EA025329B1 - Способы профилактики или предотвращения рецидивов или лечения рака молочной железы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам лечения и профилактики рака молочной железы или рецидива рака молочной железы с помощью моноклонального антитела к прогастрину.

Description

1. Перекрестная ссылка на родственные заявки

Заявка на данный патент пользуется преимуществом, изложенным в соответствии с положением 35 и.8.С. § 119(е) предварительной заявки № 61/293612, поданной 8 января 2010 г., содержание которой включено здесь посредством ссылки в полном объеме.

2. Ссылка на перечень последовательностей, таблицу или компьютерную программу

Перечень последовательностей в данном описании представлен.

3. Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие, в частности, относится к способам лечения, профилактики рака молочной железы и его рецидивов при помощи введения моноклонального антитела, специфичного к прогастрину.

4. Уровень техники

Несмотря на десятилетия фундаментальных и клинических исследований, рак молочной железы остается одним из наиболее смертельных неинфекционных заболеваний, затрагивающих преимущественно женщин, хотя у мужчин также диагностируют указанное заболевание. В соответствии с проектом СЬОΒϋί'ΆΝ Международного агентства по исследованию рака Всемирной организации здравоохранения, было подсчитано, что в 2008 году было почти 1,4 млн случаев возникновения рака молочной железы, и что в том же году больше чем 450 тыс. женщин умерло от этого заболевания. Несмотря на то что в последнее время было много изучено в отношении того, как рак молочной железы воздействует на молекулярном уровне, практикующие врачи все еще основаны на такие терапевтические способы, как хирургия, радиационная терапия, гормональная терапия и химиотерапия, которые были известны онкологам еще поколение назад. Ранняя диагностика, которая стала возможной благодаря успехам в технологии формирования и обработки изображений и молекулярной диагностике, является очень важным фактором успеха любого лечения. Хотя эффективность указанного лечения улучшилась за последние годы, улучшение показателей эффективности лечения и увеличение продолжительности жизни были возрастающими постепенно. Даже новая таргетная терапия, являющаяся результатом революции в молекулярной онкологии, по большей части, всего лишь скромно улучшила результаты. Например, Негеерйи®, который воздействует на рецепторы НЕК2, является эффективным только для 20-25% женщин, имеющих рак молочной железы, новообразования у которых являются НЕК2-положительными.

Две наиболее спорные особенности наблюдения за пациентами рака молочной железы представляют собой метастаз и рецидив.

Метастаз происходит, когда рак молочной железы распространяется к отдаленным органам из первичного новообразования. В то время как часто является возможным произвести резекцию первичного новообразования, то метастазы часто приводят к смерти пациента по той причине, что они становятся слишком многочисленными или переплетенными со здоровой питающей тканью, что является препятствием к хирургическому лечению. В соответствии с данными Американского онкологического общества, норма выживаемости в пять лет для пациентов, у которых впервые был диагностирован рак молочной железы стадии ΙΙΙΒ, в Соединенных Штатах Америки в 2001 и 2002 составляла 41%, которая понижалась вплоть до 15% при стадии IV (т.е. метастатического рака молочной железы).

Рецидив представляет собой явление, в соответствии с которым рака молочной железы возвращается после первичного лечения и явного исчезновения. Кроме эмоционального вреда, от которого страдают пациенты и их семьи, рецидив является проблемой, потому что вернувшийся рак может быть менее восприимчивым к терапии или способам лечения, которые были эффективными при лечении первичного рака. Для других пациентов предшествующее лечение первичного рака, возможно, вызвало необратимые побочные эффекты, такие как сердечно-сосудистые или неврологические нарушения. У таких пациентов риски применения той же терапии для лечения настоящего рака могут быть слишком большими. При этих обстоятельствах у пациента может быть меньше вариантов лечения с сопутствующим большим риском смертности.

Несмотря на то что достижения в хирургии, радиационном лечении, гормональной терапии, химиотерапии и появление таргетной терапии увеличили продолжительность жизни пациентов, пораженных раком молочной железы, многие из таких пациентов продолжают умирать на протяжении месяцев - нескольких лет после постановки им диагноза. По этой причине существует насущная потребность в новых способах лечения, эффективных против рака молочной железы и его рецидивов.

5. Краткое изложение сущности изобретения

Способы обеспечивают лечение нуждающихся в лечении прогастрин-зависимого рака молочной железы посредством введения терапевтически эффективного количества моноклонального антитела, которое специфично связывает прогастрин. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак молочной железы представляет собой метастатический рак и распространяется на кости, легкие, печень или мозг. В других вариантах осуществления рак молочной железы представляет собой первичный рак молочной железы. Во многих вариантах осуществления изобретения антитела антитело является эффективным для снижения пролиферации или повышения гибели клеток прогастрин-зависимого рака молочной железы, уменьшения среднего количества или размера метастаз рака молочной железы или уменьшения концентрации прогастрин в крови подвергающихся лечению пациентов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело вводится до или после хирургии или

- 1 025329 радиационной терапии, или до, одновременно с, или после введения химиотерапевтического препарата или гормонального терапевтического препарата, которые являются эффективными для лечения рака молочной железы. Кроме того, моноклональное антитело можно также вводить до, одновременно с или после введения второго терапевтического антитела, эффективного против рака молочной железы, имеющего специфичность, иную, чем специфичность к прогастрину. В некоторых из этих вариантах осуществления изобретения второе антитело имеет специфичность к РЭФР, ФРЭС или к НЕК.2 и может представлять собой бевацизумаб, трастузумаб и пертузумаб.

Способы также обеспечивают профилактику прогастрин-зависимого рака молочной железы посредством введения пациенту, нуждающемуся в профилактике прогастрин-зависимого рака молочной железы, антитела, которое специфично связывается с прогастрином, в количестве, эффективном для профилактики прогастрин-зависимого рака молочной железы. Рак молочной железы может быть первичным или метастатическим. В других вариантах осуществления изобретения клетки рака молочной железы содержат мутацию в генах ВКСА1 или ВКСА2.

Во многих вариантах осуществления изобретения моноклональные антитела являются эффективными для снижения пролиферации или увеличения степени гибели прогастрин-зависимых клеток рака молочной железы либо уменьшения концентрации прогастрина в крови подвергающихся лечению пациентов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело можно вводить одновременно или после введения химиотерапевтического препарата или гормонального терапевтического препарата, эффективного для профилактики прогастрин-зависимого рака молочной железы. Его можно также вводить одновременно с или после введения второго терапевтического антитела, эффективного для профилактики прогастрин-зависимого рака молочной железы, обладающего специфичностью, иной, чем к ирогастрину, такой как специфичность к НЕК2.

Способы также обеспечивают предотвращение рецидива прогастрин-зависимого рака молочной железы посредством введения пациенту, нуждающемуся в предотвращении рецидивов прогастринзависимого рака молочной железы, антитела, которое специфично связывается с прогастрином, в количестве, эффективном для предотвращения рецидива прогастрин-зависимого рака молочной железы. В некоторых из этих способов пациент ранее подвергался лечению рака молочной железы, такому как хирургия, радиационная терапия, биологическая терапия, иммунотерапия, гормональная терапия и химиотерапия, после чего рак молочной железы явно отсутствовал.

Во многих вариантах осуществления изобретения моноклональные антитела являются эффективными для снижения пролиферации или повышения степени гибели клеток прогастрин-зависимого рака молочной железы либо уменьшения концентрации прогастрина в крови подвергающихся лечению пациентов. В других вариантах осуществления изобретения их можно вводить одновременно или после введения второго терапевтического препарата, эффективного для профилактики прогастрин-зависимого рака молочной железы, включая, например, антитело, имеющее специфичность, иную, чем специфичность к прогастрину.

6. Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет диаграмму, где сравнивают степень экспрессии гена гастрина в трех клеточных линиях метастатического рака молочной железы человека относительно клеток 8А480.

Фиг. 2 представляет диаграмму, где сравнивают относительную степень экспрессии гена гастрина в первичных новообразованиях молочной железы от различных пациентов.

Фиг. 3 представляет диаграмму, где сравнивают относительную степень экспрессии гена гастрина в метастатических новообразованиях молочной железы от различных пациентов.

Фиг. 4 представляет диаграмму, показывающую концентрацию прогастрина в кровь пациентов с метастатическим раком молочной железы, у которых была произведена резекция первичного новообразования, по сравнению со здоровыми из контрольной группы.

Фиг. 5 представляет диаграмму, где сравнивают действие контроля и поликлонального антитела к НРС на рост метастатических клеток ΜΌΑ-ΜΒ-231 рака молочной железы в культуре.

Фиг. 6 представляет диаграмму, где сравнивают действие контроля и моноклонального антитела ΜΑΗ3 и ΜΑΗ8 к НРС на рост метастатических клеток ΜΌΑ-ΜΒ-231 рака молочной железы в культуре.

Фиг. 7 представляет диаграмму, где сравнивают действие контроля и моноклональных антител ΜΑΗ8, ΜΑΗ13, ΜΑΗ16 и ΜΑΗ19 к НРС на рост метастатических клеток ΜΌΑ-ΜΒ-231 рака молочной железы в культуре.

Фиг. 8 представляет диаграмму, где сравнивают действие контроля и моноклонального антитела к НРС на рост метастатических клеток ΜСΡ-7 рака молочной железы в культуре.

Фиг. 9 представляет диаграмму, где сравнивают действие контроля и моноклонального антитела к НРС на рост метастатических клеток Τ47Ό рака молочной железы в культуре.

Фиг. 10 представляет диаграмму, где сравнивают относительное количество экспрессии гена гастрина, связанного с ростом двух различных клеточных линий метастатического рака молочной железы в нормальных условиях тканевой культуры и при культивировании в условиях низкой адгезии.

Фиг. 11 представляет диаграмму, где сравнивают действие контроля и моноклонального антитела

- 2 025329

МЛЬ8 к №0 на рост в качестве сфероидов метастатических клеток МСР-7 рака молочной железы при культивировании в условиях низкой адгезии.

Фиг. 12 представляет диаграмму, где сравнивают действие контроля и моноклонального антитела МАЬЗ к №0 на рост в качестве сфероидов метастатических клеток МСР-7 рака молочной железы при культивировании в условиях низкой адгезии.

Фиг. 13 представляет аминокислотные последовательности человеческого препрогастрина (8ЕЦ ГО N0: 100), где сигнальная пептидная последовательность является подчеркнутой, зрелый человеческий прогастрин (8ЕЦ ГО N0: 101) и определенные продукты процессинга прогастрина, включая 034 (8ЕЦ ГО N0: 102), 034-01у (8ЕЦ ГО N0: 103), 017 (8ЕЦ ГО N0: 104), 017-01у (8ЕЦ ГО N0: 105) и СТРР (8ЕЦ ГО N0: 106).

Фиг. 14 представляет полинуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных легких и вариабельных тяжелых цепей определенных образцов мышиных моноклональных антител к №0. В каждом случае три СЭК-участка выделены полужирным подчеркнутым шрифтом, а именно фиг. 14А представляет полипептидную последовательность Ун цепи мышиного антитела МАЬ3 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 12) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 16);

фиг. 14В представляет полипептидную последовательность У_ъ цепи мышиного антитела МАЬ3 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 13) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 17);

фиг. 14С представляет полипептидную последовательность У_н цепи мышиного антитела МАЬ4 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 14) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 18);

фиг. 14Ό представляет полипептидную последовательность У_ъ цепи мышиного антитела МАЬ4 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 15) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 19);

фиг. 14Е представляет полипептидную последовательность цепи У_н мышиного антитела МАЬ8 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 59) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 67);

фиг. 14Р представляет полипептидную последовательность У_ъ цепи мышиного антитела МАЬ8 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 63) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 71);

фиг. 140 представляет полипептидную последовательность цепи У_н мышиного антитела МАЬ13 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 60) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 68);

фиг. 14Н представляет полипептидную последовательность У_ъ цепи мышиного антитела МАЬ13 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 64) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 72);

фиг. 141 представляет полипептидную последовательность цепи У_н мышиного антитела МАЬ16 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 61) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 69);

фиг. 141 представляет полипептидную последовательность У_ъ цепи мышиного антитела МАЬ16 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 65) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 73);

фиг. 14К представляет полипептидную последовательность цепи У_н мышиного антитела МАЬ19 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 62) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 70);

фиг. 14Ь представляет полипептидную последовательность цепи У_ъ мышиного антитела МАЬ19 к №0 (8ЕЦ ГО N0: 66) и полинуклеотидную последовательность, ее кодирующую (8ЕЦ ГО N0: 74).

Фиг. 15 представляет предполагаемые полипептидные последовательности для гуманизированных вариабельных тяжелых и легких цепей выбранных моноклональных антител к №0, описанных здесь. В каждом случае три СЭК-участка выделены полужирным подчеркнутым шрифтом, а именно фиг. 15А представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ3 (8ЕЦ ГО N0: 21);

фиг. 15В представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ3 (8ЕЦ ГО N0: 22);

фиг. 15С представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ4 (8ЕЦ ГО N0: 23);

фиг. 15Ό представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ4 (8ЕЦ ГО N0: 24);

фиг. 15Е представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ8(а) (8ЕЦ ГО N0: 75);

фиг. 15Р представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ8(а) (8ЕЦ ГО N0: 76);

фиг. 150 представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ8(Ь) (8ЕЦ ГО N0: 77);

фиг. 15н представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ8(Ь) (8ЕЦ ГО N0: 78);

фиг. 151 представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ8(с) (8ЕЦ ГО N0: 79);

фиг. 151 представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ8(с) (8ЕЦ ГО N0: 76);

фиг. 15К представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ13(а) (8ЕЦ ГО N0: 80);

- 3 025329 фиг. 15Ь представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи Уь гуманизированного антитела МЛЫ3(а) (8ЕС ГО N0: 81);

фиг. 15М представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЫ3(Ь) (8ЕС ГО N0: 82);

фиг. 15Ν представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ13(Ь) (8ЕС ГО N0: 83);

фиг. 150 представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ16(а) (8ЕС ГО N0: 84);

фиг. 15Р представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ16(а) (8ЕС ГО N0: 85);

фиг. 15С представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ16(Ь) (8ЕС ГО N0: 86);

фиг. 15К представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ16(Ь) (8ЕС ГО N0: 87);

фиг. 158 представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ16(с) (8ЕС ГО N0: 88);

фиг. 15Т представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ16(с) (8ЕС ГО N0: 89);

фиг. 15и представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ19(а) (8ЕС ГО N0: 90);

фиг. 15У представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ19(а) (8ЕС ГО N0: 91);

фиг. 15ν представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ19(Ь) (8ЕС ГО N0: 92);

фиг. 15Х представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ19(Ь) (8ЕС ГО N0: 93);

фиг. 15Υ представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_н гуманизированного антитела МАЬ19(с) (8ЕС ГО N0: 94);

фиг. 15Ζ представляет предполагаемую аминокислотную последовательность цепи У_ъ гуманизированного антитела МАЬ19(с) (8ЕС ГО N0: 95).

7. Детальное описание

7.1. Рак молочной железы.

Большинство злокачественных новообразований женской молочной железы начинается в клетках, которые выстилают протоки, которые служат для прохождения молока от вырабатывающих молоко желез или долек. Такой рак молочной железы упоминается как протоковый рак. Другой рак молочной железы начинается в клетках, которые выстилают дольки, названный дольковый рак. Меньшинство злокачественных новообразований молочной железы начинается в других тканях, содержащих молочную железу, включая строму, которая представляет собой жировую и соединительную ткань, окружающую протоки и дольки, лимфатические сосуды и кровеносные сосуды.

Практически все случаи рака молочной железы представляют собой карциномы, которые начинаются в эпителиальных клетках, которые выстилают протоки или дольки. Такие злокачественные новообразования известны как протоковая карцинома и дольковая карцинома соответственно. Рак молочной железы также может начаться как саркома, которая формируется в соединительной ткани молочной железы, включая мускулы, жир или кровеносные сосуды.

Отдельные виды рака молочной железы включают, но не обязательно ограничиваются ими, протоковую карциному ίη δίίπ, дольковую карциному ίη δίίυ, инвазивную (или инфильтративную) протоковую карциному, инвазивную (или инфильтративную) дольковую карциному. Малораспространенные виды рака молочной железы включают отечно-инфильтративный рак молочной железы, трижды отрицательный рак молочной железы, смешанные новообразования, медуллярную карциному, метапластическую карциному, слизеобразующую карциному, болезнь Педжета сосков, тубулярную карциному, папиллярную карциному, аденомокистозную карциному (аденокистозную карциному), филоидозное новообразование и ангиосаркому.

7.2. Метастаз рака молочной железы.

Метастаз относится к процессу, посредством которого распространяется рак. Если кратко, то опухолевых клеток оставляют первичное новообразование, передвигаются посредством системы кровообращения или лимфатической системы к новому участку ткани и образуют вторичное новообразование. Новообразования на новом участке ткани упоминаются как метастатические новообразования и обычно определяются по источнику первичного новообразования. Например, рак молочной железы, который распространился к другим тканям, упоминается как метастатический рак молочной железы, несмотря на местоположение ткани вторичного, метастатического новообразования. Наиболее распространенными органами, к которым метастазирует рак молочной железы, являются кости, легкие, печень или мозг, но рак молочной железы также может распространиться и к другим органам.

- 4 025329

Раковые клетки часто распространяются к лимфатическим узлам возле первичного новообразования, что называется поражением лимфатического узла или местно-распространенным заболеванием.

Не желая быть ограниченным какой-либо определенной принципиальной теорией, метастаз, как полагают, состоит из многих различных стадий: прорастание и миграция, интравазация, циркуляция, экстравазация и колонизация, пролиферация и ангиогенез. Во время прорастания и миграции отдельные клетки отделяются от первичного новообразования и проникают в смежную, здоровую ткань. Чтобы достичь этого, раковые клетки должны стать подвижными, и вероятно, подвергаются фенотипическому преобразованию, названному эпителиально-мезенхимальным переходом, который обеспечивает это. Ка11шт, К., и др., 1. СЬп. 1пус51.. 119 (6) (2009), 1420-28. Такие клетки могут вырабатывать ферменты, которые ослабляют внеклеточный матрикс, таким образом облегчая миграцию из первичного новообразования в окружающие здоровые ткани. Когда раковая клетка контактирует с кровеносными или лимфатическими сосудами, она вставляется между эндотелиальными клетками, выстилающими сосуды, и проникает в кровоток или лимфатическую систему. Затем аберрантная клетка перемещается через систему кровообращения или лимфатическую систему к новому органу или к лимфатическому узлу. Затем раковая клетка может разместиться в капиллярах или лимфатических сосудах органа, такого как печень, легкое, или в другой ткани или органе и затем экставазитировать, проникая через эндотелий в пространство ткани. Наконец, во время колонизации, пролиферации и ангиогенеза опухолевых клеток занимают место нахождения в их новой питающей ткани и начинают расти. Когда новое метастатическое новообразование достигает достаточного размера, оно может выделять факторы роста, такие как ФРЭС, для того чтобы стимулировать рост новых кровеносных сосудов в новообразовании, что приводит к доставке кислорода и питательных веществ для быстрого роста новообразования.

7.3. Рецидив рака молочной железы.

Рецидив рака молочной железы определяют как возвращение рака молочной железы после лечения, в результате которого рак молочной железы явно отсутствовал. Если вернувшийся рак молочной железы находится в том же самом месте, что и первичный рак или очень близко к нему (например, в той же самой молочной железе или возле шрама мастэктомии), то это известно как местный рецидив. Рак, обнаруженный на противоположной молочной железы, не является рецидивом и, как полагают, является новым случаем возникновения рака. Если вернувшийся рак молочной железы растет в лимфатических узлах или тканях возле места первичного рака, то это известно как региональный рецидив, и если вернувшийся рак молочной железы метастазирует к органам или тканям, отдаленным от места первичного рака, то это известно как системный рецидив.

7.4. Раковые стволовые клетки и рак молочной железы.

Солидные опухоли не обязательно представляют собой гомогенные ткани. Чаще, некоторые новообразования включает ряд типов аберрантных клеток, имеющих отличительные фенотипические и функциональные свойства. В этом отношении, такие новообразования походят на патологические органы. Одним важным отличием клеток, содержащих солидные опухоли, является степень, до которой они способны вызывать образование новой опухоли, когда их пересаживают на новый участок в том же хозяине, или к новому хозяину того же или различных видов. Клетки, имеющие указанное свойство, известны как клетки, вызывающие новообразования или рак, или альтернативно, стволовые опухолевые клетки или раковые стволовые клетки. Напротив, другие клетки, содержащие новообразования, значительно уменьшили потенциал вызывать новые опухоли после пересадки, даже когда используется значительное количество клеток. В одном неограничивающем примере в 100 раз меньшее количество клеток, полученных из клеточной линии рака молочной железы, имеющих фенотип раковой стволовой клетки, было в состоянии образовывать новые опухоли у мышей, по сравнению с клетками той же самой клеточной линии, которые испытывали недостаток фенотипа стволовой клетки. Оир1а, Р.В., и др., 1йеп0ПсаОоп оГ 5с1ссОус 1иЫЫ1ог8 оГ сапсег к!ет се11к Ьу ЫдЬчЬтоидЬри! кстеешпд, Се11, 13864-659 (2009). См. также Рйтоте, С.М. и С. Кирегоаккет, Нитап Ьтеак! сапсег се11 Ьпек сойаш Дет-Ьке се11к 1Ьа1 ке1Г-гепете, дйе пке 1о рЬепо4ур1са11у ййетке ргодепу апй кигуйе сЬето!Ьетару, Вг. Сапсег Кек., 10: К25 (2008).

Во многих новообразованиях раковые стволовые клетки включают относительно небольшую пропорцию всех жизнеспособных клеток, присутствующих в новообразовании. В отличие от этого, большинство опухолевых клеток, содержащих основную массу новообразования, неспособно вызывать новую опухоль после их пересадки. Однако в небольшом количестве новообразований раковые стволовые клетки могут составлять большинство или даже все клетки, которые содержат новообразование. Как используется здесь, основная масса опухолевых клеток относится к опухолевым клеткам, которые не способны вызывать новые опухоли после пересадки, за исключением тех случаев, когда используют большое количество таких клеток. Раковые стволовые клетки также имеют фенотипические характеристики, которые отличаются от основной массы опухолевых клеток, включая способность к самовосстановлению и способность к образованию новой опухоли после пересадки относительно небольшого количества раковых стволовых клеток, и экспрессию различных маркеров, которые определяют с помощью сортировки флюоресцентно активированных клеток (РЛС8) или других исследований. Возможны также и другие различия между раковыми стволовыми клетками и основной массой опухолевых клеток.

Не желая быть связанными с какой-либо определенной теорией, раковые стволовые клетки, как по- 5 025329 лагают, разделяют определенные свойства с нормальными стволовыми клетками, что в контексте раковых стволовых клеток содействует их способности давать начало новообразованиям. В частности, раковые стволовые клетки подвергаются асимметричному клеточному делению, что дает два типа дочерних клеток. Первые остаются недифференцированными и сохраняют характеристики родительской стволовой клетки, что относится к их способности к самовосстановлению без ограничений. Другие дочерние клетки, которые называют клетками-предшественниками, способны к делению и дифференциации, хотя и аберрантному, что дает начало целому спектру более дифференцированных клеток, которые находят во многих солидных опухолях. Клетки-предшественники пролиферируют более быстро, чем стволовые клетки, и, таким образом, способствуют физическому росту новообразования, в то время как стволовые клетки ответственны за способность новообразования к росту без ограничений при помощи генерирования новых клеток-предшественников.

Указанные свойства позволяют раковым стволовым клеткам вызывать, в конечном счете, большое количество клеток, содержащих растущее новообразование. Таким образом, после пересадки в новое животное раковые стволовые клетки могут воссоздать тип новообразования, из которого они произошли, даже после многократных последовательных пересадок. Однако раковые стволовые клетки, в отличие от нормальных стволовых клеток, дают начало генетическим мутациям и/или эпигенетическим изменениям, которые могут привести к искаженному характеру пролиферации и/или к низкому уровню апоптоза, так же как и привести к аберрантному дифференцированию, вызывающему накопление патологических клеток, которые могут формировать основную массу новообразования.

Раковые стволовые клетки могут быть идентифицированы в соответствии со многими фенотипическими особенностями, которые отличают их от основной массы опухолевых клеток. Во-первых, как отмечено выше, раковые стволовые клетки обладают способностью вызывать новую опухоль после их пересадки новому хозяину. В отличие от этого, основная масса опухолевых клеток или неспособна вызывать новые опухоли, или требуется значительно большее количество клеток, чем количество раковых стволовых клеток, для того чтобы достичь появления новой опухоли. Раковые стволовые клетки также можно идентифицировать по их способности экспрессировать или не экспрессировать определенные маркеры, в то время как основная масса опухолевых клеток того же самого новообразования имеет различные особенности экспрессии маркеров. Раковые стволовые клетки также имеют предпочтительную способность, по сравнению с основной массой опухолевых клеток, расти в условиях культивирования в отсутствие сыворотки и низкой адгезии и образовывать так называемые сфероиды. Возможны и другие фенотипические различия, способные отличить раковые стволовые клетки от основной массы опухолевых клеток.

Как отмечено выше, раковые стволовые клетки могут также быть идентифицированы в соответствии с характеристиками экспрессии определенных маркеров либо самих по себе, либо в комбинации с другими. Раковые стволовые клетки от различных новообразований, однако, могут демонстрировать различные фенотипы маркеров. Такие маркеры включают белки, которые экспрессируют внутри клетки или на поверхности клетки, и могут быть выявлены посредством применения многих методик, включая, но не ограничиваются ими, иммуногистохимию, иммунофлюоресценцию и РЛС8-анализ. Также возможны другие методики обнаружения маркера, которые соответствуют знаниям специалиста в данной области. Маркеры также включают белки, активность которых может функционально оцениваться в раковых стволовых клетках. Неограничивающие примеры типов маркеров включают белки-переносчики, такие как те, которые выносят вещества из клеток или приносят вещества в клетки, ферменты, такие как детоксифицирующие ферменты.

Образцовые маркеры, которые могут применяться для того, чтобы идентифицировать раковые стволовые клетки молочной железы, включают, но не ограничиваются ими, С.П44. С.П24 и ΕδΑ. Также возможны другие маркеры, подходящие для идентификации раковых стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения отсутствие экспрессии маркера указывает на фенотип раковой стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения настоящего раскрытия раковые стволовые клетки молочной железы могут быть идентифицированы следующим фенотипом маркера, посредством применения ΡΑСδ, или других методик, которые известны специалисту в данной области: СО44(+)/СП24(-), СО44(+)/СП24(низкий) и С^44(+)/С^24(-)/ΕδΑ(+). Экспрессия других маркеров, а также их комбинаций и образцов, также может применяться для того, чтобы идентифицировать раковые стволовые клетки в указанных злокачественных новообразованиях, так же как и в других видах злокачественных новообразований. В других вариантах осуществления изобретения настоящего раскрытия раковые стволовые клетки молочной железы могут быть идентифицированы посредством применения ΡΑСδ-анализа, в качестве клеток, отсортированных в так называемую боковую популяцию в соответствии с их преимущественной способностью исключать определенные контрастные вещества. Одним неограничивающим примером такого контрастного вещества является контрастное вещество НоссНЦ 33342.

Как отмечено выше, раковые стволовые клетки также можно отличить от основной массы опухолевых клеток благодаря их повышенной способности вызывать рост новой опухоли после их пересадки новому хозяину. Таким образом, одним из способов подтвердить идентичность популяции клеток, кото- 6 025329 рые как предполагают, являются раковыми стволовыми клетками, состоит в том, чтобы протестировать их способность вызвать рост новообразования после пересадки животному-реципиенту, не относящемуся к человеку.

Методы пересадки, которые подходят для оценки того, содержит ли новообразование или клеточная линия раковые стволовые клетки, известны специалисту в данной области. В качестве неограничивающего примера, новообразование, или его часть, которое как предполагают, содержит раковые стволовые клетки, отделяют таким способом, как хирургическая резекция. После этого ткань новообразования измельчают и обрабатывают ферментами или поддают какой-либо другой обработке, которая является эффективной для того, чтобы дезагрегировать новообразование и высвободить составляющие его клетки. В качестве альтернативы, когда клеточная линия подвергается анализу, может быть необходимым только диссоциировать клетки с помощью ферментативной или химической обработки.

После того, как готова суспензия клеток, клетки собирают посредством центрифугирования и субпопуляции, известные как соответствующие раковым стволовым клеткам, отделяют в соответствии с методами, известными в данной области. Как обсуждалось выше, в одном неограничивающем примере, такие клетки экспрессируют определенные образцы маркеров, которые являются показателем раковых стволовых клеток, которые выявляют посредством использования специфических антител, и с помощью сортировки флюоресцентно активированных клеток (РЛС8). В других вариантах осуществления изобретения субпопуляции, которые, как предполагают, содержат раковые стволовые клетки, могут быть отделены в соответствии с другими фенотипическими характеристиками, такими как их способность исключать определенные контрастные вещества.

После выделения соответствующих субпопуляций клеток предварительно определенное количество таких клеток затем имплантируют в одну или более целевые ткани или органы животного-реципиента. В некоторых вариантах осуществления изобретения животное-реципиент представляет собой иммунодефицитную мышь, включая, но не ограничиваясь ими, голых мышей, мышей с тяжелым комбинированным иммуннодефицитом (ТКИД) и мышей с не связанным с ожирением диабетическим ТКИД (НОДТКИД). Другие виды также могут быть использованы в соответствии со знаниями специалиста в данной области.

