JP6134141B2 - 膵臓癌を処置するための方法 - Google Patents
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Description
本願は、仮出願第61/293,612号(2010年1月8日出願)の35 U.S.C. § 119(e)下の利益を主張し、その内容がその全体において参照により組み入れられる。
配列リストを本明細書と同時に提出する。
本開示は、とりわけ、プロガストリンについて特異的な抗体を含む組成物を被験者に投与することにより原発性及び/又は転移性膵臓癌を伴う被験者を処置する方法に向けられる。
数十年の基礎及び臨床研究にもかかわらず、癌は人類の最も大きな災難の1つのままである。世界保健機関(WHO)により回収された統計によると、癌は世界中の主な死亡原因の1つであり、2004年に740万人(又はその年の全ての死亡の約13%)が死んだ。何が癌を起こすか、及び、癌が分子レベルでどのように作用するのかに関して多くのことが学ばれてきたが、癌の死亡率における最も大きな低下は、公衆衛生介入(例えば禁煙キャンペーンなど)ならびに画像テクノロジー及び分子診断における進歩により可能になった早期診断に起因しうるままである。癌細胞を実際に殺す難しい仕事については、しかし、臨床医は、依然として、一世代前の癌専門医が精通してきたであろう治療様式(例えば手術、放射線、及び化学療法など)に頼っている。全てのこれらの処置の効力が長年にわたり改善されてきたが、治癒率における改善及び寿命における増加は漸進的である。分子腫瘍学における革命に起因する新たな標的治療さえ、大半の部分について、そこそこに転帰を改善してきただけである。
ガストリンは、胃酸の分泌を刺激する消化管ペプチドホルモンである。成体の哺乳動物において、それは主に胃前庭部においてG細胞により、ならびに上部小腸及び膵臓においてある程度産生される。図1を参照すると、ガストリン遺伝子は、101アミノ酸ポリペプチド(「プレプロガストリン」と呼ばれる)に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン(「PG」)(80アミノ酸残基ポリペプチド)を生じるシグナル配列(下線)を含む。ガストリンは、主に3つの形態G34、G17、及びG14(例証せず)で見出され、プロガストリンプロセシングに起因する。
7.1 膵臓癌
膵臓(長さ約6インチの細い腺)は2つの主な機能を有する:食物を消化するのを助ける分泌液を産生し、血糖レベルを制御するのを助けるホルモン(例えばインシュリン及びグルカゴンなど)を産生する。消化分泌液は外分泌膵臓細胞により、ホルモンは内分泌膵臓細胞により産生される。膵臓癌の約95%又はそれ以上が、外分泌細胞において生じる(Yao et al., 2007, Oncology 14(12):3492-3450)。外分泌膵臓癌の内、約95%が腺癌であり、残り5%には腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、コロイド癌、未分化癌、及び破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌を含むがある(http://pathology.jhu.edu/pancreas/BasicTypes1.phpを参照のこと)。
ステージ0(上皮内癌):このステージにおいて、異常細胞が膵臓の内膜において見出される。これらの異常細胞は癌性になり、周囲組織に広がりうる。
ステージI:このステージにおいて、癌が形成し、膵臓だけで見出される。ステージIは、さらに、腫瘍のサイズに依存して、2つのサブステージに分割される:ステージIA(腫瘍が2cm又はそれより小さい)及びステージIB(腫瘍が2cmより大きい)。
ステージII:このステージにおいて、癌は近くの組織及び臓器に広がっており、リンパ節に広がっているであろう。このステージは、さらに、癌がどこに広がっているかに基づいてサブステージに分割される。ステージIA(近くの組織及び臓器に広がっているが、しかし、リンパには広がっていない);及びステージIIB(リンパならびに恐らくは他の近くの組織及び臓器に広がっている)。
ステージIII:このステージにおいて、癌は膵臓近くの主要血管に広がっており、また、近くのリンパ節に広がっている。
ステージIV:このステージにおいて、癌は任意のサイズでありうるが、遠隔組織及び臓器(例えば肝臓、肺、及び腹腔など)に広がっている(即ち、癌は転移している)。
バックグラウンドのセクションにおいて記述する通り、転移は、癌が広がるプロセスを指す。簡単には、腫瘍細胞は、原発腫瘍を離れ、血液循環又はリンパ系を介して新たな組織部位へ移動し、二次腫瘍を形成する。新たな組織部位の腫瘍は転移性腫瘍として言及され、典型的には、原発腫瘍の供給源を同定する。例えば、他の組織に広がっている膵臓癌は、二次性の転移性腫瘍の組織部位にかかわらず、「転移性膵臓癌」として言及される。
膵臓癌と診断された患者は、典型的には、不良な予後を有する。部分的には、なぜなら、膵臓癌は、通常、早期に症状を起こさず、診断時に局所的に進行した又は転移性の疾患に至るからである。処置の選択肢(上に考察する)は、診断時の疾患のステージに依存する。
