施例9」)，并进行实施例9的细胞毒杀试验。
而编码实施例8的核酸包含编码IgGκ前导序列片段(序列如SEQ ID NO:37所示)、编码抗meEGFR抗体的scFv片段(序列如SEQ ID NO:38所示)、编码CD28铰链区片段(序列如SEQ ID NO:39所示)、编码CD28跨膜域片段(序列如SEQ ID NO:40所示)、编码CD28共刺激域片段(序列如SEQ ID NO:41所示)和编码CD3ζ初级信息传递域片段(序列如SEQ ID NO:42所示)。
试验上分为2组，一组所使用的肿瘤细胞为转染编码野生型PRMT1的质粒的人类大肠直肠癌细胞株SW620(以下简称「SW620」)，另一组所使用的肿瘤细胞为转染编码失去酵素活性的突变型PRMT1(以下简称「突变型PRMT1」)的质粒的SW620，将肿瘤细胞与实施例9以2:1的比例在带有变焦系统(Essen Bioscience)的加湿培养箱中共同培养24小时，再按照制造商界定的使用说明以/>变焦系统进行细胞毒性测定，通过IncuCyte Caspase-3/7绿色细胞凋亡检测试剂的基质检测，以测量带有荧光信号的面积并评估细胞凋亡，其中绿色荧光信号代表凋亡的细胞群。
请参照图10A，为实施例9对SW620特异性裂解的分析结果图，结果显示，将野生型PRMT1导入SW620中，会促使EGFR的甲基化修饰增加，进而可增加实施例9对SW620的毒杀效果，而导入突变型PRMT1的组别则为负向对照组。
试验上另测试实施例9是否可诱导MDA-MB-231死亡。试验上先分别以靶向PRMT1的shRNA(shPRMT1)和对照组shRNA(shVOID)处理MDA-MB-231，处理shPRMT1的MDA-MB-231(以下简称「231-shPRMT1」)因PRMT1被敲除，其EGFR的甲基化修饰程度会减少，而处理shVOID的MDA-MB-231(以下简称「231-shVOID」)其EGFR的甲基化修饰程度不受影响。于试验前一天晚上分别将231-shPRMT1和231-shVOID以密度为5×103细胞/每孔种入96孔盘中，16-18小时后去除培养基，每孔加入2.5×103的实施例9或NK-92与肿瘤细胞共同培养，并于每孔中加入含IncuCyte Caspase-3/7绿色细胞凋亡检测试剂(250×稀释)的DMEM-F12，放入变焦系统，设定在白光和荧光的条件下每2小时拍照1次，共放置24小时，再使用变焦系统的分析软件进行分析，以确认EGFR甲基化修饰的有无是否影响实施例9对于MDA-MB-231的毒杀作用。
请参照图10B，为实施例9对MDA-MB-231特异性裂解的分析结果图。结果显示，实施例9对于EGFR甲基化修饰程度正常的231-shVOID的毒杀效果最好，而实施例9对于EGFR甲基化修饰程度降低的231-shPRMT1的毒杀效果与原生的NK-92无异。
上述结果显示，本发明的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞所表达的meEGFR特异性嵌合抗原受体可专一性地与肿瘤细胞上的meEGFR专一性结合，使meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞具有免疫毒性活性，进而有效地毒杀肿瘤细胞。特别是在肿瘤细胞的EGFR甲基化修饰程度正常的状况下，可有效地使肿瘤细胞对本发明的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞的杀伤具敏感性。
五、先天细胞衔接体
本发明的先天细胞衔接体，包含meEGFR抗原辨识域和至少一免疫细胞受体结合域，meEGFR抗原辨识域包含本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，至少一免疫细胞受体结合域对CD3、CD8、CD16、CD19或NKG2D中的一或多者具有结合专一性。
所述的至少一免疫细胞受体结合域可以针对各种免疫细胞上的受体进行专一性结合，免疫细胞可选自由T细胞、自然杀手细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白血球、间叶干细胞及神经干细胞所组成的群组。
进一步地，本发明的先天细胞衔接体可为双特异性T细胞衔接体、三特异性T细胞衔接体或多特异性T细胞衔接体；先天细胞衔接体亦可为双特异性自然杀手细胞衔接体、三特异性自然杀手细胞衔接体或多特异性自然杀手细胞衔接体。
本发明的先天细胞衔接体可基于scFv的结构，通过短的连接胜肽将VL及/或VH相互连接，连接胜肽在一个可变结构域的羧基末端和另一个可变结构域的胺基末端之间形成约3.5nm的桥梁。例如本发明的先天细胞衔接体的meEGFR抗原辨识域可为包含VL-连接胜肽-VH或VH-连接胜肽-VL的scFv结构。其中VH序列可选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所组成的群组，VL序列可选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所组成的群组，连接胜肽例如可为SEQ ID NO:43所示序列的重复片段，其为(GGGGS)n或其变体，其中n为非零的自然数，优选范围为1到20之间。
本发明的先天细胞衔接体可以通过以下方法获得，使用编码本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段的核酸和编码抗CD3抗体的核酸与表达载体进行构建，将建构好的表达载体导入CHO细胞或HEK293细胞，从而获得转染细胞。再培养所获得的转染细胞，并通过层析法纯化培养液以获得本发明的先天细胞衔接体。
六、抗体偶联物
本发明的抗体偶联物包含如本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段和效应分子，效应分子通过化学键或连接符偶联至抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其中效应分子为毒素、生长抑制剂、毒性蛋白质、放射性核素、放射性同位素、化学治疗药物或其组合。
