BR112019010687A2 - Anticorpo que se liga especificamente à proteína de pauf e uso deste - Google Patents

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Jeong Kim Yeon
Eun Youn So
Cheol Kim Song
Hong Seung-Mo
Yun Jeong Seong
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Abstract

a presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (pauf) e ao uso deste. o anticorpo da presente invenção se liga a uma proteína de pauf com especificidade e afinidade altas e desse modo inibe a proliferação, migração, invasão e crescimento in vivo e assim o anticorpo da presente invenção pode ser eficazmente usado no campo de diagnose e tratamento de doenças tais como câncer em que proteínas de pauf são super-expressadas.

Description

“ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE À PROTEÍNA DE PAUF E USO DESTE”
Campo técnico [001 ]A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF) e uso deste.
Fundamentos da Técnica [002]Fármacos anticâncer correntemente em uso clínico podem ser classificados como agentes quimioterápicos e agentes bioterapêuticos. Agentes quimioterápicos que foram ativamente desenvolvidos no passado são fármacos que mostram toxicidade a células cancerosas. Entretanto, estes fármacos têm problemas em que eles são tóxicos a células normais assim como a células cancerosas e são também sujeitos à tolerância. Portanto, existem limitações ao desenvolvimento e uso destes fármacos. Como tal, nos últimos anos, agentes bioterapêuticos que podem recuperar ou aumentar a função imune do corpo humano e, desse modo, enfraquecer a atividade de células cancerosas estão sendo ativamente desenvolvidos como uma alternativa. Exemplos de agentes bioterapêuticos que estão correntemente em uso ou sob desenvolvimento incluem citocinas, anticorpos recombinantes (por exemplo, anticorpos monoclonais), produtos terapêuticos de molécula de ácido nucleico, inibidores de angiogênese, etc.
[003]Dentre os agentes bioterapêuticos, anticorpos monoclonais para o tratamento são caracterizados por terem efeitos colaterais baixos devido à sua alta especificidade de reação aos alvos. Anticorpos exibem efeitos terapêuticos através de vários mecanismos; por exemplo, eles podem se ligar especificamente aos antígenos correspondentes para inibir transdução de sinal ou induzir apoptose por reticulação e adicionalmente, podem exibir efeitos terapêuticos ativando-se o sistema imune in vivo. Consequentemente, anticorpos monoclonais como um agente
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2/44 anticâncer podem especificamente rastrear células cancerosas e inibir sua atividade, assim como induzir respostas imunes e podem, desse modo, remover eficazmente células cancerosas. Como um resultado, o tratamento usando anticorpos monoclonais está tornando-se um tratamento do câncer convencional. Sob esse aspecto, anticorpos monoclonais tais como ramucirumabe, rituximabe, trastuzumabe, etc. foram desenvolvidos e usados no tratamento de câncer de estômago, câncer de mama, câncer de fígado, etc.
[004]Entretanto, proteínas de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF), que são super-expressadas em células cancerosas tais como câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer cervical uterino, etc. e envolvidas no desenvolvimento e metástase de tumores, são conhecidas como supra-regulando e estabilizando β-catenina através de um novo padrão de fosforilação, contribuindo desse modo para a proliferação rápida de células do câncer pancreático (Experimental & Molecular Medicine, 2011, 43, 82 a 90). Adicionalmente, visto que foi relatado que RNAs interferentes pequenos alvejando proteínas de PAUF podem reduzir a migração, invasão e capacidade tumorigênica de células do câncer pancreático, existe um interesse crescente em proteínas de PAUF como alvos para diagnose, tratamento, etc. de câncer (Cancer Sei., maio de 2009, 100(5): 828 a 836; Biochem Biophys Res Commun. Nov de 2014, 454(1): 144 a 150). Sob esse aspecto, uma composição para diagnose e tratamento de câncer pancreático contendo um anticorpo humano anti-proteína de PAUF foi previamente desenvolvida (Patente KR N2 10-1098186). Entretanto, existe ainda uma necessidade para o desenvolvimento de anticorpos tendo excelentes efeitos sobre a diagnose e tratamento de vários tipos de câncer enquanto melhorando simultaneamente a capacidade e afinidade de ligação para proteínas de PAUF.
Divulgação
Problema técnico
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3/44 [005]0s presentes inventores fizeram esforços para desenvolver um anticorpo que pode se ligar especificamente a uma proteína de PAUF e exibir excelentes efeitos sobre o tratamento e diagnose de vários tipos de câncer. Como um resultado, eles desenvolveram anticorpos quiméricos e humanizados com base em anticorpos de camundongo anti-PAUF e confirmaram que estes anticorpos têm afinidade e especificidade mais altas para proteínas de PAUF e atividade anticâncer mais alta contra câncer pancreático, câncer ovariano, etc. comparado a anticorpos humanos anti-PAUF existentes, concluindo desse modo a presente invenção.
Solução técnica [006]Um objetivo da presente invenção é fornecer um anticorpo que se liga a uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF).
[007]Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo que codifica o anticorpo.
[008]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um vetor de expressão que contém o polinucleotídeo.
[009]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um transformante em que o vetor de expressão é introduzido.
[010]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer contendo o anticorpo.
[011]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para prevenir ou tratar câncer que inclui administrar o anticorpo a um sujeito.
[012]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para inibir a proliferação, migração, ou invasão de células cancerosas que inclui administrar o anticorpo a um sujeito.
[013]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um conjugado de anticorpo-fármaco em que um fármaco é conjugado ao anticorpo.
[014]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer uma
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4/44 composição diagnostica de câncer contendo o anticorpo.
[015]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um kit diagnóstico de câncer contendo a composição.
[016]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método diagnóstico de câncer, que inclui detectar uma proteína de PAUF em uma amostra biológica isolada de um sujeito suspeito de câncer através de uma reação de antígeno-anticorpo usando o anticorpo.
[017]Ainda um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para triar materiais para prevenir ou tratar câncer, que inclui: (a) tratar as células cancerosas com um material candidato para prevenir ou tratar câncer; (b) medir o nível de proteínas de PAUF nas células cancerosas, em que o material candidato foi tratado, usando o anticorpo; e (c) determinar se o material candidato, que foi tratado na etapa (a), pode ser usado como um material para prevenir ou tratar câncer, quando o nível da proteína de PAUF na etapa (b) é mais baixo do que aquele das células cancerosas não tratadas com o material candidato.
Efeitos vantajosos da invenção [018]A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF) e ao uso deste.
[019]O anticorpo da presente invenção se liga a uma proteína de PAUF com especificidade e afinidade altas e desse modo inibe a proliferação, migração, invasão e crescimento in vivo e assim, o anticorpo da presente invenção pode ser eficazmente usado no campo de diagnose e tratamento de doenças tais como câncer em que uma proteína de PAUF é super-expressada.
Breve descrição dos desenhos [020]A FIG. 1 mostra gráficos ilustrando a afinidade (A) e especificidade (B) de 2H2 e 20C5, que são anticorpos de camundongo anti-proteína de PAUF, para
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5/44 proteínas de PAUF.
[021 ]A FIG. 2 mostra um gráfico ilustrando que cada um de 2H2 e 20C5 tem um epítopo diferente daquele de PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-proteína de PAUF existente) e o gráfico mostra os resultados de ELISA competitivo de 2H2 rotulado com biotina.
[022]A FIG. 3 mostra gráficos ilustrando a especificidade de cada um de cPMAb22 e cPMAb205, que são anticorpos quiméricos anti-proteína de PAUF, para proteínas de PAUF. PMAb83 (isto é, um anticorpo humano) foi usado como um grupo comparativo.
[023]A FIG. 4 mostra um gráfico ilustrando a afinidade de cada um de cPMAb22 e cPMAb205 para proteínas de PAUF, com base nos resultados do ensaio ELISA. PMAb83 (isto é, um anticorpo humano) foi usado como um grupo comparativo.
[024]A FIG. 5 mostra um gráfico ilustrando o efeito inibitório de cPMAb22 sobre a proliferação de células cancerosas, com base nos resultados do ensaio de proliferação de WST-1. Especificamente, o efeito inibitório de cPMAb22 sobre a proliferação de BxPC-3 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático) foi confirmado. IgG foi usado como o grupo de controle e PMAb83 foi usado como um grupo comparativo.
[025]A FIG. 6 mostra um gráfico ilustrando o efeito inibitório de cPMAb22 sobre a migração de células cancerosas, com base nos resultados do ensaio de migração. Especificamente, os efeitos inibitórios de cPMAb22 sobre CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático) e AMCPAC04 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático) foram confirmados. PMAb83 foi usado como um grupo comparativo.
[026]A FIG. 7 mostra gráficos ilustrando o efeito inibitório de cPMAb22 sobre a invasão de células cancerosas, com base nos resultados do ensaio de invasão.
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6/44
Especificamente, os efeitos inibitórios de cPMAb22 sobre CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático) e AMCPAC04 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático) foram confirmados. PMAb83 foi usado como um grupo comparativo.
[027]A FIG. 8 mostra um gráfico ilustrando a afinidade de 2H2-Vh1-Vl1, 2H2-Vh1-Vl2 e 2H2-Vh1-Vl3, que são anticorpos humanizados anti-proteína de PAUF preparados de acordo com uma modalidade da presente invenção, para proteínas de PAUF, com base nos resultados do ensaio ELISA. PMAb83, que é um anticorpo humano, foi usado como um grupo comparativo. cPMAb22 (isto é, um anticorpo quimérico) e PMAb83 (isto é, um anticorpo humano) foram usados como grupos comparativos.
