TWI754171B - 含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種單株抗體或其抗原結合片段及其用途。前述單株抗體或其抗原結合片段專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合，可應用於檢測PTX3之套組及其檢測方法，以及抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀的醫藥組成物及其用途。
Description
本發明是有關於一種抗體及其用途，特別是有關於一種專一性抑制或減緩PTX3的C端特定序列與PTX3受體結合之單株抗體或其抗原結合片段及其應用於檢測試劑、抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合相關之疾病或症狀的醫藥組成物及其用途。
目前已知癌細胞會刺激腫瘤周邊微環境產生各種發炎因子、白血球、血管過度增生及蛋白酶等，而癌症的慢性發炎反應也與癌細胞的生長、轉移與侵襲有關，然而其形成原因及詳細機制，仍有諸多未明之處。
腫瘤微環境除了與發炎反應有關之外，其他研究也指出，腫瘤微環境與腫瘤轉移(metastasis)及化療抗藥性(chemoresistance)亦息息相關。腫瘤微環境是由多種之基質細胞(stromal cells)及其他不同型態的細胞所構成，
不僅可保護腫瘤，使腫瘤細胞得以逃脫和抵抗免疫細胞，而造成腫瘤細胞的抗藥性。
在腫瘤周邊基質組織中的纖維母細胞及巨噬細胞受到CEBPD活化後，會誘導產生分泌型因子-正五聚蛋白相關蛋白3(pentraxin-related protein 3；PTX3)，其具有促進血管新生的活性，且可增加鼻咽癌細胞之移行及侵入組織(或稱侵襲)的能力。另外，過去研究亦證實癌周邊組織細胞中CEBPD受到活化，亦可能促使癌轉移，甚至促使在化療過程中產生抗藥性癌細胞，這些抗藥性癌細胞會生長的更快並且更容易轉移。
目前市面上雖有一些小分子抗癌藥物，例如順-雙氨雙氯鉑(cis-diammine dichloroplatinum(II)；CDDP；商品名順鉑(Cisplatin))、太平洋紫杉醇(paclitaxel；商品名Taxol)以及5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil；5-FU)等，然而最近的研究發現，上述小分子抗癌藥物不僅活化癌細胞中的CEBPD表現，亦可活化巨噬細胞及纖維母細胞內CEBPD的表現，反而促使癌細胞產生抗藥性並快速轉移，導致癌症治療效果不佳。
PTX3與PTX3受體結合相關之疾病或症狀除了上述的癌症外，也涉及纖維化疾病及/或纖維化症狀。
有鑑於此，亟需發展一種專一性結合PTX3之抗體，以檢測生物樣本中的PTX3含量、克服習知藥物對於癌症及纖維化的治療效果不佳等問題。
因此，本發明之一態樣是提供一種單株抗體或其抗原結合片段，其係專一性結合一或多種正五聚蛋白相關蛋白(pentraxin-related protein；PTX3)的C端特定序列。
本發明之另一態樣係提供一種單株抗體或其抗原結合片段，其包含特定序列的重鏈可變區序列以及輕鏈可變區序列。
本發明之又一態樣係提供一種檢測PTX3之套組，包含上述之單株抗體或其抗原結合片段。
本發明之再一態樣係在提供一種體外檢測PTX3之方法，其利用上述套組檢測PTX3。
本發明之又一態樣是提供一種醫藥組成物，其包含具有有效劑量之單株抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑，且上述之單株抗體或其抗原結合片段作為有效成分。
本發明之又另一態樣係提供一種單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中單株抗體或其抗原結合片段為活性成份，且單株抗體或其抗原結合片段具有有效劑量，以抑制或減緩與PTX3及PTX3受體結合相關的疾病或症狀。
本發明之再一態樣係提供一種用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，包含對腫瘤細胞投予具有有效劑量之上述醫藥組成物，以抑制或減緩腫瘤細胞之活性。
本發明之又一態樣是提供一種用於體外抑制或減緩纖維化疾病及/或纖維化症狀的方法，包含對受纖維化疾病及/或纖維化症狀影響之器官投予有效劑量之上述醫藥組成物，以抑制或減緩器官之纖維化疾病及/或纖維化症狀。
根據本發明之上述態樣，提出一種單株抗體或其抗原結合片段。在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段可專一性結合如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11所列之非變性胺基酸序列。
在一實施例中，上述非變性胺基酸序列可包含但不限於由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：11任一者所列之胺基酸序列或上述任意組合。在其他實施例中，上述非變性胺基酸序列可包含但不限於由SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：11任一者所列之胺基酸序列或上述任意組合。
根據本發明之另一態樣，提供一種單株抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區序列以及輕鏈可變區序列，其中重鏈可變區序列可例如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20及/或SEQ ID NO：21所列之胺基酸序列，輕鏈可變區序列可例如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25所列之胺基酸序列。
在一些實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區序列可例如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：29所列之
核酸序列編碼之胺基酸序列，輕鏈可變區序列可例如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及/或SEQ ID NO：33所列之核酸序列編碼之胺基酸序列。
在其他實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區序列可例如SEQ ID NOs：34或35所列之胺基酸序列，輕鏈可變區序列可例如SEQ ID NOs：36或37所列之胺基酸序列。
在另一些實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區序列可例如SEQ ID NOs：38或39所列之核酸序列編碼之胺基酸序列，輕鏈可變區序列可例如SEQ ID NOs：40或41所列之核酸序列編碼之胺基酸序列。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其抗原結合片段。在一例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體或其抗原結合片段。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段可例如為單鏈可變區片段(single-chain variable fragment；scFv)、單鏈可變區片段二聚體〔(scFv)2〕、單鏈可變區片段三聚體〔(scFv)3〕、可變區片段(variable fragment；Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、奈米抗體(nanobody)或上述之任意組合。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段係經由複合(conjugation)或結合、醣化、標籤附接(tag attachment)或上述任意組合予以修飾。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段為抗體藥物複合體(antibody-drug conjugate；ADC)或其抗原結合片段。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段為雙功能單株抗體(bispecific monoclonal antibody；BsAb)或其抗原結合片段。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段為三功能單株抗體(trifunctional monoclonal antibody)或其抗原結合片段。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段屬於IgG類、IgM類別、IgA類別、IgD類別或IgE類別。在另一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段屬於IgG類且具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段屬於惰性抗體或拮抗劑抗體。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段係專一性抑制或減緩PTX3受體辨識與一或多種PTX3的C端特定序列之結合。在一些例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段係抑制或減緩一或多種PTX3之活性。在另一些例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段係專一性抑制或減緩PTX3受體與一或多種PTX3之交互作用、抑制或減緩PTX3訊息傳遞或上述之任意組合。
根據本發明之又一態樣，提出一種檢測PTX3之套組，包含如上述任一者之單株抗體或其抗原結合片段，
其中單株抗體或其抗原結合片段可專一性結合非變性胺基酸序列，且此非變性胺基酸序列可包括但不限於如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11任一者所列之胺基酸序列。
根據本發明之更另一態樣，提出一種體外檢測PTX3之方法，其係利用上述檢測PTX3之套組檢測PTX3，其中檢測PTX3之套組所含之單株抗體或其抗原結合片段之分析靈敏度可例如不低於0.0016pM。
根據本發明之其他態樣，提出一種醫藥組成物，其包含具有有效劑量之單株抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑，且上述之單株抗體或其抗原結合片段為有效成分。
依據本發明一實施例，上述醫藥組成物更可包含活性藥物成分。
根據本發明之其他態樣，提出一種單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩正五聚蛋白相關蛋白(pentraxin-related protein；PTX3)與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途。在一實施例中，前述單株抗體或其抗原結合片段為活性成份，且單株抗體或其抗原結合片段具有有效劑量，以抑制或減緩與PTX3及PTX3受體結合相關的疾病或症狀。
依據本發明一實施例，上述醫藥組成物係用於抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀，其中此疾病或症狀可包括上皮細胞癌、腺癌、神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme；GBM)及纖維化。在一些
例示中，上皮細胞癌可包括肺癌(lung cancer)、乳癌(breast cancer)及鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma；NPC)。前述腺癌可例如大腸癌。
依據本發明一實施例，上述受纖維化之疾病或症狀影響之器官可包括但不限於肺、肝、腎及皮膚。
依據本發明一實施例，上述醫藥組成物可經由皮下(subcutaneous，s.c.)注射、肌肉注射、靜脈注射、腹腔(intraperitoneal，i.p.)注射、原位(orthotopic)注射、經口投予或口鼻吸入之方式投予。
根據本發明之其他態樣，提出一種用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，包括對腫瘤細胞投予有效劑量之上述醫藥組成物，藉此抑制或減緩腫瘤細胞之活性。
根據本發明之其他態樣，提出一種用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，包括對腫瘤細胞投予有效劑量之上述醫藥組成物，藉此抑制或減緩腫瘤細胞之活性。
根據本發明之其他態樣，提出一種用於體外抑制或減緩纖維化疾病及/或纖維化症狀的方法，包括對受纖維化疾病及/或纖維化症狀影響之器官投予有效劑量之上述醫藥組成物，藉此抑制或減緩前述器官之纖維化疾病及/或纖維化症狀。
應用本發明之單株抗體或其抗原結合片段，其係利用特定的PTX3單株抗體或其抗原結合片段專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合，不僅可應用於體外檢測PTX3之套組及體外檢測PTX3含量的方法，更可應用於
抑制或減緩PTX3受體辨識PTX3相關的疾病或症狀的醫藥組成物及其用途。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：〔圖1〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對PTX3重組蛋白的親和力曲線圖。
〔圖2〕係繪示根據本發明另一實施例之PTX3單株抗體對PTX3重組蛋白的親和力曲線圖。