Клетки могут быть имплантированы подкожно, в жировое тело (такое как жировое тело мышей, относящееся к грудной железе), в мозг, поджелудочную железу, или печень, или в почку (как, например, в почечную капсулу). Клетки также могут быть имплантированы в другие ткани и органы. В некоторых вариантах осуществления изобретения целевую ткань или орган выбирают для того, чтобы воспроизвести ткань или орган первичного новообразования в условиях исследования. Однако в других вариантах осуществления изобретения различные ткани или органы выбирают для того, чтобы прижить в них имплантированные клетки. В качестве неограничивающего примера, в почечную капсулу мыши НОДТКИД могут быть пересажены стволовые клетки колоректального рака, для того чтобы оценить их способность вызывать новую опухоль.

После имплантации, которую выполняют с применением методик, которые являются известными специалисту, клетки оставляют в покое, для того чтобы определить, растет ли новая опухоль на участке имплантации. Для клеток, которые были имплантированы подкожно, рост опухоли может быть оценен визуальным контролем и ощупыванием участка имплантации. Если опухоль действительно растет, то ее размер может быть измерен по истечении некоторого времени с использованием кронциркуля. Для клеток, которые были имплантированы во внутренний орган, животным можно пожертвовать через заранее установленный период времени после имплантации, чтобы определить, имеется ли опухоль, и если так, то ее размер. В качестве альтернативы, в соответствии со знаниями специалиста в данной области, для того чтобы оценить рост опухоли могут применяться неинвазивные методы.

Фенотип раковой стволовой клетки также отличается преимущественной способностью раковых стволовых клеток расти в качестве сфероидов при культивировании в условиях низкой адгезии и без сыворотки, в то время как менее вероятно, что основная масса опухолевых клеток будет в состоянии расти в качестве сфероидов при тех же самых условиях. Сфероиды представляют собой уплотненные шарики клеток, которые образуются, так как обычные клетки растут в культуре, после того, как их высеяли в качестве дезагрегированных суспензий. Образование таких сфероидов усиливается, когда клетки выращивают в среде без сыворотки (например, МаттоСиН®. которую можно получить от компании §1етСе11 Тсс1то1од1С5. 1пс, Ванкувер, Канада), как правило, в присутствии специфических факторов роста (включая, но не ограничиваясь ими, эпидермальный фактор роста (ЭФР) и основной фактор роста фибробластов (оФРФ)), и в чашках Петри, имеющих поверхность, к которой клетки млекопитающих слабо адгезируют. Подобно стволовым клеткам из нормальных тканей, было обнаружено, что раковые стволовые клетки предпочтительно растут как сфероиды в соответствующих условиях культивирования. См., например, Карра, О., и др., Ехр. Се11 Кек., 314:2110 (2008); δίη§1, 8.К., и др., Сапсег Кек., 63:5821 (2003); Рапд, Ό., и др., Сапсег Кек., 65:9328 (2005). В отличие от этого, основная масса опухолевых клеток, которые имеют тенденцию к более высокому дифференцированию, с меньшей долей вероятности образуют сфероиды при тех же самых условиях культивирования. Если основная масса опухолевых клеток на состоянии образовывать сфероиды, то они имеют тенденцию быть меньшими в размерах и/или представ- 7 025329 лять меньшее количество, по сравнению с клетками, которые были образованы похожим количеством раковых стволовых клеток.

7.5. Раковые стволовые клетки и рецидив рака молочной железы.

Опухолевые клетки со свойствами раковых стволовых клеток были определены как демонстрирующие повышенное сопротивление радиационной терапии и/или химиотерапевтическим препаратам. Для того чтобы объяснить сопротивление раковых стволовых клеток радиационной терапии или химиотерапевтическим препаратам, были предложены различные молекулярные механизмы. Например, было сообщено, что определенные раковые стволовые клетки могут обладать способностью более легко восстанавливать свою ДНК после генотоксического поражения, в то время как другие раковые стволовые клетки экспрессируют более высокие уровни противоапоптических белков или молекулярных насосов, которые являются эффективными для устранения химиотерапевтических препаратов, поступающих в такие клетки. Еу1ег, С.Е., и ΤΝ. КтсЬ, 1. СЬп. Опсо1., 26:2839-2845 (2008). Также тот факт, что раковые стволовые клетки пролиферируют более медленно, чем клетки-предшественники, также может объяснить сравнительную способность стволовых клеток перенести их подвержение радиационной терапии и токсическим химиотерапевтическим препаратам, которые могут уничтожить основную массу опухолевых клеток.

Не желая быть связанным какой-либо определенной теорией, наблюдение, что раковые стволовые клетки являются устойчивыми к радиационной терапии и химиотерапии, можно объяснить явлением рецидивов в больных раком, которые подвергались указанным способам лечения. Еу1ег, выше. У таких пациентов вначале лечение является эффективным, что приводит к уменьшению новообразования или к его отсутствию на диагностическом сканировании, но новообразования появляются снова через некоторое время после того, как лечение было прекращено.

Что касается роли раковых стволовых клеток на механизме рецидивов, то является вероятным, что, в то время как большинство или даже вся основная масса опухолевых клеток уничтожены терапией, остаются многие жизнеспособные раковые стволовые клетки, которые остаются невредимыми по причине их усиленной способности сопротивляться действию радиационной терапии или химиотерапии. После того, как терапия завершена, эти оставшиеся жизнеспособными клетки продолжают расти, что делает возможным преобразование первичной опухоли или образование новых опухолей.

В соответствии с этой теорией сообщалось, что лечение мышей, которым были пересажены человеческие клеточные линии рака молочной железы химиотерапевтическим препаратом, было эффективным для части выбранных и обогащенных опухолевых клеток, имеющих характеристики раковых стволовых клеток. Уи, Р., и др., 2007, 1е1-7 Кеди1а1ек 8е1Т гепе\уа1 апб ШтопдешсЬу о£ Ьтеак! сапсег се11к, Се11 131:1109-23.

Наблюдение, что раковые стволовые клетки молочной железы являются устойчивыми как к радиационной терапии, так и к химиотерапевтическим препаратам, предполагает, что такие клетки ответственны за рецидив рака молочной железы. РПШрк, Т.М., и др., ТЬе гекропке о£ СО24^1о'7С.П44' Ьтеак! сапсет-шШабпд се11к Ю таб1абоп, 1. №И. Сапс. 1пкЕ 98 (24): 1777-1785 (2006), Сир1а, Р.В., и др., и Рбтоте, С.М. и С. Кирегоаккет, выше.

7.6. Прогресс в понимании роли прогастрина в отношении рака молочной железы.

Как раскрыто более подробно в примерах, заявители неожиданно обнаружили, что ген гастрина (СА8Т) экспрессирует в трех различных человеческих метастатических клеточных линиях рака молочной железы, клетках МСР-7, клетках МОА-МВ231 и клетках Τ47Ό в различной степени, по сравнению с контрольными клеточными линиями. В соответствии с данными, полученными из исследований ш νίϋΌ, заявители также неожиданно обнаружили, что ген гастрина экспрессировался в различной степени в 27 из 105 первичных новообразований молочной железы и в 7 из 25 метастатических новообразований молочной железы, полученных от пациентов, страдающих раком молочной железы человека.

Поскольку прогастрин представляет собой продукт гена гастрина (наряду с другими пептидами, посттрансляционно процессированными из того же генетического продукта), данные ш νίΙΐΌ и ш У1уо исследований экспрессии гена гастрина подтверждают, чтобы некоторые, но не все первичные и метастатические новообразования молочной железы секретируют белок прогастрина. Подтверждение в отношении метастатического рака молочной железы идет из наблюдений заявителей того факта, что медианный уровень РС в крови у пациентов, у которых был диагностирован метастатический рак молочной железы, которым были удалены первичные новообразования, был выше, по сравнению с таковым в крови здоровых в группе контроля. Таким образом, метастатический рак молочной железы секретируег РС, который может быть обнаружен в крови. Уровни РС выше нормальных были также выявлены в крови определенных пациентов, у которых был диагностирован первичный рак молочной железы. По этой причине с помощью диагностических тестов является возможным обнаружить наличие рака молочной железы у пациентов, посредством сравнения уровня РС в крови у пациента, у которого подозревают наличие рака молочной железы, с уровнем РС в крови у здоровых пациентов, у которых рак отсутствует. Уровни РС в плазме и/или в сыворотке крови могут быть выявлены посредством применения нейтрализующих или не нейтрализующих антител в соответствии с настоящим раскрытием, где используют методы такие, например, но не ограничиваются ими, как РИА или ЕЬТЗА. Предварительный диагноз рака молочной желе- 8 025329 зы, на основании уровня РС в крови, который является выше нормального уровня, затем может быть подтвержден посредством применения других тестов, таких как диагностическая визуализация, например, КТ или МРТ.

Заявители также неожиданно обнаружили, что рост в культуре определенных человеческих метастатических клеточных линиях рака молочной железы, например клеток МСР-7 и клеток ΜΌΆ-ΜΒ-231, ингибируется посредством обработки с помощью поликлональных и/или моноклональных антител, которые специфически распознают ЬРС. Исследования, в которых применяли клетки ΜΌΆ-ΜΒ-231, показали, что эффект ингибирования, когда применяют моноклональное антитело к ЬРС, был зависимым от дозы и что ингибирующее действие может вызываться антителами, распознающими как Ν-конец, так и С-конец прогастрина. В отличие от этого, обработка человеческой клеточной линии метастатического рака молочной железы Τ47Ό моноклональным антителом к ЬРС существенно не повлияло на рост указанных клеток. Эти неожиданные открытия интерпретируются в том значении, что некоторые, но не все, человеческие метастатические клетки рака молочной железы являются чувствительными к РС и что рост таких клеток может быть ингибирован посредством обработки нейтрализующими антителами к ЬРС.

Клетка рака молочной железы, чувствительная к РС, является такой, которая, по крайней мере, частично зависит от прогастрина в смысле ее жизнеспособности и/или роста, прямо или косвенно. Не желая быть связанным с какой-либо определенной теорией, является вероятным, что нейтрализующие антитела к ЬРС являются эффективными для ингибирования жизнеспособности и/или роста таких клеток, посредством связывания с РС и блокирования РС-зависимой передачи сигнала. По этой причине прогастрин противодействует опосредованию их жизнеспособности и/или промотирующих рост эффектам. Однако могут существовать и другие механизмы, с помощью которых антитела к РС ингибируют жизнеспособность и/или рост клеток рака молочной железы, и отдельный механизм действия не предназначен для ограничения объема настоящего раскрытия изобретения.

На основании наблюдения того, что нейтрализующие антител к ЬРС могут ингибировать рост определенных человеческих метастатических клеток рака молочной железы, являются возможными способы лечения чувствительного к РС метастатического рака молочной железы, при помощи введения терапевтически эффективного количества нейтрализующих антител к ЬРС пациентам, нуждающимся в лечении метастатического рака молочной железы.

Другие исследования, выполненные заявителями, неожиданно продемонстрировали, что метастатический рак молочной железы содержит раковые стволовые клетки молочной железы, чувствительные к РС, рост которых может быть ингибирован посредством их обработки нейтрализующими антителами к ЬРС. В частности, заявители выявили, что приблизительно 95% клеток ΜΌΆ-ΜΒ-231 экспрессировали фенотипический маркер, ΟΌ44+/ΟΌ24-, который идентифицировал их как раковые стволовые клетки молочной железы (исследование не показано). Поскольку клетки ΜΌΆ-ΜΒ-231 являются чувствительными к РС, и почти все эти клетки экспрессируют маркер раковой стволовой клетки молочной железы, то вероятно, что стволовые клетки являются чувствительными к РС. В соответствии с этим клетки Τ47Ό, которые, как было установлено, не являются чувствительными к РС, не содержат клеток, экспрессирующих СО44+/СО24-(исследование не показано), в то время как клетки ΜΟΡ-7, которые, как сообщали, содержали приблизительно 1,6% клеток ΟΌ44+/ΟΌ24 (РЫШрз, и др., выше), как также было установлено, были чувствительными к ингибирующему действию антител к ЬРС на рост.

В поддержку вывода о том, что определенные раковые стволовые клетки молочной железы являются чувствительными к РС, было наблюдение, что экспрессия гена гастрина в клетках ΜΌΆ-ΜΒ-231 повысилась, когда клетки были выращены при культивировании в условиях низкой адгезии, которые являются благоприятными для роста раковых стволовых клеток. Однако экспрессия гена гастрина снизилась в клетках ΜΟΡ-7, когда их выращивали в условиях низкой адгезии, хотя воздействие на секрецию РС таких клеток все еще не известно.

Даже притом, что относительно небольшая часть клеток ΜΟΡ-7 экспрессирует ΟΌ44+/ΟΌ24-, заявители нашли дополнительное подтверждение идеи, что раковые стволовые клетки молочной железы являются чувствительными к РС при помощи выращивания клеток ΜΟΡ-7 при культивировании в условиях низкой адгезии и посредством определения воздействия специальной обработки антителом сфероидального образования. Как объяснено в примерах, обработка моноклональным антителом к ЬРС уменьшала количество сфероидов, по сравнению с контрольной группой. Поскольку сфероидальное образование при культивировании в условиях низкой адгезии является особенностью, которая ассоциируется с раковыми стволовыми клетками, то эти результаты указывают на клетки ΜΟΡ-7, клетки, подобные ΜΌΆ-ΜΒ-231 как содержащие раковые стволовые клетки молочной железы, чувствительные к РС, рост которых ингибируется нейтрализующими антителами.

Основываясь на этой работе, заявители также протестировали действие предварительной обработки клеток ΜΟΡ-7 различными моноклональными антителами к ЬРС, в то время как клетки были выращены при обычных условиях культивирования, после чего антитело было удалено, и клеткам позволили продолжать расти в условиях низкой адгезии, которые выбирают для роста раковых стволовых клеток. Заявители неожиданно выявили, что клетки ΜΟΡ-7, предварительно обработанные моноклональным антителом к ЬРС, образовывали меньше сфероидов, по сравнению с контрольной группой, даже притом, что

- 9 025329 во время фазы исследования роста при низкой адгезии антитела не присутствовали. Этот результат интерпретируется таким образом, что, во-первых, клетки МСР-7 содержат раковые стволовые клетки молочной железы, которые ингибируются нейтрализующим антителом к №0, и что, во-вторых, ингибирующее действие на рост таких стволовых клеток не требует длительного присутствия антител.

На основании наблюдения, что определенные новообразования молочной железы содержат раковые стволовые клетки, чувствительные к Р0, и что раковые стволовые клетки, как полагают, являются ответственными за явление рецидивов рака, являются возможными способы предотвращения рецидивов рака молочной железы посредством лечения пациентов, нуждающихся в предотвращении рецидивов рака молочной железы, с помощью нейтрализующего антитела к №0 в количестве, эффективном для предотвращения рецидива рака молочной железы, где рак молочной железы является чувствительным к Р0. Неожиданные результаты заявителей также являются основой для способов предотвращения роста раковых стволовых клеток молочной железы, чувствительных к Р0, посредством обработки таких клеток количеством нейтрализующего антитела к №0, эффективным для ингибирования роста таких клеток.

7.7. Антитела.

Антитела, которые применяют в способах и наборах, раскрытых здесь, представляют собой антитела, которые специфично связывают человеческий прогастрин преимущественно с другими продуктам гена гастрина. Как показано на фиг. 13, ген гастрина транслируется в полипептид, который состоит из 101 аминокислот, названный пре-прогастрин, который содержит сигнальную последовательность (подчеркнутая), которая расщепляется, из которого образуется прогастрин, полипептид, который состоит из 80 аминокислот. Прогастрин, в свою очередь, расщепляется с образованием продукта, который состоит из 34 аминокислот, который соответствует в последовательности остаткам 38-71 прогастрина, который затем удлиняется на карбоксильном конце посредством глицинового остатка, образуя глицинудлиненный 034 (034-01у). Промежуточным продуктом указанного расщепления является пептид, который состоит из 6 аминокислот, который называют С-концевым фланкирующим пептидом или СТРР, который соответствует в последовательности остаткам 75-80 прогастрина. Затем 034-01у далее расщепляется с образованием полипептида, который состоит из 17 остатков, соответствующий в последовательности остаткам 55-71 прогастрина, и который называют 017-01у. Удаление С-концевых глицинов 03401у и 017-01у, затем следует С-концевое амидирование, дает 034 и 017 соответственно, оба из которых являются амидированными на С-конце.

Как используется здесь, антитело является высокоспецифичным по отношению к №0 или высокоспецифично связывает №0, если оно связывается с полноразмерным прогастрином, но совсем не связывает с СТРР, с амидированным гастрином, или с глицин-удлиненным гастрином, и является специфичным по отношению к №0 или специфично связывает №0, если оно демонстрирует по крайней мере приблизительно в 5 раз большее связывание №0, чем СТРР и других продуктов гена гастрина, как установлено в стандартном анализе связывания. Специальный анализ ЕЬ18А, который можно использовать для определения специфичность отдельного антитела к №0, представлен в примере 12.

Такие высокоспецифичные и/или специфичные антитела к №0 (которые упоминаются здесь как антитела к №0) могут быть поликлональными (антитела к №0 РАЪк) или моноклональными (антитела к №0 МАЪк), хотя для терапевтического применения и, в некоторых случаях, для диагностического или другого ίη νίΐΓΟ применения, моноклональные антитела являются предпочтительными.

Антигенная детерминанта, связанная антителами к №0, не важна. Полезные антитела к №0 могут связать Ν-концевую область №0, С-концевую область №0 или разные области №0. Недавно было обнаружено, что, по крайней мере, для моноклональных антител к №0 выбор антигена, который используется для индуцирования антител к №0, может быть важным (см. международную заявку № РСТ/ЕР2010/006329, поданную 15 октября 2010 г., и заявку И8 № 12/906041, поданную 15 октября 2010 г., описания и конкретные описанные антитела к №0 которых включены здесь посредством ссылки; которые далее называют как заявки № 329 и № 41 соответственно). Как раскрыто в заявках № 329 и № 041, не все антигены, №0-специфнчных, стимулируют производство моноклональных антител, которые специфично связывают №0 в физиологических условиях. Действительно, специфичных антигены, которые использовались для того, чтобы успешно индуцировать поликлональные антитела к №0, такие как полноразмерный рекомбинантный №0 (см., например, \У0 08/076454, заявитель 8ίη§Η). и пептид, соответствующий последним десяти аминокислотам на С-концевом конце №0 (см., \У0 07/135542, заявитель Но11апбе и др.), были не в состоянии вырабатывать моноклональные антитела. Как отмечено в заявках № 329 и № 041, антигенные Ν-концевые и С-концевые последовательности в пределах последовательности №0 были определены как такие, которые могут применяться для образования моноклональных антител, которые специфично связывают №0, которая представляет интерес, что антигенная последовательность не должна быть ограничена областями последовательности №0, что является уникальным в этом случае. Пептидные антигены, имеющие области последовательности наряду с другими продуктами гена гастрина, например 017, 034 и СТРР, дают моноклональные антитела, которые не только связывают №0, но и связывают специфически его.

Антитела к №0, которые можно получить, используя пептидный антиген, имеющий последовательность, соответствующую Ν-концевой области №0 и/или который связывает Ν-концевую область

- 10 025329 №0, которые упоминаются здесь как Ν-концевые антитела к РО. Специфическая образцовая антигенная область №0, которая может применяться для того, чтобы сконструировать иммуноген, подходящий для того, чтобы получить как поликлональные, так и моноклональные антитела, специфичные по отношению к №0, соответствует остатку 1-14 №0: 8\νΐ<ΡΡδΟΟΡΌΑΡΕ0 (8ЕЦ ΙΌ Νϋ: 25). Образцовые иммуногены, которые подходят для получения Ν-концевого антитела к №0, так же как и СОК последовательности и ν_Η и ν₂ последовательности Ν-концевых моноклональных антител к №0, полученные с помощью эти образцовых иммуногенов, представлены в табл. 1А и в разделе примеров.

ТАБЛИЦА1А

Ν-концевые моноклональные антитела к ЬРС

Иммуноген	Ги&ридома (Депозит#)	МАЬ	Мышиные СОК последовательности	Мышиные Ун и νΕ последовательности	Гуманизированные Ун иУс последоаател ьиостн (сконструированные)
N1	43В9С11	МАЫ
N1	\УЕ5Н2О7	МАЬ2
N2	6В5В11С10	МАЬЗ	νΗ СОК 1.3	ΟΥΙΡΤδΥΜ	<5Ε<3 ГОКе!)	,Γ,νΗ.3	(5Ε<5Ι0Ν0.12)	κν„.3	(ЗЕО ГО №21)
			νΗ СОК 2.3	ΡΥΡΟΝ5Ο5	{ЗЕО Ю Ν«:2)
			ун СОК 3.3	ΤΚΚΟ5Ρ0Υ	(ЗЕр ΙΟ №:3)
			Уь СОК 1.3	Ο&ΐνΗδΝΟΝΤΥ	(ЗЕО Ю №:4)	тУьЗ	(ЗЕ(?ГО.№:13)	ЬУьЗ	(5Е() ГО №22)
			Уь СОК 2.3	κν$	(5Ε010 №:5)
			Уь СОК 3,3	РфОЗНУРГТ	(ЗЕр 10 №:6)
N2	2<Ю2СЗО2	МАЬ4	νΗ СОК 1,4	ΟΥΤΡ555\ν	(5Ε<} Ι0№:7)	ηιν„.4	(5Е9Ю№:]4)	ΚνΗ,4	(ЗЕр ГО №23)
			νΗ СОК 2.4	РЬРСЗОЗТ	(3Ε<? ΙΟ №:8)
			УНСОК 3.4	АТОС-ΝΥΟΨΡΛΥ	(5Ε0 !0 №9}
			Уь СОК 1.4	ОЗЕУНЗЗОУТУ	(ЗЕЦ ГОЖ10)	тУь.4	(ЗЕ<310№:15)	КУС.4	(5Ер Ю №:24)
			Уь СОК 2.4	КУЗ	(ЗЕО ГО Χ»:5)
			Уь СОК 3.4	ЗрЗТНУРРТ	(ЗЕО Ю№:11)
N2	1Е9А4А4 (1-4376)	МАЫ 5
N2	1Е9О9В6	МАЫ 6	УИСОК 1.16	0ΥΤΡΤ5ΥΥ	(3Ε<5 ΙΟ №:39)	тУн, 16	(8Е0 Ю№;61)	ЬУн.16а	(ЗЕ<3 ГО №84)
			УНСОК 2.16	ΓΝΡ8ΝΟΟΤ	(3Εί3 ГО №;43)			НУн.16Ь	(ЗЕр ГО №:$6)
			νΗ СОК 3,16	ΤΚΟΟΥΥΡΡΟΥ	(5Ε(? ΙΟ №:47)			ЬУн.16с	(ЗЕр ГО №38)
			УЬСОК 1.16	ОБЬЬОЗОСКТУ	(ЗЕр Ю №50)	тУь-16	(ЗЕр ГО №65)	ЬУ|Л6а	(ЗЕр 10 Хн;В5)
			УЬСОК 2.16	ЕУЗ	($Ε$ 10 №:53)			ЬУь.16Ь	(ЗЕ<3 ГО №.87)
			УЬСОК 3.16	дусстнзрут	(5ΕΟΙΟ№:57)			НУ;.. 16с	(ЗЕО ГО №Я9)
N2	1С8ОЮР5	МАЫ7
N2	1А7СЗРП	МАЫ8
N2	1ВЗВ4Р11	МАЫ 9	νΗ СОК 1.19	ΟΥ3ΙΤ5ΟΥΑ	(8Ε<5 ЮЖ40)	тУн,19	(ЗЕО Ю №:62)	ЬУн.19а	(ЗЕО ГО№:90)
			Ун СОК 2.19	ίδρδογτ	(5ЕЦ ΙΟ №:44)			ЬУН.19Ь	(5Е<3 ГО №92)
			νΗ СОК 3,19	ΑΚΕνΝΥΟΟδΥΗΡΟΥ	(8Ε<310 Хз:48)			ЬУн.19с	(ЗЕр 1О№:94)
			Уьсок 1.19	89ΗΚΤΥΤ	(5ЕЦ1ОЖ51)	тУь. 19	(ЗЕр ГО №66)	ЬУь19а	(5Е(3 ГО№:91)
			Уъ СОК 2.19	УКК005Н	(3Ε<3 10 №54)			ЬУь.19Ь	(ЗЕр 10 №93)
			Уь СОК 3.19	ονοθΑΐκος>3νρν	(5ΕΡ Ю №:58)			ЬУь.19с	(ЗЕр 10 №:95)
N2	1С11Р5Е8	МАЬ20

Иммуноген N1 = ^УКРКЯСКЗРОАРТХТАЬх-СутВКА. также представленный как (ЯЕ<3 ГО №:25)-АЬх-Суз-В8А Иммуноген N2 = ЗА'КРК.ЙО1)РОЛРЬСг-Л11х-Су5-К.ЬН. также представленный как (8ЕЦ ГО №:25)-АЬх-Суз-КЬН

В табл. 1Α все аминокислотные последовательности представлены посредством использования традиционной ориентации Ν^-С. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид синтезировали с Сконцевым линкером одного остатка аминогексановой кислоты (АЬх), затем следовал цистеиновый (Сук) остаток, который затем конъюгировался либо с носителем бычьего сывороточного альбумина (БСА), либо гемоцианина лимфы улитки (ГЛУ) посредством линкерного Сук остатка.

Антитела к №0, которые возможно получить посредством использования пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую С-концевой области №0, и/или который связывает Сконцевую область №0, упомянуты здесь как С-концевые антитела к №0. Специфическая образцовая антигенная область, которая может применяться для того, чтобы сконструировать иммуноген, подходящий для получения как поликлональных, так и моноклональных С-концевых антитела к №0, соответствует остаткам 55-80 №0: 00РА1ЕЕЕЕЕА¥0АМ010НН8АЕПЕ\ (8ЕЦ ΙΌ N0: 27). Образцовые иммуногены, включающие этот антиген, которые подходят для получения С-концевых антител к №0, так же как и СОК последовательности и ν_Η и ν₂ последовательности С-концевых моноклональных антител к №0, полученных посредством этих образцовых иммуногенов, представлены в табл. 1Β и в разделе примеров.

- 11 025329

В табл. 1В все аминокислотные последовательности представлены посредством использования традиционной ориентации N^0. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид синтезировали с Νконцевым линкером Айх-АЬх-Сук, который затем конъюгировался либо с носителем гемоцианина лимфы улитки (ГЛУ), либо с дифтерийным токсином (ДТ) посредством линкерного Сук остатка.

Специфичные антигенные детерминанты, связанные образцовыми моноклональными антителами к №0 МАЫ-МАЬ23, представленные в табл. 1А и 1В, были картированы посредством применения метода 8Ρ0Τ и сканирования аланином, как раскрыто в Ьаипе и др., 2002, 1. 1ттипо1. МеШойк 267:53-70 и Ьаипе, 1997, 1. ΒίοΙ. Сйет. 272:30937-30944 соответственно (см. также пример 6 из заявки № 329).

В соответствии с методом 8Ρ0Τ 15 аминокислотных пептидных последовательностей, включающих предполагаемую антигенную детерминанту, получают и точечно наносят на нитроцеллюлозную мембрану, которые затем исследуют с помощью тестируемого антитела, для того чтобы определить минимальную последовательность антигенной детерминанты, которая распознается антителом. Сканирование аланином используется для того, чтобы определить остатки в пределах антигенной детерминанты, которые важны для связывания антитела. Каждый остаток в пределах предполагаемой антигенной детерминанты мутирует, друг за другом, в аланин, и содержащие аланин пептиды затем исследуют с помощью тестируемого антитела.

В случае Ν-концевых моноклональных антител к йРО МАЬк1-4 и 15-20, антигенные детерминанты содержат, по крайней мере, следующие последовательности: ИАРЬО (8Еф ГО N0: 28), РИАРЬО (8Еф ГО N0: 29), РР8С)С)Р1) (81Т) ГО N0: 30), \\'КРР8(Х)Р1) (81Т) ГО N0: 31) или \\'КРР8(Х)Р1)ЛРР0 (8ЕО ГО N0: 32), как показано в табл. 2А.

- 12 025329

ТАБЛИЦА2А
МАЙ#	РС пептидный антиген: 5НКРК50<2РОАРЬС	8Ε0 Π> №
МАЬ2	НКРКЗООРОАРЬС	32
МАЬ4	МКРКЗООРОАРЬС	32
МАЫ	РРАРЪС	29
МАЬЗ	ЭАРЬС	28
МАЫ 7	ΜΚΡΚΞΟΰΡϋ	31
МАЫ 8	ИКРКЗООРР	31
МАЫ 9	мкркзооро	31
МАЬ20	ΜΚΡΚ300Ρϋ	31
МАЫ 5	ΡΚ3βΟΡϋ	30
МАЫ 6	ΡΚΞΟΟΡϋ	30

В случае С-концевых моноклональных антител к №0 МАЬ§5-7, 9-12, 14 и 21-23 антигенные детерминанты содержат, по крайней мере, следующие последовательности: Р0КК (8ЕЦ ГО N0: 33), ΜΌΡ0Κ (81%) ГО N0: 34), ΛΕΌΕΝ (81%) ГО N0: 35) и 0ΑΜΌΡ0ΚΚ (81%) ГО N0: 36), как показано в табл. 2В.

ТАБЛИЦА 2Β
МАМ	РС пептидный антиген: СОРИЪЕЕЁЕЕАТСИМИРСЕКЗАЕОЁИ	8Е<) ГО №
МАЫ 4	симогскк	36
МАЫ1	ΜΩΓΟΕ	34
МАЬ5	ГСЕК	33
МАЬб	ГСЕЕ	33
МАЬ7	гске	33
МАЬ9	ЕСКК	33
МАЫО	РСЕЕ.. Е	33
МАЫ2	Г6ЕЕ	33
МАЬ23	ΑΕΟΕΝ	35

Исследования картирования антигенных детерминант выявили, что антитела к №0 МАЬ2 и МАЬ4 связывают ту же антигенную детерминанту; антитела к №0 МАЬ1 и МАЬ3 связывают приблизительно ту же антигенную детерминанту; антитела МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 и МАЬ20 связывают приблизительно ту же антигенную детерминанту; антитела МАЬ15 и МАЬ16 связывают приблизительно ту же антигенную детерминанту; антитела к НРС МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ9 и МАЬ12 связывают ту же антигенную детерминанту и связывают приблизительно ту же антигенную детерминанту, что и антитело к №0 МАЬ10; и антитела к №0 МАЬ11 и МАЬ14 связывают приблизительно ту же антигенную детерминанту.