[028]A FIG. 9 mostra imagens ilustrando o rendimento de produção do 2H2-Vh1-Vl1, 2H2-Vh1-Vl2 e 2H2-Vh1-Vl3, com base nos resultados de análise de western blot, em que a faixa 1 representa 2H2-Vh1-Vl1, a faixa 2 representa 2H2-Vh1-Vl2, a faixa 3 representa 2H2-Vh1-Vl3, a faixa 4 representa 2H2-Vh2-Vl1, a faixa 5 representa 2H2-Vh2-Vl2, a faixa 6 representa 2H2-Vh2-Vl3, a faixa 7 representa 2H2-Vh3-Vl1, a faixa 8 representa 2H2-Vh3-Vl2, a faixa 9 representa 2H2-Vh3-Vl3 e a faixa 10 representa 2H2-Vh4-Vl4 e a faixa A representa um meio contendo proteína que não foi centrifugado, a faixa B representa o meio contendo proteína que foi centrifugado para remover os fragmentos seguido por filtração através de um filtro de 0,22 pm e a faixa C representa uma proteína Fc. A proteína Fc foi usada como o grupo de controle.
[029]A FIG. 10 mostra gráficos ilustrando a especificidade do anticorpo humanizado, 2H2-Vh1-Vl1 (isto é, hPMAb22), para proteínas de PAUF. PMAb83 (isto é, um anticorpo humano) foi usado como um grupo comparativo.
[030]A FIG. 11 mostra gráficos ilustrando a afinidade de hPMAb22 para proteínas de PAUF, com base nos resultados da análise de ressonância plasmônica
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7/44 superficial (SPR). PMAb83 (isto é, um anticorpo humano) foi usado como um grupo comparativo.
[031 ]A FIG. 12 mostra um gráfico ilustrando que hPMAb22 tem um epítopo diferente daquele de PMAb83, que é um anticorpo humano anti-PAUF de hPMAb22 e o gráfico mostra os resultados de ELISA competitivo de PMAb83 rotulado com biotina.
[032]A FIG. 13 mostra um gráfico ilustrando o efeito inibitório de hPMAb22 sobre a proliferação de células cancerosas, com base nos resultados de ensaio de proliferação de WST-1. Especificamente, o efeito inibitório de hPMAb22 sobre CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático) foi confirmado. IgG foi usado como o grupo de controle e PMAb83 foi usado como um grupo comparativo.
[033]A FIG. 14 mostra um gráfico ilustrando o efeito inibitório de hPMAb22 sobre a migração de células cancerosas, com base nos resultados de ensaio de migração. Especificamente, os efeitos inibitórios de hPMAb22 sobre AMCPAC06 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático) e OVCAR-5 (isto é, uma linhagem de célula de câncer ovariano) foram confirmados. PMAb83 foi usado como um grupo comparativo.
[034]A FIG. 15 mostra gráficos ilustrando o efeito inibitório de hPMAb22 sobre a invasão de células cancerosas, com base nos resultados de ensaio de invasão. Especificamente, os efeitos inibitórios de hPMAb22 sobre AMCPAC04 ou AMCPAC06 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático) e OVCAR-5 (isto é, uma linhagem de célula de câncer ovariano) foram confirmados. PMAb83 foi usado como um grupo comparativo.
[035]A FIG. 16 mostra gráficos ilustrando o efeito anticâncer in vivo de hPMAb22 e a partir dos gráficos foi confirmado que o volume e o peso dos tumores foram reduzidos pela administração de hPMAb22. Gemzar® (gencitabina) foi usado
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8/44 como um grupo comparativo.
Melhor modo [036]Para obter os objetivos acima, um aspecto da presente invenção fornece um anticorpo que se liga a uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF).
[037]*Na presente invenção, os inventores desenvolveram anticorpos, cada um dos quais inclui uma região variável de cadeia pesada que inclui uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2 e uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3, 4, ou 30; e uma região variável de cadeia leve que inclui uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 6 e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 7 ou 31. Foi confirmado que estes anticorpos exibem afinidade e especificidade significativamente mais altas para as proteínas de PAUF comparado aos anticorpos de PAUF convencionais, inibem a proliferação, migração e invasão de vários canceres tais como câncer pancreático, câncer ovariano, etc. e inibem o crescimento in vivo do câncer.
[038]Como usado aqui, o termo “proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF)” refere-se a uma proteína envolvida no desenvolvimento e metástase de tumor. Foi relatado que proteínas de PAUF são super-expressadas em células cancerosas tais como câncer pancreático, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer cervical uterino, etc. e assim estas proteínas podem ser um alvo para diagnose, tratamento, etc. de câncer (Cancer Sei. maio de 2009, 100(5): 828 a 36; Biochem Biophys Res Commun. Nov de 2014, 454(1): 144 a 50.).
[039]Como usado aqui, o termo “anticorpo” refere-se a uma molécula de proteína que atua como um receptor capaz de reconhecer especificamente antígenos e ele inclui uma molécula de imunoglobulina que é imunologicamente
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9/44 reativa com um antígeno particular. Anticorpos da presente invenção podem incluir todos os anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos integrais e fragmentos de anticorpo e também anticorpos quiméricos e moléculas bivalentes ou biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos), diacorpos, triacorpos e tetracorpos. Adicionalmente, os anticorpos da presente invenção incluem um anticorpo de cadeia única tendo uma função de ligação a receptores Fc neonatais (FcRn), cicatrizes, derivados de uma região constante de anticorpo e anticorpos artificiais com base em um andaime proteico.
[040]O anticorpo integral tem uma estrutura com duas cadeias leves de tamanho natural e duas cadeias pesadas de tamanho natural, em que cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto. O anticorpo integral inclui IgA, IgD, IgE, IgM e IgG, em que IgG inclui lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4 como subtipos.
[041 ]O fragmento de anticorpo refere-se a um fragmento tendo uma função de ligação a antígeno e ele inclui Fc, Fd, Fab, Fab', Fv, F(ab')2, etc. O Fc refere-se à porção da cauda de um anticorpo que interage com um receptor de superfície celular chamado um receptor Fc. O Fd refere-se à porção de cadeia pesada incluída no fragmento Fab e F(ab')2 refere-se a um fragmento incluindo Fd, Fab, Fab' e Fv. O Fab tem uma estrutura composta de regiões variáveis das cadeias leves e pesadas, uma região constante da cadeia leve e a primeira região constante da cadeia pesada (domínio CH1) e o Fab tem um sítio de ligação a antígeno. Fab' difere de Fab em que ele tem uma região da dobradiça incluindo pelo menos um resíduo de cisteína no término C do domínio CH1 de cadeia pesada. O anticorpo F(ab')2 é produzido conforme o resíduo de cisteína na região da dobradiça do Fab' forma uma ligação dissulfeto. Um fragmento variável (Fv) refere-se a um fragmento mínimo tendo apenas uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve. O fragmento de anticorpo Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv) é caracterizado em
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10/44 que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são ligadas por uma ligação dissulfeto, ao passo que um Fv de cadeia única (scFv) é geralmente caracterizado em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são ligadas por uma ligação covalente através de um ligador peptídico. Estes fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando uma protease (por exemplo, Fab pode ser obtido por digestão com restrição de anticorpos de tamanho natural com papaína e o fragmento F(ab')2 pode ser obtido por digestão com pepsina) e preferivelmente, pode ser preparado através de tecnologia de recombinação genética.
[042]Geralmente, uma imunoglobulina tem uma cadeia pesada e uma cadeia leve e cada uma da cadeia pesada e da cadeia leve inclui uma região constante e uma região variável. As regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada incluem três regiões hipervariáveis chamadas regiões determinantes de complementaridade (em seguida, “CDR”) e quatro regiões de estrutura (em seguida, “FR”). A CDR de cada cadeia principalmente tem o papel de se ligar a um epítopo de um antígeno e ela é tipicamente chamada CDR1, CDR2 e CDR3 sequencialmente partindo do término N. Adicionalmente, a FR de cada cadeia pode ser chamada FR1, FR2, FR3 e FR4 sequencialmente partindo do término N.
[043]Na presente invenção, a região variável da cadeia pesada pode ser chamada “Vh”; a região variável da cadeia leve pode ser chamada “Vl”; a CDR da cadeia pesada pode ser chamada “Vh-CDR1”, “Vh-CDR2” e “Vh-CDR3”; a CDR da cadeia leve pode ser chamada “Vl-CDR1”, “Vl-CDR2” e “Vl-CDR3”; a FR da cadeia pesada pode ser chamada “Vh- FR1”, “Vh- FR2”, “Vh- FR3” e “Vh- FR4”; e a FR da cadeia leve pode ser chamada “Vl- FR1”, “Vl- FR2”, “Vl- FR3” e “Vl- FR4”.
[044]Adicionalmente, quando os anticorpos da presente invenção incluem uma região constante, eles podem incluir regiões constantes derivadas de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, ou uma combinação destas, ou um híbrido destas.
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11/44 [045]Como usado aqui, o termo “combinação” significa que um polipeptídeo que codifica uma região constante de imunoglobulina de cadeia única da mesma origem é ligado a um polipeptídeo de cadeia única de origem diferente para formar um dímero ou multímero. Por exemplo, um dímero ou multímero pode ser formado de duas ou mais regiões constantes selecionadas do grupo consistindo em regiões constantes de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
[046]Como usado aqui, o termo “híbrido” significa que as sequências correspondendo a duas ou mais regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina de origens diferentes estão presentes em uma cadeia única de uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina. Por exemplo, formas híbridas possíveis podem ser compostas de um a quatro domínios selecionados do grupo consistindo em CH1, CH2, CH3 e CH4 de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
[047]Adicionalmente, na presente invenção, os anticorpos podem ser da mesma origem ou origem diferente quanto às suas regiões variáveis e regiões constantes e as origens da CDR e regiões variáveis e regiões constantes excluindo a CDR podem ser as mesmas ou diferentes.
