JPWO2008032876A1 - Ｅｒ陰性およびｈｅｒ２陰性である乳癌の予防または治療剤およびそのスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、（１）Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤、（２）Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤、（３）Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体などのホルモン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法などを提供する。
Description
本発明は、Ａｋｔ阻害剤を含有してなる乳癌の予防または治療剤に関し、特に、（１）エストロゲン受容体（以下、ＥＲともいう）陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤、（２）ＥＲ陰性、プロゲステロン受容体（以下、ＰｇＲともいう）陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤などに関する。
また、本発明は、Ａｋｔ阻害活性を指標として、（１）ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌、（２）ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌などの予防または治療剤をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、Ａｋｔ阻害活性を指標として、（１）ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌、（２）ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌などの予防または治療剤をスクリーニングする方法に関する。
乳癌に罹る女性は年々増加しており、現在、女性では胃癌を抜いて最も頻度の高い癌となっている。日本に限っても、毎年、３万人以上が罹患し、年齢を調整した罹患率では女性の癌の第１位であり、１万人弱が亡くなっている。
乳癌の約６０〜８０％は、女性ホルモン（エストロゲン、プロゲステロン）の影響を受けて成長し増殖するとされており、その指標であるホルモン受容体（ＥＲ、ＰｇＲ）が存在する乳癌にはホルモン療法（抗エストロゲン薬など）が有効である。
ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２と呼ばれることもある）は、ＥＧＦ受容体ファミリーに属するチロシンリン酸化酵素活性を有する受容体であり、癌の増殖・悪性化に関与する因子である。ＨＥＲ２は、乳癌、肺癌、大腸癌、膵癌、卵巣癌などの種々の腫瘍に高発現しており、ＨＥＲ２発現患者の予後は不良である（Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２７巻、５号、２０００年、Ｓｕｐｐｌｍｅｎｔ ９、１３−１９頁）。これより、ＨＥＲ２発現腫瘍に対する抗ＨＥＲ２療法は、腫瘍増殖を抑制するものと期待され、ＨＥＲ２に対するヒト化モノクローナル抗体（ハーセプチン（登録商標））は、ＨＥＲ２高発現の化学療法剤抵抗性転移性乳癌に対し臨床で効果を示している（非特許文献１：Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２９巻、３号、Ｓｕｐｐｌｍｅｎｔ １１、２００２年、３８−４３頁）。
ところで、別名プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれる細胞内シグナル伝達因子であるＡｋｔと乳癌の関係について、次のような知見が報告されている。
ｉ） リン酸化Ａｋｔは、乳癌患者の予後の悪さ、乳癌の転移若しくは再発と正の相関関係があること（非特許文献２：Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ８６号、５４０−５４５頁、２００２年）、
ｉｉ） リン酸化Ａｋｔは、乳癌のホルモン療法感受性と逆の相関関係があること（非特許文献３：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２巻、３２０５−３２１２頁、２００３年；非特許文献４：Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ４２巻、６２９−６３５頁、２００６年）、
ｉｉｉ） リン酸化Ａｋｔは、乳癌の放射線療法感受性と逆の相関関係があること（非特許文献５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻、５号、１１８３−１１８９頁、２００６年）、
ｉｖ） リン酸化Ａｋｔは、乳癌の抗ＨＥＲ２薬の薬物感受性を低下させること（非特許文献６：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２３巻、１１号、２４６９−２４７６頁、２００５号；非特許文献７：Ｎａｔｕｒｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ：ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３巻、５号、２６９−２８０頁、２００６年）
ｖ） リン酸化Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ系）は、乳癌治療剤の良い分子標的になりうること（非特許文献８：Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １３巻、２号、１３７−１４４頁、２００６年）。
乳癌の約６０〜８０％は、女性ホルモン（エストロゲン、プロゲステロン）の影響を受けて成長し増殖するとされており、その指標であるホルモン受容体（ＥＲ、ＰｇＲ）が存在する乳癌にはホルモン療法（抗エストロゲン薬など）が有効である。
ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２と呼ばれることもある）は、ＥＧＦ受容体ファミリーに属するチロシンリン酸化酵素活性を有する受容体であり、癌の増殖・悪性化に関与する因子である。ＨＥＲ２は、乳癌、肺癌、大腸癌、膵癌、卵巣癌などの種々の腫瘍に高発現しており、ＨＥＲ２発現患者の予後は不良である（Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２７巻、５号、２０００年、Ｓｕｐｐｌｍｅｎｔ ９、１３−１９頁）。これより、ＨＥＲ２発現腫瘍に対する抗ＨＥＲ２療法は、腫瘍増殖を抑制するものと期待され、ＨＥＲ２に対するヒト化モノクローナル抗体（ハーセプチン（登録商標））は、ＨＥＲ２高発現の化学療法剤抵抗性転移性乳癌に対し臨床で効果を示している（非特許文献１：Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２９巻、３号、Ｓｕｐｐｌｍｅｎｔ １１、２００２年、３８−４３頁）。
ところで、別名プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれる細胞内シグナル伝達因子であるＡｋｔと乳癌の関係について、次のような知見が報告されている。
ｉ） リン酸化Ａｋｔは、乳癌患者の予後の悪さ、乳癌の転移若しくは再発と正の相関関係があること（非特許文献２：Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ８６号、５４０−５４５頁、２００２年）、
ｉｉ） リン酸化Ａｋｔは、乳癌のホルモン療法感受性と逆の相関関係があること（非特許文献３：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２巻、３２０５−３２１２頁、２００３年；非特許文献４：Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ４２巻、６２９−６３５頁、２００６年）、
ｉｉｉ） リン酸化Ａｋｔは、乳癌の放射線療法感受性と逆の相関関係があること（非特許文献５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻、５号、１１８３−１１８９頁、２００６年）、
ｉｖ） リン酸化Ａｋｔは、乳癌の抗ＨＥＲ２薬の薬物感受性を低下させること（非特許文献６：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２３巻、１１号、２４６９−２４７６頁、２００５号；非特許文献７：Ｎａｔｕｒｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ：ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３巻、５号、２６９−２８０頁、２００６年）
ｖ） リン酸化Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ系）は、乳癌治療剤の良い分子標的になりうること（非特許文献８：Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １３巻、２号、１３７−１４４頁、２００６年）。
近年、乳癌の薬物療法は長足の進歩を遂げているが、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）などのホルモン受容体またはＨＥＲ２受容体が発現していない患者、また診断時にはそれらの受容体発現が確認されていても、薬物治療中に受容体が欠落し、治療に反応しなくなる患者（不応・抵抗性）は、その恩恵から取り残されている。このような状況下、ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である２重陰性乳癌患者、ＥＲ陰性、ＨＥＲ２陰性およびＰｇＲ陰性である、３重陰性（ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）乳癌患者などに対する有効な薬物および化学療法が強く求められている。特に３重陰性乳癌は、治療法が確立しておらず有効な薬物もないために予後の不良が著しく、その治療薬が切望されている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、（１）ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌組織、並びに、（２）ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌組織においてＡｋｔのリン酸化が亢進しており、Ａｋｔを含むシグナル伝達経路がＥＲ、ＰｇＲなどのホルモン受容体またはＨＥＲ２受容体陰性乳癌の増殖、悪性化に強く関与している事を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下に示すＡｋｔ阻害剤を含有してなる乳癌の予防又は治療剤、そのような乳癌の予防または治療剤薬をスクリーニングする方法などを提供する。
〔１〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔２〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔２ａ〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔２ｂ〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔２ｃ〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、プロゲステロン受容体陰性、エストロゲン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔３〕Ａｋｔが、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３から選択される１種又は２種以上である上記〔１〕〜〔２ｃ〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔３ａ〕Ａｋｔ阻害剤が、Ａｋｔのリン酸化を阻害する物質またはＡｋｔの発現を阻害する物質である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔４〕Ａｋｔ阻害剤が、（ａ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（ｂ）Ａｋｔの発現を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（ｃ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体、（ｄ）Ａｋｔの発現を阻害する抗体、（ｅ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、（ｆ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、（ｇ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、（ｈ）Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドおよび（ｉ）Ａｋｔに対するアプタマーからなる群から選択される１種または２種以上である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔４ａ〕Ａｋｔ阻害剤が、１Ｌ−６−ヒドロキシメチル−クロロ−イノシトール２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシルカーボネート、ＳＨ−５、ＳＨ−６、ＮＬ−７１−１０１、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｈ−ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ−ＯＨ）、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｈ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ−ＯＨ）およびＴＡＴ−ＴＣＬ１１０−２４から選択される１種以上である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔５〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔６〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔６ａ〕（ｉ）試験化合物をホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）試験化合物を該細胞に接触させない場合との、該細胞のＡｋｔのリン酸化量の比較を行うことを特徴とするホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬のスクリーニング方法。
〔７〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔８〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔９〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、プロゲステロン受容体陰性、エストロゲン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔１０〕エストロゲン受容体陰性が、乳癌組織切片に存在するエストロゲン受容体タンパク質を免疫組織染色法により検出し、核が染色されている陽性細胞の腫瘍全体に占める割合が１０％未満である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔１１〕プロゲステロン受容体陰性が、乳癌組織切片に存在するプロゲステロン受容体タンパク質を免疫組織染色法により検出し、核が染色されている陽性細胞の腫瘍全体に占める割合が１０％未満である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔１２〕ＨＥＲ２陰性が、乳癌組織切片に存在するＨＥＲ２タンパク質を免疫組織染色法により検出し、強度が弱から中程度に細胞膜全体が染色された陽性細胞の腫瘍全体に占める割合が１０％未満である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔１３〕エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療のためのＡｋｔ阻害剤の使用。
〔１４〕エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療のためのＡｋｔ阻害剤の使用。
〔１５〕エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬の製造のためのＡｋｔ阻害剤の使用。
〔１６〕エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬の製造のためのＡｋｔ阻害剤の使用。
〔１７〕エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療方法であって、Ａｋｔ阻害剤の有効量をそのような予防又は治療が必要な患者に投与する方法。
〔１８〕エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療方法であって、Ａｋｔ阻害剤の有効量をそのような予防又は治療が必要な患者に投与する方法。
本発明によれば、（１）エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（２）プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌、（３）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（４）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（５）エストロゲン受容体陽性、プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌などに対して有効な乳癌の予防または治療剤を提供できる。
また、先天的あるいは後天的に何らの原因によって、ＥＲ、ＰｇＲなどのホルモン受容体およびＨＥＲ２受容体が発現していない乳癌患者、また診断時には受容体発現が確認されていても、薬物治療中に受容体が欠落し、治療に反応しなくなる乳癌患者（不応・抵抗性）、に対しても有効な薬物および化学療法を提供できる。
さらに、本発明によれば、Ａｋｔリン酸化を指標として、ホルモン受容体およびＨＥＲ２受容体が発現していない乳癌の治療に有効な薬物をスクリーニングする方法を提供することができる。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、（１）ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌組織、並びに、（２）ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌組織においてＡｋｔのリン酸化が亢進しており、Ａｋｔを含むシグナル伝達経路がＥＲ、ＰｇＲなどのホルモン受容体またはＨＥＲ２受容体陰性乳癌の増殖、悪性化に強く関与している事を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下に示すＡｋｔ阻害剤を含有してなる乳癌の予防又は治療剤、そのような乳癌の予防または治療剤薬をスクリーニングする方法などを提供する。