Конкретные варианты осуществления ^концевых антител к Р0, которые применяют в способах и наборах, описанных здесь, включают антитела, которые связывают антигенную детерминанту, которая включает остатки 10-14 №0 (8ЕЦ ГО N0: 28), остатки 9-14 №0 (8ЕЦ ГО N0: 29), остатки 4-10 №0 (8ЕЦ ГО N0: 30), остатки 2-10 №0 (81%) ГО N0: 31) или остатки 2-14 №0 (81%) ГО N0: 32).

Конкретные варианты осуществления С-концевых антител к Р0, которые применяют в способах и наборах, раскрытых здесь, включают антитела, которые связывают антигенную детерминанту, которая включает остатки 71-74 №0 (8ЕЦ ГО N0: 33), остатки 69-73 №0 (8ЕЦ ГО N0: 34), остатки 76-80 №0 (81%) ГО N0: 35) или остатки 67-74 №0 (81%) ГО N0: 36).

^концевые и С-концевые антитела к №0, которые применяют в способах и наборах, раскрытых здесь, в дополнение к предоставленным в табл. 1А и 1В, могут быть идентифицированы в анализе конкурентного связывания с образцовым МАЬк 1-23, или с другими эталонными антителами, которые связывают N или С-концевые антигенные детерминанты, как будет описано более подробно в изложенном далее разделе.

Как также сообщается в заявках № 329 и № 041, не все антитела к №0, даже те которые показывают высокую степень специфичности и близости к №0, нейтрализуют биологическую активность №0. Например, хотя и антитело к №0 МАЬ14 связывает №0 с К_с, которое составляет приблизительно 6 пМ, это не происходит, по крайней мере, при исследованной концентрации, которая ингибирует рост определенных клеток колоректального рака в исследовании ίη νίίτο, в то время как другие моноклональные антитела к №0, например МАЬ1-МАЬ13 и МАЬ15-МАЬ23, показали ингибирующую активность при различны концентрациях. В то время как и ненейтрализующие и нейтрализующие антитела, которые специфично связывают №0, являются полезными для диагностических способов настоящего раскрытия, антитела к №0, которые являются полезными для применения в терапевтических способах, должны демонстрировать нейтрализующую активность. Как раскрыто в примерах, МАЬ3 и МАЬ8 продемонстрировали нейтрализующую активность, когда были исследованы на способность к ингибированию роста МОА-МВ-231 и клеток рака молочной железы МСР7 в культуре. Являются ли нейтрализующими другие антитела настоящего раскрытия, может быть определено опытным путем.

Как используется здесь, нейтрализующее антитело к №0 представляет собой антитело к №0, ко- 13 025329 торое приводит к статистически значительному уменьшению количества живых клеток рака молочной железы в испытательном образце, обработанном антителом к НРС, по сравнению с контрольным образцом, обработанным неспецифичным антителом. Специфическое исследование для установления способности любого отдельного антитела к НРС быть нейтрализующим раскрыто в примере 13. В этом исследовании, те антитела к НРС, которые показывают по крайней мере приблизительно 50%-е уменьшение количества живых клеток рака молочной железы, как полагают, являются особенно полезными для лечения рака молочной железы, хотя антитела к НРС, показывающие более низкие уровни нейтрализующей активности, например, статистически значительное уменьшение количество живых клеток рака молочной железы, которое составляет 40, 30, 20, 15 или даже 10%, в этом исследовании, как ожидают, обеспечивают терапевтические преимущества. Образцовые клетки для применения в этом исследовании включают, но не ограничиваются ими, клеточные линии рака молочной железы, чувствительного к РС, описанные здесь.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, например в терапевтических вариантах осуществления изобретения, полезные антитела к НРС являются нейтрализующими. Как раскрыто здесь и в заявках № 329 и № 041, способность моноклонального антитела к НРС быть нейтрализующим не зависит от антигенной детерминанты, поскольку как Ν-концевые (например, ΜΑΗ3), так и Сконцевые (например, ΜΑΗ8) моноклональные антитела к НРС показывают нейтрализующую активность в исследованиях с клетками рака молочной железы. Таким образом, в некоторых определенных вариантах осуществления изобретения нейтрализующие антитела к НРС являются Ν-концевыми нейтрализующими антителами к НРС. В других вариантах осуществления изобретения нейтрализующие антитела к НРС являются С-концевыми нейтрализующими антителами к НРС.

Аффинность любого специфического антитела к НРС не важна. Однако для некоторых случаев применения антитела, показывающие аффинность, которая составляет по крайней мере приблизительно 1 мкМ, может быть предпочтительной. Для терапевтического применения может быть желательной аффинность, которая составляет по крайней мере приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,1, 0,01, 0,001 нМ или еще больше. Установленная аффинность моноклональных антител к НРС, определенная в табл. 1А и 1В, варьируется в пределах от 10^-6 до 10^-12 М, как отмечено в табл. 3.

ТАБЛИЦА 3

Моноклональное антитело	Установленная Константа афинности КИ(М)
Антитело к МАЬ 1	2,5 мкМ (2,5 х10'6М)
Антитело к МАЬ 2	185 нМ (1,85 х10'7М)
Антитело к МАЬ 3	6,4 нМ (6,4х10'*М)
Антитело к МАЬ 4	3,5 нМ (3,5x10^)
Антитело к МАЬ 5	13 пМ (1,30 х10'1'М)
Антитело к МАЬ 6	0,6 нМ (6,38 х10 |иМ)
Антитело к МАЬ 7	58 пМ (5,84х10’!1М)
Антитело к МАЬ 8	0,1 нМ (1,08 х10 шМ)
Антитело к МАЬ 10	3,6 нМ (3,62 хЮАМ)
Антитело к МАЬ 11	0,3 нМ(ЗЛ2х10’шМ)
Антитело к МАЬ 12	0,4 нМ (4,43 хЮ’1иМ)
Антитело к МАЬ 13	0,6 нМ (6,12 х10‘|иМ)
Антитело к МАЬ 14	6,8 пМ (6,86 х10'|2М)
Антитело к МАЬ 15	0,2 нМ (2,11 х10'|иМ)
Антитело к МАЬ 16	0,2 нМ (2,78 х10'|иМ)
Антитело к МАЬ 17	8,3 нМ (8,29 хЮ^М)
Антитело к МАЬ 18	1,2 нМ (1,24х10*М)
Антитело к МАЬ 19	0,7 нМ (7,79 χ10'ιυΜ)
Антитело к МАЬ 20	0,2 нМ (2,47 х10’'М|
Антитело к МАЬ 21	3,9 нМ (3,90 х10’’М)’
Антитело к МАЬ 22	5 нМ (4,94 х10'чМ)
Антитело к МАЬ 23	0,4 мкМ (3,99 х10‘7М)

Моноклональное антитело к РС, имеющее аффинность, особенно подходящую для конкретного желательного применения, легко может быть выбрано из указанных, или произведено или сконструировано посредством использования различных иммуногенов, последовательностей определяющей комплементарность участки (СОК), последовательностей вариабельной тяжелой (У_Н) и вариабельной легкой (УЪ) цепей антител к НРС, описанных здесь. Аффинность любого специфического моноклонального антитела к РС может быть определена посредством применения методов, известных в данной области, или описанных здесь, таких как, например, ΕΟδΑ, изотермическая титрационная калориметрия (ИТК), ΒΙΑοογο. или поляризационный флуоресцентный анализ. Специальный анализ приведен в примере 14.

Как отмечено в табл. 1А и 1В, многие из Ν-концевых и С-концевых моноклональных антител, специфичных по отношению к НРС, были идентифицированы и, как раскрыто в заявках № 329 и № 041, все

- 14 025329 антитела, за исключением МАЫ4, показывают нейтрализующую активность против определенных клеток колоректального рака. Дополнительно, как раскрыто в примерах, антитела МАЬ3, МАЬ8, МАЫ3, МАЫ6 и МАЬ19 показывают нейтрализующую активность против клеток рака молочной железы МОАМВ-231 и МАЬ 3 показывает нейтрализующую активность против клеток рака молочной железы МСР7.

Несколько гибридом, полезных для получения антител, были депонированы 6 октября 2010 года в Национальной коллекции культур микроорганизмов (СЫСМ) в соответствии с Будапештским соглашением. Присвоенные названия гибридом, вырабатывающих антитела к №0 МАЬ§1-23, и регистрационные номера депозитария указанных депонированных гибридом представлены в табл. 1А и 1В. Кроме того, для нескольких антител были определены аминокислотные последовательности их вариабельных тяжелых цепей (Ун), вариабельных легких цепей (УЬ), Уь определяющих комплементарность участков (СОКучастков) и У_н СОК-участков. Эти аминокислотные последовательности, и условное номенклатурное обозначение, которое используется для ссылок на них в описании, также представлены в табл. 1А и 1В. Если кратко, то мышиные вариабельные домены тяжелых и легких цепей упоминаются здесь как тУ_н и тУ_ъ, затем следует номер соответствующего моноклонального антитела, например тУ_н.3 и тУ_ъ.3 для вариабельных легких и вариабельных тяжелых цепей антител к №0 МАЬ3 соответственно. Точно так же человеческие вариабельные домены тяжелых и легких цепей упоминаются здесь как ЬУ_н и ЬУ_Ъ, затем следует номер соответствующего моноклонального антитела. Три вариабельные СОК-участки тяжелых цепей и три вариабельные СОК-участки легких цепей упоминаются как У_н СОК 1, 2 или 3 и У_ъ СОК 1, 2 или 3 соответственно, затем следует номер специфического моноклонального антитела к №0. Например, У_н СОК1 МАЬ3 обозначают как У_н СОК 1.3 и У_ъ СЭК1 МАЬ3 обозначают как У_ъ СОК 1.3. У_н СОК2 МАЬ3 обозначают как У_н СЭК 2.3 и У_ь С0К2 МАЬ3 обозначают как У_ь СОК 2.3.

Ожидается, что соответствующими СОК-участки и/или У_н и У_ъ цепи моноклональных антител к №0, которые связывают приблизительно те же антигенные детерминанты, могут быть взаимозаменяемыми для получения новых моноклональных антител к №0, которые являются полезным в способах и наборах, раскрытых здесь. Например, как отмечено выше, образцовые моноклональные антитела к №0 МАЬ5 и МАЬ6 связывают ту же антигенную детерминанту. Может быть сконструировано моноклональное антитело к №0, которое включает в своей У_ъ цепи различные комбинации У_ъ СОК-участков указанных двух антител, и/или в своей У_н цепи различные комбинации У_н СОК-участков указанных двух антител. В качестве конкретного неограничивающего примера, иллюстрирующего различные возможные комбинации, такое антитело может включать в своей У_ъ цепи СОК-участки 1 и 2 МАЬ5 (У_ъ СОК 1.5 и У_ъ СОК 2.5 соответственно) и СОК 3 МАЬ6 (У_ъ СОК 3.6) и в своей У_н цепи - СОК 1 МАЬ6 (У_н СОК 1.6) и СОК-участки 2 и 3 МАЬ5 (У_н СОК 2.5 и У_н СОК 3.5 соответственно). Аминокислотные последовательности СОК-участков антител, произведенных гибридомами, которые были депонированы, могут быть получены посредством применения традиционных средств.

Аминокислотные последовательности СОК-участков антител, произведенных гибридомами, которые были депонированы, могут быть получены посредством применения традиционных средств. Например, соответствующие последовательности антител, произведенных гибридомами 6В5В11С10 и 2002С302, были определены следующим образом. Если кратко, то полная РНК была выделена из замороженных дебрисов посредством применения реактива КУАВсс. № С8-104В в соответствии с каталогом АМ8Вю, который использовали в соответствии с инструкциям изготовителя. кДНК для У-областей был приготовлен из мРНК, посредством применения полимеразной ценной реакции с обратной транскриптазой (КТ-ПЦР), затем следовала 5' быстрая амплификация концов кДНК (КАСЕ), синтез кДНК был выполнен посредством применения праймеров, специфических для константных областей, после чего первый цепочечный продукт был очищен, и использовали концевую дезоксинуклеотидтрансферазу, для того чтобы добавить комплементарные гомополимерные хвосты к 3' концам кДНК. Концевые последовательности кДНК затем были амплифицированы посредством ПЦР с использованием пары праймеров, один из праймеров для комплементарного гомополимерного хвоста и либо для области У_н либо Уь соответственно. Вариабельная область тяжелой и легкой цепи продуктов ПЦР была затем клонирована в клонирующий вектор ТА, (р-0ЕМ-Т еаку, Рготеда са1. № А 1360) и секвенирована, используя стандартные процедуры. См. фиг. 14А-В (МАЬ 3), фиг. 14С-0 (МАЬ 4).

Подобным образом, соответствующие последовательности антител, произведенных гибридомами 1С10О3В9, 2С6С3С7, 1В3В4Р1 и 1Е9О9В61, были определены следующим образом. Полная РНК была выделена из замороженных дебрисов посредством применения набора ККАдиеои5®-4РСК (АтЬюи са1. № АМ1914), который использовали в соответствии с инструкциям изготовителя. У-область тяжелой цепи мРНК была амплифицирована посредством применения набора из шести выродившихся пулов праймеров (НА - нр), и У-область легкой цепи мРНК была амплифицирована посредством применения набора из восьми выродившихся пулов праймеров, семь для κ кластера (КА - К0) и один для λ кластера (ЬА). кДНК для вариабельных областей был приготовлена из мРНК посредством применения КТ-ПЦР. Синтез кДНК был выполнен посредством применения праймеров, специфических для константных областей, затем следовал ПЦР, используя пулы выродившихся праймеров для 5' мышиных сигнальных последовательностей и праймеров к 3' константным областям для каждого из 1д0Ун, 1§кУЪ и Ι^λΥΕ (1оие5 и др.,

- 15 025329

1991, КарМ РСК с1отп§ оГГи11-1епд1Н тоике 1ттипод1оЬи1ш уапаЫе гедюпк, Вю/ТесЬпо1оду 9:88-89). Вариабельная область тяжелой и легкой цепи продуктов ПЦР была затем клонирована в ТА, клонирующий вектор (р-ОЕМ-Т еаку, Рготеда са1. № 1360) и секвенирована, используя стандартные процедуры. См. фиг. 14Е-Р (МАЬ8), 14О-н (МАЬ13). 141-1 (МАЬ 16) и 14К-Ь (МАЬ19).

Что касается табл. 1А, то конкретные варианты осуществления ^концевых антител к ЬРО, которые применяют в способах и наборах, описанных здесь, включают, но не ограничиваются ими, следующие:

(a) антитела, имеющие У_ъ СОК-участки, которые соответствуют в последовательности У_ъ СОКучасткам МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20, и У_н С1Жучастки, которые соответствуют в последовательности У_н СОК-участкам МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20;

(b) антитела, имеющие Уь СОК-участки и У_н СОК-участки, которые соответствуют в последовательности Уь и У_н СОК-участкам МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20;

(c) антитела, в которых:

(ί) Уь СОК1 выбирают из ^БIVΗБNΟNΤΥ (У_ъ СОК 1.3; БЕС ГО N0: 4), СБЬУЫББОУТУ (У_ъ СОК 1.4; БЕС ГО N0: 10), СБРРОБООКУУ (У_ъ СОК 1.16; БЕС ГО N0: 50) и БСЫКТУТ (У_ъ СОК 1.19; БЕС ГО N0: 51);

(ίί) Уь СОК2 выбирают из КУБ (У_ъ СОК 2.3 и У_ъ СОК 2.4; БЕС ГО N0: 5), ЬУБ (У_ъ СОК 2.16; БЕС ГО N0: 53) и УККООБн (У_ъ СОК 2.19; БЕС ГО N0: 54);

(ίίί) Уь СОК3 выбирают из РСОБнУРРТ (У_ъ СОК 3.3; БЕС ГО N0: 6), БСБТнУРРТ (У_ъ СОК 3.4; БЕС ГО N0: 11), УСО,ТИБРУТ (У_ъ СОК 3.16; БЕС ГО N0: 57) и ОУООА1КОСБУРУ (У_ъ СОК 3.19; БЕС ГО N0: 58);

(ίν) Ун СОК1 выбирают из О,УР^;ТБУУ(\У СОК 1.3; БЕС ГО N0: 1), О,УТРБББУ (Ун СОК 1.4; БЕС ГО N0: 7), ОУТРТБУУ (У_н СОК 1.16; БЕС ГО N0: 39) и ОУБГТБОУА (У_н СОК 1.19; БЕС ГО N0: 40);

(ν) У_н С0К2 выбирают из РУРОАБОБ (У_н СОК 2.3; БЕС ГО N0: 2), РЬРОБОБТ (У_н СОК 2.4; БЕС ГО N0: 8), П\1РБ^ОТ (У_н СОК 2.16; БЕС ГО N0: 43) и 1БРБОУТ (У_н СОК 2.19; БЕС ГО N0: 44);

(νί) У_н СОК3 выбирают из ТЫГОБРСУ (У_н СОК 3.3; БЕС ГО N0: 3), АΤ^ΟNΥ^VРАΥ (У_н СОК 3.4; БЕС ГО N0: 9), ТКООУУРРОУ (У_н СОК 3.16; БЕС ГО N0: 47) и АКЕ^УООБУЯРОУ (У_н СОК 3.19; БЕС ГО N0: 48);

(й) антитела, имеющие Уь, которая соответствует в последовательности У_ъ МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20, и У_н, которая соответствует в последовательности У_н МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20;

(е) антитела, имеющие Уь и У_н, которые соответствует в последовательности У_ъ и У_н МАЬ1, МАЬ2, МАЬ3, МАЬ4, МАЬ15, МАЬ16, МАЬ17, МАЬ18, МАЬ19 или МАЬ20.

Что касается табл. 1В, то конкретные варианты осуществления С-концевых антител к ЬРО, которые являются полезными в способах и наборах, описанных здесь, включают, но не ограничиваются ими, следующие:

(a) антитела, имеющие СОК-участки У_ъ, которые соответствуют в последовательности СОКучасткам У_ъ МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23 и СОК-участкам У_н, которые соответствуют в последовательности СОК-участкам У_н МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАВ8, МАВ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23;

(b) антитела, имеющие СОК-участки У_ъ и СОК-участки У_н, которые соответствуют в последовательности Уь и У_н СОК-участкам МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23;

(c) антитела, в которых:

(ί) Уь СОК1 выбирают из КБЬКЫТКО1ТР (У_ъ СОК 1.8; БЕС ГО N0: 49) и СБРРОБООКУУ (У_ъ СОК 1.13; БЕС ГО N0: 50);

(ίί) Уь С0К2 выбирают из СМБ (У_ъ СОК 2.8; БЕС ГО N0: 52) и ЬУБ (У_ъ СОК 2.13; БЕС ГО N0:

53);

(ίίί) Уь СОК3 выбирают из ЛСМ.РРРРТ (У_ъ СОК 3.8; БЕС ГО N0: 55) и УСО,Т1 РР’СТ (У_ъ СОК 3.13; БЕС ГО N0: 56);

(ίν) У_н СОК1 выбирают из ОРТРТТУА (У_н СОК 1.8; БЕС ГО N0: 37) и ОР1РББУО (У_н СОК 1.13; БЕС ГО N0: 38);

(ν) У_н С0К2 выбирают из 1ББООТУТ (У_н СОК 2.8; БЕС ГО N0: 41) и ЮТРООКТ (У_н СОК 2.13; БЕС ГО N0: 42);

(νί) У_н СОК3 выбирают из АΤ^ΟNΥБ^^Р (У_н СОК 3.8; БЕС ГО N0: 45) и АКОТОТУ (У_н СОК 3.13; БЕС ГО N0: 46);

(й) антитела, имеющие У_ъ, которая соответствует в последовательности У_ъ МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22ог МАЬ23 и У_н, которая соответ- 16 025329 ствует в последовательности ν_Η МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23;

(е) антитела, имеющие ν₂ и ν_Η, которые соответствуют в последовательности ν₂ и ν_Η, которые соответствуют в последовательности ν,, и ν_Η МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ9, МАЬ10, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ14, МАЬ21, МАЬ22 или МАЬ23.

Как будет оценено специалистами в данной области, антитела к ЬРО, полезные в диагностических способах, могут иметь любое происхождение, включая, например, млекопитающих (например, человек, примат, грызун, коза или кролик), не млекопитающих, или быть химерными по своей природе (полученные из больше чем одного видов происхождения). Антитела, подходящие для терапевтического применения у животных, включая людей, предпочтительно получают из тех же видов, которые предполагают подвергать лечению, или они были модифицированы или сконструированы таким образом, что являются неиммуногенными, или иммуногенность в животном, которое подвергают лечению, была понижена. Специфическим классом антител к ЬРО, полезных для терапевтического применения у людей, является класс гуманизированных антител, которые обсуждаются более подробно ниже. Антитела к ЬРО, которые применяют в способах и наборах, описанных здесь, могут также быть, или их получают из любого изотипа, включая, например, 1дА (например, 1дА1 или 1дА2), 1дИ, 1дЕ, 1дО (например, 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4) или 1дМ. Антитела к ЬРО, сконструированные для терапевтического применения, предпочтительно являются 1дО изотипом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к ЬРО, полезные для терапевтических способов, описанных здесь, являются гуманизированными. Как правило, гуманизированные антитела содержат в основном все, по крайней мере один, и обычно два вариабельных домена, в которых все или в основном все участки СИР соответствуют таковым из нечеловеческого иммуноглобулина и все или в основном все каркасные участки являются таковыми из консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина, и могут упоминаться как СИР-привитые. Гуманизированное антитело также может содержать по крайней мере часть константной области (Рс) иммуноглобулина, обычно константной области из консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Методы гуманизирования антитела, включая методы конструирования гуманизированных антител, известны в данной области. См., например, ЬеГгапс и др., 2003, Иеу. Сотр. 1ттипо1. 27:55-77; ЬеГгапс и др., 2009, №с1. АсМк Рек. 37:И1006-1012; ЬеГгапс. 2008, Мо1. Вю1есЬпо1. 40: 101-111; ШесЬтапп и др., 1988, №Лиге 332:323-7; патенты США № 5530101, 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, Оиееп и др.; ЕР239400; РСТ публикация \0 91/09967; патент США № 5225539; ЕР592106; ЕР519596; Рай1ап, 1991, Мо1. 1ттипо1. 28:489-498; 8!ийтска и др., 1994, Рго!. Епд. 7:805-814; Родикка и др., 1994, Ргос. №ц1. Асай. 8ск 91:969-973; и патент США № 5565332, описания которых включены настоящим документом посредством ссылки в их полноте.

Гуманизированные версии антител, имеющих последовательности СИР, соответствующие СИРучасткам нечеловеческих антител к ЬРО, включающие в качестве примера и, не являясь ограничением, различные Хконцевые моноклональные антитела к ЬРО, представленные в табл. 1А, и различные Сконцевые моноклональные антитела к ЬРО, представленные в табл. 1В, могут быть получены посредством применения указанных известные методов. Предполагаемые последовательности для гуманизированных У_ь, и ν_Η цепей выбранных антител к ЬРО представлены в табл. 1А и 1В. Конкретные примеры гуманизированных антител включают антитела, содержащие:

(a) любые три ν₂ СИР-участков и любые три ν_Η СИР-участков, раскрытых здесь;

(b) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, соответствующую 8Еф 1И N0: 21, и вариабельную области легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, соответствующую 8Еф 1И N0: 22;

(c) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, соответствующую 8Еф 1И N0: 23, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, соответствующую 8Еф 1И N0: 24;

(й) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф 1И N0: 75, 77 и 79, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф 1И N0: 76 и 78;

(е) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф 1И N0: 80 и 82, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф 1И N0: 81 и 83;

(ί) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф 1И N0: 84, 86 и 88, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф 1И N0: 85, 87 и 89;

(д) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф 1И N0: 90, 92 и 94, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф 1И N0: 91, 93 и 95.

- 17 025329

Как будет отмечено специалистами в данной области, антитела к №0, имеющие специфические связывающие характеристики, такие как способность связать специфическую антигенную детерминанту, которая представляет интерес, могут быть легко получены посредством применения различных антигенов и иммуногенов, описанных здесь, и посредством оценки их способности конкурентно связывать №0 эталонным антителом, которое представляет интерес. Любое из антител к №0, описанных здесь, может быть использовано в качестве эталонного антитела в таком анализе конкурентного связывания. Специфическое исследование, подходящее для оценки способности антитела конкурентно связывать №0 биотинилированным эталонным антителом к №0, которое представляет интерес, представлено в примере 15.

В проведении анализа конкурентного связывания антитела между эталонным антителом к №0 и любым тестируемым антителом (независимо от видов или изотипа) можно сначала сделать метку эталона при помощи метки, которую можно обнаружить либо непосредственно, такой как, например, радиоизотоп или флуорофор, либо косвенно, такой как, например, биотин (который можно обнаружить через связывание с флуоресцентно меченным стрептавидином) или фермент (который можно обнаружить через ферментативную реакцию), что дает возможность последующей идентификации. В этом случае, меченое эталонное антитело к №0 (в фиксированных или повышающихся концентрациях) инкубируют с известным количеством №0, образуя №0 меченый комплекс антител к №0. Немеченое тестируемое антитело затем добавляют к комплексу. Измеряют интенсивность метки комплекса. Если тестируемое антитело конкурирует с меченым эталонным антителом к №0 для №0, посредством связывания перекрывающейся антигенной детерминанты, то интенсивность метки комплекса будет уменьшаться, в сравнении с контрольным исследованием, выполненным в отсутствие тестируемого антитела.

Известно много способов выполнения анализа конкурентного связывания, и они могут быть адаптированы, для того чтобы получить результаты, сравнимые с анализом, описанным выше и в примере 15.

Антитело, как полагают, конкурирует за связывание №0 с эталонным антителом к №0, и таким образом, как полагают, связывает приблизительно ту же или перекрывающуюся антигенную детерминанту №0, что и эталонное антитело в №0, если это понижает связывание эталонного антитела к №0 с №0 в анализе конкурентного связывания и, в частности в анализе конкурентного связывания примера 15, по крайней мере на 50%, при концентрации тестируемого антитела в диапазоне 0,01-100 мкг/мл (например, 0,01, 0,08, 0,4, 2, 10, 50 или 100 мкг/мл или при другой концентрации в пределах установленного диапазона), даже если более высокие уровни понижения, например, на 60, 70, 80, 90 или даже 100%, могут быть желательными.

Антитела настоящего раскрытия могут также быть полученными, ковалентно модифицированными или конъюгированными с другими молекулами, для того чтобы изменить их свойства или улучшить их функцию. Например, но, не в качестве ограничения, полученные антитела включают антитела, которые были модифицированы, например, посредством гликозилирования, фукозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, формилирования, дериватизации при помощи известных защитных групп/блокирующих групп, сцеплением с клеточным лигандом или с другим белком и т.д. В качестве альтернативы, определенные аминокислоты в вариабельных или константных областях могут быть модифицированы, для того чтобы изменить или улучшить функцию. В одном неограничивающем примере аминокислотные остатки в области Рс антитела могут быть изменены, для того чтобы повысить время полужизни антитела в сыворотке крови, посредством повышения его связывания с РсКи.

Моноклональные антитела к №0 включают антитела, меченные с помощью фрагмента, который можно обнаружить. Такая метка может непосредственно или косвенно конъюгировать с моноклональным антителом к №0 этого раскрытия. Метка может быть обнаруживаемой как таковая (например, радиоизотопные метки, изотопные метки, или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, они могут катализировать химическое изменение соединения субстрата или композиции, который является обнаруживаемым. Примеры обнаруживаемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, позитрон-испускающие, которые используют в различных позитронно-эмиссионных томографиях, и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов.

Хотя различные антитела к №0, которые применяют в способах и наборах, описанных здесь, проиллюстрированы в качестве антител полной длины, специалисты в данной области могут понять, что связывающие фрагменты, или суррогатные антитела, сконструированные или полученные из полноразмерных антител или связывающих фрагментов, также могут применяться. Подходящие фрагменты, суррогаты и т.д. включают, но не ограничиваются ими, фрагменты РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬ, Ρν, νΙ§0, 8сРу и сурротела, τΙ§0, дисульфидстабилизированные Ρν антитела (άδΡν), диатела, триотела и антитела с одним доменом, такие как камелизированное антитело или нанотело.

Антитела настоящего раскрытия могут быть произведены в соответствии с любым способом, который является известным специалисту в данной области. В одном неограничивающем примере антитела могут быть получены из природных источников, в том числе из любых видов, способных к производству антител, такие как антитела, полученные от людей, человекообразных обезьян, кур, коз, кроликов и грызунов (например, крысы, мыши и хомяки). Другие виды также возможны. Антитела могут также быть

- 18 025329 произведены и выделены из систем, которые используют генную инженерию или методы рекомбинантных ДНК, такие как, но не ограничиваясь только ими, экспрессия рекомбинантных антител в клетках дрожжей, бактериальных клетках и клетках млекопитающих в культуре, таких как клетки СНО. Антитела могут также быть полностью или частично синтетическими.

Моноклональные антитела (МАЬ) настоящего раскрытия не ограничиваются только антителами, произведенными посредством гибридомного метода. Моноклональное антитело получают из единственного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, каким-либо образом доступного или известного в данной области. Моноклональные антитела могут быть приготовлены посредством применения широкого разнообразия способов, известных в данной области, включая применение гибридомы, рекомбинантный метод и метод фагового дисплея или их комбинаций.