[048]Como usado aqui, o termo “anticorpo que especificamente se liga a uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF)” refere-se a um anticorpo que pode se ligar a uma proteína de PAUF e desse modo inibir a atividade da proteína de PAUF.
[049]Especificamente, o anticorpo que especificamente se liga a uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF) pode ser um anticorpo de camundongo, um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humanizado.
[050]Especificamente, cada um dos anticorpos da presente invenção pode incluir:
uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma CDR1 de cadeia
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12/44 pesada da SEQ ID NO: 1; uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2; e uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3, 4, ou 30; e uma região variável de cadeia leve, que inclui uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 5; uma CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 7 ou 31, mas os anticorpos não são limitados a estes.
[051]Adicionalmente, cada um dos anticorpos da presente invenção pode incluir:
uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17, 28, ou 37; e uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18, 29, ou 38, mas os anticorpos não são limitados a estes.
[052]Adicionalmente, cada um dos anticorpos da presente invenção pode incluir uma região variável de cadeia pesada do anticorpo, que inclui:
uma região de estrutura FR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8, 19, ou 32; uma FR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 ou 20; uma FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 10,21, ou 33; e uma FR4 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11, 12, 22, 23, ou 34; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo, que inclui a FR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 13, 24, ou 35; a FR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 14 ou 25; a FR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 15 ou 26; e a FR4 de cadeia leve da SEQ ID NO: 16, 27, ou 36, mas os anticorpos não são limitados a estes.
[053]Em uma modalidade da presente invenção, cada um dos anticorpos da presente invenção tendo afinidade e especificidade melhoradas comparado aos anticorpos de PAUF existentes pode incluir especificamente:
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13/44 uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2; e uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve, que inclui uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 5; uma CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 7;
uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2; e uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4; e uma região variável de cadeia leve, que inclui uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 5; uma CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 7;
uma FR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8; uma FR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9; uma FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 10; e uma FR4 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo, que inclui a FR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 13; a FR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 14; a FR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 15; e a FR4 de cadeia leve da SEQ ID NO: 16; ou uma FR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8; uma FR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9; uma FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 10; e uma FR4 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 12; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo, que inclui a FR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 13; a FR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 14; a FR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 15; e a FR4 de cadeia leve da SEQ ID NO: 16; e mais especificamente, uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 17; e uma região variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 18, mas os anticorpos não são limitados a estes.
[054]Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo que inclui a
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14/44 região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17 e a região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18 foi denominado como “2H2” ou “cPMAb22”.
[055]Adicionalmente, cada um dos anticorpos da presente invenção pode incluir especificamente:
uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2; e uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3; e uma região variável de cadeia leve, que inclui uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 5; uma CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 7;
uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2; e uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4; e uma região variável de cadeia leve, que inclui uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 5; uma CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 7;
uma FR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19; uma FR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 20; uma FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 21; e uma FR4 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 22; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo, que inclui a FR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 24; a FR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 25; a FR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 26; e a FR4 de cadeia leve da SEQ ID NO: 27; ou uma FR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19; uma FR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 20; uma FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 21; e uma FR4 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo, que inclui a FR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 24; a FR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 25; a FR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 26; e a FR4 de cadeia leve da SEQ ID NO: 27; e mais especificamente,
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15/44 uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 28; e uma região variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 29, mas os anticorpos não são limitados a estes.
[056]Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo que inclui a região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28 e a região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 29 foi denominado como “hPMAb22”.
[057]Adicionalmente, cada um dos anticorpos da presente invenção pode incluir especificamente:
uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2; e uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 30; e uma região variável de cadeia leve, que inclui uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 5; uma CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 31; ou uma FR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 32; uma FR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9; uma FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 33; e uma FR4 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 34; e uma região variável de cadeia leve do anticorpo, que inclui a FR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 35; a FR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 14; a FR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 15; e a FR4 de cadeia leve da SEQ ID NO: 36; e mais especificamente, uma região variável de cadeia pesada, que inclui uma cadeia pesada consistindo na SEQ ID NO: 37; e uma região variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID NO: 38, mas os anticorpos não são limitados a estes.
[058]Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo que inclui a região variável de cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácido da SEQ
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ID NO: 37 e a região variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 38 foi denominado como “20C5” ou “cPMAb205”.
[059]Em uma modalidade específica da presente invenção, os inventores desenvolveram anticorpos de camundongo (isto é, 2H2 e 20C5) que se ligam a proteínas de PAUF, anticorpos quiméricos destes (isto é, cPMAb22 e cPMAb205) e um anticorpo humanizado destes (isto é, hPMAb22) e eles confirmaram que estes anticorpos podem se ligar a proteínas de PAUF com especificidade e afinidade mais altas do que os anticorpos de PAUF existentes (FIGS. 1, 3, 4 e 8 a 11). Adicionalmente, os presentes inventores confirmaram que estes anticorpos podem inibir a proliferação, migração e invasão de células cancerosas em linhagens de célula de câncer ovariano assim como em linhagens de célula de câncer pancreático e células de câncer pancreático derivadas de pacientes com câncer pancreático e também podem inibir o crescimento in vivo de câncer pancreático. Além disso, eles confirmaram que os efeitos terapêuticos de câncer destes anticorpos foram similares a ou melhores do que aquele de PMAb83, que é um anticorpo humano existente específico para proteínas de PAUF (FIGS. 5 a 7 e 13 a 16).
[060]Estes resultados sugerem que os anticorpos da presente invenção que se ligam às proteínas de PAUF podem ser eficazmente usados nos campos onde o reconhecimento de proteínas de PAUF é necessário, por exemplo, na diagnose, tratamento, etc. de doenças em que proteínas de PAUF são super-expressadas.
[061 ]Um outro aspecto da presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica o anticorpo da presente invenção, um vetor de expressão contendo o polinucleotídeo e um transformante em que o vetor de expressão é introduzido. Em particular, a explanação do anticorpo é a mesma como descrito acima.
[062]Na presente invenção, o vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser um vetor que pode replicar e/ou expressar o polinucleotídeo em células eucarióticas ou procarióticas incluindo
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17/44 células mamíferas (por exemplo, células de seres humanos, macacos, coelhos, ratos, hamsters, camundongos, etc.), células vegetais, células de levedura, células de inseto e células bacterianas (por exemplo, E. coli, etc.) e preferivelmente, pode ser operavelmente ligado a um promotor adequado de modo que o nucleotídeo possa ser expressado em uma célula hospedeira e conter pelo menos um marcador selecionável, mas o vetor de expressão não é particularmente limitado a este. Por exemplo, o vetor de expressão pode estar em uma forma onde o polinucleotídeo é introduzido em um fago, plasmídeo, cosmídeo, minicromossomo, vírus, vetor retroviral, etc.
[063]O vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser um vetor de expressão que contém um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo, ou um vetor de expressão que contém um polinucleotídeo que codifica tanto uma cadeia pesada e uma cadeia leve.
[064]Na presente invenção, o transformante em que o vetor de expressão é introduzido pode ser uma célula transformada pela introdução do vetor de expressão, incluindo células de bactérias (por exemplo, E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, etc.); células de levedura; células fúngicas (por exemplo, Pichia pastoris, etc.), células de inseto (por exemplo, Drosophila, Spodoptera (Sf9), etc.); células animais (por exemplo, células do ovário de hamster chinês (CHO), COS, mieloma de camundongo (NSO), 293T, células de bow melanoma, HT-1080, células do rim de hamster neonato (BHK), células renais embrionárias humanas (HEK), PERC.6 (células retinianas humanas), etc.); e células vegetais, mas o transformante não é particularmente limitado a estas.
[065]Como usado aqui, o termo “introdução” refere-se a um método para liberar um vetor contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo a uma célula hospedeira. A introdução pode ser obtida por métodos tais como coprecipitação de
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18/44 fosfato de cálcio-DNA, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por polibreno, eletroporação, microinjeção, fusão lipossômica, lipofectamina e fusão de protoplasta conhecidas na técnica. Adicionalmente, como usado aqui, o termo “transfecção” refere-se à liberação de um objeto em células usando partículas virais por meio de infecção. Adicionalmente, vetores podem ser introduzidos em células hospedeiras por bombardeamento de gene, etc. Na presente invenção, o termo “introdução” pode ser usado permutavelmente com “transformação”.
[066]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer contendo o anticorpo.
[067]O anticorpo mostra afinidade e especificidade extremamente altas para as proteínas de PAUF super-expressadas em câncer. O anticorpo pode inibir a proliferação, migração e invasão de vários tipos de câncer (por exemplo, câncer pancreático, câncer ovariano, etc.) e além disso, pode inibir o crescimento in vivo do câncer. Portanto, o anticorpo da presente invenção pode ser eficazmente usado na prevenção ou tratamento de doenças onde proteínas de PAUF são super-expressadas tais como câncer. Em particular, a explanação do anticorpo é a mesma como descrito acima.