本明細書に開示する通り、膵臓癌を伴う被験者は、それらの膵臓腫瘍においてプロガストリンの検出可能なレベルを有することが報告されている(Caplin et al., 2000, Br. J. Surg.87(8):1035-1040)。本明細書に報告し、実施例のセクションにおいて考察するデータは、膵臓癌細胞株BxPC−3、MIA PaCa−2、Capan 1、及びSU.86.86が、プロガストリンをコードする遺伝子(GAST)についてのmRNAを発現すること(実施例7)、また、膵臓癌細胞株がプロガストリンを分泌することを実証する(実施例8)。原発性及び転移性の両方の膵臓癌を伴う患者が、プロガストリンの上昇した血漿及び/又は血清レベルを有すること(実施例6)、原発性及び転移性膵臓腫瘍に由来する細胞の成長が、ヒトプロガストリン(「hPG」)に特異的に結合する抗体を用いた処理により阻害されること(実施例9、10、及び11)、及び、低付着培養条件下で腫瘍球として成長する膵臓癌細胞の能力が、抗hPG抗体を用いた前処理に続いて有意に低下すること(実施例12)が現在発見されている。これらの驚くべき励みになる発見に基づき、そのような抗hPG抗体を使用し、膵臓癌の診断を助け、膵臓癌の処置計画の効力をモニターし、発生の任意のステージの膵臓癌(原発性及び転移性の両方の膵臓癌を含む)を処置し、膵臓癌の再発を防止しうることが期待される。
したがって、一局面において、本開示は、膵臓癌に苦しんでいる又はそれと診断された被験者を処置する方法を提供する。この方法は、被験者に、治療的利益を提供するために効果的な1つ又は複数の抗PG抗体の量を投与することを含む。抗PG抗体を一般的に、及び方法において有用な特異的抗PG抗体を、後のセクションにおいて詳細に記載する。
抗PG抗体は、典型的には、医薬的製剤又は組成物の形態で投与されうる。そのような製剤又は組成物は、場合により、追加の活性及び/又は治療用薬剤を含みうる(当技術分野において公知の通り)。製剤は、典型的には、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤を含みうる。使用される特定の担体、賦形剤、及び/又は希釈剤は、所望の投与様式に依存しうる。この組成物は、患者にそれを投与する所望の方法に依存して、任意の適した形態でありうる。
抗PG抗体を、被験者に、治療的利益を提供するために十分な又は効果的な量で投与する。原発性及び/又は転移性膵臓癌を処置する状況において、治療的利益を、以下の1つ又は複数が達成される場合に推論することができる:腫瘍の成長を停止又は減速すること、患者の腫瘍の数及び/又はサイズを低下させること、手術不可能な腫瘍を、それらを外科的に除去することができるサイズ及び位置に収縮させること、寿命を延長させること、及び/又は患者の生活の質を改善させること。
上に記述する通り、原発性及び/又は転移性膵臓癌と診断された患者は、PGの上昇した血漿及び/又は血清レベルを有する。図4を参照すると、健常個人におけるPGのベースラインレベルは無視でき、典型的には、検出の限度である。原発性及び/又は転移性膵臓癌を伴う被験者におけるPG血漿及び/又は血清レベルが測定可能であり、約50pMである。この観察に基づき、PGの血漿及び/又は血清レベルを使用し、原発性又は転移性膵臓癌の診断を助け、又はその処置の有効性をモニターすることができる。
本明細書に開示する方法において有用な抗体は、ガストリン遺伝子の他の産物を上回りヒトプロガストリンに特異的に結合するものである。図1を参照すると、ガストリン遺伝子は、101アミノ酸ポリペプチド(プレプロガストリンと呼ばれる)に翻訳され、それは、切断されて、プロガストリン(80アミノ酸ポリペプチド)を生じるシグナル配列(下線)を含む。プロガストリンは、順に、切断されて、34アミノ酸産物(配列において、プロガストリンの残基38−71に対応する)を生成し、それは、次に、グリシン残基を用いてそのカルボキシ末端で伸長されて、グリシン伸長G34(「G34−Gly」)を生成する。この切断の副産物は、6アミノ酸ペプチド(C末端隣接ペプチド、又はCTFPと呼ばれる)であり、それは、配列において、プロガストリンの残基75−80に対応する。G34−Glyは、次に、さらに切断されて、配列において、プロガストリンの残基55−71に対応し、G17−Glyとして言及される17残基ポリペプチドを生成する。G34−Gly及びG17−GlyのC末端グリシンの除去、それに続くC末端アミド化は、それぞれG34及びG17をもたらし、それらの両方がC末端アミド化されている。
(a)配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVL CDRに対応するVL CDR、及び、配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVH CDRに対応するVH CDRを有する抗体;
(b)配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVL及びVH CDRに対応するVL CDR及びVH CDRを有する抗体;
(c)抗体、それにおいて:
