CN104936984A - 特异性结合人和小鼠l1cam的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合人和小鼠L1CAM的新型抗体，并且更具体地，涉及以高亲和力既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM的抗体、编码所述抗体的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体、导入了所述载体的转化体、包括所述抗体的用于预防或治疗癌症的药物组合物、使用所述抗体用于治疗癌症的方法、包括所述抗体的用于诊断癌症的组合物、包括所述组合物的用于诊断癌症的试剂盒、使用所述抗体用于给癌症诊断提供信息的方法以及通过将药物缀合至所述抗体所制备的抗体-药物缀合物，所述抗体通过修饰包括SEQ ID NO.1的重链可变区和SEQ ID NO.5的轻链可变区的L1CAM(L1细胞粘附分子)-特异性抗体的序列进行制备。

Description

特异性结合人和小鼠L1CAM的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及特异性结合人和小鼠L1CAM的新型抗体，并且更具体地，涉及以高亲和力既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM的抗体、编码所述抗体的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体、导入了所述载体的转化体、包括所述抗体用于预防或治疗癌症的药物组合物、使用所述抗体用于治疗癌症的方法、包括所述抗体用于诊断癌症的组合物、包括所述组合物用于诊断癌症的试剂盒、使用所述抗体用于给癌症诊断提供信息的方法以及通过将药物缀合至所述抗体所制备的抗体-药物缀合物，所述抗体通过修饰包括SEQ ID NO.1的重链可变区和SEQ ID NO.5的轻链可变区的L1CAM(L1细胞粘附分子)-特异性抗体的序列进行制备。
背景技术
L1细胞粘附分子(L1CAM,CD171)是免疫球蛋白超家族细胞粘附分子(cell adhesion molecules，CAMs)之一，在细胞表面上介导细胞对细胞粘附，并且是具有200至220kDa分子量的糖蛋白。最初知道L1CAM为介导神经元与神经元粘附并涉及神经突起和神经元迁移的蛋白质(Lee等，PNAS 74，5021，1997；McGuire and Greene 15，357，1978)。人L1CAM是1型整合膜糖蛋白，其由1,257个氨基酸组成并跨越细胞膜一次，并且其氨基末端部分存在于细胞膜外，其羧基末端部分存在于细胞质中。细胞外结构域含有六个2型免疫球蛋白结构域、五个纤连蛋白III样结构域和二十个N-糖基化位点。
除了在正常人脑中的最高表达之外，在一些造血细胞和肾细胞、外周神经和神经节也发现L1CAM的表达，但在其它正常细胞中没有发现(Huszar等，Human Pathology 37，1000-1008,2006)。最近，已经报道在癌细胞(如黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌和子宫内膜癌)中发现L1CAM的过表达，L1CAM在癌细胞的生长和转移中发挥重要作用，并且L1CAM的过表达与癌症的预后不良有关。由于该原因，L1CAM已经成为癌症治疗中的靶标(Raveh等，Cancer Letters 282:137-145，2009)。
已经有许多关于使用L1CAM抗体诊断和治疗癌症的报道。例如欧洲专利号EP1172654和美国专利号7618785公开了用于卵巢或子宫内膜肿瘤的诊断和预后的方法，其特征在于，基于L1CAM的存在指示卵巢或子宫内膜肿瘤的存在，L1CAM抗体被用于确定患者样品中L1CAM的存在和水平，以及通过向该所述患者施用所述L1CAM抗体和细胞毒药物的复合物来治疗所述肿瘤的方法。而且，美国专利公开号2004/0115206公开了通过用有效量的能够在肿瘤细胞中抑制细胞生长或诱导细胞死亡的抗L1CAM的抗体接触所述肿瘤细胞用于在所述肿瘤细胞中抑制细胞生长或诱导细胞死亡的方法。此外，国际专利公开号WO2006/013051提供了抑制在卵巢和子宫内膜癌中过表达的L1CAM蛋白及其表达的组合物，以及使用所述组合物用于预防和治疗卵巢和子宫内膜癌的方法。该专利描述了包括抗L1CAM的抗体或其衍生物的组合物抑制卵巢和子宫内膜癌并阻断癌细胞的迁移，从而实现癌症的治疗功能。而且，本发明人证实了L1CAM表达于胆管癌，并涉及胆管癌细胞的增殖和迁移，并且胆管癌细胞的生长被抗L1CAM的单克隆抗体抑制，表明L1CAM和胆管癌之间存在相关性(韩国专利号10-756051和10-0931976)。
但是，迄今为止已经开发的L1CAM抗体为小鼠抗体，并因此存在以下缺点：所述抗体结合人L1CAM，但不结合小鼠L1CAM。通常，移植了人癌细胞的裸鼠被用于抗体的抗癌效力的动物试验。关于这一点，由于结合人L1CAM但不结合小鼠L1CAM的抗体只结合人癌症组织而不结合表达于小鼠的一些正常组织中的L1CAM，与在癌症患者中的临床试验相比，它们的抗癌效力和毒性并不能被精确评估。为了解决该问题，已经有以高结合能力既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM并且表现出优异抗癌效力的抗体的需求。因此，本发明人开发了具有结合人和小鼠L1CAM的能力的结合L1CAM的抗体(韩国专利公开号10-2008-0123667)。但是，仍然有必要开发以改善的结合能力既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM的L1CAM抗体。
发明内容
技术问题
因此，本发明人已经进行深入细致的努力以开发与小鼠和人L1CAM交叉反应并具有优异的结合L1CAM能力的抗体。其结果是，他们经突变(特别是Ab4的重链和轻链可变区的氨基酸)制备了与现有抗体相比既对人L1CAM又对小鼠L1CAM具有大大改善亲和力的抗体，并且他们发现该抗体具有优异的抗癌效力，从而完成了本发明。
技术手段
本发明的一个目的是提供特异性结合人和小鼠L1CAM蛋白的新型抗体。
本发明的另一个目的是提供用于制备所述抗体的方法。
本发明的又一个目的是提供编码所述抗体的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体，以及导入了所述载体的转化体。
本发明的又一个目的是提供包括所述抗体的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
本发明的又一个目的是提供使用所述抗体用于治疗癌症的方法。
本发明的又一个目的是提供包括所述抗体的用于诊断癌症的组合物。
本发明的又一个目的是提供用于诊断癌症的方法，其包括通过使用所述抗体经抗原-抗体反应检测从被怀疑患有癌症的个体分离的生物学样品中L1CAM蛋白的步骤。
本发明的又一个目的是提供包括所述用于诊断癌症的组合物的用于诊断癌症的试剂盒。
本发明的又一个目的是提供通过将药物缀合至所述抗体所制备的抗体-药物缀合物。
技术效果
本发明的抗体以高亲和力既结合人L1CAM蛋白又结合小鼠L1CAM蛋白，并因此其可以有效用于需要该抗体的领域，例如与L1CAM的过表达有关的疾病(如癌症)的诊断和治疗。
附图说明
图1显示了用于测量针对人和小鼠L1CAM的置换突变体的结合亲和力的间接ELISA结果，所述置换突变体通过组成结合L1CAM的Ab4抗体的CDR序列的氨基酸残基的置换进行制备，其中图1a和1b显示了如通过间接ELISA所测量的相对于Ab4的针对人和小鼠L1CAM的置换突变体的结合亲和力，所述置换突变体分别通过组成Ab4抗体的VH CDR1、2和3以及VK CDR3的氨基酸残基置换为丙氨酸进行制备，并且图1c显示了相对于Ab4的置换突变体的抗原结合亲和力，所述置换突变体通过针对Ab4VH的位置50的缬氨酸置换为另一个氨基酸残基进行制备；
图2显示了用于分析和比较针对人和小鼠L1CAM蛋白的Ab4、Ab4M和Ab417抗体的抗原结合亲和力的竞争性ELISA的结果，其中图2a显示针对人L1CAM的Ab4、Ab4M和Ab4突变体的亲和力，并且图2b显示了针对小鼠的Ab4、Ab4M和Ab417的亲和力，其中抗体的亲和力(KD)定义为引起所述抗体对抗原的结合能力的50％抑制所需的竞争抗原的浓度；
图3a和3b显示了用于检查Ab4M和Ab417抗体对人和小鼠L1CAM抗原的特异性的流式细胞术结果，其中人IgG用作阴性对照和结合人L1CAM但不结合小鼠L1CAM的嵌合A10-A3(cA10-A3)抗体用作阳性对照；
图4显示了检查Ab4M抗体的ADCC的结果；
图5显示了在小鼠胆管癌模型中使用Synagis抗体作为同种型阴性对照检查Ab4M抗体的抗癌作用的结果，其中图5a显示了测量肿瘤体积的结果，并且图5b显示了测量小鼠模型体重的结果；
图6a示出表明酵母表面显示的Ab4M scFv对抗原Ig5-Fc(1×10-5至1×10-8M)结合的FACS结果，并且图6b示出表明Ab4M scFv和Ab4M-18 scFv在酵母表面上的表达和它们对抗原Ig5-Fc的结合能力的FACS结果，其中图6b的图上的点表示一个单个酵母细胞，并且垂直轴表示表明scFv表达的Cy5荧光信号，水平轴表示表明scFv对所述抗原的结合亲和力的FITC荧光信号；
图7显示了使用Octet RED(ForteBio)系统通过SPR测量Ab4M和Ab417抗体针对人L1CAM和小鼠L1CAM的亲和力的结果，其中图7a显示了针对人L1CAM的抗体的亲和力，并且图7b显示了针对小鼠L1CAM的抗体的亲和力；
图8显示了Ab417抗体的检测ADCC的结果；
图9显示了在裸鼠胆管癌模型中检测Ab417抗体的抗癌效力的结果，其中图9a显示了测量肿瘤体积的结果，图9b显示了在21天测量肿瘤重量的结果，并且图9c显示了测量所述裸鼠模型的体重的结果；
图10显示了Ab4M或Ab417抗体(其为本发明的结合L1CAM的抗体)的重链可变区和轻链可变区的序列，其中图10a显示了Ab4M或Ab417抗体的重链可变区(SEQ ID NO.12)，图10b显示了Ab417抗体的轻链可变区(SEQ IDNO.14)，图10c显示了Ab4M抗体的轻链可变区(SEQ ID NO.13)，并且在图10中，根据Kabat进行编号并且CDR加下划线；以及
图11显示了Ab417-H6L2和Ab417-H5L1突变体的pI值的分析结果。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供特异性既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM(L1细胞粘附分子)蛋白的新型抗体。
在本发明中，已经在特异性结合L1CAM的抗体中鉴定了能够改善其抗原的结合亲和力、物理性质或/和纯化效力的突变位点，所述抗体包括含有SEQID NO.2的重链CDR1、SEQ ID NO.3的重链CDR2和SEQ ID NO.4的重链CDR3的重链可变区以及含有SEQ ID NO.6的轻链CDR1、SEQ ID NO.7的轻链CDR2和SEQ ID NO.8的轻链CDR3的轻链可变区，优选地，SEQ ID NO.1的重链可变区和SEQ ID NO.5的轻链可变区，从而开发了有效结合L1CAM的新抗体。
如本文所使用的术语“L1CAM(L1细胞粘附分子)”是指属于免疫球蛋白超家族细胞粘附分子(CAMs)的整合膜糖蛋白中的一个。可以从已知数据库(如位于国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank)获得关于L1CAM蛋白的信息，并且其一个例子可以为具有登录号AAI36448的L1CAM蛋白，但并不限于此。
在神经元、造血细胞、肾细胞等中发现了L1CAM(Bateman等,EMBO J.15:6050-6059；1996)并已知其涉及神经元迁移、神经突起和细胞迁移。还已知其与癌症的相关性。具体地，已经报道了L1CAM表达于各种癌症(如黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌和结肠癌)，在癌细胞的生长和转移中发挥重要作用，并且L1CAM的过表达与癌症的预后不良有关(Raveh等，CancerLetters 282:137-145，2009)。特异性识别L1CAM蛋白的抗体可以被用于其中L1CAM过表达的疾病(如癌症)的诊断和预防或治疗，并因此本发明人开发了以高亲和力结合人和小鼠L1CAM蛋白的抗体。由于本发明的抗体以高亲和力既结合人L1CAM蛋白又结合小鼠L1CAM蛋白，所述抗体可以被有效用于使用小鼠模型的临床研究和其中L1CAM蛋白过表达的疾病的诊断。而且，所述抗体表现出对癌症生长显著的抑制作用，从而被有效用于癌症的预防或治疗。
如本文所使用的术语“抗体”是指蛋白分子，其包括与某种抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子(作为特异性识别所述抗原的受体)，并旨在包含多克隆抗体、单克隆抗体、完整抗体和抗体片段。此外，所述抗体包含嵌合抗体(例如人源化的鼠抗体)、二价或双特异性分子(例如双特异性抗体)、双特异抗体、三特异抗体和四特异抗体。所述术语还包括保留FcRn结合功能的单链抗体、SCAP、抗体恒定区的衍生物和基于蛋白质支架的人工抗体。完整抗体由两条全长轻链和两条全长重链组成，在所述轻链和重链之间具有二硫键。完整抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，并且IgG被进一步分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚型。抗体片段是指保留抗原结合功能的片段，并可以包括Fd、Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv。Fd是指重链的一部分，其包括于Fab片段中。Fab由每条重链和轻链的一个可变区、轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1结构域)组成，具有抗原结合位点。Fab’与Fab的不同之处在于其具有在重链的CH1结构域的C-末端包括一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab’)2抗体是由Fab’的铰链区的半胱氨酸残基之间的二硫键所产生的。Fv(可变片段)是由每条重链和轻链的一个可变区组成的最小的抗体片段。二硫Fv(dsFv)是重链的可变区经二硫键连接轻链的可变区形成的。单链Fv(scFV)是通过肽接头共价连接重链和轻链的各自可变区形成的。可以使用蛋白酶(例如，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化完整抗体得到Fab或F(ab’)2)获得这些抗体片段，并且优选地，可以通过遗传重组技术构建它们。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指具有一致分子组成的抗体分子，其由基本上相同的抗体群体所获得，其显示针对特定表位的结合特异性和亲和力。
典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链，每条重链和轻链包括恒定区和可变区(也称为“结构域”)。每条轻链和重链的可变区包括三个高变区(也称为互补决定区(在下文称为“CDR”))和四个框架区。CDR功能为结合抗原表位。每条链上的CDR开始于N-末端并按CDR1、CDR2和CDR3连续排列。它们通过它们所定位于其上的链被区分开。
如本文所使用的术语“人抗体”是完全由人免疫球蛋白的所有成分的氨基酸序列组成的分子，其包括互补决定区和框架区。人抗体通常被用于治疗人疾病，并具有至少三个潜在优点。第一，人抗体更优选通过例如补体依赖的细胞毒反应(CDC)或抗体依赖细胞介导的细胞毒反应(ADCC)与人免疫系统相互作用以更有效地消灭靶细胞。另一个优点是人免疫系统并不将人抗体识别为外源分子。此外，甚至当人抗体以更小的剂量或更低的频率进行施用时，它们的半衰期与人循环系统中天然存在的抗体的半衰期类似。在本发明的一个实施方案中，制备的是特异性结合L1CAM蛋白的人单克隆抗体，其所有氨基酸序列由人免疫球蛋白的氨基酸序列组成。由于人单克隆抗体具有源自人的重链和轻链结构域，它显示低免疫原性。因此，所述抗体可以被有效用于治疗癌症。
