EA015580B1

EA015580B1 - Моноклональное анти-мет антитело, его фрагменты и векторы для лечения опухолей и соответствующие продукты

Info

Publication number: EA015580B1
Application number: EA200870234A
Authority: EA
Inventors: Паоло Мария Комольо; Элиза Винья; Силвия Джордано
Original assignee: Метерезис Транслейшнл Ресерч С.А.
Priority date: 2006-02-06
Filing date: 2007-02-05
Publication date: 2011-10-31
Also published as: IL192879A; EP1981981A1; ATE514715T1; PT1981981E; CY1111884T1; KR101429297B1; AU2007213804A8; EP2192188A1; US8729043B2; EP1981981B1; BRPI0707480A8; BRPI0707480A2; AU2007213804B2; US20120134996A1; ES2368864T3; ZA200806559B; CN101379192A; CN101379192B; KR20090013745A; IL192879A0

Abstract

Описано применение моноклонального антитела, направленного против внеклеточного домена фактора роста гепатоцитов, для получения лекарственного средства для лечения опухолей и/или метастазов и диагностического средства для выявления неопластических клеток, а также векторов, содержащих по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности, кодирующей моноклональное анти-Met антитело, продуктов, содержащих моноклональное анти-Met антитело и/или по меньшей мере один его фрагмент и по меньшей мере один ингибитор киназы.

Description

Изобретение относится к применению моноклонального антитела, его фрагментов и/или частей и к применению нуклеотидной последовательности, кодирующей моноклональное антитело, его фрагменты и/или части для получения лекарственного средства для лечения опухолей и метастазов и диагностических устройств для выявления непластических клеток либо ίη νΐνο, либо ίη νίΐτο. В частности настоящее изобретение относится к применению моноклонального анти-Μеΐ антитела, направленного против внеклеточного домена рецептора фактора роста гепатоцитов.

Уровень техники

Научное исследование иммунотерапии злокачественных опухолей началось в 1950 годы, и первое применение было основано на поликлональных антителах. В настоящее время спустя более пяти десятилетий, иммунотерапия моноклональными антителами продолжает предлагать многообещающую альтернативу лечения злокачественных опухолей (1,2). Несколько антител, направленных к мишени - тирозинкиназным рецепторам (ВТК) в злокачественной опухоли, используются в настоящее время в клинической практике (3). Механизм действия таких антител в разных случаях различный, и - несмотря на примеры успешного применения - зачастую плохо понятны (4). Мишенями бевацизумаба и цетуксимаба являются УЕСЕ-УЕСЕВ и ЕСЕ-ЕСЕВ, соответственно, и они действуют, предотвращая взаимодействие лиганд-рецептор (5, 6). Герцептин является моноклональным антителом, специфичным к НЕВ2, представителю семейства ЕСЕВ. Механизм действия, лежащий в основе эффективности герцептина, не совсем понятен, но было показано, что он стимулирует распад НЕВ2, таким образом снижая уровни рецептора на поверхности опухолевых клеток (7).

Онкоген МЕТ, кодирующий тирозинкиназный рецептор для фактора роста гепатоцитов (НСЕ), контролирует генетические программы, приводящие к клеточному росту, инвазии и защите от апоптоза. Не регулируемая активация НСЕВ важна не только для приобретения канцерогенных свойств, но также для достижения инвазивного фенотипа (8). Роль МЕТ в опухолях человека выяснена с использованием нескольких экспериментальных способов и с определенностью доказана благодаря открытию мутаций, активирующих МЕТ, при наследуемых формах карцином (9, 10). Кроме того, конститутивная активация НСЕВ также часто встречается при спорадических злокачественных опухолях, и исследования данной и других лабораторий показали, что онкоген МЕТ сверхэкспрессируется в опухолях определенных гистотипов или активируется посредством аутокринных механизмов. Кроме того, ген МЕТ амплифицируется в гематогенных метастазах карцином прямой и ободочной кишки (11). Таким образом, вмешательство в активацию Мс1 становится многообещающим способом, препятствующим канцерогенным и метастатическим процессам. В последние годы предложено несколько методик блокирования аномальной передачи сигнала НСЕВ, нацеленных либо на НСЕВ, либо на его лиганд. Такие подходы включают применение антагонистов НСЕ, нейтрализующих антител к НСЕ, ловушек НСЕВ, низкомолекулярных ингибиторов сайтов связывания АТФ на НСЕВ или таких малых молекул, как гелданамицин, полипептидов домена 8Н2 и рибозимов (обзор 12).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела, направленного против внеклеточного домена рецептора фактора роста гепатсцитов (НСЕВ), в лечении опухолей и/или метастазов у субъекта, пораженного опухолью, и в диагностических устройствах для выявления неопластических клеток либо ίη νΐνο, либо ίη νίΐτο.

Таким образом, целью настоящего изобретения является применение ί) моноклонального анти-Μеΐ антитела, ίί) фрагмента, содержащего область связывания эпитопа моноклонального анти-МеС антитела и/или ίίί) генетически сконструированного антитела, содержащего область связывания эпитопа или определяющие комплементарность области (СЭВ) моноклонального анти-Меΐ антитела для получения лекарственного средства для лечения опухолей и метастазов у субъекта, страдающего опухолью, и для диагностических устройств для выявления неопластических клеток либо ίη νΐνο, либо ίη νίΐτο, где моноклональное анти-Меΐ антитело - обозначенное анти-МЕТ-В - получают с использованием линии клеток гибридомы, депонированной в А^атаей В^есНш^^у СегИег (АВС), 1н1ег1аЬ Се11 Ьше ί.’ο1^ΐίοη (1СЬС), 8. 8. Ваиса Се11и1е е Сойще ίη СМР, йат^ Вο5аηηа Веп/ί 10, Сеηονа, Ιΐα^ с номером доступа 1СЬС ΡΌ 05006.

Другой целью настоящего изобретения является применение вектора, содержащего по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности, кодирующей область связывания эпитопа или области СЭВ моноклонального анти-Меΐ антитела, полученного с использованием линии клеток гибридомы 1СЬС ΡΌ 05006, для получения лекарственного средства для лечения опухолей и метастазов у субъекта, пораженного опухолью.

Другой целью настоящего изобретения является применение ί) моноклонального анти-Меΐ антитела, ίί) фрагмента, содержащего область связывания эпитопа моноклонального анти-Меΐ антитела и/или ίίί) генетически сконструированного антитела, содержащего область связывания эпитопа или области СЭВ моноклонального анти-Меΐ антитела и по меньшей мере одного ингибитора киназы в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии опухоли и/или метастазов.

Другой целью настоящего изобретения является способ скрининга соединений, способных связы

- 1 015580 ваться по меньшей мере с одной частью внеклеточного домена рецептора фактора роста гепатоцитов (НОЕВ) для идентификации соединений, фармакологически активных для профилактики и/или лечения опухоли и/или метастазов.

Другой целью настоящего изобретения является применение антитела анти-МЕТ-В, его фрагментов и/или генетически сконструированных антител, содержащих область связывания эпитопа или области СВЭ антитела анти-МЕТ-В, в виде диагностического средства для выявления неопластических клеток либо ίη νίνο, либо ίη νίίτο.

Согласно настоящему изобретению указанные цели достигают способами, определенными формулой изобретения, которая следует далее, являющейся неотъемлемой частью технического описания настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Анти-МЕТ-В снижает активацию НОЕВ и сигнальную трансдукцию. (А) Оценка активации НОЕВ. На клетки СТЬ16 воздействовали анти-МЕТ-В в течение указанных периодов времени. НОЕВ иммунопреципитировали из клеточных лизатов и Вестерн-блоты анализировали с использованием в качестве зондов указанных антител. Обработка анти-МЕТ-В приводила к снижению активации рецептора более явно, чем супрессия рецептора, как показано при количественной оценке плотности полосы. (В) Анализ передачи сигнала НОЕВ. Клетки предварительно обрабатывали либо У8У-О, либо анти-МЕТ-В и затем стимулировали НОЕ в течение указанных периодов времени. Фосфорилирование АЙ оценивали в общих лизатах клеток. Как показано на верхней панели, анти-МЕТ-В снижали как основную, так и НОЕиндуцированную активацию АЙ.

Фиг. 2. Анти-МЕТ-В ингибирует трансформированный фенотип злокачественных клеток ίη νίίτο. (А) Независимый от заякоривания рост клеток ОТЬ16. Предварительно обработанные клетки высевали в 0,5% агар. Затем клетки поддерживали в присутствии указанных количеств антител анти-МЕТ-В или У8У-О и через 10 дней выросшие колонии окрашивали. Независимый от заякоривания рост был в значительной степени ингибирован даже при низких дозах анти-МЕТ-В. (В) Анализ инвазии. МОА-МВ-435 β 4 предварительно обрабатывали указанными антителами в течение 24 ч перед посевом в покрытую матригелем камеру Тгапз\\'с11. Нижнюю камеру заполняли ИМЕМ 2%ЕВ8+100 нг/мл НОЕ. Через 24 ч мигрировавшие клетки окрашивали и подсчитывали. Способность к инвазии в ответ на НОЕ выражали в виде кратности увеличения по сравнению с нестимулированными клетками. Как показано, обработка антиМЕТ-В значительно снижала инвазию клеток.

Фиг. 3. Анти-МЕТ-В ингибирует трансформированный фенотип злокачественных клеток ίη νίνο (А, В). Анализ образования опухолей. Мышам гшбс подкожно инъецировали 1,5 х10⁶ клеток ОТЬ16. После появления опухолей отбирали мышей, у которых наблюдали опухоли одного и того же размера, и затем инъецировали ίη зйи дважды в неделю 2 мкг/г либо У8У-О, либо анти-МЕТ-В. Объем опухолей измеряли в разных временных точках (А). Как показано, анти-МЕТ-В снижает рост опухолей у мышей нибс. которым прививали опухолевые клетки человека. Мышей умерщвляли через 8 недель после обработки и оценивали массу опухолей (В). У мышей, обработанных анти-МЕТ-В, опухоли были значимо меньше, чем у контрольных мышей (р<0,05). (С) Оценка активации НОЕВ. Срезы опухолей мышей, обработанных У8У-О (панель А) или анти-МЕТ-В (панель В) окрашивали антителом против фосфо-НОЕВ человека. Иммуногистохимический анализ опухолей выявил, что уровни активированного НОЕВ были сильно снижены у мышей, обработанных анти-МЕТ-В.

Фиг. 4. Обработка анти-МЕТ-В препятствует прогрессированию опухолей ίη νίνο. Мышам гшбс подкожно прививали 2,5х10⁶ клеток МОА-МВ-435 β4. Рост опухолей оценивали у необработанных мышей (А) и у мышей, обработанных: 10 мкг/г У8У-О, введенного в/б (В), 1 мкг/г анти-МЕТ-В, в/б (С), 10 мкг/г анти-МЕТ-В в/б (Ό) и 2 мкг/г анти-МЕТ-В 18 (Е). Как показано на диаграмме (К), анти-МЕТ-В ингибировало рост опухоли у мышей тШс, которым прививали опухолевые клетки человека. Иммуногистохимическое окрашивание антителами против фосфо-НОЕВ человека осуществляли на срезах опухоли, показанных на левой панели. Сильная активация НОЕВ имела место как у необработанных мышей (Е), так и у мышей, обработанных контрольным антителом (О). Введение анти-МЕТ-В приводило к ингибированию НОЕВ, которое происходило параллельно с нарушением роста опухоли. (Ь) Анализ легочных метастазов. Метастазы подсчитывали при микроскопическом обследовании срезов легкого после окрашивания гематоксилином/эозином. Зависимое от дозы снижение количества метастазов наблюдали у мышей, обработанных анти-МЕТ-В. (М-Ν) Оценка васкуляризации опухолей. Иммунофлуоресцентное окрашивание гистологических срезов опухолей осуществляли с использованием антитела против СЭ31 мыши. Количество и площадь сосудов оценивали флуоресцентной микроскопией. Как показано, и количество и размер сосудов уменьшались в ответ на обработку анти-МЕТ-В.

Фиг. 5. Анти-МЕТ-В индуцирует супрессию НОЕВ. Клетки ОТБ16 (А) и МИА-МВ-435 β4 (В) обрабатывали анти-МЕТ-В в течение указанных периодов времени. Равные количества суммарных клеточных лизатов обрабатывали для Вестерн-блоттинга и анализировали, используя антитела анти-НОЕВ (верхние панели) или в качестве контроля загрузки анти-Нзр70 (нижние панели). Как показано, антиМЕТ-В способно индуцировать супрессию НОЕВ как в сверхэкспрессирующих клетках (ОТЬ16), так и в

- 2 015580 клетках, экспрессирующих нормальные уровни НСЕК (ΜΌΑ-ΜΒ-435 β4). (С) Цитофлуориметрическая количественная оценка НСЕК на поверхности клеток. Клетки ΜΌΆ-ΜΒ-435 β4 инкубировали в среде отдельно (черные столбики) или с НСЕ (серые столбики) или анти-ΜΕΤ-Κ (белые стоблики). В указанных временных точках клетки окрашивали антителами против внеклеточного домена НСЕК (ΌΘ24). Как показано, анти-ΜΕΤ-Κ способно эффективно снижать количество поверхностного НСЕК, при этом максимальное снижение наблюдается через 30 ч после обработки.

Фиг. 6. Индуцированная антителом и зависимая от лиганда супрессия происходит различными путями. (А) Клетки НеЬа (верхняя панель) и СГЬ16 (нижняя панель) предварительно обрабатывали либо лактацистином (1ас!), либо конканамицином (сопс), либо обоими препаратами в течение 2 ч перед обработкой НСЕ или анти-ΜΕΤ-Κ. Супрессию НСЕК оценивали в общих лизатах клеток. В присутствии ингибиторов протеасом индуцированная лигандом супрессия НСЕК была ослаблена, тогда как индуцированная Ат супрессия не была ослаблена. В указанных условиях в клетках накапливался фрагмент 60 кД (стрелка), выявляемый только Ат, направленным против внутриклеточной части (анти-внутриклеточная часть Μеΐ). Кроме того, анализ с использованием в качестве зонда антител против убиквитина (В, верхняя панель) показал, что данный фрагмент мечен остатками убиквитина, что ожидаемо для молекулы, подвергаемой расщеплению протеосомами.