(i)VL CDR1はQSIVHSNGNTY(「VL CDR 1.3」;配列番号4)、QSLVHSSGVTY(「VL CDR 1.4」;配列番号10)、QSLLDSDGKTY(「VL CDR 1.16」;配列番号50)、及びSQHRTYT(「VL CDR 1.19」;配列番号51)より選択される;
(ii)VL CDR2はKVS(「VL CDR 2.3」又は「VL CDR 2.4」;配列番号5)、LVS(「VL CDR 2.16」;配列番号53)、及びVKKDGSH(「VL CDR 2.19」;配列番号54)より選択される;
(iii)VL CDR3はFQGSHVPFT(「VL CDR 3.3」;配列番号6)、SQSTHVPPT(「VL CDR 3.4」;配列番号11)、WQGTHSPYT(「VL CDR 3.16」;配列番号57)、及びGVGDAIKGQSVFV(「VL CDR 3.19」;配列番号58)より選択される;
(iv)VH CDR1はGYIFTSYW(「VH CDR 1.3」;配列番号1)、GYTFSSSW(「VH CDR 1.4」;配列番号7)、GYTFTSYY(「VH CDR 1.16」;配列番号39)、及びGYSITSDYA(「VH CDR 1.19」;配列番号40)より選択される;
(v)VH CDR2はFYPGNSDS(「VH CDR 2.3」;配列番号2)、FLPGSGST(「VH CDR 2.4」;配列番号8)、INPSNGGT(「VH CDR 2.16」;配列番号43)、及びISFSGYT(「VH CDR 2.19」;配列番号44)より選択される;及び
(vi)VH CDR3はTRRDSPQY(「VH CDR 3.3」;配列番号3)、ATDGNYDWFAY(「VH CDR 3.4」配列番号9)、TRGGYYPFDY(「VH CDR 3.16」;配列番号47)、及びAREVNYGDSYHFDY(「VH CDR 3.19」;配列番号48)より選択される;
(d)配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVLに対応するVL、及び、配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVHに対応するVHを有する抗体;及び
(e)配列において、MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、又はMAb20のVL及びVHに対応するVL及びVHを有する抗体。
(f)配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVL CDRに対応するVL CDR、及び、配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVH CDRに対応するVH CDRを有する抗体;
(g)配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVL及びVH CDRに対応するVL CDR及びVH CDRを有する抗体;
(h)抗体、それにおいて:
(i)VL CDR1はKSLRHTKGITF(「VL CDR 1.8」;配列番号49)及び QSLLDSDGKTY(「VL CDR 1.13」;配列番号50)より選択される;
(ii)VL CDR2はQMS(「VL CDR 2.8」;配列番号52)及び LVS(「VL CDR 2.13」;配列番号53)より選択される;
(iii)VL CDR3はAQNLELPLT(「VL CDR 3.8」;配列番号55)及び WQGTHFPQT(「VL CDR 3.13」;配列番号56)より選択される;
(iv)VH CDR1はGFTFTTYA(「VH CDR 1.8」;配列番号37)及び GFIFSSYG(「VH CDR 1.13」;配列番号38)より選択される;
(v)VH CDR2はISSGGTYT(「VH CDR 2.8」;配列番号41)及び INTFGDRT(「VH CDR 2.13」;配列番号42)より選択される;及び
(vi)VH CDR3はATQGNYSLDF(「VH CDR 3.8」;配列番号45)及び ARGTGTY(「VH CDR 3.13」;配列番号46)より選択される;
(i)配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVLに対応するVL、及び、配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVHに対応するVHを有する抗体;及び
(j)配列において、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22、又はMAb23のVL及びVHに対応するVL及びVHを有する抗体。
(k)本明細書に開示される任意の3つのVL CDR及び任意の3つのVH CDR;