而且，如果本发明的抗体包括恒定结构域，它可以源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合体。
如本文所使用的术语“组合”是指编码相同起源的单链免疫球蛋白恒定区的多肽被连接至不同起源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。例如，二聚体或多聚体可以由选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的恒定结构域组成的组的两个或多个恒定结构域形成。
如本文所使用的术语“杂合体”是指编码不同起源的两个或多个重链恒定结构域的序列存在于单链免疫球蛋白重链恒定结构域中。例如，结构域杂合体可以由选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3和CH4组成的组的一至四个结构域组成。
如本文所使用的术语“特异性结合L1CAM(L1细胞粘附分子)的抗体”是指结合L1CAM蛋白以抑制L1CAM蛋白活性的抗体。相对于本发明的目的，所述特异性结合L1CAM的抗体是结合L1CAM的Ig5区的抗体，但并不限于此。
本发明的特异性结合L1CAM的抗体具有以高亲和力既结合人L1CAM蛋白又结合小鼠L1CAM蛋白的性质。不同于本发明的抗体，仅特异性结合人蛋白的抗体并不在移植了表达L1CAM的人癌症细胞的小鼠模型(异种移植模型)中结合在一些小鼠正常组织中而不在人癌细胞中表达的L1CAM蛋白。因此，存在以下缺点：抗癌效力不能被精确评估并且应当在灵长类动物(如猴)而不是小鼠中进行毒性测试。因此，本发明的抗体的优点在于它以高亲和力既结合人L1CAM蛋白又结合小鼠L1CAM蛋白，因此能够被用于在类似人临床试验的情况下在异种移植模型中的抗癌效力测试，并也能够被用于啮齿动物的毒性测试，导致临床前研究中的成本节约。
为了提高对人或/和小鼠L1CAM的亲和力，特异性结合L1CAM的抗体为在这样的抗体中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基的置换的抗体，所述抗体包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1、SEQ ID NO.3的重链CDR2和SEQ ID NO.4的重链CDR3的重链可变区以及含有SEQ ID NO.6的轻链CDR1、SEQ ID NO.7的轻链CDR2和SEQ ID NO.8的轻链CDR3的轻链可变区，优选地，SEQ ID NO.1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.5的轻链氨基酸序列。
具体地，所述抗体可以是除了包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1；SEQID NO.3的重链CDR2；和SEQ ID NO.4的重链CDR3以及SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.8的轻链CDR3的抗体以外的结合人L1CAM(L1细胞粘附分子)蛋白的抗体，其包括含有(i)SEQ IDNO.2的重链CDR1；(ii)选自SEQ ID NO.3的重链CDR2、具有将作为SEQID NO.3的重链CDR2的位置1的一种氨基酸的缬氨酸置换为苯丙氨酸的重链CDR2(SEQ ID NO.9)和具有将SEQ ID NO.3的重链CDR2的位置5的天冬氨酸置换为谷氨酸以及将作为位置1的一种氨基酸的缬氨酸置换为苯丙氨酸的重链CDR2(SEQ ID NO.16)；和(iii)SEQ ID NO.4的重链CDR3或具有将作为SEQ ID NO.4的重链CDR3的位置3的一种氨基酸的组氨酸置换为丙氨酸的重链CDR3(SEQ ID NO.10)中的任意一个的重链可变区；以及含有(iv)SEQ ID NO.6的轻链CDR1或具有将SEQ ID NO.6的轻链CDR1的位置8的一种氨基酸的异亮氨酸置换为丝氨酸的轻链CDR1(SEQ ID NO.17)；(v)SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和(vi)选自由SEQ ID NO.8的轻链CDR3、具有将作为SEQ ID NO.8的轻链CDR3的位置5的一种氨基酸的天冬氨酸置换为丙氨酸的轻链CDR3(SEQ ID NO.11)和SEQ ID NO.15的轻链CDR3组成的组的轻链CDR3的轻链可变区。
更优选地，所述抗体可以是结合人L1CAM(L1细胞粘附分子)蛋白的抗体，其包括含有(i)SEQ ID NO.2的重链CDR1；(ii)SEQ ID NO.9的重链CDR2或具有将作为SEQ ID NO.9的重链CDR2的位置5的一种氨基酸的天冬氨酸置换为谷氨酸的重链CDR2(SEQ ID NO.16)；和(iii)SEQ ID NO.10的重链CDR3的重链可变区；以及含有(iv)SEQ ID NO.6的轻链CDR1或具有将作为SEQ ID NO.6的轻链CDR1的位置8的一种氨基酸的异亮氨酸置换为丝氨酸的轻链CDR1(SEQ ID NO.17)；(v)SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和(vi)SEQ ID NO.11的轻链CDR3或SEQ ID NO.15的轻链CDR3中的任意一个轻链CDR3的轻链可变区。
在此，所述抗体的框架区(FR)的重链可变区可以优选包括SEQ ID NO.22的重链框架区1(FR1)或具有将作为SEQ ID NO.22的位置16的一种氨基酸的精氨酸置换为甘氨酸的FR1(SEQ ID NO.26)中的任意一个FR1；SEQID NO.23的FR2；SEQ ID NO.24或具有将作为SEQ ID NO.24的位置10的一种氨基酸的赖氨酸置换为丙氨酸和将作为位置22的一种氨基酸的脯氨酸置换为丙氨酸的FR3(SEQ ID NO.27)中的任意一个FR3；和SEQ ID NO.25的FR4，以及轻链可变区可以包括SEQ ID NO.28的FR1；SEQ ID NO.29的轻链FR2或具有将作为SEQ ID NO.29的位置3的一种氨基酸的精氨酸置换为谷氨酰胺、将作为位置5的一种氨基酸的精氨酸置换为赖氨酸和将作为位置8的一种氨基酸的赖氨酸置换为谷氨酰胺的轻链FR2；SEQ ID NO.30的轻链FR3(SEQ ID NO.32)或具有将作为SEQ ID NO.30的位置19的一种氨基酸的缬氨酸置换为异亮氨酸和将位置28的甘氨酸置换为丙氨酸的轻链FR3(SEQ ID NO.33)；和SEQ ID NO.31的轻链FR4。
在下文中，本发明的上述抗体将在下面进行更详细地描述。
本发明的特异性结合L1CAM的抗体可以优选特异性结合L1CAM(L1细胞粘附分子)的抗体，其包括SEQ ID NO.1的重链可变区和SEQ ID NO.5的轻链可变区。所述抗体可以是包括选自由以下组成的组的一个或多个突变的抗体：将作为SEQ ID NO.1的重链可变区的位置50的一种氨基酸残基的缬氨酸(V)置换为苯丙氨酸(F)和将作为位置101的一种氨基酸残基的组氨酸(H)置换为丙氨酸(A)，以及将作为轻链可变区的位置93的一种氨基酸残基的天冬氨酸(D)置换为丙氨酸(A)。
本发明的包括SEQ ID NO.1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.5的轻链氨基酸序列的抗体是结合L1CAM的单克隆抗体，其由本发明人开发并公开于韩国专利公开号10-2010-0064985中。在本说明书中，该抗体被命名为Ab4。所述Ab4抗体包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1；SEQ ID NO.3的重链CDR2；和SEQ ID NO.4的重链CDR3的重链可变区和SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.8的轻链CDR3，并包括含有SEQ IDNO.22的重链FR1；SEQ ID NO.23的重链FR2；SEQ ID NO.24的重链FR3；和SEQ ID NO.25的重链FR4的重链可变区，和SEQ ID NO.28的轻链FR1；SEQ ID NO.29的轻链FR2；SEQ ID NO.30的轻链FR3；和SEQ ID NO.31的轻链FR4。
为了开发比所述Ab4抗体显示出更高亲和力的抗体，本发明人在Ab4的许多氨基酸中鉴定了能够改善亲和力的具体氨基酸，并且本发明人通过突变组成重链和轻链可变区的一部分氨基酸开发了具有比已知Ab4高出40倍的结合亲和力的抗体。
在所述Ab4抗体的SEQ ID NO.1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.5的轻链氨基酸序列中，能够改善针对L1CAM蛋白的亲和力的氨基酸残基是位于Ab4的重链可变区(SEQ ID NO.1)的位置50的氨基酸残基的缬氨酸(位于重链CDR2中)、根据Kabat编号的Ab4的重链可变区的位置97的氨基酸残基并相应于SEQ ID NO.1的位置101的氨基酸残基的组氨酸(位于重链CDR3中)，和位于Ab4的轻链可变区(SEQ ID NO.2)的位置93的氨基酸残基的天冬氨酸(位于轻链CDR3中)，但并不限于这些。
位于所述Ab4抗体的重链可变区的位置50的氨基酸残基的缬氨酸位于重链CDR2中，并被苯丙氨酸(Phe)所取代以便针对人和小鼠L1CAM显示更高的亲和力。在本发明的一个实施方案中，当将作为所述Ab4抗体的位置50的一种氨基酸残基的缬氨酸被丙氨酸所取代时，与作为对照组的野生型Ab4抗体相比，所述抗体针对人和小鼠L1CAM蛋白显示显著降低的结合亲和力。相反，当缬氨酸被苯丙氨酸所取代时，所述抗体针对人和小鼠L1CAM蛋白显示高结合亲和力(图1a和1c；以及图2)。由在所述Ab4抗体的重链可变区的位置50的缬氨酸置换为苯丙氨酸所制备的Ab4抗体突变体被命名为‘V50F’，并且该抗体包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1；SEQ ID NO.9的重链CDR2；和SEQ ID NO.4的重链CDR3的重链可变区以及含有SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.8的轻链CDR3的轻链可变区。
而且，位于根据Kabat编号的所述Ab4抗体的重链可变区(SEQ ID NO.1)的位置97的氨基酸残基的组氨酸相应于SEQ ID NO.1的位置101的氨基酸残基并位于所述Ab4抗体的重链可变区的重链CDR3中。所述组氨酸被丙氨酸所取代以便针对人和小鼠L1CAM显示更高的亲和力。在本发明的一个实施方案中，抗体由位于根据Kabat编号的重链可变区的位置97的组氨酸置换为丙氨酸所制备并被命名为‘H97A’。不同于HCDR1至3的其它26个氨基酸残基，组氨酸被丙氨酸取代提高了针对人和小鼠L1CAM蛋白的结合亲和力(图1a)。该H97A抗体包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1；SEQ ID NO.3的重链CDR2；和SEQ ID NO.10的重链CDR3的重链可变区以及含有SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.8的轻链CDR3的轻链可变区，并提供针对人L1CAM的亲和力。在这方面，如通过竞争性ELI SA所测量的，针对人L1CAM的结合/解离常数(KD值)为2.9×10-8M。
而且，当所述Ab4抗体的重链可变区的缬氨酸和组氨酸分别被苯丙氨酸和丙氨酸所取代时，与Ab4相比，所述抗体表现出针对L1CAM的高亲和力。由两个氨基酸残基的取代所制备的该抗体被命名为‘V50F/H97A’，并且该V50F/H97A抗体包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1；SEQ ID NO.9的重链CDR2；和SEQ ID NO.10的重链CDR3的重链可变区以及SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.8的轻链CDR3。该V50F/H97A抗体提供针对人L1CAM的亲和力。在这方面，如通过竞争性ELISA所测量的，针对人L1CAM的结合/解离常数(KD值)为1.8×10-8M。
位于所述Ab4抗体的轻链可变区的位置93的氨基酸残基的天冬氨酸位于轻链CDR3(LCDR3)中，并被丙氨酸所取代以便针对人和小鼠L1CAM显示更高的亲和力。特别地，天冬氨酸被丙氨酸的取代显著提高针对人L1CAM的亲和力(图1b)。在本发明的一个实施方案中，由轻链可变区的位置93的天冬氨酸置换为丙氨酸所制备的抗体被命名为‘D93A’。该D93A抗体包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1；SEQ ID NO.3的重链CDR2；和SEQ ID NO.4的重链CDR3的重链可变区以及SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.11的轻链CDR3，并提供针对人L1CAM的亲和力。在这方面，如通过竞争性ELISA所测量的，针对人L1CAM的结合/解离常数(KD值)为3.0×10-8M。
而且，本发明的特异性结合L1CAM的抗体可以是由如所述Ab4抗体的重链可变区的SEQ ID NO.1的位置50的氨基酸残基的缬氨酸置换为苯丙氨酸和将作为位置101的氨基酸残基的组氨酸置换为丙氨酸以及将作为轻链可变区的SEQ ID NO.5的位置93的一种氨基酸残基的天冬氨酸置换为丙氨酸所制备的抗体。该抗体可以包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1；SEQ ID NO.9的重链CDR2；和SEQ ID NO.10的重链CDR3的重链可变区以及SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.11的轻链CDR3。
而且，除了位于SEQ ID NO.1的重链可变区和SEQ ID NO.5的轻链可变区的CDR的所述三个氨基酸残基，本发明的特异性结合L1CAM的抗体还可以包括选自由位于轻链可变区的位置75的缬氨酸置换为异亮氨酸和位于所述框架区的轻链可变区的位置84的甘氨酸置换为丙氨酸组成的组的一个或多个突变。位于轻链可变区的位置75的缬氨酸和位置84的甘氨酸是位于所述抗体的FR3中的氨基酸残基。当所述氨基酸残基被异亮氨酸和丙氨酸分别取代时，对L1CAM蛋白的抗原结合能力可被进一步改善。由异亮氨酸和丙氨酸两个残基同时取代所制备的FR3具有SEQ ID NO.33的氨基酸序列。
优选地，包括SEQ ID NO.1的重链可变区和SEQ ID NO.5的轻链可变区的特异性结合L1CAM的抗体可以是具有将作为SEQ ID NO.1的重链可变区的位置50的一种氨基酸残基的缬氨酸置换为苯丙氨酸和将作为SEQ ID NO.1重链可变区的位置101的一种氨基酸残基的组氨酸置换为丙氨酸，和将作为SEQ ID NO.5的轻链可变区的位置93的一种氨基酸残基的天冬氨酸置换为丙氨酸，和通过另外的将作为SEQ ID NO.5的轻链可变区的位置75的一种氨基酸残基的缬氨酸置换为异亮氨酸和将轻链可变区位置84的一种氨基酸残基的甘氨酸置换为丙氨酸的抗体。
所述抗体可以包括含有SEQ ID NO.2的重链CDR1；SEQ ID NO.9的重链CDR2；和SEQ ID NO.10的重链CDR3的重链可变区；以及SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.11的轻链CDR3，并且其重链框架区(FR)可以包括含有SEQ ID NO.22的重链FR1；SEQ IDNO.23的重链FR2；SEQ ID NO.24的重链FR3和SEQ ID NO.25的重链FR4的重链可变区，以及SEQ ID NO.28的轻链FR1；SEQ ID NO.29的轻链FR2；SEQ ID NO.30的轻链FR3；和SEQ ID NO.31的轻链FR4，或含有SEQ ID NO.22的重链FR1；SEQ ID NO.23的重链FR2；SEQ ID NO.24的重链FR3；和SEQ ID NO.25的重链FR4的重链可变区，以及SEQ ID NO.28的轻链FR1；SEQ ID NO.29的轻链FR2；SEQ ID NO.33的轻链FR3；和SEQ ID NO.31的轻链FR4，并且例如，所述抗体可以包括SEQ ID NO.12的重链可变区和SEQ ID NO.13的轻链可变区。