Фиг. 7. Анти-ΜΕΤ-Κ индуцирует протеолитическое расщепление НСЕК и шеддинг внеклеточного домена (эктодомена). (А) Клетки СГЬ16 метаболически метили 358-метионином и 358-цистеином и затем обрабатывали либо НСЕ, либо анти-ΜΕΤ-Κ в течение 4 ч. Надосадки собирали и иммунопрециптировали анти-НСЕК-ΑΤ, направленных против внеклеточного домена. Разгонку в гелях осуществляли в невосстанавливающих (верхняя панель) или восстанавливающих (нижняя панель) условиях. В отсутствие восстановителей цепи α и β НСЕК мигрировали в виде комплекса, тогда как две полосы двигались отдельно в присутствии β-меркаптоэтанола. Как показано на фиг., анти-ΜΕΤ-Κ, но не НСЕ, способно индуцировать щеддинг эктодомена НСЕК. (В) Анти-ΜΕΤ-Κ также индуцирует шеддинг эктодомена в эндотелиальных клетках. Клетки НИУЕС подвергали воздействию антитела в течение указанных периодов времени. Культуральную среду собирали и иммунопреципитировали антителом, узнающим внеклеточную часть β-цепи НСЕК. Вестерн-блоты анализировали, используя в качестве зонда такое же антитело против внеклеточного домена НСЕК. (С, Ό) шеддинг эктодомена НСЕК зависит от дозы и времени. Клетки стимулировали возрастающими количествами анти-ΜΕΤ-Κ (С) или в течение различных периодов времени (Ό). Культуральную среду обрабатывали, как описано в пункте (В).

Фиг. 8. Активация сигнальной трансдукции не требуется для шеддинга эктодомена НСЕК. Клетки Со§-7 трансфицировали различными мутантами НСЕК и через 48 ч обрабатывали анти-ΜΕΤ-Κ в течение 4 ч. Равные количества общих клеточных лизатов и кондиционированных сред обрабатывали для Вестерн-блоттинга. Как показано, анти-ΜΕΤ-Κ способно индуцировать супрессию и шеддинг эктодомена всех мутантов НСЕК. НСЕК ΚΌ = НСЕК с недействующей киназой, т.е. с утратой киназной активности; НСЕК ЭонЫе = мутант НСЕК, в котором отсутствуют 2 стыковочных тирозина 1349, 1356, и которые, соответственно, не способны привлекать к себе трансдукторов сигнала; НСЕК-СЕР = мутант НСЕК, в котором внутриклеточная часть полностью заменена последовательностью СЕР.

Фиг. 9. Сброшенный эктодомен НСЕК ведет себя как ловушка. Клетки, предварительно обработанные анти-ΜΕΤ-Κ, стимулировали, используя НСЕ, либо в отсутствие, либо в присутствии эктодомена НСЕК ^е! ес!о) в культуральной среде. Как показано, сброшенный эктодомен НСЕК снижал активацию Ак1 и вел себя как ловушка.

Фиг. 10. Клетки, генетически модифицированные посредством опосредованным лентивирусом переносом генов, экспрессируют анти-ΜΕΤ-Κ. (А) Схематичное изображение двунаправленного лентивирусного вектора (интегрируемая форма), используемого для экспрессии анти-ΜΕΤ-Κ; ЬЕК: длинные концевые повторы Н1У-1; область И3 делетирована в положении -18 из области К. 8Ό: донор сплайсинга. 8А: акцептор сплайсинга. Поли-А 8У40: сайт полиаденилирования вируса обезьян 40. С1е: конститутивный транспортный элемент. полученный из вируса обезьян Мейзена-Пфейзера. РтшСМУ: минимальный промотор, полученный из цитомегаловируса. 11РСК: промотор гена фосфоглицерокиназы человека. РКЕ. Посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка. ЕЬАС-метка: последовательность, кодирующая 3-кратно повторяемый эпитоп ΌΎΚΌΌΌΚ. Н18-метка: последовательность, кодирующая 7 остатков гистидина. (В) Вестерн-блот-анализ надосадков культур, не содержащих сыворотки (75 мкл каждого образца), собранных из двух типичных клеточных линий, трансдуцированных лентивирусным вектором, несущим кДНК анти-ΜΕΤ-Κ. Образцы подвергали 8Э8-ПААГ в восстанавливающих условиях и соответствующие фильтры анализировали, используя антитело против 1д мыши. (С) Таблица, в которой показана количественная оценка анти-ΜΕΤ-Κ в надосадках культуры, полученных из панели клеточных линий, трансдуцированных лентивирусным вектором, несущим кДНК анти-ΜΕΤ-Κ.

Фиг. 11. Рекомбинантное анти-ΜΕΤ-Κ связывает с высокой аффинностью внеклеточный домен Μеΐ. (А) Вестерн-блот-анализ клеточных лизатов, содержащих рецептор Μеΐ, иммунопреципитированный анти-ΜΕΤ-Κ-антителом, полученным из разных источников (гибридома или генетически модифицированная линия клеток карциномы). Иммунопреципитацию осуществляли, инкубируя сефарозу-белок С с

- 3 015580 надосадками культуры клеток из 1: гибридомы, продуцирующей неродственное моноклональное антитело; 2: гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело анти-МЕТ-К; 3: клеток ΜΌΆ-ΜΒ 435, инфицированных лентивирусным вектором, несущим кДНК моноклонального антитела анти-МЕТ-К; 4: неинфицированные клетки ΜΌΆ-ΜΒ 435. Образцы подвергали ЗЭЗ-ПААГ в восстанавливающих условиях и соответствующие фильтры анализировали, используя анти-Ме! антитело, направленное против Сконца рецептора. (В) Анализ связывания анти-МЕТ-К и рекомбинантного анти-МЕТ-К с внеклеточным доменом рецептора Ме!. 96-луночный планшет, покрытый очищенным внеклеточным доменом МЕТ, слитым с Ее-доменом, полученным из 1д человека, (100 нг/лунку) инкубировали с возрастающими концентрациями очищенного анти-МЕТ-К или рекомбинантного анти-МЕТ-К (от 0 до 5,5 нМ). Кривую связывания получали, используя связанное с НКР антитело против 1д мыши. Для контроля специфичности связывания авторы осуществляли такой же анализ, используя лунки, покрытые Ес-Коп (химерным белком, образованным слиянием Ес-домена 1д человека с внеклеточным доменом рецептора Коп, белка, относящегося к семейству рецепторов Ме!).

Фиг. 12. Рекомбинантное анти-МЕТ-К индуцирует протеолитическое расщепление НСЕК и шеддинг внеклеточного домена (эктодомена). Клетки линии НСТ-116, линии клеток карциномы прямой и ободочной кишки, инкубировали в отсутствие сыворотки в течение 24 ч с указанным количеством очищенного анти-МЕТ-К (А) или рекомбинантного анти-МЕТ-К (В). Общие клеточные лизаты (верхние панели) и надосадки культур клеток (нижние панели) подвергали ЗЭЗ-ПААГ с последующим Вестернблот-анализом. Уменьшение количества зрелой формы Ме! (р145) в клетках и соответствующее увеличение количества эктодомена Ме! (р80) в надосадках культуры контролировали, анализируя фильтры с использованием анти-Ме! моноклонального антитела ΌΕ-21, которое узнает домен, локализованный во внеклеточной части β-цепи Ме!.

Фиг. 13. Трансдукция лентивирусным вектором, кодирующим анти-МЕТ-К, ингибирует трансформированный фенотип злокачественных клеток ίη νίΐτο и ίη νΐνο. (А) Анализ независимого от заякоривания роста. Клетки НСТ-116, трансдуцированные (анти-МЕТ-К) или нетрансдуцированные (^Т) лентивирусным вектором, кодирующим анти-МЕТ-К, высевали в 0,5% агар. Затем клетки поддерживали в среде с добавлением 2% ЕСЗ + 80 нг/мл НСЕ. Колонии подсчитывали через 14 дней; сверху показана типичная лунка; снизу на графике представлено количество колоний (подсчитано на основании трех повторов). (В) Анализ инвазии. Клетки НСТ-116, трансдуцированные (анти-МЕТ-К) или нетрансдуцированные (^Т) лентивирусным вектором, кодирующим анти-МЕТ-К, помещали в покрытую матригелем камеру ТгапотеП. Нижнюю камеру заполняли средой с 2% ЕЕ5З + 80 нг/мл НСЕ. Через 24 ч подсчитывали клетки, прикрепленные к нижней части фильтров. Картины представляют типичные области фильтров. (С) Инкубационный период опухоли ίη νΐνο. Клетки НСТ-116, трансдуцированные (анти-МЕТ-К) или нетрансдуцированные (^Т) лентивирусным вектором, кодирующим анти-МЕТ-К, инъецировали подкожно в бок бестимусных мышей пибе (3х10⁶ клеток/мышь, п=6 для каждой группы). Массу опухолей оценивали каждые 2 дня с помощью циркуля. Мыши считались позитивными в отношении присутствия опухоли, когда масса опухоли превышала 15 мм³. (Ό) Рост опухолей ш νΐνο. Клетки НСТ-116, трансдуцированные (анти-МЕТ-К) или нетрансдуцированные (^Т) лентивирусным вектором, кодирующим анти-МЕТ-К, инъецировали подкожно в бок бестимусных мышей пибе (3х10⁶ клеток/мышь, п=6 для каждой группы). Кинетику роста опухоли оценивали, измеряя массу опухоли с помощью циркуля каждые 3 дня. На 65 день всех мышей умерщвляли.

Фиг. 14: Прямая доставка внутрь опухоли лентивирусного вектора, кодирующего анти-МЕТ-К, ингибирует рост опухоли. Клетки НСТ-116 (4х 10⁶ клеток/мышь) инъецировали подкожно в бок бестимусных мышей пибе. Когда масса опухоли составляла около 10 мм³ лентивирусные векторные частицы (1 [мкг р24 /мышь) вводили внутрь опухоли в 0 день и 3 день. Одна группа (контроль) получала векторные частицы, кодирующие СЕР, тогда как другая группа получала векторные частицы, кодирующие антиМЕТ-К (анти-МЕ!-К). Кинетику роста опухоли оценивали, измеряя массу опухоли с помощью циркуля каждые 3 дня.

Фиг. 15. Карта плазмиды, кодирующей анти-МЕТ-К.

Фиг. 16. Карта плазмиды, кодирующей анти-МЕТ-К ЕЬАС-Н18.

Фиг. 17. Схематичное изображение доменов, полученных из внеклеточной части НСЕК (эктодомен Ме!).

Фиг. 18. Анти-МЕТ-К специфично узнает эпитоп, локализованный в области 1РТ. Кондиционированные среды от клеток МЭА-МВ-435, трансдуцированных лентивирусными векторными частицами, кодирующими меченую тус ловушку Ме!, меченый тус ЗЕМА РЗ1 и меченый тус РЗ1 1РТ1-4, иммунопреципитировали анти-МЕТ-К-антителом и выявляли с помощью Вестерн-блота, используя биотинилированное анти-тус-антитело (правая панель). Равные количества кондиционированной среды наносили в качестве контроля экспрессии белка (левая панель). Контроль: кондиционированная среда от клеток МИА-МВ-435, трансдуцированнх пустым лентивирусным вектором. Ловушка Ме!: кондиционированная среда от клеток МЭА-МВ-435, трансдуцированных лентивирусным вектором, экспрессирующим полный внеклеточный домен НСЕК. РЗ1-1РТ: кондиционированная среда от клеток МЭА-МВ-435, трансдуциро

- 4 015580 ванных лентивирусным вектором, экспрессирующим домены Ρ8Ι, ΙΡΤ-1, ΙΡΤ-2, ΙΡΤ-3, ΙΡΤ-4 НОРК. 8ΕΜΑ-Ρ8Ι: кондиционированная среда от клеток ΜΌΑ-ΜΒ-435, трансдуцированных лентивирусным вектором, экспрессирующим домены 8ета и Ρ8Ι НОРК. Справа показана молекулярная масса в кД.

Фиг. 19. Анти-ΜΕΤ-Κ узнает эпитоп, локализованный в области ΙΡΤ-4. Клеточные лизаты клеток ΜΟΑ-ΜΒ-435, трансдуцированных лентивирусными векторными частицами, экспрессирующими отдельные области ΙΡΤ-1, ΙΡΤ-2, ΙΡΤ-3, ΙΡΤ-4, причем все области мечены Дад, иммунопреципитировали анти-МЕТ-К-антителом и выявляли на Вестерн-блоте, используя анти-Дад-антитело (левая панель); в качестве контроля экспрессии белка сходные количества клеточных лизатов иммунопреципитировали анти-Дад-антителом и выявляли на Вестерн-блоте, используя такое же анти-Дад-антитело (правая панель). Контроль: клеточный лизат клеток ΜΌΑ-ΜΒ-435, трансдуцированных пустым лентивирусным вектором. ΙΡΤ1: клеточный лизат клеток ΜΌΑ-ΜΒ-435, трансдуцированных лентивирусным Еектором, экспрессирующим область ΙΡΤ-1 НОРК. ΙΡΤ2: клеточный лизат клеток ΜΌΑ-ΜΒ-435, трансдуцированных лентивирусным вектором, экспрессирующим область ΙΡΤ-2 НОРК. ΙΡΤ3: клеточный лизат клеток ΜΌΑ-ΜΒ-435, трансдуцированных лентивирусным вектором, экспрессирующим область ΙΡΤ-3 НОРК. ΙΡΤ4: клеточный лизат клеток ΜΌΑ-ΜΒ-435, трансдуцированных лентивирусным вектором, экспрессирующим область ΙΡΤ-4 НОРК. Справа показана молекулярная масса в кД.

