BR112021004586A2 - composição medicinal incluindo anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno e seu uso - Google Patents
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Abstract
COMPOSIÇÃO MEDICINAL INCLUINDO ANTICORPO MONOCLONAL OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO E SEU USO.
A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno com a utilização do mesmo. O anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno pode inibir ou aliviar especificamente a ligação de PTX3 e receptor de PTX3, sendo assim aplicado em um kit e um método de detecção de PTX3, bem como em composições e usos de inibição ou alívio de uma doença ou síndrome relacionada à ligação de PTX3 e receptor de PTX3.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO-
[1] A presente invenção refere-se a um anticorpo e seus usos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno para inibir ou aliviar especificamente a ligação da sequência específica do terminal C da pro- teína PTX3 ao receptor de PTX3, e suas aplicações em reagentes de detecção, composições medicinais e usos de doenças ou sintomas re- lacionados com a inibição ou alívio específico da ligação da sequência específica do terminal C de PTX3 ao receptor de PTX3.
[2] É bem conhecido que as células cancerosas podem estimu- lar o microambiente tumoral para produzir alguns tipos de fatores infla- matórios, glóbulos brancos, hiperplasia vascular e proteases. A inflama- ção crônica relacionada ao câncer geralmente está associada à prolife- ração, metástase e invasão de células cancerosas. No entanto, ainda não está claro como esses fenômenos ocorrem e o mecanismo deta- lhado envolvido neles.
[3] Como mencionado anteriormente, o microambiente tumoral está associado à inflamação; outros estudos divulgaram que o micro- ambiente tumoral está profundamente associado à metástase e à qui- miorresistência. Várias células do estroma e outros tipos celulares dife- rentes foram encontrados no microambiente tumoral, que protege e ajuda as células tumorais a evadir e resistir às células do sistema imu- nológico, resultando em quimiorresistência das células tumorais.
[4] No tecido estromal em torno do tumor, fibroblastos e macró-
fagos ativados por CEBPD podem induzir a proteína relacionada à pen- traxina 3 (PTX3), um fator secretado. PTX3 pode promover a angiogê- nese e aumentar a metástase e a invasão de células do carcinoma na- sofaríngeo (NPC) nos tecidos. Além disso, alguns estudos demonstra- ram que as células cancerosas dos tecidos circundantes ativadas por CEBPD auxiliam o progresso de metástase do câncer e das células can- cerígenas quimiorresistentes. Essas células cancerosas quimiorresis- tentes podem desenvolver metástases mais rápidas e mais fáceis.
[5] Alguns fármacos anticancerígenos de moléculas pequenas estão comercialmente disponíveis no mercado, por exemplo, cis-diami- nodicloroplatina (II) (CDDP; Nome comercial: Cisplatina); Paclitaxel (Nome comercial: Taxol); 5-Fluorouracil (5-FU) etc. No entanto, estudos recentes constataram que os fármacos anticancerígenos de moléculas pequenas, mencionados acima, podem ativar a expressão de CEBPD em células cancerosas, bem como em macrófagos e fibroblastos. Ao contrário, os fármacos anticancerígenos de moléculas pequenas promo- vem resistência aos fármacos e rápida metástase de células cancero- sas, resultando em tratamento de câncer insatisfatório.
[6] Doenças ou sintomas relacionados à PTX3 e sua ligação ao receptor de PTX3 estão envolvidos em doenças fibróticas e/ou sintomas fibróticos, além dos cânceres anteriormente mencionados.
[7] Consequentemente, há uma necessidade urgente de desen- volver um anticorpo para ligar-se especificamente à PTX3, detectando assim a quantidade de PTX3 em um espécime biológico e superando as desvantagens de fármacos convencionais em tratamentos insuficien- tes de câncer e fibrose.
[8] Portanto, um aspecto da presente invenção fornece um anti- corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que reconhece especificamente uma sequência específica do terminal C de uma ou mais proteínas PTX3.
[9] Outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreen- dendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variá- vel de cadeia leve (VL), cada um tendo sequências específicas, respec- tivamente.
[10] Outro aspecto da presente invenção fornece um conjunto para detectar PTX3, compreendendo um anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo.
[11] Outro aspecto da presente invenção fornece um método para a detecção in vitro de PTX3 usando o conjunto anteriormente men- cionado para a detecção de PTX3.
[12] Outro aspecto da presente invenção fornece uma composi- ção medicinal, compreendendo uma dose eficaz do anticorpo monoclo- nal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente men- cionado, como um ingrediente ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[13] Outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso como a medicação que inibe ou alivia especificamente a doença ou o sintoma relacionado à ligação de PTX3 ao receptor de PTX3, em que a composição medicinal inclui uma dose eficaz do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, inibindo ou aliviando assim a ligação da proteína relacionada à pentraxina (PTX3) ao receptor de PTX3.
[14] Outro aspecto da presente invenção fornece um método para inibir ou aliviar uma atividade de uma célula tumoral in vitro, que inclui a administração de uma dose eficaz de composição medicinal à célula tumoral, inibindo ou aliviando assim as atividades da célula tumo- ral.
[15] Outro aspecto da presente invenção fornece um método para inibir ou aliviar uma doença ou um sintoma relacionado à fibrose in vitro, que inclui a administração de uma dose eficaz de composição me- dicinal a um órgão afetado pela doença ou ao sintoma relacionado à fibrose, inibindo ou aliviando assim a doença ou o sintoma do órgão.
[16] Em vista do aspecto anteriormente mencionado, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode reconhecer especifi- camente uma sequência de aminoácidos não desnaturados selecionada do grupo que consiste em sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 1 a 11.
[17] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos não des- naturados é selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 1 a 11. Em outras modali- dades, a sequência de aminoácidos não desnaturados pode incluir, po- rém não se limita a sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 2 a 4 e SEQ ID NO: 11 ou qualquer combinação das mesmas.
[18] De acordo com outro aspecto, a presente invenção também fornece um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 18, 19, 20 e/ou 21, e um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 22, 23, 24 e/ou 25.
[19] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, inclui um domínio VH que compreende sequências de aminoácidos co- dificadas por sequências de ácidos nucleicos listadas como SEQ ID NOs: 26, 27, 28 e/ou 29, e um domínio VL que compreende sequências de aminoácidos codificadas por sequências de ácidos nucleicos listadas como SEQ ID NOs: 30, 31, 32 e/ou 33.
[20] Em outras modalidades, o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, inclui um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos listada como SEQ ID NOs: 34 ou 35, e um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos listada como SEQ ID NOs: 36 ou 37.
[21] Em ainda outras modalidades, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencio- nado, inclui um domínio VH que compreende uma sequência de amino- ácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NO: 38 ou 39, e um domínio VL que compreende uma sequên- cia de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NO: 40 ou 41.
[22] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, é um an- ticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em um exemplo, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo pode ser um anticorpo murino, um anticorpo quimérico humano-murino, um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[23] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um fragmento variável de cadeia única (scFv), um dímero do scFv [(scFv)2], um trímero do scFv [(scFv)3], um fragmento variável (Fv), um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento Fab' dimérico [F(ab')2], um nanocorpo ou qualquer combinação dos mesmos.
[24] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser modificado por conjugação, acoplamento, glicosilação, fixação de marcador, ou quaisquer suas combinações.
[25] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um conjugado anticorpo- fármaco (ADC) ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[26] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um anticorpo monoclonal bifuncional (BsAb) ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[27] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um anticorpo monoclonal trifuncional e/ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[28] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode pertencer à classe IgG, classe IgM, classe IgA, classe IgD ou classe IgE. Em outra modalidade, o anti- corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode pertencer ao tipo IgG e tem isótipo IgG1, isótipo IgG2, isótipo IgG3 ou isótipo IgG4.
[29] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode pertencer a um anticorpo inerte ou a um anticorpo antagonista.
[30] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode inibir ou aliviar especificamente a ligação do receptor da proteína relacionada à pentraxina (PTX3) a uma sequência específica do terminal C de uma ou mais proteínas PTX3. Em alguns exemplos, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode inibir ou aliviar especificamente as atividades de uma ou mais proteínas PTX3. Em alguns exemplos, o an- ticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode inibir ou aliviar especificamente uma interação do receptor de PTX3 e uma ou mais proteínas PTX3, uma transdução de sinal mediada por PTX3, ou qualquer combinação dos mesmos.
[31] De acordo com outros aspectos, a presente invenção tam- bém fornece um conjunto para detecção de PTX3 in vitro, que inclui qualquer um dos anticorpos monoclonais ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode se ligar espe- cificamente a uma sequência de aminoácidos não desnaturados e a se- quência de aminoácidos não desnaturados pode incluir, porém não se limita a qualquer sequência de aminoácidos listada como SEQ ID NOs: 1 a 11.
[32] De acordo ainda com outro aspecto, a invenção fornece um método para detecção de PTX3 in vitro usando o conjunto anteriormente mencionado para detecção de PTX3, em que uma sensibilidade analí- tica do anticorpo monoclonal ou de fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no conjunto para detecção de PTX3 pode ser menor do que 0,0016 pM.
[33] De acordo ainda com outro aspecto, a invenção fornece uma composição medicinal que compreende uma dose eficaz do anticorpo monoclonal anteriormente mencionado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como um ingrediente ativo e um veículo farmaceu- ticamente aceitável.
[34] Em uma modalidade, a composição medicinal inclui ainda um ingrediente farmaceuticamente ativo.
[35] De acordo ainda com outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso como um medicamento no tratamento de uma doença ou um sintoma relacionado ao receptor de PTX3 reconhecendo PTX3. Em uma modalidade, o medicamento compreende uma dose eficaz de um anti- corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ini- bindo ou aliviando assim uma doença ou sintoma relacionado ao recep- tor de PTX3 reconhecendo PTX3.
[36] Em uma modalidade, a doença ou o sintoma anteriormente mencionado pode incluir carcinoma, adenocarcinoma, glioblastoma multiforme (GBM) e fibrose. Em alguns exemplos, o carcinoma compre- ende câncer de pulmão, câncer de mama e câncer de nasofaringe. O adenocarcinoma, anteriormente mencionado, compreende câncer co- lorretal.
[37] Em uma modalidade, um órgão influenciado pela doença ou pelo sintoma da fibrose pode incluir, porém não se limita ao pulmão, fígado, rim e pele.
[38] Em uma modalidade, o medicamento pode ser administrado por meio de injeção subcutânea (s.c), Injeção intramuscular, injeção in- travenosa, injeção intraperitoneal (i.p), injeção ortotópica, administração oral ou inalação nasal.
[39] De acordo ainda com outro aspecto, a invenção fornece um método de inibir ou aliviar uma atividade de uma célula tumoral in vitro, que inclui a administração de uma dose eficaz da composição medicinal anteriormente mencionada à célula tumoral, inibindo ou aliviando assim as atividades da célula tumoral.
[40] De acordo ainda com outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso como um medicamento no tratamento de uma doença ou sin- toma relacionado à fibrose, que inclui a administração de uma dose efi- caz da composição medicinal anteriormente mencionada ao órgão afe- tado pela doença ou pelo sintoma relacionado à fibrose, inibindo ou ali- viando assim a doença ou o sintoma do órgão.
[41] Com respeito à aplicação ao anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo monoclo- nal PTX3 específico ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode inibir ou aliviar especificamente a ligação do receptor de PTX3 a PTX3, em aplicações no conjunto para detecção de PTX3 in vitro e no método para o diagnóstico in vitro de PTX3, bem como nas composi- ções e usos medicinais como um medicamento no tratamento da do- ença ou do sintoma relacionado ao receptor de PTX3 reconhecendo a proteína PTX3.
[42] A FIG. 1 ilustra um diagrama da curva de afinidade do anti- corpo monoclonal PTX3 com a proteína recombinante PTX3, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[43] A FIG. 2 ilustra um diagrama da curva de afinidade da ligação do anticorpo monoclonal PTX3 com a proteína recombinante PTX3, de acordo com outra modalidade da presente invenção.
[44] As FIGS. 3 e 4 ilustram diagramas de mapeamento de epí- topo da ligação do anticorpo monoclonal PTX3 a vários fragmentos da proteína recombinante PTX3, de acordo com uma modalidade da pre- sente invenção.
[45] A FIG. 5 ilustra um diagrama de mapeamento de epítopo da ligação do anticorpo monoclonal PTX3 a vários fragmentos da proteína recombinante PTX3, de acordo com uma modalidade da presente in- venção, em comparação com o anticorpo monoclonal PTX3 comercial.
[46] A figura 6 ilustra um diagrama de inibição competitiva da li- gação da proteína recombinante PTX3 e do receptor de PTX3 impedido pelo anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[47] As FIGS. 7A a 7C ilustram diagramas de barra de números de células migradas (FIG. 7A), números de células invasivas (FIG. 7B) e números de esferas de células (FIG. 7C) da linhagem celular de cân- cer de mama MDA-MB231 inibida pelo anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[48] As FIGS. 8A a 8C ilustram diagramas de barras de números de células migradas (FIG. 8A), números de células invasivas (FIG. 8B)
e números de esferas de células (FIG. 8C) da linhagem celular de cân- cer de pulmão A549 inibida pelo anticorpo monoclonal PTX3 do EXEM- PLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[49] As FIGS. 9A a 9C ilustram diagramas de barras de números de células migradas (FIG. 9A), números de células invasivas (FIG. 9B) e números de esferas de células (FIG. 9C) da linhagem celular de NPC HONE1 inibida pelo anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[50] As FIGS. 10A a 10C ilustram diagramas de barras de núme- ros de células migradas (FIG. 10A), números de células invasivas (FIG. 10B) e números de esferas de células (FIG. 10C) da linhagem celular GBM U87MG inibida pelo anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[51] As FIGS. 11A a 11B ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de células migradas (FIG. 11A) e números de células invasivas (FIG. 11B) da linhagem celular de câncer de mama MDA-MB231 inibida por anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[52] As FIGS. 12A a 12B ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de células migradas (FIG. 12A) e números de células invasivas (FIG. 12B) da linhagem celular de câncer de pulmão A549 inibida pelo anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[53] As FIGS. 13A a 13B ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de esferas de células da linhagem celular de NPC HONE1 inibida pelo anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[54] As FIGS. 14A a 14C ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de esferas de células da linhagem celular de cân- cer de mama MDA-MB231 (FIG. 14A), da linhagem celular de câncer de pulmão A549 (FIG. 14B), da linhagem celular de NPC HONE1 (FIG. 14C) inibida pelo anticorpo monoclonal PTX3 de EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[55] As FIGS. 15A a 15B ilustram os resultados do tamanho do tumor (FIG. 15A) e da metástase tumoral (FIG. 15B) de células de cân- cer de mama xenoenxertadas MDA-MB231 de camundongos, inibidas pelo anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[56] As FIGS. 16A e 16B ilustram resultados, respectivamente, do tamanho de tumor (FIG. 16A) e metástase tumoral (FIG. 16B) de cé- lulas de câncer de mama aloenxertadas ortotopicamente 4T1 em ca- mundongos, inibidas pelo anticorpo monoclonal PTX3 do anticorpo de controle ou de um anticorpo de controle com o mesmo isótipo, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[57] As FIGS. 17A a 17C ilustram, respectivamente, fotos de ima- gem in vivo do volume e metástase tumoral (FIG. 17A) e gráficos de linha (FIGS. 17B e 17C) das alterações no volume do tumor de células de câncer de mama aloenxertadas ortotopicamente 4T1 de camundon- gos, inibidas pelo anticorpo monoclonal PTX3 (FIG. 17B) ou em combi- nação com Taxol (FIG. 17C), de acordo com uma modalidade da pre- sente invenção.