在本发明的一个实施方案中，包括SEQ ID NO.12的重链可变区和SEQID NO.13的轻链可变区的抗体被命名为‘Ab4M’。该Ab4M抗体提供针对人和小鼠L1CAM的亲和力。在这方面，如通过竞争性ELISA所测量的，Ab4M的针对人L1CAM的亲和力(KD值)为2.9×10-9M并且其针对小鼠L1CAM的亲和力(KD值)为2.2×10-10M，与如通过竞争性ELISA所测量的Ab4针对人L1CAM的亲和力(KD值)为1.3×10-7M并且其针对小鼠L1CAM的亲和力(KD值)为1.7×10-9M的结果相比，表明所述Ab4M抗体既针对人L1CAM蛋白又针对小鼠L1CAM蛋白提供显著改善的亲和力。
而且，本发明人鉴定了能够进一步改善所述Ab4M抗体的亲和力的最佳轻链CDR3序列(SEQ ID NO.15)，并开发了与Ab4M抗体相比其表达和亲和力得到改善的、被命名为Ab417的抗体。
与Ab4M抗体相比其表达和亲和力得到改善的抗体可以包括含有SEQID NO.2的重链CDR1；SEQ ID NO.9的重链CDR2；和SEQ ID NO.10的重链CDR3的重链可变区以及SEQ ID NO.6的轻链CDR1；SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和SEQ ID NO.15的轻链CDR3，并且其重链框架区(FR)可以包括含有SEQ ID NO.22的重链FR1；SEQ ID NO.23的重链FR2；SEQ IDNO.24的重链FR3；和SEQ ID NO.25的重链FR4的重链可变区，以及SEQID NO.28的轻链FR1；SEQ ID NO.29的轻链FR2；SEQ ID NO.30的轻链FR3；和SEQ ID NO.31的轻链FR4，或含有SEQ ID NO.22的重链FR1；SEQ ID NO.23的重链FR2；SEQ ID NO.24的重链FR3；和SEQ ID NO.25的重链FR4的重链可变区，以及SEQ ID NO.28的轻链FR1；SEQ ID NO.29的轻链FR2；SEQ ID NO.33的轻链FR3；和SEQ ID NO.31的轻链FR4，但并不限于此。例如，该抗体可以包括SEQ ID NO.12的重链可变区和SEQID NO.14的轻链可变区。该抗体提供针对人和小鼠L1CAM的亲和力。在这方面，如通过SPR所测量的，其针对人L1CAM的亲和力(KD值)为0.18×10-9M并且其针对小鼠L1CAM的亲和力(KD值)为34.8pM。而且，如通过竞争性ELISA所测量的，Ab417的针对人L1CAM的亲和力(KD值)为1.2×10-9M并且其针对小鼠L1CAM的亲和力(KD值)为2.1×10-10M。
而且，本发明人鉴定了能够保持或改善针对其抗原的结合亲和力和改善显示针对人和小鼠L1CAM蛋白的优异亲和力和优异抗癌活性的Ab417抗体中的生产力或物理性质的突变位点。
具体地，所述突变位点可以包括基于SEQ ID NO.12的重链可变区的将作为位置16的一种氨基酸残基的精氨酸置换为甘氨酸；将作为位置54的一种氨基酸残基的天冬氨酸置换为谷氨酸；将作为位置76的一种氨基酸残基的赖氨酸置换为丙氨酸；和将作为位置88的一种氨基酸残基的脯氨酸置换为丙氨酸中的一个或多个；以及基于SEQ ID NO.14的轻链可变区的将作为位置31的一种氨基酸残基的异亮氨酸置换为谷氨酸；将作为位置37的一种氨基酸残基的精氨酸置换为谷氨酰胺；将作为位置39的一种氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸；和将作为位置42的一种氨基酸残基的赖氨酸置换为谷氨酰胺中的一个或多个。
用于在所述Ab417抗体中保持或改善针对其抗原的结合亲和力和改善其生产力或物理性质的重链可变区可以优选由基于SEQ ID NO.12的重链可变区的将作为位置16的一种氨基酸残基的精氨酸置换为甘氨酸，将作为位置76的一种氨基酸残基的赖氨酸置换为丙氨酸，和将作为位置88的一种氨基酸残基的脯氨酸置换为丙氨酸所制备的重链可变区(SEQ ID NO.20)；或具有基于SEQ ID NO.12的重链可变区的将作为位置16的一种氨基酸残基的精氨酸置换为甘氨酸，将作为位置76的一种氨基酸残基的赖氨酸置换为丙氨酸，将作为位置88的一种氨基酸残基的脯氨酸置换为丙氨酸，和将作为位置54的一种氨基酸残基的天冬氨酸置换为谷氨酸的重链可变区(SEQ ID NO.18)。在这些能够改善生产力和物理性质的残基中，位置16的氨基酸精氨酸位于重链FR1中，其可以由具有将作为SEQID NO.22的位置16的一种氨基酸残基的精氨酸置换为甘氨酸的FR1序列代表(SEQ ID NO.26)。而且，位置76的氨基酸赖氨酸和位置88的氨基酸脯氨酸位于FR3中，其可以由具有将作为SEQ ID NO.24的FR3的位置10的一种氨基酸残基的赖氨酸置换为丙氨酸和作为位置22的一种氨基酸残基的脯氨酸置换为丙氨酸的序列代表(SEQ ID NO.27)。在本发明中，SEQ ID NO.20的重链可变区被命名为‘H5’，并且SEQ ID NO.18的重链可变区被命名为‘H6’。
而且，用于在所述Ab417抗体中保持或改善针对其抗原的结合亲和力和改善其生产力或物理性质的轻链可变区可以优选由基于SEQ ID NO.14的轻链可变区的具有将作为位置31的一种氨基酸残基的异亮氨酸置换为丝氨酸的轻链可变区(SEQ ID NO.19)，或具有将作为位置37的一种氨基酸残基的精氨酸置换为谷氨酰胺，将作为位置39的一种氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸，和将作为位置42的一种氨基酸残基的赖氨酸置换为谷氨酰胺的轻链可变区(SEQ ID NO.21)。在此，由于位置31的氨基酸异亮氨酸位于LCDR1中，该置换相应于将作为SEQ ID NO.6的LCDR1的位置8的一种氨基酸的异亮氨酸置换为丝氨酸，并且它具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列。而且，由于位置37的氨基酸精氨酸，位置39的氨基酸精氨酸，和位置42的氨基酸赖氨酸位于轻链FR2中，所述置换相应于将作为SEQ ID NO.29的轻链FR2的位置3的一种氨基酸的精氨酸置换为谷氨酰胺，作为位置5的一种氨基酸的精氨酸置换为赖氨酸，和将作为位置8的一种氨基酸的赖氨酸置换为谷氨酰胺，并且它具有SEQ ID NO.32的氨基酸序列。
在本发明中，SEQ ID NO.19的轻链可变区被命名为‘L2’，并且SEQID NO.21的轻链可变区被命名为‘L1’。
通过Ab417抗体的突变以改善生产力和物理性质所制备的抗体可以优选为包括含有由SEQ ID NO.2的重链CDR1，由SEQ ID NO.16所代表的重链CDR2，和由SEQ ID NO.10所代表的重链CDR3的重链可变区，以及含有由SEQ ID NO.17所代表的轻链CDR1，由SEQ ID NO.7所代表的轻链CDR2，和由SEQ ID NO.15所代表的轻链CDR3的轻链可变区的抗体，并且更优选为包括SEQ ID NO.18的重链可变区(H6)以及SEQ ID NO.19的轻链可变区(L2)的抗体。在本发明的一个实施方案中，所述包括SEQ IDNO.18的重链可变区以及SEQ ID NO.19的轻链可变区的抗体被命名为‘Ab417-H6L2’。
通过Ab417抗体的突变以改善生产力和物理性质所制备的抗体可以优选为包括含有由SEQ ID NO.2所代表的重链CDR1，由SEQ ID NO.16所代表的重链CDR2，和由SEQ ID NO.10所代表的重链CDR3的重链可变区，以及含有由SEQ ID NO.6所代表的轻链CDR1，由SEQ ID NO.7所代表的轻链CDR2，和由SEQ ID NO.15所代表的轻链CDR3的轻链可变区的抗体，并且更优选为包括SEQ ID NO.18的重链可变区(H6)以及SEQ ID NO.21的轻链可变区(L1)的抗体。该抗体被命名为‘Ab417-H6L1’。
通过Ab417抗体的突变以改善生产力和物理性质所制备的抗体可以优选为包括含有由SEQ ID NO.2所代表的重链CDR1，由SEQ ID NO.9所代表的重链CDR2，和由SEQ ID NO.10所代表的重链CDR3的重链可变区，以及含有由SEQ ID NO.6所代表的轻链CDR1，由SEQ ID NO.7所代表的轻链CDR2，和由SEQ ID NO.15所代表的轻链CDR3的轻链可变区的抗体，并且更优选为包括SEQ ID NO.20的重链可变区以及SEQ ID NO.21的轻链可变区的抗体。在本发明的一个实施方案中，所述包括SEQ ID NO.20的重链可变区(H5)以及SEQ ID NO.21的轻链可变区(L1)的抗体被命名为‘Ab417-H5L1’。
通过Ab417抗体的突变以改善生产力和物理性质所制备的抗体可以优选为包括含有由SEQ ID NO.2所代表的重链CDR1，由SEQ ID NO.9所代表的重链CDR2，和由SEQ ID NO.10所代表的重链CDR3的重链可变区，以及含有由SEQ ID NO.17所代表的轻链CDR1，由SEQ ID NO.7所代表的轻链CDR2，和由SEQ ID NO.15所代表的轻链CDR3的轻链可变区的抗体，并且更优选为包括SEQ ID NO.20的重链可变区(H5)以及SEQ ID NO.19的轻链可变区(L2)的抗体。该抗体被命名为‘Ab417-H5L2’。
与现有抗体相比，本发明的各种结合L1CAM的抗体提供针对人和小鼠L1CAM的高亲和力，从而以高亲和力特异性结合L1CAM。因此，本发明的抗体可以被用于采用L1CAM抗原识别的任何应用。
在本发明的一个实施方案中，进行结合人和小鼠L1CAM的抗体Ab4的氨基酸的各种置换发现，根据Kabat进行编号的将作为重链可变区(SEQ IDNO.1)的位置97的一种氨基酸残基(SEQ ID NO.1的位置101的一种氨基酸残基)的组氨酸置换为丙氨酸(H97A)、作为重链可变区的位置50的一种氨基酸残基的缬氨酸置换为苯丙氨酸(V50F)和作为轻链可变区(SEQ ID NO.5)的位置93的一种氨基酸残基的天冬氨酸置换为丙氨酸(D93A)对于L1CAM亲和力的改善是重要的(图1)。特别地，由除了H97A、V50F、D93A的置换之外的另外的作为轻链可变区的位置75的一种氨基酸残基的缬氨酸置换为异亮氨酸和作为轻链可变区的位置84的一种氨基酸残基的甘氨酸置换为丙氨酸所制备的Ab4M抗体被发现具有既针对人又针对小鼠L1CAM的特异性，并比现有抗体Ab4的结合亲和力高大约45倍(图2至3)。而且，由于该抗体识别L1CAM蛋白，它经ADCC表现出对癌细胞的毒性和抗癌作用而没有体重减轻(图4至5)。为了进一步改善具有高亲和力的Ab4M抗体的亲和力，对Ab4M抗体的轻链CDR3进行另外的突变以开发出比Ab4M抗体具有更好地改善的亲和力的本发明的Ab417抗体。该抗体显示出其针对人L1CAM的亲和力是Ab4M抗体的两倍，并且它还是高表达的(图6至7)。另外，发现Ab417抗体识别L1CAM蛋白，从而经ADCC显示对癌细胞的毒性和抗癌作用而没有体重减轻(图8至9)。为了改善Ab417的物理性质或/和生产力，修饰Ab417的重链和轻链可变区以制备具有R16G、K76A或P88A的重链可变区(H6)；具有R16G、D54E、K76A和P88A的重链可变区(H5)；具有I31A的轻链可变区(L2)；和具有R37Q、R39K和K42Q的轻链可变区。检查了Ab417-H6L2和Ab417-H5L1的生产力和物理性质。其结果是，Ab417-H6L2具有与Ab417类似的针对L1CAM的抗原结合亲和力并显示出优异的生产力和物理性质。Ab417-H5L1也具有与Ab417类似的抗原结合亲和力并显示出改善的物理性质(实施例6)。这些结果表明本发明的抗体可以有效用于需要L1CAM识别的领域，例如具有L1CAM过表达的疾病的诊断和治疗。
在另一个方面，本发明提供用于制备所述抗体的方法。
本发明的抗体可以容易地使用已知的制备抗体的技术进行制备。例如，可以通过利用源自免疫动物的B淋巴细胞制备杂交瘤(Koeher andMilstein,1976,Nature,256:495)，或通过使用噬菌体展示技术开展单克隆抗体的制备方法，但并不限于此。可以容易地使用已知的制备抗体的技术开展单克隆抗体的制备方法。
使用噬菌体展示技术的抗体文库是这样的方法，其中不制备杂交瘤而从B淋巴细胞直接获得抗体基因以在噬菌体表面表达抗体。使用噬菌体展示技术能够避免与由B细胞永生化形成单克隆抗体有关常规困难。一般的噬菌体展示技术包括：1)将具有随机序列的寡核苷酸掺入对应于噬菌体外壳蛋白pIII(或pIV)的N-末端的基因位点；2)表达部分天然外壳蛋白和由具有随机序列的寡核苷酸编码的多肽的融合蛋白质；3)处理结合至由所述寡核苷酸编码的多肽的受体(acceptor)；4)使用具有低pH或键合竞争力的分子洗脱结合至所述受体的肽-噬菌体颗粒；5)在宿主细胞中通过淘选(pann i ng)过程扩增所洗脱的噬菌体；6)重复之前的过程至获得期望的水平；以及7)鉴定来自通过淘选所选择的噬菌体克隆的DNA序列的活性肽的序列。
优选地，使用噬菌体展示技术可以实现本发明的单克隆抗体的制备。本领域技术人员可以参考已知的噬菌体展示技术例如Barbas等(METHODS:A Companion to Methods in Enzymo logy 2:119，1991和J.Virol.2001Jul；75(14):6692-9)和Winter等(Ann.Rev.Immunol.12:433，1994)逐步进行本发明的制备方法。构建抗体文库有用的噬菌体可以是丝状噬菌体，其可以通过fd、M13、f1、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1或Pf3进行例举，但并不限于此。可以用于在所述丝状噬菌体表面展示外源基因的载体的例子包括噬菌体载体(fUSE5、fAFF1、fd-CAT1和fdtetDOG)、或噬菌粒载体(pHEN1、pComb3、pComb8或pSEX)，但并不限于此。被用来提供所需要的重组噬菌体扩增的成功再感染的野生型外壳蛋白的辅助噬菌体可以通过M13K07或VSCM13进行例举，但并不限于此。
而且，酵母展示技术是在酵母细胞表面表达蛋白质。由于酵母具有真核蛋白质表达系统，翻译后修饰发生于由该技术所表达的蛋白质中，从而与使用噬菌体或核糖体展示技术相比获得更接近于人蛋白质的重组蛋白质。而且，所述酵母展示技术具有以下优点：因为克隆通过FACS(荧光激活细胞分选)进行选择，克隆选择和定量分析可以同时进行。一般情况下，scFv抗体的酵母展示技术包括以下步骤：1)经短氨基酸接头向酵母细胞壁蛋白Aga2p的C-末端插入scFv文库和标签序列；2)将Aga2和scFv抗体基因经二硫键连接至酵母细胞壁蛋白Aga1以在酵母细胞表面表达所述基因；3)将抗原结合至酵母表面所表达的scFv抗体文库；4)处理能够特异性识别所述抗原和所述标签的荧光缀合的二抗；5)通过FACS选择表达抗原特异性scFv抗体的酵母细胞；以及6)获得通过FACS所选择的克隆的DNA序列信息以便确定具有高抗原结合能力的抗体可变区。
根据本发明的编码杂交瘤来源的单克隆抗体或噬菌体展示克隆的多核苷酸可以被容易地使用典型的工艺进行分离并测序。例如，可以采用被设计为特异性扩增来自杂交瘤或噬菌体模板DNA的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物。一旦分离了所述多核苷酸，它可以被插入表达载体，其然后被导入宿主细胞。所得到的宿主细胞(即转化体)可以生产所关注的单克隆抗体。因此，本发明的人单克隆抗体的制备方法可以包括扩增编码在携带编码人单克隆抗体的多核苷酸的表达载体中的人单克隆抗体的多核苷酸的步骤，但并不限于此。
在又一个方面，本发明提供编码所述抗体的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体和导入了所述载体的转化体。
所述抗体与如上所述的相同。
包括编码本发明中所提供的抗体的多核苷酸的表达载体可以包括但不限于允许所述多核苷酸在真核或原核细胞中的复制和/或表达的载体，所述细胞如哺乳动物细胞(例如人、猴、兔、大鼠、仓鼠、小鼠等)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(例如大肠杆菌)。优选地，所述载体可以为可操作地连接至合适的启动子的载体以便诱导所述多核苷酸在所述宿主细胞中的表达，并包括至少一个选择标记物。例如，所述多核苷酸可以被导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。