〔１〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔２〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔２ａ〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔２ｂ〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔２ｃ〕Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、プロゲステロン受容体陰性、エストロゲン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
〔３〕Ａｋｔが、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３から選択される１種又は２種以上である上記〔１〕〜〔２ｃ〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔３ａ〕Ａｋｔ阻害剤が、Ａｋｔのリン酸化を阻害する物質またはＡｋｔの発現を阻害する物質である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔４〕Ａｋｔ阻害剤が、（ａ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（ｂ）Ａｋｔの発現を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（ｃ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体、（ｄ）Ａｋｔの発現を阻害する抗体、（ｅ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、（ｆ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、（ｇ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、（ｈ）Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドおよび（ｉ）Ａｋｔに対するアプタマーからなる群から選択される１種または２種以上である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔４ａ〕Ａｋｔ阻害剤が、１Ｌ−６−ヒドロキシメチル−クロロ−イノシトール２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシルカーボネート、ＳＨ−５、ＳＨ−６、ＮＬ−７１−１０１、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｈ−ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ−ＯＨ）、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｈ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ−ＯＨ）およびＴＡＴ−ＴＣＬ１１０−２４から選択される１種以上である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔５〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔６〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔６ａ〕（ｉ）試験化合物をホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）試験化合物を該細胞に接触させない場合との、該細胞のＡｋｔのリン酸化量の比較を行うことを特徴とするホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬のスクリーニング方法。
〔７〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔８〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔９〕Ａｋｔ阻害活性を指標として、プロゲステロン受容体陰性、エストロゲン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
〔１０〕エストロゲン受容体陰性が、乳癌組織切片に存在するエストロゲン受容体タンパク質を免疫組織染色法により検出し、核が染色されている陽性細胞の腫瘍全体に占める割合が１０％未満である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔１１〕プロゲステロン受容体陰性が、乳癌組織切片に存在するプロゲステロン受容体タンパク質を免疫組織染色法により検出し、核が染色されている陽性細胞の腫瘍全体に占める割合が１０％未満である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔１２〕ＨＥＲ２陰性が、乳癌組織切片に存在するＨＥＲ２タンパク質を免疫組織染色法により検出し、強度が弱から中程度に細胞膜全体が染色された陽性細胞の腫瘍全体に占める割合が１０％未満である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳癌の予防または治療剤。
〔１３〕エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療のためのＡｋｔ阻害剤の使用。
〔１４〕エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療のためのＡｋｔ阻害剤の使用。
〔１５〕エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬の製造のためのＡｋｔ阻害剤の使用。
〔１６〕エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬の製造のためのＡｋｔ阻害剤の使用。
〔１７〕エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療方法であって、Ａｋｔ阻害剤の有効量をそのような予防又は治療が必要な患者に投与する方法。
〔１８〕エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療方法であって、Ａｋｔ阻害剤の有効量をそのような予防又は治療が必要な患者に投与する方法。
本発明によれば、（１）エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（２）プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌、（３）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（４）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（５）エストロゲン受容体陽性、プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌などに対して有効な乳癌の予防または治療剤を提供できる。
また、先天的あるいは後天的に何らの原因によって、ＥＲ、ＰｇＲなどのホルモン受容体およびＨＥＲ２受容体が発現していない乳癌患者、また診断時には受容体発現が確認されていても、薬物治療中に受容体が欠落し、治療に反応しなくなる乳癌患者（不応・抵抗性）、に対しても有効な薬物および化学療法を提供できる。
さらに、本発明によれば、Ａｋｔリン酸化を指標として、ホルモン受容体およびＨＥＲ２受容体が発現していない乳癌の治療に有効な薬物をスクリーニングする方法を提供することができる。
図１は、検体を（ｃ）の分類により分けたＡ−ＥＲ群、Ｂ−ＥＲ群、Ｃ−ＥＲ群およびＤ−ＥＲ群の各群における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を示す図である。
図２は、検体を（ｃ）の分類により分けたＡ−ＰｇＲ群、Ｂ−ＰｇＲ群、Ｃ−ＰｇＲ群およびＤ−ＰｇＲ群の各群における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を示す図である。
図３は、検体を（ｄ）の分類により分けた（ｖｉ）群（ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性の群）と、その他の群（（ｉ）群〜（ｖ）群）における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を示す図である。
図２は、検体を（ｃ）の分類により分けたＡ−ＰｇＲ群、Ｂ−ＰｇＲ群、Ｃ−ＰｇＲ群およびＤ−ＰｇＲ群の各群における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を示す図である。
図３は、検体を（ｄ）の分類により分けた（ｖｉ）群（ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性の群）と、その他の群（（ｉ）群〜（ｖ）群）における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を示す図である。
１．Ａｋｔ阻害剤を含有してなる乳癌の予防又は治療剤
まず、本発明は、Ａｋｔ阻害剤を含有してなる乳癌の予防または治療剤であって、（１）エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌、（２）ＥＲ陰性、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌などに対する予防または治療剤を提供する。
１．１ 本発明で用いられるＡｋｔ阻害剤
「Ａｋｔ」は、ｖ−ａｋｔ ｍｕｒｉｎｅ ｔｈｙｍｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇといい、別名プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれる細胞内シグナル伝達因子である。セリンスレオニンキナーゼの一種であり、癌の進行過程、インスリンシグナリングとグルコース代謝の調節、ニューロン機能において重要な役割を担うことが報告され、抗癌剤、糖尿病治療剤、脳梗塞、神経変性治療剤の標的とされている。Ａｋｔは、現在までにＡｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３の３つのアイソフォームが知られている。
「Ａｋｔ１」は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿００１０１４４３２、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００１０１４４３２に登録されている（Ｓｔａａｌ，Ｓ．Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｋｔ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ ＡＫＴ１ ａｎｄ ＡＫＴ２：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＫＴ１ ｉｎ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１４），５０３４−５０３７（１９８７））。
「Ａｋｔ２」は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿００１６２６、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００１６１７に登録されている（Ｓｔａａｌ，Ｓ．Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｋｔ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ ＡＫＴ１ ａｎｄ ＡＫＴ２：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＫＴ１ ｉｎ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１４），５０３４−５０３７（１９８７））。
「Ａｋｔ３」は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿００５４６５、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００５４５６に登録されている（Ｌｉ，Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｂｏｔｔａｒｏ，Ｄ．Ｐ．ａｎｄ Ｐｉｅｒｃｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ６４３ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ−ｄｅｌｔａ ａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３９），２４５５０−２４５５５（１９９７））。
なお、本明細書中、「Ａｋｔ」は一般的にＡｋｔタンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、Ａｋｔ遺伝子のことを意味する場合もある。
「Ａｋｔ阻害剤」は、Ａｋｔのリン酸化を阻害するまたはＡｋｔの発現を阻害する活性を有する物質をいい、Ａｋｔを介したシグナル伝達を阻害する物質を意味する。阻害には、Ａｋｔを介したシグナル伝達を完全に遮断することも、シグナルが減弱されることも含まれる。かかる物質としては、低分子若しくは高分子化合物のほか、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、抗体、アンチセンス、ペプチド、タンパク質、酵素などを用いることができる。
「Ａｋｔのリン酸化を阻害する」とは、Ａｋｔをリン酸化するタンパク質との相互作用を阻害すること、Ａｋｔのリン酸化部位を変質させてリン酸化を受けないようにしてリン酸化を阻害することなどによりＡｋｔの活性化を阻害することを意味する。
「Ａｋｔの発現を阻害する」とは、当該タンパク質の遺伝子の発現阻害を含む、当該タンパク質をコードする遺伝子からタンパク質生成までの一連の事象（例えば、転写（ｍＲＮＡの生成）、翻訳（タンパク質の生成）を含む）のうちのいずれかの事象を阻害することによって、当該タンパク質の生成を阻害することを意味する。
本発明で用いられるＡｋｔ阻害剤としては、Ａｋｔのリン酸化を阻害する物質またはＡｋｔの発現を阻害する物質等が用いられるが、具体的には、
（ａ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、
（ｂ）Ａｋｔの発現を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、
（ｃ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体、
（ｄ）Ａｋｔの発現を阻害する抗体、
（ｅ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、
（ｆ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、
（ｈ）Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド、および
（ｉ）Ａｋｔに対するアプタマーからなる群から選択される物質等が挙げられる。
なお、ここで「低分子化合物」とは、分子量１０，０００以下（好ましくは、分子量５，０００以下、より好ましくは分子量２，０００以下、特に好ましくは分子量７００以下）の有機および無機物質を意味する。また「高分子化合物」とは、分子量１０，０００超（好ましくは、分子量５０，０００以上、より好ましくは分子量１００，０００以上）の有機物質を意味する。
なお、本明細書では、Ａｋｔという用語は、それらと実質的に同一の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。上記タンパク質の変異体としては、例えば、上記文献に記載のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
実質的に同質の活性としては、例えば、細胞内シグナル伝達活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、脂肪酸合成酵素活性などが同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
Ａｋｔの部分ペプチドとしては、前記したＡｋｔと同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
Ａｋｔの酵素阻害活性は、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ１ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０１）、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ２ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０４）、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ３ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０７）等を用いて測定することもできる。
Ａｋｔのリン酸化レベルは、たとえば、ＣＡＳＥ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＡＣＴ（Ｓｅｒ ４７３）（商標；コスモバイオ株式会社製）を用いて測定することができる。
（ａ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する低分子化合物または高分子化合物
Ａｋｔのリン酸化を阻害する化合物（塩形態の化合物を含む）は、Ａｋｔの活性を阻害することができるので、Ａｋｔの活性を阻害する物質として好適に使用することができる。本発明で用いられるＡｋｔのリン酸化を阻害する化合物としては、Ａｋｔのリン酸化を阻害しうる化合物であればよく特に制限はないが、例えば、Ａｋｔに結合し、その活性を阻害する化合物またはその塩などが挙げられる。
このような化合物は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であってもよい。該化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。塩形態の化合物としては、例えば、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、生理学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
このような化合物としては、Ａｋｔ阻害剤などが挙げられる。また、このような化合物は、後述するスクリーニング方法によって得ることができる。
Ａｋｔ阻害剤としては、より具体的には、１Ｌ−６−ヒドロキシメチル−クロロ−イノシトール２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシルカーボネート（１Ｌ−６−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｃｈｌｒｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ ２−（Ｒ）−２−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−３−Ｏ−ｏｃｔａｄｅｃｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ；Ｈｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３，３０４５．）