Фиг. 20. Анти-Μеΐ-К специфично красит рецептор НОР в интактных клетках. Панель А: Профил= О'ГЕ-16, анализируемых проточной цитометрией с использованием анти-Μеΐ-К-антитела. Тонкая линия: О'ГЕ-16, инкубированные с антителом, являющимся контролем изотипа; жирная линия: ОΤ^-16, инкубированные с анти-Μеΐ-К. ΜΡΙ: Средняя интенсивность флуоресценции. Панель С: Анализ иммунофлуоресценции клеток СЕИб, меченых анти-Μеΐ-К-антителом, выявляемых антителом козы против [д мыши, конъюгированным с флуорохромом Α1еxа Р1иог 488. Панель В: Клетки ОΤ^-16, меченые только антителом против мыши^^а Р1иог 488. (Исходное увеличение х 63).

Фиг. 21. Последовательность нуклеиновой кислоты (а) и аминокислотная последовательность (Ь) тяжелой цепи анти-ΜΕΤ-Β.. Области СОК подчеркнуты как в нуклеотидной, так и в аминокислотной последовательности.

Фиг. 22. Последовательность нуклеиновой кислоты (а) и аминокислотная последовательность (Ь) легкой цепи анти-ΜΕΤ-К. Области СОК подчеркнуты как в нуклеотидной, так и в аминокислотной последовательности.

Подробное описание изобретения

Рецептор фактора роста гепатоцитов, кодируемый протоонкогеном МЕТ, является тирозинкиназным рецептором, который при активации вызывает сложный спектр биологических ответов, известных как инвазивный рост (8). Инвазивный рост включает индукцию и координирование: пролиферации клеток, миграции, дифференцировки и жизнеспособности. При физиологических условиях такая программа инвазивного роста играет центральную роль в органогенезе во время развития эмбриона, но при запуске в случае злокачественной опухоли она вносит вклад в прогрессирование опухоли и метастазы (13).

Вовлечение НОРК в опухоли человека в настоящее время твердо установлено, так как миссенсмутации зародышевой линии гена МЕТ ответственны за некоторые наследственные формы злокачественных опухолей (9, 10), и аномальная активация НОРК показана в большинстве типов солидных опухолей, что часто коррелирует с плохим прогнозом (14). Наиболее частым изменением в злокачественных опухолях человека является сверхэкспрессия (15), которая приводит к конститутивной димеризации и активации рецептора даже в отсутствие лиганда (16). Повышенная экспрессия НОРК может быть следствием (ί) амплификации гена, как в опухолях прямой и ободочной кишки, где МЕТ дает неопластическим клеткам избирательное преимущество в отношении метастазирования в печень (11), (ιί) усиленной транскрипции, индуцированной другими онкогенами, такими как Как, Ке1 и Είκ (17, 18), (ίίί) активируемой гипоксией транскрипции, в данном случае более высокое количество рецептора делает клетки гиперчувствительными к НОР и стимулирует инвазию опухоли (19).

В настоящее время в клинической практике используют две методики вмешательства в тирозинкиназные рецепторы (ΡΤΚ): (ί) лечение малыми молекулами, ингибирующими активность тирозинкиназы; (ίί) лечение антителами, мешающими активации рецептора.

Настоящее изобретение относится к применению терапии опухолей анти-НОРК антителом, и в частности, моноклональным анти-Μеΐ антителом обозначенным анти-ΜΕΤ-К, продуцируемым линией клеток гибридомы, депонированной в ΚΈΕ’ с номером доступа ΡΌ 05006, которое, как было неожиданно обнаружено, способно индуцировать супрессию рецептора.

В одном варианте настоящее изобретение относится к применению моноклонального антитела анτη-ΜΕΤ-К для получения лекарственного средства для лечения опухолей и метастазов у пациента, страдающего опухолью.

В следующем варианте настоящее изобретение относится к применению ημη-ΜΕΤ-Η антитела для производства диагностических устройств для выявления неопластических клеток либо ίη νίνο, либо ίη νίίτο.

Анти-ΜΕΤ-Ρ является моноклональным антителом (мАт), специфичным к внеклеточному домену

- 5 015580

НОРК (20). Указанное моноклональное антитело не запускает все биологические эффекты, вызываемые фактором роста гепатоцитов (подвижность, пролиферацию, жизнеспособность клеток, инвазию, тубулогенез и ангиогенез), а индуцирует только подвижность. Кроме того, оно усиливает конститутивную экспрессию активатора плазминогена урокиназного типа, но не способно индуцировать и поддерживать экспрессию рецептора активатора плазминогена урокиназного типа в течение длительных периодов времени. Указанное мАт активирует фосфорилирование рецептора, которое будучи строго зависимым от бивалентности мАт требует димеризации рецептора.

Агонистическая способность данного антитела как такового не достаточна, чтобы подтвердить его терапевтическую активность. Действительно, другое моноклональное анти-МЕТ-К антитело (ΌΘ-24), которое исследовали авторы изобретения, не способно индуцировать эффективную супрессию рецептора, и оно не стимулирует шеддинг внеклеточной части рецептора.

Анти-МЕТ-К не препятствует взаимодействию НОРК с НОР, но эффективно стимулирует супрессию НОРК, как показано в примере 4 ниже и обсуждается при описании фиг. 5. Такое взаимодействие приводит к ингибированию опосредованной НОРК сигнальной трансдукции и, в частности, пути Лк1. который как известно вовлечен в антиапоптозный ответ.

Как будет понятно из описанных ниже результатов, авторы настоящего изобретения показали, что обработка ίη νίίτο антителом анти-МЕТ-К приводила к ухудшению способности клеток расти независимым от заякоривания образом (см. пример 2 и фиг. 2), свойства, которое требует избегания апоптоза вследствие отсутствия заякоривания. Кроме того, как подробно описано в примере 3, авторы настоящего изобретения наблюдали, что ίη νίνο у животных, обработанных анти-МЕТ-К, в опухолях проявляется повышенная скорость апоптоза без значительных изменений скорости пролиферации. С другой стороны, авторы изобретения не наблюдали модификации свойств клеточного роста в ответ на антитело, ни ίη νίίτο, ни ίη νίνο, что согласуется с отсутствием ингибирующего влияния анти-МЕТ-К на активацию пути МАРК. Такое расстройство способности НОРК активировать различные пути не является новым, оно уже было показано для различных мутантов НОРК (21) и в ответ на частичные агонисты НОРК (22).

Индуцированная антителом супрессия НОРК включает шеддинг внеклеточной части рецептора. Шеддинг эктодомена представляет собой процесс, при котором внеклеточный домен мембранных белков протеолитически высвобождается с клеточной поверхности, таким образом обеспечивая клетке возможность быстро изменять свою поверхность в ответ на стимулы окружающей среды и давать растворимые регуляторы. Авторы настоящего изобретения приводят доказательство такой активности антиМЕТ-К в примерах 6 и 7.

В настоящей заявке авторы изобретения представляют доказательства - в частности, в примере 3 что антитело анти-МЕТ-К является активным ίη νίνο, при этом оно ослабляет рост опухоли и образование спонтанных метастазов из злокачественных клеток, прививаемых мышам нибс. Эксперименты свидетельствуют, что указанные эффекты опосредованы действием антитела как на злокачественные клетки, так и на микроокружение. Действительно, эндотелиальные клетки экспрессируют НОРК (24), и авторы изобретения показали, что анти-МеЕК индуцирует шеддинг НОРК также и в таком типе клеток (данные не показаны). Неоваскуляризация первичной опухоли является обязательным требованием как для роста опухоли, так и для метастазов (23), и твердо установлено, что НОР является сильным ангиогенным фактором (24). Кроме того, при активации НОРК происходит увеличение высвобождения УЕОР и других ангиогенных факторов (48-49-40). Таким образом, влияние на васкуляризацию опухоли также может быть непрямым, так как ингибирование функции Меί в опухолевых клетках может отменять высвобождение таких факторов из опухоли. Авторы настоящего изобретения наблюдали значимое снижение неоваскуляризации в опухоли вследствие уменьшения количества прорастающих сосудов микроокружения после обработки анти-МЕТ-К.

Неважно, что активность анти-МЕТ-К по отношению к клеткам-хозяевам не влияет на функционирование различных органов, таких как селезенка, костный мозг, печень, сердце, кости и почки, в которых не наблюдается явных патологических изменений (данные не показаны) после долговременного воздействия антителом. Таким образом, несмотря на узнавание НОР-К как в нормальных, так и в неопластических клетках, анти-МЕТ-К проявляет способность выявлять сверхэкспрессию НОР-К и индуцировать изменения жизнеспособности клеток.

В заключение, результаты показали, что индуцированная анти-МЕТ-К супрессия НОРК представляет собой механизм, который может быть выбран для иммунотерапии, и применение анти-МЕТ-К или его фрагментов в фармацевтической композиции может обеспечить дальнейший путь лечения опухолей и профилактики метастазов у пациентов, пораженных опухолью.

Кроме того, анти-МЕТ-К можно использовать в качестве диагностического средства для выявления неопластических клеток либо ίη νίνο, либо ίη νίίτο, например, используя мечение анти-МЕТ-К подходящими метками.

Анти-МЕТ-К согласно настоящему изобретению может быть получено обычными способами у животных или предпочтительно способами генетической инженерии.

Подразумевается, что применение моноклонального антитела анти-МЕТ-К согласно настоящему изобретению также включает применение генетически сконструированных и гуманизированных антител

- 6 015580 и антител, меченых подходящими диагностическими маркерами. Генетически сконструированные и гуманизированные антитела и способы их получения известны в данной области. См. обзор (25).

Применение анти-МЕТ-К также включает применение фрагментов, содержащих область связывания эпитопа, например пептидов, содержащих область связывания эпитопа или определяющих комплементарность области (СЭК), фрагменты Γν, зсЕу. ГаЬ, ГаЬ', Г(аЬ')₂. Обычные фрагменты, как правило, получают протеолитическим расщеплением, но также их можно получать химическим синтезом, таким как синтез в жидкой или твердой фазе, а также технологией рекомбинантных ДНК.

Анти-МЕТ-К и его фрагменты предпочтительно используют в фармацевтических композициях в форме растворимого белка, доставку которого можно осуществлять, используя обычные способы доставки лекарственных средств. Введение фармацевтических композиций, содержащих антитело антиМЕТ-К и/или его фрагменты, можно осуществлять любым способом, известным специалисту. Например, композицию можно вводить в водном растворе, который инъецируют или инфузируют пациенту. Определение точной дозы зависит от ряда конкретных переменных, включая возраст и массу пациента, и заключается в рутинном экспериментировании в рамках компетенции специалиста.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в получении фармацевтических композиций, содержащих моноклональное антитело анти-МЕТ-К, меченое подходящим диагностическим маркером, для выявления ίη νίνο или ίη νίίτο неопластических клеток у пациента страдающего опухолью.

Настоящее изобретение относится к получению ДНК-вектора, содержащего синтетический промотор, полученный связыванием минимального корового промотора (промотор тшСМУ) перед и в противоположной ориентации по отношению к эффективному промотору гена фосфоглицераткиназы человека, и ДНК, кодирующую по меньшей мере часть моноклонального антитела анти-МЕТ-К. Последовательности ДНК, находящиеся в векторе, кодируют легкую и/или тяжелую цепь анти-МЕТ-К; консервативные замены в последовательностях ДНК также входят в объем настоящего изобретения, а также последовательности, модифицированные добавлением последовательностей меток на 5'- или З'-конце. Нуклеотидные последовательности кодирующие тяжелую и легкую цепь анти-МЕТ-К, представлены в 8ЕО ΙΌ N0: 1 и 8Е0 ΙΌ N0: 2, соответственно.

Кроме того, авторы изобретения модифицировали тяжелую цепь, добавив последовательность метки к З'-концу тяжелой цепи анти-МЕТ-К (8Е0 ΙΌ N0: 3). Такая последовательность обеспечивает возможность очистки моноклонального антитела с использованием колонки с никелем и специфично распознается анти-ГЕАС антителами (8ЮМА).

Хотя получение ДНК-векторов согласно настоящему изобретению можно осуществлять различными способами, известными в данной области, получение проиллюстрировано в примере 10.

В другом варианте настоящее изобретение относится к применению ДНК-вектора, содержащего ДНК, кодирующую связывающую эпитоп область моноклонального антитела анти-МЕТ-К, для получения лекарственного средства для лечения опухоли и метастазов у субъекта. Доставка ДНК-векторов согласно настоящему изобретению может быть осуществлена с использованием известных способов генной терапии. Например, см. (10).

Следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится к продукту, содержащему антитело анти-МЕТ-К и/или его фрагменты и ингибиторы киназ в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии опухолей. Примерами ингибиторов киназ, которые предпочтительно можно использовать в настоящем изобретении, являются аналог стауроспорина К252А (Са1Ьюс11ет-№уаЬюс11ет Ιηίΐ.; 36); РНА-665752 (32)-5-[(2,6-дихлорбензил) сульфонил]-3-[(3,5-диметил-4-{[(2К)-2-(пирролидин-1-илметил)пирролидин-1-ил]карбонил}-1Н-пиррол2-ил)метилен]-1,3-дигидро-2Н-индол-2-он (34); Ш11274 [(32)-Ы-(3-хлорфенил)-3-({3,5-диметил-4-[(4метилпиперазин-1-ил)карбонил]-1Н-пиррол-2-ил}метилен)-Ы-метил-2-оксоиндолин-5-сульфонамид] (37, 38, 35); 8И11271 [(32)-5-(2,3-дигидро-1Н-индол-1-илсульфонил)-3-({3,5-диметил-4-[(4-метилпиперазин1-ил)карбонил]-1Н-пиррол-2-ил}метилен)-1,3-дигидро-2Н-индол-2-он] (38); Ш11606 [(3Ζ)-Ν-(3хлорфенил)-3-{[3,5-диметил-4-(3-морфолин-4-илпропил)-1Н-пиррол-2-ил]метилен}-Ы-метил-2оксоиндолин-5-сульфонамид] (38).

