5.发明概述
提供了用于通过施用治疗有效量的包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物,治疗需要治疗胃泌素原敏感型乳腺癌的患者的方法。在一些实施方案中,乳腺癌是转移的并且已经扩散至骨、肺、肝脏或脑。在其他实施方案中,乳腺癌是原发性乳腺癌。在许多的实施方案中,组合物的抗体有效减少胃泌素原敏感的乳腺癌细胞的增殖或增加其细胞死亡的速率、减少乳腺癌转移灶的平均数目或大小、或者降低治疗的患者中胃泌素原的血液浓度。
在一些实施方案中,组合物可以在施用有效治疗乳腺癌的手术或辐射疗法之前或之后或在施用有效治疗乳腺癌的化疗剂或激素治疗剂之前、与其同时或在其之后施用。组合物也可以在有效对抗乳腺癌的具有除胃泌素原之外的特异性的第二治疗性抗体之前、同时或在其之后施用。在这些实施方案的某些中,第二抗体具有针对VEGF或HER2的特异性并且可以是贝伐单抗、曲妥珠单抗和培妥珠单抗。
还提供了通过以下方式阻止胃泌素原敏感型乳腺癌的方法:以有效阻止胃泌素原敏感型乳腺癌的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要阻止胃泌素原敏感型乳腺癌的患者。乳腺癌可以是原发性或转移性的。在其他实施方案中,乳腺癌细胞含有在BRCA1或BRCA2基因中的突变。
在许多的实施方案中,组合物的抗体有效减少胃泌素原敏感的乳腺癌细胞的增殖或增加其细胞死亡的速率或者降低治疗的患者中胃泌素原的血液浓度。
在一些实施方案中,组合物可以与施用有效阻止胃泌素原敏感型乳腺癌的化疗剂或激素治疗剂同时或之后施用。组合物也可以与有效阻止胃泌素原敏感型乳腺癌的具有除胃泌素原之外的特异性(如针对HER2)的第二治疗性抗体同时或在其之后施用。
还提供了通过以下方式阻止胃泌素原敏感型乳腺癌复发的方法:以有效阻止胃泌素原敏感型乳腺癌复发的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要阻止胃泌素原敏感型乳腺癌复发的患者。在这些方法的某些方法中,患者先前接受乳腺癌疗法如手术、辐射疗法、生物疗法、免疫疗法、激素疗法和化疗,此后乳腺癌明显消失。
在许多的实施方案中,组合物的抗体有效减少胃泌素原敏感的乳腺癌细胞的增殖或增加其细胞死亡的速率或者降低治疗的患者中胃泌素原的血液浓度。在其他实施方案中,组合物可以与有效阻止胃泌素原敏感型乳腺癌的第二治疗剂(包括例如具有除胃泌素原之外的特异性的抗体)同时或在其之后施用。
还提供了用于在患者中通过以下方式抑制胃泌素原敏感型乳腺癌干细胞生长的方法:以有效抑制胃泌素原敏感型乳腺癌干细胞的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要抑制所述胃泌素原敏感型乳腺癌干细胞的患者。
在许多的实施方案中,组合物的抗体有效减少胃泌素原敏感的乳腺癌干细胞的增殖或增加其细胞死亡的速率或者降低治疗的患者中胃泌素原的血液浓度。在其他实施方案中,组合物可以与有效抑制胃泌素原敏感型乳腺癌干细胞生长的第二治疗剂(例如,具有除胃泌素原之外的特异性的抗体)同时或在其之后施用。
还提供了用于通过以下方式监测胃泌素原敏感型乳腺癌疗法(如化疗、生物疗法、免疫疗法或抗体疗法)在患者中功效的方法:确定胃泌素原在从乳腺癌治疗之后的患者所获得的第一样品(如体液或乳腺的活组织检查样品)中的浓度,并且随后将胃泌素原在所述第一样品中的浓度与胃泌素原在从相同患者所获得的第二样品中的浓度比较,其中与所述第一样品相比,所述第二样品中胃泌素原浓度的降低表示治疗是有效的。
在这种方法的一些实施方案中,在患者因乳腺癌而治疗之前或在治疗后,但是在获得第一样品之前获得第二样品。在其他实施方案中,使用了利用对胃泌素原特异的抗体的测定法(如RIA或ELISA)以确定第一样品中胃泌素原的浓度。
还提供了通过以下方式诊断乳腺癌在患者中存在的方法:确定从疑似患有乳腺癌的患者获得的样品(如体液)中胃泌素原的浓度,并且随后将所述样品中胃泌素原的浓度与预定值比较,其中与预定值相比,样品中升高的胃泌素原水平表示乳腺癌在患者中存在。在一些实施方案中,预定值基于已知患者无乳腺癌时所获得的样品值的平均数,并且在其他实施方案中,预定值基于群体平均数。
在本方法的一些实施方案中,患者先前治疗过乳腺癌并且在获得样品时处于缓解状态。在其他实施方案中,该方法包括对患者进行第二诊断试验以证实乳腺癌存在的额外步骤,所述第二诊断试验包括例如,血液检查、医学成像检查或基因测试。在一些实施方案中,医学成像检查是乳房X射线照片,并且在其他实施方案中,基因测试是BRCA1或BRCA2基因中的突变。在又一些实施方案中,使用了利用对胃泌素原特异的抗体的测定法(如RIA或ELISA)以确定样品中胃泌素原的浓度。
用于上述方法中的抗体组合物可以通过众多不同的途径(如静脉内)和不同方法(过输注法或通过快速浓注(bolus)法)施用。抗体剂量可以根据待治疗的受试者的体质和需要在宽阔范围内变化。剂量可以按一个次数或以多个间隔的次数施用。
不同类型的抗hPG抗体可以用于所述方法中,包括例如多克隆抗体;单克隆抗体(其可以经过人源化);以及嵌合抗体、具有IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM同种型的抗体、和单链抗体。在一些其他实施方案中,抗体与部分缀合,其中所述的部分有用地改变抗体的功能或特征,例如增加血清半寿期。在另外的实施方案中,可以为相似目的或其它目的实施氨基酸变化。针对胃泌素原的抗体亲和力可以广泛地变动,只要维持治疗性功效即可。在一些实施方案中,抗体仅识别胃泌素原的一个表位。在其他实施方案中,可以使用对胃泌素原的不同表位特异的抗体的混合物。
还提供了促进施用抗胃泌素原抗体组合物至患者的试剂盒。在一些实施方案中,试剂盒包括处于冻干形成或作为水溶液的抗胃泌素原抗体、稀释剂如药物级水或缓冲液、和用于施用抗胃泌素原抗体的装置,如注射器和针头。在其他实施方案中,试剂盒可以额外地包括第二治疗剂,如但不限于本公开的化疗剂或其他。
用于治疗转移性结肠直肠癌的方法中的抗体可以具有针对胃泌素原的结合亲和力范围,例如,约5000nM或甚至更高,例如,至少约4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。
在所公开的方法的某些实施方案中,可以使用如本文中公开的单克隆抗体,包括例如MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、MAb20、MAb21、MAb22、MAb23或其他。
在所公开的方法的其他实施方案中,可以使用如本文中公开的单克隆抗体,包括例如,单克隆抗体具有其中第一CDR选自VHCDR1.3、VHCDR1.4、VHCDR1.8、VHCDR1.13、VHCDR1.16、VHCDR1.19,第二CDR选自VHCDR2.3、VHCDR2.4、VHCDR2.8、VHCDR2.13、VHCDR2.16、VHCDR2.19并且第三CDR选自VHCDR3.3、VHCDR3.4、VHCDR3.8、VHCDR3.13、VHCDR3.16、VHCDR3.19的重链可变区(VH)。下文描述这些CDR的具体序列。其他的有用抗体具有其中第一CDR选自VLCDR1.3、VLCDR1.4、VLCDR1.8、VLCDR1.13、VLCDR1.16、VLCDR1.19,第二CDR选自VLCDR2.3、VLCDR2.4、VLCDR2.8、VLCDR2.13、VLCDR2.16、VLCDR2.19并且第三CDR选自VLCDR3.3、VLCDR3.4、VLCDR3.8、VLCDR3.13、VLCDR3.16、VLCDR3.19的轻链区域(VL)。还在下文描述这些CDR的具体序列。
6.附图简述
图1提供了相对于SW480细胞比较3个人转移性乳腺癌细胞系当中胃泌素基因表达水平的图。
图2提供了比较来自不同患者的原发性乳腺肿瘤中相对胃泌素基因表达水平的图。
图3提供了比较来自不同患者的转移性乳腺肿瘤中相对胃泌素基因表达水平的图。
图4提供了图,其显示与健康对照相比,转移性乳腺癌患者中的血液胃泌素原浓度,其中所述患者切除了原发性肿瘤。
图5提供了图,其比较了对照和抗hPG多克隆抗体对培养的MDA-MB-231转移性乳腺癌细胞生长的影响。
图6提供了图,其比较了对照和抗hPG单克隆抗体MAb3和MAb8对培养的MDA-MB-231转移性乳腺癌细胞生长的影响。
图7提供了图,其比较了对照和抗hPG单克隆抗体MAb8、MAb13、MAb16和MAb19和MAb8对培养的MDA-MB-231转移性乳腺癌细胞生长的影响。
图8提供了图,其比较了对照和抗hPG单克隆抗体对培养的MCF-7转移性乳腺癌细胞生长的影响。
图9提供了图,其比较了对照和抗hPG单克隆抗体对培养的T47D转移性乳腺癌细胞生长的影响。
图10提供了图,其比较了在正常组织培养条件下和在低黏附培养条件下两个不同的转移性乳腺癌细胞系生长相关的胃泌素基因表达的相对量。
图11提供了图,其比较了对照和抗hPG单克隆抗体MAb8对低黏附培养条件下MCF-7转移性乳腺癌细胞生长为球状体的影响。
图12提供了图,其比较了对照和抗hPG单克隆抗体MAb3对低黏附培养条件下MCF-7转移性乳腺癌细胞生长为球状体的影响。
图13提供其中信号肽序列加下划线的人前胃泌素原(SEQIDNO:100)、人成熟胃泌素原(SEQIDNO:101)和胃泌素原加工的某些产物(包括G34(SEQIDNO:102)、G34-Gly(SEQIDNO:103)、G17(SEQIDNO:104)、G17-Gly(SEQIDNO:105)和CTFP(SEQIDNO:106))的氨基酸序列。
图14提供某些示例性鼠抗hPG单克隆抗体的可变轻链和可变重链的多核苷酸序列和氨基酸序列。在每种情况下,3个CDR以粗体加下划线的字体显示。具体而言:
图14A提供鼠抗hPGMAb3的VH链的多肽序列(SEQIDNO:12)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:16);
图14B提供鼠抗hPGMAb3的VL链的多肽序列(SEQIDNO:13)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:17);
图14C提供鼠抗hPGMAb4的VH链的多肽序列(SEQIDNO:14)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:18);
图14D提供鼠抗hPGMAb4的VL链的多肽序列(SEQIDNO:15)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:19);
图14E提供鼠抗hPGMAb8的VH链的多肽序列(SEQIDNO:59)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:67);
图14F提供鼠抗hPGMAb8的VL链的多肽序列(SEQIDNO:63)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:71);
图14G提供鼠抗hPGMAb13的VH链的多肽序列(SEQIDNO:60)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:68);
图14H提供鼠抗hPGMAb13的VL链的多肽序列(SEQIDNO:64)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:72);
图14I提供鼠抗hPGMAb16的VH链的多肽序列(SEQIDNO:61)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:69);
图14J提供鼠抗hPGMAb16的VL链的多肽序列(SEQIDNO:65)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:73);
图14K提供鼠抗hPGMAb19的VH链的多肽序列(SEQIDNO:62)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:70);和
图14L提供鼠抗hPGMAb19的VL链的多肽序列(SEQIDNO:66)和编码它的多核苷酸序列(SEQIDNO:74)。