[068]Como usado aqui, o termo “câncer” refere-se a uma bossa que foi anormalmente cultivada devido ao crescimento excessivo autônomo do tecido corporal e ele inclui, sem limitação, qualquer tipo de câncer contanto que ele possa ser prevenido ou tratado pelo anticorpo da presente invenção. Exemplos específicos do câncer podem incluir câncer pancreático, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer do trato biliar, câncer esofágico, câncer de reto, câncer da cavidade oral, câncer de faringe, câncer de laringe, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de mama, câncer ovariano, câncer cervical uterino, câncer do endométrio, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de fígado, câncer ósseo, câncer do tecido conjuntivo, câncer de pele, câncer cerebral, câncer da
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19/44 tireoide, leucemia, doença de Hodgkin, linfoma e câncer sanguíneo com mieloma múltiplo.
[069]Como usado aqui, o termo “prevenção” refere-se a qualquer ação que resulta na supressão ou retardo do início do câncer administrando-se a composição acima e o termo “tratamento” refere-se a qualquer ação que resulta na melhoria ou mudanças vantajosas nos sintomas do câncer administrando-se a composição acima.
[070]A composição farmacêutica pode conter ainda um portador farmaceuticamente aceitável e o portador pode conter um portador que não ocorre naturalmente.
[071]Como usado aqui, o termo “portador farmaceuticamente aceitável” refere-se a um portador ou diluente que nem irrita os organismos nem interfere com a atividade biológica e propriedades do composto a ser administrado. Como o portador farmacêutico aceitável para composições formuladas como soluções líquidas, uma ou mais selecionadas de solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina tamponada, solução de injeção de albumina, solução de dextrose, solução de malto-dextrina, glicerol, etanol e uma mistura destes, que são adequados para esterilização e uso in vivo, podem ser misturados para o uso. Se necessário, outros aditivos convencionais tal como um antioxidante, um tampão, um agente bacteriostático, etc. podem ser adicionados. Adicionalmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser formulada em formulações injetáveis (por exemplo, soluções, suspensões, emulsões aquosas, etc.), pílulas, cápsulas, grânulos e tabletes, adicionando-se ainda um diluente, um dispersante, um tensoativo, um aglutinante e um lubrificante.
[072]A composição farmacêutica pode ser preparada em qualquer uma formulação selecionada do grupo consistindo em tabletes, pílulas, pós, grânulos, cápsulas, suspensões, soluções, emulsões, xaropes, soluções aquosas estéreis,
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20/44 solventes não aquosos, suspensões, preparações liofilizadas e supositórios e pode estar em várias formulações para administração oral ou parenteral. As formulações podem ser preparadas usando um diluente ou excipiente comumente usado tal como um enchedor, um extensor, um aglutinante, um umectante, um desintegrante, um tensoativo, etc. Formulações sólidas para administração oral podem incluir tabletes, pílulas, pós, grânulos, cápsulas, etc. e estas formulações sólidas podem ser preparadas adicionando-se pelo menos um excipiente (por exemplo, amido, carbonato de cálcio, sacarose ou lactose, gelatina, etc.). Adicionalmente, um lubrificante (por exemplo, estearato de magnésio, talco, etc.) pode ser usado além do excipiente simples. Formulações líquidas para administração oral podem incluir suspensões, remédios líquidos para uso interno, emulsões, xaropes, etc. e vários excipientes tais como umectantes, adoçantes, fragrâncias e preservantes podem ser usados, além dos diluentes simples tais como água e parafina líquida. Formulações para administração parenteral podem incluir soluções aquosas estéreis, solventes não aquosos, suspensões, emulsões, preparações liofilizadas, supositórios, etc. Exemplos dos solventes e suspensões não aquosos podem incluir óleos vegetais (por exemplo, propileno glicol, polietilenoglicol e óleo de oliva), um éster injetável (por exemplo, oleato de etila), etc. Exemplos das bases para supositórios podem incluir Witepsol, macrogol, Tween 61, manteiga de cacau, laurínio, glicerogelatina, etc.
[073]A composição da presente invenção pode ser administrada em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. Como usado aqui, o termo “quantidade farmaceuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade suficiente para o tratamento de doenças em uma razão risco/benefício razoável aplicável ao tratamento médico e o nível da dose eficaz pode ser determinado com base nos fatores incluindo o tipo de sujeito, severidade da doença, idade, sexo, tipo de doença, atividade medicamentosa, sensibilidade ao fármaco, tempo de administração, via de
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21/44 administração e taxa de dissolução, duração do tratamento, fatores incluindo fármaco(s) a ser(em) usado(s) simultaneamente em combinação e outros fatores bem conhecidos no campo médico. A composição da presente invenção pode ser administrada como um agente terapêutico individual, em combinação com outros agentes terapêuticos, ou sequencial ou simultaneamente com um agente terapêutico convencional e pode ser administrada uma vez ou múltiplas vezes. É importante que a composição farmacêutica seja administrada na quantidade mínima que se pode obter o efeito máximo sem efeitos adversos considerando todos os fatores descritos acima e a quantidade farmaceuticamente eficaz pode ser facilmente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[074]Em uma modalidade específica da presente invenção, foi confirmado que o anticorpo que se liga a proteínas de PAUF com especificidade e afinidade altas pode inibir a proliferação, migração e invasão de células cancerosas em linhagens de célula de câncer ovariano assim como em linhagens de célula de câncer pancreático e células de câncer pancreático derivadas de pacientes com câncer pancreático e adicionalmente, pode inibir o crescimento in vivo de câncer pancreático. Além disso, foi confirmado que o efeito terapêutico do anticorpo contra câncer foi similar ou superior àquele de PMAb83 (isto é, o anticorpo humano específico de proteína de PAUF existente (FIGS. 5 a 7 e 13 a 16).
[075]Estes resultados sugerem que o anticorpo que pode se ligar à proteína de PAUF da presente invenção pode ser eficazmente usado para a prevenção ou tratamento de câncer.
[076]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um método para prevenir ou tratar câncer que inclui administrar os anticorpos descritos acima a um sujeito.
[077]Em particular, as explanações do anticorpo, câncer, prevenção e tratamento são as mesmas como descrito acima.
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22/44 [078]Como usado aqui, o termo “sujeito” inclui mamíferos (por exemplo, ratos, gado, porcos, ovelha, frangos, cães, seres humanos, etc.), aves, etc. que desenvolverem ou estão em risco de desenvolverem câncer, mas qualquer sujeito em que o câncer pode ser tratado administrando-se a composição farmacêutica da presente invenção é incluído sem limitação.
[079]No método para prevenir ou tratar câncer da presente invenção, a via de administração e método de administração para administrar a composição não são particularmente limitados e qualquer via de administração e método de administração podem ser usados contanto que a composição possa atingir os sítios alvos.
[080]Especificamente, a composição pode ser administrada por intermédio de várias vias incluindo as vias oral e parenteral. Exemplos não limitantes da via de administração podem incluir administração oral, retal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, transdérmica, intranasal, por inalação, etc. Adicionalmente, a composição pode ser administrada por qualquer dispositivo capaz de liberar um agente ativo a uma célula alvo.
[081 ]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um método para inibir a proliferação, migração, ou infiltração de células cancerosas que inclui administrar o anticorpo da presente invenção.
[082]Em particular, as explanações sobre o anticorpo, sujeito e câncer são as mesmas como descrito acima.
[083]O anticorpo mostra afinidade e especificidade extremamente altas para uma proteína de PAUF super-expressada em câncer. O anticorpo pode inibir a proliferação, migração e invasão de vários tipos de câncer (por exemplo, câncer pancreático, câncer ovariano, etc.) e além disso, pode inibir o crescimento in vivo do câncer. Portanto, o anticorpo da presente invenção pode ser eficazmente usado na prevenção ou tratamento de células cancerosas.
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23/44 [084]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um conjugado de anticorpo-fármaco em que um fármaco é conjugado ao anticorpo da presente invenção.
[085]Em particular, a explanação sobre o anticorpo é a mesma como descrito acima.
[086]Como usado aqui, o termo “conjugado de anticorpo-fármaco” refere-se a um material na forma onde um fármaco é conjugado a um anticorpo usando a especificidade alvo, nenhuma toxicidade durante a circulação sanguínea e méritos farmacocinéticos do anticorpo. Um tal conjugado de anticorpo-fármaco usualmente inclui 3 tipos de elementos constituintes (isto é, um anticorpo monoclonal-um ligador-um fármaco) e pode melhorar o efeito terapêutico do anticorpo liberando-se o fármaco a células alvejadas por anticorpos, particularmente células cancerosas.
[087]Como usado aqui, o termo “fármaco” refere-se a um material que é direta ou indiretamente conjugado a um anticorpo para efetuar o tratamento de uma doença que é eficazmente alvejada pelo anticorpo. Fármacos que podem ser conjugados a um anticorpo incluem radionuclídeos, fármacos, linfocinas, toxinas, anticorpos biespecíficos, etc. Adicionalmente, exemplos dos radionuclídeos podem incluir 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125l, 1311, 186Re, etc., mas os radionuclídeos não são limitados a estes. Adicionalmente, exemplos dos fármacos ou toxinas podem incluir etoposido, teniposido, adriamicina, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, análogos de c/s-platina e c/s-platina, bleomicinas, esperamicinas, 5-fluorouracila, melfalano, mostarda de nitrogênio, etc., mas os fármacos ou toxinas que podem ser conjugados aos anticorpos da presente invenção não são limitados a estes.
[088]O conjugado de anticorpo-fármaco pode ser preparado usando um método para preparar vários conjugados de anticorpo-fármaco conhecidos na técnica.
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24/44 [089]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece uma composição diagnostica de câncer contendo o anticorpo da presente invenção.