[58] A FIG. 18A ilustra um esquema experimental para avaliação de células de câncer de mama aloenxertadas ortotopicamente 4T1 de camundongos tratados com anticorpo monoclonal PTX3 ou em combi- nação com Taxol, de acordo com uma modalidade da presente inven- ção.
[59] As FIGS. 18B a 18D ilustram, respectivamente, fotos de ima- gem in vivo do volume e metástase do tumor (FIG. 18B), um gráfico de linha (FIG. 18C) de alterações no volume tumoral e taxa de sobrevivên- cia de camundongos (FIG. 18D), das células de câncer de mama 4T1 aloenxertadas ortotopicamente de camundongos, inibidas por mAb PTX3 ou em combinação com Taxol, de acordo com outra modalidade da presente invenção.
[60] A FIG. 19A ilustra um esquema experimental para avaliação da linhagem celular de adenocarcinoma de cólon MC38 aloenxertado de camundongos, inibida pelo anticorpo monoclonal PTX3 ou pelo anti- corpo de controle, de acordo com uma modalidade da presente inven- ção.
[61] A FIG. 19B ilustra um gráfico de linha do volume do tumor na linhagem celular de adenocarcinoma de cólon aloenxertado MC38 ini- bida pelo anticorpo monoclonal PTX3 ou pelo anticorpo de controle, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[62] As FIGS. 20A e 20B ilustram gráficos de linha do volume tu- moral (FIG. 20A) e da taxa de sobrevivência (FIG. 20B) da linhagem celular GBM humana xenoenxertada U87MG inibida pelo anticorpo mo- noclonal PTX3 ou pelo anticorpo de controle, de acordo com uma mo- dalidade da presente invenção.
[63] A FIG. 21A ilustra um esquema experimental para avaliação da fibrose hepática aguda dos camundongos melhorada pelo anticorpo monoclonal PTX3, de acordo com uma modalidade da presente inven- ção.
[64] As FIGS. 21B a 21D ilustram, respectivamente, as imagens de seções histológicas coradas com hematoxilina-eosina (H&E) do lobo esquerdo do fígado (FIG. 21B, com ampliação de 20x, para observação de apoptose de hepatócitos), os diagramas de barras da porcentagem de área de necrose por seção ( FIG. 21C) e da relação do peso do fígado para o peso corporal (FIG. 21D) na fibrose hepática aguda dos camun- dongos com o anticorpo monoclonal PTX3 do Exemplo 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[65] A FIG. 22A ilustra o esquema experimental para avaliar a melhoria da fibrose hepática crônica dos camundongos tratados com o anticorpo monoclonal PTX3 do Exemplo 1, de acordo com uma modali- dade da presente invenção.
[66] As FIGS. 22B a 22D ilustram, respectivamente, as imagens de seções histológicas coradas com Picro-Sirius Red do lobo esquerdo do fígado (FIG. 22B), os diagramas de barras da porcentagem da área de fibrose do fígado por seção (FIG. 22C) e a relação do peso do fígado para peso corporal (FIG. 22D) na fibrose hepática crônica de camun- dongos tratados com o anticorpo monoclonal PTX3 do Exemplo 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[67] As FIGS. 23A a 23C ilustram, respectivamente, imagens de Western blotting da expressão da proteína relacionada à fibrose (FIG. 23A), imagens (FIG. 23B) e um diagrama de barras (FIG. 23C) de célu- las coradas em nódulos de fibroblastos renais tratados com anticorpo monoclonal PTX3, de acordo com uma modalidade da presente inven- ção.
[68] As FIGS. 24A a 24D ilustram, respectivamente, esquemas experimentais (FIGS. 24A e 24C) e imagens de coloração histológica (FIGS. 24B e 24D) de rim de camundongos UUO detectadas pelo anti- corpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modali- dade da presente invenção.
[69] As FIGS. 25A a 25D ilustram, respectivamente, imagens de Western blotting (FIG. 25A), um diagrama de barras de números de cé- lulas de migração (FIG. 25B), imagens (FIG. 25C) e um diagrama de barras (FIG. 25D) de células coradas em nódulos de fibroblastos de pul- mão tratados com anticorpo monoclonal PTX3, de acordo com uma mo- dalidade da presente invenção.
[70] As FIGS. 26A a 26D ilustram, respectivamente, um esquema experimental (FIG. 26A), um diagrama da curva de alterações no peso corporal (FIG. 26B), exame bruto do pulmão e imagens de coloração histológica (FIGS. 26C e 26D) de fibrose pulmonar induzida por BLM de camundongos tratados com anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[71] As FIGS. 27A a 27D ilustram, respectivamente, um esquema experimental (FIG. 27A), um diagrama da curva de alterações no peso corporal (FIG. 27B), exame bruto do pulmão e imagens de coloração histológica (FIGS. 27C e 27D) de fibrose pulmonar induzida por BLM de camundongos tratados com anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[72] As FIGS. 28A a 28C ilustram, respectivamente, imagens de Western blotting (FIG. 28A), imagens (FIG. 28B) e um diagrama de bar- ras (FIG. 28C) de células coradas em nódulos de fibroblastos embrio- nários tratados com anticorpo monoclonal PTX3, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[73] As FIGS. 29A a 29B ilustram, respectivamente, imagens de Western blotting usando anticorpo monoclonal PTX3 contra a expressão da proteína relacionada à fibrose de fibroblastos hepáticos em vários tratamentos, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[74] Será feita agora referência em detalhes às presentes moda- lidades da invenção, cujos exemplos estão ilustrados nos desenhos anexos.
[75] Como anteriormente mencionado, a presente invenção for- nece uma composição medicinal que inclui anticorpo monoclonal ou fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo mono- clonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe especifica- mente a ligação do receptor de PTX3 e PTX3, para ser aplicado em um conjunto e um método para detecção in vitro de PTX3, bem como uma composição medicinal e seu uso na inibição ou alívio de uma doença ou sintoma relacionado ao receptor de PTX3 que reconhece PTX3.
[76] Especificamente, em uma modalidade, o anticorpo monoclo- nal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar espe- cificamente à sequência de aminoácidos do terminal C da PTX3 hu- mana. A faixa de sequência de aminoácidos do terminal C da PTX3 hu- mana não tem limitação, e a sequência de aminoácidos do terminal C da PTX3 humana pode ser uma sequência de aminoácidos não desna- turados de uma das SEQ ID NOs: 1 a 17, por exemplo, preferivelmente uma sequência de aminoácidos não desnaturados das SEQ ID NOs: 1 a 11, mais preferivelmente uma sequência de aminoácidos não desna- turados das SEQ ID NOs: 1 a 5 e SEQ ID NO: 11, e muito mais preferi- velmente uma sequência de aminoácidos não desnaturados das SEQ ID NOs: 2 a 4 e SEQ ID NO: 11. Na modalidade anteriormente mencio- nada, as sequências de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NOs: 1 a 11 correspondem ao 200o ao 236o resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos do terminal C da PTX3 humana. Em outra modalidade, a sequência de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NOs: 1 a 5 e SEQ ID NO: 11 corresponde ao 200o ao 220o resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos do terminal C da PTX3 hu- mana. Em ainda outra modalidade, a sequência de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NOs: 2 a 4 e SEQ ID NO: 11 corresponde ao 203o ao 217o resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos do terminal C da PTX3 humana.
[77] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, compre- ende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) e uma sequência de domínio variável de cadeia leve (VL), em que a sequência da região determinante da complementaridade (CDR) 1 da sequência de domínio VH tem uma sequência de aminoácidos listada como SEQ ID NO: 1. A sequência CDR2 da sequência de domínio VH tem sequên-
cias de aminoácidos como RIDPANX1X2TKYDPX3FQG, em que X1 re- presenta Gly (G) ou Asp (D), X2 representa Asp (D) ou Asn (N), X3 re- presenta Lys (K) ou Met (M), e os exemplos de sequência CDR2 da sequência de domínio VH podem ser listados como SEQ ID NOs: 19 ou
20. A sequência CDR 3 da sequência de domínio VH tem sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NO: 21. A sequência CDR 1 da sequência de domínio VL tem sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NO: 22. A sequência CDR 2 da sequência de domínio VL tem sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NO: 23. A sequência CDR3 da sequência de domínio VL tem sequências de aminoácidos como HQX4QRSPLT, em que X4 representa Phe (F) ou Tyr (Y), e os exemplos da sequência CDR3 da sequência de domínio VL podem ser listados como SEQ ID NOs: 24 ou 25.
[78] Em outras modalidades, a sequência de domínio VH, anteri- ormente mencionada, do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ter uma sequência de aminoácidos codifi- cada pela sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 e/ou SEQ ID NO: 29, e a sequência de domínio VL do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo pode ter uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e/ou SEQ ID NO: 33.
[79] Em certas outras modalidades, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencio- nado, compreende uma sequência de domínio VH com uma sequência de aminoácidos listada como SEQ ID NOs: 34 ou 35, e uma sequência de domínio VL com uma sequência de aminoácidos listada como SEQ ID NOs: 36 ou 37.
[80] Em outras modalidades, o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado,
compreende uma sequência de domínio VH com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NOs: 38 ou 39, e uma sequência de domínio VL com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nu- cleicos listada como SEQ ID NOs: 40 ou 41.
[81] Em outras modalidades, o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, também abrange estruturas proteicas alternativas, tais como peptídeos grampeados, peptidomiméticos de ligação similar a anticorpos, proteí- nas de andaime de ligação similar a anticorpos, monocorpos, e outras proteínas de andaime não de anticorpos conhecidas. Em outras moda- lidades, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, opcionalmente compreende estru- tura proteica alternativa, por exemplo, peptídeos grampeados, peptido- miméticos de ligação similar a anticorpos, proteínas de andaime de li- gação similar a anticorpos, monocorpos, e outras proteínas de andaime não de anticorpos conhecidas.
[82] Em algumas modalidades, não há limitação para os tipos de anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo. Em outros exemplos, o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um anticorpo murino, anticorpo humano-murino, anticorpo humanizado ou seu fragmento de ligação ao anticorpo, por exemplo.
[83] Em algumas modalidades, não há limitação para a estrutura do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em atenção à premissa de estabilidade estrutural da região de- terminante da complementaridade (CDR), o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser uma estrutura de anticorpo na forma intacta ou simplificada, por exemplo, um fragmento variável de cadeia única (scFv), um dímero de scFv (scFv)2, um trímero de scFv (scFv)3, um fragmento variável (Fv), um fragmento de ligação ao antígeno (fragmento Fab), um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um nanocorpo (também conhecido como um anticorpo de domínio único, sdAb), um anticorpo de cadeia pesada ou qualquer combinação dos mesmos, de modo a simplificar o processo de anticorpo recombi- nante. O anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser produzido por métodos convencionais, tais como células de hibridoma ou expressão de gene recombinante, em vez de ser recitado repetidamente.
[84] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser opcionalmente modificado por meio de conjugação ou acopla- mento, glicosilação, fixação de marcador ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser adicional- mente formado no conjugado anticorpo-fármaco (ADC) ou em frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo. Em outros exemplos, o anti- corpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, an- teriormente mencionado, pode ser ligado a um peptídeo de sinal espe- cífico para entrar em sítios específicos, por exemplo, cruzando a bar- reira hematoencefálica (BBB).
[85] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser um anticorpo monoclonal biespecífico (BsAb), um anticorpo monoclonal trifuncional ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[86] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser de qualquer isótipo, incluindo IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE. Em um exem- plo, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser do isótipo IgG, incluindo os subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um exemplo, o anticorpo mo- noclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser um subtipo IgG1, tal como IgG1k. Em alguns exemplos, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser um anticorpo inerte ou um anticorpo antagonista. Em alguns exemplos, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencio- nado, pode inibir ou aliviar especificamente as atividades de um ou mais tipos de proteínas PTX3. Em alguns outros exemplos, o anticorpo mo- noclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode inibir ou aliviar especificamente a interação do recep- tor de PTX3 com um ou mais tipos de proteínas PTX3, uma transdução de sinal mediada por PTX3, ou qualquer combinação dos mesmos.