图15提供了本文所述选择的抗hPG单克隆抗体的人源化可变重链和轻链的突出(projected)多肽序列。在每种情况下,3个CDR以粗体加下划线的字体显示。具体而言:
图15A提供人源化MAb3的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:21);
图15B提供人源化MAb3的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:22);
图15C提供人源化MAb4的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:23);
图15D提供人源化MAb4的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:24);
图15E提供人源化MAb8(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:75);
图15F提供人源化MAb8(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:76);
图15G提供人源化MAb8(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:77);
图15H提供人源化MAb8(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:78);
图15I提供人源化MAb8(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:79);
图15J提供人源化MAb8(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:76);
图15K提供人源化MAb13(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:80);
图15L提供人源化MAb13(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:81);
图15M提供人源化MAb13(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:82);
图15N提供人源化MAb13(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:83);
图15O提供人源化MAb16(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:84);
图15P提供人源化MAb16(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:85);
图15Q提供人源化MAb16(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:86);
图15R提供人源化MAb16(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:87);
图15S提供人源化MAb16(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:88);
图15T提供人源化MAb16(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:89);
图15U提供人源化MAb19(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:90);
图15V提供人源化MAb19(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:91);
图15W提供人源化MAb19(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:92);
图15X提供人源化MAb19(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:93);
图15Y提供人源化MAb19(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:94);和
图15Z提供人源化MAb19(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQIDNO:95)。
7.具体实施方案
7.1乳腺癌
女性乳腺的大部分癌症始于内衬于导管的细胞,所述导管起到传送来自产乳腺体或小叶的乳汁作用。此类乳腺癌称作导管癌。其他乳腺癌始于内衬于小叶的细胞,称作小叶癌。少数乳腺癌始于构成乳腺的其他组织,包括间质(其为包围导管和小叶的脂肪和结缔组织)、淋巴管和血管。
几乎全部乳腺癌是始自内衬于导管或小叶的上皮细胞的癌。此类癌症分别称作导管癌和小叶癌。乳腺癌也可以作为肉瘤开始,所述肉瘤在乳腺的结缔组织(包括肌肉、脂肪或血管)中形成。
特定类型的乳腺癌包括,但是不必然限于原位导管癌、原位小叶癌、侵入型(或浸润型)导管癌、侵入型(或浸润型)小叶癌。较少常见类型的乳腺癌包括炎性乳腺癌、三阴性乳腺癌、混合瘤、髓样癌、化生性癌、粘液癌、乳头帕哲病、小管癌、乳头状癌、腺样囊性癌(囊性腺样癌)、叶状肿瘤和血管肉瘤。
7.2乳腺癌转移
转移指癌症扩散的过程。简而言之,肿瘤细胞离开原发性肿瘤,经血液循环或淋巴液系统行进至新组织部位并且形成继发性肿瘤。在新组织部位的肿瘤称作转移性肿瘤,并且一般地鉴定原发性肿瘤的来源。例如,已经扩散至其他组织的乳腺癌称作“转移性乳腺癌”,无论继发性、转移性肿瘤的组织位置在哪里。乳腺癌转移到达的最常见器官是骨、肺、肝或脑,但是乳腺癌也可以扩散至其他器官。
癌细胞经常扩散至原发性肿瘤附近的淋巴结,这称作淋巴结累及或区域性疾病。
不希望受任何具体操作理论约束,认为转移经由众多不同的步骤进行:侵入和移行、进入血管、循环、外渗和定居、增殖和血管生成。在侵入和移行期间,各个细胞自身从原发性肿瘤脱离并侵入相邻的健康组织。为实现这一点,癌细胞必须变得能动,并且推定经历表型转化,称作上皮至间质转变,后者促进这一点。Kalluri,R.,等,J.Clin.Invest.,119(6)(2009),1420-28。此类细胞可以产生降解胞外基质的酶,从而促进从原发性肿瘤移行出来并进入周围健康组织。在癌细胞遇到血管或淋巴管时,它将自身插入内衬脉管的内皮细胞之间并且渗入血流或淋巴系统中。异常细胞随后经循环系统或淋巴系统行至新的器官或行至淋巴结。癌细胞随后可以寄宿在器官如肝脏、肺或其他组织或器官的毛细血管或淋巴管中,并且随后通过渗透内皮而外渗至组织间隙中。最后,在定居、增殖和血管生成期间,肿瘤细胞在它们的新宿主组织中占据居所并且开始生长。当新的转移性肿瘤达到足够尺寸时,它可以分泌生长因子,如VEGF,以刺激新血管生长至肿瘤中,从而供应氧和营养给快速生长的肿瘤。
7.3乳腺癌复发
乳腺癌复发定义为乳腺癌在明显导致乳腺癌消失的治疗后回复。如果回复的乳腺癌处于原始癌的相同位置或与它十分接近(例如,在相同的乳房中或在乳房切除术瘢痕附近),则将它称作本地复发。存在于对侧乳房的癌症不是复发并且视为新癌症。当回复的乳腺癌在原始癌的位置附近的淋巴结或组织中生长时,将它称作区域性复发,并且当回复的乳腺转移至远离原始癌位置的器官或组织时,将它称作远端复发。
7.4癌干细胞和乳腺癌
实体肿瘤不必然是均质组织。相反地,一些肿瘤包含具有不同表型特性和功能特性的多种异常细胞类型。在这个方面,此类肿瘤类似于异常器官。构成实体肿瘤的细胞之间的一个重要差异是它们能够在移植至相同宿主中的新位点或移植至相同或不同物种的新宿主时启动新肿瘤形成的程度。具有这种特性的细胞称作启动肿瘤或癌症的细胞,或备选地,肿瘤干细胞或癌干细胞。相反地,构成肿瘤的其他细胞具有相当程度地降低的移植后启动新肿瘤的潜力,甚至当使用更多细胞时也是如此。在一个非限制性实例中,与缺少干细胞表型的相同细胞系细胞相比,少100倍的源自具有癌干细胞表型的乳腺癌细胞系的细胞能够在小鼠中形成新肿瘤。Gupta,P.B.,等,“Identificationofselectiveinhibitorsofcancerstemcellsbyhigh-throughputscreening(高通量筛选鉴定癌干细胞的选择性抑制剂),”Cell,13864-659(2009)。还见Filmore,C.M.和C.Kuperwasser,“Humanbreastcancercelllinescontainstem-likecellsthatself-renew,giverisetophenotypicallydiverseprogenyandsurvivechemotherapy(人乳腺癌细胞系含有自我更新、产生表型多样性子代和幸免于化疗的类干细胞),”Br.CancerRes.,10:R25(2008)。
在许多肿瘤中,癌干细胞包含在肿瘤内部相对小比例的完全活的细胞。相反地,在移植时,构成肿瘤主体的大部分肿瘤细胞不能启动新肿瘤。然而,在一些肿瘤中,癌干细胞可以构成肿瘤的大部分或甚至全部细胞。如本文所用,主体肿瘤细胞指移植时不能启动新肿瘤的肿瘤细胞,除非使用大量的此类细胞。癌干细胞还具有与主体肿瘤细胞不同的表型特征,包括自我更新和移植相对小数目的癌干细胞后形成新肿瘤的能力,和通过荧光激活细胞分选法(FACS)或其他测定法可检测的不同标志物的表达。癌干细胞与主体肿瘤细胞之间的其他差异也是可能的。
不希望受任何具体操作理论约束,认为癌干细胞与正常干细胞共享某些特性,所述特性在癌干细胞的背景下有助于它们产生肿瘤的能力。具体而言,癌干细胞经历非对称性细胞分裂以产生两个类型的子细胞。第一类细胞保持非分化并且保留其亲本能够无限自我更新的干细胞特征。另一类子细胞,称作祖先细胞,能够分裂和分化,虽然是异常的,以产生许多实体肿瘤存在的一系列更为分化的细胞。祖先细胞以高于干细胞的速率增殖并且因而对肿瘤的物理生长有贡献,而干细胞通过产生新的祖先细胞负责肿瘤无限生长的能力。
这些特性允许癌干细胞最终产生构成正在生长的肿瘤的巨大数目的细胞。因而,移植入新动物时,癌干细胞可以重构它们从中发源的肿瘤类型,甚至在多次连续移植后也是如此。然而,不同于正常干细胞,癌干细胞携带可以导致增殖模式改变和/或低凋亡率以及导致异常分化的遗传突变和/或后生遗传变化,所述异常分化引起可以构成肿瘤主体的异常细胞积累。
癌干细胞可以根据使其与主体肿瘤细胞区分的众多表型特征来鉴定。首先,如上文所示,癌干细胞具有移植入新宿主时启动新肿瘤的能力。相反地,主体肿瘤细胞不能启动新肿瘤或需要比癌干细胞更多的细胞以实现新肿瘤启动。癌干细胞还因它们表达或不表达某些标志物而是可鉴定的,而来自相同肿瘤的主体肿瘤细胞具有不同的标志物表达模式。与主体肿瘤细胞相比,癌干细胞还具有在无血清低黏附培养条件下生长并且形成所谓球状体的优先能力。能够将癌干细胞与主体肿瘤细胞区分的其他表型差异是可能的。
如上文指出,也可以根据单独或与其他标志物组合的某些标志物的表达模式鉴定癌干细胞。然而,来自不同肿瘤的癌干细胞可以显示不同的标志物表型。此类标志物包括在细胞内部或在细胞表面上表达的蛋白质,并且可以使用多种技术检测到,包括但不限于免疫组织化学法、免疫荧光法和FACS分析。根据本领域普通技术人员的知识,用于检测标志物的其他技术也是可能的。标志物也包括癌干细胞中可以功能性测定其活性的蛋白质。标志物类型的非限制性实例包括转运蛋白,如从细胞输出物质或将物质摄入细胞的那些转运蛋白,酶,如脱毒酶。
可以用来鉴定乳腺癌干细胞的示例性标志物包括但不限于:CD44、CD24和ESA。用于鉴定乳腺癌干细胞的其他标志物也是可能的。在一些实施方案中,某标志物表达不存在指示了癌干细胞表型。在本公开的一些实施方案中,可以使用FACS或本领域普通技术人员熟悉的其他技术,通过以下标志物表型鉴定乳腺癌干细胞:CD44(+)/CD24(-)、CD44(+)/CD24(低)和CD44(+)/CD24(-)/ESA(+)。其他标志物的表达及其组合和模式也可以用来鉴定在这些癌症以及其他癌症类型中的癌干细胞。在本公开的其他实施方案中,乳腺癌干细胞可以使用FACS分析来鉴定,因为这些细胞根据它们排除某些染料偏好的能力被分选成所谓边侧群体(sidepopulation)。这种染料的一个非限制性实例是Hoechst染料33342。