〔圖3〕與〔圖4〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體與不同片段之PTX3重組蛋白結合的表位定位圖譜。
〔圖5〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體對於不同種PTX3重組蛋白之結合的結果。
〔圖6〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體阻礙PTX3重組蛋白與PTX3受體之結合的競爭性抑制圖。
〔圖7A〕至〔圖7C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體抑制乳癌細胞株MDA-MB231之移行細胞數(圖7A)、侵襲細胞數(圖7B)、細胞球團數(圖7C)的結果。
〔圖8A〕至〔圖8C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體抑制肺癌細胞株A549之移行細胞數(圖8A)、侵襲細胞數(圖8B)、細胞球團數(圖8C)的結果。
〔圖9A〕至〔圖9C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體抑制鼻咽癌細胞株HONE1之移行細胞數(圖9A)、侵襲細胞數(圖9B)、細胞球團數(圖9C)的結果。
〔圖10A〕至〔圖10C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體抑制神經膠母細胞瘤細胞株U87MG之移行細胞數(圖10A)、侵襲細胞數(圖10B)、細胞球團數(圖10C)的結果。
〔圖11A〕至〔圖11B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體抑制乳癌細胞株MDA-MB231之移行細胞數(圖11A)及侵襲細胞數(圖11B)的結果。
〔圖12A〕至〔圖12B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體抑制肺癌細胞株A549之移行細胞數(圖12A)及侵襲細胞數(圖12B)的結果。
〔圖13A〕至〔圖13B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體抑制鼻咽癌細胞株HONE1之移行細胞數(圖13A)及侵襲細胞數(圖13B)的結果。
〔圖14A〕至〔圖14C〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或市售抗體抑制乳癌細胞株MDA-MB231(圖14A)、肺癌細胞株A549(圖14B)以及鼻咽癌細胞株HONE1(圖14C)之細胞球團數的結果。
〔圖15A〕至〔圖15B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠原位異種移植的乳癌細胞MDA-MB231之腫瘤體積(圖15A)及腫瘤轉移(圖
15B)的結果。
〔圖16A〕至〔圖16B〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或同型對照抗體抑制小鼠原位同種移植乳癌細胞4T1之腫瘤體積(圖16A)及腫瘤轉移(圖16B)的結果。
〔圖17A〕至〔圖17C〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體在併用或未併用紫杉醇的情形下，抑制小鼠原位異種移植的乳癌細胞4T1之腫瘤體積的影像圖(圖17A)及腫瘤體積變化折線圖(圖17B至圖17C)。
〔圖18A〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體在併用或未併用紫杉醇的情形下，評估小鼠原位同種移植的乳癌細胞4T1之實驗流程示意圖。
〔圖18B〕至〔圖18D〕係分別顯示根據本發明另一實施例之PTX3單株抗體在併用或未併用紫杉醇的情形下，小鼠原位同種移植的乳癌細胞4T1之腫瘤體積與轉移的影像圖(圖18B)、腫瘤體積折線圖(18C)及小鼠存活率(圖18D)。
〔圖19A〕係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠植入大腸癌細胞株MC38之實驗流程示意圖。
〔圖19B〕係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠植入大腸癌細胞株MC38之腫瘤體積折線圖。
〔圖20A〕及〔圖20B〕係顯示根據本發明一實施例
之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠植入人類神經膠母細胞瘤細胞株U87MG之腫瘤體積折線圖(圖20A)及小鼠存活率(圖20B)。
〔圖21A〕係繪示根據本發明一實施例之係繪示利用本發明一實施例之PTX3單株抗體評估對急性肝纖維化小鼠改善效果的實驗流程示意圖。
〔圖21B〕至〔圖21D〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體在急性肝纖維化小鼠體內以蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色之左肝葉組織切片(圖21B)、肝壞死區域比例(圖21C)及肝臟重/體重比(圖21D)。
〔圖22A〕係繪示利用本發明一實施例之PTX3單株抗體評估對慢性肝纖維化小鼠改善效果的實驗流程示意圖。
〔圖22B〕至〔圖22D〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體在慢性肝纖維化小鼠體內以天狼星紅(Picro-Sirius Red)染色之左肝葉組織切片(圖22B)、肝纖維化區域比例(圖22C)及肝臟重/體重比(圖22D)。
〔圖23A〕至〔圖23C〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對腎纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現之西方墨點分析結果(圖23A)、細胞結節的細胞染色影像(圖23B)及其直條圖(圖23C)。
〔圖24A〕至〔圖24D〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對UUO小鼠之腎纖維化實驗流程示意圖(圖24A及圖24C)及腎臟組織切片染色影像(圖24B及
圖24D)。
〔圖25A〕至〔圖25D〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對肺纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現之西方墨點分析結果(圖25A)、移行細胞數的直條圖(圖25B)、細胞結節的細胞染色影像(圖25C)及其直條圖(圖25D)。
〔圖26A〕至〔圖26D〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對BLM誘發肺纖維化小鼠之實驗流程示意圖(圖26A)、體重變化曲線圖(圖26B)、肺部外觀及組織切片影像(圖26C及圖26D)。
〔圖27A〕至〔圖27D〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對BLM誘發肺纖維化小鼠之實驗流程示意圖(圖27A)、體重變化曲線圖(圖27B)、肺部外觀及組織切片影像(圖27C及圖27D)。
〔圖28A〕至〔圖28C〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對胚胎纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現之西方墨點分析結果(圖28A)、細胞結節的細胞染色影像(圖28B)及其直條圖(圖28C)
〔圖29A〕至〔圖29B〕係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對不同處理之肝纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現之西方墨點分析結果。
承前所述，本發明提供一種含單株抗體或其抗
原結合片段之醫藥組成物及其用途，其係利用單株抗體或其抗原結合片段專一性抑制正五聚蛋白相關蛋白(pentraxin-related protein；PTX3)與PTX3受體之結合，可應用於檢測PTX3之套組及其檢測方法，以及抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀的醫藥組成物及其用途。
本發明此處所稱的單株抗體或其抗原結合片段可包含特定序列的重鏈可變區序列以及輕鏈可變區序列，以專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體的C端特定序列之結合。
申言之，在一實施例中，前述單株抗體或其抗原結合片段可專一性結合人類PTX3之C端胺基酸序列，其序列範圍不拘，可例如NO：1至SEQ ID NO：17所列之非變性胺基酸序列，然以專一性結合如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11所列之非變性胺基酸序列為佳，又以專一性結合如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5以及11所列之非變性胺基酸序列為較佳，又以專一性結合如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4所列之非變性胺基酸序列為更佳。在上述實施例中，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11所列之非變性胺基酸序列係對應於人類PTX3重組蛋白之非變性胺基酸序列的第200個胺基酸至第236個胺基酸。在另一個例示中，前述SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：11所列之非變性胺基酸序列係對應於人類PTX3重組蛋白之非變性胺基酸序列的第200個胺基酸至第220個胺基
酸。在又一個例示中，前述SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：11所列之非變性胺基酸序列係對應於人類PTX3重組蛋白之非變性胺基酸序列的第203個胺基酸至第217個胺基酸。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區序列以及輕鏈可變區序列，其中重鏈可變區的CDR1的序列具有如SEQ ID NO：18所列之胺基酸序列。重鏈可變區的CDR2的胺基酸序列可為RIDPANX1X2TKYDPX3FQG，其中X1代表G或D，X2代表D或N，X3代表K或M，其具體的胺基酸序列如SEQ ID NOs：19或20所列。重鏈可變區的CDR3的序列具有如SEQ ID NO：21所列之胺基酸序列。輕鏈可變區的CDR1的序列具有如SEQ ID NO：22所列之胺基酸序列。輕鏈可變區的CDR2的序列具有如SEQ ID NO：23所列之胺基酸序列。輕鏈可變區的CDR3的胺基酸序列可為HQX4QRSPLT，其中X4代表F或Y，其具體的胺基酸序列如SEQ ID NOs：24或25所列。
在其他實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區序列可具有如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：29所列之核酸序列編碼之胺基酸序列，而輕鏈可變區序列可具有如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及/或SEQ ID NO：33所列之核酸序列編碼之胺基酸序列。
在其他實施例中，上述單株抗體或其抗原結合
片段之重鏈可變區序列可具有具有如SEQ ID NOs：34或35所列之胺基酸序列，而輕鏈可變區序列可具有如SEQ ID NOs：36或37所列之胺基酸序列。
在其他實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區序列可具有如SEQ ID NOs：38或39所列之核酸序列編碼之胺基酸序列，而輕鏈可變區序列可具有如SEQ ID NOs：40或41所列之核酸序列編碼之胺基酸序列。
在一些實施例中，單株抗體或其抗原結合片段的種類不拘，可例如嵌合抗體或其抗原結合片段。在其他例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段可例如為鼠源抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段的結構不拘，在兼顧互補決定區(complementarity-determining region；CDR)結構穩定性的前提下，可為完整的抗體結構，或是簡化的抗體結構，例如單鏈可變區片段(single-chain variable fragment；scFv)、單鏈可變區片段二聚體〔(scFv)2〕、單鏈可變區片段三聚體〔(scFv)3〕、可變區片段(variable fragment；Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、奈米抗體〔nanobody，又稱單域抗體(single domain antibody，sdAb)或重鏈抗體(heavy-chain antibody)〕或上述之任意組合，藉此簡化重組抗體的製程。上述單株抗體或其抗原結合片段可利用融合瘤細胞或重組基因表現等
方式進行，此為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，此處不再贅述。
在一些實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段可視實際需求，進一步經由複合(conjugation)或結合、醣化、標籤附接(tag attachment)或上述任意組合予以修飾。舉例而言，上述單株抗體或其抗原結合片段可與藥物進一步形成抗體藥物複合體(antibody-drug conjugate；ADC)或其抗原結合片段。在其他例子中，上述單株抗體或其抗原結合片段亦可與特定的訊息胜肽結合，以進入特定部位，例如通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)。
在一些實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段可例如為雙功能單株抗體(bispecific monoclonal antibody；BsAb)、三功能單株抗體(trifunctional monoclonal antibody)或其抗原結合片段。
依據本發明一實施例，上述單株抗體或其抗原結合片段係經由複合(conjugation)或結合、醣化、標籤附接(tag attachment)或上述任意組合予以修飾。
依據本發明一實施例，上述單株抗體或其抗原結合片段為抗體藥物複合體(antibody-drug conjugate；ADC)或其抗原結合片段。
依據本發明一實施例，上述單株抗體或其抗原結合片段為雙功能單株抗體(bispecific monoclonal antibody；BsAb)或其抗原結合片段。
依據本發明一實施例，上述單株抗體或其抗原
結合片段為三功能單株抗體(trifunctional monoclonal antibody)或其抗原結合片段。
在一實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段可屬於IgG類、IgM類別、IgA類別、IgD類別或IgE類別。在一具體實施例中，上述單株抗體或其抗原結合片段屬於IgG類且具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段具有IgG1同型，例如具有IgG1k同型。在一些具體例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段屬於惰性抗體或拮抗劑抗體。在一些具體例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段可專一性抑制或減緩一或多種PTX3之活性。在另一些具體例示中，上述單株抗體或其抗原結合片段可專一性抑制或減緩PTX3受體與一或多種PTX3之交互作用、抑制或減緩PTX3訊息傳遞或上述之任意組合。
在應用時，上述單株抗體或其抗原結合片段可用於檢測PTX3之套組及方法，藉由與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11所列之非變性胺基酸序列專一性結合，提高檢測生物樣本中PTX3之分析靈敏度。本發明此處所稱的生物樣本之形式不拘，可包括但不限於例如細胞、組織、血液、尿液、淋巴液、組織液、體液等。上述檢測PTX3之套組可應用於各種習知檢測用的元件/設備，例如流式細胞儀、酵素連結免疫吸附分析(enzymelinked immunosorbent assay；ELISA)檢測試劑套組、生物晶片等；或應用於習知檢測用的方法例如直接ELISA(direct ELISA)、間接
ELISA(indirect ELISA)、三明治ELISA(sandwich ELISA)、競爭性ELISA(competitive ELISA)、免疫組織化學染色及西方墨點分析法(Western bloting analysis)等。在一具體例中，上述單株抗體或其抗原結合片段的分析靈敏度(analytical sensitivity)，亦可稱為檢測下限值(lower limit of detection；LLOD)，一般而言不低於0.0016pM。
上述之單株抗體或其抗原結合片段可作為有效成分，添加於醫藥組成物中。在一實施例中，前述醫藥組成物可選擇性包含醫藥學上可接受之載劑。本發明此處所稱之「醫藥學上可接受之載劑」係指本身非屬活性成分，而是用以將活性成分傳遞至個體之載劑、稀釋劑、佐劑及/或媒劑，或添加至上述組成物中以改善組成物之處理或儲存性質，或允許或有助於組合物之劑量單位形成適於醫藥組成物並方便投予的賦形劑或任何物質。前述醫藥學上可接受的載劑不應破壞活性成分之藥理學活性，且在傳遞足夠治療劑量之活性成分時應無毒性。
前述適用之醫藥學上可接受的載劑可為一般熟悉製造醫藥組成物之通常知識者所熟知，且包括但不限於緩衝劑、稀釋劑、崩解劑、黏合劑、黏著劑、濕潤劑、聚合物、潤滑劑、滑動劑、為遮蔽或抵消不良味道或氣味而添加之物質、染料、芳香劑及為改善組合物之外觀而添加之物質。前述醫藥學上可接受的載劑之具體例可包括但不限於檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、碳酸氫鹽緩衝劑、
硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、碳酸鎂、滑石、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、果膠、糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、澱粉、明膠、纖維素物質(諸如烷酸之纖維素酯及纖維素烷基酯)、低熔點蠟、可可脂、胺基酸、尿素、醇類、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(例如血清白蛋白)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亞碸(DMSO)、氯化鈉或其他鹽、脂質體、甘油或粉末、聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯醇及聚乙二醇)及其他醫藥學上可接受之物質。
本發明此處所稱的抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀可包括上皮細胞癌、神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme；GBM)、腺癌及纖維化。前述上皮細胞癌可例如肺癌、乳癌及鼻咽癌。前述腺癌可例如大腸癌。前述受纖維化之疾病或症狀影響之器官可包括但不限於肺、肝(例如急性肝纖維化、慢性肝纖維化)、腎及皮膚等。
在應用時，上述單株抗體或其抗原結合片段可用於對目標細胞或受試對象投予有效劑量之上述單株抗體或其抗原結合片段或上述的醫藥組成物，藉此抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀。以小鼠為例，本發明前述所稱之「有效劑量」係指每公斤體重投以2mg至10mg的PTX3單株抗體或其抗原結合片段，以此劑量一週一次投予。在另一例示中，前述之PTX3單株抗體或其抗原結合片段之有效劑量可例如5mg/kg體重至10mg/kg體
重為較佳，然以6mg/kg體重至9mg/kg體重為較佳。至於應用到其他對象時，則可根據生體相等性換算成適合的有效劑量。在此說明的是，倘若PTX3單株抗體之有效劑量低於2mg/kg體重，則無法於預設時間內有效減少或抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合。
對於腫瘤而言，上述單株抗體或其抗原結合片段可抑制或減緩腫瘤細胞之活性，例如增生(proliferation)、癌幹原細胞性(cancer stemness)、移行(migration)、侵襲(invasion)、轉移(metastasis)、腫瘤體積或抗藥性(drug resistance)。
本發明所述之纖維化係定義為在器官或組織中形成過量的纖維組織，例如纖維結締組織，或在發炎、修復或反應過程中形成的纖維組織。上述纖維組織可為反應性、良性或病理狀態。在生理學上，纖維化可用於描述纖維組織的過度沉積的病理狀態，以及傷口癒合中結締組織沉積的過程。例如由傷口形成的瘢痕，或由單一種類細胞形成之纖維瘤，或由纖維組織過度沉積的病理狀態。對於受纖維化之疾病或症狀影響之器官而言，上述單株抗體或其抗原結合片段可抑制或減緩纖維化相關的疾病或症狀，例如急性肝纖維化、慢性肝纖維化等。
上述之醫藥組成物可經由皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射、原位注射(orthotopic injection)、經口投予、口鼻吸入等方式投予，藉此專一性抑制內生性PTX3活性，進而抑
制或減緩癌細胞之活性。具體而言，經體外細胞實驗證實，本發明之單株抗體或其抗原結合片段及含此之醫藥組成物經使用達預設時間，例如4週至11週後，即可抑制或減緩癌細胞之活性。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
此實施例係利用習知融合瘤法或重組蛋白表現法，製備專一性辨識PTX3重組蛋白之C端胺基酸序列的PTX3單株抗體。
簡言之，將如SEQ ID NO：13所列之非變性胺基酸序列之PTX3重組蛋白作為免疫原，以每頭小鼠50μg之劑量以腹腔注射(i.p.)的方式注入Balb/C小鼠腹腔內，2週後再以每頭小鼠50μg之劑量補強免疫，二週一次，共四次。接著，將活化的脾細胞與骨髓癌細胞融合後，產生融合瘤細胞株。
從上述融合瘤細胞株中，篩選出對SEQ ID NO：11所列之非變性胺基酸序列的重組蛋白之結合親和力較高的融合瘤細胞株，其中所得的融合瘤細胞株產生的PTX3單株抗體可專一性結合如序列辨識編號(SEQ ID NO：)1至SEQ ID NO：11所列之非變性胺基酸序列。
收集上述所得的融合瘤細胞株之培養上清液經由市售管柱純化出PTX3單株抗體(臻崴生技，台灣)後，委由台灣偉喬生醫股份公司分析重鏈可變區及輕鏈可變區的互補決定區(complementarity-determining region；CDR)之胺基酸序列及對應的核酸序列。重鏈可變區序列可例如具有SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及/或SEQ ID NO：21所列之胺基酸序列，輕鏈可變區序列可例如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23及/或SEQ ID NO：24所列之胺基酸序列。重鏈可變區之胺基酸序列具有如SEQ ID NO：34所列之胺基酸序列，或如SEQ ID NO：38所列之核酸序列編碼之胺基酸序列。輕鏈可變區之胺基酸序列具有如SEQ ID Ns：36所列之胺基酸序列，或如SEQ ID NO：40所列之核酸序列編碼之胺基酸序列。
另外，上述PTX3單株抗體經市售單株抗體分型套組分析後，確認其抗體分型為IgG1k。
此實施例利用習知ELISA套組評估PTX3重組蛋白與實施例一之PTX3單株抗體的親和力。
首先，將5μg/mL之PTX3重組蛋白(如SEQ ID NO：14所列之非變性胺基酸序列)或牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA；作為控制組)塗佈在96孔細胞培養盤(型號：9018，Corning Costar)之各孔內，4℃反應至隔夜。接著，將阻隔溶液〔含3%脫脂奶粉之磷酸鹽緩衝溶
液(PBS)〕加入孔內，於室溫(4℃至40℃)進行阻隔反應達1小時。在去除阻隔溶液後，利用PBS潤洗各孔，再加入初級抗體於室溫(4℃至40℃)進行反應1小時，其中初級抗體為經序列稀釋之實施例一的PTX3單株抗體(濃度為2.44×10-4μg/mL至1.00μg/mL)。然後，利用PBS洗去各孔未結合的PTX3單株抗體，並加入二級抗體於室溫(4℃至40℃)反應。之後，各孔加入四甲基聯苯胺(tetramethyl benzidine；TMB)反應一段時間後，加入0.1M硫酸(H2SO4)反應10分鐘，以終止反應，其中二級抗體為結合辣根過氧化氫酶(anti-mouse horse peroxidase；HRP)之抗小鼠IgG(IgG-HRP)。接下來，利用市售酵素免疫分析儀(ELISA reader)讀取450nm的吸光值，其結果如圖1所示。每個數值為三重複。上述二級抗體的反應時間係參照製造商之操作手冊進行，此應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，故不另贅述。
請參閱圖1，其係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對PTX3重組蛋白的親和力曲線圖，其中圖號●標示之曲線代表PTX3單株抗體對PTX3重組蛋白的親和力曲線，圖號■標示之曲線代表BSA對PTX3重組蛋白的親和力曲線。
由圖1結果可知，在高達46倍的稀釋(抗體濃度相當於0.244ng/mL或0.0016pM)後，PTX3單株抗體仍維持對PTX3重組蛋白良好的親和力。
另外，利用上述ELISA套組亦證明，本發明一
實施例之PTX3單株抗體對PTX3重組蛋白具有高親和力。首先，將10μg/mL之PTX3重組蛋白(如SEQ ID NO：14所列之非變性胺基酸序列，溶於pH7.2之PBS中)塗佈在96孔細胞培養盤(型號同上)之各孔內，於4℃反應至隔夜。接著，將阻隔溶液〔含3%牛血清白蛋白(BSA)之PBS〕加入孔內，於室溫(4℃至40℃)進行阻隔反應達1小時。在去除阻隔溶液後，利用PBS潤洗各孔，再加入初級抗體於室溫(4℃至40℃)進行反應1小時，其中初級抗體為經序列稀釋之實施例一的PTX3單株抗體(濃度為0.01ng/mL至1000ng/mL)。然後，利用PBST潤洗各孔數次，以去除各孔未結合的PTX3單株抗體，並加入二級抗體於室溫(4℃至40℃)反應，其中二級抗體為結合HRP之抗小鼠IgG(IgG-HRP)。之後，各孔加入TMB反應反應一段時間後，加入0.1M硫酸(H2SO4)反應10分鐘，以終止反應。接下來，利用市售酵素免疫分析儀讀取450nm的吸光值，其結果如圖2所示。每個數值為四重複。上述二級抗體的反應時間應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，故不另贅述。
請參閱圖2，其係繪示根據本發明另一實施例之PTX3單株抗體對PTX3重組蛋白的親和力曲線圖。
由圖2結果可知，PTX3單株抗體對於PTX3重組蛋白(即抗原)之解離常數(KD)為85pM，代表PTX3單株抗體對PTX3重組蛋白具有較高的親和力，故可應用於PTX3檢測套組。
另外，在其他實驗中，PTX3單株抗體可專一性結合PTX3重組蛋白之第200個胺基酸至第359個胺基酸(如SEQ ID NO：13所列之非變性胺基酸序列；圖未繪示)或第200個胺基酸至第236個胺基酸(如SEQ ID NO：12所列之非變性胺基酸序列；如圖3所示)。
1.評估實施例一之PTX3單株抗體與PTX3結合的表位定位區域
此實施例利用習知ELISA套組評估PTX3單株抗體與PTX3結合的表位定位(epitope mapping)區域。
此實施例係利用與實施例一相同的方式，評估PTX3單株抗體對PTX3的較小結合區域，惟其不同之處在於，本實施例是將200μg/mL之PTX3重組蛋白(如SEQ ID NOs：12、16、17所列之非變性胺基酸序列，溶於0.1M的碳酸氫鈉水溶液，pH 8.3)或BSA(作為控制組)塗佈在96孔細胞培養盤之孔內，4℃反應至隔夜。接著，將阻隔溶液〔含1% BSA之PBS〕加入孔內，於室溫(4℃至40℃)進行阻隔反應達1小時。在去除阻隔溶液後，利用PBS潤洗各孔，再加入實施例一之PTX3單株抗體(濃度為125ng/mL)於室溫(4℃至40℃)進行反應2小時。然後，利用PBS洗去各孔未結合的PTX3單株抗體，並加入二級抗體(抗小鼠IgG-HRP，以1：5000稀釋)於室溫(4℃至40℃)反應1小時。之後，各孔加入TMB反應反應一段時間後，加入0.1M
硫酸反應10分鐘以終止反應，並利用市售酵素免疫分析儀讀取450nm的吸光值，其結果如圖3所示。每個數值為三重複。
請參閱圖3，其係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體與不同片段之PTX3重組蛋白結合的表位定位圖譜，其中RI37代表如SEQ ID NO：12所列之PTX3重組蛋白片段，KT44代表如SEQ ID NO：16所列之PTX3重組蛋白片段，GI40代表如SEQ ID NO：17所列之PTX3重組蛋白片段，而圖號「＊＊＊」則代表相較於控制組(即BSA組)具有統計顯著性(p<0.001)。
由圖3的結果可知，PTX3單株抗體對於如SEQ ID NO：12所列之PTX3重組蛋白片段的親和力，高於其他片段，且具有統計顯著性。
請參閱圖4，其係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體與不同片段之PTX3重組蛋白結合的表位定位圖譜，其中橫軸分別代表如SEQ ID NO：1~10所列之PTX3重組蛋白片段。
由圖4的結果可知，PTX3單株抗體對於如SEQ ID NOs：1~5或如SEQ ID NOs：2~4所列之PTX3重組蛋白片段的親和力，遠高於其他片段，其中SEQ ID NOs：2~4所列之PTX3重組蛋白片段係對應於PTX3第203至217個胺基酸，如SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列，代表實施例一之PTX3單株抗體與PTX3結合的表位定位區域坐落於如SEQ ID NOs：2~4所列或如SEQ ID NO：11所列之胺
基酸序列的範圍內。
2.評估實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體與PTX3結合的表位定位區域之差異
此實施例係利用與實施例三相同的方式，評估實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(型號：ab90806；abcam plc.，U.K.)對於PTX3結合的表位定位區域，其結果如圖5所示。每個數值為三重複。
請參閱圖5，其係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體及市售PTX3單株抗體與不同片段之PTX3重組蛋白結合的表位定位圖譜，其中PTX3/FL代表如SEQ ID NO：15所列之PTX3重組蛋白片段，RI37代表如SEQ ID NO：12所列之PTX3重組蛋白片段，KT44代表如SEQ ID NO：16所列之PTX3重組蛋白片段，GI40代表如SEQ ID NO：17所列之PTX3重組蛋白片段，而圖號「＊＊＊」則代表相較於控制組(即BSA組)具有統計顯著性(p<0.001)。
由圖5的結果可知，實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)對於PTX3/FL(SEQ ID NO：15)的親和力皆較高，但實施例一之PTX3單株抗體PTX3單株抗體對於RI37(SEQ ID NO：12)之PTX3重組蛋白片段的親和力高於市售PTX3單株抗體(ab90806)，且具有統計顯著性，代表PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)對於PTX3結合的表位定位區域確實具有差
異。
PTX3單株抗體可競爭性結合至PTX3之PTX3受體結合區或其鄰近區域，進而專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合的機會。本實施例係以CD44作為PTX3受體的一個例子，利用競爭性結合試驗，評估PTX3單株抗體競爭性抑制PTX3結合至PTX3受體的效果。
本實施例證實，實施例一之PTX3單株抗體可中和PTX3，使其無法與PTX3受體(例如CD44)之結合區域或其鄰近區域結合。
申言之，此實施例使用的競爭性結合分析法係與實施例一相似的方式，惟不同之處在於，本實施例是將10μg/mL之PTX3受體〔例如CD44 N端重組蛋白(CD44 N端第1~220個胺基酸殘基之序列，溶於PBS，pH 7.2；Sino Biological Inc.，北京，中國)〕塗佈在96孔細胞培養盤之孔內，4℃反應至隔夜。接著，將阻隔溶液〔含3%脫脂奶粉之PBS〕加入孔內，於室溫(4℃至40℃)進行阻隔反應達1小時。
在進行競爭性結合試驗時，將結合HRP之PTX3重組蛋白(如SEQ ID NO：14所列之非變性胺基酸序列，HRP-PTX3，濃度為5μg/mL)與不同濃度的實施例一之PTX3單株抗體(濃度為1μg/mL或2μg/mL)於室溫(4℃
至40℃)進行預反應1小時，以形成預反應物。
在去除阻隔溶液後，利用PBS潤洗各孔，再加入上述預反應物，於室溫(4℃至40℃)進行反應2小時。然後，利用PBS洗去各孔未結合的預反應物，於各孔加入TMB反應一段時間後，加入0.1M硫酸反應10分鐘以終止反應，並利用市售酵素免疫分析儀讀取450nm的吸光值，其結果如圖6所示。每個數值為四重複。
請參閱圖6，其係繪示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體阻礙PTX3重組蛋白與PTX3受體之結合的競爭性抑制圖，其中縱軸代表競爭性抑制率(%)，橫軸下方的圖號「+」或「-」代表進行結合反應時有或無添加特定成分，圖6左側第1道直條代表控制組(即未加PTX3單株抗體的PTX3重組蛋白的組別)，而圖號「＊＊＊」則代表相較於控制組具有統計顯著性(p<0.001)。
由圖6的結果可知，以圖6左側第1道未加PTX3單株抗體的數值作為0%之競爭性抑制率，當PTX3單株抗體與PTX3重組蛋白預反應後再與CD44受體反應，所得之競爭性抑制率(%)與PTX3單株抗體的濃度呈現劑量依存關係，且具有統計顯著性，代表實施例一之PTX3單株抗體確實可中和PTX3，使其無法與CD44的結合區域或其鄰近區域結合。
乳癌、肺癌、鼻咽癌、神經膠母細胞瘤
(glioblastoma multiforme；GBM)屬於惡性腫瘤，且上述癌細胞具有移行(migration)、侵襲(invasion)及癌幹原細胞性(cancer stemness)等活性。此實施例係利用人類乳癌細胞株(MDA-MB231，寄存編號：BCRC 60425，ATCC HTB-26；三陰性乳腺癌細胞株，以下簡稱MB231)、人類肺癌細胞株A549(寄存編號：BCRC 60074；ATCC CCL-185)、人類鼻咽癌細胞株HONE1(Int.J.Cancer.1990 Jan 15；45(1)：83-9；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86,pp.9524-9528,December 1989)、人類GBM癌細胞U87MG(ATCC寄存編號：HTB-14；BCRC寄存編號：60360)等，藉由下述試驗評估實施例一之PTX3單株抗體對癌細胞活性之影響。
1.評估PTX3單株抗體對癌細胞移行之影響
在進行移行實驗時，將上述癌細胞以1×105細胞/孔之細胞密度，接種於24孔之博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層(底部孔徑為8μm)，並培養3小時。接著，將上層之細胞培養液更換為不含血清之細胞培養液，並於下層之不含血清之細胞培養基中添加0.2μg/mL之PTX3重組蛋白(如SEQ ID NO：14所列之非變性胺基酸序列)、0.4μg/mL之PTX3單株抗體或0.4μg/mL之控制組抗體(IgG1k)。
在培養16小時後，以棉棒刮除上層內側之細胞，移行至上層底部外側的細胞利用4’,6-二脒基-2-苯基
吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Invitrogen)進行染色，並於螢光顯微鏡之放大倍率200倍的視野下，計算移動至上層底部外側之細胞數，其結果如圖7A、圖8A、圖9A及圖10A所示。
請參閱圖7A、圖8A、圖9A及圖10A，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖7A)、肺癌細胞A549(圖8A)、鼻咽癌細胞HONE1(圖9A)及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG(圖10A)之移行細胞數直條圖。上述實施例之數據皆係將每一時間點及每一樣品之三重複實驗數據，正負其平均標準差而獲得，所有的值皆係藉由單因子變異數分析(one way ANOVA)而分析。上述實施例之圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖7A、圖8A、圖9A及圖10A之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549、鼻咽癌細胞HONE1及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG的移行細胞數，且此項差異具有統計顯著性。
2.評估PTX3單株抗體對癌細胞侵襲之影響
在進行侵襲實驗時，24孔之博登細胞移行器(Boyden chamber)的上層(底部孔徑為8μm)底面預先以基底膜基質(matrigel，購自BD Bioscience)塗覆後，將
上述癌細胞以1×105細胞/孔之細胞密度，接種於24孔之博登細胞移行器的上層，並培養3小時。接著，將上層之細胞培養液更換為不含血清之細胞培養液，並於下層之不含血清之細胞培養基中添加0.2μg/mL之PTX3重組蛋白(如SEQ ID NO：4所列之非變性胺基酸序列)、0.4μg/mL之PTX3單株抗體或0.4μg/mL之控制組抗體(IgG1k)。
在培養16小時後，以棉棒刮除上層內側之細胞，移行至上層底部外側的細胞利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Invitrogen)進行染色，並於螢光顯微鏡之放大倍率200倍的視野下，計算移動至上層底部外側之細胞數，其結果如圖7B、圖8B、圖9B及圖10B所示。
請參閱圖7B、圖8B、圖9B及圖10B，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖7B)、肺癌細胞A549(圖8B)、鼻咽癌細胞HONE1(圖9B)及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG(圖10B)之侵襲細胞數直條圖，其中圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖7B、圖8B、圖9B及圖10B之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549、鼻咽癌細胞HONE1及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG的侵襲細胞數，且此項差異具有統計顯著性。
3.評估PTX3單株抗體對癌細胞移行之影響
上述癌細胞具有癌幹原細胞性(cancer stemness)，添加PTX3重組蛋白可引起前述癌細胞形成細胞球團(sphere)。
在進行細胞球團實驗時，將上述癌細胞加入含0.2μg/mL之PTX3重組蛋白、0.4μg/mL之PTX3單株抗體或0.4μg/mL之控制組抗體(IgG1k)之含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS)的RPMI-1640細胞培養液〔含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum；FBS)，50~100μg/mL的鏈黴素及50~100U/mL的青黴素〕中，並在37℃保持溼度之5%二氧化碳濃度下培養，此為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，故不另贅述。
然後，將上述不同處理的癌細胞以5×103細胞/孔之細胞密度，接種於超低吸附表面多孔培養皿(multi-well plate with ultra-low attachment surface；Corning Inc.)中，以不含血清(serum-free)之細胞培養基DMEM/F12(Gibco)[含B27(Invitrogen)、20ng/mL之表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF；Abcam)以及10ng/mL之鹼性纖維母細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF；Peprotech)]，進行共同培養。經培養2週後，以光學顯微鏡觀察細胞球團數，其結果如圖7C、圖8C、圖9C及圖10C所示。
請參閱圖7C、圖8C、圖9C及圖10C，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖7C)、肺癌細胞A549(圖8C)、鼻咽癌細胞HONE1(圖9C)及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG(圖10C)之細胞球團數直條圖，其中圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖7C、圖8C、圖9C及圖10C結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，實施例一之PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549、鼻咽癌細胞HONE1及神經膠母細胞瘤細胞株U87MG的細胞球團數，且此項差異具有統計顯著性。
4.評估實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體對癌細胞活性之影響
此實施例係利用與實施例二相同的方式，評估實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(型號：ab90806；abcam plc.，U.K.)對於癌細胞活動之抑制效果，其結果如圖11A至圖14C所示。
請參閱圖11A、圖12A及圖13A，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體或與市售PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖11A)、肺癌細胞A549(圖12A)及鼻咽癌細胞HONE1(圖13A)之移行細胞數直條圖，其中圖號「＊」代表具有統計顯著性(P<0.05)
之數據，圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖11A、圖12A及圖13A之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549及鼻咽癌細胞HONE1的移行細胞數，但實施例一之PTX3單株抗體抑制或減緩癌細胞移行的效果，明顯高於市售PTX3單株抗體(ab90806)，且具有統計顯著性。
請參閱圖11B、圖12B及圖13B，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體或與市售PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖11B)、肺癌細胞A549(圖12B)及鼻咽癌細胞HONE1(圖13B)之侵襲細胞數直條圖，其中圖號「＊」代表具有統計顯著性(P<0.05)之數據，圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖11B、圖12B及圖13B之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549及鼻咽癌細胞HONE1的侵襲細胞數，但實施例一之PTX3單株抗體抑制或減緩癌細胞侵襲的效果，明顯高於市售PTX3單株抗體(ab90806)，且具有統計顯著性。
請參閱圖14A、圖14B及圖14C，其係分別繪示利用本發明實施例一之PTX3單株抗體或與市售PTX3單株抗體抑制乳癌細胞MB231(圖14A)、肺癌細胞A549(圖14B)及鼻咽癌細胞HONE1(圖14C)之細胞球團數直條圖，其中圖號「＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.01)之數據，圖號「＊＊＊」代表具有統計顯著性(P<0.001)之數據。
由圖14A、圖14B及圖14C之結果可知，相較於控制組抗體IgG1k，實施例一之PTX3單株抗體與市售PTX3單株抗體(ab90806)可顯著抑制或減緩乳癌細胞MB231、肺癌細胞A549及鼻咽癌細胞HONE1的細胞球團數，但實施例一之PTX3單株抗體抑制或減緩細胞球團數的效果，仍明顯高於市售PTX3單株抗體(ab90806)，且具有統計顯著性。
1.評估實施例一之PTX3單株抗體在活體內抑制原位異種移植之乳癌腫瘤的生長及轉移的效果
此實施例係將上述人類癌細胞株原位注射至免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪墊中，待形成腫瘤後，再施用實施例一之PTX3單株抗體，藉此評估實施例一之PTX3單株抗體抑制或減緩腫瘤之效果。
首先，將乳癌細胞MB231-Luc2〔MB231為人類乳癌細胞，不表現雌激素受體(estrogen receptor；ER)α及ERβ；Luc2為表現螢光素酶的基因〕原位接種到NOD-SCID小鼠(購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)的乳腺脂肪墊中。待腫瘤的平均體積達到80mm3後，對實驗小鼠施予實施例一之PTX3抗體(8mg/kg體重)或控制組抗體(IgG1k，8mg/kg體重)，每週施予一次，其結果如圖15A至圖15B所示。圖15B係在接種乳癌細胞MB231-Luc2後第11週活體成像結果，其中活體成像係利用市售活體動物螢光成像(in vivo bioluminescent images)系統〔例如：非侵入式3D活體分子影像系統(IVIS system)，PerkinElmer〕觀察腫瘤的大小，發光圖像處代表小鼠體內具有乳癌細胞MB231-Luc2形成的腫瘤。然後，犧牲所有小鼠，測量其體內腫瘤大小，並利用下式(I)計算腫瘤體積：V=(w×l 2)×0.52 (I)
在式(I)中，l代表腫瘤長度，w代表腫瘤寬度。
請參閱圖15A至圖15B，其係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠原位異種移植的乳癌細胞MDA-MB231之腫瘤體積(圖15A)及腫瘤轉移(圖15B)的結果。圖15A之數據係將每一時間點及每一樣品之六重複實驗數據，取其正負平均標準差而獲得，而圖號「＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性(p<0.05)。
由圖15A及圖15B的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩原位異種移植的乳癌細胞MB231的腫瘤體積及腫瘤轉移，且此項差異具有統計顯著性。
2.評估實施例一之PTX3單株抗體在活體內抑制原位同種移植之乳癌腫瘤的生長及轉移的效果
此實施例係將上述小鼠癌細胞株原位注射至免疫系統正常小鼠的乳腺脂肪墊中，待形成腫瘤並建立小鼠三陰性乳癌(tri-negative breast cancer；TNBC)模式後，再施用實施例一之PTX3單株抗體，藉此評估實施例一之PTX3單株抗體抑制腫瘤之效果。
首先，將1×106乳癌細胞4T1(4T1為小鼠乳癌細胞株，轉染含有Luc2基因的載體，表現ERβ但不表現ERα，ATCC®CRL-2539TM)作為原位同種移植物，原位接種到野生型BALB/c雌性小鼠(6~8週齡，購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)的乳腺脂肪墊中。待腫瘤的平均體積達到50mm3後，對實驗小鼠施予實施例一之PTX3抗體(10mg/kg體重)或控制組抗體(IgG1k，10mg/kg體重)，每週施予一次。利用活體動物螢光成像系統觀察腫瘤的大小與轉移。然後，犧牲所有小鼠，測量其體內腫瘤大小，並利用上式(I)計算腫瘤體積。
請參閱圖16A至圖16B，其係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠原
位原位同種移植的乳癌細胞4T1之腫瘤體積(圖16A)及腫瘤轉移(圖16B)的結果。圖16B係在接種乳癌細胞4T1後第5週活體成像結果，其中發光圖像處代表小鼠體內具有乳癌細胞4T1形成的腫瘤，且圖16A之數據係將每一時間點及每一樣品之六重複實驗數據，取其正負平均標準差而獲得，而圖號「＊＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性(p<0.01)。
由圖16A及圖16B的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可顯著抑制或減緩原位同種移植的乳癌細胞4T1的腫瘤體積及腫瘤轉移，且此項差異具有統計顯著性。
3.評估實施例一之PTX3單株抗體併用抗癌藥物在活體內抑制原位同種移植之乳癌腫瘤的生長的效果(I)
此實施例係利用與實施例六第2點相同的方式進行評估，不同之處在於，此實施例係將上述小鼠乳癌細胞株4T1原位接種至BALB/C雌性小鼠(6~8週齡，購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)的乳腺脂肪墊中。待腫瘤的平均體積達到50mm3後，施用實施例一PTX3單株抗體〔2.5mg/kg體重(亦稱為mpk)、5.0mg/kg體重或10.0mg/kg體重的PTX3 Ab，臻崴生技，台灣〕、控制組抗體(10mg/kg體重的IgG1k，型號10101，偉喬生醫，台灣)或併用紫杉醇(Taxol或稱Paclitaxel，30.0mg/kg體重)，每週一次以腹腔注射的方式投予小鼠，共投予六週。
第六週老鼠犧牲後，利用活體動物螢光成像系統觀察腫瘤的大小與轉移。
六週後，利用市售活體動物螢光成像(in vivo bioluminescent images)系統〔例如：非侵入式3D活體分子影像系統(IVIS system)，PerkinElmer〕觀察腫瘤的大小，其結果如圖17A所示，其中發光圖像處代表小鼠體內具有乳癌細胞4T1形成的腫瘤。由上述系統測量小鼠體內腫瘤大小及轉移，並根據上式(I)計算腫瘤體積，其結果如圖17B至圖17C所示。
請參閱圖17A至圖17C，其係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體在併用或未併用紫杉醇的情形下，抑制小鼠原位同種移植的乳癌細胞4T1之腫瘤體積與轉移的影像圖(圖17A)及腫瘤體積變化折線圖(圖17B至圖17C)。圖17B至圖17C之數據係將每一時間點及每一樣品之六重複實驗數據，取其正負平均標準差而獲得，其中圖號「＊＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性(p<0.01)。
由圖17A至圖17C的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體或紫杉醇可抑制或減緩原位同種移植的乳癌細胞4T1的腫瘤體積及轉移，如圖17A及圖17B所示。然而，小鼠併用PTX3單株抗體與紫杉醇後，可提升抑制或減緩原位同種移植的乳癌細胞4T1的腫瘤體積及轉移，且二者併用的效果遠超過單獨
處理效果的綜效，如圖17A及圖17C所示。以上差異皆具有統計顯著性。
4.評估實施例一之PTX3單株抗體併用抗癌藥物在活體內抑制原位同種移植之乳癌腫瘤的生長的效果(II)
此實施例係按照圖18A的實驗流程示意圖，利用與實施例六第3點相同的方式進行評估，其結果如圖18B至圖18D所示。
請參閱圖18B至圖18D，其係分別顯示根據本發明另一實施例之PTX3單株抗體在併用或未併用紫杉醇的情形下，小鼠原位同種移植的乳癌細胞4T1之腫瘤體積與轉移的影像圖(圖18B)、腫瘤體積折線圖(圖18C)及小鼠存活率(圖18D)。圖18C至圖18D之數據係將每一時間點及每一樣品之六重複實驗數據，取其正負平均標準差而獲得，其中圖號「＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性(p<0.05)，而圖號「＊＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性(p<0.01)。
由圖18B至圖18D的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體或紫杉醇可抑制或減緩原位同種移植的乳癌細胞4T1的腫瘤體積及轉移，如圖18B及圖18C所示。然而，小鼠併用PTX3單株抗體與紫杉醇後，可提升抑制或減緩原位同種移植的乳癌細胞4T1的腫瘤體積，並提升小鼠的存活率達80%以上，且
二者併用的效果遠超過單獨處理效果的綜效，如圖18D所示。以上差異皆具有統計顯著性。
5.評估實施例一之PTX3單株抗體在活體內抑制同種異體移植之大腸結腸癌腫瘤的生長的效果
此實施例係按照圖19A的實驗流程示意圖，利用與實施例六第3點相同的方式進行評估，不同之處在於，此實施例係將上述小鼠大腸癌細胞株MC38皮下(s.c.)注射至C57BL/6J雄性小鼠(6~8週齡，購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)。待MC38細胞注射第7天後，施用實施例一PTX3單株抗體〔10.0mg/kg體重的PTX3 Ab，臻崴生技，台灣〕或控制組抗體(10mg/kg體重的IgG1k，型號10101，偉喬生醫，台灣)，每週一次以腹腔(i.p.)注射的方式投予小鼠，共投予三重複。每週利用活體動物螢光成像系統觀察腫瘤的大小。第23天後，犧牲所有小鼠，測量其體內腫瘤大小，並利用上式(I)計算腫瘤體積。
請參閱圖19B，其係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠植入大腸癌細胞株MC38之腫瘤體積的結果。圖19B之數據係將每一時間點及每一樣品之四重複實驗，取其正負平均標準差而獲得，其中圖號「＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性(p<0.05)，圖號「＊＊＊」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性(p<0.001)。
由圖19B的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可抑制或減緩大腸癌細胞株MC38的腫瘤體積，且此差異具有統計顯著性。
6.評估實施例一之PTX3單株抗體在活體內抑制異種移植之神經膠母細胞瘤的生長的效果
此實施例係利用與實施例六第3點相同的方式進行評估，不同之處在於，此實施例係將上述人類神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme；GBM)細胞株U87MG皮下(s.c.)注射至NOD-SCID雄性小鼠(6~8週齡，購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)。待U87MG細胞注射第20天後，施用實施例一PTX3單株抗體〔10.0mg/kg體重的PTX3 Ab，臻崴生技，台灣〕或控制組抗體(10mg/kg體重的IgG1k，型號10101，偉喬生醫，台灣)，每週一次以腹腔(i.p.)注射的方式投予小鼠，共投予四週。20天後，測量腫瘤大小，並利用上式(I)計算腫瘤體積。
請參閱圖20A及圖20B，其係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體或控制組抗體抑制小鼠植入人類神經膠母細胞瘤細胞株U87MG之腫瘤體積折線圖(圖20A)及小鼠存活率(圖20B)。圖20A之數據係將每一時間點及每一樣品之三或四重複實驗數據，取其正負平均標準差而獲得，其中圖號「p=0.0008」則代表相較於控制組抗體(IgG1k)具有統計顯著性。
由圖20A及圖20B的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可抑制或減緩異種移植之神經膠母細胞瘤細胞U87MG的腫瘤體積(圖20A)，且可提升小鼠的存活率達75%(圖20B)。以上差異皆具有統計顯著性。
1.評估實施例一之PTX3單株抗體在活體內逆轉急性肝纖維化之肝壞死的效果
此實施例係按照圖21A的實驗流程示意圖進行，此乃根據義守大學義大醫院動物中心的指南設計。首先，對C57BL/6J雄性小鼠(8週齡，購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)肌肉注射1mL/kg體重之四氯甲烷(CCl4與橄欖油以1：1之體積比混合)。四氯甲烷引起的急性肝纖維化會在12小時內導致肝細胞凋亡(apoptosis)及壞死(necrosis)。接著，在注射四氯甲烷後的第4個小時及第28小時，以腹腔(i.p.)注射的方式對小鼠施用實施例一PTX3單株抗體〔10mg/kg體重的PTX3 Ab，臻崴生技，台灣〕或控制組抗體(10mg/kg體重的IgG1k，型號10101，偉喬生醫，台灣)。第2天犧牲所有小鼠，觀察肝組織切片變化、肝壞死區域所占比例及肝臟重/體重比，其結果如圖21B至圖21D所示。
請參閱圖21B至圖21D，其係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體在急性肝纖維化小鼠體內以蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色之左肝葉組織切片(圖21B，放大倍率：20倍，觀察肝細胞凋亡的情況)、肝壞死區域比例(圖21C)及肝臟重/體重比(圖21D)。圖21C係利用市售影像分析軟體ImageJ(W.S.Rasband,NIH,Bethesda,Maryland,USA)之自動偵測閾值的功能，測量總掃描區域中，肝壞死區域所佔的百分比。
由圖21B至圖21D的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可減緩四氯甲烷引起急性肝纖維化的細胞凋亡(圖21B)及壞死(圖21C)，且可減緩小鼠因急性肝纖維化而增加肝臟重量的程度(圖21D)。以上差異皆具有統計顯著性。
2.評估實施例一之PTX3單株抗體在活體內逆轉慢性肝纖維化之肝壞死的效果
此實施例係按照圖22A的實驗流程示意圖進行，其係利用與實施例七第1點相同方式設計。不同之處在於，此實施例是對C57BL/6J雄性小鼠(8週齡，購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)肌肉注射1mL/kg體重之四氯甲烷(CCl4與橄欖油以1：1之體積比混合)，一週注射2次，共八週。接著，在注射四氯甲烷後的第3週至第8週，以腹腔(i.p.)注射的方式對小鼠施用實施例一PTX3單株抗體〔10mg/kg體重的PTX3 Ab，臻崴生技，台灣〕
或控制組抗體(10mg/kg體重的IgG1k，型號10101，偉喬生醫，台灣)，每週一次。第8週結束，犧牲所有小鼠，觀察肝組織切片變化、肝壞死區域所占比例及肝臟重/體重比，其結果如圖22B至圖22D所示。
請參閱圖22B至圖22D，其係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體在慢性肝纖維化小鼠體內以天狼星紅(Picro-Sirius Red)染色之左肝葉組織切片(圖22B，放大倍率：20倍，觀察肝纖維化的情況)、肝纖維化區域比例(圖22C)及肝臟重/體重比(圖22D)。圖22C係利用市售影像分析軟體ImageJ(W.S.Rasband,NIH,Bethesda,Maryland,USA)之自動偵測閾值的功能，測量總掃描區域中，肝壞死區域所佔的百分比。
由圖22B至圖22D的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可減緩四氯甲烷引起的慢性肝纖維化(圖22B)及區域比例(圖22C)，且可減緩小鼠因慢性肝纖維化而增加肝臟重量的程度(圖22D)。以上差異皆具有統計顯著性。
4.評估實施例一之PTX3單株抗體對腎纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現的影響
此實施例係利用大鼠腎纖維母細胞株(NRK49F，寄存編號：BCRC 60084，ATCC® CRL-1570TM)，藉由下述試驗評估實施例一之PTX3單株抗體對腎纖維化之影響。
首先，將腎纖維母細胞株NRK49F細胞培養在杜貝可氏改良伊格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)(12800-082,Gibco)〔含10% FBS、100μg/mL的鏈黴素及100U/mL的青黴素〕中。
NRK49F細胞利用0.4μg/mL IgG1k(型號10101，偉喬生醫)、0.4μg/mL PTX3抗體(臻崴生技)處理後，再以200ng/mL PTX3處理6小時。接著，利用改良式放射免疫沉澱分析(modified radioimmunoprecipitation assay，RIPA)緩衝液〔modified RIPA buffer，含有50mM Tris-HCl(pH 7.4),150mM NaCl,1mM EDTA、1% NP-40、0.25%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)、1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、1mM苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、抑肽酶(aprotinin，1mg/ml)以及亮肽素(leupeptin，1mg/ml)〕〕溶解NRK49F細胞。之後，利用特定的抗體進行西方墨點法(western blotting)，以偵測α-微管蛋白(α-tubulin，型號T6199，Sigma)、纖維連接蛋白(Fibronectin，型號15613-1-AP，ProteinTech)之表現，並以α-微管蛋白的表現量作為注入控制(loading control)組，其結果如圖23A所示。
另外，將NRK49F細胞種入24孔細胞培養盤，利用0.4μg/mL IgG1k(型號10101，偉喬生醫)、PTX3抗體(臻崴生技)或200ng/mL PTX3處理24小時。接著，
NRK49F細胞利用甲醇固定於-20℃至隔夜。隔天，利用天狼星紅溶液(Picro-Sirius Red Solution，型號ab246832，Abcam)在室溫下染色20分鐘後，利用醋酸潤洗二次。利用光學顯微鏡在放大倍率200倍的視野下，判定細胞的結節數。然後，利用0.1N NaOH溶解這些細胞，利用市售ELISA讀取設備測量於490nm之吸光值，其結果如圖23B及圖23C所示。
請參閱圖23A至圖23C，其係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對小鼠腎纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現之西方墨點分析結果(圖23A)、細胞結節的細胞染色影像(圖23B)及其直條圖(圖23C)。圖號「＊＊＊」則代表相較於控制組具有統計顯著性(p<0.001)。
由圖23A至圖23C的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可降低腎纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現(圖23A)、減少細胞結節數(圖23B，圖23C)，且此差別具有統計顯著差異性。
5.評估實施例一之PTX3單株抗體在單側輸尿管阻塞(unilateral ureteral obstruction，UUO)動物模式中減緩腎纖維化的效果
此實施例係分別按照圖24A及圖24C的實驗流程示意圖進行評估。首先，取六至八週齡C57BL/6J品系之雄性小鼠(購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)。接著，由小鼠左側切口進行單側輸尿管阻塞
(unilateral ureteral obstruction，UUO)手術。取出左腎露出輸尿管(ureter)，並利用絲線(4-O Silk)縫合輸尿管。之後，利用手術縫合器縫合傷口。接下來，術後第0天及第7天(前處理，如圖24A及圖24B)或術後第7天(後處理，如圖24C及圖24D)，小鼠利用10mg/kg IgG1k(型號10101，偉喬生醫)、10mg/kg PTX3抗體(臻崴生技)處理，在術後第14天將小鼠安樂死。將半顆腎臟以福馬林固定，並包埋於石蠟中。組織切片以蘇木紫-伊紅(Haematoxylin Eosin，HE)或天狼星紅溶液(Picro-Sirius Red Solution，型號ab246832，Abcam)染色後，覆蓋上玻片後封片，以20倍的放大倍率觀察影像，其結果如圖24B及圖24D所示，圖中比例尺代表100μm。
請參閱圖24B及圖24D，其係分別顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對UUO小鼠之腎臟組織切片染色影像。
由圖24B及圖24D的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體確實可減緩UUO動物之腎纖維化。
6.評估實施例一之PTX3單株抗體對PTX3處理之肺纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現及移行的影響
此實施例係利用人類肺纖維母細胞株(HFL1，寄存編號：BCRC 60299，ATCC® CCL-153TM)，藉由下述試驗評估實施例一之PTX3單株抗體對肺纖維化之影響。
首先，將HFL1細胞培養在漢氏F-12K(F12K)培養基〔凱恩(Kaighn)改良〕(21127-022,Gibco)〔含10% FBS、100μg/mL的鏈黴素及100U/mL的青黴素〕中。
HFL1細胞利用0.4μg/mL IgG1k(型號10101，偉喬生醫)、0.4μg/mL PTX3抗體(臻崴生技)處理後，再以200ng/mL PTX3處理6小時。接著，利用改良式RIPA緩衝液溶解HFL1細胞。之後，利用特定的抗體進行西方墨點法(western blotting)，以偵測α-微管蛋白(α-tubulin，型號T6199，Sigma)、纖維連接蛋白(Fibronectin，型號15613-1-AP，ProteinTech)、膠原蛋白第1型(Collagen I，型號14695-1-AP，ProteinTech)以及α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle sctin，α-SMA，型號GTX 100904，GeneTex)之表現，並以α-微管蛋白的表現量作為注入控制(loading control)組，其結果如圖25A所示。
另外，將HFL1細胞種入24孔細胞培養盤〔內含孔徑8-μm的插入式培養皿(353097,BD Biosciences)〕，下層培養孔含或不含0.4μg/mL IgG1k(型號10101，偉喬生醫)、PTX3抗體(臻崴生技)或200ng/mL PTX3處理。經培養16小時後，利用棉棒刮下插入式培養皿內的細胞。貼附在插入式培養皿之聚碳酸酯薄膜下表面之總細胞數移行到插入式培養皿底部外的細胞，則利用
DAPI染色，利用螢光顯微鏡在放大倍率200倍的視野下，判定細胞數，其結果如圖25B所示。
將HFL1細胞種入24孔細胞培養盤，利用含或不含0.4μg/mL IgG1k(型號10101，偉喬生醫)、PTX3抗體(臻崴生技)或200ng/mL PTX3處理24小時。接著，HFL1細胞利用甲醇固定於-20℃至隔夜。隔天，利用天狼星紅溶液(Picro-Sirius Red Solution，型號ab246832，Abcam)在室溫下染色20分鐘後，利用醋酸潤洗二次。利用光學顯微鏡在放大倍率200倍的視野下，判定細胞的結節數。然後，利用0.1N NaOH溶解這些細胞，利用市售ELISA讀取設備測量於490nm之吸光值，其結果如圖25C及圖25D所示。
請參閱圖25A至圖25D，其係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對肺纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現之西方墨點分析結果(圖25A)、移行細胞數的直條圖(圖25B)、細胞結節的細胞染色影像(圖25C)及其直條圖(圖25D)。圖號「＊＊＊」則代表相較於控制組具有統計顯著性(p<0.001)。
由圖25A至圖25D的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可減緩PTX3處理之肺纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現、移行及細胞結節數。
7.評估實施例一之PTX3單株抗體對於IPF小鼠模式之博來黴素誘發之肺纖維化的影響(I)
此實施例係按照圖26A的實驗流程示意圖進行。首先，取六至八週齡C57BL/6J品系之雄性小鼠(購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)。小鼠透過氣管灌注(intratracheally instilled，I.T.)方式投予PBS或2mg/kg博來黴素(bleomycin，BLM，型號ap302，Znzo)誘發纖維化。誘發纖維化後，第14、21天以腹腔注射方式對小鼠投予10mg/kg IgG1k(型號10101，偉喬生醫)或10mg/kg PTX3抗體(臻崴生技)，在第28天進行安樂死。
C57BL/6小鼠在以氣管灌注方式投予博來黴素後的第7、14、21或28天，分別測量其體重，然後以腹腔注射方式投予10mg/kg IgG1k(控制組)或投予10mg/kg PTX3抗體，其結果如圖26B所示。
小鼠在安樂死後，肉眼檢視以氣管灌注方式投予PBS(即健康控制組)或2mg/kg博來黴素(即BLM)後第7、14、21或28天之小鼠肺部組織。左肺葉經灌流後，以三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並以石蠟包埋。組織切片以HE染色後，覆蓋上玻片後封片，以20倍的放大倍率觀察影像，其結果如圖26C所示，圖中比例尺代表100μm。
小鼠在安樂死後，肉眼檢視以博來黴素誘導纖維化後並投予10mg/kg IgG1k或10mg/kg PTX3抗體第28天之小鼠肺部組織。左肺葉經灌流後，以三聚甲醛
(paraformaldehyde)固定，並以石蠟包埋。組織切片以HE染色後，覆蓋上玻片後封片，以20倍的放大倍率觀察影像，其結果如圖26D所示，圖中比例尺代表100μm。
請參閱圖26B至圖26D，其係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對BLM誘發肺纖維化小鼠之體重變化曲線圖(圖26B)、肺部外觀及組織切片影像(圖26C及圖26D)。
由圖26B至圖26D的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體在誘發肺纖維化小鼠中，可逆轉因肺纖維化導致之體重減輕及肺纖維化的程度。
8.評估實施例一之PTX3單株抗體對於IPF小鼠模式之博來黴素誘發之肺纖維化的影響(II)
此實施例係按照圖27A的實驗流程示意圖進行。首先，取六至八週齡C57BL/6J品系之雄性小鼠(購自於樂斯科生物科技股份有限公司，台灣)。小鼠透過氣管灌注(intratracheally instilled，I.T.)方式投予PBS或2mg/kg博來黴素(bleomycin，BLM，型號ap302，Znzo)誘發纖維化。誘發纖維化後，第21天以腹腔注射方式對小鼠投予10mg/kg IgG1k(型號10101，偉喬生醫)或10mg/kg PTX3抗體(臻崴生技)，在第28天進行安樂死。
C57BL/6小鼠在以氣管灌注方式投予博來黴素後的第7、14、21或28天，分別測量其體重，然後在第
21天以腹腔注射方式投予10mg/kg IgG1k(控制組)或投予10mg/kg PTX3抗體，其結果如圖27B所示。
小鼠在安樂死後，肉眼檢視以氣管灌注方式投予PBS(即健康控制組)或2mg/kg博來黴素(即BLM)後第7、14、21或28天之小鼠肺部組織。左肺葉經灌流後，以三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並以石蠟包埋。組織切片以HE染色後，覆蓋上玻片後封片，以20倍的放大倍率觀察影像，其結果如圖27C所示，圖中比例尺代表100μm。
小鼠在安樂死後，肉眼檢視以博來黴素誘導纖維化後並投予10mg/kg IgG1k或10mg/kg PTX3抗體第28天之小鼠肺部組織。左肺葉經灌流後，以三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並以石蠟包埋。組織切片以HE染色後，覆蓋上玻片後封片，以20倍的放大倍率觀察影像，其結果如圖27D所示，圖中比例尺代表100μm。
請參閱圖27B至圖27D，其係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對BLM誘發肺纖維化小鼠之體重變化曲線圖(圖27B)、肺部外觀及組織切片影像(圖27C及圖27D)。
由圖27B至圖27D的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體在誘發肺纖維化小鼠中，可逆轉因肺纖維化導致之體重減輕及肺纖維化的程度。
9.評估實施例一之PTX3單株抗體對NIH-3T3胚胎纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現的影響
此實施例係利用小鼠胚胎纖維母細胞株(NIH-3T3，寄存編號：BCRC 60008，ATCC® CCL-1658TM)，藉由下述試驗評估實施例一之PTX3單株抗體對纖維化之影響。
首先，將NIH-3T3細胞培養在DMEM(12800-082,Gibco)〔含10% FBS、100μg/mL的鏈黴素及100U/mL的青黴素〕中。
NIH-3T3細胞利用0.4μg/mL PTX3抗體(臻崴生技)處理後，利用200ng/mL PTX3處理6小時。接著，利用RIPA緩衝液溶解細胞。之後，利用特定的抗體進行西方墨點法(western blotting)，以偵測α-微管蛋白(α-tubulin，型號T6199，Sigma)、膠原蛋白第1型(Collagen I，型號14695-1-AP，ProteinTech)以及α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle sctin，α-SMA，型號GTX 100904，GeneTex)之表現，並以α-微管蛋白的表現量作為注入控制(loading control)組，其結果如圖28A所示。
另外，將NIH-3T3細胞種入24孔細胞培養盤，以含或不含0.4μg/mL IgG1k(型號10101，偉喬生醫)、PTX3抗體(臻崴生技)或200ng/mL PTX3處理24小時。之後，NIH-3T3細胞利用甲醇固定於-20℃至隔夜。隔天，利用天狼星紅溶液(Picro-Sirius Red Solution，型
號ab246832，Abcam)在室溫下染色20分鐘後，利用醋酸潤洗二次。利用光學顯微鏡在放大倍率200倍的視野下，判定細胞的結節數。然後，利用0.1N NaOH溶解這些細胞，利用市售ELISA讀取設備測量於490nm之吸光值，其結果如圖28B及圖28C所示。
請參閱圖28A至圖28C，其係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對胚胎纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現之西方墨點分析結果(圖28A)、細胞結節的細胞染色影像(圖28B)及其直條圖(圖28C)。圖號「＊＊＊」則代表相較於控制組具有統計顯著性(p<0.001)。
由圖28A至圖28C的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可減緩NIH-3T3細胞之纖維化相關蛋白表現及細胞結節數。
10.評估實施例一之PTX3單株抗體對F28肝纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現的影響
首先，將人類癌症相關纖維母細胞/肝細胞〔cancer associated fibroblast/F28(CAF/F28)cells〕培養在DMEM(12800-082,Gibco)〔含10% FBS、100μg/mL的鏈黴素及100U/mL的青黴素〕中。
CAF/F28細胞暴露在放射劑量8格雷(Gray，Gy)後，利用0.4μg/ml PTX3抗體(臻崴生技)處理6小時。接著，利用改良式放射免疫沉澱分析(modified radioimmunoprecipitation assay，RIPA)緩衝液
〔modified RIPA buffer，含有50mM Tris-HCl(pH 7.4),150mM NaCl,1mM EDTA、1% NP-40、0.25%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)、1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、1mM苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、抑肽酶(aprotinin，1mg/ml)以及亮肽素(leupeptin，1mg/ml)]〕溶解細胞。之後，利用特定的抗體進行西方墨點法(western blotting)，以偵測α-微管蛋白(α-tubulin，型號T6199，Sigma)、纖維連接蛋白(Fibronectin，型號15613-1-AP，ProteinTech)、膠原蛋白第1型(Collagen I，型號14695-1-AP，ProteinTech)以及α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle sctin，α-SMA，型號GTX 100904，GeneTex)之表現，並以α-微管蛋白的表現量作為注入控制(loading control)組，其結果如圖29A所示。
另外，CAF/F28細胞利用0.4μg/mL PTX3抗體(臻崴生技)處理後，利用200ng/mL PTX3處理6小時。接著，利用RIPA緩衝液溶解細胞。之後，利用特定的抗體進行西方墨點法(western blotting)，以偵測α-微管蛋白(α-tubulin，型號T6199，Sigma)、纖維連接蛋白(Fibronectin，型號15613-1-AP，ProteinTech)、膠原蛋白第1型(Collagen I，型號14695-1-AP，ProteinTech)以及α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle sctin，α-SMA，型號GTX 100904，GeneTex)之表現，並以α-微管蛋白
的表現量作為注入控制(loading control)組，其結果如圖29B所示。
請參閱圖29A至圖29B，其係顯示根據本發明一實施例之PTX3單株抗體對不同處理之肝纖維母細胞之纖維化相關蛋白表現之西方墨點分析結果。
由圖29A至圖29B的結果可知，相較於控制組抗體(IgG1k)，實施例一之PTX3單株抗體可減緩CAF/F28肝纖維母細胞因照射放射線或PTX3引起之纖維化相關蛋白表現。
上述小鼠實驗係根據國立成功大學實驗動物照護及使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)進行，且相關動物的使用方案已經過實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的審查及核准。
補充說明的是，本發明實施例一之PTX3單株抗體對PTX3重組蛋白具有良好的親和力及靈敏度，可應用於檢測PTX3之套組及方法，以於體外檢測生物樣本中的PTX3含量。關於適用的生物樣本、適用於檢測PTX3之方法、套組、元件/設備等悉如前述，不另贅言。其次，本發明之含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途，其利用親和力及靈敏度較高的PTX3單株抗體或其抗原結合片段作為有效成分，藉由有效抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合，進而抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀，可作為跨疾病廣效藥。
綜言之，本發明雖以特定序列的PTX3單株抗體、特定的分析模式或特定的評估方式作為例示，說明本發明之含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途，亦可使用其他的分析模式或其他的評估方式進行。
由上述實施例可知，本發明之含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途，其優點在於利用特定的PTX3單株抗體或其抗原結合片段作為有效成分，專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體之結合，可應用於檢測PTX3之套組及方法，以及抑制或減緩與PTX3與PTX3受體結合相關的疾病或症狀。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 臻崴生物科技有限公司
<120> 含單株抗體或其抗原結合片段之醫藥組成物及其用途
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<221> CDS
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<400> 41
Claims (51)
- 一種單株抗體或其抗原結合片段，其特徵在於該單株抗體或其抗原結合片段係專一性結合一非變性胺基酸序列，該非變性胺基酸序列係選自於由如序列辨識編號(SEQ ID NO：)1至SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列所組成之一族群，且該單株抗體或其抗原結合片段包括：一重鏈可變區序列，具有如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20及/或SEQ ID NO：21所列之胺基酸序列；以及一輕鏈可變區序列，具有如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及/或SEQ ID NO：25所列之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該非變性胺基酸序列係選自於由如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列所組成之一族群。
- 根據申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該非變性胺基酸序列係選自於由如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列所組成之一族群。
- 根據申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該非變性胺基酸序列為如SEQ ID NO：2所列之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該非變性胺基酸序列為如SEQ ID NO：3所列之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該非變性胺基酸序列為如SEQ ID NO：4所列之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該非變性胺基酸序列為如SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列。
- 一種單株抗體或其抗原結合片段，包括：一重鏈可變區序列，具有如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：29所列之核酸序列編碼之核酸序列；以及一輕鏈可變區序列，具有如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及/或SEQ ID NO：33所列之核酸序列編碼之核酸序列。
- 一種單株抗體或其抗原結合片段，包括：一重鏈可變區序列，具有如SEQ ID NOs：34或35所列之胺基酸序列；以及一輕鏈可變區序列，具有如SEQ ID NOs：36或37所列之胺基酸序列。
- 一種單株抗體或其抗原結合片段，包括：一重鏈可變區序列，具有如SEQ ID NOs：38或39所列之核酸序列編碼之核酸序列；以及一輕鏈可變區序列，具有如SEQ ID NOs：40或41所列之核酸序列編碼之核酸序列。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一 項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其抗原結合片段。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體或其抗原結合片段。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為單鏈可變區片段(single-chain variable fragment；scFv)、單鏈可變區片段二聚體〔(scFv)2〕、單鏈可變區片段三聚體〔(scFv)3〕、可變區片段(variable fragment；Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、奈米抗體(nanobody)或上述之任意組合。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段係經由複合(conjugation)或結合、醣化、標籤附接(tag attachment)或上述任意組合予以修飾。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段為抗體藥物複合體(antibody-drug conjugate；ADC)或其抗原結合片段。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段為雙功能單株抗體(bispecific monoclonal antibody；BsAb)或其抗原結合片段。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段為三功能單株抗體(trifunctional monoclonal antibody)或其抗原結合片段。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段屬於IgG類別、IgM類別、IgA類別、IgD類別或IgE類別。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段屬於IgG類別且具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段具有IgG1同型。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段屬於惰性抗體。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段屬於拮抗劑抗體。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段係專一性抑制或減緩正五聚蛋白相關蛋白(pentraxin-related protein；PTX3)受體與一或多種 PTX3的一C端特定序列之結合。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段係專一性抑制或減緩一或多種PTX3之活性。
- 根據申請專利範圍第1項至第10項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段係專一性抑制或減緩PTX3受體與一或多種PTX3之交互作用、抑制或減緩PTX3訊息傳遞或上述之任意組合。
- 一種檢測PTX3之套組，包含如申請專利範圍第1項至第25項任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段係專一性結合一非變性胺基酸序列，且該非變性胺基酸序列係選自於由如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列所組成之一族群。
- 根據申請專利範圍第26項所述之檢測PTX3之套組，其中該單株抗體或其抗原結合片段係專一性結合一非變性胺基酸序列，且該非變性胺基酸序列係選自於由如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列所組成之一族群。
- 根據申請專利範圍第26項所述之檢測PTX3之套組，其中該單株抗體或其抗原結合片段係專一性結合一非變性胺基酸序列，且該非變性胺基酸序列係選自於由如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列所組成之一族群。
- 根據申請專利範圍第26項所述之檢測PTX3之套組，其中該非變性胺基酸序列為如SEQ ID NO：2所列之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第26項所述之檢測PTX3之套組，其中該非變性胺基酸序列為如SEQ ID NO：3所列之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第26項所述之檢測PTX3之套組，其中該非變性胺基酸序列為如SEQ ID NO：4所列之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第26項所述之檢測PTX3之套組，其中該非變性胺基酸序列為如SEQ ID NO：11所列之胺基酸序列。
- 一種體外檢測PTX3之方法，其係利用如申請專利範圍第26項至第32項任一項所述之檢測PTX3之套組檢測PTX3，其中該檢測PTX3之套組所含之單株抗體或其抗原結合片段之一分析靈敏度不低於0.0016 pM。
- 一種醫藥組成物，包含具有一有效劑量之一單株抗體或其抗原結合片段及一醫藥學上可接受之載劑，其係以如第1項至第10項任一項所述之該單株抗體或其抗原結合片段作為一有效成分。
- 根據申請專利範圍第34項所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物更包含一活性藥物成分。
- 根據申請專利範圍第34項所述之醫藥組 成物，其中該有效劑量為每公斤體重2mg至10mg。
- 根據申請專利範圍第34項所述之醫藥組成物，其中該有效劑量為5mg/kg體重至10mg/kg體重。
- 根據申請專利範圍第34項所述之醫藥組成物，其中該有效劑量為6mg/kg體重至9mg/kg體重。
- 一種單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩正五聚蛋白相關蛋白(PTX3)與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該醫藥組成物為如申請專利範圍第34項至第38項任一項所述，且該單株抗體或其抗原結合片段具有一有效劑量，以抑制或減緩與該PTX3與PTX3受體結合相關的一疾病或一症狀。
- 根據申請專利範圍第39項所述之單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該疾病或該症狀包括上皮細胞癌、腺癌、神經膠母細胞瘤(glioblastoma multiforme；GBM)及纖維化。
- 根據申請專利範圍第40項所述之單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該上皮細胞癌包括肺癌、乳癌、鼻咽癌。
- 根據申請專利範圍第40項所述之單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該腺癌包括大腸癌。
- 根據申請專利範圍第40項所述之單株抗 體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中受該纖維化之該疾病或該症狀影響之一器官係選自於由肺、肝、腎及皮膚所組成之一族群。
- 根據申請專利範圍第40項所述之單株抗體或其抗原結合片段用於製備專一性抑制或減緩PTX3與PTX3受體結合之醫藥組成物之用途，其中該醫藥組成物係經由皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射、原位注射(orthotopic injection)、經口投予或口鼻吸入之方式投予。
- 一種用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，包括對一腫瘤細胞投予一有效劑量之如申請專利範圍第34項至第38項任一項所述的醫藥組成物，藉此抑制或減緩該腫瘤細胞之一活性。
- 根據申請專利範圍第45項所述之用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，其中該腫瘤細胞之一來源包括神經膠母細胞瘤、上皮細胞癌及腺癌。
- 根據申請專利範圍第46項所述之用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，其中該上皮細胞癌包括肺癌、乳癌及鼻咽癌。
- 根據申請專利範圍第46項所述之用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，其中該腺癌包括大腸癌。
- 根據申請專利範圍第45項所述之用於體外抑制或減緩腫瘤細胞之活性的方法，其中該活性包含增 生(proliferation)、癌幹原細胞性(cancer stemness)、移行(migration)、侵襲(invasiveness)、轉移(metastasis)、腫瘤體積或抗藥性(drug resistance)。
- 一種用於體外抑制或減緩纖維化疾病及/或纖維化症狀的方法，包括對受該纖維化疾病及/或該纖維化症狀影響之一器官投予一有效劑量之如申請專利範圍第34項至第38項任一項所述的醫藥組成物，藉此抑制或減緩該器官之該纖維化疾病及/或該纖維化症狀。
- 根據申請專利範圍第50項所述之用於體外抑制或減緩纖維化疾病及/或纖維化症狀的方法，其中該器官係選自於由肺、肝、腎及皮膚所組成之一族群。
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