CN110291110B - 特异性结合pauf蛋白的抗体及其用途 - Google Patents

特异性结合pauf蛋白的抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110291110B
CN110291110B CN201780072925.9A CN201780072925A CN110291110B CN 110291110 B CN110291110 B CN 110291110B CN 201780072925 A CN201780072925 A CN 201780072925A CN 110291110 B CN110291110 B CN 110291110B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
cancer
light chain
heavy chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780072925.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110291110A (zh
Inventor
高祥锡
金妍廷
尹昭恩
金松铁
洪承模
郑盛允
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanwha Chemical Corp
Research Foundation for Industry Academy Cooperation of Dong A University
Original Assignee
Hanwha Chemical Corp
Research Foundation for Industry Academy Cooperation of Dong A University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hanwha Chemical Corp, Research Foundation for Industry Academy Cooperation of Dong A University filed Critical Hanwha Chemical Corp
Publication of CN110291110A publication Critical patent/CN110291110A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110291110B publication Critical patent/CN110291110B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及特异性结合胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白的抗体及其用途。本发明的抗体以高特异性和亲和力结合PAUF蛋白，并抑制癌细胞的增殖、迁移、侵入和体内生长，从而有效地用于诊断和治疗其中PAUF蛋白过表达的疾病例如癌症的领域中。

Description

特异性结合PAUF蛋白的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及特异性结合胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白的抗体及其用途。
背景技术
目前临床使用的抗癌药物可分为化学治疗剂和生物治疗剂。过去积极开发的化学治疗剂是对癌细胞显示出毒性的药物。然而，这些药物的问题在于它们对正常细胞以及癌细胞都有毒，并且还具有耐受性。因此，这些药物的开发和使用存在局限性。因此，近年来，正在积极开发能够恢复或增加人体免疫功能从而削弱癌细胞活性的生物治疗剂作为替代方案。目前正在使用或正在开发的生物治疗剂的实例包括细胞因子、重组抗体(例如单克隆抗体)、核酸分子治疗剂、血管生成抑制剂等。
在生物治疗剂中，用于治疗的单克隆抗体的特征在于由于它们对靶标的高反应特异性而具有低副作用。抗体通过各种机制表现出治疗效果；例如，它们可以特异性结合相应的抗原以抑制信号转导或通过交联诱导细胞凋亡，另外，它们可以通过激活体内免疫系统而表现出治疗效果。因此，作为抗癌剂的单克隆抗体可以特异性地追踪癌细胞并抑制它们的活性，并诱导免疫应答，从而可以有效地去除癌细胞。因此，使用单克隆抗体的治疗正成为主流的癌症治疗。在这方面，已开发出单克隆抗体，例如雷莫芦单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗等，并用于治疗胃癌、乳腺癌、肝癌等。
同时，胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白在胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫颈癌等癌细胞中过表达，并参与肿瘤的发展和转移，已知其通过新的磷酸化模式上调和稳定β-连环蛋白，从而促进胰腺癌细胞的快速增殖(Experimental&Molecular Medicine，2011，43，82-90)。另外，由于据报道靶向PAUF蛋白的小干扰RNA可以减少胰腺癌细胞的迁移、侵袭和致瘤能力，因此人们越来越关注PAUF蛋白作为用于诊断、治疗癌症等的靶标(Cancer，Sci.，2009年5月，100(5)：828-836；Biochem Biophys Res Commun.2014年11月，454(1)：144-150)。在这方面，先前开发了用于诊断和治疗含有抗PAUF蛋白质人抗体的胰腺癌的组合物(KR专利号10-1098186)。然而，仍然需要开发对各种癌症的诊断和治疗具有优异效果，同时提高对PAUF蛋白质的结合能力和亲和力的抗体。
发明内容
[技术问题]
本发明人努力开发可以特异性结合PAUF蛋白质，并且对各种癌症的治疗和诊断表现出优异效果的抗体。因此，他们已经开发了基于抗PAUF小鼠抗体的嵌合和人源化抗体，并证实了这些抗体与现有抗-PAUF人抗体相比，对PAUF蛋白具有更高的亲和力和特异性，以及针对胰腺癌、卵巢癌等的更高抗癌活性，从而完成了本发明。
[技术方案]
本发明的一个目的是提供一种与胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白结合的抗体。
本发明的另一个目的是提供编码该抗体的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供含有该多核苷酸的表达载体。
本发明的另一个目的是提供引入有该表达载体转化体。
本发明的另一个目的是提供含有该抗体的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供预防或治疗癌症的方法，其包括将该抗体施用于受试者。
本发明的另一个目的是提供抑制癌细胞增殖、迁移或侵袭的方法，其包括将该抗体施用于受试者。
本发明的另一个目的是提供抗体-药物缀合物，其中药物与该抗体缀合。
本发明的另一个目的是提供含有该抗体的癌症诊断组合物。
本发明的另一个目的是提供含有该组合物的癌症诊断试剂盒。
本发明的另一个目的是提供癌症诊断方法，其包括使用该抗体通过抗原-抗体反应检测从怀疑患有癌症的受试者中分离的生物样品中的PAUF蛋白。
本发明的另一个目的是提供用于筛选预防或治疗癌症的物质的方法，其包括：(a)用预防或治疗癌症的候选物质处理癌细胞；(b)使用该抗体测量用候选物质处理的癌细胞中PAUF蛋白的水平；以及(c)当步骤(b)中PAUF蛋白的水平低于未用候选物质处理的癌细胞的PAUF蛋白水平时，确定步骤(a)中处理的候选物质是否可用作预防或治疗癌症的物质。
[本发明的有益效果]
本发明涉及特异性结合胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白的抗体及其用途。
本发明的抗体以高特异性和亲和力结合PAUF蛋白，从而抑制增殖、迁移、侵袭和体内生长，并因此本发明的抗体可有效地用于诊断和治疗疾病(例如其中PAUF蛋白过表达的癌症)的领域。
附图说明
图1显示了抗PAUF蛋白小鼠抗体2H2和20C5对PAUF蛋白的亲和力(A)和特异性(B)的图。
图2显示了说明2H2和20C5各自具有与PMAb83(即现有的抗PAUF蛋白质人抗体)不同的表位的图，且该图显示了生物素标记的2H2竞争性ELISA的结果。
图3显示了说明cPMAb22和cPMAb205(抗PAUF蛋白嵌合抗体)各自对PAUF蛋白的特异性的图。PMAb83(即人抗体)用作比较组。
图4显示了基于ELISA测定的结果，说明cPMAb22和cPMAb205各自对PAUF蛋白的亲和力的图。PMAb83(即人抗体)用作比较组。
图5显示了基于WST-1增殖测定的结果，说明cPMAb22对癌细胞增殖的抑制作用的图。具体地，证实了cPMAb22对BxPC-3(即胰腺癌细胞系)增殖的抑制作用。IgG用作对照组，且PMAb83用作对照组。
图6显示了基于迁移测定结果，说明cPMAb22对癌细胞迁移的抑制作用的图。具体地，证实了cPMAb22对CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)和AMCPAC04(即源自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)的抑制作用。PMAb83用作比较组。
图7显示了基于侵袭测定的结果说明cPMAb22对癌细胞侵袭的抑制作用的图。具体地，证实了cPMAb22对CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)和AMCPAC04(即源自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)的抑制作用。PMAb83用作比较组。
图8显示了基于ELISA测定的结果，说明PAUF蛋白的2H2-VH1-VL1，2H2-VH1-VL2和2H2-VH1-VL3(根据本发明实施方式制备的抗PAUF蛋白质人源化抗体)的亲和力的图。人抗体PMAb83用作比较组。cPMAb22(即嵌合抗体)和PMAb83(即人抗体)用作对照组。