如上文指出,癌干细胞也可以因它们在移植入新宿主后启动新肿瘤生长的能力增加而与主体肿瘤细胞区分。因而,证实疑似为癌干细胞的细胞群体的身份的一种方式是测试它们在移植入非人类受体动物后启动肿瘤生长的能力。
用于评估肿瘤或细胞系是否含有癌干细胞的移植方法是本领域普通技术人员熟悉的。作为非限制性实例,分离疑似含有癌干细胞的肿瘤或其部分,如通过手术切除。此后,将肿瘤组织切碎并用酶处理或进行有效解散肿瘤和释放其组成细胞的一些其他处理。备选地,在分析细胞系时,可以仅需要用酶促或化学处理法使细胞解离。
在制备细胞悬液后,通过离心收集细胞,并且根据本领域已知的方法分离出已知与癌干细胞相对应的亚群。如上文讨论,在一个非限制性实例中,此类细胞表现出指示癌干细胞的某些标志物模式,这些标志物模式是使用特异性抗体和荧光激活细胞分选法(FACS)可检测的。在其他实施方案中,疑似含有癌干细胞的亚群可以根据其他表型特征分离,如它们排除某些染料的能力。
在分离相关细胞亚群后,随后将预定数目的此类细胞植入受体动物中的一个或多个靶组织或靶器官。在一些实施方案中,受体动物是免疫缺陷性小鼠,包括但不限于裸小鼠、重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠和非肥胖糖尿病SCID(NOD-SCID)小鼠。根据普通技术人员的知识,也可以使用其他物种。
细胞可以皮下地植入脂肪垫(如小鼠的乳腺脂肪垫)中、植入脑、胰或肝脏或植入肾中(如植入肾囊)。细胞也可以植入其他组织和器官中。在一些实施方案中,选择靶组织或器官以复制所分析的肿瘤起源的组织或器官。然而,在其他实施方案中,选择所植入细胞驻留的独特组织或器官。作为非限制性实例,可以将结肠癌干细胞移植入NOD-SCID小鼠的肾囊以评估它们启动新肿瘤的能力。
在植入(这使用普通技术人员熟悉的技术实施)后,任由细胞不扰动以确定新肿瘤是否在植入部位生长。对于皮下植入的细胞,可以通过目视检查和触诊植入部位评估肿瘤生长。如果肿瘤的确生长,可以使用卡尺经过一段时间测量其大小。对于器官内部植入的细胞,可以在植入后的预定时间处死动物以确定肿瘤是否存在,并且如果存在,确定其大小。备选地,根据普通技术人员的知识,非侵入性技术可以用来评估肿瘤生长。
癌干细胞表型也以癌干细胞在无血清、低黏附培养条件下生长为球状体的偏好能力为特征,而主体肿瘤细胞较不可能在相同条件下能够生长为球状体。球状体是致密的细胞球,这些细胞球在某些细胞作为解聚集的悬液接种后在培养下生长时形成。在无血清培养基(例如,从StemCellTechnologies,Inc.,Vancouver,加拿大可获得)中通常在特定生长因子存在下(包括但不限于表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))和在具有哺乳动物细胞对其黏附不良的表面的组织培养皿中培育细胞时,引发此类球状体的形成。类似于来自正常组织的干细胞,已经发现癌干细胞在适宜的培养条件下优先地生长为球状体。见,例如,Rappa,G.等,Exp.CellRes.,314:2110(2008);Singh,S.K.等,CancerRes.,63:5821(2003);Fang,D.等,CancerRes.,65:9328(2005)。相反地,倾向于更高度分化的主体肿瘤细胞在相同的培养条件较不可能形成球状体。在主体肿瘤细胞能够形成球状体的情况下,与相似数目的癌干细胞形成的那些球状体相比,这些球状体倾向于更小和/或在数目上更少。
7.5癌干细胞和乳腺癌复发
已经鉴定到具有癌干细胞特性的显示增强的辐射和/或化疗剂耐药性的肿瘤细胞。已经提出不同的分子机制以解释癌干细胞对辐射或化疗剂的抵抗。例如,已经报道某些癌干细胞可以在基因毒性攻击后能够更轻易地修复它们的DNA,而其他癌干细胞表达高水平的抗凋亡蛋白或高水平的有效消除进入此类细胞的化疗剂的分子泵。Eyler,C.E.和J.N.Rich,J.Clin.Oncol.,26:2839-2845(2008)。癌干细胞还比祖先细胞增殖得更缓慢,这也可以解释干细胞在暴露于本会杀死主体肿瘤细胞的辐射和有毒化疗剂后存活的对比能力。
不希望受任何具体操作理论约束,癌干细胞抵抗辐射和化疗的观察结果可以解释用此类疗法治疗的癌症患者中的复发现象。见上文Eyler。在此类患者中,治疗起初是有效的,引起肿瘤在诊断扫描时缩减或消失,但是肿瘤在治疗停止一些时间后复现。
就癌干细胞在复发机制中的作用而言,假设尽管大部分或甚至全部主体肿瘤细胞被疗法杀死,但是仍存在许多有活力的癌干细胞,它们因其增强的抵抗辐射或化疗疗效的能力而存活。在疗法结束后,这些幸存的细胞继续生长,从而允许原始肿瘤的再形成或新肿瘤的形成。
与这种理论一致,据报道,用化疗剂治疗移植有人乳腺癌细胞系的小鼠有效从肿瘤中选择并且富集具有癌干细胞特征的细胞比例。Yu,F.,等,2007,“let-7Regulatesselfrenewalandtumorigenicityofbreastcancercells(let-7调节乳腺癌细胞的自我更新和致瘤性),”Cell131:1109-23。
乳腺癌干细胞抵抗辐射和化疗剂的观察结果表明此类细胞是乳腺癌复发的原因。Phillips,T.M.等,“TheresponseofCD24-/low/CD44+breastcancer-initiatingcellstoradiation(CD24-/低/CD44+乳腺癌启动细胞对辐射的应答),”J.Natl.Canc.Inst.,98(24):1777-1785(2006),Gupta,P.B.等和Filmore,C.M.和C.Kuperwasser,上文。
7.6理解乳腺癌中胃泌素原作用的进展
如实施例中更详细地描述,申请人已经惊讶地发现,与对照细胞系相比,胃泌素基因(GAST)在3个不同的转移性人乳腺癌细胞系(MCF-7细胞、MDA-MB231细胞和T47D细胞)中以可变的水平表达。与来自体外实验的数据相关,申请人还已经惊讶地发现,胃泌素基因在105例原发性乳腺癌的27例之间和从人乳腺癌患者获得的25例转移性乳腺癌的7例之间以变动不定的水平表达。
因为胃泌素原是胃泌素基因的产物(连同从相同基因产物中翻译后加工的其他肽),所以来自体外和体内胃泌素基因表达研究的数据表明一些但并非全部的原发性和转移性乳腺癌分泌胃泌素原蛋白质。转移性乳腺癌的证实来自申请人的以下观察结果:与健康对照的血液中相比,PG在去除原发性肿瘤的诊断患有转移性乳腺癌的患者当中的中位血液水平更高。因而,转移性乳腺癌分泌可以在血液中检测到的PG。还在诊断患有原发性乳腺癌的某些患者的血液中检测到高于正常水平的PG。诊断测试因此可能通过将疑似患有乳腺癌的患者中的血液PG水平与无癌症的健康患者中的血液PG水平比较来检测乳腺癌在患者中的存在。使用本公开的中和性或非中和性抗体,使用技术如但不限于RIA或ELISA,可以检测到血浆和/或血清中的PG水平。随后可以使用其他测试法(如医学成像检查例如CT或MRI)证实基于高于血液PG正常水平对乳腺癌的推测性诊断。
申请人还已经惊讶地发现,某些转移性人乳腺癌细胞系(例如,MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞)在培养下的生长受特异性识别hPG的多克隆和/或单克隆抗体处理抑制。使用MDA-MB-231细胞的实验表明,使用抗hPG单克隆抗体的抑制性作用是剂量反应的并且这种抑制性作用可能由识别胃泌素原N端和C端的抗体介导。相反地,用针对hPG的单克隆抗体处理T47D转移性人乳腺癌细胞系未显著影响此类细胞的生长。这些令人惊讶的发现解读为意指,一些但并非全部转移性人乳腺癌细胞对PG敏感并且可以通过中和性抗hPG抗体处理来抑制此类细胞的生长。
PG敏感性乳腺癌细胞是其存活和/或生长直接或间接地至少部分地依赖胃泌素原的一种乳腺癌细胞。不希望受任何具体操作理论约束,假设中和性抗hPG抗体通过与PG结合并阻断PG依赖性信号传导而有效抑制此类细胞的存活和/或生长。因此阻止胃泌素原介导其存活和/或生长促进作用。然而,抗PG抗体抑制乳腺癌细胞存活和/或生长的其他机制可能存在,并且具体作用机制不意图限制本公开的范围。
基于针对hPG的中和性抗体可以抑制某些转移性人乳腺癌细胞生长的观察结果,通过以下方式治疗PG敏感的转移性乳腺癌的方法是可能的:施用治疗有效量的中和性抗hPG抗体至需要治疗转移性乳腺癌的患者。
由申请人实施的其他实验令人惊讶地显示,转移性乳腺癌含有可以通过用中和性抗hPG抗体处理抑制其生长的PG敏感的乳腺癌干细胞。具体而言,申请人发现约95%的MDA-MB-231细胞表达表型标志物CD44+/CD24-,这鉴定了这些细胞为乳腺癌干细胞(实验未显示)。因为MDA-MB-231细胞是PG敏感的并且几乎全部这些细胞表达乳腺癌干细胞标志物,所以这些干细胞可能是PG敏感的。与这个发现一致,被发现并非PG敏感的T47D细胞不含表达CD44+/CD24-的细胞(实验未显示),而发现据报道含有约1.6%CD44+/CD24-细胞的MCF-7细胞(Phillips等,上文)也对抗hPG抗体的生长抑制作用敏感。
以下观察结果支持某些乳腺癌干细胞为PG敏感的结论:当MDA-MB-231细胞在有利于癌干细胞生长的低黏附培养条件下培育时,细胞中的胃泌素基因表达增加。然而,在低黏附条件下培育时,MCF-7细胞中的胃泌素基因表达减少,虽然仍不知道对于此类细胞的PG分泌的影响。
即使相对低比例的MCF-7细胞表现出CD44+/CD24-,然而通过低黏附培养条件下培育MCF-7细胞并且确定特异性抗体处理对球状体形成的影响,申请人进一步为乳腺癌干细胞是PG敏感的观点找到支持。如实施例中所解释,与对照相比,用抗hPG单克隆抗体处理减少球状体的数目。因为球状体在低黏附培养条件下的形成是与癌干细胞相关的特性,这些结果表明与MDA-MB-231细胞相似,MCF-7细胞含有其生长受中和性抗体抑制的PG敏感的乳腺癌干细胞。
基于这种工作,申请人还测试了用不同抗hPG单克隆抗体预处理MCF-7细胞的影响,与此同时,细胞在常规培养条件下培育,随后移去抗体并且允许细胞继续在选择癌干细胞生长的低黏附条件下生长。申请人惊讶地发现与对照相比,用抗hPG单克隆抗体预处理的MCF-7细胞形成更少球状体,即便抗体在实验的低黏附生长阶段期间不存在。这种结果解读为意指,MCF-7细胞含有受中和性抗hPG抗体抑制的乳腺癌干细胞并且对此类干细胞生长的抑制性作用不需要抗体的持续存在。
基于某些乳腺癌含有PG敏感的癌干细胞并且认为癌干细胞负责癌症复发现象的观察结果,通过以下方式阻止乳腺癌复发的方法是可能的:用有效阻止乳腺癌复发的量的中和性抗hPG抗体处理需要阻止乳腺癌复发的患者,其中乳腺癌是PG敏感的。申请人令人惊讶的研究结果也是以下方法的基础:通过用有效抑制PG敏感的乳腺癌干细胞生长的中和性抗hPG抗体量处理此类细胞而阻止PG敏感性乳腺癌干细胞的生长。
7.7抗体
用于本文公开的方法和试剂盒中的抗体是这些抗体,它们与人胃泌素原的特异性结合胜过与胃泌素基因的其他产物的结合。如图13中所示,胃泌素基因翻译为101个氨基酸的多肽(称为前胃泌素原(pre-progastrin)),其包含被切除从而产生胃泌素原(80个氨基酸的多肽)的信号序列(加下划线)。胃泌素原转而经切割以产生在序列上与胃泌素原的残基38-71相应的34个氨基酸的产物,所述产物然后在其羧基端用甘氨酸残基延长,产生甘氨酸延长的G34(“G34-Gly”)。这种切割的副产物是一种6个氨基酸的肽(称为C端侧翼肽或CTFP),其在序列上与胃泌素原的残基75-80相对应。G34-Gly然后经进一步切割以产生一种17个残基的多肽,该多肽在序列上与胃泌素原的残基55-71相对应,称为G17-Gly。去除G34-Gly和G17-Gly的C端甘氨酸,然后C端酰胺化,分别产生G34和G17,二者都是C端酰胺化的。
如本文所用,如在标准结合测定法中测量的那样,如果一种抗体结合于全长胃泌素原但是完全不结合于CTFP、酰胺化胃泌素或甘氨酸延长的胃泌素,则它是“对hPG高度特异的”或“高度特异性结合”hPG,并且如果该抗体显示与hPG的结合至少约5倍高于CTFP和胃泌素基因的其他产物,则它是“对hPG特异的”或“特异性结合”hPG。实施例12中提供可以用来评估特定抗hPG抗体的特异性的具体ELISA测定法。
此类高度特异性和/或特异性抗hPG抗体(在本文中称作“抗hPG抗体”)可以是多克隆的(“抗hPGPAb”)或单克隆的(“抗hPGMAb”),不过对于治疗性用途并且在一些情况下,对于诊断或其他体外用途,单克隆抗体是优选的。
被抗hPG抗体结合的表位不是关键的。有用的抗hPG抗体可以结合hPG的N端区域、hPG的C端区域或hPG的不同区域。最近,已经发现,至少对于单克隆抗hPG抗体,用来产生抗hPG抗体的抗原的选择可能是重要的(见,2010年10月15日提交的国际申请号PCT/EP2010/006329和2010年10月15日提交的美国申请号12/906,041,所述公开及其具体公开的抗hPG抗体通过引用方式并入本文;下文分别称作‘329申请和‘041申请)。如‘329申请和‘041申请中所公开,并非所有衍生自hPG的抗原均在生理条件下刺激特异性结合hPG的单克隆抗体的产生。实际上,已经用来成功产生多克隆抗hPG抗体的某些抗原(如全长重组hPG(见例如Singh的WO08/076454)和与hPG的C端最后十个氨基酸相对应的肽(见例如Hollande的WO07/135542))未能产生抗hPG单克隆抗体。如在‘329申请和‘041申请中所指出,已经在hPG序列内鉴定出可以用来产生特异性结合hPG的单克隆抗体的抗原性N端和C端序列。令人感兴趣的是,抗原性序列不需要限于对其独特的hPG序列区域。与胃泌素基因的其他产物(例如G17、G34和CTFP)具有共同序列区域的肽抗原产生了不但结合hPG,而且特异性结合hPG的单克隆抗体。
可用具有对应于hPGN端区域的序列的肽抗原获得和/或与hPGN端区域结合的抗hPG抗体在本文中称为“N端抗PG抗体”。可以用来构建适于获得对hPG特异的多克隆和单克隆抗体的免疫原的具体示例性hPG抗原区对应于hPG的残基1至14:SWKPRSQQPDAPLG(SEQIDNO:25)。在下表1A中和实施例部分中提供用于获得N端抗hPG抗体的示例性免疫原以及用这些示例性免疫原获得的N端抗hPG单克隆抗体的CDR和VH和VL序列:
在表1A中,用常规N→C取向表示所有氨基酸序列。对于每种免疫原,将胃泌素原肽合成为具有一个氨基己酸(Ahx)残基后接半胱氨酸(Cys)残基的C端接头,然后将其通过Cys接头残基与牛血清白蛋白(“BSA”)或匙孔血蓝蛋白(“KLH”)载体缀合。
使用具有对应于hPGC端区域的序列的肽抗原可获得和/或与hPGC端区域结合的抗hPG抗体在本文中称为“C端抗PG抗体”。可以用来构建用于获得多克隆和单克隆C端抗hPG抗体的免疫原的具体示例性抗原区对应于hPG的残基55至80:QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQIDNO:27)。在下表1B中和实施例部分中提供用于获得C端抗hPG抗体的示例性免疫原(包括这种抗原)以及用这些示例性免疫原获得的C端抗hPG单克隆抗体的CDR和VH和VL序列:
在表1B中,用常规N→C取向表示所有氨基酸序列。对于每种免疫原,将胃泌素原肽合成为具有N端Ahx-Ahx-Cys接头,其随后通过Cys接头残基与匙孔血蓝蛋白(“KLH”)或白喉毒素(“DT”)载体缀合。
使用分别在Laune等,2002,J.Immunol.Methods267:53-70和Laune,1997,J.Biol.Chem.272:30937-30944中描述的SPOT技术和丙氨酸扫描法图谱定位了由表1A和表1B中提供的示例性抗hPG单克隆抗体MAb1-MAb23结合的具体表位(也见,‘329申请的实施例6)。
在SPOT技术中,产生跨越推定的表位的15个氨基酸肽序列,并点在硝酸纤维素膜上,然后用测试抗体探测来确定抗体识别的最小表位序列。丙氨酸扫描法用来确定表位内部对抗体结合关键的残基。将推定的表位内部的每个残基逐一突变成丙氨酸,并且随后用测试抗体探测含有丙氨酸的肽。
对于N端抗hPG单克隆抗体MAb1-4和15-20,表位至少包含以下序列:DAPLG(SEQIDNO:28)、PDAPLG(SEQIDNO:29)、PRSQQPD(SEQIDNO:30)、WKPRSQQPD(SEQIDNO:31)或WKPRSQQPDAPLG(SEQIDNO:32),如以下表2A中所示。
对于C端抗hPG单克隆抗体MAb5-7、9-12、14和21-23,表位至少包含以下序列:FGRR(SEQIDNO:33)、MDFGR(SEQIDNO:34)、AEDEN(SEQIDNO:35)和GWMDFGRR(SEQIDNO:36),如以下表2B中所示。
表位图谱定位实验揭示,抗hPGMAb2和MAb4结合相同的表位;抗hPGMAb1和MAb3结合大致相同的表位;MAb17、MAb18、MAb19和MAb20结合大致相同的表位;MAb15和MAb16结合大致相同的表位;抗hPGMAb5、MAb6、MAb7、MAb9和MAb12结合相同的表位,且与抗hPGMAb10结合大致相同的表位;抗hPGMAb11和MAb14结合大致相同的表位。
用于本文所述的方法和试剂盒中的N端抗hPG抗体的具体实施方案包括结合以下表位的抗体,所述表位是包括hPG的残基10至14(SEQIDNO:28)、hPG的残基9至14(SEQIDNO:29)、hPG的残基4至10(SEQIDNO:30)、hPG的残基2至10(SEQIDNO:31)或hPG的残基2至14(SEQIDNO:32)的表位。
用于本文所述的方法和试剂盒中的C端抗PG抗体的具体实施方案包括结合以下表位的抗体,所述表位包括hPG的残基71至74(SEQIDNO:33)、hPG的残基69至73(SEQIDNO:34)、hPG的残基76至80(SEQIDNO:35)或hPG的残基67至74(SEQIDNO:36)。
除表1A和表1B中提供的那些之外,用于本文公开的方法和试剂盒中的N端和C端抗hPG抗体还可以在竞争性结合测定法中采用示例性MAb1-23或采用结合N-或C端表位的其他参考抗体来鉴定,如在稍后部分中更详细地描述。
还如‘329申请和‘041申请中所报道,全部抗hPG抗体,甚至对hPG显示高程度特异性和亲和力的那些并不都中和hPG的生物学活性。例如,虽然抗hPGMAb14以约6pM的KD结合hPG,它在体外测定法中不抑制某些结肠直肠癌细胞的生长,至少在所测试的浓度如此,而其他抗hPG单克隆抗体(例如MAb1-MAb13和MAb15-MAb23)显示程度不一的抑制活性。尽管特异性结合hPG的非中和抗体和中和抗体均用于本公开的诊断方法,但是用于治疗方法的抗hPG抗体应当显示中和活性。如实施例中所述,在测试它们抑制培养的MDA-MB-231和MCF7乳腺癌细胞生长的能力时,显示MAb3和MAb8具有中和活性。可以经验地确定本公开的其他抗体是否具有中和性的。
如本文所用,“中和性抗hPG抗体”是这样的抗hPG抗体,与用非特异性抗体处理的对照样品相比,其在抗hPG抗体处理的测试样品中导致活的乳腺癌细胞数目的统计显著减少。实施例13中描述了用于评估任意特定抗hPG抗体中和hPG的能力的具体测定法。虽然预期在这个测定法中显示较低中和活性水平(例如统计显著地减少活乳腺癌细胞数目40%、30%、20%、15%或甚至10%)的抗hPG抗体提供治疗益处,但是认为在这个测定法中显示使活乳腺癌细胞数目减少至少约50%的那些抗hPG抗体在治疗乳腺癌方面尤其有用。用于这些测定法中的示例性细胞包括但不限于本文所述的PG敏感性乳腺癌细胞系。
因此,在一些实施方案中,例如治疗性实施方案,有用的抗hPG抗体是中和性的。如本文公开和在‘329申请和‘041申请中公开,抗hPG单克隆抗体具有中和作用的能力不是表位依赖的,因为N端抗hPG单克隆抗体(例如,MAb3)和C端抗hPG单克隆抗体(例如,MAb8)均在乳腺癌细胞的测定法中显示中和活性。因而,在一些具体实施方案中,中和性抗hPG抗体是N端中和性抗hPG抗体。在其他实施方案中,中和性抗hPG抗体是C端中和性抗hPG抗体。
任何特异性抗hPG抗体的亲和力不是关键的。然而,对于一些用途,可以优选显示至少约1μM亲和力的抗体。对于治疗性用途,可能想要至少约90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM或甚至更大的亲和力。如下表3中所示,在表1A和表1B中鉴定的抗hPG单克隆抗体的测定的亲和性是10-6至10-12M:
具有尤其适合于所希望的具体应用的亲和力的抗PG单克隆抗体可以容易地从这些中选择,或者使用本文所述的多种免疫原、抗hPG抗体的互补决定区(CDR)序列、可变重链VH和可变轻链VL序列来产生或设计。可以用本领域公知或本文所述的技术测定任意具体的抗PG单克隆抗体的亲和力,例如ELISA、等温滴定量热法(ITC)、BIAcore或荧光偏振测定法。在实施例14中提供具体的测定法。
如表1A和表1B中所示,已经鉴定到对hPG特异的众多N端和C端单克隆抗体,并且如‘329申请和‘041申请中公开,除MAb14之外的全部抗体均显示针对某些结肠直肠癌细胞的中和活性。另外,如实施例中所述,MAb3、MAb8、MAb13、MAb16和MAb19显示针对MDA-MB-231乳腺癌细胞的中和活性并且MAb3显示针对MCF7乳腺癌细胞的中和活性。
用于获得这些抗体的几种杂交瘤根据布达佩斯条约在2010年10月6日保藏于法国国立微生物保藏中心(CNCM)。在表1A和表1B中提供了产生抗hPGMAbs1-23的杂交瘤的命名名称和那些保藏的杂交瘤的保藏注册编号。此外,对于这些抗体的几种,已经确定了它们的可变重链(VH)、可变轻链(VL)、VL互补决定区(CDR)和VHCDR的氨基酸序列。在表1A和表1B中还提供在本公开中自始至终用来指称它们的这些氨基酸序列和缩写命名。简而言之,鼠重链可变区和轻链可变区在本文中称作mVH和mVL,后接相应单克隆抗体的编号,例如mVH.3和mVL.3分别用于抗hPGMAb3的可变轻链和可变重链。类似地,人重链可变区和轻链可变区在本文中称作hVH和hVL,后接相应单克隆抗体的编号。3个可变重链CDR和3个可变轻链CDR分别称作VHCDR1、2或3和VLCDR1、2或3,后接特异性抗hPG单克隆抗体的编号。例如,MAb3的VHCDR1表示为VHCDR1.3,并且MAb3的VLCDR1表示为VLCDR1.3。MAb3的VHCDR2表示为VHCDR2.3,并且MAb3的VLCDR2表示为VLCDR2.3。
预期结合大致相同表位的抗hPG单克隆抗体的相应CDR和/或VH和VL链可以互换以产生用于本文所述的方法和试剂盒中的新抗hPG单克隆抗体。例如,如上文指出,示例性抗hPG单克隆抗体MAb5和MAb6结合相同的表位。可以设计在其VL链中包含这两种抗体的VLCDR的多种组合和/或在其VH链中包含这两种抗体的VHCDR的多种组合的抗hPG单克隆抗体。作为说明多种可能的组合的具体非限制性实例,这种抗体可以在其VL链中包含MAb5的CDR1和2(分别为VLCDR1.5和VLCDR2.5)及MAb6的CDR3(VLCDR3.6),在其VH链中包含MAb6的CDR1(VHCDR1.6)及MAb5的CDR2和3(分别为VHCDR2.5和VHCDR3.5)。可以使用常规手段获得由已经保藏的杂交瘤产生的抗体的CDR的氨基酸序列。
可以使用常规手段获得由已经保藏的杂交瘤产生的抗体的CDR的氨基酸序列。例如,如下测定由杂交瘤6B5B11C10和20D2C3G2产生的抗体的相关序列。简而言之,根据制造商的说明书使用RNABee试剂,AMSBio目录号CS-104B,从冷冻的细胞沉淀物分离总RNA。使用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR),从mRNA制备V区的cDNA,随后5′快速扩增cDNA末端(RACE)。使用恒定区特异性引物实施cDNA合成,此后,纯化出第一链产物并且使用末端脱氧核苷酸转移酶用来添加均聚的尾部至cDNA的3′末端。随后通过PCR使用引物对扩增“加尾的”cDNA序列,每一引物分别针对均聚的尾部和VH或VL区。重链可变区和轻链可变区PCR产物随后克隆入“TA”克隆载体(p-GEM-Teasy,Promega目录号A1360)并且使用标准方法测序。见图14A-B(MAb3)、图14C-D(MAb4)。
类似地,如下测定由杂交瘤1C10D3B9、2C6C3C7、1B3B4F1和1E9D9B61产生的抗体的相关序列。根据制造商的说明书,使用-4PCR试剂盒(Ambion目录号AM1914),从冷冻的细胞沉淀物分离总RNA。使用一组6种简并引物汇集物(HA至HF)扩增重链V区mRNA并且使用一组8种简并引物汇集物(7种用于κ类(KA至KG)和一种用于λ类(LA))扩增轻链V区mRNA。用RT-PCR从mRNA制备可变区cDNA。用恒定区特异的引物进行cDNA合成,然后用5’鼠信号序列的简并引物及IgGVH、IgκVL和IgλVL中每一个的3’恒定区引物的库进行PCR。使用RT-PCR,从mRNA制备可变区的cDNA。使用恒定区特异性引物实施cDNA合成,随后使用5′鼠信号序列的简并引物和分别针对IgGVH、IgκVL和IgλVL的3′恒定区引物的汇集物进行PCR。(Jones等,1991,RapidPCRcloningoffull-lengthmouseimmunoglobulinvariableregions(全长小鼠免疫球蛋白可变区的快速PCR克隆),Bio/Technology9:88-89)。重链可变区和轻链可变区PCR产物随后克隆入“TA”克隆载体(p-GEM-Teasy,Promega目录号A1360)并且使用标准方法测序。见图14E-F(MAb8)、14G-H(MAb13)、14I-J(Mab16)和14K-L(Mab19)。
参照表1A,用于本文所述的方法和试剂盒中的N端抗hPG抗体的具体实施方案包括但不限于以下抗体:
(a)抗体,其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VLCDR相对应的VLCDR和在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VHCDR相对应的VHCDR;
(b)抗体,其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VLCDR和VHCDR相对应的VLCDR和VHCDR;
(c)抗体,其中:
(i)VLCDR1选自QSIVHSNGNTY(“VLCDR1.3”;SEQIDNO:4)、QSLVHSSGVTY(“VLCDR1.4”;SEQIDNO:10)、QSLLDSDGKTY(“VLCDR1.16”;SEQIDNO:50)和SQHRTYT(“VLCDR1.19”;SEQIDNO:51);
(ii)VLCDR2选自KVS(“VLCDR2.3”和(“VLCDR2.4”;SEQIDNO:5)、LVS(“VLCDR2.16”;SEQIDNO:53)和VKKDGSH(“VLCDR2.19”;SEQIDNO:54);
(iii)VLCDR3选自FQGSHVPFT(“VLCDR\3.3”;SEQIDNO:6)、SQSTHVPPT(“VLCDR3.4”;SEQIDNO:11)、WQGTHSPYT(“VLCDR3.16”;SEQIDNO:57)和GVGDAIKGQSVFV(“VLCDR3.19”;SEQIDNO:58);
(iv)VHCDR1选自GYIFTSYW(“VHCDR1.3”;SEQIDNO:1)、GYTFSSSW(“VHCDR1.4”;SEQIDNO:7)、GYTFTSYY(“VHCDR1.16”;SEQIDNO:39)和GYSITSDYA(“VHCDR1.19”;SEQIDNO:40);
(v)VHCDR2选自FYPGNSDS(“VHCDR2.3”;SEQIDNO:2)、FLPGSGST(“VHCDR2.4”;SEQIDNO:8)、INPSNGGT(“VHCDR2.16”;SEQIDNO:43)和ISFSGYT(“VHCDR2.19”;SEQIDNO:44);和
(vi)VHCDR3选自TRRDSPQY(“VHCDR3.3”;SEQIDNO:3)、ATDGNYDWFAY(“VHCDR3.4”;SEQIDNO:9)、TRGGYYPFDY(“VHCDR3.16”;SEQIDNO:47)和AREVNYGDSYHFDY(“VHCDR3.19”;SEQIDNO:48);
(d)抗体,其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VL相对应的VL和在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VH相对应的VH;和
(e)抗体,其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VL和VH相对应的VL和VH。
参照表1B,用于本文所述的方法和试剂盒中的C端抗hPG抗体的具体实施方案包括但不限于以下抗体:
(a)抗体,其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VLCDR相对应的VLCDR和在序列上与MAB5、MAb6、MAb7、MAB8、MAB9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VHCDR相对应的VHCDR;
(b)抗体,其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VLCDR和VHCDR相对应的VLCDR和VHCDR;
(c)抗体,其中:
(i)VLCDR1选自KSLRHTKGITF(“VLCDR1.8”;SEQIDNO:49)和QSLLDSDGKTY(“VLCDR1.13”;SEQIDNO:50);
(ii)VLCDR2选自QMS(“VLCDR2.8”;SEQIDNO:52)和LVS(“VLCDR2.13”;SEQIDNO:53);
(iii)VLCDR3选自AQNLELPLT(“VLCDR3.8”;SEQIDNO:55)和WQGTHFPQT(“VLCDR3.13”;SEQIDNO:56);
(iv)VHCDR1选自GFTFTTYA(“VHCDR1.8”;SEQIDNO:37)和GFIFSSYG(“VHCDR1.13”;SEQIDNO:38);
(v)VHCDR2选自ISSGGTYT(“VHCDR2.8”;SEQIDNO:41)和INTFGDRT(“VHCDR2.13”;SEQIDNO:42);和
(vi)VHCDR3选自ATQGNYSLDF(“VHCDR3.8”;SEQIDNO:45)和ARGTGTY(“VHCDR3.13”;SEQIDNO:46);
(d)抗体,其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VL相对应的VL和在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VH相对应的VH;
(e)抗体,其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VL和VH相对应的VL和VH。
如技术人员将理解,用于诊断方法中的抗hPG抗体可以是任何来源的,包括例如哺乳动物(例如,人、灵长类、啮齿类、山羊或兔)、非哺乳动物或是在性质上嵌合的(源自多于一个起源物种)。适于在动物(包括人)中治疗性使用的抗体是优选地源自意在进行治疗的相同物种,或已经经修饰或设计以在正在治疗的动物中无免疫原性或具有减少的免疫原性。下文更详细地讨论,在人类中治疗性使用的抗hPG抗体的具体类型是人源化抗体类型。用于本文所述的方法和试剂盒中的抗hPG抗体还可以属于或衍生自任何同种型,包括例如IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。设计用于治疗性使用的抗hPG抗体优选地是IgG同种型的。
在一些实施方案中,用于本文所述的治疗方法的抗hPG抗体是人源化的。一般而言,人源化抗体包含至少一个(并且通常为两个)可变结构域的基本上全部,其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些,全部或基本上全部构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些,且可以称为“CDR移植的”。人源化抗体还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白共有序列的恒定区。用于人源化抗体的方法(包括用于设计人源化抗体的方法)是本领域熟知的。见例如Lefranc等,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77;Lefranc等,2009,Nucl.AcidsRes.37:D1006-1012;Lefranc,2008,Mol.Biotechnol.40:101-111;Riechmann等,1988,Nature332:323-7;Queen等的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370;EP239400;PCT公开WO91/09967;美国专利号5,225,539;EP592106;EP519596;Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498;Studnicka等,1994,Prot.Eng.7:805-814;Roguska等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973;和美国专利号5,565,332;所述文献在此以通过引用方式完整并入。
可以使用这些熟知的方法获得具有与非人抗hPG抗体的CDR相对应的CDR序列的抗体的人源化形式,例如包括并且不限于表1A中提供的多种N端抗hPG单克隆抗体和表1B中提供的多种C端抗hPG单克隆抗体。在表1A和表1B中提供了选择的抗hPG抗体的人源化VL和VH链的突出序列。人源化抗体的具体实例包括了包含以下区域的抗体:
(a)本文中公开的任何3个VLCDR和任何3个VHCDR;
(b)包含与SEQIDNO:21相对应的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQIDNO:22相对应的氨基酸序列的轻链可变区;
(c)包含与SEQIDNO:23相对应的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQIDNO:24相对应的氨基酸序列的轻链可变区;
(d)包含选自SEQIDNO:75、77和79的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQIDNO:76和78的氨基酸序列的轻链可变区;
(e)包含选自SEQIDNO:80和82的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQIDNO:81和83的氨基酸序列的轻链可变区;
(f)包含选自SEQIDNO:84、86和88的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQIDNO:85、87和89的氨基酸序列的轻链可变区;和
(g)包含选自SEQIDNO:90、92和94的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQIDNO:91、93和95的氨基酸序列的轻链可变区。
如技术人员将认识到,可以使用本文所述的多种抗原和免疫原并且评估它们与目的参考抗体竞争结合hPG的能力,轻易地获得具有特异性结合特性(如结合特定目的表位的能力)的抗hPG抗体。本文所述的任何抗hPG抗体可以用作这种竞争测定法中的参考抗体。实施例15中提供了用于评估抗体与生物素酰化的目的参考抗hPG抗体竞争结合hPG的能力。
在参考抗hPG抗体和任意测试抗体(不考虑物种或同种型)之间实施抗体竞争研究时,可以首先用可检测标记物(如放射性同位素或荧光团)直接标记或用例如生物素(通过与荧光标记的链霉亲和素结合是可检测的)或酶(通过酶促反应是可检测的)间接标记参考抗体,以能够进行后续鉴定。在这种情况下,将标记的抗hPG参考抗体(以固定浓度或增加的浓度)与已知量的hPG孵育,形成hPG:标记的抗hPG抗体复合物。随后将未标记测试抗体添加至这种复合物。测量复合的标记物的强度。如果测试抗体通过结合重叠表位与标记的参考抗hPG抗体竞争hPG,则相对于测试抗体不存在时所实施的对照实验,复合的标记物的强度将降低。
用于实施结合竞争测定法的许多方法是已知的并且可以进行修改,以产生与上文和实施例15中所述的测定法可比的结果。
如果一种抗体在竞争性结合测定法中并且尤其在实施例15的竞争性结合测定法中以0.01-100μg/ml范围内的测试抗体浓度(例如,0.01μg/ml、0.08μg/ml、0.4μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml或100μg/ml或所述范围内的其他浓度)减少参考抗hPG抗体与hPG的结合至少50%,不过更高水平的减少(例如,60%、70%、80%、90%或甚至100%)可以是合乎需要的,则认为该抗体与参考抗hPG抗体竞争结合hPG并且因而认为它大体上结合与参考抗hPG抗体相同或重叠的hPG表位。
本公开的抗体也可以衍生化、共价修饰或与其他分子缀合以改变它们的特性或改善它们的功能。例如,但不作为限制,衍生化抗体包括已例如通过糖基化、岩藻糖基化、乙酰化、聚乙二醇化(pegylation)、磷酸化、酰胺化、甲酰化、通过已知保护/封闭基团衍生化、与细胞配体或其他蛋白质连接等修饰的抗体。备选地,可以改变可变区或恒定区中的特定氨基酸以改变或改善功能。在一个非限制性实例中,可以改变抗体Fc区中的氨基酸残基以增加抗体与FcRn结合来增加其血清半寿期。
抗hPG单克隆抗体包括用可检测部分标记的抗体。这种标记物可以与本公开的抗hPG单克隆抗体直接或间接地缀合。标记物可以自身是可检测的(例如放射性同位素标记物、同位素标记物或荧光标记物),或者在酶标记物的情况下,可以催化底物化合物或组合物的可检测的化学变化。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用多种正电子发射成像术的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
虽然用于本文所述的方法和试剂盒中的多种抗hPG抗体已经用全长抗体例举,但是技术人员会理解,也可以使用从全长抗体或结合片段设计或衍生的结合片段或替代抗体。合适的片段、替代物等包括但不限于Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、vIgG、scFv片段和替代抗体、rIgG、二硫键稳定的Fv抗体(dsFv)、双体抗体、三体抗体和单结构域抗体,如骆驼化抗体或纳米体(nanobody)。
本公开的抗体可以根据本领域普通技术人员已知的任何方式产生。在一个非限制性实例中,抗体可以从天然来源获得,包括从能够产生抗体的任何物种获得,如源自人、猴、鸡、山羊、兔和啮齿类(例如,大鼠、小鼠和仓鼠)的抗体。其他物种也是可能的。抗体也可以从利用基因工程或重组DNA技术的系统产生和分离,如但不限于在培养下的酵母细胞、细菌细胞和哺乳动物细胞(如CHO细胞)中表达重组抗体。抗体也可以完全地或部分地是合成的。
本公开的单克隆抗体(MAb)不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。通过本领域可得或已知的任意手段从单个克隆(包括任意真核、原核或噬菌体克隆)衍生单克隆抗体。可以使用本领域已知的多种技术(包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合)制备单克隆抗体。
7.8乳腺癌的治疗
乳腺癌的治疗分成几个类别。
在乳腺癌局限于乳腺、或乳腺和腋窝淋巴结时,考虑手术。有效治疗乳腺癌的外科术包括,但不必然地限于肿块切除术、四分之一切除术、乳房全切除术、乳房根治术和乳房改良根治术。
辐射疗法可以用来杀死手术后残余的乳腺癌细胞。辐射可以由身体外部的机器(外部光束辐射疗法)产生,或它可以由置于身体内癌症附近的放射性物质(内部辐射疗法或近距离辐射疗法)产生。
化疗、激素疗法和靶向疗法是全身性疗法的非限制性实例,所述全身性疗法可以用作手术或者手术及辐射后的辅助疗法或用作主要疗法对抗具有扩散超出乳腺进入远端器官的转移性乳腺癌。此类疗法可以单独或彼此组合地使用。辅助疗法是为杀死可能从手术或辐射疗法中幸存的癌细胞所施用的一种疗法。
辐射疗法和/或手术也可以用来治疗转移性乳腺癌,如用来治疗某些区域内少数的转移灶,用来防止骨折或肝脏中阻塞或用来提供疼痛或其他症状的缓解。已经扩散至骨的乳腺癌转移灶可以用外部光束辐射疗法和/或双膦酸盐如帕米膦酸二钠(Aredia)或唑来膦酸(Zometa),连同钙和维生素D治疗,以强化骨。
化疗依赖于杀死或减慢或停止乳腺癌细胞生长的药物。通过不同机制奏效的多种化疗剂可用于治疗乳腺癌。在全身性施用时,化疗可以有效对抗转移性乳腺癌,但是也可以按更局限化的方式施用,如施与围绕脑的流体中。
可以有效对抗乳腺癌的示例性化疗剂包括:叶酸拮抗剂,包括甲氨蝶呤和培美曲塞;嘌呤拮抗剂,包括克拉立滨、氯法拉滨、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、奈拉滨(nelarabine)、喷司他丁;嘧啶拮抗剂,包括卡培他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲;博来霉素;DNA烷化剂,包括亚硝基脲、卡莫司汀、罗莫司汀;DNA交联药物和烷化剂,包括苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、美法仓、达卡巴嗪、替莫唑胺、丙卡巴肼;天冬酰胺酶;抗生素类,包括丝裂霉素;铂络合物,包括卡铂、顺铂、奥沙利铂;蛋白体抑制剂,包括硼替佐米;纺锤体毒剂类,如紫杉烷类(包括多西紫杉醇、紫杉醇)和长春碱类(包括长春碱、长春新碱、长春瑞滨);拓扑异构酶抑制剂,如蒽环类(包括佐柔比星、柔红霉素、多柔比星、表柔比星)、喜树碱类(包括依立替康和拓扑替康)、鬼臼毒素类(包括依托泊苷、替尼泊苷和米托蒽醌);酪氨酸激酶抑制剂(包括厄洛替尼(Tarceva)、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、索拉替尼、舒尼替尼)。其他化疗剂也是已知的。
已知有效对抗乳腺癌的具体化疗剂及其组合包括但不限于CMF,其是环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶的组合;CAF(FAC),其是环磷酰胺、多柔比星和5-氟尿嘧啶的组合;AC,其是多柔比星和环磷酰胺的组合;EC,其是表柔比星和环磷酰胺的组合;TAC,其是多西他赛、多柔比星和环磷酰胺的组合;AC→T,其是多柔比星和环磷酰胺后接紫杉醇或多西紫杉醇(对于HER2/neu阳性肿瘤,赫赛汀可以随紫杉醇或多西紫杉醇一起给予)的组合;A→CMF,其是多柔比星后接CMF的组合;CEF(FEC),其是环磷酰胺、表柔比星和5-氟尿嘧啶(这可以后接多西紫杉醇)的组合;TC,其是多西紫杉醇和环磷酰胺的组合;TCH,其是多西紫杉醇、卡铂和赫赛汀(用于HER2/neu阳性肿瘤)的组合。
可以有效对抗乳腺癌的其他化疗剂包括顺铂、长春瑞滨、卡培他滨、PEG化的脂质体多柔比星、吉西他滨、米托蒽醌、伊沙匹隆、和白蛋白结合的紫杉醇)和其他。
雌激素促进约三分之二的乳腺癌即那些含有雌激素受体(ER阳性癌)和/或孕酮受体(PR阳性癌)的生长。因而,在患有ER阳性和PR阳性乳腺癌的患者,激素疗法寻求阻断雌激素的作用或降低雌激素水平。因而,激素疗法需要施用有效阻断身体天然激素的产生和/或活性的合成性激素或其他药物,所述天然激素否则可能支持或促进激素敏感的乳腺癌细胞的生长。
他莫昔芬、托瑞米芬和雷洛昔芬是拮抗乳腺癌细胞中雌激素受体的选择性雌激素受体调节物(SERM)和抗雌激素药的实例。起到消除雌激素受体作用的氟维司群可以是有效的,即便乳腺癌不再应答于他莫昔芬。芳香酶抑制剂通过阻止雌激素产生来发挥作用,并且包括药物来曲唑、阿那曲唑和依西美坦。卵巢消除也可以用来消除绝经前女性中雌激素的主要来源。可以通过手术去除卵巢做到永久性卵巢消除。卵巢消除也可以用称作促黄体素释放素(LHRH)类似物的药物(如戈舍瑞林或亮丙瑞林)进行,所述药物可以单独或连同他莫昔芬一起作为激素疗法在绝经前女性中使用。醋酸甲地孕酮可以在其癌症不应答于其他激素治疗的女性中使用。也可以考虑使用雄激素。其他激素治疗剂也是可能的,如比卡鲁胺和氟他胺。
靶向疗法针对已知参与乳腺癌的特定基因或基因产物。靶向疗法的具体类型是抗体疗法,该疗法包括施用直接或间接杀死乳腺癌细胞、减慢或终止其生长的抗体,如单克隆抗体。此类抗体可以通过多种独特的机制发挥作用。例如,某些抗体可以标记癌细胞以便由患者的免疫系统借助抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)或其他机制发动攻击。其他抗体与癌细胞需要用于存活或生长的抗原结合并且改变或抑制其功能。其他机制也是可能的。抗体也可以缀合于能够在与癌细胞上表达的相应抗原结合后杀死癌细胞的放射性或化学毒性部分。
靶向乳腺癌的抗体疗法的实例是单克隆抗体曲妥珠单抗和贝伐单抗。曲妥珠单抗和相似抗体靶向HER2基因产物,而贝伐单抗和相似抗体靶向VEGF。曲妥珠单抗可以单独地或与化疗组合以及与其他治疗组合施与患有HER2阳性癌症的女性。贝伐单抗可以与化疗药物紫杉醇以及其他治疗组合。
靶向疗法的其他类型包括小分子药物,如拉帕替尼。不再应答于曲妥珠单抗的HER2阳性癌症可以应答于拉帕替尼,所述拉帕替尼可以随化疗药物卡培他滨以及其他治疗一起给予。
7.9使用抗PG抗体的治疗方法
本公开提供了治疗方法,所述方法包括出于治疗和阻止转移性乳腺癌、阻止乳腺癌复发和阻止乳腺癌干细胞生长的目的,施用组合物中的抗PG抗体至受试者。在某些实施方案中,抗体是对人胃泌素原(“hPG”)特异的,并且在其他实施方案中,此类抗体是单克隆抗体。
根据这些实施方案中的某些实施方案,如本文公开的抗PG抗体在组合物中以治疗有效量作为单药疗法或作为联合疗法施与需要治疗转移性乳腺癌的受试者。此类受试者包括但不限于诊断患有转移性乳腺癌的那些受试者。在这些方法的某些实施方案中,抗体是抗hPG单克隆抗体。
根据其他实施方案,如本文公开的抗PG抗体在组合物中以治疗有效量作为单药疗法或作为联合疗法施与需要阻止转移性乳腺癌的受试者。此类受试者包括但不限于确定患有原发性乳腺癌但是其中不知道癌症已经扩散至远端组织或器官的那些受试者。在这些方法的某些实施方案中,抗体是抗hPG单克隆抗体。
根据另外的实施方案,如本文公开的抗PG抗体在组合物中以治疗有效量作为单药疗法或作为联合疗法施与需要阻止转移性乳腺癌复发的受试者。此类受试者包括但不限于先前治疗过原发性或转移性乳腺癌,在治疗后这种癌症明显消失的那些受试者。在这些方法的某些实施方案中,抗体是抗hPG单克隆抗体。
根据其他实施方案,如本文公开的抗PG抗体在组合物中以治疗有效量作为单药疗法或作为联合疗法施与需要抑制乳腺癌干细胞生长的受试者。此类受试者包括但不限于患有以下乳腺癌的那些受试者,其中所述乳腺癌的生长或转移至少部分地归咎于其内部存在癌干细胞。其他实施方案提供了通过使乳腺癌干细胞与阻止或抑制此类细胞生长的有效量抗PG抗体组合物接触而阻止或抑制此类细胞生长的方法。此类方法可以在体外或在体内实施。在这些方法的某些实施方案中,抗体是抗hPG单克隆抗体。
中和性抗PG抗体将是治疗性抗体组合物中的主要有效物质,虽然如果非中和性抗PG抗体的存在基本上不抑制中和性抗体的治疗性功效,则它们可以存在。
对其可以施用抗PG抗体组合物的受试者可以是哺乳动物,如非灵长类(例如奶牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类(例如猴、猩猩、猿或人)。受试者可以是人,如成人患者或儿科患者。
出于治疗或阻止转移性乳腺癌或阻止乳腺癌复发的目的,抗PG抗体组合物可以作为单药疗法单独地或作为一种或多种有效治疗或阻止转移性乳腺癌或有效防阻止乳腺癌复发的主要疗法的辅助物施与受试者。
因而,在本公开的某些实施方案中,抗hPG抗体组合物可以作为化疗的辅助物、作为辐射疗法的辅助物、作为生物疗法的辅助物、作为激素疗法的辅助物、作为手术疗法的辅助物或作为其他类型抗体疗法的辅助物施与需要治疗或阻止转移性乳腺癌的受试者,有效治疗或阻止转移性乳腺癌。在另外的实施方案中,抗hPG抗体组合物可以作为其他有效阻止乳腺癌复发的疗法的辅助物施与需要阻止乳腺癌复发的受试者。
作为辅助性疗法,抗hPG抗体组合物可以与主要疗法一起同时、相继或分别施用。
当抗hPG抗体组合物和主要疗法在相同时间施用,则抗hPG抗体组合物和主要疗法是同时施用的,即使当分别的施用重叠但是在不同时间开始或结束时也是同时施用。同时施用的非限制性实例是在受试者接受转移性乳腺癌化疗或接受手术切除原发性乳腺肿瘤的同时,施用抗hPG抗体组合物。
当抗hPG抗体组合物和主要疗法在相同日(例如在相同的临床就诊期间)但不同时施与受试者,则抗hPG抗体组合物和主要疗法是相继施用。相继施用可以间隔1、2、3、4、5、6、7或8小时或更多小时发生。可以首先施用主要疗法,随后施用抗hPG抗体组合物。在一个备选实施方案中,可以首先施用抗hPG抗体组合物,随后是主要疗法。
当抗hPG抗体组合物和主要疗法在不同日施与受试者,则抗hPG抗体组合物和主要疗法是分别施用的。在某些实施方案中,抗hPG抗体组合物和主要疗法可以按1日、2日、3日、4日、5日、6日、1周、2周、3周或1个月或更长的时间间隔施用。就相继施用而言,抗hPG抗体组合物的施用可以先于或后于主要疗法的独立施用。
在本公开的某些其他实施方案中,抗hPG抗体组合物和主要疗法可以按交替模式反复施用,无论是否是相继施用还是分别施用。
在某些实施方案中,施用作为主要疗法的辅助物的抗hPG抗体组合物可以产生大于相加效应的作用或协同效应,从而提供在这两种疗法均不能以治疗有效而不招致难以容忍性副作用的量单独施用时的治疗益处。在这些情况下,抗hPG抗体组合物和/或主要疗法可以按更低的量施用,从而降低副作用的可能性或严重性。然而,对于采用抗hPG抗体组合物的辅助疗法治疗有效而言,不要求协同效应。
7.10监测转移性乳腺癌治疗的功效的方法
如上文指出,诊断患有原发性和/或转移性乳腺癌的患者具有升高的PG血浆和/或血清水平,而健康个体中PG的基线水平是可忽略的。在患有原发性和/或转移性乳腺癌的受试者中的PG血浆和/或血清水平是可测量的并且对于转移性乳腺癌而言是约25pM或更大。基于这种观察结果,PG的血浆和/或血清水平尤其可以用来监测原发性或转移性乳腺癌治疗的有效性、检测和诊断原发性或转移性乳腺癌的存在并且选择可能从抗PG抗体治疗中获益的受试者。
因而,本公开提供了监测因乳腺转移性癌症而正在治疗的受试者以确定前一轮转移性乳腺癌疗法之有效性的方法。这些方法可以用于任何类型针对转移性乳腺癌的疗法,所述疗法是单独使用的或与其他疗法组合的疗法,包括但不限于施用抗hPG抗体组合物、采用其他类型抗体的疗法、化疗、辐射疗法、激素疗法、生物疗法和其他。在一轮疗法结束后,负责护理受试者的治疗团队需要确定疗法是否有效,以决定是否施用新一轮疗法和作出其他临床决定。
在监测方法的一些实施方案中,可以在启动转移性乳腺癌疗法之前测量一种或多种体液(如血液、血浆、血清或其他)中PG的浓度并且随后将其与治疗结束后某个时间在相同类型体液中所测量的PG水平比较。在其他实施方案中,测量目的组织(如乳腺癌的活组织检查样品)中的PG水平。
PG浓度的降低表示有功效。一般地而言,治疗后PG减少的程度越大,疗法越有效。不希望受任何具体的操作理论约束,认为随着患者中转移灶的数目和/或尺寸因有效治疗而缩减,由转移灶产生的PG的总量也下降。相反地,在治疗结束后PG水平没有降低或PG水平上升可能表明该疗法不是有效的。基于这种信息,治疗团队可以决定是否启动新一轮疗法。
在一轮疗法结束后取得样品用于监测之前的合适时间间隔由本领域普通技术人员轻易地确定并且取决于此类变量如所考虑的疗法类型、受试者性别和年龄及其他。示例性时间间隔包括在一轮疗法结束后取得样品用于本公开的监测方法中之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11周和3、4、5或6个月。其他时间间隔也是可能的。在其他实施方案中,可以在治疗结束后以不同间隔期取得多个量值,并且随后绘图以确定趋势是否存在。在非限制性实例中,可以在一轮治疗结束后的头六个月每周或每月测定PG水平。其他时间间隔也是可能的。
体液中的PG浓度水平可以是使用本领域普通技术人员熟悉的分析技术(如但不限于RIA和ELISA)测量。根据本领域普通技术人员的知识,可以使用非中和性或中和性抗体(如本文公开的那些)实施分析方法,如依赖于对hPG特异的抗体的那些方法。
在一个具体实施方案中,可以使用夹心ELISA测量PG水平,其中所述夹心ELISA采用一个靶向胃泌素原N端的抗PG抗体和一个靶向胃泌素原C端的第二抗PG抗体。在稍后部分中描述用于这种夹心测定法的示例性N端和C端抗PG抗体。在这种测定法中,制备了与已知量的第一“捕获”N端或C端抗PG抗体结合的表面,如96孔板中的孔。随后将测试样品施加至该表面,随后是孵育时期。随后将表面洗涤以移去未结合的抗原,并且施加含有第二“检测”抗PG抗体的溶液,其中检测抗体结合PG的不同表位(例如,如果捕获抗体是C端抗PG抗体,则使用N端抗PG抗体作为检测抗体,并且反之亦然)。然后直接(如果例如将检测抗体与可检测标记缀合)或间接(通过结合检测抗PG抗体的标记第二抗体)测量PG水平。在实施例11中提供用于测量血浆和/或血清PG水平的具体夹心测定法。
在本公开方法的一个备选实施方案中,可以监测施用抗hPG抗体组合物至受试者在降低目的体液中的PG水平方面的功效。在这些方法中,可以随时间推移取得样品并且将PG浓度作图以评估趋势。如果疗法有效治疗转移性乳腺癌的话,在残余抗hPG抗体存在的情况下,数据可以显示为PG水平因PG被抗体阻隔而降低,随后因这种作用削弱而升高,然后接着下降。
根据本公开方法的其他实施方案,在小于约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、1pM或更小的预定阈值以下的血液、血清或血浆PG浓度指示了治疗转移性乳腺癌的功效。指示功效的其他PG浓度阈值也是可能的并且由本领域普通技术人员轻易地确定。
7.11确定存在乳腺癌的方法
本公开还提供了某些实施方案,根据这些实施方案,可以对受试者测试以确定与适宜的基线相比,它们是否在体液(如血液、血浆、血清或其他)中具有升高的PG水平,目的在于检测乳腺癌的存在或治疗后乳腺癌的复发。
在本公开方法的某些实施方案中,受试者可以是这样一位受试者,对其而言需要确定原发性或转移性乳腺癌是否在这位受试者中存在。在此类受试者中,相对于基线而言升高的PG水平表示存在乳腺癌。不希望受任何具体操作理论约束,认为随着受试者中乳腺癌的大小和/或程度增加,全身性和/或局限化PG水平也在该受试者中增加。
在其他实施方案中,受试者可以是先前治疗过原发性乳腺癌的一位受试者,对其而言需要确定乳腺癌是否已经转移至远端的组织或器官。在此类受试者中,相对于基线而言升高的PG水平表示存在转移性乳腺癌。对于此类受试者,本公开的方法尤其也用于确定意图阻止转移性乳腺癌的疗法是否有效。不希望受任何具体操作理论约束,认为随着受试者中转移灶的数目和/或大小增加,全身性和/或局限化PG水平也在该受试者中增加。
根据另外的实施方案,受试者可以是先前治疗过原发性或继发性乳腺癌的一位受试者,其中癌症明显消失并且其中需要确定乳腺癌是否已经复发或回复。在此类受试者中,相对于基线而言升高的PG水平表示乳腺癌已经复发。不希望受任何具体操作理论约束,认为随着受试者中复发性乳腺癌的大小和/或程度增加,全身性和/或局限化PG水平也在该受试者中增加。
考虑到本文所述的研究结果:某些原发性和转移性乳腺癌分泌PG并且某些乳腺癌细胞是PG敏感的,本公开还提供了选择受试者的方法,所述受试者可以因施用抗PG抗体而从疗法中获益。因而,受试者可以由护理提供者筛查以检测他们是否相对于基线具有升高的血液PG水平。一旦鉴定出此类受试者,则护理提供者可以要求额外的测试(如乳房X射线照片术)以证实受试者中存在乳腺癌。如果乳腺癌得到证实,则可以开始治疗,包括施用抗hPG抗体。
在用于选择受试者的方法的某些实施方案中,筛查可以作为例行体检的部分由受试者的初级保健医师进行或作为以更大受试者群体为目标的公共卫生计划的部分来进行。在其他实施方案中,待筛查的受试者是具有高于平均的乳腺癌形成风险的特定亚群体的成员。此类群体包括但不限于在增加的乳腺癌风险相关的BRCA1基因、BRCA2基因或其他基因中具有突变的受试者。其他群体包括具有非恶性乳腺异常,如原位导管癌(DCIS)或原位小叶癌(LCIS)的受试者、具有诊断患有乳腺癌的一级亲属(姐妹、母亲或女儿)的受试者、暴露于胸部照射的受试者、具有早初潮、晚绝经或高龄初产史的受试者、使用避孕药的受试者、具有高身体质量指数的受试者或摄入高脂膳食或饮酒的受试者。另外的类群包括之前诊断有乳腺癌并且成功经过治疗的受试者。
在选择受试者的方法的另外实施方案中,待筛查的受试者是接到并未明确判定或排除存在乳腺癌的乳腺癌诊断试验结果的那些受试者。筛选升高的PG水平可以提供待由护理提供者用来改善诊断准确度的额外信息。此类受试者的一个非限制性实例将是那些接到不确定、模糊或难以读取乳房X射线照片的结果的那些受试者。
PG浓度可以是使用普通技术人员熟悉的技术(如但不限于RIA和ELISA)测量。根据本领域普通技术人员的知识,可以使用非中和性或中和性抗体(如本文公开的那些)实施分析方法,如依赖于对hPG特异的抗体的那些方法。
基于使用本公开的方法检测到升高的PG水平,治疗团队可以随后决定是否采取额外测试以证实乳腺癌的存在或乳腺癌在治疗后复发,或直接推进至治疗受试者。
可以使用与受试者中测量到的PG水平相比较的不同基线。在本公开方法的一些实施方案中,通过测量目的体液中的PG水平建立基线,所述目的体液在先前时间从相同受试者中采样。可以按照预定的时间间隔取得此类样品,并且测量PG水平。在非限制性实例中,在治疗结束后头六个月每周或每月、随后每三个月一次直至治疗结束第二年并且随后每6个月或一年测量PG水平。其他预定的时间间隔也是可能的。
在本公开方法的其他实施方案中,可以在与接受采样以检测乳腺癌或乳腺癌复发的那些受试者具有相似特征的个体群体中从平均PG水平建立基线。此类特征可以包括,但是不必然地限于性别、年龄、原发性乳腺肿瘤的分期、先前暴露于某些治疗、或这些因素的组合及其他因素。在另外的实施方案中,受试者特异性基线以及群体衍生基线均可以用于评估受试者的状况。
根据本领域普通技术人员的知识,在来自受试者的样品中相对于基线超过某个阈值的PG水平被推断为患有乳腺癌、治疗后已经复发的乳腺癌,或可能从抗hPG抗体处理中获得治疗益处的受试者。治疗团队随后可以采取验证性测试以证实存在乳腺癌或复发性乳腺癌。此类测试的非限制性实例包括包括探查手术、成像术如乳房X射线照片术和检查血液或其他组织中乳腺癌产生的生物学因子的存在。
因为进食通常增加胃泌素合成和分泌,所以进食可以导致血液PG水平的短暂增加,这可以干扰在正就治疗功效和转移存在进行监测的患者中精确测量由乳腺癌转移或复发性乳腺癌产生的PG。为避免这种影响,尤其待测定血浆和/或血清中的PG水平的情况下,可以从禁食足够时间后的受试者取得样品,这一点可以由本领域普通技术人员轻易地确定。
7.12药物组合物
用于本公开的方法中的抗hPG抗体可以配制为组合物。任选地,组合物可以包含一个或多个额外的治疗剂,如具有针对转移性乳腺癌或乳腺癌复发的治疗性功效的化疗剂或其他抗体。组合物通常将作为无菌药物组合物的部分提供,该无菌药物组合物通常将包含可药用载体。这种组合物可以是任意适合的形式,其取决于所需的施用它至患者的方法。
抗PG抗体可以通过多种途径,一般肠胃外地施与受试者,例如,通过皮下、静脉内、腹膜内或肌内注射。施用可以作为一个或多个快速浓注(bolus)或作为一个或多个输注实施。根据本领域普通技术人员的知识,其他施用途径也是可能的。在任意给定的情况下最合适的施用途径将取决于待施用的具体组合物和受试者的特征如年龄或性别。
药物组合物可以便利地以每剂量含有预定量的本公开抗hPG抗体的单位剂量形式提供。这种单位可以包含例如但不限于5mg至5g,例如10mg至1g或20至50mg。取决于例如施用途径,用于本公开的可药用载体可以采用多种形式。
可以通过将具有希望的纯度的抗体与可选的本领域中通常利用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(在本文中全都称为“载体”)(即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂(isotonifier)、非离子型去垢剂、抗氧化剂和其他多种混合添加物)混合,将本公开的药物组合物制备为冻干制剂或水溶液进行保存。见Remington′sPharmaceuticalSciences,第16版(Osol编辑1980)。这类添加剂必须在所利用的剂量和浓度对接受者无毒性。
缓冲剂帮助维持pH在接近生理条件的范围内。它们可以按约2mM至约50mM的范围内的浓度存在。适合用于本公开的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐二者,如柠檬酸缓冲液(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡糖酸缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外,可以使用磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐(如Tris)。