Авторы изобретения действительно наблюдали, что механизм ингибирования, активируемый антиМЕТ-К, не требует тирозинкиназной активности НСЕК. Указанное свойство дает существенное преимущество в способе терапии. Действительно, в клинической практике часто комбинируют разные лекарственные средства, чтобы усилить влияние на молекулу-мишень. Таким образом, в случае НСЕК можно комбинировать ингибиторы киназ с антителом, обеспечивая одновременное действие как на активацию, так и на уровни НСЕК. Вероятно это усиливает терапевтическую эффективность целенаправленной терапии опухолей, сверхэкспрессирующих Мер благодаря предотвращению как роста опухоли, так и приобретения инвазивного-метастатического фенотипа.

Часть продукта согласно настоящему изобретению, представленного антителом анти-МЕТ-К и его фрагментами, получают как указано выше. Ингибиторы киназ, используемые в комбинированном препарате согласно настоящему изобретению, могут быть получены обычными способами химического синтеза или генетической инженерии.

- 7 015580

В следующем варианте настоящее изобретение относится к способу скрининга соединений, способные связываться по меньшей мере с одной частью внеклеточного домена рецептора фактора роста гепатоцитов, при этом такие соединения обладают агонистической активностью по отношению к рецептору фактора роста гепатоцитов и являются фармакологически активными в профилактике и/или лечении опухоли и/или метастазов. В частности, такие соединения способны индуцировать супрессию рецептора фактора роста гепатоцитов или шеддинг по меньшей мере части внеклеточного домена рецептора фактора роста гепатоцитов.

Настоящее изобретение далее будет описано с обращением к предпочтительным вариантам в качестве неограничивающих примеров.

Антитела, ингибиторы и другие реагенты

Моноклональное анти-НСЕВ анти-МЕТ-В первоначально описано Рта! (20). Другими антителами, используемыми для иммунопреципитации и Вестерн-блот-анализа, являются: анти-НСЕВ-антитела ΌΘ24 и БЬ21 (узнающие внеклеточный домен НСЕВ, описанные в 20); антитела против фосфотирозина ΡΥ20 (ТгаикбисДои ЬаЬогаЮпсх). против убиквитина (ВаЬео), против Н§р70 (81ге55деп), против фосфоАк! (8ег473, Се11 81дпайпд Тесйпо1оду), против Ак! (8ап!а Сгих Вю!есйпо1од1е8), против внутриклеточного домена НСЕВ (С12, 8ап!а Стих Вю1ес11по1още5). Иммуногистохимические окрашивания осуществляли, используя: антитело против фосфо-НСЕВ человека (Се11 81дпа1тд) и антитело против СБ31 мыши (Рйатттдеп). В случае экспериментов ίη уйто и ίη у1уо в качестве контроля использовали антитело против вируса везикулярного стоматита (У8У-С, 8фта). Лактацистин и конканамицин приобретали из Са1Ьюсйет.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности анти-МЕТ-К

Трансляция нуклеотидной последовательности тяжелой цепи анти-МЕТ-В, соответствующей последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 1 и фиг. 21а, показана на фиг. 21Ь и в 8Е0 ГО Ио: 6.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, соответствующие областям СБВ, подчеркнуты на фиг. 21а и 21Ь; их аминокислотные последовательности представляют собой следующие последовательности: СБВ-Н1: 6ΥΤΕΤ8ΥΑ (8ЕС) ГО N0: 8); СБВ-Н2: ЮТ88СВТ (8 ЕС) ГО N0: 9); СБВ-Н3: А8ВСΥ (8ЕС) ГО N0: 10).

Трансляция нуклеотидной последовательности легкой цепи анти-МЕТ-В, соответствующей последовательности 8Е0 ГО N0: 2 и фиг. 22а, показана на фиг. 22Ь и в 8Е0 ГО №: 7.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, соответствующие областям СБВ, подчеркнуты на фиг. 22а и 22Ь; их аминокислотные последовательности представляют собой следующие последовательности: СБВ-Ы: 08\Ί)ΥΙ)6(.ι8Υ (8 ЕС) ГО N0: 11); СБВ-Ь2: АА8 (8ЕС) ГО N0: 12); СБВ-Ь3: ^^8ΥЕ^Ρ^Т (8ЕС) ГО N0: 13).

Временная трансфекция клеток 293Т для продуцирования лентивирусных векторов

Примерно за 24 ч до трансфекции 6,0х10⁶ клеток 293Т высевали на чашки диаметром 15 см. За 2 ч до трансфекции культуральную среду заменяли, добавляя 22 мл ΙΜΌΜ, дополненной инактивированной нагреванием ЕВ8 (1,0%), пенициллином (25 ед./мл), стрептомицином (25 ед./мл) и глутамином (1%). Смесь плазмидной ДНК для трансфекции получали добавлением: плазмиды ЕЛУ (У8У-С), 9 мкг; плазмиды РАСКАСГЫС рМБЬд/рВВЕ, 16,2 мкг; плазмиды ВЕУ, 6, 25 мкг; векторной плазмиды для переноса №330 или №331, 37,5 мкг. Раствор плазмид готовили в конечном объеме 1125 мкл, используя 0,1Х ТЕ/6Н₂0 (2:1). Добавляли 125 мкл 2,5 М СаС1₂ и оставляли при комнатной температуре на 5'. Затем при встряхивании с полной скоростью добавляли 1250 мкл 2Х-раствора НВ8 и затем сразу же по каплям добавляли в культуру клеток. СаР1-преципитированную плазмидную ДНК инкубировали в течение 14-16 ч, затем среду заменяли свежей средой с добавлением 1 мМ бутирата натрия (18 мл на чашку). Надосадок культуры клеток, содержащий векторные частицы, собирали через 30-36 ч после замены среды. После сбора надосадки центрифугировали при 2500 об./мин в течение 10', фильтровали через 0,2 мкм-фильтр и хранили при -80°С.

Инфекция клеток-мишеней надосадком клеток, содержащим лентивирусный вектор

10⁵ клеток высевали в свежей культуральной среде с добавлением 10% ЕВ8, глутамина. Для инфекции линии клеток инкубировали в присутствии 8 мкг/мл полибрена с надосадком, содержащим лентивирусные векторные частицы, полученные как описано выше, с конечной концентрацией векторных частиц от 10 до 150 нг/мл эквивалента Сад р24 ВИЧ-1 (измерение в анализе ЕЫ8А). Через 18 ч среду заменяли и клетками давали возможность расти. Когда культура достигала слияния в монослое на 80% клетки инкубировали в бессывороточной среде и через 72 ч собирали надосадок, содержащий анти-МЕТ-В.

Анализ супрессии НСЕК

Клетки поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (БМЕМ) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка. Обработки антителами и НСЕ осуществляли в бессывороточной среде, используя 80 мкг/мл и 80 нг/мл, соответственно. В указанных случаях клетки перед стимуляцией предварительно инкубировали в течение 2 ч либо с 10 мкМ лактацистина, либо 100 нМ конканамицина. Для анализа расщепления НСЕВ клетки лизировали в ЬВ-буфере (2% 8Ό8, 0,5 М трис-НС1 рН 6,8) и концентрацию белка в клеточных лизатах оценивали, используя набор для анализа белка ВСА (Р1егсе). Затем эквивалентные количества суммарных белков анализировали в 8Б8-ПААГ и на Вестерн-блотах. Для

- 8 015580 экспериментов по иммунопреципитации клетки лизировали в буфере ЕВ (20 мМ трис-НС1, рН 7,4, 5 мМ ΕΌΤΑ, 150 мМ ЫаС1, 10% глицерина, 1% тритона Х-100) в присутствии ингибиторов протеаз и 1 мМ Ναортованадата. После иммунопреципитации соответствующими антителами осуществляли промывки в условиях высокой жесткости. Затем иммунопреципитированные белки обрабатывали для Вестернблоттинга согласно стандартным способам. Конечное выявление осуществляли, используя систему регистрации ЕСЬ (Атегзйат).

Метаболическое мечение и анализ шеддинга НСЕК. Клетки подвергали голоданию без сыворотки в течение 16 ч, импульсно метили [³⁵8]-метионином и [³⁵8]-цистеином (100 мккюри/мл, Атегзйат Согр.) в течение 30 мин в среде ΌΜΕΜ, не содержащей метионина и цистеина, и затем обрабатывали либо антиΜΕΤ-К, либо У8У-С или НСЕ в течение 4 ч. Кондиционированные среды собирали и подвергали иммунопреципитации антителом против внеклеточного домена НСЕК. Иммунопреципитированные белки разделяли в 8И8-ПААГ и осуществляли авторадиографию, как описано ранее в (26).

Биологические анализы ΐη νϊίΐΌ

Для оценки независимого от заякоривания роста СТБ16 предварительно обрабатывали либо антиΜΕΤ-К, либо У8У-С в истощенной среде в течение 48 ч. Затем 1500 клеток высевали в ΌΜΕΜ с 2% ЕВ8 плюс 0,5% мягкого агара (агароза 8еаР1ацие, ВМА) в каждой лунке и поддерживали в присутствии указанных количеств антител и НСЕ в течение 10 дней. Наконец, выросшие колонии визуализировали, используя окрашивание тетразолием (47). Анализ инвазии осуществляли в камерах ТгаиьетеИ (Согшпд). Поликарбонатные фильтры (размер пор 8 мкм) покрывали 15 мкг/см² базальной мембраны Μаίπде1 (Со11аЬога11уе Кезеагсй). Обработку антителами осуществляли, предварительно инкубируя клетки в течение 24 ч перед посевом 20 нМ анти-ΜΕΤ-Κ или У8У-С. Затем 5х10⁴ клеток высевали на верхнюю сторону фильтров и инкубировали в ΌΜΕΜ+2% ЕВ8 с 100 нг/мл НСЕ, добавляемыми в нижние лунки камер. Через 48 ч клетки с верхней стороны фильтров удаляли механически. Клетки, мигрировавшие на нижнюю сторону фиксировали, окрашивали и подсчитывали. Коэффициент миграции получали делением количества клеток, мигрировавших при стимуляции НСЕ, на количество мигрировавших без стимуляции.

Мечение НСЕК антителами анти-Ме1-К ΐη νΐίτο

Для проточно-цитометрического анализа 10⁵ клеток СЕС-16 открепляли, используя 0,025% РВ8ΕΌΤΑ, промывали РВ8 и инкубировали с 50 мкг/мл анти-Μеί-К-антитела или таким же количеством используемого в качестве контроля изотипа мышиного 1д в течение 15' при комнатной температуре. После 2 промывок РВ8 клетки инкубировали с 15 мкг/мл конъюгированного с ФИТЦ козьего антитела против 1д мыши (1аскзоп 1ттипоге8еагс11 1аЬога1опез) в течение 15' при комнатной температуре. Затем клетки промывали, ресуспендировали в РВ8-5% БСА и анализировали проточной цитометрией (Вес1оп Июкш5оп, Μоиηίа^η У1е\\·. СА). Клетки ОТЬ-16 фиксировали в смеси метанол:ацетон (3:1) в течение 5' на льду, затем блокировали 2% сывороткой козы в РВ8 в течение 30' при комнатной температуре. Очищенное анти-Μеί-К добавляли в концентрации 2,5 мкг/мл в РВ8 с 2% сыворотки козы и инкубировали 1 ч при комнатной температуре, затем после 3 промывок РВ8 связанное анти-НСЕК-антитело выявляли, используя 4 мкг/мл антитела против 1д мыши, конъюгированного с А1еха Е1иог 488 (^Κ^πτ РгоЬез). Анализ образцов осуществляли во флуоресцентном микроскопе (ΌΜ-ШВ, Ье1са Μ^с^08у8ίет8).

Эксперименты ΐη νίνο

Эксперименты ίη у1уо осуществляли, инокулируя подкожно либо 1 х 10⁶ ΟΤΕ16, либо 2,5х 10⁶ ΜΌΑΜВ-435β4 в заднюю часть бока шестинедельных иммунодефицитных самок мышей пи/пи на фоне 8\νίδ5 СИ1 (Сйаг1е8 К1уег ЬаЬогаФпез). После появления опухоли отбирали мышей, несущих образования сравнимого размера, и инокулировали либо в/б, либо 18 (18 только в случае мышей, которым инъецировали С1Ы6) дважды в неделю идентичными количествами анти-ΜΕΤ-Κ и анти-У8У-С. После 8 недель обработки мышей умерщвляли и оценивали массу опухолей. У мышей, которым инъецировали ΜΩΑ-ΜΕ 435 β4, анализировали легкие в отношении наличия спонтанных метастазов. Иммуногистохимическое окрашивание первичных опухолей для оценки фосфорилированного НСЕК осуществляли на залитых парафином 5 мкм-срезах опухоли, используя анти-фосфо-НСЕК антитело (Се11 81дпа1шд, 1:100). Количество метастазов устанавливали с помощью микроскопического исследования легких после окрашивания гематоксилином/эозином, выполненного согласно протоколу Μа88оη-Τ^^сй^оте (81дта) для обычного патологического обследования. Оценку васкуляризации опухолей осуществляли с помощью иммуногистохимии на образцах, залитых в соединение Τ^55ие-Τек ОСТ (8акига Еше1ек), и сразу замораживали при -80°С. Для иммуногистохимического окрашивания использовали моноклональное антитело крысы против СИ31 мыши (Рйагтшдеп).