包括编码所述抗体的多核苷酸的表达载体可以是包括编码所述抗体各自的重链或轻链的各自的多核苷酸的表达载体，或包括既编码所述抗体的重链又编码所述抗体的轻链的多核苷酸的表达载体。
导入本发明中所提供的表达载体的转化体的例子包括但不限于细菌细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌)；酵母细胞；真菌(如毕赤巴斯德酵母)；昆虫细胞(如果蝇属、夜蛾属Sf9)；动物细胞(如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人类淋巴母细胞、COS、NSO(小鼠骨髓瘤)、293T、Bowes黑色素瘤细胞、HT-1080、BHK(幼仓鼠肾细胞)、HEK(人胚肾细胞)和PERC.6(人视网膜细胞))；和植物细胞，其通过导入所述表达载体进行转化。
如本文所使用的术语“导入”是指将包括编码所述抗体的多核苷酸的载体递送进入宿主细胞。可以使用本领域众所周知的各种方法进行所述导入，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质体转染和原生质体融合。转导是指所期望的物质经病毒颗粒在感染的基础上被转移至细胞的过程。此外，可以通过基因轰击将载体递送进入宿主细胞。在本发明中，导入与转化可以互换使用。
在又一个方面，本发明提供通过将药物缀合至所述抗体所制备的抗体-药物缀合物。
所述抗体与如上所述的相同。
如本文所使用的术语“抗体-药物缀合物”是指利用靶特异性、在血液循环过程中没有毒性和所述抗体的药物代谢动力学优点，通过将药物缀合至所述抗体所制备的物质。通常，该抗体-药物缀合物包括单克隆抗体-接头-药物的三个组分，并且该缀合物可以通过将药物递送至所述抗体靶向的细胞(特别是癌细胞)提高治疗效果。
如本文所使用的术语“药物”是指被直接或间接缀合至所述抗体以便实现所述抗体靶向的疾病的治疗的物质。能够结合所述抗体的药物包括放射性核素、药物、淋巴因子、毒素和双特异性抗体。所述放射性核素的例子包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、186Re，但并不限于此。所述药物或毒素的例子包括依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、顺铂及其类似物、博莱霉素、埃斯波霉素、5-氟尿嘧啶和美法仑和其它氮芥，但能够结合本发明的抗体的药物或毒素并不限于这些例子。
可以通过本领域已知的各种制备抗体-药物缀合物的方法制备所述抗体-药物缀合物。
在又一个方面，本发明提供包括所述抗体的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
由于所述抗体以高亲和力结合L1CAM蛋白、所述L1CAM蛋白已知在癌症中过表达并在癌症的生长和转移中发挥重要作用，它带来L1CAM蛋白的抑制、中和或细胞毒性，导致具有L1CAM过表达的疾病的预防或治疗。所述抗体与如上所述的相同。
如本文所使用的术语“癌症”并不特别限定，只要用本发明的抗体它是可预防的或可治疗的。所述癌症的例子包括胆管癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金病、淋巴瘤和多发性髓样血液癌症。如本文所使用的术语“预防”是指由于施用所述组合物导致癌症发作的抑制或延迟的作用，并且术语“治疗”是指由于施用所述组合物导致癌症症状的改善或所述症状的有益改变的作用。
所述药物组合物还可以包括药学可接受的载体。
如本文所使用的术语“药学可接受的载体”是指不会对生物体引起显著刺激且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。对于液体制剂，所述药学可接受的载体应当被灭菌并适合活体。例如，它可以包括盐水溶液、灭菌水、林格氏溶液、缓冲盐溶液、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或一种或多种以上的成分的混合物。如果必要的话，可以加入其它普通添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。另外，还可以加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂以将所述组合物配制成注射制剂(如水溶液、悬浮剂)和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。
所述药物组合物可以是各种口服或非口服剂型。所述药物组合物可与稀释剂或赋形剂(如填料、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等)组合配制。用于口服给药的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等的形式。关于这些固体制剂，本发明的化合物与至少一种赋形剂(如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶)组合配制。除了简单的赋形剂，可以使用润滑剂(如硬脂酸镁、滑石等)。用于口服给药的液体制剂是混悬液、内服的溶液、乳剂、糖浆剂等。除了简单的稀释剂(如水或液体石蜡)，可以在液体制剂中包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。另外，本发明的药物组合物可以是肠胃外剂型如无菌水溶液、非水性溶剂、混悬液、乳剂、冻干制剂、栓剂。丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射酯(如油酸乙酯)可被用于非水溶剂和混悬液。栓剂的基础材料包括Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂和甘油明胶。
所述药物组合物可以具有选自由片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、混悬液、内服的溶液、乳剂、糖浆剂、无菌水溶液、非水性溶剂、混悬液、乳剂、冻干制剂和栓剂组成的组的任意一种制剂。
本发明的组合物以药学有效量进行施用。
如本文所使用的术语“药学有效量”是指以合理的优点/风险比足以治疗疾病的量，其可以适用于医疗。有效剂量水平可以根据受试者的种类和严重程度、年龄、性别、癌症的类型、药物活性、对该药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄速率、治疗持续时间、或包括同时施用的药物的元素、或医疗领域中众所周知的其它元素来确定。本发明的组合物可以单独施用或与其它治疗剂组合施用，或者也可以顺序或者同时的方式与常规治疗剂一起进行施用。另外，可以单剂量或可被分成多个剂量施用所述组合物。鉴于上述所有因素，以能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量施用所述组合物是重要的，并且其可容易地由本领域技术人员确定。
在本发明的一个实施方案中，发现作为Ab4抗体的代表性抗体突变体的Ab4M和Ab417有效诱导ADCC并抑制癌症生长而没有体重减轻，从而被用于癌症的预防和治疗(图4、5、8和9)。
在又一个方面，本发明提供使用所述抗体用于治疗癌症的方法。
所述抗体和癌症与如上所述的相同。
所述用于治疗癌症的方法可以是包括给患有癌症或怀疑患有癌症的受试者施用包括所述抗体和药学可接受的载体的药物组合物的步骤的用于治疗癌症的方法。所述药学可接受的载体如上所述。所述用于治疗癌症的方法可以优选包括给患有癌症的受试者施用包括所述抗体的组合物的步骤的用于治疗癌症的方法。
所述受试者可以是哺乳动物(如牛、猪、绵羊、鸡、狗、人等)和鸟，并且它可以包括任何受试者，其癌症可以通过施用本发明的组合物进行治疗，而没有限制。
可以药学有效量以单剂量或多个剂量施用所述组合物。在这方面，可以溶液、粉剂、气雾剂、胶囊剂、肠溶片或胶囊剂或栓剂的形式施用所述组合物。施用模式包括腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内和直肠内，但并不限于此。但是，由于肽在口服施用后被消化，用于口服施用的组合物的活性成分应当被包衣或配制成防止在胃中的降解。此外，可以使用能够输送活性成分进入靶细胞的特定装置施用所述药物组合物。
在又一个方面，本发明提供用于给癌症诊断提供信息的方法，其包括检测从怀疑患有癌症的受试者分离的生物样品中L1CAM蛋白和所述抗体之间的抗原-抗体反应的步骤。该方法也可以是用于诊断癌症的方法。
所述抗体、癌症、受试者和L1CAM蛋白与如上所述的相同。已知L1CAM蛋白在各种癌症中过表达，并因此本发明的抗体可以被有效用于其中L1CAM蛋白过表达的癌症的诊断。
在所述用于给癌症诊断提供信息的方法中，可以通过将本发明的L1CAM特异性人单克隆抗体与从怀疑患有癌症的受试者分离的生物样品反应并且然后检测抗原-抗体复合体的形成来检测L1CAM蛋白。因此，可以提供信息用于癌症诊断。
详细地，所述方法可以是提供信息用于癌症诊断的方法或用于诊断癌症的方法，包括以下步骤：(a)用所述抗体处理从怀疑患有癌症的受试者分离的生物样品以便通过抗原-抗体反应检测L1CAM蛋白；(b)比较在(a)中与对照组中所检测的L1CAM蛋白水平，并且当L1CAM蛋白的水平比对照组的高时确定所述受试者为癌症患者。
如本文所使用的术语“生物样品”可以为组织、细胞、全血、血清、血浆流体、组织(脑、皮肤、淋巴结、脊髓)的现场验证的(autoptical)样品、细胞培养上清、破坏的真核细胞、细菌表达系统等，但并不限于此。可以通过将操作过的或非操作过的生物样品与本发明的抗体反应来检测L1CAM蛋白或癌症的存在
如本文所使用的术语“抗原-抗体复合体”是指所述样品中的L1CAM蛋白抗原和本发明的识别所述抗体的单克隆抗体的复合物质。可以通过选自由以下组成的组的任何方法监测这样的抗原-抗体复合体的形成：比色法、电化学法、荧光法、发光法、粒子计数法、视觉评估和闪烁计数法。但是所述方法并不限于上述例子并具有各种应用。
各种标记可被用于检测本发明中的抗原-抗体复合体。其具体的例子可以选自由酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒和放射性同位素组成的组，但并不限于此。
检测标记的例子包括作为酶标记的乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶和β-内酰胺酶；作为荧光标记的荧光素、Eu3+、Eu3+螯合物和穴状化合物；作为配体标记的生物素衍生物；作为发光标记的吖啶酯、异鲁米诺衍生物；作为微粒标记的胶体金、有色胶乳；和作为放射性同位素标记的57Co、3H、125I、125I-Bolton Hunter试剂。
优选地，可以通过使用酶联免疫吸附测定(EL I SA)来检测抗原-抗体复合体。ELISA技术包括各种ELISA方法，诸如使用标记的识别附着于支撑体上的抗原的抗体的直接ELISA；使用标记的识别抗原-抗体复合体的捕获抗体的二抗的间接ELISA，其中所述抗原附着于支撑体；使用另一种标记的抗体的直接夹心ELISA，所述抗体识别附着于支撑体的抗原-抗体复合体的抗原；和使用另一种标记的识别抗体的二抗的间接夹心ELISA，在与识别附着于支撑体的抗原-抗体复合体的抗原的所述抗体反应之后。
所述单克隆抗体可以具有可检测的标记。另外，可以通过处理另一种能够捕获所述单克隆抗体并具有可检测的标记的抗体来检测抗原-抗体复合体。
在又一个方面，本发明提供包括所述抗体的用于诊断癌症的组合物。
所述抗体和癌症与如上所述的相同。包括本发明的L1CAM蛋白-特异性抗体的诊断组合物可以被用于诊断疾病，其与L1CAM蛋白的表达或表达水平有关，例如癌症。
在又一个方面，本发明提供用于诊断癌症的试剂盒，其包括用于诊断癌症的组合物。
所述组合物和癌症与如上所述的相同。而且，用于诊断癌症的试剂盒还可以包括一种或多种组合物、溶液或装置，其适用于所述分析方法。
具体实施例
在下文中，本发明将被更详细地参考以下实施例进行说明。然而，这些实施例仅用于说明的目的，并且本发明不打算受这些实施例的限制。
实施例1.人和小鼠结合L1CAM的抗体Ab4的制备
人和小鼠结合L1CAM的抗体Ab4及其制备操作被公开于韩国专利公开号10-2008-0123667，并且其制备操作如下。
(实施例1-1)人L1CAM抗原和人L1CAM-Fc抗原的制备
为了制备人L1CAM抗原，将包括编码人L1CAM的细胞外结构域(位置1-1112的氨基酸残基；在下文中，称为‘人L1CAM’)的cDNA的表达质粒pJK-dhfr2-L1-单体(韩国专利号10-0931976)使用脂质体2000(Invitrogene,USA)转染至培养于含有10％胎牛血清的DMEM(Hyclone,USA)培养基中的HEK293T细胞，并在37℃、5％CO2的培养箱中培养4-6小时。然后，用无血清CD293(Gibco,USA)培养基替换所述培养基。细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养的同时，每三天用新鲜培养基替换所述培养基。收集上清三次，然后使用通过将A10-A3抗体结合CNBr琼脂糖(Amersham Phamacia,UK)所制备的柱进行亲和柱色谱。
为了制备人L1CAM-Fc抗原，将含有人L1CAM的细胞外结构域的序列(位置1－1112的氨基酸残基)的pJK-dhfr2-L1-单体(韩国专利号10-0931976)经受聚合酶链式反应(PCR)并将得到的DNA片段用EcoRI和XhoI处理，然后克隆入pJK-dhfr2-Fc的EcoRI和XhoI位点，并且所制备的质粒被命名为pJK-dhfr2-hL1Fc。
为了表达人L1CAM-Fc，将pJK-dhfr2-hL1Fc转染至HEK293T细胞，然后在无血清培养基中培养。培养上清经受使用蛋白G柱(Upstate,USA)的亲和色谱以纯化所述蛋白。
(实施例1-2)小鼠L1CAM抗原和小鼠L1CAM-Fc抗原的制备
为了制备小鼠L1CAM的细胞外结构域(在下文中，称为‘小鼠L1CAM’)，从pJK-dhfr-mL1-Fc表达载体合成小鼠L1CAM，并且从pJEX2T载体合成S1标签。通过PCR重组这两个DNA片段。将所重组的DNA片段克隆入pJK-dhfr-mL1-Fc表达载体的EcoRI和XhoI位点，并且所得到的小鼠L1CAM单体表达载体被命名为pJK-dhfr-mL1-S1。将该质粒转染至HEK293T，然后在无血清培养基中培养。收集上清并使用通过将KR127抗体结合至CNBr琼脂糖(Amersham Phamacia,UK)所制备的柱进行亲和柱色谱。
以小鼠L1CAM的细胞外结构域和人IgG1的Fc区的融合蛋白质的形式制备小鼠L1CAM-Fc抗原。首先，通过RT-PCR扩增从小鼠干细胞系SH-J1获得干细胞型L1CAM cDNA(与癌症型相同)并克隆和测序。为了制备仅表达小鼠L1CAM的细胞外结构域的载体，通过聚合酶链式反应扩增相应于小鼠L1CAM的氨基酸序列中位置1－1113的DNA片段，并且使用琼脂糖凝胶纯化试剂盒(iNtRON，韩国)来分离并纯化所得到DNA片段，然后克隆至pJK-dhfr2-Fc(其为具有人抗体IgG1的Fc的载体)的EcoRI和XhoI位点。所得到的表达载体DNA被命名为pJK-dhfr-mL1-Fc。将该质粒转染至HEK293T细胞，然后在无血清培养基中培养。培养上清经受使用蛋白G柱(Upstate,USA)的亲和色谱以纯化小鼠L1CAM-Fc。
(实施例1-3)既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM的Ab4抗体的开发
为了开发同时结合人L1CAM和小鼠L1CAM的抗体，人L1CAM被用作淘选的第一轮和第二轮中的抗原，并且小鼠L1CAM-Fc被用于淘选的第三轮中。其结果是，人L1CAM阳性克隆在淘选的第二轮中开始累积，并且在淘选的第三轮中获得既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM的克隆。