可以添加防腐剂来延缓微生物生长,且可以按0.2%-1%(w/v)的范围内的量添加。适合用于本公开的防腐剂包括酚、苄醇、间甲酚、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苄烷铵卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯己双铵和尼泊金烷基酯(如尼泊金甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以加入等渗剂(有时称为“稳定剂”)来确保本公开的液体组合物的等渗性,其包括多元糖醇,例如三元糖醇或高级糖醇,如丙三醇、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。稳定剂指一大类赋形剂,其功能可以从填充剂至稳定治疗剂或帮助防止变性或黏附于容器壁的添加剂。常见的稳定剂可以是多元糖醇(上文所列);氨基酸,如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等;有机糖或糖醇,如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、丙三醇等,包括环多醇,如肌醇(inositol);聚乙二醇;氨基酸聚合物;含硫还原剂,如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠;低分子量多肽(例如10个残基或更少残基的肽);蛋白质,如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;单糖,如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖;二糖,如乳糖、麦芽糖、蔗糖;三糖,如蜜三糖;和多糖,如葡聚糖。稳定剂可以以每份重量的活性蛋白质0.1至10,000重量存在。
可以添加非离子型表面活性剂或去垢剂(也称为“湿润剂”)来帮助溶解治疗剂,以及保护治疗性蛋白质免受搅拌诱导的聚集,其还允许制剂暴露于应力剪切表面而不导致蛋白质变性。适宜的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、Polyoxamer(184、188等)、多聚醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐单醚(等)。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml,例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。然而,表面活性剂具有与抗体结合的倾向性并且可以损害抗体的构象。因此,在使用表面活性剂时,起稳定作用的浓度应当是低的并且实验地断定。
其他的多种赋形剂包括螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。
抗hPG抗体可以单一地施用或作为一种或多种抗hPG抗体的混合物单独施用或与用于阻止乳腺癌转移或复发的其他药物(包括但不限于化疗剂、激素治疗剂、生物治疗剂和抗体治疗剂(例如,贝伐单抗))混合或组合施用。
7.13药物试剂盒
在某些实施方案中,本发明提供了由临床医生或其他人使用的药物试剂盒。药物试剂盒是一种包装,其包含本公开的抗hPG抗体(例如以冻干的形式或作为水溶液)和以下一种或多种:如本公开中其它地方所描述的至少第二治疗剂;施用抗hPG抗体的装置,例如,针头和/或注射器;和如果抗体为冻干或浓缩形式用于重悬或稀释抗体的药物级水或缓冲液。试剂盒也可以包括用于制备抗体组合物和/或施用该组合物至患者的说明书。
每个单位剂量的抗hPG抗体组合物可以单独地包装,并且试剂盒可以含有一个或多个单位剂量(例如,2个单位剂量、3个单位剂量、4个单位剂量、5个单位剂量、7个单位剂量、8个单位剂量、10个单位剂量或更多)。在一个实施方案中,一个或多个单位剂量各自装在注射器,并且在另一个实施方案中,一个或多个单位剂量各自包含于适合与静脉内导管连接的袋内或相似容器内。
7.14有效剂量
包含本公开的中和性抗hPG抗体的组合物通常以有效(至少部分)实现所需结局的剂量施与需要治疗或阻止乳腺癌转移或阻止乳腺癌复发的受试者。
就治疗乳腺癌转移而言,治疗益处尤其意指转移性乳腺癌的任何改善、停顿或减慢乳腺癌转移灶的生长、减少此类转移灶在受试者内部的数目和/或大小、减少流向乳腺癌转移灶的血流量、降低乳腺癌转移灶的代谢、降低乳腺癌转移性癌症的严重性、抑制转移性乳腺癌细胞的增殖或增加其凋亡、停顿或延迟受试者中与转移性乳腺癌相关的症状或体征加重、允许手术切除乳腺癌转移灶,而在治疗之前此类切除本来已经不可能、增加患有转移性乳腺癌的受试者的寿命、舒适感或生活质量或减少这种受试者中的疼痛。对于治疗益处存在而言,不要求转移性乳腺癌的完全治愈,尽管转移性乳腺癌的完全治愈是所希望的。
转移性乳腺癌肿瘤尺寸、数目和代谢可以使用多种扫描技术,包括但不限于CT、MRI、功能MRI、SPECT和PET以及本领域普通技术人员已知的其他方法测量。
治疗益处也可以与一个或多个代用终点相关。通过举例方式,不受限制地,可以在受试者中随时间推移测量转移性乳腺癌产生某些蛋白质或其他因子,如胃泌素原或癌胚抗原(CEA),其中所述因子水平的降低表示治疗益处。
就阻止乳腺癌转移而言,有效剂量是这样的量,所述量至少部分地有效阻止转移性乳腺癌,尤其如以下佐证:不存在乳腺癌转移、延迟、停顿或减慢乳腺癌转移灶的生长、减少最终可能出现的任何乳腺转移灶的数目和/或大小并且抑制或干扰转移性乳腺癌细胞能够借以从原发性肿瘤扩散出来的任何机理性步骤。对于功效存在而言,不要求完全阻止乳腺癌转移,尽管完全阻止乳腺癌转移是所希望的。
就阻止乳腺癌复发而言,有效剂量是这样的量,所述量至少部分地有效阻止乳腺癌复发,尤其如以下佐证:不存在乳腺癌复发、维持乳腺癌消退、或延迟、停顿或减慢其中初始乳腺癌变得不可检测到或明显消失的治疗后受试者中乳腺癌复现或再生长或新乳腺肿瘤生长。阻止乳腺癌复发的功效尤其也由以下情况佐证:杀死乳腺癌干细胞、延迟、停顿、抑制或减慢乳腺癌干细胞的生长或增殖、增加乳腺癌干细胞凋亡或引起乳腺癌干细胞分化成不能够有助于乳腺癌形成或生长的细胞。如本文其他处所描述,乳腺癌干细胞可鉴定为具有表示此类细胞特征的一个或多个表型属性,包括但不限于某些细胞标志物的表达,在低黏附培养条件下生长为球状体的能力和移植后启动新肿瘤生长的能力。对于功效存在而言,不要求完全阻止乳腺癌复发,尽管完全阻止乳腺癌复发是所希望的。
为实现治疗性功效不必然要求结合全部胃泌素原。相反地,系统性降低肿瘤内部、尤其体液如腹水、来自胸膜渗出液、脑脊液、淋巴液、血液、血浆、血清或其他地方的流体内部胃泌素原的浓度也可以是有效的。
根据本领域普通技术人员的知识,可以在患者中用滴定法测量抗hPG抗体组合物的剂量,从而在施用后在预定时间降低目的组织或体液中的游离hPG浓度至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%、或约5%-10%、约10%-15%、约15%-20%、约20%-25%、约25%-30%、约30%-35%、约35%-40%、约40%-45%、约45%-50%、约50%-55%、约55%-60%、约60%-65%、约65%-70%、约70%-75%、约75%-80%、约80%-85%、约85%-90%、或约90%-95%、或范围在任何前述值之间的游离hPG浓度降低百分数。
所施用的抗hPG抗体的量将取决于多种因素,包括待治疗的受试者体格大小和重量、施用的形式、途径和部位,治疗方案(例如是否使用第二治疗剂),正在治疗的具体受试者的年龄和病症、在治疗之前的所述受试者血液中检测到的PG水平、正在用抗PG抗体治疗的受试者的敏感性。本领域技术人员可以容易地测定适宜剂量。最终,临床医生将决定待使用的适当剂量。可以根据需要重复此剂量。如果出现副作用,可以按照正常临床实践改变或降低剂量的量和/或频率。适当的剂量和治疗方案可以通过使用本公开的方法或本领域普通技术人员已知的其他方法监测治疗进展来建立。
最初可以从体外测定法估计有效剂量。例如,可以配制用于动物的起始剂量来达到抗hPG抗体的循环血液或血清浓度,该浓度处于或高于体外测量的抗体对胃泌素原的结合亲和力。考虑具体抗体的生物利用率来计算达到这类循环血液或血清浓度的剂量良好地处于技术人员的能力范围之内。对于指导,读者可参考第1部分:总原则(GeneralPrinciples),引自″GoodmanandGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics”,第11版,Hardman,J.G.等,编著,McGraw-HillProfessional及其中引用的参考文献。也可以从体内数据(如动物模型)估计起始剂量。普通技术人员可以常规地改编这类信息来确定适合用于人施用的剂量。
在具体实施方案中,可以通过以下方式确定个体受试者的静脉内剂量;在治疗之前一些日至一些周测量该个体的血清或血浆PG浓度若干次并且计算将具有饱和作用的抗PG抗体量,即,足以结合全部PG的量。如技术人员将理解,对给定PG血清或血浆浓度实现饱和作用所需要的任何特定抗体的量将部分地取决于特定抗体的亲和常数。用于计算特定目的抗PG抗体的饱和量的方法是熟知的。
为确保饱和,可以施用大于计算饱和量的量,例如,可以施用大于计算饱和量至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或甚至10倍的量。对于除静脉内施用之外的施用模式,如本领域熟知,可以基于药物代谢动力学和生物利用率调整这个量。
取决于寻求阻止复发的癌症的类型、施用途径及受试者的年龄、体重和状态,抗hPG抗体组合物的有效剂量可以是每个单次施用(例如,快速浓注)、多次施用或持续施用(例如,输注)从约0.001mg/kg至约250mg/kg或其中任意有效范围或值。在某些实施方案中,每个剂量可以是从约0.1mg/kg至约0.5mg/kg;约0.25mg/kg至约0.75mg/kg;约0.5mg/kg至约1mg/kg;约2mg/kg;约1.5mg/kg至约2.5mg/kg;约2mg/kg至约3mg/kg;约2.5mg/kg至约3.5mg/kg;约3mg/kg至约4mg/kg;约3.5mg/kg至约4.5mg/kg;约4mg/kg至约5mg/kg;约5mg/kg至约7mg/kg;约6mg/kg至约8mg/kg;约7mg/kg至约9mg/kg;约8mg/kg至约10mg/kg;约10mg/kg至约15mg/kg;约12.5mg/kg至约17.5mg/kg;约15mg/kg至约20mg/kg;约17.5mg/kg至约22.5mg/kg;约20mg/kg至约25mg/kg;约22.5mg/kg至约27.5mg/kg;约25mg/kg至约30mg/kg;约30mg/kg至约40mg/kg;约35mg/kg至约45mg/kg;约40mg/kg至约50mg/kg;约45mg/kg至约55mg/kg;约50mg/kg至约60mg/kg;约55mg/kg至约65mg/kg;约60mg/kg至约70mg/kg;约65mg/kg至约75mg/kg;约70mg/kg至约80mg/kg;约75mg/kg至约85mg/kg;约80mg/kg至约90mg/kg;约85mg/kg至约95mg/kg;约90mg/kg至约100mg/kg;约95mg/kg至约105mg/kg;约100mg/kg至约150mg/kg;约125mg/kg至约175mg/kg;约150mg/kg至约200mg/kg;约175mg/kg至约225mg/kg;约200mg/kg至约250mg/kg。其他剂量范围也是可能的。
施用的量、频率和持续时间将取决于多种因素,如患者年龄、体重和疾病状态。因而,在非限制性实例中,治疗性施用方案可以持续1日或更长、2日或更长、3日或更长、4日或更长、5日或更长、6日或更长、1周或更长、2周至无限期、2周至6个月、3个月至5年、6个月至1年或2年、8个月至18个月等。任选地,提供治疗方案用于反复施用,例如每日一次、每日两次、每两日、三日、五日、一周、两周或一个月。可以按相同的剂量或按不同的剂量反复施用。可以反复施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。可以作为单次剂量或在治疗方案的过程内(例如在一周、两周、三周、一个月、三个月、六个月、一年或更长的过程内)施用治疗有效量的抗hPG抗体。