进一步地，本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段和效应分子之间的偶联可通过偶联剂实现，其中偶联剂可为非选择性偶联剂、羧基偶联剂、肽链和二硫键偶联剂中的一种或多种，非选择性偶联剂是指使效应分子和本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段之间形成共价键的化合物，例如戊二醛。羧基偶联剂可为顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的一种或多种。
连接符可为可降解连接符或不可降解连接符，其中可降解连接符通常在细胞内环境中容易降解，例如在目标位点处发生降解，从而释放出药物。适合的可降解连接符包含酵素降解连接符，其中包含可被细胞内蛋白酶(如溶酶体蛋白酶或胞内体蛋白酶)降解的肽基连接符或者糖连接符。肽基连接符可以是二肽，例如缬胺酸-瓜胺酸、苯丙胺酸-离胺酸或缬胺酸-丙胺酸。糖连接符例如可被葡萄糖苷酶降解的含有葡萄醣苷的连接符。其他适合的可降解连接符包含pH敏感连接符(如pH小于5.5时水解的连接符，例如腙连接符)和在还原条件下会降解的连接符(如二硫键连接符)。不可降解连接符通常在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
毒素可为小分子毒素或酶促活性毒素，例如但不限于白喉毒素A链(diphtheriatoxin A chain)、白喉毒素(diphtheria toxin)的非结合活性片段、外毒素A链(exotoxinA chain)、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、相思子毒素A链(abrin A chain)、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、康乃馨(dianthin)蛋白质、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白质、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)或单端孢霉烯族毒素(trichothecene)。
放射性核素可选自下列组成的群组：111In、99Tc、14C、131I、125I及3H。放射性同位素可选自下列组成的群组：At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu放射性同位素。
化学治疗药物可选自下列组成的群组：5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、类美登素(maytansinoid)、奥瑞他汀(auristatin)、海兔毒素(dolastatin)、卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物、蒽环霉素(anthracycline)、甲胺喋呤(methotrexate)、长春地辛(vindesine)、紫杉烷、单端孢霉烯族毒素(trichothecene)、CC1065、长春花生物碱、甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力霉素(adriamicin)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)、小红莓(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)及道诺霉素(daunorubicin)。
首先，为测试本发明的抗体偶联物可被肿瘤细胞通过内吞作用内化至肿瘤细胞内，试验上将实施例1与染剂DyLight 488偶联后形成实施例10的抗体偶联物(以下简称「实施例10」)为示例，再将实施例10分别加入MDA-MB-231和MDA-MB-468的培养基中共同培养30分钟后，观察实施例10是否可内化至MDA-MB-231和MDA-MB-468的胞内。请参照图11A，为实施例10被MDA-MB-231和MDA-MB-468内化的分析结果图，结果显示，无论在MDA-MB-231和MDA-MB-468皆可见实施例10的绿色荧光信号，因此可见TNBC细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-468皆具有良好内化本发明的抗体偶联物的能力。
试验上再分别将载体、编码野生型EGFR的质粒或编码R198/200K突变型EGFR(非甲基化突变型)的质粒转染至SW620中，将实施例10分别加入上述细胞的培养基中共同培养30分钟后，观察实施例10是否可内化至SW620的胞内。
请参照图11B，为实施例10被SW620内化的分析结果图，结果显示，在编码野生型EGFR的质粒的SW620中，可见实施例10被内化至SW620胞内的现象。但在转染载体或编码R198/200K突变型EGFR(非甲基化突变型)的质粒的SW620中，可见实施例10的绿色荧光信号位于细胞膜的周边，而未被内化至SW620的胞内。
上述结果显示，本发明的抗体偶联物上的meEGFR抗体或其抗原结合片段对于meEGFR具有高专一性，因此可辨识表达meEGFR的肿瘤细胞，并被表达meEGFR的肿瘤细胞通过内吞作用内化于其中。借此，可将抗体偶联物上的效应分子一同内化至肿瘤细胞中，使效应分子发挥毒杀肿瘤细胞的作用。