在淘选的第三轮之后，将洗脱的噬菌体稀释104、105和106倍，并感染大肠杆菌TG1，并置于2YTA固体培养基上，接着在37℃的培养箱中孵育过夜。随机选择125个克隆并分别接种于5ml的2YTA液体培养基，并在摇动下、在37℃的培养箱中培养直到每个克隆在600nm处的吸光度在0.7和0.8之间。接下来，加入IPTG至终浓度1mM，并且所述克隆在摇动下、在37℃的培养箱中培养过夜。然后，培养上清被回收并经受用于检测既识别人L1CAM又识别小鼠L1CAM的抗体的间接ELISA。
选择结合人L1CAM和小鼠L1CAM的21个克隆并且分离它们的质粒DNA并用限制性酶BstNI(罗氏公司(Roche),瑞士)进行消化。根据片段大小对克隆进行分组，并且选择具有不同片段大小的6个克隆(Ab4、Ab6、Ab8、Ab10、Ab12和Ab13)，接着测序。其结果是，发现所述克隆彼此不同。
为了分析6个不同克隆针对人L1CAM和小鼠L1CAM的结合能力，进行了间接ELISA。其结果是，发现Ab4显示最高的抗原结合能力。
接下来，通过聚合酶链式反应从Ab4扩增重链可变区和轻链可变区，并在1.5％琼脂糖凝胶(Cambrex)上进行分离，接着使用Zymo凝胶提取试剂盒(Zymoresearch，USA)进行纯化以将Fab型Ab4转换成整个的Ig。而且，通过PCR从pdCMV-dhfrC(韩国专利号10-0476363)合成重链和轻链的前导序列，并使用1.5％琼脂糖凝胶(Cambrex)和Zymo凝胶提取试剂盒(Zymoresearch，USA)进行分离和纯化以在动物细胞中表达和生产所述抗体。接下来，通过重组PCR分别连接重链前导序列和重链可变区以及轻链前导序列和轻链可变区并使用1.5％琼脂糖凝胶(Cambrex)和Zymo凝胶提取试剂盒(Zymoresearch，USA)进行分离和纯化。此后，用限制性酶EcoRI(罗氏公司(Roche)，瑞士)和ApaI(罗氏公司(Roche)，瑞士)消化重链，并且用限制性酶HindIII(罗氏公司(Roche)，瑞士)和BsiWI(罗氏公司(Roche)，瑞士)消化轻链，并且将它们分别克隆至用相同的酶消化的pdCMV-dhfrC载体的重链和轻链恒定区的上游，然后纯化。所得到的被命名为pdCMV-dhfrC-Ab4。本发明人于2008年11月21日将所述pdCMV-dhfrC-Ab4表达载体保藏于韩国生物科学与生物技术研究所基因库(保藏号KCTC11431BP)。
由此获得的Ab4抗体是既针对人L1CAM又针对小鼠L1CAM具有高结合能力的抗体，并且其包括SEQ ID NO.1的重链可变区和SEQ ID NO.5的轻链可变区。
(实施例1-4)Ab4抗体的表位分析
L1CAM的细胞外结构域包括6个Ig-样结构域(Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5和Ig6)和5个FnIII结构域(Fn1、Fn2、Fn3、Fn4和Fn5)的11个结构域。为了检查Ab4结合哪个结构域，韩国专利申请号10-2006-0107428中所述的缺失L1CAM的突变体的人L1CAM-Fc和L1Ig(1-6)Fc、L1Ig(1-5)Fc、L1Ig(1-4)Fc、L1Ig(1-3)Fc和L1Fn(1-5)Fc蛋白经受8％的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)并转移至PVDF膜(Millipore,韩国)进行Western印迹。在这方面，Ab4抗体被用作一抗，并且抗hIgG(Fc)-HRP(Pierce,1/5000)用作二抗，并且ECL试剂(Amersham Biosciences)被用于检测。其结果是，所述Ab4抗体结合L1Fc、L1Ig(1-6)Fc和L1Ig(1-5)Fc，但不结合L1Ig(1-4)Fc、L1Ig(1-3)Fc和L1Fn(1-5)Fc。这些结果表明Ab4结合第五个免疫球蛋白结构域，L1CAM的Ig5。
实施例2.Ab4抗体的结合亲和力的改善
为了改善实施例1中所制备的Ab4抗体的结合人L1CAM的亲和力，检查了组成所述Ab4抗体的可变区的各自氨基酸对Ab4抗体的结合能力的作用。为此，构成Ab4抗体的重链可变区(在下文中，称为‘VH’，SEQ IDNO.1)的HCDR1(SEQ ID NO.2)、HCDR2(SEQ ID NO.3)、HCDR3(SEQID NO.4)和轻链可变区(在下文中，称为SEQ ID NO.5)的LCDR3(SEQID NO.8)的各自氨基酸被替换为丙氨酸，然后通过ELISA将针对人L1CAM和小鼠L1CAM的各自突变体的结合能力与现有Ab4抗体的结合能力比较如下。
(实施例2-1)HCDR的丙氨酸置换突变体的制备和抗原结合能力的分析
制备引物以通过聚合酶链式反应用丙氨酸替换组成Ab4抗体的HCDR的各自氨基酸残基，并且在1.5％琼脂糖凝胶上电泳反应产物。切出含有DNA的条带并使用Zymo凝胶提取试剂盒(Zymoresearch，USA)进行纯化。用限制性酶EcoR和Apa(Roche，德国)消化纯化的DNA的两端，并且也用相同的限制性酶消化要向其插入DNA片段的pdCMV-dhfrC-Ab4载体(登录号KCTC11431BP)的DNA。使用T4连接酶(TaKaRa，日本)连接两个DNA片段，并且将由此制备的质粒DNA转化入大肠杆菌DH5α用于扩增。
大量获得各自突变体的表达载体，并使用脂质体2000(invitrogen)转染人胚肾HEK293T细胞，接着培养。所转染的细胞生产并将整个抗体分泌出细胞，并且收集培养上清并经受间接ELISA如下。使用纯化的人L1CAM的细胞外结构域(在下文中，称为‘人L1CAM’)和纯化的小鼠L1CAM的细胞外结构域(在下文中，称为‘小鼠L1CAM’)作为抗原，以100ng/孔的浓度，在4℃包被96孔板(MaxiSorp，Nunc)过夜，所述抗原稀释于缓冲溶液(15mM Na2CO3、34.84mM NaHCO3，pH 9.6)中。第二天，用0.05％PBS-T缓冲溶液洗涤板两次。Difco脱脂牛奶(BD)以2％的浓度溶解于0.05％PBS-T缓冲溶液中，并且将其200μl加至每个孔，接着在37℃孵育1小时。然后，用0.05％PBS-T缓冲溶液洗涤孔两次。向板加入100μl上清并使其在37℃反应1小时。然后，用0.05％PBS-T缓冲溶液洗涤孔三次以去除非抗原结合抗体。加入作为二抗的特异性识别人抗体的Fc区的山羊抗人IgG(Fc)-HRP(Pierce，1/5000)，并使其在37℃反应1小时。然后，用0.05％PBS-T缓冲溶液洗涤孔四次以去除剩余的二抗。
为了通过显色检查所述亲和力，100μl含有作为HRP酶(其共价连接至二抗)的底物的TMB的溶液(BD OptEIA,BD)加至每个孔，并在室温孵育10分钟。然后，100μl的2.5M H2SO4溶液加至每个孔以终止酶促反应。终止所述反应之后，测量450nm处的吸光度(VERSAmax微孔板读板机(VERSAmax microplate reader)，分子仪器公司(Molecular Devices))。
如图1a中所示，间接ELISA的结果显示，与Ab4抗体相比，在重链可变区突变体中通过根据Kabat编号的位置97(SEQ ID NO.1的位置101的氨基酸残基)的组氨酸置换为丙氨酸所制备的突变体(在下文中，称为‘H97A’)具有既针对人L1CAM又针对小鼠L1CAM的提高的结合亲和力。
(实施例2-2)LCDR3的丙氨酸置换突变体的制备和抗原结合能力的分析
制备引物以通过聚合酶链式反应用丙氨酸替换组成Ab4抗体的LCDR3的各自氨基酸残基，并且在1.5％琼脂糖凝胶上电泳反应产物。切出含有DNA的条带并使用Zymo凝胶提取试剂盒(Zymoresearch，USA)进行纯化。
用限制性酶BsiI和HindIII(罗氏公司(Roche)，德国)消化纯化的DNA的两端，并且也用相同的限制性酶消化要向其插入DNA片段的pdCMV-dhfrC-Ab4载体的DNA。使用T4连接酶(TaKaRa，日本)连接两个DNA片段，并且将由此制备的质粒DNA转化入大肠杆菌DH5α用于扩增。
接下来，各自突变体被以实施例2-1中相同的方式转染入HEK293T细胞，并且从细胞培养物回收整个IgG并用于ELISA。
如图1b所示，与Ab4抗体相比，通过将作为位置93的一种氨基酸残基的天冬氨酸置换为丙氨酸所制备的突变体(D93A)具有既针对人L1CAM又针对小鼠L1CAM的提高的结合亲和力。
(实施例2-3)具有提高的抗原结合亲和力的Ab4突变体(Ab4M)的制备
将Ab4抗体的VH和VK的氨基酸序列与Ab4抗体所来源于的人抗体VH种系序列VH3-30和VL种系序列VK1-39进行比较。
凭借该工序，通过将现有Ab4抗体的轻链可变区FR3的位置75的缬氨酸(V)和位置84的甘氨酸分别置换为异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)来制备Ab4-V75I/G84A突变体。
Ab4VH的V50A突变体显示出比实施例2-1中Ab4更低的抗原结合能力(图1a)。为了检查除了丙氨酸的能够提高抗原结合能力的氨基酸残基，以如在实施例2-1中相同的方式制备并表达包括通过如Ab4VH的位置50的氨基酸残基的缬氨酸置换为谷氨酸(V50E)、苯丙氨酸(V50F)、精氨酸(V50R)或苏氨酸(V50T)所制备的重链突变体和V75I/G84A序列的轻链突变体的抗体，并且分析了它们针对人和小鼠L1CAM的抗原结合能力。结果示于图1c中。
如图1c中所示，与其它突变体不同，苯丙氨酸置换突变体(V50F)显示既针对人又针对小鼠L1CAM的显著提高的抗原结合能力。
另外，为了进一步改善V50F突变体的抗原结合能力，在实施例2-1和2-2中比Ab4显示出更高的抗原结合能力的VK的D93A突变和VH的H97A突变被纳入来制备具有Ab4抗体的VK的V75I、G84A、D93A和VH的V50F、H97A的突变体，并且该突变体被命名为‘Ab4M’。而且，具有Ab4M序列的表达载体被命名为pdCMV-dhfrC-Ab4M。
实施例3.Ab4M抗体的表征
(实施例3-1)抗体的纯化
为了比较Ab4抗体和实施例2中所制备的Ab4M抗体之间的抗原结合亲和力，纯化了所述抗体。而且，还纯化了Ab4的VH的H97A突变体(VH H97A)和VH的V50F/H97A突变体(VH V50F/H97A)以及VK的D93A突变体(VKD93A)。以如实施例2-1中相同的方式分别大量获得这些抗体的表达载体的质粒DNA，并在HEK293T细胞中表达。离心细胞培养物以仅收集上清。通过亲和色谱纯化所收集的上清。将各自上清上样至填充有偶联蛋白A珠的柱，并且使用0.1M柠檬酸溶液(pH 3.2)从蛋白A释放Ab4M抗体，并向所释放的抗体立即加入1.0M Tris溶液(pH 8.0)进行中和以保持所述抗体的结构。所纯化的抗体经受10％SDS-PAGE并进行考马斯染色，以便确认每条重链和轻链得到很好地表达并且它们被组装为I gG型。
(实施例3-2)抗体亲和力的测量
通过竞争性ELISA测量了所纯化的抗体针对人L1CAM的亲和力。制备密度1ⅹ10-6M的人L1CAM并使用PBS缓冲溶液连续稀释至1ⅹ10-11M。根据各自抗体的结合能力通过将它们用PBS缓冲溶液稀释制备成具体浓度的抗体。由此所稀释的抗原和抗体以相同的体积比互相进行反应，并使其在室温反应2小时。
使用稀释于缓冲溶液(15mM Na2CO3、34.84mM NaHCO3，pH 9.6)中的纯化的人L1CAM、以100ng/孔的浓度在4℃包被96孔板(MaxiSorp，Nunc)过夜。第二天，用0.05％PBS-T缓冲溶液洗涤板两次。Difco脱脂牛奶(BD)以2％的浓度溶解于0.05％PBS-T缓冲溶液中，并且将其200μl加至每个孔，接着在室温孵育1小时。然后，用0.05％PBS-T缓冲溶液洗涤孔两次。向板加入100μl所述反应了2小时的抗原/抗体反应物并使其在室温反应1小时。然后，用0.05％PBS-T缓冲溶液洗涤孔三次以去除非抗原结合抗体。加入作为二抗的特异性识别人抗体的Fc区的山羊抗人IgG(Fc)-HRP(Pierce，1/5000)，并使其在室温反应1小时。然后，用0.05％PBS-T缓冲溶液洗涤孔四次以去除剩余的二抗。为了通过显色检查所述亲和力，100μl含有作为HRP酶(其共价连接至二抗)的底物的TMB的溶液(BD OptEIA,BD)加至每个孔，并在室温孵育10分钟。然后，100μl的2.5M H2SO4溶液加至每个孔以终止酶促反应。终止所述反应之后，测量450nm处的吸光度(VERSAmax微孔板读板机(VERSAmax microplatereader)，分子仪器公司(Molecul arDevices))。结果示于图2中。
如图2a中所示，Ab4针对人L1CAM的亲和力为1.3ⅹ10-7M，Ab4的VH H97A突变体的亲和力为2.9ⅹ10-8M，VH V50F/H97A突变体的亲和力为1.8ⅹ10-8M，VKD93A突变体的亲和力为3.0ⅹ10-8M，以及Ab4M的亲和力为2.9ⅹ10-9M，表明本发明的Ab4抗体的所有突变体显示出优异的亲和力，并且其中，Ab4M显示出为Ab4的亲和力大约45倍的高亲和力从而具有针对人L1CAM的优异的结合亲和力。
如图2c中所示，测量了Ab4和Ab4M针对小鼠L1CAM的亲和力，并且结果显示它们的亲和力分别为1.7ⅹ10-9M和2.2ⅹ10-10M并且Ab4M显示出为Ab4的亲和力大约8倍的高亲和力，表明与Ab4抗体相比，本发明的Ab4M抗体具有既针对人L1CAM又针对小鼠L1CAM的优异的结合亲和力。
(实施例3-3)Ab4M的抗原结合特异性的分析
为了检查Ab4M抗体是否选择性结合人和小鼠L1CAM，使用各种类型的细胞进行了流式细胞术。在这方面，使用结合人L1CAM但不结合小鼠L1CAM的嵌合A10-A3抗体(cA10-A3，Lee等，EMM 4:293-302，2012)作为比较抗体。
培养了作为不表达人L1CAM的细胞的HEK293T、胰腺癌细胞系CFPAC(ATCC号CRL-1918)和CHO-DG44(ATCC号PTA-3356)。培养了作为表达人L1CAM的细胞的胆管癌细胞系Choi-CK(Min等，Clin Cancer Res.16:3571-80,2010)。培养了作为过表达人L1CAM的细胞的胆管癌细胞系SCK-L1(Min等，Clin Cancer Res.16:3571-80，2010)。培养了作为表达小鼠L1CAM的细胞的黑色素瘤细胞系B16F1(ATCC号CRL-6323)。使用解离缓冲液(GIBCO，invitrogen)收获所培养的细胞，然后重悬于1％PBA溶液中，并置于冰上20分钟。然后，将所述细胞以2ⅹ105/孔的密度加至96孔RV板(B i oneer)。
将纯化的Ab4M抗体以10μg/ml的浓度稀释于PBS溶液，并且将其1μg加至每个孔并与细胞混合好。将板置于冰上1小时。在这方面，在相同的条件下处理作为Ab4M的阴性对照的人IgG抗体(Pierce)。向每个孔加入作为二抗的0.5μg的抗体(Sigma)(其特异性结合人IgG的Fc区并共价连接FITC)并混合，然后将该板包裹箔片以阻挡光线，并使其在冰上反应1小时。对其用染色试剂PI以1:100的比进行处理来评价细胞活力。所有反应完成之后，检测细胞中的FITC和PI荧光信号，并且结果示于图3中。
如图3中所示，结果显示Ab4M抗体几乎不结合L1CAM阴性细胞HEK293T、CFPAC和CHO-DG44，并明显结合L1CAM阳性细胞SCK-L1和Choi-CK以及B16F1。结果还显示对照组不结合小鼠L1CAM但特异性结合人L1CAM的cA10-A3抗体不结合小鼠黑色素瘤细胞系B166F1但结合表达L1CAM的人细胞系，表明本发明的Ab4M抗体是特异性既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM的抗体。
(实施例3-4)Ab4M通过ADCC(抗体依赖细胞毒作用)的癌细胞毒性的测定
为了检查Ab4M抗体是否表现出ADCC，SCK-L1细胞被用作靶细胞，并且人PBMC细胞被用作效应细胞以进行LDH测定(乳酸脱氢酶测定，细胞毒性检测试剂盒(LDH)，罗氏应用科学(Roche Applied Science))。
详细地，将50μl含有靶细胞SCK-L1(5×103个细胞)的RPMI-1640培养基(无酚红，含有1％FBS)加至96孔组织培养板的每个孔，并且25μl的Ab4M抗体溶液以10、1、0.1、0.01、0.001或0μg/ml的浓度加入其中，并混合好，接着孵育15分钟(37℃，5.0％CO2)。向其加入25μl的含有在加入之前才分离的人PBMC(1.5×105个细胞)的RPMI-1640培养基(无酚红，含有1％FBS)，接着在培养箱中孵育4小时(37℃，5.0％CO2)。为了测量来自抗体通过ADCC破坏的靶细胞的LDH活性，将LDH测定试剂盒中含有的100μl试剂加至每个孔，接着在室温孵育5分钟。此后，向每个孔加入在该试剂盒中含有的50μl反应终止试剂，并通过摇动混合10分钟。终止实验之后，读取96孔组织培养板在492nm处的OD(光密度)。