[87] Na prática, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode se ligar espe- cificamente a uma sequência de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NOs: 1 a 11, de modo que possa ser aplicado a um conjunto e a um método para detectar PTX3 com maior sensibilidade analítica de PTX3 em uma amostra biológica. A amostra biológica pode ser de qual- quer forma, sem limitação, incluindo, porém não se limitando a células, tecidos, sangue, urina, fluido linfático, fluido tecidual, fluido corporal, etc. O conjunto anteriormente mencionado para detectar PTX3 pode utilizar dispositivos/equipamentos convencionais de detecção, por exemplo, ci- tometria de fluxo, reagentes e kits de detecção do ensaio de imunoab- sorção enzimática (ELISA), biochips, etc; ou métodos de detecção con- vencionais, por exemplo, ELISA direto, ELISA indireto, ELISA sanduí- che, ELISA por competição), análise de imunoistoquímica (IHC) e Wes- tern bloting, etc. Em um exemplo, a sensibilidade analítica (ou chamada de limite inferior de detecção, LLOD) do anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, não pode ser inferior a 0,0016 pM.
[88] O anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, anteriormente mencionado, pode ser um ingrediente ativo em um medicamento. Em uma modalidade, o medicamento pode incluir opcionalmente um veículo medicinalmente aceitável. O “veículo medici- nalmente aceitável” daqui em diante é definido como um ingrediente não ativo, por exemplo, um veículo, um diluente, um adjuvante e/ou um veí- culo para suprir o ingrediente ativo a um indivíduo; ou um aditivo para ser adicionado na composição, anteriormente mencionada, para melho- rar suas propriedades de tratamento ou armazenamento; ou um excipi- ente ou qualquer substância para permitir ou auxiliar na dose da com- posição adaptada para a formação e fácil administração do medica- mento. O veículo medicinalmente aceitável, anteriormente mencionado, não deve ser prejudicial à atividade farmacológica do ingrediente ativo e não tem toxicidade ao administrar uma dose suficiente do ingrediente ativo durante o tratamento.
[89] O veículo medicinalmente aceitável adequado pode ser aquele comumente conhecido na técnica anterior e produzido por uma pessoa versada na técnica para produzir uma composição medicinal, e os exemplos de veículo podem incluir, porém não se limitam a um agente tampão, um diluente, um desintegrante, um aglutinante, um ade- sivo, um agente umectante, um polímero, um lubrificante, um agente de deslizamento, uma substância para proteger ou eliminar sabores ou odores desagradáveis, um corante, uma fragrância e uma substância para melhorar a aparência da composição. Exemplos de veículos medi- cinalmente aceitáveis incluem, porém não se limitam a agente tampo- nante de citrato, agente tamponante de fosfato, agente tamponante de acetato, agente tamponante de bicarbonato, ácido esteárico, estearato de magnésio, talco, gelatina, goma arábica, alginato de sódio, pectina, dextrina, manitol, sorbitol, lactose, sacarose, amido, material derivado de celulose (por exemplo, éster de ácido alcanoico de celulose, alquil éster de celulose), cera de baixo ponto de fusão, manteiga de cacau, aminoácidos, ureia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolipídios, proteína (por exemplo, albumina sérica), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sul- fóxido de dimetila (DMSO), cloreto de sódio ou outros sais, lipossomas, glicerol ou glicerol em pó, polímero (por exemplo, polivinilpirrolidona, ál- cool polivinílico e polietilenoglicol) e outras substâncias medicinalmente aceitáveis.
[90] A “inibição ou alívio” da “doença ou sintoma” relacionado ao receptor de PTX3 que reconhece PTX3 pode incluir carcinoma, glioblas- toma multiforme (GBM), adenoma e fibrose. O carcinoma, anteriormente mencionado, pode ser exemplificado como câncer de pulmão, câncer de mama e câncer de nasofaringe. O adenocarcinoma pode incluir cân- cer colorretal. Um órgão influenciado pela doença ou pelo sintoma de fibrose pode incluir, porém não se limita ao pulmão, fígado (por exemplo, fibrose hepática aguda, fibrose hepática crônica), rim, pele e similares.
[91] Na prática, um medicamento pode ser adicionado com uma dose eficaz de anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, anteriormente mencionado, para administração a uma célula alvo ou a um indivíduo, de modo a inibir ou aliviar uma doença ou sintoma relacionado ao receptor de PTX3 que reconhece PTX3. Em um caso de camundongos, a “dose eficaz”, anteriormente mencionada, re- fere-se ao anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em 2 mg a 10 mg por kg de peso corporal uma vez por se- mana. Em outro exemplo, a dose eficaz de anticorpo monoclonal ou fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser preferivelmente de 5 mg a 10 mg por kg de peso corporal, e mais preferivelmente de 6 mg a 9 mg por kg de peso corporal. Quanto à aplicação em outros indiví- duos, a dose eficaz, anteriormente mencionada, pode ser convertida em dose adequada dependendo da bioequivalência. Deve ser esclarecido que, se a dose eficaz de anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fosse inferior a 2 mg/kg de peso corporal, tal dose não poderia eficazmente diminuir, inibir ou aliviar o receptor de PTX3 que reconhece PTX3 em um período desejado.
[92] Quanto a um tumor, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode inibir ou aliviar as atividades das células tumorais, tais como proliferação, derivação do câncer, migração, invasão, metástase ou resistência a fármacos.
[93] A “fibrose”, discutida aqui, é definida como a formação de tecido conjuntivo fibroso em excesso em um órgão ou tecido em um processo reparador ou reativo. Esse pode ser um estado reativo, be- nigno ou patológico. Fisiologicamente, a fibrose pode ser usada para descrever o estado patológico de deposição excessiva de tecido fibroso, bem como o processo de deposição de tecido conjuntivo na cicatriza- ção, por exemplo, uma cicatriz formada em resposta a uma lesão, um fibroma surgido de uma única linhagem celular, ou um estado patológico de deposição excessiva de tecido fibroso. Quanto ao órgão influenciado pela doença ou sintoma de fibrose, o anticorpo monoclonal ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo pode inibir ou aliviar a doença ou sintoma relacionado à fibrose, por exemplo, fibrose hepática aguda, fibrose hepática crônica e similares, para atuar como fármacos de amplo espectro para tratar várias doenças.
[94] O medicamento anteriormente mencionado pode ser admi- nistrado por meio de injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, injeção ortotópica, administração oral ou inalação nasal, para inibir as atividades de PTX3 endógena, bem como inibir ou aliviar as atividades das células tumorais. Mais especifi- camente, as experimentações de células in vitro fornecem evidências de que as atividades das células tumorais podem ser inibidas ou alivia- das após a administração do anticorpo monoclonal ou fragmento de li- gação ao antígeno da presente invenção, ou do medicamento que os compreende por um determinado período, por exemplo, 4 semanas a 11 semanas.
[95] A seguir, será entendido que configurações, aspectos, exem- plos, cláusulas e modalidades particulares descritos a seguir são mos- trados a título de ilustração e não como limitações da invenção. As ca- racterísticas principais desta invenção podem ser usadas em várias mo- dalidades sem se desvio do escopo da invenção. Assim, uma pessoa versada na técnica pode facilmente determinar as características essen- ciais da presente invenção e, sem se afastar do espírito e escopo da mesma, pode fazer várias alterações e modificações na invenção para adaptá-la a vários usos e condições. EXEMPLO 1. Preparação de Anticorpos Monoclonais PTX3
[96] Neste EXEMPLO, o anticorpo monoclonal PTX3 (mAb), que reconhece a sequência de aminoácidos do terminal C da proteína re- combinante PTX3, foi preparado por tecnologia convencional baseada em hibridoma ou expressão de anticorpo recombinante.
[97] Em suma, um imunógeno da proteína recombinante PTX3 listada como uma sequência de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NO: 13 foi injetado intraperitonealmente (i.p.) na cavidade abdominal de camundongos Balb/C em uma dose de 50 μg por camundongo. Após 2 semanas da imunização primária, cada camundongo recebeu reforço quatro vezes em intervalos de duas semanas usando uma dose de 50 μg do mesmo imunógeno para cada injeção. Em seguida, os esplenóci- tos ativadores foram fundidos com células de mieloma para gerar linha- gens de células de hibridoma.
[98] Uma linhagem celular de hibridoma com maior afinidade para a proteína recombinante listada como a sequência de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NO: 13 foi rastreada a partir das linhagens celulares de hibridoma anteriormente mencionadas. A linhagem celular de hibridoma rastreada pode reconhecer especificamente as sequên- cias de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO:
13.
[99] mAb PTX3 foi purificado a partir do meio de cultura da linha- gem celular de hibridoma rastreada através de uma coluna comercial- mente disponível. As sequências de aminoácidos e suas sequências de ácidos nucleicos correspondentes, das regiões determinantes de com- plementaridade (CDRs) do domínio variável da cadeia pesada (VH) e do domínio variável da cadeia leve (VL) de mAb PTX3, foram analisadas por Leadgene Biomedical, Inc. Taiwan. O domínio VH tinha as sequên- cias de aminoácidos listadas como SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e/ou SEQ ID NO: 21. O domínio VL tinha as sequências de aminoácidos lis- tadas como SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e/ou SEQ ID NO: 24. A sequência de aminoácidos do domínio VH foi aquela listada como SEQ ID NO: 34 ou codificada por uma sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NO: 38. A sequência de aminoácidos do domínio VL foi aquela listada como SEQ ID NO: 36 ou codificada por uma sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NO: 40.
[100] Além disso, mAb PTX3 mencionado anteriormente foi anali- sado por um kit de isotipagem de mAb comercialmente disponível e con- firmou que seu isótipo era IgG1k. EXEMPLO 2. Avaliação da Afinidade de mAb PTX3
[101] Neste EXEMPLO, a afinidade de mAb PTX3 do EXEMPLO 1, que reconhece a proteína recombinante PTX3, foi avaliada por kit de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) convencional.
[102] Em primeiro lugar, 5 μg/mL de proteína recombinante PTX3
(representando uma sequência de aminoácidos desnaturados listada como SEQ ID NO: 14) ou albumina de soro bovino (BSA, como um con- trole) foram revestidos em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços (Produto No. 9018, Corning Costar), e reagiram a 4 °C du- rante a noite. Em seguida, a solução de bloqueio [contendo 3% de leite desnatado em solução salina tamponada com fosfato (PBS)] foi adicio- nada aos poços e bloqueada por 1 hora sob temperatura ambiente (isto é, 4°C a 40°C). Depois de remover a solução de bloqueio, cada poço foi enxaguado com PBS e, em seguida, reagiu com um anticorpo primário por 1 hora sob temperatura ambiente (isto é, 4 °C a 40 °C), em que o anticorpo primário era mAb PTX3 do EXEMPLO 1 diluído em série em uma faixa de concentração de 2,44×10-4 μg/mL a 1,00 μg/mL. Em se- guida, cada poço foi lavado com PBS para remoção de mAb PTX3 não conjugado e reagiu com o anticorpo secundário sob temperatura ambi- ente (isto é, 4 °C a 40 °C), em que o anticorpo secundário era anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase de cavalo (HRP) (anti-IgG de camundongo-HRP). Posteriormente, tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada a cada poço para reação ao longo de um período de tempo e, em seguida, 0,1 M de solução de ácido sulfúrico (H2SO4) por 10 mi- nutos para interromper a reação. Subsequentemente, a absorvância a 450 nm de cada poço foi medida por um leitor de ELISA comercialmente disponível e os resultados foram apresentados na FIG. 1. Cada valor foi obtido em triplicata. O tempo de reação do anticorpo secundário pode ser realizado de acordo com o manual do fabricante, que era bem co- nhecido por uma pessoa versada na técnica e desnecessário ser rela- tado em detalhes.
[103] Foi feita referência à FIG. 1, que ilustrou um diagrama da curva de afinidade de mAb PTX3 do Exemplo 1 de ligação à proteína recombinante PTX3, de acordo com uma modalidade da presente in- venção, em que uma curva marcada pelo símbolo “●” indicava uma curva de afinidade de mAb PTX3 com a proteína recombinante PTX3, e a curva marcada pelo símbolo “■” indicava uma curva de afinidade de mAb PTX3 com BSA.
[104] Conforme mostrado na FIG. 1, mAb PTX3 do Exemplo 1 exi- biu uma boa afinidade com a proteína recombinante PTX3 em uma con- centração significativamente baixa de seis diluições em série de 4 vezes (isto é, diluição em série de 46 vezes, e a concentração final do anticorpo foi equivalente a 0,244 ng/mL ou 0,0016 pM).
[105] Além disso, o kit ELISA, anteriormente mencionado, também provou que o mAb PTX3 do Exemplo 1 tinha alta afinidade com a pro- teína recombinante PTX3. Em primeiro lugar, 10 μg/mL de proteína re- combinante PTX3 (representando uma sequência de aminoácidos não desnaturados listada como SEQ ID NO: 14, dissolvidos em PBS de pH 7,2) foram revestidos em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços (Produto No. 9018, Corning Costar) e reagiram a 4°C du- rante a noite. Em seguida, a solução de bloqueio (contendo BSA 3% em PBS) foi adicionada aos poços e bloqueada durante 1 hora à tempera- tura ambiente (isto é, 4°C a 40°C). Depois de remover a solução de blo- queio, cada poço foi enxaguado com PBS e, em seguida, reagiu com um anticorpo primário por 1 hora sob temperatura ambiente (isto é, 4°C a 40°C), em que o anticorpo primário era mAb PTX3 do EXEMPLO 1 diluído em série em uma faixa de concentração de 0,01 ng/mL a 1000 ng/mL. E, em seguida, cada poço foi enxaguado várias vezes com PBST (isto é, PBS com Tween 20) para remover mAb PTX3 não conjugado, e reagiu com o anticorpo secundário à temperatura ambiente (isto é, 4 °C a 40 °C), em que o anticorpo secundário era anti-IgG de camundongo- HRP. Posteriormente, TMB foi adicionado em cada poço para reação ao longo de um período de tempo e, em seguida, adicionado com 0,1 M de solução de H2SO4 por 10 minutos para interromper a reação. Subse- quentemente, a absorvância a 450 nm de cada poço foi medida por um leitor de ELISA comercialmente disponível e os resultados foram apre- sentados na FIG. 2. Cada valor foi obtido quadruplicado. O tempo de reação do anticorpo secundário pode ser realizado de acordo com o manual do fabricante, que era bem conhecido por uma pessoa versada na técnica e desnecessário ser relatado em detalhes.