7.8. Лечение рака молочной железы.

Лечение рака молочной железы подпадает в несколько категорий.

Хирургия рассматривается, когда рак молочной железы ограничен молочной железой или молочной железой и подмышечными лимфатическими узлами. Хирургические способы, эффективные для лечения рака молочной железы, включают, но не обязательно ограничиваются ими, лампэктомию, увадрантэктомию, простую мастэктомию, радикальную мастэктомию и модифицированную радикальную мастэктомию.

Радиационная терапия может применяться для того, чтобы уничтожить клетки рака молочной железы, остающиеся после хирургии. Радиационное облучение может осуществляться машиной вне тела (наружная дистанционная радиационная терапия) или оно может осуществляться посредством радиоактивного материала, помещенного внутрь тела возле раковых клеток (внутренняя облучение, или брахитерапия).

Химиотерапия, гормональная терапия и таргетная терапия представляют собой неограничивающие примеры системных способов лечения, которые могут применяться как вспомогательные способы лечения после хирургии, или после хирургии и радиационной терапии, или как основные способы лечения против метастатического рака молочной железы, который распространился помимо молочной железы в отдаленные органы. Такие способы лечения могут применяться отдельно или в комбинации друг с другом. Вспомогательная терапия при этом является терапией, которую применяют для того, чтобы уничтожить раковые клетки, которые, возможно, остались живыми после радиационной терапии или хирургии.

Радиационная терапия и/или хирургия могут также применяться для лечения метастатического рака молочной железы, например для лечения небольшого количества метастаз в отдельной области, для предотвращения переломов костей или нарушение работы печени или для обеспечения облегчения боли или других симптомов. Метастазы рака молочной железы, которые распространились на кости, можно лечить с помощью наружной дистанционной радиационной терапии и/или с помощью бисфосфонатов, таких как памидронат (Аредиа) или золедроновая кислота (Зомета), вместе с кальцием и витамином Ό, для укрепления костей.

Химиотерапия основывается на наркотиках, которые применяют для того, чтобы уничтожить, или замедлить, или остановить рост клеток рака молочной железы. Ряд химиотерапевтических препаратов, которые действуют посредством различных механизмов, являются доступными для лечения рака молочной железы. Химиотерапия может быть эффективной против метастатического рака молочной железы, когда ее применяют системно, но также ее можно применять и более локализованным способом, например, вводить в окружающую мозг жидкость.

Примерные химиотерапевтические препараты, которые могут быть эффективными против рака молочной железы, включают антагонисты фолата, включая метотрексат и пеметресед; антагонисты пурина, включая кладрибин, клофарабин, флударабин, 6-меркаптопурин, неларабин, пентостатин; антагонисты пиримидина, включая капецитабин, цитарабин, 5-фтороурацил, гемцитабин, гидроксимочевину; модификаторы биологического ответа, включая интерферон-альфа; блеомицин; алкилирующие ДНК средства, включая нитрозомочевины, кармустин, ломустин; перекрестно сшивающие ДНК препараты и алкилирующие средства, включая бендамустин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид, меклоретамин (азотистый иприт), мелфалан, дакарбазин, темозоломид, прокарбазин; аспарагиназа; антибиотики, включая митомицин; платиновые комплексы, включая карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин; ингибиторы протеосомы, включая бортезомиб; веретенные яды, такие как таксаны (включая доцетаксел, паклитаксел) и барвинки (включая винбластин, викристин, винорелбин); ингибиторы топоизомеразы, такие как антрациклины (включая даунорубицин, дауномицин, доксорубицин, эпирубицин), камптотецины, (включая иринотекан, топотекан), подофиллотоксины (включая этопозид, тенипозид и митоксантрон); ингибиторы тирозинкиназы, (включая эрлотиниб (Тарцева), гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, сорафениб, сунитиниб). Известными являются также другие химиотерапевтические препараты.

Отдельные химиотерапевтические препараты и их комбинации, известные в качестве эффективных против рака молочной железы, включают, но не ограничиваются ими, СМР, что является комбинацией циклофосфамида, метотрексата и 5-фтороурацила; САР (РАС), что является комбинацией циклофосфамида, доксорубицина и 5-фтороурацила; АС, что является комбинацией доксорубицина и циклофосфамида; ЕС, что является комбинацией эпирубицина и циклофосфамида; ТАС, что является комбинацией

- 19 025329 доцетакса, доксорубицина и циклофосфамида; АС®Т, что является комбинацией доксорубицина и циклофосфамида, с последующими паклитакселом или доцетакселом (герцептин может быть предоставлен с паклитакселом или доцетакселом для НЕК2-положительных новообразований); Л^СМР, что представляет собой комбинацию доксорубицина, далее идут СМР; СЕР (РЕС), что является комбинацией циклофосфамида, эпирубицина и 5-фтороурацила (с возможным последующим доцетакселом); ТС, что является комбинацией доцетаксела и циклофосфамида; ТСН, что является комбинацией доцетаксела, карбоплатина и герцептина для НЕК2-положительных новообразований.

Другие химиотерапевтические препараты, которые могут быть эффективными против рака молочной железы, включают цисплатин, винорелбин, капецитабин, пегилированный липосомальный доксорубицин, гемцитибин, митоксантрон, иксабепилон, альбумин-связанный паклитаксел и другие.

Эстроген промотирует рост приблизительно двух третей случаев рака молочной железы, т.е. новообразований, которые содержат рецепторы эстрогена (ЕК-положительные злокачественные новообразования) и/или рецепторы прогестерона (РК-положительные злокачественные новообразования). Таким образом, у пациентов с ЕК-положительным и РК-положительным раком молочной железы, гормональная терапия стремится заблокировать действие эстрогена или понизить уровни эстрогена. Таким образом, гормональная терапия влечет за собой введение синтетических гормонов или других препаратов, которые являются эффективными для блокирования выработки и/или активности естественных гормонов организма, которые, в противном случае, могут поддерживать или промотировать рост гормонзависимых клеток рака молочной железы.

Тамоксифен, торемифен и ралоксифен являются примерами селективных модуляторов рецепторов эстрогенов (§ЕКМ-ов) и антиэстрогенов, которые противодействуют рецепторам эстрогенов в клетках рака молочной железы. Фулвестрант, который действует на уничтожение рецепторов эстрогенов, может быть эффективным, даже если рак молочной железы больше не восприимчив к тамоксифену. Ингибиторы ароматазы действуют на остановку выработки эстрогена и включают препараты летрозол, анастрозол, и экземестан. Удаление яичников также может применяться для того, чтобы устранить главный источник эстрогенов у женщин с пременопаузой. Остаточное удаление яичников может быть выполнено хирургическим путем удаления яичников. Удаление яичников также может быть проведено с помощью препаратов, известных как аналоги гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон (ЬНКН), такие как госерелин или леупролид, которые могут применяться отдельно или с тамоксифеном как гормональная терапия у женщин с пременопаузой. Мегестрол ацетат может применяться для женщин, злокачественные новообразования которых не отвечают на другое гормональное лечение. Применение андрогенов также возможно. Другие препараты гормональной терапии также возможны, такие как бикалутамид и флутамид.

Таргетная терапия направлена к конкретным генам или генным продуктам, о которых известно, что они связаны с раком молочной железы. Специфическим видом таргетной терапии является терапия антителом, которая включает введение антитела, такого как моноклональное антитело, которое непосредственно или косвенно уничтожает, замедляет или останавливает рост клеток рака молочной железы. Такие антитела могут функционировать посредством множества различных механизмов. Например, определенные антитела могут отмечать раковые клетки для атак иммунной системы пациента посредством антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЭСС) или других механизмов. Другие антитела связываются с и изменяют или ингибируют функцию антигенов, которые необходимы раковым клеткам для их жизнеспособности или роста. Другие механизмы также возможны. Антитела могут также конъюгировать с радиоактивными или гемотоксичными фрагментами, способным уничтожать раковые клеток после связывания с соответствующим антигеном, экспрессированным на раковых клетках.

Примерами таргетной терапии антителом рака молочной железы являются моноклональные антитела трастузумаб и бевацизумаб. Трастузумаб и подобные антитела воздействуют на генный продукт НЕК2, в то время как бевацизумаб и подобные антитела воздействуют ФРЭС. Трастузумаб можно вводить женщинам с НЕК2-положительными злокачественными новообразованиями отдельно или в комбинации с химиотерапией, так же как и с другим лечением. Бевацизумаб может быть комбинирован с таким препаратом химиотерапии, как паклитаксел, так же как и с другими.

Другие виды таргетной терапии включают низкомолекулярные препараты, такие как лапатиниб. НЕК2-положительные злокачественные новообразования, которые больше не отвечают на трастузумаб, могут ответить на лапатиниб, который может быть введен с препаратом химиотерапии капецитабин, так же как и с другими.

7.9. Терапевтические способы, в которых применяют антитела к РО.

Настоящее раскрытие предусматривает терапевтические способы, содержащие введение антитела к РО субъекту в целях лечения и профилактики метастатического рака молочной железы, для предотвращения рецидива рака молочной железы и для предотвращения роста раковых стволовых клеток молочной железы. В определенных вариантах осуществления изобретения антитела представляют собой моноклональные антитела.

В соответствии с некоторыми из указанных вариантов осуществления изобретения антитела к РО,

- 20 025329 как раскрыто здесь, вводят субъекту, нуждающемуся в лечении метастатического рака молочной железы, в терапевтически эффективном количестве в качестве монотерапии или в качестве комбинированной терапии. Такие субъекты включают, но не ограничиваются ими, тех, у которых диагностирован метастатический рак молочной железы. В определенных вариантах осуществления указанных способов антитела представляют собой моноклональные антитела к ЬРС.

В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения антитела к РС, как раскрыто, здесь вводят субъекту, нуждающемуся в профилактике метастатического рака молочной железы, в терапевтически эффективном количестве в качестве монотерапии или в качестве комбинированной терапии. Такие субъекты включают, но не ограничиваются ими, субъектов, у которых обнаружен первичный рак молочной железы, но у которых рак, как известно, не распространился к отдаленным тканям или органам. В определенных вариантах осуществления указанных способов антитела представляют собой моноклональные антитела к ЬРС.

В соответствии с еще другими вариантами осуществления изобретения антитела к РС, как раскрыто здесь, вводят субъекту, нуждающемуся в предотвращении рецидивов метастатического рака молочной железы, в терапевтически эффективном количестве в качестве монотерапии или в качестве комбинированной терапии. Такие субъекты включают, но не ограничиваются ими, тех, которые ранее подвергались лечению первичного или метастатического рака молочной железы, и после такого печения такой рак явно отсутствовал. В определенных вариантах осуществления указанных способов антитела представляют собой моноклональные антитела к ЬРС.

7.10. Применение антитела в способах в составе композиции и набора.

Антитела к ЬРС, которые применяют в способах настоящего раскрытия, могут быть составлены как композиции. Необязательно, композиции могут содержать один или более дополнительных терапевтических препаратов, таких как химиотерапевтические препараты или другие антитела с терапевтической эффективностью против метастатического рака молочной железы или рецидивов рака молочной железы. Композиции будут обычно обеспечиваться как часть стерильной, фармацевтической композиции, которая обычно включает фармацевтически приемлемый носитель. Указанная композиция может быть в любой подходящей форме, в зависимости от желательного способа введения ее пациенту.

Антитела к РС может вводить субъекту посредством многих способов введения, обычно парентерально, например, при помощи подкожной, внутривенной, внутрибрюшинной или внутримышечной инъекции. Введение может быть осуществлено как одно или более болюсных инфузий, или как одно или более инфузий. Другие способы введения также возможны в соответствии со знаниями специалиста в данной области. Самый подходящий способ для введения в любом конкретном случае может зависеть от конкретной композиции, которая будет вводиться, и характеристик субъекта, таких как возраст или пол.

Фармацевтические композиции могут быть удобно представлены в виде однократной дозы, содержащей предварительно определенное количество антитела к ЬРС раскрытия на дозу. Такая однократная доза может содержать, например, но без ограничения, 5 мг-5 г, например 10 мг-1 г или 20-50 мг. Фармацевтически приемлемые носители для применения в раскрытии могут иметь широкое разнообразие видов, зависящих, например, от способа введения.

Фармацевтические композиции раскрытия могут быть приготовлены для хранения в качестве лиофилизованных препаративных форм или водных растворов, посредством смешивания антитела, имеющего желательную степень чистоты, с дополнительными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами, обычно используемыми в данной области (все из которых упоминаются здесь как носители), т.е. буферирующими агентами, стабилизирующими средствами, консервантами, изотонирующие добавки, неионогенные детергенты, антиокислители, и другие различные добавки. См. КешшдЮи'з РЬаттасеиБса1 8с1спсс5. 16 издание (Озо1, изд. 1980). Такие добавки должны быть нетоксичными для реципиента в используемых дозах и концентрациях.

Буферирующие агенты помогают поддерживать значение рН в диапазоне, который приближен к физиологическим условиям. Они могут быть представлены в концентрации в пределах от приблизительно 2 до приблизительно 50 мМ. Подходящие буферирующие агенты для применения в соответствии с настоящим раскрытием включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферы (например, смесь мононатрий цитрата - двунатрий цитрата, смесь лимонной кислоты - тринатрий цитрата, смесь лимонной кислоты - мононатрия цитрата и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты - мононатрий сукцината, смесь янтарной кислоты - гидрооксида натрия, смесь янтарной кислоты - двунатрий сукцината и т.д.), тартратные буферы (например, смесь винной кислоты - тартрата натрия, смесь винной кислоты - тартрата калия, смесь винной кислоты - гидрооксида натрия и т.д.), фумаровые буферы (например, смесь фумаровой кислоты - мононатрий фумарата, смесь фумаровой кислоты - двунатрий фумарата, смесь мононатрий фумарата - двунатрий фумарата и т.д.), глюконовые буферы (например, смесь глюконовой кислоты - натрий глюконата, смесь глюконовой кислоты - гидрооксида натрия, смесь глюконовой кислоты - глюконата калия и т.д.), оксалатные буферы (например, смесь щавелевой кислоты - оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты - гидрооксида натрия, смесь щавелевой кислоты - оксалата калия и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочной кислоты - натрий лактата, смесь молочной кислоты - гидрооксида натрия, смесь молочной кислоты - лактата

- 21 025329 калия и т.д.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусной кислоты - ацетата натрия, смесь уксусной кислоты - гидрооксида натрия и т.д.). Дополнительно могут применяться фосфатные буферы, гистидиновые буферы и триметиламиновые соли, такие как Трис.

Консерванты могут быть добавлены, для того чтобы задержать рост микробов, и они могут быть добавлены в количестве в пределах от 0,2-1% (мас./об.). Подходящие консерванты для применения в соответствии с настоящим раскрытием включают фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, октадецилдиметилбензил аммоний хлорид, бензалкониевые галиды (например, хлорид, бромид и йодид), гексамнтоний хлорид и алкилированные парабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол. Изотонирующие добавки, иногда известные как стабилизаторы, могут быть добавлены для того, чтобы гарантировать изотоничность жидких композиций настоящего раскрытия и включают многоатомные сахарные спирты, например трехатомные или более высокие сахарные спирты, такие как глицерин, эритритол, арабитол, ксилитол, сорбитол и маннит. Стабилизаторы относятся к широкой категории наполнителей, которые могут варьироваться в зависимости от функции от объемообразующего препарата до добавки, которая солюбилизирует терапевтический препарат или помогает предотвратить денатурацию или прилипает к стенке емкости. Традиционные стабилизаторы могут представлять собой многоатомные сахарные спирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, Ь-лейцин, 2-фенилаланин, глутамин, треонин и т.д., органический сахар или сахарные спирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбитол, ксилитол, рибитол, миоиниситол, галактитол, глицерин и т.п., включая циклитолы, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; аминокислотные полимеры; уменьшающие содержание серы агенты, такие как мочевина, глутатинон, тиоктовая кислота, натрий тиоглиеолат, тиоглицерол, α-ионотиоглицерол и натрий тиосульфат; полипептиды низкой молекулярной массы (например, пептиды из 10 остатков или меньше); белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза и трисахариды, такие как раффиноза; и полисахариды, такие как декстран. Стабилизаторы могут присутствовать в диапазоне от 0,1 до 10000 в весовом отношении активного белка.

Неионогенные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как смачивающие вещества) могут быть добавлены для того, чтобы помочь солюбилизировать терапевтический препарат, а также защитить терапевтический белок от агрегации, вызываемой встряхиванием, что также позволяет подвергать препаративную форму скалыванию поверхности, не вызывая денатурацию белка. Подходящие неионогенные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), плюрониловые полиолы, моноэфиры полиоксиэтилен-сорбитана (Τ^ΕΕΝ®-20, Т\УЕЕЖ®-80 и т.д.). Неионогенные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в диапазоне от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,0 мг/мл, например приблизительно 0,07 мг/мл, приблизительно 0,2 мг/мл. Однако поверхностно-активные вещества имеют тенденцию связываться с антителами, и могут поставить под угрозу их конформацию. Поэтому, когда их используют, устойчивые концентрации должны быть низкими и определяться экспериментально.

Дополнительные различные наполнители могут включать хелатирующие вещества (например, ΕΌΤΆ), антиокислители (например, аскорбиновая кислота, метионин, витамин Е) и сорастворители.

Антитела к 1РО можно вводить отдельно или в качестве смесей одного или более антител к 1РО только указанных антител, или в смеси или в комбинации с другими препаратами, которые являются полезными для предотвращения метастаза рака молочной железы или рецидивов, включая, но не ограничиваясь ими, химиотерапевтические препараты, препараты гормональной терапии, препараты биологической терапии и препараты терапии антителами (например, бевацизумаб).

В определенных вариантах осуществления изобретение предусматривает фармацевтические наборы для использования практикующими врачами или другими. Фармацевтический набор представляет собой упаковку, содержащую антитело к 1РО, раскрытого здесь (например, либо в лиофилизованном виде, либо как водный раствор), и один или более следующих компонентов: по крайней мере, второй терапевтический препарат, как описано где-либо в этом описании; устройство для введения антитела к 1РО, например иглу и/или шприц; и жидкость, соответствующую требованиям фармацевтической промышленности, или буферный раствор, для того чтобы ресуспендировать или разбавить антитело, если антитело находится в лиофилизованном или концентрированном виде. Наборы могут также включать инструкции для приготовления композиции антитела и/или введения композиции пациенту.

Каждая однократная доза композиции антитела к 1РО может быть упакована отдельно, и набор может содержать одну или более однократных доз (например, две однократные дозы, три однократные дозы, четыре однократные дозы, пять однократных доз, семь однократных доз, восемь однократных доз, десять однократных доз, или больше). В одном варианте осуществления изобретения одна или больше однократных доз, каждая, помещены в шприц, и в другом варианте осуществления изобретения одна или больше однократных доз, каждая, содержатся в мешочке или подобной емкости, подходящей для под- 22 025329 соединения к системе для внутривенного введения.

7.11. Эффективные дозы антитела.

Нейтрализующие антитела к №0 настоящего раскрытия в составе композиции необходимо, как правило, вводить субъекту, нуждающемуся в лечении или в предотвращении метастаза рака молочной железы, или в предотвращению рецидивов рака молочной железы, в дозе, эффективной для достижения, по крайней мере частично, желательного результата.

Что касается лечения метастаза рака молочной железы, терапевтическая польза, среди прочего, означает любое улучшение метастатического рака молочной железы, остановку или замедление роста метастаз рака молочной железы, уменьшение количества и/или размера таких метастаз у субъекта, уменьшение кровотока к метастазам рака молочной железы, уменьшение метаболизма метастаз рака молочной железы, уменьшение тяжести рака молочной железы метастатического рака, ингибирование пролиферации или увеличение апоптоза метастатических клеток рака молочной железы, остановку или замедление ухудшения симптомов или признаков, связанных с метастатическим раком молочной железы у субъекта, возможность хирургической резекции метастаз рака молочной железы, если такая резекция не была возможна до лечения, повышение продолжительность жизни, комфорт или качество жизни субъекта, имеющего метастатический рак молочной железы, или уменьшение боли у такого субъекта. Полного излечения от метастатического рака молочной железы, когда это желательно, для наличия терапевтической пользы не требуется.

Размер метастатического новообразования рака молочной железы, количество и метаболизм могут быть установлены посредством применения различных методов сканирования, включая, но не ограничиваясь ими, КТ, МРТ, функциональное МРТ, ОФЭКТ и ПЭТ, так же как и другие методы, известные специалисту в данной области.

Терапевтический эффект также может быть коррелирован с одной или более суррогатными конечными точками. В качестве неограничивающего примера производство определенных белков или других факторов метастатическим раком молочной железы, таких как прогастрин или карциноэмбрионный антиген (СЕА), могут быть установлены у субъекта на протяжении времени с уменьшение уровней фактора, являющегося показательным для терапевтической пользы.

Что касается предотвращения метастаза рака молочной железы, эффективной дозой является доза, которая эффективна для того, чтобы, по крайней мере, частично предотвратить метастатический рак молочной железы, что подтверждается, среди прочего, отсутствием метастаз рака молочной железы, замедлением, остановкой или замедлением роста метастаз рака молочной железы, уменьшением количества и/или размера любых метастаз молочной железы, которые, в конечном счете, могли бы произойти, и ингибированием или влиянием на любой из механизмов, посредством которых метастатические клетки рака молочной железы могут распространяться от первичного новообразования. Полное предотвращение метастаза рака молочной железы, когда это желательно, для существования эффективности предотвращения метастаз не требуется.

Что касается предотвращения рецидивов рака молочной железы, эффективной дозой является доза, которая эффективна для того, чтобы, по крайней мере, частично предотвратить рецидив рака молочной железы, что подтверждается, среди прочего, отсутствием рецидивов рака молочной железы, поддержание ремиссии рака молочной железы, или отсрочка, остановка или замедление нового появления или нового роста рака молочной железы, или роста новой опухоли молочной железы у субъекта после лечения, где начальный рак молочной железы стал необнаруживаемым или явно отсутствовал. Эффективность предотвращения рецидива рака молочной железы также подтверждается, среди прочего, уничтожением раковых стволовых клеток молочной железы, отсрочкой, остановкой, ингибированием или замедлением роста или пролиферации раковых стволовых клеток молочной железы, повышением апоптоза раковых стволовых клеток молочной железы или вызовом дифференциации раковых стволовых клеток молочной железы в клетки, которые не способны влиять на образование или рост рака молочной железы. Как описано где-либо здесь, раковые стволовые клетки молочной железы можно идентифицировать как имеющие одну или более фенотипических качественных характеристик таких клеток, включая, но не ограничиваясь ими, экспрессию определенных маркеров клетки, способность расти как сфероиды при культивировании в условиях низкой адгезии и способности вызывать новый рост новообразования после пересадки. Полное предотвращение рецидивов рака молочной железы, когда это желательно, для существования эффективности не требуется.

Не обязательно необходимо связывание всего прогастрина, для того чтобы достичь терапевтической эффективности. Чаще, системное понижение концентрации прогастрина в пределах новообразования, в определенных жидкостях тела, таких как жидкость асцита, жидкость от плевральных излияний, цереброспинальная жидкость, лимфа, кровь, плазма, сыворотка или какая-либо еще, также может быть эффективным.

В соответствии со знаниями специалиста в данной области, доза композиции антитела к №0 может титроваться для пациента таким образом, чтобы понижать концентрацию свободного №0 в ткани или жидкости тела, которая представляет интерес, в предварительно определенный период времени после введения по крайней мере приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% либо приблизитель- 23 025329 но 5-10%, приблизительно 10-15%, приблизительно 15-20%, приблизительно 20-25%, приблизительно 25-30%, приблизительно 30-35%, приблизительно 35-40%, приблизительно 40-45%, приблизительно 4550%, приблизительно 50-55%, приблизительно 55-60%, приблизительно 60-65%, приблизительно 6570%, приблизительно 70-75%, приблизительно 75-80%, приблизительно 80-85%, приблизительно 85-90% или приблизительно 90-95%, или понижения процента концентрации свободного №0, который находится в пределах любых из предшествующих значений.

Количество вводимого антитела к №0 будет зависеть от многих факторов, включая размер и вес субъекта, которого будут подвергать лечению, вид, способ и участок введения, терапевтический режим (например, используется ли второе терапевтическое вещество), возраст и состояние конкретного пациента, которого подвергают лечению, уровень Р0, обнаруженный в крови указанного субъекта до лечения, чувствительность субъекта, которого подвергают лечению антителом к Р0. Соответствующая доза может быть легко определена специалистом в данной области. В конечном счете, практикующий врач определяет соответствующие дозы, которые будут применяться.

Указанная доза может повторяться настолько часто, как это необходимо. Если развиваются побочные эффекты, то количество и/или частота дозы может быть изменена или уменьшена, в соответствии с нормальной клинической практикой. Надлежащая доза и режим лечения могут быть установлены посредством контроля продвижение терапии при помощи применения способов настоящего раскрытия или других способов, известных специалисту в данной области.

Эффективные дозы могут быть установлены первично в результате ίη νίίτο исследования. Например, начальная доза для применения у животных может быть составлена для достижения в крови или в сыворотке концентрации антитела к №0, которая является около или выше связывающей способности антитела к прогастрину, как установлено ίη νίίτο. Вычисляя дозы для достижения такой концентрации в крови или в сыворотке, принимают во внимание бионакопление конкретного антитела, что является в пределах способностей специалистов в данной области. Для руководства читателя отправляют к части 1: 0епега1 Ргтар1е8 ίη ''Сообтап апб 0Птап8 ТЬе РЬагтасо1одюа1 Ва818 οί ТЬегареиЬск, 11-е изд., Нагбтап, ί.0., и др., Еб«., Мс0га№-НШ РгоГе88Юпа1, и к ссылкам, процитированным там. Начальные дозы могут также быть установлены в соответствии с данными исследования ίη νί\Ό, таких как экспериментальные модели на животных. Обычно специалисты в данной области могут привычно адаптировать такую информацию, для того чтобы определить дозы, подходящие для введения человеку.

В определенных вариантах осуществления изобретения в.в. доза может быть определена для отдельного субъекта, посредством измерения концентрации Р0 в сыворотке крови или плазме человека, несколько раз несколько дней за несколько недель до лечения, и вычисления количества антитела к Р0, которое было бы насыщающим, т.е. количества, которого будет достаточно для того, чтобы связать весь Р0. Как будет воспринято специалистами в данной области, количество любого конкретного антитела, необходимого для достижения насыщенности концентрации Р0 для данной сыворотки крови или плазмы, будет зависеть, частично, от аффинной константы конкретного антитела. Способы для вычисления количества насыщения для определенных антител к Р0, которые представляет интерес, известны.

Для того чтобы обеспечить насыщенность, можно вводить количество, которое является большим, чем расчетное количество насыщения, например, можно вводить по крайней мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или даже в 10 раз больше, чем расчетное количество насыщения. Для способов введения, других, чем в.в., количество может подбираться на основании фармакокинетики и бионакопления, которые известны в данной области.

Доза антитела к ЬР0, которая является эффективной, может варьироваться от приблизительно 0,001 до приблизительно 250 мг/кг на одно (например, болюс) введение, многократные введения или непрерывное (например, инфузия) введение, или составлять любой эффективный диапазон или его значение, в зависимости от вида рака, рецидива которого быть предотвращен, способа введения и возраста, веса и состояния субъекта. В определенных вариантах осуществления изобретения каждая доза может варьироваться от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мг/кг; от приблизительно 0,25 до приблизительно 0,75 мг/кг; от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мг/кг; приблизительно 2 мг/кг; приблизительно

1.5 - приблизительно 2,5 мг/кг; приблизительно 2 - приблизительно 3 мг/кг; приблизительно 2,5 - приблизительно 3,5 мг/кг; приблизительно 3 - приблизительно 4 мг/кг; приблизительно 3,5 - приблизительно

4.5 мг/кг; приблизительно 4 - приблизительно 5 мг/кг; приблизительно 5 - приблизительно 7 мг/кг; приблизительно 6 - приблизительно 8 мг/кг, приблизительно 7 - приблизительно 9 мг/кг; приблизительно 8 приблизительно 10 мг/кг; приблизительно 10 - приблизительно 15 мг/кг; приблизительно 12,5 - приблизительно 17,5 мг/кг; приблизительно 15 - приблизительно 20 мг/кг; приблизительно 17,5 - приблизительно 22,5 мг/кг; приблизительно 20 - приблизительно 25 мг/кг; приблизительно 22,5 - приблизительно 27,5 мг/кг; приблизительно 25 - приблизительно 30 мг/кг; приблизительно 30 - приблизительно 40 мг/кг; приблизительно 35 - приблизительно 45 мг/кг; приблизительно 40 - приблизительно 50 мг/кг; приблизительно 45 - приблизительно 55 мг/кг; приблизительно 50 - приблизительно 60 мг/кг; приблизительно 55 приблизительно 65 мг/кг; приблизительно 60 - приблизительно 70 мг/кг, приблизительно 65 - приблизительно 75 мг/кг; приблизительно 70 - приблизительно 80 мг/кг; приблизительно 75 - приблизительно 85 мг/кг; приблизительно 80 - приблизительно 90 мг/кг; приблизительно 85 - приблизительно 95 мг/кг; при- 24 025329 близительно 90 - приблизительно 100 мг/кг; приблизительно 95 - приблизительно 105 мг/кг; приблизительно 100 - приблизительно 150 мг/кг; приблизительно 125 - приблизительно 175 мг/кг; приблизительно 150 - приблизительно 200 мг/кг; приблизительно 175 - приблизительно 225 мг/кг; приблизительно 200 приблизительно 250 мг/кг. Другие диапазоны доз также возможны.

Количество, частота и продолжительность введения будут зависеть от многих факторов, таких как возраст пациента, вес и состояние заболевания. Таким образом, в неограничивающих примерах терапевтический режим для введения может продолжаться на протяжении 1 дня или больше, 2 дней или больше, 3 дней или больше, 4 дней или больше, 5 дней или больше, 6 дней или больше, 1 недели или больше, 2 недели - без ограничений, на протяжении 2 недель - 6 месяцев, от 3 месяцев до 5 лет, от 6 месяцев до 1 или 2 лет, от 8 месяцев до 18 месяцев или подобным образом. Необязательно, терапевтический режим предусматривает повторное введение, например один раз ежедневно, два раза в день, каждые два дня, три дня, пять дней, одну неделю, две недели или один месяц. Повторное введение может быть в той же самой дозе или в различной дозе. Введение может быть повторено один раз, дважды, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, десять раз или больше. Терапевтически эффективное количество антитела к ЬРС можно вводить как одноразовую дозу или на протяжении курса терапевтического режима, например, на протяжении курса в течение недели, двух недель, трех недель, одного месяца, трех месяцев, шести месяцев, одного года или дольше.

8. Примеры

Пример 1. Экспрессия гена гастрина в метастатических, клеточных линиях рака молочной железы.

Этот пример описывает экспрессию гена гастрина (СА8Т) в метастатических клеточных линиях рака молочной железы.

A. Способы.

Экспрессию СА8Т мРНК определяли количественно посредством применения количественного анализа КТ-ПЦР от препаратов РНК из МСР-7, МЭА-МВ-231 и клеточной линии Т47Э. Данные выражают в сравнении с уровнем экспрессии мРНК, обнаруженным в клеточной линии 8\У480, клеточной линии первичного колоректального рака, клетки которой известны тем, что экспрессируют высокие уровни мРНК гастрина.

Клетки МСР-7 представляют собой клеточную линию человеческого метастатического рака молочной железы. Их первично получали из плеврального выпота пациента, которому был поставлен диагноз аденокарциномы молочной железы. Клетки МОА-МВ-231 представляют собой клеточную линию человеческого метастатического рака молочной железы. Их первично получали из плеврального выпота пациента, которому был поставлен диагноз аденокарциномы молочной железы. Клетки Т47Э представляют собой клеточную линию человеческого метастатического рака молочной железы. Их первично получали из плеврального выпота пациента, которому был поставлен диагноз инфильтрированной протоковой карциномы молочной железы.

B. Результаты.

Уровень экспрессии гена гастрина, установленный количественным КТ-ПЦР анализом, показан на фиг. 1. Все три протестированные клеточные линии метастатического рака молочной железы экспрессировали ген гастрина на уровнях приблизительно одинаковых или меньше, по сравнению с экспрессией в клетках 8\У480. Посредством посттрансляционного процессинга продукт гена гастрина может быть преобразован в прогастрин.

Пример 2. Экспрессия гена гастрина в первичных и метастатических новообразованиях молочной железы, удаленных хирургическим путем у пациентов.

Этот пример описывает экспрессию гена гастрина (СА8Т) в первичном и метастатическом новообразовании молочной железы, удаленном хирургическим путем у пациентов.

A. Способы.

Первичный и метастатический рак молочной железы был хирургическим путем резецирован у разных пациентов в соответствии с применимыми этическими руководящими принципами. РНК готовили из образцов рака, и мРНК гастрина была установлена посредством количественного анализа КТ-ПЦР. Экспрессия мРНК гастрина в клинических образцах была нормализована относительно уровня экспрессии в МСР-7 клетках.

B. Результаты.

Общее количество 105 первичных новообразований молочной железы и 25 метастатических новообразований молочной железы было протестировано на экспрессию гена гастрина. мРНК прогастрина была обнаружена в 27 из протестированных первичных новообразований (фиг. 2) и в 7 из протестированных метастатических новообразований (фиг. 3). Таким образом, ген гастрина экспрессирует как в подклассе первичного, так и в подклассе метастатического рака молочной железы, и уровень экспрессии изменяется по злокачественным новообразованиям, в которых обнаружена экспрессия гена гастрина.

Пример 3. Концентрации прогастрина в плазме крови у пациентов, страдающих от рака молочной железы.

Этот пример описывает количественное определение уровней прогастрина в плазме крови у пациентов, страдающих от первичного и метастатического рака молочной железы.

- 25 025329

A. Способы.

Концентрации прогастрина в плазме крови измеряли у здоровых людей, в качестве контроля, и у 42 пациентов с метастатическим раком молочной железы, у которых первичные новообразования были удалены хирургическим путем, и у 3 пациентов с первичным раком молочной железы. Общее количество из банка крови и плазмы было получено 104 здоровых контрольных образца.

Количественное определение уровня прогастрина в плазме или сыворотке крови было выполнено посредством применения прогастрин-специфического анализа сэндвич-ЕЫ§А, подобного тому, как описано ниже.

Лунки Ыипс Мах18ОРР-96-луночных планшетов покрывали первым прогастрин-специфичным антителом следующим образом. Поликлональные антитела к прогастрину, специфичные по отношению к карбоксиконцевой области прогастрина, растворяли в концентрации 3 мкг/мл в растворе 50 мМ, со значением рН 9.6, буферного раствора карбоната/бикарбоната натрия в воде МИНЦ. Общее количество, составляющее 100 мкл раствора антитела, затем добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов, и инкубировали на протяжении ночи при температуре 4°С. После связывания раствор антитела удаляли из лунок, которые затем промывали три раза 100 мкл промывочного буфера (1Х ФСБ/0.1% Т\уееп-20). Общее количество 100 мкл блокирующего буфера (1Х ФСБ/0,1% Туееп-20/0,1% ΒδΑ), затем добавляли к каждой лунке и инкубировали на протяжении 2 ч при температуре 22°С. Блокирующий буфер затем удаляли и лунки промывали три раза промывочным буфером. Образцы плазмы или сыворотки, выделенные от пациентов, затем добавляли к лункам в объеме 100 мкл в серии растворений, обычно 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10 растворений, и затем инкубировали на протяжении 2 ч при температуре 22°С. Образцы плазмы или сыворотки были проанализированы в двух параллельных опытах.

Исследование также включает две стандартные кривые. Первая стандартная кривая подготовлена посредством применения растворения рекомбинантного гена прогастрина до окончательного количества, которое представляет собой 1, 0,5, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01 и 0 нг на лунку. Вторая стандартная кривая, которая служит негативным контролем, подготовлена из прогастрин-негативной человеческой сыворотки, растворенной в блокирующем буфере при тех же растворениях, что и испытательные образцы, т.е. 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10. В качестве альтернативы, когда оценивают образцы плазмы, вторую стандартную кривую, которая служит негативным контролем, подготавливают из прогастрин-негативной человеческой плазмы, растворенной в блокирующем буфере при тех же растворениях, что и испытательные образцы, т.е. 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10.

После того, как инкубация с образцами плазмы или сыворотки завершена, содержание лунок удаляли, и лунки промывали три раза промывочным буфером, в количестве 100 мкл/лунку, после чего прогастрин, связанный с первым антителом, определяли посредством применения второго антитела, специфичного к прогастрину, следующим образом.

Биотин-сопряженные поликлональные или моноклональные антитела к прогастрину, специфичные по отношению к амино-концевой области прогастрина, растворяли в блокирующем буфере до концентрации 0,1-10 мкг/мл, в зависимости от антитела. Общее количество 100 мкл раствора антитела затем добавляли к каждой лунке и инкубировали на протяжении 1 ч при температуре 22°С.

После того как связывание вторичного антитела завершено, планшеты промывали три раза с промывочным буфером, 100 мкл/лунку, после чего 100 мкл раствора стрептавидин-НКР (25 нг/мл в блокирующем буфере) добавляли к каждой лунке и инкубировали на протяжении 1 ч при температуре 22°С. После того как инкубация с стрептавидин-НРР раствором завершена, планшеты промывали три раза с промывочным буфером, 100 мкл/лунку. После этого приготавливали 100 мкл хемилюминесцентного субстрата посредством применения набора Р1етсе 8ирет§1дпа1 ΕΟδΑ РстЮ Махшит δοηδίΐίνίΐν СНепи1иттс5ссп1 §иЬ81га1е, который добавляли на лунку, инкубировали на протяжении 5 мин при комнатной температуре в темноте и затем прочитывали на люминометре.

На основании данных люменометра применяли линейный регрессный анализ, для того чтобы получить соотношение линий, соответствующих данным стандартной кривой. Применяя это соотношение, затем вычисляли концентрацию прогастрина в образцах от различных пациентов.

B. Результаты.

Коробчатая диаграмма на фиг. 4 показывает 25-й процентиль, медиану, и 75-й процентиль концентраций прогастрина в плазме крови у пациентов, страдающих от рака молочной железы, имеющих метастатический рак молочной железы, по сравнению со здоровыми из контрольной группы. Усы указывают на 5-й и 95-й процентили концентраций прогастрина в плазме крови. Эти данные демонстрируют, что у пациентов с метастатическим раком молочной железы, у которых были удалены первичные новообразования рака молочной железы, была более высокая медианная концентрации прогастрина в плазме крови, чем у здоровых людей. Статистический анализ данных содержится в табл. 4.

У трех пациентов, у которых был диагностирован первичный рак молочной железы без метастаз, уровни прогастрина были определены как 45,7, 97,3 и 667,7 пМ, демонстрируя, что уровни прогастрина также повышаются у определенных пациентов с первичным раком молочной железы.

- 26 025329

ТАБЛИЦА 4
Анализ таблицы	Рак молочной железы
Столбец А	Контроли
V»	νδ
Столбец ϋ	Т-М+
Тест Манна-Уитни
Значение Р	< 0.0001
Точное или приблизительное значение Р?	Гауссова Аппроксимация
Суммарное значение Р	***
Являются ли медианы знач. различными9 (Р < 0.05)	Да
Одно- или дво-стороннее значение Р?	Дво-стороннее
Сумма рангов в столбце А,В	5900, 1976
Критерий Манна-Уитни	439,5

Пример 4. Действие поликлональных антител к прогастрину на рост метастатических клеток рака молочной железы МЭА-МВ-231 в культуре.

Этот пример описывает действие поликлональных антител к прогастрину на рост клеток МЭА-МВ231 в культуре.

A. Способы.

Клетки МЭА-МВ-231 высевали в 6-луночные планшеты (50 000 клеток/лунку) в среде КТ1М1 плюс 10% ЭБС, инкубировались на протяжении одного дня и затем без сыворотки на протяжении ночи. Затем среду меняли два раза в день на протяжении 48 ч на среду КРМ1, с добавлением 0,5% Раппехш Н, содержащего 2 мкг/мл контрольного антитела или поликлонального антитела к прогастрину в трех параллельных опытах. Контрольное антитело было поликлональным античеловеческим 1дС кролика, аффинность В|оРеадеп15 Ке£ #8А1-600, 2 мкг/мл. Исследование был выполнено в двух параллельных опытах, и технический специалист был поражен относительно содержания растворов для обработки. В конце исследования клетки из каждой лунки были посчитаны три раза.

B. Результаты.

Результаты, показанные на фиг. 5, были вычислены как среднее количество клеток на лунку в конце исследования минус количество клеток, высеянных в начале исследования. Статистический анализ данных содержится в табл. 5. Результаты указанного исследования демонстрируют, что поликлональные антитела к прогастрину являются эффективными для снижения роста метастатических клеток рака молочной железы МЭА-МВ-231 ίη νίίτο, по сравнению с контрольными поликлональными антителами.

ТАБЛИЦА 5
Анализ таблицы	ΜϋΑ-ΜΒ-231
Столбец ϋ	Антитела к РЗ РАб-ТО
Уз	νδ
Столбец Е	СТ РАб-ТО
Тест Манна-Уитни
Значение Р	0.0139
Точное или приблизительное значение Р?	Гауссова Аппроксимация
Суммарное значение Р	*
Являются ли медианы знач. различными? (Р < 0.05)	Да
Одно- или дво-стороннее значение Р?	Одно-стороннее
Сумма рангов в столбце ϋ.Ε	481 .695
Критерий Манна-Уитни	181,0

Пример 5. Действие моноклональных антител к прогастрину на рост метастатических клеток рака молочной железы МЭА-МВ-231 в культуре.

Этот пример описывает действие моноклональных антител к прогастрину на рост клеток МЭА-МВ231 в культуре.

А. Способы.

В первом исследовании, использующем МАЬ3 и МАЬ8, клетки МЭА-МВ-231 высевали в 6луночные планшеты (50000-50000 клеток/лунку) в среде РРМ1 плюс 10% ЭБС, инкубировали на протяжении 8 ч и затем без сыворотки на протяжении ночи. Начиная после 24 ч после высева (время Т0) среду меняли два раза в день на протяжении 48 ч на среду КРМ1 с добавлением 0,5% Раппехш Н, содержащего 1-10 мкг/мл моноклонального антитела к ЬРО или контрольного моноклонального антитела (мышиное античеловеческое 1§С1). В Т0 количество клеток было посчитано в трех лунках для каждого исследования. 48 ч спустя количество клеток, выживших в каждой лунке, было посчитано четыре раза слепым способом. Посчитанные клетки в Т0 были вычтены из посчитанных клеток в 48 ч и данные нормализованы как процент относительно количества клеток, выживших после обработки контрольным антителом.

- 27 025329

Во втором исследование клетки МОА-МВ-231 высевали в 6-луночные планшеты (100000 клеток/лунку) и обрабатывали МАЬ8, МАЬ13, МАЬ16 и МАЬ19 (10 мкг/мл), как выше.

В. Результаты.

Результаты исследований, показанных на фиг. 6 и 7, демонстрируют, что пять различных антител к №0, МАЬ3, МАЬ8, МАЬ13, МАЬ16 и МАЬ19 эффективны для ингибирования роста метастатических клеток рака молочной железы МОА-МВ-231, ίη νίίΓΟ, по сравнению с контрольными моноклональными антителами. Ингибирующее действие МАЬ8 было зависимым от дозы. МАЬ8 и МАЬ13 распознают Сконцевые антигенные детерминанты №0, в то время как МАЬ3, МАЬ16 и МАЬ19, каждое, распознают N концевые антигенные детерминанты, демонстрирующие, что антитело, нейтрализующее активность, не зависит от того, расположена ли целевая антигенная детерминанта в Оконце или С-конце белка прогастрина.

Пример 6. Действие моноклональных антител к прогастрину на рост МСР-7 метастатических клеток рака молочной железы в культуре.

Этот пример описывает действие моноклональных антител к прогастрину на рост МСР-7 клеток на культуре.

A. Способы.

Клетки МСР-7 высевали в 6-луночные планшеты (100000 клеток/лунку) и выращивали в ОМЕМ, содержащем 10% эмбриональную сыворотку теленка на протяжении 8 ч. Клетки без сыворотки инкубировали на протяжении ночи и начиная через 24 ч после того, как их высеяли (время Т0), клетки обрабатывали каждые 12 ч при температуре течение 48 ч в присутствии 0,5% Рапемпн с 1 мкг/мл контрольного моноклонального антитела (мышиное античеловеческое 1д01, Са1Ьюсйет Ке£ #411451) или 1 мкг/мл антитела к №0 МАЬ3, как указано. Количество живых клеток как в контрольном МАЬ, так и в МАЬ к №0 обработанных клеток было посчитано через 48 ч. Посчитанные клетки в начале обработки (Т0) были вычтены из посчитанных тестируемых клеток и контрольных клеток, установленных через 48 ч. Технический специалист был поражен относительно содержания растворов для обработки.

B. Результаты.

Результаты, показанные на фиг. 8, были вычислены как среднее количество клеток на лунку в конце исследования минус количество клеток, высеянных в начале исследования. Статистический анализ данных содержится в табл. 6. Результаты указанного исследования демонстрируют, что моноклональные антитела к прогастрину являются эффективными для снижения роста МСР-7 метастатических клеток рака молочной железы ίη νίίτο, по сравнению с контрольными антителами.

ТАБЛИЦА6
Анализ таблицы	МСР-7
Столбец ϋ	Антитела к РО МАЬЗ-ТО
Уз	νδ
Столбец Е	СТ МАЬ-ТО
Тест Манна-Уитни
Значение Р	0,0194
Точное или приблизительное значение Р?	Гауссова Аппроксимация
Суммарное значение Р	*
Являются ли медианы знач. различными? (Р < 0.05)	Да
Одно- или дво-стороннее значение Р?	Дво-стороннее
Сумма рангов в столбце О,К	109,191
Критерий Манна-Уитни	31,00

Пример 7. Действие моноклональных антител к прогастрину на рост метастатических клеток рака молочной железы Τ47Ό в культуре.

Этот пример описывает действие моноклональных антител к Р0 на рост клеток Τ47Ό в культуре.

A. Способы.

Клетки Τ47Ό высевали в 6-луночные планшеты (50 000 клеток/лунку) и выращивали в КРМ1, содержащем 10% эмбриональной сыворотки теленка на протяжении 8 ч. Клетки без сыворотки инкубировали на протяжении ночи и начиная через 24 ч после того, как их высеяли (время Т0), клетки обрабатывали каждые 12 ч при температуре течение 48 ч в присутствии 0,5% Рапемпн, с 1 мкг/мл контрольного моноклонального антитела (мышиное античеловеческое 1д01, Са1Ьюсйет Ке£ #411451) или 1 мкг/мл антитела к ЬР0 МАЬ3, как указано. Количество живых клеток как в контрольном МАЬ, так и в МАЬ к №0 обработанных клеток было посчитано через 48 ч. Посчитанные клетки в начале лечения (Т0) были вычтены из посчитанных тестируемых клеток и контрольных клеток, установленных через 48 ч. Технический специалист был поражен относительно содержания растворов для обработки.

B. Результаты.

Результаты, показанные на фиг. 9, были вычислены как среднее количество клеток на лунку в конце исследования минус количество клеток, высеянных в начале исследования. Статистический анализ данных содержится в табл. 7. В этом исследовании никаких статистически значимых различий не было вы- 28 025329 явлено в действии на рост клеток Τ47Ό ίη νίΐτο посредством обработки моноклональным антителом к прогастрину МЛЬЗ, по сравнению с контрольными антителами.

ТАБЛИЦА 7
Анализ таблицы	Т47Р
Столбец Р	СТ МАЬ-ТО
Уз	ν3
Столбец Е	к РО МАЬ-ТО
Тест Манна-Уитни
Значение Р	0,1248
Точное или приблизительное значение Р?	Гауссова Аппроксимации
Суммарное значение Р	н.з
Являются ли медианы знач. различными? (Р < 0.05)	Нет
Одно- или дво-стороннее значение Р?	Одно-сторон нее
Сумма рангов в столбце Р,Е	108.5, 144,5
Критерий Манна-Уитни	42,50

Пример 8. Действие культивирования в условиях низкой адгезии на экспрессию гена гастрина в метастатических клеточных линиях рака молочной железы.

Этот пример сравнивает действие на экспрессию гена гастрина в МИА-МВ-231 и клеточных линиях МСР7 на рост при обычных условиях тканевой культуры и в условиях низкой адгезии.

Α. Способы.

Клетки МИА-МВ-231 и МСР-7 были выращены при обычных условиях и при культивировании в условиях низкой адгезии. В начале исследования 30000 клеток были выращены в обычных и при условиях ультранизкой адгезии, составляющей 75 см² на матрас, для культивирования (Согшпд) в МаттоСиН МсДшт (§1стСс11 #05621) с МаттоСиИ РгоПГсгаОоп 5ирр1стсп1 (§1стСс11 # 05622), 5 мкг/мл инсулина, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 100 ед./мл пенициллина и 100 ед./мл стрептомицина. После сбора клетки были диассоциированы в Асситах (компания §1дта) на протяжении 45 мин при температуре 37°С до экстракции РНК, после чего всю РНК поддавали экстракции в соответствии со стандартными методиками. мРНК гастрина определяли количественно посредством применения количественного анализа ΚΤ-ПЦР. Данные выражали по сравнению с уровнями мРНК гастрина, определенными в клетках МИА-МВ-435, которые экспрессируют ген гастрина, уровень которого немного выше обнаруживаемого порогового значения.

В. Результаты.

Результаты показаны на фиг. 10. В клетках МИА-МВ-231 рост при культивировании в условиях низкой адгезии приводит к повышению количества мРНК гастрина в таких клетках, по сравнению с ростом в обычных условиях тканевой культуры. В клетках МСР7 экспрессия гена гастрина была снижена в клетках, выращенных в условиях низкой адгезии, по сравнению с тем же типом клеток, выращенных при обычных условиях.

Пример 9. Действие моноклонального антитела к №О на рост метастатических клеток рака молочной железы в качестве сфероидов, при культивировании в условиях низкой адгезии.

Этот пример описывает действие моноклонального антитела к прогастрину на рост в качестве сфероидов МСР-7 клеточных линий метастатического рака молочной железы, когда такие клетки были выращены при культивировании в условиях низкой адгезии.

Α. Способы.

Клетки МСР-7 высевали в культуральных планшетах с низкой адгезией (500 клеток/лунку) в 500 мкл среды МаттосиН без сыворотки. Каждый день на протяжении 10 дней после высева моноклональные антитела к №О (МАЬ8) или контрольные моноклональные антитела добавляли к среде культуры два раза в день (3 мкг/мл). В конце исследования было посчитано количество сфероидов, которые образовались в присутствии антител к №О и контрольных антител. Исследование было выполнено слепым способом.

Β. Результаты.

Результаты показан на фиг. 11, которые демонстрируют, что рост МСР-7 метастатических клеток рака молочной железы в качестве сфероидов при культивировании в условиях низкой адгезии был снижен в результате обработки моноклональным антителом к №О МАЬ8, по сравнению с обработкой неспецифичным контрольным антителом.

Пример 10. Действие предварительной обработки моноклональным антителом к прогастрину на рост метастатических клеток рака молочной железы в качестве сфероидов при культивировании в условиях низкой адгезии.

Этот пример описывает действие предварительной обработки посредством применения моноклонального антитела к прогастрину на рост в качестве сфероидов МСР-7 клеточных линий метастатического рака молочной железы, когда их выращивали при культивировании в условиях низкой адгезии.

- 29 025329

А. Способы.

Клетки сначала выращивали в обычной адгезивной культуре на протяжении 48 ч, при температуре присутствии моноклонального антитела к ЬРС (ΜΑΒ3) или контрольного моноклонального антитела. В конце обработки 500 клеток/лунку высевали в 24-луночные культуральные планшеты с низкой адгезией в 500 мкл среды Μαιηιηοαιΐΐ без сыворотки и выращивали на протяжении 11 дней без дальнейшей обработки антителом. В конце исследования количество сфероидов на лунку было посчитано.

Β. Результаты.

Результаты показаны на фиг. 12, которые демонстрируют, что предварительная обработка ΜСР-7 метастатических клеток рака молочной железы моноклональным антителом к ЬРС ΜΑΒ3 была эффективной для уменьшения количества сфероидов, образованных такими клетками, когда их культивировали в условиях низкой адгезии без дальнейшей обработки антителом. Поскольку культивирование в условиях низкой адгезии служит для роста раковых стволовых клеток молочной железы, эти результаты указывают, что нейтрализующие антитела против РС эффективны для уменьшения количества таких стволовых клеток на популяцию клеток рака молочной железы. Кроме того, наблюдение, что предварительная обработка специфическими антителами эффективно уменьшает количество раковых стволовых клеток молочной железы, предполагает, что, подвергая новообразования молочной железы действию нейтрализующих антител к ЬРС, может получить длительные эффекты по уменьшению онкогенности стволовых клеток даже после того, как антитела больше не присутствуют.

Пример 11. Количественное определение уровней РС в плазме или сыворотке крови.

Уровни РС в плазме и/или в сыворотке крови могут быть традиционно определены посредством применения следующего исследования. 96-луночные микротитровальные планшеты покрывали количеством в пределах 0,5 и 10 мкг/мл С-концевого антитела к ЬРС, например С-концевого поликлонального кроличьего антитела к ЬРС, или С-концевого антитело к ЬРС, описанного здесь, и затем инкубировали на протяжении ночи. Планшеты затем промывали три раза в ФСБ-Туееп (0,05%) и блокировали 2% (м/о) обезжиренного сухого молока в ФС.'Б-Т\уееп (0,05%). Отдельно, испытательные образцы, контрольные образцы (контрольная проба или образцы РС-негативной плазмы или сыворотки крови), количество в пределах приблизительно 5 пМ (0,5х10^-11 М) и приблизительно 0,1 нМ (1х 10^-10 М) ЬРС стандартного образца (лиофилизованный ЬРС, разбавленный в РС-негативной плазме или сыворотке крови) подготавливали в соответствующем разбавителе (например, ФСБ-Туееп 0,05%). Образцы инкубировали на покрытых пластинах на протяжении промежутка времени между 2 и 4 ч при температуре 37°С или в качестве альтернативы на протяжении промежутка времени между 12 и 16 ч при температуре 21°С. После инкубации планшеты промывали три раза ФСБ-Туееп (0,05%) и инкубировали с количеством в пределах между 0,001 и 0,1 мкг/мл Ν-концевого антитела к ЬРС, например, Ν-концевого поликлонального антитела к ЬРС или Ν-концевого моноклонального антитела к ЬРС, как описано здесь, конъюгированного с пероксидазой хрена (ИКР) (см. №-1капе и др., 1974, 1. ШзЮсЬет. Су!осЬет. 22 (12): 1084-1091) на протяжении 30 мин при температуре 21°С. Планшеты затем промывали три раза в ФСБ-Туееп (0,05%) и субстраты НКР добавляли на протяжении 15 мин при температуре 21°С. Реакцию останавливали посредством добавления 100 мкл 0,5 М серной кислоты и проводили оптическое измерения плотности при 405 нм. Уровень ЬРС испытательного образца определяли по сравнению со стандартной кривой, построенной в соответствии с измерениями, полученными из значений ЬРС стандартного образца.

Пример 12. Анализ ЕЫ8А для определения специфичности антител к ЬРС.

Специфичность антител к ЬРС может быть подходящим образом определена посредством применения анализа ЕЫ8А следующим образом. 96-луночные планшеты инкубировали на протяжении ночи при температуре 4°С с соответствующей концентрацией(ми) испытательного полипептида (например, 25 и 50 нг рекомбинантного человеческого РС, и 50 и 250 нг СТРР или других гастрин-производных генных продуктов) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), после чего лунки промывали три раза промывочным буфером (ФСБ и 0,1% Т\уееп-20) и затем инкубировали на протяжении 2 ч при температуре 22°С с 100 мкл блокирующего буфера (ФСБ, 0,1% Туееп-20. 0,1% бычьего сывороточного альбумина или гидролизата казеина) на лунку. После блокирования лунки промывали три раза и добавляли антитело, подлежащее анализу (тестируемое антитело). 100 мкл тестируемого антитела (от 0,3 до 1 нг/мл) в ФСБ и 0,1% Туееп20 добавляли в каждую лунку. Планшеты затем инкубировали на протяжении 2 ч при температуре 22°С, после чего испытательный раствор антитела сливали и заменяли, после стадии промывки (3х 100 мкл промывочным буфером, как отмечено выше) на блокирующий буфер, содержащий вторичное антитело, козье антимышиное антитело 1дС (Рс), соединенное с пероксидазой хрена. После 1 ч инкубации с вторичным антителом 100 мкл субстратного раствора (например, Раз! ОРЭ, или О-фенилендиамина дигидрохлорид, коммерчески доступный от компании Еадта-АИпсЬ Со., приготовленный в соответствии с указаниям изготовителя) добавляли в каждую лунку и инкубировали в темноте на протяжении 20 мин при температуре 22°С. Реакцию останавливали при помощи добавления 50 мкл 4Ν серной кислоты и количество катализованного субстрата определяли посредством измерения оптической плотности (О.П.) при 492 им. Преобразование субстрата пропорционально количеству первичного (тестируемого) антитела, связанного с антигеном. Исследования проводят в двух параллельных опытах и установленные зна- 30 025329 чения О.П. представляют графически как функцию концентрации антигена. Тестируемые антитела отмечают как специфические к РО, если значение О.П. находится в пределах между 0,2 и 1,5 в отношении ЬРО и отсутствует статистически значимый сигнал выше фона, содержащего СТРР, или любые другие пептиды, полученные из гена гастрина, где фон представляет собой средний сигнал от контрольных лунок, содержащих только ФСБ.

Пример 13. Исследование для определения нейтрализующей активности антител к ЬРО.

Особый тест для определения того, является ли нейтрализующим конкретное антитело к ЬРО, может быть выполнен следующим образом. Клетки рака молочной железы высевали в 6-луночный планшет, где количество клеток составляло приблизительно 50000-100000 клеток на лунку. Клетки затем обрабатывали тестируемым антителом к ЬРО или контрольным антителом, где концентрация антитела составляла приблизительно 10 мкг/мл, с интервалом в 12 ч на протяжении 48 ч. В исследовании тестируемое антитело определяют как нейтрализующее, если количество клеток, обработанных испытательным антителом, показывает статистически значимое уменьшение по крайней мере на 10% количества жизнеспособных клеток, по сравнению с количеством клеток, обработанных контрольным антителом, неспецифичным антителом посредством применения двустороннего теста Манна-Уитни (с разницей, считающейся существенной, когда р <0.05). Общее количество клеток корректируют с количеством клеток в начале периода обработки, которое упоминается как Т₀. Образцовые клетки рака молочной железы для применения в этом исследовании включают, но не ограничиваются ими, клетки ΜΌΑ-ΜΒ-231 и клетки МСР7.

Пример 14. Исследование для определения аффинности антитела к ЬРО.

Константы аффинности антител к ЬРО могут быть установлены посредством применения методики РгсЯеоп (компания ВюКай) в соответствии с ЫаЬ8Ьо1 и др., 2008, Апа1уйса1 ВюсЬепиДгу 383:52-60, включенной здесь посредством ссылки в полном объеме. Если коротко, то для мышиных антител к РО, антимышиное антитело 1дС (50 мкг/мл) сначала наносили на сенсорный чип, убеждаясь, что сигнал, определяемый чипом после инъекции антитела, находится между 10000 и 11500 единиц ответа (ЕО). Затем вводили мышиное антитело к ЬРО, которое представляет интерес (тестируемое антитело) (при обычной концентрации 30 мкг/мл). Если тестируемое антитело связывает достаточно, то будет наблюдаться дополнительный сигнал, составляющий по крайней мере 500 ЕО. Затем получают динамику связывания между тестируемым антителом и ЬРО с помощью введения различных концентраций ЬРО, например 200, 100, 50, 2 и 12,5 нМ, и определяют степень связывания. Как правило, для того чтобы протестировать многочисленные антитела, параллельно в одном исследовании, доступно несколько каналов, позволяя оценить связывание одного тестируемого антитела при различных концентрациях ЬРО параллельно. В один канал может быть введено мышиное моноклональное антителом, которое не является специфичным по отношению к ЬРО, в качестве контроля для неспецифичного связывания, и в другой канал может быть введен один только буферный раствор как основа для фонового сигнала. Как правило, в канале, в который ввели неспецифичное мышиное антитело, связывания не выявляют. Антитела, показывающие высокую степень связывания при этих параметрах, что может проявляться в насыщенности связанного с ЬРО моноклонального антитела, могут быть протестированы с применением более низких концентраций ЬРО (50, 25, 12,5, 6,25 и 3,125 нМ), допуская более точное измерение.

Константы аффинности (К_с) вычисляют как соотношение между константой диссоциации (к_й) и константой ассоциации (к_а). Экспериментальные значения могут быть обоснованы посредством анализа статистически соответствующего подобия между экспериментальными кривыми, основанными на измерениях связывания и теоретических параметрах.

Константы аффинности немышиных антител к ЬРО могут быть установлены подобным образом посредством применения 1дО, специфичных для видов происхождения тестируемого антитела к ЬРО.

Пример 15. Исследование для определения конкурентного связывания с эталонным антителом к

ЬРО.

Специфическое исследование для определения того, подходит ли антитело, которое представляет интерес (тестируемое антитело), для конкурентного связывания ЬРО с биотинилированным эталонным антителом к ЬРО, может быть выполнено следующим образом. 96-луночные планшеты покрывали иммобилизованным антителом к ЬРО (поликлональное или моноклональное антитело, распознающее Ν- или С-концевую область ЬРО, которая отличается от антигенной детерминанты, распознаваемой биотинилированным эталонным антителом к ЬРО), при концентрации, которую выбирают в пределах 1-10 мкг/мл, на протяжении ночи при температуре 4°С (0,1-1 мкг/лунку). После блокирования с помощью блокирующего буферного раствора (0,1% Т\уееп-20, 0,1% БСА в ФСБ) на протяжении 2 ч при температуре 22°С, добавляли рекомбинантный ЬРО при концентрации, находящейся в пределах между 10 пМ-1 нМ (101000 пг/лунку) и инкубировали на протяжении 2 ч при температуре 22°С. После этого добавляли биотинилированное эталонное антитело к ЬРО (или смесь, содержащую биотинилированное эталонное антитело к ЬРО) вместе с увеличивающимися концентрациями немеченого тестируемого антитела и инкубировали на протяжении 1 ч при температуре 22°С. После промывания, для того чтобы удалить несвязанные антитела, осуществляли выявление связанного меченого эталонного антитела к ЬРО, посредством инкубирования смеси с 50 нг/мл стрептавидин-НКР на протяжении 1 ч при температуре 22°С, затем следова- 31 025329 ла инкубация с флуорогенным субстратом для пероксидазы хрена, и затем определяли количество относительных световых единиц (ОСЕ) в люминометре. Исследование осуществляли в двух параллельных опытах.

Антитела, которые конкурируют с эталонным антителом к 1РО, ингибируют связывание эталонного антитела к 1РО. Антитело, которое связывается в основном с той же антигенной детерминантой, или с перекрывающейся антигенной детерминантой, как эталонное антитело значительно снижает (например, по крайней мере на 50%) количество связанного эталонного антитела к 1РО, что подтверждается уменьшением наблюдаемого количества ОСЕ.

Высокое контрольное значение получают из контрольного исследования, которое выполняют посредством инкубирования меченого эталонного антитела с рекомбинантным 1РО без тестируемого антитела. Низкие контрольные значения получают из контрольного исследования, которое выполняют посредством инкубирования меченого эталонного антитела с рекомбинантным 1РО в присутствии превышающих концентраций немеченого эталонного антитела (немеченое эталонное антитело, таким образом, конкурирует с меченым антителом за связывание с 1РО). Способность тестируемых антител конкурировать с эталонным антителом к 1РО затем определяют посредством инкубирования меченого эталонного антитела с рекомбинантным 1РО в присутствии повышенных концентраций немеченого тестируемого антитела.

В проведенном исследовании значительное уменьшение наблюдаемого количества ОСЕ в присутствии тестируемого антитела демонстрирует, что тестируемое антитело распознает в основном ту же антигенную детерминанту, что и эталонное антитело к 1РО.

Ингибирование связывания может быть выражено как константа ингибирования, или К₁, которую вычисляют в соответствии со следующей формулой:

К., = ИКу) / (1 + ([концентрация АЬ эталонного антитела к НРО]/ Кг;^{АЬ этал}’^{нного акткла к} где ИК₅₀ представляет собой концентрацию тестируемого антитела, которая приводит к 50%-му снижению связывания эталонного антитела, и К_С ^{АЬ эталонного антитела} к ь^рО представляет собой константу диссоциации эталонного антитела к 1РО, степень его аффинности к 1РО. Полезные тестируемые антитела, которые конкурируют с эталонным антителом к 1РО (например, одно из антител к 1РО, описанных здесь), обычно будут иметь К₁к, которое варьируется в пределах от 10 пМ до 100 нМ при условиях исследования, описанных здесь.

Все публикации, патенты, заявки на патент и другие документы, процитированные в этом документе, включены здесь полностью посредством ссылки во всех смыслах в одинаковой степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент, заявка на патент, или другой документ были бы отдельно указаны для того, чтобы быть включенными посредством ссылки во всех смыслах.

При том, что различные конкретные варианты осуществления были проиллюстрированы и описаны, следует понимать, что различные модификации могут быть осуществлены, не выходя за рамки сущности и объема изобретения(й).

- 32 025329

Перечень последовательностей <110> БИОРИАЛИТЕ С.А.С.

<120> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ <130? 332657-006МО (105305) <150? 61/293,612 <151? 2010-01-08 <160;· 106 <170? РаЬепЫп уегзгоп 3.5 <210? 1 <211? 8 <212? РЕТ <213> Искусственная Последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 1 <31у Туг Не РЬе ТЬг Зег Туг Тгр

5 <210? 2 <211? 8 <212> РЕТ <213> Искусственная Последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический <400? 2

РЬе Туг Рго О1у Азп Зег Азр Зег

5 <210? 3 <211? 8 <212? РЕТ <213> Искусственная Последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 3

ТЬг Агд Агд Авр Зег Рго С1п Туг 1 5 <210? 4 <211? 11 <212? РЕТ <213> Искусственная Последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

- 33 025329 <400» 4 αΐη Зег Не Уа1 Ηίε Зег Азп С1у Аеп ТЬг Туг 15 10 <210» 5 <211» 3 <212» РКТ <213> Искусственная Последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400» 5

Ьуз Уа1 Зег <210» 6 <211» 3 <212» РКТ <213> Искусственная Последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400» 6

РЬе <31п С1у Зег Шз Уа1 Рго РЬе ТЬг

5 <210» 7 <211» 8 <212» РКТ <213> Искусственная Последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400» 7

С1у Туг ТЬг РЬе Зег Зег Зег Тгр

5 <210» 8 <211» 8 <212» РКТ <213» Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400» 8

РЬе Ьей Рго С1у Зег Е1у Зег ТЬг

5

- 34 025329 <210» 9 <211» 11 <212» РКТ <213> Искусственная Последовательность <220» <223> Описание пептид искусственном последовательности: синтетическим <400» 9

А1а ТНг Азр СЬу Азп Туг Азр Тгр РНе А1а Туг 15 10 <210» 10 <211» 11 <212» РКТ <213> Искусственная Последовательность <220» <223> Описание пептид искусственной последовательности; синтетическим <400» 10 <31п Бег Ьеи Уа1 Н1з Бег Бег С1у Уа1 ТНг Туг 15 10 <210» 11 <211» 9 <212» РКТ <213> Искусственная Последовательность <220» <223> Описание пептид искусственной последовательности: синтетический <400» 11

Бег С1п Бег ТНг Н1з 7а 1 Рго Рго ТНг 1 5 <210» 12 <211» 115 <212» РКТ <213> Искусственная Последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400» 12

С1и Уа1 С1п Ьеи С1п О1п Бег С1у ТНг 1/а1 Ьеи А1а Агд Рго С1у А1а 15 10 15

Бег Уа1 Ьуз МеЬ Бег Суз Ьуз А1а Бег С1у Туг Не РЬе ТЬг Бег Туг 20 25 30

- 35 025329

Тгр УаЬ Ηί3 Тгр УаЬ	Ьуз СЬп Агд 40	Рго	СЬу СЬп СЬу	Ьеи 45	СЬи	Тгр	Не
	35
СЬу СЬу	РЬе Туг Рго	СЬу Азп Зег	Азр	Зег Агд Туг	АЗП	СЬп	Ьуз	РЬе
50		55		60
Ьуз СЬу	Ьуз А1а ТЬг	Ьеи ТЬг А1а	УаЬ	ТЬг Зег АЬа	Зег	ТЬг	АЬа	Туг
65		70		75				80
МеС Азр	Ьеи Зег Зег	ьеи ТЬг Азп	СЬи	Азр Зег А1а	УаЬ	Туг	РЬе	Сув
	85			90			95
ТЬг Агд	Агд Азр зег	Рго СЬп Туг	Тгр	О1у αΐη сьу	ТЬг	ТЬг	ьеи	ТЬг
	100		105			но
УаЬ Зег	Зег
	115
<210> 13
<211> 112
<212> РЕТ
<213> Искусственная	Последовательность

<220>

<223> ЬОписание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 13

Азр УаЬ Ьеи Ме! ТЬг СЬп ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Рго УаЬ Зег Ьеи СЬу 15 10 15

Азр СЬп А1а Зег 11е Зег Сув Агд Зег Зег 31η Зег Не УаЬ НЬз Зег 20 25 30

Азп СЬу Азп ТЬг Туг ьеи <31и тгр Туг Ьеи СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп Зег 35 40 45

Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг Ьуз УаЬ Зег Азп Агд РЬе Зег С1у УаЬ Рго 50 55 60

Азр Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Зег Агд Ьеи СЬи А1а СЬи Азр Ьеи СЬу УаЬ Туг Туг Суз РЬе СЬп СЬу 85 90 95

Зег Ηί3 УаЬ Рго РЬе ТЬг РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи Т1е Ьуз

100 105 110 <210> 14

-=211=. не <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

с400ь 14

О1п 1

Уа1

С1п

Ьеи

С1п 5

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и 10

Ьеи

МеС

Ьуз

Рго

01у 15

А1а

зег

Уа1

Ьуз

Не 20

Зег

Суз

Ьуз

А1а

ТЬг 25

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

Зег 30

Зег

Зег

Тгр

Не

О1и 35

Тгр

Ьеи

Ьуз

61п

Агд 40

Рго

С1у

НЬз

С1у

Ьеи 45

С1и

Тгр

Не

сз1у

<31и 50

РЬе

Ьеи

Рго

61у

Зег 55

С1у

Зег

ТЬг

Азр

Туг 60

Азп.

С1и

Ьуз

РЬе

Ьуз 65

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

РЬе 70

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

Зег 75

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Туг 30

МеС

Ьеи

Ьеи

Зег

Зег 35

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Аар 90

Зег

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

ТЬг

Азр

О1у 100

АЗП

Туг

Азр

тгр

РЬе 105

А1а

Туг

Тгр

С1у

<31п 110

Й1у

ТЬг

Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а 115 <210> 15 <211> 112 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400=- 15

Азр Ьеи Уа1 МеС ТЬг С1п ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 зег ьеи С1у 15 10 15

Азр <31п А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи Уа1 НЬз Зег 20 25 30

- 37 025329

Зег

СЬу УаЬ 35

ТЬг

Туг

Ьеи

ΗΪ3

Тгр 40

Туг

Ьеи

СЬп

ьуз

Рго 45

СЬу

СЬп

Зег

Рго

Ьув Ьеи

ьеи

Не

Туг

Ьув

УаЬ

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

50

55

60

Азр 65

Агд РЬе

Зег

СЬу

Зег 70

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр 75

РЬе

ТЬг

Ьеи

ьуз

Ые 80

Зег

Агд УаЬ

СЬи

А1а 85

СЬи

Авр

Ьеи

СЬу

УаЬ 90

Туг

РЬе

Суз

Зег

СЬп 95

Зег

ТНг

НЬз УаЬ

Рго 100

Рго

ТЬг

РЬе

СЬу

Зег 105

СЬу

ТЬг

Ьуз

ьеи

СЬи 110

Ые

Ьуз

<210> 16 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>

<221> СИЗ <222> (1)..(345) <400> 16

дад СЬи 1

дЕЕ УаЬ

сад сЕс

сад СЬп 5

сад СЬп

ЕсЕ Зег

ддд асЕ

дед УаЬ 10

СЕд Ьеи

дса АЬа

адд Агд

ССЕ Рго

ддд СЬу 15

дсЕ АЬа

48

СЬп

Ьеи

СЬу

ТЬг

Есс

дЕд

аад

аЕд

ЕСС

Еде

аад

дсЕ

ЕСЕ

ддс

Еас

аЕс

ЕЕЕ

асе

аде

Еас

96

Зег

УаЬ

Ьув

МеЕ

Зег

Суз

Ьуз

АЬа

Зег

СЬу

Туг

ЬЬе

РЬе

ТЬг

зег

Туг

20

25

30

едд

дЕа

сас

Едд

дсс

ааа

сад

адд

ссЕ

дда

сад

ддс

сЕа

даа

едд

аЕЕ

144

Тгр

УаЬ

НЬз

Тгр

УаЬ

Ьув

СЬп

Агд

Рго

СЬу

СЬп

СЬу

Ьеи

СЬи

Тгр

ЬЬе

35

40

45

ддс

ддс

ЕЕЕ

ЕаЕ

ссЕ

дда

ааЕ

адЕ

даЕ

ЕсЕ

адд

Еас

аас

сад

ааа

ЕЕС

192

(ЗЬу

СЬу

РЬе

Туг

Рго

СЬу

Азп

Зег

Азр

Зег

Агд

Туг

Азп

СЬп

Ьуз

РЬе

50

55

60

аад

ддс

аад

дсс

аса

сЕд

асЕ

дса

дсс

аса

Есс

дсс

адЕ

асЕ

дсс

Еас

240

Ьув

СЬу

Ьув

АЬа

тЬг

Ьеи

ТЬг

АЬа

УаЬ

ТЬг

Зег

АЬа

Зег

тЬг

АЬа

Туг

65

70

75

80

аЕд

дас

сЕс

аде

аде

сЕд

аса

ааЕ

дад

дас

ЕСЕ

дед

дЕс

ЕаЕ

ЕЕС

сдс

288

МеЕ

Авр

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Азп

СЬи

Азр

зег

АЬа

УаЬ

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

- 38 025329 аса ада ада даР адр ссс сад Рас Рдд ддс саа ддс асе асР сРс аса 336

ТЬг Агд Агд Азр Зег Рго С1п Туг Тгр <31у С1п СЯу ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг

100 105 110 дрс Рсс Рса 345

Уа1 Зег Зег

115 <210> 17 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>

<221> СПЗ <222> (1)..(336) <400> 17 даР дРР РРд асд асе саа асР сса сРс Рсс сРд сер дрс адр сРР дда 48

Аар 17а1 Ьеи Мер ТЬг <31п ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Рго УаЬ Зег Ьеи С1у

10 15 даР саа дсс Рсс аРс РсР Рдс ада РсР адр сад аде аРР дра саР адр 96

Азр О1п А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег 11е 37а1 Н1з Зег

25 30 ааР дда аас асе РаР РРа даа Рдд Рас сРд сад ааа сса ддс сад РсР 144

Азп С1у Азп ТЬг Туг Ьеи С1и Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз Рго С1у Θΐη Зег

40 45 сса аад сРс сРд аРс Рас ааа дРР Рсс аас еда РРР РсР ддд дрс сса 192

Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Ьуз Уа1 Зег Азп Агд РЬе зег С1у з/а1 Рго

55 60 дас адд РРс адр ддс адр дда Рса ддд аса даР РЬе аса сРс аад аРс 240

Аер Агд РЬе Зег О1у Зег О1у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз Не

70 75 80

аде Зег

ада Агд

сРд дад

дсР А1а 85

дад <31и

даР Азр

сРд дда дрр Ьеи С1у Уа1 90

РаР Туг

Рас Туг

Рдс Суз

РРР РЬе

саа С1п 95

ддь О1у

288

Ьеи

С1и

Рса

саР

дРР

сед

РРс

асд

РРс

дда

ддд

ддд

асе

аад

сРд

даа

аРа

ааа

336

Зег

Нтз

Уа1

Рго

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

<31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

О1и

Не

Ьуз

100

105

НО

<210> 18 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность с220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

- 39 025329

<220? <221? СБЗ <222? (1),.

(354)

<400? 18

сад

дСС

сад

ссд

сад

сад

СсС

дда

дсС

дад

сСд

аСд

аад

сса

ддд

дсс

48

С1п

Ца1

С1п

Ьеи

σΐη

01п

Зег

С1у

А1а

С1и

Ьеи

МеС

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Сса

дьд

аад

аСа

Ссс

Сдс

аад

дсС

асС

ддс

Сас

аса

ССс

адС

аде

Ссс

96

бег

Ца1

Ьуз

Не

Зег

Суз

Ьуз

А1а

ТЬг

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

Зег

Бег

Зег

20

25

30

Сдд

аСа

дад

Сдд

ССа

ааа

сад

адд

ссС

дда

саС

ддс

ССС

дад

Сдд

аСС

144

Тгр

Не

С1и

Тгр

Ьеи

Ьуз

С1п

Агд

Рго

С1у

ΗΪ3

С1у

Ьеи

О1и

Тгр

Не

35

40

45

дда

дад

ссс

ССа

ссС

дда

адС

ддь

адС

аса

дас

Сас

ааС

дад

аад

ссс

192

С1у

<31и

РЬе

Ьеи

РГО

61у

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Азр

Туг

Азп

С1и

Ьуе

РЬе

50

55

60

аад

ддс

аад

дсс

аса

ССС

ас С

дса

дас

аса

Ссс

Ссс

дас

аса

дсс

Сас

240

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

РЬе

ТЬг

А1а

Азр

ТНг

Зег

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

аСд

сСа

сСс

аде

аде

сСд

аса

СсС

дад

дас

СсС

дсс

дСс

СаС

Сас

сдс

288

МеС

Ьеи

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дса

асС

да С

ддс

аас

СаС

дас

Сдд

ссс

дсС

Сас

Сдд

ддс

саа

ддд

асС

336

А1а

ТЬг

Азр

С1у

Азп

Туг

Азр

Тгр

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

110

сСд дес асС дСс СсС дса 354

Ьеи 1/а1 ТЬг Уа1 Зег А1а

115 <210> 19 <211? 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222? (1)..(336) <400> 19

даС Азр 1

сСС Ьеи

дед Уа1

аСд МеС

асе ТЬг 5

саа С1п

асС ТЬг

сса Рго

сСс Ьеи

Ссс Зег 10

сСд Ьеи

ссС Рго

дсс Ца1

адС Зег

сСС Ьеи 15

дда С1у

48

даС

саа

дсс

Ссс

аСс

СсС

Сдс

ада

СсС

адС

сад

аде

ССС

дСа

сас

адС

96

Азр

О1п

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Уа1

ΗΪ8

Зег

20

25

30

- 40 025329

адЬ дда Бег С1у

дЬс Уа1 35

асе ТЬг

ЬаЬ Туг

ььа саЬ Ьец Нгз

Ьдд Ьас Тгр Туг 40

сЬд Ьей

сад аад сса

ддс <31у

сад О1п

ЬсЬ Зег

144

<31п

Ьуз

Рго 45

сса

аад

сЬс

сЬд

аЬс

Ьас

ааа

дЬЬ

Ьсс

аас

еда

ььь

ЬсЬ

ддд

дьс

сса

192

Рго

Ьуз

Ьей

Ьей

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Бег

Аеп

Агд

РЬе

Бег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

дас

адд

ЬЬс

аде

ддс

адЬ

дда

Ьса

ддд

аса

даь

ььс

аса

СЬС

аад

аьс

240

Азр

Агд

РЬе

Бег

С1у

Бег

С1у

Бег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьей

Ьуз

Не

65

70

75

80

аде

ада

дГд

дад

дсЬ

дад

да Г

сЬд

дда

дЬЬ

ьаь

ЬЬС

Где

ЬСЬ

саа

адЬ

288

Бег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьей

С1у

Уа1

Туг

РЬе

Суз

Бег

51п

Зег

85

90

95

аса

саЬ

дЬЬ

ССЬ

ссс

асд

ЬЬс

ддс

ьед

ддд

аса

аад

¢69

даа

аЬа

ааа

336

ТЬг

Нгз

Уа1

Рго

Рго

ТЬг

РЬе

С1у

Бег

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьей

<31ц

Не

Ьуз

100

105

110

<210> 20 <211> 80 <212» РКТ <213> Ното заргепз

<400> 20
Бег Тгр Ьуз	Рго Агд Бег О1п 61п	Рго Азр А1а	Рго Ьей С1у ТЬг С1у
1	5	10	15

А1а Азп Агд Азр Ьей О1и Ьей РГО Тгр Ъеи С1и С1п С1п О1у Рго А1а 20 25 30

Зег Нгз Нгз Агд Агд О1п Ьей 61у Рго С1п С1у Рго Рго Нгз Ьей Уа1 35 40 45

А1а Азр Рго Зег Ьуз Ьуз αΐη <31у Рго Тгр Ьец 01ц 01и 61и О1и 01и 50 55 60

А1а Туг О1у Тгр МеЬ Азр РЬе О1у Агд Агд Зег А1а 01ц Азр С1и Азп 65 70 75 80 <210> 21 <211> 115 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 21 <31п Уа1 31п Ьей Уа1 С1п Бег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а 15 10 15

- 41 025329

Зег Уа1 Ьуз	Уа1 20	Зег Суз Ьуз А1а Зег 25	С1у Туг	Пе	РЬе	ТЬг 30	Зег	Туг
Тгр Уа1 Н1з 35	Тгр	Уа1 Агд Οίη А1а Рго 40	С1у 61п	Агд	ьеи 45	61и	Тгр	Мес
С1у 61у РНе 50	туг	Рго С1у Азп Зег Азр 55	Зег Агд	Туг 60	Зег	б1п	Ьуз	РЬе
С1п С1у Агд 65	Уа1	ТЬг Не ТЬг Агд Азр 70	ТЬг Зег 75	А1а	Зег	ТЬг	А1а	Туг 80
МеС 61и Ьеи	Зег	Зег Ьеи Агд Зег 61и 85	Аер ТЬг 90	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
ТЬг Агд Агд Азр Зег Рго 61п Туг Тгр 61у 61п 100 105 \7а1 Зег Зег 115 <210> 22 <211> 112 <212 > РЕТ <213> Искусственная последовательность	О1у	ТЬг	Ьеи 110	Уа1	ТЬг

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид <400> 22

Азр 1

Уа1

Уа1

Мес

ТЬг 5

αΐη

Зег

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

νβΐ

ТЬг

Ьеи 15

61у

61п

Рго

А1а

Зег 20

Пе

Зег

Суз

Агд

Зег 25

Зег

61п

Зег

Пе

Уа1 30

ΗΪ8

Зег

Азп

С1у

Азп 35

ТЬг

Туг

Ьеи

С1и

Тгр 40

РЬе

С1п

61п

Агд

Рго 45

С1у

С1п

Зег

Рго

Агд 50

Агд

ьеи

Пе

Туг

ьуз 55

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе 60

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр 65

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег 70

61у

Зег

С1у

ТЬг

Азр 75

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Пе 80

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а 85

61и

Азр

Уа1

61у

Уа1 90

Туг

Туг

Суз

РЬе

61 п 95

61у

- 42 025329

Зег Ηίβ УаЬ Рго РЬе ТЬг РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз 100 105 110 <210> 23 <211> 118 <212> РКТ <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический олипептид

<400> 23

СЬп 1

УаЬ

СЬп

Ьеи

УаЬ 5

СЬп

Зег

СЬу

АЬа

СЬи 10

УаЬ

Ьуз

Ьуз

Рго

СЬу 15

АЬа

Зег

УаЬ

Ьуз

УаЬ 20

Зег

Суз

Ьуз

АЬа

Зег 25

СЬу

Туг

ТЬг

РЬе

Зег 30

Зег

Зег

Тгр

МеЬ

НЬз 35

Тгр

УаЬ

Агд

СЬп

АЬа 40

Рго

СЬу

СЬп

СЬу

ьеи 45

СЬи

тгр

МеЬ

СЬу

Не 50

РЬе

Ьеи

Рго

СЬу

Зег 55

СЬу

Зег

ТЬг

Азр

Туг 60

АЬа

СЬп

Ьуз

РЬе

СЬп 65

СЬу

Агд

УаЬ

ТЬг

МеЬ 70

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег 75

ТЬг

Зег

ТЬг

УаЬ

Туг 80

МеЬ

СЬи

Ьеи

Зег

Зег 85

Ьеи

Агд

Зег

СЬи

Азр 90

ТЬг

АЬа

УаЬ

Туг

Туг 95

Суз

А1а

ТЬг

Азр

СЬу 100

Азп

Туг

Азр

Тгр

РЬе 105

АЬа

Туг

Тгр

СЬу

СЬп НО

СЬу

ТЬг

Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 <210> 24 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 24

Авр 11е УаЬ МеЬ ТЬг СЬп ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Зег УаЬ ТЬг Рго <31у 15 10 15

С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег СЬп Зег Ьеи УаЬ Н1з Зег 20 25 30

- 43 025329

Зег

СХу

УаХ 35

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр 40

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго 45

СХу

СХп

Зег

Рго

ОХп 50

Ьеи

ьеи

Не

Туг

Ьуз 55

УаХ

Зег

Азп

Агд

РНе 60

Зег

СХу

УаХ

Рго

Аар 65

Агд

РНе

Зег

С1у

Зег 70

С Ху

Зег

С1у

ТЬг

Азр 75

РНе

ТНг

Ьеи

Ьуз

11е 80

Зег

Агд

УаХ

С1и

А1а 85

С1и

Авр

УаХ

С1у

УаХ 90

Туг

Туг

Суз

Зег

С1п 95

Зег

ТНг

ΗΪ3

Уа1

Рго 100

Рго

ТНг

РНе

С1у

С1п 105

СХу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СХи 110

1Хе

Ьуз

<210> 25 <211> 14 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 25 зег тгр Ьуз Рго Агд Зег С1п С1п Рго Азр А1а Рго Ьеи С1у 15 10 <210> 26 <211> 16 с212> РКТ <213> Искусственная последовательность икусственный пептид <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>

<221ь МОО_КЕ5 <222> (15)..(15) <223> АНх <400> 26

Зег Тгр Ьуз Рго Агд Зег С1п С1п Рго Авр АХа Рго Ьеи С1у Хаа Суз 15 10 15 <210> 27 <211> 26 с212> РКТ •;213> Ното заргепз <400> 27

СХп СХу Рго Тгр Ьеи СХи СХи С1и СХи <31и А1а Туг СХу Тгр МеГ Авр 15 10 15

- 44 025329

РЬе С Ту Агд Агд Зег А1а С1и Азр С1и Азп 20 25 <210> 28 <211? 5 <212> РРТ <213? Ното зархепз <400? 28

Азр А1а Рго Ьеи С Ту <210? 29 <211? 6 <212? РКТ <213> Ното зархепз <400? 29

Рго Азр А1а Рго Ьеи <31у 1 5 <210> 30 <211> 7 <212? РКТ <213? Ното зархепз <400? 30

Рго Агд Зег СТп СТп Рго Азр <210? 31 <211? 9 <212? РКТ <213? Ното зархепз <400? 31

Тгр Ьуз Рго Агд Зег Θΐη 6ΐη Рхо Аар 1 5 <210? 32 <211? 13 <212> РКТ <213? Ното зархепз <400? 32

Тгр Ьуз Рго Агд Зег СТп СТп Рго Азр А1а Рго Ьеи СТу

10 <210? 33 <211? 4 <212? РКТ <213? Ното зархепз <400? 33

РЬе СТу Агд Агд

- 45 025329 <210> 34 <211> 5 <212> РЕТ <213 > Ното зартепз <400> 34

МеС Азр РЬе С1у Агд

5 <210> 35 <211> 5 <212> РКТ <213 > Ното зартепз <400> 35

А1а 01и Азр 01и Азп 1 5 <210> 36 <211> 3 <212> РЕТ <213> Ното зар1епз <400> 36

01у Тгр МеЬ Азр РЬе С1у Агд Агд 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание пептид искусственной последовательности: синтетический <400> 37

С1у РЬе ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг А1а

5 <210>

<211>

<212>

<213>

<220=>

<223>

РЕТ

Искусственная последовательность

Описание пептид искусственной последовательности: синтетический <400> 38

О1у РЬе Не РЬе Бег Бег Туг С1у <210> 39

- 46 025329 <211> 8 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Искусственная последовательность с220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 39

С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг Туг

5 <210> 40 <211> 9 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 40 <31 у Туг Зег 11е ТЬг Зег Азр Туг А1а

5 <210э 41 <211=> 8 <212ь РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 41

11е Зег Зег <31у С1у ТЬг Туг ТЬг

5 <210ь 42 <211> 8 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400э 42

Не Азп ТЬг РЬе С1у Азр Агд ТЬг

5 <210> 43 <211> 8 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; синтетический

- 47 025329 пептид <400> 43

Не Азп Рго Зег Азп С1у СЯу ТЬг 1 5 <210> 44 <211=· 7 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 44

11е Зег РЬе Зег <31у Туг ТЬг

1	5
<210> 45 <211> 10 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание	искусственной последовательности: синтетический
пептид <400> 45 А1а ТЬг С1п С1у	Азп Туг Зег Ьеи Азр РЬе
1	5 10

<210> 46 <211> 7 <212 > РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 46

А1а Агд <31у ТЫ С1у ТЬг Туг

5 <210> 47 <211> 10 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 47

ТЬг Агд С1у <31у Туг Туг Рго РЬе Азр Туг

10

- 48 025329 <210? 48 <211? 14 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <220?

<22 3> Описание пептид искусственном последовательности: синтетическим <400? 48

А1а Адд С1и Уа1 Азп Туг О1у Азр Бег Туг Ндз РЬе Азр Туг 15 10 <210? 49 <211? 11 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание пептид искусственном последовательности: синтетическим <400? 49

Ьуз Бег Ьеи Агд Н13 ТЬг Ьуз С1у Не ТЬг РЬе 15 10 <210? 50 <211? 11 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание пептид искусственном последовательности: синтетическим <400? 50

С1п Зег Ьеи ьеи Азр Бег Азр С1у Ьуз тЬг туг 15 10 <210? 51 <211? 7 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> ОезсгίρΟίοη. о£ Искусственная последовательность: ЗупЬЬеНс рерЫЬе <400? 51

Бег О1п НЬз Агд ТЬг Туг ТЬг <210? 52 <211? 3 <212? РКТ <213? Искусственная последовательность

- 49 025329 <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 52

С1п МеС Зег <210? 53 <211? 3 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <22 0?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 53

Ьеи Уа1 Зег <210? 54 <211? 7 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 54

А7а1 Ьуз Ьуз Азр С1у Зег Н1з

5 <210? 55 <211? 9 <212? РКТ <213? Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400? 55

А1а О1п Азп Ьеи 01и Ьеи Рго Ьеи ТЬг

5 <210? 56 <211? 9 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> ЬОписание искусственной последовательности: синтетический пептид

- 50 025329 <400> 56

Тгр <31п Н1у ТЬг Н1й РЬе Рго С31п ТЬг 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> РКТ <213> АИскусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид е400> 57

Тгр С1п С1у ТЬг Нхз Зег Рго Туг ТЬх

5 <210> 58 <211> 13 с212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 58

С1у Уа1 С1у Азр А1а Не Ьуз О1у С1п Зех Уа1 РЬе Уа1

10 <210> 59 <211> 117 <212 > РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 59

51и Уа1 <31п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у С1у С1у Ьеи Уа1 Ьуе Рго <31у С1у 15 10 15

Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Сув А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬх РЬе ТЬг ТЬг Туг 20 25 30

А1а Мех Зех Тгр Уа1 Агд С1п ТЬх Рхо <31и Ьуз Агд Ьеи <31и Тгр Уа1 35 40 45

А1а ТЬх 11е Зег Зег О1у С1у ТЬх Тух ТЬх Тух Тух Рхо Азр Зех Уа1 50 55 60

Ьуз <31у Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

А1а

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи <31п МеС

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Бег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

МеС

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а ТЬг С1п

С1у

Азп

туг

Зег

Ьеи

Азр

РЬе

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Зег

100

105

110

ьеи ТЬг Уа1

Зег

Зег

115

<210> 60

<211> 114

<212> РКТ

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 60

С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 61и Зег С1у <31у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго <31у <31у 15 10 15

Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Не РЬе Зег Зег Туг 20 25 30

61у МеС Зег Тгр Уа1 Агд С1п Зег Рго Азр Агд Агд Ьеи С1и Ьеи Уа1 35 40 45

А1а Зег 11е Азп ТЬг РЬе 01у Азр Агд ТЬг Туг Туг Рго Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи С1п МеС ТЬг Зег Ьеи Ьуз Зег С1и Азр ТЬг А1а Не Туг Туг Суз 85 90 95

А1а Агд <31у ТЬг С1у ТЬг Туг Тгр О1у О1п <31у ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 100 105 110

Зег Бег <210> 61 <211> 117 <212> РКТ <213> Искусственная Последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 61

61п Уа1 С1п Ьеи С1п <31п Зег С1у А1а С1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у А1а 15 10 15

Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 25 30

Туг Мед Туг Тгр 17а1 Ьуз С1п Агд Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр Не 35 40 45

С1у Б1и Не Азп Рго Зег Азп О1у С1у ТЬг Азп РЬе Азп С1и Ьуз РЬе 50 55 60

Ьуз Зег Ьуа А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 75 80

Мед С1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег 61и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

ТЬг Агд <31у С1у Туг Туг Рго РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг 100 105 110

Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 62 <211> 121 <212> РКТ <213> Искусственная Последовательность <220>

<223> ООписание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 62

Азр Уа1 Οίη Ьеи 61п С1и Зег С1у Рго О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег <31п 15 10 15

- 53 025329

МеЬ

С1у 50

Туг

Пе

Зег

РЬе

Зег СЬу Туг ТЬг 55

Зег

Туг 60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Не

Зег

УаЬ

ТЬг Агд Азр ТЬг

Зег

Агд

Азп

О1п

РЬе

РЬе

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Ьеи

ТЬг

Зег

УаЬ

ТЬг ТЬг СЬи Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

СЬи

УаЬ

Азп

Туг

СЬу Азр Зег Туг

НЬз

РЬе

Азр

Туг

Тгр

СЬу

100

105

110

С1п

О1у

ТЬг

Не

УаЬ

ТЬг

Уа1 Зег Зег

115

120

<210> 63

<211> 112

<212> РКТ

<213> Искусственная

Последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <40С> 63

Азр Не ЧаЬ МеЬ ТЬг С1п А1а А1а Зег Зег Αεη Рго ’7а1 ТЬг Ьеи С1у 15 10 15

ТЬг Зег А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Агд Н1з ТЬг 20 25 30

Ьуз С1у Не ТЬг РЬе Ьеи Туг Тгр Туг Ьеи <31п Ьуз Рго С1у αϊη Зег 35 40 45

Рго С1п Ьеи Ьеи Не Туг С1п Мес Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РЬе Зег Зег Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Агд 11е 65 70 75 80

Зег Агд Уа1 С1и АЬа С1и Азр Ьеи С1у Уа1 Туг Туг Суз А1а С1п Азп 85 90 95

Ьеи С1и Ьеи Рго Ьеи ТЬг РЬе С1у А1а С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Ьеи Ьуз 100 105 110 <210> 64 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная Последовательность

- 54 025329 <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400? 64

Азр Уа1 ν$1 Ьеи ТЬг С1п ТЬг Рго Ьеи ТЬг Ьеи Зег Уа1 ТЬг 11е О1у 15 10 15

С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег 20 25 30

Азр <31у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд Рго С1у С1п Зег 35 40 45

Рго Ьуз Агд Ьеи 11е Туг ьеи νβΐ Зег Ьуз Ьеи Азр Зег О1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег О1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз Не 65 70 75 80

Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Ьеи <31у ν8ΐ Туг Туг Суз Тгр С1п С1у 85 90 95

ТЬг Низ РЬе Рго С1п ТЬг РЬе 01у СЯу С1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз 100 105 110 <210> 65 <211? 112 <212> РЕТ <213> Искусственная Последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 65

С1у

Аар 1

Уа1

νβΐ

МеР

ТЬг Θΐη ТЬг 5

Рго

Ьеи

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

11е 15

Агд

Рго

А1а

Зег 20

Не Зег Суз

Ьуз

Зег 25

Зег

С 1л

Зег

Ьеи

Ьеи 30

Азр

Зег

Азр

С1у

Ьуз 35

ТЬг

Туг Ьеи Туг

Тгр 40

ьеи

Ьеи

С1п

Агд

Рго 45

С1у

С1п

Зег

Рго

ьуз 50

Агд

Ьеи

11е Туг Ьеи 55

иа1

Зег

С1и

Ьеи

Азр 60

Зег

С1у

νβΐ

Рго

Азр

Агд

Не

ТЬг

С1у Зег С1у

Зег

<31у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

70 75 80

Зег Агд УаЬ СЬи А1а СЬи Азр Ьеи СЬу УаЬ Туг Туг Суз Тгр СЬп СЬу 85 90 95

ТЬг НЬз Зег Рго Туг ТЬг РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи ЬЬе Ьуз 100 105 110 с210> 66 <211> 115 <212> РЕТ <213> Искусственная Последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 66

С1п Ьеи АЬа Ьеи ТЬг СЬп Зег Зег Зег А1а Зег РЬе Зег Ьеи СЬу А1а 15 10 15

Зег А1а Ьуз Ьеи ТЬг Суз ТЬг Ьеи Зег Зег С1п НЬз Агд ТНг Туг ТЬг 20 25 30

Не С1и Тгр Туг С1п <31п СЬп Зег Ьеи Ьуз Рго РГО Ьуз Туг УаЬ МеЬ 35 40 45

СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Азр СЬу Зег НЬз Зег ТЬг СЬу НЬз СЬу ЬЬе Рго Азр 50 55 60

Агд РЬе Зег СЬу Зег Зег Зег СЬу АЬа Азр Агд Туг Ьеи Зег Ые Зег 65 70 75 80

Азп 11е СЬп Рго СЬи Азр СЬи АЬа 11е Туг ТЬе Суз СЬу УаЬ СЬу Азр 85 90 95

АЬа Ые Ьуз СЬу СЬп Зег УаЬ РЬе УаЬ РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ 100 105 110

ТЬг Уа1 Ьеи 115 <210> 67 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная Последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

- 56 025329

<220? <221? СЬЗ <222? (1).. <400? 67

<35ΐ:

I

даа

дьд

сад

сьд

дьд

дад

ЬСЬ

ддд

дда

ддс

ЬЬа

дьд

аад

ссь

дда

ддд

48

О1и 1

Уа1

<31п

Ьеи

Уа1 5

с1и

Зег

С1у

С1у

С1у 10

Ьеи

Уа1

ьуз

Рго

О1у 15

С1у

ЬСС

сЬд

ааа

сЬс

Ьсс

ЬдЬ

дса

дсс

ЬсЬ

дда

ЬЬе

асЬ

ЬЬе

асЬ

асе

ЬаЬ

96

Зег

Ьеи

Ьув

Ьеи 20

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег 25

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

ТЬг

Тух

дсс

аьд

ЬсЬ

ьдд

дьь

сдс

сад

асЬ

ссд

дад

аад

адд

сьд

дад

ьдд

дьс

144

А1а

МеЬ

Зег 35

Тгр

Уа1

Агд

С1п

ТЬг 40

Рго

61и

Ьуз

Агд

Ьеи 45

С1и

Тгр

Уа1

дса

асе

аЬЬ

адь

адЬ

ддь

ддЬ

асЬ

Ьас

асе

Ьас

ЬаЬ

сса

дас

адь

дЬд

192

А1а

ТЬг 50

Не

Зег

Зег

С1у

С1у 55

ТЬг

Туг

ТЬг

Туг

Туг 60

Рго

Азр

Зег

Уа1

аад

ддЬ

еда

ЬЬе

асе

аЬс

Ьсс

ада

дас

ааь

дсс

аад

аас

дсс

сЬа

Ьас

240

Ьуз 65

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

Не 70

Бег

Агд

Азр

Азп

А1а 75

Ьуз

Азп

А1а

Ьеи

Туг 80

сьд

саа

асд

аде

адЬ

сед

адд

ЬсЬ

дад

дас

асд

дсс

аьд

ЬаЬ

Ьас

ЬдЬ

288

Ьеи

31п

неь

Зег

Зег 85

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Авр 90

ТЬг

А1а

меь

Тух

Туг 95

Суз

дса

аса

сад

ддд

ааъ

Ьас

ЬсЬ

ЬЬд

дас

ЬЬе

ьдд

ддс

саа

ддс

асе

ЬсЬ

336

А1а

ТЬг

С1п

С1у 100

Аэп

Туг

Зег

Ьеи

Азр 105

РЬе

Тгр

С1у

д1п

С1у но

ТЬг

Зег

сЬс аса дьс ьсс сса 351

Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег

115 <210? 68 <211? 342 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220?

<221? СЬЗ <222? (1)..(342) <400? 68 дад дЬд сад сЬд дЬд дад ЬсЬ ддд дда ддс ЬЬд дед сад ссЬ дда ддд 48

С1и 7а1 С1п Ьеи \/а1 <31и Зег С1у О1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у 15 10 15

Ьсс сьд ааа сьс ьсс ьдь дса дсс ЬсЬ дда ЬЬе аЬЬ Ыс адь аде ЬаЬ 96

- 57 025329

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи 20

Зег

Суз А1а

А1а

Зег С1у 25

РЬе

Не

РЬе

Зег 30

Зег

Туг

ддс

асд

СсС

ьдд

дсс

сдс

сад

СсС

сса

дас

адд

адд

сед

дад

ССд

дСс

144

С1у

мес

Зег

тгр

Уа1

Агд

С1п

Зег

Рго

АЗр

Агд

Агд

Ьеи

С1и

Ьеи

Уа1

35

40

45

дса

адС

аСС

ааС

ас С

ссс

ддс

даС

ада

асе

СаС

СаС

сса

дас

адС

дед

192

А1а

Зег

Не

Азп

ТЬг

РЬе

С1у

Азр

Агд

ТЬг

Туг

туг

Рго

Авр

Зег

Уа1

50

55

60

аад

ддс

еда

ССС

асе

асе

Ссс

ада

дас

ааС

дсс

аад

аас

асе

сСд

Сас

240

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

сХд

саа

аСд

асе

ад С

сСд

аад

СсС

дад

дас

аса

дсс

аСС

СаС

Сас

СдС

288

Ьеи

С1п

МеС

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

СХи

Азр

ТЬг

А1а

Ые

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дса

ада

ддд

асе

дда

асе

Сас

едд

ддс

саа

ддс

асе

асС

ссс

аса

дсс

336

А1а

Агд

С1у

ТЬг

С1у

ТЬг

Туг

Тгр

СХу

61п

С1у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

100

105

110

Ссс

Сса

342

Зег

зег

<210> 69 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>

<221> СЬЗ <222> ¢1)., (351) <400> 69

сад С1п 1

дСс Уа1

саа О1п

сСд Ьеи

сад С1п 5

сад С1п

СсС Зег

ддд СХу

дсс А1а

даа СХи 10

сед Ьеи

дСд УаХ

аад Ьуз

ссС Рго

ддд СХу 15

дсс АХа

46

Сса

дед

аад

ССд

Ссс

Сдс

аад

дсс

СсС

ддс

Сас

асе

ССС

асе

аде

Сас

96

Зег

Уа1

Ьуз

ьеи 20

Зег

Суз

Ьуз

АХа

Зег 25

СХу

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

Зег

Туг

СаС

асд

Сас

едд

дСд

аад

сад

адд

ссС

дда

саа

ддс

есс

дад

едд

асе

144

Туг

МеС

Туг 35

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Агд 40

Рго

О1у

С1п

СХу

Ьеи 45

61и

Тгр

Ые

дда

дад

аСС

ааС

ссС

аде

ааС

ддС

ддс

асе

аас

ССс

аас

дад

аад

ссс

192

С1у

С1и 50

Ые

Азп

Рго

Зег

Азп 55

С1у

СХу

ТЬг

Азп

РЬе 60

Азп

СХи

Ьуз

РЬе

аад

аде

аад

дсс

аса

сСд

асе

дса

дас

ааа

Ссс

Ссс

аде

аса

дса

Сас

240

- 58 025329

Ьуз 65

Зег

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи 70

ТЬг Уа1 Азр

Ьуэ

Зег 75

Зег

Зег ТЬг

А1а

туг 80

абд

саа

сбс

аде

аде

сбд

аса

Ось

Зад

дас

Ссб

дед

дбе

баб

бас

бдб

288

меб

С1п

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

61и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

аса

ада

ддс

ддЬ

бас

Вас

ссс

ббб

дас

бас

бдд

ддс

саа

ддс

асе

асб

336

ТЬг

Агд

С1у

СЯу

Туг

Туг

Рго

РЬе

Азр

туг

Тгр

С1у

С1п

<31у

ТЬг

ТЬг

100

105

110

сбс

аса

дбе

бсс

Ьса

351

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

<210? 70 <211? 363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220?

<221? СПЗ <222? (1)..(363) <400? 70

даб Азр 1

дбд сад

ебб Ьеи

сад С1п 5

дад С1и

бед Зег

дда С1у

ссб Рго

ддс С1у 10

сбд Ьеи

дбд Уа1

ааа Ьуз

ссб Рго

бсб Зег 15

сад С1п

43

Уа1

С1п

бсб

сбд

бсс

сбс

аса

бде

асб

дбе

асб

ддс

бас

бса

абс

асе

адб

да б

96

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи 20

ТЬг

Суз

тЬг

УаЬ

ТЬг 25

е1у

Туг

Зег

Не

ТЬг 30

Зег

Азр

баб

дсс

бдд

ааб

бдд

абс

сдд

сад

ббб

сса

дда

аас

ааа

сбд

дад

бдд

144

Туг

А1а

Тгр 35

Азп

тгр

Ие

Агд

С1п 40

РЬе

Рго

<31у

Азп

ьуз 45

Ьеи

СЬи

тгр

абд

ддс

бас

аба

аде

ббс

адб

ддб

бас

асб

адб

бас

аас

сса

бсб

сбс

192

меб

С1у 50

Туг

Не

Зег

РЬе

Зег 55

<31у

Туг

ТЬг

Зег

Туг 60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

ааа

адб

еда

абс

бсб

дбе

асб

сдд

дас

аса

бсс

адд

аас

саа

ббс

ббс

240

Ьуз 65

Зег

Агд

Не

Зег

Уа1 70

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег 75

Агд

Азп

СЬп

РЬе

РЬе 80

сбс

сад

ббд

асб

бсб

дбд

асб

асб

дад

дас

аса

дсс

аса

баб

бас

бдб

288

Ьеи

С1п

Ьеи

ТЬг

Зег 85

Уа1

ТЬг

ТЬг

С1и

Азр 90

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг 95

Суз

дса

ада

дад

дбе

аас

баб

ддд

дас

бсс

бас

сас

ббб

дас

бас

бдд

ддс

336

А1а

Агд

61и

Уа1 100

Азп

Туг

С1у

Азр

Зег 105

Туг

К1з

РЬе

Азр

Туг 110

Тгр

С1у

саа ддс асе аьь дЬс аса дЬс Ьее Ьса 363

С1п С1у ТЬг Не Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120 <210» 71 <211» 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220» <221» СОЗ <222» (1) . .(336) <400» 71

дас Азр 1

аЬЬ Не

дьд аьд

асд сад дсь

дса АЬа

Ьсс Зег

ЬсЬ Зег 10

ааь Азп

сса дьс

асЬ ТЬг

СЬЬ Ьеи 15

дда СЬу

48

Уа1

МеЬ

ТЬг 5

СЬп

А1а

Рго

УаЬ

аса

Ьсс

дсь

Ьсс

аьс

ьсс

Ьдс

адд

ЬсЬ

адь

аад

адь

сЬс

сда

саь

асЬ

96

ТЬг

Зег

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Агд

НЬз

ТЬг

20

25

30

ааа

ддс

аьс

асЬ

ЬЬЬ

ЬЬд

Ьаь

ьдд

Ьаь

сьд

сад

аад

сса

ддс

сад

ЬсЬ

144

Ьуе

СЬу

Не

ТЬг

РЬе

Ьеи

Туг

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

Зег

35

40

45

ссь

сад

сЬс

сьд

аЬЬ

Ьаь

сад

аЬд

ЬСС

аас

сЬЬ

дсс

Ьса

дда

дьс

сса

192

Рго

СЬп

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

СЬп

МеЬ

Зег

Азп

Ьеи

АЬа

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

50

55

60

дас

адд

ЬЬе

адь

аде

адь

ддд

Ьса

дда

асЬ

даЬ

ЬЬе

аса

сьд

ада

аьс

240

Азр

Агд

РЬе

Зег

Зег

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Агд

Не

65

70

75

80

аде

ада

дЬд

дад

дсЬ

дад

даЬ

ььд

ддь

дьь

Ьаь

Ьас

ЬдЬ

дсЬ

саа

ааЬ

288

Зег

Агд

УаЬ

СЬи

А1а

СЬи

Азр

Ьеи

СЬу

УаЬ

Туг

Туг

Суз

АЬа

СЬп

Азп

85

90

95

сЬа

даа

СЬЬ

ссд

сЬс

асд

ЬЬе

ддь

дсь

ддд

асе

аад

сЬд

дад

сЬд

ааа

336

Ьеи

<31и

Ьеи

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

СЬу

АЬа

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьеи

Ьуз

100

105

110

<210» 72 <211» 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид

- 60 025329 <220» <221» СЬБ <222» (1)..(336} <400» 72 даС дСС дСд сСд асе сад асе сса сСс асе ССд Ьед дСС асе аСС дда 48

Азр Уа1 Уа1 Ьей ТЬг С1п ТЬг Рго Ьей ТЬг Ьец Зег Уа1 ТЬг 11е С1у 15 10 15 саа сса дсс Ссс асе Ссс Сде аад Сса адС сад аде сСс ССа даЬ аде 96

С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьей Ьей Азр Зег

25 30 дас дда аад аса СаС ССд аас Сдд ССд ССа сад адд сса ддс сад СсС 144

Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьей Аэп Тгр Ьей Ьей С1п Агд Рго С1у <»1п Бег

40 45 сса аад сдс сСа аСС СаС сСд дСд ЬсС ааа сСд дас СсС дда дСс ссС 192

Рго Ьуэ Агд Ьей 11е Туг Ьей Уа1 Зег Ьуз Ьеи Азр Зег С1у νπΐ Рго

55 60 дас адд ссс асе ддс аде дда Сса ддд аса дас СЬс аса ссд ааа асе 240

Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег <31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е

70 75 80

аде бег

ада Агд

дед Ца1

дад дсС С1и А1а 85

дад дас

ссд дда Ьеи С1у

дсс Уа1 90

Туг

Нас Туг

Сдс Суз

Сдд Тгр

саа ддС βΐη <31у 95

288

<31и

Азр

аса

сас

ССС

ссС

сад

асд

ССс

ддб

дда

ддс

асе

аад

сСд

даа

аСс

ааа

336

ТЬг

Н1з

РЬе

Рго

С1п

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

<31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

110

<210» 73 <211» 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220» <221» СЬБ <222» (1)..(336) <400» 73

дас Азр 1

дсс Уа1

дед Уа1

аСд Мес

асе ТЬг 5

сад С1п

асе ТЬг

сса Рго

сСс Ьеи

асе ТЬг 10

ССд Ьеи

Ссд Бег

966 Уа1

асе ТЬг

аСС Ие 15

ддд С1у

48

сдс

сса

дсс

Ссс

аСс

ЬсС

Сдс

аад

Сса

аде

сад

аде

сСс

ССа

дас

аде

96

Агд

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

О1п

Бег

Ьеи

Ьеи

Азр

Бег

20

25

30

дас дда аад аса СаС ССд СаС Сдд сед ССа сад адд сса ддс сад СсС 144

Азр 01у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Туг Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд Рго 01у С1п Зег

40 45 сса аад сдс сСа асе саС сСд дед СсС дад сСд дас СсС дда дСс ссс 192

Рго Ьуе Агд Ьеи 11е Туг Ьеи ναΐ Зег (31и Ьеи Азр Зег В1у ’7а1 Рго

55 60 дас адд асе асе ддс аде ддд Сед ддд аса даС ССс аса сСд аад асе 24 0

Азр Агд 11е ТЬг 61у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьув 11е

70 75 80

аде ада Зег Агд

дед дад

дсс А1а 85

дад С1и

дас Азр

ссд дда Ьеи С1у

дсс Уа1 90

ЁаЁ Туг

СаС Туг

Сдс Суз

сдд Тгр

саа С1п 95

дда С1у

288

νβΐ

С1и

аса

сас

СсС

ссд

Сас

асд

ССс

дда

999

999

асе

аад

сед

да а

аса

ааа

336

ТЬг

Нга

Зег

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

С1у

О1у

01у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

110

<210> 74 <211? 345 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<220>

<221? СЬБ

<222> (1)..

(345)

<400? 74

саа

есс

дед

ССС

асС

сад

Сса

СсС

Сса

дсс

ссс

ССс

Ссс

ссд

дда

дсс

48

Οίη

Ьеи

А1а

Ьеи

ТЬг

В1п

Бег

Бег

Бег

А1а

Зег

РЬе

Бег

Ьеи

В1у

А1а

1

5

10

15

Сса

дса

ааа

сса

асд

Сдс

асе

ссд

аде

аде

саа

сас

ада

асд

Сас

асе

96

Бег

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Ьеи

Бег

Бег

В1п

Ηίβ

Агд

ТЬг

Туг

ТЬг

20

25

30

аСС

даа

ьдд

СаС

сад

саа

сад

Сса

сСс

аад

ссС

ссС

аад

сас

дед

аСд

144

11е

С1и

Тгр

Туг

В1п

<31п

С1п

Зег

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

Ьуз

Туг

1/а1

МеС

35

40

45

дад

дсс

аад

ааа

даС

дда

аде

сас

аде

аса

ддь

саС

ддд

асе

ссС

даС

192

С1и

Уа1

Ьуз

Ьуз

Азр

С1у

Зег

Нгз

Бег

ТЬг

В1у

Нхз

В1у

Г1е

Рго

Азр

50

55

60

сдс

ССс

СсС

дда

Ссс

аде

ССС

ддо

дсс

даС

сдс

сас

сСс

аде

аСС

Ссс

240

Агд

РЬе

Бег

В1у

Бег

Зег

Бег

61у

А1а

Азр

Агд

Туг

Ьеи

Бег

11е

Бег

65

70

75

80

аас

асе

сад

ССС

да а

да С

даа

дса

аСа

Сас

аСс

сдс

ддс

дьд

ддС

да С

288

Азп

11е

61п

Рго

С1и

Азр

С1и

А1а

Пе

Туг

11е

Суз

С1у

Уа1

С1у

Азр

85

90

95

дса

асе

аад

дда

саа

СсС

дед

ССС

дсс

ССс

ддс

ддс

ддс

асе

аад

дЬс

336

А1а

Не

Ьуз

В1у

В1п

Зег

Уа1

РЬе

Уа1

РЬе

В1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

- 62 025329

100

105

НО асе дХс сХа ТЬх Уа1 Ьеи

115

345 <210 = 75 <211> 117 <212 = РКТ <213> Искусственная последовательность <220 = <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400 = 75

С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зех С1у <31у (31у Ьеи Уа1 Ьуе Рго С1у <31у 15 10 15

Зех Ьеи Ахд Ьеи Зех Суз А1а А1а Зех 61у РЬе ТЬх РЬе ТЬг ТЬх Тух 20 25 30

А1а МеХ Зег Тхр Уа1 Ахд С1п А1а Рхо С1у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45

Зег Зех 11е Зех Зег С1у 61у ТЬх Тух ТЬх Тух Тух А1а Азр Зех Уа1 50 55 60

Ьуз С1у Агд РЬе ТЬх Не Зех Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Тух 65 70 75 80

Ьеи С1п МеХ Азп Зег Ьеи Ахд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Тух Туг Суз 85 90 95

А1а ТЬх С1п 51у Азп Тух Зех Ьеи Азр РЬе Тгр <31у 31п С1у ТЬх ТЬх 100 105 110

Уа1 ТЬх Уа1 Зех Зех 115 <210= 76 <211> 112 <212= РКТ <213> Искусственная последовательность <220 = <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400= 76

Азр 11е Уа1 МеХ ТЬх С1п Зех Рхо Ьеи Зех Ьеи Рго Уа1 ТЬх Рхо С1у 15 10 15

- 63 025329

СЬи

Рго

АЬа

Зег 20

11е

Зег Суз Агд

Зег 25

Бег

Ьуз

Бег

Ьеи

Агд 30

ΗΪ3

ТЬг

Ьуе

СЬу

Ые

ТЬг

РЬе

Ьеи Туг Тгр

Туг

Ьеи

СЬп

Ьуз

РГО

СЬу

СЬп

Бег

35

40

45

Рго

СЬп

Ьеи

Ьеи

Ые

Туг СЬп МеЕ

Зег

Азп

Агд

АЬа

зег

СЬу

УаЬ

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

СЬу

Бег СЬу Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Ые

65

70

75

80

Зег

Агд

УаЬ

СЬи

АЬа

СЬи Азр УаЬ

СЬу

УаЬ

Туг

Туг

Суз

АЬа

СЬп

Азп

35

90

95

Ьеи

СЬи

Ьеи

Рго

Ьеи

ТЬг РЬе СЬу

СЬу

СЬу

ТЬг

Ьуз

УаЬ

СЬи

Ые

Ьуз

100

105

110

<210

> 77

<211> 117

<212

> РКТ

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400? 77

СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго СЬу СЬу 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе ТЬг ТЬг Туг 20 25 30

АЬа МеЕ Азп Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ 35 40 45

Зег Зег 11е Зег Зег СЬу СЬу ТЬг Туг ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ 50 55 60

Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг Ые Зег Агд Азр Азп АЬа Ьуз Азп Зег Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи СЬп МеЕ Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз 85 90 95

АЬа ТЬг СЬп СЬу Азп Туг Зег Ьеи Азр РЬе Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг 100 105 110

- 64 025329

УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 с210> 78 <211> 112 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 78

Азр 1	Ые	УаЬ	МеЬ	ТЬг СЬп 5	Зег	Рго	Ьеи	Зег Ьеи Рго УаЬ 10	ТЬг	Рго 15	ОЬу
СЬи	Рго	А1а	Зег	Ые Зег	Суз	Агд	Зег	Зег ьуз Зег Ьеи	Агд	НЬз	ТЬг
			20				25		30
Ьуз	ОЬу	11е	ТЬг	РЬе Ьеи	Азр	Тгр	Туг	Ьеи СЬп Ьуз Рго	сьу	СЬп	Зег
		35				40		45
Рго	αΐη	ьеи	Ьеи	11е Туг	СЬп	МеЬ	Зег	Азп Агд АЬа Зег	СЬу	УаЬ	Рго
	50				55			60
АЗр	Агд	РЬе	Зег	СЬу Зег	СЬу	Зег	СЬу	ТЬг Азр РЬе ТЬг	Ьеи	Ьуз	Ые
65				70				75			80
Зег	Агд	УаЬ	СЬи	АЬа СЬи	Азр	УаЬ	СЬу	УаЬ Туг Туг Суз	АЬа	СЬп	Азп
				85				90		95
Ьеи	СЬи	Ьеи	Рго	Ьеи ТЬг	РЬе	СЬу	СЬу	СЬу ТЬг Ьуз УаЬ	СЬи	11е	Ьуз
			100				105		110
с210> 79
<211> 117
<2Ь2> РЕТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание	искусственной последовательности: синтетический
	полипептид
<400> 79
СЬи	УаЬ	СЬп	Ьеи	УаЬ СЬи	Зег	СЬу	СЬу	СЬу Ьеи УаЬ Ьуз	Рго	СЬу	ОЬу
1				5				10		15
Зег	Ьеи	Агд	Ьеи	Бег Суз	АЬа	АЬа	Зег	СЬу РЬе ТЬг РЬе	ТЬг	ТЬг	Туг
			20				25		30

- 65 025329

А1а МеС Зег Тгр Уа1 Агд	О1п	А1а 40	Рго	О1у Ьуз	О1у	Ьеи 45	С1и	Тгр	Уа1
35
Зег ТЬг Пе Зег Зег О1у 50	О1у 55	ТЬг	Туг	ТЬг Туг	Туг 60	А1а	Азр	Зег	Уа1
Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг Пе 65 70	Зег	Агд	Азр	Азп А1а 75	Ьуз	Азп	Зег	Ьеи	Туг 80
Ьеи О1п Мес Азп Зег Ьеи 85	Агд	А1а	01 и	Азр ТЫ 90	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
А1а ТЬг С1п О1у Азп Туг Зег Ьеи Азр РЬе Тгр 100 105 Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 80 <211> 114 <212=. РКТ <21 3> Искусственная последовательность	С1у	С1п	О1у 110	ТЬг	ТЬг
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид <400> 80	ι: синтетический

01и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 01у 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Не РЬе Зег Зег Туг 20 25 30

С1у МеС Зег Тгр Уа! Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45

А1а Азп Не Азп ТЬг РЬе 01у Азр Агд ТЬг Туг Туг Уа1 Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Авп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи С1п МеД Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

А1а Агд 01у ТЬг ОЬу ТЬг Туг Тгр О1у С1п 01у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 100 105 НО

Зег Зег <210> @1 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬОписание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 81

Азр Уа1 Уа1 МеС ТЬг О1п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТЬг Ьеи С1у 15 10 15 αΐη Рго А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег 20 25 30

Азр е1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр РЬе С1п С1п Агд Рго С1у О1п Зег 35 40 45 рго Агд Агд Ьеи 11е Туг Ьеи Уа1 Зег Азп Агд Азр Зег С1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Зег Агд Уа1 С1и А1а <31и Азр Уа]. С1у Уа1 Туг Туг Суз Тгр О1п 31у 85 90 95

ТЬг Н1з РЬе Рго <31п ТЬг РЬе С1у 51у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз 100 105 110 <210> 82 <211? 114 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ЬОписание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400? 82

О1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у О1у С1у Ьеи Уа1 <31п Рго <31у <31у 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе Не РЬе Зег Зег Туг 20 25 30

- 67 025329

СЬу

МеЬ

Зег 35

Тгр

УаЬ

Агд

СЬп

АЬа 40

Рго

СЬу

Ьуз

СЬу

Ьеи 45

СЬи

Тгр

УаЬ

АЬа

Зег 50

Не

Азп

ТЬг

РЬе

СЬу 55

Азр

Агд

ТЬг

Туг

Туг 60

УаЬ

Азр

Зег

УаЬ

Ьуз 65

СЬу

Агд

РЬе

ТЬг

Не 70

Зег

Агд

Азр

Азп

АЬа 75

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг 80

Ьеи

СЬп

МеЬ

Азп

Зег 85

Ьеи

Агд

АЬа

СЬи

Азр 90

ТЬг

АЬа

УаЬ

Туг

Туг 95

Суз

АЬа

Агд

СЬу

ТЬг

СЬу

ТЬг

Туг

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

ТЬг

Ьеи

УаЬ

ТЬг

УаЬ

100 105 НО

Зег Зег <210> 33 <211> 112 <212> РКТ

<21 3> Искусственная	последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 83
Азр УаЬ УаЬ МеС ТЬг	СЬп Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго УаЬ ТЬг Ьеи СЬу
1 5	Ю 15
СЬп Рго АЬа Зег Не	Зег Суз Агд Зег Зег СЬп Зег Ьеи Ьеи Азр Зег
20	25 30
Азр СЬу Ьуз ТЬг Туг	Ьеи Азп Тгр РЬе ОЬп СЬп Агд Рго СЬу СЬп Зег
35	40 45
Рго Агд Агд Ьеи Не	Туг Ьеи УаЬ Зег Ьуз Агд Азр Зег СЬу УаЬ Рго
50	55 60
Азр Агд РЬе Зег СЬу	Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз Ые
65	70 75 80
Зег Агд УаЬ СЬи АЬа	СЬи Азр УаЬ СЬу УаЬ Туг Туг Суз Тгр СЬп СЬу
85	90 95
ТЬг НЬз РЬе Рго СЬп	ТЬг РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи 11е Ьуз

- 68 025329

	100	105	110
<210?	84
<211?	117
<212?	РКТ
<213>	Искусственная последовательность
<220?
<223>	Описание искусственной	последовательности:	синтетический
	полипептид
<400?	84

01η Уа1 01η Ьеи Уа1 01η Зег О1у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а 15 10 15

Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 25 30

Туг Мер Туг Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго С1у О1п С1у Ьеи С1и Тгр Мер 35 40 45

О1у Пе Пе Азп Рго Зег Азп С1у 01у ТЬг Зег Туг А1а 01п Ьуз РЬе 50 55 60

О1п С1у Агд λ/а! ТЬг Мер ТЬг Агд Азр ТЬг Бег ТЬг Зег ТЬг Уа1 Туг 65 70 75 80

МеР 01и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег <31и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

90 95

ТЬг Агд С1у С1у Туг Туг Рго РЬе Азр Туг Тгр 01у С1п С1у ТЬг ТЬг 100 105 110

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 85 <211? 112 <212? РЕТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400? 85

Азр Уа1 Уа1 Мер ТЬг е1п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТЬг Ьеи С1у 15 Ю 15

61п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег

- 69 025329

Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Туг Тгр РЬе С1п С1п Агд Рго С1у С1п Бег

40 45

Рго Агд Агд Ьеи Не Туг Ьеи Уа] Бег Αεη Агд Αερ Бег С1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РЬе Бег С1у Бег С1у Бег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Бег Агд ν«1 ©1и А1а СЯи Азр Уа1 61у Уа1 Туг Туг Суз Тгр О1п С1у 85 90 95

ТЬг Нгз Бег Рго Туг ТЬг РЬе С1у О1п О1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз 100 105 110 <210> 86 <211> 117 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 86

С1п У’а1 <31п Ьеи Уа1 Θΐη Бег С1у А1а С1и 7а1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а 15 10 15

Бег ν,οΐ Ьуз '/а.1 Бег Суз Ьуз А1а Бег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Бег Туг 20 25 30

Туг МеС Нгз Тгр νηΐ Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр МеС 35 40 45

СХу 11е 11е Азп Рго Бег Азп С1у С1у ТЬг Бег Туг А1а С1п Ьуз РЬе 50 55 60

С1п О1у Агд Ца1 ТЬг МеС ТЬг Агд Азр ТЫ Зег ТЫ Зег ТЬг Уа1 Туг 65 70 75 80

МеС С1и Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег С1и Азр ТЬг А1а т/а1 Туг Туг Суз

90 95

ТЬг Агд С1у С1у Туг Туг Рго РЬе Азр Туг Тгр <31у <31п С1у ТЬг ТЬг 100 105 110

Уа1 ТЫ Уа1 Зег Зех 115 <210 = 87 <211= 112 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400> 87

Αερ Уа1 1	Уа1 МеЬ	ТЬх С1п 5	Зег	Рхо Ьеи Зех 10	Ьеи	Рхо	Уа1	тЬх	Ьеи 15	С1у
СШ Рго	А1а Зег	Не Зех	Суз	Ахд Зех Зех	С1п	Бех	Ьеи	Ьеи	Азр	Зег
	20			25				30
Азр С1у	Ьуз ТЬг	Тух Ьеи	Азп	Тгр РЬе С1п	С1п	Агд	Рго	О1у	С1п	Зег
	35			40			45
Рго Агд	Агд Ьеи	Не Тух	Ьеи	Уа1 Зех Азп	Ахд	Агр	Зег	С1у	Уа1	Рхо
50			55			60
Азр Агд	РЬе Зег	С1у Зег	61у	Зег О1у ТЬх	АЗр	РЬе	ТЬх	Ьеи	ьуз	Не
65		70			75					80
Зег Агд	Уа1 С1и	А1а С1и	Азр	Уа1 С1у Уа1	тух	Туг	Суз	Тгр	С1п	С1у
		35		90					95
ТЫ Нгз	Бех Рхо	Тух ТЬх	РЬе	С1у С1п О1у	ТЬх	Ьуз	Ьеи	С1и	Не	ьуз
	100			105				110
<210= 88
<211> 117
<212= РКТ
<213> Искусственная последовательность
<220 =
<223> Описание	искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 88
С1п Уа1	С1п ьеи	Уа1 О1п	Зех	О1у А1а С1и	Уа1	Ьуз	Ьуа	Рхо	С1у	А1а
1		5		10					15
Зег Уа1	Ьуз Уа1	Бег Суз	Ьуз	А1а Зег С1у Тух	тЬг	РЬе	ТЬх	Зех	тух
	20			25				30

- 71 025329

Туг

МеЕ

Туг 35

Тгр

УаЬ

Агд

СЬп

АЬа 40

Рго

СЬу

СЬп

СЬу

Ьеи 45

СЬи

Тгр

МеЕ

СЬу

СЬи 50

Ые

Азп

Рго

Зег

Азп 55

СЬу

СЬу

ТЬг

АЗП

Туг 60

АЬа

СЬп

Ьуз

РЬе

СЬп 65

СЬу

Агд

УаЬ

ТЬг

МеЕ 70

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег 75

ТЬг

Зег

ТЬг

УаЬ

Туг 80

меь

СЬи

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

СЬи

Азр

ТЬг

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

85

90

95

ТЬг

Агд

СЬу

СЬу 100

Туг

Туг

Рго

РЬе

Азр 105

Туг

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу 110

ТЬг

ТЬг

УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 <210> 89 <211? 112 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности; синтетический полипептид <400? 89

Азр УаЬ УаЬ МеЕ ТЬг СЬп Зег Рго 1 5

Ьеи Зег Ьеи Рго УаЬ ТЬг Ьеи СЬу 10 15

СЬп Рго А1а Зег 11е Зег Суз Агд 20

Зег Зег С1ь Зег Ьеи Ьеи Азр Зег 25 30

Азр СЬу Ьуз ТЬг Туг Ьеи Туг Тгр

40

РЬе СЬп СЬп Агд Рго СЬу СЬп Зег

Рго Агд Агд Ьеи ГЬе Туг Ьеи УаЬ 50 55

Зег СЬи Агд Азр Зег СЬу УаЬ Рго 60

Азр Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег 65 70

СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 1Ье 75 80

Зег Агд УаЬ СЬи А1а С1и Азр УаЬ 85

СЬу УаЬ Туг Туг Суз Тгр СЬп СЬу 90 95

- 72 025329

ТЬг НЬз Бег Рго Туг ТНг РЬе С1у СЬп СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи 11е Ьуз 100 105 110 <210 = 90 <211 = 121 <212 = РКТ <213> Искусственная последовательность <220=· <223> РОписание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400 = 90

С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1и Бег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Бег С1п 15 10 15

ТЬг Ьеи Бег Ьеи ТЬг Суз ТЬг Уа1 Бег СЬу Туг Бег 11е ТЬг Бег Азр 20 25 30

Туг А1а Тгр Азп Тгр 11е Агд С1п НЬз Рго О1у Ьуз С1у Ьеи СЬи Тгр 35 40 45

11е С1у Туг 11е Зег РЬе Зег С1у Туг ТЬг Туг Туг Азп Рго Зег Ьеи 50 55 60

Ьуз Зег Агд Уа1 ТЬг 11е Бег Уа1 Азр ТЬг Бег Ьуз Азп СЬп РЬе Зег 65 70 75 80

Ьеи Ьуз Ьеи Зег Бег Уа1 ТЬг АЬа А1а Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

АЬа Агд С1и Уа1 Азп Туг С1у Азр Бег Туг НЬз РЬе Азр Туг Тгр С1у 100 105 110

С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Vа1 Бег Бег 115 120 <210= 91 <211 = 115 <212= РКТ <213> Искусственная последовательность <220 = <223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400= 91

С1п Ьеи 7а1 Ьеи ТЬг С1п Бег Рго Бег А1а Зег А1а Зег Ьеи С1у А1а 15 10 15

- 73 025329

Зег Уз1	Ьуз	Ьеи 20	ТЬг	Суз ТЬг Ьеи Зег 25	Зег О1п	Шз	Агд ТЬг 30	Туг ТЫ
Не С1и	Тгр	Шз	С1п	С1п С1п Рго 51и	ЬуЗ <з1у	Рго	Агд Туг	Ьеи МеС
	35			40			45
Ьуз Уа1	ьуз	Ьуз	АЗр	С1у зег Шз Зег	ьуз С1у	Азр	<31у Не	Рго Азр
50				55		60
Агд РЬе	Зег	61у	зег	Зег Зег <31у А1а	С1и Агд	Туг	ьеи ТЬг	11е Зег
65				70	75			80
Зег Ьеи	αΐη	Зег	О1и	Азр <з1и А1а Азр	туг туг	суз	<31 у Уа1	С1у Азр
			85		90			95
А1а Не	Ьуз	С1у	<31п	Зег Уа1 РЬе Уа1	РЬе Шу	С1у	<31у ТЬг	Ьуз Уа1
		100		105			но
С1и Не	Ьуз
	115
<210> 92
<211? 121
<212> РКТ
<21 3> Искусственная	последовательное	ть
<220?
<223> Описание	искусственной последовательности	ι: синтетический
полипептид
<400> 92

Οίη Уа1 <31η Ьеи С1п 61и Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег Θΐη 15 10 15

ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг Уа1 Зег <31у Туг Зег 11е ТЬг Зег Азр 20 25 30

Туг А1а Тгр Зег Тгр Не Агд С1п Шз Рго С1у Ьуз С1у Ьеи <31и Тгр 35 40 45

Не С1у Туг Не Зег РЬе Зег С1у Туг ТЬг Туг Туг Азп Рго Зег Ьеи 50 55 60

Ьуз Зег Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Уа1 Азр ТЬг Зег Ьуз Азп О1п РЬе Зег 65 70 75 80

Ьеи Ьуз Ьеи Зег Зег Уа1 ТЫ А1а А1а Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

- 74 025329

А1а Агд 01ц 3/а1 Азп Туг С1у Азр Зег Туг ΗΪ8 РЬе Авр Туг Тгр <31у 100 105 110

С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120 <210? 93 <211? 115 <212? РЕТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400? 93

С1п Ьеи Уа1 Ьеи ТЬг <31п Зег Рго Зег А1а Зег А1а Зег Ьеи С1у А1а 15 10 15

Зег Уа1 Ьув Ьеи ТЬг Суз ТЬг Ьеи Зег Зег СЯп Н1е Агд ТЬг Туг ТЬг 20 25 30

Пе А1а Тгр Шз С1п 31п С1п Рго <31и Ьуз С1у Рго Агд Туг Ьеи МеР 35 40 45

Ьуз Уа1 Ьуз Ьуз Авр С1у Зег Шз Зег Ьуз 31у Азр С1у 11е Рго Азр 50 55 60

Агд РЬе Зег О1у Зег Зег Зег <31у А1а <31и Агд Туг Ьеи ТЬг 11е Зег 65 70 75 80

Зег Ьеи €1п Зег С1и Азр СЯи А1а Азр Туг Туг Сув СЯу 3/а1 С1у Азр 85 90 95

А1а 11е Ьуз С1у С1п Зег \7а1 РЬе ’7а1 РЬе СЯу СЯу СЯу ТЬг Ьуз Уа1 100 105 110

СЯи Пе Ьуз 115 <210? 94 <211? 121 <212? РЕТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400? 94

- 75 025329

С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1и Зех С1у Рго 51у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1п 15 10 15

ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг 7а1 Зег С1у Тух Зех 11е ТЬг Зег Азр 20 25 30

Туг А1а Тгр Азп Тгр 11е Ахд С1п Ыз Рхо С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тхр 35 40 45

11е С1у Туг 11е Зег РЬе Зех О1у Тух ТЬг Зег Туг Азп Рхо Зег Ьеи 50 55 60

Ьуз Зег Агд ’7а1 ТЬг 11е Зех 1/а1 Азр ТЬг Зех Ьуз Азп С1п РЬе Зег 65 70 75 80

Ьеи Ьуз Ьеи Зех Бег Уа1 ТЬг А1а А1а Азр ТЬг А1а Л7а1 Тух Тух Суз 85 90 95

АХа Агд С1и Уа1 Азп Тух 61у Азр Зех Туг Нхз РЬе Азр Туг Тгр 61у 100 105 110

С1п С1у ТЬх Ьеи Уа1 ТЬх Уа1 Зег Зег 115 120 <210? 95 <211? 115 <212? РКТ <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <400? 95

С1п Ьеи Уа1 Ьеи ТЬх О1п Зех Рхо Зех А1а Зех А1а Зех Ьеи С1у А1а 15 10 15

Зег Уа1 Ьуз Ьеи ТЬх Суз ТЬх Ьеи Зег Зег <31п Нхз Ахд ТЬг Тух ТЬг 20 25 30

11е С1и Тгр Н1з 31п С1п С1п Рхо С1и Ьуз С1у Рхо Агд Туг Ьеи Мес 35 40 45

С1и Уа1 Ьуз Ьуз Азр С1у Бег Нхз Зех Ьуз С1у Азр С1у 11е Рхо Азр 50 55 60

Ахд РЬе Зех О1у Зех Зех Зех 31у А1а С1и Ахд Тух Ьеи ТЬх 11е Зех 65 70 75 80

Зег Ьеи СЬп Зег СЬи Αερ СЬи АЬа Азр Туг Туг Суз СЬу УаЬ СЬу Азр 85 90 95

АЬа Не Ьуз СЬу СЬп Зег УаЬ РЬе УаЬ РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ 100 105 110

СЬи Не Ьуз 115 <210> 96 <211> 29 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>

<221 > МОЬ_ЕЕЗ <222> (2). . (3) <223> АЬх <400> 96

Суз Хаа Хаа СЬп СЬу Рго Тгр Ьеи СЬи СЬи СЬи СЬи СЬи АЬа Туг СЬу 15 10 15

Тгр МеЬ Азр РЬе С1у Агд Агд Зег АЬа СЬи Азр СЬи Азп 20 25 <210=· 97 <211> 13 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>

<221> ΜΟϋ_ΚΕ5 <222> (2).,(3) <223> АЬх <400> 97

Суз хаа Хаа РЬе СЬу Агд Агд Зег АЬа СЬи Азр СЬи Азп

10 <210> 98 <211=> 13 <212> РКТ <21 3> Искусственная последовательность <220>

- 77 025329 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220» <221» МОЬ_ЕЕЗ <222» (11),.(12} <223» АЬх <400» 98

РЬе С1у Агд Агд Зег А1а <31и Азр 01и Азп Хаа Хаа Суз

1	5	10
<210» <211> <212» <213>	99 15 РЕТ Искусственная последовательность
<220> <223>	Описание искусственной пептид	последовательности: синтетический
<400»	99

О1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег 15 10 15

<210»	100
<211»	101
<212»	РЕТ
<213»	Нолю	заргепз
<400»	100
МеС С1п	ι Агд	Ьеи Суз Уа1 Туг ν^Ι Ьеи Не РНе А1а Ьеи А1а Ьеи А1а

10 15

А1а РЬе Зег С1и А1а Зег Тгр Ьуз Рго Агд Зег С1п С1п Рго Азр А1а 20 25 30

Рго Ьеи <31у ТЬг С1у А1а Азп Агд Азр Ьеи С1и Ьеи Рго Тгр Ьеи С1и 35 40 45

31п С1п О1у Рго А1а Зег Нгз Нгз Агд Агд 01п Ьеи С1у Рго <31п С1у 50 55 60

Рго Рго Нгз Ьеи Уа1 А1а Азр Рго Зег Ьуз Ьуз С1п С1у Рго Тгр Ьеи 65 70 75 80

С1и С1и С1и С1и С1и АЬа Туг С1у Тгр Мес Азр РЬе <31у Агд Агд Зег 85 90 95

А1а С1и Азр С1и Азп 100 <210 = 101 <211 = 80 <212 = РЕТ <213=· Ното зараепз <400= 101

Бег Тгр

ι Ьуз

Рго Агд

Бег

С1п

О1п

Рго

Азр

А1а

Рго

Ьеи

О1у

ТНг

С1у

1

5

10

15

А1а Азп

ι Агд

Азр Ьеи

С1и

Ьеи

Рго

Тгр

Ьеи

(31и

С1п

С1п

О1у

Рго

А1а

20

25

30

Зег ΗΪ3

Н±з

Агд Агд

С1п

Ьеи

<31у

Рго

σΐη

<31у

Рго

Рго

Н1з

Ьеи

Уа1

35

40

45

А1а Азр

' Рго

Зег Ьуз

Ьуз

С1п

С1у

Рго

Тгр

Ьеи

<31и

С1и

О1и

О1и

С1и

50

55

60

А1а Туг

С1у

Тгр МеС

Азр

РНе

С1у

Агд

Агд

Бег

А1а

С1и

Азр

О1и

Азп

65

70

75

80

<210 =

102

<211 =

34

<212 =

РКТ

<213 =

Ното

зараепз

<400 =

102

О1п Ьеи

С1у

Рго С-1п

С1у

Рго

Рго

Н1з

Ьеи

Уа1

А1а

Азр

Рго

Бег

Ьуз

1

5

10

15

Ьуз С1п

С1у

Рго Тгр

Ьеи

<31и

<31и

<31и

<31и

<31и

А1а

Туг

С1у

Тгр

МеС

20

25

30

Азр РНе

<210 =

103

<211 =

35

<212 =

РКТ

<213 =

Ното

ЗарЬепз

<400 =

103

О1п Ьеи

<31у

Рго С1п

С1у

Рго

Рго

Н1з

Ьеи

Уа1

А1а

Αερ

Рго

Бег

Ьуз

1

5

10

15

Ьуз С1п

С1у

Рго Тгр

Ьеи

01и

С1и

61и

С1и

61и

А1а

Туг

С1у

Тгр

МеС

25 30

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ профилактики или предотвращения рецидивов или лечения рака молочной железы, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества моноклонального антитело к прогастрину человека.
2. 2. Способ по п.1, где рак молочной железы представляет собой первичный рак молочной железы или метастатический рак молочной железы.
3. 3. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-№0 антитело вводится до или после хирургической резекции новообразования молочной железы.
4. 4. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-№0 антитело вводится до или после применения дозы радиационной терапии рака молочной железы.
5. 5. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-№0 антитела вводится до, одновременно или после введения химиотерапевтического препарата для лечения рака молочной железы.
6. 6. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-№0 антитело вводится до, одновременно или после введения гормонального терапевтического препарата для лечения рака молочной железы.
7. 7. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-№0 антитело вводится до, одновременно или после введения второго терапевтического антитела, которое специфично связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из РЭФР, ФРЭС и нЕК2.
8. 8. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-№0 антитело является гуманизированным антителом.
9. 9. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-№0 антитело имеет связывающую способность к прогастрину, составляющую от по крайней мере приблизительно 0,001 нМ до по крайней мере приблизительно 5000 нМ.

   - 80 025329
10. 10. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-ЬР0 антитело выбрано из группы, состоящей из МАЬЗ, МАЬ4, МАЬ5, МАЬ6, МАЬ7, МАЬ8, МАЬ11, МАЬ12, МАЬ13, МАЬ15, МАЬ16 и МАЬ19.
11. 11. Способ по п.1 или 2, где моноклональное анти-ЬР0 антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (ν_Η), в которой определяющая комплементарность область 1 (СГОГО) выбрана из ν_Η СОК 1.3 (5ЕО ГО N0: 1), ν_Η СОК 1.4 (5ЕО ГО N0: 7), ν_Η СОК 1.8 (5ЕО ГО N0: 37), ν_Η СОК 1.13 (5ЕО ГО N0: 38), ν_Η СОК 1.16 (5ЕО ГО N0: 39), ν_Η СОК 1.19 (5ЕО ГО N0: 40), СОК2 выбрана из ν_Η СОК 2.3 (5ЕО ГО N0: 2), ν_Η СОК 2.4 (5ЕО ГО N0: 8), ν_Η СОК 2.8 (5ЕО ГО N0: 41), ν_Η СОК 2.13 (5ЕО ГО N0: 42), ν_Η СОК 2.16 (5ЕО ГО N0: 43), ν_Η СОК 2.19 (5ЕО ГО N0: 44) и СОК3 выбрана из ν_Η СОК 3.3 (5ЕО ГО N0: 3), ν_Η СОК 3.4 (5ЕО ГО N0: 9), ν_Η СОК 3.8 (5ЕО ГО N0: 45), ν_Η СОК 3.13 (5ЕО ГО N0: 46), ν_Η СОК 3.16 (5ЕО ГО N0: 47), ν_Η СОК 3.19 (ЪЕф ГО N0: 48), и/или вариабельную область легкой цепи (^), в которой определяющая комплементарность область 1 (СОК1) выбрана из ν₂ СОК 1.3 (ЪЕф ГО N0: 4), ν₂ СОК 1.4 (ЙЕО ГО N0: 10), ν СОК 1.8 (5ЕО ГО N0: 49), ν СОК 1.13 (5ЕО ГО N0: 50), ν СОК 1.16 (5ЕО ГО N0: 50), ν СОК 1.19 (5ЕО ГО N0: 51), СОК2 выбрана из ν СОК 2.3 (5ЕО ГО N0: 5), ν СОК 2.4 (5ЕО ГО N0: 5), ν СОК 2.8 (5ЕО ГО N0: 52), ν СОК 2.13 (5ЕО ГО N0: 53), ν СОК 2.16 (5ЕО ГО N0: 53), ν СОК 2.19 (5ЕО ГО N0: 54) и СОК3 выбрана из ν СОК 3.3 (5ЕО ГО N0: 6), ν СОК 3.4 (5ЕО ГО N0: 11), ν СОК 3.8 (5ЕО ГО N0: 55), ν СОК 3.1 (5ЕО ГО N0: 13), ν СОК 3.16 (5ЕО ГО N0: 57), ν СОК 3.19 (ЙЕО ГО N0: 58).
12. 12. Способ по п.1, где моноклональное анти-ЬР0 антитело представляет собой ^терминальное анти-ЬР0 антитело.
13. 13. Способ по п.12, где ^терминальное моноклональное анти-ЬР0 антитело индуцировано против иммуногена, включающего пептид, имеющий последовательность 5^КРК5>ООРОАРЕ0 (5Еф ГО N0: 25).
14. 14. Способ по п.12, где ^терминальное моноклональное анти-ЬР0 антитело конкурирует за связывание с ЬР0 с референсным антителом, выбранным из:

    (а) моноклонального антитела, включающего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 12 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью 5Еф ГО N0: 13;

    (б) моноклонального антитела, включающего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 61 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью 5Еф ГО N0: 65;

    (в) моноклонального антитела, включающего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 62 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью 5Еф ГО N0: 66.
15. 15. Способ по п.1, где моноклональное анти-ЬР0 антитело представляет собой С-терминальное анти-ЬР0 антитело.
16. 16. Способ по п.15, где С-терминальное моноклональное анти-ЬР0 антитело индуцировано против иммуногена, включающего пептид, имеющий последовательность ^ОРV^ЕЕЕЕЕΑΥОVМ^ΡОКК§ΑЕ1)Е\ (5ЕО ГО N0: 27).
17. 17. Способ по п.16, где С-терминальное моноклональное анти-ЬР0 антитело конкурирует за связывание с ЬР0 с референсным антителом, выбранным из:

    (а) моноклонального антитела, включающего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 59 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью 5Еф ГО N0: 63;

    (б) моноклонального антитела, включающего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 60 и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 64.
18. 18. Способ по п.1, где моноклональное анти-ЬР0 антитело вводят в дозе, которая составляет от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 250 мг/кг.
19. 19. Способ по п.18, где указанную дозу указанного моноклонального анти-ЬР0 антитела вводят с помощью совокупности разделенных по времени введений.