通过使用下列等式计算特异性裂解(％)来获得PBMC和靶细胞通过抗体的特异性细胞毒性(ADCC)：
特异性裂解(％)＝[(特异性释放－非特异性释放)/(最大释放－自发释放)]×100
其中特异性释放代表在加入所有的靶细胞、效应细胞和抗体之后样品反应获得的OD值，非特异性释放代表仅加入靶细胞和效应细胞之后样品反应获得的OD值，最大释放代表通过使用所述试剂盒中提供的细胞裂解试剂培养所述靶细胞从样品获得的OD值，以及自发释放代表仅加入靶细胞和抗体之后从样品获得的值。
其结果是，随着Ab4M的浓度提高，对SCK-L1细胞的ADCC也提高，表明Ab4M通过ADCC表现出对癌细胞的细胞毒性，从而具有抗癌作用。
(实施例3-5)Ab4M的抑制肿瘤生长作用的测定
为了检查Ab4M抗体的抗肿瘤作用，将人来源的胆管癌细胞系Choi-CK注射至裸鼠(BALB/c Slc-nu，SPF，Central.Lab.Animal Inc.)以产生肿瘤，然后将大约100mm3的肿瘤移植至裸鼠中。1周后，每10只小鼠用Ab4M抗体或阴性对照的Synagis抗体(帕利珠单抗)以10mg/kg的剂量进行静脉内注射(i.v.)，每周三次，共4周，并分别测量小鼠的肿瘤大小和体重并示于图5a和5b中。
如图6中所示，Ab4M抗体非常有效地抑制肿瘤生长而没有降低裸鼠的体重。
实施例4.Ab417抗体的制备
为了进一步改善Ab4M抗体针对L1CAM的亲和力，将Ab4M的VK LCDR3的突变体以scFv的形式展示于酵母表面，然后分离具有更高亲和力的突变体。
(实施例4-1)Ab4M scFv的酵母表面展示
Ab4M的scFv被制备并克隆入酵母展示表达载体(pYD1，invitrogen)。通过PCR合成Ab4M抗体的VH和VK，并合成编码现有scFv序列中(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3的核苷酸序列，然后通过重组PCR连接这些DNA片段以制备scFv基因。用SphI和EcoRI消化pYD1DNA，然后在琼脂糖凝胶上进行分离，并且所得到的DNA片段和之前合成的scFv DNA以1:5的比被转化入酵母株EBY100(Invitrogrn)，并通过同源重组在酵母中进行连接。通过转化获得的酵母转化体接种于含有半乳糖的培养基，并培养18至36小时以表达scFv形式的Ab4M抗体。
36小时后，仅收集酵母细胞并用通过向1×PBS缓冲溶液加入0.1％的BSA所制备的0.1％PBA缓冲溶液进行洗涤，并且向其加入被从1×10-5连续稀释至1×10-8M的人L1CAM的Ig5结构域-Fc融合蛋白，并使其室温反应1小时。反应后，用0.1％PBA缓冲溶液洗涤酵母细胞，然后与抗原-特异性抗体、山羊抗人IgG(Fc)-FITC以1:5000的比在室温反应1小时。反应后，用0.1％PBA缓冲溶液洗涤酵母细胞，然后在FACS Calibur(BD)中测量FITC信号以确定scFv形式的Ab4M抗体的抗原结合能力。结果示于图6a中。
其结果是，随着抗原浓度提高，scFv形式的Ab4M抗体的结合更强，表明Ab4M抗体以scFv的形式表达良好，并且Ab4M的scFv保持抗原结合能力(图6a)。
(实施例4-2)Ab4M scFv序列的突变和酵母表面展示
为了获得具有高亲和力的Ab4M突变体，预期与抗原直接相互作用的7个氨基酸残基(T91、H92、A93、T94、R95、Q95a和Y96)选自于组成LCDR3的10个氨基酸，并进行随机置换(T91、H92、A93、T94、R95、Q95a和Y96)。合成用于替换以XYZ编码(X编码38％G，19％A，26％T，17％C；Y编码31％G，34％A，17％T，18％C；Z编码24％G，76％C)7个氨基酸的密码子的引物(IDT,USA)以进行PCR。在这方面，为了提高PCR的精确性，使用Prime STAR(AKARA,日本)聚合酶。
通过将模板DNA在94℃预变性5分钟进行PCR。接下来，重复由94℃变性30秒、引物与模板55℃退火30秒和然后DNA在72℃延伸30秒组成的循环25次。25个循环之后，使DNA在72℃再延伸7分钟。通过PCR获得DNA片段以及用SphI和EcoRI消化的酵母展示表达载体被转化入酵母EBY100。所转化的酵母细胞被稀释10、102、105、1010倍，并被置于无色氨酸的培养基并在30℃孵育2天以计数所形成的克隆数。由此所获得的文库的多样性为2×109。
为了从文库选择具有针对人L1CAM的结合亲和力的突变体，进行MACS(磁激活细胞分选)。将转化体接种于含有半乳糖的培养基，并培养18至36小时以在酵母表面展示scFv。然后，收集酵母细胞并用0.1％PBA缓冲溶液进行洗涤，然后向其加入稀释为1×10-7M的人L1CAM的Ig5-Fc，并使其室温反应1小时。反应后，用0.1％PBA缓冲溶液洗涤酵母细胞，然后与抗原特异性蛋白G磁珠(NEB)混合，然后使其在4℃反应1小时。所反应的突变体由于磁珠显示出磁性。因此，当这些突变体被上样至固定于磁支持物(QuadroMACSTM分离单元，美天旎生物公司(MiltenyiBiotec))的柱(MACS分离柱，美天旎生物公司(Miltenyi Biotec))时，只有对人L1CAM抗原具有结合能力的突变体结合所述柱。从支持物分离所述柱以获得仅结合的突变体。对人L1CAM具有结合能力的突变体的数量为1.37×107。
为了从这些突变体中选择比Ab4M对人L1CAM具有更高结合能力的突变体，进行FACS分选。由于实施例3-1的FACS实验显示出Ab4M scFv一直具有抗原结合能力直到人L1CAM的浓度为1×10-8M，所使用的抗原浓度被测定为5×10-9M。由MACS获得的突变体以与上述相同方式被表达为scFv，以及收集酵母细胞并结合至浓度5×10-9M的抗原，接着FITC染色并通过FACS Aria(BD)进行分选。在这方面，为了选择仅具有改善的亲和力的突变体，确定门被以从全部突变体分选具有前0.1％的结合亲和力的突变体。分选两次，并从所得到的突变体中最终获得具有不同序列的48个突变体。
48个突变体全部被表达，并且分析它们的抗原结合能力和scFv的酵母表面展示。表达全部48个酵母克隆并收集5×106个酵母细胞并用0.1％PBA洗涤两次。向其加入1×10-8M的人L1CAM的Ig5-Fc作为抗原并将细胞悬浮好并在室温放置1小时，并使其结合scFv和抗原。用0.1％PBA洗涤细胞两次。为了检查ScFv的表面展示，V5标签特异性兔抗体(abcam，1.00mg/ml)结合至酵母，并用识别所述抗体的抗小鼠IgG-Cy5抗体(abcam，0.50mg/ml)染色。
为了检测抗原结合能力，结合Ig5-Fc(1×10-8M)，接着用抗人IgG(Fc)-FITC(Pierce，mg/ml)染色。将它们在4℃反应1小时，然后用0.1％PBA洗涤三次。反应后，收集酵母细胞并悬浮于0.1％PBA中，接着在FACS Calibur(BD)中进行FACS。FACS的结果是，发现了表现出与Ab4MscFv表达类似的表达但具有改善的抗原结合能力的突变体，其被命名为‘Ab4M-18’。
比较了在Ab4M和Ab4M-18之间的scFv表达水平和抗原结合能力，并示于图6b中。具体地，在图6b中，在纵轴上的增加值表示更高的表达水平，和在横轴上的增加值表示更高的抗原结合能力。即，由于在右上方(UR)象限中的高群体可以表明高表达和高抗体结合能力，并且Ab4M-18scFv比Ab4M scFv在右上方(UR)象限中显示更高的群体，表明抗体结合能力的改善。这些结果表明，与Ab4M相比，Ab4M-18具有优异的抗体结合能力和表达水平。
(实施例4-3)Ab4M-18抗体的密码子优化和提高的表达水平
为了提高Ab4M-18抗体在哺乳动物细胞中的表达水平，Ab4M-18抗体的重链和轻链的密码子针对哺乳动物细胞进行了优化。基于Ab4M-18的轻链和重链的氨基酸序列，针对哺乳动物细胞优化的核苷酸序列的信息获取自EnCor B iotechnology Inc.的主页(http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm)，并且轻链和重链的基因由IDT(U.S.A)合成。
用ApaI和NotI消化重链恒定区的密码子优化基因的两端，并克隆入pdCMV-dhfrC-Ab4M的ApaI-NotI位点，并且用EcoRI和ApaI消化密码子优化的VH基因的两端并克隆入包含密码子优化重链恒定区的载体。用BsiWI和XbaI消化轻链恒定区的密码子优化的基因的两端，并亚克隆入所得载体的BsiWI-XbaI位点。用HindIII和BsiWI消化密码子优化的VK基因的两端，并亚克隆入所得载体的HindIII-BsiWI位点。所得到的包括密码子优化的重链基因和轻链基因的表达载体被命名为pdCMV-dhfrC-Ab417。
将最终的pdCMV-dhfrC-Ab417载体以如实施例2中相同的方式转染至HEK293T细胞，然后培养于无血清培养基中。仅收集上清以使用人IgG作为标准通过夹心ELISA检查表达水平。其结果是，观察到表达水平提高大约20％。从pdCMV-dhfrC-Ab417载体表达的IgG被命名为‘Ab417’抗体。
实施例5.Ab417抗体的亲和力、特异性和效力的分析
(实施例5-1)Ab417抗体的生产和纯化
使用试剂盒(HiSpeed质粒抽提试剂盒(HiSpeed PlasmidMaxi Kit)，QIAGEN)分离并纯化大量pdCMV-dhfrC-Ab417质粒DNA。用500μl的150mM NaCl(pH 5.4)溶液分别稀释10μg所获得的质粒DNA和40μg的PEI(聚乙烯亚胺)，然后互相混合两个溶液并在室温放置15分钟。将该混合物均匀地喷洒到HEK293T细胞(70至80％密度)上，所述细胞以2×105个细胞/ml的密度培养于100mm2板中，并将其在37℃，5.0％CO2的培养箱中孵育6小时。6小时后，完全去除培养基，并且将所述细胞培养于10m l的无血清培养基中。3和6天后，仅收集上清。以与实施例2中相同的方式从所收集的上清纯化抗体。通过生物分析仪(Bioanalyzer)分析所纯化的抗体的纯度。
(实施例5-2)Ab417抗体亲和力的测量
通过与实施例3-2中相同的方式的竞争性ELISA测量纯化的Ab417抗体针对人L1CAM的亲和力。如图2b中所示，纯化的Ab417抗体针对人L1CAM的亲和力为1.2×10-9M，表明其亲和力是Ab4M亲和力(2.9×10-9M)的大约2.4倍，并且是Ab4亲和力(1.3×10-7M)的大约100倍。
如图2c中所示，Ab417抗体针对小鼠L1CAM的亲和力为2.1×10-10M，表明其亲和力与Ab4M针对小鼠L1CAM的亲和力(2.2×10-10M)类似，并且是Ab4亲和力(1.7×10-9M)的大约8倍。这些结果表明与Ab4抗体相比，本发明的Ab417抗体对人L1CAM又和小鼠L1CAM都具有非常优异的结合能力。
除了所述竞争性ELISA之外，还根据制造商的说明使用Octet RED(ForteBio，USA)测量了SPR(表面等离子体共振)以确定Ab417抗体和Ab4M抗体对人和小鼠L1CAM的亲和力。将所述抗体用PBS稀释为2μg/ml的浓度，然后用PBS连续稀释人L1CAM为100、50、25、12.5、6.25和0nM的浓度，并用PBS连续稀释小鼠L1CAM为30、10、3.3、1.1、0.37、0.12、0.04和0nM的浓度并将其每200μl加至不透明的96孔板，以防止光透射。使用AHC(抗人IgGFc捕获)传感器芯片，在以PBS溶液、抗体、PBS溶液、抗原和PBS溶液的顺序传送传感器芯片的同时，通过检查抗体与抗原的结合和解离时发生的折射率的变化来分析所述抗体与抗原的结合动力学。结果示于图7中。
其结果是，Ab417抗体针对人L1CAM的亲和力(KD)为0.18nM(Kon(1/Ms)＝1.27×105；Kdis(1/s)＝2.33×10-5)，并且Ab4M抗体针对人L1CAM的亲和力(KD)为0.33nM(Kon(1/Ms)＝1.30×105；Kdis(1/s)＝4.30×10-5)。而且，Ab417抗体针对小鼠L1CAM的亲和力(KD)为34.8pM(Kon(1/Ms)＝2.33×105；Kdis(1/s)＝8.10×10-6)，并且Ab4M抗体针对小鼠L1CAM的亲和力(KD)为89.3pM(Kon(1/Ms)＝2.49×105；Kdis(1/s)＝2.22×10-5)。这些结果表明Ab417抗体的亲和力是Ab4M的亲和力的大约2倍。
(实施例5-3)Ab417抗体的特异性的分析
通过与实施例3-2中相同的方式的流式细胞术分析了Ab417抗体对抗原的特异性，并且结果示于图3中。
其结果是，与Ab4M抗体类似，Ab417抗体也具有对人和小鼠L1CAM的特异性，表明Ab417抗体可以被用作既结合人L1CAM又结合小鼠L1CAM的抗体。
(实施例5-4)Ab417抗体依据ADCC的癌细胞毒性
为了测量Ab417抗体的ADCC，使用如实施例3-4中SCK-L1细胞作为靶细胞和人PBMC细胞作为效应细胞进行LDH测定以检测细胞毒性。结果示于图8中。
如图8中所示，随着Ab417的浓度提高，对SCK-L1细胞的ADCC也提高，表明本发明的Ab417抗体具有ADCC活性并因此本发明的抗体可以有效用于癌症的治疗。
(实施例5-5)Ab417抑制肿瘤生长作用的分析
为了研究Ab417抗体的抗肿瘤作用，如实施例3-5中制备胆管癌模型，并且每10只小鼠施用人IgG Fc(对照组，3.3mg/ml)或Ab417抗体(实验组，10mg/kg)，每周三次，总共9次，以检查抗肿瘤作用。结果示于图9中。
如图9a中所示，与施用阴性对照人IgG Fc的组相比，施用本发明的Ab417抗体的组显示出显著的抑制肿瘤生长的作用。而且，在完成所述施用之后，从裸鼠模型切除肿瘤并称重。其结果是，肿瘤的重量比对照组的小63％(图9b)。此外，在施用期间在小鼠中没有观察到体重减轻并且没有观察到抗体施用的毒性(图9c)。
因此，这些结果表明本发明的抗体对L1CAM具有高结合能力，从而可以被非常有效地用于癌症的预防和治疗。
实施例6.Ab417抗体突变体的制备和表征
(实施例6-1)Ab417-H6L2和Ab417-H5L1突变体的制备
为了提高Ab417抗体的生产力，通过将抗体可变区的表面的几个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基来改善Ab417抗体的可变区的理化性质，并检查了生产力的改善。被置换的氨基酸残基和克隆操作如下。
Ab417抗体的VH的位置16的精氨酸、位置76的赖氨酸和位置88的脯氨酸被分别替换为甘氨酸(R16G)、丙氨酸(K76A)和丙氨酸(P88A)，并且可发生翻译后修饰的位置54的天冬氨酸被替换为谷氨酸(D54E)。合成含有R16G、D54E、K76A和P88A的VH DNA并通过聚合酶链式反应与人重链恒定区(人C1)连接。在1.0％琼脂糖凝胶中使该反应产物经电泳，然后切出含有所合成的DNA的条带并使用Zymo凝胶提取试剂盒进行纯化。用限制性酶EcoRI和NotI消化纯化的重链DNA的两端，并亚克隆入克隆载体pcDNATM3.4(Life technologies)的EcoRI-NotI位点，其被命名为pcDNATM3.4-Ab417-H6。而且，合成含有R16G、K76A和P88A的VH DNA并通过聚合酶链式反应与人重链恒定区(人C1)连接。将其亚克隆入pcDNATM3.4的EcoRI-NotI位点，其被命名为pcDNATM3.4-Ab417-H5。分析被导入大肠杆菌DH5α的pcDNATM3.4-Ab417-H6和pcDNATM3.4-Ab417-H5的核苷酸序列，并确认上述氨基酸残基的置换。
通过将Ab417抗体的VK的位置31的异亮氨酸置换为丝氨酸所制备的I 31S突变体通过聚合酶链式反应与轻链恒定区(人C1)连接。在1.0％琼脂糖凝胶中使该反应产物经电泳，然后切出含有所合成的DNA的条带并使用Zymo凝胶提取试剂盒进行纯化。用限制性酶HindIII和XbaI消化纯化的轻链DNA的两端，并亚克隆入克隆载体pcDNATM3.4的HindIII-XbaI位点，其被命名为pcDNATM3.4-Ab417-L2。