[106] Foi feita referência à FIG. 2, que ilustrou um diagrama da curva de afinidade de mAb PTX3 com a proteína recombinante PTX3 de acordo com outra modalidade da presente invenção. Como mostrado na FIG. 2, o mAb PTX3 do Exemplo 1 exibiu uma maior afinidade para a proteína recombinante PTX3 (isto é, antígeno) com uma constante de dissociação (KD) de 85 pM, para ser aplicada ao kit de detecção de PTX3.
[107] Além disso, em outras experiências, o mAb PTX3 pode ligar- se especificamente ao 200o até o 359o resíduo de aminoácidos (tal como a sequência de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NO: 13; o resultado não mostrado) ou ao 200o até o 236o resíduo de aminoácidos (tais como a sequência de aminoácidos não desnaturados da SEQ ID NO: 12; o resultado mostrado na FIG. 3) da proteína recombinante PTX3. EXEMPLO 3. Avaliação da Região de Ligação de PTX3 e do Anti- corpo Monoclonal PTX3
1. Análise da Região de Mapeamento de Epítopo de PTX3 reconhe- cida pelo Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1
[108] Neste EXEMPLO, a região de mapeamento de epítopo de PTX3 reconhecida por mAb PTX3 foi avaliada pelo kit ELISA convenci- onal.
[109] Neste EXEMPLO, o mesmo método do EXEMPLO 1 foi usado para mapear uma região mais estreita de ligação de PTX3 ao mAb PTX3, exceto que 200 μg/mL de proteína recombinante PTX3 (re- presentando uma sequência de aminoácidos não desnaturados listada como SEQ ID NOs: 12, 16 ou 17, dissolvidos em solução de bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 8) ou BSA (como um controle) foram revestidos em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços e reagiram a 4°C durante a noite. Em seguida, a solução de bloqueio (contendo BSA 1% em PBS) foi adicionada aos poços e bloqueada durante 1 hora à temperatura ambiente (isto é, 4°C a 40°C). Depois de remover a solu- ção de bloqueio, cada poço foi enxaguado com PBS e, em seguida, re- agiu com mAb PTX3 do EXEMPLO 1 (uma concentração de 125 ng/mL) durante 2 horas à temperatura ambiente (isto é, 4°C a 40°C). E então, cada poço foi enxaguado várias vezes com PBS para remover mAb PTX3 não conjugado e reagiu com o anticorpo secundário (anti-IgG de camundongo-HRP a uma diluição de 1:5000) sob temperatura ambiente (isto é, 4°C a 40°C) durante 1 hora. Posteriormente, TMB foi adicionado em cada poço para reação ao longo de um período de tempo e, em seguida, adicionado com 0,1 M de solução de H2SO4 por 10 minutos para interromper a reação. Subsequentemente, a absorvância a 450 nm de cada poço foi medida por um leitor de ELISA comercialmente dispo- nível e os resultados foram apresentados na FIG. 3. Cada valor foi ob- tido em triplicata.
[110] Foi feita referência à FIG. 3, que ilustrou um diagrama de mapeamento de epítopos da ligação de mAb PTX3 com vários fragmen- tos da proteína recombinante PTX3, de acordo com uma modalidade da presente invenção, em que RI37 refere-se a um fragmento da proteína recombinante PTX3 listado como SEQ ID NO: 12, KT44 refere-se a um fragmento da proteína recombinante PTX3 listado como SEQ ID NO: 16, GI40 refere-se a um fragmento da proteína recombinante PTX3 lis- tado como SEQ ID NO: 17, e os asteriscos (***) indicaram uma diferença estatisticamente significativa em comparação com o grupo de controle (isto é, grupo BSA) (p<0,001).
[111] No resultado da FIG. 3 foi mostrado que o mAb PTX3 do
Exemplo 1, de ligação ao fragmento da proteína recombinante PTX3 listado como SEQ ID NO: 12, exibiu uma afinidade maior com outros fragmentos da proteína recombinante PTX3 e teve uma significância es- tatística.
[112] Foi feita referência à FIG. 4, que ilustrou um diagrama de mapeamento de epítopos da ligação de mAb PTX3 a vários fragmentos da proteína recombinante PTX3, de acordo com uma modalidade da presente invenção, em que o eixo geométrico horizontal mostrou os gru- pos usando vários fragmentos da proteína recombinante PTX3 listados como SEQ ID NOs: 1 a 10.
[113] No resultado da FIG. 4 foi mostrado que o mAb PTX3 do Exemplo 1, de ligação ao fragmento da proteína recombinante PTX3 listado como SEQ ID NOs: 1 a 5 ou SEQ ID NOs: 2 a 4, exibiu uma afinidade relativamente maior para outros fragmentos da proteína re- combinante PTX3, em que as proteínas recombinantes PTX3 listadas como SEQ ID NOs: 2 a 4 corresponderam ao 203o até o 217o resíduo de aminoácidos da proteína recombinante PTX3 ou à sequência de ami- noácidos listada como SEQ ID NO: 11, indicando que a região de ma- peamento de epítopo de PTX3 reconhecida por mAb PTX3 estava loca- lizada em uma região que incluía a sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs: 2 a 4 ou SEQ ID NO: 11.
2. Diferenças das Regiões de Mapeamento de Epítopo de PTX3 en- tre o Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 e o Anticorpo Mo- noclonal PTX3 comercial
[114] Neste EXEMPLO, o mesmo método do EXEMPLO 3 foi usado para avaliar regiões de mapeamento de epítopos de PTX3 entre mAb PTX3 do EXEMPLO 1 e mAb PTX3 comercial (ab90806, abcam plc., U.K.), e os resultados foram mostrados na FIG. 5. Cada valor foi obtido em triplicata.
[115] Foi feita referência à FIG. 5, que ilustrou um diagrama de mapeamento de epítopo da ligação de mAb PTX3 a vários fragmentos da proteína recombinante PTX3, de acordo com uma modalidade da presente invenção, em comparação com o mAb PTX3 comercial, em que PTX3/FL refere-se a um fragmento de comprimento total da prote- ína recombinante PTX3 listado como SEQ ID NO: 15, RI37 refere-se a um fragmento da proteína recombinante PTX3 listado como SEQ ID NO: 12, KT44 refere-se a um fragmento da proteína recombinante PTX3 lis- tado como SEQ ID NO: 16, GI40 refere-se a um fragmento da proteína recombinante PTX3 listado como SEQ ID NO: 17, e asteriscos (***) in- dicaram uma diferença estatisticamente significativa em comparação com o grupo de controle (isto é, grupo BSA) (p<0,001).
[116] No resultado da FIG. 5 foi mostrado que tanto o mAb PTX3 do Exemplo 1 quanto o mAb PTX3 comercial (ab90806) de ligação a PTX3/FL (SEQ ID NO: 15) exibiram uma afinidade comparativamente alta; no entanto, o mAb PTX3 do Exemplo 1 de ligação ao fragmento RI37 da proteína recombinante PTX3 (SEQ ID NO: 12) exibiu uma afi- nidade relativamente maior para o mAb PTX3 comercial (ab90806). Isso teve significância estatística nas regiões de mapeamento de epítopos de PTX3 entre o mAb PTX3 do Exemplo 1 e o mAb PTX3 comercial (ab90806). EXEMPLO 4. Avaliação in vitro da Ligação de PTX3 a seu Receptor Afetado pelo Anticorpo Monoclonal PTX3
[117] O mAb PTX3 pode ligar-se competitivamente à região de li- gação do receptor de PTX3 ou à região circundante de PTX3, de modo a inibir ou aliviar especificamente a oportunidade de ligação de PTX3 ao receptor de PTX3. Neste EXEMPLO, CD44 serviu como um exemplo do receptor de PTX3, e um ensaio de ligação competitiva foi usado para avaliar o efeito da inibição de ligação de PTX3 ao receptor de PTX3.
[118] Este EXEMPLO demonstrou que o mAb PTX3 do EXEMPLO
1 pode neutralizar PTX3 e impedir que PTX3 se ligasse à região de li- gação do receptor de PTX3 ou à região circundante do receptor de PTX3 (tal como CD44).
[119] Mais particularmente, neste EXEMPLO, o ensaio de ligação competitiva foi igual ao EXEMPLO 1, exceto que 10 μg/mL de receptor de PTX3 [por exemplo, proteína recombinante do terminal N de CD44 (terminal N do primeiro ao 220o resíduo de aminoácidos de CD44, dis- solvido em PBS, pH 7,2; Sino Biological Inc., Beijing, China)] foram re- vestidos em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços e reagiram a 4°C durante a noite. Em seguida, a solução de bloqueio (contendo 3% de leite desnatado em PBS) foi adicionada aos poços e bloqueada por 1 hora sob temperatura ambiente (isto é, 4°C a 40°C).
[120] Durante a realização do ensaio de ligação competitiva, o PTX3 conjugado a HRP (tal como a sequência de aminoácidos não des- naturados da SEQ ID NO: 14, HRP-PTX3 em uma concentração de 5 μg/mL) pré-reagiu com várias concentrações (1 μg/mL ou 2 μg/mL) de mAb PTX3 do EXEMPLO 1 por 1 hora sob temperatura ambiente (isto é, 4 °C a 40 °C), formando assim um pré-reagente.
[121] Após remover a solução de bloqueio, cada poço foi enxa- guado com PBS e, em seguida, reagiu com o pré-reagente, anterior- mente mencionado, durante 2 horas sob temperatura ambiente (isto é, 4 °C a 40 °C). E, em seguida, cada poço foi enxaguado com PBS para remover o pré-reagente não conjugado, e TMB foi adicionado a cada poço para reação durante um período de tempo e, em seguida, adicio- nado com 0,1 M de solução de H2SO4 por 10 minutos para interromper a reação. Subsequentemente, a absorvância a 450 nm de cada poço foi medida por um leitor de ELISA comercialmente disponível e os resulta- dos foram apresentados na FIG. 6. Cada valor foi obtido quadruplicado.
[122] Foi feita referência à FIG. 6, que ilustrou um diagrama de inibição competitiva da ligação da proteína recombinante PTX3 e recep- tor de PTX3 impedido pelo mAb PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção, em que o eixo geométrico ver- tical refere-se a uma taxa de inibição competitiva (%), e o símbolo “+” ou “-” abaixo do eixo geométrico horizontal refere-se à adição de um ingrediente específico ou não durante a reação de ligação. A primeira barra do lado esquerdo da FIG. 6 refere-se ao grupo de controle (apenas proteína recombinante PTX3 sem mAb PTX3), e três asteriscos (***) in- dicaram uma diferença estatisticamente significativa em comparação ao grupo de controle (p<0,001).
[123] No resultado da FIG. 6 foi mostrado que, com base nos da- dos da primeira barra do lado esquerdo da FIG. 6 (o grupo de controle) como 0 % de taxa de inibição competitiva, a taxa de inibição competitiva (%) que resultou do mAb PTX3 do Exemplo 1 pré-reagido com a prote- ína recombinante PTX3 e reagido com o receptor de CD44 pode exibir uma relação dependente de dose a uma concentração de mAb PTX3, outros fragmentos de proteína recombinante PTX3, e teve uma signifi- cância estatística, indicando que o mAb PTX3 do EXEMPLO 1 poderia neutralizar PTX3 e impedir que PTX3 se ligasse à região de ligação ou à sua região circundante de CD44. EXEMPLO 5. Avaliação das Atividades das Células Cancerosas In- fluenciadas pelo Anticorpo Monoclonal PTX3
[124] Câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de nasofaringe e glioblastoma multiforme (GBM) pertenciam a tumores malignos e es- sas células cancerosas tinham atividades de migração, invasão, deriva- ção do câncer e similares. Neste Exemplo, a influência de mAb PTX3 do EXEMPLO 1 nas atividades das células cancerosas foi avaliada em uma linhagem de células humanas de câncer de mama [MDA-MB231, Número de Acesso ao Depósito: BCRC 60425, depositado no Bioresou- rce Collection and Research Center (BCRC), Taiwan, do Instituto de
Pesquisa e Desenvolvimento da Indústria Alimentar, PO Box 246, Hsin- chu, Taiwan 300, República da China, ou Número de Acesso ao Depó- sito: ATCC HTB-26; abreviado a seguir como MB231], uma linhagem de células humanas de câncer de pulmão A549 (Número de acesso ao de- pósito: BCRC 60074, depositado em BCRC; ou ATCC CCL-185), uma linhagem de células humanas de câncer de nasofaringe (NPC) HONE1 (Int. J. Cancer. 15 de Jan de 1990; 45(1):83-9; Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 86, págs. 9524-9528, dezembro de 1989), linhagem de célu- las humanas de glioblastoma multiforme (GBM) U87MG (ATCC HTB-14 ou BCRC 60360) e assim por diante.
1. Avaliação da Influência de mAb PTX3 na Migração de Células Cancerosas
[125] No teste de migração, uma densidade celular de 1 x 105 cé- lulas/poço das células cancerosas, mencionadas acima, foi semeada em cada inserção superior (com poros de 8 μm na parte inferior) da câ- mara de Boyden de 24 poços durante 3 horas de cultivo. E, em seguida, o meio em cada inserção superior foi substituído por um meio sem soro, e o meio em cada poço inferior foi adicionado com meio sem soro con- tendo 0,2 μg/mL de proteína recombinante PTX3 (tal como a sequência de aminoácidos não desnaturados listada como SEQ ID NO: 14), bem como 0,4 μg/mL de mAb PTX3 ou do anticorpo de controle (IgG1k).
[126] As células dentro de cada inserção superior foram limpas com cotonetes e removidas após 16 horas de cultivo. As células rema- nescentes que migraram para o fundo da membrana de inserção foram coradas por 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Invitrogen) e calculadas em número de células sob microscopia de fluorescência com ampliação de 200 vezes. Os resultados foram mostrados nas FIGS. 7A, 8A, 9A e 10A.