ＳＨ−５、ＳＨ−６（Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１１４４．）、ＮＬ−７１−１０１（Ｒｅｕｖｅｎｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，１０３０４．）、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｈ−ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ−ＯＨ）、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｈ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ−ＯＨ）、ＴＡＴ−ＴＣＬ１１０−２４（Ｈｉｒｏｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５３４０７．）などが挙げられる。これらのＡｋｔ阻害剤は、単独で、または必要に応じてそれらの２種以上を組み合わせて用いることができる。
（ｂ）Ａｋｔの発現を阻害する低分子化合物または高分子化合物
Ａｋｔの発現を阻害する化合物（塩形態を含む）は、Ａｋｔの発現を抑制することができるので、Ａｋｔの発現を阻害する物質として好適に使用することができる。Ａｋｔの発現を阻害する化合物としては、Ａｋｔの発現を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、（ｉ）Ａｋｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）からＡｋｔをコードするｍＲＮＡへの転写を阻害する化合物、（ｉｉ）ＡｋｔをコードするｍＲＮＡからＡｋｔへの翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。
（ｉ）Ａｋｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）からＡｋｔをコードするｍＲＮＡへの転写を阻害する化合物としては、Ａｋｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡへの転写を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Ａｋｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡへの転写に関与する因子に結合し、転写を阻害する化合物などが挙げられる。（ｉｉ）ＡｋｔをコードするｍＲＮＡからＡｋｔへの翻訳を阻害する化合物としては、ＡｋｔをコードするｍＲＮＡからＡｋｔへの翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、ＡｋｔをコードするｍＲＮＡからＡｋｔへの翻訳に関与する因子に結合し、翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。
このような化合物としては、前述のＡｋｔ阻害剤などが挙げられる。また、このような化合物は、後述するスクリーニング方法によって得ることができる。
（ｃ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体および（ｄ）Ａｋｔの発現を阻害する抗体
本発明においては、Ａｋｔのリン酸化を阻害することが目的であるから、Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体であればいかなる抗体をも用いることができる。そのような抗体は、（１）Ａｋｔまたはその部分ペプチドを認識し得る抗体であって、Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体、（２）Ａｋｔをリン酸化するタンパク質を認識し得る抗体であって、Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体などを含む。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるＡｋｔもしくはその部分ペプチド、Ａｋｔをリン酸化するタンパク質もしくはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明で用いられるタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ｉ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明で用いられるタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明で用いられるタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
（ｅ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ
Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡ（例、Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）は、低毒性であり、Ａｋｔをコードする遺伝子の翻訳を抑制することができ、Ａｋｔの発現を抑制することができるので、Ａｋｔの発現を阻害する物質として好適に使用することができる。このような、Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡとしては、ＡｋｔをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（例、Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）など）などが挙げられる。
このような二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年；特表２００２−５１６０６２号公報；米国特許出願公開第２００２／０８６３５６号明細書；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４巻，１８０−１８３頁，２０００年；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６巻，２４０−２４４頁，２０００年；Ｎａｔｕｒｅ，４０７巻，３１９−３２０頁，２００２年；Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１６巻，９４８−９５８頁，２００２年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９巻，５５１５−５５２０頁，２００２年；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６巻，５５０−５５３頁，２００２年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９巻，６０４７−６０５２頁，２００２年；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０巻，４９７−５００頁，２００２年；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０巻，５００−５０５頁，２００２年；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０巻，ｅ４６，２００２年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
本発明で用いられるＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡの長さは、通常、１７〜３０塩基、好ましくは１９〜２７塩基、より好ましくは２０〜２２塩基である。
（ｆ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド
Ａｋｔまたは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明で用いられるＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明で用いられるＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明で用いられるＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明で用いられるＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明で用いられるＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明で用いられるＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（ｉ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、ＡｋｔのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ｉｉ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明で用いられるＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、またはＡｋｔの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
（ｇ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム
Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対してリボザイム活性を有するポリヌクレオチドは、Ａｋｔの発現を抑制することができるので、Ａｋｔの発現を阻害する物質として好適に使用することができる。このようなリボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２２８巻，２２８頁，１９８８年；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２３９巻，２８５頁，１９８８年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７巻，７０５９頁，１９８９年；Ｎａｔｕｒｅ，３２３巻，３４９頁，１９８６年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９巻，６７５１頁，１９９１年；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．３巻，７３３頁，１９９０年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９巻，３８７５頁，１９９１年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９巻，５１２５頁，１９９１年；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８６巻，１２７１頁，１９９２年など参照）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、ＡｋｔをコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。ＡｋｔをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。上記リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ ＲＮＡなどのラージリボザイム、ハンマーヘッド型やヘアピン型などのスモールリボザイムなどが含まれる（タンパク質核酸酵素，３５巻，２１９１頁，１９９０年）。ハンマーヘッド型リボザイムについては、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２２８巻，２２８頁，１９８８年；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２３９巻，２８５頁，１９８８年；タンパク質核酸酵素，３５巻，２１９１頁，１９９０年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７巻，７０５９頁，１９８９年などを参照することができる。また、ヘアピン型リボザイムについては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２３巻，３４９頁，１９８６年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９巻，６７５１頁，１９９１年；化学と生物，３０巻，１１２頁，１９９２年などを参照することができる。
（ｈ）Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド
Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドは、Ａｋｔの活性を阻害することができるので、Ａｋｔの活性を阻害する物質として好適に使用することができる。本明細書において、「Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するタンパク質の変異体」とは、それが発現することによって、Ａｋｔの活性を阻害（消失もしくは低下）させる作用を有するタンパク質を意味する（多比良和誠編，遺伝子の機能阻害実験法，羊土社，２６−３２頁，２００１年など参照）。
（ｉ）Ａｋｔに対するアプタマー
Ａｋｔに対するアプタマーは、Ａｋｔの活性や機能を阻害することができるので、Ａｋｔの活性を阻害する物質として好適に使用することができる。アプタマーは、公知の方法、例えばＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５６巻，５５５−５８３頁，２００５年）を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に公知の方法に従いアプタマーを製造する。
１．２ 本発明が対象とする疾患
本発明においては、上述したＡｋｔ阻害剤を含有してなる医薬を、乳癌の予防または治療剤として用いる。
本発明の予防又は治療剤が対象とする疾患は、（１）エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（２）プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌、（３）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（４）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（５）エストロゲン受容体陽性、プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌患を含む。本発明が特に対象とする疾患は、（１）エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌と、（３）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌である。すなわち、本発明はこれらの乳癌の予防又は治療剤を提供するものである。
以下、エストロゲン受容体の陰性・陽性判定試験、プロゲステロン受容体の陰性・陽性判定試験およびＨＥＲ２の陰性・陽性判定試験について説明する。
１．２．１ ＨＥＲ２の陰性・陽性判定試験
「ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ２、Ａｖｉａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｂ ２）」は、ヒト上皮細胞増殖因子受容体遺伝子と類似する癌遺伝子であり、ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ２などの別名で呼ばれることもある。ＨＥＲ２は受容体型チロシンリン酸化酵素であり、乳癌患者の１０−３０％で過剰発現していると言われている。ＨＥＲ２は、その酵素活性により、細胞内へ増殖シグナルを伝える事が明らかとなっている。従って、ＨＥＲ２を過剰に発現した乳癌は、増殖能、転移能が高いと言われており、結果として化学療法剤耐性、放射線療法耐性、予後不良など進行性乳癌の表現型をとる。これらの事から、ＨＥＲ２発現腫瘍に対する抗ＨＥＲ２療法は、腫瘍増殖を抑制するものと期待され、ＨＥＲ２に対するヒト化モノクローナル抗体（ハーセプチン（登録商標））は、ＨＥＲ２高発現の化学療法剤抵抗性転移性乳癌に対し臨床で効果を示している。
一方、ＨＥＲ２の発現していない患者、またハーセプチンなど抗ＨＥＲ２療法の治療中に、ＨＥＲ２が欠落し、治療に反応しなくなる患者（不応・抵抗性）が知られており、ＨＥＲ２受容体陰性の乳癌に対する治療薬は、強く求められている。
本発明はこのような要請に応えるもので、少なくともＨＥＲ２陰性である乳癌の予防又は治療剤を提供するものである。
ＨＥＲ２は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿００４４４８．２ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００４４３９で登録されている。クローニング論文としては、以下の文献が知られている。
（１）Ｋｉｎｇ，Ｃ．Ｒ．，Ｋｒａｕｓ，Ｍ．Ｈ．ａｎｄ Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｖ−ｅｒｂＢ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１７），９７４−９７６（１９８５））
（２）Ｓｅｍｂａ Ｋ，Ｋａｍａｔａ Ｎ，Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ．Ａ ｖ−ｅｒｂＢ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｃ−ｅｒｂＢ−２，ｉｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃ−ｅｒｂＢ−１／ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：６４９７−６５０１，１９８５．
（３）Ｃｏｕｓｓｅｎｓ Ｌ，Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇ ＴＬ，Ｌｉａｏ ＹＣ，ｅｔ ａｌ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｈａｒｅｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｅｕ ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１１３２−１１３９，１９８５．
ヒトの乳癌患者においては、その１０〜３０％で、ＨＥＲ２遺伝子の増幅とタンパクの過剰発現が報告されている。この過剰発現は、遺伝子の検出（ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、ＰＣＲ、サザンブロット法など）、ｍＲＮＡ発現の検出（ＩＳＨ、ノーザンブロット法など）、タンパク質発現の検出（免疫組織染色（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定（ＥＩＡ）法等）が可能である（Ｂｉｌｏｕｓ Ｍ，Ｄｏｗｓｅｔｔ Ｍ，Ｈａｎｎａ Ｗ，Ｉｓｏｌａ Ｊ，Ｌｅｂｅａｕ Ａ，Ｍｏｒｅｎｏ Ａ，Ｐｅｎａｕｌｔ−Ｌｌｏｒｃａ Ｆ，Ｒｕｓｃｈｏｆｆ Ｊ，Ｔｏｍａｓｉｃ Ｇ，ｃａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ Ｍ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ＨＥＲ２ ｔｅｓｔｉｎｇ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍａｔｉｏｎａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ １６：１７３−１８２，２００３．）。