Оценка апоптоза

Морфологическую оценку апоптоза осуществляли согласно критериям Кегг. Вследствие большого количества отдельных некротических клеток и индуцированного ишемией апоптоза вблизи некротических очагов только ткань по меньшей мере в 1 НРЕ (поле зрения при большом увеличении =0,63 мм) вдали от областей некроза считали подходящей для подсчета апоптоза. Случаи с массивными некрозами опухолей не оценивали. Все случаи относили к одной из двух категорий: больше или меньше 10 картин апоптоза/10 НРЕ.

- 9 015580

Ингибирование протеаз

Перед стимуляцией антителом клетки обрабатывали в течение 2 ч следующими ингибиторами: 4 мМ амилорид (Б1дта), чтобы ингибировать урокиназу; 5 мМ 1,10-фенантролин (Б1дта), чтобы ингибировать ΆΌΛΜ и Ζη-зависимые протеазы; 20 мкг/мл апротинина и 100 мкг/мл лейпептина, чтобы ингибировать сериновые и цистеиновые протеазы, 10 мкг/мл пепстатина А, чтобы ингибировать кислые протеазы (Са1Ьюе11ст). РКС ингибировали обработкой клеток 1 мкМ ТРА в течение 24 ч.

Способы скрининга

Изобретение относится к анализам для скрининга тестируемых соединений, которые модулируют экспрессию/функцию/биологическую активность НОРК, или индуцируют шеддинг внеклеточного домена НОРК в присутствии или в отсутствие НОР или других агонистов рецептора.

Тестируемое соединение связывается с НОРК, предпочтительно взаимодействуя с внеклеточной частью рецептора. Более предпочтительно тестируемое соединение снижает биологическую активность, опосредованную НОРК, по меньшей мере примерно на 10, предпочтительно примерно на 50, более предпочтительно примерно на 75, 90 или 100% по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения. Кроме того, тестируемое соединение предпочтительно регулирует экспрессию НОРК. Более предпочтительно тестируемое соединение супрессирует транскрипт или белок НОРК, по меньшей мере примерно на 10, предпочтительно примерно на 50, более предпочтительно примерно на 75, 90 или 100% по сравнению с ситуацией в отсутствие тестируемого соединения.

Тестируемые соединения

Тестируемые соединения могут представлять собой фармакологические средства, пептиды или белки, уже известные в данной области, или могут представлять собой ранее неизвестные соединения, обладающие какой-либо фармакологической активностью. Тестируемые соединения могут быть природными или сконструированными в лаборатории. Они могут быть выделены из микроорганизмов, животных или растений, могут быть получены рекомбинантными способами или синтезированы химическими способами, известными в данной области. При необходимости тестируемые соединения могут быть получены с использованием любого из многочисленных способов, основанных на комбинаторных библиотеках, известных в данной области, включая без ограничения способы, основанные на биологических библиотеках, пространственно адресуемых параллельных твердофазных или жидкофазных библиотеках, синтетических библиотеках, требующих деконволюции, способ на основе библиотеки один шарик-одно соединение и способы на основе синтетических библиотек с использованием селекции, основанной на аффинной хроматографии. Способ с использование биологических библиотек ограничен библиотеками полипептидов, в то время как другие четыре способа применимы к библиотекам соединений полипептидов, непептидных олигомеров или малых молекул.

Анализы связывания

В случае анализов связывания тестируемое соединение предпочтительно представляет собой молекулу, которая связывается с внеклеточной частью НОРК, при этом указанная молекула имитирует антиМе1-К активность, тем самым предотвращая нормальную биологическую активность НОРК. Примеры таких молекул включают без ограничения малые молекулы, пептиды или пептидоподобные молекулы.

В анализах связывания либо тестируемое соединение, либо внеклеточная часть НОРК могут содержать регистрируемую метку, такую как радиоизотопная, флуоресцентная, хемилюминесцентная или ферментная метка (например, радиоактивно меченый йод, радиоактивно меченый фосфор, флюорофоры или флуоресцирующие белки, люцифераза, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза). Затем может быть осуществлено выявление тестируемого соединения, которое связано с внеклеточным доменом НОРК, например, прямым подсчетом радиоизлучения, счетом сцинтилляции или определением превращения соответствующего субстрата в регистрируемый продукт, при этом НОРК или часть его внеклеточного домена связаны с подложкой или экспрессируются клеткой или могут быть извлечены хорошо известными специалисту в данной области способами.

Функциональные анализы

Тестируемые соединения могут быть исследованы в отношении способности уменьшать биологический эффект НОРК. Такие биологические эффекты можно определить, используя функциональные анализы, описанные в настоящей заявке. Такие анализы называют анализом независимого от заякоривания роста и анализом инвазии (оба способа подробно описаны в примерах 2 и 11) и оценкой трансформированного фенотипа ίη νίνο (подробно описана в примерах 3, 11, 12). Таким образом, функциональные анализы могут быть осуществлены ίη νίίτο с использованием линии клеток, экспрессирующих НРОК, или ίη νίνο с использованием любой животной модели, в которой возможно исследование развития экспериментальной или встречающейся в природе опухоли, экспрессирующей НОРК. Тестируемое соединение, которое снижает биологическую активность НРОК по меньшей мере примерно на 10, предпочтительно примерно на 50, более предпочтительно примерно на 75, 90 или 100%, идентифицируют как потенциальное фармакологическое средство для снижения биологической активности НОРК.

Примеры

Пример 1. Анти-Ме! антитело анти-МЕТ-К снижает сигнальную трансдукцию НОРР.

Анти-МЕТ-К является моноклональным антителом, направленным против внеклеточного домена

- 10 015580 рецептора НОЕ, при этом оно узнает эпитоп, отличный от эпитопа, связываемого лигандом. Такое моноклональное антитело ведет себя как частичный агонист, так как оно не запускает все биологические эффекты, вызываемые фактором роста гепатоцитов (подвижность, пролиферацию, жизнеспособность клеток, инвазию, тубупогенез и ангиогенез), а индуцирует только подвижность. Кроме того, оно действует как стимулятор конститутивной экспрессии активатора плазминогена урокиназного типа, но не способно индуцировать и поддерживать экспрессию рецептора активатора плазминогена урокиназного типа в течение длительных периодов времени. Указанное моноклонарное антитело активирует фосфорилирование рецептора, которое, будучи строго зависимым от бивалентности моноклонарного антитела, требует димеризации рецептора.

Задаваясь вопросом, может ли анти-МЕТ-В антитело представлять собой средство, препятствующее конститутивной активации рецептора НОЕ в сверхэкспрессирующих опухолях, авторы изобретения сначала проанализировали его биохимическую и биологическую активность в опухолевых клетках, на которые хронически воздействовали антителом. В качестве модели авторы изобретения использовали клетки ОТЬ16, полученные из карциномы желудка человека, в которых НОЕВ сверхэкспрессируется и поэтому олигомеризуется и конститутивно активируется (27). На фиг. 1А показано значимое снижение экспрессии НОЕВ и фосфорилирования тирозина.

Затем оценивали влияние антитела на сигнальную трансдукцию НОЕВ. Так как известно, что НОЕВ стимулирует мощную антиапоптозную программу посредством стимулирования активации Лк1. то авторы изобретения оценивали уровень фосфорилирования Лк! после обработки анти-МЕТ-В. Как показано на фигуре 1В, фосфорилирование Ак! было ингибировано как в исходных условиях, так и в НОЕстимулированных клетках.

Другим важным путем, активируемым НОЕВ, является путь МАРК, который, как известно, вовлечен в стимуляцию клеточного роста. Авторы изобретения проверяли уровень активации МАРК в клетках, обработанных антителом, но не обнаружили значимого ингибирования указанного пути (данные не показаны).

Пример 2. Анти-МЕТ-В ингибирует трансформированный фенотип злокачественных клеток ίη νίίτο.

Влияние антитела на рост клеток и на трансформированный фенотип оценивали, измеряя способность клеток расти зависимым от заякоривания и независимым от заякоривания образом и прорастать во внеклеточный матрикс. Как показано на фиг. 2А, не наблюдали различия в способности клеток расти в условиях зависимости от заякоривания после обработки антителом.

Независимый от заякоривания рост строго зависим от способности клеток преодолевать апоптоз изза отсутствия заякоривания, так называемый аноикис; указанное свойство обычно анализируют посредством оценки способности клеток расти в мягком агаре (28). Так как во многих сообщениях показано, что активация НОЕВ может придавать клеткам такое свойство, авторы изобретения высевали клетки ОТЬ16 в 0,5% агар и поддерживали культуру в присутствии или в отсутствие разных количеств антиМЕТ-В или нерелевантного совпадающего по изотипу антитела (У8У-О) в качестве контроля. Как показано на фиг. 2В, клетки, обработанные У8У-О, а также необработанных клетки способны образовывать многочисленные колонии. Напротив, анти-МЕТ-В значительно ингибировало независимый от заякоривания рост злокачественных клеток зависимым от дозы образом. Интересно отметить, что клетки ОТЬ16 способны образовывать колонии при анализе в мягком агаре даже в исходных условиях вследствие конститутивной активации НОЕВ, и что антитело ослабляло трансформированный фенотип таких клеток как в присутствии, так и в отсутствие НОЕ.

Чтобы оценить способность антитела препятствовать инвазивности клеток, авторы изобретения исследовали МЭА-МВ-435 β4, линию клеток карциномы млекопитающих, которые в ответ на НОЕ способны прорастать в реконструированные базальные мембраны (29). Как показано на фиг. 2С, обработка ίη νίίτο таких клеток анти-МЕТ-В антителом приводила к зависимому от дозы ослаблению инвазивных свойств в ответ на НОЕ.

Пример 3. Анти-МЕТ-В ингибирует трансформированный фенотип ίη νίνο.

Чтобы оценить активность анти-МЕТ-В на рост опухоли ίη νίνο, авторы изобретения подкожно инокулировали клетки ОТЬ16 в заднюю часть бока иммунодефицитных самок мышей пи/пи. Животных обрабатывали дважды в неделю либо анти-МЕТ-В, либо У8У-О, вводимым ίη 5Ш1 (2 мкг/г). Терапию начинали через 1 неделю после трансплантации, после появления опухолей в месте инъекции: только животных, несущих опухоли сравнимого размера, обрабатывали в течение 4 недель. Объем опухоли контролировали на протяжении всей обработки, и сниженный рост наблюдали у мышей, обработанных анти-МЕТ-В (фиг. 3А). После обработки мышей подвергали аутопсии и опухоли вырезали и взвешивали. Как показано на фиг. 3В, у мышей, обработанных анти-МЕТ-В, опухоли были значимо меньше, чем в контролях (р<0,05). В таких опухолях уровень активации НОЕВ, показанный при окрашивании специфичными антителами против фосфорилированной формы рецептора, был снижен (фиг. 3С), в то время как процентное содержание апоптозных клеток было значимо увеличено (фиг. 3Ό). Кроме того, авторы настоящего изобретения оценивали на срезах опухолей после окрашивания гематоксилином/эозином апоптозные и митотические картины. Хотя апоптоз был значимо повышен в опухолевых тканях, полученных от мышей, обработанных анти-МЕТ-В, количество митозов было почти неизменным (данные не

- 11 015580 показаны).

Авторы изобретения также осуществляли эксперименты подобного рода на клетках ΜΌΑ-ΜΒ-435 β 4, модельной системе спонтанных метастазов ίη νίνο (29). Животных обрабатывали дважды в неделю разными дозами анти-ΜΕΤ-Κ или контрольным антителом, вводимыми либо системно (1 мкг/г или 10 мкг/г внутрибрюшинно), либо в опухоль (2 мкг/г ίη 811н). Терапию начинали в день трансплантации и осуществляли в течение восьми недель (время проявления метастатического потенциала). После обработки мышей подвергали аутопсии и проводили анализ первичных опухолей и легких (преимущественное место метастазов для таких клеток). Также обследовали разные органы (селезенку, костный мозг, печень, сердце, кости и почки), чтобы исключить возможные токсические эффекты. Данные макроскопического анализа показали, что обработка анти-ΜΕΤ-Κ. приводила к ингибированию роста первичных опухолевых образований (фиг. 4А-Е и К). Иммуногистохимическое окрашивание антителами, узнающими фосфорилированную по тирозину форму НСЕК, и в таком случае показало заметное снижение активации рецептора (фиг. 4Е-1). Кроме того, микроскопический анализ срезов легкого выявил, что и инъекция внутрь опухоли и системное введение анти-ΜΕΤ-Κ предотвращало появление отдаленных метастазов в легком и в обследованных органах (фиг. 4Ь).

Так как во многих работах показано, что НСЕ является сильным ангиогенным фактором и что передача сигнала НСЕК вносит вклад в ангиогенез опухолей, авторы изобретения анализировали васкуляризацию опухолей после обработки анти-МЕТ-К. В таких опухолях авторы изобретения обнаружили значимое снижение количества сосудов (которые были меньше и больше по размеру) и их ответвлений (фиг. 4 М, Ν). Таким образом, авторы изобретения пришли к выводу, что наблюдаемое противоопухолевое и противометастатическое влияние обработки было следствием комбинированного действия антитела на опухоль и на прорастание сосудов микроокружения.

Пример 4. Анти-ΜΕΤ-Κ индуцирует супрессию НСЕК.

Чтобы исследовать механизм, посредством которого анти-МЕТ-К способно препятствовать активации НСЕК, авторы изобретения обрабатывали либо анти-ΜΕΤ-К, либо У8У-С клетки, сверхэкспрессирующие НСЕК; такой случай сходен с тем, что часто наблюдается во многих встречающихся в природе опухолях. Как показано на фиг. 5А, авторы изобретения наблюдали, что общее количество НСЕК снижалось зависимыми от времени образом при обработке анти-ΜΕΤ-К, но не при обработке У8У-С. Полученные данные свидетельствуют, что анти-Μеΐ антитело специфично индуцировало супрессию рецептора. Интересно подчеркнуть, что в таких клетках, сверхэкспрессирующих НСЕК, лиганд НСЕ был неспособен индуцировать супрессию рецептора (фиг. 6, нижняя панель).