[127] Foi feita referência às FIGS. 7A, 8A, 9A e 10A, que ilustram,
respectivamente, diagramas de barras com números de células migra- das da linhagem de células de câncer de mama MB231 (FIG. 7A), da linhagem de células de câncer de pulmão A549 (FIG. 8A), da linhagem de células de NPC HONE1 (FIG. 9A), e da linhagem de células de GBM U87MG (FIG. 10A) inibidas pelo mAb PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Todos os dados desses exemplos foram obtidos a partir de triplicatas em cada ponto de tempo, e cada amostra como média mais ou menos o desvio padrão médio. Todos os dados foram analisados em uma ANOVA de uma via. Neste exemplo, dois asteriscos (**) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,01) e três asteriscos (***) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001).
[128] Os resultados das FIGS. 7A, 8A, 9A e 10A mostraram que, em comparação com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir significativamente o número de células migradas da linhagem de células de câncer de mama MB231, da linha- gem de células de câncer de pulmão A549, da linhagem de células de NPC HONE1, e da linhagem de células de GBM U87MG, e suas dife- renças tiveram significância estatística.
2. Avaliação da Influência de mAb PTX3 na Invasão de Células Can- cerosas
[129] No teste de invasão, a base (com poros de 8 μm) da inserção superior foi pré-revestida com a matriz de membrana de embasamento (nome do produto: matrigel, adquirido na BD Bioscience) e uma densi- dade celular de 1 x 105 células/poço das células cancerosas anterior- mente mencionadas foi semeada em cada inserção superior da câmara de Boyden de 24 poços durante 3 horas de cultivo. E, em seguida, o meio em cada inserção superior foi substituído por meio sem soro, e o meio em cada poço inferior foi adicionado com meio sem soro contendo 0,2 μg/mL de proteína recombinante PTX3 (tal como a sequência de aminoácidos não desnaturados listada como SEQ ID NO: 14), bem como 0,4 μg/mL de mAb PTX3 ou de anticorpo de controle (IgG1k).
[130] As células dentro de cada inserção superior foram limpas com cotonetes e removidas após 16 horas de cultivo. As células rema- nescentes que migraram para o fundo da membrana de inserção foram coradas por DAPI (Invitrogen) e calculadas em número de células sob microscopia de fluorescência com ampliação de 200 vezes. Os resulta- dos foram mostrados nas FIGS. 7B, 8B, 9B e 10B.
[131] Foi feita referência às FIGS. 7B, 8B, 9B e 10B, que ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de células invasivas da linhagem de células de câncer de mama MB231 (FIG. 7B), da linha- gem de células de câncer de pulmão A549 (FIG. 8B), da linhagem de células de NPC HONE1 (FIG. 9B), e da linhagem de células de GBM U87MG (FIG. 10B) inibidas pelo mAb PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Neste exemplo, dois aste- riscos (**) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente sig- nificativa (p<0,01), e três asteriscos (***) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001).
[132] Os resultados das FIGS. 7B, 8B, 9B e 10B mostraram que, em comparação com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir significativamente o número de células invasivas da linhagem de células de câncer de mama MB231, da linha- gem de células de câncer de pulmão A549, da linhagem de células de NPC HONE1, e da linhagem de células de GBM U87MG, e suas dife- renças tiveram significância estatística.
3. Avaliação da Influência de mAb PTX3 na Derivação do Câncer de Células Cancerosas
[133] As células cancerosas, anteriormente mencionadas, tinham derivação de câncer e poderiam formar esferas cocultivadas com a pro- teína recombinante PTX3.
[134] No teste de esfera celular, as células cancerosas, anterior- mente mencionadas, foram cultivadas em meio de células RPMI-1640 [(suplementado com 10 % de Soro Fetal Bovino (FBS), 50-100 μg/mL de estreptomicina e 50-100 U/mL de penicilina] adicionado com 0,2 μg/mL de proteína recombinante PTX3 (tal como a sequência de ami- noácidos não desnaturados listada como SEQ ID NO: 14), bem como 0,4 μg/mL de mAb PTX3 ou do anticorpo de controle (IgG1k). Essas células foram incubadas a 37 °C em CO2 5% umidificado, cujas condi- ções eram bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica, em vez de serem aqui relatadas em detalhes.
[135] Em seguida, a densidade celular de 5 x 103 células/poço das células cancerosas anteriormente mencionadas foram inoculadas em placas de múltiplos poços com superfície de fixação ultrabaixa (Corning Inc.), cultivadas em meio sem soro DMEM/F12 (Gibco) [contendo B27 (Invitrogen), 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF; Ab- cam) e 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF; Peprotech)]. Após 2 semanas de cultivo, os números de esferas celula- res foram observados por microscopia óptica. Os resultados foram mos- trados nas FIGS. 7C, 8C, 9C e 10C.
[136] Foi feita referência às FIGS. 7C, 8C, 9C e 10C, que ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de esferas celulares da linhagem de células de câncer de mama MB231 (FIG. 7C), da linha- gem de células de câncer de pulmão A549 (FIG. 8C), da linhagem de células de NPC HONE1 (FIG. 9C), e da linhagem de células de GBM U87MG (FIG. 10C) inibidas pelo mAb PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Neste exemplo, dois aste- riscos (**) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente sig- nificativa (p<0,01), e três asteriscos (***) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001).
[137] Os resultados das FIGS. 7C, 8C, 9C e 10C mostraram que,
em comparação com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir significativamente o número de esferas celulares da linhagem de células de câncer de mama MB231, da linha- gem de células de câncer de pulmão A549, da linhagem de células de NPC HONE1, e da linhagem de células de GBM U87MG, e suas dife- renças tiveram significância estatística.
4. Avaliação da Influência de mAb PTX3 do EXEMPLO 1 nas Ativi- dades Cancerígenas das Células Cancerosas
[138] Neste EXEMPLO, o mesmo método do EXEMPLO 2 foi usado para avaliar o efeito das atividades das células cancerosas inibi- das pelo mAb PTX3 do EXEMPLO 1 ou mAb PTX3 comercial (ab90806, abcam plc., UK), e os resultados foram mostrado nas FIGS. 11A a 14C.
[139] Foi feita referência às FIGS. 11A, 12A e 13A, que ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de células migradas da linhagem de células de câncer de mama MB231 (FIG. 11A), da linha- gem de células de câncer de pulmão A549 (FIG. 12A), e da linhagem de células de NPC HONE1 (FIG. 13A) inibidas por mAb PTX3 do EXEM- PLO 1 ou mAb PTX3 comercial, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Neste exemplo, um asterisco (*) indicou os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05), dois aste- riscos (**) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente sig- nificativa (p<0,01), e três asteriscos (***) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001).
[140] Os resultados das FIGS. 11A, 12A e 13A mostraram que, em comparação com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 e o mAb PTX3 comercial (ab90806) podem inibir signifi- cativamente o número de células migradas da linhagem de células de câncer de mama MB231, da linhagem de células de câncer de pulmão A549 e da linhagem de células de NPC HONE1; no entanto, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir mais significativamente a migração de células cancerígenas do que o mAb PTX3 comercial (ab90806), e suas diferenças tiveram significância estatística.
[141] Foi feita referência às FIGS. 11B, 12B e 13B, que ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de células invasivas da linhagem de células de câncer de mama MB231 (FIG. 11B), da linha- gem de células de câncer de pulmão A549 (FIG. 12B), e da linhagem de células de NPC HONE1 (FIG. 13B) inibidas por mAb PTX3 do EXEM- PLO 1 ou do mAb PTX3 comercial, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Neste exemplo, um asterisco (*) indicou os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05), dois aste- riscos (**) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente sig- nificativa (p<0,01) e três asteriscos (***) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001).
[142] Os resultados das FIGS. 11B, 12B e 13B mostraram que, em comparação com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 e o mAb PTX3 comercial (ab90806) podem inibir signifi- cativamente o número de células invasivas da linhagem de células de câncer de mama MB231, da linhagem de células de câncer de pulmão A549, e da linhagem de células de NPC HONE1; no entanto, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir mais significativamente a invasão de células cancerígenas do que o mAb PTX3 comercial (ab90806), e suas diferenças tiveram significância estatística.
[143] Foi feita referência às FIGS. 14A, 14B e 14C, que ilustram, respectivamente, diagramas de barras de números de esferas celulares da linhagem de células de câncer de mama MB231 (FIG. 14A), da linha- gem de células de câncer de pulmão A549 (FIG. 14B), e da linhagem de células de NPC HONE1 (FIG. 14C) inibidas por mAb PTX3 do EXEM- PLO 1 ou do mAb PTX3 comercial, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Neste exemplo, dois asteriscos (**) indicaram os da- dos tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,01), e três asteriscos (***) indicaram os dados tendo uma diferença estatistica- mente significativa (p<0,001).
[144] Os resultados das FIGS. 14A, 14B e 14C mostraram que, em comparação com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 e o mAb PTX3 comercial (ab90806) podem inibir signifi- cativamente o número de esferas celulares da linhagem de células de câncer de mama MB231, da linhagem de células de câncer de pulmão A549, e da linhagem de células de NPC HONE1; no entanto, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir ou aliviar mais significativamente o nú- mero de esferas celulares do que o mAb PTX3 comercial (ab90806), e suas diferenças tiveram significância estatística. EXEMPLO 6. Avaliação do Crescimento in vivo e Metástase de Tu- mores Afetados pelo Anticorpo Monoclonal PTX3
1. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Inibição do Crescimento in vivo e Metástase de Cânceres de Mama Ortotopicamente Xenoenxertados
[145] Neste exemplo, a linhagem de células humanas de câncer foi inoculada ortotopicamente na almofada de gordura mamária de ca- mundongos imunodeficientes. Após a formação de tumores, o mAb PTX3 do EXEMPLO 1 foi injetado nestes camundongos, avaliando as- sim o efeito do tratamento de tumores inibidos ou aliviados pelo mAb PTX3 do EXEMPLO 1.
[146] Em primeiro lugar, células MB231-Luc2 [células MB231 eram células de câncer de mama humano sem expressão do receptor de es- trogênio (ER) α e ERβ; e o gene Luc2 expressava luciferase] foram ino- culadas ortotopicamente na almofada de gordura mamária de camun- dongos NOD-SCID (adquiridas da BioLASCO Taiwan Co., Ltd.). Uma vez que os tumores atingiram um volume médio de 80 mm3, o anticorpo PTX3 (8 mg/kg de peso corporal) do EXEMPLO 1 ou o anticorpo de controle (IgG1K, 8 mg/kg de peso corporal) foi injetado intraperitoneal- mente nos camundongos experimentais uma vez por semana. O resul- tado foi mostrado nas FIGS. 15A e 15B. A FIG. 15B mostrou fotografias de imagem in vivo da 11a semana após inoculação das células de cân- cer de mama, células MB231-Luc2, em que a foto da imagem in vivo foi obtida pelo sistema de imagem bioluminescente comercialmente in vivo [por exemplo, sistema de imagem 3D in vivo não invasivo (Sistema IVIS), PerkinElmer] para observar o tamanho dos tumores e as regiões de radiação referentes aos tumores formados a partir das células MB231-Luc2 em camundongos. Posteriormente, todos os camundon- gos foram sacrificados, os tamanhos dos tumores nos camundongos fo- ram medidos e calculados pela fórmula (I): V =(w×l2)× 0.52 (I) Na fórmula (I), “I” era o comprimento e “w” era a largura do tumor.
[147] Foi feita referência às FIGS. 15A e 15B, que ilustram, res- pectivamente, os resultados do tamanho de tumor (FIG. 15A) e metás- tase tumoral (FIG. 15B) das células de câncer de mama xenoenxertadas ortotopicamente MDA-MB231 de camundongos, inibidas por mAb PTX3 do anticorpo de controle, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Todos os dados da FIG. 15A foram obtidos sextuplicados em cada ponto de tempo e cada amostra como média mais ou menos o desvio padrão médio. Neste exemplo, um asterisco (*) indicou os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05).
[148] Os resultados das FIGS. 15A e 15B mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir significativamente o tamanho do tumor e a me- tástase do tumor da linhagem de células de câncer de mama MB231 xenoenxertadas ortotopicamente, e as diferenças tiveram significância estatística.
2. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Inibição do Crescimento in vivo e Metástase de Cânceres de Mama Aloenxertados Ortotopicamente
[149] Neste exemplo, a linhagem de células de câncer de camun- dongo foi inoculada ortotopicamente na almofada de gordura mamária de camundongos imunocompetentes. Após a formação de tumores e estabelecimento do modelo de câncer de mama tri-negativo (TNBC), mAb PTX3 do EXEMPLO 1 foi administrado nestes camundongos, ava- liando assim o efeito do tratamento de tumores inibidos ou aliviados pelo mAb PTX3 do EXEMPLO 1.
[150] Em primeiro lugar, 1×106 células de câncer de mama 4T1 (ATCC®CRL-2539™), que eram da linhagem de células de câncer de mama de camundongo transfectadas com plasmídeo contendo o gene Luc2 e expressando ERβ, porém não ERα, foram inoculadas ortotopi- camente como aloenxerto ortotópico na almofada de gordura mamária de camundongos fêmeas do tipo selvagem BALB/c (seis a oito semanas de idade, adquiridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd.). Uma vez que os tumores atingiram um volume médio de 50 mm3, o anticorpo PTX3 (10 mg/kg de peso corporal) do EXEMPLO 1 ou o anticorpo de controle (IgG1K, 10 mg/kg de peso corporal) foi administrado aos camundongos uma vez por semana. O tamanho dos tumores e a metástase nos ca- mundongos foram observados pelo sistema de imagem biolumines- cente in vivo. E, em seguida, todos os camundongos foram sacrificados, os tamanhos dos tumores nos camundongos foram medidos e calcula- dos pela fórmula (I) acima.
[151] Foi feita referência às FIGS. 16A e 16B, que ilustram, res- pectivamente, os resultados do tamanho de tumor (FIG. 16A) e metás- tase tumoral (FIG. 16B) das células de câncer de mama 4T1 aloenxer- tadas ortotopicamente de camundongos, inibidas por mAb PTX3 do an-
ticorpo de controle, de acordo com uma modalidade da presente inven- ção. A FIG. 16B mostrou fotos de imagem in vivo da quinta semana após a inoculação da célula de câncer de mama 4T1, na qual as regiões ra- diantes se referiam aos tumores formados a partir das células de câncer de mama 4T1 em camundongos. Todos os dados da FIG. 16A foram obtidos sextuplicados em cada ponto de tempo e cada amostra como média mais ou menos o desvio padrão médio. Neste exemplo, dois as- teriscos (**) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,01) em comparação com o anticorpo de controle (IgG1k).