图9显示了基于免疫印迹分析的结果，说明2H2-VH1-VL1，2H2-VH1-VL2和2H2-VH1-VL3的产量的图像，其中泳道1表示2H2-VH1-VL1，泳道2表示2H2-VH1-VL2，泳道3表示2H2-VH1-VL3，泳道4表示2H2-VH2-VL1，泳道5表示2H2-VH2-VL2，泳道6表示2H2-VH2-VL3，泳道7表示2H2-VH3-VL1，泳道8表示2H2-VH3-VL2，泳道9表示2H2-VH3-VL3，泳道1θ表示2H2-VH4-VL4，泳道A表示未离心的含蛋白质的培养基，泳道B表示离心除去碎片然后通过0.22μm过滤器过滤的含蛋白质的培养基，泳道C表示Fc蛋白。Fc蛋白用作对照组。
图10显示了说明人源化抗体2H2-VH1-VL1(即hPMAb22)对PAUF蛋白的特异性的图。PMAb83(即人抗体)用作比较组。
图11显示了基于表面等离子体共振(SPR)分析的结果，说明hPMAb22对PAUF蛋白的亲和力的图。PMAb83(即人抗体)用作比较组。
图12显示了说明hPMAb22具有与PMAb83(hPMAb22的抗PAUF人抗体)不同的表位的图，且该图显示了生物素标记的PMAb83竞争性ELISA的结果。
图13显示了基于WST-1增殖测定的结果，说明hPMAb22对癌细胞增殖的抑制作用的图。具体地，证实了hPMAb22对CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)的抑制作用。IgG用作对照组，且PMAb83用作对照组。
图14显示了基于迁移测定的结果，说明hPMAb22对癌细胞迁移的抑制作用的图。具体地，证实了hPMAb22对AMCPAC06(即源自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)和OVCAR-5(即卵巢癌细胞系)的抑制作用。PMAb83用作比较组。
图15显示了基于侵袭测定的结果，说明hPMAb22对癌细胞侵袭的抑制作用的图。具体地，证实了hPMAb22对AMCPAC04或AMCPAC06(即源自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)和OVCAR-5(即卵巢癌细胞系)的抑制作用。PMAb83用作比较组。
图16显示了说明hPMAb22的体内抗癌作用的图，并且从图中证实了通过施用hPMAb22减少了肿瘤的体积和重量。(吉西他滨)用作对照组。
具体实施方式
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了结合胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白的抗体。
在本发明中，发明人开发了抗体，每个抗体包括重链可变区，其包含SEQ ID NO：1的重链CDR1，SEQ ID NO：2或39的重链CDR2和SEQ ID NO：3、4或30的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：5的轻链CDR1，SEQ ID NO：6的轻链CDR2和SEQ ID NO：7或31的轻链CDR3。证实了这些抗体与常规PAUF抗体相比，PAUF蛋白显示出显著更高的亲和力和特异性，抑制各种癌症如胰腺癌、卵巢癌等的增殖、迁移和侵袭，并抑制癌症的体内生长。
如本文所用，术语“胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白”是指参与肿瘤发展和转移的蛋白质。据报道，PAUF蛋白在癌细胞中过表达，如胰腺癌，卵巢癌，结肠癌，子宫颈癌等，因此这些蛋白质可作为癌症诊断、治疗等的靶点(Cancer Sci.2009年5月，100(5)：828-36；BiochemBiophys Res Commun.2014年11月，454(1)：144-50)。
如本文所用，术语“抗体”是指作为能够特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，并且其包括与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子。本发明的抗体可包括所有多克隆抗体，单克隆抗体，完整抗体和抗体片段，以及嵌合抗体和二价或双特异性分子(例如双特异性抗体)，双抗体，三抗体和四抗体。另外，本发明的抗体包括对新生儿Fc受体(FcRn)具有结合功能的单链抗体，结痂蛋白，抗体恒定区的衍生物和基于蛋白质支架的人工抗体。
整个抗体具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，其中每条轻链通过二硫键与重链连接。整个抗体包括IgA，IgD，IgE，IgM和IgG，其中IgG包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4作为亚型。
抗体片段是指具有抗原结合功能的片段，其包括Fc，Fd，Fab，Fab′，Fv，F(ab′)2等。Fc是指与称作Fc受体的细胞表面受体相互作用的抗体尾部。Fd是指包含在Fab片段中的重链部分，F(ab′)2是指包含Fd，Fab，Fab′和Fv的片段。Fab具有由轻链和重链的可变区，轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1结构域)组成的结构，并且Fab具有一个抗原结合位点。Fab′与Fab的不同之处在于它具有在重链CH1结构域的C-末端包含至少一个半胱氨酸残基的铰链区。Fab′的铰链区中的半胱氨酸残基形成二硫键以产生F(ab′)2抗体。可变片段(Fv)是指仅具有重链可变区和轻链可变链的最小片段。二硫键稳定的Fv(dsFv)抗体片段的特征在于重链可变区和轻链可变区通过二硫键连接，而单链Fv(scFv)通常表征为重链可变区和轻链可变区通过肽接头由共价键连接。这些抗体片段可以使用蛋白酶获得(例如Fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性消化全长抗体获得，并且F(ab′)2片段可以通过用胃蛋白酶消化获得)，并且优选地，可以通过基因重组技术制备。
通常，免疫球蛋白具有重链和轻链，并且重链和轻链中的每一个包括恒定区和可变区。轻链和重链的可变区包括称为互补决定区(下文称“CDR”)的三个高变区和四个框架区(下文称为“FR”)。每条链的CDR主要具有结合抗原表位的作用，并且通常从N-末端开始依次称为CDR1，CDR2和CDR3。另外，每个链的FR可以从N-末端依次称为FR1，FR2，FR3和FR4。
在本发明中，重链的可变区可以称为“VH”；轻链的可变区可称为“VL”；重链的CDR可以称为“VH-CDR1”，“VH-CDR2”和“VH-CDR3”；轻链的CDR可以称为“VL-CDR1”，“VL-CDR2”和“VL-CDR3”；重链的FR可称为“VH-FR1”，“VH-FR2”，“VH-FR3”和“VH-FR4”；并且轻链的FR可以称为“VL-FR1”，“VL-FR2”，“VL-FR3”和“VL-FR4”。
另外，当本发明的抗体包括恒定区时，它们可包括衍生自IgG，IgA，IgD，IgE和IgM或其组合的恒定区，或其杂合体。
如本文所用，术语“组合”是指编码相同来源的单链免疫球蛋白恒定区的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。例如，二聚体或多聚体可以由选自IgG，IgA，IgD，IgE和IgM恒定区的两个或更多个恒定区形成。
如本文所用，术语“杂合体”是指对应于两个或更多个不同来源的免疫球蛋白重链恒定区的序列存在于免疫球蛋白重链恒定区的单链中的序列。例如，可能的杂合形式可以由1-4个结构域组成，所述结构域选自由IgG，IgA，IgD，IgE和IgM的CH1，CH2，CH3和CH4组成的组。
另外，在本发明中，抗体在其可变区和恒定区上可以是相同来源或不同来源，并且CDR和除CDR外的可变区和恒定区的来源可以相同或不同。
如本文所用，术语“特异性结合胰腺腺癌上调因子(PAUF)蛋白的抗体”是指可以结合PAUF蛋白从而抑制PAUF蛋白活性的抗体。
具体地，特异性结合胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白的抗体可以是小鼠抗体，嵌合抗体或人源化抗体。
具体地，本发明的每种抗体可包括：
重链可变区，其包含SEQ ID NO：1的重链CDR1；SEQ ID NO：2或39的重链CDR2；和SEQ ID NO：3、4或30的重链CDR3；和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：5的轻链CDR1；SEQ ID NO：6的轻链CDR2；和SEQ IDNO：7或31的轻链CDR3，
但抗体不限于此。
另外，本发明的每种抗体可包括：
重链可变区，其由SEQ ID NO：17、28或37的氨基酸序列组成；和
轻链可变区，其由SEQ ID NO：18、29或38的氨基酸序列组成，但抗体不限于此。
另外，本发明的每种抗体可包括抗体的重链可变区，其包括：
SEQ ID NO：8、19或32的重链框架区FR1；SEQ ID NO：9或20的重链FR2；SEQ ID NO：10、21或33的重链FR3；和SEQ ID NO：11、12、22、23或34的重链FR4；和
抗体的轻链可变区，其包括SEQ ID NO：13、24或35的轻链FR1；SEQ ID NO：14或25的轻链FR2；SEQ ID NO：15或26的轻链FR3；和SEQ ID NO：16、27或36的轻链FR4，
但抗体不限于此。
在本发明的一个实施方式中，与现有PAUF抗体相比具有改善的亲和力和特异性的本发明的每种抗体可以具体包括：
重链可变区，其包含SEQ ID NO：1的重链CDR1；SEQ ID NO：2或39的重链CDR2；和SEQ ID NO：3的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：5的轻链CDR1；SEQ ID NO：6的轻链CDR2；和SEQ ID NO：7的轻链CDR3；
重链可变区，其包含SEQ ID NO：1的重链CDR1；SEQ ID NO：2或39的重链CDR2；和SEQ ID NO：4的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：5的轻链CDR1；SEQ ID NO：6的轻链CDR2；和SEQ ID NO：7的轻链CDR3；