为测试本发明的抗体偶联物是否可诱导肿瘤细胞死亡，试验上使用本发明中的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段与效应分子偶联生成抗体偶联物为另一示例。详细地，将实施例1与化疗药物-单甲基奥瑞他汀E(monomethyl auristatin E,MMAE)偶联后形成实施例11的抗体偶联物(以下简称「实施例11」)，其中基于半胱胺酸(Cystenine)的实施例11可使用连续偶联和原位偶联两种方法构建。链接器-MMAE有效负载的合成为基于胜肽的马来酰亚胺己酰基-L-缬胺酸-L-瓜胺酸-对胺基苯甲醇对硝基苯基碳酸酯(Mc-Val-Cit-PABC-PNP)连接符或重桥连接符与MMAE反应。
传统接头-MMAE有效负载的构建如下：在500μL二甲基甲酰胺中溶解并混合18.20μmol的MMAE、16.38μmol的Mc-Val-Cit-PABC-PNP和3.64μmol的羟基苯并三唑。在混合物中加入18.20μmol的吡啶，并在2分钟后频繁混合。再加入20μmol的三氟乙酸(TFA)，并在24小时后完成反应。
构建重新连接链接器-MMAE有效负载的方法如下：试验上先合成重新连接链接器(rebriging linker)，在20mL乙酸中混合3.91mmol的6-氨基己酸和3.91mmol的3,4-二溴呋喃-2,5-二酮。在室温下搅拌10分钟后，将溶液在100oC加热18小时，再利用真空除去溶剂，并使用硅胶进行重新连接链接器的纯化，洗脱液使用0-40％的二氯甲烷/乙酸乙酯。在0.25mL二氯甲烷中混合13.55μmol的N,N'-二异丙基碳二亚胺、13.55μmol的N,N-二异丙基乙胺和33.85μmol的重新连接链接器。在室温下频繁混合1小时。添加13.55μmol的MMAE并在另外16小时频繁混合。合成的重新连接链接器-MMAE通过真空泵除去溶剂，然后使用配备600控制器/泵和996PDA检测器的Waters HPLC系统进行纯化。纯化过程使用具有5μm C18(2)和250×10mm的反相C18柱(Phenomenex Luna)，以A相(水+0.1％ TFA)和B相(乙腈)的梯度洗脱缓冲液。纯化产物通过Agilent 6500系列精确质量Q-TOF LC/MS(AgilentTechnologies)进行确认。
连续偶联的方法为在pH 8.0的50mM硼酸盐缓冲液中将5mg/mL的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段用1mM二硫苏糖醇(DTT)在37oC下还原1小时。使用含有1mM PBS缓冲液的Pierce透析柱进行重复的缓冲液交换。将传统接头-MMAE有效负载和重新连接链接器-MMAE有效负载分别与还原的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段混合，传统接头-MMAE有效负载：抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的摩尔比为6.6：1，重新连接链接器-MMAE有效负载:抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的摩尔比为4.4：1。在4oC下孵育1小时后，添加超过有效负载20倍摩尔过量的半胱胺酸来终止反应。最终产物通过G-25凝胶过滤纯化，以得到实施例11。
原位偶联的方法为使用7当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)在pH 8.0的50mM硼酸盐缓冲液中还原5mg/mL的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段。同时添加传统接头-MMAE有效负载或重新连接链接器-MMAE有效负载与7当量的TCEP。在37oC下孵育2小时后，通过G-25凝胶过滤纯化，以得到实施例11。
试验上进一步测试实施例11是否可诱导肿瘤细胞死亡，所使用的肿瘤细胞为MDA-MB-468。于试验前一天将MDA-MB-468以8×103细胞/每孔的密度种于96孔盘中，培养16-18小时后，将孔洞内培养基清除，加入含有不同浓度的实施例1、实施例11或MMAE(浓度分别为0.1nM、1nM、10nM、100nM和1000nM)的DMEM-F12培养基，其中加入MMAE的组别为正向对照组，培养48小时后进行MTT试验。MTT试验的方法为去除96孔盘内培养基，加入100μl含5μg/mLMTT的DMEM-F12，于培养箱内培养4小时后，完全去除孔盘内溶液，加入100μL的DMSO待结晶溶解后，以酵素免疫分析仪读取波长570nm下的吸光值。
请参照图12，为实施例11诱导MDA-MB-468死亡的分析结果图，结果显示施用实施例11可显著诱导MDA-MB-468死亡，其治疗效果优于单独以抗体治疗的组别(实施例1)，且施用实施例11可达到与施用MMAE相当的治疗效果。而MMAE虽治疗效果好，但因其具毒性无法单独入药，借此，可将MMAE与本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段偶联形成抗体偶联物，其可达到与MMAE相当的治疗效果，又可以减轻MMAE本身对于生物体的毒性。此外，本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段可与其他效应分子偶联，例如可将MMAE置换为5-氟尿嘧啶或吉西他滨等化疗药物，不仅可降低化疗药物本身对于生物体的毒性，另可进一步利用本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段和化疗药物的协同作用，达到更优异的治疗效果。