(l)配列番号21に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号22に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(m)配列番号23に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号24に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(n)配列番号75、77、及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号76及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(o)配列番号80及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号81及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(p)配列番号84、86、及び88からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号85、87、及び89からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;及び
(q)配列番号90、92、及び94からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに配列番号91、93、及び95からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
本明細書に記載する方法において有用な抗PG抗体を、標準的な周知の方法を使用して得てもよい。本明細書に記載する方法において有用な抗PG抗体を発現するために、部分又は全長の軽及び重鎖をコードするDNAを発現ベクター中に挿入し、遺伝子が、転写及び翻訳制御配列に操作的に結合されるようにする。この状況において、用語「操作的に結合される」は、抗体遺伝子がベクター中に連結され、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するそれらの意図される機能を果たすようにすることを意味することを意図する。発現ベクター及び発現制御配列を選び、使用する発現宿主細胞と適合させる。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子を別々のベクター中に挿入することができる。又は、より典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入する。
8.1 実施例1:血漿又は血清PGレベルの定量化
PGの血漿及び/又は血清レベルは、以下のアッセイを使用して便利に決定することができる。96ウェルマイクロタイタープレートを、0.5〜10μg/mLのC末端抗hPG抗体、例えば、ウサギC末端抗hPGポリクローナル抗体、又はC末端抗hPG抗体(本明細書に記載する)を用いてコーティングし、次に、一晩インキュベートする。プレートを、次に、PBS−TWEEN(0.05%)中で3回洗浄し、PBS−TWEEN(0.05%)中の2%(w/v)脱脂乾燥ミルクを用いてブロックする。別々に、テストサンプル、コントロールサンプル(ブランク又はPG陰性血漿又は血清サンプル)、及び約5pM(0.5×10−11M)〜約0.1nM(1×10−10M)のhPG参照基準(PG陰性血漿又は血清中で希釈した凍結乾燥hPG)を適切な希釈剤(例、PBS−TWEEN 0.05%)中で調製する。サンプルを、コーティングしたプレート上で2〜4時間にわたり37℃で、又は、あるいは、12〜16時間21℃でインキュベートする。インキュベーション後、プレートを、PBS−TWEEN(0.05%)を用いて3回洗浄し、0.001〜0.1μg/mLのN末端抗hPG抗体、例えば、ポリクローナルN末端抗hPG抗体又はN末端モノクローナル抗hPG抗体(本明細書に記載する)を用いてインキュベートし、21℃で30分間にわたり西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091を参照のこと)に共役させる。プレートを次にPBS−TWEEN(0.05%)中で3回洗浄し、HRP基質を21℃で15分間にわたり加える。反応を、100μLの0.5M硫酸を加えることにより停止させ、光学密度測定値を405nMで取る。テストサンプルhPGレベルを、hPG参照基準に由来する測定値から構築された標準曲線との比較により決定する。
抗hPG抗体の特異性を、以下の通りにELISAアッセイを使用して便利に決定することができる。96ウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の適切な濃度のテストポリペプチド(例、25及び50ngの組換えヒトPG、ならびに50及び250ngのCTFP又は他のガストリン由来の遺伝子産物)を用いて4℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルを、洗浄溶液(PBS及び0.1%TWEEN−20)を用いて3回洗浄し、次に1ウェル当たり100μLのブロッキング溶液(PBS、0.1%TWEEN−20、0.1%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物)を用いて22℃で2時間にわたりインキュベートした。ブロッキング後、ウェルを3回洗浄し、アッセイする抗体(テスト抗体)を加える。100μLのPBS中のテスト抗体(0.3〜1ng/mL)及び0.1%TWEEN−20を各ウェルに加える。