SEQ ID NO：8的重链FR1；SEQ ID NO：9的重链FR2；SEQ ID NO：10的重链FR3；和SEQID NO：11的重链FR4；和抗体的轻链可变区，其包括SEQ ID NO：13的轻链FR1；SEQ ID NO：14的轻链FR2；SEQ ID NO：15的轻链FR3；和SEQ ID NO：16的轻链FR4；或
SEQ ID NO：8的重链FR1；SEQ ID NO：9的重链FR2；SEQ ID NO：10的重链FR3；和SEQID NO：12的重链FR4；和抗体的轻链可变区，其包括SEQ ID NO：13的轻链FR1；SEQ ID NO：14的轻链FR2；SEQ ID NO：15的轻链FR3；和SEQ ID NO：16的轻链FR4；更具体地，
重链可变区，其包含由SEQ ID NO：17组成的重链；和由SEQ ID NO：18组成的轻链可变区，
但抗体不限于此。
在本发明的一个实施方式中，包含由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成的轻链可变区的抗体命名为“2H2”或“cPMAb22”。
另外，本发明的每种抗体可具体包括：
重链可变区，其包含SEQ ID NO：1的重链CDR1；SEQ ID NO：2或39的重链CDR2；和SEQ ID NO：3的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：5的轻链CDR1；SEQ ID NO：6的轻链CDR2；和SEQ ID NO：7的轻链CDR3；
重链可变区，其包含SEQ ID NO：1的重链CDR1；SEQ ID NO：2或39的重链CDR2；和SEQ ID NO：4的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：5的轻链CDR1；SEQ ID NO：6的轻链CDR2；和SEQ ID NO：7的轻链CDR3；
SEQ ID NO：19的重链FR1；SEQ ID NO：20的重链FR2；SEQ ID NO：21的重链FR3；和SEQ ID NO：22的重链FR4；和抗体的轻链可变区，其包括SEQ ID NO：24的轻链FR1；SEQ IDNO：25的轻链FR2；SEQ ID NO：26的轻链FR3；和SEQ ID NO：27的轻链FR4；或
SEQ ID NO：19的重链FR1；SEQ ID NO：20的重链FR2；SEQ ID NO：21的重链FR3；和SEQ ID NO：23的重链FR4；和抗体的轻链可变区，其包括SEQ ID NO：24的轻链FR1；SEQ IDNO：25的轻链FR2；SEQ ID NO：26的轻链FR3；和SEQ ID NO：27的轻链FR4；更具体地，
重链可变区，其包含由SEQ ID NO：28组成的重链；和由SEQ ID NO：29组成的轻链可变区，
但抗体不限于此。
在本发明的一个实施方式中，包含由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成的轻链可变区的抗体命名为“hPMAb22”。
另外，本发明的每种抗体可具体包括：
重链可变区，其包含SEQ ID NO：1的重链CDR1；SEQ ID NO：2或39的重链CDR2；和SEQ ID NO：30的重链CDR3；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：5的轻链CDR1；SEQ ID NO：6的轻链CDR2；和SEQ ID NO：31的轻链CDR3；要么
SEQ ID NO：32的重链FR1；SEQ ID NO：9的重链FR2；SEQ ID NO：33的重链FR3；和SEQ ID NO：34的重链FR4；和抗体的轻链可变区，其包括SEQ ID NO：35的轻链FR1；SEQ IDNO：14的轻链FR2；SEQ ID NO：15的轻链FR3；和SEQ ID NO：36的轻链FR4；更具体地，
重链可变区，其包含由SEQ ID NO：37组成的重链；和由SEQ ID NO：38组成的轻链可变区，
但抗体不限于此。
在本发明的一个实施方式中，包含由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：38的氨基酸序列组成的轻链可变区的抗体命名为“20C5”或“cPMAb205”。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明人开发了与PAUF蛋白结合的小鼠抗体(即2H2和20C5)，其嵌合抗体(即cPMAb22和cPMAb205)及其人源化抗体(即hPMAb22)，并且他们已经证实这些抗体可以以比现有PAUF抗体更高的特异性和亲和力结合PAUF蛋白(图1，3，4和8-11)。另外，本发明人已经证实这些抗体可以抑制卵巢癌细胞系以及胰腺癌患者的胰腺癌细胞系和胰腺癌细胞中癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并且还可以抑制体内生长的胰腺癌。此外，他们已经证实这些抗体的癌症治疗效果与PMAb83(对PAUF蛋白质特异的现有人抗体)相似或更好(图5-7和13-16)。
这些结果表明，与PAUF蛋白结合的本发明抗体可以有效地用于需要识别PAUF蛋白的领域，例如在PAUF蛋白过表达的疾病的诊断、治疗等中。
本发明的另一方面提供了编码本发明抗体的多核苷酸，含有该多核苷酸的表达载体，和引入有该表达载体的转化体。特别地，抗体的解释与上述相同。
在本发明中，含有编码抗体的多核苷酸的表达载体可以是能够在真核或原核细胞包括哺乳动物细胞(例如人，猴，兔，大鼠，仓鼠，小鼠等)，植物细胞，酵母细胞，昆虫细胞和细菌细胞(例如大肠杆菌等)中复制和/或表达多核苷酸的载体，并且优选地可以与合适的启动子可操作地连接，使得核苷酸可以在宿主细胞中表达并含有至少一种选择标记，但表达载体不特别限于此。例如，表达载体可以是将多核苷酸引入噬菌体，质粒，粘粒，微型染色体，病毒，逆转录病毒载体等的形式。
含有编码抗体的多核苷酸的表达载体可以是含有编码抗体重链或轻链的多核苷酸的表达载体，或含有编码重链和轻链两者的多核苷酸的表达载体。
在本发明中，引入表达载体的转化体可以是通过引入表达载体转化的细胞，包括细菌细胞(例如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌等)；酵母细胞；真菌细胞(例如巴斯德毕赤酵母等)，昆虫细胞(例如果蝇，夜蛾(Sf9)等)；动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，COS，小鼠骨髓瘤(NSO)，293T，弓形黑色素瘤细胞，HT-1080，幼仓鼠肾细胞(BHK)，人胚肾细胞(HEK)，PERC.6(人类视网膜细胞)等)；和植物细胞，但转化体不特别限于此。
如本文所用，术语“引入”是指用于将含有编码抗体的多核苷酸的载体递送至宿主细胞的方法。引入可以通过诸如磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体融合，脂质转染胺和本领域已知的原生质体融合的方法来实现。另外，如本文所用，术语“转染”是指通过感染使用病毒颗粒将物体递送到细胞中。另外，可以通过基因轰击等将载体引入宿主细胞中。在本发明中，术语“引入”可以与“转化”互换使用。
本发明的又一方面提供了含有抗体的用于预防或治疗癌症的药物组合物。
该抗体对癌症中过表达的PAUF蛋白显示出极高的亲和力和特异性。抗体可以抑制各种癌症(例如胰腺癌、卵巢癌等)的增殖、迁移和侵袭，此外，可以抑制癌症的体内生长。因此，本发明的抗体可以有效地用于预防或治疗PAUF蛋白过表达的疾病，例如癌症。特别地，抗体的解释与上述相同。
如本文所用，术语“癌症”是指由于身体组织的自主过度生长而异常生长的肿块，并且它包括但不限于任何类型的癌症，只要其可以通过本发明的抗体预防或治疗即可。癌症的具体实例可包括胰腺癌，胃癌，结肠癌，胆道癌，食道癌，直肠癌，口腔癌，咽癌，喉癌，肺癌，结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫颈癌，子宫内膜癌，前列腺癌，睾丸癌，膀胱癌，肾癌，肝癌，骨癌，结缔组织癌，皮肤癌，脑癌，甲状腺癌，白血病，霍奇金病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤血癌。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用上述组合物导致抑制或延迟癌症发作的任何作用，术语“治疗”是指通过施用上述组合物导致癌症症状改善或有利改变的任何作用。
药物组合物可以进一步含有药学上可接受的载体，并且载体可以含有非天然存在的载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指既不刺激生物也不干扰待施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。作为配制成液体溶液的组合物可接受的药物载体可以混合使用，选自盐水，无菌水，林格氏溶液，缓冲盐水，白蛋白注射液，右旋糖溶液，麦芽糊精溶液，甘油，乙醇及其混合物中的一种或多种，其适合于灭菌和体内使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，如抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂等。另外，通过进一步添加稀释剂，分散剂，表面活性剂，粘合剂和润滑剂，可以将根据本发明的药物组合物配制成可注射制剂(例如水溶液，悬浮液，乳液等)，丸剂，胶囊剂，颗粒剂和片剂。