[152] Os resultados das FIGS. 16A e 16B mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir significativamente o tamanho do tumor e a me- tástase tumoral da linhagem de células de câncer de mama 4T1 do alo- enxerto ortotópico, e as diferenças tiveram significância estatística.
3. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 e Fár- maco Anticâncer afetando a Inibição do Crescimento in vivo e Me- tástase de Cânceres de Mama Aloenxertados Ortotopicamente (I)
[153] Neste EXEMPLO, o mesmo método da 2a parte do EXEM- PLO 6 foi usado na avaliação, exceto que a linhagem de células de cân- cer de camundongos 4T1 foi inoculada ortotopicamente na almofada de gordura mamária de camundongos fêmeas BALB/c (seis a oito semanas de idade, adquiridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) neste EXEMPLO. Uma vez que os tumores atingiram um volume médio de 50 mm3, os camundongos foram injetados i.p. com o anticorpo PTX3 (2,5, 5,0 ou 10 mg/kg de peso corporal, JustWin Biotech Co., Ltd.) do EXEMPLO 1 ou o anticorpo de controle (IgG1K, 10 mg/kg de peso corporal, Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan), ou em combinação com Ta- xol (Paclitaxel, 30,0 mg/kg de peso corporal), uma vez por semana du- rante seis semanas. Todos os camundongos foram sacrificados na sexta semana, o tamanho e a metástase dos tumores foram observados pelo sistema de imagem bioluminescente in vivo.
[154] Após seis semanas, o tamanho dos tumores foi observado pelo sistema de imagem bioluminescente in vivo [por exemplo, sistema de imagem 3D in vivo não invasivo (Sistema IVIS), PerkinElmer], os re- sultados foram mostrados na FIG. 17A, e as regiões radiantes referem- se aos tumores formados a partir de células 4T1 em camundongos. O sistema pode medir os tamanhos dos tumores e a metástase em ca- mundongos, o volume tumoral foi calculado pela fórmula (I) e o resultado foi mostrado nas FIGS. 17B e 17C.
[155] Foi feita referência às FIGS. 17A a 17C, que ilustram, res- pectivamente, fotos de imagem in vivo do volume e metástase tumoral (FIG. 17A) e gráficos de linha (FIGS. 17B e 17C) de alterações no vo- lume do tumor das células de câncer de mama 4T1 aloenxertadas orto- topicamente de camundongos, inibidas por mAb PTX3 (FIG. 17B) ou em combinação com Taxol (FIG. 17C), de acordo com uma modalidade da presente invenção. Todos os dados das FIGS. 17B e 17C foram obtidos sextuplicados em cada ponto de tempo e cada amostra como média mais ou menos o desvio padrão médio. Neste exemplo, dois asteriscos (**) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significa- tiva (p<0,01) em comparação com o anticorpo de controle (IgG1k).
[156] Os resultados das FIGS. 17A a 17C mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 ou Taxol pode inibir ou aliviar o volume tumoral e a metás- tase da linhagem de células de câncer de mama 4T1 aloenxertadas or- totopicamente, como mostrado nas FIGS. 17A e 17B. No entanto, a ad- ministração combinada de mAb PTX3 do Exemplo 1 e Taxol pode inibir ou aliviar significativamente o volume tumoral e a metástase da linha- gem de células de câncer de mama 4T1 aloenxertadas ortotopicamente, indicando que o efeito sinérgico da administração combinada foi muito maior do que o da administração individual, como mostrado nas FIGS. 17A e 17C, e as diferenças tiveram significância estatística.
4. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 e Fár- maco Anticâncer em Combinação com um Fármaco Anticâncer afe- tando a Inibição do Crescimento in vivo de Cânceres de Mama Alo- enxertados Ortotopicamente (II)
[157] Neste EXEMPLO, o esquema experimental da FIG. 18A e o mesmo método que na 3a parte do EXEMPLO 6 foram usados na avali- ação e os resultados foram mostrados nas FIGS. 18B a 18D.
[158] Foi feita referência às FIGS. 18B a 18D, que ilustram, res- pectivamente, fotos de imagem in vivo do volume do tumor e metástase (FIG. 18B), um gráfico de linha (FIG. 18C) das alterações no volume tumoral e da taxa de sobrevivência de camundongos (FIG. 18D) com células de câncer de mama 4T1 aloenxertadas ortotopicamente, inibi- das por mAb PTX3 ou em combinação com Taxol, de acordo com outra modalidade da presente invenção. Todos os dados das FIGS. 18C a 18D foram obtidos sextuplicados em cada ponto de tempo e cada amos- tra como média mais ou menos o desvio padrão médio. Neste exemplo, um asterisco (*) indicou os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05), e dois asteriscos (**) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,01) em comparação com o anticorpo de controle (IgG1k).
[159] Os resultados das FIGS. 18B a 18D mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 ou Taxol pode inibir ou aliviar o volume do tumor e a metás- tase da linhagem de células de câncer de mama 4T1 de aloenxerto or- totópico, como mostrado nas FIGS. 18B e 18C. No entanto, a adminis- tração combinada de mAb PTX3 do Exemplo 1 e Taxol pode inibir ou aliviar significativamente o volume do tumor e a metástase da linhagem de células de câncer de mama 4T1 de aloenxerto ortotópico e os ca- mundongos podem ter uma taxa de sobrevivência aumentada de 80 % ou mais, indicando que o efeito sinérgico da administração combinada foi muito maior do que o da administração individual, conforme mostrado na FIG. 18D, e as diferenças tiveram significância estatística.
5. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 e Fár- maco Anticâncer afetando a Inibição do Crescimento in vivo de Cânceres Colorretais Aloenxertados Ortotopicamente
[160] Neste EXEMPLO, o esquema experimental da FIG. 19A e o mesmo método que o da 3a parte do EXEMPLO 6 foram usados na ava- liação, exceto que a linhagem de células de adenocarcinorma de cólon MC38 de camundongo foi injetada subcutaneamente (s.c.) em camun- dongos machos C57BL/6J (seis a oito semanas de idade, adquiridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) neste EXEMPLO. Sete dias após a injeção das células MC38, os camundongos foram injetados i.p. com anticorpo PTX3 (10 mg/kg de peso corporal, JustWin Biotech Co., Ltd.) do EXEM- PLO 1 ou com anticorpo de controle (IgG1K, 10 mg/kg de peso corporal, Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan), uma vez por semana em triplicado. O tamanho do tumor de todos os camundongos foi observado semanalmente pelo sistema de imagem bioluminescente in vivo. Todos os camundongos foram sacrificados no 23o dia, o tama- nho do tumor foi medido e o volume do tumor foi calculado pela fórmula (I).
[161] Foi feita referência à FIG. 19B, que ilustrou um gráfico de linha do volume tumoral nos camundongos aloenxertados com a linha- gem de células de adenocarcinorma de cólon MC38 inibidas por mAb PTX3 ou com o anticorpo de controle, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Todos os dados da FIG. 19B foram obtidos qua- druplicados em cada ponto de tempo e cada amostra como média mais ou menos o desvio padrão médio. Neste exemplo, um asterisco (*) indi- cou os dados tendo diferença estatisticamente significativa (p<0,05) e três asteriscos (***) indicaram uma diferença estatisticamente significa- tiva em relação ao grupo de controle (p<0,001).
[162] O resultado da FIG. 19B mostrou que, em comparação com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 poderia inibir ou aliviar o volume do tumor do aloenxerto ortotópico da linhagem de células de adenocarcinorma de cólon MC38, e as diferen- ças tiveram significância estatística.
6. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 e Fár- maco Anticâncer afetando a Inibição do Crescimento in vivo de Glioblastoma Multiforme Xenoenxertado
[163] Neste EXEMPLO, o mesmo método que o da 3a parte do EXEMPLO 6 foi usado na avaliação, exceto que a linhagem celular hu- mana de glioblastoma multiforme U87MG (GBM) foi injetada subcuta- neamente (s.c.) em camundongos machos NOD-SCID (seis a oito se- manas de idade, adquiridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) neste EXEMPLO. Vinte dias após a injeção das células U87MG, os camun- dongos foram injetados i.p. com anticorpo PTX3 (10 mg/kg de peso cor- poral, JustWin Biotech Co., Ltd.) do EXEMPLO 1 ou com anticorpo de controle (IgG1K, 10 mg/kg de peso corporal, Produto No. 10101, Lead- gene Biomedical, Inc., Taiwan), uma vez por semana durante quatro se- manas. Após vinte dias, o tamanho do tumor foi medido e o volume do tumor foi calculado pela fórmula (I).
[164] Foi feita referência às FIGS. 20A e 20B, que ilustram os grá- ficos de linha do volume de tumor (FIG. 20A) e a taxa de sobrevivência (FIG. 20B) de camundongos xenoenxertados com uma linhagem de cé- lulas humanas de GBM U87MG, inibida pelo mAb PTX3 ou pelo anti- corpo de controle, de acordo com uma modalidade da presente inven-
ção. Todos os dados da FIG. 20A foram obtidos triplicados ou quadru- plicados em cada ponto de tempo e cada amostra como média mais ou menos o desvio padrão médio. Neste exemplo, “p=0,0008” indicou que os dados têm uma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
[165] O resultado das FIGS. 20A e 20B mostrou que, em compa- ração com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode inibir ou aliviar o volume tumoral do xenoenxerto da linhagem de células humanas de GBM U87MG (FIG. 20A) e a taxa de sobrevivência dos camundongos aumentou até 75 % (FIG. 20B). Essas diferenças tiveram significância estatística. EXEMPLO 7. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEM- PLO 1 afetando o Alívio ou Reversão da Fibrose in vivo
1. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Reversão de Necrose hepática da Fibrose Hepática Aguda
[166] Neste EXEMPLO, o esquema experimental da FIG. 21A foi usado na avaliação, que foi elaborada de acordo com as Diretrizes do Laboratory Animal Center (Centro de Animais de Laboratório) do E-Da Hospital, I-Shou University, Taiwan. Em primeiro lugar, 1 mL/kg de peso corporal de tetracloreto de carbono (CCl4 misturado com azeite de oliva em uma relação de volume de 1:1) foi injetado por via intramuscular em camundongos machos C57BL/6J (oito semanas de idade, adquiridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taiwan). O tetracloreto de carbono induziu à fibrose hepática aguda e resultou em apoptose e necrose de hepató- citos em doze horas. Em seguida, os camundongos foram injetados i.p. com anticorpo PTX3 (10 mg/kg de peso corporal, JustWin Biotech Co., Ltd.) do EXEMPLO 1 ou com anticorpo de controle (IgG1K, 10 mg/kg de peso corporal, Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan) na quarta e na vigésima oitava horas após a injeção de tetracloreto de carbono. Todos os camundongos foram sacrificados no segundo dia após a administração de anticorpos, as seções histológicas do fígado, a porcentagem da área de necrose por seção, e a relação de peso do fígado para peso corporal foram observadas, como mostrado nas FIGS. 21B a 21D.
[167] Foi feita referência às FIGS. 21B a 21D, que ilustrou, respec- tivamente, as imagens de seções histológicas coradas com hematoxi- lina-eosina (H&E) do lobo esquerdo do fígado (FIG. 21B, com ampliação de 20x, para observação de apoptose de hepatócito), os diagramas de barras da porcentagem de área de necrose por seção (FIG. 21C), e a relação de peso do fígado para peso corporal (FIG. 21D) na fibrose he- pática aguda dos camundongos com o mAb PTX3 do Exemplo 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Na FIG. 21C, a por- centagem de área de necrose na área total de varredura foi medida pela função de limiar automático do software de análise de imagem comerci- almente disponível ImageJ (W.S. Rasband, NIH, Bethesda, Maryland, EUA).
[168] O resultado das FIGS. 21B a 21D mostrou que, em compa- ração com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode aliviar a apoptose (FIG. 21B) e a necrose (FIG. 21C) da fibrose hepática aguda induzida por tetracloreto de carbono, bem como aliviar o nível de aumento de peso do fígado (FIG. 21D) de ca- mundongos, causado por fibrose hepática aguda. Essas diferenças ti- veram significância estatística.
2. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Reversão de Necrose Hepática da Fibrose Hepática Crônica
[169] Neste EXEMPLO, o esquema experimental da FIG. 22A foi usado na avaliação, o mesmo método que o da 1a parte do EXEMPLO 7 foi determinado na avaliação, exceto que 1 mL/kg de peso corporal de tetracloreto de carbono (CCl4 misturado com azeite em uma relação de volume de 1:1) foi injetado intramuscularmente em camundongos ma- chos C57BL/6J (oito semanas de idade, adquiridos da BioLASCO Tai- wan Co., Ltd., Taiwan), duas vezes por semana durante oito semanas. Em seguida, os camundongos foram injetados i.p. com anticorpo PTX3 (10 mg/kg de peso corporal, JustWin Biotech Co., Ltd.) do EXEMPLO 1 ou com anticorpo de controle (IgG1K, 10 mg/kg de peso corporal, Pro- duto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan) na terceira e oitava horas após a injeção de tetracloreto de carbono, uma vez por semana. Todos os camundongos foram sacrificados no final da oitava semana após a administração de anticorpos. As seções histológicas do fígado, a porcentagem de área de necrose por seção e a relação de peso do fígado para peso corporal foram observadas, como mostrado nas FIGS. 22B a 22D.
[170] Foi feita referência às FIGS. 22B a 22D, que ilustram, res- pectivamente, as imagens de seções histológicas, coradas com Picro- Sirius Red, do lobo esquerdo do fígado (FIG. 22B, com ampliação de 20x, para observação de fibrose de hepatócito), os diagramas de barras da porcentagem de área de fibrose hepática por seção (FIG. 22C) e a relação de peso do fígado para peso corporal (FIG. 22D) na fibrose he- pática crônica de camundongos tratados com o mAb PTX3 do Exemplo 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Na FIG. 22C, a porcentagem de área necrótica do fígado na área total de varredura foi medida pela função de limiar automático do software de análise de imagem comercialmente disponível ImageJ (W.S. Rasband, NIH, Bethesda, Maryland, EUA).