[090]Em particular, as explanações do anticorpo e câncer são as mesmas como descrito acima.
[091 ]A composição diagnostica de câncer da presente invenção contém vários tipos de anticorpos que podem se ligar especificamente a proteínas de PAUF que são super-expressadas em vários tipos de células cancerosas e assim a composição diagnostica de câncer da presente invenção pode ser eficazmente usada para a diagnose de doenças associadas com a presença/ausência de expressão ou nível de expressão de proteínas de PAUF (por exemplo, câncer).
[092]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um kit diagnóstico de câncer contendo a composição.
[093]Em particular, as explanações da composição e câncer são as mesmas como descrito acima.
[094]O kit diagnóstico de câncer da presente invenção pode ser constituído incluindo-se ainda uma composição tendo um ou mais tipos de outros componentes, uma solução, ou um dispositivo adequado para o método de análise.
[095]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um método diagnóstico de câncer, que inclui detectar proteínas de PAUF em uma amostra biológica isolada de um sujeito suspeito de ter câncer através de uma reação de antígeno-anticorpo usando o anticorpo da presente invenção.
[096]Em particular, as explanações do anticorpo, sujeito e câncer são as mesmas como descrito acima.
[097]Visto que é conhecido que proteínas de PAUF são super-expressadas em vários tipos de células cancerosas, o anticorpo da presente invenção que se liga a uma proteína de PAUF com especificidade e afinidade altas pode ser eficazmente usado para a diagnose de doenças associadas com a presença/ausência de
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25/44 expressão ou nível de expressão de uma proteína de PAUF (por exemplo, câncer).
[098]O método diagnóstico de câncer pode detectar proteínas de PAUF reagindo-se o anticorpo específico de PAUF da presente invenção com uma amostra biológica isolada de um sujeito suspeito de ter câncer, seguido por detecção da formação de um complexo de antígeno-anticorpo, por meio do qual o câncer pode ser diagnosticado.
[099]Especificamente, o método diagnóstico de câncer pode ser um método que inclui (a) tratar o anticorpo a uma amostra biológica isolada de um sujeito suspeito de ter câncer e detectar proteínas de PAUF através de uma reação de antígeno-anticorpo e (b) comparar o nível de proteínas de PAUF detectadas em (a) com aquele do grupo de controle e determinar o sujeito como um paciente com câncer quando o nível de proteínas de PAUF for mais alto do que aquele do grupo de controle.
[0100]Como usado aqui, o termo “amostra biológica” pode incluir tecidos, células, sangue total, soro, plasma, amostras de autópsia tecidual (cérebro, pele, linfonodos, medula espinhal, etc.), sobrenadante de cultura celular, células eucarióticas rompidas, sistemas de expressão bacteriana, etc., mas a amostra biológica não é limitada a estas. A presença de uma proteína de PAUF ou presença de câncer pode ser confirmada reagindo-se estas amostras biológicas, com ou sem manipulação, com os anticorpos da presente invenção.
[0101]Como usado aqui, o termo “complexo de antígeno-anticorpo” refere-se a um conjugado entre um antígeno de uma proteína de PAUF em uma amostra e um anticorpo da presente invenção que reconhece o antígeno. A formação do complexo de antígeno-anticorpo pode ser detectada por qualquer método tal como um método colorimétrico, um método eletroquímico, um método fluorimétrico, um método luminométrico, um método de contagem de partículas, avaliação visual, um método de contagem por cintilação, etc. Entretanto, os métodos para detectar a formação do
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26/44 complexo de antígeno-anticorpo não são limitados a estes, mas várias aplicações são possíveis.
[0102]Vários marcadores podem ser usados para detectar o complexo de antígeno-anticorpo. Exemplos específicos dos marcadores podem incluir enzimas, materiais fluorescentes, ligantes, materiais luminescentes, micropartículas, radioisótopos, etc., mas os marcadores não são limitados a estes. Em particular, exemplos das enzimas que podem ser usadas como os marcadores para detecção podem incluir acetilcolinesterase, fosfatase alcalina, β-D-galactosidase, peroxidase de raiz forte, β-lactamase, etc.; exemplos dos materiais fluorescentes podem incluir fluoresceína, Eu3+, quelatos de Eu3+, criptatos de Eu3+, etc.; exemplos dos ligantes podem incluir derivados de biotina, etc.; exemplos dos materiais luminescentes podem incluir ésteres de acridínio, derivados de isoluminol, etc.; exemplos das micropartículas podem incluir ouro coloidal, látex colorido, etc. e exemplos dos radioisótopos podem incluir 57Co, 3H, 125l, reagente de 125l-Bonton Hunter, etc.
[0103]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um método para triar materiais para prevenir ou tratar câncer, que inclui (a) tratar células cancerosas com um material candidato para prevenir ou tratar câncer; (b) medir o nível de uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF) nas células cancerosas, em que o material candidato foi tratado, usando o anticorpo da presente invenção; e (c) determinar se o material candidato, que foi tratado na etapa (a), pode ser usado como um material para prevenir ou tratar câncer, quando o nível da proteína de PAUF na etapa (b) for mais baixo do que aquele das células cancerosas não tratadas com o material candidato.
[0104]Em particular, as explanações do anticorpo, proteína de PAUF e câncer são as mesmas como descrito acima.
[0105]Como usado aqui, o termo “material candidato para a prevenção ou tratamento de câncer” é um material que é esperado tratar câncer e qualquer
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27/44 material capaz de melhorar direta ou indiretamente o câncer e pode ser usado sem limitação. O material candidato inclui todos os materiais que são esperados ser usados para o tratamento tais como compostos, genes, proteínas, etc.
[0106]Na presente invenção, a etapa (a) de tratar células cancerosas com um material candidato para a prevenção ou tratamento de câncer pode ser realizada usando um método conhecido na técnica. Em uma modalidade específica, células cancerosas podem ser tratadas com o material candidato e cultivadas juntamente ou o material candidato pode ser tratado administrando-o em um organismo vivo contendo células cancerosas, mas o método não é limitado a este e uma pessoa de habilidade comum na técnica será capaz de usar um método adequado para o objetivo da presente invenção.
[0107]Adicionalmente, a etapa (b) de medir o nível de uma proteína de PAUF pode ser realizada usando qualquer método conhecido a uma pessoa de habilidade comum na técnica. Em uma modalidade específica, western blot, ensaio de co-imunoprecipitação, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), imunomanchamento histológico, análise de citometria de fluxo, etc. podem ser usados, mas o método não é limitado a este e uma pessoa de habilidade comum na técnica será capaz de usar um método adequado para o objetivo da presente invenção.
[0108]Finalmente, a etapa (c) refere-se a determinar se o material candidato pode ser usado como um material para a prevenção ou tratamento de câncer e o material candidato que pode reduzir o nível de uma proteína de PAUF, que é super-expressada em células cancerosas e promove a proliferação, migração, invasão, crescimento, etc. de células cancerosas, pode ser usado como um material para a prevenção e tratamento do câncer.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0109]Em seguida, a presente invenção será descrita em mais detalhe com
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28/44 referência aos exemplos seguintes. Entretanto, estes Exemplos são para propósitos ilustrativos apenas e o escopo da invenção não é limitado por estes Exemplos.
Exemplo 1. Descoberta e confirmação de anticorpo de camundongo anti-proteína de PAUF
Exemplo 1 -1. Descoberta de 2H2 e 20C5 [0110]Para desenvolver um anticorpo que alveja uma proteína de PAUF, um anticorpo monoclonal de camundongo que se liga à proteína de PAUF foi primeiro usado.
[0111]Especificamente, um anticorpo de camundongo anti-proteína de PAUF foi descoberto no método seguinte. Depois de injetar a proteína de PAUF em um camundongo, um anticorpo para a proteína de PAUF foi produzido e linfócitos B foram isolados do baço do camundongo. Os linfócitos isolados foram submetidos a uma diluição de muitas vezes de modo que apenas um linfócito B fosse deixado entrar em cada poço de uma placa de 96 poços revestida com a proteína de PAUF. Depois, os linfócitos B que se ligam à proteína de PAUF foram triados usando anticorpos anti-camundongo rotulados com HRP.