これらの公知の方法を用いて、ＨＥＲ２過剰発現と判定された検体は、本発明においてはＨＥＲ２陽性と判定される。米国ＦＤＡ、日本、ヨーロッパで承認され臨床で用いられる検査法として、以下のものが知られている。
ＦＩＳＨ： ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｈｅｒ２ ＦＩＳＨ ｐｈａｒｍＤｘＴＭ Ｋｉｔ（ＤａＫｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）
ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ ＨＥＲ−２ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｋｉｔ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社）
ＩＨＣ（免疫組織染色）： ＨｅｒｃｅｐｔｅｓｔＴＭ（ＤａＫｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）
ＥＩＡ（酵素免疫測定法）：ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＬＩＳＡ（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社）
ＥｒｂＢ−２ ＥＩＡ「ニチレイ」（ニチレイ）
本発明においては、免疫組織染色法（ＩＨＣ）を用いてＨＥＲ２タンパク質発現を検出するハーセプテスト（登録商標：Ｈｅｒｃｅｐ Ｔｅｓｔ、Ｄａｋｏ社）を用いてＨＥＲ２陰性・陽性の判定を行った。
ハーセプテスト（登録商標）は、米国ＦＤＡ及び日本厚生省で乳癌のスクリーニングキットとして承認されており、定められた実施方法に従って判定を行う。ハーセプテスト（登録商標）の実施は、Ｄａｋｏ社のマニュアルに従い行うことができる。ハーセプテスト（登録商標）により染色された標本は、定められた基準、すなわち、弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％である検体がＨＥＲ２過剰発現と判定され、本発明におけるＨＥＲ２陽性と判定される。
例えば、ハーセプテストを用いた検体の染色像を観察して、以下のように０、１＋、２＋、３＋にスコア化して分類した場合、
０：細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％（細胞質に限局する陽性染色は判定対象外）。
１＋：ほとんど識別できないほど、かすかな細胞膜の染色がある癌細胞≧１０％、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。
２＋：弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％。
３＋：強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％。
スコア２＋または３＋以上の検体はＨＥＲ２タンパク質過剰発現（本発明ではＨＥＲ２陽性）であり、スコア１＋以下検体はＨＥＲ２タンパク質過剰発現無（本発明ではＨＥＲ２陰性）と判定できる。
１．２．２ ホルモン感受性乳癌
乳癌の６０〜８０％はホルモン受容体を発現しており、ホルモン受容体を発現している乳癌は女性ホルモン（プロゲステロン、エストロゲン等）の刺激が、癌の増殖に影響すると言われている。
現在、生検乳癌組織、もしくは摘出乳癌組織中のホルモン受容体を検査することにより、女性ホルモンの影響を受けうるかどうか、判定可能になっている。ＥＲもしくはＰｇＲの一方、または、両方の受容体を発現し、女性ホルモンに影響されやすい乳癌は、「ホルモン感受性乳癌」または「ホルモン依存性乳癌」と呼ばれ、抗ホルモン療法による高い治療効果が得られることが明らかとなっている。
閉経前女性で、卵巣機能が活発な場合は、主として卵巣が女性ホルモンの供給源となり、閉経後女性の場合は、副腎皮質から分泌される男性ホルモンが原料となる事が知られている。
「ホルモン感受性乳癌」または「ホルモン依存性乳癌」では、抗エストロゲン剤、選択的アロマターゼ阻害剤、黄体ホルモン分泌刺激ホルモン抑制剤など抗ホルモン薬の効果が期待できる。しかし、元々、ホルモン受容体を発現していない、もしくは薬物治療中に受容体が欠落し、治療に反応しなくなる患者（不応・抵抗性）が知られており、ホルモン受容体陰性癌、「ホルモン非感受性乳癌」、または「ホルモン非依存性乳癌」に対する治療薬が、強く求められている。
本発明はこのような要請に応えるもので、ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性を示す乳癌、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性を示す乳癌、ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性を示す乳癌に対する、Ａｋｔ阻害剤を含有してなる乳癌の予防または治療剤を提供するものである。
１．２．３ ＥＲ（エストロゲン受容体）陰性・陽性判定試験
ＥＲ（エストロゲン受容体）は、女性ホルモンの一種エストロゲンの受容体であり、ヒト乳癌患者においては、その８３．２％でＥＲ遺伝子の発現が報告されている（Ｈａｒｖｅｙ，ＪＭ．，Ｃｌａｒｋ，ＧＭ．，Ｏｓｂｏｒｎｅ，ＣＫ．，Ａｌｌｒｅｄ ＤＣ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔａｔｕｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｄｊｕｖａｎｔ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １７：１４７４−１４８１，１９９９．）。
ＥＲは、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿０００１２５、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿０００１１６で登録されている（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｇｉｌｎａ，Ｐ．，Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｂａｋｅｒ，Ａ．，Ｈｏｒｔ，Ｙ．ａｎｄ Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１（４７４２），１１５０−１１５４（１９８６）等）。ＥＲには、ＥＲ１（別名ＥＲα）、ＥＲ２（別名ＥＲβ）の２種類のＥＲが知られている。
エストロゲン受容体発現の臨床検査には免疫組織染色による検出法が代表的に用いられている。
体外医学品として市販されている抗体には、Ｃｌｏｎｅ １Ｄ５（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）、６Ｆ１１（Ｖｅｎｔａｎａ Ｊａｐａｎ社）、ＥＲ８８（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｉｘ社）などがあり、これらの抗体は自動免疫染色装置を用いての染色が可能であり、Ｃｌｏｎｅ １Ｄ５およびＥＲ８８については、用手法による染色も可能である。
また、米国、日本、ヨーロッパで承認され臨床で用いられる検査法として、ＩＨＣ（免疫組織染色）：
ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）−ＥＲ，１Ｄ５・ＰｇＲ，ＰｇＲ６３６（ダコ・サイトメーション）、「協和ステイン」ＥＲ（Ｍ）、（協和メディックス）、
などがある。
本発明においては、免疫組織染色法（ＩＨＣ）を用いてＥＲタンパク質発現を検出する、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ ＥｓｔｒｏｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ（６Ｆ１１）（登録商標：Ｖｅｎｔａｎａ社）を用いて、ＥＲ陽性／陰性の判定を行った。
Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ（登録商標）の実施は、Ｖｅｎｔａｎａ社のマニュアルに従い行うことができる。Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ（登録商標）により染色された標本は、光学顕微鏡にて，対物レンズ４倍で腫瘍全体を観察し、腫瘍細胞の核にＥＲの免疫反応性を確認できる。免疫反応性の認められる核を有する細胞を陽性細胞とし、その染色強度に関わりなく、陽性細胞が腫瘍全体に占める割合をパーセンテージで算出した。算出されたパーセンテージに基づき、陽性細胞占有率１０％以上をＥＲ陽性と判定することができる。
１．２．４ ＰｇＲ（プロゲステロンゲン受容体）陰性・陽性判定試験
ＰｇＲ（プロゲステロンゲン受容体）は、女性ホルモンの一種プロゲステロンの受容体であり、ヒト乳癌患者においては、その７３．０％でＰｇＲ遺伝子の発現が報告されている（Ｓｙｅｄ Ｋ Ｍｏｈｓｉｎ，Ｈｅｉｄｉ Ｗｅｌｓｓ，Ｔｈｏｍａｓ Ｈａｖｉｇｈｕｒｓｔ，Ｇａｒｙ Ｍ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｌｏｒａ Ｂｅｒａｒｄｏ，Ｌｅ Ｄ Ｒｏａｎｈ，Ｔａ Ｖ Ｔｏ，Ｑｉａｎ Ｚｈｏ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒ Ｌｏｖｅ ａｎｄ Ｄ Ｃｒａｉｇ Ａｌｌｒｅｄ，Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｏｃｏｍｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００４）１７，１５４５−１５５４）。ＰｇＲ陽性乳癌では、乳癌細胞の増殖にプロゲステロンなど女性ホルモンが関与している。従い、抗エストロゲン剤、選択的アロマターゼ阻害剤、黄体ホルモン分泌刺激ホルモン抑制剤などの抗ホルモン薬の効果が期待できる。しかし、元々、ＰｇＲを発現していない、もしくは薬物治療中にＰｇＲが欠落し、治療に反応しなくなる患者（不応・抵抗性）が知られており、ＰｇＲ受容体陰性の乳癌に対する治療薬が、強く求められている。
ＰｇＲは、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ｇｅｎｅ：ＮＭ＿０００９２６．２、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿０００９１７で登録されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｄ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｒｅｎｏｎｅ ｗｉｔｈ ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｙｔｏｓｏｌ Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｒｅｓ．Ｐａｒｔ Ａ Ｃｌｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｅｒａｔｏｌ．１５（１），９５−１０１（１９８３）、Ｍｉｓｒａｈｉ，Ｍ．；Ａｔｇｅｒ，Ｍ．；ｄ’Ａｕｒｉｏｌ，Ｌ．；Ｌｏｏｓｆｅｌｔ，Ｈ．；Ｍｅｒｉｅｌ，Ｃ．；Ｆｒｉｄｌａｎｓｋｙ，Ｆ．；Ｇｕｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅｌ，Ａ．；Ｇａｌｉｂｅｒｔ，Ｆ．；Ｍｉｌｇｒｏｍ，Ｅ．：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４３：７４０−７４８，１９８７．等）。
プロゲステロン受容体発現について体外医学品として市販されている抗体には、Ｃｌｏｎｅ Ｐｇｒ６３６（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）、１Ａ６（Ｖｅｎｔａｎａ Ｊａｐａｎ社）、ＰＲ８８（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｉｘ社）などがあり、これらの抗体は自動免疫染色装置を用いての染色が可能であり、Ｃｌｏｎｅ Ｐｇｒ６３６およびＰＲ８８については、用手法による染色も可能である。
また、米国、日本、ヨーロッパで承認され臨床で用いられる検査法として、ＩＨＣ（免疫組織染色）：
ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）−ＥＲ，１Ｄ５・ＰｇＲ，ＰｇＲ６３６（ダコ・サイトメーション）、「協和ステイン」ＰｇＲ（Ｍ）、（協和メディックス）、
などがある。
本発明においては、免疫組織染色法（ＩＨＣ）を用いてＰｇＲタンパク質発現を検出する、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ ＥｓｔｒｏｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ（６Ｆ１１）（登録商標：Ｖｅｎｔａｎａ社）を用いて、ＥＲ陽性／陰性の判定を行った。
Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ（登録商標）の実施は、Ｖｅｎｔａｎａ社のマニュアルに従い行うことができる。Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ（登録商標）により染色された標本は、光学顕微鏡にて，対物レンズ４倍で腫瘍全体を観察し、腫瘍細胞の核にＰｇＲの免疫反応性を確認できる。免疫反応性の認められる核を有する細胞を陽性細胞とし、その染色強度に関わりなく、陽性細胞が腫瘍全体に占める割合をパーセンテージで算出した。算出されたパーセンテージに基づき、陽性細胞占有率１０％以上をＥＲ陽性と判定することができる。
１．３． Ａｋｔ阻害剤を含有する製剤
本発明においては、Ａｋｔ阻害剤を常套手段に従って、製剤化し、乳癌の予防または治療剤として用いることができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
なお前記した各組成物は、上記活性成分との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分（例えば、他の抗癌剤など）を含有してもよい。また、他の活性成分（例えば、他の抗癌剤など）と併用してもよい。
該活性成分（例えば、他の抗癌剤など）の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該活性成分を、約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該活性成分の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該活性成分を、約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドは、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下、関節腔内、癌病変部等に投与してもよい。上記二重鎖ＲＮＡ、リボザイム、上記本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
上記抗体、アプタマーなどは、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、静脈注射）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
２．乳癌の予防または治療薬のスクリーニング方法
次に、本発明は、Ａｋｔ阻害活性を指標として、上記した乳癌の予防または治療薬をスクリーニングする方法を提供するものであり、特に、ホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、試験化合物のＡｋｔリン酸化阻害活性を評価し、Ａｋｔ阻害活性を有する選択することを含む方法である。選択されたＡｋｔ阻害活性を有する化合物は、ホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬のための候補化合物となる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
より具体的には、例えば、（１）（ｉ）試験化合物をホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）試験化合物を該細胞に接触させない場合との、該細胞のＡｋｔのリン酸化量の比較を行うことを特徴とするホルモン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬のスクリーニング方法を提供する。
本方法においては、まず、ホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌細胞に、試験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、特に制限されないがヒトの乳癌細胞が好ましい。ホルモン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌細胞としては、ＥＲ及び／又はＰｇＲ、及びＨＥＲ２をコードする遺伝子をノックアウトして発現を阻害するなど一般的な遺伝子工学技術によって作製することもできる。
次に、Ａｋｔリン酸化活性を測定する。具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、そのリン酸化されたＡｋｔタンパク量を測定する。リン酸化Ａｋｔタンパク量の測定は、公知の方法、リン酸化Ａｋｔに対して特異的に反応するリン酸化抗体を用いたウエスタンブロッティング法あるいはＥＬＩＳＡ法により測定することができる。また、Ａｋｔ系シグナル伝達に関与するタンパク質の下流に存在する転写因子の転写活性化能の測定、例えば、その転写因子の標的遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子）を連結し、その標識遺伝子の活性を見ることにより、Ａｋｔリン酸化をシグナル伝達活性で測定することもできる。試験化合物としては、前記と同様のものが用いられる。
Ａｋｔの酵素阻害活性は、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ１ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０１）、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ２ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０４）、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ３ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０７）等を用いて測定することもできる。
また、細胞内でのＡｋｔ阻害活性は、以下の論文に記載の方法等を用い、測定することもできる。
Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｐ．；Ｓｕｎ，Ｈ．；Ｂｒｏｇｎａｒｄ，Ｊ．；Ｄｅｎｎｉｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｏｖｅｌ ＰＩ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｂｌｏｃｋ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ａｋｔ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．；（Ｃｏｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）；２００３；１２５（５）；１１４４−１１４５