[171] O resultado das FIGS. 22B a 22D mostrou que, em compa- ração com os dados do anticorpo de controle IgG1k, o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode aliviar a fibrose hepática crônica (FIG. 22B) e a porcen- tagem de área de fibrose (FIG. 22C) da fibrose hepática crônica induzida por tetracloreto de carbono, bem como aliviar o nível de aumento de peso do fígado (FIG. 22D) de camundongos, causado por fibrose hepá- tica crônica. Essas diferenças tiveram significância estatística.
4. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Expressão das Proteínas Relacionadas à Fibrose de Fi- broblastos Renais
[172] Neste EXEMPLO, a linhagem de células de fibroblasto de rim de rato NRK49F (Número de Acesso ao Depósito: BCRC 60084 ou ATCC® CRL-1570™) foi usada nas seguintes experiências para avalia- ção do anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 que afeta a fibrose renal.
[173] Em primeiro lugar, a linhagem de células de fibroblastos re- nais NRK49F foi cultivada em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (12800-082, Gibco) (suplementado com FBS a 10%, 100μg/mL de estreptomicina e 100U/mL de penicilina).
[174] As células NRK49F foram tratadas com 0,4 μg/mL de anti- corpo de controle (IgG1k, Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan) ou 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.), seguidos por tratamento com 200 ng/mL de proteína recombinante PTX3 por 6 horas. E, em seguida, as células NRK49F foram lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação modificado (RIPA), que in- cluiu Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 1%, 0,25% de desoxicolato de sódio, 1 mM de ditiotreitol ( DTT), 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), aprotinina (1 mg/ml) e leupeptina (1 mg/ml). Em seguida, Western blotting foi usado para detectar as ex- pressões de α-tubulina (Número do produto: T6199, Sigma) e fibronec- tina (Número do produto: 15613-1-AP, ProteinTech) com anticorpos es- pecíficos, a expressão da α-tubulina serviu como um grupo de controle de carregamento, e o resultado foi mostrado na FIG. 23A.
[175] Além disso, as células NRK49F foram semeadas em placa de cultura de células de 24 poços e tratadas com 0,4 μg/mL de anticorpo de controle IgG1k (Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Tai- wan), 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.) ou 200 ng/mL de proteína recombinante PTX3 por 24 horas. A seguir, as células NRK49F foram fixadas em metanol a -20 °C durante a noite. No dia se- guinte, as células NRK49F foram coradas com Picro-Sirius Red Solution (Número do produto: ab246832, Abcam) à temperatura ambiente du- rante 20 minutos e enxaguadas duas vezes com ácido acético. O nú- mero de nódulos das células foi contado de acordo com imagens ao microscópio óptico com ampliação de 200x. Depois, as células foram lisadas em NaOH 0,1 N e a absorvância de cada poço a 490 nm foi detectada por leitor de ELISA comercialmente disponível, e os resulta- dos foram mostrados nas FIGS. 23B e 23C.
[176] Foi feita referência às FIGS. 23A a 23C, que ilustram, res- pectivamente, imagens de Western blotting da expressão das proteínas relacionadas à fibrose (FIG. 23A), imagens (FIG. 23B) e um diagrama de barras (FIG. 23C) de células coradas em nódulos de fibroblastos re- nais tratados com mAb PTX3, de acordo com uma modalidade da pre- sente invenção, e três asteriscos (***) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001) em comparação com o anticorpo de controle (IgG1k).
[177] Os resultados das FIGS. 23A a 23C mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle (IgG1k), o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode reduzir as expressões das proteínas relacionadas à fibrose de fibroblastos renais (FIG. 23A) e o número de nódulos das cé- lulas (FIGS. 23B e 23C), e também que as diferenças tiveram significân- cia estatística.
5. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando o Alívio da Fibrose Renal no Modelo Animal de Obstrução Ureteral Unilateral (UUO)
[178] Neste EXEMPLO, os esquemas experimentais das FIGS.
24A e 24C foram usados na avaliação. Primeiramente, foram fornecidos camundongos machos C57BL/6J (seis a oito semanas de idade, adqui- ridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taiwan). Em seguida, os camun- dongos foram submetidos à obstrução ureteral unilateral (UUO) por meio de incisão no flanco esquerdo. O rim esquerdo foi removido e o ureter esquerdo exposto foi ligado com sutura de seda (4-O Silk). De- pois, a incisão foi fechada com grampeador cirúrgico. Posteriormente, no zero e no sétimo dias após a cirurgia de UUO (pré-tratamento como mostrado nas FIGS. 24A e 24B) ou no sétimo dia após a cirurgia de UUO (pós-tratamento como mostrado nas FIGS. 24C e 24D), os camun- dongos foram tratados com o anticorpo de controle (IgG1k, 10 mg/kg de peso corporal, Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan) ou com anticorpo PTX3 (10 mg/kg de peso corporal, JustWin Biotech Co., Ltd.) do EXEMPLO 1. Todos os camundongos foram sacrificados no 14o dia após a cirurgia de UUO. Metade do rim foi fixada em formalina e embebida em parafina. As seções histológicas foram coradas com he- matoxilina-eosina (H&E) ou com Picro-Sirius Red Solution (Número do produto: ab246832, Abcam), cobertas com lamínulas e seladas. As se- ções histológicas foram observadas com ampliação de 20x, e todas as imagens foram mostradas nas FIGS. 24B e 24C com uma barra de es- cala em 100 µm.
[179] Foi feita referência às FIGS. 24B e 24D, que ilustram, res- pectivamente, imagens de coloração histológica de rim de camundon- gos com UUO detectadas pelo mAb PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[180] Os resultados das FIGS. 24B e 24D mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle (IgG1k), o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode, de fato, reduzir a fibrose renal de animais com UUO.
6. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Expressão da Proteína relacionada à Fibrose e Migração de
Fibroblastos Pulmonares Tratados por PTX3
[181] Neste EXEMPLO, a linhagem de células humanas de fi- broblastos de pulmão HFL1 (Número de Acesso ao Depósito: BCRC 60299 ou ATCC® CRL-153™) foi usada nas seguintes experiências para avaliação do anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 que afeta a fibrose pulmonar.
[182] Em primeiro lugar, as células HFL1 foram cultivadas em meio F12K de Ham (F12K) (modificação de Kaighn) (21127-022, Gibco) (su- plementado com FBS 10 %, 100 μg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina).
[183] As células HFL1 foram tratadas com 0,4 μg/mL de anticorpo de controle (IgG1k, Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Tai- wan) ou 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.), seguido por tratamento com 200 ng/mL de proteína recombinante PTX3 por 6 horas. E, em seguida, as células HFL1 foram lisadas em tampão RIPA modificado. Em seguida, Western blotting foi usado para detectar as ex- pressões de α-tubulina (Número do produto: T6199, Sigma), fibronec- tina (Número do produto: 15613-1-AP, ProteinTech), Colágeno tipo I (Número do produto: 14695-1-AP, ProteinTech) e α-actina de músculo liso (α-SMA, Número do Produto: GTX 100904, GeneTex) com anticor- pos específicos, a expressão da α-tubulina serviu como um grupo de controle de carga e o resultado foi mostrado na FIG. 25A.
[184] Além disso, as células HFL1 foram semeadas em uma placa de cultura de células de 24 poços (cada poço tendo uma inserção com poros de 8 μm no fundo; Número do produto: 353097, BD Biosciences), e o meio em cada poço inferior foi adicionado sem ou com 0,4 μg/mL de anticorpo de controle IgG1k (Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan), 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.) ou 200 ng/mL de proteína recombinante PTX3. Após o tratamento por 16 horas, as células dentro de cada inserção superior foram limpas com cotonetes e removidas após 16 horas de cultivo. As células remanes- centes, que aderiram à superfície inferior da membrana de policarbo- nato da inserção migrando para fora do fundo da inserção, foram cora- das por DAPI e calculadas em números de células sob microscopia de fluorescência com ampliação de 200 vezes. Os resultados foram mos- trados na FIG. 25B.
[185] As células HFL1 foram semeadas em uma placa de cultura de células de 24 poços e tratadas sem ou com 0,4 μg/mL de anticorpo de controle IgG1k (Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Tai- wan), 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.) ou 200 ng/mL de proteína recombinante PTX3 por 24 horas. Em seguida, as células HFL1 foram fixadas em metanol a -20°C durante a noite. No dia se- guinte, as células HFL1 foram coradas por Picro-Sirius Red Solution (Número do produto: ab246832, Abcam) à temperatura ambiente du- rante 20 minutos e enxaguadas duas vezes com ácido acético. O nú- mero de nódulos das células foi contado de acordo com imagens de microscópio óptico com ampliação de 200x. Mais tarde, as células foram lisadas em NaOH 0,1 N e a absorvância de cada poço a 490 nm foi detectada por leitor de ELISA comercialmente disponível, e os resulta- dos foram mostrados nas FIGS. 25C e 25D.
[186] Foi feita referência às FIGS. 25A a 25D, que ilustram, res- pectivamente, imagens de Western blotting (FIG. 25A), um diagrama de barras de números de células de migração (FIG. 25B), imagens (FIG. 25C) e um diagrama de barras (FIG. 25D) de células coradas em nódu- los de fibroblastos pulmonares tratados com mAb PTX3, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Três asteriscos (***) indicaram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001) em comparação com o anticorpo de controle (IgG1k).
[187] Os resultados das FIGS. 25A a 25D mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle (IgG1k), o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode reduzir as expressões das proteínas relacionadas à fibrose de fibroblastos pulmonares, bem como o número de células de migração e o número de nódulos celulares.
7. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Fibrose Pulmonar induzida por Bleomicina em Modelo de Camundongo IPF (I)
[188] Neste EXEMPLO, os esquemas experimentais da FIG. 26A foram usados na avaliação. Primeiramente, foram fornecidos camun- dongos machos C57BL/6J (seis a oito semanas de idade, adquiridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taiwan). Em seguida, os camundongos fo- ram instilados por via intratraqueal (I.T.) com PBS ou 2 mg/kg de bleo- micina (BLM, Número do produto: ap302, Enzo) para indução de fibrose. No 14o e 21o dias após a indução da fibrose, os ratos foram injetados i.p. com o anticorpo de controle (IgG1K, 10 mg/kg de peso corporal, Pro- duto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan) ou anticorpo PTX3 (10 mg/kg de peso corporal, JustWin Biotech Co., Ltd.). Todos os ca- mundongos foram sacrificados no 28o dia após a indução de fibrose.
[189] Os pesos corporais de camundongos C57BL/6J foram medi- dos individualmente no 7o, 14o, 21o ou 28o dias após a instilação intra- traqueal com BLM e, em seguida, esses camundongos foram injetados i.p. com 10 mg/kg de peso corporal do anticorpo de controle IgG1K (o grupo de controle) ou anticorpo PTX3. Todos os resultados foram mos- trados na FIG. 26B.
[190] Após a eutanásia, o tecido pulmonar dos camundongos foi examinado macroscopicamente no 7o, 14o, 21o ou 28o dias após a insti- lação intratraqueal com PBS (isto é, o grupo de controle saudável) ou 2 mg/kg de BLM. Os lobos do pulmão esquerdo foram instilados por via intratraqueal, fixados em paraformaldeído e embebidos em parafina. As seções histológicas foram coradas por H&E, cobertas com lamínulas e seladas. As seções histológicas foram observadas com ampliação de
20x, e todas as imagens foram mostradas na FIG. 26C com uma barra de escala em 100 µm.
[191] Após a eutanásia, os tecidos fibrosos pulmonares induzidos por BLM dos camundongos foram examinados macroscopicamente no 28o dia, tratados com 10 mg/mL de anticorpo de controle (IgG1k) ou mAb PTX3. Os lobos do pulmão esquerdo foram instilados por via intra- traqueal, fixados em paraformaldeído e embebidos em parafina. As se- ções histológicas foram coradas por H&E, cobertas com lamínulas e se- ladas. As seções histológicas foram observadas com ampliação de 20x, e todas as imagens foram mostradas na FIG. 26D com uma barra de escala em 100 µm.
[192] Foi feita referência às FIGS. 26B a 26D, que ilustram, res- pectivamente um diagrama de curva de alterações no peso corporal (FIG. 26B), exame macroscópico do pulmão, e imagens de coloração histológica (FIGS. 26C e 26D) de fibrose pulmonar induzida por BLM de camundongos tratados com mAb PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[193] Os resultados das FIGS. 26B a 26D mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle (IgG1k), o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode reverter os níveis da fibrose pulmonar e a perda de peso corporal causada pela fibrose pulmonar.
8. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Fibrose Pulmonar induzida por Bleomicina em Modelo de Camundongo IPF (II)
[194] Neste EXEMPLO, os esquemas experimentais da FIG. 27A foram usados na avaliação. Em primeiro lugar, foram fornecidos camun- dongos machos C57BL/6J (seis a oito semanas de idade, adquiridos da BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taiwan). Em seguida, os camundongos fo- ram instilados por via intratraqueal (I.T.) com PBS ou 2 mg/kg de bleo- micina (BLM, Número do produto: ap302, Enzo) para indução de fibrose.
No 21o dia após a indução de fibrose, os camundongos foram injetados i.p. com o anticorpo de controle (IgG1K, 10 mg/kg de peso corporal, Pro- duto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan) ou com anticorpo PTX3 (10 mg/kg de peso corporal, JustWin Biotech Co., Ltd.). Todos os camundongos foram sacrificados no 28o dia após a indução de fibrose.
[195] Os pesos corporais dos camundongos C57BL/6J foram me- didos individualmente no 7o, 14o, 21o ou 28o dias após a instilação intra- traqueal com BLM e, em seguida, esses camundongos foram injetados i.p. com 10 mg/kg de peso corporal do anticorpo de controle IgG1K (o grupo de controle) ou com anticorpo PTX3 no 21o dia. Todos os resulta- dos foram mostrados na FIG. 27B.