[0112]Como um resultado, quatro tipos de anticorpos de camundongo anti-proteína de PAUF (isto é, 2H2, 4E6, 11G6 e 20C5) foram descobertos e as sequências das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, CDR e FR são descritas nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1 - Sequências de aminoácido de 2H2 (um anticorpo de camundongo anti-proteína de PAUF)
Nome do anticorpo Categoria Sequência SEQ ID NO
2H2 Região variável de cadeia QVQLKQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKD YYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYD 17
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pesada (Vh) PKFQGKASITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAV YYCARRAITTATAWFAYWGQGTLVTVSA
Vh-CDR1 GFNIKDYY 1
Vh-CDR2 IDPENGNT 2
Vh-CDR3 ARRAITTATAWFA 3
Vh-CDR3 ARRAITTATAWFAY 4
Vh-FR1 QVQLKQSGAELVRPGALVKLSCKAS 8
Vh-FR2 MHWVKQRPEQGLEWIGW 9
Vh-FR3 IYDPKFQGKASITADTSSNTAYLQLSSLTSED TAVYYC 10
Vh-FR4 YWGQGTLVTVSA 11
Vh-FR4 WGQGTLVTVSA 12
Região variável de cadeia leve (Vl) DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLN SRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRE SGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVY YCKQSYNLYTFGAGTKLELK 18
Vl-CDR1 QSLLNSRTRKNY 5
Vl-CDR2 FOI 6
Vl-CDR3 KQSYNLY 7
Vl-FR1 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSS 13
Vl-FR2 LAWYQQKPGQSPKLLIY 14
Vl-FR3 TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDL AVYYC 15
Vl-FR4 TFGAGTKLELK 16
Tabela 2 - Sequências de aminoácido de 20C5 (um anticorpo de camundongo anti-proteína de PAUF)
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Nome do anticorpo Categoria Sequência SEQ ID NO
20C5 Região variável de cadeia pesada (Vh) QVQLKESGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKD YYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEHGNTIYD PKFQGKASLTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAV YYCARRGWLPAWFAYWGQGTLVTVSA 37
Vh-CDR1 GFNIKDYY 1
Vh-CDR2 IDPEHGNT 2
Vh-CDR3 ARRGWLPAWFAY 30
Vh-FR1 QVQLKESGAELVRPGALVKLSCKAS 32
Vh-FR2 MHWVKQRPEQGLEWIGW 9
Vh-FR3 IYDPKFQGKASLTADTSSNTAYLQLSSLTSED TAVYYC 33
Vh-FR4 WGQGTLVTVSA 34
Região variável de cadeia leve (Vl) DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTLSCKSSQSLLNS RTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYY CKQSYNLYTFGGGTKLEIK 38
Vl-CDR1 QSLLNSRTRKNY 5
Vl-CDR2 FOI 6
Vl-CDR3 KQSYNLYT 31
Vl-FR1 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTLSCKSS 35
Vl-FR2 LAWYQQKPGQSPKLLIY 14
Vl-FR3 TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDL AVYYC 15
Vl-FR4 FGGGTKLEIK 36
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Exemplo 1-2. Confirmação da especificidade para a proteína de PAUF [0113]O anticorpo com a afinidade mais alta pela proteína de PAUF dentre os quatro tipos de anticorpos (2H2, 4E6, 11G6 e 20C5) descobertos no Exemplo 1-1 foi identificado usando o método seguinte.
[0114]Especificamente, a afinidade do antígeno-anticorpo foi testada usando ELISA indireto. A imunoplaca revestida com PAUF foi tratada com os quatro tipos de anticorpos (2H2, 4E6, 11G6 e 20C5) em diferentes concentrações e os valores de OD foram medidos usando o anticorpo anti-camundongo rotulado com HRP. Em particular, conforme o valor de OD se torna mais alto, a afinidade do anticorpo pelo PAUF se torna mais alta. Adicionalmente, para a medição da ligação não específica de um anticorpo monoclonal de camundongo anti-PAUF, que tem uma afinidade alta por PAUF, a outras proteínas antigênicas, a imunoplaca foi revestida com PAUF e antígenos não específicos de modo a realizar ELISA indireto.
[0115]Como um resultado, como mostrado nas FIGS. 1A e 1B, foi confirmado que os dois tipos de anticorpos (2H2 e 20C5) se ligam à proteína de PAUF com uma afinidade mais alta comparado a outros anticorpos e também que os dois tipos de anticorpos (2H2 e 20C5) têm especificidade extremamente alta para a proteína de PAUF.
Exemplo 1-3. Confirmação dos epítopos [0116]Para confirmar os epítopos de 2H2 e 20C5 descobertos no Exemplo 1-1, foi confirmado se estes anticorpos têm o mesmo epítopo como 8F3, que é um anticorpo monoclonal humano específico de PAUF divulgado na Patente KR N2 10-1098186 (isto é, PMAb83).
[0117]Especificamente, ELISA competitivo de 2H2 rotulado com biotina foi realizado. Uma imunoplaca foi revestida com PAUF e depois, anticorpos 2H2 rotulados com biotina e anticorpos não rotulados com biotina foram adicionados a esta em cada razão de 1:0, 1:50, 1:100 e 1:200. Como o anticorpo secundário,
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32/44 epítopos foram analisados medindo-se o valor de OD de cada anticorpo usando estreptavidina-HRP. Em particular, quando os dois anticorpos têm epítopos similares, os valores de OD diminuem conforme a concentração do anticorpo não rotulado aumenta, ao passo que quando os epítopos dos dois anticorpos diferem um do outro, os valores de OD não mudam mesmo quando a concentração do anticorpo não rotulado aumenta.
[0118]Como um resultado, como mostrado na FIG. 2, foi confirmado que 2H2 ou 20C5 podem reconhecer epítopos similares e cada um deles tem um epítopo diferente de PMAb83.
Exemplo 2. Preparação de anticorpos quiméricos anti-proteína de PAUF e confirmação de suas características
Exemplo 2-1. Preparação de cPMAb22 ou cPMAb205 [0119]Para minimizar a rejeição dos anticorpos de camundongo descobertos no Exemplo 1 (isto é, 2H2 e 20C5), anticorpos quiméricos foram preparados em que a região variável de cada anticorpo foi mantida e apenas a região constante destes foi substituída com uma proteína derivada do ser humano.
[0120]Especificamente, o mRNA total foi isolado de células de hibridoma que produzem anticorpo de camundongo 2H2 ou 20C5 e cada cDNA para 2H2 ou 20C5 foi sintetizado a partir deste. Depois, DNA para 2H2 ou 20C5 foi obtido amplificando-se apenas as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de cada anticorpo através de PCR. Cada uma das regiões variáveis de 2H2 e 20C5 obtidos através de PCR foi clonada em um vetor tendo regiões constantes de cadeias pesadas e leves humanas. Ο 2H2 e 20C5 clonados em vetores foram confirmados por DNA eletroforese e as sequências foram analisadas e divididas em grupos. Depois de remover os clones tendo as mesmas sequências, as cadeias pesadas e leves de cada anticorpo foram selecionadas. As sequências selecionadas foram expressadas em células HEK293 e desse modo dois tipos de anticorpos quiméricos
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33/44 tendo a região variável de um camundongo e uma região constante de seres humanos foram finalmente preparadas.
[0121]Como um resultado, cPMAb22 (isto é, um anticorpo quimérico de 2H2) e cPMAb205 (isto é, um anticorpo quimérico de 20C5) foram preparados. Adicionalmente, foi confirmado que as regiões variáveis de cadeias pesadas e leves, sequências de CDR e FR destes anticorpos quiméricos foram as mesmas como 2H2 ou 20C5 descritos nas Tabelas 1 e 2 acima.
Exemplo 2-2. Confirmação da especificidade para proteína de PAUF [0122]A especificidade de cPMAb22 ou cPMAb205 preparados no Exemplo 2-1 para proteínas de PAUF foi confirmada usando o método seguinte.
[0123]Especificamente, ELISA indireto foi realizado. Os anticorpos quiméricos (isto é, cPMAb22 e cPMAb205) e anticorpo humano (isto é, PMAb83) foram adicionados a uma imunoplaca, que foi revestida com a proteína de PAUF-His e uma pluralidade de proteínas de antígeno não específica, em cada concentração de 0 pg/mL, 1 pg/mL e 5 pg/mL e depois, os valores de OD valores medidos usando a HRP de cadeia leve capa anti-humana (isto é, um anticorpo secundário).
[0124]Como um resultado, como mostrado na FIG. 3, foi confirmado que tanto cPMAb22 quanto cPMAb205 têm especificidade extremamente alta para à proteína de PAUF e em particular, têm especificidade mais alta às proteínas de PAUF do que PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente).
Exemplo 2-3. Confirmação da afinidade por proteínas de PAUF [0125]A especificidade de cPMAb22 ou cPMAb205 preparados no Exemplo 2-1 para proteínas de PAUF foi confirmada usando o método seguinte.
[0126]Especificamente, ELISA indireto foi realizado. Uma imunoplaca foi revestida com a proteína de PAUF-His e tratada com cada anticorpo em diferentes concentrações e os resultados foram analisados usando o Fc-HRP anti-humano capaz de reconhecer a região constante de anticorpo humano como o anticorpo
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34/44 secundário. Em particular, conforme a concentração de cada anticorpo aumenta, o valor de OD aumenta.
[0127]Como um resultado, como mostrado na FIG. 4, foi confirmado que tanto cPMAb22 quanto cPMAb205 têm especificidade extremamente alta à proteína de PAUF e em particular, têm especificidade mais alta para proteínas de PAUF do que PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente).
Exemplo 2-4. Confirmação do efeito inibitório sobre a proliferação de células cancerosas [0128]Para confirmar o efeito de cPMAb22 (isto é, um dos anticorpos quiméricos preparados no Exemplo 2-1) sobre o tratamento do câncer, o efeito inibitório de cPMAb22 sobre a proliferação de BxPC-3 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático) foi confirmado.
[0129]Especificamente, o ensaio de proliferação de WST-1 foi realizado. A linhagem de célula BxPC-3 tendo um alto nível de auto-expressão de PAUF foi adicionada a uma placa de 96 poços em uma concentração de 3 x 103 células/poço e a placa de 96 poços foi tratada com IgG, cPMAb22 (um anticorpo quimérico) e PMAb83 (um anticorpo humano) uma vez a cada dois dias em uma concentração de 15 pg/mL, respectivamente. Depois, a placa de 96 poços foi tratada com WST-1 e a absorvância foi medida a 450 nm.
[0130]Como um resultado, como mostrado na FIG. 5, foi confirmado que o grupo tratado com cPMAb22 tem uma capacidade inibitória mais alta contra a proliferação de células BxPC-3 comparado ao grupo tratado com o anticorpo de controle de IgG.