Затем авторы изобретения проверяли, может ли анти-ΜΕΤ-К-антитело также запускать супрессию рецептора в клетках, экспрессирующих нормальные уровни НСЕК. Как показано на фиг. 5В, левая панель, в таких клетках также анти-ΜΕΤ-К эффективно вызывало супрессию НСЕК. Индуцированное антителом уменьшение количества НСЕК, экспонированного на клеточной мембране, также оценивали в ЕАС8-анализе. Цитофлуориметрический анализ показал, что обработка антителом снижала количество НСЕК, экспрессированного на клеточной поверхности с более высокой эффективность, чем сам НСЕ (фиг. 5В, правая панель). Сходное снижение в таком же анализе наблюдали также в клетках СЕЕ16 (не показано).

Пример 5. Молекулярный механизм индуцированной анти-ΜΕΤ-К супрессии НСЕК.

Зависимая от лиганда и индуцированная антителом супрессия может происходить разными путями. Зависимая от лиганда супрессия КЕК является многостадийным процессом, включающим интернализацию, убиквитинилирование, сортировку в эндосомах и наконец расщепление в лизосомах или протеасомах (30).

Чтобы оценить, какой путь расщепления вовлечен в индуцированную антителом супрессию НСЕК, авторы изобретения блокировали активность либо лизосом, либо протеасом специфичными ингибиторами конканамицином и лактацистином, соответственно, перед стимуляцией антителом. Неожиданно, в то время как ингибирование протеасомного пути сильно снижало индуцированное лигандом расщепление НСЕК, оно не оказывало влияния на супрессию рецептора вследствие обработки анти-ΜΕΤ-К (фиг. 6А, верхняя панель), таким образом показывая, что антитело и лиганд стимулируют супрессию НСЕК посредством разных молекулярных механизмов. Кроме того, когда активность протеасом была снижена, фрагмент 60 кД, регистрируемый только в исходных условиях, в большой степени накапливался в клетках после обработки антителом (фиг. 6А, нижняя панель). Указанный фрагмент можно было выявить на Вестерн-блотах только с использованием антитела против внутриклеточной части НСЕК и он находился в цитоплазматическом домене рецептора. Кроме того, как предполагалось для молекул, подвергаемых расщеплению протеасомами, фрагмент 60 кД был мечен остатками убиквитина (фиг. 6В).

Так как внеклеточный домен (эктодомен) рецептора не выявляется в клеточных лизатах после обработки ημή-ΜΕΤ-Β, авторы изобретения проверяли, высвобождается ли он вне клеток при расщеплении - явление, известное как шеддинг (31). Чтобы проверить такую гипотезу авторы изобретения определяли присутствие эктодомена НСЕК в культуральной среде для клеток. Клетки метаболически метили радиоактивными ³⁵8-цистеином и ³⁵8-метионином и затем обрабатывали либо НСЕ, либо анти-ΜΕΤ-К в течение 4 ч. Среды собирали и подвергали иммунопреципитации анти-НСЕК-антителом, узнающим вне

- 12 015580 клеточный домен. Как показано на фиг. 7А, из культуральных сред метаболически меченых клеток авторы изобретения иммунопреципитировали полосу, которая двигалась в невосстанавливающих условиях с кажущейся молекулярной массой 130 кД (соответствующей комплексу внеклеточных α,β-цепей); при разгонке в геле в восстанавливающих условиях комплекс разделялся на две полосы 80 кД (β-цепь) и 45 кД (α-цепь). Несмотря на то что стимуляция НОР не усиливала указанный процесс, шеддинг рецептора значительно увеличивался при связывании антитела. Согласно предыдущим данным (15) известно, что небольшое количество эктодомена НОРВ конститутивно высвобождается во внеклеточную среду. Интересно подчеркнуть, что индуцированный антителом шеддинг эктодомена также наблюдали в клетках, экспрессирующих нормальные уровни НОРВ, таких как эндотелиальные клетки (фиг. 7В).

При обработке клеток возрастающими количествами антитела в течение 4 ч авторы изобретения наблюдали, что опосредованный антителом шеддинг НОРВ зависел от дозы (фиг. 7С). Чтобы проанализировать кинетику индуцированного антителом шеддинга НОРВ авторы изобретения стимулировали клетки одинаковым количеством либо анти-МЕТ-В, либо У8У-О в течение разных периодов времени. Возрастающие уровни эктодомена выявляли в среде клеток, обработанных анти-МЕТ-В, но не У8У-С, что показывает, что наблюдаемый индуцированным антителом шеддинг было специфичным и зависел от времени (фиг. 7Ό).

Пример 6. Индуцированный антителом шеддинг НОРВ происходит на поверхности клеток.

Чтобы проверить, требуется ли эндоцитоз для шеддинга НОРВ, авторы изобретения использовали линию клеток, стабильно трансфицированных мутантной формой динамина (Эуп К44А), который как известно, нарушает зависимый от клатрина эндоцитоз, и экспрессия которого находится под контролем системы, регулируемой тетрациклином. Клетки поддерживали в течение 48 ч либо в присутствии (С1т), либо в отсутствие (К44А Иуи) тетрациклина, чтобы ослабить эндоцитоз вследствие экспрессии мутантного динамина. Как показано на фиг. 7Ό, индуцированный антителом шеддинг не нарушался в клетках, в которых ингибирован зависимый от клатрина эндоцитоз.

Протеазы, обычно вовлеченные в шеддинг мембранных белков, относятся к α-секретазам семейства АОАМ. Пытаясь идентифицировать фермент, ответственный за шеддинг НОРВ, Ζη-хелатирующий агент 1,10-фенантролин, ингибитор АОАМ и Ζη-зависимых протеаз, добавляли к клеткам перед обработкой антителом. Такие условия не влияли на шеддинг рецептора (данные не показаны), что свидетельствует о том, что протеолитическое отщепление эктодомена НОРВ не опосредовано α-секретазой, а опосредовано независимой от Ζη протеазой.

Так как известно, что НОРВ транскрипционно регулирует гены, вовлеченные в свертывание крови, авторы изобретения также проверяли, может ли протеаза системы коагуляции отвечать за шеддинг эктодомена. Однако роль прокоагулянтных факторов в указанном процессе была исключена, так как их ингибирование апротинином не изменяло индуцируемый антителом шеддинг эктодомена НОРВ (данные не показаны). Используя панель других ингибиторов (амилорида, пепстатина А, лейпептина) авторы изобретения также исключили участие других известных гидролаз, таких как урокиназа, кислые протеазы, сериновые и цистеиновые протеазы (данные не показаны). Кроме того, авторы изобретения также доказали, что шеддинг эктодомена не зависит от активации РКСа, так как ингибирование указанного фермента высокой дозой (1 мкМ) и длительной обработкой (24 ч) форболовым эфиром ТРА не уменьшало шеддинг эктодомена (данные не показаны).

Указанная группа экспериментов, которые все проводились с соответствующими позитивными контролями, показывает, что фермент, ответственный за шеддинг эктодомена НОРВ не входит в список протеаз, очевидно вовлеченных в шеддинг рецепторов.

Пример 7. Активация НОРВ не требуется для индуцированного антителом шеддинга.

Как сообщали авторы изобретения ранее, тримерный комплекс, содержащий эндофилин, СГЫ85 и СЫ, опосредует зависимую от лиганда супрессию НОРВ (32). Такой комплекс привлекается к рецептору при активации НОРВ и стимулирует эндоцитоз, убиквитинилирование и расщепление рецептора. Чтобы проверить, требуется ли активация рецептора и сигнальная трансдукция для индуцируемого антителом понижающего модулирования и шеддинга, авторы изобретения исследовали способность анти-МЕТ-В вызывать супрессию различных мутантов НОРВ. Авторы изобретения экспрессировали в клетках СО8-7 либо НОРВ дикого типа, либо следующие мутанты: ί) МЕТ КО, кодирующий рецептор смерти, не имеющий тирозинкиназной активности вследствие замены Ьу8-А1а в связывающем АТФ кармане, и) МЕТ двойной, кодирующий НОРВ в котором отсутствуют тирозины Υ1349, Υ1356, присоединяющие трансдукторы сигнала, ίίί) МЕТ-ОРР, доминантный негативный мутант, в котором последовательность, кодирующая целый внутриклеточный домен рецептора, заменяли последовательностями ОРР. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки обрабатывали анти-МЕТ-В в течение 3 ч. Клеточные экстракты и внеклеточные среды анализировали, используя Вестерн-блот. Неожиданно анти-МЕТ-В оказалось способным запускать супрессию и индуцировать шеддинг НОРВ во всех мутантах (фиг. 8). Указанный эксперимент свидетельствует, что индуцируемая антителом супрессия рецептора НОР не требует ни киназной активности рецептора, ни привлечения цитоплазматических трансдукторов и что целый внутриклеточный домен необязателен для данного процесса. Это дополнительно подтверждает, что антитело

- 13 015580 и лиганд активируют разные механизмы супрессии.

Пример 8. Сброшенный эктодомен НСЕВ ведет себя как ловушка.

Так как было показано, что генетически сконструированный внеклеточный домен НСЕВ может эффективно функционировать в качестве доминантной негативной молекулы-ловушки (33), авторы изобретения тестировали способность сброшенного эктодомена в ингибировании передачи сигнала НСЕВ. Клетки, предварительно обработанные в течение 72 ч анти-МЕТ-В или У8У-С, стимулировали в течение разных периодов времени НСЕ либо в присутствии (фиг. 9, дорожки 4-6), либо в отсутствие (дорожки 79) эктодомена НСЕВ в культуральной среде. Как показано, в присутствии эктодомена НСЕВ запускаемое НСЕ фосфорилирование АЙ сильно нарушено, таким образом подтверждая идею, что сброшенный фрагмент подобно ловушке (33) действует и как конкурент за связывание НСЕ и как доминантная негативная молекула, препятствующая активации НСЕВ.

Пример 9. Агонистическое анти-МЕТ-В-антитело Ό0-24 не индуцирует шеддинг эктодомена.

Агонистическая способность данного антитела как таковая не достаточна для подтверждения его терапевтической активности. Действительно, другое моноклональное анти-МЕТ-В-антитело (Ό0-24), которое авторы исследовали, не стимулирует шеддинг внеклеточной части рецептора, но способно полностью активировать рецептор.

Пример 10. Получение анти-МЕТ-В с использованием переноса гена посредством лентивирусного вектора.

Авторы изобретения встраивали последовательности тяжелой и легкой цепи анти-МЕТ-В в двунаправленный лентивирусный вектор (51) (фиг. 10А, 15 и 16). Такой лентивирусный вектор обеспечивает координированную экспрессию двух отдельных кДНК благодаря присутствию синтетического промотора (АССТСССТТ, 8Е0 ΙΌ N0: 4), полученного связыванием минимального корового промотора (промотор тшСМУ) выше и в противоположной ориентации по отношению к промотору 11РСК (51). Такой синтетический промотор способен управлять транскрипционной активностью в обоих направлениях. Таким образом, помещая две кДНК, кодирующие анти-МЕТ-В, одну выше в антисмысловой ориентации (легкая цепь), а другую ниже в смысловой ориентации (тяжелая цепь), можно координировано создать две независимые мРНК. Авторы изобретения получали векторные частицы с использованием временной трансфекции клеток 293Т, как описано. Затем, чтобы постоянно модифицировать геном клеток-мишеней, авторы изобретения инфицировали панель полученных из карциномы линий клеток надосадком, содержащим векторные частицы. После инфекции клетки подвергали голоданию в среде без сыворотки и инкубировали в течение 72 ч, чтобы собрать надосадки культур клеток. Присутствие анти-МЕТ-В антитела оценивали вестерн-блот-анализом (фиг. 10В), и количественную оценку анти-МЕТ-В осуществляли посредством ЕЬ18А (фиг. 10С). Все трансдуцированные линии клеток продуцировали анти-МЕТ-В антитело, которое правильно секретировалось в надосадок культуры. Продуцирование антитела варьировало в диапазоне 0,2-6 мкг/мл в зависимости от анализируемой линии клеток. Специфичность рекомбинантного анти-МЕТ-В контролировали, используя анализ иммунопреципитации (фиг. 11А), тогда как аффинность связывания оценивали в анализе ЕЬ18А (фиг. 11В). Рекомбинантное анти-МЕТ-В способно специфично узнавать рецептор Меΐ с аффинностью в таком же диапазоне, что и аффинность, получаемая в случае анти-МЕТ-В, продуцируемого обычным образом гибридомой. Кроме того, рекомбинантное анти-МЕТ-В, как и анти-МЕТ-В, продуцируемое гибридомой, способно индуцировать протеолитическое расщепление Меΐ и шеддинг внеклеточного домена (фиг. 12).

Пример 11. Трансдукция лентивирусным вектором, кодирующим анти-МЕТ-В, ингибирует трансформированный фенотип злокачественных клеток ίη νίΐτο и ίη νΐνο.

Авторы изобретения трансдуцировали клетки НСТ-116 лентивирусным вектором, кодирующим анти-МЕТ-В (25 нг р24/мл). Трансдуцированные клетки тестировали в сравнении с клетками дикого типа в отношении их трансформированного фенотипа, анализируя независимый от заякоривания рост и инвазивные свойства при канцерогенезе ίη νίΐτο и ίη νΐνο. Для независимого от заякоривания роста авторы изобретения высевали клетки, продуцирующие анти-МЕТ-В и клетки дикого типа в качестве контроля в 0,5% агаре и подсчитывали колонии, полученные после 15 дней культивирования. Способность трансдуцированных клеток к независимому от заякоривания росту была подавлена, так как они давали меньшее количество колоний, меньшего размера по сравнению с колониями, образуемыми клерками дикого типа (фиг. 13А). Чтобы тестировать инвазивность клеток авторы изобретения анализировали способность клеток проникать в реконструированные базальные мембраны. Как показано на фиг. 13В, имело место снижение инвазивных свойств трансдуцированных клеток. Авторы изобретения также тестировали образование опухолей ίη νΐνο клетками, трансдуцированными лентивирусным вектором, кодирующим антиМЕТ-В, инъецируя их подкожно в бок бестимусным мышам гшйе. Данные, показанные на фиг. 13С и Ό, свидетельствуют, что у трансдуцированных клеток нарушены канцерогенные свойства ίη νΐνο, так как инкубационный период опухоли и рост опухоли были ингибированы по сравнению с клетками дикого типа.

Пример 12. Направленное введение внутрь опухоли лентивирусного вектора, кодирующего антиМЕТ-В, ингибирует рост опухоли.

Чтобы получить формальное доказательство эффективности переноса гена анти-МЕТ-В, авторы

- 14 015580 изобретения вводили лентивирусные векторные частицы, несущие кДНК, кодирующие антитело, непосредственно в ранее образованные опухоли, полученные подкожной инъекцией клеток НСТ-116 в бок мышей пибе. Опухоли, обработанные векторами, кодирующими анти-МЕТ-К, имели более медленную скорость роста по сравнению с опухолями, обработанными контрольным вектором (фиг. 14).

Пример 13. Участок связывания анти-МЕТ-К на эктодомене Ме!.

Чтобы картировать эпитоп, узнаваемый анти-МЕТ-К, проводили эксперименты по иммунопреципитации с использованием разных внеклеточных доменов рецептора фактора роста гепатоцитов (также называемого эктодоменом Ме!) (фиг. 17):

ловушка Ме! (аминокислоты 1-932): это растворимый рекомбинантный белок, соответствующий полной внеклеточной области Ме! человека, отсеченной перед трансмембранным доменом (М1сЫе11 е! а1. 2004);

ЗЕМА РЗ1 (аминокислоты 1-562): это укороченная форма ловушки Ме!, содержащая домен ЗЕМА (аминокислоты 1-515) (З!ато§ е! а1., 2004; Сйегагб1 е! а1., 2004) и область РЗ1 (аминокислоты 516-562) (Κοζίον е! а1., 2004).

РЗ1 1РТ (аминокислоты 1-24; 516-932): это укороченная форма ловушки Ме!, содержащая эндогенную лидерную последовательность (аминокислоты 1-24), слитую с областью РЗ1 (аминокислоты 516562) и четырьмя доменами 1РТ (аминокислоты 563-932) (ΒοτΚ е! а1., 1999; Сйегагб1 е! а1., 2004).

Полигистидиновую метку и Мус-эпитопную метку добавляли к С-концу каждой молекулы.

Последовательность ловушки Ме! получали из последовательности, имеющей номер доступа в Сепе Вапк Х54559 (Сюгбагю е! а1., 1991); такая последовательность соответствует основному транскрипту гена Ме! человека, который кодирует белок тирозинкиназы, который правильно процессируется и локализован в мембране.

Другие публикации относятся к последовательности, имеющей номер доступа в Сепе Вапк 102958 (Рагк е! а1., 1987); указанный номер соответствует альтернативно сплайсируемому минорному транскрипту, содержащему инсерцию длиной 54 п.о. в положении от нуклеотида 2264 до нуклеотида 2318. Указанный транскрипт кодирует белок тирозинкиназы, который неправильно процессирован и не локализован в мембране (Кοб^^диеζ е! а1., 1991). В соответствии с такой последовательностью внеклеточная область Ме! соответствует аминокислотам 1-950, и третий домен 1РТ (1РТ3) содержит инсерцию 18 аминокислот.

В табл. 1 суммированы положения разных доменов Ме!, соответствующих последовательностям Х54559 и 102958.

Таблица 1

Эктодомены МЕТ	Сепе Вапк Х54559 (а-к а-к)	Сепе Вапк Л02958 (а-к а-к)
Ловушка Мек	1-932	1-950
ЗЕМА Ρ3Ι	1-562	1-562
Ρ3Ι	1-24; 516-932	1-24; 516-985
ΙΡΤ 1	563-656	563-656
ΙΡΤ 2	657-741	657-741
ΙΡΤ 3	742-838	742-856
ΙΡΤ 4	839-932	857-950

кДНК для конструируемых молекул субклонировали в лентивирусном векторе рККЬ.ып.РРТ.СМУ.^рге (Го11епа е! а1., 2000); рекомбинантные лентивирусные частицы получали в большом масштабе и использовали для трансдукции линий опухолевых клеток человека (М1сЫей е! а1., 2004).

Кондиционированные среды от клеток МЭА-МВ-435, трансдуцированных ловушкой Ме!, ЗЕМА РЗ1 и РЗ1 1РТ, мечеными тус, иммунопреципитировали анти-МЕТ-К-антителом и выявляли с помощью Вестерн-блота, используя биотинилированное анти-тус-антитело (фиг. 18, правая панель). Равные количества кондиционированной среды наносили в качестве контроля экспрессии белка (фиг. 18, левая панель), при этом контролем является кондиционированная среда клеток МЭА-МВ-435, трансдуцированных пустым лентивирусным вектором. Как показано на правой панели фигуры 18, анти-МЕТ-К способно иммунопреципитировать ловушку Ме! и Р51-1РТ, но не ЗЕМА-РЗ1. Следовательно антитело узнает эпитоп в области 1РТ.

Чтобы более подробно картировать эпитоп, узнаваемый антителом анти-МЕТ-К, осуществляли эксперименты по иммунопреципитации, используя отдельные домены 1РТ (Έογ1< е! а1., 1999). Каждый 1РТ представляет собой укороченную форму РЗ1-1РТ, содержащую эндогенную лидерную последовательность (аминокислоты 1-24), слитую с 1РТ 1 (аминокислоты 563-656) или 1РТ 2 (аминокислоты 657-741) или 1РТ 3 (аминокислоты 742-838) или 1РТ 4 (аминокислоты 839-932).

- 15 015580

Полигистидиновую метку и Е1ад-эпитопную метку добавляли к С-концу каждой молекулы. кДНК для конструируемых молекул субклонировали в таком же лентивирусном векторе, который указан ранее, и рекомбинантные лентивирусные частицы использовали для трансдукции линий опухолевых клеток человека.

Все рекомбинантные белки представляют собой растворимые факторы, но 1РТ 2 не секретируется в кондиционированную среду трансдуцированных клеток. По этой причине эксперименты по иммунопреципитации проводили на лизатах клеток.

Клеточные лизаты клеток МОА-МВ-435, трансдуцированных йад-мечеными отдельными 1РТ, иммунопреципитировали анти-МЕТ-В-антителом и выявляли на Вестерн-блоте, используя анти-Падантитело (фиг. 19, левая панель); сходные количества клеточных лизатов иммунопреципитировали антийад-антителом и выявляли на Вестерн-блоте, используя такое же анти-йад-антитело, в качестве контроля экспрессии белка (фиг. 19, правая панель).

Как показано на левой панели, анти-МЕТ-В способно иммунопреципитировать 1РТ 4, но не способно иммунопреципитировать три другие домена 1РТ. Анти-МЕТ-В узнает эпитоп, находящийся в домене 1РТ 4 внеклеточной области МЕТ.

Пример 14. Анти-МЕТ-В узнавало НОЕВ в интактных клетках как в анализе ЕАС8, так и в анализе иммунофлуоресценции.

Клетки ОТЬ-16, линию клеток карциномы желудка человека, инкубировали с анти-МЕТ-Вантителом. Профиль ОТЬ-16, полученный при анализе проточной цитометрией, выявил, что анти-МЕТ-В способно специфично окрашивать клетки, экспрессирующие НОЕВ. Действительно, среднее значение интенсивности флуоресценции в клетках, меченых анти-Ме1-В-антителом, было повышено по сравнению с контрольными клетками (фиг. 20, панель А). Клетки ОТЬ-16 также после фиксации инкубировали с анти-МеЬВ антителом, чтобы осуществить анализ иммунофлуоресценции. Окрашивание показало специфичное мечение клеточной поверхности, соответствующей рецептору Ме! (фиг. 20, панели В, С).

Конечно, хотя принцип изобретения остается таким же, детали конструирования и варианты осуществления могут широко варьировать по сравнению с описанными и проиллюстрированными только в качестве примера, не выходя за рамки объема настоящего изобретения, который определен в прилагаемой формуле изобретения.

Библиография

1. Ни^п, Р. 1. (1999) Сигг. Ορίη. Iттиηο1. 11, 548-557.

2. Ни^п, Р. 1. & 8οи^^аи, С. (2003) Νοί. Меб. 9, 129-134.

3. ОзсЬетшб, А., Е1зсйег, Ο. М. & ИПпсй, А. (2004) ΝηΙ. Веν. Сатет 4, 361-370.

4. Сгадд, М. 8., ЕТеисЬ В. В. & О1еηη^е, М. 1. (1999) Сигг. Ορίη. Iттиηο1. 11, 541-547.

5. Ееггага, Ν., НШащ К. 1., ОегЬег, Н. Р. & Νονοίηγ, V. (2004) №1. Веν. Огид Ό№ον. 3, 391-400.

6. Ь1, 8., 8сйтЙ7, К. В., 1ейгеу, Р. Ό., νί1ίζίυ3, 1. 1., Кизз1е, Р. & Еегдибющ К. М. (2005) Самсег Се11 7, 301-311.

7. Нугез, Ν. Е. & Ьа^, Н. А. (2005) ΝίΛ Веν. Сагсег 5, 341-354.

8. Т^изο1^ηο, Ь. & Сοтοд1^ο, Р. М. (2002) №11. Веν. Самсег 2, 289-300.

9. 8с1нп1бЬ Ь., Пий, Е. М., Сйещ Е., КкШба, Т., ОШпп, О., С^уке, Р., 8сйегег, 8. V., ΖΗνικ^, Ζ., Бийску, I., Оеагг М. е! а1. (1997) №1. Семе!. 16, 68-73.

10. К1т, I. 1., Рагк, 1. Н., Каод, Н. С., 8Ηίη, У., 11т, 8. В., Ки, 1. Ь., Угтд, Н. К., Ьее, К. и. & Рагк, 1. О. (2003) 1. Меб. Ое^к 40, е97.

11. Όί Веηζο, М. Е., 01гуего, М., Оха^тю^ А., Рο^ίе, Н., Сйазйе, Е., Миюззау, Ь., №гб1тдег, В., Вгей1, 8., Вοίίа^б^, 8., Оют-бадо, 8. е! а1. (1995) С1ш. Сатсег Вез. 1, 147-154.

12. Το^ο, 8., Сοтοд1^ο, Р. М. & ОмМат, 8. (2005) Тгсп6з Мο1. Меб. 11, 284-292.

13. Сοтοд1^ο, Р. М. & Т^изο1^ηο, Ь. (2002) 1. С1ш. Ιηνοδΐ 109, 857-862.

14. Маи11к, О., 8й^^кйаηбе, А., Кгрта, Т., Ма, Р. С., Мο^^^зοη, Р. Т. & 8а1д1а, В. (2002) Су Юк те &ο\ν11ι Еаскг Веν. 13, 41-59.

15. В1гскте1ег, С., В1гскте1ег, V., Ойегагб1, Е. & Уичбе Vοибе, О. Е. (2003) ΝοΣ Веν. Мο1. Се11 Вю1.

4. 915-925.

16. Кοηд-Ве1ί^аη, М., 8ίатοз, 1. & V^ск^атаз^ηдйе, Ό. (2004) Сичсег Се11 6, 75-84.

17. 1уащ М., Вοηб, 1. А., Рга1, М., Сοтοд1^ο, Р. М. & \VуηΓο^б-Т1ютаз. Ό. (1997) Οηсοдеηе 14, 24172423.

18. ОатЬагойа, О., Вοссасс^ο, С., Оют-бадо, 8., Аηбο, М., 81е11а, М. С. & Сοтοд1^ο, Р. М. (1996) Οηсοдеηе 13, 1911-1917.

19. РеηηассЫей^, 8., МюЫей, Р., Оа11иζζο, М., Маζζοηе, М., Ою^ам, 8. & Сοтοд1^ο, Р. М. (2003) Сагсег Се11 3, 347-361.

20. Рга1, М., Сгера1б1, Т., РеηηассЫей^, 8., Виззο1^ηο, Е. & Сοтοд1^ο, Р. М. (1998) 1. Се11 8ск 111 (Р! 2), 237-247.

21. Оют-бадо 8., Майе А., ХУПкатз Т.А., Агйд1ат 8., Оиа1 Р., ВагбеШ А., ВазИ^ С. МюЫей, Р., ΟοιιιομΗο Р.М. (2000), ЕА8ЕВ 1., 2, 399-406.

22. Ηοι-οι^ίο С., Аηбο' М., Сοтοд1^ο Р.М., (2002) ЕА8ЕВ 1 1, 120-2.

- 16 015580

23. Рο1ктап, 1. (1971) N. Епд1. 1. Меб. 285, 1182-1186.

24. Βι^οίπιο, Р., Όί ^ηζο, М. Р., Ζίοΐ'ΐο, М., Βοοο6ίο6ο, Е., ОНгего, М., Να16ίηί, Ь., Саабню, О., Тата^^т, Ь., ΟοίϊεΓ, А. & ΕοπιοβΗο, Р. М. (1992) 1. Се11 ΒίοΙ. 119, 629-641.

25. С1агк М. (2000) 1тт. Тсбау 21 397-402.

26. Рга1, М., Сгера1б1, Т., Саибню, Ь., О^бат, 8., ί-οηβαΐί, Р. & Сοтοд1^ο, Р. (1991) Мο1. Се11 ΒίοΙ. 11, 5954-5962.

27. бютбапс, 8., Рοηζеίίο, С., Όί ^ηζο, М. Р., Сοοре^, С. 8. & ΕοπιοβΗο, Р. М. (1989) №1иге 339, 155156.

28. Рпзсб, 8. М. & Егапйз, Н. (1994) 1. Се11 ΒίοΙ. 124, 619-626.

29. Т^изο1^пο, Ь., ΒοΛοίΙί, А. 8 Εοαομίιο, Р. М. (2001) Се11 107, 643-654.

30. Όί Рюге, Р. Р. & 1)е Сатбб, Р. (2001) Се11 106, 1-4.

31. АтЬаз, 1. & Βοποίο, А. (2002) Сбет. Кеу. 102, 4627-4638.

32. Рекге111, А., О11езбо, О. Р., ^аηζа^бο, 8., Εοαοβίίο, Р. М., М^ге, Ν. & Ою^ам, 8. (2002) Кйиге 416, 187-190.

33. МюЫеб, Р., Маζζοηе, М., ΒίΜΙίοο, С, Сауазза, 8., 8ο6ί^, А., Nа1б^η^, Ь. & Εοαοβίίο, Р. М. (2004) Сапсег Се11 6, 61-73.

34. СклзЕпзеп ТО., 8сбгеск К., Βυτον 1., Киащапб Р., Сбап Е., Ье Р., Сбеп 1., ХУаад X., Кизбт Ь., Β1аке К., Είρκοη К.Е., Катрба1 1., Όο 8., Сш ЕЕ, Сбе^^^πдίοπ 1.М., Мепбе1 Ό.Β. (2003) Сапсег Кез. Νον 1;63 (21):7345-55.

35. ΒογιΗοπ 8., АеЬепю1б О.М., 8с11паб1 Ь.8., 8бюка Ό., Не1д1 С., 86ΐίί Β., 81а1бег Ό., ОгиЬег О., Бланд С., ^Меб А.К., Сапббтз Ό., Огетег К.Н., Είρ3οη К.Е., Ζιπιπιογ Υ. (2004) Опс^еие 1хх1 8;23 (31): 538793.

36. Мο^οίί^ А., М11а 8., Ас^тего Р., ТадбаЬие Е., Рοηζебο С. (2002) Опс^еие 1и1 25;21 (32) :4885-93.

37. 8аб1ег М., Рпбе Υ.Β., Ма Р., Огатбсб ЕЬ., Сби 8.С., Ошппап Ь.А., 8б1№1ап 8., Е1апд С., Рοба^ К., Сбпз1епзеп 1.О., 8а1д1а К. (2003) Сапсег Кез. 8ер 1;63 (17):5462-9.

38. ^апд X., Ье Р., Бланд С., Сбап 1., К1еМкб Ό., МШег Т., Натз Ό., 8ип Ь., Шсе А., Уаз11е 8., Б1аке К.А., Не^кй А.К., Ра!е1 Ν., МсМа^и О., ^^ρзοп К.Е. (2003) Ме1 Сапсег Тбег. Νον; 2(11):1085-92.

39. 8ίатοз 1., Блиагиз К.А, Υаο X., КйсбМег Ό., \У1езта!1!1 С., (2004) ЕМΒО 1; 23:2325-2335.

40. Обегагб1 Е., Боге С.А., Езпοиί К.М., кпез ЕЛ^-., (2004) Сигг. Орт. 8бисЕ ΒίοΙ., 14: 669-678.

41. Εοζίον О., РеггеаиЙ А., 8сбгад Ι.Ό., Рагк М., Суд1ег М., Оебппд К., Ек1е1 I., (2004) Βίοοίιοιη Βίοрбуз Кез Сοттип.; 321 (1): 234-40.

42. ΒογΕ Р., ΌοογΙ^ Т., 8рппдег Т.А., 8пе1 Β., (1999) Тгепбз Βίοοίιοιη 8с1.; 24 (7):261-3.

43. Сюх-бат 8., Рοηζебο С., (οιιιομίιο Р.М., (1991) 1. ΒίοΙ. Сбет.; 266:19558-19564.

44. Рагк М., Пеан М., Каи1 К., БгаипМ.1, Оοпба М.А., Уапбе ν'οικΕ О, (1987) Р^8; 84:6379-6383.

45. ^бидиев О.А., ^ирказ М.А., Ргак М., (1991) Ηοί. Се11 ΒίοΙ.; 11:2962-2970.

46. Εοίίοηζί А., А1без Б.Е., Β;ι1<ονίο 8., Оеипа М., №11бби Ь., (2000) №1. СепеБ; 25:217-222.

47. 8сбаейег ν.Ι., апб Бпепб К. (1976) Сапсег 1еб.; 1: 259-262.

48. 8епдир1аз, Обегагб1 Е., 8е11егз Ь.А., \Υοο6 ЕМ., 8аз1зекбагап К., Рап ТР (2003). АйегюБскг ТбготЬ Уазе ΒίοΙ. 23:69-75

49. νοιΕοη Β., -апд Х.Р., Ьее Т.Ь., ЕздаЙ! Ь., -еб КТ., СоНен ТО., Уап \Уаез С., Сбеп Ζ.(2005) Сапсег Кез.; 65:7071-80.

50. Ζбапд Υ.ν., 8и Υ., νο^τί О.У., Уапбе ^ибе ОР. (2003) Ргос №б беаб 8с1 И8А.; 100:12718-23.

51. Атепбο1а М., Уеппеп М.А., Βϊίϊϊ А., У1дпа Е., Кббби Б. (2005)№йиге ΒίοΕοΙι. 23: 108-116.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение:

ί) моноклонального анτи-сМеί антитела анти-МЕТ-К,

б) фрагмента (ί), содержащего определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМеί антитела анти-МЕТ-К, где СОК-Н1 представляет собой 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, СОК-Н2 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 9, СОК-Н3 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 10, СПК-Б1 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 11, СПК-Б2 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 12 и СПК-Б3 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 13, и/или ϊϊΐ) генетически сконструированного антитела, содержащего определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМеί антитела анти-МЕТ-К, где СОК-Н1 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 8, СОК-Н2 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 9, СОК-Н3 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 10, СПК-Б1 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 11, СПК-Б2 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 12 и СПК-Б3 представляет собой 8ЕО ГО ΝΟ: 13, для получения лекарственного средства для лечения опухолей и/или метастазов у пациента, страдающего опухолью, где указанное антитело анти-МЕТ-К продуцируется линией клеток гибридомы 1СБС РО 05006.
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело, указанный фрагмент и/или указанное генетически сконструированное антитело находятся в форме растворимого белка.

- 17 015580
3. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело и/или указанное генетически сконструированное антитело получают способом, выбранным из группы, состоящей из технологии рекомбинантных ДНК, твердофазного синтеза, синтеза в жидкой фазе.
4. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанный фрагмент выбран из группы, состоящей из ЕаЬ, Е(аЬ')₂, ЕаЬ', Εν, ксЕу и пептида, содержащего определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМе! антитела анти-МЕТ-К, где СЭК-Н1 представляет собой 8ЕО ΙΌ N0: 8, СЭКН2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 9, СЭК-Н3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 10, СОК-Ы представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 11, СЭК-Е2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 12 и СЭК-Е3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 13.
5. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанный фрагмент получают способом, выбранным из группы, состоящей из протеолитического расщепления указанного антитела, технологии рекомбинантных ДНК, твердофазного синтеза, синтеза в жидкой фазе.
6. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство вводят посредством инъекции или инфузии.
7. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанная опухоль выбрана из опухоли прямой и ободочной кишки и опухоли печени.
8. Применение нуклеотидной последовательности, кодирующей:

ί) моноклональное анти-сМе! антитело анти-МЕТ-К, ίί) фрагмент (ί), содержащий определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМе! антитела анти-МЕТ-К, где СЭК-Н1 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 8, СЭК-Н2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 9, СЭК-Н3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 10, СОК-Ы представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 11, СПК-Ь2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 12 и СПК-Ь3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 13, и/или ίίί) генетически сконструированное антитело, содержащее определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМе! антитела анти-МЕТ-К, где СЭК-Н1 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 8, СЭК-Н2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 9, СЭК-Н3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 10, СОК-Ы представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 11, СПК-Ь2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 12 и СПК-Ь3 представляет собой 8ЕО ΙΌ N0: 13, для получения лекарственного средства для лечения опухолей и/или метастазов у пациента, страдающего опухолью, где указанное моноклональное анти-сМе! антитело анти-МЕТ-К продуцируется линией клеток гибридомы ΙΟΈί’ ΡΌ 05006.
9. Применение по п.8, отличающееся тем, что нуклеотидная последовательность содержит, по меньшей мере:

ί) последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 8Е0 ΙΌ N0: 2, ίί) нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 8Е0 ΙΌ N0: 2, в которой присутствует одна или несколько молчащих замен.
10. Применение вектора, содержащего, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, кодирующую:

ί) моноклональное анти-сМе! антитело анти-МЕТ-К, ίί) фрагмент (ί), содержащий определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМе! антитела анти-МЕТ-К, где СЭК-Н1 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 8, СЭК-Н2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 9, СЭК-Н3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 10, СОК-Ы представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 11, СПК-Ь2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 12 и СЭК-Е3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 13, и/или ίίί) генетически сконструированное антитело, содержащее определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМе! антитела анти-МЕТ-К, где СЭК-Н1 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 8, СЭК-Н2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 9, СЭК-Н3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 10, СОК-Ы представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 11, СПК-Ь2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 12 и СПК-Ь3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 13, где моноклональное анти-сМе! антитело анти-МЕТ-К продуцируется линией клеток гибридомы ГСЬС ΡΌ 05006, для получения лекарственного средства для лечения опухоли и/или метастазов у субъекта, страдающего опухолью.
11. Применение по п.10, отличающееся тем, что указанный вектор содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из:

ί) последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 8Е0 ΙΌ N0: 2, ίί) нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 8Е0 ΙΌ N0: 2, в которой присутствуют одна или несколько молчащих замен.
12. Применение по п.10, отличающееся тем, что указанный вектор находится в форме частицы.
13. Продукт, содержащий:

ί) моноклональное анти-сМе! антитело анти-МЕТ-К, ίί) фрагмент (ί), содержащий определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМе! антитела анти-МЕТ-К, где СЭК-Н1 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 8, СЭК-Н2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 9, СЭК-Н3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 10, СОК-Ы представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 11, СПК-Ь2 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 12 и СПК-Ь3 представляет собой 8Е0 ΙΌ N0: 13, и/или

- 18 015580 ίίί) генетически сконструированное антитело, содержащее определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМе! антитела анти-МЕТ-К, где СИК-Н1 представляет собой ЗЕЦ ГО N0: 8, С0К-Н2 представляет собой ЗЕЦ ГО N0: 9, СИК-Н3 представляет собой ЗЕЦ ГО N0: 10, С0К-Ь1 представляет собой ЗЕО ГО N0: 11, СИК-Ь2 представляет собой ЗЕЦ ГО N0: 12 и СИК-Ь3 представляет собой ЗЕО ГО N0: 13, и по меньшей мере один ингибитор киназы в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения опухолей и/или метастазов, где указанное моноклональное анти-сМе! антитело анти-МЕТ-К продуцируется линией клеток гибридомы 1СЬС ΡΌ 05006.
14. Продукт по п.13, отличающийся тем, что указанное антитело и/или указанный по меньшей мере один его фрагмент находятся в форме растворимого белка.
15. Продукт по п.13, отличающийся тем, что указанное антитело и/или указанное генетически сконструированное антитело получают способом, выбранным из группы, состоящей из технологии рекомбинантных ДНК, твердофазного синтеза или синтеза в жидкой фазе.
16. Продукт по п.13, отличающийся тем, что указанный фрагмент выбран из группы, состоящей из РаЬ, Р(аЬ')₂, РаЬ', Εν, 8сЕу. пептида, содержащего определяющие комплементарность области (СОК) моноклонального анти-сМеЬ антитела анти-МЕТ-К, где СОК-Н1 представляет собой ЗЕО ГО N0: 8, СОК42 представляет собой ЗЕО ГО N0: 9, С0К-Н3 представляет собой ЗЕО ГО N0: 10, С0К-Ы представляет собой ЗЕО ГО N0: 11, С0К-Ь2 представляет собой ЗЕО ГО N0: 12 и СОК-Ь3 представляет собой ЗЕО ГО N0: 13.
17. Продукт по п.13, отличающийся тем, что указанный фрагмент получают способом, выбранным из группы, состоящей из протеолитического расщепления указанного антитела, технологии рекомбинантных ДНК, твердофазного синтеза или синтеза в жидкой фазе.
18. Продукт по п.13, отличающийсч тем, что указанный по меньшей мере один ингибитор киназы выбран из группы, состоящей из аналога стауроспорина К252А; (3Ζ)-5-[(2,6-дихлорбензил)сульфонил]-3[(3,5-диметил-4-{[(2К)-2-(пирролидин-1-илметил)пирролидин-1-ил]карбонил}-1Н-пиррол-2-ил)метилен]-

1.3- дигидро-2Н-индол-2-она; [(3Ζ)-Η-(3 -хлорфенил)-3 -({3,5-диметил-4-[(4-метилпиперазин-1-ил)карбонил]-1Н-пиррол-2-ил}метилен)-Ы-метил-2-оксоиндолин-5-сульфонамида]; [(3Ζ)-5-(2,3-дигидро-1Н-индол-1-илсульфонил)-3-({3,5-диметил-4-[(4-метилпиперазин-1 -ил)карбонил]-1Н-пиррол-2-ил}метилен)-

1.3- дигидро-2Н-индол-2-она]; [(3Ζ)-N-(3-хлорфенил)-3-{[3,5-диметил-4-(3-морфолин-4-илпропил)-1Н- пиррол-2-ил]метилен}-Ы-метил-2-оксоиндолин-5-сульфонамида].
19. Продукт по п.13, отличающийся тем, что указанный продукт вводят посредством инъекции или инфузии.