综上所述，本发明提供一种抗meEGFR抗体或其抗原结合片段、检测套组、检测meEGFR阳性癌症的方法、治疗癌症的医药组合物、meEGFR特异性嵌合抗原受体、编码meEGFR特异性嵌合抗原受体的核酸、meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞、先天细胞衔接体及抗体偶联物。说明书中证明本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段对于meEGFR具有高专一性和高亲和力，并证明本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段非常适合检测肿瘤组织中的meEGFR，进而可用于检测meEGFR阳性癌症。说明书中亦证明包含本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段的治疗癌症的医药组合物具有优异的抑制肿瘤细胞生长效果。此外，说明书中以肿瘤细胞的细胞试验，证明以本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段为基础所开发的meEGFR特异性嵌合抗原受体及其表达细胞对于肿瘤细胞具有优异的特异性裂解能力。且本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段在肿瘤细胞中具有良好的内化能力，因此可以本发明的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段为基础开发抗体偶联物和先天细胞衔接体作为临床应用，多方面克服及突破目前临床上治疗meEGFR阳性癌症的困境，提供了传统EGFR标靶药物具有耐药性的癌症治疗中低反应率的解决方案，同时亦可应用于meEGFR阳性癌症的多种类实体肿瘤治疗上，可望大大帮助癌症患者的用药选择及治疗效果，深具临床意义、广大的市场价值及全球性的竞争优势。
然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视所附的权利要求所界定的范围为准。

Claims (20)

1.一种抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其与一甲基化表皮生长因子受体(methylated epidermal growth factor receptor,meEGFR)专一性结合，且该meEGFR于R198和R200位点带有不对称二甲基化修饰，该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段包含：
一重链可变区(VH)，其包含一重链互补决定区1(HCDR1)、一重链互补决定区2(HCDR2)及一重链互补决定区3(HCDR3)；以及
一轻链可变区(VL)，其包含一轻链互补决定区1(LCDR1)、一轻链互补决定区2(LCDR2)及一轻链互补决定区3(LCDR3)；
其中该HCDR1、该HCDR2、该HCDR3、该LCDR1、该LCDR2及该LCDR3的序列选自由以下组成的群组：
SEQ ID NO:7的该HCDR1、SEQ ID NO:8的该HCDR2、SEQ ID NO:9的该HCDR3、SEQ ID NO:10的该LCDR1、SEQ ID NO:11的该LCDR2及SEQ ID NO:12的该LCDR3；
SEQ ID NO:13的该HCDR1、SEQ ID NO:14的该HCDR2、SEQ ID NO:15的该HCDR3、SEQ IDNO:16的该LCDR1、SEQ ID NO:17的该LCDR2及SEQ ID NO:18的该LCDR3；及
SEQ ID NO:19的该HCDR1、SEQ ID NO:20的该HCDR2、SEQ ID NO:21的该HCDR3、SEQ IDNO:22的该LCDR1、SEQ ID NO:23所示的该LCDR2及SEQ ID NO:24所示的该LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其特征在于，该VH和该VL的序列选自由以下组成的群组：
包含SEQ ID NO:1的该VH和包含SEQ ID NO:2的该VL；
包含SEQ ID NO:3的该VH和包含SEQ ID NO:4的该VL；以及
包含SEQ ID NO:5的该VH和包含SEQ ID NO:6的该VL。
3.如权利要求1所述的抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其特征在于，该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段选自由一单域抗体、一人源化抗体、一多聚体抗体、一单链可变片段(scFv)、一Fab片段、一Fab’片段及一F(ab’)2片段组成的群组。
4.一种检测套组，用以检测meEGFR阳性癌症，其特征在于，该检测套组包含：
如权利要求1至权利要求3任一项所述的该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段。
5.如权利要求4所述的检测套组，其特征在于，该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段与一标记物结合，该标记物为一荧光标记物、一化学发光标记物、一放射线同位素标记物、一酶标记物、一生物素标记物或其组合。
6.一种检测meEGFR阳性癌症的方法，其特征在于，包含：
提供一待测样本；
提供如权利要求4所述的该检测套组；
进行一结合步骤，将该待测样本与该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段接触并进行结合反应；以及
进行一检测步骤，检测该待测样本是否有一抗体癌细胞复合体。
7.如权利要求6所述的检测meEGFR阳性癌症的方法，其特征在于，该meEGFR阳性癌症为一乳癌、一大肠直肠癌、一前列腺癌、一肺癌或一胰腺癌。
8.一种治疗癌症的医药组合物，其特征在于，包含：
如权利要求1至权利要求3任一项所述的该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段；以及
一医药上可接受载剂。
9.如权利要求8所述的治疗癌症的医药组合物，其特征在于，还包含一化学治疗剂、一免疫调节剂、一靶向治疗药物、一抗体药物或其组合，其中该抗体药物与该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段不同。
10.一种meEGFR特异性嵌合抗原受体，其特征在于，包含：
一胞外域，用以辨识一甲基化表皮生长因子受体(methylated epidermal growthfactor receptor,meEGFR)，且该meEGFR于R198和R200位点带有不对称二甲基化修饰，该胞外域包含如权利要求1至权利要求3任一项所述的该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段；以及
一细胞内信息传递域。
11.如权利要求10所述的meEGFR特异性嵌合抗原受体，其特征在于，还包含一跨膜域，其连接该胞外域和该细胞内信息传递域。
12.如权利要求10所述的meEGFR特异性嵌合抗原受体，其特征在于，该细胞内信息传递域包含一共刺激域和一初级信息传递域。
13.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求10所述的该meEGFR特异性嵌合抗原受体。
14.一种meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞，其特征在于，包含：
一免疫细胞；以及
如权利要求13所述的该核酸；
其中该meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞为将该核酸转染至该免疫细胞而得到。
15.如权利要求14所述的meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞，其特征在于，该免疫细胞为一T细胞或一自然杀手细胞。
16.一种治疗癌症的医药组合物，其特征在于，包含：
如权利要求14所述的该meEGFR特异性嵌合抗原受体表达细胞；以及
一医药上可接受载剂。
17.一种先天细胞衔接体，其特征在于，包含：
一meEGFR抗原辨识域，其包含如权利要求1至权利要求3任一项所述的该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段；以及
至少一免疫细胞受体结合域，其对CD3、CD8、CD16、CD19或NKG2D中的一或多者具有结合专一性。
18.如权利要求17所述的先天细胞衔接体，其特征在于，该先天细胞衔接体为一双特异性T细胞衔接体、一三特异性T细胞衔接体或一多特异性T细胞衔接体。
19.如权利要求17所述的先天细胞衔接体，其特征在于，该先天细胞衔接体为一双特异性自然杀手细胞衔接体、一三特异性自然杀手细胞衔接体或一多特异性自然杀手细胞衔接体。
20.一种抗体偶联物，其特征在于，包含：
如权利要求1至权利要求3任一项所述的该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段；以及
一效应分子，该效应分子通过化学键或一连接符偶联至该抗meEGFR抗体或其抗原结合片段，其中该效应分子为一毒素、一生长抑制剂、一毒性蛋白质、一放射性核素、一放射性同位素、一化学治疗药物或其组合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110200595A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-18 Roche Glycart TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR
US8691231B2 (en) * 2011-06-03 2014-04-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of tumors expressing predominantly high affinity EGFR ligands or tumors expressing predominantly low affinity EGFR ligands with monoclonal and oligoclonal anti-EGFR antibodies
US20170314079A1 (en) * 2011-07-05 2017-11-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against epidermal growth factor receptor (egfr) and uses thereof
US9120853B2 (en) * 2012-04-27 2015-09-01 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
US10537635B2 (en) * 2013-11-19 2020-01-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Detection of arginine methylation of EGFR for prediction of resistance to therapy
EP3145954A1 (en) * 2014-05-23 2017-03-29 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Anti- egfr conformational single domain antibodies and uses thereof
US11124575B2 (en) * 2017-02-22 2021-09-21 University Of Saskatchewan EGFR-binding agents and uses thereof

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