プレートを次に22℃で2時間にわたりインキュベートし、その後、テスト抗体溶液を捨て、洗浄工程(3×100μLの洗浄溶液、上に記述する通り)後、二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼに共役させたヤギ抗マウスIgG(Fc)抗体を含むブロッキング溶液を用いて置換する。二次抗体を用いた1時間のインキュベーション後、100μLの基質溶液(例、Fast OPD、又はO−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigma-Aldrich Co.から入手可能、製造者の指示に従って調製した)を各ウェルに加え、暗所で、22℃で20分間にわたりインキュベートした。反応は、50μLの4N硫酸を加えることにより停止させ、触媒された基質の量を、492nmでの光学密度(OD)を測定することにより決定する。基質変換は、抗原に結合した一次(テスト)抗体の量に比例する。実験を2通りに実行し、OD測定値を抗原濃度の関数としてプロットする。テスト抗体は、測定されたODがhPGについて0.2〜1.5の間であり、CTFP又は他のガストリン遺伝子由来ペプチドのいずれかを用いて、バックグラウンドを上回る統計的に有意なシグナルがない場合、PGについて特異的であるとスコア化される(ここで、バックグラウンドはPBSだけを含むコントロールウェルからの平均シグナルである)。
特異的な抗hPG抗体が中和性であるか否かを評価するための特定のテストを、以下の通りに実行することができる。BxPC−3膵臓癌細胞を6ウェルプレートの6ウェル中に約150,000個細胞/ウェルで播種する。細胞を、次に、テスト抗hPG抗体又はコントロール抗体を用いて、約5μg/mLの抗体濃度で48時間にわたり12時間間隔で処理する。テスト抗体は、テスト抗体を用いて処理した細胞の数が、コントロールの非特異的抗体を用いて処理した細胞の数と比較して、生存細胞の数における少なくとも10%の統計的に有意な低下を示す場合(両側マンホイットニー検定(差は、p<0.05の場合に有意と考えられる)を使用する)、アッセイにおいて中和性であるとして定義される。全細胞数は、処理期間の開始時での細胞数について補正され、T0として言及される。
抗hPG抗体の親和性定数は、Proteon Technique(BioRad)を使用して、Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383: 52-60(その全体において参照により本明細書により組み入れられる)に従って測定することができる。簡単には、マウス抗PG抗体について、抗マウスIgG抗体(50μg/mL)を最初にセンサーチップ上にコーティングし、抗体の注射後にチップにより検出されたシグナルが10,000〜11,500応答単位(RU)の間に入ることを確認する。目的のマウス抗hPG抗体(テスト抗体)を次に注射する(30μg/mLの典型的な濃度で)。テスト抗体が十分に結合する場合、少なくとも500RUの追加シグナルが観察される。テスト抗体とhPGの間での結合の時間経過を、次に、hPGの変動濃度、例えば、200nM、100nM、50nM、25nM、及び12.5nMを注射し、結合のレベルを検出することにより得る。典型的には、いくつかのチャンネルが、単一の実験において並行して複数の抗体をテストするために利用可能であり、hPGの異なる濃度で並行して単一のテスト抗体の結合をアッセイすることを可能にする。1つのチャネルを、非特異的結合についてのコントロールとして、hPGに特異的ではないマウスモノクローナル抗体を用いて注射すべきである。別のチャネルを、バックグラウンドシグナルについてのベースラインとして、希釈緩衝液単独を用いて注射すべきである。一般的に、結合は、非特異的マウス抗体を用いて注射したチャネルにおいて検出可能ではない。この設定において高レベルの結合を示す抗体は、hPGによる捕捉モノクローナル抗体の飽和をもたらしうるが、より低いhPG濃度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、及び3.125nM)に対してテストすることができ、より精度のよい測定を可能とする。
目的の抗体(テスト抗体)が、hPG結合について、ビオチン化参照抗hPG抗体と競合するか否かを評価するための特定のアッセイを、以下の通りに実施することができる。96ウェルプレートを、捕捉抗hPG抗体(ビオチン化参照抗hPG抗体により認識されるエピトープとは異なるhPGのN又はC末端領域を認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体)を用いて、1〜10μg/mLの範囲内で選ばれる濃度で、4℃で一晩コーティングする(0.1〜1μg/ウェル)。22℃で2時間にわたるブロッキングバッファー(PBS中の0.1% TWEEN−20、0.1%BSA)を用いたブロッキング後、組換えhPGを、10pM〜1nM(10〜1000pg/ウェル)の間の範囲の濃度で加え、22℃で2時間にわたりインキュベートする。その後、ビオチン化参照抗hPG抗体(又はビオチン化参照抗hPG抗体を含む混合物)を、増加濃度の非標識テスト抗体濃度と共に加え、22℃で1時間にわたりインキュベートする。非結合抗体を除去するための洗浄後、結合した標識参照抗hPG抗体の検出を、混合物を、50ng/mLのストレプトアビジン(steptavidin)−HRPと22℃で1時間にわたりインキュベーション、西洋ワサビペルオキシダーゼ用の蛍光基質との22℃で1時間にわたるインキュベーション、及び、次に、ルミノメーターにおける相対的な光単位(RLU)の定量化により実施する。アッセイは二重に実施する。
Ki=IC50/[1+([参照抗hPG Ab濃度]/KD 参照抗hPG Ab)]
式中、「IC50」は、参照抗体の結合における50%低下をもたらすテスト抗体の濃度であり、KD 参照抗hPG Abは参照抗hPG抗体の解離定数(hPGについてのその親和性の測定値)である。参照抗hPG抗体(例えば、本明細書に記載する抗hPG抗体の1つ)と競合する有用なテスト抗体は、典型的には、本明細書に記載するアッセイ条件下で10pM〜100nMの範囲のKisを有する。
この実施例では、原発性又は転移性のいずれかの膵臓癌と診断された患者がプロガストリンの上昇した血漿又は血清レベルを有することを実証する。
血漿又は血清プロガストリン濃度を、健常個人(コントロールとして)において、及び膵臓癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、又は乳癌と診断された患者において測定した。健常コントロールサンプル(n=104)を血液バンクから得た。分析に含まれた患者の内、25/32の膵臓癌患者が転移性疾患を有したが、その内の10人がそれらの原発性腫瘍を除去されていた。
図4におけるボックスプロットは、健常コントロールと比較した、アッセイされた癌患者の25パーセンタイル、中央値、及び75パーセンタイル血漿又は血清プロガストリン濃度を示す。ウィスカーは、血漿又は血清プロガストリン濃度の5及び95パーセンタイルを示す。このデータは、原発性及び転移性膵臓癌を伴う患者を含む患者集団が、健常個人と比較して、それらの血漿又は血清中のプロガストリンの上昇レベルを有していたことを実証する。
この実施例では、GAST遺伝子が原発性及び転移性膵臓癌細胞株において発現されることを示す。
テストした細胞は、原発性膵臓癌細胞株BxPC 3及びMIA PaCa 2、ならびに転移性膵臓癌細胞株Capan 1及びSU.86.86からであった。成長の期間後、細胞を再懸濁し、溶解し、全mRNAを、製造者のプロトコールに従ってQIAGEN RNeasy Miniキットを使用して抽出した。RNAを、オリゴ(dT)15プライマー(Roche Applied Science)の存在においてSuperscript II RT(Invitrogen)を使用して逆転写した。リアルタイムPCRを、Quantifast SYBR Green PCRキット(Qiagen)及びEppendorf Mastercycler ep realplex(Eppendorf)を使用して実施した。GAST及びGAPDH遺伝子増幅用のプライマーをSigma Life Scienceから得た。各PCR増幅を、以下の条件を使用して3通りのウェルにおいて実施した:95℃で5分、合計45の2温度サイクル(95℃で10秒及び60℃で30秒)が続く。
異なる細胞株中で発現されるガストリンmRNAの相対レベルを図56に報告する。レベルを、LS174T結腸直腸癌細胞株(ポジティブコントロールとしての役割を果たした)において発現されるGAST mRNAの量と比べて標準化し、データをLS174T CRC細胞株における発現レベルと比べて表現した。テストした全ての膵臓癌細胞株が、プロガストリンをコードする遺伝子(GAST)についてのmRNAを発現する。
この実施例では、膵臓癌細胞株がプロガストリンを分泌することを実証する。
プロガストリンの分泌は、以下のプロトコールを使用して、2D培養中で成長させた膵臓細胞から得られた条件培地において、サンドイッチELISA法を使用して定量化した。細胞を、それらが60%コンフルエントに達するまで75cm2フラスコ中で成長させた。培地を次に除去し、細胞をPBSで1回洗浄した。細胞を次に20mlのM11培地(フェノールレッドを伴わない)中で48時間にわたり成長させた。培地を次に回収し、1,000gで5分間にわたり遠心し、細胞デブリを除去し、−80℃で凍結した。細胞を次にトリプシン処理し、カウントした。
膵臓癌細胞株により条件付けした培地中のプロガストリンの濃度を図6に報告する。データを、プロガストリン濃度(pM)/100万個細胞/48時間の成長として表現した。
この実施例では、抗hPG抗体が転移性膵臓腫瘍細胞の増殖を阻害することを実証する。
Capan 1細胞を6ウェルプレート中に播種し(50,000個細胞/ウェル)、20%ウシ胎児血清を含むDMEM中で8時間にわたり成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ(播種後24時間目に開始する(時間T0))、細胞を、48時間にわたり12時間毎に、0.5% PanexinHの存在において、1μg/mLのコントロールモノクローナル抗体(マウス抗ヒトIgG1、Calbiochem Ref #411451)を用いて、又は1μg/mLの抗hPG MAb3を用いて処理した(示す通り)。技術者は、処理溶液の内容物に関して盲検化された。
結果(図7に示す)を、実験の終了時での平均細胞数/ウェル−実験の開始時に播種した細胞数として算出した。この実験の結果は、抗hPG MAb3が、コントロール抗体と比較して、インビトロでCapan 1転移性膵臓癌細胞の成長を低下させるために効果的であることを実証する。
この実施例では、培養中のBxPC−3原発性膵臓癌細胞の成長に対する抗hPGモノクローナル抗体の阻害効果を実証する。
各実験について、150 000個のBxPC−3細胞を6ウェルプレート中に播種し、8時間にわたり10%ウシ胎児血清を含む培地中で成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ(播種後24時間目に開始する(時間T0))、細胞を、48時間にわたり12時間毎に、0.5% PanexinHの存在において、1μg/mLのコントロールモノクローナル抗体(P3X63Ag8、ATCC、Ref TIB−9)を用いて、又は1μg/mLの抗hPG MAb8を用いて処理した(示す通り)。
結果を図8に示す。コントロール及びテストの両方のサンプルについての実際の細胞数、ならびにコントロールと比べたテストサンプルの細胞数を、以下の表4に提供する:
この実施例では、培養中のMIA PaCa−2原発性膵臓癌細胞の成長に対する抗hPGモノクローナル抗体の阻害効果を実証する。
各実験について、100 000個のMIA PaCa−2細胞を6ウェルプレート中に播種し、10%ウシ胎児血清+2.5%ウマ血清を含む培地中で8時間にわたり成長させた。細胞を一晩血清飢餓させ(播種後24時間目に開始する(時間T0))、細胞を、72時間にわたり12時間毎に、0.5% PanexinHの存在において、10μg/mLのコントロールモノクローナル抗体(P3X63Ag8、ATCC、Ref TIB−9)を用いて、又は10μg/mLの抗hPG MAb8を用いて処理した(示す通り)。コントロールMAb処理細胞及び抗hPG MAb処理細胞の両方における生細胞の数を、72時間目にカウントした。処理の開始時(T0)での細胞数を、72時間目に測定したテスト及びコントロール細胞数から引いた。
実験の結果を図9に提供する。コントロール及びテストの両方のサンプルについての実際の細胞数、ならびにコントロールと比べたテストサンプルの細胞数を、以下の表5に提供する:
この実施例では、抗プロガストリンモノクローナル抗体を用いた転移性膵臓癌細胞の前処理が、低接着培養条件下で癌球として成長するこれらの細胞のその後の能力に対して有する阻害効果を実証する。
100,000個のCapan 1細胞/ウェルを、最初に6ウェルプレート中へ20%FCSを伴うDMEM中に播種し、一晩血清飢餓させ、抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb3又はモノクローナルコントロール抗体(マウス抗ヒトIgG1;Calbiochem ref #411451)の存在において、0.5%Panexin Hを伴うDMEM中で48時間にわたり成長させた。処理の終了時、各処理群について、500個細胞/ウェルを超低付着24ウェルプレートの8つのウェル中へ500μlの無血清M11培地(bFGF及びEGFを含む)中に蒔き、さらに11日間にわたり処理なしで成長させた。この期間の終了時に、写真を撮り、ウェル当たりの球の数をカウントし、球の表面積を測定した。
写真を11日間の「休薬」期間の終了時に撮り、その間に、全ての本来の処理条件からのCapan 1細胞を同じM11培地中で成長させた。その後、全てのウェルの同一性について盲検化された操作者が、球をカウントした。
150,000個細胞/ウェル(転移性膵臓癌細胞株SU.86.86)を、最初に6ウェルプレート(従来の付着性カルチャウェア)中へ8時間にわたり10%FCSを伴うRPMI中に播種し、一晩血清飢餓させ、抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb8、MAb13、MAb16、又はMAb19の非存在又は存在において、0.5%Panexin Hを伴うRPMI中で48時間にわたり成長させた。処理の終了時、各処理群について、50個細胞/ウェルを超低付着96ウェルプレートの8つのウェル中へ100μlの無血清M11培地(bFGF及びEGFを含む)中に蒔き、さらに6日間にわたり処理なしで成長させた。この期間の終了時に、写真を撮り、ウェル当たりの球の数をカウントし、球の表面積を測定した。
写真を6日間の「休薬」期間の終了時に撮り、その間に、全ての本来の処置条件からのSU.86.86細胞を同じM11培地中で成長させた。その後、全てのウェルの同一性について盲検化された操作者が、球をカウントした。
Claims (7)
- 抗ヒトプロガストリン(hPG)抗体を含む膵臓癌の処置に使用する医薬組成物であって、当該抗hPG抗体が、配列番号101のアミノ酸配列を有するヒトプロガストリンポリペプチドに特異的に結合するが、配列番号104のガストリン17のアミド化体、配列番号105のグリシン伸長ガストリン17又は配列番号106のC末端隣接ペプチド(CTFP)には検出可能に結合しない抗hPGモノクローナル抗体であって、下記(a)ないし(e)からなる群から選択される領域を含む抗hPG抗体である医薬組成物:
(a)CDR1がV H CDR1.3(配列番号1)のアミノ酸配列であり、CDR2がV H CDR2.3(配列番号2)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV H CDR3.3(配列番号3)のアミノ酸配列である重鎖可変領域と、CDR1がV L CDR1.3(配列番号4)のアミノ酸配列であり、CDR2がV L CDR2.3(配列番号5)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV L CDR3.3(配列番号6)のアミノ酸配列である軽鎖可変領域、
(b)CDR1がV H CDR1.16(配列番号39)のアミノ酸配列であり、CDR2がV H CDR2.16(配列番号43)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV H CDR3.16(配列番号47)のアミノ酸配列である重鎖可変領域と、CDR1がV L CDR1.16(配列番号50)のアミノ酸配列であり、CDR2がV L CDR2.16(配列番号53)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV L CDR3.16(配列番号57)のアミノ酸配列である軽鎖可変領域、
(c)CDR1がV H CDR1.19(配列番号40)のアミノ酸配列であり、CDR2がV H CDR2.19(配列番号44)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV H CDR3.19(配列番号48)のアミノ酸配列である重鎖可変領域と、CDR1がV L CDR1.19(配列番号51)のアミノ酸配列であり、CDR2がV L CDR2.19(配列番号54)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV L CDR3.19(配列番号58)のアミノ酸配列である軽鎖可変領域、
(d)CDR1がV H CDR1.8(配列番号37)のアミノ酸配列であり、CDR2がV H CDR2.8(配列番号41)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV H CDR3.8(配列番号45)のアミノ酸配列である重鎖可変領域と、CDR1がV L CDR1.8(配列番号49)のアミノ酸配列であり、CDR2がV L CDR2.8(配列番号52)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV L CDR3.8(配列番号55)のアミノ酸配列である軽鎖可変領域、及び
(e)CDR1がV H CDR1.13(配列番号38)のアミノ酸配列であり、CDR2がV H CDR2.13(配列番号42)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV H CDR3.13(配列番号46)のアミノ酸配列である重鎖可変領域と、CDR1がV L CDR1.13(配列番号50)のアミノ酸配列であり、CDR2がV L CDR2.13(配列番号53)のアミノ酸配列であり、そしてCDR3がV L CDR3.13(配列番号56)のアミノ酸配列である軽鎖可変領域。 - 前記抗hPGモノクローナル抗体は、下記(a)ないし(e)からなる群から選択される領域を含む、請求項1記載の医薬組成物:
(a)配列番号12の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号13の軽鎖可変ドメイン配列、
(b)配列番号61の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号65の軽鎖可変ドメイン配列、
(c)配列番号62の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号66の軽鎖可変ドメイン配列、
(d)配列番号59の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号63の軽鎖可変ドメイン配列、及び
(e)配列番号60の重鎖可変ドメイン配列、及び配列番号64の軽鎖可変ドメイン配列。 - 前記抗hPG抗体がヒト化抗hPG抗体である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記膵臓癌が原発性膵臓癌である、請求項1ないし3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記膵臓癌が転移性膵臓癌である、請求項1ないし3のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記抗hPGモノクローナル抗体が、腫瘍の外科的切除の補助として投与される、請求項1ないし5のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記抗hPGモノクローナル抗体が、化学療法の補助として投与される、請求項1ないし5のいずれかに記載の医薬組成物。
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