为了降低Ab417的pI值，通过将Ab417抗体的VK的位置37的精氨酸置换为谷氨酰胺(R37Q)、位置39的精氨酸置换为赖氨酸(R39K)和位置42的赖氨酸置换为谷氨酰胺(K42Q)来制备突变体，然后通过聚合酶链式反应与人轻链恒定区连接。在1.0％琼脂糖凝胶中电泳该DNA产物，然后切出含有所合成的DNA的条带并使用Zymo凝胶提取试剂盒进行纯化。用限制性酶HindIII和XbaI消化纯化的轻链DNA的两端，并亚克隆入pcDNATM3.4的HindIII-XbaI位点，其被命名为pcDNATM3.4-Ab417-L1。分析被导入大肠杆菌DH5α的pcDNATM3.4-Ab417-L2和pcDNATM3.4-Ab417-L1的核苷酸序列，并确认上述氨基酸残基的置换。
(实施例6-2)Ab417-H6L2和Ab417-H5L1突变体的生产力的分析
将作为Ab417突变体的Ab417-H6L2和Ab417-H5L1的生产力与Ab417的生产力进行比较。为了表达Ab417-H6L2突变体，使用PureYieldTM质粒大提系统(PureYieldTMPlasmid Maxiprep System)(Promega)大量分离并纯化pcDNATM3.4-Ab417-H6和pcDNATM3.4-Ab417-L2质粒DNA，并以如实施例5-1相同的方式共转染至HEK293T细胞。为了表达Ab417-H5L1突变体，分离pcDNATM3.4-Ab417-H5和pcDNATM3.4-Ab417-L1质粒DNA并共转染至HEK293T细胞。在这方面，为了作为对照组表达Ab417抗体，分离pcDNATM3.4-Ab417-H和pcDNATM3.4-Ab417-L并共转染至HEK293T细胞。
培养所转染的细胞3天或6天，然后以如实施例2中相同的方式获得上清并纯化抗体。通过Nanodrop测量所纯化的抗体的量。
其结果是，与Ab417的生产力相比，Ab417-H5L1抗体的生产力没有得到提高，而与Ab417的生产力相比，Ab417-H6L2抗体的生产力提高了大约2.5倍。使用生物分析仪(Bioanalyzer)分析了所纯化的抗体的纯度。
(实施例6-3)Ab417-H6L2和Ab417-H5L1突变体的pI值的分析
为了检查Ab417-H6L2和Ab417-H5L1突变体的pI值，pH梯度预制凝胶IEF-PAG系统(Koma Biotech)被用于测量pI值。在这方面，也作为对照组分析了Ab417抗体的p I。每5μg的Ab417-H5L1、Ab417-H6L2抗体和Ab417抗体被加至pH梯度凝胶的每个孔，并且该凝胶填充有带正电荷的缓冲溶液和带负电荷的缓冲溶液，100V的电压被施加1小时和200V的电压2小时用于等电聚焦。在这方面，作为pI标记的IEF标记(Markers)3-10、SERVA Liquid Mix(SERVA Electrophoresis)和曲妥单抗(罗氏公司(Roche))抗体(其pI是已知的)也进行电泳。等电聚焦后，为了去除缓冲溶液的带正电荷的离子和带负电荷的离子，用三蒸水洗涤所述凝胶10分钟三次，并在10％的三氯乙酸溶液中固定10分钟和在1％的三氯乙酸溶液中固定16小时。固定后，用三蒸水洗涤所述凝胶10分钟三次，并用考马斯蓝R-250染色并用甲醇-乙酸溶液脱色以观察剩余的蛋白质条带。
其结果是，与Ab417抗体的pI值相比，Ab417-H5L1和Ab417-H6L2突变体的pI值降低了(参见图11)。这些结果表明具有降低的pI的Ab417-H5L1和Ab417-H6L2突变体的物理性质可能比Ab417抗体的物理性质更好，因为抗体结构表面上的高带正电荷的氨基酸残基与带负电荷的分子发生聚集。
(实施例6-4)Ab417-H6L2和Ab417-H5L1突变体的亲和力分析
为了将Ab417-H6L2和Ab417-H5L1突变体的抗原结合能力与Ab417的抗原结合能力进行比较，使用人L1CAM作为抗原进行ELISA。
其结果是，Ab417-H6L2和Ab417-H5L1突变体的抗原结合能力与Ab417的抗原结合能力类似。
总之，Ab417-H6L2突变体显示比Ab417抗体更高的生产力和更低的pI值，并且Ab417-H5L1突变体显示比Ab417抗体更低的pI值，但显示与Ab417类似的人L1CAM结合能力。
根据上面的描述，本领域技术人员应当理解的是本发明可以不同的具体形式实施而不改变其技术精神或基本特征。因此，应当理解的是上述实施方案并不是限制性的，而是在所有方面说明性的。本发明的保护范围由所附的权利要求书而不是其之前的说明书所定义，并因此落入权利要求书的边界和界限或这样的边界和界限的等价物范围内所有改变和修改因而被所述权利要求书所涵盖。
<110>    江原大学校产学协力团
         韩国生命工学研究院
<120>    特异性结合人和小鼠L1CAM的抗体及其用途
<130>    OPA13172-CN
<150>    KR 10-2012-0130590
<151>    2012-11-16
<160>    33
<170>    KopatentIn 2.0
<210>    1
<211>    121
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    Ab4的一个重链可变区
<400>    1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
             20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gly Arg His Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120   
<210>    2
<211>    5
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    Ab4的一个重链可变区的CDR1
<400>    2
Arg Phe Gly Met His
  1               5
<210>    3
<211>    17
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>     Ab4的一个重链可变区的CDR2
<400>    3
Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
  1               5                  10                  15
Gly
<210>    4
<211>    12
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>     Ab4的一个重链可变区的CDR3
<400>    4
Gly Arg His Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro
  1               5                  10       
<210>    5
<211>    108
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    Ab4的一个轻链可变区
<400>    5
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr
             20                  25                  30
Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Asp Thr Arg Gln
                 85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105           
<210>    6
<211>    11
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>     Ab4的一个轻链可变区的CDR1
<400>    6
Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr Val Asn
  1               5                  10   
<210>    7
<211>    7
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>     Ab4的一个轻链可变区的CDR2
<400>    7
Ala Ala Ser Asn Leu His Ser
  1               5       
<210>    8
<211>    10
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>     Ab4的一个轻链可变区的CDR3
<400>    8
Gln Gln Thr His Asp Thr Arg Gln Tyr Thr
  1               5                  10
<210>    9
<211>    17
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>     V50F的一个重链可变区的CDR2
<400>    9
Phe Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
  1               5                  10                  15
 Gly
<210>    10
<211>    12
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>     H97A的一个重链可变区的CDR3
<400>    10
Gly Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro
  1               5                  10       
<210>    11
<211>    10
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    D93A的一个轻链可变区的CDR3
<400>    11
Gln Gln Thr His Ala Thr Arg Gln Tyr Thr
  1               5                  10
<210>    12
<211>    121
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>     Ab4M和Ab417的一个重链可变区
<400>    12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
             20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120   
<210>    13
<211>    108
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    Ab4M的一个轻链可变区
<400>    13
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr
             20                  25                  30
Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Ala Thr Arg Gln
                 85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105           
<210>    14
<211>    108
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    Ab417的一个轻链可变区
<400>    14
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr
             20                  25                  30
Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Gly Arg Gly Val
                 85                  90                  95
Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105           
<210>    15
<211>    10
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    Ab417的LCDR3
<400>    15
Gln Gln Ser Ile Gly Arg Gly Val Val Thr
  1               5                  10
<210>    16
<211>    17
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    HCDR2 (H6)
<400>    16
Phe Ile Ser Asn Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
  1               5                  10                  15
Gly
<210>    17
<211>    11
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    LCDR1 (L2)
<400>    17
Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ser Tyr Val Asn
  1               5                  10   
<210>    18
<211>    121
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    重链可变区 (H6)
<400>    18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
             20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Asn Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ala Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120   
<210>    19
<211>    108
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    轻链可变区 (L2)
<400>    19
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Gly Arg Gly Val
                 85                  90                  95
Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105           
<210>    20
<211>    121
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    重链可变区 (H5)
<400>    20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