药物组合物可以选自由片剂，丸剂，粉末，颗粒，胶囊，悬浮液，溶液，乳液，糖浆，无菌水溶液，非水溶剂，悬浮液，冻干制剂和栓剂组成的组中的任一种制剂制备，并且可以是用于口服或肠胃外施用的各种制剂。制剂可以使用常用的稀释剂或赋形剂制备，例如填充剂，增量剂，粘合剂，保湿剂，崩解剂，表面活性剂等。用于口服施用的固体制剂可以包括片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂。这些固体制剂可以通过添加至少一种赋形剂(例如淀粉，碳酸钙，蔗糖或乳糖，明胶等)来制备。另外，除了简单的赋形剂之外，还可以使用润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石等)。用于口服施用的液体制剂可以包括悬浮液，内用液体药物，乳液，糖浆等，并且除了简单的稀释剂如水和液体石蜡之外，还可以使用各种赋形剂，例如保湿剂，甜味剂，芳香剂和防腐剂。用于肠胃外施用的制剂可包括无菌水溶液，非水溶剂，悬浮液，乳液，冻干制剂，栓剂等。非水溶剂和悬浮液的实例可包括植物油(例如丙二醇，聚乙二醇和橄榄油)，可注射酯(例如油酸乙酯)等。用于栓剂的基质的实例可包括Witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂，甘草明胶等。
本发明的组合物可以以药学有效量施用。如本文所用，术语“药学有效量”是指足以以适合于医学治疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量的水平可以基于包括受试者种类，疾病严重程度，年龄，性别，疾病种类，药物活性，药物敏感性，施用时间，施用途径和溶出率，治疗时间的因素，包括同时组合使用的药物的因素和在医学领域众所周知的其它因素来确定。本发明的组合物可以作为单独的治疗剂，与其它治疗剂组合，或者与常规治疗剂相继或同时施用，并且可以施用一次或多次。重要的是，考虑到上述所有因素，药物组合物以能够获得最大效果的最小量施用而没有不利影响，并且本领域普通技术人员可以容易地确定药学有效量。
在本发明的一个具体实施方式中，证实了以高特异性和亲和力结合PAUF蛋白的抗体可以抑制卵巢癌细胞系以及来源于胰腺癌患者的胰腺癌细胞系和胰腺癌细胞中癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，还可以抑制胰腺癌的体内生长。此外，证实抗癌抗体的治疗效果与PMAb83(即现有的PAUF蛋白特异性人抗体)相似或更优(图5-7和13-16)。
这些结果表明，可以与本发明的PAUF蛋白结合的抗体可以有效地用于预防或治疗癌症。
本发明的又一方面提供了用于预防或治疗癌症的方法，其包括将上述抗体施用于受试者。
特别地，抗体、癌症、预防和治疗的解释与上述相同。
如本文所用，术语“受试者”包括已发展或有风险发展癌症的哺乳动物(例如大鼠，牛，猪，绵羊，鸡，狗，人等)，鸟等，但包括可以通过施用本发明的药物组合物来治疗癌症的任何受试者，而没有限制。
在本发明的预防或治疗癌症的方法中，用于施用组合物的施用途径和施用方法没有特别限制，可以使用任何施用途径和施用方法，只要该组合物可以到达目标部位即可。
具体地，组合物可以通过各种途径施用，包括口服和肠胃外途径。施用途径的非限制性实例可包括口服，直肠，局部，静脉内，腹膜内，肌肉内，动脉内，透皮，鼻内，吸入施用等。此外，组合物可通过能够将活性剂递送至靶细胞的任何装置施用。
本发明的又一方面提供了用于抑制癌细胞增殖、迁移或浸润的方法，其包括施用本发明的抗体。
特别地，关于抗体、受试者和癌症的解释与上述相同。
该抗体对癌症中过表达的PAUF蛋白显示出极高的亲和力和特异性。抗体可以抑制各种癌症(例如胰腺癌，卵巢癌等)的增殖、迁移和侵袭，此外，可以抑制癌症的体内生长。因此，本发明的抗体可以有效地用于癌细胞的预防或治疗。
本发明的又一方面提供了抗体-药物缀合物，其中药物与本发明的抗体缀合。
特别地，对抗体的解释与上述相同。
如本文所用，术语“抗体-药物缀合物”是指使用靶特异性、在血液循环期间无毒性和抗体的药代动力学优点将药物与抗体缀合的形式的物质。这种抗体-药物缀合物通常包括3种构成元素(即单克隆抗体-接头-药物)，并且可以通过将药物递送至抗体，特别是癌细胞靶向的细胞来改善抗体的治疗效果。
如本文所用，术语“药物”是指直接或间接与抗体缀合以实现抗体有效靶向的疾病治疗的物质。可以与抗体缀合的药物包括放射性核素，药物，淋巴因子，毒素，双特异性抗体等。此外，放射性核素的实例可包括3H，14C，32P，35S，36Cl，51Cr，57Co，58Co，59Fe，90y，125I，131I，186Re等，但放射性核素不限于此。另外，药物或毒素的实例可包括依托泊苷，替尼泊苷，阿霉素，道诺霉素，胭脂红霉素，氨基蝶呤，放线菌素，丝裂霉素，顺铂和顺铂类似物，博来霉素，埃斯哌霉素，5-氟尿嘧啶，美法仑，氮芥等，但可以与本发明的抗体缀合的药物或毒素不限于此。
可以使用本领域已知的制备各种抗体-药物缀合物的方法制备抗体-药物缀合物。
本发明的又一方面提供了含有本发明抗体的癌症诊断组合物。
特别地，抗体和癌症的解释与上述相同。
本发明的癌症诊断组合物含有各种抗体，其可以特异性结合在各种癌细胞中过表达的PAUF蛋白质，因此本发明的癌症诊断组合物可以有效地用于诊断与PAUF蛋白(例如癌症)的表达存在/不存在或表达水平相关的疾病。
本发明的又一方面提供了含有该组合物的癌症诊断试剂盒。
特别地，组合物和癌症的解释与上述相同。
本发明的癌症诊断试剂盒可以通过进一步包括具有一种或多种其它组分的组合物，溶液或适合于分析方法的装置来构成。
本发明的又一方面提供了癌症诊断方法，其包括使用本发明的抗体通过抗原-抗体反应检测从怀疑患有癌症的受试者分离的生物样品中的PAUF蛋白。
特别地，抗体、受试者和癌症的解释与上述相同。
由于已知PAUF蛋白在各种癌细胞中过表达，因此以高特异性和亲和力结合PAUF蛋白的本发明抗体可有效用于诊断与PAUF蛋白(例如癌症)的表达存在/不存在或表达水平相关的疾病。
癌症诊断方法可以通过使本发明的PAUF特异性抗体与从怀疑患有癌症的受试者分离的生物样品反应，然后检测抗原-抗体复合物的形成来检测PAUF蛋白，由此可以诊断癌症。
具体地，癌症诊断方法可以是这样的方法，其包括(a)将抗体用于治疗从怀疑患有癌症的受试者中分离的生物样品并通过抗原-抗体反应检测PAUF蛋白质，和(b)将在(a)中检测的PAUF蛋白质水平与对照组进行比较，并在PAUF蛋白质水平高于对照组时将受试者确定为癌症患者。
如本文所用，术语“生物样品”可包括组织，细胞，全血，血清，血浆，组织尸检样品(脑，皮肤，淋巴结，脊髓等)，细胞培养上清液，破裂的真核细胞，细菌表达系统等，但生物样品不限于此。PAUF蛋白的存在或癌症的存在可以通过使这些生物样品在有或没有操作的情况下与本发明抗体的反应来确认。
如本文所用，术语“抗原-抗体复合物”是指样品中PAUF蛋白的抗原与识别抗原的本发明抗体之间的缀合物。抗原-抗体复合物的形成可以通过任何方法检测，例如比色法，电化学法，荧光法，发光法，粒子计数法，视觉评估法，闪烁计数法等。用于检测抗原-抗体复合物形成的方法不限于此，但是各种应用是可能的。
各种标记可用于检测抗原-抗体复合物。标记的具体实例可包括酶，荧光材料，配体，发光材料，微粒，放射性同位素等，但标记不限于此。特别地，可用作检测标记的酶的实例可包括乙酰胆碱酯酶，碱性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，辣根过氧化物酶，β-内酰胺酶等；荧光材料的实例可包括荧光素，Eu3+，Eu3+螯合物，Eu3+穴状物等；配体的实例可包括生物素衍生物等；发光材料的实例可包括吖啶酯，异鲁米诺衍生物等；微粒的实例可包括胶体金，有色乳胶等，并且放射性同位素的实例可包括57Co，3H，125I，125I-Bonton Hunter试剂等。
本发明的又一方面提供了用于筛选预防或治疗癌症的物质的方法，其包括(a)用预防或治疗癌症的候选物质处理癌细胞；(b)使用本发明的抗体测量用候选物质处理的癌细胞中胰腺腺癌上调因子(PAUF)蛋白的水平；以及(c)当步骤(b)中PAUF蛋白的水平低于未用候选物质处理的癌细胞的PAUF蛋白水平时，确定步骤(a)中处理的候选物质是否可用作预防或治疗癌症的物质。
特别地，抗体、PAUF蛋白和癌症的解释与上述相同。
如本文所用，术语“用于预防或治疗癌症的候选物质”是预期治疗癌症的物质，并且可以使用任何能够直接或间接改进或改善癌症的物质而没有限制。候选物质包括预期用于治疗的所有物质，例如化合物，基因，蛋白质等。
在本发明中，可以使用本领域已知的方法进行用预防或治疗癌症的候选物质处理癌细胞的步骤(a)。在一个具体实施方式中，癌细胞可以用候选物质处理并一起培养，或者候选物质可以通过将其施用到含有癌细胞的活生物体中来治疗，但是该方法不限于此，并且本领域普通技术人员将能够使用适合于本发明目的的方法。
另外，测量PAUF蛋白质水平的步骤(b)可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法进行。在一个具体实施方式中，可以使用蛋白质印迹，共免疫沉淀测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)，组织学免疫染色，流式细胞术分析等，但是该方法不限于此，并且本领域普通技术人员将会能够使用适合于本发明目的的方法。
最后，步骤(c)涉及确定候选物质是否可用作预防或治疗癌症的物质，并且可降低PAUF蛋白(其在癌细胞中过表达并促进癌细胞的增殖，迁移，侵袭，生长等)水平的候选物质可用作预防和治疗癌症的物质。
[发明详述]
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明目的，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1.抗PAUF蛋白小鼠抗体的发现和确认
实施例1-1. 2H2和20C5的发现
为了开发靶向PAUF蛋白的抗体，首先使用结合PAUF蛋白的小鼠单克隆抗体。
具体地，以下列方法发现抗PAUF蛋白小鼠抗体。在将PAUF蛋白注射到小鼠中后，产生针对PAUF蛋白的抗体，并从小鼠的脾中分离B淋巴细胞。对分离的淋巴细胞进行高倍稀释，使得只有一个B淋巴细胞进入涂有PAUF蛋白的96孔板的每个孔中。然后，使用HRP标记的抗小鼠抗体筛选与PAUF蛋白结合的B淋巴细胞。
因此，发现了四种抗PAUF蛋白小鼠抗体(即2H2、4E6、11G6和20C5)，重链和轻链可变区，CDR和FR的序列描述于表中1和2。
[表1]2H2的氨基酸序列(抗PAUF蛋白小鼠抗体)
/>
[表2]20C5的氨基酸序列(抗PAUF蛋白小鼠抗体)
/>
实施例1-2.确认对PAUF蛋白的特异性