[196] Após a eutanásia, o tecido pulmonar dos camundongos foi examinado macroscopicamente no 7o, 14o, 21o ou 28o dias após a insti- lação intratraqueal com PBS (isto é, o grupo de controle saudável) ou 2 mg/kg de BLM. Os lobos do pulmão esquerdo foram instilados por via intratraqueal, fixados em paraformaldeído e embebidos em parafina. As seções histológicas foram coradas por H&E, cobertas com lamínulas e seladas. As seções histológicas foram observadas com ampliação de 20x, e todas as imagens foram mostradas na FIG. 27C com uma barra de escala em 100 µm.
[197] Após a eutanásia, os tecidos de fibrose pulmonar induzida por BLM dos camundongos foram examinados macroscopicamente no 28o dia, tratados com 10 mg/mL de anticorpo de controle (IgG1k) ou mAb PTX3. Os lobos do pulmão esquerdo foram instilados por via intra- traqueal, fixados em paraformaldeído e embebidos em parafina. As se- ções histológicas foram coradas por H&E, cobertas com lamínulas e se- ladas. As seções histológicas foram observadas com ampliação de 20x, e todas as imagens foram mostradas na FIG. 27D com uma barra de escala em 100 µm.
[198] Foi feita referência às FIGS. 27B a 27D, que ilustram, res- pectivamente, um diagrama de curva de alterações no peso corporal (FIG. 27B), exame macroscópico do pulmão e imagens de coloração histológica (FIGS. 27C e 27D) de fibrose pulmonar induzida por BLM de camundongos tratados com mAb PTX3 do EXEMPLO 1, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[199] Os resultados das FIGS. 27B a 27D mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle (IgG1k), o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode reverter os níveis da fibrose pulmonar e a perda de peso corporal causada pela fibrose pulmonar.
9. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Expressão da Proteína Relacionada à Fibrose de Fibroblas- tos Embrionários NIH-3T3
[200] Neste EXEMPLO, a linhagem celular de fibroblasto embrio- nário de camundongo NIH-3T3 (Número de Acesso ao Depósito: BCRC 60008 ou ATCC® CRL-1653™) foi usada nas seguintes experiências para avaliação do anticorpo monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 que afeta a fibrose.
[201] Em primeiro lugar, as células NIH-3T3 foram cultivadas em DMEM (12800-082, Gibco) (suplementado com FBS 10 %, 100 μg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina).
[202] Células NIH-3T3 foram tratadas com 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.), seguido por tratamento com 200 ng/mL de proteína recombinante PTX3 por 6 horas. E, em seguida, as células NIH-3T3 foram lisadas em tampão RIPA modificado. Em se- guida, Western blotting foi usado para detectar as expressões de α-tu- bulina (Número do produto: T6199, Sigma), fibronectina (Número do produto: 15613-1-AP, ProteinTech), Colágeno tipo I (Número do pro- duto: 14695-1-AP, ProteinTech) e α-SMA (Número do produto: GTX
100904, GeneTex) com anticorpos específicos, a expressão da α-tubu- lina serviu como um grupo de controle de carga, e o resultado foi mos- trado na FIG. 28A.
[203] Além disso, as células NIH-3T3 foram semeadas em uma placa de cultura de células de 24 poços, e o meio em cada poço inferior foi adicionado sem ou com 0,4 μg/mL de anticorpo de controle IgG1k (Produto No. 10101, Leadgene Biomedical, Inc., Taiwan), 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.) ou 200 ng/mL de proteína recom- binante PTX3 por 24 horas de tratamento. Posteriormente, as células NIH-3T3 foram fixadas em metanol a -20°C durante a noite. No dia se- guinte, as células NIH-3T3 foram coradas por Picro-Sirius Red Solution (Número do produto: ab246832, Abcam) à temperatura ambiente du- rante 20 minutos, e enxaguadas duas vezes com ácido acético. O nú- mero de nódulos das células foi contado de acordo com as imagens ao microscópio óptico com ampliação de 200x. Posteriormente, as células foram lisadas em NaOH 0,1N e a absorvância de cada poço a 490 nm foi detectada por um leitor de ELISA comercialmente disponível, e os resultados foram mostrados nas FIGS. 28B e 28C.
[204] Foi feita referência às FIGS. 28A a 28C, que ilustram, res- pectivamente, imagens de Western blotting (FIG. 28A), imagens (FIG. 28B) e um diagrama de barras (FIG. 28C) de células coradas em nódu- los de fibroblastos embrionários tratados com mAb PTX3, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Três asteriscos (***) indi- caram os dados tendo uma diferença estatisticamente significativa (p<0,001) em comparação com o anticorpo de controle (IgG1k).
[205] Os resultados das FIGS. 28A a 28C mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle (IgG1k), o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode reduzir as expressões das proteínas relacionadas à fibrose e o número de nódulos das células de NIH-3T3.
10. Avaliação do Anticorpo Monoclonal PTX3 do EXEMPLO 1 afe- tando a Expressão da Proteína relacionada à Fibrose de Fibroblas- tos Hepáticos F28
[206] Neste EXEMPLO, fibroblasto/F28 associado ao câncer hu- mano (células CAF/F28, ou denominadas como fibroblasto hepático F28) foi cultivado em DMEM (12800-082, Gibco) (suplementado com FBS 10%, 100 μg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina).
[207] Células CAF/F28 foram expostas a 8 Gray (Gy) de radiação, seguidos por tratamento de 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.) por 6 horas. E, em seguida, as células CAF/F28 foram lisadas em tampão RIPA modificado, que incluiu Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 1 %, 0,25 % de desoxicolato de sódio, 1 mM de ditiotreitol (DTT), 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), aprotinina (1 mg/ml) e leupeptina (1 mg/ml). Em seguida, Western blot- ting foi usado para detectar as expressões de α-tubulina (Número do produto: T6199, Sigma), fibronectina (Número do produto: 15613-1-AP, ProteinTech), Colágeno tipo I (Número do produto: 14695-1-AP, Pro- teinTech), e α-SMA (Número do produto: GTX 100904, GeneTex) com anticorpos específicos, a expressão de α-tubulina serviu como um grupo de controle de carga, e o resultado foi mostrado na FIG. 29A.
[208] Além disso, as células CAF/F28 foram tratadas com 0,4 μg/mL de mAb PTX3 (JustWin Biotech Co., Ltd.), seguidos por trata- mento com 200 ng/mL de proteína recombinante PTX3 por 6 horas. E, em seguida, as células CAF/F28 foram lisadas em tampão RIPA modi- ficado. Em seguida, Western blotting foi usado para detectar as expres- sões de α-tubulina (Número do produto: T6199, Sigma), fibronectina (Número do produto: 15613-1-AP, ProteinTech), Colágeno tipo I (Nú- mero do produto: 14695-1-AP, ProteinTech), e α-SMA (Número do pro- duto: GTX 100904, GeneTex) com anticorpos específicos, a expressão de α-tubulina serviu como um grupo de controle de carga, e o resultado foi mostrado na FIG. 29B.
[209] Foi feita referência às FIGS. 29A a 29B, que ilustram, res- pectivamente, imagens de Western blotting usando mAb PTX3 contra a expressão das proteínas relacionadas à fibrose de fibroblastos hepáti- cos em vários tratamentos, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[210] Os resultados das FIGS. 29A e 29B mostraram que, em com- paração com os dados do anticorpo de controle (IgG1k), o mAb PTX3 do Exemplo 1 pode aliviar as expressões das proteínas relacionadas à fibrose de fibroblastos hepáticos causadas por exposição à radiação ou PTX3.
[211] Todos os experimentos em camundongos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, National Cheng Kung University, Taiwan. O protocolo de uso de ani- mais, como citado acima, foi revisado e aprovado pelo Comitê Instituci- onal de Cuidado e Uso de Animais (IACUC).
[212] Deve ser complementado que, o mAb PTX3 do EXEMPLO 1 tem excelente afinidade e sensibilidade com a proteína recombinante PTX3, ele pode ser aplicado em um conjunto e um método para detectar PTX3, para detecção in vitro de uma quantidade de PTX3 em um espé- cime biológico. Os espécimes biológicos adequados, métodos, conjun- tos, dispositivos/equipamentos foram citados como anteriormente men- cionados e sendo desnecessário relatar em detalhes. Além disso, as composições e usos medicinais que compreendem o anticorpo mono- clonal PTX3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo monoclonal PTX3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com maior afinidade e sensibilidade serve como um ingrediente eficaz, podem especificamente inibir ou aliviar o receptor de PTX3 que reconhece PTX3, para especificamente inibir ou aliviar a doença ou o sintoma relacionado ao receptor de PTX3 reconhecendo a proteína
PTX3, de modo que possam atuar como fármacos de amplo espectro no tratamento de várias doenças.
[213] Em suma, o anticorpo monoclonal PTX3 com sequências es- pecíficas, sítios SNP específicos, modelos de análise específicos ou métodos de avaliação específicos são exemplificados para esclarecer a composição medicinal, incluindo anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno e uso do mesmo da presente invenção. No entanto, como é entendido por uma pessoa versada na técnica, outros modelos de análise ou outros métodos de avaliação também podem ser adotados na composição medicinal, incluindo anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno e uso do mesmo na presente invenção.
[214] De acordo com as modalidades da presente invenção, a composição medicinal, incluindo o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, vantajosamente inclui o anticorpo monoclonal PTX3 específico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como o ingrediente ativo, que pode inibir ou aliviar especifica- mente o receptor de PTX3 no reconhecimento da PTX3, para aplicações em conjunto para detecção in vitro de PTX3 e o método para diagnóstico in vitro de PTX3, bem como as composições medicinais e usos como um medicamento no tratamento da doença ou do sintoma relacionado ao receptor de PTX3 reconhecendo a proteína PTX3.
[215] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes consideráveis com referência a certas modalidades da mesma, outras modalidades são possíveis. Portanto, o espírito e o escopo das reivindi- cações anexas não devem ser limitados à descrição das modalidades contidas neste documento.
Claims (16)
1. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos não desnaturados, e a sequência de ami- noácidos não desnaturados é selecionada do grupo que consiste de se- quências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 1 a 11; ou em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH), compreendendo sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 18, 19, 20 e/ou 21, e um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo se- quências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 22, 23, 24 e/ou 25; ou um domínio VH compreendendo sequências de aminoácidos codificadas por sequências de ácidos nucleicos listadas como SEQ ID NOs: 26, 27, 28 e/ou 29, e um domínio VL compreendendo sequências de aminoácidos codificadas por sequências de ácidos nucleicos listadas como SEQ ID NOs: 30, 31, 32 e/ou 33; ou um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoáci- dos listada como SEQ ID NO: 34 ou 35, e um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoáci- dos listada como SEQ ID NO: 36 ou 37; ou um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoáci- dos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NO: 38 ou 39, e um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoáci- dos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos listada como SEQ ID NO: 40 ou 41.
2. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico, um anticorpo mu- rino, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico humano-murino, um conjugado anticorpo-fármaco (ADC), e o fragmento de ligação ao an- tígeno do anticorpo monoclonal é um fragmento variável de cadeia única (scFv), um dímero do scFv [(scFv)2], um trímero do scFv [(scFv)3], um fragmento variável (Fv), um fragmento Fab, um fragmento Fab', um frag- mento Fab' dimérico [F(ab')2], um nanocorpo, um anticorpo de domínio único, ou quaisquer suas combinações.
3. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo monoclonal é modificado por conjugação, acoplamento, glicosilação, fixação de marca- dor, ou quaisquer suas combinações.
4. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, carac- terizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo monoclonal bifuncional (BsAb) ou um anticorpo monoclonal trifuncional ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo.
5. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, carac- terizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pertence à classe IgG, preferivelmente ao isótipo IgG1, isótipo IgG2, isótipo IgG3 ou isótipo IgG4, à classe IgM, classe IgA, classe IgD ou classe IgE.
6. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, carac- terizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pertence a um anticorpo inerte ou a um anticorpo antagonista.
7. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, carac- terizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou seu fragmento inibe ou alivia especificamente as atividades de uma ou mais proteínas PTX3.
8. Kit para detecção de PTX3, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos não desnaturados, e a sequência de aminoácidos não desnaturados é sele- cionada do grupo que consiste de sequências de aminoácidos listadas como SEQ ID NOs: 1 a 11.
9. Composição medicinal, caracterizada pelo fato de que com- preende uma dose eficaz de um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, como um ingrediente ativo e um veículo farmaceu- ticamente aceitável.
10. Composição medicinal de acordo com a reivindicação 9, ca- racterizada pelo fato de que compreende ainda um ingrediente farmaceu- ticamente ativo.
11. Composição medicinal, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a dose eficaz é de 2 mg/kg de peso cor- poral a 10 mg/kg de peso corporal (mg/kg BW).
12. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medica- mento para inibir ou aliviar especificamente uma doença ou um sintoma relacionado à ligação de PTX3 com o receptor de PTX3, em que o medi- camento é uma composição medicinal, como definida em qualquer uma das reivindicações 9 a 11, e o anticorpo monoclonal ou fragmento de li- gação ao antígeno do mesmo está presente em uma dose eficaz, inibindo ou aliviando assim a ligação de PTX3 com o receptor de PTX3.
13. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a doença ou o sintoma compreende carcinoma, preferi- velmente câncer de pulmão, câncer de mama e câncer de nasofaringe, adenocarcinoma, preferivelmente câncer colorretal, glioblastoma multi- forme (GBM) e fibrose, preferivelmente fibrose em pulmão, fígado, rim e pele.
14. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado por injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, inje- ção ortotópica, administração oral ou inalação nasal.
15. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a proliferação, derivação do câncer, migração, invasão, metástase, volume tumoral ou resistência a fármacos é inibida ou alivi- ada.
16. Uso de um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que na preparação de um medica- mento e/ou composição e/ou kit para inibir ou aliviar especificamente uma doença ou um sintoma relacionado à ligação de PTX3 com o receptor de PTX3, em que preferencialmente o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo está presente em uma dose eficaz, inibindo ou aliviando assim a ligação de PTX3 com o receptor de PTX3.
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