             20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ala Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Ser Gly Ser Leu Phe Asp Pro Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120   
<210>    21
<211>    108
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    轻链可变区 (L1)
<400>    21
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr
             20                  25                  30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Ser Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Gly Arg Gly Val
                 85                  90                  95
Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105           
<210>    22
<211>    30
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    HFR1
<400>    22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
             20                  25                  30
<210>    23
<211>    14
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    HFR2
<400>    23
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
  1               5                  10               
<210>    24
<211>    32
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    HFR3
<400>    24
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
             20                  25                  30
<210>    25
<211>    11
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    HFR4
<400>    25
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  1               5                  10   
<210>    26
<211>    30
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    HFR1 (H6)
<400>    26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
             20                  25                  30
<210>    27
<211>    32
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    HFR3 (H6)
<400>    27
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ala Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
             20                  25                  30
<210>    28
<211>    23
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    LFR1
<400>    28
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
             20           
<210>    29
<211>    15
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    LFR2
<400>    29
Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile Tyr
  1               5                  10                  15
<210>    30
<211>    32
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    LFR3
<400>    30
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
  1               5                  10                  15
Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys
             20                  25                  30
<210>    31
<211>    10
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    LFR4
<400>    31
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
  1               5                  10
<210>    32
<211>    15
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    LFR2 (L1)
<400>    32
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Ser Leu Ile Tyr
  1               5                  10                  15
<210>    33
<211>    32
<212>    PRT
<213>    人工序列
<220>
<223>    LFR3 (Ab4M)
<400>    33
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
  1               5                  10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
             20                  25                  30

Claims (25)

1.一种结合人L1CAM(L1细胞粘附分子)蛋白的抗体，其包含：
重链可变区，其包含(i)SEQ ID NO.2的重链CDR1；(ii)SEQ ID NO.9的重链CDR2或除了将作为位置5的一种氨基酸的天冬氨酸置换为谷氨酸以外的SEQ ID NO.9的重链CDR2；和(iii)SEQ ID NO.10的重链CDR3；以及
轻链可变区，其包含(i)SEQ ID NO.6的轻链CDR1或除了将作为位置8的一种氨基酸的异亮氨酸置换为丝氨酸以外的SEQ ID NO.6的轻链CDR1；(v)SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和(vi)SEQ ID NO.11的轻链CDR3或SEQID NO.15的轻链CDR3中的任意一个。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其包含SEQID NO.2的重链CDR1、SEQ ID NO.9的重链CDR2和SEQ ID NO.10的重链CDR3；以及
轻链可变区，其包含SEQ ID NO.6的轻链CDR1、SEQ ID NO.7的轻链CDR2和SEQ ID NO.11的轻链CDR3。
3.如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO.12的重链可变区和SEQ ID NO.13的轻链可变区。
4.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其包含SEQID NO.2的重链CDR1、SEQ ID NO.9的重链CDR2和SEQ ID NO.10的重链CDR3；以及
轻链可变区，其包含SEQ ID NO.6的轻链CDR1、SEQ ID NO.7的轻链CDR2和SEQ ID NO.15的轻链CDR3。
5.如权利要求4所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO.12的重链可变区和SEQ ID NO.14的轻链可变区。
6.如权利要求4所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO.20的重链可变区和SEQ ID NO.21的轻链可变区。
7.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其包含SEQID NO.2的重链CDR1、SEQ ID NO.16的重链CDR2和SEQ ID NO.10的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO.17的轻链CDR1、SEQ ID NO.7的轻链CDR2和SEQ ID NO.15的轻链CDR3。
8.如权利要求7所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO.18的重链可变区和SEQ ID NO.19的轻链可变区。
9.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其包含SEQID NO.2的重链CDR1、SEQ ID NO.16的重链CDR2和SEQ ID NO.10的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO.6的轻链CDR1、SEQ ID NO.7的轻链CDR2和SEQ ID NO.15的轻链CDR3。
10.如权利要求9所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO.18的重链可变区和SEQ ID NO.21的轻链可变区。
11.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，其包含SEQID NO.2的重链CDR1、SEQ ID NO.9的重链CDR2和SEQ ID NO.10的重链CDR3；以及
轻链可变区，其包含SEQ ID NO.17的轻链CDR1、SEQ ID NO.7的轻链CDR2和SEQ ID NO.15的轻链CDR3。
12.如权利要求11所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO.20的重链可变区和SEQ ID NO.19的轻链可变区。
13.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO.22的重链FR1(框架区1)或除了将作为位置16的一种氨基酸的精氨酸置换为甘氨酸以外的SEQ ID NO.22的重链FR1中的任意一个重链FR1；SEQ ID NO.23的FR2；SEQ ID NO.24的重链FR3或除了将作为位置10的一种氨基酸的赖氨酸置换为丙氨酸和将作为位置22的一种氨基酸的脯氨酸置换为丙氨酸以外的SEQ ID NO.24的重链FR3中的任意一个重链FR3；和SEQ ID NO.25的FR4，以及
其轻链可变区包含SEQ ID NO.28的FR1；SEQ ID NO.29的轻链FR2或除了将作为位置3的一种氨基酸的精氨酸置换为谷氨酰胺、将作为位置5的一种氨基酸的精氨酸置换为赖氨酸和将作为位置8的一种氨基酸的赖氨酸置换为谷氨酰胺以外的SEQ ID NO.29的轻链FR2；SEQ ID NO.30的轻链FR3或除了将作为位置19的一种氨基酸的缬氨酸置换为异亮氨酸和将作为位置28的一种氨基酸的甘氨酸置换为丙氨酸以外的SEQ ID NO.30的轻链FR3；以及SEQ IDNO.31的轻链FR4。
14.一种结合人L1CAM(L1细胞粘附分子)蛋白的抗体，其包含：
重链可变区，其包含(i)SEQ ID NO.2的重链CDR1；(ii)选自由以下组成的组的重链CDR2：SEQ ID NO.3的重链CDR2、除了将作为位置1的一种氨基酸的缬氨酸置换为苯丙氨酸以外的SEQ ID NO.3的重链CDR2和除了将作为位置1的一种氨基酸的缬氨酸置换为苯丙氨酸和将位置5的天冬氨酸置换为谷氨酸以外的SEQ ID NO.3的重链CDR2；和(iii)SEQ ID NO.4的重链CDR3或除了将作为位置3的一种氨基酸的组氨酸置换为丙氨酸以外的SEQ ID NO.4的重链CDR3中的任意一个重链CDR3；以及
轻链可变区，其包含(iv)SEQ ID NO.6的轻链CDR1或除了将作为位置8的一种氨基酸的异亮氨酸置换为丝氨酸以外的SEQ ID NO.6的轻链CDR1；(v)SEQ ID NO.7的轻链CDR2；和(vi)选自由以下组成的组的轻链CDR3：SEQ ID NO.8的轻链CDR3、除了将作为位置5的一种氨基酸的天冬氨酸置换为丙氨酸以外的SEQ ID NO.8的轻链CDR3和SEQ ID NO.15的轻链CDR3。
15.一种编码权利要求1至14任一项所述的抗体的多核苷酸。
16.一种包含权利要求15所述的多核苷酸的表达载体。
17.一种导入了权利要求16所述的表达载体的转化体。
18.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1至14任一项所述的抗体。
19.如权利要求18的所述组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：胆管癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、霍奇金病、淋巴瘤和多发性髓样血液癌症。
20.一种用于诊断癌症的方法，其包括通过使用权利要求1至14任一项所述的抗体经抗原-抗体反应检测从被怀疑患有癌症的个体分离的生物学样品中L1CAM(L1细胞粘附分子)蛋白的步骤。
21.一种用于诊断癌症的组合物，其包含权利要求1至14任一项所述的抗体。
22.一种用于诊断癌症的试剂盒，其包含权利要求21所述的组合物。
23.一种抗体-药物缀合物，其中将药物缀合至权利要求1至14任一项所述的抗体。
24.如权利要求23所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物是选自由以下组成的组的任何一种或多种放射性核素：3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、186Re，或选自由以下组成的组的任何一种或多种药物：依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、顺铂及其类似物、博莱霉素、埃斯波霉素、5-氟尿嘧啶和美法仑。
25.一种用于治疗癌症的方法，其包括向受试者施用权利要求1至14任一项所述的抗体的步骤。
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