使用以下方法鉴定实施例1-1中发现的四种抗体(2H2、4E6、11G6和20C5)中对PAUF蛋白具有最高亲和力的抗体。
具体地，使用间接ELISA测试抗原-抗体的亲和力。用不同浓度的四种抗体(2H2、4E6、11G6和20C5)处理PAUF包被的免疫板，并使用HRP标记的抗小鼠抗体测量OD值。特别地，随着OD值变得更高，抗体对PAUF的亲和力变得更高。另外，为了测量对PAUF具有高亲和力的抗PAUF小鼠单克隆抗体与其它抗原蛋白的非特异性结合，用PAUF和未指定的抗原包被免疫板以进行间接ELISA。
因此，如图1A和1B所示，证实了两种抗体(2H2和20C5)与PAUF蛋白结合，与其它抗体相比具有更高的亲和力，并且两种抗体(2H2和20C5)对PAUF蛋白质具有极高的特异性。
实施例1-3.确认表位
为了证实实施例1-1中发现的2H2和20C5的表位，证实了这些抗体是否具有与8F3相同的表位，8F3是KR专利号10-1098186中公开的PAUF特异性人单克隆抗体(即PMAb83)。
具体地，进行生物素标记的2H2竞争性ELISA。用PAUF包被免疫板，然后以1∶0、1∶50、1∶100和1∶200的比例向其中加入生物素标记的2H2抗体和未用生物素标记的抗体。作为二抗，通过使用链霉抗生物素蛋白-HRP测量每种抗体的OD值来分析表位。特别地，当两种抗体具有相似的表位时，OD值随着未标记抗体的浓度增加而降低，而当两种抗体的表位彼此不同时，即使在未标记抗体的浓度增加时，OD值也不会改变。
因此，如图2所示，证实了2H2或20C5可以识别相似的表位，并且它们中的每一个具有与PMAb83不同的表位。
实施例2.抗PAUF蛋白嵌合抗体的制备及其特性的确认
实施例2-1. cPMAb22或cPMAb205的制备
为了使实施例1中发现的小鼠抗体(即2H2和20C5)的排斥最小化，制备嵌合抗体，其中保留每种抗体的可变区并且仅用人源蛋白替换其恒定区。
具体地，从产生2H2或20C5小鼠抗体的杂交瘤细胞中分离总mRNA，并由此合成2H2或20C5的每种cDNA。然后，通过PCR仅扩增每种抗体的重链和轻链可变区，以获得2H2或20C5的DNA。将通过PCR获得的2H2和20C5的每个可变区克隆到具有人重链和轻链恒定区的载体中。通过DNA电泳确认克隆到载体中的2H2和20C5，分析序列并分成组。除去具有相同序列的克隆后，选择每种抗体的重链和轻链。选择的序列在HEK293细胞中表达，从而最终制备了两种具有小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。
因此，制备了cPMAb22(即2H2的嵌合抗体)和cPMAb205(即20C5的嵌合抗体)。另外，证实了这些嵌合抗体的重链和轻链可变区，CDR和FR的序列与上述表1和2中描述的2H2或20C5相同。
实施例2-2.确认对PAUF蛋白的特异性
使用以下方法确认实施例2-1中制备的cPMAb22或cPMAb205对PAUF蛋白的特异性。
具体而言，进行间接ELISA。将嵌合抗体(即cPMAb22和cPMAb205)和人抗体(即PMAb83)加入免疫板中，该板用PAUF-His蛋白和多种未指定的抗原蛋白包被，每种浓度为0μg/mL，1μg/mL和5μg/mL，然后使用抗人κ轻链-HRP(即第二抗体)测量OD值。
因此，如图3所示，证实了cPMAb22或cPMAb205对PAUF蛋白具有极高的特异性，特别是对PAUF蛋白具有比PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)更高的特异性。
实施例2-3.确认对PAUF蛋白的亲和力
使用以下方法确认实施例2-1中制备的cPMAb22或cPMAb205对PAUF蛋白的特异性。
具体而言，进行间接ELISA。用PAUF-His蛋白包被免疫板，并用不同浓度的每种抗体处理，并使用能够识别人抗体恒定区的抗人Fc-HRP作为第二抗体分析结果。特别地，随着每种抗体的浓度增加，OD值增加。
因此，如图4所示，证实了cPMAb22和cPMAb205对PAUF蛋白具有极高的特异性，特别是对PAUF蛋白具有比PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)更高的特异性。
实施例2-4.确认对癌细胞增殖的抑制作用
为了证实cPMAb22(即实施例2-1中制备的嵌合抗体之一)对癌症治疗的作用，证实了cPMAb22对BxPC-3(即胰腺癌细胞系)增殖的抑制作用。
具体地，进行WST-1增殖试验。将具有高自身表达水平的PAUF的BxPC-3细胞系以3×103细胞/孔的浓度添加到96孔板中，并且用IgG，cPMAb22(嵌合抗体)和PMAb83(人抗体)以浓度为15μg/mL每两天一次处理96孔板。然后，用WST-1处理96孔板，并在450nm处测量吸光度。
因此，如图5所示，证实了与用IgG对照抗体处理的组相比，用cPMAb22处理的组对BxPC-3细胞的增殖具有更高的抑制能力。
从以上结果可以确认，cPMAb22对癌细胞的增殖具有优异的抑制效果，因此cPMAb22可以有效地用作预防或治疗癌症的物质。
实施例2-5.确认对癌细胞迁移的抑制作用
为了证实cPMAb22(即实施例2-1中制备的嵌合抗体之一)对癌症治疗的作用，证实了cPMAb22对CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)和AMCPAC04(即来自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)的迁移的抑制作用。
具体地，使用Transwell装置进行迁移测定。在CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)的情况下，使用无血清培养基将5×104个细胞加入Transwell的上部隔室中，然后用IgG，cPMAb22和PMAb83以各自浓度为15μg/mL进行处理，而含有血清的培养基加入Transwell的下部隔室。24小时后，观察细胞的迁移。另外，在AMCPAC04(即来自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)的情况下，使用无血清培养基将6×104个细胞添加到Transwell的上部隔室中，并且用IgG，cPMAb22和PMAb83以各自浓度为10μg/mL处理细胞，而含有血清的培养基加入Transwell的下部隔室。20小时后，观察细胞的迁移。
因此，如图6所示，证实了与用IgG处理的组(即对照组抗体)相比，用cPMAb22处理的组显示了来自胰腺癌细胞系或来自胰腺癌患者的胰腺癌的细胞的迁移水平显著降低。特别地，证实了与用PMAb83处理的组相比，该迁移水平甚至更低。
从这些结果可以证实，与PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)相比，cPMAb22对癌细胞的迁移具有优异的抑制效果，因此cPMAb22可以有效地用作预防或治疗癌症的物质。
实施例2-6.确认对癌细胞侵袭的抑制作用
为了证实cPMAb22(即实施例2-1中制备的嵌合抗体之一)对癌症治疗的作用，证实了cPMAb22对CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)和AMCPAC04(来自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)的侵袭的抑制作用。
具体地，使用Transwell装置进行侵袭测定。特别地，Transwell用Matrigel包被，其可以人工模拟细胞外基质，并且观察到由每种抗体改变的胰腺癌细胞系的侵袭能力。在CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)的情况下，使用无血清培养基将7×104个细胞加入Transwell的上部隔室中，然后用IgG，cPMAb22和PMAb83以浓度为15μg/mL进行处理，而含有血清的培养基加入Transwell的下部隔室。24小时后，观察到细胞的侵袭。另外，在AMCPAC04(即来自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)的情况下，使用无血清培养基将6×104个细胞添加到Transwell的上部隔室中，并且用IgG，cPMAb22和PMAb83以各自浓度为10μg/mL处理细胞，而含有血清的培养基加入Transwell的下部隔室。20小时后，观察到细胞的侵袭。
因此，如图7所示，与用IgG处理的组(即对照组抗体)相比，证实了用cPMAb22处理的组显示了来自胰腺癌细胞系或来自胰腺癌患者的胰腺癌的细胞的侵袭水平显著降低。特别地，证实了与用PMAb83处理的组相比，这种侵袭水平甚至更低。
从这些结果可以证实，与PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)相比，cPMAb22对癌细胞的侵袭具有优异的抑制效果，因此cPMAb22可以有效地用作预防或治疗癌症的物质。
实施例3.抗PAUF蛋白质人源化抗体的制备及其特征的确认
实施例3-1.hPMAb22的制备
为了最小化2H2(即实施例1中发现的小鼠抗体)和cPMAb22(即实施例2中制备的嵌合抗体之一)的排斥，制备人源化抗体，其中保留了2H2和cPMAb22的CDR(源自小鼠)，而除CDR之外的可变区和恒定区被人源蛋白替换。
具体地，通过CDR移植制备三种人源化抗体(即2H2-VH1/VL1，2H2-VH1/VL2和2H2-VH1/VL3)，并确认它们的亲和力和产量。为了测量人源化抗体的表达水平，允许在三个重链(VH1，VH2和VH3)和三个轻链(VL1，VL2和VL3)之间交叉组装，每个的水平为5mL，然后产生结果。将其转染到HEK293细胞中。然后，6天后，通过收获含有抗体蛋白质的培养基获得培养液，并通过蛋白质印迹法测量表达率。另外，通过间接ELISA分析这些抗体的亲和力。用PAUF-His包被免疫平板，然后用不同浓度的每种抗体处理。使用能够识别人抗体恒定区作为二抗的抗人Fc-HRP测量OD值。
因此，如图8所示，与其它人源化抗体相比，2H2-VH1/VL1抗体对PAUF蛋白具有最高亲和力，因此证实了2H2-VH1/VL1抗体与cPMAb22(即嵌合抗体)或PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)相比具有更高的亲和力。