[0131 ]A partir dos resultados acima, foi confirmado que cPMAb22 exibe um excelente efeito inibitório sobre a proliferação de células cancerosas e assim cPMAb22 pode ser eficazmente usado como um material para a prevenção ou tratamento de câncer.
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Exemplo 2-5. Confirmação do efeito inibitório sobre a migração de células cancerosas [0132]Para confirmar o efeito de cPMAb22 (isto é, um dos anticorpos quiméricos preparados no Exemplo 2-1) sobre o tratamento do câncer, os efeitos inibitórios de cPMAb22 sobre a migração de CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático) e AMCPAC04 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático) foram confirmados.
[0133]Especificamente, um ensaio de migração foi realizado usando um dispositivo Transwell. No caso de CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático), 5 x 104 células foram adicionadas no compartimento superior do Transwell usando um meio isento de soro e depois tratadas com IgG, cPMAb22 e PMAb83, cada um em uma concentração de 15pg/mL, ao passo que um meio contendo soro foi adicionado no compartimento inferior do transwell. Depois de 24 horas, a migração das células foi observada. Adicionalmente, no caso de AMCPAC04 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático), 6 x 104 células foram adicionadas no compartimento superior do Transwell usando um meio isento de soro e as células foram tratadas com IgG, cPMAb22 e PMAb83, cada um em uma concentração de 10 pg/mL, ao passo que um meio contendo soro foi adicionado no compartimento inferior do Transwell. Depois de 20 horas, a migração das células foi observada.
[0134]Como um resultado, como mostrado na FIG. 6, foi confirmado que o grupo tratado com cPMAb22 mostrou uma diminuição significativa no nível de migração das células de uma linhagem de célula de câncer pancreático ou câncer pancreático derivado de um paciente com câncer pancreático, comparado ao grupo tratado com IgG (isto é, o anticorpo do grupo de controle). Em particular, foi confirmado que este nível de migração foi ainda mais baixo comparado àquele do grupo tratado com PMAb83.
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36/44 [0135]A partir destes resultados, foi confirmado que cPMAb22 tem um efeito inibitório superior sobre a migração de células cancerosas comparado a PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente) e assim cPMAb22 pode ser eficazmente usado como um material para a prevenção ou tratamento do câncer.
Exemplo 2-6. Confirmação do efeito inibitório sobre a invasão de células cancerosas [0136]Para confirmar o efeito de cPMAb22 (/sto é, um dos anticorpos quiméricos preparados no Exemplo 2-1) sobre o tratamento do câncer, os efeitos inibitórios de cPMAb22 sobre a invasão de CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático) e AMCPAC04 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático) foram confirmados.
[0137]Especificamente, o ensaio de invasão foi realizado usando um dispositivo Transwell. Em particular, o Transwell foi revestido com Matrigel, que pode simular artificialmente a matriz extracelular e a capacidade de invasão da linhagem de célula de câncer pancreático que muda por cada anticorpo foi observada. No caso de CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático), 7 x 104 células foram adicionadas no compartimento superior do Transwell usando um meio isento de soro e depois tratadas com IgG, cPMAb22 e PMAb83, cada um em uma concentração de 15pg/mL, ao passo que um meio contendo soro foi adicionado no compartimento inferior do Transwell. Depois de 24 horas, a invasão das células foi observada. Adicionalmente, no caso de AMCPAC04 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático), 6 x 104 células foram adicionadas no compartimento superior do Transwell usando um meio isento de soro e as células foram tratadas com IgG, cPMAb22 e PMAb83, cada um em uma concentração de 10 pg/mL, ao passo que um meio contendo soro foi adicionado no compartimento inferior do Transwell. Depois de 20 horas, a invasão das células foi observada.
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37/44 [0138]Como um resultado, como mostrado na FIG. 7, foi confirmado que o grupo tratado com cPMAb22 mostrou uma diminuição significativa no nível de invasão das células de uma linhagem de célula de câncer pancreático ou câncer pancreático derivado de um paciente com câncer pancreático, comparado ao grupo tratado com IgG (isto é, o anticorpo do grupo de controle). Em particular, foi confirmado que este nível de invasão foi ainda mais baixo comparado àquele do grupo tratado com PMAb83.
[0139]A partir destes resultados, foi confirmado que cPMAb22 tem um efeito inibitório superior sobre a invasão de células cancerosas comparado a PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente) e assim cPMAb22 pode ser eficazmente usado como um material para a prevenção ou tratamento do câncer.
Exemplo 3. Preparação de anticorpos humanizados anti-proteína de PAUF e confirmação de suas características
Exemplo 3-1. Preparação de hPMAb22 [0140]Para minimizar a rejeição de 2H2 (isto é, o anticorpo de camundongo descoberto no Exemplo 1) e cPMAb22 (isto é, um do anticorpo quimérico preparado no Exemplo 2), anticorpos humanizados foram preparados em que as CDRs de 2H2 e cPMAb22 (derivados de um camundongo) foram mantidas enquanto as regiões variáveis e regiões constantes excluindo as CDRs foram substituídas com uma proteína derivada do ser humano.
[0141]Especificamente, três tipos de anticorpos humanizados (isto é, 2H2-Vh1/Vl1,2H2-Vh1/Vl2 e 2H2-Vh1/Vl3) foram preparados através de enxerto de CDR e sua afinidade e rendimento de produção foram confirmados. Para medir os níveis de expressão de anticorpos humanizados, montagem cruzada foi permitida entre três cadeias pesadas (Vh1 , Vh2 e Vh3) e três cadeias leves (Vl1 , Vl2 e Vl3), cada uma em um nível de 5 mL e depois os resultantes foram transfectados em células HEK293. Então, depois de 6 dias, a solução de cultura foi obtida colhendo-se
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38/44 o meio contendo a proteína do anticorpo e a taxa de expressão foi medida por western blotting. Adicionalmente, a afinidade destes anticorpos foi analisada por ELISA indireto. Imunoplacas foram revestidas com PAUF-His e depois tratadas com cada anticorpo em concentrações diferentes. Os valores de OD foram medidos usando o Fc-HRP anti-humano que pode reconhecer as regiões constantes de anticorpo humano como o anticorpo secundário.
[0142]Como um resultado, como mostrado na FIG. 8, o anticorpo 2H2-Vh1/Vl1 tinha a afinidade mais alta por proteínas de PAUF comparado a outros anticorpos humanizados, confirmando assim que o anticorpo 2H2-Vh1/Vl1 tem afinidade ainda mais alta comparado a cPMAb22 (isto é, um anticorpo quimérico) ou PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente).
[0143]Adicionalmente, como mostrado na FIG. 9, o rendimento de produção do anticorpo 2H2-Vh1/Vl1 foi 165,5mg/L, confirmando assim que o anticorpo 2H2-Vh1/Vl1 tem rendimento de produção significativamente mais alto do que o anticorpo 2H2-Vh1/Vl1 (28,25 mg/L) ou o anticorpo 2H2-Vh1/Vl3 (42,0 mg/L).
[0144]A partir destes resultados, o anticorpo 2H2-Vh1/Vl1 que mostrou ter a afinidade mais alta por proteínas de PAUF e o rendimento de produção mais alto foi selecionado como o anticorpo humanizado de 2H2 e cPMAb22 de acordo com a presente invenção, designado como “hPMAb22” e as sequências são descritas na Tabela 3 abaixo.
Tabela 3 - Sequências de aminoácido de hPMAb22 (isto é, um anticorpo humanizado anti-proteína de PAUF)
Nome do anticorpo Categoria Sequência SEQ ID NO
hPMAb2 Região variável QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIK 28
2 de cadeia DYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGNT
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pesada (Vh) NYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRS D DTAVYYCAR RAITTATAW FAYWGQGTL VT VSS
Vh-CDR1 GFNIKDYY 1
Vh-CDR2 IDPENGNT 2
Vh-CDR3 ARRAITTATAWFA 3
Vh-CDR3 ARRAITTATAWFAY 4
Vh-FR1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS 19
Vh-FR2 MHWVRQAPGQGLEWMGW 20
Vh-FR3 NYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRS DDTAVYYC 21
Vh-FR4 YWGQGTLVTVSS 22
Vh-FR4 WGQGTLVTVSS 23
Região variável de cadeia leve (Vl) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLN SRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCKQSYNLYTFGQGTKVEIK 29
Vl-CDR1 QSLLNSRTRKNY 5
Vl-CDR2 FOI 6
Vl-CDR3 KQSYNLY 7
Vl-FR1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS 24
Vl-FR2 LAWYQQKPGQPPKLLIY 25
Vl-FR3 TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYC 26
Vl-FR4 TFGQGTKVEIK 27
Exemplo 3-2. Confirmação da especificidade para proteínas de PAUF [0145]A especificidade de hPMAb22 (isto é, o anticorpo humanizado
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40/44 preparado no Exemplo 3-1) para proteínas de PAUF foi confirmada usando o método do Exemplo 2-2.
[0146]Como um resultado, como mostrado na FIG. 10, foi confirmado que hPMAb22 tem especificidade significativamente alta para proteínas de PAUF e em particular, especificidade ainda mais alta do que PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente).
Exemplo 3-3. Confirmação da afinidade por proteínas de PAUF [0147]A afinidade de hPMAb22 (isto é, o anticorpo humanizado preparado no Exemplo 3-1) por proteínas de PAUF foi confirmada usando o método do Exemplo 2-2.
[0148]Especificamente, a afinidade de ligação de antígeno-anticorpo foi medida usando o método SPR. PAUF antigênico foi imobilizado na superfície de uma película metálica fina e o anticorpo foi diluído em concentrações diferentes e deixado passar através da superfície metálica. A afinidade de ligação de antígeno-anticorpo foi medida medindo-se o tempo necessário para ligação e dissociação entre antígenos e anticorpos.