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、Ａｋｔリン酸化を抑制（低下）させる化合物を選択する。例えば、上記（ｉ）の場合におけるＡｋｔリン酸化を、上記（ｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上抑制する試験化合物を、Ａｋｔリン酸化を抑制（低下）させる化合物として選択することができる。このようにして選択された化合物は、Ａｋｔのリン酸化を阻害する物質であり、ホルモン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌乳癌の予防または治療薬の候補化合物となる。
本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
まず、本発明は、Ａｋｔ阻害剤を含有してなる乳癌の予防または治療剤であって、（１）エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌、（２）ＥＲ陰性、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌などに対する予防または治療剤を提供する。
１．１ 本発明で用いられるＡｋｔ阻害剤
「Ａｋｔ」は、ｖ−ａｋｔ ｍｕｒｉｎｅ ｔｈｙｍｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇといい、別名プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれる細胞内シグナル伝達因子である。セリンスレオニンキナーゼの一種であり、癌の進行過程、インスリンシグナリングとグルコース代謝の調節、ニューロン機能において重要な役割を担うことが報告され、抗癌剤、糖尿病治療剤、脳梗塞、神経変性治療剤の標的とされている。Ａｋｔは、現在までにＡｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３の３つのアイソフォームが知られている。
「Ａｋｔ１」は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿００１０１４４３２、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００１０１４４３２に登録されている（Ｓｔａａｌ，Ｓ．Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｋｔ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ ＡＫＴ１ ａｎｄ ＡＫＴ２：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＫＴ１ ｉｎ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１４），５０３４−５０３７（１９８７））。
「Ａｋｔ２」は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿００１６２６、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００１６１７に登録されている（Ｓｔａａｌ，Ｓ．Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｋｔ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ ＡＫＴ１ ａｎｄ ＡＫＴ２：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＫＴ１ ｉｎ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１４），５０３４−５０３７（１９８７））。
「Ａｋｔ３」は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿００５４６５、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００５４５６に登録されている（Ｌｉ，Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｂｏｔｔａｒｏ，Ｄ．Ｐ．ａｎｄ Ｐｉｅｒｃｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ６４３ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ−ｄｅｌｔａ ａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３９），２４５５０−２４５５５（１９９７））。
なお、本明細書中、「Ａｋｔ」は一般的にＡｋｔタンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、Ａｋｔ遺伝子のことを意味する場合もある。
「Ａｋｔ阻害剤」は、Ａｋｔのリン酸化を阻害するまたはＡｋｔの発現を阻害する活性を有する物質をいい、Ａｋｔを介したシグナル伝達を阻害する物質を意味する。阻害には、Ａｋｔを介したシグナル伝達を完全に遮断することも、シグナルが減弱されることも含まれる。かかる物質としては、低分子若しくは高分子化合物のほか、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、抗体、アンチセンス、ペプチド、タンパク質、酵素などを用いることができる。
「Ａｋｔのリン酸化を阻害する」とは、Ａｋｔをリン酸化するタンパク質との相互作用を阻害すること、Ａｋｔのリン酸化部位を変質させてリン酸化を受けないようにしてリン酸化を阻害することなどによりＡｋｔの活性化を阻害することを意味する。
「Ａｋｔの発現を阻害する」とは、当該タンパク質の遺伝子の発現阻害を含む、当該タンパク質をコードする遺伝子からタンパク質生成までの一連の事象（例えば、転写（ｍＲＮＡの生成）、翻訳（タンパク質の生成）を含む）のうちのいずれかの事象を阻害することによって、当該タンパク質の生成を阻害することを意味する。
本発明で用いられるＡｋｔ阻害剤としては、Ａｋｔのリン酸化を阻害する物質またはＡｋｔの発現を阻害する物質等が用いられるが、具体的には、
（ａ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、
（ｂ）Ａｋｔの発現を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、
（ｃ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体、
（ｄ）Ａｋｔの発現を阻害する抗体、
（ｅ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、
（ｆ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、
（ｈ）Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド、および
（ｉ）Ａｋｔに対するアプタマーからなる群から選択される物質等が挙げられる。
なお、ここで「低分子化合物」とは、分子量１０，０００以下（好ましくは、分子量５，０００以下、より好ましくは分子量２，０００以下、特に好ましくは分子量７００以下）の有機および無機物質を意味する。また「高分子化合物」とは、分子量１０，０００超（好ましくは、分子量５０，０００以上、より好ましくは分子量１００，０００以上）の有機物質を意味する。
なお、本明細書では、Ａｋｔという用語は、それらと実質的に同一の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。上記タンパク質の変異体としては、例えば、上記文献に記載のアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
実質的に同質の活性としては、例えば、細胞内シグナル伝達活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、脂肪酸合成酵素活性などが同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
Ａｋｔの部分ペプチドとしては、前記したＡｋｔと同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜６）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
Ａｋｔの酵素阻害活性は、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ１ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０１）、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ２ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０４）、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ３ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０７）等を用いて測定することもできる。
Ａｋｔのリン酸化レベルは、たとえば、ＣＡＳＥ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＡＣＴ（Ｓｅｒ ４７３）（商標；コスモバイオ株式会社製）を用いて測定することができる。
（ａ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する低分子化合物または高分子化合物
Ａｋｔのリン酸化を阻害する化合物（塩形態の化合物を含む）は、Ａｋｔの活性を阻害することができるので、Ａｋｔの活性を阻害する物質として好適に使用することができる。本発明で用いられるＡｋｔのリン酸化を阻害する化合物としては、Ａｋｔのリン酸化を阻害しうる化合物であればよく特に制限はないが、例えば、Ａｋｔに結合し、その活性を阻害する化合物またはその塩などが挙げられる。
このような化合物は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であってもよい。該化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。塩形態の化合物としては、例えば、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、生理学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
このような化合物としては、Ａｋｔ阻害剤などが挙げられる。また、このような化合物は、後述するスクリーニング方法によって得ることができる。
Ａｋｔ阻害剤としては、より具体的には、１Ｌ−６−ヒドロキシメチル−クロロ−イノシトール２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシルカーボネート（１Ｌ−６−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｃｈｌｒｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ ２−（Ｒ）−２−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−３−Ｏ−ｏｃｔａｄｅｃｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ；Ｈｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．２０００．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３，３０４５．）
ＳＨ−５、ＳＨ−６（Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，１１４４．）、ＮＬ−７１−１０１（Ｒｅｕｖｅｎｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，１０３０４．）、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｈ−ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ−ＯＨ）、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｈ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＡＶＴＤＨＰＤＲＬＷＡＷＥＫＦ−ＯＨ）、ＴＡＴ−ＴＣＬ１１０−２４（Ｈｉｒｏｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，５３４０７．）などが挙げられる。これらのＡｋｔ阻害剤は、単独で、または必要に応じてそれらの２種以上を組み合わせて用いることができる。
（ｂ）Ａｋｔの発現を阻害する低分子化合物または高分子化合物
Ａｋｔの発現を阻害する化合物（塩形態を含む）は、Ａｋｔの発現を抑制することができるので、Ａｋｔの発現を阻害する物質として好適に使用することができる。Ａｋｔの発現を阻害する化合物としては、Ａｋｔの発現を阻害しうるものであればよく特に制限はないが、例えば、（ｉ）Ａｋｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）からＡｋｔをコードするｍＲＮＡへの転写を阻害する化合物、（ｉｉ）ＡｋｔをコードするｍＲＮＡからＡｋｔへの翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。
（ｉ）Ａｋｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）からＡｋｔをコードするｍＲＮＡへの転写を阻害する化合物としては、Ａｋｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡへの転写を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、Ａｋｔをコードする遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡへの転写に関与する因子に結合し、転写を阻害する化合物などが挙げられる。（ｉｉ）ＡｋｔをコードするｍＲＮＡからＡｋｔへの翻訳を阻害する化合物としては、ＡｋｔをコードするｍＲＮＡからＡｋｔへの翻訳を阻害するものであればよく特に制限はないが、例えば、ＡｋｔをコードするｍＲＮＡからＡｋｔへの翻訳に関与する因子に結合し、翻訳を阻害する化合物などが挙げられる。
このような化合物としては、前述のＡｋｔ阻害剤などが挙げられる。また、このような化合物は、後述するスクリーニング方法によって得ることができる。
（ｃ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体および（ｄ）Ａｋｔの発現を阻害する抗体
本発明においては、Ａｋｔのリン酸化を阻害することが目的であるから、Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体であればいかなる抗体をも用いることができる。そのような抗体は、（１）Ａｋｔまたはその部分ペプチドを認識し得る抗体であって、Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体、（２）Ａｋｔをリン酸化するタンパク質を認識し得る抗体であって、Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体などを含む。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるＡｋｔもしくはその部分ペプチド、Ａｋｔをリン酸化するタンパク質もしくはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明で用いられるタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ｉ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明で用いられるタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明で用いられるタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
（ｅ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ
Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡ（例、Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）は、低毒性であり、Ａｋｔをコードする遺伝子の翻訳を抑制することができ、Ａｋｔの発現を抑制することができるので、Ａｋｔの発現を阻害する物質として好適に使用することができる。このような、Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対してＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡとしては、ＡｋｔをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（例、Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ（ｓｈｏｒｔ）ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）など）などが挙げられる。
このような二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年；特表２００２−５１６０６２号公報；米国特許出願公開第２００２／０８６３５６号明細書；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４巻，１８０−１８３頁，２０００年；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６巻，２４０−２４４頁，２０００年；Ｎａｔｕｒｅ，４０７巻，３１９−３２０頁，２００２年；Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１６巻，９４８−９５８頁，２００２年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９巻，５５１５−５５２０頁，２００２年；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６巻，５５０−５５３頁，２００２年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９巻，６０４７−６０５２頁，２００２年；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０巻，４９７−５００頁，２００２年；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０巻，５００−５０５頁，２００２年；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０巻，ｅ４６，２００２年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