另外，如图9所示，2H2-VH1/VL1抗体的产量为165.5mg/L，从而证实了2H2-VH1/VL1抗体的产量显著高于2H2-VH1/VL1抗体(28.25mg/L)或2H2-VH1/VL3抗体(42.0mg/L)。
根据这些结果，选择显示对PAUF蛋白具有最高亲和力和最高产量的2H2-VH1/VL1抗体作为根据本发明的2H2和cPMAb22的人源化抗体，命名为“hPMAb22”，并且序列描述于下表3中。
[表3]hPMAb22的氨基酸序列(即抗PAUF蛋白质人源化抗体)
实施例3-2.确认对PAUF蛋白的特异性
使用实施例2-2的方法确认hPMAb22(即实施例3-1中制备的人源化抗体)对PAUF蛋白的特异性。
因此，如图10所示，证实了hPMAb22对PAUF蛋白具有显著高的特异性，特别是甚至比PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)更高的特异性。
实施例3-3.确认对PAUF蛋白的亲和力
使用实施例2-2的方法确认hPMAb22(即实施例3-1中制备的人源化抗体)对PAUF蛋白的亲和力。
具体地，使用SPR方法测量抗原-抗体结合亲和力。将抗原PAUF固定在薄金属膜的表面上，并将抗体以不同浓度稀释并使其通过金属表面。通过测量抗原和抗体之间结合和解离所需的时间来测量抗原-抗体结合亲和力。
因此，如图11所示，证实了PAMb83的Kd值为1.169×10-9M，hPMAb22的Kd值为0.1938×10-9M。根据这些结果，证实了hPMAb22对PAUF蛋白具有显著高的亲和力，并且特别地，与PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)相比具有更高的亲和力。
实施例3-4.确认表位
为了证实实施例3-1中制备的hPMAb22的表位，首先根据实施例1-3确认PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)和表位是否相同。
因此，如图12所示，证实了hPMAb22具有与PMAb83不同的表位。
实施例3-5.确认对癌细胞增殖的抑制作用
为了证实hPMAb22(即实施例3-1中制备的人源化抗体)对癌症治疗的作用，通过根据实施例2-4的方法证实了hPMAb22对CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)增殖的抑制作用。
因此，如图13所示，与用IgG处理的组(即对照组抗体)相比，证实了用hPMAb22处理的组对CFPAC-1(即胰腺癌细胞系)的增殖具有优异的抑制作用。
从这些结果可以确认，hPMAb22对癌细胞的增殖具有优异的抑制效果，因此hPMAb22可以有效地用作预防和治疗癌症的物质。
实施例3-6.确认对癌细胞迁移的抑制作用
为了证实hPMAb22(即实施例3-1中制备的人源化抗体)对癌症治疗的作用，通过实施例2-5的方法证实了hPMAb22对AMCPAC06(即源自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)和OVCAR-5(卵巢癌细胞系)的迁移的抑制作用。
因此，如图14所示，与用IgG处理的组(即对照组抗体)相比，用hPMAb22处理的组显示了源自胰腺癌患者的胰腺癌细胞系，癌细胞系和卵巢癌细胞系的迁移水平显著降低。特别是，这些结果证实，hPMAb22处理的迁移水平的降低甚至低于用PMAb83处理的组。
从这些结果可以确认，与PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)相比，hPMAb22对癌细胞的迁移表现出优异的抑制效果，因此hPMAb22可以有效地用作预防和治疗癌症的物质。
实施例3-7.确认对癌细胞侵袭的抑制作用
为了证实hPMAb22(即实施例3-1中制备的人源化抗体)对癌症治疗的作用，通过根据实施例2-6的方法证实了hPMAb22对AMCPAC04或AMCPAC06(即源自胰腺癌患者的胰腺癌细胞)和OVCAR-5(即卵巢癌细胞系)的侵袭的抑制作用。
因此，如图15所示，与用IgG处理的组(即对照组抗体)相比，用hPMAb22处理的组显示了来自胰腺癌患者的胰腺癌细胞系，癌细胞系和卵巢癌细胞系的侵袭水平显著降低。特别是，这些结果证实，hPMAb22处理的侵袭水平降低甚至低于用PMAb83处理的组。
从这些结果可以确认，与PMAb83(即现有的抗PAUF人抗体)相比，hPMAb22对癌细胞的侵袭具有优异的抑制效果，因此hPMAb22可以有效地用作预防和治疗癌症的物质。
实施例3-8.确认体内抗癌作用
由于对PAUF蛋白特异性的人源化抗体hPMAb22通过实施例3-5至3-7被证实可抑制癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭，检测了hPMAb22是否也表现出相同的体内抗癌作用。
具体地，将胰腺导管腺癌患者的癌组织移植到每只NSG小鼠中以制备源自患者的异种移植物(PDX)模型。将从PDX-小鼠模型中取出的癌组织皮下移植到每只裸鼠的右腿中。约3周后，选择肿瘤大小为80mm3至120mm3的小鼠并分成组。将药物施用于小鼠的尾静脉。IgG和hPMAb22以10mg/kg的剂量一周施用，每周两次，共4周，并且以50mg/kg的剂量施用用作阳性对照的(吉西他滨)一次。具体地，使用卡尺每周两次测量肿瘤的大小，并且还测量每只小鼠的体重以确定肿瘤对药物的反应。在第31天终止实验后，除去肿瘤并测量和比较每个肿瘤的重量。
因此，如图16所示，证实了与用对照组的抗体处理的组相比，用hPMAb22处理的组在癌细胞生长中显示降低30％或更多。特别地，证实了hPMAb22的生长抑制作用优于施用用作抗癌剂的组。
从这些结果可以确认，与(即现有的抗癌剂)相比，hPMAb22对癌细胞的体内生长具有优异的抑制效果，因此hPMAb22可以有效地用作预防和治疗癌症的物质。
综上所述，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本发明的技术概念或本质特征的情况下，本发明可以其它特定形式实施。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，不应解释为限制本发明的范围。相反，本发明不仅要涵盖示例性实施方式，还要涵盖可以包括在由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替换，修改，等同和其它实施方式。
<110> 东亚大学校产学协力团
普雷斯蒂奇生物制药私人有限公司
<120> 特异性结合PAUF蛋白的抗体及其用途
<130> OPA17181
<150> 10-2017-0096370
<151> 2017-07-28
<160> 38
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2、20C5和hPMAb22的VH-CDR1
<400> 1
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2和hPMAb22的VH-CDR2
<400> 2
Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2和hPMAb22的VH-CDR3
<400> 3
Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Ala Thr Ala Trp Phe Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2和hPMAb22的VH-CDR3
<400> 4
Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Ala Thr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2、20C5和hPMAb22的VL-CDR1
<400> 5
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2、20C5和hPMAb22的VL-CDR2
<400> 6
Trp Ala Ser
1
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2和hPMAb22的VL-CDR3
<400> 7
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr
1 5
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2的VH-FR1
<400> 8
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2和20C5的VH-FR2
<400> 9
Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Trp
<210> 10
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2的VH-FR3
<400> 10
Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2的VH-FR4
<400> 11
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2的VH-FR4
<400> 12
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2的VL-FR1
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2和20C5的VL-FR2
<400> 14
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 15
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2和20C5VL-FR3
<400> 15