[0149]Como um resultado, como mostrado na FIG. 11, foi confirmado que PAMb83 tem um valor de Kd de 1,169 x 10’9 M e hPMAb22 tem um valor de Kd de 0,1938 x 10’9 M. A partir destes resultados, foi confirmado que hPMAb22 tem afinidade significativamente alta por proteínas de PAUF e em particular, afinidade mais alta comparado a PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente).
Exemplo 3-4. Confirmação dos epítopos [0150]Para confirmar o epítopo de hPMAb22 preparado no Exemplo 3-1, primeiro foi confirmado se PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente) e o epítopo são os mesmos de acordo com o Exemplo 1-3.
[0151]Como um resultado, como mostrado na FIG. 12, foi confirmado que hPMAb22 tem um epítopo que é diferente daquele de PMAb83.
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Exemplo 3-5. Confirmação do efeito inibitório sobre a proliferação de células cancerosas [0152]Para confirmar o efeito de hPMAb22 (isto é, o anticorpo humanizado preparado no Exemplo 3-1) sobre o tratamento do câncer, o efeito inibitório de hPMAb22 sobre a proliferação de CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático) foi confirmado pelo método de acordo com o Exemplo 2-4.
[0153]Como um resultado, como mostrado na FIG. 13, foi confirmado que o grupo tratado com hPMAb22 tem um efeito inibitório superior sobre a proliferação de CFPAC-1 (isto é, uma linhagem de célula de câncer pancreático), comparado ao grupo tratado com IgG (isto é, o anticorpo do grupo de controle).
[0154]A partir destes resultados, foi confirmado que hPMAb22 exibe um excelente efeito inibitório sobre a proliferação de células cancerosas e assim hPMAb22 pode ser eficazmente usado como um material para a prevenção e tratamento do câncer.
Exemplo 3-6. Confirmação do efeito inibitório sobre a migração de células cancerosas [0155]Para confirmar o efeito de hPMAb22 (isto é, o anticorpo humanizado preparado no Exemplo 3-1) sobre o tratamento do câncer, o efeito inibitório de hPMAb22 sobre a migração de AMCPAC06 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático) e OVCAR-5 (isto é, uma linhagem de célula de câncer ovariano) foi confirmado pelo método de acordo com o Exemplo 2-5.
[0156]Como um resultado, como mostrado na FIG. 14, o grupo tratado com hPMAb22 mostrou uma diminuição significativa nos níveis de migração da linhagem de célula de câncer pancreático, linhagem de célula cancerosa derivada de um paciente com câncer pancreático e linhagem de célula de câncer ovariano, comparado ao grupo tratado com IgG (isto é, o anticorpo do grupo de controle). Em
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42/44 particular, estes resultados confirmaram que a diminuição no nível de migração pelo tratamento com hPMAb22 foi ainda mais baixa do que aquela do grupo tratado com PMAb83.
[0157]A partir destes resultados, foi confirmado que hPMAb22 exibe um efeito inibitório superior sobre a migração de células cancerosas comparado a PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente) e assim hPMAb22 pode ser eficazmente usado como um material para a prevenção e tratamento do câncer.
Exemplo 3-7. Confirmação do efeito inibitório sobre a invasão de células cancerosas [0158]Para confirmar o efeito de hPMAb22 (/sto é, o anticorpo humanizado preparado no Exemplo 3-1) sobre o tratamento do câncer, o efeito inibitório de hPMAb22 sobre a invasão de AMCPAC04 ou AMCPAC06 (isto é, células de câncer pancreático derivadas de um paciente com câncer pancreático) e OVCAR-5 (isto é, uma linhagem de célula de câncer ovariano) foi confirmado pelo método de acordo com o Exemplo 2-6.
[0159]Como um resultado, como mostrado na FIG. 15, o grupo tratado com hPMAb22 mostrou uma diminuição significativa nos níveis de invasão da linhagem de célula de câncer pancreático, linhagem de célula cancerosa derivada de um paciente com câncer pancreático e linhagem de célula de câncer ovariano, comparado ao grupo tratado com IgG (isto é, o anticorpo do grupo de controle). Em particular, estes resultados confirmaram que a diminuição no nível de invasão pelo tratamento com hPMAb22 foi ainda mais baixa do que aquela do grupo tratado com PMAb83.
[0160]A partir destes resultados, foi confirmado que hPMAb22 exibe um efeito inibitório superior sobre a invasão de células cancerosas comparado a PMAb83 (isto é, um anticorpo humano anti-PAUF existente) e assim hPMAb22 pode ser eficazmente usado como um material para a prevenção e tratamento do câncer.
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Exemplo 3-8. Confirmação do efeito anticâncer in vivo [0161]Como hPMAb22, que é um anticorpo humanizado específico para proteínas de PAUF, foi confirmado inibir a proliferação, migração e invasão in vitro de células cancerosas através dos Exemplos 3-5 a 3-7, foi examinado se hPMAb22 também exibe os mesmos efeitos anticâncer in vivo.
[0162]Especificamente, o tecido canceroso de um paciente com adenocarcinoma ductal pancreático foi transplantado em cada camundongo NSG para preparar um modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PDX). O tecido canceroso removido do modelo de camundongo PDX foi subcutaneamente transplantado na pata direita de cada camundongo nu. Depois de cerca de 3 semanas, os camundongos que tiveram um tamanho de tumor de 80 mm3 a 120 mm3 foram selecionados e divididos em grupos. O fármaco foi administrado às veias caudais dos camundongos. IgG e hPMAb22 foram administrados em uma dose de 10 mg/kg duas vezes por semana por um total de 4 semanas e Gemzar® (gencitabina), que foi usado como o controle positivo, foi administrado uma vez em uma dose de 50 mg/kg. Em particular, o tamanho do tumor foi medido usando um calibrador duas vezes por semana e o peso corpóreo de cada camundongo também foi medido para determinar a resposta do tumor ao fármaco. Depois de terminar o experimento no 312 dia, os tumores foram removidos e o peso de cada tumor foi medido e comparado.
[0163]Como um resultado, como mostrado na FIG. 16, foi confirmado que o grupo tratado com hPMAb22 mostrou uma diminuição de 30 % ou mais no crescimento da célula cancerosa comparado ao grupo tratado com o anticorpo do grupo de controle. Em particular, foi confirmado que o efeito inibitório sobre o crescimento de hPMAb22 foi superior àquele do grupo administrado com Gemzar®, sendo usado como um agente anticâncer.
[0164]A partir destes resultados, foi confirmado que hPMAb22 exibe um
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44/44 efeito inibitório superior sobre o crescimento in vivo de células cancerosas comparado a Gemzar® (isto é, um agente anticâncer existente) e assim hPMAb22 pode ser eficazmente usado como um material para a prevenção e tratamento do câncer.
[0165]A partir do precedente, uma pessoa habilitada na técnica à qual a presente invenção pertence será capaz de entender que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente invenção. Sob esse aspecto, as modalidades exemplares divulgadas aqui são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitando o escopo da presente invenção. Ao contrário, a presente invenção é intencionada a abranger não apenas as modalidades exemplares mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem ser incluídas dentro do espírito e escopo da presente invenção como definido pelas reivindicações anexas.

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo que se liga a uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    uma região variável de cadeia pesada, que compreende uma CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1; uma CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2; e uma CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3, 4, ou 30; e uma região variável de cadeia leve, que compreende uma CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 5; uma CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 6; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 7 ou 31.
  2. 2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que:
    a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende uma FR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8, 19, ou 32; uma FR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 ou 20; uma FR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 10, 21, ou 33; e uma FR4 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11, 12, 22, 23, ou 34; e a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende a FR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 13, 24, ou 35; a FR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 14 ou 25; a FR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 15 ou 26; e a FR4 de cadeia leve da SEQ ID NO: 16, 27, ou 36.
  3. 3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que:
    a região variável de cadeia pesada consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17, 28, ou 37; e a região variável de cadeia leve consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18, 29, ou 38.
  4. 4. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica o anticorpo
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    2/3 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
  5. 5. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 4.
  6. 6. Transformante, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 5 é introduzido.
  7. 7. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
  8. 8. Método para prevenir ou tratar câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 a um sujeito.
  9. 9. Método para inibir a proliferação, migração, ou invasão de células cancerosas, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 a um sujeito.
  10. 10. Conjugado de anticorpo-fármaco, CARACTERIZADO pelo fato de que um fármaco é conjugado ao anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
  11. 11. Composição diagnostica de câncer, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
  12. 12. Kit diagnóstico de câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composição de acordo com a reivindicação 11.
  13. 13. Método diagnóstico de câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende detectar uma proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF) em uma amostra biológica isolada de um sujeito suspeito de câncer através de uma reação de antígeno-anticorpo usando o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
  14. 14. Método para triar materiais para prevenir ou tratar câncer,
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    3/3
    CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
    (a) tratar as células cancerosas com um material candidato para prevenir ou tratar câncer;
    (b) medir o nível da proteína de fator supra-regulado em adenocarcinoma pancreático (PAUF) nas células cancerosas, em que o material candidato foi tratado, usando o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3; e (c) determinar se o material candidato, que foi tratado na etapa (a), pode ser usado como um material para prevenir ou tratar câncer, quando o nível da proteína de PAUF na etapa (b) é mais baixo do que aquele das células cancerosas não tratadas com o material candidato.
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