本発明で用いられるＲＮＡｉ作用を有する二重鎖ＲＮＡの長さは、通常、１７〜３０塩基、好ましくは１９〜２７塩基、より好ましくは２０〜２２塩基である。
（ｆ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド
Ａｋｔまたは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明で用いられるＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明で用いられるＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明で用いられるＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明で用いられるＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明で用いられるＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明で用いられるＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（ｉ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、ＡｋｔのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ｉｉ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明で用いられるＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、またはＡｋｔの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
（ｇ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム
Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対してリボザイム活性を有するポリヌクレオチドは、Ａｋｔの発現を抑制することができるので、Ａｋｔの発現を阻害する物質として好適に使用することができる。このようなリボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２２８巻，２２８頁，１９８８年；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２３９巻，２８５頁，１９８８年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７巻，７０５９頁，１９８９年；Ｎａｔｕｒｅ，３２３巻，３４９頁，１９８６年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９巻，６７５１頁，１９９１年；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．３巻，７３３頁，１９９０年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９巻，３８７５頁，１９９１年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９巻，５１２５頁，１９９１年；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８６巻，１２７１頁，１９９２年など参照）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、ＡｋｔをコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。ＡｋｔをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。上記リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ ＲＮＡなどのラージリボザイム、ハンマーヘッド型やヘアピン型などのスモールリボザイムなどが含まれる（タンパク質核酸酵素，３５巻，２１９１頁，１９９０年）。ハンマーヘッド型リボザイムについては、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２２８巻，２２８頁，１９８８年；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２３９巻，２８５頁，１９８８年；タンパク質核酸酵素，３５巻，２１９１頁，１９９０年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７巻，７０５９頁，１９８９年などを参照することができる。また、ヘアピン型リボザイムについては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２３巻，３４９頁，１９８６年；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９巻，６７５１頁，１９９１年；化学と生物，３０巻，１１２頁，１９９２年などを参照することができる。
（ｈ）Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチド
Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドは、Ａｋｔの活性を阻害することができるので、Ａｋｔの活性を阻害する物質として好適に使用することができる。本明細書において、「Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するタンパク質の変異体」とは、それが発現することによって、Ａｋｔの活性を阻害（消失もしくは低下）させる作用を有するタンパク質を意味する（多比良和誠編，遺伝子の機能阻害実験法，羊土社，２６−３２頁，２００１年など参照）。
（ｉ）Ａｋｔに対するアプタマー
Ａｋｔに対するアプタマーは、Ａｋｔの活性や機能を阻害することができるので、Ａｋｔの活性を阻害する物質として好適に使用することができる。アプタマーは、公知の方法、例えばＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５６巻，５５５−５８３頁，２００５年）を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に公知の方法に従いアプタマーを製造する。
１．２ 本発明が対象とする疾患
本発明においては、上述したＡｋｔ阻害剤を含有してなる医薬を、乳癌の予防または治療剤として用いる。
本発明の予防又は治療剤が対象とする疾患は、（１）エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（２）プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌、（３）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（４）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（５）エストロゲン受容体陽性、プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌患を含む。本発明が特に対象とする疾患は、（１）エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌と、（３）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌である。すなわち、本発明はこれらの乳癌の予防又は治療剤を提供するものである。
以下、エストロゲン受容体の陰性・陽性判定試験、プロゲステロン受容体の陰性・陽性判定試験およびＨＥＲ２の陰性・陽性判定試験について説明する。
１．２．１ ＨＥＲ２の陰性・陽性判定試験
「ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ２、Ａｖｉａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｂ ２）」は、ヒト上皮細胞増殖因子受容体遺伝子と類似する癌遺伝子であり、ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ２などの別名で呼ばれることもある。ＨＥＲ２は受容体型チロシンリン酸化酵素であり、乳癌患者の１０−３０％で過剰発現していると言われている。ＨＥＲ２は、その酵素活性により、細胞内へ増殖シグナルを伝える事が明らかとなっている。従って、ＨＥＲ２を過剰に発現した乳癌は、増殖能、転移能が高いと言われており、結果として化学療法剤耐性、放射線療法耐性、予後不良など進行性乳癌の表現型をとる。これらの事から、ＨＥＲ２発現腫瘍に対する抗ＨＥＲ２療法は、腫瘍増殖を抑制するものと期待され、ＨＥＲ２に対するヒト化モノクローナル抗体（ハーセプチン（登録商標））は、ＨＥＲ２高発現の化学療法剤抵抗性転移性乳癌に対し臨床で効果を示している。
一方、ＨＥＲ２の発現していない患者、またハーセプチンなど抗ＨＥＲ２療法の治療中に、ＨＥＲ２が欠落し、治療に反応しなくなる患者（不応・抵抗性）が知られており、ＨＥＲ２受容体陰性の乳癌に対する治療薬は、強く求められている。
本発明はこのような要請に応えるもので、少なくともＨＥＲ２陰性である乳癌の予防又は治療剤を提供するものである。
ＨＥＲ２は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿００４４４８．２ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿００４４３９で登録されている。クローニング論文としては、以下の文献が知られている。
（１）Ｋｉｎｇ，Ｃ．Ｒ．，Ｋｒａｕｓ，Ｍ．Ｈ．ａｎｄ Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｖ−ｅｒｂＢ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１７），９７４−９７６（１９８５））
（２）Ｓｅｍｂａ Ｋ，Ｋａｍａｔａ Ｎ，Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ．Ａ ｖ−ｅｒｂＢ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｃ−ｅｒｂＢ−２，ｉｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃ−ｅｒｂＢ−１／ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：６４９７−６５０１，１９８５．
（３）Ｃｏｕｓｓｅｎｓ Ｌ，Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇ ＴＬ，Ｌｉａｏ ＹＣ，ｅｔ ａｌ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｈａｒｅｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｅｕ ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１１３２−１１３９，１９８５．
ヒトの乳癌患者においては、その１０〜３０％で、ＨＥＲ２遺伝子の増幅とタンパクの過剰発現が報告されている。この過剰発現は、遺伝子の検出（ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、ＰＣＲ、サザンブロット法など）、ｍＲＮＡ発現の検出（ＩＳＨ、ノーザンブロット法など）、タンパク質発現の検出（免疫組織染色（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定（ＥＩＡ）法等）が可能である（Ｂｉｌｏｕｓ Ｍ，Ｄｏｗｓｅｔｔ Ｍ，Ｈａｎｎａ Ｗ，Ｉｓｏｌａ Ｊ，Ｌｅｂｅａｕ Ａ，Ｍｏｒｅｎｏ Ａ，Ｐｅｎａｕｌｔ−Ｌｌｏｒｃａ Ｆ，Ｒｕｓｃｈｏｆｆ Ｊ，Ｔｏｍａｓｉｃ Ｇ，ｃａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ Ｍ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ＨＥＲ２ ｔｅｓｔｉｎｇ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍａｔｉｏｎａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ １６：１７３−１８２，２００３．）。
これらの公知の方法を用いて、ＨＥＲ２過剰発現と判定された検体は、本発明においてはＨＥＲ２陽性と判定される。米国ＦＤＡ、日本、ヨーロッパで承認され臨床で用いられる検査法として、以下のものが知られている。
ＦＩＳＨ： ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｈｅｒ２ ＦＩＳＨ ｐｈａｒｍＤｘＴＭ Ｋｉｔ（ＤａＫｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）
ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ ＨＥＲ−２ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｋｉｔ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社）
ＩＨＣ（免疫組織染色）： ＨｅｒｃｅｐｔｅｓｔＴＭ（ＤａＫｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）
ＥＩＡ（酵素免疫測定法）：ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＬＩＳＡ（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ社）
ＥｒｂＢ−２ ＥＩＡ「ニチレイ」（ニチレイ）
本発明においては、免疫組織染色法（ＩＨＣ）を用いてＨＥＲ２タンパク質発現を検出するハーセプテスト（登録商標：Ｈｅｒｃｅｐ Ｔｅｓｔ、Ｄａｋｏ社）を用いてＨＥＲ２陰性・陽性の判定を行った。
ハーセプテスト（登録商標）は、米国ＦＤＡ及び日本厚生省で乳癌のスクリーニングキットとして承認されており、定められた実施方法に従って判定を行う。ハーセプテスト（登録商標）の実施は、Ｄａｋｏ社のマニュアルに従い行うことができる。ハーセプテスト（登録商標）により染色された標本は、定められた基準、すなわち、弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％である検体がＨＥＲ２過剰発現と判定され、本発明におけるＨＥＲ２陽性と判定される。
例えば、ハーセプテストを用いた検体の染色像を観察して、以下のように０、１＋、２＋、３＋にスコア化して分類した場合、
０：細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％（細胞質に限局する陽性染色は判定対象外）。
１＋：ほとんど識別できないほど、かすかな細胞膜の染色がある癌細胞≧１０％、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。
２＋：弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％。
３＋：強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％。
スコア２＋または３＋以上の検体はＨＥＲ２タンパク質過剰発現（本発明ではＨＥＲ２陽性）であり、スコア１＋以下検体はＨＥＲ２タンパク質過剰発現無（本発明ではＨＥＲ２陰性）と判定できる。
１．２．２ ホルモン感受性乳癌
乳癌の６０〜８０％はホルモン受容体を発現しており、ホルモン受容体を発現している乳癌は女性ホルモン（プロゲステロン、エストロゲン等）の刺激が、癌の増殖に影響すると言われている。
現在、生検乳癌組織、もしくは摘出乳癌組織中のホルモン受容体を検査することにより、女性ホルモンの影響を受けうるかどうか、判定可能になっている。ＥＲもしくはＰｇＲの一方、または、両方の受容体を発現し、女性ホルモンに影響されやすい乳癌は、「ホルモン感受性乳癌」または「ホルモン依存性乳癌」と呼ばれ、抗ホルモン療法による高い治療効果が得られることが明らかとなっている。
閉経前女性で、卵巣機能が活発な場合は、主として卵巣が女性ホルモンの供給源となり、閉経後女性の場合は、副腎皮質から分泌される男性ホルモンが原料となる事が知られている。
「ホルモン感受性乳癌」または「ホルモン依存性乳癌」では、抗エストロゲン剤、選択的アロマターゼ阻害剤、黄体ホルモン分泌刺激ホルモン抑制剤など抗ホルモン薬の効果が期待できる。しかし、元々、ホルモン受容体を発現していない、もしくは薬物治療中に受容体が欠落し、治療に反応しなくなる患者（不応・抵抗性）が知られており、ホルモン受容体陰性癌、「ホルモン非感受性乳癌」、または「ホルモン非依存性乳癌」に対する治療薬が、強く求められている。
本発明はこのような要請に応えるもので、ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性を示す乳癌、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性を示す乳癌、ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性を示す乳癌に対する、Ａｋｔ阻害剤を含有してなる乳癌の予防または治療剤を提供するものである。
１．２．３ ＥＲ（エストロゲン受容体）陰性・陽性判定試験
ＥＲ（エストロゲン受容体）は、女性ホルモンの一種エストロゲンの受容体であり、ヒト乳癌患者においては、その８３．２％でＥＲ遺伝子の発現が報告されている（Ｈａｒｖｅｙ，ＪＭ．，Ｃｌａｒｋ，ＧＭ．，Ｏｓｂｏｒｎｅ，ＣＫ．，Ａｌｌｒｅｄ ＤＣ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔａｔｕｓ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｄｊｕｖａｎｔ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １７：１４７４−１４８１，１９９９．）。
ＥＲは、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ｇｅｎｅ：ＮＭ＿０００１２５、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿０００１１６で登録されている（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｇｉｌｎａ，Ｐ．，Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｂａｋｅｒ，Ａ．，Ｈｏｒｔ，Ｙ．ａｎｄ Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１（４７４２），１１５０−１１５４（１９８６）等）。ＥＲには、ＥＲ１（別名ＥＲα）、ＥＲ２（別名ＥＲβ）の２種類のＥＲが知られている。
エストロゲン受容体発現の臨床検査には免疫組織染色による検出法が代表的に用いられている。
体外医学品として市販されている抗体には、Ｃｌｏｎｅ １Ｄ５（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）、６Ｆ１１（Ｖｅｎｔａｎａ Ｊａｐａｎ社）、ＥＲ８８（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｉｘ社）などがあり、これらの抗体は自動免疫染色装置を用いての染色が可能であり、Ｃｌｏｎｅ １Ｄ５およびＥＲ８８については、用手法による染色も可能である。
また、米国、日本、ヨーロッパで承認され臨床で用いられる検査法として、ＩＨＣ（免疫組織染色）：
ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）−ＥＲ，１Ｄ５・ＰｇＲ，ＰｇＲ６３６（ダコ・サイトメーション）、「協和ステイン」ＥＲ（Ｍ）、（協和メディックス）、
などがある。
本発明においては、免疫組織染色法（ＩＨＣ）を用いてＥＲタンパク質発現を検出する、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ ＥｓｔｒｏｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ（６Ｆ１１）（登録商標：Ｖｅｎｔａｎａ社）を用いて、ＥＲ陽性／陰性の判定を行った。
Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ（登録商標）の実施は、Ｖｅｎｔａｎａ社のマニュアルに従い行うことができる。Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ（登録商標）により染色された標本は、光学顕微鏡にて，対物レンズ４倍で腫瘍全体を観察し、腫瘍細胞の核にＥＲの免疫反応性を確認できる。免疫反応性の認められる核を有する細胞を陽性細胞とし、その染色強度に関わりなく、陽性細胞が腫瘍全体に占める割合をパーセンテージで算出した。算出されたパーセンテージに基づき、陽性細胞占有率１０％以上をＥＲ陽性と判定することができる。
１．２．４ ＰｇＲ（プロゲステロンゲン受容体）陰性・陽性判定試験
ＰｇＲ（プロゲステロンゲン受容体）は、女性ホルモンの一種プロゲステロンの受容体であり、ヒト乳癌患者においては、その７３．０％でＰｇＲ遺伝子の発現が報告されている（Ｓｙｅｄ Ｋ Ｍｏｈｓｉｎ，Ｈｅｉｄｉ Ｗｅｌｓｓ，Ｔｈｏｍａｓ Ｈａｖｉｇｈｕｒｓｔ，Ｇａｒｙ Ｍ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｌｏｒａ Ｂｅｒａｒｄｏ，Ｌｅ Ｄ Ｒｏａｎｈ，Ｔａ Ｖ Ｔｏ，Ｑｉａｎ Ｚｈｏ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒ Ｌｏｖｅ ａｎｄ Ｄ Ｃｒａｉｇ Ａｌｌｒｅｄ，Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｏｃｏｍｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００４）１７，１５４５−１５５４）。ＰｇＲ陽性乳癌では、乳癌細胞の増殖にプロゲステロンなど女性ホルモンが関与している。従い、抗エストロゲン剤、選択的アロマターゼ阻害剤、黄体ホルモン分泌刺激ホルモン抑制剤などの抗ホルモン薬の効果が期待できる。しかし、元々、ＰｇＲを発現していない、もしくは薬物治療中にＰｇＲが欠落し、治療に反応しなくなる患者（不応・抵抗性）が知られており、ＰｇＲ受容体陰性の乳癌に対する治療薬が、強く求められている。
ＰｇＲは、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ｇｅｎｅ：ＮＭ＿０００９２６．２、ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＰ＿０００９１７で登録されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｄ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｒｅｎｏｎｅ ｗｉｔｈ ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｙｔｏｓｏｌ Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｒｅｓ．Ｐａｒｔ Ａ Ｃｌｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｅｒａｔｏｌ．１５（１），９５−１０１（１９８３）、Ｍｉｓｒａｈｉ，Ｍ．；Ａｔｇｅｒ，Ｍ．；ｄ’Ａｕｒｉｏｌ，Ｌ．；Ｌｏｏｓｆｅｌｔ，Ｈ．；Ｍｅｒｉｅｌ，Ｃ．；Ｆｒｉｄｌａｎｓｋｙ，Ｆ．；Ｇｕｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅｌ，Ａ．；Ｇａｌｉｂｅｒｔ，Ｆ．；Ｍｉｌｇｒｏｍ，Ｅ．：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４３：７４０−７４８，１９８７．等）。
プロゲステロン受容体発現について体外医学品として市販されている抗体には、Ｃｌｏｎｅ Ｐｇｒ６３６（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）、１Ａ６（Ｖｅｎｔａｎａ Ｊａｐａｎ社）、ＰＲ８８（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｉｘ社）などがあり、これらの抗体は自動免疫染色装置を用いての染色が可能であり、Ｃｌｏｎｅ Ｐｇｒ６３６およびＰＲ８８については、用手法による染色も可能である。
また、米国、日本、ヨーロッパで承認され臨床で用いられる検査法として、ＩＨＣ（免疫組織染色）：
ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）−ＥＲ，１Ｄ５・ＰｇＲ，ＰｇＲ６３６（ダコ・サイトメーション）、「協和ステイン」ＰｇＲ（Ｍ）、（協和メディックス）、
などがある。
本発明においては、免疫組織染色法（ＩＨＣ）を用いてＰｇＲタンパク質発現を検出する、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ ＥｓｔｒｏｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ（６Ｆ１１）（登録商標：Ｖｅｎｔａｎａ社）を用いて、ＥＲ陽性／陰性の判定を行った。
Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ（登録商標）の実施は、Ｖｅｎｔａｎａ社のマニュアルに従い行うことができる。Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｏｎｆｉｒｍ（登録商標）により染色された標本は、光学顕微鏡にて，対物レンズ４倍で腫瘍全体を観察し、腫瘍細胞の核にＰｇＲの免疫反応性を確認できる。免疫反応性の認められる核を有する細胞を陽性細胞とし、その染色強度に関わりなく、陽性細胞が腫瘍全体に占める割合をパーセンテージで算出した。算出されたパーセンテージに基づき、陽性細胞占有率１０％以上をＥＲ陽性と判定することができる。
１．３． Ａｋｔ阻害剤を含有する製剤
本発明においては、Ａｋｔ阻害剤を常套手段に従って、製剤化し、乳癌の予防または治療剤として用いることができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
なお前記した各組成物は、上記活性成分との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分（例えば、他の抗癌剤など）を含有してもよい。また、他の活性成分（例えば、他の抗癌剤など）と併用してもよい。
該活性成分（例えば、他の抗癌剤など）の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該活性成分を、約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該活性成分の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、注射剤の形で投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該活性成分を、約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドは、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下、関節腔内、癌病変部等に投与してもよい。上記二重鎖ＲＮＡ、リボザイム、上記本発明で用いられるタンパク質に対してドミナントネガティブに作用する本発明で用いられるタンパク質の変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
上記抗体、アプタマーなどは、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、静脈注射）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
２．乳癌の予防または治療薬のスクリーニング方法
次に、本発明は、Ａｋｔ阻害活性を指標として、上記した乳癌の予防または治療薬をスクリーニングする方法を提供するものであり、特に、ホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、試験化合物のＡｋｔリン酸化阻害活性を評価し、Ａｋｔ阻害活性を有する選択することを含む方法である。選択されたＡｋｔ阻害活性を有する化合物は、ホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬のための候補化合物となる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
より具体的には、例えば、（１）（ｉ）試験化合物をホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）試験化合物を該細胞に接触させない場合との、該細胞のＡｋｔのリン酸化量の比較を行うことを特徴とするホルモン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療薬のスクリーニング方法を提供する。
本方法においては、まず、ホルモン受容体陰性（ＥＲ陰性及び／又はＰｇＲ陰性）およびＨＥＲ２陰性である乳癌細胞に、試験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、特に制限されないがヒトの乳癌細胞が好ましい。ホルモン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌細胞としては、ＥＲ及び／又はＰｇＲ、及びＨＥＲ２をコードする遺伝子をノックアウトして発現を阻害するなど一般的な遺伝子工学技術によって作製することもできる。
次に、Ａｋｔリン酸化活性を測定する。具体的には、例えば、上記（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、上記細胞を培養し、そのリン酸化されたＡｋｔタンパク量を測定する。リン酸化Ａｋｔタンパク量の測定は、公知の方法、リン酸化Ａｋｔに対して特異的に反応するリン酸化抗体を用いたウエスタンブロッティング法あるいはＥＬＩＳＡ法により測定することができる。また、Ａｋｔ系シグナル伝達に関与するタンパク質の下流に存在する転写因子の転写活性化能の測定、例えば、その転写因子の標的遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子）を連結し、その標識遺伝子の活性を見ることにより、Ａｋｔリン酸化をシグナル伝達活性で測定することもできる。試験化合物としては、前記と同様のものが用いられる。
Ａｋｔの酵素阻害活性は、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ１ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０１）、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ２ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０４）、ＨＴＳｃａｎＴＭ Ａｋｔ３ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログＮｏ．７５０７）等を用いて測定することもできる。
また、細胞内でのＡｋｔ阻害活性は、以下の論文に記載の方法等を用い、測定することもできる。
Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｐ．；Ｓｕｎ，Ｈ．；Ｂｒｏｇｎａｒｄ，Ｊ．；Ｄｅｎｎｉｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｏｖｅｌ ＰＩ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｂｌｏｃｋ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ａｋｔ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．；（Ｃｏｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）；２００３；１２５（５）；１１４４−１１４５
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、Ａｋｔリン酸化を抑制（低下）させる化合物を選択する。例えば、上記（ｉ）の場合におけるＡｋｔリン酸化を、上記（ｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上抑制する試験化合物を、Ａｋｔリン酸化を抑制（低下）させる化合物として選択することができる。このようにして選択された化合物は、Ａｋｔのリン酸化を阻害する物質であり、ホルモン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌乳癌の予防または治療薬の候補化合物となる。
本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
外科的に摘出した乳癌組織の一部（１００ｍｇ以上）を、採取後、直ちに液体窒素にて凍結し、−８０°Ｃにて保存した。凍結した乳癌組織は、直ちに１０％中性ホルマリン固定液にて２４−４８時間固定し、パラフィン包埋した。このホルマリン固定標本を免疫組織化学的解析に用いた。
ホルマリン固定標本は４−６μｍの厚さに薄切、スライド上で伸展し、検体スライドを作成した。この検体スライドを用い、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現をＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔＴＭ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて検索した。またＣＯＮＦＩＲＭＴＭ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｊａｐａｎ）を用いエストロゲン受容体（Ｃｌｏｎｅ ６Ｆ１１）、プロゲステロン受容体（Ｃｌｏｎｅ １Ａ６）を検索した。いずれの染色法、判定基準も診断キット製造元のプロトコールに準じて行った。
ＨＥＲ２免疫組織染色の具体的な工程は以下のとおりである。
（ａ）脱パラフィン
（ｂ）抗原賦活処理
（１）あらかじめ抗原賦活溶液中をドーゼにいれ恒温漕内に浸漬し加温しておく
（２）検体組織スライドを恒温漕内にいれる
（３）一時的に低下した抗原賦活化液が９５−９９℃に上昇したことを確認後、４０分間加温する
（４）この間、９５−９９℃に温度を保ち、水分蒸発を防ぐため染色ドーゼにふたをする
（５）染色ドーゼを恒温漕より取り出し、フタをはずして放置する：常温２０分間
（６）流水での水洗：３分間
（７）洗浄液中に浸漬：５分間
（ｃ）内因性パーオキシダーゼのブロッキング
（１）ブロッキング試薬を２滴滴下：常温５分間反応
（２）流水での水洗：３分間
（３）洗浄液中に浸漬：５分間
（ｄ）一次抗体の反応
（１）スライド上の余分な水分を注意深くふき取る
（２）一次抗体を２滴滴下：常温３０分間反応
（３）洗浄液ですすぐ
（４）洗浄液中に浸漬：５分間×２回
（ｅ）ポリマー試薬の反応
（１）スライド上の余分な水分を注意深くふき取る
（２）ポリマー試薬を２滴滴下：常温３０分間反応
（３）洗浄液ですすぐ
（４）洗浄液中に浸漬：５分間×２回
（ｆ）基質溶液による発色
（１）スライド上の余分な水分を注意深くふき取る
（２）調整した基質溶液を１００μｌ滴下
（３）常温１０分間反応
（４）精製水ですすぐ
（５）精製水中に浸漬
（ｇ）対比染色
（ｈ）封入
ＥＲ及びＰｇＲ免疫組織染色は、自動免疫染色装置Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ（商標；Ｖｅｎｔａｎａ Ｊａｐａｎ）を用いて行なった。脱パラフィンから発色までが全自動であり、プロトコールの概要は以下のとおりである。
（ａ）脱パラフィン
（ｂ）抗原賦活処理：抗原性賦活化液Ｓｔａｎｄａｒｄ ＣＣ１ ｂｕｆｆｅｒ中にて、１００℃で６０分間加熱する。
（ｃ）一次抗体反応：一次抗体（ＥＲ：６Ｆ１１，ＰｇＲ１６）を用いて、室温で３２分間反応させる。
（ｄ）二次抗体反応：ＬＳＡＢキットを用いた反応。
（ｅ）発色
以下に示す基準でスコア化し、各検体のＨＥＲ２陽性／陰性の判定を行った。
ＨＥＲ２免疫組織染色スコア（ＨＥＲ２ ＩＨＣ）
０： 細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞＜１０％（細胞質に限局する陽性染色は判定対象外）。
細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。
スコア０、１＋を陰性、スコア２＋、３＋を陽性と判定した。
以下に示す基準でスコア化し、各検体のＥＲ陽性／陰性、ＰｇＲ陽性／陰性の判定を行った。
０： 陰性（１０％≧）
１＋：陽性細胞数 １０％≦ ＜５０％
２＋：陽性細胞数 ５０％≦
スコア０を陰性、スコア１＋、２＋を陽性と判定した。
上記した外科的に摘出した乳癌組織の一部を用いて生化学的解析（ウェスタンブロッティング）を行った。凍結保存した組織片は物理的に破砕後、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸：ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１％ ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）を加え、ホモゲナイズ後に不溶性画分を遠心にて除き、組織抽出液を得た。ＤＣプロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社製，コード番号５００−０１２０）を用い、組織抽出液のタンパク質濃度を定量し、タンパク質１０μｇに対し、等容量の２倍濃度ＳＤＳサンプルバッファーを混合、９５℃、５分の熱処理を行い、組織溶解液とした。ウェスタンブロッティング解析は以下のように行った。すなわち、この組織溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて泳動分離し（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）にトランスファーした。
その後、ニトロセルロース膜上の目的タンパク質を、各々に特異的な抗体および各々のリン酸化に特異的な抗体を用い検出した。
一次抗体に、Ａｋｔに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９２７２）、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９２７１）、及びＭＡＰＫに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９１０２）、抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９１０１）、ＨＥＲ２に特異的な抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２２４２）、リン酸化ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２２４４）
を用いた。
二次抗体には、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体を（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号７０７４）用い、ＥＣＬシステム（アマシャム）にて抗体を検出し、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士写真フィルム）を用いて可視化と画像解析を行い、各々のタンパク質量、リン酸化タンパク質量を測定し、これらの重量比を算出した。
乳癌患者から得た４４検体を、組織型、ＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２の発現状況により分類したところ、一般的な頻度に合致しており特定の偏りは認められなかった。
ａ）組織型
非浸潤癌 ５／４４（１１．４％）
浸潤癌 ３９／４４（８８．６％）
（ｂ）
ＥＲ陽性 ３３／４４（７５．０％），
ＥＲ陰性 １１／４４（２５．０％）
ＰｇＲ陽性 ２９／４４（６５．９％）
ＰｇＲ陰性 １５／４４（３４．１％）
ＨＥＲ２陽性 １４／４４（３１．８％），
ＨＥＲ２陰性 ３０／４４（６８．２％）
（ｃ）
Ａ−ＥＲ群：ＥＲ陽性およびＨＥＲ２陰性 ２１／４４（４７．７％）
Ｂ−ＥＲ群：ＥＲ陽性およびＨＥＲ２陽性 １２／４４（２７．３％）
Ｃ−ＥＲ群：ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陽性 ３／４４（６．８％）
Ｄ−ＥＲ群：ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性 ８／４４（１８．２％）
Ａ−ＰｇＲ群：ＰｇＲ陽性およびＨＥＲ２陰性 ２０／４４（４５．４％）
Ｂ−ＰｇＲ群：ＰｇＲ陽性およびＨＥＲ２陽性 ９／４４（２０．５％）
Ｃ−ＰｇＲ群：ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陽性 ６／４４（１４．６％）
Ｄ−ＰｇＲ群：ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性 ９／４４（２０．５％）
（ｄ）
（ｉ）群 ＥＲ陽性、ＰｇＲ陽性およびＨＥＲ２陰性 ２０／４４（４５．５％）
（ｉｉ）群 ＥＲ陽性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性 １／４４（２．３％）
（ｉｉｉ）群 ＥＲ陽性、ＰｇＲ陽性およびＨＥＲ２陽性 ９／４４（２０．５％）
（ｉｖ）群 ＥＲ陽性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陽性 ３／４４（６．８％）
（ｖ）群 ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陽性 ３／４４（６．８％）
（ｖｉ）群 ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性 ８／４４（１８．２％）
検体を（ｃ）の分類により分けたＡ−ＥＲ群、Ｂ−ＥＲ群、Ｃ−ＥＲ群およびＤ−ＥＲ群の各群における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を図１に示した。
ＥＲ陰性であるＣ−ＥＲ群およびＤ−ＥＲ群では、ＥＲ陽性であるＡ−ＥＲ群およびＢ−ＥＲ群よりも、ＭＡＰＫのリン酸化が亢進していることが明らかになった。すなわち、ＭＡＰＫ阻害剤がエストロゲン受容体陰性である乳癌の予防または治療剤として有用であることが示唆される。
また、Ｄ−ＥＲ群においては、Ａ−ＥＲ群、Ｂ−ＥＲ群およびＣ−ＥＲ群に比較してＡｋｔのリン酸化が有意に亢進していることが明らかになった。すなわちＡｋｔ阻害剤がエストロゲン受容体陰性かつＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤として有効であることが判明した。
検体を（ｃ）の分類により分けたＡ−ＰｇＲ群、Ｂ−ＰｇＲ群、Ｃ−ＰｇＲ群およびＤ−ＰｇＲ群の各群における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を図２に示した。
ＰｇＲ陰性であるＣ−ＰｇＲ群およびＤ−ＰｇＲ群では、ＰｇＲ陽性であるＡ−ＰｇＲ群およびＢ−ＰｇＲ群よりも、ＭＡＰＫのリン酸化が亢進していることが明らかになった。すなわち、ＭＡＰＫ阻害剤がプロゲステロン受容体陰性である乳癌の予防または治療剤として有用であることが示唆される。
また、Ｄ−ＰｇＲ群においては、Ａ−ＰｇＲ群、Ｂ−ＰｇＲ群およびＣ−ＰｇＲ群に比較してＡｋｔのリン酸化が亢進していることが明らかになった。すなわちＡｋｔ阻害剤がプロゲステロン受容体陰性かつＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤として有効であることが判明した。
検体を（ｄ）の分類により分けた（ｖｉ）群（ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性の群）と、その他の群（（ｉ）群〜（ｖ）群）における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値について検討した。その検討結果を図３に示した。
図３に示すように、（ｖｉ）群においては、他の（ｉ）〜（ｖ）群に比較してＡｋｔのリン酸化が有意に亢進していることが明らかになった。すなわちＡｋｔ阻害剤がエストロゲン受容体陰性かつプロゲステロン受容体陰性かつＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤として有効であることが判明した。
外科的に摘出した乳癌組織の一部（１００ｍｇ以上）を、採取後、直ちに液体窒素にて凍結し、−８０°Ｃにて保存した。凍結した乳癌組織は、直ちに１０％中性ホルマリン固定液にて２４−４８時間固定し、パラフィン包埋した。このホルマリン固定標本を免疫組織化学的解析に用いた。
ホルマリン固定標本は４−６μｍの厚さに薄切、スライド上で伸展し、検体スライドを作成した。この検体スライドを用い、ＨＥＲ２タンパク質過剰発現をＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔＴＭ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて検索した。またＣＯＮＦＩＲＭＴＭ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｊａｐａｎ）を用いエストロゲン受容体（Ｃｌｏｎｅ ６Ｆ１１）、プロゲステロン受容体（Ｃｌｏｎｅ １Ａ６）を検索した。いずれの染色法、判定基準も診断キット製造元のプロトコールに準じて行った。
ＨＥＲ２免疫組織染色の具体的な工程は以下のとおりである。
（ａ）脱パラフィン
（ｂ）抗原賦活処理
（１）あらかじめ抗原賦活溶液中をドーゼにいれ恒温漕内に浸漬し加温しておく
（２）検体組織スライドを恒温漕内にいれる
（３）一時的に低下した抗原賦活化液が９５−９９℃に上昇したことを確認後、４０分間加温する
（４）この間、９５−９９℃に温度を保ち、水分蒸発を防ぐため染色ドーゼにふたをする
（５）染色ドーゼを恒温漕より取り出し、フタをはずして放置する：常温２０分間
（６）流水での水洗：３分間
（７）洗浄液中に浸漬：５分間
（ｃ）内因性パーオキシダーゼのブロッキング
（１）ブロッキング試薬を２滴滴下：常温５分間反応
（２）流水での水洗：３分間
（３）洗浄液中に浸漬：５分間
（ｄ）一次抗体の反応
（１）スライド上の余分な水分を注意深くふき取る
（２）一次抗体を２滴滴下：常温３０分間反応
（３）洗浄液ですすぐ
（４）洗浄液中に浸漬：５分間×２回
（ｅ）ポリマー試薬の反応
（１）スライド上の余分な水分を注意深くふき取る
（２）ポリマー試薬を２滴滴下：常温３０分間反応
（３）洗浄液ですすぐ
（４）洗浄液中に浸漬：５分間×２回
（ｆ）基質溶液による発色
（１）スライド上の余分な水分を注意深くふき取る
（２）調整した基質溶液を１００μｌ滴下
（３）常温１０分間反応
（４）精製水ですすぐ
（５）精製水中に浸漬
（ｇ）対比染色
（ｈ）封入
ＥＲ及びＰｇＲ免疫組織染色は、自動免疫染色装置Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ（商標；Ｖｅｎｔａｎａ Ｊａｐａｎ）を用いて行なった。脱パラフィンから発色までが全自動であり、プロトコールの概要は以下のとおりである。
（ａ）脱パラフィン
（ｂ）抗原賦活処理：抗原性賦活化液Ｓｔａｎｄａｒｄ ＣＣ１ ｂｕｆｆｅｒ中にて、１００℃で６０分間加熱する。
（ｃ）一次抗体反応：一次抗体（ＥＲ：６Ｆ１１，ＰｇＲ１６）を用いて、室温で３２分間反応させる。
（ｄ）二次抗体反応：ＬＳＡＢキットを用いた反応。
（ｅ）発色
以下に示す基準でスコア化し、各検体のＨＥＲ２陽性／陰性の判定を行った。
ＨＥＲ２免疫組織染色スコア（ＨＥＲ２ ＩＨＣ）
０： 細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞＜１０％（細胞質に限局する陽性染色は判定対象外）。
以下に示す基準でスコア化し、各検体のＥＲ陽性／陰性、ＰｇＲ陽性／陰性の判定を行った。
０： 陰性（１０％≧）
１＋：陽性細胞数 １０％≦ ＜５０％
２＋：陽性細胞数 ５０％≦
スコア０を陰性、スコア１＋、２＋を陽性と判定した。
上記した外科的に摘出した乳癌組織の一部を用いて生化学的解析（ウェスタンブロッティング）を行った。凍結保存した組織片は物理的に破砕後、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸：ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１％ ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）を加え、ホモゲナイズ後に不溶性画分を遠心にて除き、組織抽出液を得た。ＤＣプロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社製，コード番号５００−０１２０）を用い、組織抽出液のタンパク質濃度を定量し、タンパク質１０μｇに対し、等容量の２倍濃度ＳＤＳサンプルバッファーを混合、９５℃、５分の熱処理を行い、組織溶解液とした。ウェスタンブロッティング解析は以下のように行った。すなわち、この組織溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（ゲル濃度：７．５−１５％）にて泳動分離し（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６６号、３６８−３７９頁、１９８７年）、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）にトランスファーした。
その後、ニトロセルロース膜上の目的タンパク質を、各々に特異的な抗体および各々のリン酸化に特異的な抗体を用い検出した。
一次抗体に、Ａｋｔに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９２７２）、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９２７１）、及びＭＡＰＫに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９１０２）、抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号９１０１）、ＨＥＲ２に特異的な抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２２４２）、リン酸化ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号２２４４）
を用いた。
二次抗体には、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体を（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、コード番号７０７４）用い、ＥＣＬシステム（アマシャム）にて抗体を検出し、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士写真フィルム）を用いて可視化と画像解析を行い、各々のタンパク質量、リン酸化タンパク質量を測定し、これらの重量比を算出した。
乳癌患者から得た４４検体を、組織型、ＥＲ、ＰｇＲ、ＨＥＲ２の発現状況により分類したところ、一般的な頻度に合致しており特定の偏りは認められなかった。
ａ）組織型
非浸潤癌 ５／４４（１１．４％）
浸潤癌 ３９／４４（８８．６％）
（ｂ）
ＥＲ陽性 ３３／４４（７５．０％），
ＥＲ陰性 １１／４４（２５．０％）
ＰｇＲ陽性 ２９／４４（６５．９％）
ＰｇＲ陰性 １５／４４（３４．１％）
ＨＥＲ２陽性 １４／４４（３１．８％），
ＨＥＲ２陰性 ３０／４４（６８．２％）
（ｃ）
Ａ−ＥＲ群：ＥＲ陽性およびＨＥＲ２陰性 ２１／４４（４７．７％）
Ｂ−ＥＲ群：ＥＲ陽性およびＨＥＲ２陽性 １２／４４（２７．３％）
Ｃ−ＥＲ群：ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陽性 ３／４４（６．８％）
Ｄ−ＥＲ群：ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性 ８／４４（１８．２％）
Ａ−ＰｇＲ群：ＰｇＲ陽性およびＨＥＲ２陰性 ２０／４４（４５．４％）
Ｂ−ＰｇＲ群：ＰｇＲ陽性およびＨＥＲ２陽性 ９／４４（２０．５％）
Ｃ−ＰｇＲ群：ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陽性 ６／４４（１４．６％）
Ｄ−ＰｇＲ群：ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性 ９／４４（２０．５％）
（ｄ）
（ｉ）群 ＥＲ陽性、ＰｇＲ陽性およびＨＥＲ２陰性 ２０／４４（４５．５％）
（ｉｉ）群 ＥＲ陽性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性 １／４４（２．３％）
（ｉｉｉ）群 ＥＲ陽性、ＰｇＲ陽性およびＨＥＲ２陽性 ９／４４（２０．５％）
（ｉｖ）群 ＥＲ陽性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陽性 ３／４４（６．８％）
（ｖ）群 ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陽性 ３／４４（６．８％）
（ｖｉ）群 ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性 ８／４４（１８．２％）
検体を（ｃ）の分類により分けたＡ−ＥＲ群、Ｂ−ＥＲ群、Ｃ−ＥＲ群およびＤ−ＥＲ群の各群における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を図１に示した。
ＥＲ陰性であるＣ−ＥＲ群およびＤ−ＥＲ群では、ＥＲ陽性であるＡ−ＥＲ群およびＢ−ＥＲ群よりも、ＭＡＰＫのリン酸化が亢進していることが明らかになった。すなわち、ＭＡＰＫ阻害剤がエストロゲン受容体陰性である乳癌の予防または治療剤として有用であることが示唆される。
また、Ｄ−ＥＲ群においては、Ａ−ＥＲ群、Ｂ−ＥＲ群およびＣ−ＥＲ群に比較してＡｋｔのリン酸化が有意に亢進していることが明らかになった。すなわちＡｋｔ阻害剤がエストロゲン受容体陰性かつＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤として有効であることが判明した。
検体を（ｃ）の分類により分けたＡ−ＰｇＲ群、Ｂ−ＰｇＲ群、Ｃ−ＰｇＲ群およびＤ−ＰｇＲ群の各群における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値を図２に示した。
ＰｇＲ陰性であるＣ−ＰｇＲ群およびＤ−ＰｇＲ群では、ＰｇＲ陽性であるＡ−ＰｇＲ群およびＢ−ＰｇＲ群よりも、ＭＡＰＫのリン酸化が亢進していることが明らかになった。すなわち、ＭＡＰＫ阻害剤がプロゲステロン受容体陰性である乳癌の予防または治療剤として有用であることが示唆される。
また、Ｄ−ＰｇＲ群においては、Ａ−ＰｇＲ群、Ｂ−ＰｇＲ群およびＣ−ＰｇＲ群に比較してＡｋｔのリン酸化が亢進していることが明らかになった。すなわちＡｋｔ阻害剤がプロゲステロン受容体陰性かつＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤として有効であることが判明した。
検体を（ｄ）の分類により分けた（ｖｉ）群（ＥＲ陰性、ＰｇＲ陰性およびＨＥＲ２陰性の群）と、その他の群（（ｉ）群〜（ｖ）群）における、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのタンパク質量とリン酸化タンパク質量の比の平均値について検討した。その検討結果を図３に示した。
図３に示すように、（ｖｉ）群においては、他の（ｉ）〜（ｖ）群に比較してＡｋｔのリン酸化が有意に亢進していることが明らかになった。すなわちＡｋｔ阻害剤がエストロゲン受容体陰性かつプロゲステロン受容体陰性かつＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤として有効であることが判明した。
本発明によれば、（１）エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（２）プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌、（３）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（４）エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性の乳癌、（５）エストロゲン受容体陽性、プロゲステロン受容体陰性及びＨＥＲ２陰性の乳癌などに対して有効な乳癌の予防または治療剤を提供できる。
また、本発明によれば、上記のような乳癌の予防又は治療剤をスクリーニングする方法を提供することができる。
［配列表］
また、本発明によれば、上記のような乳癌の予防又は治療剤をスクリーニングする方法を提供することができる。
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Claims (6)
- Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
- Ａｋｔ阻害剤を含有してなる、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤。
- Ａｋｔが、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔ３から選択される１種又は２種以上である請求項１または２に記載の乳癌の予防または治療剤。
- Ａｋｔ阻害剤が、（ａ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（ｂ）Ａｋｔの発現を阻害する低分子化合物若しくは高分子化合物、（ｃ）Ａｋｔのリン酸化を阻害する抗体、（ｄ）Ａｋｔの発現を阻害する抗体、（ｅ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、（ｆ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、（ｇ）Ａｋｔをコードするポリヌクレオチドに対するリボザイム、（ｈ）Ａｋｔに対してドミナントネガティブに作用するＡｋｔの変異体もしくはそれをコードするポリヌクレオチドおよび（ｉ）Ａｋｔに対するアプタマーからなる群から選択される１種または２種以上である請求項１または２に記載の乳癌の予防または治療剤。
- Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
- Ａｋｔ阻害活性を指標として、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性およびＨＥＲ２陰性である乳癌の予防または治療剤をスクリーニングする方法。
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