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2的VL-FR4
<400> 16
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2的VH
<400> 17
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Ala Thr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2H2的VL
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VH-FR1
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VH-FR2
<400> 20
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Trp
<210> 21
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VH-FR3
<400> 21
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VH-FR4
<400> 22
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VH-FR4
<400> 23
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 24
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VL-FR1
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VL-FR2
<400> 25
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 26
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VL-FR3
<400> 26
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hPMAb22的VL-FR4
<400> 27
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VH
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Ala Thr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hPMAb22的VL
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VH-CDR3
<400> 30
Ala Arg Arg Gly Trp Leu Pro Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VL-CDR3
<400> 31
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr
1 5
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VH-FR1
<400> 32
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 33
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VH-FR3
<400> 33
Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VH-FR4
<400> 34
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 35
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VL-FR1
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VL-FR4
<400> 36
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VH
<400> 37
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu His Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Trp Leu Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VL
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20C5的VH-CDR2
<400> 39
Ile Asp Pro Glu His Gly Asn Thr
1 5

Claims (14)

1.一种结合胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白的抗体，其包含：
(a)重链可变区，其包含：SEQ ID NO：1的重链CDR1；SEQ ID NO：2的重链CDR2；和SEQ IDNO：4的重链CDR3；和
轻链可变区，其包含：SEQ ID NO：5的轻链CDR1；SEQ ID NO：6的轻链CDR2；和SEQ IDNO：7的轻链CDR3；或者
(b)重链可变区，其包含：SEQ ID NO：1的重链CDR1；SEQ ID NO：39的重链CDR2；和SEQID NO：30的重链CDR3；和
轻链可变区，其包含：SEQ ID NO：5的轻链CDR1；SEQ ID NO：6的轻链CDR2；和SEQ IDNO：31的轻链CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中：
所述抗体的重链可变区包含：SEQ ID NO：8、19或32的重链框架区FR1；SEQ ID NO：9或20的重链FR2；SEQ ID NO：10、21或33的重链FR3；和SEQ ID NO：11、12、22、23或34的重链FR4；并且
所述抗体的轻链可变区包含：SEQ ID NO：13、24或35的轻链FR1；SEQ ID NO：14或25的轻链FR2；SEQ ID NO：15或26的轻链FR3；和SEQ ID NO：16、27或36的轻链FR4。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中：
所述重链可变区由SEQ ID NO：17、28或37的氨基酸序列组成；并且
所述轻链可变区由SEQ ID NO：18、29或38的氨基酸序列组成。
4.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的抗体。
5.一种表达载体，其包含根据权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种转化体，其中引入有根据权利要求5所述的表达载体。
7.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的抗体。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症为胰腺癌或卵巢癌。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体在制备用于抑制癌细胞的增殖、迁移或侵袭的药物中的用途，其中所述癌细胞为胰腺癌细胞或卵巢癌细胞。
10.一种抗体-药物缀合物，其中药物与根据权利要求1至3中任一项所述的抗体缀合。
11.一种癌症诊断组合物，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的抗体。
12.一种癌症诊断试剂盒，其包含根据权利要求11所述的组合物。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体在制备用于检测从怀疑患有癌症的受试者分离的生物样品中的胰腺癌上调因子(PAUF)蛋白的组合物中的用途。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体在制备用于筛选用于治疗癌症的物质的组合物中的用途，其中所述癌症为胰腺癌或卵巢癌。
CN201780072925.9A 2017-07-28 2017-08-16 特异性结合pauf蛋白的抗体及其用途 Active CN110291110B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2017-0096370 2017-07-28
KR1020170096370A KR101856904B1 (ko) 2017-07-28 2017-07-28 Pauf 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
PCT/KR2017/008893 WO2019022281A1 (ko) 2017-07-28 2017-08-16 Pauf 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110291110A CN110291110A (zh) 2019-09-27
CN110291110B true CN110291110B (zh) 2023-11-24

Family

ID=62185493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780072925.9A Active CN110291110B (zh) 2017-07-28 2017-08-16 特异性结合pauf蛋白的抗体及其用途

Country Status (18)

Country Link
US (1) US11046779B2 (zh)
EP (1) EP3660052A4 (zh)
JP (1) JP7017581B2 (zh)
KR (1) KR101856904B1 (zh)
CN (1) CN110291110B (zh)
AR (1) AR112579A1 (zh)
AU (1) AU2017425111B2 (zh)
BR (1) BR112019010687A2 (zh)
CA (1) CA3044216C (zh)
IL (1) IL266576B1 (zh)
MX (1) MX2020001027A (zh)
MY (1) MY192517A (zh)
PH (1) PH12020500172A1 (zh)
RU (1) RU2735102C1 (zh)
SG (1) SG11201903573RA (zh)
TW (1) TWI703155B (zh)
WO (1) WO2019022281A1 (zh)
ZA (1) ZA202001042B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010036031A2 (en) * 2008-09-23 2010-04-01 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Pauf-specific human monoclonal antibody, pharmaceutical composition for treating cancer comprising the same and method for detecting cancer using the same

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100954322B1 (ko) * 2006-06-14 2010-04-21 주식회사 엘지생명과학 췌장암과 관련된 신규한 ｌｂｆｌ313 유전자
EP2703001A1 (en) * 2012-08-26 2014-03-05 XAX Kft. Tumor vaccination
KR101504039B1 (ko) 2012-11-16 2015-03-19 강원대학교산학협력단 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2019022274A1 (ko) 2017-07-28 2019-01-31 동아대학교 산학협력단 Pauf 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010036031A2 (en) * 2008-09-23 2010-04-01 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Pauf-specific human monoclonal antibody, pharmaceutical composition for treating cancer comprising the same and method for detecting cancer using the same

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"A PAUF-neutralizing antibody targets both carcinoma and endothelial cells to impede pancreatic tumor progression and metastasis";Su Jin Kim, et al;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20141018;第454卷(第1期);全文 *
"Efficient targeting and tumor retardation effect of pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor (PAUF)-specific RNA replacement in pancreatic cancer mouse model";Yun-Hee Kim, et al;《Cancer Letters》;20131101;第344卷(第2期);全文 *
"pancreatic adenocarcinoma up regulated factor a novel up regulated secretory protein in pancreatic ductal adenocarcinoma";Kim,Sun A. et al.;《Cancer Science》;20090531;第100卷(第5期);全文 *
"Pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor (PAUF) enhances the accumulation and functional activity of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in pancreatic cancer";Jinhoi Song,et al.;《Oncotarget》;20160617;第7卷(第32期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2020001027A (es) 2020-08-06
JP7017581B2 (ja) 2022-03-03
CN110291110A (zh) 2019-09-27
IL266576A (en) 2019-07-31
TW201910350A (zh) 2019-03-16
EP3660052A1 (en) 2020-06-03
MY192517A (en) 2022-08-25
JP2020520230A (ja) 2020-07-09
CA3044216A1 (en) 2019-01-31
TWI703155B (zh) 2020-09-01
CA3044216C (en) 2023-05-23
US20200055951A1 (en) 2020-02-20
US11046779B2 (en) 2021-06-29
PH12020500172A1 (en) 2020-10-12
EP3660052A4 (en) 2021-04-14
RU2735102C1 (ru) 2020-10-28
SG11201903573RA (en) 2019-05-30
AU2017425111A1 (en) 2019-05-16
IL266576B1 (en) 2024-02-01
AU2017425111B2 (en) 2020-06-18
WO2019022281A1 (ko) 2019-01-31
ZA202001042B (en) 2021-05-26
BR112019010687A2 (pt) 2020-02-18
AR112579A1 (es) 2019-11-13
KR101856904B1 (ko) 2018-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101535341B1 (ko) Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
US20210261658A1 (en) Anti-human claudin 18.2 monoclonal antibody and application thereof
EP3381940B1 (en) Anti-ang2 antibody
CA3056972A1 (en) Anti-ox40 antibody and use thereof
CN109069620B (zh) 拮抗剂ccr7受体的人源化抗体
CN114502592A (zh) 靶向cldn18.2的抗体及其制备方法和应用
KR101504039B1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
CN105518028A (zh) 与dll4和vegf特异性结合的新型双靶向蛋白及其用途
CA2669731A1 (en) Anti-human dlk-1 antibody showing anti-tumor activity in vivo
AU2017358359B2 (en) Antibody binding specifically to CD66c and use thereof
CN109988240B (zh) 抗gpc-3抗体及其用途
CA2794407A1 (en) Humanized anti cxcr4 antibodies for the treatment of cancer
KR20150032075A (ko) Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체를 포함하는 항암제
CN116323676A (zh) 抗Claudin18.2和CD3的双特异性抗体以及其用途
EP4169947A1 (en) Anti-claudin18.2 antibody and use thereof
CN111378040B (zh) 检测多种恶性肿瘤细胞的抗体及其应用
JP7436711B2 (ja) 抗ｓｉｒｐ－アルファ抗体
EP4070816A1 (en) Anti-gdf15 antibody
CN110291110B (zh) 特异性结合pauf蛋白的抗体及其用途
EP4079758A1 (en) Semg2 antibody and use thereof
CN114437227A (zh) 双特异抗体及其应用
CN115368458A (zh) 抗cd73抗体及其应用
WO2023025306A1 (zh) 靶向pd-l1和cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用
WO2024002266A1 (zh) 分离的抗原结合蛋白及其用途
WO2023236844A1 (zh) 靶向her2和pd-l1的双特异性抗体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant